This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Unterschiede im konstanten (C-terminalen) Peptidsatz menschlicher Typ L-Bence-Jones-Proteine *

F R A N K W . T I S C H E N D O R F * * u n d E L L I O T T F . O S S E R M A N * * *

Institute of Cancer Research College of Physicians and Surgeons of Columbia University, New York City

(Z. Naturforschg. 22 b , 1337—1339 [1967] ; e ingegangen am 8. September 1967)

The invariant (C-terminal) set of peptides of 18 type L-Bence-Jones proteins has been compared after hydrolysis with trypsin. 6 proteins showed structural variations of one invariant peptide (5 cases) and two invariant peptides (1 case). A single amino acid substitution (lysine for arginine) could be detected at position 190: 3 proteins had lysine, 15 proteins had arginine.

Die beim multiplen Myelom und der Makroglo-bulinämie Waldenstrom im Harn nachweisbaren Bence-Jones-Proteine (BJ-Proteine) entsprechen den L (Light) -Ketten der korrespondierenden M-Typ Pro-teine des Serums und sind mit den L-Ketten der nor-malen Immunoglobuline verwandt. Zwei Typen von L-Ketten sind bekannt: x- und >i-Ketten. Sie gehören zum immunologischen Typ K bzw. L. Während die N-terminale Hälfte der BJ-Proteine in ihrer Amino-säure-Sequenz beträchtlich von einem Protein zum anderen variiert, scheint die C-terminale Hälfte bis auf eine Position bei individuellen Proteinen iden-tisch zu sein 1 _ e .

Unsere gegenwärtige Untersuchung an 18 Typ L-BJ-Proteinen bestätigt die kürzlich von A P P E L L A und EIN 6 angegebene Existenz von 2 Formen von Typ L-BJ-Proteinen, welche sich durch eine einzelne Amino-säure (Lysin bzw. Arginin an Position 190) im C-terminalen Teil unterscheiden. Unsere Ergebnisse zeigen jedoch (1) eine von den Ergebnissen dieser Autoren stark abweichende Verteilung dieser beiden Formen in unserem Material und weisen (2) auf weitere Aminosäuren-Austausche in anderen als den beschriebenen Sektionen der C-terminalen Hälfte von Typ L-BJ-Proteinen hin.

* Die Studien wurden mit Hilfe des USPHS Grant CA 02332 durchgeführt.

** Stipendiat der Deutschen Forschungsgemeinschaft. Gegen-wärtige Adresse: Medizinische Universitätsklinik Tübin-gen.

*** Faculty Research Associate of the American Cancer So-ciety.

1 N. HILSCHMANN U. L. C . CRAIG, Proc. nat. Acad. Sei. USA 53, 1403 [1965].

2 C. MILSTEIN, Nature [London] 209, 370 [1966]. 3 C . BAGLIONI, L . ALESCIO ZONTA, D . CIOLI U. A . CARBONARA,

Science [Washington] 152,1517 [1966].

Methodischer Teil

Alle 18 BJ-Proteine wurden durch Fällung mit 60-proz. Ammonsulfat aus dem Harn von Patienten mit multiplem Myelom, M. Waldenstrom und Plasmazell-Dyskrasie mit Amyloidose7 gewonnen und anschlie-ßend durch DEAE-Chromatographie (Phosphat-Puffer, PH 8,0, Gradienten- und/oder stufenweise Elution) ge-reinigt. Alle isolierten Proteine wanderten als schmal-basige Einzelbanden in der Acetatzellulose-Elektropho-rese bei ph 8,6, waren immunologisch rein und wurden mittels spezifischer Antiseren zum immunologischen Typ L zugehörig charakterisiert.

Vorbereitung der Proteine zur tryptischen Hydrolyse 1. Oxydation mit Perameisensäure bei —10 °C 8. 2. Reduktion mit Merkaptoethanol und Alkylierung

mit Monojodessigsäure 9. Enzymatische Hydrolyse mit Trypsin. Das für die

Spaltung benutzte Trypsin (2-mal umkristallisiert, TRL 6FA, Worthington Biochemical Corporation, Freehold, N. J., USA) wurde zur Inaktivierung von Spuren beigemischten Chymotrypsins 24 Stdn. bei 37 °C mit re/16-HCl inkubiert. Konzentration des BJ-Proteins 0,5%, die des Trypsins 0,005 Prozent. Trypti-sche Hydrolyse in 0,2-m. NH4HC03 , pH 8,2. Nach 18 Stdn. bei 40 °C wurde die Reaktion durch Lyophili-sieren des Hydrolysates gestoppt.

Zweidimensionale Papier Chromatographie und Hoch-spannungselektrophorese. Tryptische Peptid-Finger-prints im wesentlichen nach den Vorschriften von K A T Z ,

4 C. W. EASLEY U. F. W. PUTNAM, J . biol. Chemistry 2 4 1 , 3671 [1966].

5 K. TITANI, M. W I K L E R U. F. W. PUTNAM, Science [Washing-ton] 1 5 5 , 8 2 8 [1967].

6 E . APPELLA U. D . E I N , Proc. nat. Acad. Sei. U S A 5 7 , 1449 [1967].

7 E. F. OSSERMAN, Proc. IV Int. Symp. Immunopathology, Monte Carlo, Feb. 1965. Schwabe & Co., Stuttgart 1966. Pp. 2 8 3 - 2 9 3 .

8 C. H . W. H I R S , J . biol. Chemistry 2 1 9 , 611 [1956]. 9 R. E . CANFIELD U. C. B . ANFINSEN, J . biol. Chemistry 2 3 8 ,

2684 [1963].

Position Trypt. Synonym16 i. d. Spez. Färbe-Reaktion Pept id Polypept idkette 5 , 1 5

Lß A3 151 — 157 keine spez. Färbe-Reaktion L7 A4 158—167 keine spez. Färbe-Reaktion L10 A15 188-190 Histidin (Pauly-Färbung)

Arginin (Diacetyl-Reaktion)

Tab. 1. Charakteristica der Cterminalen tryptischen Peptide L6 , L7 und L10.

D R E Y E R und A N F I N S E N 10. Trennung von 1,5 mg trypti-schen Hydrolysates auf Whatman 3MM-Papier zuerst durch aszendierende Chromatographie in Butanol/Eis-essig/Wasser (4 :1 :5 ) , danach durch Elektrophorese bei 2000 V (180 mA) für 75 Min. in Pyridin/Eis-essig/Wasser (20:150:4335) bei pn 3,6 unter Varsol als Kühlsubstanz. Die Peptidflecken wurden gefärbt mit 0,5% Ninhydrin/Butanol-Spray und spezifischen Färbelösungen für Histidin und/oder Tyrosin (Pau ly -Färbung) , Arginin (Diacetyl-Reaktion), Tryptophan (E h r 1 i c h - Färbung) und Cystein und/oder Methio-nin (Platiniodid-Reaktion) n .

Isolierung und Aminosäuren-Zusammensetzung des tryptischen Peptides L10. Tryptisches Hydrolysat von oxydiertem Protein wurde auf Whatman 3MM-Papier durch wiederholte eindimensionale Hochspannungs-elektrophorese bei PH 3,6 aufgetrennt und das Peptid mit H 2 0 eluiert und lyophilisiert. Die Peptidproben wurden in Zusammenarbeit mit Dr. D. J. M A T T K E in 6-n. HCl unter Vakuum im geschlossenen Rohr 16 Stdn. bei 105 °C hydrolysiert. Die eingedampften Hydroly-sate wurden dann im automatischen Technicon-Amino-säuren-Analysator entsprechend den Vorschriften von S P A C K M A N , S T E I N und M O O R E 12 untersucht.

Ergebnisse

Die C-terminale Hälfte (Position 1 0 8 - 2 1 3 ) der Typ L-BJ-Prote ine 5 ' 1 3 - 1 5 ist in tryptischen Peptid-Fingerprints durch einen charakteristischen Satz von Flecken repräsentiert; dieser Peptidsatz ist in der Mehrzahl der Proteine vorhanden 1 6 , 1 7 . In den 18 untersuchten Typ L-BJ-Proteinen konnte dieser ge-meinsame Peptidsatz in 12 Fällen festgestellt wer-den; die übrigen 6 Proteine zeigten eine Abwei-chung vom gewöhnlichen Peptidmuster. Als Reprä-sentant für Proteine mit gewöhnlichem gemeinsamen Peptidsatz gilt BJ-Protein St (vgl. Abb. 1) *. Trypti-sche Hydrolysate von 17 Proteinen wurden 1 : 1 mit

1 0 A . M . K A T Z , W . J . D R E Y E R U . C . B . ANFINSEN, J . biol. Chem-istry 234,2897 [1959].

1 1 R . J. BLOCK, E . L . D U R R U M U. G . Z W E I G , A Manual of Paper Chromatography and Paper Electrophoresis, Academic Press, New York 1958.

12 D. H. SPACKMAN, W. H. STEIN U. S . M O O R E , Analytic. Chem. 30, 1190 [1958],

13 C. M I L S T E I N , J. molecular Biol. 21, 203 [1966].

tryptischem Hydrolysat von St gemischt und das Gemisch mit dem Fingerprint-Verfahren untersucht. Hierdurch wurden die Strukturunterschiede in den 6 oben genannten Fällen noch zusätzlich gesichert.

In 3 Proteinen (SI, Ho, El) fehlte im Fingerprint-Muster Peptid L10 (Aminosäurereste 188 — 190, vgl. Tab. 1 ) , welches in den übrigen 15 Fällen durch seine positive Färbung für Histidin und Arginin zu erkennen ist (Tab. 1 ) . Es erscheint ein neuer Fleck mit größerer Basizität (Abb. 2) und geringerem Rf-Wert (Abb. 3 ) , welcher die positive Argininfärbung vermissen läßt. Mischungen von Hydrolysaten von oxydierten bzw. reduzierten Proteinen SI, Ho und El zeigten für L1 0 aller 3 Proteine Identität in Mobili-tät und Rf-Wert. Das Peptid L10 vom Protein Ho wurde auf seine Aminosäure-Zusammensetzung hin untersucht. Es fand sich die Komposition (Ser, Hist, Lys) im molaren Verhältnis 1 : 1 : 1 (Tab. 2 ) . Die

Aminosäuren Lauf I Lauf II [xMol jxMol

Serin 0,008 0,051 Histidin 0,052 0,057 Lysin 0,057 0,059 Asparaginsäure 0,004 Spur Glutaminsäure Spur Spur Glycin 0,008 0,005 Alanin 0,003 Spur

Tab. 2. Aminosäure-Zusammensetzung des Peptides L10 (Protein Ho).

Aminosäuren-Zusammensetzung zeigt, daß die C-terminale Aminosäure Arginin durch Lysin substitu-iert wird. Es handelt sich um einen einzelnen Amino-säure-Austausch in der C-terminalen Hälfte, da son-

14 C. M I L S T E I N , Proc. Roy. Soc. [London] 1 6 6 , 1 3 8 [ 1 9 6 6 ] . 1 5 C . M I L S T E I N . J. B . CLEGG U. J. M . JARVIS, Nature [London]

214, 270 [1967], 1 6 F . W. PUTNAM U. C. W. E A S L E Y , J . biol. Chemistry 2 4 0 , 1 6 2 6

[1965], 1 7 C . BAGLIONI U. D . CIOLI , J . exp. Medicine 1 2 4 , 3 0 7 [ 1 9 6 6 ] . * Abbn. 1 - 3 s. Tafeln S. 1338 a u. b.

PR

X

' 2

St r 10

Q

X

0o St - 9 % #

a 0 9

X

Hn

*

Sa O

r'\ H

§ St + Hn

I • 7 I 'St + Sa

O

• 6 % 7

Abb. 1. Tryptische Fingerprints von 3 oxydierten Typ L-BJ-Proteinen (St, Hn, Sa). Die gewöhnlichen konstanten Peptide (Lt — L10) sind mit soliden Kreisen, die fehlenden konstanten Peptide mit gepünktelten Kreisen versehen. Chromatographie in vertikaler, Elektrophorese in horizontaler Richtung, mit der Anode links. Auftragstelle links unten (0). Das mit einem Kreis

versehene x auf der vertikalen Achse bezeichnet die Position des Phenolrot-Indikators nach Chromatographie.

Abb. 2. Vergleichende eindimensionale Hochspannungselektrophorese von tryptischen Hydrolysaten von oxydierten Typ L-BJ-Proteinen St, El, Ho und SI. Das einen Argininrest enthaltende Peptid L10 (St) ist durch einen Einzelpfeil, das einen Lysinrest

enthaltende Peptid L10 (El, Ho, SI) durch einen Doppelpfeil gekennzeichnet.

u X O 5 0 I +

c X

Abb. 3. Tryptische Fingerprints von zwei oxydierten Typ L BJ-Proteinen (Hn und SI) und von einem Gemisch von tryptischen Hydrolysaten beider Proteine.

stige Abweichungen im konstanten Teil dieser 3 Pro-teine nicht entdeckt werden konnten.

In den übrigen 3 BJ-Proteinen (Hn, Hi, Sa) un-serer Untersuchungsreihe wurde das Fehlen der kon-stanten Peptide L6 und L7 beobachtet, was darauf hinweist, daß die Positionen 151 — 167 (vgl. Tab. 1) weitere Plätze für einen Aminosäure-Austausch sein können. Es fehlen in den Fingerprints: L7 in Pro-tein Hn (Abb. 1) und Protein Hi (nicht abgebildet) und L6 und L7 in Protein Sa (Abb. 1) .

Die 12 Proteine mit gewöhnlichem konstanten Peptidsatz stammten von Patienten mit Plasmazell-Dyskrasie mit Amyloidose (2 Fälle), BJ-Myelom mit Amyloidose (1 Fall) und ohne Amyloidose (7 Fälle), yG3-Myelom 18 ohne Amyloidose (1 Fall) und Plasmazell-Leukämie (1 Fall); die 6 Proteine mit abweichendem konstanten Peptidsatz stammen von Patienten mit Plasmazell-Dyskrasie mit Amy-loidose (Fall El) , BJ-Myelom mit Amyloidose (Fall Sa), mit fraglicher Amyloidose (Fall SI) und ohne Amyloidose (Fälle Ho, Hn) und M. Waldenstrom (Fall Hi) . Keine sichere Korrelation konnte zwi-schen Art der Peptidanomalie und Art der Erkran-kung, der Symptomatologie (z.B. Vergesellschaftung mit Amyloidose) und der H-Ketten-Klasse der kor-respondierenden Serum M-Typ-Proteine (yG, yA, yM) aufgestellt werden.

Diskussion

Wenigstens jeweils 2 Formen von BJ-Proteinen können innerhalb der zwei großen immunologischen (strukturellen) Gruppen [Typ K (x) und Typ L ( / ) ] auf Grund definierter Aminosäure-Variationen in der C-terminalen Hälfte der Moleküle unterschie-den werden: Typ K-BJ-Proteine durch die einzelne Aminosäuresubstitution von Valin für Leucin an Position 191 1 - 5 , Typ L-BJ-Proteine durch die ein-zelne Substitution von Lysin für Arginin an Posi-tion 190 6 . Bei den Typ K-BJ-Proteinen entspricht Leucin dem genetischen Faktor InV (a - f ) und Va-lin dem Faktor InV (b + ) 2 - 4 . Möglicherweise han-delt es sich bei der Substitution von Lysin für Ar-ginin an Position 190 der Typ L-BJ-Proteine eben-falls um einen solchen genetischen Faktor. Diese

18 7G3 = Vi (y2c)-Antigen-Subtyp der y-Ketten; vgl. H. G. K U N K E L , J . L . F A H E Y , E . C . FRANKLIN, E . F . OSSERMAN U. W. D . T E R R Y , „Notation for Human IgG-Subclasses" (Bull. Wld. Hlth. Org. 35, 953 [1966]).

Substitution kann durch eine Präcipitinreaktion nachgewiesen werden 19.

Frühere Untersuchungen an 30 Typ L-BJ-Pro-teinen hatten eine positive Reaktion für Arginin in Peptid L10 nachweisen können1 6 '1 7 , und auch die bisher in ihrer Primärstruktur aufgeklärten 3 Typ L-BJ-Proteine hatten einen Argininrest an der Posi-tion 190 5 , l s . Die Substitution von Lysin für Argi-nin wurde — während an dieser Untersuchung ge-arbeitet wurde — in 7 von 12 Typ L-BJ-Proteinen beschrieben 6. Diese Substitution im tryptischen Pep-tid L10 wurde allerdings in nur 3 von unseren 18 Typ L-BJ-Proteinen beobachtet. Untersuchungen an einer weiteren größeren Anzahl von Typ L-BJ-Pro-teinen scheinen nötig, um diese Diskrepanz zu er-klären.

Studien zur Natur der von uns beobachteten Va-riationen im konstanten Peptidsatz der drei weiteren Typ L-BJ-Proteine (Hn, Hi, Sa) werden unternom-men werden, und es bleibt abzuwarten, ob auch diese Variationen einzelne Aminosäure-Substitutio-nen in der C-terminalen Hälfte dieser Proteine dar-stellen.

Die Substitution von Lysin für Arginin an Posi-tion 190 kann auf ein genetisches Ereignis zurück-geführt werden, das zur Änderung eines einzelnen Nucleotids im Segment des DNA-Stranges führt, welches für Lysin bzw. Arginin an Position 190 codiert: nämlich zur Änderung von AGA oder AGG zu AAA oder AAG 2 0 . Die Beobachtung geringer Variationen der Struktur der C-terminalen (kon-stanten) Hälfte von BJ-Proteinen mag von klinischer Bedeutung sein oder nicht. Ihre Entdeckung wird jedoch zu einem klareren Verständnis der geneti-schen Mechanismen, welche ihre strukturellen Varia-tionen bestimmen, beitragen. Diese Medianismen können mit den Mechanismen identisch sein, welche strukturelle und funktionelle Variabilität von Anti-körpern bestimmen.

Wir danken Herrn Dr. D. J. M A T T H E (Dept. of Phar-macology, New York State Psychiatric fnstitute) für die Durchführung der Aminosäuren-Analyse und Herrn Dr. A. Z L O T N I C K (Hadassah University Hospital, Jerusa-lem) für Protein Sa.

1 9 D . E I N U . J . L . F A H E Y , Science [Washington] 1 5 6 , 947 [1967].

2 0 M . N I R E N B E R G , P . L E D E R , M . BERNFIELD, R . BRIMACOMBE, J . T R U P I N , F . ROTTMAN U. C. O ' N E A L , Proc. nat. Acad. Sei. U S A 5 3 , 1 1 6 1 [ 1 9 6 5 ] .