Aus den Instituten fur Milcherzeugung (Direktor: Prof. Dr. W . Kirsch) und Milchhygiene (Direktor: Prof. Dr. M . Seelemann)

der Bundes-V,ersuchs- und Forschungsanstalt f u r Mikchwirtschaft, Kiel

Uber die Wirkung von Ultraschall auf Kaninchenhoden

v o n

W. KRUGER und S. SCHOLTYSSEK

Mit 8 Abbildsngen

I. Einleitung

Im Rahnien der Untersuchung uber Ultraschalleinflusse auf Kaninchen- spermien konnte SCHOLTYSSEK (2) zeigen, dai3 bei Schalliibertragung auf eine Kiivette mit verdunntem Kaninchensperma eine gewisse Schadigung der Samenzellen zu beobachten war. Durch Festlegung der Letaldosis wurde einc Abhangigkeit von Schallintensitat, Beschallungszeit und Frequenz nachge- wiesen. Die Aufklarung der Schadigungsgrunde ergab eine einwandfreie chemische Urnsetzung in der Spermasuspension, die durch die Warmeentwick- lung, vor allem in den hoheren Intensitatsstufen, beschleunigt wurde. Diese Tatsache der chemischen Umsetzung in der Samenflussigkeit lai3t den Schlufl zu, dai3 die Spermien nicht direkt angegriffen wurden, sondern indirekt eine Schadigung durch die Umstimmung ihres Verdunnungsmediums erfuhren. Um nunmehr einen Versuch einer tdirekten Beeinflussung der Spermien vor- zunehmen, sind die Hoden von Kaninchen direkt beschallt worden. Die Er- gebnisse sollen in der folgenden Arbeit im einzelnen beschrieben werden.

11. Versuchsanordnung

Als Versuchstiere dienten acht Kaninchenrammler, von denen je zwei Wurfgeschwister waren. Ein Tier jedes Geschwisterpaares wurde mit Ultra- schall behandelt, das andere unbehandelt als Kontrolltier gebraucht. Die Schalliibertragung erfolgte bei allen Versuchen mit &em medizinischen US- Gerat durch Quarzschwinger init Vorsatzkopf. Die strahlende Flache betrug 1,3 cnG. Die Leistungsfrequenz- und Zeitangaben sind aus Tabelle 1 zu ent- nehmen.

Wahrend in der Arbeit von GUNSEL und FUCHS ( I ) bei einer Rattcii- hodenbeschallung die Hoden des narkotisierten Tieres in einen mit US durch- setzten Wasserbehalter gehangt wurden, sind die Kaninchenhoden der vor- iiegenden Untersuchungen durch Streichmassage der ventralen Hodenseite behandelt worden. Welcher Hoden jeweils den US-Wellen ausgesetzt wurde, ist obenfalls aus Tabelle I zu entnehmen.

2 f . Tier~i ichtg. u Zuchtgsbiol Bd 62 Heft 1 3

34

Paar

Tier

Frequenz . . . . . . Intensitat ...... tagl. Dauer . . . . Versuchsdauer . . rechter Hoden . . linker Hoden . . .

K R U C E R u n d S C H O L T Y S S E K

1 2 3

A l a I b I c 1000 kHz - 3000 kHz - 3000 kHz -

5,8 Wak 5,5 w a k 595 w a k

3 min 3 min 3 min 14 Tage 14 Tage 14 Tage

+ + i- + + ~

T a b e l l e 1 V e r s u c h s b e d i n g u n g e n

3000 kHz 595 Wak 3 min

14 Tage

-

4

1,3 0,s

1,8 2,o

2,5

0,8 1,4 1,8 2,O 1,6 2,3

1,7 3,5 0,9 329

1,7 2,4 1,9

I

0.5 1,2 2,3 2,4

3,2 4,5 - 6,4

0,O 0,6

- I 4-

0,7 1,8

4,5 2,6

1,2

Die Versuchsperiode erstreclite sich uber 14 Tage. Taglich wurden die entsprechenden Hoden einmal drei Minuten init Ultraschall behandelt. Alle zwei ?'age wurden von den Versuchsrammlern (groi3e Buchstaben) und voii den Kontrollrammlern (kleine Buchstaben) Samenproben entnommen zur Bestimmung von Dichte, pH-Wert, Aufbewahrungszeit und Anzahl der ab- normen Spermien. Auflerdem sind von jeder Samenprobe je zwei Hasinnen besaint worden, um die Fruchtbarkeit des behandelten Spermas und seine Ruckwirkung auf die Nachkonimenschaft (Geschlechtsverhaltnis) festzuhalten. Die Rammler A, C, D wurden nach dem Versuch geschlachtet und ihre Hoden zur histologischen Untersuchung eingebettet, geschnitten und gefarbt. An] Rammler B wurden die Spermaveranderungen nach der Behandlung studiert.

2,O

4,9 -

111. Versuchsergebnisse a) S p e r m a b e f u n d

Bei den laufenden Spermauntersuchungen war die Qualitat des Spermas der behandelten Tiere nicht wesentlich schlechter als das der Kontrolltiere. Alie Samenproben fo1,gten eincr obfallenden Tendenz, was als Folge der haufigen Samenentnahme zu deuten ist. Im einzelnen wurden untersucht:

D i e D i c h t e. Das ist die Anzahl der Spermien in Millionen in einern mm", ausgezahlt in der B i i ~ ~ ~ ~ s c h e n Zahlkammer.

T a b e l l e 2

1. I 3. I 5. I 7. I 9. I 11. I 13. I l5 .Tag l im0 Die Dichte betrug am

Mill./mil13

2,5 2,5

2,o 4,7 3,9 3,6

fur A . . . . . . . . . . . . . . . a . . . . . . . . . . . . . . .

fur B . . . . . . . . . . . . b . . . . . . . . . . . .

fur C . . . . . . . . . . . . . . c ...............

fur D . . . . . . . . . . . . . . . d . . . . . . . . . . . . . .

1,5

0,8 2,7

2,O 2,O I 2 2

1,4 2.2 2,7 1,9 1.1 3, l

Wirkung von Ultraschall auf Kaninchenhoden 35

D e r p H - W e r t anderte sich kaum. Die Ejakulate hatten im Durch- schnitt folgende Werte: A 7,4, a 7,4; B 7 3 , b 7,4; C 7,1, c 7 , l f ; D 7,2, d 7,3 +. Die Kreuze bedeuten, daB 'diese Rammler bei uber 50 O/o ihrer Sprunge den gallertartigen Nachsekretpfropfen mitlieferten.

D i e A u f b e w a h r u n g s z e i t gibt an, wieviel Tage die Spermien bei einer Temperatur von + 5 " C Beweglichkeit zeigen, und zwar ist sowohl eine unverdunnte als auch cine mit Spermasol im Verhaltnis I : 10 verdunntr Probe untersucht worden.

Die Probeh des

hielten sich bei

A unverdiinnt verdunnt

a unverdiinnt verdunnt

B unverdiinnt vcrdunnt

b unverdiinnt verdunnt

C unverdiinnt verdunnt

c unverdunnt verdunnt

D unverdiinnt verdunnt

d unverdunnt verdiinnt

1. 1 3. 1 5. 1 7. 1 9. 1 1 1 . 1 13. 1 1 5 . T a g e s

Tage

0 5 3

4 4

G 6

7 4

2 1

- -

7 1

6 2

1 1

2 1,5

4 4

2 6

6 3

5 3

2 1

5 1

'L

5 5

3 4

'2 3

6 2

4 3

0,5 I

8 2

0 3 1

1 3

4 4

0,5 4

0 3 0,5

1 3

2 2

6 3

G 3

3 3

3 2

3 3

5 2

1 2

0-5 1

1 2

Durch die Zahlen wird das eingangs Gesagte bestatigt. Behandelte und unbehandelte Tiere zeigen nur geringe Unterschiede, obwohl bei einer Gesamt- durchschnittsberechnung aller Versuche die Aufbewahrungszeiten fur die be- handelten Rammler bei 2,5 bzw. 2,1 Tagen liegen und fur die unbehandelten bei 3,1 bzw. 2,9.

Dafi der Ultraschall naturlich doch einen Einflufl auf die Spermiogenese hatte, ist aus den Auszahlungen der abnormen Spermienformen zu ersehen. Dazu geht mail so vor, dai3 von jedem Ejakulat Ausstriche hergestellt unil die geknickten, gerollten und verschlungenen Spermiumschwanze, sowie die abgeplatteten und gequollenen Spermiumkopfe registriert werden. Die Zu- nahme dieser abnorinen Formen war bei allen Tieren etwa gleichmafsig, so dai3 wir nur die Anfangs- und Endwerte anzugeben brauchen.

3'1

36 K R U C E R u n d S C H O L T Y S S E K

N

Wirkung von Ultraschall auf Kaninchenhoden 37

h

n c 3

00

n n c

,

a

38 K R U C E R u n d S C H O L T Y S S E K

am am ersten Tag letzten Tag

Es lieferte abnorme Spermien

Rammler A 4 11 a 4 5

Rammlcr B 3 I0 b 2 5

T a b e l l e 4

Es lieferte am

abnorme ersten Tag Spermien

Rammler C 6 C 4

Rammler D 4 d 7

am letzten Tag

12 6

13 7

In den Abbildungen 1 bis 8 sind Ausstriche des letzten Versuchstages festgehalten worden, die bei den behandelten Tieren nicht nur abnorine Spermienfornien zeigen, sondern auch ein durch Sekretteilchen verschmutztes und vie1 unsaubereres Spermabild als bei den unbehandelten Rammlern.

Vom Rammler B sind nach dem Versuch noch weitcre Samenproben ge- n3inmen worden. Sie zeigen eine deutliche Besserung im Sperinabefund uiid dainit eine wahrscheinliche Regeneration der US-Schadigung.

T a b r l l e 5

B lieferte am

Samen rnit einer Dichte von

Samen mit einer Aufbewah- rungszeit von (unverdiinnt)

Samen rnit einer Aufbewah- rungszeit van (verdiinnt) .

Sarnen mit abnormen Spermien von . . . . . . . . . .

13. Versuchstage 7. Tage nach dem Versuch

13. Tage nach dem Versuch

4,5 (3,6) Mill./mm3

5 ( 3 ) Tagen

3 c2) Tagen

5 (4) Stiick Die Klammern geben die Werte fur das Koncrolltier b an.

b) F r u c h t b a r k e i t u n d G e s c h 1 e c h t 5 v e r h a 1 t n i s

Fruchtbarkeit uiid Geschlcchtsverhaltnis der Nachkommenschaft sind nur bei den Rammlern B, C uiid D und ihren Wurfbrudern untersucht worden, u-eil sie einheitlich rnit einer Frequenz behandelt wurden. Aus den aufge- fuhrten Werten ist ohne weiteres zu ersehen, dafs die US-Behandlung eine Einbufse in der Fruchtbarkeit mit sich gebracht hat (Tabelle 6). Vergleicht nian die Fruchtbarkeitswerte insgesamt, so sind von den behandelten Ramm- lern

von 40 Hasinncn 23 fruditbar geworden, das ist eine 57,5 Oloige Frucht-

von 36 Hasinnen 26, das ist eine 72,2 O/oige Fruchtbarkeit.

Die Festlegung und Beobachtung des Geschlechtsverhaltnisses kann iiur als 'T'estversuch angesehen werden, weil das Material nicht grofs genug ist, urn endgultige Schlusse daraus zu ziehen. Die Nachkommenschaft der 23 fruchtbaren Hasinnen der Versuchsraminlcr bestand aus 75 mannlichen und 57 weiblichen Tieren, die 26 Hasinnen der Kontrollrammler warfen 129

barkeit, uiid von den Kontrolltieren

Wirkung von Ultraschall auf Kaninchenhoden 39

Tiere, davon 63 mannlich und 66 weiblich. Obwohl eine kleine Verschiebung nach der mannlichen Seite abzulesen ist, vor allem, wenn man 'die Nachkom- inenshaft der einseitig hodenbeschallten Tiere C und D betrachtet, so sind die Differenzen zwischen Versuchs- und Kontrolltieren zufallig zustaiide gekonimen; das beweist die statistische Beurteiluiig nach WEBER ( 3 ) .

Fur alle Versuchstiere betragt D") = 9O/o, OD = 6O/o, fur die Tiere von C betragt D ) = 24O/o, aD = 12 O/o, fur die Tiere von D betragt D':.) = 9 O / o .

Bei statistischer Sicherheit hatten die Werte fur D iiber 3aD liegen mus-

9 O/o, aD =

sen, also bei 18 bzw. 36 und 27 O/o.

T a b c l l e 6 F r u c h t b a r k e i t u n d G e s c h l e c h t s v e r h a l t n i s

Insgesamt: Vcrsuchsrammlcr: 132 Nachkommen, davon 75 mannl. 57 weibl. Kontrollrammler: 129 63 66 ,,

Erklarung: Beispicl ,,+ 9 5 : 4" bedcutet, dafi die besamte H i s i n fruchtbar war (bei Un- fruchtbarkeit steht cin , , - ' I ) , 9 Jungticrc gcworfen hat, davon 5 mlnnlich, 4 wciblich.

Annicrkend sei noch fdgende Feststellung betreffs der Gewichtszahlen der Nachkommenschaft angefugt, die auch die Beobachtung von SCHOLTYSSI. h (2) bcstatigt, dafi nainlich nach US-Behandlung die Wurf- und Jungtier- gewichte verringert und die Wurfe selbst unausgeglichener sind (vgl. T a - belle 7).

") = Diffcrenz.

40 K R U C E R u n d S C H O L T Y S S E K

T a b e l l e 7 G e w i c h t s - u n d G r o n e n z a h l e n d e r N a c h k o m m e n

Versuch

B beiderseitig . . . .

b Kontrolltier . . . . .

C rechtsseitig . . . . ,

c Kontrolltier . . . .

D linksseitig . , . . .

d Kontrolltier . .

Zahl der Nach-

kommen

44

41

33

38

55

50

~

Zahl der Wurfe

Vurfgewicht in g

372 74 - 548

31 2 217 -- 367

270 195 - 380

292 250 - 410

324 140 - 610

380 255 - 415

Gewicht pro Tier

in g

59 35 - 75

69 4 5 - 82

57 45 - 75

69 52 - 73

5 3 15 - 75

61 45 75

c) A n a t o m i s c h e u n d h i s t o l o g i s c h e H o d e n u n t e r - s u c h u n g

Bei der Totung, die bei lden Tieren A, C, D am Tage der letzten Be- schallung vorgenommen wurde, zeigten sich keinerlei makroskopisch erkenn- bare Veranderungen an den Hoden. Die Hoden wurden unmitttelbar nadi der Totung in 10 O/oige Formalinlosung eingelegt und nach ihrer Fixierung in Paraffin uberfuhrt. Die Farbung der Schnitte erfolgte bei den Tieren C und D ausschliei3lich mit Haemalaun-Eosin. Die Hodcnschnitte des Tieres A wurdeii ebenfalls zum groi3en Teil mit Haemalaun-Eosin gefarbt, an einem anderen Teil der Schnitte hat Herr Dr. K a r r as :>) einige von ihm ausgearbeitete Spezialfarbungen vorgenommen, die eine bessere Erkennung des Reifezu- standes der Spermien gestatten.

Untersuchungen iiber die durch Ultraschall an Hoden erzeugten Ver- anderungen liegen von GUNSEL und FUCHS (1) vor. Sie betreffen Rattenhoden. Die Veranderungen waren bei diesen Untersuchungen nicht gleichmaflig uber dsen ganzen Hoden verteilt. Es fanden sich zwischen veranderten stets auch ganz normale, unveranderte Hodenschlauche. Weiter zeigte sich, dai3 eine Verstarkung der Dosis oder eine langere Ausdehnung der Behandlung keines- wegs stets eine Verstarkung der Veranderungen zur Folge hatte, woraus geschlossen wird, dai3 die individuelle Empfindlichkeit fur die Hodenbeschal- lung, wie alle anderen biologischen Merkmale, erheblich variiert. Im ubrigeii zeigten die Veranderungen etwa das gleiche Bild wie bei der einfachen Hoden- atrophie, d. h. einen successiven Untergang der Zellen in der Reihenfolge des Ausreifungsgrades. Die basalen Zellen blieben am langsten erhalten. Die in Teilung begriffenen Spermiozyten erwiesen sich als wenig empfindlidl gegen das Trauma. D a Teile des Muttergewebes immer erhalten blieben und die Vermehrungsfahigkeit der uberlebenden Zellen nicht beeintrachtigt zu

'>) Herrn Dr. KARRAS, Tierseuchenamt Neumunster, danken wir ergebenst fur die angefertigten Farbungen.

Wirkung von Ultraschall auf Kaninchenhoden 41

werden pflegt, nehmen GUNSEL und FUCHS (1) an, dafi mit einer volligeii Regeneration des Keimepithels gerechnet werden kann.

Bei den vorliegenden eigenen Untersuchungen wurden Veranderungen von der Schwere, wie GUNSEL und FUCHS sie an Rattenhoden beobachteten, (Triimmerzonen) nicht festgestellt. Erkennbar war jedoch auch bei unseren Versuchen eine Auflockerung des Gefiiges der Sertolizellen, in deren syn- cytialem Protoplasma die Bildungsvorstufen der Samenzellen eingebettet sind. Kugelformige Absprengungen dieses Protoplasmas wurden in verhaltnis- mafiig groflem Ausmafl ;m freien Lumen der Samenkanalchen beobachtet. Daneben waren in einzelnen Hodenkanalchen nicht nur die Samenzellen vor- zeitig abgestofien wordcn, sondern auch noch nicht ausgereifte Spermiden, eventuell sogar Praspermiden wurden im Lumen angetroffen. Die Wand der Hodenkanalchen erschien infolgedessen verdiinnt, doch ging dies nie so weit, dai3, wie GUNSEL und FUCHS beobachteten, nur noch die Spermiogonien neben den Kernen der Sertolizellen als einziger Wandbelag der Hoden- kanalchen iibriggeblieben waren.

Die beschriebenen Veranderungen betrafen niemals alle Hodenkanalchen und auch nebeneinanderliegende nicht in gleicher Starke. Eine etwas ver- starkte Veranderung der Kanalchenstruktur an der ventralen Hodenflache, die der Beschallung in erster Linie ausgesetzt war, konnte iiicht beobachtet werden. Bei den Tieren C und D, die nur einseitig behandelt worden waren, schien selbst der nicht beschallte Hoden nicht ganz frei von Veranderungen, wenn auch die groi3ere Ausdehnung der Veranderungen beim beschallten Hoden unverkennbar war.

Insbesondere an Hand der von Herrn Dr. K a r r a s nach seiner Spezial- methode gefarbten Praparate 1ai3t sich iiber die Spermien folgendes sagen: die Spermien scheinen nur in bestimmten Reifungsgraden beschadigt zu sein, was aus den verschiedenen Farbintensitaten abgelesen werden kann. Die Spermienansammlung in den Kanalchen ist sehr unregelmaflig, ihre Lage ungeordneter und ihre Zahl geringer als im unbehandelten Hoden.

Die Veranderungen deuten demnach hin auf eine Beschleunigung der Spermienabstofiungen von der Hodenkanalchenwand durch den Ultraschall, wobei auch unreife Spermien und Spermiden, eventuell sogar Praspermiden und Teile des Syncytiums der Sertolizellen in grolSerer Meilge als normal und vorzeitig den Weg ins Hodenlumen finden. Daneben scheint auch der Abtransport der im Lumen der Hodenkanalchen befindlichen Zellelemente in Richtung auf das Rete testis und den Nebenhodenkanal durch den Ultra- schall beschleunigt zu werden. Dafi die Spermiogonien in ihrem Teilungs- vermogen durch den Ultraschall beeinflufit werden, ist auch nach unseren Befunden nicht wahrscheinlich.

Zusammenfassung

An vier Kaninchenrammlern wurde untersucht, inwieweit sich eine Ultra- schallbehandlung der Hoden auf das Spermabild, die Nachkommenschaft und das Keimgewebe auswirkt.

Bei den angewandten Schallindikationeil (Frequenz 1000 und 3000 kHz, Intensitat 5,s bzw. 5,5 Watt,k) zeigte das Spermabild eine Verschlechterung hinsichtlich der Dichte, der Aufbewahrungszeit und der Anzahl von abnormeri Spermienformen.

42 KRUGER u. SCHOLTYSSEK, Wirkung von Ultraschall auf Kaninchenhoden

An der Nachkommenschaft konnte das Geschlechtsverhaltnis nicht be- einflui3t werden, wahrend sich die Fruchtbarkeitsrate von 72 O / o bei den Kon- trolltieren auf 57 O / o bei den Versuchstieren verschlechterte. Bcei den histolo- gischen Untersuchungen war nach der Beschallung eine beschleunigte Ab- stoflung der Spermien wie auch der Spermidcn ins Lumen der Hodenkanalchen zu erkennen. Die Schadigung durch ,die Ultraschallbehandlung war sehr un- regelmaflig.

Literaturverzeichnis

1. GUNSEL, E. und FIJCHS, H. K.: Uber die Wirkung des Ultraschalls auf den Rattenhoden. Strahlentherapie 79, 261-270, 1949.

Untersuchungen iiber die Behandlung von Kaninchensperma mit Ultra- schall und die Auswirkung auf die Nachkornrnenschaft (Geschlechtsverhaltnis, Ge- wichts- und GroRenunterschiede). 2. f . Tierzuchtung u. Ziichtungsbiologie 61, 61, 1953.

3. WEBER, E: Die rnathernatisch-statistische Beurteilung von Behandlungserfolgen. Aus: Wissenschaftliche Arbeiten der Jahre 1945-1950 der Vet.-Anstalt der Friedrich- Schiller-Universitat von V. GOERTTLER, Jena 1950.

2. SCHOLTYSSEK S.: