K. HExes nnd C. KELCK: Bestimmung yon Glucurons~ure usw. 339

Verfahrens wird die Forderung einer linearen Proportionalit/~t zwischen dcr Senkung der Depolarisationsstufe und der Menge des zu bestim- menden Stoffes in der LSsung erhoben.

Es wird auf die MSglichkeit einer sehr genauen Stufenabmessung hin- gewiesen, die auf einer Messung der DepolarisationsstufenhShe gegen den durch I~berschul3 des gesuchten Stoffes erhMtenen Grundstrom beruht.

Die Bedingungen ffir das Erzielen eines guten AnMysenergebnisses werden besprochen.

Schliel~lich wird die 3s einer indirekten Bestimmung yon Calcium, 3/[agnesinm und Eisen(III) mit Hi]re yon Versenat (Athylen- diamintetraacetat) an Hand yon Daten aus der Literatur Ms Rechen- beispiel angeffihrt.

Literatur. 1MATu B., U. I. K0SSLER: Collect. czechoslov, chem. Commun. 16, 221

(1951). - - 2 SCnWARZE~SACg, G., u. H. ACXERMANN: Helv. chim Acts 30, 1798 (1947). - - a SCHWA~Z~AC]t, G., u. H. ACXER~IAh-N: Helv. chim. Acts 81, 1029 (1948). - - a SCgWA~ZE-~AC~, G., u. J. HELLE]~: Heir. chim. Acts 84, 576 (1951).

DAGFI~ LYD~Sn~, Norges LsndbrukshSyskole, Vollebekk (Norwegen).

Aus dem Chemischen Institut der Universitgt tIamburg und der wissensch~ftl. Abteilung der Deutschen Maizena Werke Gmbtt., Hamburg.

Ober die quantitative Bestimmung von Glucuronsiiure und yon Glucurono siden mittel s der Naphthore sorcin-Reaktion.

Von K. HEYNS und C. KELCIt.

Mit 2 Textsbbildungen.

(Eingegangen am 18. Mai 1953.)

Durch neuere synthetische Verfahren ist die Glucuronsg~ure in grSftcren Mengen fiir die Prtifung ihres biochemischen Verhaltens im Organismus verfiigbar geworden 1. Voraussetzung hierfiir isg das Vorhandensein yon Verfahren zur Bestimmung der freien und der glucosidisch gcbundenen Glucurons~iure nebeneinander mit hinreichend zuverliissigen analy- tischen Methodcn. Die bisher beschriebenen Bestimmungsverfahrcn haben jedoch keineswegs Allgemeingiiltigkeit, was vielfach nicht ge- biihrend berticksichtigt worden ist, so dab leicht Fehlschlfisse entstehen, die sich vermeiden liel~en, wenn man die Leistungsfiihigkeit der Methoden in jedem Fall speziell beriicksichtigte.

Ein mikroanMytisches Verfahren, das eine quantitative Bestimmung yon freier Glucuronsgure in reinen wgSrigen LSsungen mit befriedigender Genauigkeit auszuftihren gcstattet, wurde yon MAUGHAX, Evnnyzc u.

22*

340 K. H~r~s und C. K~LCH:

B~ow~E ~ entwickelt. Dieses Verfahren beruht auf der Naphthoresorcin- reaktion yon TOLLE~S 3, derzufolge eine w~l~rige LSsung yon Glucuron bzw. Glucurons~ure mit Salzs~ure und Naphthoresorcin* 30 m i n i m sie- denden Wasserbad erhitzt wird. Dabei entsteht ein blauer ~iederschlag, dessen ~enge der jeweils vorhandenen Glucurons~uremenge proportional ist. Dieser Niederschlag ist in ~ the r mit blaurot-violetter Farbe 15slich; die gebildete ~enge des ~Tiederschlags wird nach Ausschiitteln in der i~therischen LSsung colorimetrisch best immt.

Die Leistungsf~higkeit der yon ~AVG~A~ und Mitarb. ~ angegebenen Arbeitsweise l i~ t sich jedoch durch verschiedene Ab~nderungen noch verbessern. Zur Bereitung der w~l~rigen NR-Reagensl5sung arbeitet man vorteilhafter nach der yon SMITg 4 beschriebenen Methode. MA~G~AN und Mitarb. ~ verwendeten ~ls l~eagens eine w~l~rige NR-LSsung, die 24 Std auf 38 ~ C gehalten und anschliel3end bei 3 - -5 ~ C lichtgeschfitzt aufbewahrt wurde. Sie stellten lest, dab bei gleichen Glucurons~ure- konzentrat ionen die Farbintensi t~ten dann grSI~er waren als mit alko- holischen NR-L5sungen. S~ITH ~ und auch J ~ z I G E 5 ver t re ten die An- sicht, da~ die Behandlung der Nl~-LSsung nach der Methode yon ~ ~ und Mitarb. ~ ein Einstellen des Gleichgewichtes zwischen ~1~ und seinem Oxydationsprodukt bedingt und der farbige Niederschl~g weniger yon NI~, sondern haupts~chlich yon dessen Oxydationsprodukt gebildet wird. S ~ K ~ bereite~ daher die I~e~genslSsung, indem er durch eine w~l]rige 0,2% ige NR-LSsung eine S~d Sauerstoff ]eitet und nach 24 Std den Sauerstoffiiberschul~ durch Durchlei~en yon Stickstoff ent- fernt. ~ i t einer n~ch diesem Verfahren hergestellten l~eagenslSsung er- hielten wir einen steileren Anstieg der Ext inkt ionskurve als mit einer, die nach der ~e~hode yon M_~u~x~ und ~ i t~rb . ~ hergestellt war.

Die Extr~kt ion des farbigen Niederschlages fiihrten wir nur mit ~ther , also ohne Zus~z yon Alkohol, durch. Au~erdem wurde der i~the- rische Ex t rak t mit Hilfe eines Scheidetrichters yon der Reaktions- 15sung ~bgetrennt und filtrier~. Durch diese Bch~ndlung erreichten wir, da~ die zu messenden Farbext rak te nun nicht mehr opalisierten und die Streuung der einzelnen Mel~werte geringer wurde. W~hrend M ~ u ~ A ~ und )/[itarb. ~ mit nut je 2 ml Glucurons~urelSsung, ~l%LSsung und konzen~rierter Salzs~ure die Farbre~ktion ausffihrten, arbeiteten wit mit je 5 ml.

Besonders beachtenswert is~ die Feststellung yon ~OZO~OWSK~ ~, dai~ nur innerhalb eines best immten Konzentrationsbereiches der Glucuron- s~ure Proportionali~i~t zwischen Ext inkt ion und Konzentrat ion bes~eht und nur bier einwandfreie Resultate erziel~ werden. Bei unbekannten Konzentrat ionen ist es daher erforderlich, Verdfinnungsreihen durchzu-

* ~aphthoresorcin ist im Folgenden immer ,,~R" abgekfirzt.

Bestimmung yon Glucuronsaure mittels Naphthoresorcin-Reaktion. 341

messen und nur so]ehe Megwerte zu verwerten, deren Farbintensit~ten dem Verdiinnungsverhaltnis entsloreehen.

Die NR-geakt ion erfaBt nicht nut freie Glucuronsaure, sondern sie spricht aueh auf Mle Glueuronide an. Ihre Reaktionsbedingungen ermSg- lichen entweder praktisch restlose, aber oft aueh nur teilweise Hydrolyse der Gheuronide, so dab die entspreehende Menge jeweils freigewordener Glueuronsaure der Reaktion zug~tngiieh wird. Bekanntlich verlauft die Saurespaltung yon Glucosiden, zu denen aueh die Glucuronide gehSren, in den meisten Fallen naeh den Gesetzen der monomolekul~ren geakt ion:

d x 1 d t -- k ( a - - x ) bzw. ]c= In

3 ~ - - - X

wobei a die Anfangskonzentration des Glucosids, x die umgesetzte Menge zur Zeit t seit Beginn der Hydrolyse und/c diel~eaktionskonstante bedeuten. Die ttydrolysengesehwindigkeit ist nicht allein yon der Wasser- stoff-Ionenkonzentration abhangig, sondern sie ist unter bestimmten, genau definierten Bedingungen eine eharakteristische Konstante, die je- wefts yon der Natur des betreffenden Glueosides abhangt.

Wir untersuchten den Hydrolysenverlauf yon Phenol-fl-d-glueuron- saure in Abhangigkeit yon der Zeit unter den Bedingungen der NR- Rcaktion durch eolorimetrisehe Bestimmung des jeweiligen Phenol- gehaltes mit Diazobenzolsulfosaure (Tab. 1). Die Testsubstanz wurde yon Glueuron ausgehend fiber den 1-Bromtriacetyl-glueuronsauremethyl- ester durch Umsetzung mit Phenol synthetisiertL

T~belle 1. Hydrolysenverlau/ yon Phenolglucuronid.

Zeit

m i n

5 10 15 20 30 40 50 60 70

P h e n o l g e h a l t

~

30,9 52,0 68,3 77,6 89,6 95,2 97,8 98,9 99,5

a - - x

1,45 2,08 3,16 4,47 9,62

20,8 45,4 90,8

200,0

0,16137 0,31806 0,49 969 0,65031 0,98318 1,31806 1,65706 1,95809 2,30103

Die graphische Darstellung der freigewordenenPhenolmenge in Prozen- ten in Abhangigkeit yon der Zeit t zeigt anschaulich denVerlanf der t tydro-

lyse (Abb. 1, S. 342). Die graphische Darstellung des Verh~ltnisses log a ~ X

gegen die Zeit t ergibt eine Gerade, die den monomolekularen l~eaktions- verlauf der Saurehydrolyse von Phenolglueuronid erweist (Abb. 2). Nach 30 min ist die Phenolglueuronsaure zu 89,6~o hydrolysiert. Dieses Ergeb- nis deekt sieh mit dem der NR-Reaktion, die ebenfalls 85,0~o der in Phenol

342 K. ttEyNS und C. KELO~:

glucuronid vorhandenen Glucuronsaure nach 30 min in 4n SMzs~ure an- Zeigt (Tab. 2 u. 7). Die kleine Differenz zwischen den beiden Methoden kommt dadurch zustande, dag bei der t tydrolyse die Salzsgure im Zeit- punkt 0 (d. h. im Augenb]ick der Phenolglucuronidzugabe) bereits die

706

f 80

~G

20

f ~

I I / I 0 20 fO 60 00

, t s ~

Abb. 1, Hydrolysenverlatff yon Phenolglucuronid. Zunahme der Phenolmenge mi~ der Zeit.

3,5

I /

i 0,5

0 20 40 00

Abb. 2. t tydrolysenverlauf yon Phenolglucuronid. Ab-

des Verhgltnisses log a yon der Zei~. h~ngigkeit

Temperatur des siedenden Wasserbades hat, w~hrend bei der NR-Reak- tion das Reaktionsgemisch im Zeitpunkt 0 noch Zimmertemperatur auf- weist und dann erst in das siedende Wasserbad gebrach~ wird.

Weiterhin wand~en wir die Ng-Reakt ion auch auf einige andere Glu- curons~urederivate an. Wie Tab. 2 zeigt, werden auch nichtglucosidische Bindungen nur unvollst~ndig hydrolysiert.

Tabelle 2. Hydrolysierbarkeit einiger Glucuronsgurederivate.

Glucurons~urederivate

Zugefiigte Menge berechnet

als Glucuron

peg peg

Gefundene~enge Glucuron

~

fl-Triacetylglucuron . . . . . . . 58,3 59,1 101,3 a-Triacetylglucuron . . . . . . . 58,3 98,0 Kaliumglucuronat . . . . . . . . 65,7 100,0 fl-Tetraacetylglucurons~uremethyl-

ester . . . . . . . . . . . . . 46,8 58,7 fl-Phenoltriacetylglueuron-

sauremethylester . . . . . . . 42,9 fl-Phenol- d-glucurons~ure . . . . 65,2

In Tab. 3 sind Hydrolysendaten von Temperatur yon 100 ~ C zusammengestellt, die yon anderen Autoren ver- 6ffentlicht wurden s.

57,2 65,7

27,5

18,3 42,6 55,4 85,0

Phenolglucuronid bei einer

Bestimmung yon Glucurons~iure mittels Naphthoresorcin-Re~ktion. 343

Tabelle 3. Hydrolysendaten yon Phenolglucuronid.

Sgure und deren Konzentration

H2SO 4 10 n

HCI 1 n HC1 1 n HC1 0,1 n HC1 0,1 n I-IC1 0,1 n ItC1 0,1 n

Kydrolysendauer in Minuten

~ Phenol- glucuronid,

hydrolysiert

60 100 I0 16

210 99 10 2 20 8 30 14 40 20

Verfasser

POP~TEOUS u.W[LLI~kN[S (1949)

MASA~UNE (Tokio 1933)

~ARTON, I~OBINSON 11. WILLIAIV[S s

Es ergibt sich eindeutig, dab der gefundene Glueurons~urewert bei Anwendung der Nt~-Reaktion auf Glucuronide nicht immer dem wahren Glueurons~uregehalt entsprieht, weft die Reaktionsbedingungen bei einigen Glueuroniden nicht zur vollst~ndigen Hydrolyse ausreiehen. Wenn MAVGItA~ und Mitarb. 2, MOZOLOWSKIS sowie FLO~KI~ und~ i t a rb . 9 festgestellt haben, dab Pregnandiol-, Benzoyl-, Borneol- und 3s glucuronid yon der NI~-Reaktion quant i ta t iv erfaBt werden, so wider- sprieht dieses keineswegs unseren Beobaehtungen, sondern besagt nut, dab diese Verbindungen im Gegensatz zu anderen Glucuroniden, z. B. Phenolglueuronid, vollstgndig hydrolysiert werden.

Um gber restlose Hydrolyse mSgliehst aller Glueuronide zu gewghr- leisten, mtissen entweder die Bedingungen w~hrend der Nt~-l~eaktion versehgrft werden, oder die betreffende Verbindung bzw. das vorliegende Substanzgemiseh mug vor Anwendung der Nt~-I~eaktion einer Vorhydro- lyse unterworfen werden. ~-[ANSON, ~V[ILLS U. WILLIAMS 10 besehreiben eine Methode, in der die Bedingungen der NR-Reakt ion gegeniiber der Methode yon MArrGHAN 2 erheblieh verschgrft werden. Sie verlangern die Erhitzungsdauer yon 30 min auf 2 Std, erhShen die Konzentrat ion der Salzsgure yon etwa 4 n auf etwa 5 n (5,15 n) und die Konzentrat ion der NI~-LSsung yon 0,2% auf 0,25~ extrahieren den Farbstoff mit Amyl- alkohol start mit _~ther und messen die Absorption bei 615--620 m# star t bei 565 m#. Diese 3/[ethode wurde an einigen Glueuroniden fiberpriift und ergab brauehbare t~esultate. Zu niedrige Werte wurden bei o-Amino- phenylglueuronid, o-Amino-p-sulfonamidophenylglucuronid, Euxanthin- s~ure 1~ und DienSstrolglueuronid n gefunden. Am Beispiel der o-Amino- phenylglueuronsgure zeigten die obigen Verfasser, dag dutch Verlgngern der t~eaktionsdauer bis zu 4 Std ebenfalls ein brauchbares Ergebnis er- zielt wird. Den anfangs zu niedrigen Wert fiihrten sie daher auf unzu- reiehende Hydrolyse infolge besonderer Stabilitgt dieser glueosidisehen Bindung zuriiek. Gleiehzeitig erbraehten sie den Beweis, dag das f r e t werdende Aglykon auf die NR-I~eaktion ohne Einflug ist. Auf die Not- wendigkeit einer Vorhydrolyse wurde bisher nur yon SIPLET, KOMA~OV

344 X. l-I~Yss und C. K~LcJ~:

u. SJ~AY 1~ und auch nur fiir polymere Verbindungen hingewiesen. Sie stellten fest, dab ffir Untersuchungen von Polyurons~uren eine Vor- hydrolyse erforderlich ist, weft die Bedingungen der NR-Reakt ion ffir eine vollsti~ndige t Iydrolyse nieht ausreiehten. Nach den obigen Aus- ffihrungen ist auch bei der Untersuchung gepaarter Glucurons~uren mit der NR-Reakt ion oft eine Vorhydrolyse erforder]ich, da aueh die ver- schi~rfte NR-Reakt ion nach HANSON, MILLS u. WILLIAMS 10 nicht immer restlose t Iydrolyse gew/~hrleistet.

Die Vorhydrolyse darf aber nur unter mildesten Bedingungen dureh- gefiihrt werden, da Glucuronsiiure durch langeres Behandeln mit heil~er Salzs~ure zersetzt wird. Den Zersetzungsverlauf yon reinen Glucuron- 16sungen nach Behandeln mit 4 n Salzsi~ure yon 100 ~ C ermittelten wir

mittels der NR-Reakt ion und dureh Tabelle4. Zersetzungsverlau/son Messen der spezifischen Drehung.

Glucurons5ure. Der restliche Glucuronsguregehalt in Abh/ingigkeit yon der Zeit ist

Zeit Glucuronsgure t gefunden aus Tab. 4 ersichtlich.

iginuten ~ Liegen LSsungen vor, die freie Glueurons/inre und ein Glucuronid

30 86 60 79 enthalten, so ergibt die NR-Reakt ion 90 75 einen Wert, der sich aus dem Gehalt

120 71 der urspriinglieh vorhandenen freien Glucurons~ure und dem Prozentsatz

an Glueurons/~ure zusammensetzt, der infolge IIydrolyse aus dem Glucu- ronid durch die geaktionsbedingungen abgespalten wird. Ffir eine ge- t rennte Best immung yon freier Glucurons~ure einerseits und yon ge- bundener Glucnrons~ure andererseits mfiBten diese vor Anwendung der NR-Reakt ion durch eine geeignete Methode voneinander getrennt werden.

Die ToLLw~ssche 8 Ng-Reak t ion spricht sehr empfindlieh allgemein auf ttexurons~uren, nicht nur auf Glucurons~ure und ihre Derivate an. Bei Penturons/iuren fallt nach Untersuchungen yon H v ~ E ~ u. L rxx la die NR-Reakt ion negativ aus. Pentosen und tIexosen liefern unter den gleiehen Bedingungen ebenfalls farbige Niederschliige und charakteri- stisch gef/irbte LSsungen, die zwar auch mit ~ the r oder Chloroform, je- doch nicht mi t Benzol - - zum Unterschied yon Hexuronsi~uren - - aus- geschfitte]t werden k6nnenla. "

Abgesehen yon der etwas anderen Farbnuance ist diese Reaktion auf t texosen und Pentosen bei weitem nicht so empfindlich wie auf t texuron- s~turen. Zur Best immung der Gr6Benordnung des Einflusses yon Dextrose auf die NR-l~eaktion wurde einer best immten Glucurons~urekonzen- t ra t ion die 5faehe Menge dieser Konzentrat ion yon Dextrose zugesetzt. Es erh6hte sich dadurch der gefundene ,, Glucurons/~ure"-Wert gegentiber dem tatsiichlieh vorhandenen Glucurons~uregehalt um 5,5%. Wurde

Bestimmung yon Glucurons~ure mittels Naphthoresorcin-Reaktion. 345

j edoch die 50 fache Dextrosemenge zugesetzt, so betrug die ErhShung des ,,Glucuronsgure"-Wertes 9~o. Dextrose ohne Glucuronsgurezusatz ]ie- ferte nach der Nl%-Reaktion einen rotbraun gefgrbten Xtherextrakt , dessen Extinkt ion bei einer 10% igen DextroselSsung einer 0,033~o igen GlucuronsgurelSsung entsprach.

HAzcSOZr M~LS u. WILLIAZ~S 1~ fanden, dal] der stSrende Einfin6 yon Dextrose und Arabinose ungef~hr gleich groG, der yon Fructose dagegen etwas grSl]er als der yon Dextrose ist. Die GrSl~e des Einflusses yon Dextrose unter ihren lgeaktionsbedingungen (siehe oben) ist aus der Aufstellung ersichtlich (Tab. 5).

Tabelle 5. Erh5hung des Glucurons~urewertes in Gegenwart yon Dextrose.

Dextrose

~g

0 18 36 54

Zugeffigt

sg

53,6 53,6 53,6 53,6

* zugeffigt als 1-Menthylglucuronid.

Glucnronsgure*

Gefunden

/~g

54,0 56,5 57,0 61,0

Ferner darf nicht iibersehen werden, dab bci physiologischen Unter- suchnngen anfter den oben genannten Stoffen auch andere Verbindungen anwesend sein kSnnen, die sowohl mit als auch ohne NR-Reaktion den gtherischen Ext rak t fgrben oder die Intensitgt des gebildeten Farbstoffes beeinflussen kSnnen. Aus diesen Griinden daf t die Reaktion nicht ohne weiteres zu physiologisehen Untersuehungen eingesetzt werden, sondern ihr mul~ stets eine Reinigungsoperation vorausgehen, um alle stSrenden Stoffe zu entfernen und Ergebnisse zu erzielen, die den wahren Verh~lt- nissen entsprechen. Im Blur wird bcispielsweise der normalerweise vor- gefundene Wert yon 3--5 rag% Glucurons~ure schon durch den gewShn- lichen Blutzuckerwert yon 60--100 rag% ungenau ausfallen.

lgozonowsxI s wies bereits darauf hin, da~ eine genaue Bestimmung im Harn nur dann ausgefiihrt werden kann, wenn der Gehalt an Glucu- rons~uren grol~ genug ist, um eine betrgehtliche Verdfinnung zu erlauben. Dadnrch liel~ sich der Einflul3 stSrender Substanzen so weir herabsetzen, dal~ der verursachte Fehler innerhalb der Fehlergrenze der 1V[ethode lag und die gemessenen Werte den Verdiinnungsreihen entsprachen.

Bei geringen Glucurons~urekonzentrationen versagt dieses Verfahren, und zur Beseitigung stSrender Verbindungen miissen andere Wege ein- geschlagen werden. Hierfiir kann allerdings kein allgemein giiltiges Ver- fahren angegeben werden, da die zu nntersuchenden Fliissigkeiten wie Itarn, Blut, Gewebsextrakte nsw. sehr unterschiedliche Zusammen- setzung aufweisen. Es mul~ daher fiir jeden speziellen Fall ein besonderes

346 K. H ~ s und C. K~c~ :

~einigungsverfahren entwickelt werden. Fiir die Genauigkeit der j ewel ligen l~einigungsmethode ist es um so vorteilhafter, je weniger Arbeits- g~nge erforderlieh sind, um stSrende Substanzen, die vSllig verschiedenen Stoffklassen angehSren k6nnen, zu entfernen. Bei mehreren Arbeitsg~tngen ist es oft sehr schwer, die gleichen Bedingungen genauestens einzuhalten, wodurch die Genauigkeit der Methode entsprechend verringert wird.

FLOI~KI~ und Mitarb.9 unterwarfen den Harn vor Durchfiihrung der Farbreakt ion einer mehrstufigen l~einigung, in deren Verlauf u. a. durch Behandlung mit Kupfersu]fatlSsung und Calciumhydroxydsuspension alle Glucuronderivate vom Ester typ hydrolysiert werden und gleich- zeitig eine Reihe yon stSrenden Substanzen wie freie Glueurons~ure, Dextrose, Pentosen usw. entfernt werden sollen. Ansehlie~ende Behand- lung mit Quecksilberacetat soll ferner andere stSrende Stoffe wie z. B. Indirubin entfernen. Bei der Ausfiihrung der Farbreakt ion h~lt sich FLORKrN 9 an die Vorschrift yon M~UOHA~ und ~iitarb. ~, nur verwendet er konz. Salzs~ure, die mit dem gleichen Volumen Wasser verdtinnt wird, w~hrend MA~G~A~ 2 konz. Salzs~ure gebraucht. Die endgiiltige l~eak- tionslSsung enth~lt demnach bei der FLo~K~schen 9 Methode 73,9 g Salz- s~ure im Liter, d. h. die LSsung ist etwa 2 n salzsuuer, w~hrend die end- giiltige t~eaktionslSsung nach M A ~ G ~ s Methode 2 147,8 g Salzs~ure im Liter enth~lt, also etwa 4 n salzsauer ist.

Wir ha t ten bereits festgestellt, dal~ Phenolglucuronid in 4 n Salzs~ure nach 30 rain zu etwa 88% hydrolysiert wird. Bei tdberpriifung der t tydrolysierbarkei t in 2 n Salzs~ure unter sonst gleiehen Bedingungen fanden wir, dal~ nur noeh ungef~hr 31% der Phenolglucurons~ure hy- drolysiert werden. Es kann ohne weiteres angenommen werden, da[~ neben der Phenolglueurons~ure auch andere schwer oder noch schwerer zu hydrolysierende Glucuronide vorliegen (siehe HA~so~, ~V~ILLS U. WILLIAMS1~ Die Bedingungen der Nt~-I~eaktion, wie sie FLO~KI~ 9 an- wendet, sindim al]gemeinen zu schwach, und die naeh dieser Methode gefun- denen Glucurons~urewerte werden in vielen F~llen zu niedrig ausfallen.

Zur tJberpriifung der yon F~OaKI~ und Mitarb2 beschriebenen l~eini- gung des Harnes zur Entfernung einer l~eihe stSrender Stoffe benutzten wir daher die yon M~CGH~ ~ entwickelte Nt~-I~eaktion unter Berfick- sichtigung der yon uns vorgenommenen Ab~nderungen. In der ersten Versuchsreihe (Tab. 6) wurden zun~chst w~l~rige LSsungen yon Glueuron, Dextrose und Pheno]glueuron~d einzeln und miteinander gemiseht der Reinigungsbehandlung unterworfen und ansehliel~end mit den gereinigten Fil t raten die Farbreakt ion durchgefiihrt. Gleichzeitig wurde die Farb- reaktion mit einer w~l~rigen PhenolglucuronidlSsung ohne Vorbehand- lung ausgefiihrt (Tab. 7).

Die Ergebnisse zeigen, da[~ Glucuron und Dextrose einerseits durch die FLo~Krt~sche ~einigungsmethode ~ restlos entfernt und dadurch

Bestimmung yon Glucurons~ure mittels Naphthoresorcin-geaktion. 347

Tabelle 6. Ein/lufi der t~einigung nach FLORKISr 9 au/ wiifirige LSsungen yon Phenol- glucuronid, Glueuron und Dextrose.

ZugegebeneMengen yon

PhenoIg lucu ron id be- r echne t als Glucuron

z g

96,6

96,6 96,6 96,6 96,6

Glucuron

ttg

8O

8O

80 80

Dext rose

~g

m

800

8OO 800 80O

E x t i n k t i o n

0,27 0 0 0,30 0,28 0,24 0,21

Gefundene Menge Glucuron

ttg

48 0 0

53 50 43 37

%

50 0 0

55 52 45 38

Tabelle 7. Ge/undene Glucuronmenge aus Phenolglucuronid ohne Reinigungsbehandlung.

ZugebenelVfengen yon

Pheno lg lucu ron id Glucuron be rechne t als

Glucuron

~g ~g

G e f u n d e n e ) I e n g e Glucuron

96,6 96,6

100 80

Extinktion

I.~

0,56 0,45 0,47 0,45

100 80 84 80

%

100 100 87 83

yon der Farbreakt ion nieht erfal?t werden, andererseits aber auch ein nicht unbetr~ohtlieher Teil yon Phenolglueuronid aus der L6sung dutch diese Behandlung entfernt wird. Dureh die Farbreakt ion wurden in LSsungen yon Phenolglueuronid ohne Vorreinigung etwa 85% des be- reehneten Glueuronwertes wiedergefunden, wghrend in den gleiehen, je- doeh naeh FnO~Krs 9 vorbehandelten LSsungen unter sonst vSllig gleiehen Bedingungen nur etwa 50% des bereehneten Glueuronwertes wieder- gefunden wurden. Bei L6sungen yon Phenolglucuronid, die zugleieh Glueuron bzw. Dextrose enthielten, betrug die gefundene Glueuron- si~uremenge naeh Durehf~ihrung der t~einigung und der Farbreakt ion ebenfalls nur etwa 50% des erreehneten Wertes. Bei LSsungen, die auBer Phenolglucuron sowohl Glueuron als aueh Dextrose enthielten, betrug die ansehlieBend gefundene Glueuronmenge in einem Falle nut 45% und im anderen Falle nur 38%!

In weiteren Versuehsreihen (Tab. 8) untersuehten wir den Einflug der l~einigungsmeghode nach FnORKIX 9 aufHarne, die mit bekanntenMengen yon Phenolglueurons~ure, Glueuron und Dextrose versetzt wurden.

I m wesentliehen entspreehen die Ergebnisse den oben erw~thnten Ver- h~ltnissen, doeh sind die Abweiehungen der einzelnen Werte vonein- ander bei den Harnen grSBer als bei den wagrigen L6sungen. Bemerkens- wert ist die Abnahme der Ext inkt ion und damit des Gesamt-Glueuron-

348 K. HEY~s und C. KELCtt:

Tabelle 8. Ein/lu[3 der Reinigung naeh FLORKIW au] Harne, die mit Phenolglueuronid, Glucuron und Dextrose versetzt wurden.

Zugegebene Menge yon

Phenolglucuronid Glueuron bereehnet

a]s Glucuron

~g #g

Harn A - - 96,6

- - 80 96,6 80

96,6 - - 80

96,6 80

Ham B - - 96,6

- - 80 96,6 80

96,6 - - 80

96,6 80

Dextrose

m

8 0 0

800 800 800

800 800 800 800

]~xtinktion

1,05 1,28 0,98 1,24 0,94 1,20 0,90 1,05

0,50 0,76 0,52 0,79 0,45 0,67 0,44 0,62

Gesamtgehalt Glucuron gefunden

~g

191 233 178 226 171 218 164 191

88 133 91

139 78

118 77

109

Wiederge- fundene~lenge

Glucuron

~g ~

0 0 42 44

0 0 48 50

0 0 47 49

0 0 27 28

0 0 45 47 ,3" ,,3" 48 50

0 0 40 41

0 0 32 33

wer tes bei Zusi i tzen y o n Glueuron oder Dex t rose oder Glucuron ~- Dex t rose gegenfiber g l e i chbehande l t em H a r n ohne i rgendwelche Zus~tze. Dagegen s ink t aueh hier der Glucuronwer t be i g]eichzeit iger Anwesenhe i t von Dex t rose u n d Glucuron in e twa gle ichem MaBe wie bei der w~Brigen LSsung in Gegenwar t dieser be iden s t5 renden Subs tanzen . Die yon FLo~- xIN ~ beschr iebene Re in igungsme thode is t zwar geeignet , s t5 rende Stoffe, wie Glueuron und Dext rose , aus den zu un t e r suehenden H a r n e n zu ent- fernen, gle ichzei t ig wi rd abe r auch ein hoher Ante i l an Glucuron iden - - e twa 4 0 - - 5 0 % - en t fe rn t , wie es in Versuchen mi t Pheno lg lucu ron id nachgewiesenwurde . D a V e r h s t e yon Glucuron iden au f G r u n d chemiseher R e a k t i o n e n unwahrsche in l i ch sind, is t anzunehmen, dab es sich h ierbe i u m Adso rp t ionsve r lu s t e hande l t , die dureh die Me thod ik des Rein igungs-

ve r fahrens bed ing t s ind. Andere iV~Sgliehkeiten zur E n t f e r n u n g s tSrender Subs t anzen wiiren,

die Glucurons~ureve rb indungen aus den zu un t e r suehenden L5sungen en tweder dureh F~l len m i t bas i sehem Ble i aee t a t oder dureh E x t r a k t i o n m i t X the r abzu t r ennen . E x t r a k t i o n s v e r f a h r e n s ind nur be d ing t zur Ab- t r e n n u n g einiger in ~ t h e r le ieh t 15slicher Glueuron ide (z. B. Menthol - glueuronid15, 1~, 17) geeignet . Al lgemein a n w e n d b a r is t diese Methode nicht , da die Ver te i lung der G lueu ronsau reve rb indungen in die waBrige P h a s e u n d den i i ther ischen Auszug nach dem l~R~STschen Ver te i lungs-

Bestimmung yon Glucurons~ure mittels N~phthoresorcin-I~eaktion. 34L9

satz erfoigt, entsprechend dem Verhaltnis der LSslichkeiten der Verbin- dungen in jeder der beiden Phasen. Die LSsliehkeiten der Glueuronide in Wasser und in )[ther sind so versehieden, dab auch die Verteilungs- koeffizienten jeweils andere Werte annehmen. Das bedeutet, dab Glueu- ronide in der waBrigen Phase und im Atherext rakt in einem Verhaltnis gefunden werden, das yon den Verteilungskoeffizienten der vorliegenden Glucuronide best immt wird. Sowohl FLORKZ~ und Mitarb. 9 als auch MAVGHA~ und Fiitarb. 2 haben daher diese Art yon Reinigungsverfahren, die auf QUICK 15 zuriiekgehen, abgelehnt.

Es ist zu erwarten, dug einzelne Glucuronide, die in Wasser schwer 15slieh oder unlSslich sind, fast ausschlieglich im atherischen Auszug ge- funden werden, wahrend andere, die in Xther sehwer- oder unlSslich sind, kaum vom Xther aufgenommen werden. Ein Verfahren, das auf diesen Tatsachen beruht und eine Trennung aller gepaarten Glucuronsa~ren yon freier Glueuronsaure gestat ten soll, wie es NEU]~E~G u . SC]~EWKETI8 und SC~EWKET 19 beschreiben, ist allein auf Grund der oben dargestellten Uberlegungen unbrauchbar. Wir iiberpriiften dieses Verfahren mit Glueu- ton und synthetiseher Phenol-/~-d-glueuronsaure als Testsubstanzen urtd erhielten folgendes Ergebnis, das die theoretisehen Ausffihrungen be- statigte:

Naeh Aussehiitteln einer w~it]rigen GlucuronlSsung (c = 20 rag%) warden 5,5% und 8,0% Glucuron im ~therischen Auszug gefunden. Nach Ausschiitteln einer w~grigen Phenolglueuronidl6sung (c = 13 rag%) wurden im ~therischen Auszug 29,8% uad 32,3% und in der w~BrigerL Phase 40,4% und 40,0% der theoretisch berechnetea Glueuronmenge gefundem Die Summe der im ~therextrakt und in der w~grigen Phase gefundenen Glucuronmenge be~r/igt 70,2% und 72,3% start etwa 85%, wie es ~uf Grund der Kydrolysierbarkeit yon Pheno]glueuronid unter den ]~edingungen der NI~-geak~ion zu erwarten w~re. Diese Abweichung kanrt dureh Verluste beim getrennten Auf~rbeiten der beiden Phasen erld~rt werden.

Nach Untersuehungen yon FLORKIN und Nitarb. 9 ist das yon S~LT 2~ beschriebene Verfahren zur Abtrennung yon stSrenden Stoffen durch Fallen der Glueuronsaureverbindungen mit basisehem Bleiaeetat und Untersuehung des gebildeten Niedersehlags ebenfalls ungeeignet. Von zugefiigten Glueuronsauremengen wurden hierbei nur etwa 500/0 wieder- gefunden und st6rende Substanzen, wie Arabinose und Xylose, konnten nicht entfernt werden.

Die quant i ta t ive mikroana]ytische Best immung yon Glueuronsaure bzw. Glueuron in reinen LSsungen mittels der NI~-l~eaktion fiihrt also zu befriedigenden Ergebnissen. Bei der generellen Best immung yon Glueuroniden und Polyglucuroniden versagt sie, denn sie erfaBt nur don Gehalt an freier Glueuronsaure, der aus diesen Verbindungen im Verlauf der l~eaktion infolge I-Iydrolyse abgespalten wird. In einigen Fallen ge- niigen die normalen t~eaktionsbedingungen (30 rain siedendes Wasser- bad) zur vollst~indigen Hydrolyse, u n d e s t r i t t auch bei Anwendung der

350 K. HEY~s und C. KELe~:

verseh~irften Reakt ion (2--4 Std im siedenden Wasserbad) keine Er- h6hung gegeniiber den Werten der normalen Reaktion ein. Werden da- gegen die gefundenenWerte dureh Versch~rfen der l%aktionsbedingungen erh6ht, ist es ratsam, die Nl%l~eaktion erst naeh ausreiehender Vor- hydrolyse anzuwenden. Die Mehrzahl der in physiologisehen L6sungen vorkommenden Glueuronide ist zwar bekannt, aber fiber ihre tIydroly- sierbarkeit liegen fast keine Angaben vor. Es kann daher nut dutch Ver- suehe entsehieden werden, in welehen F~tllen die normale Ng-l~eal~tion aus- reieht, warm die verseh~rfte NR-l:~eaktion eingesetzt oder eine Vorhydro- lyse durehgeffihrt werden mul3. Dies gilt insbesondere aueh beianalytisehen Untersuehungen fiber den Verbleib yon Arzneimitteln im Organismus.

Die Nl%I~eaktion ist nieht spezifiseh ffir Glueurons~iure, sondern ganz allgemein eine sehr empfindliehe Reaktion auf Hexurons~uren. AuBerdem geben auch andere Stoffe unter den Bedingungen der Nl~-l:~eaktion far- bige Niedersehl~ge und beeinflussen daher oft die gefundenen Glucuron- sgurewerte. Die zur Abtrennung stSrender Stoffe besehriebenen Ver- fahren sind nut in vereinzelten F~llen hierffir geeignet und besitzen daher keine Allgemeingfiltigkeit. In diesen l~illen arbeitet man oft vorteilhaft ohne Vorreinigung und ermittel t aus Testversuehen die ungefKhre GrSl3e der dutch die vorliegenden stSrenden Stoffe verursachten Fehler und beriehtigt dementspreehend die gefundenen Werte.

Eine getrennte Best immung von freier Glueurons~ure einerseits und yon Glucuroniden andererseits kann nicht durehgeffihrt werden, da es bisher keine Methode gibt, Glueurons~ure yon der Vielzahl der Glucu- ronide, deren ehemisehes und physikalisches Verhalten auf keinen ge- meinsamen Nenner zu bringen ist, abzutrennen. Man erhalt lediglich konventionelle Werte, deren Inhal t und AussagemSgliehkeiten jeweils er- 5rtert werden mfissen.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dab die Best immung des Glueurons~uregehaltes in K6rperfliissigkeiten mittels der Nl~-l~eaktion nur dann zu brauchbaren Ergebnissen ffihrt, wenn die Fehler, die infolge wechselnder Hydrolysierbarkeit yon Glueuroniden und Polyglucuron- s~uren und dureh Beeinflussen der t~eaktion dutch st6rende Stoffe auf- t reten kSnnen, dureh entsprechende Magnahmen ausgesehaltet, weit- gehendst vermindert oder bei der Auswertung der lVieBergebnisse ent- spreehend berfieksiehtigt werden.

A us/i~hr ung der Naphthoresorcin- Reaktion. Reagenzien: 1. Naph~horesoreinl6sung 0,2%ig: 0,2 g Naphthoresorcin werden

in 100 ml H20 durch kr~ftiges Schtit~eln gelSst. In die klare LSsung wird 1 Std Sauerstoff eingeleitet (3--5 Blasen je see). Nach 24 Std lange m Stehen in ver- schlossenem Gef~g bei l~aumtemperatur wird der I~[bersehuB yon Sauerstoff dutch Einleiten yon Stickstoff in gleieher Weise entfernt (3--5 Blasen je sec, 1 Std lang). Dutch Aufbewahren im Eisschrank isg die ReagenslSsung l~ngere Zeit hMtbar.

2. Salzs/~ure, konz. (])1,19) Io. a.; 3. -~ther, DAB 6; 4. Glucuronsgure, reinst.

Best immung yon Glueurons/iure mit tels Naphthoresorcin-Reaktion. 351

Aus/i~hrung: 5 ml einer w/igrigen LSsung unbekann ten Glueurons~uregehaltes (etwa 20--150#g), 5 ml konz. Salzs~ure und 5 ml Naphthoresorein]Ssung Werden in einem versehlossenen l~eagensgef/~g ( 2 0 • mi t Sehliffstopfen) gut ge- mischt und 30 min in efll siedendes Wasserbad gestellt. Darauf wird das Gef/~B 10 rain in Eiswasser gektihlt, ansehliel~end 15 ml eisgekiihlter J~ther zugefiigt und das versehlossene Gef~2 1 rain kr~ftig geschiittelt. Mittels Seheidetriehter wird die w/~Brige Schieht abge t rennt und der gefi~rbte ~therische Auszug durch ein Falten- filter in einen Schiittelzylinder filtriert. Wenn etwa 10 ml Ffltrag aufgefangen sind, wird der Sehfittelzylinder versehlossen und his zur Nessung in Eiswasser gestellt.

Zum Aufstellen der Eiehkurve werden Testl5sungen bekann ten Gluourons~ure- gehaltes (20--100 #g) wie oben besehrieben behandel t . In gleieher Weise wird ein ]31indversueh mit 5 ml destilliertem Wasser ausgeffihrt.

In einem geeigneten S10ektralphotometer werden die Ext inkt ionen der /ithe- risehen Ext rak te bei 565 m # Wellen]~nge gemessen. Nach Abzug des Blindwertes yon den iibrigen Megwerten werden die Extink~ionen der TestlSsungen in ein Diagramm eingetragen. Aus der erha]tenen Eichkurve wird der Glucurons~ure- gehalt der Untersuchungsl6sung entnommen. ]3eim Arbei ten mi t einem PCLFRICi- Photometer (Filter S 57) entf/il]t der Abzug des Blindwertes, da der ]31indversueh a]s Kompensa~ionslSsung dient. Von Untersuehungsl6sungen, deteR Glueuron- s/~uregehalt grSBenordnungsm~Big unbekann t ist, mtissen Verdiinnungsreihen durchgemessen werden, bis die gefundenen Werte dem Verdfinnungsverh/~Itnis ent- sprechen, da Ext inkt ionen von Glueuronsguremengen fiber 200 #g nieht mehr der Konzentra t ion proportional sind.

L i t e r a t u r .

Vgl. K. HEY~S u. G. GgAEFE : Chem. Ber. 86, 646 (1953); weitere Lit. ebenda, ferner C. L. MEtILTRETTER, C. E. RIST, B. H. ALEXANDER U. R. Z. MELLIES: J . Amer. chem. Soc. 73, 2424 (1951). - - 2 MAUGF~AN, G. ]3., K. A. EVELYN U. J. S. L. ]3ROWNE : J. bio]. Chemistry 126, 567 (1938). - - 3 TOLLENS, ]3. : ]3er. dtseh, chem. Ges. 41, 1788 (1908). - - TOLLENS, B. u. F. ROHV]~ : Ber. dtsch, chem. Ges. 41, 1783 (1908); vg]. diese Z. t8 , 657 (1909). - - 4 A~TZ, N. E., u. E. M. OSMAN: ,,Bioche- mistry of Glucuronic Acid", S. 7. Academic Press Publishers, Inc., New York 1950, - - "~ JAI~nlGE, P. : Bull. Soc. Chim. biol. Paris 29, 461 (1947). - - 6 MozoLows~:I, W. : ]3iochemic. J. 34, 823 (1940). - - 7 HErNS, K., u. C. K~Lc~: Chem. Ber. 86, 601 (1953). - - s GARTON, G. A., D. RO~INSO~ u. t%. T. WILLIAMS: Biochemic. J. 45, 65 ( 1 9 4 9 ) . - ~ FLOnKI~, M., R. CRISPER, G. DUO]~ATE~U U. R. HOUET: Enzy- mologia (Amsterdam) 10, 220 (1942). - - ~o HANSON, S. W. F., G. T. MILLS u. R. T. WILLIAMS: Biochemie. J. 38, 274 (1944). - - ~ DoasoN, K. S., G. A. Gxn~oN, A. L. S~UBBS U. R. T. WILLIamS: ]3iochemic. J. 42, 357 (1948). - - ~2 SII'LET, H., S. A. KO~AI~OV u. H. S~Ar: J. biol. Chemistry 176, 545 (1948). - - ~ H u ~ N ~ n , C. F., u. K. P. LI~K: Abstracts of Papers, l l 0 t h Meeting Americaa Chemical Society, Chicago, IlL, 9.--13. Sept. 1946, p. 5 R. - - 1r M~DEL, J . A . , u. C. I~EUBEnG: Bioehem. Z. 13, 148 (1908) ; vgh diese Z. 48, 658 (1909). - - NEVBEn~, C. : Bioehem. Z. 24, 436 ( 1 9 1 0 ) . - NEUBEnG, C., u. S. S ~ E Y O S ~ : Bioehem. Z. 36, 56 (1911); vgl. diese Z. 52, 132 (1913). - - NEUB~n~, C., u. M~n~A K O ~ L : Biochem. Z. 2~3, 435 (1931). - - ~ Qc~c~:, A. J. : J . biol. Chemistry 61, 667 (1924). - - ~ F~SCH~AW, W. H. : J . biol. Chemistry 127, 367 (1938). - - ~ LIPSCHITZ, W. I~., u. E. BUEDING: J . biol. Chemistry 129, 333 (1939). - - ~s NEU~nnc, C., u. O. SCHEW~:~: ]3iochem. Z. 44, 502 (1912); vgl. diese Z. 53, 338 (1914). - - ~ Sc~Ew]~E~, 0 . : ]3iochem. Z. 55, 4 ( 1 9 1 3 ) . - eo SALT, H. ]3. : ]3iochemic. J. 29, 2705 (1935).

Prof. Dr. K. HEYXS, Chemisches Staats inst i tut , Hamburg 36, Jungiusstrai~e.