460 Bericht: Spezielle analytische Methoden Bd. 198

20 g reines Coffein, 30 g Na-Benzoat und 50 g krist. Na-Aeetat werden in Wasser unter Erwarmung gelSst und mit dest. Wasser auf 400 ml aufgefiillt; 2. Diazo- reagens. (I) 5 g Suffanilsaure werden in wenig dest. Wasser gelSst, mit 15 ml konz. Salzs/~ure versetzt und mit H20 auf 1 1 aufgefiillt; II . 0,5~ NaN02-LSsung, dunkel un4 kiil~ aufbewahrt. Vor der Reaktion werden 10 ml (I) und 0,5 ml (II) gemischt.

Lab. Delo 8, Nr. 2, 19--21 (1962) [l~ussisch]. -- z J~N])~ASSlK, L., u. ~. A. CLErmont: Biochem. Z. 289, 1 (1936); J ~ s s m , L., u. P. GR6F: Biochem. Z. 296, 71 (1938); vgl. diese Z. 110, 382 (1937); 118, 159 (1939/40). P. I-Ix~s

Nueleinsiiurespaltprodukte hat R. I t . HALL I an Kiesclgurs/~ulen mit organi- schen LSsungsmitteln getrennt. Als Ausgangsmaterial wird Aseites-Tumor der Maus verwendet und hicraus nach K. S. Kn~nY 2 sowie E. KAY, N. S. S ~ r o ~ s und A. DovxcE a Desoxyribonucleins~ure (DNA) gewonnen. DNA wird naeh I. WALKEX~ und G. BUTLER ~ enzymatisch hydrolysiert. Zur Trennung der Desoxynucleoside Thymidin, Desoxyadenosin, Desoxyguanosin und Desoxycytidin wird das zweiphasige Gemisch Athylucetat-2-~thoxy~thanol-2~ w~gr. Ameisens~ure (4:1:2) ver- wendet. 50 g Celite 545 werden mit 22 ml der unteren Phase in eine S~u]e yon 1,9 cm ;~ geffillt. 0,6 g des lyophilisierten Hydrolysats yon DNA werden in 5 m] der unteren Phase gelSst und zentrifugiert. Der D~berstancl wird mit 11 g Celite 545 gemischt und auf die Siiulenfiillung gegeben. Die S~ule wird dann mit der oberen Phase mit einer Geschwindigkeit yon 60 ml/Std eluiert. Das Eluat wird in der Durchflul3zelle eines Spektralphotometers bei 270 nm gepriift und entspreehend fraktioniert. -- Die t~ibonucleoside aus menschlicher Leber nach K. S. I~i~mr5 werden mit dem Gemiseh Athylacetat-2-~thoxy~thanol-2,5~ w~Br. Ameisens~ure (4:1:2) ge- trennt. 110 g einer Mischung yon Celite 545 und Microeel E (9:1) werclen mit 55 ml unterer Phase in eine S~ule geffillt. 4,25 g lyophilisiertes I-Iydrolysat warden in 16 ml der unteren Phase gelSst und zentrffugiert. Der Uberstand wird mit 30 g Celite 545-Mieroce] E-Gemisch (9:1) verrfihrt und auf die S~ulenfiillung gegeben. Dann wird mit der oberen Phase eluiert, bis nach etwa 175 ml A4ertosin ausgetreten ist. lgur~ wird die Elution fortgesetzt mit tier oberert Phase der Mischung n-Butanol- Jkthylacetat-Wasser (1: t : 1). -- Die ]reien Basen der Nucleinsauren werden mit dem Gemisch ~thylacetat-2-]~thoxy~thanol-10~ w~gr. Ameisens~ure (~:1:2) ge- trennt. 50 g Celite-Microcel E (9 : 1) werden mit 28 ml der unteren Phase in eine S~ule yon 1,9 cm ~ geffillt. Eine Mischung yon je 5 mg der freien Basen (Guanha nur 2 rag) wird in 2 ml der unteren Phase gel6st und zentrifugiert. Der ~Jberstan4 wird mit 4 g S/~ulenffillung gemischt und auf die S~ule gebracht. Die Ss wird mit einer L6sung mit abnehmender Ameisensi~urekonzentration eluiert (200 ml der oberen Phase, in die 200 ml vom Gemisch ]~thylacetat-2-Athoxy~thanol [4:1!. einfliegen). AnsehlieBen4 wird mit der oberen Phase der Mischung n-Butanol-Athylacetat- Wasser (1 : 1 : 1) eluiert.

J. biol. Chemistry 237, 2283--2288 (1962). Dept. Exp. Therapeutics, l~oswell Park Memorial Inst., Buffalo 3, New York. (USA). -- 2 Biochim. biophysiea Aeta 86, 117 (1959). - - ~ J. Amer. chem. Soc. 74, 1724 (1952). - - ~ Canad. J. Chemistry 84, 1168 (1956). -- ~ Biochim. biophysica Aeta 40, 193 (1960). A. N I ] ~ A ~

~ber eine ~[ethode zur Trennung der Nueleinsiiuren in Aseiteszellen yon Ehrlieh-Careinom berichtcn L. S. M _ m ' ~ und I. B. ZB~SKtJ 1. Die Trennung yon Desoxyribonueleins~ure (DNS) und l~ibonucleinshure (t~NS) yon Asciteszellen n~ch M. OGu~ und G. R o s ~ 2 wurde nachgeprfift, Nach verschiedenen Methoden erhaltene Resultate der Nucleins~iurcbestimmung wurden mit den Ergebnissen ver- glichen, die nach Einfiihrung yon radioaktiv markierten Vorstufen in verschiedene

1963 4. AnMyse yon biologisehem Material 461

Nueleins&urefraktionen bei versehiedenen Reinigungsmethoden yon DNS erha.lten wurden. - - 1. Nucleinsiiurebestimmung. In 4--5 Parallelanalysen wurden Aseites- zellen am 7. Tag naeh i~berimpfung abzentrifugiert, 3 mal mit 0,06 m Phosphat- puffer (pH 7,4) gewasehen und in 0,14 m Natriumehloridl6sung suspendiert. Aus der Suspension wurden 5 ml-Proben entnommen und entweder in der K~ilte mit 5~ Triehloressigs&ure zur Trennung der Nucleins~iure naeh G. Sca3~I])T und S. J. T~SrKAUSER a oder mit iibersehiissigem Alkohol zur Nueleins~urenbestim- mung naeh 0Gv~ und I~OSESr (1. e.) behandelt. Die Entfernung der s~urel6sliehen Verbindungeu und der Lipide some die Trennung der Nueleins~uren naeh SCtr~IDT und T m ~ m ~ r s E ~ warden wie iiblieh ausgefiihr~. RNS wurde naeh V. V. ME~- B~g~ ~ bestimmt, DNS naeh J. M. WEBB und I-L B. L~vY 5. Aliquote Proben der mit J~thanol gef/tllten Aseiteszellen warden 3 real mit ~_thanol, 1 real mit J~ghanol- Ather extrahiert uud bei 0--4~ in J~thanol aufbewahrt. Die Proben wurden mit 0,3 n-Perehlors~ure unter Kiihlung homogenisiert, 3mal mit 0,3 n-Perehlorsiiure gewasehen und mit n-Perehlors~m'e unter gelegentliehem Aufsehiitteln 18 Std bei 0--2~ exgrahiert (OGv~ lind I~OSEX). Dann wurde zentrifugiert und mit wenig Wasser gewasehen, t~berstand und Wasehw~sser wurden vereinigt und zur ~arke aufgefiillt (l~raktion ~NS-A). Der Rest des Gewebes wurde mit n-Kalilauge bei 37~ 18 Std hydrolysiert und die Trennung von DNS und I~NS dutch Neutralisation und Ans~uern tier L6sung bewirkt (Scm~IDT und T~AN~KXVS~). Der i-lberstand naeh Zentrifugieren yon DiNS in der KMte enthielt die Fraktion I~NS-B. Darin wurde aueh der DNS-Gehalg bestimmt. - - 2. Best immung radiocdctiv marl~ierter VorstuJen in verschiedenen 2gucleins~iure/ralctionen. Die Aseitesfliissigkei~ wurde mit Na~II~P0~ oder mit ~C-l~ormiat (10--15 #Curie/ml) versetz~ un4 1 Std bei 37 ~ C unger st&ndigem Misehen bebriitet. Dann wurden die Zellen 3 real mit Phosphat- puffer gewasehen, darin suspendiert und Aliquota wie folgt naeh a), b) oder e) verarbeitet: a) S~urel6sliehe Verbindungen und Lipide warden naeh Som-um~ und T ~ a U S E ~ getrennt. -- b) Lipide und s~urel6sliehe Verbindungen wurden naeh O~v~ und ROSE~r entfernt. I~NS wurde mi~ n-Perehlors~ure in der K~lte extrahiert (siehe oben): Man erhielt die Fraktion RNS-A, beha~ndelge den I~est des Gewebes naeh Scm~mT und T ~ K A V S E ~ und sehied die Fraktionen RNS-B und DNS ab. Da hierbei nut ein Drittel der DNS gef~llt wird, bleibt der Rest bei RNS-B. Die Hydrolysate yon RNS wurden naeh l~einigung der t~ibonueleotide mit Aktivkohle ~ zur Bestimmung der l~adioaktivit&t verwendet. Der entstandene Niedersehlag wurde mit ges~tt. NatriumbiearbonatlSsung behandelt und mit 10% iger Natrium- ehloridl6sung bei 90~ extrahiert. Die Natriumehloridl6sung wurde mit nieht- radioaktiver l~ K~I-IP0t- oder l~ Natriumformiatl6sm~g versetzt, um freies Formiat-~C oder Na~I-Ia~P0~ zu entfernen. Die so extrahierte DINS wurde mit Alkohol gef~llt, in Wasser gelSst mud mit heigem Phenol bei p~ 8,3 behandel~. Naeh Zentrifugieren wurde der Uberstand mit _&ther gewasehen; DNS wurde mit ~Mkohol gef~llt, 3real mit 0,5 n-Kalilauge behandelt, noehmals mit 5~ Tri- ehloressigsS~ure gef/~llt, mit Alkohol und J~gher gewasehert, im Exsieeator getroeknet und in Alkohol-Ammoniak geRist; in letzterer L6sung wurde die spezifisehe l~adioaktivit/it bestimmt. -- e) Dutch 3malige Behandlung der Aseiteszellen mit einem Gemiseh yon Phenol (p~ 6,0) und 0,14 m-Natriumehloridl6sung (GEo~elEV, t~iI~'N~, 1. e.) wurden hoehpolymere und niediqg-polymere I~NS (,,HP-I~NS" und ,,NP-I~NS") abgesehieden. Der phenolunl6sliehe Gewebsrest ~urde mit heiger 10~ Natriumehloridl6sung extrahiert, wobei DNS und die bei der Phenol- behandlung nicht extrahierte !gNS-Fraktion (NE-I~NS) abgetrermt WUl'den. Der Auszug wurde Mederholt mit Phenol wie oben beh~ndelt, die Nueleins~iuren wurden mit Alkohol, darm mit 5~/0iger Triehloressigs~ure gef&llt. DNS und I~NS warden naeh Scmvrn)~ und T]~N-i~rSE~ getrennt und wie oben gereinigt. -- Die Behandlung

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462 Bericht: Spezielle analytisehe Methoden Bd. 198

yon Aseiteszellen nach Oou~ und R o s ~ ffihrt zu keiner befriedigenden Fraktio- nierung. Die Verfahren yon O~v~ und R o s ~ einerseits und yon SCH~DT und T H n ~ - ] ~ U S ~ andererseits ergeben gleiehe Resultate, wena sie dutch Einffihrung yon a~P und ~tC-Formiat in die RNS gepriift werden. Einschlu~ yon a~P und ~*C-Formiat in Ehrlich-Carcinom-Asciteszellen in vitro ffihr$ zu Werten, die denen fiir HP-RNS nahestehen, demnach zu niedrigeren als fiir Gesamt-RNS. Die Phenolmethode erlaubt eine gleichzeitige Trennung yon drei RNS-Fraktionen yon verschiedener Stoffwechselaktivit~.

Vop. reed. Chim. 8, 412--417 (1962) [Russiseh]. (Mit engl. Zus.fass.) ,,A. N. S]~v]~RCOV"-Inst. f. Tiermorphologie der Akad. d. Wiss. d. Sowjetunion, Moskau. --

Arch. Bioehem. 25, 262 (1950). -- a J. biol. Chem. 161, 83 (1945); diese Z. 166, 208 (1959). -- a Biochimija 10, No. 4, 353 (1945). -- ~ J. biol. Chem. 213, 107 (1955); vgl. diese Z. 169, 305 (1959). - - ~ GEORGIEV, G. P., u. V. L. ~V~ANT'JEV• Biochimija 31, ~o . 1, 165 (1961); M m ' ~ , L. S.: Vop. reed. Chim. 7, No. 2, 212 (1961); Biochimija 8], No. 6, 1082 (1961). P. H ~ s

S~iureliisliche Nucleotide aus Gewebeextrakten trennt H.M. K L o u w ~ 1 mit Hilfe der Hochspannungsele]ctrophorese. Hierzu werden die Gewebeteile mit kalter 2~ Perchlors~ure homogenisiert. Die Extrakte werden mit 6 n Kalilauge neutralisiert, dureh Zentrifugieren vom Kalinmperchlorat befrei~, ]yophilisiert un4 in wenig Wasser aufgenommen (0,1 ml je 100 mg Ausgangsmaterial). In manchen FMlen ist es vorteilhaft, die LSsungen nach der Neutralisation fiber Aktivkohle zu geben ~ und die Nucleotide mit 50~ Athano], das 1~ Ammoniak enthglt, zu eluieren. Es folgt die Gefriertrocknung. Die Elektrophorese wird nach RYL~ 3 auf Whatman-Papier Nr. 1, das vorher mit 1 n Salzs~ure und Wasser gewaschen wurde, bei 2000 Volt in 1 Std ausgeffihrt. Der Puffer vom p~ 3,6 enth~lt 10 ml Pyridin und 100 ml Eisessig in 1 1. Die Nucleotide werden im UV-Licht auf Photopapier lokali- siert, nachdem alle Pyridinspuren dm'ch 15 rain Waschen in Athylacetat entfernt worden sind. Die entsprechenden Zonen werden ausgesclmitten, mit Wasser eluiert, die Extinktionen bei 260 nm gemessen und die Basenin den Nucleotiden nach W:~ATT ~ bestimmt.

1 j . Chromatogr. (Amsterdam) 7, 216--222 (1962). Radiobiol. Inst., Org. Health Res. T.N.O., Rijswijk, Z .H . (Niederlande). -- 2 VAN ]~EY~VM, D. W.: Biochim. biophysica Acta (Amsterdam) 25, 487 (1957). -- a ~YL~, A. P., F. S A ~ ( ~ , L. P. S~IT~ and R. KIT~I: Biochemic. J . 60, 541 (1955). -- a WrATT, G. R., and S. S. C o ~ : Bioehemic. J . 55, 774 (1953). - - WYATT, G. 1~.: Biochemic. J . 48, 584 (1951). A. N I E ~

Diinnschichtchromatographie yon Nucleotiden auf Cellulose-Ionen- austauscherschiehten. Nachdem vor kurzem yon K. ~:~A~D]~RAT]:[ 1 aUf ECTEOLA- Celluloseschichten Nucleinsi~urederivate dfinnschicht-chromatographisch getrennt werdenkonnten, berichtet K. I~AND~ATH~in tier vorliegendenArbeit tiber Nucleotid- trennungen. Zur Herstellung der Sorptionsschicht werden 10,0 g ECTEOLA- oder DEAE-Cellulosepulver mit 60--70 ml dest. Wasser 30--45 see lung kraftig durch- geschiittelt. ~ach der Stah]schen Standardmethode lassen sich die 100 • 200 mm groi~en Platten beschichten. Wahrend tier Nacht werden sie bei Raumtemperatur getrocknet. Auf die zuvor markierten Startpunkte werden 10 -a bis 10 -1/~Mol mit einer ~r aufgetragen. In einem offenen Becher wird mit verd. Salzsaure als Flie•mittel chromatographiert. Vollstandig getrennt werden innerhalb yon 60--100 rain ATP, GTP und UTP oder CTP, GTP und UTP mi~ 0,04 n Salzsaure. Die Nucleosiddiphosphate und -triphosphate lassen sich ebenfalls gut trennen. Mit