Jg. 31, Heft 25/26 GEOt~O B~CXEI% F~zCz BoDe und W ~ s ~ SC~ADs.: Uber Lipopeptide des Blutes und Gewebes. 593 L Juh 1953

Zusatz yon bestimmten Glucosemengen zum Blur gemacht. Die erzielten Resnltate sind in Tabelle 2 wiedergegeben.

Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, wird die dem Blur zugesetzte Glucose im enteiweil?ten Fi l t rat quanti tat iv wiedergefunden.

VI. Vorsichtsmaflregeln in der Teehnik. Das Elektrophotometer ist an und fiir sich sine

bei der selbst geringe subtile Messungsapparatur, Sehwankungen der elek- trischen Spannung wgh- rend der Extinktions- messung sehon einige Megfehler verursachen, so d ig wir bei der ~{es- sung der Extinktion im Elektrophotometer sorg- f~ltig auf solehe Sehwan- kung aufpassen und vor jeder Ablesung dis Span- nung genau auf 100 Volt einstellen.

Sonstige Vorsichts- magnahmen, vor Mlem die strenge Einhaltung der Reaktionstempera- tur und der l~eaktions- zeit, haben wit bereits eingehend erwahnt.

einen leichten Stich ins Gelbblaue zeigt. Die Be- nutzung einer solehen Ware ist unstatthaft.

Geschickte Pipettierung, besonders bei Zugabe yon Natriumsulfit- und SublimatlSsung, ist aueh yon groBem Belang. Empfehlenswert ist noeh, die 10 em a NatriumsulfitlSsung auf alle F/~lle in etwa 25 see ganz sehnell auszupipettieren. Ferner ist noeh darauf zu aehten, dag bei Zugabe yon 6 n-NaOH dis Kolben- wand mit der Spitze der laugehaltigen Pipette nieht in Beriihrung kommt.

Enteiweil3ung

J31utfilgrat

Glucose (1 Mol)

Harnstoff Harns~ure Kreatinin Glutathion Thionein Aminosauren Ammoniak BTS Milehs~ure Essigs~ure Glueurons~ure AseorbinsSmre

I. Stufe

HJ04 + tl~SO,

H-CHO (I Mol)

,tI.COOI-I (5 Mol) (HJOa)

PH 0,7 20 rain

bei 250 C

Tabelle 3.

II. Stufe

Na~SO~

II.CHO (1 ~{ol)

IIJO~-~HJO~

(H J) PH 6,6 5 rain

bei 250 C

I I I , Strafe I

tIgCI2 +NaO 5g 1

H . ~ ( I ~ o l ) I (Na2SQ) t

ttgO --+ I Hg * Photometric Pu 13,2 bei t~aum- 5 rain temperatur

bei 250 C 5--50 rain

Als Reagentien daft man nur ehemiseh reine Sub- stanzen verwenden, da allergeringste Spuren von farberzeugenden Stoffen in LSsnngen die genauen Messungen erheblich st6ren. 5{an mug daher l~ea- gentien bester Qua lit~t beziehen. Wit verwendeten beispielsweise Natrium hydroxydatum yon E. 2vferek- Darmstadt pro anatysi (Nr. 6498). Falls ein R~eagens (z. B. NaOI-I) yon einer anderen Firma aufs neue bezogen wurde, haben wir jedesmal eine neue Eieh- knrve hergestetlt. Es gibt aueh manehmM Natrium- hydroxyd, dis beim Ansatz der Reaktion mit Sublimat

VII. Zusammenfassung und Sehlul~folgerung.

Uns ist es erst, malig gelungen, den Blutzuckerwert nieht auf die allgemein iibliehe I~reise unter Benutzung der reduzierenden Eigenseha.ften des Zuckes, sondern auf einem ganz besonders originellen Wege dureh Per~odatoxydation der ZuckerstoHe exakt zu bestimmen. Zur Erleichterung des Uberblickes iiber die neue Blutzuekerbestimmungsmethode nach TAKATA-TAxA- I~ASUI wird der Reaktionsmechanismu8 sehematisch wiedergegeben (Tabelle 3).

UBER LIPOPEPTIDE DES BLUTES UND GEWEBES. Von

GEORG BECKER, FRITZ BODE u n d W E R N E R SCHRADE. Aus der I. )Iedizinischen Universit~tsklinik Frankfurt a. M. (Direktor: Prof. Dr. F. HOFF).

Ein gemeinsames Merkmal der versehiedenen Fette und Lipoide ist ihre L6sliehkeit in bestimmten organi- schen L6sungsmitteln. So ist auch bei Blur und Ge- webe die Zugeh6rigkeit einer Substanz zu den Fet ten oder Lipoiden dureh ihre eharakteristisehe Beziehung zu FettlSsungsmitteln gegeben. Die Zusammensetzung der mit solchen LSsungsmittetn gewonnenen Serum- oder Organextrakte erseheint weitgehend gekIgrt, man ei~varget niehts anderes als Neutralfette, Sterine, Phosphatide, zuekerhMtige Lipoide und Lipochrome. Es ist allerdings aueh bekannt, d ig diese versehiedenen Stoffe im Blute und aueh im Gewebe tatsgehlich nu t zum Tell in freier Form enthalten sind, vielmehr eine Koppelung mit Proteinen eingehen kSnnen. Diese Verbindung wird jedoch (lurch die iibliche prepara- tive Darstellung gelSst; die Extrakte sind daher eiweil3frei.

Klinische Wochenschrift, 31. Jahrg.

Unterzieht man nun Lipoidextrakte einer papier- ehrom~tographisehen Untersuchung, so ergeben sieh bezfiglich ihrer Zusammensetzung Befunde, die mit unseren bisherigen Kenntnissen in Widerspruch stehen. Hieriiber soll im fotgenden beriehtet werden.

Wir stellten aus menschlichem Blutserum oder aus gefriergetroekneten tierisehen Organen (mit Ausnahme yon Gehirn) in der fibliehen Weise mit heil3em Alkohol- Xther (3:1) Extrakte her (1), die wiederum in Chloro- form (2) oder Xther (3) oder Petrolgther (4) oder Benzol (5) aufgenommen ~rden. Diese verschiedenen Lipoidextrakte wurden auf Schteicher- und Sch/ill- papier 2043b aufgetragen und in Eisessig (1%) - - Wasser (1% ) - - 5{ethanol (98 % ) eindimensional chro- matographiert. Nach dem Troeknen der Chromato- gramme erfolgte Bestimmung mit einer 1/2%igen L6- sung yon Ninhydrin in wassergesgttigtem Butanol und

38a

594 G~o~a B~cx~, Fai~z BoD~ und W ~ t ~ Scm~aD~: ~ber Lipopeptide des Blutes und Gewebes. Klinisehe Woehenschrif~

Entwieklung der Farbreaktion in der W~rme. Dabei ergab sich die zweifellos iiberraschende Tatsache, dab simtliche Fe~textrakte ninhydrinpositive Substanzen cnthielten (Abb. 1).

Da AminosBuren nnd Peptide in den angefiihrten FettlSsnngsmitteln unlSsbar sind, ist ihre Amvesen-

0 0 0 g O % 0 0 0 0 o

e ~ a

1 2 G 3

0 @ 0 @

o

5

Abb. 1. Chromatogramme volI Llpoidextrakten, die mit versehiedenen LSsungsmitieln arts dem gleiehen Blutsernm gewonnen wnrden. 1 Alkohol- A~her (3:1); 2 Chloroform; 3 Xther; 4 Petroli ther; 5 Benzol; 6 Fallung der Phosphatide raft Aceton. Chromatographfe-L6snngsmittelsystem Eisessig

(1% ), Wasser (1% ), Methanol (98 %), Ninhydl'inreaktion.

heir in den Fettextrakten nur damit zn erkI~ren, dab eine enge Beziehung der ninhydrinpositiven Stoffe zu Lipoiden hestehen mug. Eine solche Verbindnng mit

0 0

O

0 o 0

0 0 1 2

0 9 0 0

o

3 G

Abb. 2. Abhingigkeil; tier BpWerte der Ninhyddaflecke yore Chromato- graphie-LSSUligsmittetsys~em. I u n d 2 Butanol-Wasser-Eisessig (6:5:1);

3 und g Eisessig-Wasser-Methanol (1:1 : 98).

primir fettlSslichen Substanzen ist Voraussetzung da- fiir, dag die an sich unlSslichen Stoffe sekundir eben- falls L6slichkeit in Fettl6sungsmittel erlangen. Die innige Verkniipfung zwisehen Lipoiden nnd ninhydrin- positiven Substanzen geht aueh darans hervor, dab die ~Vanderungsgesehwindigkeit der Ninhydrinflecke davon abhingig ist, in welchem Verhaltnis das bei der Chromatographie verwendete LSsungsmittelsystem zu den Lipoiden steht. Abb. 2 zeigt, dab in einem fiir

Lipoide weniger gut geeigneten LSsungsmittel, nBm- lich Butanol-Wasser-Eisessig (4:5 : 1) auch die R t- Werte der Ninhydrinfleeke niedriger sind als in einem die Wanderung der L~poide beg/instigenden LSsungs- mittelsystem (Eisessig-Wasser-Methanol 1 : 1 : 98). Das Zusammenlaufen der beiden verschiedenartigen Sub- stanzen ist eindeutig.

Unter den verschiedenen Lipoiden kommen als TrBger der Amino-N-haltigen Verbindungen vor allem die Phosphatide in Betracht. Diese Vermutung Iieg sich in 2facher Weise bestBtigen. Einmal haben wir in einem Lipoidextrakt die Phosphatide nachtrBglich mit Aceton gef~llt nnd konnten dann in dem Filtrat chromatographisch Ninhydrinflecke nicht mehr nach- weisen (6 in Abb. 1). Es land sich lcdiglich ein zarter, kaum erkennbarer Fleck (in der Abbildnng gestrichelt nmrandet). In der Hanptsache, wenn nicht sogar ans- schtieBlich gehSren also die ninhydrinpositiven Sub- stanzen den acetonfillbaren Lipoiden an.

Die Beziehung zu den Phosphatiden ergab sich weiterhin aus Untersuchnngen mit markiertem Phos- phor (ps2). Wit spritzten Ratten radioaktiven Phosphor, t6teten die Tiere nach 24 Std und stellten aus ver- schiedenen Organen Lipoidextrakte her. Naeh dieser Zeit ist, wie bekannt, aktiver Phosphor in die Phos- phatide eingebaut. Anf den mit diesen Extrakten ent- wickelten Chromatogramraen liet~ sich h den nin- hydrinpositiven Flecken Radioaktivitgt nachweisen.

Es erhebt sich nun die Frage, ob die positiven Chromatogramme der Lipoidextrakte dutch Amino- gruppen zustande kommen, die Bestandteil des Phos- phatidmolekiils sind, oder ob sie dadurch bedingt sind, dal~ an diese Lipoide andere Amino-N&altige Verbin- dungen gekoppelt sind, die zusammen mit den Lipo- iden in die LUsnngsmittel gelangen. Wenn man die erste MSgIichkeit in Betrach& zieht~, so wire daranf hinzuweisen, dab nur 2 ninhydrinpositive MIolekiil- bestandteile yon Phosphatiden bekannt sind, n~mlich Colamin nnd Serin. Die Chromatogramme der nnvor- behandelten Lipoidextrakte enthielten jedoch stets mehr als 2 I-Ianptflecke, so dal~ diese beiden Stoffe sicher nicht fiir die Erkl~rung der Chromatogramme ausreichen. Von besonderer Bedentung ist hier nun das Ergebnis der chromatographischen Untersuchung der Extrakte nach Durchfiihrung einer IIydrolyse. Es wurde hierbei so vorgegangen, dab Lipoidextrakt in Linie anf Chromatographiepapier aufgetragen und ent- wickelt wurde. Nach dem Trockncn des Chromato- gramms wurde ein Randstreifen abgeschnitten nnd mit Ninhydrin gef~trbt. Entsprechend 3 Hauptflecken auf diesem Beziehnngsstreifen (Abb. 3, links) wufden 3 Zonen (A, B nnd C) auf dem nichtgefirbten Chro- matogramm herausgeschnitten nnd jede Zone ftir sich mit warmem Chloroform eluier~. Das Eluat wurde in steilwandigen Porzellantiegelchen getrocknet, und der Niederschlag mit 95 % igem Athanol wieder gel6st. Das Xthanol wurde langsam auf dem Wasserbad durch 32% ttC1 ersetzt und 7 Std often hydrolysiert. Der Inhalt jedes Tiegels, also die hydrolysierten Eluate A, B und C, wurden dann erneug auf Chromatographie- papier aufgetragen, entwickelt nnd gef~rbt (Abb. 3, rechgs). Jeder der mit Chloroform herausgel6sten Flecke des Beziehungsstreifens IBSt sich also, wie aus der Abbildung hervorgeh~ , durch ttydrolyse in weitere Flecke zerlegen. Diese Ergebnisse wurden auch unter anderen Hydrolysebedingungen erzielt. Bisher haben

Jg. 31, Heft 25/26 W. Au~¢~ und E. Ma~Hm~nm ~ber den Einflug yon Norada'enalin auf das weige Blutbild. 595 1. Juti 1953

wir Serin, Alanin, Valin, Leuzin, Tyrosin, Threonin, Pro]in nnd Glutamins~nre naehgewiesen. Man mul3 es danaeh ffir wahrscheinlieh halten, dab sich zu- sammen mit Lipoiden in den Extrakten Polypeptide befinden, die durch die I-Iydrolyse in Aminos~nren zerleg~ werden. Zu der gleiehen Feststellung kamen, ebenfalls auf Grund yon allerdings etwas anders durchgefiihrten ehromatographischen Priifungen yon Petrol~therextrakten kfirzlieh aueh WYNN und WIL- 5~A~S in Australien, wie wit nach Abschlul3 unserer Un~ersuchungen leststeltten.

f)ber die Zahl der beteiligten Aminogrnppen gabon quantitative Auswertungen der Ninhydrinflecke vor nnd nach Hydrolyse Aufschlug, die nach der Methode yon BOp:% H t ) ~ v . ~ , B ~ C K N ~ und H o ~ s durch- gefiihrt wurden, So fanden sich in 1,4 mg nnvor- behandelten Lipoidextrakt 2,47 Amino-N, in der gMchen }Ienge hydrolysierten Extraktes 6,7 y Amino-N. Bei Beriicksichtigung eines gewissen Hydro- lyseverlustes ergab sich also etwa die 3faehe Menge. Diese Ergebnisse maehen es tmwahrseheinHch, dal~ sieh das Pep~idmolekfil aus wesentlieh mehr als 4 his 5 Aminos~uren zusammensetzt.

Das in allen Anfarbeitungen vSllig gMchartige Verhalten der Aminos~nren bzw. Polypeptide und der Phosphatide kann sehwerlich anders als mi~ der An- nahme erktiirt werden, dab die beiden Stoffe mit- einander verbunden sind, und zwar mug die Vereini- gung bereits in vivo bestehen. Es handelt sieh nicht etwa um Produkte, die erst w/ihrend der Prgparation zustande kommen. Der einzige preparative Eingriff ist ja fiberhaup~ nut die ]~ehandtung mit einem Fe~t- 16sungsmittel, ein Vorgang, der seinem Wesen nach eine Anfteilung yon Substanzen nach itu-er L6slich- keit herbeiffihrt, der abet sicher vSllig ungeeignet ist, freie, d.h. yon Lipoiden nnabhgngige Aminos~uren oder Peptide in L6sung zu bringen. Es muB also nach unseren Untersuchungen damit gerechnet werden, dag es nicht nut Lipoproteine, sondern auch Lipopeptide in Blur und Gewebe gibt.

Uber die biologische Bedeutung der Phosphatid- Peptidaggregate lgl3t sich vorerst niehts Sieheres aussagen. Aueh die Art der Bindung nnd die Frage ihrer Stabilitgt ist noeh nicht gekl~rt. In diesem Zu- sammenhang sei darauf hingewiesen, dab beispiels- weise Behandlung des Blutserums mi~ Ultraschall vor der Lipoidextraktion zu einer Vermindernng des Ge- hattes an lipoidgebundenem Amino-N fiihrt. Unter krankhaften Verh~ltnissen scheinen erhebliehe Ab- weichungen zustande zu kommen, auch hierfiber soll

sparer berichtet werden. In methodischer Hinsioht ist es auf jeden Fall wichtig zu wissen, dab mit den fibliehen Fettextraktionsmethoden aus Blutserum und Organen keineswegs nur die reinen Fette oder Lipoide gewonnen werden, sondern sieh m den Extrakten stets aueh Aminostickstoff naehweisen l£gt.

Zusammen/assung. Extrakte ans Blutsermn und Organen, die mit verschiedenen FettlSsungsmitteln gewonnen werden, enthMten nicht nur Fet~e und Lipoide, sondern auch papierchromatographisch nach- weisbare ninhydrinpositive Substanzen. Hydrolyse dieser mit Chloroform eluierten Stoffe und t~eehro- matographie ffihrt zu einer Vermehrung der Flecke.

A

Abb. 3.

<:::) ~ : ~ (2=2)

A B C

Clxromatogramme yon Lipoidgewebsextrakten vor un4 nach Hych'olyse. :Beseh~eibung im Text.

Im hydi'o]ysierten Lipoidextrakt ist etwa 3real sovieI Amino-N wie im unvorbehandelten Extrakt festzu- stellen. Naeh Durchffihrung einer F~llung der Phos- phatide mit Aceton gibt der Fettextrakt keine nin- hydrinpositiven Ftecke, diese sind also an die Phos- phatide gekoppelt. Das zeigt sich auch in Versuchen mit radioaktivem Phosphor. Der Amino-N, der in Chromatogrammen yon Lipoidextrakten nachweisbar ist, geht wahrscheinlich zum Teil auf das Colamin und Serin des PhosphatidmolekiiIs zuriick. Dariiber hin- aus handelt es sich jedoch um an Phosphatide ge- koppelte Aminos~uren und Peptide. Die Ergebnisse weisen darauf hin, da$ in Blur nnd Gewebe auger Lipoproteinen noch Lipopeptide anwesend sind.

Literatur. ]~ODE, tIt~BS~E~, B~#CI~ER u. ttOE~s: N~tnr- wiss. 39, 524 (1952). -- W¥~wN and ~VILLIA2~S : Nature (Lond.) 165, 768 (1950).

~ B E R DEN EINFLUSS YON N O R A D R E N A L I N AUF DAS WEISSE BLUTBILD NACH V A G U S D X M P F U N G .

V o n

W. AuI~G~ und E. MA~N~I~R. Aus der I I . ~Iedlzinisehen Unive~sit~tsklinik in Wien (Vorstand: P~oL Dr. K. ~LLINGI~R).

Unter den hormonellen Faktoren, welche die Leuko- oytenregulation beeirfflussen, ist am eingehendsten das Adrenalin untersucht worden. Schon BEaTV, LL;, FALTA und Sc~w~c~a 1 stellten im Tierversuch mid am Yen- schen lest, dag auf Nebennierenextrakte regelm~Big eine neutrophile Leukooytose auftritt, die manohmal his auf 500% des Ausgangswertes ansteigt. Daneben

kommt es zu einer relativen Verminderung der Mono- nucle~ren und einem ausgesproohenen Abfall der Eosinophilen, der seinen ttShepunkt etwa 4 Std nach Injektion erreicht. Zu ~hnlichen Ergebnissen gelangen zahlreiche andere Autoren, welche nach Adrenalin- injektion zuerst eine kurzdauernde Lymphocytoso (F~EY 2, H~ss 3) und •onocytose 3, (S~ocKINGm~ 4)

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