Untersuchung der Kälteanpassungsmechanismen bakterieller ...hss.ulb.uni-bonn.de/2015/4145/4145.pdf · International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology von 25 im

Untersuchung der

Kälteanpassungsmechanismen

bakterieller Zellmembranen

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Grades

Doctor throphologiae

(Dr. troph.)

der Landwirtschaftlichen Fakultät

der

Rheinischen Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn

vorgelegt am 14. August 2014

von

Julia Derichs geb. Krüger

aus Dormagen

Referent: Professor Dr. André Lipski

Korreferent: Professor Dr. Andreas Schieber

Tag der mündlichen Prüfung: 9. Februar 2015

Erscheinungsjahr: 2015

Inhaltsverzeichnis III

Inhaltsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................ VI

Kurzfassung ............................................................................................................... VIII

Abstract ....................................................................................................................... IX

Veröffentlichungen ........................................................................................................ X

1. Einführung ................................................................................................................ 1

1.1 Definition Psychrophilie/Psychrotoleranz ............................................................. 2

1.1.1 Psychrophile und psychrotolerante Mikroorganismen in der

Lebensmittelindustrie ............................................................................................. 3

1.2 Aufbau der Plasmamembran / Das Flüssig-Mosaik-Modell / Funktionen ............. 4

1.3 Fettsäuren in der Zellmembran ............................................................................ 8

1.3.1 Nomenklatur der Fettsäuren ......................................................................... 8

1.3.2 Fettsäurezusammensetzung in der Kälteanpassung ..................................... 9

1.4 sonstige Lipide in der Zellmembran ................................................................... 11

1.4.1 Chinone ...................................................................................................... 12

1.4.2 Carotinoide ................................................................................................. 15

1.4.3 Weitere Mechanismen in der Kälteanpassung von Bakterien ...................... 18

1.5 Ziel der Arbeit .................................................................................................... 19

2. Material und Methoden ........................................................................................... 20

2.1 Herkunft der Bakterienisolate ............................................................................ 20

2.2 Verwendete Medien und Kultivierung der Bakterien .......................................... 23

2.3 Makroskopische und mikroskopische Morphologiebeschreibung ....................... 23

2.4 Temperaturtoleranztest ..................................................................................... 23

2.5 Salzkonzentrationstest ...................................................................................... 23

2.6 Molekularbiologische Methoden ........................................................................ 24

2.6.1 Molekularbiologische Identifizierungen anhand von 16S rRNA-Gen-

Sequenzanalysen ................................................................................................ 24

IV Inhaltsverzeichnis

2.6.2 Molekulare Phylogenie-Analyse .................................................................. 26

2.6.3 DNA-DNA Hybridisierung ............................................................................ 26

2.7 Chemotaxonomische Methoden ........................................................................ 27

2.7.1 Fettsäureanalyen ........................................................................................ 27

2.7.2 Chinonanalysen .......................................................................................... 28

2.7.3 Kombinierte polare Lipid- und Chinonanalyse ............................................. 30

2.7.4 Carotinoidextraktion .................................................................................... 31

2.8 Messungen des Zellertrages ............................................................................. 34

2.8.1 Messung des Wachstumsverhaltens mittels optischer Dichte ..................... 34

2.8.2 Messung des Proteingehaltes ..................................................................... 34

2.9 Kälteresistenztest .............................................................................................. 36

2.10 Überlebenstest - Zellertragsmessung bei 10°C und 30°C in einem

Modelllebensmittel ................................................................................................... 36

2.11 Physiologisches Reaktionsprofil ...................................................................... 37

3. Ergebnisse .............................................................................................................. 38

3.1 Makroskopische und mikroskopische Isolatbeschreibung .................................. 38

3.2 Identifizierung mittels 16S rRNA-Gen Sequenzierung ....................................... 45

3.2.1 Phylogenetische Beziehung der kälteangepassten Isolate .......................... 47

3.3 Neubeschreibung Isolat J22 .............................................................................. 50

3.3.1 Makroskopische und mikroskopische Zellmorphologie ................................ 50

3.3.2 Temperatur- und Salztoleranztest ............................................................... 50

3.3.3 Chemotaxonomische Beschreibung ............................................................ 51

3.3.4 physiologisches Reaktionsprofil .................................................................. 53

3.3.5 Molekulare Phylogenie-Analyse und DNA-DNA-Hybridisierung .................. 54

3.3.6 Namensgebung ........................................................................................... 54

3.4 Fettsäuremuster bei 10°C- und 30°C-Inkubation ............................................... 56

3.5 Chinonmuster und -gehalt bei 10°C- und 30°C-Inkubation ................................ 66

3.5.1 Qualitative Chinonanalyse ........................................................................... 66

3.5.2 Quantitative Chinonanalyse ........................................................................ 69

Inhaltsverzeichnis V

3.6 Carotinoidgehalt bei 10°C- und 30°C-Inkubation ............................................... 74

3.7 Wachstumsverhalten ......................................................................................... 79

3.7.1 Wachstumsverlauf einzelner Isolate bei 10°C- und 30°C-

Inkubationstemperatur ......................................................................................... 79

3.7.2 Wachstumsverhalten einzelner Isolate bei 10°C und 30°C im Vergleich zu

Typ- bzw. Referenzstämmen ............................................................................... 82

3.7.3. Exponentielle Wachstumsraten und maximale OD-Werte .......................... 85

3.8 Zelldichte ........................................................................................................... 86

3.9 Kälteresistenztest Listeria monocytogenes ........................................................ 88

3.10 Überlebenstest bei 10°C und 30°C in einem Modelllebensmittel ..................... 89

4 Diskussion ............................................................................................................... 91

4.1 Isolierung kälteangepasster Bakterien ............................................................... 91

4.2 Neubeschreibung Pedobacter nutrimenti J22T ................................................... 91

4.3 Fettsäurebewertung .......................................................................................... 93

4.3.1 Taxonomische Bedeutung .......................................................................... 93

4.3.2 Bewertung der Fettsäuremuster in der Kälteanpassung .............................. 94

4.4 Chinone ............................................................................................................. 96

4.4.1 Taxonomische Bedeutung der Chinone ...................................................... 96

4.4.2 Chinone in der Kälteanpassung .................................................................. 99

4.5 Carotinoide ...................................................................................................... 102

4.5.1 Carotinoide in Bakterien ............................................................................ 102

4.5.2 Carotinoide in der Kälteanpassung ........................................................... 103

4.6 Zelldichte und Wachstumsverhalten ................................................................ 106

4.7 Kälteresistenztest und Überlebenstest Listeria monocytogenes ...................... 108

5. Zusammenfassung ............................................................................................... 111

6. Literaturverzeichnis ............................................................................................... 113

8. Danksagung ......................................................................................................... 143

VI Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis

ATCC American Type Culture Collection

bp Basenpaare

CCUG Culture Collection, University of Göteborg, Sweden

CSP cold shock proteins

c/t cis/trans

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat

DSMZ Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen

ECL Equivalent Chain Length

EDTA Ethylendiamintetraacetat

g Einheit der Erdbeschleunigung (~ 9,81 m/s2)

GC Gaschromatographie

FS Fettsäure

h Stunden

HP Hewlett-Packard

HTA Hefeextrakt Trypton Soja Agar

HTB Hefeextrakt Trypton Soja Bouillon

HPLC High Pressure Liquid Chromatography

IAM IAM Culture Collection, University of Tokyo

IFO Institute for Fermentation Osaka

M molar

mM milli-Molar

mAU*s milli-Absorbance-Units pro Sekunde

MK Menachinon

MTK Methionachinon

MS Massenspektrometrie

N Normalität

OD Optische Dichte

PCR Polymerase Chain Reaction

pmol Pikomol

PQ Plastochinon

Q Ubichinon

rpm Rounds per minute

Abkürzungsverzeichnis VII

rRNA Ribosomale Ribonukleinsäure

spp. Species pluralis

TSA Trypton Soja Agar

TSB Trypton Soja Bouillon

U Unit (Enzymeinheit)

UV Ultraviolett

VIII

Kurzfassung

Die Lebensmittelindustrie versucht stetig, die Haltbarkeit ihrer Produkte zu verlängern,

um ihre Produktivität zu optimieren. Dafür verwendet sie auch Kühlungs- und

Gefriertechniken. Durch den Einsatz dieser Techniken sollen die für den Menschen

pathogenen Mikroorganismen im Lebensmittel absterben bzw. die Anzahl vermindert

werden, da ein Wachstum bei niedrigen Temperaturen nicht mehr möglich oder stark

verlangsamt ist. Es gibt jedoch auch psychrophile bzw. psychrotolerante Bakterien, die

sich in sehr kalten Regionen der Erde an die dort herrschenden Umwelt- und

Klimabedingungen evolutiv angepasst haben. Einige dieser kälteadaptierten Bakterien

finden optimale Wachstumsvoraussetzungen bei kühlschrankähnlichen Bedingungen

vor. Gelangen diese Bakterien nun mit Lebensmittelrohstoffen in ein Lebensmittel,

bietet sich ihnen ein nährstoffreiches Biotop, in dem sie sich gut vermehren können. Zu

diesen psychrophilen bzw. psychrotoleranten Bakterien zählen die Gattungen Listeria,

Clostridium, Yersinia und einige für den Menschen pathogene Bacillus-Stämme.

In dieser Dissertation werden die Kälteanpassungsmechanismen psychrophiler bzw.

psychrotoleranter Bakterien näher untersucht. Als Standardmechanismus der

Kälteanpassung wird in der herrschenden Literatur die Änderung im Fettsäuremuster

innerhalb der bakteriellen Membran definiert, welche sich qualitativ und quantitativ

verändern kann. Es gibt aber auch Bakteriengruppen, bei denen dieser

Anpassungsmechanismus bei Untersuchungen nicht nachgewiesen werden konnte.

Diese Feststellung führt zu der Annahme, dass es weitere Mechanismen der

Kälteanpassung bei Bakterien geben muss. Diese sollen im Rahmen der vorliegenden

Arbeit gefunden und erläutert werden. Sie konzentriert sich dabei auf die lipophilen

Substanzen Chinone und Carotinoide, die Bestandteile der bakteriellen Zellmembran

sind. Als Keimquellen dienten lebensmittelassoziierte Habitate.

Diese Arbeit konnte nachweisen, dass bei bestimmten Bakterienarten der

Chinongehalt und der Carotinoidgehalt durch Kälteeinfluss verändert wird. Zum Teil

kommt es zu einer Erhöhung des Gehaltes, durch den die Kältetoleranz dieser

Bakterien erklärt werden kann. Zusätzlich konnte durch diese Arbeit eine erhöhte

Zellausbeute bei einer Kühlinkubation gezeigt werden. Dieser Effekt trat nur bei

Wildisolaten auf, jedoch nicht bei Referenzstämmen. Die vorliegenden

Forschungsergebnisse können in der Lebensmittelindustrie bei der Haltbarmachung

von Produkten und in der Medizin angewendet werden. Sie erweitern den

Forschungsstand, um besser mit kälteangepassten, potenziell pathogenen

Mikroorganismen umzugehen und daraus entstehende Gefahren (für den Menschen)

besser beherrschbar zu machen.

IX

Abstract

To increase its productivity, food industry continuously tries to enhance the shelf life of

its products. To achieve this objective they employ refrigeration and cooling

techniques. These techniques make sure that human-pathogenic microorganisms in

food die off or their number decreases because they don’t grow at these low

temperatures or they grow very slowly. However, there are psychrophilic or

psychrotolerant bacteria that have adapted to cold temperatures because of

environmental and climate conditions on earth. Some of these cold-adapted bacteria

find their growth optimum at refrigerated conditions. Getting in food via e.g. food

ingredients these bacteria have a nutrient-rich habitat which allows them to proliferate.

These psychrophilic or psychrotolerant bacteria include the genera Listeria,

Clostridium, Yersinia and some human-pathogenic Bacillus-strains.

This graduate thesis examines the cold adaptation mechanisms of psychrophilic and

psychrotolerant bacteria more closely. In literature the qualitatively or quantitatively

change in fatty acid pattern inside the bacterial membrane is described as standard

mechanism. However, some groups of bacteria obviously don´t use this mechanism.

This leads to the assumption that other mechanisms exist. The present study tries to

find out and explain these mechanisms. The main focus is on the quinones and

carotenoids as lipophilic substances that can be components of the bacterial cell

membrane. As major source for bacterial isolates food-associated habitats were used.

The results show that quinone content and carotenoid content are altered by cold

influence in several types of bacteria. Partly, the content of quinones and carotenoids

increased. That affects the cold tolerance of bacteria. Additionally, the graduate thesis

resulted in an increased cell yield at cool incubation. This observation occurred only in

wild isolates but not in reference strains.

The present results can be applied in food industry and as well in medicine. They

deepen knowledge to optimize handling of cold-adapted, potentially human-pathogenic,

microorganisms and improve the management of emerging risks.

X

Veröffentlichungen

Beiträge bei Fachtagungen

Derichs, J. & Lipski, A. (2012): Fatty-acid independent adaptation of bacterial

membranes to cold temperatures. Posterpräsentation auf der VAAM Jahrestagung,

Tübingen, 18.-21.03.2012

Derichs, J., Falkenberg, F., Fritsch, C., Verbeek, J. & Lipski, A. (2013): Low growth

temperatures elevate cell yield for mesophilic isolates from food. Posterpräsentation

auf der VAAM Jahrestagung, Bremen, 10.-13.03.2013

Publikation

Derichs, J., Kämpfer, P. & Lipski, A. (2014): Pedobacter nutrimenti sp. nov., isolated

from chilled food. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 64,

1310-1316.

Einführung 1

1. Einführung

Organismen sind in der Lage, in vielen ökologischen Nischen zu überleben und sich zu

vermehren. Dafür notwendig ist die Bildung von Enzymen, die dem Organismus die

Synthese und den Abbau der Substrate ermöglichen, die für das Überleben in der

jeweiligen Umgebung notwendig sind. (Georlette et al. 2004)

In weiten Teilen der Erdbiosphäre, wie Ozeanböden, den Polarregionen oder

Hochgebirgsregionen herrschen das ganze Jahr über Temperaturen von unter 5°C.

Diese permanent kalten Lebensräume bilden eine Wachstumsnische für psychrophile

und psychrotolerante Mikroorganismen, die sich auf unterschiedliche Art und Weise

den dortigen Umweltbedingungen angepasst haben. Für eine lange Zeit wurden

Psychrophile als exotische Organismen bezeichnet, aber in den letzten Jahren wurden

immer mehr psychrophile Isolate untersucht (Helmke und Weyland 2004). So stieg die

Anzahl der Neubeschreibungen psychrophiler Mikroorganismen pro Jahr im

International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology von 25 im Jahr 2000

auf 73 im Jahr 2013 an.

Aufgrund des regen Interesses, z.B. aus der Biotechnologie, wurde die Erforschung

der Mechanismen der Kälteanpassung in den letzten Jahren vorangetrieben (Margesin

et al. 2008). Die Weiterentwicklung der industriellen Produktion von Lebensmitteln und

der immer häufigere Einsatz von Kühlung bzw. Tiefgefrieren zur Konservierung sorgen

dafür, dass psychrophile und pychrotolerante Mikroorganismen auch in Lebensmitteln

entsprechende Habitate vorfinden und an Bedeutung gewinnen (Hébraud und Potier

1999). Dies ist besonders im Zusammenhang mit den heutigen modernen

Anforderungen an die Lebensmittelproduktion wichtig, da Konservierungsmittel vom

Konsumenten nur teilweise toleriert werden, da natürlicher Geschmack und

Bekömmlichkeit an oberster Stelle stehen (Russell 2002).

Es gibt psychrophile und psychrotrophe Bakterienspezies, die als

Lebensmittelverderbniserreger oder sogar Lebensmittelpathogene bezeichnet werden.

Als Verderbniserreger gelten u.a. Brochothrix thermosphacta, Pseudomonas spp.,

Micrococcus spp. oder Lactobacillus-Arten. Zu den lebensmittelassoziierten

Pathogenen zählen beispielsweise Listeria monocytogenes, Clostridium botulinum oder

Yersinia enterocolitica (Laksanalasmai et al. 2011; Russell 2002). Diese nehmen

großen Einfluss auf die Lebensmittelsicherheit. Die Bakterien gelangen durch

Kontamination von ihren natürlichen Standorten in gekühlte Lebensmittelrohstoffe bzw.

–produkte und finden dort ein nährstoffreiches Habitat vor. Dadurch können sie sich

2 Einführung

vermehren und somit auch ihre Stoffwechselprodukte oder gegebenenfalls Toxine

ansammeln, welche letztlich die Eigenschaften des Produktes verändern oder die

Gesundheit des Lebensmittelkonsumenten schädigen können. (Kraft 1992)

1.1 Definition Psychrophilie/Psychrotoleranz

Neben der Toleranz von hohen Temperaturen, extremen pH-Werten und begrenzter

Verfügbarkeit von Sauerstoff oder Wasser, stellt die Kälteanpassung eine notwendige

Adaption für die Bakterien dar (Morita 1975). Eine niedrige Temperatur ist ein

wesentlicher Umweltfaktor und hat großen Einfluss auf das Wachstum und die

Entwicklung von lebenden Organismen (Suutari und Laakso 1994). Diese Organismen

werden als psychrophil und psychrotolerant bezeichnet. Durch die Fähigkeit

psychrophiler Organismen auch bei den niedrigsten Temperaturen überleben zu

können, sind sie in der Lage große Teile der Erdoberfläche zu besiedeln. Diese

extremophilen Organismen, entweder prokaryotisch oder eukaryotisch, stellen damit

eine wichtige Klasse der belebten Welt dar, wenn wir die Weitläufigkeit dieser

dauerhaft kalten Regionen der Welt, wie beispielweise polare und alpine Regionen,

betrachten. Die erfolgreiche Ansiedlung von Psychrophilen in solch extremen

ökologischen Nischen, wurde in den letzten Jahren immer intensiver erforscht. (Feller

und Gerday 1997)

Diese genannte Fähigkeit von Bakterien in kalter Umgebung zu überleben und sogar

sich vermehren zu können, zählt somit zu den bedeutsamsten Anpassungen an

unterschiedliche und teils extreme Umwelteinflüsse. Tiefe Temperaturen führen zu

einer Verlangsamung des bakteriellen Stoffwechsels bis hin zum Wachstumsstillstand

(Busta 1978). Im Normalfall beeinflusst die Temperatur die Wachstumsrate welche

durch die Enzymaktivität bestimmt wird. Im drastischen Fall würde es zu

Konformationsänderung zellulärer Makromoleküle und Denaturierung kommen, was

einen Zelltod zur Folge hätte. (Ratkowsky et al. 1982) Dieser Zusammenhang

zwischen Temperatur und Enzymaktivität wird durch die Arrhenius-Gleichung

beschrieben (Russell et al. 1990).

Mit Hilfe der unterschiedlichsten Mechanismen können Mikroorganismen Lebensräume

mit Temperaturen unter 5°C besiedeln. Es gibt zwei Arten von Kältetoleranz.

Psychrophile Mikroorganismen besitzen bezogen auf die Wachstumsgeschwindigkeit

ein Temperaturoptimum von unter 15°C, und können auch bei -5°C noch wachsen.

Psychrotolerante Bakterien haben ebenfalls ein Temperaturminimum bei -5°C, das

Wachstumsoptimum liegt dagegen zwischen 20 und 40°C. (Morita 1975; Gounot und

Russell 1999) Somit sind diese auch bei Kühlschranktemperaturen vermehrungsfähig.

Einführung 3

Mit sinkender Temperatur können jedoch teilweise die Generationszeiten im

Wachstumsverlauf ansteigen und die lag-Phase sich verlängern. (Krämer 2007).

Kältetolerante Vertreter der Gram-negativen Bakterien, der Gram-positiven Bakterien,

der Archaen, der Hefen, der Pilze und der Mikroalgen spiegeln sehr auffallend die

Merkmale der Kälteanpassung wieder. (Deming 2002; Gounot und Russell 1999;

Morita 1975; Russell et al. 1990). Beispielsweise können psychrophile Bakterien in

einem Vollmedium bei 4ºC Verdopplungszeiten aufweisen wie der mesophile

Escherichia coli bei 37°C; nur können psychrophile Bakterien bei dieser hohen

Temperatur nicht wachsen (Feller und Gerday 1997). Die meisten zellulären

Anpassungsmechanismen an niedrige Temperaturen sind noch nicht vollständig

verstanden und werden noch untersucht. Dazu gehören Studien über die Regulierung

der Membranfluidität, die Aufrechterhaltung der Proteinsynthese und die Produktion

von Kälte-Proteine und die speziellen Mechanismen der Kältetoleranz. (Saunders et al.

2003)

1.1.1 Psychrophile und psychrotolerante Mikroorganismen in der

Lebensmittelindustrie

Mehrere Studien zeigen, dass psychrophile und psychrotolerante Bakterien oft in der

Lebensmittelmatrix auftreten können. Diese Veröffentlichungen beschäftigen sich

entweder mit Lebensmittelverderbniserregern oder mit Pathogenen, die unter kalten

Bedingungen wachsen können. (Scherer und Neuhaus 2006)

Beispielsweise wurden psychrotolerante Milchsäurebakterien als Hauptursache für den

Verderb von Schweinefleisch-Wurstwaren verantwortlich gemacht (Hamasaki et al.

2003). Außerdem wurden als Hauptbesiedler von kühlgelagerten Schweinefleisch die

Gattungen Pseudomonas, Aeromonas und Acinetobacter identifiziert. (Olsson et al.

2003) Aber auch andere für die Lebensmittelindustrie wichtige Mikroorganismen sind in

der Lage bei niedrigen Temperaturen zu überleben und sich sogar zu vermehren. Die

Fähigkeit von Campylobacter jejuni Kühl- und Gefriertemperaturen zu überleben, hat

eine hohe Relevanz für die Lebensmittelsicherheit und die öffentliche Gesundheit

(Chan et al. 2001). Andere Beispiele für lebensmittelassoziierte Spezies, die sich bei

kalten Temperaturen vermehren können sind Bacillus cereus, Clostridium perfringens,

Staphylococcus aureus und Yersinia enterocolitica. (Lechner et al. 1998; Guenlcrl und

Linton 2003; Harrison et al. 2000; Kalinowski et al. 2003; Steele und Wright 2001; Zhao

et al. 2003).

4 Einführung

Die Reduzierung psychrophiler und psychrotoleranter Bakterien spielt daher eine sehr

wichtige Rolle in der Lebensmittelindustrie. Jedoch ist die Strategie, wie sich Bakterien

genau in einer Lebensmittelmatrix bei kalter Umgebungstemperatur vermehren können

nur wenig aufgeklärt. (Scherer und Neuhaus 2006)

1.2 Aufbau der Plasmamembran / Das Flüssig-Mosaik-Modell / Funktionen

In der Bakterienzelle ist neben der Proteinsynthese, Enzymaktivität und

Nährstoffaufnahme auch die Zusammensetzung, Integrität und Struktur der

Zellmembran temperaturabhängig (Suutari und Laakso 1994). Der Erhalt der

Membranfluidität ist von wesentlicher Bedeutung für die Funktion der

Transportvorgänge und die Signaltransduktion und daher überlebenswichtig (Berg et

al. 2003). Bei Senkung der Temperatur reagieren Bakterien in den meisten Fällen mit

einer Beibehaltung der Membranfluidität durch Veränderung im Fettsäureprofil. Der

Begriff „homeoviscous adaptation“ wurde im Jahr 1974 für diese Anpassung geprägt

(Sinensky 1974). Dadurch wird die Funktionsfähigkeit der bakteriellen Zellen in

bestimmten Stresssituationen wie Kälteeinfluss aufrechterhalten. (Heller et al. 1993)

Darüber hinaus gibt es spezielle Verbindungen zur Anpassung an einen Kälteschock,

die in der Zelle produziert werden. So ist beispielsweise die Anpassung nach

Kälteeinfluss bei Bakterien auch durch sogenannte „cold induced proteins“ (CSP)

reguliert. Bei diesen CSP´s handelt es sich um circa 7 KDa große Proteine, die den

generellen Metabolismus, die Translation und die Proteinfaltung beeinflussen können.

(Graumann et al. 1996). Neben den CSP´s können auch weitere Stoffgruppen zur

Akklimatisation der Zellen bei Kälte beitragen. Es ist bekannt, dass kompatible Solute

(z.B. Betain, Treholose und Ectoin) die Zellen bei Stress schützen können. Es wird

davon ausgegangen, dass kompatible Solute als chemische Chaperone gegen die

Denaturierung und Aggregation von Proteinen bei niedrigen Temperaturen und gegen

oxidativen Stress als Radikalfänger wirken. Weiterhin wird vermutet, dass sie die

Membran stabilisieren und schützen sowie als mögliches Frostschutzmittel fungieren

können. (Kandror et al. 2002) Kompatible Solute können entweder synthetisiert

(Kandror et al. 2002) oder mit Hilfe von spezifischen Transportern aus der Umgebung

aufgenommen werden. (Brigulla et al. 2003; Mendum und Smith 2002) Diese Stoffe

werden jedoch im Cytoplasma eingelagert und nicht in der Plasmamembran (Cleland

et al. 2004).

Für die optimale Funktionstüchtigkeit der Plasmamembran ist es notwendig, dass sich

die Membranlipide in einem sogenannten flüssig-kristallinen Zustand befinden. Unter

normalen physiologischen Bedingungen ist dies auch der Fall. Wenn allerdings die

Einführung 5

Umgebungstemperatur der Bakterien absinkt, wird durch Veränderung der

Membrankomponenten die normalerweise fluide Membran viskös; nun befindet sich sie

sich in der Gelphase. Diese Fluidität der Zellmembranen spielt aber eine sehr wichtige

Rolle bei den biologischen Prozessen, die zwischen dem Extrazellulär- und dem

Intrazellulärraum stattfinden. Dadurch wird unter anderem die normale Funktion der

Enzyme beeinträchtigt. Somit müssen einige Anpassungen zur Erhaltung dieser

Fluidität vorgenommen werden. (Beales 2004; Sinensky 1974).

Daher ist das Verständnis des Phasenüberganges von Gelphase (lipid-geordnet) zu

flüssig-kristallinen Phase (flüssig-ungeordnet) sehr wichtig (Abb.1). Dieser Zustand, in

dem sich die Kohlenwasserstoffketten der Lipide befinden und der die Fluidität der

Membran bestimmt, ist der wesentliche Parameter für die Funktion biologischer

Membranen. Bei der für eine Lipidsorte spezifischen Phasenübergangstemperatur TC

findet ein reversibler Phasenübergang statt. TC hängt dabei von der

Fettsäurezusammensetzung und der Kopfgruppenstruktur der Lipide sowie von

Umgebungsvariablen, wie dem pH-Wert und der Ionenkonzentration im umgebenden

Medium, ab. (Heller et al. 1993)

Abbildung 1: Simulation der Membranstruktur in der Gelphase (oben) und der flüssigkristallinen

Phase (unten) in Bezug auf die Temperatur (Heller et al. 1993).

Mit der Abnahme der Umgebungstemperatur, sind eine Reihe von Veränderungen im

Fettsäuremuster der Bakterienzellmembranen bekannt. Dadurch wird die laterale

Diffusion innerhalb der Membran aufrechterhalten. (Chattopadhyay 2006)

Viele Studien haben adaptive Veränderungen in der Fettsäurezusammensetzung mit

dem Hauptaugenmerk auf ungesättigte und verzweigtkettige Fettsäuren gezeigt. Die

6 Einführung

wichtigsten Anpassungsmechanismen werden durch Gounot & Russell (1999),

Chintalapati et al. (2004) und Scherer & Neuhaus (2006) beschrieben. Dazu zählen der

Ersatz von gesättigten durch ungesättigte Fettsäuren, das Abnehmen der Fettsäure-

Kettenlänge, der Ersatz von geradkettigen durch methylverzweigte Fettsäuren, der

Ersatz von iso-verzweigten durch anteiso-verzweigte Fettsäuren, die Isomerisierung

von trans- in cis-Doppelbindungen und der Ersatz von geradzahligen durch

ungeradzahlige Fettsäuren. Diese Anpassungen können mit den verschiedenen

Schmelzpunkten der jeweiligen Fettsäuren erklärt werden und somit kommt es zu einer

gewünschten Schmelzpunkterniedrigung. In Tabelle 1 sind Schmelzpunkte

verschiedener Fettsäuren aufgeführt.

Tabelle 1: Schmelzpunkte bestimmter Fettsäuren nach Guendouzi und Mekelleche (2012), Kaneda

(1991), Muranushi et al. (1981) und United States Environmental Protection Agency, Washington,

DC, USA (2012)

Fettsäure Schmelzpunkt [°C]

C 13:0 iso 89,3

C 14:1 trans 2 99,5

C 14:0 53,9

C 15:0 52,5

C 16:0 63,1

C 17:0 61,3

C 18:0 69,6

C 16:1 cis 9 0,5

C 18:1 trans 9 51,0

C 18:1 cis 9 8-10

C 18:1 trans 11 44,0

C 18:2 cis,cis 9,12 -5,0

15:0 iso 51,7

17:0 iso 60,2

15:0 anteiso 23,0

17:0 anteiso 36,8

Trotz der allgemein anerkannten dominierenden Funktion der Fettsäureprofile in der

Membrananpassung gibt es einige aktuelle Literaturquellen über mikrobielle

Gemeinschaften in arktischen und antarktischen Lebensräumen, die - teilweise

zusätzlich - andere Strategien verfolgen. Beispiele dafür sind das Verändern der

polaren Kopfgruppe, die Konzentrationsänderung von integralen Membranproteinen

und das Ändern der Carotinoidzusammensetzung und –gehaltes aus polaren und

unpolaren Carotinoiden (Chintalapati et al. 2004; Margesin et al. 2007).

Einführung 7

Im den folgenden Abschnitten wird nun detaillierter auf die Fettsäuren und andere

lipophile Komponenten der Zellmembran, die eine Rolle bei der Kälteanpassung auf

zellulärer Ebene spielen könnten, eingegangen.

8 Einführung

1.3 Fettsäuren in der Zellmembran

1.3.1 Nomenklatur der Fettsäuren

Fettsäuren können nach der Länge der Acylkette, Anzahl, Position und Konfiguration

der Doppelbindungen, sowie nach dem Vorkommen zusätzlicher funktioneller Gruppen

klassifiziert werden.

Abbildung 2: unterschiedliche Fettsäuretypen; 1: C18:0 Fettsäure; 2: C18:0 Fettsäure mit

Methylester markiert; 3: C18:1 cis9 Fettsäure; 4: C19:0 anteiso Fettsäure; 5: C19:0 iso 3OH

Fettsäure

In der Literatur werden die Fettsäuren mit einer Abkürzung bezeichnet, z.B. 18:1 cis9,

für Ölsäure (Abb.2). Die Angabe der Positionen der Doppelbindungen erfolgt, indem

vom Carboxylende aus gezählt wird. Weiter wird die Konfiguration der Doppelbindung

mit cis oder trans angegeben. Methylverzweigungen werden mit dem Zusatz methyl

angegeben. Eine Methylverzweigung am vorletzten C-Atom wird mit iso, eine

Methylverzweigung am vorvorletzten C-Atom wird mit anteiso gekennzeichnet. Die

Benennung von Cyclopropanstrukturen erfolgt mit dem Zusatz cyclo, sowie der

1

2

3

2

4

2

5

2

Einführung 9

Positionsangabe des C-Atoms. Hydroxylgruppen werden mit OH, sowie der

Positionsangabe gekennzeichnet. (Belitz et al. 2008; IUPAC-IUB-Commission on

Biochemical Nomenclature 1978)

1.3.2 Fettsäurezusammensetzung in der Kälteanpassung

Durch Schwankungen der Umgebungstemperatur der Mikroorganismen, sind die

Fettsäuren der Phospholipiddoppelschicht einer Anzahl von möglichen Änderungen

ausgesetzt (Chintalapati et al. 2004). Die Anpassungen wurden bereits im Abschnitt

1.2 aufgelistet. Fettsäuren unterschiedlicher Kettlängen und Sättigungsgrad befinden

sich in der Lipiddoppelschicht. Gesättigte Fettsäuren fördern die Aneinanderlagerung

benachbarter Acylketten, was wiederum stabilere Strukturen verursacht und die

Membran visköser macht. Diese Membranen haben wegen der optimalen, engen side

by side Packung und der daraus resultierenden höheren van-der-Waals-Kräfte einen

höheren Schmelzpunkt. (Freedman 1981; Hazel und Eugene Williams 1990)

Im Gegensatz dazu sind kürzere Fettsäuren, besonders die mit weniger als zwölf

Kohlenstoff-Atomen, nicht in der Lage in so hohem Maße hydrophobe

Wechselwirkungen mit anderen Lipiden oder Proteinen einzugehen, da sie zu kurz

sind, um durch die Lipiddoppelschicht der Membran zu reichen. Somit wird der fluide

Zustand der Membran gefördert. (Quinn 1981) Dieser Mechanismus der

Acylkettenlängenmodifizierung bei abfallender Temperatur ist allerdings an das

Wachstum der Zellen gekoppelt, das heißt die kürzeren Fettsäuren müssen de novo

synthetisiert werden. (Denich et al. 2003; Russell 1984).

Außerdem besitzen einige Bakterien membrangebundene Desaturasen. Diese sind in

der Lage in einem aeroben Prozess Doppelbindungen in Fettsäuren einzubauen, die

bereits in der Membran existieren. Ihre Funktion wird durch mehrere verknüpfte

Untereinheiten vermittelt, welche die Wasserstoffatome vom Substrat zu molekularem

Sauerstoff kanalisieren, um eine Doppelbindung und Wasser zu bilden. Die Fluidität

wird erhöht, indem die Doppelbindung in cis-Konfiguration in der Fettsäure mehr Platz

einnimmt und so für mehr Fluktuation in der Membran sorgt. Trans-Fettsäuren

dagegen reduzieren ähnlich wie gesättigte Fettsäuren die Fluidität der Membran.

(Aguilar und Mendoza 2006; Heipieper et al. 1992; Russell 1984) Aerobe Bakterien

erzeugen diese trans-Fettsäuren in ihrer Membran durch Umwandlung von bereits

bestehenden cis-Fettsäuren. Dies geschieht mit Hilfe der cis-trans-Isomerase. Sie ist in

der Lage eine einfach ungesättigte Doppelbindung in der cis-Konfiguration in einem

energie- und wachstumsunabhängigen Prozess in die trans-Konfiguration zu

10 Einführung

überführen. Die trans-Isomere der Fettsäuren haben daher Einfluss auf die

Membranfluidität. Sie weisen allerdings aufgrund ihrer langgestreckten, sterischen

Struktur, im Gegensatz zu den cis-Isomeren, eher die Eigenschaften von gesättigten

Fettsäuren auf und haben somit einen eher reduzierenden Effekt auf die

Membranfluidität. Die aufgelisteten Schmelzpunkte aus der Tabelle 1 können diesen

Effekt erklären. Zusätzlich sind Bakterien mit anaerobem Stoffwechsel in der Lage

trans-Fettsäuren de novo zu synthetisieren und in ihre Membran einzubauen.

(Heipieper et al. 2003; Keweloh und Heipieper 1996)

Als Beispiel für diesen Effekt konnten in einigen psychrophilen Bakterien der Gattung

Vibrio und Pseudomonas mit steigender Wachstumstemperatur ein Anstieg des trans-

Fettsäuregehaltes verzeichnet werden. Diese vermehrte Bildung der trans-Fettsäuren

kann den Effekt des Temperaturanstieges ausgleichen und somit die Membranfluidität

reduzieren. (Kiran et al. 2004; Okuyama et al. 1990)

Zusätzlich spielen in der Kälteanpassung die strukturellen Isomere der geradkettigen

Fettsäuren eine wichtige Rolle. Die strukturellen Isomere iso und anteiso sind die

häufigsten Formen der methylverzweigten Fettsäuren (Chintalapati et al. 2004). Diese

endständig verzweigten Fettsäuren werden de novo synthetisiert, das heißt die

Position der Methylverzweigung ist durch die jeweilige Aminosäure, aus der die

Fettsäure in der Fettsäuresynthese hervorgeht, determiniert und kann nicht mehr

verändert werden. Die zusätzliche Methylgruppe der verzweigten Fettsäuren benötigt

mehr Raum in der Plasmamembran und kann somit die Ordnung einer

Phospholipiddoppelschicht mehr beeinträchtigen als die iso-verzweigten Fettsäuren.

(Kaneda 1991; Russell 1984; Suutari und Laakso 1994).

Zusammengefasst kann gesagt werden, dass bei der Kälteadaptation von

Mikroorganismen das temperaturabhängige Fettsäuremuster der Membranen eine

wesentliche Rolle spielt. Durch Verzweigungen, die Variation der Kettenlänge, der

Anteils an Doppelbindungen und Cyclisierungen, können Fettsäuren verändert werden

(Suutari und Laakso 1994). Die Verschiebung zu verzweigten Fettsäuren (Annous

1997), die Verringerung des Sättigungsgrades und die Kürzung der Kettenlänge

erhöhen die Membranfluidität bei sinkenden Temperaturen (Quinn 1981).

Einführung 11

1.4 sonstige Lipide in der Zellmembran

Neben den membranbildenen Lipiden (Phospholipide, Sphingolipide) sind Isoprenoide

lipophile Strukturbestandteile der pro- und eukaryotischen Zellmembranen. Zu den

Isoprenoiden zählen u.a. die große Gruppe der Steroide (Zoo- und Phytosterine),

Carotinoide und Chinone.

Bezogen auf die Kälteanpassung übernimmt in eukaryotischen Zellen vor allem das

Cholesterin (Steroid) die Funktion zur Regulierung der Membranstabilität bzw.

Membranfluidität. In Eukaryoten ist Cholesterin daher ein wichtiger Bestandteil von

Membranen. Cholesterin ist bekannt für die Wirkung auf die physikalischen

Eigenschaften von Membranen. Das starre Steroidgerüst unterbricht die

Wechselwirkungen zwischen den Fettsäureketten. Durch die zusätzliche Bildung

spezifischer Komplexe mit den Phospholipiden wird die Membran weniger fluide und

die Wahrscheinlichkeit für Phasenübergänge wird gleichzeitig gesenkt (Berg et al.

2003). Aus diesem Grund kann es die Auswirkungen der Temperatur auf die

Membranstruktur und -funktion minimieren, d.h. die Phase des Übergangszustandes

wird verbreitert. Eine Änderung der Umgebungstemperatur hat unmittelbare Folgen für

die Membranen. Einige Eigenschaften der Membran sind aber besonders wichtig, um

die Funktionalität aufrechtzuerhalten. Dabei spielt, wie zuvor in Abschnitt 1.2

beschrieben, die Ordnung der Membran, die entsprechende Phase der

Lipiddoppelschicht sowie die Durchlässigkeit der Membran eine wichtige Rolle. Durch

Temperaturschwankungen ist eine Umstrukturierung bzw. Unordnung der Membran

erforderlich, um diese aufrecht zu erhalten. Wie bereits erwähnt, ist das Cholesterin

eine ideale Wahl für diese Umgestaltung der Membran, da die planare Struktur die

Ordnung der Akylketten im höheren Wachstumsbereich stabilisiert und die Ordnung

der Akylketten im niedrigen Bereich stört. (Crockett 1998)

Jedoch wird Cholesterin von Prokaryonten nicht gebildet bzw. exogen aufgenommen.

Eine Ausnahme sind dabei die Mykoplasmen. Mykoplasmen können das Steroid

exogen aufnehmen und dieses kann somit in die Membran diffundieren, um so u.a. die

Bildung einer Gelphase der Membran bei niedrigen Temperaturen zu verhindern.

(Razin et al. 1980; Rottem et al. 1973; Rottem 1981).

Diese Studien unterstützen die Arbeitshypothese, dass das Prinzip der Unordnung der

Acylketten der Phospholipide durch hydrophobe membranlösliche Moleküle in

kälteangepassten Bakterien als alternativer Mechanismus zur Fettsäuremodifikation

realisiert werden kann. Daher können auch andere Lipide an der Regulation der

12 Einführung

Membranfluidität beteiligt sein. In dieser Arbeit wurde versucht, Indizien dafür zu

finden, ob isoprenoide Strukturen wie Chinone und Carotinoide an der Regulation der

Fluidität beteiligt sind.

1.4.1 Chinone

Chinone sind in der Natur weit verbreitet und kommen größtenteils als fettlösliche

Komponenten membrangebunden vor. (Søballe und Poole 1999)

Der Begriff Chinon beschreibt eine chemische Verbindungsklasse, die häufig in

Naturstoffen vorkommt und vielfältige Eigenschaften aufweist. Er leitet sich von dem

Namen der Chinasäure ab, einer Zwischenstufe im Shikimatweg, welche wichtig für die

Biogenese von Aromaten ist. Im Allgemeinen werden Chinone nach dem jeweiligen

Aromaten benannt, von dem sie sich durch Oxidation ableiten. So erhält man aus

chemischer Sicht para-Benzochinon und ortho-Benzochinon aus Benzol, para-

Napthochinon und ortho-Naphthochinon aus Naphthalin sowie Anthrachinon aus

Anthracen. (Effenberger-Neidnicht 2011) Bakterielle Chinone können in zwei Gruppen

aufgeteilt werden. Die erste Gruppe umfasst die Benzochinone, die auch als

Ubichinone oder Coenzym Q bezeichnet werden. Beide Namen werden von der

IUPAC-Kommission für die Nomenklatur anerkannt (Nič et al. 2009). Der Begriff

Coenzym Q wird vermehrt im biochemischen und klinischen Bereich verwendet. Die

Abkürzung für Ubichinon, welche auch in dieser Arbeit verwendet wird, ist entweder Q

oder Q-n, wobei n für die Anzahl der Isopreneinheiten in der Seitenkette steht. Die

zweite Gruppe sind die Naphthochinone. Diese lassen sich in Phyllochinone (Vitamin

K1) und Menachinone (MK-n, Vitamin K2) unterscheiden. Phyllochinone tragen am 3.

Kohlenstoffatom des Naphtochinonrings eine Phytylgruppe und werden in grünen

Pflanzen gebildet. Dagegen sind Menachinone, die am C-3 eine ungesättigte

Polyprenylgruppe tragen, in Bakterien vorhanden. (Søballe und Poole 1999; Stein

2003)

Die verschiedenen Chinontypen unterscheiden sich in der Länge der

Isoprenseitenketten sowie dem Sättigungs- und Hydrierungsgrad der Isopreneinheiten.

Beispielsweise haben Menschen Chinone mit 10 Isoprenoidseitenketten, wohingegen

Nagetiere, das Bakterium Pseudomonas und Hefen überwiegend 6, 8 oder 9

Isoprenoideinheiten in der Seitenkette vorweisen. Die chemische Struktur von

Chinonen ist am Beispiel von Q-8 und MK-8 in Abbildung 3 gezeigt. (Collins und Jones

1981; Søballe und Poole 1999)

Einführung 13

Abbildung 3: chemische Struktur von Ubichinon (links) und Menachinon (rechts) am Beispiel von

Q-8 und MK-8 (Søballe und Poole 1999)

Die Klasse der Ubichinone ist in der Natur weit verbreitet und kommen in Zellen von

Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen (v.a. Alpha-, Beta und Gammaproteobacteria)

vor. Gram-positive Bakterien und einige Gram-negative Bakterien wie Sulfatreduzierer

oder die Gattung Bacteroides und Cyanobakterien besitzen dagegen (zum Teil

zusätzlich) Menachinone. (Munk 2008)

Chinone sind Elektronenüberträger in der Atmungskette und spielen daher eine

wichtige Rolle bei der oxidativen Phosphorylierung. Zu den verbreitetsten

Atmungskettenchinonen zählen die Ubichinone, die Menachinone und die

Dimethylmenachinone. Der bekannteste Elektronencarrier ist das Coenzym Q, ein

Ubichinon. Das Chinon kann zwei Elektronen nacheinander aufnehmen, dabei entsteht

im ersten Schritt ein Semichinon-Radikal und bei Aufnahme des zweiten Elektrons ein

Hydrochinon. Chinone fungieren als Schalter zwischen Ein-und Zwei-Elektronen-

Übergängen. Bei der Reduktion des Chinons mit zwei Elektronen werden auf der

Membraninnenseite zwei Protonen aufgenommen, die bei der Oxidation auf der

Membranaußenseite wieder abgegeben werden. Wird das Hydrochinon durch einen

Elektronencarrier oxidiert, der nur eines der beiden Elektronen aufnimmt, wird das

zweite Elektron in den Chinonpool zurückgeführt, wo es ein festgebundenes Chinon

zum Semichinon-Radikal reduziert. Bei der Oxidation eines weiteren Hydrochinons

wird erneut ein Elektron auf den nachfolgenden Elektronencarrier übertragen, das

andere reduziert das gebundene Semichinon-Radikal zum Hydrochinon. Insgesamt

werden so in einem kompletten Chinonzyklus zwei Hydrochinone zum Chinon oxidiert,

ein gebundenes Chinon zu Hydrochinon reduziert und dabei zwei Elektronen und vier

Protonen transportiert. An den Elektronentransportketten der verschiedenen

Organismen sind wie oben beschrieben unterschiedliche Chinone beteiligt. (Madigan et

al. 2008; Madigan et al. 2013; Munk 2008)

14 Einführung

Bemerkenswert ist, dass das prokaryotische Atmungssystem ein flexibles Design

aufweist, welches der Zelle ermöglicht, Veränderungen der Wachstumsbedingungen

auszugleichen und sich an verschiedene verfügbare Elektronenakzeptoren wie z.B.

Sauerstoff oder Nitrat anzupassen. Dies wird dadurch bestätigt, dass Chinone eine

Rolle im Management von oxidativem Stress spielen. (Søballe und Poole 1999)

1.4.1.1 Chinone in der Taxonomie

Da sich die Art der Chinone und ihre Seitenkettenlänge je nach Bakteriengattung

unterscheiden, können diese zur chemotaxonomischen Einordnung von

Mikroorganismen herangezogen werden. Die Arbeiten von Jeffries et al. (1967), Collins

et al. (1979) und Collins & Jones (1981) wurden als neue Grundlage zur Nutzung von

Chinonstrukturen als taxonomische Kriterium genommen. Daraus geht hervor, dass

Ubichinone nur in Eukaryoten und bestimmten gramnegativen Bakterien vorkommen,

wogegen Menachinone in gramnegativen und grampositiven Bakterien sowie Archaea

enthalten sind.

1.4.1.2 Chinone in der Kälteanpassung

In der Literatur ist ein Einfluss von Chinonen auf die Kälteanpassung von

Zellmembranen bisher nicht beschrieben. Einer der Grundgedanken dieser Arbeit war

es daher, dass die membranständigen Menachinone und Ubichinone einen Einfluss

auf die Membranfluidität und damit gegebenenfalls auf die Kälteadaptation von

psychrophilen und psychrotoleranten Bakterien haben können. Dies ist in erster Linie

auf ihre molekulare Struktur, den dreidimensionalen, raumfordernden Aufbau und die

enthaltenen Doppelbindungen ungesättigter Isoprenoidseitenketten zurückzuführen.

Durch die Lokalisation in bakteriellen Membranen kommt es zur der Hypothese, dass

bei einer kälteinduzierten Restrukturierung der Membran ebenso das Chinonprofil

betroffen ist, welches unter Umständen sowohl qualitativ als auch quantitativ aktiv

angepasst werden kann, um die Adaption an die neuen Umweltbedingungen zu

gewährleisten.

Einführung 15

1.4.2 Carotinoide

Abbildung 4: Strukturformel unterschiedlicher Carotinoide; 1 -Carotin; 2: Bacterioruberin

Alle Carotinoide werden aus der gleichen Grundstruktur von 40 Kohlenstoffatomen

gebildet. Die aus acht Isopreneinheiten aufgebaute Polyen-Kohlenwasserstoffkette

bildet das Zentrum des Moleküls. Durch die Cyclisierung der Kettenenden,

Hydrierungen der Doppelbindungen sowie durch Addition von sauerstoffhaltigen

funktionellen Gruppen können Modifikationen entstehen (Abb. 4). Obwohl jede

Doppelbindung als cis oder trans Konfiguration auftreten kann, sind in der Natur

hauptsächlich die thermodynamisch stabileren all-trans-Carotinoide vertreten.

Carotinoide werden in die zwei Hauptgruppen Carotine und Xanthophylle unterteilt. Die

Carotine sind reine Polyene-Kohlenwasserstoffe, während Xanthophylle zusätzlich

mindestens eine sauerstoffhaltige funktionelle Gruppe (z.B. Hydroxylgruppe) enthalten.

(Belitz et al. 2008; Rodriguez-Amaya 2001).

Für die chemischen und physikalischen Eigenschaften der Carotinoide sind

hauptsächlich zwei Aspekte in der molekularen Struktur verantwortlich. Der strukturelle

Aufbau der Carotinoide (Größe, Gestalt, funktionellen Gruppen) ermöglicht die

funktionelle Lokalisation und Orientierung innerhalb der zellulären Strukturen. Das

System aus konjugierten Doppelbindungen ist entscheidend für die photochemischen

Eigenschaften und chemische Reaktivität. Aufgrund der konjugierten Doppelbindungen

können Carotinoide im sichtbaren Wellenlängenbereich von 400 bis 500 nm

Lichtenergie absorbieren. (Britton 1995)

Bei Mikroorganismen wird die Wirkung von Carotinoiden oft zwischen phototroph und

nicht-phototroph unterschieden. Phototrophe Bakterien benötigen Carotinoide für die

2

2

1

2

16 Einführung

Aufnahme von Lichtenergie zur Photosynthese und zum Schutz der

Chlorophyllmoleküle vor photooxidativen Schäden (Cogdell und Frank 1987). Bei den

nicht-phototrophen Bakterien wirken Carotinoide unter anderem schützend gegenüber

UV-Strahlung (Dieser et al. 2010).

1.4.2.1 Carotinoide in der Kälteanpassung

Carotinoide zeigen als lipophile Moleküle die Fähigkeit sich in biologische Membranen

einzulagern und somit einen Einfluss auf die Membranfluidität und Membranrigidität zu

nehmen. Bei Bakterien können daher die Carotinoide eine ähnliche regulierende

Funktion wie das Cholesterin bei Eukaryonten übernehmen. Damit kann die Regulation

der Membranfluidität in der Kälteadaptation bei Bakterien neben der unterschiedlichen

Fettsäurezusammensetzung in der Lipiddoppelschicht (Annous 1997; Quinn 1981;

Suutari und Laakso 1994) zusätzlich durch die Gruppe der Carotinoide übernommen

werden (Chattopadhyay et al. 1997; Jagannadham et al. 2000; Pintea et al. 2005;

Subczynski et al. 1991)

Die lipophilen Verbindungen sind meist in den Membranen lokalisiert, wobei die

Orientierung innerhalb der Lipiddoppelschicht von der Struktur und den funktionellen

Gruppen abhängt. Carotinoide mit polaren Substituenten (z.B. Zeaxanthin) können

Interaktionen mit den polaren Kopfgruppen der Phospholipide eingehen und somit die

Membran durchspannen. Hydrocarbone (β-Carotin) liegen dagegen innerhalb des

lipophilen Kerns der Membran vor. (Britton 2008)

Vor allem polare Carotinoide können einen Einfluss auf die Membranstruktur haben.

Oberhalb der Phasenübergangstemperatur erzielen sie über die Rigidisierung eine

Senkung der Membranfluidität (Subczynski et al. 1991). Indem die polaren Carotinoide

die Lipiddoppelschicht vollständig durchspannen, wird die Beweglichkeit der Lipide

innerhalb der Membran eingeschränkt und die Membranstabilität im fluiden Stadium

erhöht. Die apolaren Carotinoide wie β-Carotin ermöglichen dagegen eine verstärkte

Beweglichkeit der Membranlipide und erhöhen dadurch die Membranfluidität.

Carotinoide erfüllen somit ähnliche Funktionen wie das Cholesterin (Britton 2008).

In vitro Studien synthetischer Membranen mit Phosphatidylcholin haben gezeigt, dass

die Carotinoide Zeaxanthin, Cryptoxanthin und -Carotin in der Membran gebunden

wurden und damit die Fluidität der Membran verringert wurde (Jagannadham et al.

2000). In einer in vivo Studie konnte an dem psychrotoleranten Bakterienstamm

Micrococcus roseus 45R eine temperaturabhängige Synthese von Carotinoiden

Einführung 17

gezeigt werden. Bei der Wachstumstemperatur von 5°C stiegen der

Gesamtcarotinoidgehalt sowie der Anteil an den polaren Carotinoiden

Bacterioruberindiglycosid und Bacterioruberinmonoglycosid im Vergleich zu einer

Wachstumstemperatur von 25°C an (Chattopadhyay et al. 1997). Auch das

psychrotolerante Bakterium Sphingobacterium antarcticus steigerte bei 5°C die

Synthese an polaren Carotinoiden und ungesättigten Fettsäuren. Die ungesättigten

Fettsäuren erhöhen die Fluidität der Membran, während dagegen die polaren

Carotinoide die Stabilität erhalten können (Jagannadham et al. 2000).

In diesem beschriebenen Zusammenhang ist es sehr interessant, dass grampositive

Bakterien aus der Antarktis kollektiv eine Dominanz an pigmentierten Isolaten

vorweisen. Bei Arthrobacter agilis, ein Bakterium, welches aus dem antarktischen

Eismeer isoliert wurde, wird die starke Pigmentierung bei niedriger Temperatur durch

ein C-50 langes Carotinoidmolekül hervorgerufen, welches als Derivat von

Bacterioruberin identifiziert wurde. Diese Aussagen, dass solche Carotinoide die

Membran stabilisieren, werden auch von anderen extremophilen Bakterien und

Archaeen berichtet, die starken Salzkonzentrationen oder UV-Strahlenbelastung

ausgesetzt sind. (Fong et al. 2001)

Diese Aussagen passen auch zu der Beobachtung von Varkonyi et al. (2002), dass

einige polare Carotinoide nur bei einer niedrigen Temperatur in den

Thylakoidmembranen des Cyanobakteriums Cylondrospermopsis raciborskii induziert

wurden.

Jedoch scheint es auch so, dass die oben beschriebene Carotinoid-vermittelte

Stabilisierung von Membranen und die dadurch auftretende Abnahme der

Membranfluidität, durch Veränderungen im Fettsäuremuster wieder ausgeglichen

werden müssen. Dadurch würde die Membranfluidität wieder erhöht.

Allgemein kann gesagt werden, dass in Abhängigkeit von der Struktur und Polarität

Carotinoide unterschiedliche Effekte auf die Membran ausüben können und die

Membranfluidität oder die Rigidität erhöhen können. In Kombination mit den Fettsäuren

könnten Carotinoide eine regulierende Rolle bei der Anpassung an niedrige

Temperaturen spielen.

Jedoch sind Studien, die den Einfluss der Wachstumstemperatur auf die

Carotinoidsynthese bei Mikroorganismen und die damit verbundene Funktion der

Carotinoide bei der Kälteadaption liefern, insbesondere außerhalb der Psychrophilen

sehr selten. Es ist wichtig, das Zusammenspiel von Carotinoiden und Fettsäuren bei

18 Einführung

niedriger Temperatur verstehen zu können und damit aufzuklären. (Scherer und

Neuhaus 2006)

Daher war ein weiterer Grundgedanke dieser Arbeit, dass Carotinoide nicht nur einen

Einfluss auf die Membranstabilität haben, sondern auch auf die Membranfluidität, um

damit gegebenenfalls die Kälteadaptation von psychrophilen und psychrotoleranten

Bakterien erklären zu können. Carotinoide könnten wie Chinone oder ungesättigte

Fettsäuren durch ihre molekulare Struktur und die enthaltenen Doppelbindungen

raumfordernd auf die Membran wirken. Durch die Lokalisation in bakteriellen

Membranen kommt es zur erweiterten Arbeitshypothese, dass bei Kälteeinfluss die

Membran durch den vermehrten Einbau von Carotinoiden aktiv angepasst werden

kann, um die Funktionsfähigkeit der Membran zu gewährleisten.

1.4.3 Weitere Mechanismen in der Kälteanpassung von Bakterien

Neben den oben genannten Veränderungen können noch weitere membranständige

Substanzen einen Einfluss auf die Fluidität der Membranen nehmen und somit eine

Kälteadaption erklären, wovon beispielhaft zwei Gruppen kurz beschrieben werden.

Membranproteine tragen durch ihre Fähigkeit mit Lipiden zu interagieren zur

Gesamtstabilität der Phospholipiddoppelschicht bei (Epand 1998). Takeuchi et al.

zeigten bereits 1978 bei Escherichia coli, dass dessen Membranphospholipide mit den

Membranproteinen interagieren. In einer späteren Studie von Am Kropinski et al.

(1987) konnten auch temperaturabhängige Schwankungen im Proteingehalt der

Plasmamembran von Pseudomonas aeruginosa gezeigt werden. Diese Ergebnisse

untermauerten die Bedeutung der Membranproteine in der Kälteadaptation, auch wenn

sie im Vergleich zu den anderen Mechanismen eine untergeordnete Rolle spielen

(Shivaji et al. 2007).

Hopanoide stellen einem dem Cholesterin strukturell ähnlichen Stoff dar, der von

Bakterien gebildet werden kann. Somit können Hopanoide in Membranen von

Bakterien eine ähnliche Funktion besitzen, wie Cholesterin in Membranen von

Eukaryonten. Die Bildung von Hopanoiden scheint, wie auch die Bildung von

Carotinoiden und langkettigen, gesättigten Fettsäuren, die Membran als hydrophobe

Barriere zu stabilisieren und einer möglichen Erhöhung der Permeabilität

entgegenzuwirken. (Bringer et al. 1985; Kannenberg und Poralla 1999)

Einführung 19

1.5 Ziel der Arbeit

Am Ende dieser Arbeit soll die Erkenntnis stehen, ob und wie andere lipophile

Komponenten der Zellmembran von Bakterien einen Einfluss auf die Kälteanpassung

haben.

Mit dem Hintergrund der Bedeutsamkeit kälteangepasster Bakterien in der

Mikrobiologie, aber auch für die Lebensmittelindustrie im Bereich Biotechnologie und

Lebensmittelsicherheit, wurden für diese Arbeit lebensmittelassoziierte Kühlhabitate

und gekühlte Lebensmittel untersucht, um psychrophile bzw. psychrotolerante

Bakterien zu isolieren. Die erhaltenen Isolate werden morphologisch und

chemotaxonomisch charakterisiert und per 16S rRNA-Gensequenzierung identifiziert.

Bezogen auf die Kälteanpassung werden alle Isolate hinsichtlich ihres

Fettsäuremusters bei 10°C und 30°C analysiert und in Gruppen eingeordnet. Bei

ausgewählten Isolaten werden zusätzlich bei 10°C und 30°C zum einen die

Chinonanalytik und zum anderen die Carotinoidanalytik angewendet, um die unter

Abschnitt 1.4 beschriebenen weiteren Kälteanpassungsstrategien auf Membranebene

auszuarbeiten.

20 Material & Methoden

2. Material und Methoden

Die verwendeten Chemikalien und Lösungsmittel stammen, sofern nicht zusätzlich

angegeben, von den Firmen Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland) und Merck

KGaA (Darmstadt, Deutschland).

2.1 Herkunft der Bakterienisolate

Als Isolationsquellen dienten zum einen Oberflächen von verschiedenen

Kühlschrankeninnenseiten, Kühlräumwänden sowie ein gekühlter Milchtank und zum

anderen verschiedene, gekühlte Lebensmittelproben.

Die Isolate wurden entweder mit dem Rodac-Plattenverfahren oder dem

Tupferverfahren von der jeweiligen Oberfläche isoliert oder mithilfe des

Oberflächenverfahrens aus dem jeweiligen Lebensmittel isoliert (Bast 1999). Die

Isolate wurden als kälteadaptiert bezeichnet, sobald ein sichtbares Wachstum bei 10°C

nach 7 Tagen stattfand.

In Tabelle 2 werden die jeweiligen kälteadaptierten Bakterienisolate mit Herkunft

aufgelistet.

Tabelle 2: untersuchte Bakterienisolate und deren Herkunft

Isolat Isolationsquelle

J1

Oberfläche der Innenwand eines Kühlschrankes

J2

J3

J5

J6

J7

J8

J9

J10

J11

J12

J16

J17

Material & Methoden 21

J20 frische Tortellini mit Schweinefleischfüllung (gekühlt) J21

J22

J23

J29 Vanillespeiseeis aus Eisdiele J32

J34

J39

Oberfläche der Innenseite eines Kühlschrankes

J40

J44

J45

J48

J50

J52 Schlagsahne aus Sahneaufschlagmaschine einer Eisdiele J53

J54 Bananenspeiseeis von einer Eisdiele J55

J57

J58

Schokoladenspeiseeis von einer Eisdiele J59

J60

J61

J62

Rohmilch aus Milchtank (Forschungsgut Frankenforst der Universität

Bonn)

J63

J64

J65

J66

J67

J68

J69

J70

J71

J72

Tupfer-Abstrich Milchtankablass (Forschungsgut Frankenforst der

Universität Bonn)

J73

J74

J75

J76

J77

J78

J79

J80 Rohmilch Milchtank (Forschungsgut Frankenforst der Universität Bonn) J81

J82 Emmentaler Biomarkt J83

J84 Eichenblattsalat Biomarkt


J85 frisches, gemischtes Hackfleisch (50% Rind, 50% Schwein) J86

J87

Salat (verzehrsfertiger Mischsalat) J88

J89

J90

J91

FFL1 Räucherlachs

Iso1/1

11

Frisches Lammhackfleisch

Verwendete Referenz- und Vergleichsstämme sind in Tabelle 3 aufgelistet. Die

Stämme wurden von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen

(DSMZ) bzw. den Laboratorium voor Microbiologie, Universität Gent (LMG) bezogen.

Tabelle 3: Referenz- und Vergleichsstämme zu bestimmten Isolaten

Referenz- bzw. Vergleichsbakterium Stammbezeichnung

Bacillus cereus DSM 345

Pedobacter panaciterrae LMG23400T

Pedobacter africanus DSM 12126T

Pedobacter heparinus DSM 2366T

Listeria monocytogenes DSM 20600T


2.2 Verwendete Medien und Kultivierung der Bakterien

Die Isolate wurden für die Untersuchungen und für die Stammhaltung in Trypton-Soja-

Bouillon (TSB) (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland; Zusammensetzung: Pepton

aus Casein 17,0 g/L, Pepton aus Sojamehl 3,0 g/L, D(+)Glucose-Monohydrat 2,5 g/L,

Natriumchlorid 5,0 g/L di-Kaliumhydrogenphosphat 2,5g/L) oder auf Trypton-Soja-Agar

(TSA) (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland; Zusammensetzung: Pepton aus Casein

15,0g/L, Pepton aus Sojamehl 5,0 g/L, Natriumchlorid 5,0 g/L Agar-Agar 15,0 g/L)

angezogen. Bei der Gattung Listeria wurde Hefeextrakt-Trypton-Soja-Bouillon (HTB)

(Zusammensetzung TSB und 6g/L Hefeextrakt (Oxoid, Hampshire, UK) oder

Hefeextrakt-Trypton-Soja-Agar (HTA) (Zusammensetzung: TSA und 6g/L Hefeextrakt)

zur Kultivierung verwendet.

2.3 Makroskopische und mikroskopische Morphologiebeschreibung

Zur Differenzierung der gewonnenen Reinkulturen wurde neben der

Koloniemorphologie auch die Zellmorphologie mit einem Lichtmikroskop (Modell BH-2,

Olympus, Hamburg, Deutschland untersucht. Die Zellgröße wurde mit einem

Phasenkontrastmikroskop (Axio, Zeiss, Deutschland) bestimmt. Eine weitere

Differenzierung der Isolate erfolgte mittels Gram-Färbung mit anschließender

mikroskopischer Betrachtung (Gram & Friedländer 1884). Die Ergebnisse des

Gram-Färbeverhaltens wurden mit dem KOH-Test (Buck 1982) und dem L-Alanin-

Aminopeptidase-Nachweis mit Bactident® Aminopeptidase-Teststreifen (Merck

KGaA, Darmstadt, Deutschland) überprüft. Außerdem wurde die Katalasereaktion

nach Gerhardt et al. (1981) getestet. Die Oxidasereaktion wurde mittels

Oxidaseteststreifen (Merck KGaA, Darmstadt, Deutschland) bestimmt.

2.4 Temperaturtoleranztest

Für einen Temperaturtoleranztest wurde bei 4°C, 8°C, 10°C, 17°C, 28°C, 30°C, 37°C

und 42°C inkubiert und auf Wachstum untersucht. Als Nährmedium diente Trypton-

Soja-Agar.

2.5 Salzkonzentrationstest

Um die Salztoleranz festzustellen, wurde bei verschiedenen Salzkonzentrationen bei

30°C inkubiert. Die Salzkonzentrationen lagen bei 0,5%, 1%, 1,5%, 2% 3% und 4%.

Als Nährmedium diente R2A-Bouillon (LAB MLimited, Lancashire, UK).


2.6 Molekularbiologische Methoden

2.6.1 Molekularbiologische Identifizierungen anhand von 16S rRNA-Gen-

Sequenzanalysen

Um die Isolate molekularbiologisch zu identifizieren, wurde das 16S rRNA-Gen

sequenziert. Dafür erfolgte die DNA-Extraktion mit dem Qiagen DNeasy® Blood and

Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben.

Die Bakterienbiomasse wurde als Zellpellet aus 1 mL Bakteriensuspension durch

Zentrifugation bei 7.500 x rpm extrahiert, anschließend in 180 µL Lysepuffer (20 mg/mL

Lysozym, 20 mM Tris, pH 8,0, 2 mM EDTA, 1,2% Triton X-100) resuspendiert und 30

Minuten bei 37°C inkubiert.

Durch Zugabe von 200 µL des Puffers AL sowie 25 µl Proteinase K und

anschließender Inkubation für 30 Minuten bei 70°C setzte die Lyse der Zellen ein.

Nach Zusatz von 200 µL Ethanol und gründlichen Vortexen wurde die Probe auf die

Säule pipettiert. Durch einen 1-minütigen Zentifugationsschritt bei 8.000 rpm wurde die

Probe durch den Filter in ein Sammelgefäß gedrückt. Die Nukleinsäuren werden dabei

durch Anwesenheit der chaotropen Salze an die Glasfasern des Filters gebunden. Um

PCR-störende Komponenten, Salze, Proteine sowie zelluläre Verunreinigungen von

der Säule zu waschen, wurde die Säule in ein neues Sammelgefäß überführt, mit 500

µL AW1-Puffer versetzt und erneut bei 8.000 rpm eine Minute zentrifugiert. Ein zweiter

Waschschritt erfolgte auf gleicher Weise mit Waschpuffer AW2. Zum Schluss folgte

noch ein letzter Zentrifugationsschritt bei voller Drehzahl (13.200 rpm), um die Säule zu

trocknen. Die DNA wurde schließlich mit Hilfe von 200 µL AE Puffer und Zentrifugation

von der Säule eluiert und anschließend in einem 1,5 mL-Reaktionsgefäß bei -20°C

gelagert. Die Amplifikation der 16S rRNA-Gen-DNA wurde mit der Polymerase

Kettenreaktion (PCR) durchgeführt. Für den Mastermix wurden 0,5 µl (1U/Ansatz) Taq-

PolymeraseBioTherm, Ares Bioscience GmbH, Köln, Deutschland), 1 µl 10mM dNTP´s

(Bioline GmbH, Luckenwalde, Deutschland), 1,5 µL 50 mM MgCl (BioTherm, Ares

Bioscience GmbH, Köln), 1 µL (8pmol/µL) foward-Primer GM3 (VBC, Biotech, Wien,

Österreich), 1 µL (8pmol/µL) reverse-Primer GM4 (VBC, Biotech, Wien, Österreich),

0,75 µL Bovine Serum Albumin (Promega Corporation, Madison, USA) gemischt und

auf 50 µl Reaktionsvolumen mit hochreinem und autoklaviertem HPLC-Wasser

aufgefüllt. Die PCR wurde mit dem Thermocycler (Mastercycler gradient, Eppendorf,

Hamburg, Deutschland) durchgeführt. Das Temperaturprogramm umfasste 10 Zyklen

mit jeweils der Denaturierungsphase bei 95°C (1 Minute), der Annealingphase des

Primers bei 49°C (1 Minute) und der Polymerisation bei 72°C (1,5 Minuten).


Anschließend folgten 20 Zyklen mit jeweils einer Minute bei 95°C, einer Minute bei

44°C sowie 1,5 Minuten bei 72 °C.

Zur Überprüfung der erfolgreichen DNA-Isolierung und der PCR-Amplifikation erfolgte

eine Gelelektrophorese mit einem 1%igen Agarosegel (VWR International GmbH,

Darmstadt, Deutschland) bei 70 V für 40 Minuten. 2 µL des DNA-Extrakts wurden dafür

mit 1 µL DNA Loading Buffer (Bioline GmbH, Luckenwalde, Deutschland) vermischt

und in die Geltaschen gegeben. Als Längenstandard wurden 3 µL einer DNA-Leiter

(HyperLadder I, Bioline GmbH, Luckenwalde, Deutschland) mitgeführt. Das Gel wurde

anschließend mit dem 3-fach konzentrierten DNA-Farbstoff GelRed (Biotium, Hayward,

USA ) 20 Minuten gefärbt und konnte unter UV-Licht betrachtet werden.

Bei erfolgreicher Amplifikation wurde das PCR-Produkt mit dem QIAquick PCR

Purification Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) nach Herstellerangaben aufgereinigt.

Nach Zugabe von 250 µL PB Puffer wurde das Gemisch auf eine Säule pipettiert.

Durch Zentrifugation bei 8.000 rpm wurde die DNA an die Glasfasern der Säule

gebunden. Die Säule wurde anschließend in ein neues Sammelgefäß überführt und mit

PE-Puffer gewaschen, um störende Komponenten zu entfernen. Nach Zugabe von

30 µL EB Puffer und einminütiger Inkubationszeit bei Raumtemperatur wurde durch

Zentrifugation das aufgereinigte PCR-Produkt von der Säule gelöst. Dieses wurde

dann in einem 1,5 mL-Reaktionsgefäß bei -20°C gelagert.

5 µL des aufgereinigten PCR-Produktes wurde mit jeweils 2 µL der Primer GM8Rneu

(5‘-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3‘) und GM1F (Muyzer et al. 1993) (jeweils 20

pmol/µL) versetzt und zur Sequenzierung der Isolate an die Firma SeqLab (Sequence

Laboratories GmbH, Göttingen, Deutschland) geschickt. Die erhaltenen

Basensequenzen wurden zunächst mit dem Programm Chromas Lite (Technelysium

Pty Ltd, Brisbane, Australien) geprüft und falls nötig manuell editiert. Die

Zusammensetzung der Basensequenzen erfolgte mit dem Programm MEGA 5.0

(Tamura et al. 2007). Zum Schluss wurden die erhaltenen Basensequenzen mit

bekannten Gensequenzen über die Datenbank EzTaxon-e server 2.1 (Kim et al. 2012)

abgeglichen.


2.6.2 Molekulare Phylogenie-Analyse

Die Konstruktion eines phylogenetischen Stammbaumes wurde ebenfalls mit dem

Programm MEGA 5.0 (Tamura et al. 2007) mittels „Neighbor-Joining“-Analyse (Saitou

und Nei 1987) durchgeführt. Im „Bootstrap“-Verfahren konnten durch wiederholte

Berechnung (1000x) der Baumtopologie mit dem „Neighbor-Joining“-Verfahren Werte

für die statistische Signifikanz ermittelt werden. Um dieses Ergebnis zu bestätigen,

wurde zusätzlich die „Maximum Liklihood“ Analyse und die „Maximum Parsimony“

Analyse durchgeführt.

2.6.3 DNA-DNA Hybridisierung

Durch die DNA-DNA-Hybridisierung kann man den Grad der Ähnlichkeit zwischen

genetischen Pools von DNA-Sequenzen messen. Die Hybridisierung wurde mit

genomischer DNA des zu testenden Isolates und mit DNA des nächstähnlichen

Typstammes durchgeführt. Es wurde die von Ziemke et al. (1998) beschriebene

Methode verwendet, mit der Ausnahme, dass für die Nick-Translation 2 mg DNA

während einer 3-stündigen Inkubation bei 15°C markiert wurde.

Diese Analyseexperimente wurden von Prof. Peter Kämpfer im Institut für angewandte

Mikrobiologie, Abteilung Mikrobiologie der Recyclingprozesse der Universität Giessen,

durchgeführt.


2.7 Chemotaxonomische Methoden

2.7.1 Fettsäureanalyen

Die Fettsäureprofile der kälteangepassten Isolate wurden gaschromatographisch

bestimmt. Dabei wurde nach der Methode der sauren Methanolyse von Sasser (1990)

und Miller (1982) vorgegangen. Die eingesetzten Lösemittel besaßen HPLC-

Reinheitsgrad. Zunächst wurden die Isolate auf TSA bzw. HT-Agar ausgestrichen und

bei 30°C für 48 Stunden oder bei 10°C für 168 Stunden inkubiert. Anschließend

wurden 40 mg Zellmasse in ein Pyrexröhrchen eingewogen und eine

Fettsäuremethylester-Präparation durchgeführt. Dafür wurde als erstes die

Verseifungsreagenz (15% NaOH in Methanol/bidest. Wasser 1:1 v/v) hinzugegeben

und anschließend bei 100°C gekocht, um die Fettsäuren abzuspalten. Die

anschließende Methylierung erfolgte durch das Methylierungsreagenz (6,0 N

HCl/Methanol 13:11 v/v) und einen weiteren Erhitzungsprozess bei 80°C. Durch

Zugabe von einer Extraktionsreagenz (1:1 Hexan:Methyl-tert-Butylether) wurde eine

Phasentrennung hervorgerufen, durch die die Fettsäuremethylester gewonnen werden

konnten. Nach einer Waschung mit 1,2% NaOH-bidest. H2O-Lösung wurden die

Fettsäuren in ein Glas-Vial überführt und mittels

Gaschromatographie/Massenspektrometrie bestimmt (GC 7890A, GC

Massenspektrometer 5975C, Agilent Technologies, Böblingen). Zur besseren

Detektion hydroxilierter Fettsäuren wurde der Gaschromatograph mit einen FID-

Detektor (GC 6890A, Agilent Technologies, Böblingen, Deutschland) verwendet.

Das Injektionsvolumen betrug 1 µL, welches mit dem Trägergas Helium 5.0 auf die 5%-

ige Phenylmethylsilicon-Kapillarsäule (0,25 mm x 30 m) überführt wurde. Der

Injektorblock besaß eine Temperatur von 250°C und der Säulenofen wurde mit einer

Heizrate von 5°C/min von 120°C auf 240°C erhitzt (Lipski & Altendorf, 1997). Für die

Auswertung wurden die Software ChemStation GCMS Data-Analysis (Agilent

Technologies, Böblingen) verwendet. Die Retentionszeiten der Fettsäuremethylester

wurden mit denen eines Standards (Microbial ID, Newark, USA) abgeglichen und mit

Hilfe des Equivalent-Chain-Length-Wertes (ECL-Wert) über eine hausinterne

Datenbank identifiziert. Zur Überprüfung der Ergebnisse wurde das Massenspektrum

der Peaks ausgewertet. Der prozentuale Gehalt einer Fettsäure wurde durch die

ChemStation Software bestimmt. Die Lagerung der Proben erfolgte bei -20°C.


2.7.2 Chinonanalysen

Die Analyse des Chinongehaltes in Bakterienzellen wurde nach einer modifizierten

Methode von Hiraishi et al. (1996) und Hu et al. (1999) durchgeführt. Die Gewinnung

der Bakterienbiomasse erfolgte aus 100 mL Zellsuspension durch Zentrifugation für 20

Minuten bei 10.000 g. Es folgte eine zweifache Waschung mit 0,9%-iger NaCl-Lösung.

Zum Teil wurden die Zellpellets in einer Gefriertrocknungsanlage (Christ, Alpha 1-2 LD,

Osterode) plus Vakuumpumpe (vacuubrand, Wertheim) lyophyllisiert, um den

potentiellen Fehlerfaktor durch das Gewicht des Wassers zu eliminieren. Alle

eingesetzten Lösemittel besaßen HPLC-Reinheitsgrad.

Die bakterielle Biomasse wurde mit 5 mL Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,4), 10 mL

Methanol und 5 mL Chloroform versetzt. Während des Mischens im Überkopf-Schüttler

für 1,5 Stunden wurden die Chinone aus den Zellen extrahiert. Aufgrund der

Lichtempfindlichkeit der Chinone sowie der Flüchtigkeit der eingesetzten Lösungsmittel

erfolgte dieser Schritt in abgedeckten 50 mL-Pyrexröhrchen mit Teflon-Dichtung.

Anschließend wurden 5 mL bidestilliertes Wasser und 5 mL Chloroform hinzugegeben

und 5 Minuten bei 3.000 g zentrifugiert. Zum Wasserentzug und zur Trocknung des

Lösungsmittels wurde die untere Phase (Chloroform-Methanol-Phase) über

Filterflocken mit wasserfreiem Natriumsulfat filtriert und das Filtrat im

Rotationsverdampfer (CVC 3000 vakuubrand, IKA RV 10 digital, IKA, HB 10 digital,

VWR, Darmstadt) bei 45°C und 100 mbar bis zur Trockne eingeengt.

Zur Extraktion der Chinone wurde anschließend 5 mL bidestilliertes Wasser und 10 mL

Hexan zugesetzt und 5 Minuten geschüttelt. Die Hexanphase wurde in einen neuen

Spitzkolben überführt und die Extraktion im ersten Kolben mit 10 mL Hexan wiederholt.

Die Hexanphasen wurden vereinigt und wieder bis zur Trockne eingeengt. Danach

wurde das Extrakt in 1 mL Hexan wieder aufgenommen und auf eine vorkonditionierte

Silicagelsäule (1 g Sorbent, 6 mL Reservoir, Biotage, Uppsala, Schweden)

aufgetragen. Die Elution der Menachinone erfolgte mit 20 mL eines Hexan-

Diethylether-Gemisches (98:2, v/v). Ubichinone wurden mit 20 mL Hexan-Diethylether

(90:10, v/v) von der Säule gelöst. Die zusammengeführten Extrakte wurden bis zur

Trockne im Rotationsverdampfer eingeengt, in 300 µL Methanol aufgenommen und für

die Analyse in Glas-Vials abgefüllt.

Die Analyse der Chinongehalte erfolgte mittels HPLC (HP Series 1050, Böblingen,

Deutschland). 15 µL der Probe wurden auf die ODS Hypersil RP18-Säule (HP,

Böblingen/Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) injiziiert, die durch den Ofen

(Mistral, Spark Holland, Emmen, Niederlande) auf einer Temperatur von 30°C gehalten

wurde. Als isokratisches Laufmittel wurde ein Gemisch aus Methanol und


Diisopropylether (9:2, v/v) mit einer Flussrate von 1 mL/min eingesetzt. Die Detektion

erfolgte über einen Diodenarray-Detektor (HP Series 1050, Böblingen, Deutschland)

bei 275 nm. Bis zu ihrer Verwendung wurden die Proben bei -20°C abgedunkelt

gelagert.

Zur Auswertung wurde die Software ChemStation (HP, Böblingen, Deutschland)

verwendet. Die auftretenden Peaks konnten über die Retentionszeiten und ihre

charakteristischen UV-Spektren identifiziert werden. Nach der Identifizierung der Ubi-

und Menachinone über das charakteristische UV-Spektrum konnte über das Verhältnis

der Retentionszeiten von Probe zu mitgeführtem Standard und mit Hilfe einer internen

Auswertungstabelle die genaue Chinonart mit der Anzahl an Isopreneinheiten ermittelt

werden. Als Standard wurde Ubichinon Q10 sowie das Phyllochinon Vitamin K1 mit

jeweils einer Konzentration von 100 nmol/mL in Hexan Methanol (1:2, v/v) eingesetzt.

Für die quantitative Bestimmung wurden die Peakflächen von Probe und mitgeführtem

Standard zur Berechnung herangezogen. Die Fläche unter dem Peak gibt die Menge

an absorbiertem Licht in milli-Absorbance-Units mal Sekunde (mAU*s) an. Über die

bekannte Konzentration des Standards und die eingesetzten Biomassenmenge konnte

der Chinongehalt pro Gramm Biomasse bzw. Lyophylisat mit Hilfe einer Formel

berechnet werden.

𝐶ℎ𝑖𝑛𝑜𝑛𝑔𝑒ℎ𝑎𝑙𝑡 𝑖𝑛 𝑑𝑒𝑟 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑒 [𝑛𝑚𝑜𝑙

𝑔]

= 𝑃𝑒𝑎𝑘𝑓𝑙ä𝑐ℎ𝑒 𝑑𝑒𝑟 𝑃𝑟𝑜𝑏𝑒 [𝑚𝐴𝑈 ∗ 𝑠] × 100

𝑛𝑚𝑜𝑙𝑚𝑙

× 0,3 𝑚𝑙

𝑃𝑒𝑎𝑘𝑓𝑙ä𝑐ℎ𝑒 𝑆𝑡𝑎𝑛𝑑𝑎𝑟𝑑 [𝑚𝐴𝑈 ∗ 𝑠] × 𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑠𝑒 [𝑔]

Biomasse in g: Nassgewicht bzw. Trockengewicht

0,3 mL: aufgenommen in 300µl Methanol


2.7.3 Kombinierte polare Lipid- und Chinonanalyse

Dieses Verfahren ist eine kombinierte Methode und nach Minnikin et al. (1984)

modifiziert. Alle Lösungsmittel hatten HPLC-Reinheitsgrad.

In einem ersten Schritt wurden aus lyophylisierter Biomasse mit einen wässrigem

Methanol/Petroleumether (60-80°C)-Gemisch (1:1, v/v) die Chinone extrahiert. Der

Rückstand wurde in Aceton aufgenommen und mittels Dünnschichtchromatographie

auf einer Kieselgelplatte 60F254 getrennt. Als Standard für Menachinone wurde Vitamin

K1, als Standard für Ubichinone wurde Coenzym Q10 mit aufgetragen. Als Laufmittel

diente Petroleumether/Diethylether (85:15, v/v). Das Ergebnis wurde unter einer UV-

Lampe betrachtet. Die getrennten Mena- und Ubichinone wurden dann aus der

Kieselgelplatte eluiert und in der HPLC nach Hu et al. (1999) analysiert. Als

Elutionsmittel für Menachinone diente Diethylether und für Ubichinone Aceton.

In einem zweiten Schritt wurde das Lyophylisat nach der Chinonextraktion weiter mit

Chloroform/Methanol/0,3% NaCl-Lösung (9:10:3, v/v) behandelt, um die polaren Lipide

aus der Zellmembran zu extrahieren. Das gewonnene Extrakt wurde auf eine

Silicagelplatte aufgetragen und zweidimensional entwickelt. Als erstes Laufmittel wurde

Chloroform/Methanol/Wasser (65:25:4, v/v) und als zweites Laufmittel

Chloroform/Essigsäure/Methanol/Wasser (80:15:12:4, v/v) verwendet. Die getrocknete

Kieselgelplatte wurde zuerst mit Ninhydrinsprühreagenz besprüht und 5 Minuten bei

100°C inkubiert, um die Lipide mit freier Aminogruppe sichtbar zu machen. Nach einer

kurzen Abkühlung wurden die Platten mit Molybdänblau-Reagenz besprüht und

ebenfalls für 5 Minuten bei 100°C inkubiert. Entstandene blaue Flecken

kennzeichneten Phospholipide.

Es wurde jeweils eine Dokumentationsplatte unter den gleichen Bedingungen

angefertigt. Diese Platte wurde jedoch nicht mit den verschiedenen Färbereagenzien

besprüht, sondern mit 30% Schwefelsäure behandelt und anschließend erhitzt. Die

sich hier bildenden braunen Flecken kennzeichnen alle auf der Platte aufgetrennten

polaren Lipide.


2.7.4 Carotinoidextraktion

Die Carotinoidextraktionsmethode modifiziert nach Kaiser et al. (2007) und Rezwan et

al. (2007) stellte sich in der Abschlussarbeit von Jacobsen (2013) als effektivste

Extraktionsmethode heraus und würde daher als Carotinoidanalysemethode

angewendet.

Der Zellaufschluss wurde mit Lysozym und Ultraschall durchgeführt, um anschließend

die Carotinoide mit den Lösungsmitteln Methanol und Chloroform zu extrahieren. Alle

verwendeten Lösemittel besaßen HPLC-Reinheitsgrad.

Die Herstellung der Lysozym- (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland, Artikelnr:

L6876) und Lipase- (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland, Artikelnr: L1754)-

Lösung mit einer Konzentration von 2,4 mg/mL erfolgte mit einem Phosphatpuffer mit

pH 7,0. Die zur Extraktion benötigten Lösungsmittel Chloroform und das Chloroform-

Methanol-Gemisch wurden mit der Zugabe von 0,1% Butylhydroxytoluol (Sigma-

Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) stabilisiert. Es wurden 20-50 mg Zelllyophilisat in

50 mL-Pyrexröhrchen eingewogen und in 5 mL Lysozym- und Lipase-Lösung

resuspendiert. Für den Zellaufschluss wurde die Suspension für zwei Stunden bei 37°C

unter Schütteln inkubiert und anschließend für 60 Minuten im Ultraschallbad (Sonorex,

Bandelin electronic, Berlin) behandelt. Nach dem Zellaufschluss wurde die

Zellsuspension in Zentrifugenröhrchen überführt und das Zellpellet durch Zentrifugation

für 10 Minuten bei 12.000 g und 4°C für die Carotinoidextraktion gewonnen.

Für die Extraktion der Carotinoide wurden 4 mL Methanol/Chloroform-Gemisch (7:3,

v/v) zum Zellpellet gegeben und gevortext. Nach einer Zentrifugation für 10 Minuten bei

12.000 g und 4°C wurde der Überstand, bestehend aus dem Extrakt mit den

Carotinoiden, über Filterflocken in ein 50 mL-Pyrexröhrchen überführt. Die Extraktion

wurde je nach Isolat drei- bis viermal wiederholt, bis der Extrakt farblos erschien. Zur

Gewinnung der Chloroformphase wurde den vereinigten Extrakten 10 mL 10%ige

NaCl-Lösung und 3 mL Chloroform hinzugefügt und die Mischung gevortext. Über

einen Zentrifugationsschritt für 5 Minuten bei 4000 rpm und 4°C konnte eine

Phasentrennung erreicht werden. Die untere Chloroform-Phase wurde in einen 25 mL

Spitzkolben überführt. Die Extraktion der Carotinoide aus der wässrigen Phase wurde

wiederholt, bis beide Phasen farblos waren.

Aus den vereinigten Extrakten wurde mit dem Rotationsverdampfer bei 100 mbar und

20-35°C das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand wurde für die photometrische

und chromatographische Carotinoidbestimmung in Hexan aufgenommen.


2.7.4.1 Quantitative Carotinoidbestimmung

Die quantitative Carotinoidbestimmung erfolgte über eine photometrische und eine

chromatographische Methode.

Für die photometrische Bestimmung der Carotinoidkonzentration in den Proben

wurden die Lösungsmittel nach der Extraktion mit dem Rotationsverdampfer bei

100 mbar bei 30°C entfernt und die Rückstände in 1-5 mL Hexan aufgenommen. Das

Hexanvolumen war von der Rückstandsmenge abhängig, um eine Absorption von <1,0

im Spektralphotometer zu erreichen. Nach Rodriguez-Amaya (2001) wurden die

Lösungen bei einer Wellenlänge von 450 nm mit dem Spektralphotometer (Genesys

10uv Scanning, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) gemessen. Die

Berechnung der Carotinoidmenge in der Probe in µg und der Carotinoidkonzentration

als Carotinoidmenge pro Gramm Lyophylisat wurden nach Rodriguez-Amaya (2001)

berechnet. Für ein Gemisch aus verschiedenen unbekannten Carotinoiden wird nach

Britton (1995) die Verwendung eines spezifischen Absorptionskoeffizienten von

2500 x 100𝑚𝐿

𝑔∙𝑐𝑚 vorgeschlagen.

𝑥[µ𝑔] =𝐴 ∙ 𝑦[𝑚𝐿] ∙ 106

𝐴1𝑐𝑚1% ∙ 100

𝑥[µ𝑔

𝑔] =

𝑥[µ𝑔]

𝐸𝑖𝑛𝑤𝑎𝑎𝑔𝑒 [𝑔]

x = Carotinoidmenge in µg bzw. -konzentration in µg/g Trockengewicht

y = Volumen an Lösungsmittel in mL

A = Absorption bei 450 nm

𝐴1𝑐𝑚1% = spezifischer Absorptionskoeffizient (2500

100𝑚𝐿

𝑔∙𝑐𝑚)

Für die chromatographische Bestimmung des Carotinoidgehaltes und zur Auftrennung

des Carotinoidgemisches wurden die Extrakte aus der photometrischen Bestimmung

erneut mit dem Rotationsverdampfer eingedampft. Nach der Entfernung des

Lösungsmittels wurde der Rückstand in 200 µl Hexan aufgenommen, in Glas-Vials

überführt und bis zur Messung bei -20°C gelagert.

Die chromatographische Analyse der Carotinoide wurde nach der modifizierten

Methode von Rählert (2007) durchgeführt. Die Detektion erfolgte wieder über das

HPLC-System mit einen Diodenarray-Detektor (HP Series 1050, Böblingen). 20 µL der

Probe wurden in das HPLC-System injiziert. Die Auftrennung der Analyten erfolgte

über eine auf 20°C temperierte ODS Hypersil RP18-Säule (Thermo Fisher Scientific,


Massachusetts, USA). Als mobile Phase wurde ein Gemisch aus Acetonitril, Methanol

und Isopropanol im Verhältnis 85:10:5 mit einer Flussrate von 0,8mL/min eingesetzt.

Der Diodenarray-Detektor detektierte die aufgetrennten Analyten bei einer Wellenlänge

von 440 nm. Zur Auswertung wurde die Software ChemStation 2.0 (HP, Böblingen)

verwendet. Die erhaltenen Peaks wurden über ihre charakteristischen

Absorptionspektren als Carotinoide identifiziert und der Gesamtcarotinoidgehalt mithilfe

des mitgeführten β-Carotin-Standards berechnet.

Über den Vergleich der gemessen Peakfläche des Standards mit bekannter

Konzentration und der Gesamtpeakfläche der Carotinoide in der Probe wurde die

Carotinoidkonzentration des Extraktes in mg/L nach der nachstehenden Formel

berechnet (Matissek et al. 2010).

𝑋[𝑚𝑔

𝐿] =

𝐹𝑙ä𝑐ℎ𝑒𝑃𝑟𝑜𝑏𝑒 ∙ 𝑚𝑆𝑡𝑑

𝐹𝑙ä𝑐ℎ𝑒𝑆𝑡𝑑 ∙ 𝑉𝐷

X = Carotinoidkonzentration in mg/L

Fläche (Probe) = Gesamtpeakfläche der Probe

Fläche (Std) = Peakfläche Standard

VD = Verdünnung des Standards für die chromatographische Analyse

mStd = Konzentration des Standards in mg/L

Über die Carotinoidkonzentration in mg/L in dem Probenextrakt konnte der

Carotinoidgehalt in der Probe in µg und der Carotinoidgehalt bezogen auf die

Einwaage (Lyophilisat) berechnet werden.

𝑥[µ𝑔] =𝑋[

𝑚𝑔𝐿 ]

106 ∙ 𝑦[µ𝑙]∙ 103

𝑥[µ𝑔

𝑔] =

𝑥[µ𝑔]

𝐸𝑖𝑛𝑤𝑎𝑎𝑔𝑒 [𝑔]

X = Carotinoidkonzentration der Probe in mg/L

x = Carotinoidmenge in der Probe in µg bzw. -konzentration in µg/g

y = Volumen an Lösungsmittel in µl


2.8 Messungen des Zellertrages

2.8.1 Messung des Wachstumsverhaltens mittels optischer Dichte

Zur Bestimmung des bakteriellen Zellertrages wurde von ausgewählten Isolaten eine

Wachstumskurve erstellt. Somit konnte man den bakteriellen Wachstumsverlauf

verfolgen. Hierfür wurde die indirekte Methode der Trübungsmessung gewählt. Dabei

wird die optische Dichte (OD) einer Bakteriensuspension, die innerhalb bestimmter

Grenzwerte proportional zur Zellzahl ist, photometrisch gemessen (Madigan et al.

2008). Als Nährmedium wurde TSB bzw. HT-Bouillon verwendet. Die optische Dichte

wurde bei einer Wellenlänge von 625 nm im Spektralphotometer (Genesys 10uv

Scanning, Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA) gemessen.

Im Verlauf dieser Messung wurde die optische Dichtung in regelmäßigen Abständen

bestimmt. Damit konnten die unterschiedlichen Wachstumsphasen möglichst genau

bestimmt werden. Besonders relevant waren die Zeitpunkte der spätexponentiellen

Wachstumsphase und der stationären Wachstumsphase, weil in diesen Phasen die

optische Dichte am höchsten war. Danach wurde die Messung beendet, da die

Bakterien die stationäre Phase erreicht hatten und kein Anstieg mehr erfolgte.

Die Wachstumsgeschwindigkeit während der exponentiellen Vermehrung wurde über

die Wachstumsrate µ berechnet (Schlegel et al. 2007)

µ = ln(𝑥𝑡) − ln(𝑥0)

𝑡 − 𝑡0

µ: exponentielle Wachstumsrate einer statischen Kultur [h-1]

xt: Zelldichte zum Zeitpunkt t [hier: OD]

x0: Zelldichte zum Zeitpunkt t0 [hier: OD]

t: Zeit am Ende der exponentiellen Wachstumsphase [h]

t0: Zeit zu Beginn der exponentiellen Wachstumsphase [h]

2.8.2 Messung des Proteingehaltes

Zur Messung des bakteriellen Zellertrages wurde zusätzlich neben der Ermittlung der

optischen Dichte eine Proteinbestimmung nach Biuret (Bast 1999) durchgeführt.

Die ausgewählten Isolate wurden in Flüssigkultur (TSB bzw. HT-Bouillon) bis zu dem

Zeitpunkt des Erreichens der spätexponentiellen Wachstumsphase bei der jeweiligen

Temperatur inkubiert.


5 mL dieser Flüssigkultur wurden abgenommen, abzentrifugiert, mit 0,9%-iger NaCl-

Lösung zweimal gewaschen und anschließend die Gesamtproteinmenge des

entstandenen Zellpellets bestimmt. Dafür wurde das jeweilige Zellpellet mit 3 molarer

Natronlauge versetzt und anschließend 5 Minuten bei 100°C gekocht. Danach wurde

2,5% Kupfersulfat-Lösung hinzupipettiert und der Ansatz bei Raumtemperatur für 30

Minuten stehengelassen. Der Ansatz wurde zentrifugiert und der Überstand bei einer

Wellenlänge von 555 nm im Spektralphotometer gemessen.

Zusätzlich zu den Proben wurde eine Eichgerade erstellt. Die gemessenen Extinktion

der entsprechend eingestellten Proteinmengen (in mg pro 5 mL Probenansatz) wurden

als Eichkurve graphisch dargestellt. Somit konnte die Proteinmenge pro Probenansatz

ermittelt werden. Das eingesetzte Volumen wurde dividiert, um den Proteingehalt pro

mL Ausgangssuspension zu erhalten.


2.9 Kälteresistenztest

Bei dem Kälteresistenztest wurde die Resistenz gegenüber Einfrier- und Auftaustress

bestimmter Listerienstämme untersucht.

Dafür würde eine Bakterienkultur des jeweiligen Listerienstammes in HT-Bouillon bis

zur spätexponentiellen Wachstumsphase bei 6 °C wachsen gelassen und die Zellzahl

kulturell im Oberflächenverfahren bestimmt. Danach würde im Dreifachansatz jeweils

1 mL dieser kälteadaptierten Bakteriensuspension bei -20°C für 20 Stunden

eingefroren, anschließend wieder aufgetaut und die Zellzahl erneut kulturell im

Oberflächenverfahren bestimmt. Ein zweiter Dreifachansatz wurde zusätzlich bei -20°C

für 20 Stunden eingefroren, aufgetaut, erneut wieder für 20 Stunden bei -20°C

eingefroren und aufgetaut und dann die Zellzahl kulturell im Oberflächenverfahren

bestimmt. Das Verhältnis der Lebendzellzahl pro mL vor und nach der Behandlung

wurde als Maß für die Stressresistenz gegenüber kalten Bedingungen verwendet.

2.10 Überlebenstest - Zellertragsmessung bei 10°C und 30°C in einem

Modelllebensmittel

Als Modelllebensmittel diente 3,5% ultrahocherhitzte Milch. Isolat Iso 1/11 wurde als

Versuchskeim verwendet. Als Vergleichskeim wurde der Typstamm Listeria

monocytogenes DSM 20600T ausgewählt.

Für den Versuch wurden für jeden Keim jeweils 1 Liter Milch mit 108 KbE/mL inokuliert

(Endkonzentration 105 KbE/mL Milch) und parallel bei 10°C und 30°C inkubiert. Als

Negativkontrolle diente bei beiden Temperaturen 1L Milch, die nicht inokuliert wurde.

Die Ausgangskeimzahl wurde kulturell im Oberflächenverfahren bestimmt. Danach

wurden in bestimmten Abständen die Keimzahlen bestimmt, bis die Absterbephase der

Wachstumskurve einsetzte.


2.11 Physiologisches Reaktionsprofil

Um das biochemische Reaktionsprofil zu bestimmen, wurden verschiedene

biochemische Tests durchgeführt.

Als erster Test wurde der API 20 E®-Test durchgeführt. Es ist ein biochemischer Test,

der zur Identifizierung von Enterobacteriaceae und gram-negativen Stäbchenbakterien

(BioMèrieux, Marcy l'Etoile, Frankreich) verwendet wird. Der Test wurde nach Angaben

des Herstellers durchgeführt.

Zur Analyse der Kohlenhydratverwertung wurde der API50CH Test (BioMèrieux, Marcy

l'Etoile, Frankreich) durchgeführt. Der Test wurde nach Angaben des Herstellers

durchgeführt. Jedoch wurde das CHB-Medium, welches laut Hersteller für die Gattung

Bacillus verwendet werden soll auch für gramnegative Stäbchenbakterien benutzt. Ein

positives Ergebnis wird durch einen Farbumschlag nach Gelb angezeigt; dann wurde in

Folge der Verwertung des Kohlenhydrats Säure gebildet.

Der GN2 Microplate Test (Biolog, Hayward, USA) diente zur Identifikation und

Charakterisierung von aeroben gramnegativen Bakterien. Er beruht auf der Reduktion

von Tetrazolium, welches bei einem aktiven Metabolismus reduziert wird. Es wurden in

einer 96-well Mikrotiterplatte 95 verschiedene Kohlenstoffquellen angeboten. Bei

Verstoffwechselung einer Kohlenstoffquelle kommt es zu einem Farbumschlag, der im

Mikrotiterplattenspektralphotometer (Epoch BioTekR, Winooski, USA) bei 550 nm

gemessen wird.

38 Ergebnisse

3. Ergebnisse

3.1 Makroskopische und mikroskopische Isolatbeschreibung

Nachfolgend werden die Ergebnisse des makroskopischen und mikroskopischen

Bildes sowie das Gramverhalten, die Oxidasereaktion und die Katalasereaktion

aufgeführt. Das makroskopische Bild wurde bei den Isolaten J1 bis J91 auf TS-Agar

beschrieben. Bei Isolat FFL1 und Iso1/11 wurde HT-Agar verwendet.

Insgesamt zeigten 65% aller untersuchten Isolate ein positives Gram-Verhalten und

35% ein negatives Gram-Verhalten.

Tabelle 4: Makroskopische und mikroskopische Eigenschaften aller Isolate sowie deren

Gramverhalten, Katalase- und Oxidasereaktion.

Isolat Makroskopisches Bild Mikroskopisches Bild Gram-verhalten

Kata-lase

Oxi-dase

J1

beige, matt

sehr starkes Wachstum

in Agar gewachsen

wachsartige Konsistenz

fransiger Rand

Stäbchenbakterien

endterminale Sporenbildner

Bakterienketten geschwungen

+ - -

J2

beige-glänzend, durchsichtig

moderates Wachstum

kleine, runde Kolonien mit glattem Rand

kleine, aber dicke Stäbchenbakterien

- + -

J3

gelb, matt

moderates Wachstum

kleine, runde Kolonien mit glattem Rand

Kokken

zusammenhängende Zellverbände

+ + -

J5

weißlich, beige, matt

spröde, trockene Konsistenz

wurzelartiges Koloniewachstum

leicht fransiger Rand

moderates Wachstum

kleine, dünne Stäbchen-bakterien

Sporenbildner

beweglich

+ + -

J6

beige, matt

sehr starkes Wachstum

in Agar gewachsen


fransiger Rand

Faserausbildung

Stäbchen-bakterien

oft in Ketten zusammen-hängend


Bakterienketten geschwungen

+ - -

Ergebnisse 39

J7

gelblich-orange, beige-glänzend

kleine Kolonien

glatter Rand

moderates Wachstum

Stäbchenbakterien + + -

J8

weißlich-beige, matt, leicht glänzend

starkes Wachstum

große Kolonien

leicht, fransiger Rand


Stäbchenbakterien


+ - -

J9

orange, matt, leicht glänzend

moderates Wachstum

runde, mittelgroße Kolonien

glatter Rand

Kokken

oft Sarcinenbildung

+ + +

J10

weißlich-beige, matt

trockene, spröde Konsistenz

starkes Wachstum

fransiger Rand

wurzelartiges Kolonienwachstum

kleine Stäbchenbakterien

+ + -

J11

beige-glänzend

schleimige, visköse Konsistenz

starkes Wachstum

sehr dünne Stäbchenbakterien

- + +

J12

beige-glänzend

starkes, schwirrendes Wachstum

viele kleine Kolonien

leicht fransiger Rand

Stäbchenbakterien


beweglich

+ + +

J16

gelblich-matt

kleine, runde Kolonien

glatter Rand

moderates Wachstum

Kokken

Sarcinenbildung

+ + -

J17

gelblich-matt

geringes Wachstum

kleine Kolonie

runde Kolonien

glatter Rand

Kokken

meist in Zellverbänden

+ + -

J20

pastell-orange,

starkes Wachstum

kleine, runde Kolonien

glatter Rand

kleine, dicke Stäbchenbakterien

wenige Sporenbildner

+ + -

40 Ergebnisse

J21

beiglich-matt,

starkes Wachstum

runde Kolonien, glatter Rand

leicht erhabene Form


- + +

J22

beige, glänzend, leicht durchsichtig

kleine, runde Kolonienmit glattem Rand

flache Kolonien

moderates Wachstum

kleine, dünne Stäbchen

- + -

J23

gelblich-beige, glänzend, leicht matt

runde Form, glatter Rand

moderates Wachstum


- + +

J29 weißlich-matt

kleine Kolonien

moderates Wachstum

Hefe / + -

J32 gelblich-matt

kleine Kolonien

moderates Wachstum

Kokken + + -

J34 hellbeige, glänzend

kleine Kolonien

schwaches Wachstum

Kokken bzw. dicke Stäbchen

+ - -

J39 hellgelb, matt

kleine Kolonien

moderates Wachstum

Kokken + + -

J40 Gelblich-matt

kleine Kolonien

moderates Wachstum

Kokken + + -

J44

hellbeige, matt

große Kolonien

unregelmäßiger Rand

starkes Wachstum

dünne Stäbchen-bakterien

jedoch sehr große Stäbchen

teilsweise Sporenbildung

teilweise zusammen-hängend

+ + -

J45 gelblich-matt

kleine Kolonien

moderates Wachstum

Kokken + + -

Ergebnisse 41

J48 gelblich-matt

kleine Kolonien

moderates Wachstum

Kokken + + -

J50

starke gelb pigmentiert, leicht neonfarbend, glänzend

hydrophiles Pigment

leicht durchsichtig

kleine Kolonien

starkes Wachstum

Kokken + + -

J52

Weiß-opaque

Matte, glatte Oberfläche

runde Kolonien

Rand gekerbt

butterartige Konsistenz

moderates Wachstum

lange Stäbchenbakterien

+ + -

J53

weißlich-gelb

opaque

glänzende, glatte Oberfläche

rundes Kolonien

glatter Rand

schleimige Konsistenz

moderates Wachstum

sehr kleine, Stäbchenbakterien

beweglich

- + +

J54

weiß-milchig opaque

rauhe Oberfläche

unregelmäßiges Koloniebild

Rand gekerbt

visköse Konsistenz

moderates Wachstum

Stäbchenbakterien

zum Teil in 2er oder 3er Ketten

+ + +

J55

beige-glänzend

leicht durchsichtig

runde Kolonien

Rand leicht gekerbt

Butterartige Konsistenz

starkes Wachstum

kurze, dicke Stäbchenbakterien

beweglich

- + -

J57

weißlich-milchig

matte Oberfläche

konzentrische Linien

unregelmäßige Kolonien

wellenförmiger Rand

visköse Konsistenz

moderates Wachstum

kleine, dicke Stäbchenbakterien

+ + +

42 Ergebnisse

J60

weißlich-beige

mittig matt

außen glänzend

rundes Kolonien

Rand leicht gekerbt

butterartige Konsistenz

moderates Wachstum

Stäbchenbakterien

beweglich

+ + -

J61

beige-milchig, glänzend

glatte Oberfläche

rundes Kolonien

leicht erhaben

glatter Rand

visköse Konsistenz

moderates Wachstum


- - +

J67

beige-glänzend

große Kolonien

leichte Erhebung

i.d. Mitte der Kolonie etwas dunkler

moderates Wachstum

Stäbchenbakterien - + +

J70 hell-orange, matt

fransiger Rand

moderates Wachstum

Kokken + + -

J72 beige-glänzend

muffiger Geruch

moderates Wachstum

kokkoide Stäbchenbakterien

+ + -

J73

hell-orange, leicht glänzend, matt

leichte Turmbildung

moderates Wachstum

Kokken + + -

J74 gelb-glänzend

kleine Kolonien

moderates Wachstum

Kokken + + -

J75 gelb-glänzend

moderates Wachstum

Kokken,

oft in Zellverbänden

+ + -

J76

beige-glänzend


moderates Wachstum

Kokken + + -

J77

beige- glänzend

leichte Erhebung in der Mitte der Kolonie

moderates Wachstum

Kokken + + -

Ergebnisse 43

J78 gelb-glänzend

starkes Wachstum

Kokken

oft in Zellverbänden

+ + -

J79 okkafarbend-

glänzend

moderates Wachstum

dicke Stäbchen-bakterien

- + +

J82 weiß-glänzend

glatter Rand

moderates Wachstum

Diplokokken + + -

J84

weiß-glänzend

filamentös

moderates Wachstum

Kokkoide Stäbchenbakterien

- + -

J85

Weiß, durchsichtig, glänzend

glatter Rand

moderates Wachstum

kurze Stäbchenbakterien

- - -

J86

weiß

filamentös, matt

glatter Rand

moderates Wachstum

Hefe + + -

J87

orange, stark pigmentiert

hydrophiles Pigment

glatter Rand

starkes Wachstum

kurze Stäbchenbakterien

beweglich

- + +

J88 hellgelb

glatter Rand

moderates Wachstum

Stäbchenbakterien

beweglich

- + -

J89

weiß-rosé, leicht glänzend


starkes Wachstum

Stäbchenbakterien - + -

J90

Beige-orange, glänzend, durchsichtig

Rand weniger pigmentiert

glatter Rand

konvex

moderates Wachstum

Stäbchenbakterien - - -

J91

Beiglich-weiß, durchsichtig

glatter Rand

moderates Wachstum

Stäbchenbakterien - + +

44 Ergebnisse

FFL1

beige

kleine Kolonien

glatter Rand

schwaches Wachstum


Iso 1/11

beige

kleine Kolonien

glatter Rand

schwaches Wachstum


Ergebnisse 45

3.2 Identifizierung mittels 16S rRNA-Gen Sequenzierung

Nachfolgend sind die Isolatidentifizierungen durch die 16S rRNA-Gen Sequenzierung

aufgelistet. Insgesamt wurden die Spezies von 47 Isolaten mit 98,8%

Sequenzübereinstimmung bestimmt. Das Isolat J22 (bei 1454 bp) lag unter diesen

Wert. Auch Isolat J45 lag unter diesen Wert, jedoch wurde hierbei nur ein Teil (719 bp)

des 16S rRNA-Gens sequenziert.

Tabelle 5: Identifizierung mittels 16S rRNA-Gen Sequenzierung zum nächstähnlichen Typstamm

Isolat Nächstähnlicher

Typstamm Accession-Nr:

Untersuchte Basenpaarlänge

Bp-übereinstimmung in

%

J1 Bacillus cereus ATCC

14579T AE016877 774 99.2

J2 Acinetobacter lwoffii DSM

2403T X81665 721 99.7

J3 Micrococcus luteus NCTC

2665T CP001628 732 99.2

J5 Bacillus pumilus ATCC

7061T ABRX01000007 763 99.2

J7 Solibacillus silvestris

HR3-23T AJ006086 1470 99.6

J9 Macrococcus hajekii

CMM 4809T AY119685 764 99.2

J10 Bacillus altitudinis

41KF2bT AJ831842 753 99.1

J11 Pseudomonas koreensis

Ps 9-14T AF468452 734 98.9

J12 Paenibacillus

glucanolyticus DSM 5162T

AB073189 1495 99.5


2665T CP001628 743 99.3

J17 Kocuria palustris DSM

11925T Y16263 708 99.3

J20 Rhodococcus qingshengii

djl-6T DQ090961 725 98.9

J21 Stenotrophomonas

maltophilia ATCC 13637T AB008509 742 99.1

J22 Pedobacter panaciterrae

Gsoil 042T AB245368 1454 98.7

J23 Achromobacter

marplatensis B2T EU150134 500 98.8

J34 Lactococcus lactis subsp.

lactis NCDO 604T AB100803 733 100.0


2665T CP001628 741 99.5

46 Ergebnisse

J40 Kocuria palustris DSM

11925T Y16263 712 100.0

J44 Bacillus mycoides DSM

2048T ACMU01000002 762 99.3

J45 Microbacterium foliorum

DSM 12966T AJ249780 719 98.6

J48 Kocuria rhizophila DSM

11926T Y16264 666 99.6


2665T CP001628 738 98.9

J52 Bacillus

weihenstephanensis WSBC 10204T

Z84578 726 99.9

J53 Pseudomonas lundensis

ATCC 49968T AB021395 729 99.5

J54 Bacillus mycoides DSM

2048T AE016877 755 99.6

J55 Escherichia coli KCTC

2441T EU014689 746 99.5



J60 Bacillus safensis FO-

036bT AF234854 706 99.9



J64 Chryseobacterium aquaticum 10-46T

AM748690 726 99.7

J67 Pseudomonas libanensis

CIP 105460T AF057645 743 99.2

J70 Staphylococcus xylosus

ATCC 29971T D83374 748 99.1

J74 Microbacterium

maritypicum DSM 12512T AJ853910 897 99.8

J75 Microbacterium oxydans

DSM 20578T Y17227 1435 99.9

J78 Microbacterium oxydans

DSM 20578T Y17227 1437 99.9

J79 Paracoccus sulfuroxidans

LW36T DQ512861 657 98.9

J82 Staphylococcus

saprophyticus ATCC 15305T

AP008934 725 100.0

J84 Acinetobacter lwoffii DSM

2403T AIEL01000120 728 99.7

Ergebnisse 47

J85 Carnobacterium

divergens DSM 20623T M58816 750 99.3

J86 Brochothrix

thermosphacta DSM 20171T

AY543023 759 99.6

J87 Pseudomonas

chlororaphis DSM 21509T FJ168543 943 99.4

J88 Serratia plymuthica DSM

4540T AJ233433 743 100.0

J89 Pantoea agglomerans

DSM 3493T AJ233423 736 99.7

J90 Erwinia rhapontici ATCC

29283T U80206 743 99.6

J91 Pseudomonas baetica

a390T FM201274 741 99.0

FFL1 Listeria monocytogenes

4b H7858 AADR00000000 755 99.6

Iso 1/11


HQ012006 754 99.3

3.2.1 Phylogenetische Beziehung der kälteangepassten Isolate

In Abbildung 5 und 6 ist die phylogenetische Beziehung der kälteangepassten Isolate

einschließlich ihrer nächstähnlichen Typstämme dargestellt. Dabei gehören 18 durch

16S rRNA-Sequenzierung identifizierte Isolate zum Phylum Firmicutes, 13 Isolate

lassen sich dem Phylum Actinobacteria zuordnen, 2 Isolate werden zum Phylum

Bacteroidetes gezählt und 15 Isolate gehören zum Phylum Proteobacteria.

48 Ergebnisse

Abbildung 5: Phylogenetischer Stammbaum der über ihre 16S rRNA-Gensequenzen identifizierten

Wildisolate einschließlich ihrer Typstamm-Referenzsequenzen der Abteilung Firmicutes und

Actinobacteria. Der Stammbaum wurde mit dem Programm „MEGA 5.0“ (Tamura et al. 2007) unter

Verwendung des „Neighbour-Joining-Algorithmus“ (Saitou und Nei 1987) erstellt. Die Korrektheit

der Baumtopologie wurde mit dem Bootstrap-Verfahren (Felsenstein 1985) mit 1.000

Wiederholungen überprüft und Bootstrap-Wert 70% als Zahl gekennzeichnet. Die dargestellte

Skalierung entspricht einer phylogenetischen Distanz von 5 %.

Firm

icu

tes

Actin

ob

acte

ria

Ergebnisse 49

Abbildung 6: Phylogenetischer Stammbaum der über ihre 16S rRNA-Gensequenzen identifizierten

Wildisolate einschließlich ihrer Typstamm-Referenzsequenzen der Abteilung Bacteriodetes und

Proteobacteria. Der Stammbaum wurde mit dem Programm „MEGA 5.0“ (Tamura et al. 2007) unter

Verwendung des „Neighbour-Joining-Algorithmus“ (Saitou und Nei 1987) erstellt. Die Korrektheit

der Baumtopologie wurde mit dem Bootstrap-Verfahren (Felsenstein 1985) mit 1.000

Wiederholungen überprüft und ein Bootstrap-Wert in 70% als Zahl gekennzeichnet. Die

dargestellte Skalierung entspricht einer phylogenetischen Distanz von 5 %.

Pro

teo

bacte

ria

Ba

cte

rio

de

tes

50 Ergebnisse

3.3 Neubeschreibung Isolat J22

Im Verlauf dieser Arbeit wurde das Isolat J22 aus frischen Fleischtortellini isoliert,

welches bei der 16S rRNA-Gen Sequenzierung bei 1454 Basenpaaren nur eine 98,7%

Übereinstimmung mit dem nächstähnlichen Typstamm Pedobacter panaciterrae

LMG23400T aufwies. Durch diese niedrige Sequenzübereinstimmung war eine

Differenzierung auf Speziesebene nicht möglich und muss daher überprüft werden. Um

diesen Verdacht zu bestätigen, wurde eine DNA-DNA Hybridisierung mit dem

nächstähnlichen Typstamm auf 16S rRNA-Gensequenzebene, nämlich Pedobacter

panaciterrae LMG23400T durchgeführt. Hierbei ergab sich ein Wert von weniger als

36%. Der Schwellenwert für eine neu zu beschreibende Spezies wird mit einem

Grenzwert von weniger als 70% angegeben (Wayne et al. 1987), d.h. Isolat J22 gehört

nicht zur Spezies Pedobacter panaciterrae und kann als Vertreter einer neuen Spezies

neu beschrieben werden.

3.3.1 Makroskopische und mikroskopische Zellmorphologie

Isolat J22 wächst unter aeroben Bedingungen und bildet keine Sporen. Das Gram-

negative Stäbchenbakterium hat eine Länge von 2 µm und einem Durchmesser von

0,6 µm. Die Kolonien hatten auf TS-Agar einen Durchmesser von 2 mm nach zwei

Tagen Inkubation bei 30°C. Außerdem war es Oxidase- und Katalase-positiv.

3.3.2 Temperatur- und Salztoleranztest

Die Ergebnisse zum Wachstumstemperaturprofil und der Salztoleranz von Isolat J22

und drei Referenzstämmen sind in Tabelle 6 dargestellt.

Tabelle 6: Wachstumstemperaturprofil und Salztoleranz von Isolat J22 (1) sowie den

Referenzstämmen Pedobacter panaciterrae LMG 23400T (2) , Pedobacter africanus DSM12126T (3)

und Pedobacter heparinus DSM2366T (4)

1 2 3 4

Wachstumsbereich in °C 4-37 4-37 4-37 8-37

NaCl-Toleranz in R2A-Medium (in

%)

0-2 0-3 0-2 0-2

Isolat J22 und alle drei Referenzstämme zeigen Wachstum bis zur Maximaltemperatur

von 37°C. Die Minimaltemperatur für Wachstum liegt, mit der Ausnahme von

Pedobacter heparinus DSM2366T, bei 4°C. Alle vier untersuchten Stämme tolerieren

NaCl-Konzentrationen bis 2%, der Stamm Pedobacter panaciterrae LMG23400T sogar

bis 3%.

Ergebnisse 51

3.3.3 Chemotaxonomische Beschreibung

Als Hauptfettsäuren wurden bei Isolat J22 C15:0 iso und C16:1 cis 9 detektiert. Eine

genaue Auflistung des kompletten Fettsäuremusters von Isolat J22 sowie der drei

weiteren Referenzstämmen zum Vergleich befinden sich in Tabelle 7.

Als einziges respiratorisches Chinon wurde bei Isolat J22 und den Referenzstämmen

Pedobacter panaciterrae LMG23400T, Pedobacter africanus DSM12126T und

Pedobacter heparinus DSM2366T das Menachinon MK-7 detektiert.

Tabelle 7: Fettsäuremuster mittels GC-FID Analyse des Isolates J22 sowie der Referenzstämme

Pedobacter panaciterrae LMG23400T, Pedobacter africanus DSM12126T und Pedobacter heparinus

DSM2366T bei der Wachstumstemperatur von 30°C; Angaben in %.

J22 P. panaciterrae P. africanus P. heparinus

ECLa 12,880 2,4 0,8 0,7 1,0

ECLa 13,530 4,6 4,8 5,6 6,3

ECLa 13,600 - - - 1,3

C 14:0 4,8 3,0 1,5 1,0

C 15:0 iso 34,8 37,5 33,8 31,6

C 15:0 anteiso - 0,7 0,8 1,2

C 15:1 cis 9 0,7 0,8 - 2,5

C 15:0 2,6 1,3 0,5 2,2

C 14:0 3-OH 1,8 - - -

C 16:0 iso 0,7 - - -

C 16:1 cis 9 24,9 35,5 28,6 25,6

C 16:1 cis 11 4,1 3,3 1,9 1,7

C 16:0 7,3 1,6 2,3 1,2

C 15:0 iso 3-OH 2,3 1,4 2,3 3,3

C 17:1 iso cis 9 0,6 3,5 6,5 3,3

C 17:1 iso cis 11 - 1,0 1,5 2,1

C 17:0 cyclo 0,5 - 0,9 0,6

ECLa 17,115 0,7 - - 0,8

C 16:0 3-OH 3,0 0,9 1,5 1,3

ECLa17,875 - - 1,1 0,8

C 17:0 iso 3-OH 4,4 4,1 9,8 8,4

ECLa18,225 - - - 1,5

Verhältnis S/Ub 1,66 1,00 0,99 1,05 a ECL: Equivalent Chain Length b S: gesättigte Fettsäuren C 14:0, C 15:0 iso, C 15:0 anteiso, C 15:0, C 16:0 und C16:0 iso b U: ungesättigte Fettsäuren C 15:1 cis 9, C 16:1 cis 9, C 16:1 cis 11, C 17:1 iso cis 9 und C 17:1 iso cis 11

52 Ergebnisse

Als polare Lipide wurden bei Isolat J22 Phosphatidylethanolamin, zwei Lipide ohne

Aminogruppen, drei Aminolipide und drei Aminophospholipide identifiziert. Außerdem

wurden die polaren Lipide der drei Referenzstämme mit untersucht. Abbildung 8 zeigt

die Dünnschichtchromatographieplatten aller vier Stämme. Die Referenzstämme

zeigten zwar ein ähnliches polares Lipidmuster, jedoch war die Anzahl der einzelnen

Lipidgruppen teilweise unterschiedlich. So bildete der nächstähnliche Typstamm

P. panaciterrae LMG23400T im Gegensatz zu Isolat J22 nur ein Lipid und ein

Aminophospholipid, jedoch insgesamt vier Aminolipide.

Abbildung 7: zweidimensionale Dünnschichtplatten mit polaren Lipidextrakten von Isolat J22 (A),

Pedobacter africanus DSM12126T (B), Pedobacter heparinus DSM 2366T(C) und Pedobacter

panaciterrae LMG23400T (D). L1-L2: unbekannte Lipide, AL1-AL4: unbekannte Aminolipide, APL1-

APL5: unbekannte Aminophospholipide; PE: Phosphatidylethanolamin

Ergebnisse 53

3.3.4 physiologisches Reaktionsprofil

Isolat J22 und alle drei Referenzstämme (Pedobacter panaciterrae LMG23400T,

Pedobacter africanus DSM12126T und Pedobacter heparinus DSM2366T)

verstoffwechselten im API 50CH Test und im GN2-Test D-Cellobiose, D-Glukose, D-

Laktose, D-Maltose und D-Mannose. Im API20E-Test zeigten alle vier Stämme

negative Reaktionen in Bezug auf H2S-Bildung, Indolbildung und Nitratreduktion. Im

Vergleich zu den drei Referenzstämmen verwertete Isolat J22 als einziger Vertreter

Tween 80, Itaconsäure, α-keto Butyrinsäure, d-Alanin, L-Asparaginsäure, Uraconsäure

und Thymidin (Tab. 8). Die Ergebnisse aller Reaktionen befinden sich im Anhang in

Tabelle 22 bis 24.

Tabelle 8: Unterschiedliche biochemische Eigenschaften von Isolat J22 (1), Pedobacter

panaciterrae LMG23400T (2), Pedobacter africanus DSM12126T (3) und Pedobacter heparinus

DSM2366T (4). +: positive Reaktion; w: leicht positive Reaktion, -: negative Reaktion

Verwertung von (API 50CH und GN2-

Microplate)

1 2 3 4

Tween 80 + - - -

L-Arabinose - + w +

D-Fruktose + + - +

D-Raffinose - + - w

D-Trehalose + + - +

D-Turanose - + w +

D-Mannitol - - - +

Essigsäure + - w +

cis-Aconitsäure - + - -

D-Glucosaminsäure - + - -

α-Hyroxybutyrinsäure + - - w

α-keto Butyrinsäure + - - -

Itaconsäure + - - -

D-Alaninamid + - - w

D-Alanin + - - -

L-Asparagin + - - w

L-Asparaginsäure + - - -

L-Leucin + - w -

L-Ornithin + - - w

L-Prolin + - w -

L-Serin + - - w

L-Threonin + w w -

Urocansäure + - - -

Thymidin + - - -

54 Ergebnisse

3.3.5 Molekulare Phylogenie-Analyse und DNA-DNA-Hybridisierung

Der mit der Neighbour-Joining-Analyse erstellte phylogenetische Stammbaum der 16S

rRNA-Gen Sequenz (Abb. 9) zeigt, dass Isolat J22 zu der Gattung Pedobacter

zugeordnet werden kann. Das gleiche Ergebnis wurde auch mit der Maximun-

Likelihood-Methode und der Maximum-Parsimony-Methode erzielt. Diese

phylogenetischen Stammbäume sind im Anhang in Abbildung 42 und 43 dargestellt.

Vergleichende 16S rRNA-Gen-Sequenzanalysen von Isolat J22 (1553 bp) zeigten

Sequenzübereinstimmung mit der Bakterienstämmen Pedobacter panaciterrae

LMG23400T (98,7%), gefolgt von Pedobacter africanus DSM 12126T (98,5%) und

Pedobacter heparinus DSM2366T (98,3%).

Zusätzlich wurde eine DNA-DNA Hybridisierung mit dem nächstähnlichen Typstamm

Pedobacter panaciterrae LMG23400T durchgeführt. Hierbei ergab sich ein Wert von

35,2% und einem reziprokalen Wert von 7,4%.

3.3.6 Namensgebung

Isolat J22 wurde aus frischen Fleischtortellini isoliert, welche bei 6°C gekühlt gelagert

wurden. Dieses Lebensmittelprodukt wurde in Deutschland hergestellt und vertrieben.

Aus diesem Grund wurde für das Isolat J22 der Speziesname Pedobacter nutrimenti

(nu.tri´men.ti L. gen. n. nutrimenti von nutriment (engl.); Nahrungsmittel) vorgeschlagen

(Derichs et al. 2014).

Der Typstamm J22T ist in der Stammsammlung der DSMZ unter der Nummer DSM

27373T und in der Stammsammlung der CCUG mit der Nummer CCUG 64422T

hinterlegt.

Ergebnisse 55

Abbildung 8: Phylogenetischer Stammbaum mit Neighbour-Joining Algorithmus der 16S rRNA

Gensequenzen von Isolat J22 in Relation zu 40 beschriebenen Pedobacter Spezies. Bacteroides

fragilis DSM2151T dient als Außengruppe. „Bootstrap“-Werte ≥70 % sind als Zahl gekennzeichnet.

Der Skalierungsbalken entspricht einem Sequenzunterschied von 0,02%

56 Ergebnisse

3.4 Fettsäuremuster bei 10°C- und 30°C-Inkubation

In Tabelle 9 sind die Hauptveränderungen des Fettsäuremusters der Isolate nach

Wachstum bei verschiedenen Temperaturen dargestellt.

Tabelle 9: Gesamtübersicht – Veränderung des Fettsäuremusters durch Temperaturunterschied

Isolat Hauptfettsäuren Bei 10°C in % Bei 30°C in % Fettsäuremuster bei 10°C im Vergleich zu 30°C

J1 C 13:0 C 15:0 C 16:0

76,1 7,8 4,8

9,3 39,7 9,4

KFS a

J2 C 16:1 cis9 C 16:0 C 18:1 cis 9

54,9 14,3 19,9

42,9 32,4 13,7

UFS b

J3 C 15:0 iso C 15:0 anteiso

5,7 93,9

19,4 75,5

AFS c

J5

C 15:0 iso C 15:0 anteiso C 17:0 iso C 17:0 anteiso

35,9 46,6 6,9 6,0

45,7 4,3 0,0 0,0

LFS d

J6 C 13:0 iso C 15:0 iso

63,0 10,40

27,9 37,0

KFS

J7

C 15:0 iso C 15:0 anteiso C 16:1 iso 5 C 16:0 iso

33,6 4,8 34,7 10,4

53,7 10,7 15,3 3,1

AFS

J8 C 13:0 iso C 15:0 iso

68,4 12,7

25,2 45,7

KFS

J9 C 15:0 anteiso C 17:1 iso cis 5

76,5 7,4

52,7 22,7

AFS


55,2 44,9

67,4 29,4

AFS

J11

C 16:1 cis 9 C 16:0 C 17:0 cyclo C 18:1 cis 11

40,7 35,8 2,9 16,8

27,2 34,3 18,2 14,7

UFS

J12 C 15:0 iso C 15:0 anteiso C 16:0 iso

3,0 71,2 4,3

3,8 73,0 9,8

Keine eindeutige Veränderung im FS-Muster


5,0 93,4

7,2 91,6


J17 C 15:0 anteiso 100,0 100,0 Keine eindeutige Veränderung im FS-Muster

J20 C 16:1 cis 10/trans 9 C 16:0 C 18:1 cis 9

31,3 31,8 27,0

12,8 60,8 13,1

UFS

J21

C 15:0 iso C 15:0 anteiso C 16:1 cis 9 C 16:0

20,0 11,0 32,4 10,7

42,4 12,5 12,4 16,0

UFS

Ergebnisse 57

J22 C 15:0 iso C 16:1 cis 9 C 16:0

43,0 31,8 6,8

38,0 17,3 29,3

UFS

J23


53,7 28,7 1,4 12,1

19,3 49,1 22,3 4,2

UFS


J34 C 16:0 C 19:0 cyclo 11-12

52,3 33,4

81,6 10,3

LFS


9,6 89,6

14,9 84,7



J44

C 13:0 iso C 13:0 anteiso C 15:0 iso C 16:1 c/t 5

37,1 10,9 8,3 26,9

27,9 2,4 45,3 0,0

KFS

UFS


13,3 81,0

13,5 85,0


J48 C 15:0 iso C 15:0 anteiso C 17:0 anteiso

7,7 76,6 11,1

9,3 69,4 18,1


J50 C 15:0 anteiso C 16:0 iso C 17:0 anteiso

49,8 18,2 12,9

56,7 12,3 28,6


J52 C 13:0 iso C 15:0 iso

51,1 7,7

9,0 61,9

KFS

J53


33,0 34,5 12,4 10,7

2,9 45 44,7 0,8

UFS

J55 C 16:0 C 17:0 cyclo C 18:1 cis 11

40,3 4,7 39,5

60,5 16,4 8,3

UFS

J57 C 15:0 iso C 15:0 anteiso C 16:1 cis 9

28 17,9 38,7

55,9 22,0 8,4

UFS


54,3 45,7

58,1 40,5

AFS

J63


48,8 16,0 1,1 16,3

34,1 32,7 10,9 10,1

UFS

J61 C 15:0 iso C 15:0 anteiso C 16:1 cis 9

30 18 35,4

48,8 18,1 10,0

UFS

J67 C 16:1 cis 9 C 16:0 C 18:1 cis 11

44,6 18,0 23,4

31,7 31,3 9,7

UFS

J70


10,0 15,2 16,4 50,5

6,8 11,6 17,6 54,3


58 Ergebnisse

a KFS: kurzkettige Fettsäuren

b UFS: ungesättigte Fettsäuren

c AFS: anteiso-verzweigte Fettsäuren

d LFS: langkettige Fettsäuren

e IFS: iso-verzweigte Fettsäuren

Die komplett ermittelten Fettsäuremuster werden im Anhang in Tabelle 15 aufgelistet.

Aus der Tabelle 9 wird ersichtlich, dass es einige Isolate gab, die ihre Hauptfettsäuren

bei einem Temperaturunterschied von 20°C nicht eindeutig änderten. Zu diesen zählen

die Isolate J12, J16, J17, J32, J39, J40, J45, J50, J70, J74, J75, J78. In den

Abbildungen 10 bis 16 sind die Fettsäuremuster mit prozentualem Anteil als

J72 C 16:1 cis 9 C 16:0 C 18:1 cis 9

30,2 6,0 44,3

16,3 26,5 36,0

UFS


60,8 18,5 12,1

59,0 21,8 16,6



59,7 10,0 11,2

53,7 14,3 21,0


J76 C 16:1 cis 9 C 16:0 C 18:1 cis 9

29,3 6,6 44,3

13,9 28,3 38,3

UFS

J78


17,7 50,0 15,3 6,6

12,8 52,9 15,0 18,2


J82 C 15:0 anteiso C 17:0 anteiso

85,7 13,3

79,0 9,6

AFS

J84

C 16:1 cis 9 C 16:0 C 18:1 cis 7 C 18:1 cis 11

62,2 7,5 13,2 11,4

43,5 26,2 15,8 6,7

UFS

J86 C 15:0 anteiso 98,2 81,5 IFS e

J87 C 16:1 cis 9 C 16:0 C 18:1 cis 11

26,2 18,8 13,4

11,1 41,8 3,0

UFS

J88 C 16:1 cis 9 C 16:0

53,8 32,2

27,2 52,4

UFS

J89 C 16:1 cis 9 C 16:0

47,1 39,7

28,5 50,5

UFS

J90 C 16:1 cis 9 C 16:0 C 18:1 cis 11

48,5 27,4 16,6

30,6 45,3 5,9

UFS

J91 C 16:1 cis 9 C 16:0 C 18:1 cis 11

48,3 26,2 19,8

28,0 61,1 1,4

UFS

FFL 1 C 15:0 anteiso C 17:0 anteiso

84,9 6,8

67,8 25,0

KFS

Iso 1/11 C 15:0 anteiso C 17:0 anteiso

85,7 8,7

67,7 27,9

KFS

Ergebnisse 59

Säulendiagramm von diesen Isolaten dargestellt. Alle anderen Isolate zeigten eine teils

eindeutige Veränderung im Fettsäureprofil bei einem Temperaturunterschied. In den

Abbildungen 16 und 17 sind als Beispiel die Fettsäuremuster von Isolaten dargestellt,

die eine Anpassung im Fettsäuremuster in Bezug auf Kälteeinfluss zeigten.

Abbildung 9: Fettsäuremuster von Paenibacillus glucanolyticus J12 bei den

Wachstumstemperaturen 10°C und 30°C

In Abbildung 9 erkennt man, dass Paenibacillus glucanolyticus J12 keine eindeutigen

Veränderungen im Fettsäuremuster in Bezug auf einen Temperaturunterscheid zeigte.

Sowohl bei 10°C als auch bei 30°C wurde mit über 70% die Hauptfettsäure C15:0

anteiso gebildet. Die ungesättigte Fettsäure C16:1 c/t 5 wurde ca. 9% vermehrt bei

10°C gebildet, jedoch ist fraglich, ob dieser Effekt die Kälteadaptation erklären kann.

1,4

1,1

3,0

71

,2

11

,0

3,7

4,3 1

,4

1,3

1,7

0,7

0,2

3,8

73

,0

0,8

1,9 0,2

9,8

3,0 0

,4

6,1

0

10

20

30

40

50

60

70

80

An

teil

in %

Paenibacillus glycanolyticus J12

10°C

30°C

60 Ergebnisse

0,0

1,2

5,0

93

,4

0,0

0,0

0,7

0,0

7,2

91

,6

0,6

0,0

0,0

0,0

9,6

89

,6

0,5

0,0

0,0

0,0

14

,9

84

,7

0,3

0,0

1,1 0,0

13

,3

81

,0

3,2 0

,4

0,6

0,0

13

,5

85

,0

0,9

0,0

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

An

teil

in %

Micrococcus luteus J16, Micrococcus luteus J39 und Microbacterium foliorum J45

J16 10°C

J16 30°C

J39 10°C

J39 30°C

J45 10°C

J45 30°C

Abbildung 10: Fettsäuremuster von Micrococcus luteus J16, Micrococcus luteus J39,

Microbacterium foliorum J45 und bei den Wachstumstemperaturen 10°C und 30°C

Alle Isolate in Abbildung 10 weisen mit über 80% C15:0 anteiso als Hauptfettsäure auf.

Ähnlich wie bei Paenibacillus glucanolyticus J12 gibt es keine eindeutige Verschiebung

im Fettsäuremuster in Bezug auf einen Temperaturwechsel.

Ergebnisse 61

Abbildung 11: Fettsäuremuster von den Isolaten Kocuria palustris J17und Kocuria palustris J40

bei den Wachstumstemperaturen 10°C und 30°C

In Abbildung 11 ist erkennbar, dass es keine deutliche Veränderung im

Fettsäuremuster in Bezug auf einen Temperaturunterschied gibt. Diese Isolate gehören

der Spezies Kocuria palustris an.

Abbildung 12 Fettsäuremuster von Isolat Kocuria rhizophila J32 bei den Wachstumstemperaturen

10°C und 30°C

10

0,0

0,0

0,0

10

0,0

0,5

2,1

97

,3

0,4

0,7

98

,1

0

20

40

60

80

100

An

teil

in %

Kocuria palustris J17 und Kocuria palustris J40

J17 10°C

J17 30°C

J40 10°C

J40 30°C

89

,1

3,6 0,4

87

,8

2,8

1,9

0

20

40

60

80

100

An

teil

in %

Kocuria rhizophila J32

10°C

30°C

62 Ergebnisse

Abbildung 13: Fettsäuremuster von Isolat Kocuria rhizophila J32 bei den Wachstumstemperaturen

10°C und 30°C

Auch Abbildungen 12 und 13 zeigen, dass es keine eindeutigen Veränderungen im

Fettsäureprofil von den Isolaten J32 und J48 gibt. Die Isolate gehören der Spezies

Kocuria rhizophila an.

7,7

76

,6

4,3 0

,6

11

,1

9,3

69

,4

2,0

0,9

18

,10

20

40

60

80

100

An

teil

In %

Kocuria rhizophila J48

10°C

30°C

Ergebnisse 63

Abbildung 14: Fettsäuremuster von den Isolaten Micrococcus luteus J50, Microbacterium oxydans

J75 und Microbacterium oxydans J78 bei den Wachstumstemperaturen 10°C und 30°C

Das Fettsäuremuster von den Isolaten aus der Abbildung 14 unterschied sich teilweise

von den Fettsäuremustern der anderen Isolate. So zählten zu den Hauptfettsäuren

C15:0 anteiso und C17:0 anteiso. Außerdem wurde die Fettsäure C16:0 iso mit über

10% am Gesamtanteil gebildet. Zusätzlich wurde bei Kälteeinwirkung die ungesättigte

Fettsäure C14:1 trans 2 gebildet.

9,5 7

,4

49

,8

18

,2

0,9

0,8

12

,9

0,0

1,4

56

,7

12

,3

0,7

0,4

28

,6

9,0

9,7

59

,7

10

,0

0,0

0,3

11

,2

0,0

9,1

53

,7

14

,3

0,0

2,0

21

,0

4,5

9,4

56

,7

12

,2

0,0

1,1

16

,1

0,0

12

,2

53

,3

15

,2

0,3

1,8

17

,7

0

10

20

30

40

50

60

70

An

teil

in %

Micrococcus luteus J50, Microbacterium oxydans

J75 und Microbacterium oxydans J78

J50 10°C

J50 30°C

J75 10°C

J75 30°C

J78 10°C

J78 30°C

64 Ergebnisse

Abbildung 15: Fettsäuremuster von den Isolaten Staphylococcus xylosus J70 bei den


In Abbildung 15 ist zu erkennen, das bei dem Isolat Staphylococcus xylosus J70 bei

10°C und 30°C die Hauptfettsäure C15:0 anteiso.

Alle anderen Isolate zeigten eine Verschiebung im Fettsäuremuster unter Kälteeinfluss.

Als Beispiel hierfür sind die Isolate J7, FFL1 und Iso 1/11 in den Abbildungen 17 und

18 dargestellt. In Abbildung 17 ist zu erkennen, dass eine Verkürzung der Kettenlänge

bei Kälteeinfluss zu ca. 20% stattfindet. In Abbildung 18 ist ersichtlich, dass sich die

ungesättigte Fettsäure C16:1 c/t 5 von 15% auf 35 % durch Kälteeinfluss erhöht.

10

,0

15

,2

0,5

0,9

16

,4

50

,5

0,3

0,1

0,7

0,8

0,8

3,5

6,8

11

,6

0,6

0,7

17

,6

54

,3

0,4

0,5

0,0

0,0

2,5

4,8

0

10

20

30

40

50

60

An

teil

in %

Staphylococcus xylosus J70

10°C

30°C

8,3

84

,9

0,0

0,0

0,0

6,8

5,6

67

,8

1,0

0,2

0,4

25

,0

5,6

85

,7

0,0

0,0

0,0

8,73

,6

67

,7

0,3

0,3

0,1

27

,9

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

An

teil

in %

Listeria monocytogenes FFL1 und Listeria monocytogenes Iso 1/11

FFL 1 10°C

FFL 1 30°C

Iso 1/1110°C

Iso 1/1130°C

Ergebnisse 65

Abbildung 16: Fettsäuremuster von den Isolaten Listeria monocytogenes FFL1 und Listeria

monocytogenes Iso 1/11 bei den Wachstumstemperaturen 10°C und 30°C

Abbildung 17 Fettsäuremuster von Isolat Solibacillus silvestris J7 bei den


33

,6

4,8

34

,7

10

,4 5,6 3

,0

53

,7

10

,7

15

,3

3,1

4,9

3,9

0

10

20

30

40

50

60

An

teil

in %

Solibacillus silvestris J7

10°C

30°C

66 Ergebnisse

3.5 Chinonmuster und -gehalt bei 10°C- und 30°C-Inkubation

3.5.1 Qualitative Chinonanalyse

Die Isolate, die keine Veränderung im Fettsäuremuster aufwiesen, wurden im 2. Schritt

auf den Chinongehalt untersucht. Zusätzlich wurden auch Isolate auf Chinongehalte

untersucht, die ein verändertes Fettsäuremuster bei einem Temperaturunterschied von

20°C aufwiesen, um einen zusätzlich möglichen Kälteanpassungsmechanismus

aufzuzeigen.

Hierbei wurde zuerst eine qualitative Beurteilung durchgeführt. Die Ergebnisse sind in

Tabelle 10 dargestellt. Hierbei handelte es sich um ein Art Screening, inwieweit sich

der prozentuale Anteil von Chinonen bei den unterschiedlichen Temperaturen

verändert und/oder neue Chinone gebildet werden. Zusätzlich wurde mit der gleichen

Methode und mit Hilfe eines mitgeführten Standards quantitativ von ausgewählten

Isolate (Tab. 11) der jeweilige Chinongehalt bestimmt. Die quantitative Chinonanalyse

wurde anfangs mit feuchter Biomasse durchgeführt, im Laufe der Untersuchungen

stellte sich jedoch durch hohe Standardabweichungen heraus, dass der Wasseranteil

der Biomasse zu starken Varianzen führen kann und daher wurde die Analyse auf

gefriergetrocknetes Material umgestellt.

Tabelle 10: Chinongehalt in % der untersuchten Isolate

Isolat Chinon Relative Retentionszeit

Anteil in % bei 10°C

Anteil in % bei 30°C

B. cereus J1 MK-7 1,34 100 100

M. luteus J3

MK-7 MK-7 (H2) MK-8 MK-8 (H2) MK-9 (H2)

1,34 1,46 1,65 1,84 2,30

0 13 0 87 0

4 15 18 59 3

B. pumilus J5 MK unbekannt MK-7

0,70 1,34

27 73

8 82

S. silvestris J7 MK-6 MK-7

1,10 1,34

4 96

16 84

M. carouselicus J9 MK unbekannt MK-6

0,70 1,10

3 97

20 80

P. glucanolyticus J 12 MK-7 1,34 100 100

M. luteus J16

MK unbekannt MK unbekannt MK-7 MK-7 (H2) MK-8 (H2) MK-8 (H4) MK-9 (H2)

0,90 1,21 1,34 1,46 1,80 2,02 2,25

0 3 2 92 3 0 0

1 0 0 10 77 7 5

Ergebnisse 67

K. palustris J17

MK unbekannt MK-7 MK-7 (H2) MK-8 MK-8 (H2) MK-8 (H4) MK-9 (H2)

1,20 1,34 1,46 1,65 1,80 2,02 2,25

0 0 7 15 72 3 3

3 2 90 0 5 0 0

R. qingshengii J20

MK unbekannt MK unbekannt MK-6 MK-8 (H2) MK unbekannt

0,70 1,00 1,10 1,85 2,35

6 0 0 94 0

3 1 2 90 3

S. maltophilia J21 MK-8 (H2) 1,85 100 100

Q unbekannt Q-8

0,55 0,68

0 100

2 98

Pedobacter nutrimenti J22 MK-7 1,34 100 100

A. marplatensis J23 Q-8 0,68 100 100

L. lactis J34

MK unbekannt MK-7 MK-8 MK-8 (H4)

0,70 1,34 1,65 2,02

86 14 0 0

37 12 14 37

K. rhizophila J32

MK unbekannt MK-7 MK-7 (H2) MK-8 (H2)

1,21 1,34 1,46 1,84

0 0 100 0

6 2 89 3

M. luteus J39

MK-7 MK-7 (H2) MK-8 MK-8 (H2) MK-9 (H2)

1,34 1,46 1,65 1,80 2,29

0 12 0 88 0

3 10 14 70 3

K. palustris J40

MK unbekannt MK unbekannt MK-7 (H2) MK-8 (H2)

1,00 1,20 1,46 1,80

5 7 83 5

10 11 78 0

M. luteus J45

MK unbekannt MK unbekannt MK-7 (H2) MK-8 (H2)

0,90 1,00 1,46 1,80

4 1 12 83

17 0 42 41

K. rhizophila J48

MK unbekannt MK unbekannt MK unbekannt MK unbekannt MK unbekannt MK-7 MK-7 (H2) MK-8 (H2)

0,74 0,78 0,90 1,20 1,28 1,34 1,46 1,80

0 0 0 4 4 4 80 8

2 2 4 5 0 3 62 22

M. luteus J50

MK unbekannt MK unbekannt MK-9 (H4) MK unbekannt MK-12

0,70 0,80 2,55 3,27 4,20

5 17 0 12 65

0 50 1 11 38

B. weihenstephanensis J52 MK-7 1,34 100 100

E. coli J55

MK-7 MK-8

1,34 1,65

0 100

8 92

Q unbekannt Q-8

0,55 0,68

1 99

4 96

68 Ergebnisse

S. maltophilia J57 Q unbekannt Q-8

0,55 0,68

0 100

2 98

B. safensis J60 MK-6 MK-7

1,10 1,34

0 100

1 99

M. oxydans J75

MK unbekannt MK unbekannt MK-11 MK-12

0,70 0,80 3,27 4,20

10 11 9 70

7 25 23 45

M. oxydans J78

MK unbekannt MK unbekannt MK-11 MK-12

0,70 0,80 3,27 4,20

4 15 11 70

0 9 30 61

A. lwoffii J 84

Q unbekannt Q-8 Q-9 Q-10

0,56 0,65 0,80 1,00

1 31 65 1

1 30 68 1

B. thermosphacta J86 MK-7 1,34 100 100

P. agglomerans J89

MK-7 MK-8

1,34 1,65

4 96

6 94

Q unbekannt Q unbekannt Q-8

0,48 0,56 0,65

0 2 98

1 6 93

P. baetica J91 Q-8 Q-9 Q-10

0,65 0,80 1,00

3 97 0

5 94 1

Ergebnisse 69

3.5.2 Quantitative Chinonanalyse

3.4.2.1 Gesamtchinongehalt

In Abbildung 18 und 19 ist der Gesamtchinongehalt in nmol/g Nassgewicht bzw. in

nmol/g Lyophylisat der verschiedenen Isolate dargestellt.

Die meisten Isolate wurden im Zweifachansatz untersucht. Bei den Isolaten J7 und J12

wurde bei 10°C bei Messung in nmol/g Nassgewicht ein 6-fach bzw. 5-fach-Ansatz

durchgeführt.

Abbildung 18: Gesamtchinongehalt in nmol/g Biomasse

Im Laufe der Arbeit stellte sich vor allem durch Untersuchungen der Isolate J7 und 12

heraus, dass es effizienter ist, mit lyophylisierten Zellmaterial zu arbeiten, da die

Ausbeuten besser ausfielen. Gerade Isolat J7 und J12 schienen interessant, da hier

bei 10°C laut Untersuchung mehr Chinon bei 10°C gebildet wurde. In Abbildung 19 ist

der Gesamtchinongehalt in nmol/g Lyophylisat dargestellt.

-200

0

200

400

600

800

1000

J1 J7 J11 J12 J16 J17 J20 J21 J22 J23 J34

nm

ol/

g B

iom

asse

Gesamtchinongehalt

10°C

30°C

70 Ergebnisse

Abbildung 19: Gesamtchinongehalt in nmol/g Lyophylisat

3.4.2.2 Quantitativer Gehalt der einzelnen Chinone

Wie man in Tabelle 11 erkennen kann, bildeten die Isolate Bacillus cereus J1,

Rhodococcus qingshengii J20, Stenotrophomonas maltophilia J21, Achromobacter

marplatensis J23, Kocuria palustris J40; Acinetobacter lwoffii J84 und Pseudomonas

baetica J91 vermehrt Chinone bei einer Inkubationstemperatur von 30°C.

Im Gegensatz dazu, veränderte sich der Chinongehalt der Isolate Solibacillus silvestris

J7, Brochothrix thermosphacta J86 und Pantoea agglomerans J89 bei einer

Inkubationstemperatur von 10°C und 30°C kaum.

Bei den Isolaten Microbacterium oxydans J75 und J78 wurde zwar der

Gesamtchinongehalt bei einer Inkubationstemperatur von 30°C erhöht, jedoch wurde

bei einer Inkubationstemperatur von 10°C zusätzlich das unbekannte Menachinon mit

der relativen Retentionszeit von 0,70 gebildet.

Bei den Isolaten Paenibacillus glucanolyticus J12 und Pedobacter nutrimenti J22

wurde zwei- bis dreifach vermehrt das Menachinon MK-7 bei einer

Inkubationstemperatur von 10°C gebildet. Bei dem Ergebnis bei 30°C von Isolat J22

handelt es ich jedoch nur um eine Einfachbestimmung.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

J7 J12 J40 J45 J75 J78 J84 J86 J89 J91

nm

ol/

g Ly

op

hyl

isat

Gesamtchinongehalt

10°C

30°C

Ergebnisse 71

Tabelle 11: Chinongehalt in nmol/g Biomasse

Isolat

Inkuba

tions-

tempe-

ratur

Chinon Rel.

RT a) Gehalt in nmol/g

Bacillus cereus J1 1) 10°C MK-7 1,34 408,3 ± 34,7

30°C MK-7 1,34 825,3 ± 20,9

Solibacillus silvestris J7 2)

10°C MK-6

MK-7

1,10

1,34

15,9 ± 3,2

376,1 ± 114,8

30°C MK-6

MK-7

1,10

1,34

28,5 ± 10,5

357,0 ± 249,4

Paenibacillus glucanolyticus J12 2) 10°C MK-7 1,34 887,6 ± 172,2

30°C MK-7 1,34 283,4 ± 104,2

Rhodococcus qingshengii J20 1)

10°C

MK-unbekannt

MK-8 H2

MK-unbekannt

0,70

1,85

2,35

1,6

24,4

0,0

30°C

MK-unbekannt

MK-8 H2

MK-unbekannt

0,70

1,85

2,35

1,9

77,6

2,1

Stenotrophomonas maltophilia J21 1)

10°C

MK-unbekannt

MK-8 H2

Q-unbekannt

Q-8

0,70

1,85

0,55

0,68

0,6

15,1

0,0

81,0

30°C

MK-unbekannt

MK-8 H2

Q-unbekannt

Q-8

0,70

1,85

0,55

0,68

2,1

6,7

4,3

178,2

Pedobacter nutrimenti J22 1) 10°C MK-7 1,34 241

30°C MK-7 1,34 118,8

Achromobacter marplatensis J23 1) 10°C Q-8 0,68 407,9

30°C Q-8 0,68 608,7

72 Ergebnisse

Kocuria palustris J40 2)

10°C

MK-unbekannt

MK-unbekannt

MK-7 H2

MK-8 H2

1,00

1,20

1,46

1,84

9,7 ± 4,1

27,0 ± 3,7

542,9 ± 188,1

14,9 ± 5,1

30°C

MK-unbekannt

MK-unbekannt

MK-7 H2

MK-8 H2

1,00

1,20

1,46

1,84

36,4 ± 5,7

214,3 ± 50,1

2446,1 ± 695,0

0,0

Microbacterium oxydans J75 2)

10°C

MK-unbekannt

MK-unbekannt

MK-11

MK-12

0,70

0,80

3,27

4,20

15,7 ± 0,9

19,1 ± 1,0

21,6 ± 10,0

154,7 ± 49,0

30°C

MK-unbekannt

MK-unbekannt

MK-11

MK-12

0,70

0,80

3,27

4,20

0,00

85,4

75,0

150,6

Microbacterium oxydans J78 2)

10°C

MK-unbekannt

MK-unbekannt

MK-11

MK-12

0,70

0,80

3,27

4,20

8,3 ± 0,8

26,7 ± 3,0

17,4 ± 5,6

114,8 ± 26,7

30°C

MK-unbekannt

MK-unbekannt

MK-11

MK-12

0,70

0,80

3,27

4,20

0

34,2

114,4

235,8

Acinetobacter lwoffii J84 2)

10°C

Q-unbekannt

Q-8

Q-9

Q-10

0,55

0,68

0,80

1,00

3,8 ± 0,8

166,7 ± 0,5

362,9 ± 20,6

5,80 ± 0,23

30°C

Q unbekannt

Q-8

Q-9

Q-10

0,55

0,68

0,80

1,00

10,5 ± 2,1

264,2 ± 82,4

623,0 ± 265,1

9,8 ± 5,6

Brochothrix thermosphacta J86 2) 10°C MK-7 1,34 61,4 ± 3,0

30°C MK-7 1,34 60,7 ± 10,6

Pantoea agglomerans J89 2) 10°C

MK-7

MK-8

Q unbekannt

Q unbekannt

Q-8

1,34

1,85

0,50

0,56

0,68

3,5 ± 0,6

88,4 ± 8,6

1,5 ± 0,2

15,1 ± 5,5

659,2 ± 49,7

Ergebnisse 73

30°C

MK-7

MK-8

Q-unbekannt

Q-unbekannt

Q-8

1,34

1,85

0,50

0,56

0,68

10,8 ± 3,4

166,4 ± 60,1

4,4 ± 0,6

36,3 ± 3,2

486,0 ± 122,8

Pseudomonas baetica J91 2)

10°C

Q-unbekannt

Q-8

Q-9

Q-10

0,55

0,65

0,80

1,00

1,4 ± 0,0

24,5 ± 3,8

1668,1 ± 1357,2

0 ± 0,0

30°C

Q-unbekannt

Q-8

Q-9

Q-10

0,55

0,65

0,80

1,00

7,5 ± 6,5

84,7 ± 39,5

2164,0 ± 1586,5

19,1 ± 14,9

a) relative Rententionszeit 1) nasse Zellen als Biomasse 2) Lyophylisat als Biomasse

74 Ergebnisse

3.6 Carotinoidgehalt bei 10°C- und 30°C-Inkubation

Im Laufe der Arbeit stellte sich heraus, dass einige Bakterienisolate eine stärkere

Pigmentbildung bei 10°C Inkubationstemperatur zeigten als bei 30°C

Inkubationstemperatur. Aus den Abbildungen 20 bis 24 ist beispielhaft ersichtlich, dass

sich die Intensität der Pigmentbildung der Isolate J7, J48, J50 und J70 bei 10°C im

Vergleich zu 30°C unterscheidet.

Abbildung 20: Isolat Solibacillus silvestris J7 bei 10°C (links) und 30°C (rechts)

Inkubationstemperatur

Abbildung 21: Isolat Kocuria rhizophila J48 bei 10°C (links) und 30°C (rechts)


Ergebnisse 75

Abbildung 22: Isolat Micrococcus luteus J50 bei 10°C (links) und 30°C (rechts)


Abbildung 23: Isolat Staphylococcus xylosus J70 bei 10°C (links) und 30°C (rechts)


Abbildung 24: Isolat Microbacterium maritypicum J74 bei 10°C (links) und 30°C (rechts)


76 Ergebnisse

Um den Carotinoidgehalt zu bestimmen, wurde in den Abschlussarbeiten von Murr

(2013) und Jacobsen (2013) nach einer effizienten Extraktionsmethode gesucht. In

Abbildung 25 und 26 sind die Ergebnisse von Jacobsen (2013) dargestellt. Zusätzlich

wurden in dieser Abschlussarbeit von den Isolaten Kocuria rhizophila J48, Micrococcus

luteus J50 und Staphylococcus xylosus J70 die nächstähnlichen Typstämme auf ihren

Carotinoidgehalt bei 10°C und 30°C untersucht und miteinander verglichen. Diese

Ergebnisse sind in Abbildung 27 dargestellt.

Abbildung 25: Gesamtcarotinoidgehalt in µg/g Lyophylisat nach photometrischer Messung bei

10°C und 30°C Inkubationstemperatur der Isolate S. silvestris J7, K. rhizophila J32, K. rhizophila

J48, M. luteus J50, S. xylosus J70, M. maritypicum J74 und M. oxydans J75

Die Ergebnisse aus der photometrischen Methode zeigen, dass bei den Isolaten

K. rhizophila J48, M. luteus J50 und S. xylosus J70 eine vier- bis sechsfache Zunahme

der Carotinoidgehaltes in der kälteren Umgebung stattfand. Geringere Unterschiede

zwischen den Wachstumstemperaturen wiesen dagegen die Isolate K. rhizophila J32

und M. oxydans J75 auf. Bei S. silvestris J7 und M. maritypicum J74 konnte kein

signifikanter Unterschied im Carotinoidgehalt ermittelt werden. Dies ist jedoch

verwunderlich, da man in Abbildung 20 und 24 eine deutliche Veränderung der

Pigmentierung bei 10°C erkennen kann.

25,5

139,8

223,5248,6 254,9

68,796,5

19,6

78,656,4 58,3 39,9

79,759,1

0

50

100

150

200

250

300

S. silvestris J7 K. rhizophilaJ32

K. rhizophilaJ48

M. luteus J50 S. xylosus J70 M. maritypicumJ74

M. oxydans J75

Car

ote

no

idge

hal

t [µ

g/g]

Gesamtcarotinoidgehalt bei 10°C und 30°Cnach der photometrischen Bestimmung

10°C

30°C

C

Ergebnisse 77

Abbildung 26: Gesamtcarotinoidgehalt in µg/g Lyophylisat nach chromatographischer

Bestimmung mittels HPLC bei 10°C und 30°C Inkubationstemperatur der Isolate S. silvestris J7, K.

rhizophila J32, K. rhizophila J48, M. luteus J50, S. xylosus J70, M. maritypicum J74 und M. oxydans

J75

Auch nach der chromatographischen Bestimmung wurde bei den Isolaten

K. rhizophila J48, M. luteus J50 und S. xylosus J70 der größte Anstieg des

Carotinoidgehaltes bei 10°C festgestellt. In Abhängigkeit von der verwendeten

Methode unterschieden sich die absoluten Carotinoidkonzentrationen. Bei

M. luteus J50 übersteigt der chromatographisch ermittelte Wert von über 400 µg/g die

photometrisch bestimmte Konzentration von ca. 250 µg/g, während der

Gesamtcarotinoidgehalt bei S. xylosus J70 mit ca. 180 µg/g (chromatographisch)

wesentlich geringer ausfällt. Im Gegensatz zu der photometrischen Bestimmung zeigte

das Isolat M. oxydans J75 über die chromatographische Berechnung einen Anstieg der

Carotinoidkonzentration von 59 µg/g auf 220 µg/g bei einer Inkubationstemperatur von

10°C. In Abhängigkeit von den Methoden wurden die Messungen bei 450 nm

(photometrisch) bzw. 440 nm (chromatographisch) durchgeführt, daher war die

Quantifizierung unterschiedlich. Die photometrische Methode wurde per

Absorptionskoeffizient aus der Literatur durchgeführt und die chromatographische

Methode mit eigenem Standard. Die genannten Differenzen im Gesamtcarotinoidgehalt

der Isolate zwischen der photometrischen und der chromatographischen Methode

können daher darauf zurückgeführt werden.

6,2

98,1

282,8

416,6

183,5

99,0

220,3

1,8

58,528,6 44,3

11,4

98,958,8

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

S. silvestris J7 K. rhizophila J32 K. rhizophila J48 M. luteus J50 S. xylosus J70 M. maritypicumJ74

M. oxydans J75

Car

oti

no

idge

hal

t [µ

g/g]

Gesamtcarotinoidgehalt bei 10°C und 30°Cnach der chromatographischen Bestimmung

10°C

30°C

78 Ergebnisse

Abbildung 27: Vergleich der photometrisch ermittelten Gesamtcarotinoidgehalte der Isolate und

Typstämme, inkubiert bei 10°C und 30°C

Der Vergleich der Isolate mit den Typstämmen der jeweiligen Spezies zeigt, dass bei

den Isolaten von K. rhizophila und S. xylosus in der kälteren Umgebung von 10°C

jeweils ein Anstieg des Carotinoidgehaltes nachgewiesen werden konnte. Die

Typstämme K. rhizophila DSM 11926T und S. xylosus DSM 20266T erreichten jedoch

noch größere Carotinoidkonzentrationen als die Wildisolate. Der Typstamm von M.

luteus bildete jedoch bei 30°C mit 122 µg/g mehr Carotinoide als das Wildisolat J50 mit

58 µg/g. Im Gegensatz zu Micrococcus luteus J50 wurde bei dem Typstamm kein

Anstieg des Carotinoidgehaltes bei 10°C beobachtet.

432,0

223,5

111,2

248,6

414,5

254,9

115,7

56,4

121,6

58,390,8

39,9

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

500

K. rhizophilaDSM 11926

K. rhizophilaJ48

M. luteus DSM20030

M. luteus J50 S. xylosus DSM20266

S. xylosus J70

Car

oti

no

idge

hal

t [µ

g/g]

Gesamtcarotinoidgehalt bei 10°C und 30°C nach der photometrischen Bestimmung

10°C

30°C

Ergebnisse 79

3.7 Wachstumsverhalten

Bei einigen Isolaten zeigte sich, dass der Zellertrag in der stationären Phase bei einer

Inkubationstemperatur von 10°C deutlich höher lag als bei der Inkubationstemperatur

von 30°C. Um diesen Effekt näher untersuchen zu können, wurden Wachstumskurven

erstellt und der maximale Zellertrag mittels Trübungsmessung und Proteingehalt

bestimmt. Im folgenden Abschnitt sind einige Isolate als Beispiel für einen erhöhten

Zellertrag dargestellt. Zum Teil werden die Wachstumsverläufe bzw. Zellgehalte der

Isolate mit Wachstumsverläufen bzw. Zellgehalten von Typ- bzw. Referenzstämmen

verglichen.

3.7.1 Wachstumsverlauf einzelner Isolate bei 10°C- und 30°C-


Die Abbildungen 28 bis 34 zeigen die Wachstumsverläufe der untersuchten Isolate. Auf

der X-Achse ist jeweils die Dauer der Messung in Stunden dargestellt und auf der

Ordinate die Werte der Optischen Dichte (OD) bei einer Wellenlänge von 625 nm.

Die Zellkulturen aller untersuchten Isolate hatte bei 10°C Inkubationstemperatur eine

deutlich längere lag-Phase als bei 30°C. Auch die stationäre Phase wurde wesentlich

später erreicht als bei 30°C Inkubationstemperatur, nämlich nach mindestens 100 h,

bei den Isolaten FFL1 und Iso1/11 nach 80 h. Die stationäre Phase bei 30°C wurde

bereits nach ca. 24 h erreicht.

Der maximale Zellertrag fällt bei allen Isolaten gemessen anhand der ODmax bei 10°C

deutlich höher aus als bei 30°C Inkubationstemperatur. Bei Isolat J70 wird sogar eine

ODmax von 25 bei 10°C gemessen. Bei 30°C Inkubationstemperatur liegt der

Maximalwert 5-fach niedriger. Alle anderen Isolate zeigten eine 0,5 bis 3-fache

Erniedrigung des Zellertrages bei 30°C.

80 Ergebnisse

Abbildung 28: Wachstumskurven von Isolat Bacillus cereus J1 bei 10°C und 30°C Inkubation

Abbildung 29: Wachstumskurven von Isolat Paenibacillus glucanolyticus J12 bei 10°C und 30°C

Inkubation

Abbildung 30: Wachstumskurven von Isolat Pedobacter nutrimenti J22 bei 10°C und 30°C

Inkubation

0123456789

0 50 100 150

OD

be

i 62

5 n

m

Zeit in h

Bacillus cereus J110°C

10°C

10°C

30°C

30°C

30°C

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

0 50 100 150

OD

be

i 62

5 n

m

Zeit in h

Paenibacillus glucanolyticus J12

10°C

10°C

10°C

30°c

30°C

30°C

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 50 100 150 200

OD

be

i 62

5 n

m

Zeit in h

Pedobacter nutrimenti J22

10°C

10°C

10°C

30°C

30°C

30°C

Ergebnisse 81

Abbildung 31: Wachstumskurven von Isolat Escherichia coli J55 bei 10°C und 30°C Inkubation

Abbildung 32: Wachstumskurven von Isolat Staphylococcus xylosus J70 bei 10°C und 30°C

Inkubation

Abbildung 33: Wachstumskurven von Isolat Listeria monocytogenes FFL1 bei 10°C und 30°C

Inkubation

0

2

4

6

8

10

12

0 50 100 150 200

OD

be

i 62

5 n

m

Zeit in h

Escherichia coli J55

10°C

10°C

10°C

30°C

30°C

30°C

0

5

10

15

20

25

30

0 50 100 150

OD

be

i 62

5 n

m

Zeit in h

Staphylococcus xylosus J70

10°C

10°C

10°C

30°C

30°C

30°C

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 20 40 60 80 100

Od

be

i 62

5 n

m

Zeit in h

Listeria monocytogenes FFL1

10°C

10°C

10°C

30°C

30°C

30°C

82 Ergebnisse

Abbildung 34: Wachstumskurven von Isolat Listeria monocytogenes Iso 1/11 bei 10°C und 30°C

Inkubation

3.7.2 Wachstumsverhalten einzelner Isolate bei 10°C und 30°C im Vergleich zu

Typ- bzw. Referenzstämmen

Zusätzlich zu dem Wachstumsverhalten der Isolate aus Abschnitt 3.7.1 wurde dieses

Wachstumsverhalten mit dem Wachstumsverhalten von Referenzstämmen bei 10°C

und 30°C verglichen.

In Abbildungen 35 bis 38 kann man erkennen, dass sich der Wachstumsverlauf bei

einer Inkubationstemperatur von 30°C von Wildisolat und Referenzstamm nicht ändert.

Jedoch zeigt sich auch, dass bei einer Inkubationstemperatur von 10°C der

Wachstumsverlauf von Wildisolat im Vergleich zum Referenzstamm variierte. So

zeigten alle Wildisolate, wie zuvor auch in Abschnitt 3.7.1 beschrieben, auch bei 10°C

eine deutlich höhere optische Dichte als der Referenzstamm bei 10°C Inkubation. Bei

10°C-Inkubation änderte sich auch die Wachstumsrate von Wildisolat im Vergleich zu

Referenzstamm. Auf diesen Aspekt wird im nächsten Abschnitt eingegangen.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 20 40 60 80 100

OD

be

i 62

5 n

m

Zeit in h

Listeria monocytogenes Iso 1/11

10°C

10°C

10°C

30°C

30°C

30°C

Ergebnisse 83

Abbildung 35: Wachstumskurven von Isolat Bacillus cereus J1 im Vergleich zum Referenzstamm

Bacillus cereus DSM 345 bei 10°C und 30°C Inkubation

Abbildung 36: Wachstumskurven von Isolat Escherichia coli J55 im Vergleich zum Referenzstamm

Escherichia coli DSM 498 bei 10°C und 30°C Inkubation

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

0 25 50 75 100 125 150 175 200

OD

be

i 62

5 n

m

Zeit in h

Wachstumsverhalten von B.cereus J1 im Vergleich zu B. cereus DSM 345 bei 10°C und 30°C

10°C B.cereusDSM345

10°C B.cereus J1

30°C B.cereusDSM345

30°C B.cereus J1

0

2

4

6

8

10

12

0 25 50 75 100 125 150 175 200 225 250 275 300

OD

be

i 62

5 n

m

Zeit in h

Wachstumsverhalten von E. coli J55 im Vergleich zu E. coli DSM 498 bei 10°C und 30°C

10°C E.coli DSM498

10°C E.coli J55

30°C E.coli DSM498

30°C E.coli J55

84 Ergebnisse

Abbildung 37: Wachstumskurven von Isolat Pedobacter nutrimenti J22 im Vergleich zum

nächstähnlichen Typstamm Pedobacter panaciterrae LMG 23400T bei 10°C und 30°C Inkubation

Abbildung 38: Wachstumskurven von den Isolaten Listeria monocytogenes FFL1 und Iso 1/11 im

Vergleich zum nächstähnlichen Typstamm Listeria monocytogenes DSM 20600T bei 10°C und 30°C

Inkubation

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 25 50 75 100 125 150 175 200

OD

be

i 62

5 n

m

Zeit in h

Wachstumsverhalten von P. nutrimenti J22 im Vergleich zu P. panaciterrae LMG 23400T bei 10°C

und 30°C

10°C LMG23400T

10°C J22

30°CLMG23400T30°C J22

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 25 50 75 100 125

OD

62

5 n

m

Zeit in h

Wachstumsverhalten von L. monocytogenes FFL1 und Iso 1/11 im Vergleich zu L. monocytogenes

DSM 20600T bei 10°C und 30°C 10°CDSM20600T

10°CFFL1

10°C Iso1/11

30°CDSM20600T

30°CFFL1

30°C Iso1/11

Ergebnisse 85

3.7.3. Exponentielle Wachstumsraten und maximale OD-Werte

Nachfolgend sind die exponentiellen Wachstumsraten und die maximalen OD-Werte

der Wildisolate und deren Referenzstämme dargestellt.

Tabelle 12: Exponentielle Wachstumsraten und maximaler OD-Werte der Wildisolate

Isolate 10 °C µ OD625

30 °C µ OD625

Bacillus cereus J1 0,022 h-1 7,47± 0,51

0,028 h-1 4,93 ± 0,05

Paenibacillus glucanolyticus J12 0,022 h-1 4,08 ± 0,11

0,082 h-1 1,65 ± 0,07

Pedobacter nutrimenti J22 0,024 h-1 8,24 ± 0,07

0,041 h-1 3,93 ± 0,04

Escherichia coli J55 0,021 h-1 9,01 ± 0,74

0,044 h-1 4,78 ± 0,16

Staphylococcus xylosus J70 0,019 h-1 25,5 ± 0,99

0,035 h-1 5,60 ± 0,28

Listeria monocytogenes FFL1 0,026 h-1 3,26 ± 0,04

0,042 h-1 2,22 ± 0,16

Listeria monocytogenes Iso1/11 0,020 h-1 3,63 ± 0,04

0,056 h-1 2,29 ± 0,08

Tabelle 13: Exponentielle Wachstumsraten und maximaler OD-Werte der Referenz- bzw.

Vergleichsstämme

Referenz- bzw. Typstämme 10 °C µ OD625

30 °C µ OD625

Bacillus cereus DSM 345 0,013 h-1 0,98 ± 0,03

0,116 h-1 4,26 ± 0,01


0,024 h-1 6,16 ± 0,06

0,037 h-1 3,23 ± 0,88

Escherichia coli DSM 498 0,010 h-1 3,26 ± 0,01

0,031 h-1 5,02 ± 0,03


0,028 h-1 2,48 ± 0,08

0,099 h-1 2,19 ± 0,04

Wenn man die Werte der Wildstämme mit den Werten der Referenzstämme (Tab. 12

und 13) vergleicht, lässt sich erkennen, dass die optischen Dichten in der stationären

Phase aller Wildisolate bei einer 10°C- Inkubationstemperatur höher liegen als bei den

Referenzstämmen. Darüber hinaus kann man erkennen, dass alle untersuchten

Wildisolate bei 10°C eine höhere optische Dichte erreichen als bei 30°C

Inkubationstemperatur. Die exponentiellen Wachstumsraten hingegen sind bei einer

10°C-Inkubation niedriger als bei einer 30°C-Inkubation.

86 Ergebnisse

Die Referenzstämme verhielten sich wiederum entgegengesetzt. So war die höchste

optische Dichte, mit Ausnahme von Pedobacter panaciterrae LMG23400T, bei den

Zellkulturen zu verzeichnen, die bei 30°C inkubiert wurden. Die exponentiellen

Wachstumsraten verhielten sich aber wie die Wildisolate mit einem kleineren Wert bei

einer 10°C-Inkubation.

3.8 Zelldichte

Um die Ergebnisse des Wachstumsverhaltens und der höherer Zelldichte gemessen

mit der optischen Dichte zu validieren, wurde von den zuvor beschriebenen Isolaten

und deren Referenz- bzw. Typstämmen zusätzlich eine Proteinbestimmung

durchgeführt (Tab. 14).

Tabelle 14: Proteingehalt in mg/mL Zellsuspension und maximaler OD-Wert in der

spätexponentiellen Wachstumsphase bei 625 nm der Isolate und deren Referenz- und

Vergleichsstämme

Inkubations- temperatur

Isolat bzw. Referenzbakterium Proteingehalt in g/mL Bakterien-suspension

Endpunkt-messung der OD bei 625 nm

10°C B. cereus J1 0,60 ± 0,02 7,47 ± 0,51

B. cereus DSM 345 0,29 ± 0,01 0,98 ± 0,03

30°C B. cereus J1 0,53 ± 0,02 4,93 ± 0,05

B. cereus DSM 345 0,54 ± 0,06 4,26 ± 0,01

10°C Pedobacter nutrimenti J22 0,81 ± 0,05 8,24 ± 0,07

Pedobacter panaciterrae LMG23400T 0,62 ±0,09 6,16 ± 0,06

30°C Pedobacter nutrimenti J22 0,49 ±0,01 3,93 ± 0,04

Pedobacter panaciterrae LMG23400T 0,66 ± 0,12 3,23 ± 0,88

10°C E. coli J55 1,41 ± 0,04 9,01 ± 0,74

E. coli DSM 498 0,32 ±0,10 3,26 ± 0,01

30°C E. coli J55 0,52 ±0,06 4,78 ± 0,16

E. coli DSM 498 1,06 ± 0,29 5,02 ± 0,03

10°C

L. monocytogenes FFL 1 0,51 ±0,01 3,26 ± 0,04

L. monocytogenes Iso 1/11 0,56 ± 0,01 3,63 ± 0,04

L. monocytogenes DSM 20600T 0,48 ± 0,00 2,48 ± 0,08

30°C

L. monocytogenes FFL 1 0,36 ± 0,01 2,22 ± 0,16

L. monocytogenes Iso 1/11 0,37 ± 0,02 2,29 ± 0,08

L. monocytogenes DSM 20600T 0,46 ± 0,02 2,19 ± 0,04

Wie man in Tabelle 14 erkennen kann, korrelieren die Ergebnisse, mit Ausnahme von

P. panaciterrae LMG23400T, mit den Ergebnissen der OD-Wert Bestimmung.

Man kann jedoch nicht von einer 100% Übereinstimmung ausgehen, da es sich bei der

Proteinbestimmung nach Biuret um eine direkte Methode der Zellmassenbestimmung

Ergebnisse 87

handelt und die Trübungsmessung mittels optischer Dichte eine indirekte

Bestimmungsmethode der Biomasse ist. Chemische Zellbestandteile wie zum Beispiel

Gesamtstickstoff, Protein oder DNA lassen sich zur direkten Bestimmung der

Biomasse heranziehen, da der Bestandteil einen genügend großen Anteil der

Zellmasse ausmacht und zum größten Teil in einem gleichbleibenden Verhältnis zur

Gesamtbiomasse steht. (Bast 1999)

88 Ergebnisse

3.9 Kälteresistenztest Listeria monocytogenes

Für diese Untersuchung wurde der Wildstamm Listeria monocytogenes Iso 1/11 der

Gefrierschranktemperatur von -20°C über einen definierten Zeitraum ausgesetzt.

Dieser Versuch wurde mit dem nächstähnlichen Typstamm Listeria monocytogenes

DSM 20600T als Vergleich parallel wiederholt.

Abbildung 39: Lebendzellausbeute in KbE/mL nach Kältestresstest bei -20°C von Isolat Listeria

monocytogenes Iso 1/11 im Vergleich zum nächstähnlichen Typstamm Listeria monocytogenes

DSM 20600T

Die Abbildung 39 zeigt die Lebenszellzahl von Wildisolat und Typstamm vor Beginn

des Einfrierprozesses, nach einem bzw. zwei Einfrier- und Auftauzyklen. Man kann

erkennen, dass das das gewachsene Wildisolat Listeria monocytogenes Iso 1/11 im

Vergleich zu dem Typstamm Listeria monocytogenes DSM 20600T resistenter

gegenüber Einfrier- und Auftaustress ist.

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

L.monocytogenes DSM 20600 Iso1/11

Leb

en

dze

llzah

l in

Kb

E/m

L Ze

llsu

spe

nsi

on

Ausgangskeimzahlbei 6°C in spätex.Phase

1. Einfrieren

2. Einfrieren

Ergebnisse 89

3.10 Überlebenstest bei 10°C und 30°C in einem Modelllebensmittel

Um die Ergebnisse aus 3.7 und 3.8 am Beispiel von Listeria monocytogenes in einem

Lebensmittel nachzustellen, wurde das Modelllebensmittel Milch (ultrahocherhitzt,

3,5% Fettanteil) zum einem mit dem Wildisolat Listeria monocytogenes Iso 1/11 und

zum anderen mit dem Typstamm Listeria monocytogenes DSM 20600T inokuliert und

anschließend bei 10°C und 30°C inkubiert.

Abbildung 40: Kälteresistenztest von Isolat Listeria monocytogenes Iso 1/11 im Vergleich zum

nächstähnlichen Typstamm Listeria monocytogenes DSM 20600T in dem Modelllebensmittel Milch

bei 10°C und 30°C

In Abbildung 41 kann man erkennen, dass die Lebendzellzahl sowohl von Wildisolat

Iso 1/11 als auch von Typstamm DSM 20600T bei 30°C Inkubationstemperatur nach

sechs Tagen Inkubation langsam abnimmt. Im Gegensatz dazu bleibt die

Lebendzellzahl von Wildisolat Iso 1/11 bei einer Inkubationstemperatur von 10°C über

einen Zeitraum von über 180 Tagen fast konstant. Die Lebendzellzahl von Typstamm

DSM 20600T bei einer Inkubationstemperatur von 10°C nimmt dagegen ab 45 Tagen

kontinuierlich ab. Die Lebenszellzahl nahm zwischen Tag 46 und Tag 185 um ca. 90%

ab.

Allgemein hat dieser Versuch gezeigt, dass ein Wildstamm im Vergleich zu einem

Referenzstamm nach einem längeren Zeitraum eine erhöhte Zellausbeute bei 10°C

Inkubationstemperatur auch in einem Modelllebensmittel wie Milch aufweisen kann.

1,00E+04

1,00E+05

1,00E+06

1,00E+07

1,00E+08

1,00E+09

1,00E+10

0 2 6 8 14 22 29 37 44 46 185

Leb

en

dze

llzah

l in

Kb

E/m

L M

ilch

Untersuchungszeitraum in Tagen (d)

DSM 20600T 10°C

Iso 1/11 10°C

DSM 20600T 30°C

Iso 1/11 30°C

90 Ergebnisse

Außerdem konnte eine unterschiedliche Überlebensdauer und einen unterschiedlichen

Wachstumsverlauf bei niedrigen Temperaturen detektiert werden. kann.

Diskussion 91

4 Diskussion

4.1 Isolierung kälteangepasster Bakterien

Insgesamt wurden 54 Bakterienstämme aus gekühlten Lebensmitteln und

lebensmittelassoziierten Kalthabitaten isoliert. Bei 48 Isolaten wurden das 16S rRNA-

Gen sequenziert, um sie zu identifizieren. Diese Methode hat sich zur Beschreibung

neuer Prokaryoten-Spezies sowie zur Identifikation von Bakterienisolaten bewährt

(Janda und Abbott 2007; Stackebrandt und Goebel 1994).

Die Phyla Proteobacteria, Actinobacteria und Firmicutes waren unter den für die

Identifizierung ausgewählten Isolaten zu etwa gleichen Anteilen vertreten, während

das Phylum Bacteroidetes den geringsten Anteil an identifizierten Isolaten

ausmachte. Dies stellt ein phylogenetisches Muster für kälteliebende Bakterien dar,

wie Simon et al. (2009) bei Proben von Gletschereis feststellten.

4.2 Neubeschreibung Pedobacter nutrimenti J22T

Isolat J22 konnte der durch 16S rRNA-Gensequenz, Fettsäuremuster, Chinonmuster

und polaren Lipidmuster der Gattung Pedobacter zugeordnet werden, die zuerst von

Steyn et al. (1998) beschrieben wurde. Die Gattung umfasste zum Zeitpunkt der

Beschreibung Pedobacter heparinus (vorher: Flavobacterium heparinum (Takeuchi und

Yokota 1992); Sphingobacterium heparinum (Payza und Korn 1956) und die zwei

neuen Spezies Pedobacter africanus und Pedobacter saltans. Seitdem wurden

mehrere Pedobacter-Spezies neu beschrieben und zurzeit umfasst die Gattung

Pedobacter 40 Spezies. Hauptsächlich wurde die Gattung aus Bodenproben isoliert

((Yoon et al. 2007), (Zhou et al. 2012), (Luo et al. 2010), (Oh et al. 2013)) aber auch

aus Wasserproben (Baik et al. 2007), Gletscher Kyroconit (Margesin 2003), Kompost

(Lee et al. 2009) oder der Pflanzenrhizosphäre (Kwon et al. 2007).

Obwohl vermehrt die verschiedenen Spezies der Gattung Pedobacter aus Sediment-

und Umweltproben isoliert wurden, gibt es Beschreibungen, in denen vereinzelt

Pedobacter-Stämme aus Lebensmitteln isoliert wurden. So isolierte Herranen et al.

(2010) einen Pedobacter-Stamm aus Cornflakes und Tsukamoto et al. (2002) aus dem

Speisepilz Clitocybe sp. Die 16S rRNA-Gen Analysen in diesen Arbeiten könnten

aufgrund von Sequenzübereinstimmungen unter 98% auf eine neue Spezies

hinweisen, jedoch wurde dieser Verdacht nicht weiter untersucht. Daher ist es sehr

wichtig die potentielle Rolle der Gattung Pedobacter im Lebensmittelbereich weiterhin

zu untersuchen.

92 Diskussion

Die Gattung Pedobacter besitzt eine gewisse Affinität zu kalten Habitaten. Es gibt

mehrere Pedobacter-Spezies, die auch wie Isolat J22 aus kalten Habitaten isoliert

wurden, wie beispielsweise Pedobacter articus aus dem Erdboden der Kältesteppe

(Zhou et al. 2012) und Pedobacter himalayensis aus einem Gletscher des Himalaya-

Gebirges (Shivaji 2005). Dadurch, dass auch Isolat J22 aus einem kalten Habitat

isoliert wurde, spielt dessen Temperaturwachstumsbereich eine wichtige Rolle. Es

wurde ein Temperaturbereich von 4°C bis 37°C ermittelt, mit einem Optimum bei 30°C.

Beim Test der biochemischen Reaktionsprofile mit den Testsystemen API 20E und API

50CH zeigte sich, dass im Vergleich zu den drei Referenzstämmen nur das

Pedobacter-Isolat J22 die Substrate Tween 80, Itaconsäure, α-Keto-Butylsäure, D-

Alanin, L-Asparaginsäure, Urocansäure und Thymindin verstoffwechselte. Damit

konnte dieses Isolat von den anderen nächstähnlichen Typstämmen abgegrenzt

werden.

Bei der phylogenetischen Analyse mit den drei verschiedenen Algorithmen Neighbour-

Joining, Maximum-Likelihood und Maximum-Parsimony zeigte sich, dass Isolat J22 in

die Gattung Pedobacter eingeordnet werden konnte. Bei der DNA-DNA Hybridisierung

wurde ein Wert von 35,2% (reziprok 7,4%) zwischen dem Isolat J22 und dem

nächstähnlichen Typstamm Pedobacter panaciterrae LMG23400T gezeigt. Wayne et al.

(1987) definierten den Wert von weniger als 70% als Kriterium zur Abgrenzung und

Beschreibung einer neuen Spezies in der bakteriellen Taxonomie.

Die Fettsäureanalyse ermittelte die Hauptfettsäuren C14:0, C15:0 iso, C16:1 cis 9,

C16:0 und C17:0 iso 3-OH, welche im Vergleich zu anderen Pedobacter-Spezies

typisch für diese Gattung sind. (Kim et al. (2013); Luo et al. (2010); Steyn et al. (1998);

Yoon et al. (2007); Zhou et al. (2012)). Jedoch gab es teilweise Unterschiede zu den

Referenzstämmen. So konnte Isolat J22 durch den höheren Gehalt an der Fettsäure

C16:0 und dem niedrigeren Gehalt an C17:1 iso cis 9 von den anderen drei Referenz-

Pedobacter-Stämmen abgegrenzt werden. Außerdem wurde die für die Gattung

Pedobacter typische Fettsäure C17:1 iso cis 11 nicht detektiert. Bei den polaren

Lipiden ergab sich das typische Pedobacter-Muster aus Phosphatidylethanolamin, zwei

Lipiden, zwei Aminophospholipiden und drei Aminolipide. Dieses Muster ist im

Vergleich zu den drei Referenzstämmen teilweise übereinstimmend. Menachinon MK-7

wurde als einziges Chinon sowohl bei Isolat J22 als auch bei den drei

Referenzstämmen detektiert. Dieses Ergebnis ist aber übereinstimmend mit allen

Vertretern der Familie Sphingobacteriaceae (Margesin und Shivaji 2011).

Diskussion 93

Die oben aufgeführten chemotaxischen Daten und die phylogenetische Inferenz lässt

die Schlussfolgerung zu, dass Isolat J22 zu der Gattung Pedobacter gehört. Es kann

aber durch die unterschiedlich phänotypische Charakteristik und durch die DNA-DNA

Hybridisierung mit dem nächstähnlichen Typstamm Pedobacter panaciterrae

LMG23400T mit einem Wert von weniger als 40% abgegrenzt werden.

Bezogen auf die hier beschriebenen Daten, konnte Isolat J22 als Repräsentant einer

neuen Spezies in der Gattung Pedobacter eingeordnet werden, für welche der Name

Pedobacter nutrimenti sp. nov. vorgeschlagen wurde (Derichs et al. 2014).

4.3 Fettsäurebewertung

4.3.1 Taxonomische Bedeutung

Die Fettsäureanalytik spielt in der Chemotaxonomie und damit auch in der

Neubeschreibung von Bakterienarten eine wichtige Rolle. Viele Bakteriengattungen

weisen ein unterschiedliches Fettsäuremuster auf und können damit von anderen

Bakteriengattungen abgegrenzt werden. Die hier aus kalten Habitaten stammenden

beschriebenen Isolate weisen alle ihr gattungstypisches Fettsäuremuster auf. Die am

häufigsten vertretenden Gattungen sind Bacillus, Micrococcus und Pseudomonas. So

sind die Fettsäuren C13:0 iso, C15:0 iso, C16:0, C17:0 iso, C15:0 anteiso, C16:0 iso

typisch für die Gattung Bacillus (Guinebretiere et al. 2013). Die Gattung Micrococcus

hat mit 15:0 iso und 15:0 anteiso zwei Hauptfettsäuren (Wieser et al. 2002) und die

Gattung Pseudomonas besitzt neben den für gramnegative Bakterien typische

hydroxylierten Fettsäuren noch die Fettsäuren C16:0 und C18:1 cis 11 (Yu et al. 2013).

Durch die Inkubation bei 10°C veränderten sich das Fettsäuremuster und die

Fettsäurezusammensetzung von vielen Isolaten; zum Teil kam es sogar zu starken

Veränderungen. Somit erkennt man, dass die Veränderung im Fettsäuremuster eine

wichtige Rolle in der bakteriellen Kälteanpassung spielt. Dies ist eine bereits bekannte

und in der Literatur oft beschriebene Strategie zur Änderung der Membranfluidität und -

beweglichkeit in der Zellmembran (Russell 1984).

94 Diskussion

4.3.2 Bewertung der Fettsäuremuster in der Kälteanpassung

Die Grundstruktur jeder Zellmembran ist die Lipiddoppelschicht. Diese

Membrandoppelschicht muss die richtige Fluidität aufweisen, um die Permeabilität und

somit die Beweglichkeit der Membran zu gewährleisten. Der funktionelle Zustand ist

immer die flüssig-kristalline Phase, jedoch kann es beim Absenken der Temperatur zu

einem Übergang in die Gelphase kommen, wodurch essentielle

Membraneigenschaften verloren gehen können. Die Temperatur, bei der dieser

Phasenübergang stattfindet, ist abhängig von der Lipidzusammensetzung der

Membran, aber zum größten Teil von den Fettsäureketten, die in der

Lipiddoppelschicht verankert sind. Daher ist eine der wichtigsten Aufgabe von

psychrophilen und psychrotoleranten Bakterien, diese Fettsäurezusammensetzung an

die Umgebungstemperatur anzupassen. (Feller und Gerday 2003)

Anhand der Fettsäureanalyse nach Sasser (1990) ist dieser aus der Literatur bekannte

Kälteanpassungsmechanismus bei verschiedenen Isolaten nachgewiesen geworden.

Zu den häufigsten Modifizierungen im Fettsäuremuster zählen die Erhöhung des

Anteils von ungesättigten Fettsäuren, der Ersatz von langkettigen durch kurzkettige

Fettsäuren, die Substitution von geradkettigen durch methyl-verzweigte Fettsäuren, die

Substitution von iso-verzweigten durch anteiso-verzweigte Fettsäuren und die

Isomerisierung von trans in cis-Doppelbindungen (Scherer und Neuhaus 2006). Alle

diese Modifizierungen bzw. Veränderungen, mit der Ausnahme von der Isomerisierung

von trans in cis-Doppelbindungen und die Substitution von geradkettigen durch methyl-

verzweigte Fettsäuren, wurden in dieser Arbeit nachgewiesen.

Viele Isolate erhöhten bei Kälteeinfluss ihren Anteil an ungesättigten Fettsäuren.

Dieser Effekt wurde vermehrt von gramnegativen Bakterienisolaten angewendet, wie

Isolat J2, J11, J21, J22, J23, J52, J55, J57, J61, J63, J67, J84, J88, J86, J90 und J91.

Diese Isolate zählten alle zu der Familie der Pseudomonadaceae, Moraxellaceae oder

Enterobacteriaceae. Dies kann man jedoch auch darauf zurückzuführen, dass

ungesättigte Fettsäuren die Hauptfettsäuren dieser Bakterienfamilien darstellen (Zelles

1999).

Die Substitution von iso-verzweigten Fettsäuren durch anteiso-verzweigte Fettsäuren

wurde vermehrt durch Bakterienisolate der Familien Bacillaceae, Listeriaceae und

Staphylococcaceae aus der Ordnung Bacillales gezeigt. Eine Erhöhung des Gehaltes

an der verzweigten, kurzkettigen Fettsäuren C13:0 iso wurde bei Isolaten der Spezies

Bacillus cereus nachgewiesen. Der Anteil an langkettigeren Fettsäuren nahm dabei ab.

http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Pseudomonaceae&action=edit&redlink=1

http://de.wikipedia.org/wiki/Moraxellaceae

http://de.wikipedia.org/wiki/Enterobacteriaceae

http://de.wikipedia.org/wiki/Bacillaceae

http://de.wikipedia.org/wiki/Listeriaceae

http://de.wikipedia.org/wiki/Staphylococcaceae

Diskussion 95

Die Veränderungen im Fettsäuremuster führen zu einer Herabsetzung des

Schmelzpunktes (Tab.1), wodurch die Membranfluidität auch bei niedrigen

Temperaturen aufrechterhalten werden kann (Russell 1984). Laut Tabelle 1 müsste die

Membran jedoch durch den Ersatz mit ungesättigten Fettsäuren wie beispielsweise

C16:1 cis 9 oder C18:1 cis 9 stärker fluid gehalten werden als durch den Ersatz von

anteiso-verzweigten Fettsäuren. Damit kann man auch erklären werden, dass das

Ausmaß der Veränderung je nachdem welche Fettsäure eingebaut wird, stärker oder

schwächer ausfällt.

Auch die Übersicht aus Tabelle 9 verdeutlicht, dass die Erhöhung der ungesättigten

Fettsäuren zu Lasten der gesättigten Fettsäuren eine bevorzugte Strategie zur

Kälteadaptation darstellt. Somit ist ableitbar, dass dieser Mechanismus gegenüber

anderen eine effektivere Methode darstellen könnte, um sich an kältere

Umgebungstemperaturen anzupassen. Die Einführung von Doppelbindungen wird

daher bevorzugt angewendet.

Doppelbindungen können mit zwei verschiedenen Mechanismen in die Fettsäuren

eingebaut werden (Russell 1984). Der Einbau und die dadurch entstehende

Veränderungen im Fettsäuremuster werden gattungsspezifisch entweder durch die

Sauerstoff-unabhängige Synthese ungesättigter Fettsäuren erreicht oder durch die

sauerstoffabhängige Desaturierung von gesättigten Fettsäuren. Der

sauerstoffunabhängige Mechanismus wurde nicht nur in anaeroben Bakterien

gefunden (Clostridium, Lactobacillus), sondern auch im aeroben Bakterien, wie

Escherichia oder Pseudomonas. Der sauerstoffabhängige Mechanismus wurde bei

Spezies von Bacillus, Mycobacterium und Micrococcus entdeckt. (Erwin und Bloch

1964; Härtig et al. 1999; Magnuson et al. 1993)

Der Einbau über den anaeroben Weg geschieht während des

Kettenverlängerungsprozess während der de-novo Fettsäurebiosynthese. Hierbei wird

die Doppelbindung in der Regel bei Position 7 eingeführt (Magnuson et al.1993). Der

Einbau der Doppelbindung über den sogenannten aeroben Weg der

Fettsäurebiosynthese kann mittels Desaturase eingefügt werden. Dieser Mechanismus

ist dadurch charakterisiert, dass die Doppelbindung bei Position C9 der

entsprechenden Fettsäure spezifisch eingeführt wird (Fulco 1974). Da C18:1 cis 9 die

Hauptfettsäure bei Acinetobacter darstellt, ist dies beispielsweise ein Indikator für die

Gegenwart dieses Desaturase-Systems und daher auch für den aeroben

Stoffwechselweg der Fettsäurebiosynthese in der Gattung Acinetobacter. (Härtig et al.

96 Diskussion

1999) Bei der Gattung Pseudomonas (Wada et al. 1989) und Vibrio (Morita et al. 1993)

scheinen beide Biosynthesewege zu existieren.

Allgemein lässt sich aus den Ergebnissen erkennen, dass drei auf Fettsäureebene

bekannte Adaptationsvorgänge an niedrige Umgebungstemperaturen vorliegen. Es gibt

jedoch auch Isolate, die keinen eindeutigen Unterschied bezüglich dieser

Anpassungsstrategien zeigen. Dies gibt Hinweise darauf, dass diese kälteangepassten

Stämme andere Anpassungsmechanismen besitzen müssen. Bei diesen Stämmen ist

es sehr interessant, die zuvor aufgestellten Hypothesen der fettsäureunabhängigen

Kälteanpassung auf andere lipophile Komponenten der Zellmembran zu untersuchen.

Somit könnten andere und unbekannte Strategien aufgeklärt werden. Diese

Hypothesen werden in den folgenden Abschnitten untersucht und diskutiert.

4.4 Chinone

4.4.1 Taxonomische Bedeutung der Chinone

Die chemisch-analytische Erfassung der Membranzusammensetzung

(Fettsäuremuster, polare Lipide, Mycolsäuren, Chinone) dient unter anderem der

Gattungs- und Speziesbestimmung von Bakterien (Kämpfer 1996). Chinone sind in

allen Arten von aeroben und photosynthetischen Mikroorganismen vorhanden und

zeigen deutliche Strukturvariationen in Abhängigkeit von der mikrobiellen Taxonomie.

Daher werden Chinone nicht nur als Marker in der chemotaxonomischen mikrobiellen

Systematik, sondern auch als Maßstab von mikrobiellen Populationen in Bezug auf

Quantität, Qualität und Aktivität verwendet. Insbesondere die Analyse von

Chinonprofilen ist nützlich für die Überwachung von mikrobiellen

Populationsverschiebungen z.B. in einem Ökosystem, soweit die Verschiebungen nicht

durch konventionelle Kulturverfahren und molekulare Techniken detektiert werden

können. (Hiraishi 1999)

Chinone stellen Coenzyme dar und werden für den Elektronentransfer in der

mikrobiellen Zelle verwendet. Ein bakterielles Phylum hat in der Regel eine dominante

Art von respiratorischen Chinonen. So stellen Ubichinone gute Marker für Alpha-, Beta-

und Gammaproteobacteria dar. (Kunihiro et al. 2014)

Das fakultativ anaerobe, gram-positive Isolat Bacillus cereus J1 bildete die beiden

Menachinone MK-6 und MK-7, wobei MK-7 den Hauptanteil der Chinonkonzentration in

den Zellen ausmachte. Dies entspricht dem Chinonmuster des nächstähnlichen

Typstamms IAM 1074T (Watanuki und Aida 1972).

Diskussion 97

Die Isolate Acinetobacter lowffii J2 und J84 bildeten als Hauptubichinon Q-9 und zu

geringen Anteilen Q-8 und Q-10. Laut Malhotra et al. (2012) bildet die Gattung

Acinetobacter das Hauptubichinon Q-9.

Bei Isolat Solibacillus silvestris J7 wurden die Menachinone MK-6 und MK-7

nachgewiesen. In der Umbenennung von Krishnamurthi et al. (2009) des Bakteriums

Bacillus silvestris (Rheims et al. 1999) in Solibacillus silvestris wurden ebenfalls MK-7

als Hauptchinon nachgewiesen.

In der Zellmembran von Isolat Paenibacillus glucanolyticus J12 wurde als einziges

Menachinon MK-7 detektiert. Dieses Ergebnis deckt sich mit der Erstbeschreibung von

Shida et al. (1997).

Mehrere Menachinonarten wurden bei Isolat Micrococcus luteus J16 detektiert. Als

Hauptmenachinon wurde bei 30°C das hydrierte Menachinon MK-8 H2 analysiert.

Zusätzlich wurden auch die Menachinone MK-7, MK-8 und die hydrierten Isoprene MK-

7 H2 und MK-9 H2 nachgewiesen. Laut Wieser et al. (2002) werden vorwiegend die

Menachinone MK-8 H2 und MK-8 von der Spezies Micrococcus luteus gebildet. Die

phylogenetisch-verwandte Spezies Micrococcus yunnanensis und Micrococcus flavus

bilden MK-7 H2 und MK-8 H2 (Rieser et al. 2013). Zusätzlich wurden aber auch noch

andere hydrierte Menachinone in der Zellmembran detektiert. Auf diesen Aspekt wird

jedoch in der angegebenen Literatur nicht eingegangen. .

Bei Kocuria palustris J17 wurden wie bei Isolat Micrococcus luteus J16 wieder mehrere

Menachinone, teils auch hydrierte Menachinone analysiert. Dieses Ergebnis stimmt mit

dem Ergebnis von Kovacs et al. (1999) überein.

Im Isolat Rhodococcus qingshengii J20 wurde genauso wie bei der Erstbeschreibung

von Xu et al. (2007) als dominierendes Chinon das hydrierte Menachinon MK-8 H2

nachgewiesen.

Die Menachinone MK-8 und MK-9 wurden im aerotoleranten Isolat Lactococcus lactis

J34 analysiert. Andere Isolate dieser Spezies wiesen zusätzlich zu kleinen Anteilen die

Chinone MK-7 oder MK-10 auf (Morishita et al. 1999). Auch die taxonomisch

benachbarte Gattung Streptococcus weist als Hauptchinon MK-9, gefolgt von MK-8

und zu kleinen Anteilen MK-7 und MK 10 auf. (Collins et al. 1983)

Wie auch in der Literatur für die Gattung Stenotrophomonas beschrieben, bildet Isolat

Stenotrophomonas maltophilia J21, als aerobes und gramnegatives Bakterium als

Hauptchinon das Ubichinon Q-8 (Palleroni und Bradbury 1993).

98 Diskussion

Bei Isolat Pedobacter nutrimenti J22 wird als einziges Menachinon MK-7 bestimmt.

Diese Aussage deckt sich mit der Speziesbeschreibung des nächstähnlichen

Typstammes Pedobacter panaciterrae (Yoon et al. 2007) und kann auf die komplette

Gattung Pedobacter bezogen werden (Steyn et al. 1998).

In der Zellmembran von den Isolaten Microbacterium oxydans J75 und J78 wurden

neben zwei unbekannten Chinonen vorwiegend die Menachinone MK-11 und MK-12

identifiziert. Die Bakteriengattung Microbacterium bildet als Hauptchinone MK-11 und

MK-12. (Takeuchi und Hatano 1998). Auch Yu et al. (2013) detektierte unbekannte

Chinone zu geringen Anteilen. Auf die Identifikation wurde jedoch in dieser Arbeit nicht

eingegangen. Interessant ist jedoch, dass es sich bei dem von Yu et al (2013)

untersuchten Bakterium um ein psychrotolerantes Microbacterium handelte.

Wie bei den meisten hier beschriebenen gram-negativen und aeroben Bakterien bilden

Achromobacter marplatensis J23 (Yabuuchi und Yano 1981) und Pantoea

agglomerans J89 (Kageyama et al. 1992) als Hauptchinon Ubichinon Q-8.

In Isolat Brochothrix thermosphacta J86 wird das Menachinon MK-7 als

Hauptmenachinon detektiert (Collins et al. 1979).

Das für die Gattung Pseudomonas typische Ubichinon Q-9 (Lin et al. 2013) wurde auch

als Hauptchinon in Isolat Pseudomonas baetica J91 nachgewiesen. Zusätzlich wurden

zu kleinen Anteilen Q-8 und Q-10 detektiert. Das Ubichinon Q-8 wurde auch zu 4% von

(Ramos et al. 2013) in der Neuschreibung von der phylogenetisch-benachbarten

Spezies Pseudomonas punonensis detektiert.

Diskussion 99

4.4.2 Chinone in der Kälteanpassung

Arbeiten über das Thema Temperaturabhänigkeit bei Chinonprofilen und

Chinongehalten in Bakterien sind nicht vorhanden. 1975 wurde von Ashcroft und

Haddock jedoch eine veränderte Chinonsynthese in Abhängigkeit von der

Sauerstoffverfügbarkeit ermittelt. So wurde bei der Spezies Escherichia coli mehr

Ubichinon Q-8 unter aeroben Wachstum und mehr Menachinon MK-8 unter

anaerobem Wachstum detektiert. Dieser Effekt kann jedoch auf die unterschiedlichen

Redoxpotentiale zurückgeführt werden.

Durch Absenken der Umgebungstemperatur wurden in der vorliegenden Arbeit bei

bestimmten Bakterienisolaten Veränderungen im Chinongehalt und Chinonmuster der

Bakterienzellen festgestellt. Bei einigen Isolaten stieg die Chinonkonzentration an oder

es wurden zusätzliche Chinone gebildet. Dadurch wird die Hypothese bestärkt, dass

Chinone eine Rolle bei der Kälteanpassung spielen können.

Auch Hiraishi et al. (1999) detektierten bei einer Temperaturänderung eine

Veränderung im Chinongehalt von Bakterien. Jedoch bezog sich dieses Ergebnis auf

Bakterien, die aus heißen Quellen isoliert wurden und daher starker Hitze ausgesetzt

waren. Die interessante Beobachtung war, dass die Chinonprofile der untersuchten

Bakteriengemeinschaften unterschiedlich in Abhängigkeit von der Temperatur waren

und dass diese auftretenden Unterschiede unabhängig von der untersuchten

geographischen Lage waren. Es wurden vorwiegend folgende Strukturtypen von

Chinonen in Abhängigkeit der jeweiligen Umgebungstemperatur erkannt. Bei 68°C war

das Hauptchinon Methionachinon MTK-7 vertreten, bei 61 bis 65°C wurde

hauptsächlich Menachinon MK-10 detektiert, bei 45 bis 56°C Quellentemperatur das

Plastochinon PQ-9 und das Vitamin K1 und bei unter 40°C Umgebungstemperatur das

Ubichinon Q-8.

Bei vielen hier untersuchten Bakterienisolaten führte das Wachstum in kalter

Umgebung zu einem reduzierten Gehalt an bakterieneigenen Chinonen. Zu erklären ist

dies mit einer geringeren Biosyntheserate bei niedrigen Temperaturen. In Bakterien

sind an der Biosynthese von Ubi- und Menachinonen verschiedene Enzyme beteiligt

(Bentley und Meganathan 1982; Meganathan 2001). Da normalerweise die Aktivität

von Enzymen temperaturabhängig ist und innerhalb bestimmter Grenzen mit der

Temperatur ansteigt (Feller et al. 1994), liegt bei tiefen Temperaturen folglich eine

niedrigere Enzymaktivität vor. Der verringerte Chinongehalt kann daher auf einen

Verminderung der Biosyntheserate zurückgeführt werden. Zusätzlich werden dadurch

100 Diskussion

vermutlich auch weniger Chinone in der Atmungskette benötigt, da bei weniger

Substratumsatz auch weniger Elektronen eingespeist werden müssen.

Im Gegensatz zu dieser allgemeinen Aussage wurde in Bezug auf den

Gesamtchinongehalt im Zellmaterial der Isolate Paenibacillus glucanolyticus J12,

Pedobacter nutrimenti J22 und Pantoea agglomerans J89 bei 10°C ein erhöhter

Chinongehalt gemessen. Zusätzlich dazu wurde in den Isolaten Kocuria palustris J40,

Microbacterium oxydans J75 und J78 ein neues Chinon unter Kälteeinfluss gebildet. Es

kam demzufolge zu einer Veränderung im Chinonprofil und Chinongehalt. Dadurch

kann die aufgestellte Hypothese unterstützt werden, dass diese Bakterienisolate u.a.

durch diese erhöhte bzw. geänderte Chinonkonzentrationen in der Lage waren, in

dieser kalten Umgebung sich zu vermehren. Diese Hypothese wird durch die Arbeit

von Hiraishi et al. (1999) unterstützt, bei der es auch zu einer Änderung im Chinonprofil

bei einem Temperaturunterschied kommt.

Da die Sauerstofflöslichkeit bei niedrigen Temperaturen besser ist, könnten aerobe

Bakterien aber auch eine verlängerte bzw. verstärkt ablaufende Atmungskette und

anschließende oxidative Phosphorylierung betreiben. Durch einen größeren

Chinonvorrat in der Zellmembran wären die Bakterien in der Lage, schneller Energie in

Form von ATP zu synthetisieren und für biosynthetische Reaktionen zu nutzen

(Madigan et al. 2013).

In der Einleitung wurden die grundsätzlichen Mechanismen der Erhaltung der

mikrobiellen Membranfluidität, z.B. durch Modifikation des Fettsäuremusters bzw.

Erhöhung des Cholesteringehaltes bei Eukaryonten als Reaktion auf niedrige

Umgebungstemperaturen geschildert. Da auch Chinone in das Membransystem

integriert sind, wird die Vermutung aufgestellt, dass für Chinone ähnliche Annahmen

bezüglich der Anpassung an Kälte gelten und somit die Unordnung der Membran

beibehalten wird. Damit könnte die Aufrechterhaltung der Membranfluidität durch

vermehrten Einbau von Chinonen in die Zellmembran erklärt werden. Die Ergebnisse

von Asai und Watanabe (1999), in denen ein Anstieg von Chinonen eine fluidere

Modellmembran ergibt, würden diese Theorie bekräftigen. Dabei wurden Chinone in

eine Modellmembran eingebaut, dadurch die Temperatur der Phasenumwandlung

gesenkt und folglich die Membranfluidität erhöht. Damit konnte ein fluidisierender Effekt

von Chinonen an der Modellmembran beobachtet werden.

Um diese Hypothese zusätzlich zu überprüfen, wurde in der Abschlussarbeit von

Fritsch (2012) Bakterienzellen Vitamin K1 beim Wachstum zugesetzt, diese dann

detektiert und in die Bakterienzelle aufgenommene Vitamin K1-Menge berechnet. Die

Diskussion 101

Hypothese dieser Arbeit lag in der Annahme, dass Chinone als eine Art Schutzstoff in

die Membran aufgenommen werden und somit die Stresstoleranz von Bakterien bei

niedrigen Temperaturen erhöhen. Ein Zusammenhang zwischen der Synthese bzw.

Aufnahme von kompatiblen Soluten und der Kälteadaption konnte in verschiedenen

Studien bereits nachgewiesen werden. In Untersuchungen von Ko et al. (1994) mit

Listeria monocytogenes wurde beispielsweise ein erhöhter Gehalt an Glycinbetain bei

Wachstum in kalter Umgebung (4°C) entdeckt. Anhand weiterer Versuche konnte

bestätigt werden, dass die Anreicherung des osmotisch aktiven Soluts dem Bakterium

auch die Kältetoleranz verleiht. Ebenfalls wurde durch kompatible Solute eine

induzierte Kältetoleranz in überwinternden Insekten bewiesen (Storey und Storey

1986).

Der genaue Mechanismus, wie Glycinbetain als Gefrierschutzmittel wirkt, ist

unbekannt. Allerdings ist zu berücksichtigen, dass Betain ein Stabilisierungsmittel

darstellt und daher eine nicht gewünschte Ordnung der Lipiddoppelschicht verhindern

kann. Außerdem kann Betain die Löslichkeit von Zellproteinen oder die physikalischen

Eigenschaften der Zellmembran positiv verändern (Rudolph et al. 1986). Osmotischer

Stress scheint das Phasenverhalten der Zellmembran zu verändern (Sanderson et al.

1991) und Glycinbetain kann sowohl osmotischen Stress als auch Kältestress durch

einen ähnlichen Mechanismus entgegenwirken.

Fast alle untersuchten Bakterienisolate nahmen Vitamin K1 aus einer mit Vitamin K1

versetzten Flüssigbouillon während des Wachstums auf und bauten es zu

unterschiedlichen Anteilen vermutlich in ihre Plasmamembran ein, da es im

analysierten Zellpellet nachgewiesen wurde. Dabei wurden jedoch größere Mengen in

nmol/g Biomasse detektiert, wenn die Bakterienisolate bei 30°C inkubiert wurden.

Allerdings zeigte sich eine Ausnahme: Bei Isolat Lactococcus lactis J34 war der

Vitamin K1-Gehalt in den Zellen nach 10°C-Anzucht um etwa 60% höher als nach

Anzucht bei 30°C. Die Ergebnisse von Fritsch (2012) deuten auf eine erhöhte

Chinonproduktion und eine erhöhte Chinonaufnahme bei steigender Temperatur hin,

obwohl ein untersuchtes Isolat ein umgekehrtes Verhalten zeigt.

Dieses Isolat J34 aus der Masterarbeit von Fritsch (2012) und die untersuchten Isolate

J12, J22, J75 und J78 aus dieser Arbeit, die eine erhöhte Chinonkonzentration bzw.

eine Veränderung im Chinonmuster bei Kälteeinfluss zeigen, geben Anlass dazu, einen

weiteren Kälteanpassungsmechanismus mit lipophilen Substanzen der Zellmembran

zu untersuchen. Wie es scheint, können Chinone bei Kälteeinfluss zwar nicht allgemein

aber teilweise eine Rolle spielen. Um dieses Ergebnis abzusichern, wäre es sinnvoll,

102 Diskussion

die temperaturabhängigen Chinonversuche auf eine komplette Gattung zu beziehen

und mit Referenzstämmen zu vergleichen.

4.5 Carotinoide

4.5.1 Carotinoide in Bakterien

22 der in Tabelle 4 aufgelisteten Isolate zeigten eine tyisch durch Carotinoide

hervorgerufene Pigmentierung der Kolonie.

Carotinoide spielen innerhalb der Bakterienzellmembran eine wichtige Rolle. Sie

dienen zum Beispiel als Schutz gegen durch Singulett-Sauerstoff verursachte

Schäden. Bakterien und Pilze bedienen sich des Schutzes von Carotinoiden, wenn sie

unter Licht und Sauerstoffanwesenheit wachsen. So können Bakterien diese

membrangebundenen Carotinoide als Antioxidans gegen oxidativen Stress nutzen.

Schon 1957 konnte Swart-Füchtbauer beobachten, dass der Prozentsatz der

pigmentierten Bakterien in der Luft etwa dreimal so hoch war wie in der Erde. Daraus

wurde geschlossen, dass pigmentierte Bakterien gegenüber Sonnenstrahlen

widerstandsfähiger sind als farblose Bakterien. Carotinoide sind außerdem beteiligt am

Lichtsammelkomplex, eine Ansammlung von Membranproteinen in den

photosynthetischen Membranen von Mikroorganismen, die Photosynthese betreiben,

wie beispielsweise Purpurbakterien (Guedes et al. 2011). Damit besitzen mikrobielle

Carotinoide biochemisch wie auch pflanzliche Carotinoide als sekundärer Pflanzenstoff

zwei charakteristische Eigenschaften: 1. Radikalfänger (Antioxidans) und 2. bei der

UV-VIS-Absorption (Lichtsammelpigmente).

Eine vergleichsweise wenig geprüfte Hypothese zur Funktionalität bakterieller

Carotinoide ist die Funktion eines Membranstabilisierers, welche in Eukaryoten von

Cholesterin übernommen wird (Mitchell et al. 1986; Ourisson und Nakatani 1994).

Durch ihre Lipophilie und Molekülstruktur können sich Carotinoide in biologische

Membranen einlagern und in der Folge die Fluidität verändern (Pintea et al. 2005). Bei

thermophilen Bakterien wird beispielsweise eine funktionelle Membranverstärkung

durch Carotinoide als Überlebensstrategie bei extrem hohen Temperaturen postuliert

(Havaux 1998; Subczynski et al. 1992).

Diese Aussage der Hitzeresistenz könnte jedoch auch auf andere Umwelteinflüsse wie

osmotischer Stress oder Kälteeinfluss übertragen werden. So bildet beispielsweise das

pathogene Bakterium Staphylococcus aureus ein goldschimmerndes Pigment aus,

welches laut Liu (2005) dazu benutzt wird, sich gegen äußere Umwelteinflüsse zu

Diskussion 103

schützen. Bei dem Pigment könnte es sich das Staphylokokken-typische Carotinoid

Staphyloxanthin (Marshall und Wilmoth 1981) handeln. Auf diesen Aspekt wird jedoch

bei Liu (2005) nicht eingegangen.

4.5.2 Carotinoide in der Kälteanpassung

Jacobsen (2013) zeigte bei einer 10°C-Inkubation vier- bis sechsfache Zunahmen der

Carotinoidkonzentration bei den Isolaten Kocuria rhizophila J48, Micrococcus luteus

J50 und Staphylococcus xylosus J70. Die stärkste Zunahme wurde bei S. xylosus J70

ermittelt, die Carotinoidkonzentration stieg von 40 µg/g bei 30°C auf 255 µg/g in der

kälteren Umgebung an. Die ermittelten Carotinoidmengen bezogen sich auf das

Lyophilisat und können nicht mit Literaturangaben verglichen werden, da

entsprechende Daten für die analysierten Bakterienstämme fehlen. Jagannadham et

al. (2000) und Chattopadhyay et al. (1997) bezogen sich lediglich auf die prozentualen

Carotinoidanteile in der Biomasse in Abhängigkeit von der Wachstumstemperatur und

nicht auf absolute Carotinoidgehalte. So stieg beispielsweise der Gehalt in der

Biomasse von Zeaxanthin bei Sphingobacterium antarcticus von ca. 50 % bei 25°C auf

ca. 80 % bei 5°C an.

Bei dem psychrotrophen Bakterium Arthrobacter agilis konnten

Carotinoidkonzentrationen zwischen 250 µg/g bei 30°C Inkubation bis zu über

1000 µg/g bei 5°C Inkubation bezogen auf das Trockengewicht detektiert werden

(Fong et al. 2001). Die Mikroalge Chlorella protothecoides zeigte unter

Stressbedingungen, wie hoher Belichtung, Salzstress oder Nährstoffmangel höhere

Carotinoidgehalte pro Gramm Lyophilisat (Campenni’ et al. 2013). Ebenfalls zeigte der

Schimmelpilz Mucor strictus bei einer Inkubationstemperatur von 0°C eine erhöhte ß-

Carotin Produktion im seiner Biomasse im Gegensatz zu 25°C Inkubationstemperatur

(Dexter und Cooke 1984).

Die temperaturabhängigen Veränderungen der Carotinoidmengen deuten auf einen

Zusammenhang zwischen der Carotinoidsynthese und der Kälteanpassung hin. Die

Erhöhung der Carotinoidkonzentration unter kälteren Wachstumsbedingungen bei den

Isolaten K. rhizophila J48, M. luteus J50 und S. xylosus J70 werden durch die

Ergebnisse von Chattopadhyay et al. (1997) bei Micrococcus roseus und

Jagannadham et al. (2000) bei Sphingobacterium anarticus bestätigt.

Die mangelhafte Auftrennung der Peaks über die HPLC-Messung nach der Methode

von Rählert (2007) und die fehlende Bestimmung der Absorptionsmaxima verhinderte

104 Diskussion

leider die zusätzliche Ermittlung der prozentualen Carotinoidprofile. Die Angabe von

Chattopadhyay et al. (1997) und Jagannadham et al. (2000), dass bei niedrigeren

Wachstumstemperaturen ein höherer Anteil an polaren Carotinoiden gebildet wird,

kann ohne die prozentualen und die Identifizierung der Carotinoide nicht bestätigt

werden. Bei der chromatographischen Analyse des Isolates M. maritypicum J74

wurden die isolierten Carotinoide nach 10°C-Inkubation bei kürzeren Retentionszeiten

detektiert als nach 30°C-Inkubation. Da für die Auftrennung eine C18-Säule und ein

polares Lösungsmittel verwendet wurden, kann dies ein Indiz auf eine vermehrte

Synthese von polaren Carotinoiden sein. Doch auch die Molekülgröße hat einen

Einfluss auf die Retentionszeit, z.B. durchlaufen kleinere Verbindungen die stationäre

Phase schneller.

Neben den beschriebenen Wildisolaten wurden zusätzlich in der Abschlussarbeit von

Jacobsen (2013) die Referenzstämme K. rhizophila DSM 11926T, M. luteus DSM

20030T und S. xylosus DSM 20266T auf den Carotinoidgehalt analysiert. Bereits in der

Literatur wird auf die Pigmentierung der Typstämme hingewiesen. Nach Kovacs et al.

(1999) wächst Kocuria rhizophila DSM 11926T bei 28°C in gelb gefärbten Kolonien und

auch Micrococcus luteus DSM 20030T bildet Kolonien mit cremig gelben Pigmenten bei

37°C (Wieser et al. 2002). Einige Stämme von Staphylococcus xylosus zeigen nur bei

Wachstumstemperaturen unter 20°C eine orange-gelbe Pigmentierung und sind bei

30-37°C farblos (Schleifer und Kloos 1975). Dieser Aspekt unterstützt die zweite

Hypothese dieser Arbeit, dass Carotinoide einen Einfluss auf die Kälteanpassung

haben. Nach der Anzucht bei 10°C und 30°C konnten bei diesen drei Typstämmen

Carotinoide isoliert werden. Die Typstämme von K. rhizophila DSM 11926T und

S. xylosus DSM 20266T wiesen entsprechend der Wildisolate bei 10°C einen höheren

Carotinoidgehalt auf. Der Typstamm von M. luteus zeigte jedoch keine Veränderung im

Gesamtcarotinoidgehalt (Abb. 28).

Dieser zuvor beschriebene Effekt der Erhöhung der Carotinoidkonzentration bei

Kälteeinfluss wurde auch bereits in einer angewandten Studie der

Lebensmittelindustrie postuliert. Dort wurde beschrieben, dass es Bakterien gibt, die

Pigmente ausbilden und zu einem Verderb bei Lebensmitteln führen können. So

konnte Kröckel (2007) beobachten, dass es in einer vorgepackten, kühl gelagerten

Weißwurst zu einer Gelbfärbung kam. Es stellte sich heraus, dass es sich um das

gelbpigmentierte Milchsäurebakterium Leuconostoc gelidum handelte, welches diese

Gelbfärbung verursachte. Kröckel (2007) stellte in weiteren Versuchen fest, dass diese

Gelbfärbung jedoch nur bei kalten Temperaturen vorkam, wie beispielsweise der

Diskussion 105

gekühlten Lagertemperatur. Die Identifizierung des Carotinoids erfolgte mittels UV-VIS

Spektroskopie und Größenausschlusschromatographie. Während ein gelbes Pigment

von Leuconostoc citreum spektrophotometrisch eindeutig als 4,4’-Diaponeurosporin

identifiziert werden konnte, welches temperaturunabhängig produziert wird, handelte

es sich bei dem nur in der Kälte produzierten gelben Pigment von Leuconostoc

gelidum um eine Vorstufe dieses Triterpenoids. Leuconostoc gelidum ist zwar für den

Menschen nicht pathogen, jedoch wird es als Lebensmittelverderber angesehen, da

durch die Verfärbung des Lebensmittelproduktes es zu einer Ablehnung des

Konsumenten gegenüber dem Produkt kommt.

Wie die Ergebnisse der Carotinoidbestimmung zeigen, liegt die Vermutung nahe, dass

es durch Kälteeinfluss zu einer erhöhten Carotinoidproduktion in der Zellmembran

kommen kann. Dieser Effekt wird jedoch, wie bei Kröckel (2007) bevorzugt bei

Wildisolaten beobachtet. Somit kann davon ausgegangen werden, dass dieser erhöhte

Gehalt an Carotinoiden einen Schutzmechanismus gegenüber Kältestress darstellen

kann.

Der verstärkte Einbau von Carotinoiden in die Zellmembran bei Kälteeinfluss kann im

Gegensatz zu Fettsäuren nicht mit der physikalischen Eigenschaft des

Schmelzpunktes erklärt werden. Die Schmelzpunkte verschiedener Carotinoide liegen

bei über 150°C (Rothblat et al. 1964; Zscheile und White 1940), somit kann der

Mechanismus nicht mit einer Verschiebung des Schmelzpunktes begründet werden.

Vielmehr kann hier die molekulare Struktur der Carotinoide eine Rolle spielen. Die

genaue Funktion von unterschiedlichen Carotinoiden in Membranen ist immer noch

unbekannt. Es gibt jedoch Hinweise, dass das bakterielle Carotinoid Bacterioruberin

sich an Membranvesikel bindet und somit die Rigidität der Membran ansteigt (Strand et

al. 1997). Die Daten von Dieser et al. (2010) tragen zum Verständnis der

Funktionsweise von Carotinoiden bei. Carotinoid-pigmentierte heterotrophe Bakterien

tolerieren niedrige Temperaturen und episodisches Einfrieren erfolgreicher als nicht-

pigmentierte Bakterien. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass Carotinoide bei

der Modulation der Membranfluidität mitwirken müssen und zusätzlich auf die

Membranstabilität einen Einfluss haben. Daher ist dies eine notwendige Anpassung an

physikalischen Stress, der unter niedrigen oder Gefriertemperaturen entsteht. Laut

Donato et al. (1997) kann die Anwesenheit von Carotinoiden, eine höhere

Packungsdichte der Phospholipide in der Membran verursachen, womit diese

stabilisiert wird.

106 Diskussion

Somit kann festgestellt werden, dass Carotinoide eine wichtige Rolle bei Kältestress

von Bakterien auf Zellmembranebene spielen können. Sowohl für die Medizin als auch

für die Industrie ist es daher von großer Bedeutung genauer herauszufinden, warum

und zu welchem Zweck Carotinoide in Bakterien synthetisiert werden.

4.6 Zelldichte und Wachstumsverhalten

Um die Auswirkung von unterschiedlichen Temperaturen auf das jeweilige

Wachstumsverhalten von Bakterien zu untersuchen, wurde von ausgewählten Isolaten

der Wachstumsverlauf bei 10°C und 30°C bestimmt. An den beispielhaft in Abschnitt

3.7 beschriebenen Isolaten wurden temperaturabhängige Veränderungen bei den

maximalen Zellerträgen ermittelt. Es wurde jeweils eine höhere Zellausbeute bei 10°C

im Vergleich zu 30°C festgestellt. Dieses Verhalten wurde zuvor auch in den

Abschlussarbeiten von Fritsch (2012), Jacobsen (2013) und Murr (2013) beobachtet.

Bereits Margesin (2009) und Muranushi (2009) konnten diesen Effekt ebenfalls bei

ausgewählten Isolaten, die aus kalten Habitaten stammen, nachweisen.

Es fällt auf, dass dieser Effekt fast ausschließlich bei den Wildisolaten auftrat, nicht

aber bei verwandten Typ- oder Referenzstämmen. Dieses Verhalten konnte in der

Proteinbestimmung bestätigt werden.

Nach den Angaben aus der Literatur wachsen diese Isolate vorwiegend im mesophilen

Bereich. Das Wachstumsoptimum von Bacillus cereus liegt bei 37°C (Warth 1978) und

von Paenibacillus glucanolyticus liegt der Wachstumsbereich zwischen 17-37°C

(Alexander und Priest 1989). Pedobacter panaciterrae hat ein Wachstumsoptimum bei

25°C (Yoon et al. 2007) und Escherichia coli bei 37°C bis 42°C (Buchanan und La

Klawitter 1992). Staphylococcus xylosus wächst im Temperaturbereich zwischen 15°C

und 45°C (Schleifer und Kloos 1975). Listeria monocytogenes hat ein

Wachstumsoptimum zwischen 30°C und 37°C (Krämer 2007).

Bei mesophilen Bakterien liegt der maximale Wachstumsertrag meist in der Nähe des

Temperaturoptimums und bleibt zusammen mit der Wachstumsrate über einen großen

Temperaturbereich konstant. Manche psychrophile Bakterien (z.B. Psychrobacter)

versuchen dagegen sinkende Wachstumsraten bei Temperaturen unterhalb des

Wachstumsoptimums mit einer Erhöhung des Wachstumsertrages auszugleichen.

(Bakermans und Nealson 2004)

Jedoch zeigte sich bei diesen Isolaten, die laut Speziesbeschreibung ein

Wachstumsoptimum im mesophilen Bereich haben, eine deutlich höhere Zellausbeute

Diskussion 107

bei einer niedrigeren, im Kältebereich liegenden Temperatur. Da es sich bei allen

Isolaten laut Speziesbeschreibung eigentlich um mesophile Bakterien handelte, sind

diese Beobachtungen erstaunlich, da es eigentlich zu einer Reduzierung der

Zellausbeute hätte kommen müssen. Die erhöhte Zellausbeute wurde in dieser Arbeit

zusätzlich mit einer Proteinbestimmung bestätigt. Der potentielle Mechanismus dieses

Effektes sollte durch weiterführende Arbeiten ausführlicher untersucht werden, da

bislang wenige Literaturquellen zu diesem Thema existieren. Außerdem muss genauer

abgegrenzt werden, zu welchen Bakterientypen in Bezug auf das Temperaturverhalten

diese Wildisolate zählen. Außerdem sind sie nicht immer mit dem Verhalten der

Referenzstämme gleichzusetzen.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass die Wachstumsausbeute ein sehr

wichtiger, jedoch auch oft übersehener, Faktor in der Temperaturanpassung von

Bakterien ist. Zu diesem Resultat kommen auch Knoblauch und Jørgensen (1999). Die

Korrelation zwischen einer hohe Zellausbeute und Wachstum bei niedrigen

Temperaturen kann ein Merkmal von kälteangepassten Bakterien sein und kann daher

den psychrophilen Bakterien einen Vorteil beim mikrobiellen Wettbewerb bieten.

Mikroorganismen, die über einen weiten Temperaturbereich leben, benötigen einen

Ausgleich für langsame Reaktionsgeschwindigkeiten bei niedrigen Temperaturen, um

wettbewerbsfähig zu bleiben zu können. So würde die langsamere Wachstumsrate und

die dadurch langsameren biochemischen Prozesse kompensiert werden. Einige

Psychrophile maximieren oder versuchen ihr Wachstum bei niedrigen Temperaturen zu

erhalten, um niedrige Wachstumsraten auszugleichen. Damit wären sie

konkurrenzfähig. Die Daten der vorliegenden Arbeit werden auch Harder & Veldkamp

(1968), Harder und Veldkamp (1971) Isaksen & Jorgensen (1996) und Knoblauch &

Jorgensen (1999) bestätigt, die u.a. Zellausbeute und spezifische Wachstumsrate von

unterschiedlichen psychrophilen Bakterienstämmen untersucht haben. So zeigte sich

beispielweise bei Knoblauch und Jorgensen (1999), dass der psychrophile Sulfat-

reduzierende Bakterienstamm LSv514 zwar die höchste spezifische Wachstumsrate

und die Sulfatreduktion im mesophilen Temperaturbereich aufwies, die höchste

Zellausbeute jedoch zwischen 0 und 4°C gemessen wurde. Außerdem kann damit die

längere Anpassungsphase erklärt werden. Der eigentlichen Vermehrung geht bei

kühlen Inkubationstemperaturen ebenso wie bei wärmeren Inkubationstemperaturen

zunächst immer diese Anpassungsphase voraus. Diese lag-Phase ist extrem

temperaturabhängig, wie Mossel et al. (1995) bereits festgestellt hatten. Die

Anpassungsphase von L. monocytogenes lag bei einem Temperaturbereich von 0 bis

108 Diskussion

1°C zwischen 3 und 33 Tagen, bereits eine geringfügige Erhöhung auf 3°C verkürzte

sie auf 2 bis 8 Stunden.

Insgesamt kann festgestellt werden, dass durch die Kälteanpassung das Wachstum

von Bakterien sich deutlich verändert. Es scheint, dass das Wachstum in der Kälte

einen interessanten jedoch auch bislang wenig untersuchten Effekt zur Folge hat. Es

zeigt sich ein teilweise stark erhöhter Zellertrag bei kälteangepassten Bakterien im

Vergleich mit mesophilen Bakterien bei ihrer optimalen Temperatur. Dies könnte darauf

hindeuten, dass kälteadaptierte Bakterien möglicherweise ihre Kohlenstoffquelle

effizienter nutzen, um somit die mehr verlangte Biomasse aufzubauen. Außerdem

muss der niedrige bzw. nicht auftretende Effekt des gesteigerten Zellertrages bei

Referenzstämmen, die meist aus Stammsammlungen bezogen werden, geklärt

werden.

4.7 Kälteresistenztest und Überlebenstest Listeria monocytogenes

Der Kälteresistenztest zeigt, dass ein Listeria monocytogenes-Wildstamm eine stärkere

Kälteresistenz aufweist als der vergleichende Referenzstamm. So konnte der

Wildstamm Listeria monocytogenes Iso 1/11 zum einen trotz Stress in Form von

Gefrieren seine Zelldichte aufrechterhalten und zum anderen über einen sehr langen

Zeitraum in dem Lebensmittel Milch bei niedriger Temperatur überleben und die

Zelldichte halten. Diese Effekte konnten bei dem Referenzstamm DSM 20600T nicht

gezeigt werden. Die Zelldichte des Referenzstammes nahm sowohl im

Kälteresistenztest als auch im Überlebenstest ab Tag 44 ab.

Diese Ergebnisse zeigen, dass man das Verhalten gegenüber einem Stressfaktor wie

in diesem Fall niedrige Temperaturen nicht immer auf eine komplette Spezies beziehen

kann, wie es bei der Spezies Listeria monocytogenes oft der der Fall ist (Tasara und

Stephan 2006). Unser Fall zeigt, dass nur das Wildisolat eine stärker ausgeprägte

Kälteresistenz, nicht jedoch der Referenzstamm DSM 20600T, aufweist.

In der Literatur ist der Bezug von der Spezies Listeria monocytogenes zu kalten

Umgebungstemperaturen ausführlich beschrieben. Bezogen auf die

Wachstumstemperatur ist der durchschnittliche minimale Wert bei 1,7°C anzusiedeln,

wie entsprechende Untersuchungen von Junttila et al. (1988) zeigen. Laut Guillier et al.

(2005) weist die Spezies Listeria monocytogenes eine innerhalb für Bakterien recht

weiten Spannbreite von 0°C bis 45°C auf.

Diskussion 109

Auch bezogen auf das Wachstumsverhalten von L. monocytogenes konnte Jiang et al.

(2004) ein anderes Wachstumsverhalten bei unterschiedlichen Temperaturen zeigen.

So waren in Erdboden eingebrachte L. monocytogenes-Stämme bei 21°C bis zu 3

Wochen lebensfähig und bei 5°C sogar bis zu 43 Tage. Aber auch bezogen auf den

Lebensmittelbereich werden in der Literatur besonders häufig die Spezies Listeria

monocytogenes in geräucherter und gekühlter Fischware beschrieben. Als Beispiel sei

hier Hudson und Mott (1993) genannt, wo sich in geräucherten, abgepackten Lachs

L. monocytogenes bei einer Lagertemperatur von 10°C innerhalb von 4 Tagen um ca.

3 Zehnerpotenzen vermehren konnte. Zusätzlich stellten Guyer und Jemmi (1991) bei

mit L. monocytogenes kontaminiertem Lachs fest, was die anschließende

Lagertemperatur bis zu 30 Tage bei 4°C und 10°C für eine wichtige Rolle spielen kann.

Die Anfangskontamination von 6,5 x 102 Zellen/g wurde bei 4°C nach 30 Tagen circa

verhundertfacht und zwar auf einen Wert von ca. 104 Zellen/g. Bei 10°C

Lagertemperatur lag dieser Wert nach 10 Tagen sogar schon bei knapp 107 Zellen/g.

Bradshaw et al. (1985) zeigte, dass bei einer Aufbewahrungstemperatur von Milch bei

8°C sich eine anfängliche Listerien-Population von ca. 10 Zellen innerhalb von 7 Tagen

auf ca. 104 KbE/mL und nach 10 Tagen auf 106 KbE/mL anstieg.

Wie man erkennen kann, spielen die extrinsischen Faktoren eines Lebensmittels

(Lagertemperatur, aber auch Gasatmosphäre) eine wichtige Rolle bezogen auf

Wachstumsverhalten und Vermehrungsfähigkeit von Listeria monocytogenes.

Wahrscheinlich mehr als die intrinsischen Faktoren (aw-Wert, pH-Wert,

Zusammensetzung) und die Struktur des Lebensmittels, da insbesondere der

extrinsische Faktor Kühlung in aller Regel nicht ausreicht, einmal ins Produkt gelangte

L. monocytogenes-Stämme im Wachstum einzuschränken oder gar zu reduzieren.

Man erkennt, dass L. monocytogenes somit in der Lage ist, in kühlpflichtigen

Lebensmitteln nicht nur zu überdauern, sondern auch zu wachsen. Die mögliche

Gefährdung für den Menschen steigt mit längerer Lagerungsdauer grundsätzlich an,

wenn das Lebensmittel erst einmal mit dem Erreger kontaminiert ist. Die Zellen

benötigen zwar nach der Besiedlung eine temperaturabhängige Anpassungszeit,

jedoch gehen die Zellen dann schnell in die exponentielle Vermehrung mit einer kurzen

Generationszeit über. (Bülte 2008b)

Für eine Risikobewertung sind die Temperatur und die Temperaturführung daher von

wesentlicher Bedeutung. Selbst bei geringer Belastung von Lebensmitteln mit Listeria

monocytogenes mit einigen wenigen Zellen, kann bei haushaltsüblichen

110 Diskussion

Kühlschranktemperaturen der Grenzwert von 100 KbE/mg bzw. mL schnell erreicht

und überschritten werden. (Bülte 2008a)

Wie in den zuvor erwähnten Bespielen beschrieben, wird in der Literatur von den

untersuchten Isolaten oder Bakterienstämmen auf die komplette Spezies geschlossen.

Gerade bei der Spezies Listeria monocytogenes ist dies der Fall, da sie ein gut

untersuchter Vertreter für kälteadaptierte Lebensmittelpathogene ist. Die vorliegenden

Versuche zeigen aber, dass es zu einem stammspezifisch starken Unterschied in der

Vermehrungsfähigkeit und im Wachstumsverhalten bei niedrigen Temperaturen

kommen kann. Insbesondere für die Qualitätssicherung der Lebensmittelindustrie ist

diese Erkenntnis von Bedeutung. So ist es interessant, wie sich in den Rückstellproben

bestimmte Bakterien während einer gewährleisteten kühlen Lagerung im Laufe des

Mindesthaltbarkeitsdatums verhalten und dabei ihren Zellgehalt verändern bzw. sich im

Gegensatz zu höheren Temperaturen erhöhen.

Zusätzlich ist es interessant und eigentlich unabdingbar zu testen, inwieweit sich das

Wachstum von Wildstämmen und den verwendeten Referenzstämmen in einem

Lebensmittel unterscheidet. Denn erst damit wird das Wachstumsverhalten von

Bakterienstämmen, die durch Umwelteinflüsse von der (erwarteten) Standardisierung

abweichen können, der Realität entsprechend abgebildet. Erfahrungen dieser

Testreihen könnten die Qualitätssicherung in der Lebensmittelindustrie voranbringen

und die Haltbarkeit der Produkte weiter optimieren.

Zusammenfassung 111

5. Zusammenfassung

In der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene Kälteanpassungsmechanismen

bakterieller Zellmembranen untersucht. Die übergeordnete Leitfrage war, ob und wie

andere lipophile Komponenten der Zellmembran von Bakterien einen Einfluss auf die

Kälteanpassung haben.

Dafür wurden kälteadaptierte Bakterienisolate aus Lebensmitteln und

lebensmittelassozierten Habitaten isoliert und bei den Wachstumstemperaturen 10°C

und 30°C inkubiert. Untersucht wurden sie zuerst auf Unterschiede im Fettsäuremuster

und dann auf Unterschiede im Chinonmuster bzw. Chinongehalt sowie dem

Carotinoidgehalt. Zusätzlich wurde von ausgewählten Isolaten das jeweilige

Wachstumsverhalten bei verschiedenen Temperaturen untersucht und mit dem

Wachstumsverhalten bestimmter Referenzstämme verglichen. Darüber hinaus wurden

mit einem Wildstamm der Spezies Listeria monocytogenes ein Kälteresistenztest in

Bezug auf Gefriertemperaturen und ein Überlebenstest im Modelllebensmittel Milch

durchgeführt. Die Ergebnisse wurden mit Ergebnissen eines Referenzstammes aus der

Stammsammlung verglichen. Zudem konnte die Speziesneubeschreibung von

Pedobacter nutrimenti veröffentlicht werden.

Die Ergebnisse der Fettsäureanalyse entsprachen weitestgehend den Erwartungen: So

war bei Kälte bei vielen Bakterien eine deutliche Verschiebung des Fettsäuremusters

hin zu verzweigten, kurzkettigen, ungesättigten bzw. hydroxylierten Fettsäuren

erkennbar. Bei gram-positiven Vertretern zeigte sich diese Verschiebung nicht so

deutlich wie bei gram-negativen Vertretern. Der nächste Schritt dieser Arbeit bestand

deswegen darin, dieser Tendenz auf den Grund zu gehen und diese Isolate in Bezug

auf Chinone und Carotinoide weiter zu untersuchen.

Die Ergebnisse der Chinonanalyse zeigten dann oft eine Abnahme des Chinongehaltes

bei 10°C Inkubation, obwohl bei wenigen, ausgewählten Isolaten es entweder zu einem

Anstieg im Chinongehalt bzw. zu einer Veränderung des Chinonmusters bei

Kälteeinfluss kam.

Damit konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Chinongehalte bzw.

Chinonmuster einen potentiellen fettsäureunabhängigen

Kälteanpassungsmechanismus darstellen können.

Die Ergebnisse der Carotinoidanalyse ergaben, dass bestimmte Isolate bei 10°C eine

größere Carotinoidmenge aufwiesen als bei 30°C. Der Vergleich mit den

Fettsäuremustern unterstützte die Erkenntnis, dass es einen Zusammenhang zwischen

112 Zusammenfassung

Carotinoiden und einem fettsäureunabhängigen Kälteanpassungsmechanismus der

Bakterien gibt.

Eigentlich sollten in der vorliegenden Arbeit nur Fettsäuren, Chinone und Carotinoide

von Bakterien und ihr Einfluss auf die Kälteanpassung analysiert werden. Aber auch

das Wachstumsverhalten einiger der untersuchten Bakterien zeigte einen auffallenden

Effekt durch Kälteeinfluss. Somit brachte diese Arbeit eine weitere, nicht erwartete

Erkenntnis: Die Zellausbeute bei einer Inkubation von 10°C war bei einigen Isolaten

stark erhöht im Gegensatz zu einer Inkubation bei 30°C. Auffällig zudem: Dieser Effekt

trat nur bei Wildisolaten, nicht aber bei den Vergleichs- und Referenzstämmen auf.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass bei einigen Bakterienstämmen bei

sinkender Umgebungstemperatur eine Zunahme bzw. Änderung der Chinonsynthese

und Carotinoidsynthese stattfindet. Diese Ergebnisse unterstützen die in dieser Arbeit

voranstehende Hypothese, nämlich dass Chinone und Carotinoide als lipophile

Komponenten in der Zellmembran einen Einfluss auf die Membranstruktur bei

Kälteeinfluss haben können und die Kälteanpassung der Bakterienzelle auch

fettsäureunabhängig ablaufen kann. Somit wird die Fluidität der Zellmembran

beeinflusst, um auch bei niedrigeren Temperaturen in der flüssig-kristallinen und damit

funktionellen Phase zu bleiben.

In zukünftigen Arbeiten sollte der Einfluss dieser Substanzen auf die Membranfluidität

genauer untersucht und der Grad der Fluidität gemessen werden.

Außerdem sollte der Effekt der höheren Zellausbeute bei niedrigeren Temperaturen auf

ein Modelllebensmittel bezogen werden. Dieser Effekt und das Resultat, dass eine

erhöhte Zellausbeute bei einer niedrigeren Temperatur nachgewiesen wurde, obwohl

das Wachstumsoptimum dieser Isolate laut Literatur eher im mesophilen Bereich liegt,

kann auch für die Lebensmittelindustrie wichtig sein.

Zusätzlich sollte darauf geachtet werden, das Wachstumsverhalten eines Bakteriums

nicht immer auf eine komplette Spezies zu beziehen, sondern stammspezifisch zu

untersuchen. Gerade in der Lebensmittelindustrie wäre dies wichtig, da oft Versuche

zu Vermehrungsfähigkeit und Überdauerung in Lebensmitteln mit Referenzorganismen

aus Stammsammlungen durchgeführt werden, diese sich jedoch stark im

Wachstumsverhalten zu Wildisolaten unterscheiden können. Dieser Aspekt ist in der

Literatur kaum beschrieben und muss für die Qualitätssicherung stärker untersucht

werden.

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7. Anhang

Tabelle 15: Fettsäuremuster aller Isolate bei 10°C und 30°C; Angaben in %

J1

J1

J2

J2

J3

J3

J5

J5

J7

J7

J8

J8

J9

J9

J10

J10

J11

J11

J12

J12

10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 10°C 30°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 10°C 30°c 30°C

10:0

0,00 0,05

11:0 iso

11:0 anteiso

11:0 3OH

12:0

1,90 5,30

12:0 cis 5

12:0 2OH

12:0 3OH

0,00 0,81

13:0

13:0 iso 76,14 9,32

68,38 25,22 0,00 1,26

13:0 anteiso 0,00 0,18

5,06 1,22

13:0 iso 3OH

14:0 iso 0,00 2,19

0,13 2,21

5,74 2,16 1,99 2,11

0,00 0,68 1,43 1,33 0,75 0,68

14:0 3OH

14:1 trans 2

14:0

0,00 0,12

0,00 1,15

1,18 0,0 1,23 0,97 0,28 0,18

15:0 iso 7,75 39,68

5,65 19,37 35,93 45,67 33,12 33,98 54,91 52,44 12,70 45,71 2,74 9,11 55,15 67,44 5,00 7,16 3,12 2,88 3,89 3,66

15:0 anteiso 0,00 1,91

93,91 75,48 46,64 54,33 4,58 5,00 10,85 10,6 0,00 5,20 76,53 52,70 44,85 29,44 93,41 91,60 70,46 71,96 71,75 74,33

15:0 2OH

15:0 iso 3OH

15:1 cis 10

15:0

0,00 0,00 0,99 0,66

16:1 cis 10 bzw. 16:1

trans 9

6,91 7,60

0,00 9,16

16:1 cis 9

54,89 42,90

0,41 0,00

16:1 cis 11

16:1 c/t 5 4,43 1,05

2,95 0,13 2,72 2,80

11,52 10,45 2,16 1,64

16:1 iso 5

35,76 33,64 15,03 15,63

3,59 3,78 0,33 0,16

16:0 iso 2OH

16:0 3OH

16:0 iso 0,00 5,55

0,25 2,49 1,71 0,00 9,8 10,97 2,88 3,3 0,00 0,50

0,00 0,57 4,28 4,22 9,91 9,63

16:0 4,77 9,37 14,34 32,37

1,70 0,00 4,16 4,61

1,56 1,2 3,11 2,86

17:1 iso cis 9

17:1 iso cis 6 bzw. cis

9

17:1 iso 5 0,00 9,53

5,9 5,31 4,73 5,13 0,00 1,07 7,35 22,70 0,00 1,48

1,15 1,39 0,00 0,00

17:1 (iso?) 10

0,00 4,92 0,00 1,53

17:1 anteiso cis 5 0,00 1,58

3,19 2,75 3,74 4,02 0,00 0,24 3,89 0,00

17:0 iso 3OH

17:0 cyclo

17:0 iso 0,00 11,45

6,93 0,00

0,00 1,82 0,00 1,50

0,39 0,32

17:0 anteiso 0,00 0,67

5,95 0,00

1,66 1,79 6,42 5,87

17:0

18:1 cis 7

4,29 3,07

18:1 cis 9

19,88 13,70

18:1 cis 11

8,99 4,28

18:1 trans 9 bzw. cis

11

18:0

0,00 0,44

130

An

ha

ng

J16 J17 J20 J21 J22 J23 J34 J39 J40

10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C

10:0

11:0 iso 1,59

4,13

11:0 anteiso

11:0 3OH

12:0

12:0 cis 5

12:0 2OH

12:0 3OH

13:0

13:0 iso

13:0 anteiso

13:0 iso 3OH 0,00 2,45

14:0 iso 0,00 0,68

0,52 0,36

14:0 3OH

0,99 1,81

14:1 trans 2

14:0 1,18 0,00 3,06 3,61 2,2

2,81

4,57 3,11 3,31 1,2 5,82 2,01 0,65

15:0 iso 5,00 7,16 20,03 42,43 42,9 37,98 9,62 14,87

15:0 anteiso 93,41 91,60 100 100 10,99 12,45 5,69 89,64 84,66 94,49 98,1

15:0 2OH

15:0 iso 3OH

1,58 2,6

15:1 cis 10

15:0 1,09 0,00

16:1 cis 10 bzw. 16:1 trans 9 31,32 12,81 6,29 0,00

16:1 cis 9 1,49 0,00 32,47 12,36 31,84 17,31 53,73 19,3

16:1 cis 11

6,99

16:1 c/t 5 3,99 0,00

16:1 iso 5

16:0 iso 2OH

16:0 3OH

2 3,94

16:0 iso

0,54 0,26

16:0 10,6 15,94

6,77 29,3 28,67 49,09 52,29 81,56

17:1 iso cis 9 1,49

2,51

17:1 iso cis 6 bzw. cis9

17:1 iso 5

17:1 (iso?) 10

17:1 anteiso cis 5

17:0 iso 3OH

2,23 4,31

17:0 cyclo 0,00 2,27 1,4 22,28

17:0 iso 0,69 2,64

17:0 anteiso

17:0

18:1 cis 7

18:1 cis 9 4,92 0,00

18:1 cis 11 4,42 0,00 12,1 4,22 13,08 2,36

18:1 trans 9 bzw. cis 11

18:0

19:0 cyclo 11-12

33,43 10,26

Anhang

13

1

J44

J44

J45

J45

J48

J48

J50

J50

J52

J52

J53

J53

J54

J54

J55

J55

J57

J57

10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C

10:0 3OH

1,20 1,00

11:0 iso

1,60 2,80

11:0 anteiso

11:0 3OH

12:0

2,90 1,70

0,90 2,50

12:0 cis 5

12:0 2OH

0,50 1,00

12:0 3OH

2,10 2,90

1,90 0,00

13:0

0,80 0,00

13:0 iso 37,12 28,19

51,10 8,99

17,54 3,50

13:0 anteiso 10,90 2,46

2,20 0,00

1,43 0,00

13:0 iso 3OH

0,80 1,00

14:0 iso 0,60 4,02 1,11 0,61

2,70 0,00

4,70 0,00

14:0 3OH

2,60 2,90

14:1 trans 2

9,54 0,00

14:0 0,00 3,11

0,00 1,72

1,73 0,00 3,80 3,60 1,70 0,50

15:0 iso 8,31 45,70 13,31 13,50 7,69 9,28 7,37 1,38 7,70 61,91

36,01 68,00

28,00 55,90

15:0 anteiso 5,98 5,75 81,01 85,03 76,64 69,41 49,78 56,70 0,00 4,04

10,40 5,90

17,90 22,00

15:0 2OH

15:0 iso 3OH

15:1 cis 10

15:0

16:1 cis 10 bzw. 16:1 trans

9

0,92 2,88

2,30 1,11 2,30 0,00 1,02 5,10

16:1 cis 9 1,10 0,00

1,20 0,00 33,00 2,90

7,80 2,60 38,70 8,40

16:1 cis 11

16:1 c/t 5 26,86 0,00

19,40 0,00

12,55 0,00

16:1 iso 5

16:1 cis 7

2,60 0,00

16:0 iso 2OH

16:0 3OH

16:0 iso 0,00 1,60 3,22 0,86 4,25 2,00 18,22 12,29 0,00 1,72

0,92 1,60

16:0 10 oder 11 methyl

16:0 5,83 4,57

0,62 0,85 0,86 0,65 9,90 12,02 34,50 45,00 10,61 2,10 40,30 60,50 4,40 6,50

17:1 iso cis 9

0,70 1,10


17:1 iso 5 2,39 0,00

2,80 2,53

2,04 0,00

17:1 (iso?) 10

17:1 anteiso cis 5

0,00 2,70

17:0 iso 3OH

17:0 cyclo

12,40 44,70

4,70 16,40

17:0 iso 0,00 1,36

0,82 0,43 0,00 5,76

0,00 11,00

0,60 1,80

17:0 anteiso

0,38 0,00 11,08 18,06 12,85 28,56

17:0

1,33 0,00

18:1 cis 7

18:1 cis 9

18:1 cis 11

10,70 0,80

39,50 8,30 0,80 0,00

18:1 trans 9 bzw. cis 11

18:2 cis, cis 9,12

18:3 cis 9,12,15

18:0

19:0 cyclo 11-12

0,40 3,10

132

An

ha

ng

J60

J60

J61

J61

J63

J63

J67

J67

J70

J70

J72

J72

J73

J73

J74

J74

J75

J75

J76

J76

10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C 10°C 30°C

Rt 4,018 (Aldehyd?)

1,92 2,19 0,66 1,36

2,42 2,64

1,46 2,70

10:0 3 methoxy

10:0 3OH

0,50 0,20 2,63 0,56 3,04 1,13

10:0

0,00 0,24

0,00 0,23

11:0 iso

2,00 2,80

0,10 0,07

11:0 anteiso

0,17 0,00

11:0 3OH

0,00 0,40

12:0

7,43 4,22 4,97 5,22

9,94 8,11

10,25 7,98

12:0 cis 5

12:0 2OH

3,10 1,68 1,99 2,74

0,44

0,00 0,17

12:0 3OH

2,10 0,50 2,17 0,95 1,71 2,60

0,95 1,92

1,22 0,90

13:0

13:0 iso

10,01 6,83

13:0 anteiso

15,23 11,60

13:0 iso 3OH

1,10 1,60

14:0 iso 0,00 0,50

0,50 0,58

14:0 3OH

14:1 trans 2

7,82 0,00 8,99

14:0

2,00 1,40 0,14 0,33 0,12 0,41 0,92 0,66 0,00 0,52

0,00 0,26

15:0 iso 54,30 58,10 30,00 48,80

16,35 17,60

1,82 9,41 1,03 2,37 9,72 9,05

15:0 anteiso 45,70 40,50 18,00 18,10

50,47 54,32

83,56 72,45 60,75 58,92 59,71 53,65

15:0 2OH

48,84 34,12

15:0 iso 3OH

15:0

0,00 0,70 0,00 0,89 0,19 0,94

16:1 cis 10 bzw. 16:1 trans 9 0,00 0,90

16:1 cis 9

35,40 10,00

44,62 31,70

30,22 16,31

29,26 13,88

16:1 cis 11

16:1 c/t 5

0,32 0,00

16:1 iso 5

0,13 0,00

16:1 cis 7

3,30 0,80

16:0 iso 2OH

16:0 3OH

16:0 iso

0,00 0,60

0,32 0,44

0,00 1,17 18,46 21,76 10,03 14,27

16:0 10 oder 11 methyl

16:0

3,20 7,90 16,02 32,73 18,01 31,29 0,14 0,53 5,94 26,54 0,00 0,59

6,57 28,29

17:1 iso cis 9

1,00 2,50


0,08 0,21 0,14 0,22

0,00 0,68

0,35 0,18

17:1 iso 5

0,71 0,00

17:1 (iso?) 10

17:1 anteiso cis 5

0,75 0,00

17:0 iso 3OH

17:0 cyclo

1,12 10,85 1,02 11,52

17:0 iso

0,60 3,00

0,78 2,50

0,00 2,02 0,00 0,37 0,25 2,02

17:0 anteiso

3,46 4,78

14,62 13,68 12,05 16,63 11,16 21,00

17:0

0,00 0,80 0,12 0,80

0,00 0,45

17:0 10 methyl

18:1 cis 7

18:1 cis 9

44,27 35,98

44,27 38,29

18:1 cis 11

0,70 0,70 16,28 10,08 23,35 9,72

5,94 5,34

6,28 6,28

18:0

0,00 0,21

0,00 0,11 0,00 0,46 0,00 0,40

0,00 0,62

18:0 10 methyl

19:0 cyclo 2OH

19:1 cis 7

19:0 cyclo 11-12 0,00 0,11

Anhang

133

J79

J79

J82

J82

J82

J82

J84

J84

J84

J84

J85

J85

J85

J85

J86

J86

J86

J86

J87

J87

J87

J87

J88

J88

J88

J88

J89

J89

J89

J89

J90

J90

J90

J90

J91

J91

J91

J91

FFL1

FFL1

FFL1

FFL1

Iso 1/11

Iso 1/11

Iso 1/11

Iso 1/11

10°C 10°C 10°C 10°C 10°C 10°C 10°C 10°C 10°C 10°C 10°C 10°C 10°C 10°C 10°C 30°C 30°C 30°C 30°C 30°C 30°C 30°C 30°C 30°C

Rt 4,018 (Aldehyd?)

1,83 2,61

3,02 12,50 2,67 2,57 5,53 5,55 4,26 3,11 2,28 0,00

10:0 3 methoxy

1,08 0,82

10:0 3OH

4,64 1,07

10:0

0,17 0,64

11:0 iso

11:0 anteiso

11:0 3OH

4,30 1,69

12:0

2,28 1,27

12:0 cis 5

3,76 5,25

2,45 2,36 0,35 2,13 0,27 3,32 2,13 0,75

12:0 2OH

12:0 3OH

3,13 0,00

0,14 0,57

13:0

0,15 0,00

0,53 0,00

0,21 0,55

13:0 iso

13:0 anteiso

0,45 0,00

13:0 iso 3OH

0,29 0,64 5,35 0,00

14:0 iso

14:0 3OH

14:1 trans 2 10,50 0,00

3,30 0,00 0,62 0,60

0,18 1,20

14:0

1,00 5,77

0,09 0,14

15:0 iso 17,65 12,20 0,67 9,60

98,20 81,51

6,07 5,84 1,12 2,82 2,84 5,20 0,00 0,20 8,30 5,63 5,58 3,62

15:0 anteiso 49,96 53,29 85,68 78,96

84,87 67,77 85,70 67,65

15:0 2OH

15:0 iso 3OH

0,00 0,82

15:1 cis 5

0,66 0,00

15:1 cis 10

15:0

16:1 cis 10 bzw.

16:1 trans 9

0,50 0,48

0,15

16:1 cis 9

26,22 11,05

16:1 cis 11

62,16 43,51

28,25 27,16 47,12 28,50 48,45 30,64 48,29 27,95

16:1 c/t 5

16:1 iso 5

16:1 cis 7

16:0 iso 2OH

2,90 0,45

16:0 3OH

0,00 2,79

16:0 iso 15,31 15,21 0,00 0,15

16:0 10 oder 11

methyl

0,00 0,91

16:0

0,27 0,00 0,23

18,79 41,82

0,00 1,02 0,00 0,33

17:1 iso cis 9

7,53 26,17

54,51 52,41 39,67 50,48 27,39 45,33 26,16 61,05

17:1 iso 5

17:1 (iso?) 10

17:1 anteiso cis 5

17:0 iso 3OH

17:0 cyclo

17:0 iso 0,39 1,82 0,00 1,05

0,00 9,29

0,00 4,35 0,00 4,93 0,56 5,71 0,00 0,42 0,00 0,14

17:0 anteiso 6,58 17,69 13,34 9,62

6,83 25,01 8,73 27,94

17:0

0,00 0,24 0,00 0,32

17:0 10 methyl

0,46 0,44

0,00 0,12

18:1 cis 7

18:1 cis 9

13,15 15,78

18:1 cis 11

13,36 2,96

18:1 trans 9 bzw.

cis 11

11,42 6,66

4,50 4,32 6,19 6,47 16,58 5,85 19,82 1,42

18:0

0,00 0,26

19:0 cyclo 11-12

0,16 0,00

sonstige

10,53 24,63

134

A

nhang

Anhang 137

Tabelle 16: Ergebnisse des API 20E-Test von Isolat J22, P. africanus DSM12126T, P. heparinus

DSM2366T und P. panaciterrae LMG23400T

+: Positive Reaktion; - : negative Reaktion

Isolat J22

P. africanus DSM12126T

P. heparinus DSM2366T

P. panaciterrae LMG23400T

ONPG + + + +

ADH - - - -

LDC - - - -

ODC - +/- - -

CIT - - - -

H2S - - - -

URE - - - -

TDA - - - -

IND - - - -

VP + + + +

GEL - - - -

GLU - - + +

MAN - - - -

INO - - - -

SOR - - - -

RHA - - - -

SAC - - - -

MEL - - -

AMY - - - -

ARA - -

-

OX + + + +

NO2 - - - -

N2 - - - -

138 Anhang Anhang

Tabelle 17: Ergebnisse des API 20E-Test von Isolat J22, P. africanus DSM12126T, P. heparinus

DSM2366T und P. panaciterrae LMG23400T

++: Stark positive Reaktion; +: schwach positive Reaktion; - : negative Reaktion

Isolat J22 P. panaciterrae DSM 23400T

P. africanus DSM12126T

P. heparinus DSM2366T

Kontrolle - - - -

Glycerin - - - -

Erythriol - - - -

D-Arabinose + ++ ++ ++

L-Arabinose - ++ + ++

D-Ribose - - - -

D-Xylose - ++ - ++

L-Xylose - - - -

D-Adonitol - - - +

Methyl-ßD-Xylopyranosid - + - -

D-Galactose - ++ + ++

D-Glucose + ++ + ++

D-Fructose - ++ - ++

D-Mannose + ++ + ++

L-Sorbose - - - -

L-Rhamnose - - - ++

Dulcitol - - - -

Inositol - - - -

D-Mannitol - - - ++

D-Sorbitol - - - ++

Methyl-aD-Mannopyranosid - ++ - +

Methyl-aD-Glucopyranosid - ++ + ++

N-AcetylGlucosamin - ++ + ++

Amygdalin + ++ - +

Arbutin - ++ - +

Esculin Eisensubstrat ++ ++ ++ ++

Salicin - ++

+

D-Cellobiose + ++ + ++

D-Maltose + ++ + ++

D-Lactose (bovin) + ++ + ++

D-Melbiose - ++ + ++

D-Saccharose - ++ + ++

D-Trehalose + ++ + ++

Inulin - + - -

D-Melezitose - + - -

D-Raffinose - ++ - +

Amidon + ++ - -

Glycogen - - - -

Xylit - - - -

Gentibiose + + + +

D-Turanose - ++ + ++

D-Lyxose - - - -

D-Tagatose - - - -

D-Fucose - - - -

L-Fucose + + + +

D-Arabitol - - - -

L-Arabitol - - - -

Kaliumgluconat - - - -

Kalium-2-Ketogluconat - - - -

Kalium-5-Ketogluconat - - - -

Anhang 139

Tabelle 18: Ergebnisse des Biolog-GN2 Testes von Isolat J22, P. africanus DSM12126T,

P. heparinus DSM2366T und P. panaciterrae LMG23400T

++: Stark positive Reaktion; +: schwach positive Reaktion; - : negative Reaktion

Isolat J22


Pedoabacter africanus DSM12126T

Pedobacter heparinus DSM2366T

a-Cyclodextrin + ++ +

Dextrin ++ ++ + ++

Glycogen

Tween 40 ++ + ++

Tween 80 ++ +

N-Acetyl-D-Galactosamin ++ + ++

N-Acetyl-D-Glucosamin ++ ++ ++ ++

Adonitol +

L-Arabinose + + +

D-Arabitol

D-Cellobiose ++ ++ ++ ++

i-Erythritol

D-Fructose ++ ++ ++

L-Fructose ++ + +

D-Galactose ++ ++ + ++

Gentiobiose ++ ++ + ++

a-D-Glucose ++ ++ ++ ++

M-Inositol

a-D-Lactose ++ ++ + ++

Lactulose ++ ++ ++

Maltose ++ ++ + ++

D-Mannitol ++

D-Mannose ++ ++ + ++

D-Melibiose ++ ++ +

ß-Methyl-D-Glucoside ++ ++ ++

D-Psicose

d-Raffinose ++ +

L-Rhamnose

D-Sorbitol ++

Sucrose + ++ +

D-Trehalose ++ ++ +

Turanose ++ ++ + +

Xylitol

Methyl-Pyruvat ++ + + ++

Mono-methyl-Succinat + + ++

Acetic acid ++ + ++

cis-Aconitic-acid ++

Citric acid +

Formic acid + +

D-Galactonic acid lactone + +

D-Galacturonic acid

d-Gluconic acid +

D-Glucosaminic acid ++

D-Glucuronid acid + + +

a-hydroxy Butytic acid ++ +

ß-Hydroxy-Butyric acid +

g-Hydroxy Butyric acid +

p-Hydroxy Phenylacetic acid

Itaconic acid ++

a-keto Butyric acid ++

a-Keto Glutaric acid

a-Keto Valeric acid ++ + +

D,L-Lactic acid ++ + + ++

Malonic acid +

Propionic acid +

Quinic acid

D-Saccharic acid +

Sebacic acid

Succinic acid + +

Bromo succinic acid

succinamic acid +

140 Anhang Anhang

Glucuronamide

L-Alaninamide ++ +

D-Alanine ++

L-Alanine ++ + +

L-Alanyl-glycine ++ + + +

L-Asparagine ++ +

L-Aspartic acid ++

L-Glutamic acid ++ + + ++

Glycyl-L-Aspartic acid ++ + +

Glycyl-L-Glutamic acid ++ + +

L-Histidine

Hydroxy-L-Proline

L-Leucine ++ +

L-Ornithine ++ +

L-Phenylalanine +

L-Proline ++ +

L-Pyroglutamic acid

D-Serine

L-Serine ++ +

L-Threonine ++ + + ++

D,L-Carnitine + + +

g-Amino Butyric acid +

Urocanic acid ++

Inosine

Uridine +

Thymidine ++

Phenylethylamine +

Putrescine

2-Aminoethanol

2,3,-Butanediol

Glycerol ++ +

D,L-a-Glycerol phosphate ++ +

Glucose-1-phosphate + + +

Glucose-6-phosphate + + +

Anhang 141

Abbildung 41: Phylogenetischer Stammbaum mit Maximum-Liklihood-Methode der 16S rRNA


fragilis DSM2151T dient als Außenseiter. „Bootstrap“-Werte ≥70 % sind als Zahl gekennzeichnet.

Der Skalierungsbalken entspricht einem Sequenzunterschied von 0,05%.

142 Anhang Anhang

Abbildung 42: Phylogenetischer Stammbaum mit Maximum-Parsimony-Methode der 16S rRNA


fragilis DSM2151T dient als Außenseiter.

Danksagung 143

8. Danksagung

An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mich während der letzten

Jahre mit Rat und Tat unterstützt haben:

Als erstes gilt mein großer Dank Prof. Dr. André Lipski für die Bereitstellung des

Themas, das entgegengebrachte Vertrauen und die wissenschaftliche Betreuung.

Außerdem möchte ich mich bei ihm für das Ermöglichen mehrerer Kongressteilnahmen

zur Veröffentlichung der Studienergebnisse und natürlich für die Unterstützung

bedanken.

Herr Prof. Dr. Andreas Schieber möchte ich herzlich für die Übernahme des

Korreferats danken.

Ein besonders herzlicher Dank gilt Eva Meyer. Bei Ihr möchte ich von Herzen für die

enorme Unterstützung und Hilfsbereitschaft, all die vielen schönen Pausen und die

unzähligen Gespräche während aller Höhen und Tiefen bedanken. Gleiches gilt für

Mareike Weber. Bei Ihr möchte ich mich für ihre (vor allem im Endspurt) enorme

Unterstützung in allen Bereichen der Arbeit, die unzähligen wissenschaftlichen und

nicht-wissenschaftlichen Gespräche ☺ und das Korrekturlesen der Arbeit danken.

Dieser Dank gilt natürlich auch Beate Silkens.

Frau Paula Nöthen danke ich für die schöne Zusammenarbeit und die vielen netten

und lustigen Gespräche.

Ich danke allen im Laufe der Zeit wechselnden Mitgliedern meiner Arbeitsgruppe für

die freundschaftliche und amüsante Zusammenarbeit. Ein besonders Dankeschön gilt

hierbei Nina Müller, Nicole Breuer, Rommy Schmidt, Sandra Szczepanski, Alina Meyer,

Jan Sieber, Daniela Reekers, Charlotte Weiß, Jonas Verbeek, Julian Weber, Caroline

Fritsch, Dorothee Murr, Marina Jacobsen und Waldemar Seel.

Herrn Dr. Benno Zimmermann danke ich für seine hilfreichen Ratschläge bei der

Carotinoidbestimmung.

Ich danke allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Instituts für Ernährungs- und

Lebensmittelwissenschaften und dem Institut für Mikrobiologie und Biotechnologie.

Ganz zum Schluss möchte ich mich bei meiner Familie und vor allem bei meinem

Mann Marcus für die unendliche, liebevolle Unterstützung in allen Lebenslagen und

Euren festen Glaube an mich und meine Fähigkeiten bedanken.

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Untersuchung der Kälteanpassungsmechanismen bakterieller ...hss.ulb.uni-bonn.de/2015/4145/4145.pdf · International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology von 25 im