Untersuchung der Wasserqualität von Bodensee und Baikalsee · Vergleichende Untersuchung der Wasserqualität von Bodensee und Baikalsee 2 Berichtsblatt 1. ISBN oder ISSN ISBN 2

Vergleichende Untersuchung der Wasserqualität von Bodensee und Baikalsee

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Untersuchung der Wasserqualität von Bodensee und Baikalsee

Projektverbund unter Förderung des

Bundesministeriums für Bildung und Forschung

Vergleichende molekularbiologische und mikrobiologische Untersuchung der Wasserqualität

unter dem Aspekt der Trinkwasseraufbereitung Teilprojekte 02WT0488 und 02WT0489

September 2008


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Berichtsblatt

1. ISBN oder ISSN ISBN

2. Berichtsart Schlussbericht

3a. Titel des Berichts Untersuchung der Wasserqualität von Bodensee und Baikalsee. Vergleichende molekularbiologische und mikrobiologische Untersuchung der Wasserqualität unter dem Aspekt der Trinkwasseraufbereitung 3b. Titel der Publikation

4a. Autoren des Berichts (Name, Vorname(n)) Prof. Dr. Ursula Obst, Harald Peter, Jan Fickel, PD Dr. Till Bachmann

5. Abschlussdatum des Vorhabens September 2008

4b. Autoren der Publikation (Name, Vorname(n)) Autorenkollektiv

6. Veröffentlichungsdatum September 2008

8. Durchführende Institution(en) (Name, Adresse) Forschungszentrum Karlsruhe (FZKa), Mitglied der Herrmann von Helmholtz Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren, Institut für Technische Chemie, Abteilung Umweltmikrobiologie

7. Form der Publikation Broschüre

Hermann-von-Helmholtz-Platz 1 9. Ber. Nr. Durchführende Institution FZKa, Universität Stuttgart

76344 Eggenstein-Leopoldshafen 10. Förderkennzeichen 02WT0488, 02WT0489

11a. Seitenzahl Bericht 68

13. Fördernde Institution (Name, Adresse)

11b. Seitenzahl Publikation

Bundesministerium für 12. Literaturangaben

Bildung und Forschung (BMBF) 14. Tabellen 14

53170 Bonn

15. Abbildungen 73

16. Zusätzliche Angaben 17. Vorgelegt bei (Titel, Ort, Datum) 18. Kurzfassung Vorkommen und natürliche Eliminationsfaktoren von Enterokokken wurden im Baikal- und Bodensee untersucht. Entgegen der ursprünglichen Annahmen wurde ein Ruhestadium der Enterokokken, jedoch keine vollständige Elimination entdeckt. Umfangreiche Laborexperimente bestätigten diese Beobachtung. Zur Unterstützung der Untersuchungen wurde ein grosses Methodenspektrum entwickelt, das u.a. rDNA-basierte PCR-Verfahren, molekularbiologische und biochemische Verfahren zum Nachweis bakterieller Stressantworten und einen neuartigen DNA-Microarray für den Nachweis von toxigenen Cyanobakterien umfasst. Das neu entwickelte und etablierte Methoden-spektrum steht nun für zukünftige Untersuchungen zur Verfügung. Enterokokken im Ruhestadium konnten unter geeigneten Milieubedingungen reaktiviert werden. Dieser Befund und offensichtliche strukturelle Veränderungen im Zellaufbau während und nach dem Ruhestadium weisen auf eine mögliche höhere Umweltresistenz der Enterokokken hin. Diese Veränderungen könnten sich auch auf eine erhöhte Desinfektionsresistenz auswirken. Die vorliegenden Untersuchungen sind somit ein erster Hinweis auf notwendige Überprüfungen und ggf. Optimierungen von Desinfektionsprozessen. 19. Schlagwörter Enterokokken, VBNC, Reaktivierung; Baikalsee, Bodensee, DNA-Microarray, Cyanobakterien

20. Verlag

21. Preis Übernahme der Versandkosten


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Document Control Sheet 1. ISBN or ISSN ISBN

2. Type of Report Final report

3b. Title of Publication Investigation of the Water Quality of Lake Constance and Lake Baikal: Comparing molecular biological and microbiological investigation of the water quality with regard to drinking water treatment R&D

4b. Author(s) of the Publication (Family Name, First Name(s)) Prof. Dr. Ursula Obst, Harald Peter, Jan Fickel

6. Publication Date Septmeber 2008

8. Performing Organization(s) (Name, Address) Forschungszentrum Karlsruhe, Mitglied der Herrmann von Helmholtz Gemeinschaft Deutscher Forschungszentren, Institut für Technische Chemie, Abteilung Umweltmikrobiologie

7. Form of Publication brochure

Hermann-von-Helmholtz-Platz 1 9. Originator’s Report No.

76344 Eggenstein-Leopoldshafen 10. Reference No. 02WT0488, 02WT0489

11a. No. of Pages Report

13. Sponsoring Agency (Name, Address)

11b. No. of Pages Publication

Bundesministerium für 12. No. of References

Bildung und Forschung (BMBF) 14. No. of Tables 14

53170 Bonn

15. No. of Figures 71

16. Supplementary Notes

17. Presented at (Title, Place, Date) 18. Abstract Occurence and natural elimination factors of enterococci were investigated in Lake Baikal and Lake Constance. In contrast to the initial hypothesis a state of dormancy , but no complete elimination was detected in enterococci. Comprehensive laboratory experiments proved the observation in the field. To support the investigations a broad methodological spectrum was developed including rDNA-based PCR, molecular biological and biochemical methods to detect bacterial stress responses as well as a novel DNA Microarray to detect toxigenic cyanobacteria. The novel methodological spectrum is now applicable for future investigations. Dormant enterococci could be resuscitated under optimized environmental conditions. This result and the obvious structural changes in the cellular composition during and after dormancy indicate a potential increased resistance of enterococci against adverse environmental conditions. These changes may also cause an increased resistance against disinfection. Thus, the results obtained in the project are a first hint about necessary examinations and optimisations of disinfection technologies.

19. Keywords Enterococci, VBNC, resuscitation; Lake Baikal, Lake Constance, DNA Microarray, cyanobacteria

20. Publisher

21. Price mail and package


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Das diesem Bericht zugrunde liegende Vorhaben wurde mit Mitteln des Bundesministeriums für Bildung und Forschung unter dem Förderkennzeichen 02WT0488 und 02WT0489 gefördert. Die Verantwortung für den Inhalt dieser Veröffentlichung liegt beim Autor.


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Inhalt

1. Zielsetzung des Projekts…………………………………………………………... 10

2. Russisch-deutsche Kooperation…………………………………...................... 11

2.1. Beschreibung der mikrobiologischen Qualität des Baikalsees………………... 11

2.2. Beschreibung der mikrobiologischen Qualität des Bodensees……………….. 13

2.3. Gemeinsames deutsch - russisches Arbeitsprogramm………………………… 15

2.3.1. Methodenentwicklung……………………………………………………………. 15

2.3.2. Probenahmen…………………………………………………………………….. 16

2.3.3. Expeditionen auf dem Baikalsee……………………………………………….. 17

2.3.3.1. Expedition 2005………………………………………………………………… 17

2.3.3.2. Aufenthalt und Probenahmen durch Harald Peter

Sommer 2006………………………………………………………................. 24

2.3.3.3. Expedition 2007………………………………………………………………… 24

3. Teilprojekt FZKa1……………………………………………………………………...29

3.1. Ziel des Teilprojektes………………………………………………....................... 29

3.2. Geräte und Meterialien…………………………………………………………….. 30

3.2.1. Polymerase Kettenreaktion (PCR) und Primersysteme……………………… 31

3.3. Ausführung………………………………………………………………………….. 32

3.3.1. Enterokokken Referenzen………………………………………………………. 32

3.3.2. Aufbereitung der Proben vom Baikal-See und Bodensee…………………… 32

3.3.3. Nachweis der Enterokokken mit Polymerase Kettenreaktion (PCR) ………. 34

3.3.4. Real-time PCR (TaqMan)……………………………………………………….. 37

1:FZKa: Forschnungszentrum Karlsuhe


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3.3.5. Populationsanalyse nativer Biofilme mittels PCR und anschließender Danaturierender Gradienten Gel Elektrophorese (PCR-DGGE)…………………… 39

3.4. Ergebnisse der Probenahmen an Baikal- und Bodensee……………………… 42

3.4.1. Expedition Baikalsee 2005……………………………………………………… 42

3.4.2. Expedition Baikalsee 2007……………………………………………............... 46

3.4.3. Untersuchungen am Bodensee………………………………………………… 49

3.4.4. Untersuchungen an Biofilmen…………………………………………………... 50

3.4.5. Diskussion der Ergebnisse……………………………………………………… 52

3.4.6. Änderung des Arbeitsplanes……………………………………………………. 55

3.5. Versuche mit Enterokokken zum Viable but not culturable (VBNC) – Stadium…………………………………………………………………. 56

3.5.1. Einleitung………………………………………………………………………….. 56

3.5.2. Material und Methoden…………………………………………………………...57

- Geräte und Materialien………………………………………………………...57

- Enterokokkenstämme für Stress- und Resuszitationsversuche…………..58

- Kulturmedien……………………………………………………………………58

- Stressfaktoren…………………………………………………………………..58

- Stress- und Resuszitationsansatz…………………………………………….59

- Definiertes Abtöten von Zellen………………………………………………..60

- Vitalitätstest - CTC-Dehydrogenase – Test und Gegenfärbung mit DAPI……………..................................................60

- Bestimmung lebender Mikroorganismen mittels Direct Viable Count (DVC)………………………….... 62

- Diskriminierung lebender und toter Zellen mit Propidium-Monoazid (PMA)…………........................................................ 63

- Zellaufkonzentrierung…………………………………………………. ………64


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- Enviromental scanning electron microscope (ESEM)……………………..64

- Intact Cell Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time of Flight (MALDI-ToF) Massenspektrometrie…..................................................... 66

3.5.3. Ergebnisse…………………………………………………………..................... 68

3.5.3.1. Methodenentwicklung………………………………………………………… 68

- Vitalitätstest - Nachweis lebender Mikroorganismen mittels Direct Viable Count (DVC)……………………………...68 - Nachweis lebender und toter Zellen mit PMA und Quantifizierung mit Real Time PCR (TaqMan-PCR)……………………………………….. 70 - Intact Cell-MALDI…………………………………………………………….. 71

- Mikroskopische Aufnahmen von nicht kultiverbaren Enterokokkenzellen mittels ESEM…………………………………............................................. 74

3.5.3.2. Stressversuche mit Enterococcus faecium……………………………......... 75

3.5.4. Diskussion……………………………………………………………...................82

3.6. Zusammenfassung des TeilprojektesFZKa…………………............................. 82

4. Teilprojekt Uni Stuttgart……………………………………………………………. 84

4.1. Ziel des Teilprojektes………………………………………………………………. 84

4.2. Erzielte Ergebnisse………………………………………………………………… 84

4.2.1. Primer Design zur Amplifizierung der Ziel-DNA………………………………. 84

4.2.2. Isolierung genomischer DNA aus Cyanobakterien………………………….... 85

4.2.3. Etablierung einer Multiplex-Amplifizierung der Zielgene 16S rDNA und mcyA…………………………………………………………….. 86

4.2.4. Entwicklung des Cyano-Chips (DNA Microarray)…………………………….. 87

4.2.5. Mathematische Betrachtungen: ROC-Analyse……………………………….. 90


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4.3. Entwicklung eines portablen Formates zur Durchführung von DNA-Microarray- Experimenten vor Ort (Baikalsee/Schiff) bzw. im Feldversuch………………... 92

4.4. Durchführung von Feldexperimenten am Baikalsee auf der Forschungsstation in Bolshie Kotie und dem Forschungsschiff Vereshagin im August 2006 …. 93

4.5. Baikalexpeidtionen 2005, 2006, 2007……………………………………………. 94

4.5.1 Expedition 2005…………………………………………………………………… 95

4.5.2. Forschungshaufenthalt 2006……………………………………………………. 95

4.5.3. Forschungsaufenthalt Irkutsk / Baikalsee August 2007……………………… 95

4.6. Auswertung der Baikalseeproben 2005, 2006 und 2007………………………. 96

4.7. Auswertung der Bodenseewasserproben……………………………………… 100

4.8. Nachweisgrenze, Sensitivität des Cyano-Chip-Systems……………………... 102

4.9. Bestätigung der Funktionalität des Cyano-Chips anhand relevanter Referenzstämme……………………………………………………... 110 4.10. Zusammenfassung Teilprojekt Stuttgart……………………………………… 110

5. Teilprojekt ZV BWV………………………………………………………………... 113

6. Diskussion der Gesamtergebnisse……………………………………………...113

6.1. Kultivierbare Enterokokken und enterokokkale DNA…………………………..113

6.2. Cyanobakterien…………………………………………………….……………... 114

6.3. VBNC: Versuchsergebnisse der Labors Karlsruhe und Irkutsk……………… 116

6.4. Fazit und Perspektiven…………………………………………….…………….. 117

7. Zusammenfassung………………………………………………….……………...119

8. Literatur……………………………………………………………….……………... 121


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9. Anhang…………………………………………………………………................... 131

9.1. FZKa

9.1.1 Beprobungsplan Baikal - See Expedition 2005

9.1.1.1.Tabelle enterokokkale DNA Baikal – See, Expedition 2005

9.1.2. Beprobungsplan Baikal Expedition 2007

9.1.2.1. Tabelle enterokokkale DNA Baikal – See, Expedition 2007

9.1.3. Tabelle enterokokkale DNA Bodensee 2005 – 2006, Beprobungsplan 9.2. Daten Baikal-See, Limnologisches Institut Irkutsk 9.2.1 Mikrobiologische Ergebnisse freie Wasserphase 2007 9.2.2. Mikrobiologische Ergebnisse Sedimente 2007 9.2.3. Chemische Parameter freie Wasserphase 2007 9.2.4. Temperaturdaten freie Wasserphase 2007 9.3. Universität Stuttgart 9.3.1 Tabellen, Zusammenfassung Cyano-Chip Sondensignale Bodensee 9.3.2 Tabellen, Zusammenfassung Cyano-Chip Sondensignale Baikalsee


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1. Zielsetzung des Projekts Ziel des Vorhabens war es, Verbleib und Schicksal fäkaler Einträge am Beispiel von Enterokokken in Süsswasserseen zu untersuchen, die für die Trinkwasserversorgung genutzt werden. Anlass waren mikrobiologische Untersuchungen am Baikal-See, bei denen Fäkalindikatoren wie Enterokokken nach verhältnismässig kurzer horizontaler und vertikaler Entfernung von der Eintragsquelle nicht mehr nachgeweisen werden konnten. Es wurden natürliche Eliminationsmechanismen wie Cyanotoxine, Phagenbefall oder enzymatische Lyse durch die autochthone Mikroflora vermutet, die als Vorbild für ähnliche Mechanismen im Bodensee herangezogen werden sollten.

Der Bodensee sollte ausserdem beispielhaft für einen mäßig, aber nicht gleichförmig belasteten See als Trinkwasserquelle stehen, aus dem die Bodensee-Wasserversorgung (BWV) in Sipplingen das Rohwasser entnimmt und zu Trinkwasser aufbereitet. Das unbelastete Gewässer wurde durch den Baikal-See mit der Trinkwassergewinnung und Flaschenabfüllung durch das Limnologische Institut in Irkutsk repräsentiert.

Vergleichsparameter sollten die Zusammensetzung der planktonischen und sessilen mikrobiellen Population unter besonderer Berücksichtigung der Enterokokken, deren Resistenzen sowie die für die Trinkwasserqualität massgebenden mikrobiellen Stoffwechselaktivitäten darstellen. Neben den mikrobiologischen und den mikroskopischen Verfahren sollten die Analysen neben den klassischen mikrobiologischen Untersuchungen durch das Limnologische Institut in Irkutsk für den Baikalsee und durch die Bodensee-Wasserversorgung für den Bodensee hauptsächlich auf der Basis molekularbiologischer Untersuchungen (Forschungszentrum Karlsruhe) durchgeführt werden. Zusätzlich sollten die Cyanobakterien-Populationen elektronenmikroskopisch erfasst und ein DNA-Chip hinsichtlich der taxonomischen Zuordnung und der potentiellen Toxinbildung entwickelt werden (Universität Stuttgart).


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2. Russisch-deutsche Kooperation

2.1 Beschreibung der mikrobiologischen Qualität des Baikalsees (V. Parfenova, eingereicht bei Int. J. Hydrobiol.) Der Baikalsee ist ein oligotropher Tiefwassersee, dessen Wassertiefe und Bodensedimente insbesondere durch das Limnologische Institut der Russischen Akademie der Wissenschaften/Abteilung Sibirien am Baikalsee intensiv wissenschaftlich untersucht wird. Die mikrobielle Population des Baikalsees ist ein wichtiger Faktor des dortigen Süsswasserökosystems. Sie entwickelte sich im Laufe von 25 Mio. Jahren unter einzigartigen ökologischen Bedingungen: grosse Wassertiefen (über 1,6 km), lange Eisperioden (derzeit bis zu 5 Monate), tiefe Durchschnittswassertemperaturen (0 – 14°C). Autochthone Mikroorganismen mussten daher ihre Lebensfunktionen spezifisch an diese Verhältnisse anpassen, um existieren zu können, und wurden ebenfalls vielfach untersucht. Der Schwerpunkt lag dabei auf der Zahl und Biomasse physiologischer Bakteriengruppen, ihre saisonbedingte Dynamik sowie ihre vertikale Verteilung im Wasserkörper und im Sediment [Valentina 1-5]. Auch die phylogenetische Variabilität der Mikrobengesellschaft war Gegenstand zahlreicher Untersuchungen [Valentina 6 - 8]. Basierend auf den 16S rRNA-Sequenzen gehören zu den im Baikal-See identifizierten Bakterien hauptsächlich Cyanobakterien, Proteobakterien und Actinomyceten. Proteobakterien bilden eine beträchtlichen Anteil an der bakteriellen Baikal-Population; basierend auf der phylogenetischen Analyse sind alle 4 α-, β-, γ- und δ-Unterklassen vertreten. Die vertikale Verteilung der Bakterien im See zeigt, dass vor allem an der Oberfläche (Neuston) hoch aktive und dichte Besiedlungen mit aquatischen Mikroorganismen der Spezies Pseudomonas, Mycobacterium, Bacillus, Chromobacterium u.a. vorliegt [Kozhova, O.M. und Izmestéva, L.R. (1998)]. Hier scheint auch die Bakterienpopulation vorzuliegen, die hauptsächlich an den Kohlenstoffkreisläufen im See beteiligt ist. Die heterotrophe Biomasse nimmt naturgemäß mit zunehmender Tiefe ab und korreliert mit der phototrophen Biomasse. In 100 m Tiefe sinkt die mikrobielle Zellzahl auf die Nachweisgrenze ab. Pathogene und opportunistische Bakterien wurden dagegen lange Zeit nicht erforscht. Durch die zunehmend technische und später auch touristische Erschliessung, vor allem am südlichen Baikal, rückte das ökologische Potential dier Bakterien zunehmend ins Interesse und die räumlicher Verteilung, biologische Vielfalt des Genus Enterobacteriaceae (z.B. E. coli) und sog. nicht-fermentierenden Bakterien (z.B. Pseudomonaden) wurde verfolgt [V. Parvenova, Int. J. Hydrobiol]. Dagegen wurde der Relevanz der Enterokokken als potentiell Pathogene und Risikofaktoren wenig Beachtung geschenkt. Dies änderte sich, nachdem Pathogenität, Virulenz und auch Antibiotika-Resistenzen der Enterokokken bekannt wurden [V. Parvenova, Int. J. Hydrobiol]. Erste mikrobiologische Untersuchungen im Vorfeld des Projekts durch die Partner vom Limnologischen Institut in Irkutsk ergaben jedoch, das Einträge von Fäkalbakterien über Abwassereinleitungen seeanliegender Gemeinden und Industrieanlagen sowie aus natürlichen Zuflüssen (z.B. Selenga) innerhalb kurzer Entfernung bzw. Tiefe mikrobiologisch nicht mehr nachweisbar waren. Die Ursachen hierfür waren nicht bekannt, konnten aber in den widrigen


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Umweltbedingungen (Kälte, Nährstoffmangel, Licht), in Verdünnungseffekten in dem riesigen Wasserkörper, Nahrungsfeinden oder biogenen Toxinen (z.B. Cyanobakterien) vermutet werden.

Der Baikalsee dient – genau wie der Bodensee – als Rohwasser für die Trinkwassergewinnung am Baikal und Umgebung. Durch die sehr gute Qualität des aus 600 m Tiefe geförderten Seewassers kann sich die Aufbereitung auf eine fraktionierter Filtration bis 0,4 µm sowie auf Desinfektion mit UV-Strahlung und Ozon beschränken [Way to obtain Baikal Drinking water Patent N 2045478 Russia, МKI 6 CO2F1/00 A 23 L 3/34. / Grachev M.A. Souturin A.N., Avdeev B.B., Drukker V.V.? Sorin V. L.Ivanov U.R., Cemenov A.P. Scherstjankin G.G., Galasiy G.I., Limnological Institute SB PAS /].Nach Untersuchungen verschiedener internationaler Laboratorien, beispielsweise des Instituts Fresenius in Taunusstein/Deutschland, entspricht dieses Wasser dem hygienischen und qualitativen Zustand eines einwandfreien Trinkwassers und kann bis zu 1,5 Jahren in 1,5 L-PE-Flaschen ohne irgendwelche schädliche Veränderungen gelagert werden.

Diese offensichtliche Selbstreinigungspotenz des Baikalsees hinsichtlich fäkaler Einflüsse war der Impetus, die Kenntnis von Eliminationsmechanismen mittels neuer analytischer Methoden zu vertiefen. Basis hierfür waren das bestehende Messprogramm inklusive verschiedener Messpunkte sowie die Probenahmelogistik des Limnologischen Instituts in Irkutsk.

Abb. 1: Baikalsee mit Probenahmestellen des Limnologischen Instituts in Irkutsk


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80% des Wassereinzugsgebiets des Baikalsees liegen in der Autonomen Republik Buryatien mit den Hauptnebenflüssen Selenga, Barguzin und Obere Angara. Im Irkutsker Gebiet liegen die Hauptkontaminationsquellen in Sludyanka (Eisenbahnknotenpunkt), Kultuk (50.000 Einwohner) und dem Industrieort Baikalsk (Zellulose- und Papierherstellung) [Valentina Parvenova 13]. So konnten in Untersuchungen des Limnologischen Instituts bis zu 225 Enterokken/100 mL bei Kultuk und 12 bis 15 Enterokokken/100 mL bei Baikalsk detektiert werden. Selbst in der südlichen Kontrollstation Listvyanka-Tanchoi (L-T) in der Mitte des Süd-Baikal konnten in 10 m Tiefe 24 Enterokokken/100 mL nachgewiesen werden (Abb. 18,19). Der mikrobiologische Nachweis endete jedoch in tieferen Tiefen. Die potentiell gefährlichste Verschmutzungsquelle ist der Zufluss Selenga, der aus Buryatien und der Mongolei vorgereinigte Industrie- und kommunale Abwässer mit sich bringt (Abb.1). Hier und in den Nebenflüssen der Selenga können die Enterokokkenzahlen bis über 100 KBE/100 mL steigen. Das Wasser des Pelagial nach der Mündung des Selengadeltas gleicht sich in der Qualität jedoch rasch der des Baikalsees an. Ein ähnliches Bild abnehmender Enterokokkenzahlen ergibt sich nach der Mündung des Barguzin in der Barguzin Bay. In der Flussmündung direkt können noch bis zu 13 Enterokken/100 mL mikrobiologisch nachgewiesen werden, nicht jedoch im offenen See bzw an der Kontrollstation Uchan Kap – Tonkij Kap (U-T) in der Mitte des Mittleren Baikals (Abb. 18, 19). Im nördlichen Teil des Baikal sind die Enterokokkenzahlen gering (bis zu 4 KBE/100 mL). So kann die räumliche Verteilung der Enterokken im Baiklasee mit seenahen Siedlungen, Zuflussmündungen und schlecht gereinigten kommunalen Abwässern verbunden werden, die sich im offenen Wasserkörper und mit zunehmender Tiefe verliert.

2.2. Beschreibung der mikrobiologischen Qualität des Bodensees (H. Güde: Limnologica 34, 117-123; Arch.Hydrobiol. 160, 289-303; Stuttgarter Berichte zur Siedlungswasserwirtschaft 154, 19-35) Der Bodensee ist ein ursprünglich oligotropher voralpiner See mit einer Maximaltiefe von 254 m. Trotz der verschiedenen klimatischen Bedingungen und Grössen weist er einige Gemeinsamkeiten mit dem Baikalsee hinsichtlich des originalen Nährstoffregimes und der Nutzung zu Trinkwasserzwecken auf. Während des 20. Jhd. wurden immer grössere Nährstoffmengen anthropogenen Ursprungs in den See eingetragen, was zu einer zunehmenden Eutrophierung führte. Diese Entwicklung konnte jedoch grösstenteils durch die Einführung von Kläranlagen um den See umgekehrt werden.

Zusammensetzung und Biomasse des Bakterienplanktons werden seit den 1980iger Jahren verfolgt, wobei Veränderungen der Biomasse mit den Veränderungen des Nährstoffstatus nur wenig oder verzögert erfolgten. Die Eutrophierung hatte jedoch Auswirkungen auf die Zahl der kultivierbaren Bakterien: während die mikroskopisch erfassbare Gesamtzellzahl in etwa konstant blieb, stieg die Koloniezahl während der Eutrophierungsphasen an. Insgesamt weist jedoch der Zustand des Bakterienplanktons im Bodensee nur wenig Abhängigkeit vom Trophiezustand auf. Wenn überhaupt ist Wachstum saisonal von der Verfügbarkeit an anorganischem


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Phosphor, nicht jedoch an organischem Kohlenstoff begrenzt. Kleine einzellige Bakterien bilden die Hauptform des Planktons, was auf einen sehr wirksamen Adaptationsmechanismus auf Hungerzustände, nämlich einen Anstieg des Oberflächen/Volumen-Verhältnisses durch Verleinerung der Zellform, zurückzuführen ist. Eine andere Ursache für verkleinerte Zellformen könnte der durch Protozoen ausgeübte Frassdruck darstellen, wobei die Nährstofflimitierung grösseren Einfluss ausüben dürfte. Langsames Wachstum oder zeitweiliges Nicht-Wachstum stellt zudem auch eine effiziente Schutzmassnahme gegen parasitische Beeinträchtigungen wie Virusbefall dar.

Der Eintrag von fäkalen Keimen in den Bodensee erfolgt überwiegend über Zuflüsse, die als Kläranlagen-Vorfluter dienen und je nach Einzugsgebiet unterschiedliche Belastungsgrade aufweisen (z.B. Schussen mit 20.000 EWG/m3sec und Seefelder Aach mit 9.000EWG/m3sec). Obwohl nach heutigen Standards ausgebaute Kläranlagen nachweislich zu einer bedeutenden Keim-Entlastung beitragen, ist doch eine verbleibende Restbelastung ihrer Ausläufe unvermeidlich. Vor allem regenentlstungen mit ihren stark erhöhten Keimdichten führen zu sprunghaften Anstiegen der Keimbelastungen in den Vorflutern und letztendlich im See. Auch Resuspensionen von in Flusssedimenten abgelagerten Keimen können zu einem Belastungsanstieg beitragen.

Während üblicherweise E. coli als Indikator für fäkale Verunreinigungen dient, zeigen Enterokokken oder Bakterienspezies mit Dauerformen wie Clostridien längerfristige Verunreinigungen mit höherer Gleichmässigkeit an. So sind erhöhte Keimdichten von E. coli vor allem unmittelbar nach den Einmündungen der Kläranlagenabläufe in die Vorfluter zu verzeichnen, während erhöhte Enterokokken- oder Clostridienzahlen die gleichmässige Verteilung von fäkalen Einträgen punktuellen und diffusen Ursprungs deutlich anzeigen. Sie eignen sich daher nach den bisherigen klassisch-mikrobiologischen Untersuchungen des Bodensees vor allem gut zum Nachweis längerfristiger oder älterer Verunreinigungen. Des weiteren liessen die mikrobiologischen Untersuchungen bis dato den Schluss zu, dass bei Starkniederschlagsereignissen erhöht auftretende Keimdichten wieder verhältnismässig schnell durch hohe Absterberaten der Bakterien reduziert werden. Trotzdem werden gerade bei starken Niederschlägen immer wieder hohe Keimbelastungen, vor allem von Enterokokken nachgewiesen, die auf den Eintrag von ungeklärtem Abwasser und ungereinigtem Regenwasser aus Rückhaltebecken zurückgeführt werden und vermehrte Desinfektionsmassnahmen bei der Trinkwasseraufbereitung erfordern.


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Abb. 2: Beprobungsstellen Bodensee

2.3 Gemeinsames deutsch-russisches Arbeitsprogramm

2.3.1. Methodenentwicklung Im Verlaufe der Projektpartnerschaft konnten den Projektpartnern des Limnologischen Institutes Irkutsk folgende Methoden, die am Institut für Technische Chemie, Bereich Wasser- und Geotechnologie (ITC-WGT), Abt. Mikrobiologie natürlicher und technischer Grenzflächen, etabliert sind, gezeigt und ausgewählte russische Mitarbeiter darin praktisch unterwiesen und angelernt werden – mit dem Ziel, dass diese Methoden auch von russischer Seite her angewendet und interpretiert werden können:

Klassische Enterokokken PCR mit verschiedenen Primersystemen (vgl. Kap. 3.3.3. und Abb. 16),

- Vorgehensweise zum Primerdesign mittels verschiedener Datenbanken (nicht beschrieben). - Spezifische Anreicherung von Mikroorganismen und Durchführung von VBNC-Versuchen mit verschiedenen Stressparametern (vgl. Kap. 3.5.2.). - RNA Isolation und anschliessender RT-PCR für die zukünftige Beschreibung von Genexpressionen im geplanten Nachfolgeprojekt (z.B. Penicillin binding protein 5 u.v.a.) (nicht beschrieben).


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Des weiteren wurden die russischen Kollegen während zweier Besuche (2005 und 2007) in der Abt. Mikrobiologie natürlicher und technischer Grenzflächen in folgenden Methoden erfolgreich eingearbeitet:

- Detektion von hygienisch relevanten Mikroorganismen mittels Realtime PCR (vgl. Kap. 3.3.4.), - Populationsanalysen mittels PCR und anschliesender Denaturierender Gradienten Gel Elektrophorese (DGGE) (vgl. Kap. 3.3.5. - sowie - weitere enterokokkenspezifischen PCR-Systeme (nicht beschrieben).

Insgesamt wurden alle Methoden erfolgreich vermittelt. Insbesondere die Methoden der Populationsanalyse werden von den russischen Kollegen angewendet und wohl in Zukunft auf die mikrobiologischen Besonderheiten am Baikalsee abgestimmt werden. Diesbezüglich besteht reger Informationsaustausch zwischen den russischen und deutschen Projektpartnern, damit entstandene Probleme mit diesen Systemen und/oder bei der Interpretation der Ergebnisse schnell gelöst werden können.

2.3.2 Probenahmen - Probenahmen Baikal-See: Die Entnahmen gemeinsam bearbeiteter Proben am Baikalsee fanden während den im folgenden beschriebenen Expeditionen 2005 und 2007 statt. Die Proben der Expeditionen wurden in speziellen Transportbehältern gekühlt mit Trockeneis von Irkutsk/Russland per Fedex bzw. DHL an das Forschungszentrum Karlsruhe/Deutschland geschickt. Diese Probenbehälter beider Probenahmen (2005, 2007) kamen nach einer erheblichen zeitlichen Verzögerung ungekühlt in Deutschland an. Durch diesen Umstand war die DNA-Ausbeute in den nachfolgenden Extraktionen im Labor nicht optimal und bei einigen Proben unzureichend. Aufgrund der sehr begrenzten DNA-Menge mussten zahlreiche Optimierungsschritte für die molekularbiologischen Nachweismethoden durchgeführt werden (siehe 3.2).

- Biofilm-Coupons aus V4A-Stahl wurden im März 2005 in Form eines „Mobiles“ (siehe auch Abb. 25a) an einer Beprobungsstelle („Polygon“) des Limnologischen Instituts nordöstlich von Listvyanka am Kap Berezoviy in 3,4,7 und 17m Tiefe ausgebracht und verankert. Parallel wurden Aufwuchsträger aus natürlichem Gestein (Marmor, Granit und Amphibolit) am selben Ort ausgebracht. Die Stahl-Coupons wurden während der Expedition im August 2005, die Gesteine im September 2005 geerntet.

- Probenahmen Bodensee: Die Probenahmen wurden vom Projektpartner BWV zwischen März 2005 bis Juni 2006 genommen (siehe Abb, 2), unter Kühlung als fixierte Filtrationsprobe gelagert und chargenweise an das FZKa geschickt bzw. persönlich abgeholt. Insgesamt wurden in dem Beprobungszeitraum März 2005 bis Juni 2006 220 Filtrationsproben genommen. Biofilm-Coupons (V4A-Stahl) wurden an den Zuflüssen Schussen, Argen, Stockacher Aach und Seefelder Aach zweimalig ausgebracht. Trotz Sicherung wurden die Coupons jedoch von unbekannte Dritte entfernt, so dass hier keine Proben gewonnen werden konnten. Innerhalb des Sees


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konnten wegen der Schifffahrt und entsprechender Auflagen keine Biofilm-Probenahmestellen eingerichtet werden. Ufernahe Coupons fielen durch den extrem niedrigen Wasserstand im Sommer 2006 trocken.

2.3.3.1 Expedition 2005 (18. August bis 28. August 2005): Planung der Expedition: Durchführung und Verlauf der Expedition wurden von Dr. Valentina Parfenova und Prof. Dr. Ursula Obst im Herbst 2003 während eines Aufenthalts von Obst in Irkutsk geplant. Der Plan orientierte sich an der Fragestellung des Projekts, die natürliche Elimination von Fäkalindikatoren wie Enterokokken im Baikal zu erforschen und nach Möglichkeit auf andere Standorte wie den Bodensee zu übertragen. Hierzu wurden über den gesamten Baikal belastete Zuflüsse und Standorte gewählt und dazu im Vergleich unbelastete Transsekten in der Seemitte. Schwerpunkt der Bewertung sollte auf den molekularbiologischen Analysen von bakterieller und cyanobakterieller Population und von hygienisch relevanten Bakterien liegen. Auf Wunsch von Prof. Dr. Grachev wurde nachträglich die Analyse von Mikrocystin durch das Karlsruher Labor mit einbezogen. Der Hauptteil der Molekularbiologie wurde in Karlsruhe angesiedelt, die Cyanobakterien-Analytik in Stuttgart. Logistik sowie klassische mikrobiologische und wasserchemische Analytik im Baikal wurde Aufgabe des Irkutsker Instituts, die des Bodensees wurde Aufgabe des Sipplinger Labors. Dr. Meyer brachte als mikrobiologische Referenz-Parameter für den Baikal zusätzlich Clostridium perfringens und eine Enterokokken-Analytik gemäß TrinkwV ein. Nach weiteren Detail-Absprachen im März 2005 während des kick-off meetings ergab sich ein Probenahmeplan gemäß Abb. 1. Die Kosten für die Expedition wurden 2003 mit 10.000.-US$ angegeben und so auch beantragt. Im Expeditionsvertrag 2005 wurden die Kosten dann auf 10.550.- € erhöht, was mit erhöhten Benzinkosten etc. begründet wurde. Eine detaillierte Aufstellung wurde dem Projektträger bereits übermittelt. Es wurden Geräte im Gesamtwert von 18.000.-€ für die Probenvorbereitung während der Expedition über RIOL und CHIMED nach Irkutsk bestellt. Allerdings fehlten bei Beginn der Expedition eine dringend benötigte Filtrationseinheit und eine Pumpe, die erst 2 Wochen später nachgeliefert wurden. Der ingenieurstechnischen Kompetenz von Fickel, Heidt und Feuerstein-Obst ist eine Improvisation zu verdanken, die alle Proben zu konservieren half.

Verlauf der Expedition: Die Expedition wurde auf der MS Vereshagin (440 BRG) unter Kapitän Anatoliy Svyashenkov durchgeführt. Das Schiff ist Eigentum des Partners Limnologisches Institut und konnte für diese Zwecke gechartert werden.


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Abb. 3: MS Vereshagin nahe der Babushka Bay Die Fahrt startete am 18.8.05, mittags, nachdem das Schiff mit der Laborausrüstung und den Privatsachen der Teilnehmer beladen war.

18.8.2005: Polygon Monitoring Station = 8 Biofilmproben aus 4 Tiefen (per Taucher)

Nach dem kick-off meeting Anfang März 2005 wurden durch einen Taucher des Irkutsker Instituts Biofilm-Aufwuchsträger in verschiedenen Tiefen an einer institutseigenen Messstation (sog. Polygon) in verschiedenen Tiefen (3, 4, 7, 17 m) eingebracht. Von jeder Tiefe wurde eine Aufwuchsplatte entfernt und im Schiffslabor konserviert.

19.8.2005: Kultuk und Baikalsk = 28 Wasserproben

Die Probenahmen im Südbaikal gestalteten sich etwas zeitaufwendiger wegen der Verhandlungen von Prof. Grachev in Baikalsk. Nichtsdestotrotz konnten die Arbeiten bis etwa 24:00 abgeschlossen werden.

Durch die Initiative von Prof. Grachev war es auch möglich, Proben aus der Abwasseraufbereitung des Kombinats (Schönungsteich) zu entnehmen.


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Abb. 4: Zellstoffkombinat in Baikalsk

20.8.2005: Selenga-Mündung (Ust-Kharauz) = 15 Wasserproben

Aufgrund heftigen Wellengangs konnte die geplante Transsekte Kontrollstation Südbaikal nicht genommen werden. Nach Ankerung in einer Bucht gegenüber des Selenga-Deltas konnte spätabends bis in den frühen Morgen die Probenahme an der Transsekte Ust-Kharauz durchgeführt werden.

Die Selenga ist eine der Haupt-Kontaminanten des Baikal und bringt vorwiegend Abwässer aus der Mongolischen und Barjutischen Volksrepublik mit sich.

21.8.2005: Kontrollstation Mittel-Baikal (U-T) = 16 Wasserproben Nachdem sich im mittleren Baikal der Seegang beruhigte, konnte das Tiefenprofil an der Kontrollstation Mittel-Baikal bis zu 1650 m Tiefe als unbelastete Negativkontrolle genommen werden.

Die Probenahme dauerte insgesamt über 8 Stunden. Der Temperatursprung fand zwischen 15 und 30 m statt. In 1650 m Tiefe herrschte ein Druck von etwa 1600 dbar und eine Temperatur von 3,2°C.


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Abb. 5: Probenahme im Vertikal-Profil

22.8.2005: Barguzin Bay und Chivyrkyi Bay = 15 Wasserproben Die Mündung des Barguzin Rivers stellt eine Kontamination vorwiegend landwirtschaftlicher Prägung dar. Chivyrkyi Bay und die Schlangenbucht sind aufgrund der dort vorhandenen heißen Quellen eine beliebte Touristengegend. Zudem wurden einige Proben für Cyanobakterien und anderes Picoplankton an den heißen Quellen genommen.

23.8.2005: Kontrollstation Nord-Baikal (D-E) = 10 Wasserproben Die 2. Negativkontrolle eines unbelasteten Vertikalprofils bis 800 m Tiefe wurde an der Kontrollstation Nord-Baikal genommen. Die Probenahme dauerte etwa 3 Stunden. Temperatursprung war zwischen 9 und 14 m, Druck in 890 m ca. 870 dbar.

Abb. 6: Entnahme der Wasserproben aus dem Probenehmer


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24.8.2005: Nizhne Angarsk und Severo-Baikalsk = 5 Wasserproben Am Nord-Baikal wurden im Bereich Nizhne Angarsk, der Mündung der Oberen Angara, Severobaikalsk und Baikalkoe Proben entnommen. Der Bereich ist durch die Bautätigkeit der BAM (Baikal-Amur-Magistrale), Hafenanlagen und andere Industrie belastet.

25.8.2005: Small Sea/Olkhon Island = 4 Wasserproben Das „Kleine Meer“ zwischen Olkhon Island und dem westlichen Festland ist flach und außerdem durch relativ viel Tourismus belastet. Es wurden Proben vor Khuzhir, dem Hauptort von Olkhon Island, bei MRS (Fähre zwischen Festland und Insel), sowie am Durchgang zwischen „Kleinem Meer“ und offenem Baikal genommen.

Abb. 7: MS Vereshagin vor Khuzhir

26.8.2005: Keine Probenahme wegen Sturms

27.8.2005: Kontrollstation Süd-Baikal (L-T) sowie Listvankya und Angara-Ausfluss = 15 Wasserproben Am letzten Tag der Expedition hatte sich das Wetter so beruhigt, dass wieder ein Vertikalprofil auf dem offenen Baikal bis 1400 m Tiefe beprobt werden konnte. Der Temperatursprung fand zwischen 10 und 25 m Tiefe statt. In 1370 m Tiefe herrschten 1360 dbar. Zusätzlich wurden Oberflächenproben vor Listvyanka und am Angara-Ausfluss gezogen.


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Abb. 8: Vor Listvyanka

28.8.2005: Ende der Expedition Am Vormittag des 28.8. gingen wir in Listvyanka von Bord.

Abb. 9: Ausräumen der Vereshagin

Erhobene Parameter: - Hydrologische Grundparameter (auf dem Schiff erhoben durch Slava Ivanov)

- Wasserchemische Grundparameter (auf dem Schiff analysiert durch Irina Tomberg)

- Gesamtbakterienzahlen, Coliforme, E. coli, Coliphagen (auf dem Schiff analysiert durch Tatjana Kostornova und Irina Nikulina)


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- Enterokokken, Clostridien (auf dem Schiff analysiert durch Olga Pavlova und Doris Jaiter)

- Enterokokken-DNA (fixiert und auf Filtern konserviert durch Jan Fickel; die Analysen wurden in Deutschland fertig gestellt)

Abb. 10: Vorbereitung der Proben für die Bestimmung enterokokkaler DNA

- Picoplankton (fixiert und konserviert durch Irina Tichonova; Analysen werden in Irkutsk fertig gestellt)

- Cyanobacteria (fixiert und auf Filter konserviert durch Till Bachmann; Analysen wurden in Deutschland fertig gestellt)

- Microcystin (fixiert und auf Kartuschen konserviert durch Axel Heidt; Analysen wurden in Deutschland fertig gestellt)

- Gelöster organischer Kohlenstoff (filtriert und mit Säure konserviert durch Thomas Feuerstein-Obst; Analysen wurden in Deutschland fertig gestellt)

Probentransport:

Alle in Deutschland zu analysierenden Proben wurden beim Zoll in Irkutsk deklariert und mit Trockeneis per DHL nach Karlsruhe versandt. Die Proben der Expedition 2005 kamen trotz exakter Deklaration mit erheblichem Zeitverzögerung aus nicht nachvollziehbaren Gründen im FZKa an. Die Folge war, dass nur eine verhältnismäßig geringe Menge Gesamt-DNA zur weiteren Verarbeitung aus den Proben gewonnen werden konnte. Eine vollständige Populationsanalyse bzw. die Detektion weiterer hygienisch relevanter Bakterien außer den Enterokokken war damit nicht möglich.


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Ergebnisse: Die Ergebnisse sind im Ergebnisteil aufgeführt.

2.3.3.2 Aufenthalt und Probenahmen durch Harald Peter Sommer 2006 Durchführung von Feldexperimenten am Baikalsee auf der Forschungsstation in Bolshie Kotie und dem Forschungsschiff Vereshagin im August 2006 sind in Kapitel 4 beschrieben.

2.3.3.3 Expedition 2007 (12.09.2007 – 21.09.2007): Planung der Expedition:

Durchführung und Verlauf der Expedition wurde von Dr. T. Zemskaya 2007 in Absprache mit Prof. Dr. U. Obst und Dr. V. Parfenova geplant. Hierbei sollten zum einen möglichst viele Vergleichsproben zu der Expedition 2005 sowie zusätzliche Sedimentproben genommen werden. Hierzu wurden im südlichen Baikal wieder wie 2005 belastete Zuflüsse und Standorte gewählt und dazu im Vergleich unbelastete Transsekten in der Seemitte.

Des Weiteren wurden von einer weiteren russischen Arbeitsgruppe Methankonzentrationen im Sediment sowie „Ölemissionen“ vom Grund des Baikals untersucht. Von den russischen Kollegen des Limnologischen Institutes wurde die Gesamt-DNA aus den Sedimentproben direkt auf dem Schiff extrahiert, um im Institut molekularbiologische Nachweise zu führen. Die molekularbiologische Quantifizierung wurde nach Karlsruhe übertragen und mehrere DNA-Extrakte dafür zur Verfügung gestellt.

Probenahmeplan und Koordinaten der Probenahmestellen sind im Anhang aufgeführt.

Die Kosten für die Expedition betrugen beinahe 11.000.-€. Die Geräte, die für die Expedition 2005 bereits angeschafft wurden, konnten wiederholt bei dieser Expedition effizient genutzt werden. So war es möglich, in einer kurzen Zeit den Probenahmeplan (siehe Anhang) abzuarbeiten.

Verlauf der Expedition:

Die Expedition wurde wieder auf der MS Vereshagin (440 BRG) unter Kapitän Anatoly Svyashenkov durchgeführt. Das Schiff ist Eigentum des Partners Limnologisches Institut und kann für diese Zwecke gechartert werden.


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14.08.2007: Beginn der Expedition

9.30: Abfahrt zum Labor. Besprechung mit Dr. Zemskaya über den weiteren Expeditionsablauf. Die Utensilien für die Expedition werden zum Transport bereit gelegt.

Beladen der Fahrzeuge und Fahrt des gesamten Expeditionsteams zum Schiff.

Abfahrt mit Schiff 18:00. An Control-Station Süd Probenahme Tiefenprofil bis 1400 m. Proben wurden abfiltiert (bis 24 Uhr) (Analog zu Probenbezeichnung: CSSB). Weiterfahrt nach Kultuk Koordinaten der Probenahmestellen sind analog zu dem Expeditionsbericht 2005.

15.08.2007

7:00:Probenahme Sediment und –Wasserproben (near ground, surface) Kultuk.

Weiterfahrt nach Baikalsk (Papierkombinat). Probenahmestelle wie 2005 und Transekte (1,2,3,6 km) left, central, right. Wasserproben surface und near ground, Sediment 1 cm.

Insgesamt wurden 14 Sedimentproben und 29 Wasserproben aufbereitet.

Unterbrechung durch Regierungsbeamten (Security des Zellstoff-Kombinats vom Ufer aus). Probenahmeende 22:00 Uhr. Arbeitsende 23: Uhr. Nachts Weiterfahrt nach Babushkin (rauher Seegang).

Abb. 11: Neuer Mehrfach-Probenehmer


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16.08.2007

Abb. 12: Sedimentbeprobung: H. Metzger, J. Fickel, Dr. T. Zemskaya Babushkin: Beprobungsort für Methanbestimmung. Dafür war eine gesonderte Arbeitsgruppe an Bord. Weiterführende Probenaufbereitung (DNA-Isolation) sowie Planungsgespräche mit Dr. Zemskaya und Olga Pavlova sowie Unterstützung des „Methanteams“.

Weiterfahrt Selenga-Delta. Beprobung Transsekte 14,5; 10, 5; 1 km. Jeweils Sediment – und Wasserproben. Siehe Beprobungsplan.

Arbeitsende 23 Uhr.

Abb. 13: Öl -Schlieren durch „oil-bubbles“ Über Nacht Weiterfahrt nach Ukhan Tonky. Morgends 8:00 Uhr Beprobung Tiefenprofil.

1400 m und 1500 m Proben konnten nicht genommen werden. 1 Sedimentprobe und bodennahes Wasser wurden bei 1649m genommen.

Weiterfahrt nach Cape Tonky station 23: Oberflächenprobe von oil-bubbles und Sediment.

Aufräumen des Labors und Sichern Ausrüstung vor vorhergesagtem Unwetter mit Sturm.


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18.08.2007

Rückfahrt nach Irkutsk Teil 1. Rückfahrt im Allrad-Van bis Nähe Uhlan-Ude.

Übernachtung Nähe Selenga-Delta in einem Seminar-Heim.

Ende ca. 22:30 Uhr.

19.08.2007

Weiterfahrt nach Irkutsk ca. 9:30 Uhr. Ankunft in Irkutsk 17:30 Uhr.

20.08.2007

Arbeitsbeginn im Institut ca. 9:00 Uhr. Abschlussbesprechung über die Expedition mit Dr. Parfenova. Versand der Proben wurde mit A. Gurulev durchgesprochen und in die Wege geleitet. Voraussichtliches Versanddatum: 27.08.2007 mit DHL-Express. Die Versandgebühr, 100 €, wurde bar von deutscher Seite bezahlt (Empfangsbestätigung vorhanden).

Abschließende Gespräche mit dem russ. Labor-Team über verschiedene Methoden für molekularbiologische Nachweise von Enterokokken und DNA-Extraktionen aus Sedimenten.

Erhobene Parameter:

- Hydrologische Parameter und Programmierung des Mehrfach-Probenehmers durch Slava Ivanov

- Gesamtbakterienzahl, DNA-Extraktion und Sedimentuntersuchungen durch Dr. Tamara Zemskaya, Tatjana Kostornova, Dr. Olga Pavlova.

- Bakterielle Populationsanalysen und spezifische Taxons (fixiert und auf Filtern konserviert, sowie Probenahme von Sedimenten durch Jan Fickel und Herbert Metzger; Analysen werden in Deutschland fertig gestellt)


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Probentransport:

Alle genommenen Proben wurden beim Zoll in Irkutsk deklariert und mittels DHL-Express nach Karlsruhe versandt. Die Proben der Expedition 2007 kamen wegen fehlerhafter Deklaration seitens der russischen Kollegen mit erheblicher Zeitverzögerung im FZKa an. Die Folge war, dass nur eine verhältnismässig geringe Menge Gesamt-DNA zur weiteren Verarbeitung aus den Proben gewonnen werden konnte. Eine vollständige Populationsanalyse bzw. die Detektion weiterer hygienisch relevanter Bakterien ausser den Enterokokken war damit nicht möglich.

Ergebnisse:

Die Ergebnisse dieser Expedition sind im Ergebnisteil Kap. 3.4.2. aufgeführt.


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3. Teilprojekt FZKa

3.1. Ziel des Teilprojekts

Aufgabe des Teilprojekts des Forschungszentrums Karlsruhe war es, die planktonische und an ausgesuchten Probenahmestellen die adhäsive Bakterienpopulation in den beiden Seen mit molekularbiologischen Methoden zu untersuchen und möglichst Auswirkungen auf Population und ggf. Funktionen durch gelegentliche Kontaminationen (Zuflüsse, Regenereignisse, industrielle und kommunale Einleitungen) zu erfassen. Im Kontext mit den Teilprojekten der anderen Partner sollte dadurch das mit mikrobiologischen Methoden nachgewiesene Verschwinden von Fäkalbakterien im Baikalsee erklärt und die zugrunde liegenden natürlichen Eliminationsprozesse nach Möglichkeit auf den Bodensee übertragen werden. Bei diesen Untersuchungen sollten insbesondere die Enterokokken als fäkale Leitorganismen einen Untersuchungsschwerpunkt bilden, da sie neben ihrer im Vergleich zu E. coli höheren Desinfektionstoleranz eine gesundheitlich bedenkliche Antibiotikaresistenz aufweisen können.

Die Populationsanalysen sollten auf der Basis von DNA-Mustern und rRNA-Übereinstimmungen und die Funktionsanalysen über mRNA-Muster durchgeführt werden.


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3.2 Geräte und Materialien

Tabelle 1: Abkürzungsverzeichnis

Abkürzungsverzeichnis BHI Brain-heart-infusion (Vollmedium), Merck, Darmstadt bp Basenpaare Ct threshold cycle dbar 1,0000 · 104 Pa DNA Desoxyribonukleinsäure dNTPs Desoxynukleosidtriphosphat DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH x g Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s2) h Stunde inkl. Inklusive KAA Kanamycin-Aesculin-Agar MALDI-ToF Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation min Minute MW Mittelwert NaCLphys. Physiologische Kochsalzlösung NCBI National Center for Biotechnology Information OD Optische Dichte PBS Phosphate buffered saline, Phosphat-gepufferte Salzlösung PCR Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain-reaction) rDNA ribosomale DNA rpm rounds per minute sec Sekunde TAMRA 6-Carboxy-Tetramethylrodamin TEM Transmissionselektronenmikroskop VBNC Viable but not culturable

Im folgenden sind häufig verwendete Materialien und Geräte aufgeführt. Methodenspezifische Geräte und Materialien sind direkt in den entsprechenden Textabschnitten aufgeführt.

Geräte:

Lumi-Imager T1 (Roch Diagnostics, Mannheim)

Autoklav Dampfsterilisator (Varioklav)

Thermomixer Compact (Eppendorff)

Magnetrührer MR 3001 (Heidoplph)

Analysenwaage Laboratoy LC 220 S (Sartorius)

Zentrifuge Biofuge Pico (Heraeus)


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Vortex-Mixer Stuart (Bibbery Sterlin)

Materialien:

Duran-Flaschen 250 – 5000 mL (Schott)

Handschuhe (Ansel health care)

Reasearch ® Pipetten 10 µl – 10 mL (Eppendorf) mit jeweiligen Pipettenspitzen (Eppendorf)

Reaktionsgefäße 0,1 – 2 mL (Eppendorf)

Zentrifugenröhrchen 15 mL und 50 mL (Nunc, Sarstedt)

3.2.1. Polymerase Kettenreaktion (PCR) und Primersysteme

Geräte und Materialien der PCR:

Thermocycler GeneAmp ® PCR-System 9700 (Applied Biosystem)

Sterilbank (Holten Lamin air)

Elektrophoresekammer (Renner)

Elektrophorese Power Pack (Biorad)

Sterile PCR-Reaktionsgefäße 0,2 mL, DNA-frei (Eppendorf)

10x PCR-Puffer, inkl. 15 mM MgCl2 (Qiagen)

dNTP-Set, 100 mM Lösungen( dATP, dCTP, dTTP, dGTP, Amerhsam Bioscience, Freiburg, Deutschland) : je 10 mM endkonzentration

Vorwärts- und Rückwärts-Primer (je 10 mM, Biomers)

HotStar-Taq™ Polymerase (5 units/µL, Qiagen)

LiChroSolv PCR-Wasser (Merck)


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Agarosegel: 1%iges Agarose Gel mit Ethidiumbromid (Endkonzentration 1 µg/mL, Sigma)

TAE-Puffer: (100x, 1 Liter): 484,4 g (4M) Tris-Base (Sigma, 82,0 g (1M) Natriumacetat (Merck, 37,2 g (0,1M) EDTA (Riedl-de-Haen), 100 mL Eisessig (Sigma), pH 8.0

Beladungspuffer: 2 mL EDTA (50 mM) pH 8.0 , 0,4 g (20%) Ficoll (Sigma),

5 mg (0,25%) Bromphenolblau (Sigma), 5 mg (0,25 %)Xylen-Cyanol (Sigma)

Größenstandard 100 bp-Ladder XIV (Roche)

Physiologische Kochsalzlösung: 0,9 % (Massenprozent) NaCl in 1 L demineralisiertes Wasser, sterilautoklavieren.

Phosphat-gepufferte Salzlösung: 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4 in 1 l demineralisiertes Wasser, pH 7.4, sterilautoklavieren.

3.3 Ausführung

3.3.1 Enterokokken Referenzen

Als Referenzstamm für die molekularbiologischen Nachweise von Enterokokken diente Enterococcus faecium B7641 (Klinik-Isolat, vanA-positiv).

Zur Anzucht wurde ein Aliquot des Referenzstammes in 30 mL BHI-Medium und bei 37°C auf einem Schüttelinkubator (Heidolph Unumax 2010, Certomat H Sartorius) bei 125 rpm für 4 h inkubiert. Zur Zellseparation wurde die Supsension 15 min bei 2000 rpm zentrifugiert (Centrifuge 5403, Eppendorff), zweimal mit steriler NaClphys.

gewaschen und in NaClphys bei -80°C gelagert. Die Zellen wurden direkt für die molekularbiologischen Nachweise verwendet.

3.3.2 Aufbereitung der Proben vom Baikal-See und Bodensee Die Wasserproben vom Baikal-See wurden während der Expeditionen 2005 und 2007 direkt auf dem Schiff in einem provisorischen Labor filtriert (Probenanzahl und Filtrationsvolumina (siehe Anhang 9.1.2:Beprobungsplan 2007) (Filtrationseinheit: Sartorius , Filtermaterial: Porengröße 0,2 µm, 47 mm Durchmesser, Whatman), mittels EtOH 70% fixiert, in ein steriles Nunc-Röhrchen bzw. 2 mL Reaktionsgefäß (Sarstedt, Eppendorff) überführt und bei -20°C gelagert. Der Transport der Proben

http://de.wikipedia.org/wiki/Massenanteil


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erfolgte idealerweise unter Trockeneis. Die Probenahme und Konservierung der Proben gilt analog für die Bodensee-Proben. Im FZKa wurden die Filter steril entnommen und in ein 2 mL Eppendorf Reaktionsgefäß überführt, mit 1 mL sterilem Wasser (Merck, Darmstadt) versetzt (vgl.Probentransport, Kap. 2.3.2., Kap. ). Die Zellen wurden mittels der Gefrier-Tau-Methode (schockfrosten mit flüssigem Stickstoff, anschließendes Auftauen bei 52°C unter schütteln (Thermomixer compact, Eppendorff)) aufgeschlossen. Der Gefrier-Tau-Schritt wurde jeweils 5 mal pro Probe wiederholt. Der entstandene Zellaufschluss wurde anschließend vom Filter separiert und diente direkt als Template für die molekularbiologischen Untersuchungen mittels Polymerase-Ketten-Reaktion (siehe 3.2 und 3.3.3).

Die Biofilmproben der Expedition 2005 wurden direkt vor Ort mit sterilen Zellschabern in 1ml autochtonem Wasser abgeschabt, steril in 1,5µl Eppendorff-Reaktionsgefäße überführt und bei -20°C gelagert.

Das Probenmaterial wurde mit den russischen Kollegen geteilt. Da das Probenmaterial sehr gering war konnte die Biofilmsuspension im FZKa nur direkt für molekularbiologische Nachweise verwendet werden.

Die Sedimentproben der Expedition 2007 wurden direkt in dem provisorischen Labor aufgearbeitet.

Die Sedimente wurden direkt aus dem Probenehmer (vgl. Expeditionsbericht 2007) bis zu einer max. Tiefe von 1cm entnommen, was dem ersten cm des Seebodens entspricht. Ca. 20 mg Sediment wurde in ein 2 mL Eppendorff-Reationsgefäss überführt und mit dem DNA-Isolationskit PrepMan™ Ultra (Applied Biosystems) versetzt.

Hierzu wurde das Sediment mit 400 µl PrepMan™ Ultra – Reagenz überschichtet, unter schütteln suspendiert, 10 min bei 100°C (Wasserbad) behandelt, 2 min bei 6000 rpm zentrifugiert, der Überstand abgenommen und bei -20°C gelagert. Dieser Überstand wurde im FZKa direkt für die molekularbiologischen Nachweise eingesetzt.

Es wurden alle Primersysteme (vgl. Kap.3.3.3, Tabelle 2) auf die Sedimentproben angewendet.


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AbbXX: Agarosegel der PCR-Produkte der Sedimentproben 2007 Abb. 14: Agarosegel – PCR-Produkte Sedimentproben Selenga 2007 In Abb. 14 ist zu erkennen, dass die Probe 21 (Sedimentprobe Selenga in 1 km Entfernung) ein positives, enterokokkenspezifisches PCR-Produkt aufweist. Neben dieser Bande sind aber auch unspezifische PCR-Produkte zu erkennen.

3.3.3 Nachweis von Enterokokken mit Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Die PCR ist eine in vitro-Technik, um kleinste DNA-Mengen nachweisen zu können. Durch die Vervielfältigung eines spezifischen DNA-Abschnittes des Zielbakteriums werden DNA-Fragmente amplifiziert. Durch Erhitzen wird die doppelsträngige DNA in ihre Einzelstränge zerlegt. Um DNA nun mit Hilfe der PCR amplifizieren zu können, werden spezifische, komplementäre Oligonukleotidsequenzen (Primer) benötigt, die die zu amplifizierende Region begrenzt. Eine DNA-Polymerase verlängert unter den richtigen Reaktionsbedingungen und in Gegenwart von Desoxynucleotidtriphosphaten (dNTPs) die Primer entlang der einzelsträngigen denaturierten DNA-Matrize und synthetisiert so neue DNA-Stränge, die komplementär zur Zielregion sind. So werden nach mehreren Zyklen die spezifischen DNA-Abschnitte amplifiziert und können im Agarosegel unter Anfärbung mit Ethidiumbromid detektiert werden. Das Amplikon wurde mittels Gelelektrophorese (1 %iges Agarose-Gel, 10 µL Amplifikat) und einer DNA-Ladder 100 bps detektiert. Für alle Amplifikationen wurde das Gerät GeneAmp, PCR-system 9700, Applied Biosystems verwendet.

Zum Nachweis der Zielorganismen wurde bis zu 10 µL der Zellsuspensionen direkt in die PCR eingesetzt. Der Mastermix bestand aus PCR-Puffer (50 mmol·L-1 KCl, 10 mmol·L-1 TrisHCl (pH: 8,3), 1,5 mmol·L-1 MgCl2 , 0,001% (w/v)gelantine, 200 µmol·L-1 dNTPs, 10 pmol · Ansatz-1 Primer, 2,5 U Taq Polymerase je 50µL Reaktionsansatz.

22 23

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

12,24 100 bp-Ladder 1-11 Sedimentprobe 20-10 13-20 Sedimentprobe 9-2 21: Sediment Selenga 1km

Entfernung 22 Positivkontrolle 23 Negativkontrolle


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Als Negativkontrolle wurde PCR-Wasser (Merck, Darmstadt) eingesetzt. Um Bestandteile in dem Probenmaterial zu reduzieren, die die molekularbiologischen Nachweismethoden limitieren können (Huminsäuren u.ä.) wurden die Proben gegebenenfalls mit Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) aufgereinigt. Hierzu wurde 10 mg steriles PVPP in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß eingewogen, mit 100µL Probenflüssigkeit versetzt und 15 min unter Schütteln gemischt.

Danach wurde das PVPP abzentrifugiert, der Flüssigkeitsüberstand abgenommen und direkt für die molekularbiologischen Nachweise eingesetzt.

Abb. 15: Agarose-Gel der PCR-Produkte der Selenga-Wasserproben 2007, 14,5km Entfernung, 270m Tiefe, PVPP behandelt

Für die molekularbiologische Detektion von Enterokokken des Boden- und Baikalsees wurden folgende PCR-Systeme eingesetzt, welche aus dem Optimierungsmodell Abb. 15 und Tab. 2 abgeleitet wurden.

Ausgang für die Optimierung der molekularbiologischen Nachweismethoden war ein enterokokkales DNA-Fragment ausgehend von der 16S rDNA bis hin zur Position 985 der 23S rDNA. Dieses Fragment schließt die Intergenic Spacer Region ISR ein.

1. Selenga 207m, 14,5 km, 1:1 2. Selenga 207m, 14,5 km, 1:10 3. Selenga 207m, 14,5 km, 1:100 4. Positivkontrolle 5. Negativkontrolle 6. 100 bp-Ladder

1 2 3 4 5 6


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Abb.16: Schema des ausgewählten DNA-Fragments zum Nachweis von Enterokokken

Basierend auf dem Schema aus Abb. 16 lassen sich aus diesem molekularbiologischen Gesamtsystem für Enterokokken verschiedene semispezifische und spezifische Detektionssysteme formulieren.

Tabelle 2: Enterkokkenspezifsche Primerkombinationen Primer 1 Primer 2 Region Spezifität 16S14F 985R - semispezifisch Grundamplifikat 16S14F 23S0R 16S, ISR Semispezifisch

durch ISR

23S0F 985R 23S semispezifisch Auch seminested aus16S14F/985R

ECST784F 985R 23S spezifisch

Als semispezifisches Detektionssystem für Enterokokken wurde das Primerpaar 23S0F-985R verwwendet, welches ein DNA-Fragment mit einer Länge von 2663 bps erfasst.

Als spezifisches Detektionssystem für Enterokokken wurde das Primerpaar ECST 784F – 985R für die Detektion von Enterokokkus faecium bzw. Enterokokkus faecalis angewendet. Das DNA-Fragement beträgt 1866 bps.


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Die Sequenzen der angewendeten Primer sind im Folgenden dargestellt

Tabelle 3: Primersequenzen

Primer Zielsequenz Sequenz (5´ - 3´ ) 16S14F 16S rDNA ctt gta cac acc gcc cgt c 23S0R 23S rDNA tgc cag ggc atc cac cgt g 23S0F 23S rDNA cac ggt gga tct ggc a ECST 784 23S rDNA aga aat tcc aaa cga act tg 985R 23S rDNA ccg gtc ctc tcg tac t

Parameter für die PCR:

2-10 µL Probe wurden steril mit dem Mastermix gemischt. Für die Positivkontrolle wurden 2-10 µL Zellsuspension von E. faecium B7641 eingesetzt. Die PCR-Parameter für beide PCR-Systeme stellten sich wie folgt zusammen: 15 min Denaturierung und Enzymaktivierung bei 95°C, 40 Zyklen mit Hitzedenaturierung bei 94°C für 1,5 min, Primeranlagerung bei 60°C für 1 min, danach Extension bei 72°C für 1,5 min und abschließend eine Synthesekomplettierung bei 72°C für 10 min.

3.3.4 Real-time PCR (TaqMan) Bei der TaqMan™-PCR handelt es sich um eine Modifikation der PCR, die eine Quantifizierung der eingesetzten Zielsequenzen ermöglicht. Mit einer entsprechenden Kalibrierung lassen sich diese Werte auf Zellzahlen umrechnen. Diese sogenannte TaqMan™-PCR Assay basiert auf dem ursprünglichen 5´-Nuclease Assay und macht sich zunächst die 5´-3´- Exonuklease-Aktivität der Taq DNA Polymerase zu nutze. Hierfür wird eine fluorogene Sonde eingesetzt, die aus einem Oligonukleotid besteht, dessen 5´-Ende mit einem fluoreszenten Reporter-Farbstoff (FAM) markiert ist, während das 3´- Ende einen Quencher-Farbstoff (TAMRA) trägt und mit einem Phosphatrest blockiert ist.

Wird die intakte Sonde bei einer spezifischen Wellenlänge von 488 nm zur Fluoreszenz angeregt, so wird die Fluoreszenz aufgrund der räumlichen Nähe zum Quencher durch den Fluoreszenz-Energietransfer (FET) unterdrückt. Während der PCR hybridisiert die Sonde mit den Primern zunächst an einem Matrizenstrang. In der Extensionsphase trifft die Taq-Polymerase auf diese Sonde und beginnt sie zu verdrängen. Es entsteht eine y-förmige Sekundärstruktur, wodurch die 5´-3´-Exonuklease Aktivität der Taq-DNA-Polymerase aktiviert und die Sonde geschnitten wird. Freie, nicht-hybridisierte Sonden werden nicht hydrolysiert. Kommt es zur Sondenhydrolyse, so wird die räumliche Nähe – und damit auch die FET – zwischen Reporter und Quencher unterbrochen. Entsprechend der Akkumulation von PCR-Produkt steigt die Fluoreszenz des Reporters also bei jedem PCR-Zyklus. Das dabei gebildete Signal ist aufgrund der Sondenhybridisierung mit der Zielsequenz


38

sequenzspezifisch. Die Veränderung der Fluoreszenzintensitäten von Reporterfarbstoff und Quencher wird mit einem ABI Prism 7000 Detector (Applied Biosystems) im geschlossenen Reaktionsgefäß Zyklus für Zyklus erfasst.

Für die Durchführung wurde ein für den Ansatz von quantitativen PCR-Assays optimierter Universal Master Mix (uMM, Applied Biosystems) verwendet, der dNTPs, AmpliTaq Gold® DNA Polymerase, AmpErase® UNG (Uracil-N-Gykosidase), MgCl2 und Pufferkomponenten, sowie den fluorogenen Farbstoff ROX als passive Referenz enthält, mit dem Pipettierfehler von der Auswertungs-Software automatisch korrigiert werden.

Tabelle 4: Reaktionsansatz für Real Time PCR Für die quantitative PCR wurde ein Reaktionsvolumen von 50 µl verwendet.

pro Ansatz 2 x uMM Buffer 25 µl Vorwärts-Primer 5µM 3 µl Rückwärts-Primer 5µM 3 µl Sonde 5µM 2 µl Template 10 µl Wasser 7 µl

Die bei der TaqMan-PCR eingesetzte Polymerase AmpliTaq Gold® (Applied Biosystems) ist eine rekombinante Form der AmpliTaq DNA-Polymerase und wird erst durch einen 9 bis 12 minütigen Inkubationsschritt bei 95°C irreversibel aktiviert. Zur Optimierung der Sondenhybridisierung wird bei TaqMan-Assays unter Standardbedingungen eine 2-Schritt-PCR durchgeführt. Dadurch wird die Aktivität des AmpliTaq Gold Kit bei Temperaturen ≥55°C signifikant erhöht und durch eine Auswahl von Primern mit einer Tm um 60°C wird dieses 2-Schritt-PCR-Protokoll vereinheitlicht. Zum Schutz vor Übertragungs-Kontaminationen benötigt die AmpErase® UNG einen 2-minütigen Inkubationsschritt bei 50°C.

Die Amplifikationsparameter der TaqMan-PCR stellen sich wie folgt zusammen: Inkubationsschritt der AmpErase® bei 50°C für 2 min, 10 min bei 95°C für die Aktivierung der AmpliTaq DNA Polymerase, 40 Zyklen mit Hitzedenaturierung bei 95°C für 15 s, anschließende Primeranlagerung bei 60°C für 60 s.


39

Abb. 17: Amplifikationsreaktion einer Real-Time-PCR

Die logarithmische Auftragung der Fluoreszenzintensitätszunahme als Maß des gebildeten PCR-Produkts (Amplification Plot) ist in Abb. 17 dargestellt. Als Maß für die Menge der im Reaktionsansatz vorgelegten Ziel-DNA dient der Ct-Wert. Er gibt den Zyklus an, bei dem das Fluoreszenzsignal einen definierten Schwellenwert (Threshold) überschreitet. Zur Quantifizierung können Kalibrierkurven erstellt und den erhaltenen Ct-Werten Zellzahlen der KBE-Zählungen zugeordnet werden. Für Enterokokken liegt bei dem verwendeten System (Primer: ECST784F, ENC854R, GPL-Sonde (Sequenzen nicht beschrieben) die Detektionsgrenze bei ca. 8 Zellen / 5 µl.

3.3.5 Populationsanalyse nativer Biofilme mittels PCR und anschließender Denaturierender Gradienten Gel Elektrophorese (PCR-DGGE)

Diese Methode wurde nicht im Teilprojekt des FZKa eingesetzt, sondern an die russischen Partner weitervermittelt, um molekularbiologisch-ökologische Analysen des Baikalsees zu erlauben.

Die PCR-DGGE ist eine hochauflösende Methode zur Erfassung und Darstellung der mikrobiellen Diversität komplexer Ökosysteme. 16S rDNA-Fragmente, mittels PCR vervielfältigt, werden in einer Acrylamid-Gelmatrix, die einen denaturierenden Harnstoffgradienten aufweist, aufgetrennt. Durch die Wahl der Primer und der Reaktionsbedingungen des PCR-Systems ist es möglich, gezielt 16S rDNA-Fragmente von Gruppen und Familien der Mikroorganismen selektiv zu vervielfältigen. Das Trennprinzip der DGGE basiert auf dem unterschiedliche Schmelzverhalten von DNA-Fragmenten gleicher Länge, aber unterschiedlicher Sequenz entlang eines denaturierenden Harnstoffgradienten. Um die genotypische Diversität in diesen Proben darzustellen, werden Amplifikate gleich langer Fragmente


40

der 16S-rDNA, aber unterschiedlicher, artspezifischer Basenzusammensetzung in der Denaturierenden Gradienten Gelelektrophorese analysiert. Nach Abschluss der Elektrophorese wird die DNA mit SYBR-Green oder SYBR-Gold angefärbt und mittels UV-Licht bei 520 nm detektiert. Es wird ein Bandenmuster sichtbar, wobei jede Bande ein DNA-Fragment gleicher Sequenz und somit gleichem Schmelzverhalten enthält. Im idealen Fall ist jede Bande einer Bakterienart zuzuordnen. Um eine präzise Trennung von PCR-Produkten gleicher Länge, aber unterschiedlicher Sequenz zu erreichen, muß einer der PCR-Primer am 5´-Ende durch eine GC-Klammer (Guanin- Cytosin-Klammer) modifiziert werden. Durch die jeweils drei Wasserstoffbrücken zwischen Guanin und Cytosin hat das resultierende PCR-Produkt an seinem 5´-Ende eine Region, die im Bereich der verwendeten Harnstoffkonzentration aufgeschmolzen werden kann. Das Resultat der parallelen DGGE-Trennung bei der Separierung von PCR-Produkten, die von unterschiedlichen Arten stammen, ist ein Bandenmuster, wobei die Anzahl und Positionen der Banden im DGGE-Gel für jede Probe spezifisch sind. Das DGGEBandenverteilungsmuster ist somit eine Möglichkeit, bakterielle Populationszusammensetzungen in nativen Biofilmen darzustellen.

Durchführung:

Für die Acrylamidgele wurden folgende Substanzen verwendet: Acrylamide/ bis- Acrylamide

40% Solution (Sigma, A 7168), Formamide (AppliChem,A 0871,0500), Harnstoff (Sigma, U- 5378), TEMED ultra pure grade (amresco, 0761), Tris-Base (Sigma7-9, Sigma, T 1378), Acetic acid glacial (A 6283), EDTA ( Riedel-de-Haën, 27285), Ammoniumpersulfat ACS grade,APS ( amresco 0486).

Für den Probenauftrag wurde als Marker Bromphenolblau (Sigma, B-8026) und zum anfärben der Banden SYBR Green (Sigma, S 9430) verwendet.

Durchführung der PCR:

Die Biofilmproben wurden direkt in die PCR eingesetzt. Mit Hilfe der PCR wird eindefinierter Abschnitt eubakterieller 16S rDNA vervielfältigt. Die Zugabe der Primerkombination GC27F / 517R ergab ein 527 Basenpaare (bp) großes DNA - Fragment.

Pro Reaktionsansatz von einem Volumen von 100 μL wurden 2.5 U HotStar Taq-DNA polymerase (Qiagen, Germany), 30 pmol Primer, 1 x PCR buffer (Qiagen,

Germany) und 200 μM dNTP und 5-10 μL der nativen Biofilmsuspensionen verwendet.


41

Tabelle 5: Primer zur Vervielfältigung eubakterieller 16S rDNA Oligonucleotid Organismus Sequenz (5´-3´) GC 27 F Eubacteria (GC-Clamp) -

AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG

517 R Eubacteria ATTACCGCGGCTGCTGG GC-Clamp: 5´-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCG CCC CCG CCC C-3´ Die Amplifikationsparameter für diesen PCR-Schritt stellen sich wie folgt zusammen:

15 min Denaturierung bei 95°C; danach folgt ein touch down-Temperaturprofil mit Hitzedenaturierung von 94°C für 15 s, Primeranlagerung bei 65°C und einer Synthesekomplettierung bei 72°C für 60 s. Das touch down-Temperaturprofil besteht aus 10 Zyklen, wobei nach jedem Amplifikationsschritt die Temperatur um 1°C bis gesenkt wird (65°C – 55°C). Danach folgen 25 Zyklen mit Hitzedenaturierung bei 94°C für 15 s, anschließende Primeranlagerung bei 53°C für 30 s, danach Extension bei 72°C für 30 s und abschließend eine Synthesekomplettierung bei 72°C für 10 min.

Als Negativkontrolle wurde PCR-Wasser (Merck, Darmstadt) eingesetzt. Als Positivkontrollen wurden Zellsuspensionen der ausgewählten Leitorganismen verwendet.

5 μl der PCR- Produkte wurden danach in einem 1% Agarosegel auf ihre Größe (527bp) überprüft.

Durchführung der DGGE

Für die Auftrennung der PCR-Produkte aus der vorangegangenen PCR mit den Primern GC27F/517R wurde ein Polyacrylamid-Gel mit einem denaturierenden Harnstoffgradienten von 40 bis 70% verwendet (Abb. 16).

Je nach Intensität wurden 5-15 μl PCR-Produkt mit 2-3μl Bromphenolblau gemischt und in die Taschen des Acrylamidgels eingebracht. Die Laufzeit betrug 16 Stunden bei 50V und 56°C. Danach wurde das Gel mit SYBRGreen für 20 min unter Lichtausschluss gefärbt und die Bandenmuster anschließend im UV – Licht bei 520 nm detektiert und dokumentiert.

Für alle Populationsanalysen wurden die Geräte DCode™ System – Universal Mutant Detection System und Power PAC 300 der Firma BioRad (München, Germany) verwendet.


42

Abb. 17: Prinzip der DGGE

3.4 Ergebnisse der Probenahmen an Baikal- und Bodensee

3.4.1 Expedition Baikalsee 2005 Bei dieser ersten und ausführlichsten Probenahme am Baikalsee im Rahmen des Projekts wurden an den in Abb. 1 aufgeführten Messstellen insgesamt 110 Proben entnommen und entsprechend Kap. 2.3 und 3.2 vorbehandelt und untersucht.

Durch den mangelhaften Transport der Proben und die Unterbrechung der Kühlkette war nur eine geringe Menge der DNA trotz ursprünglich grosser Probenvolumina (bis zu 15 L) zu erhalten (siehe auch Kap. 2.3.2). Die Konsequenz war, dass nach zahlreichen zeitaufwendigen Optimierungsschritten keine umfassende Populationsanalyse, sondern ausschliesslich Untersuchungen auf die im Fokus des Projekts stehenden Enterokokken durchgeführt werden konnten. Hierbei konnten nur qualitative, keine quantitativen PCR-Ergebnisse generiert werden. Trotzdem ergab


43

sich im Vergleich zu den von den russischen Partnern erhobenen mikrobiologischen Werten aus den gleichen Proben ein bemerkenswertes Bild.

Abb. 19: Mikrobiologische Enterokokkenbefunde der Expedition August 2005

An den in Abb. 19 grün markierten Probenahmestellen wurden mikrobiologisch auf Selektivmedium kultivierbare Enterokokken gefunden (Daten in Anhang) . Diese positiven Befunde (insgesamt 19) waren grösstenteils in der Nähe der Kontaminationsquellen (Zuflüsse, Abwassereinleitungen) und oberflächennah zu finden. Mikrobiologische Daten zu weiteren Fäkalindikatoren (E. coli, Clostridien etc.) bestätigen diese Befunde (Daten in Anhang).


44

Abb. 20: Molekularbiologische Enterokokkenbefunde der Expedition August 2005

Abb. 20 ist zu entnehmen, dass an mehr Probenahmestellen enterokokkale DNA als kultivierbare Enterokokken zu detektieren war (Einzeldaten in Anhang). Die positiven DNA-Befunde (insgesamt 32) befanden sich jedoch vorwiegend nicht direkt in der Nähe der Kontaminationszonen oder im oberflächennahen Wasser, sondern in weiterer Entfernung und Tiefe als die mikrobiologisch positiven Befunde (Abb. 20 a,b)

So ist in Abb. 21a zu erkennen, dass mikrobiologisch positive Befunde nur in der Nähe der Selenga-Mündung im oberflächennahen Wasser zu detektieren waren, während enterokokkale DNA erst in grösserer Entfernung zu finden war. Die Befunde


45

in Abb. 21b zeigen, dass in der Tiefe des Sees über Grund ausschliesslich enterokokkale DNA, nicht jedoch kultivierbare Enterokokken auftraten.

Abb. 21a: Positive Befunde in der Selenga- Abb. 21b: Positive Befunde in der Selenga-

mündung (Oberfläche) mündung (Tiefe)

Noch bemerkenswerter sind die Untersuchungen an Tiefenprofilen in der Mitte des Sees (siehe auch Abb. 19 und 20), die eigentlich als Nullkontrollen für Enterokokken galten.

Abb. 22a: Tiefenprofil der Kontrollstation Abb. 22b: Tiefenprofil der Kontrollstation Middle South Baikal Baikal

In Abb. 22a traten an der Oberfläche der in der Mitte des südlichen Baikalsees gelegenen Probenahmestelle noch kultivierbare Enterokokken auf, während in tieferen Tiefen bis 750 m noch enterokokkale DNA zu finden war. Im Tiefenprofil in der Seemitte des mittleren Baikalsees (Abb. 22b) waren kultivierbare Enterokokken immerhin noch in 200 m Tiefe nachzuweisen, enterokokkale DNA jedoch bis zu 1500 m Tiefe (!). Naturgemäss erhebt sich hier die Frage, inwieweit es sich um zellfreie DNA oder intakte Zellen handeln kann.

Selenga Mouth Surface

0

1

1 3 5 7 10 14,5

Entfernung (km)

pos.

/neg

.

Enterokokken mik. Enterokokken mol.

Selenga Mouth Surface

0

1

1 3 5 7 10 14,5

Entfernung (km)

pos.

/neg

.


Selenga Mouth Ground

0

1

1 3 5 7 10 14,5

Entfernung (km)

pos.

/neg

.


Selenga Mouth Ground

0

1

1 3 5 7 10 14,5

Entfernung (km)

pos.

/neg

.


Control Station South Baikal

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 5 10 15 25 50 100 150 250 500 750 1000 1200 1400

Tiefe (m)

pos.

/neg

.


Control Station South Baikal

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0 5 10 15 25 50 100 150 250 500 750 1000 1200 1400

Tiefe (m)

pos.

/neg

.


Control Station Middle Baikal

0

1

0 5 10 25 50 100 200 400 600 800 1000 1200 1300 1400 1500 1649

Tiefe (m)

pos.

/neg

.

Enterokokken mik. Entrokokken mol.

Control Station Middle Baikal

0

1

0 5 10 25 50 100 200 400 600 800 1000 1200 1300 1400 1500 1649

Tiefe (m)

pos.

/neg

.

Enterokokken mik. Entrokokken mol.


46

Nukleinsäuren im Allgemeinen sind in der aquatischen Umwelt nur zeitlich begrenzt stabil. In morphologisch intakten Bakterien sind DNA-Moleküle deutlich stärker vor Abbau durch DNasen geschützt als freie DNA, die bei Lyse der Bakterien dann deutlich rascher abgebaut werden. Ein Befund von ribosomalen DNA-Fragmenten in der freien Wasserphase, die charakteristisch für spezifische Bakterienspezies sind, kann nicht unmittelbar als Beweis für physiologisch aktive Bakterien herangezogen werden, ist jedoch ein deutliches Indiz, dass intakte Bakterienzellen in dem jeweiligen Habitat präsent waren, bevor ubiquitär vorhandene DNasen diese DNA-Moleküle abbauen konnten und damit ein molekularbiologischer Nachweis nicht mehr möglich ist.

3.4.2 Expedition Baikalsee 2007 Die vom Limnologischen Institut in Irkutsk durchgeführten mikrobiologischen Untersuchungen des Baikalwassers im Spätsommer 2007 ergaben, dass an signifikant mehr Probenahmestellen (insgesamt 23) kultivierbare Enterokokken gefunden werden konnten (Abb. 22 und 23) als während der Expedition im August 2005 (vgl. Abb. 19).

Abb. 23: Ergebnisse der mikrobiologischen Detektion von Enterokokken im Oberflächenwasser des Baikalsees (29.05.07- 12.06.07)

- sampling points during expedition;- microbiologicalenterococci results ofthe expedition

r.Sukhayar.Buguldejka

r.Sarma r.Turka

r.Tampudar.Rel

r.Frolikha

r.Kichera

- sampling points during expedition;- microbiologicalenterococci results ofthe expedition

r.Sukhayar.Buguldejka

r.Sarma r.Turka

r.Tampudar.Rel

r.Frolikha

r.Kichera


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Abb. 24: Enterokokkenverteilung am südlichen Baikalsee (25.06.07-30.06.07) Molekularbiologische Sedimentuntersuchungen

Insgesamt wurden 20 Sedimentproben genommen (vgl. Probenahmeplan im Anhang).

Um enterokokkale DNA detektieren zu können wurden alle im Methodenteil 3.3.3. dargestellten Primersysteme eingesetzt.

Enterokokkale DNA konnte im Selenga Delta in 1km Entfernung detektiert werden (mit unspezifischen Nebenprodukten, siehe Abb 14: Agarosegel der PCR-Produkte der Sedimentproben 2007), in den restlichen 19 Sedimenten wurde keine enterokokkale DNA nachgewiesen. Mikrobiologisch wurden lediglich im Sediment westlich Baikalsk geringe Zahlen an Enterokokken nachgewiesen. Beide Befunde zeigen, dass Enterokokken in den untersuchten Sedimentproben nur sehr geringe Persistenz aufwiesen.

0

5

10

15

0 m 50 m 100 m 200 m >300 m

CFU/100 ml

0

5

10

15

0 m 50 m 100 m 200 m >300 m0 m 50 m 100 m 200 m >300 m

CFU/100 ml


48

3.4.3 Untersuchungen am Bodensee

Der Probenahmeplan für den Bodensee sah Proben an den Zuflüssen von Schussen, Argen, Seefelder Aach und Stockacher Aach, sowie Tiefenprofilproben aus dem Überlinger See von 0 – 140 m (Entnahmestelle des ZV BWV) und aus dem Obersee von 0 – 60 m Tiefe (siehe auch Abb. 2), vor.

Bis zur Erstellung des vorliegenden Berichts wurden den Partnern vom FZKa und Uni Stuttgart vom ZV BWV entgegen dem im bewilligten Antrag festgelegten Arbeitsplan keinerlei aufbereitete Daten der mikrobiologischen Untersuchungen zugestellt. Lediglich für den Zeitraum von März 2005 bis Juni 2006 konnten von uns Rohdaten aus Laborprotokollen kopiert werden.

Nach diesen Daten konnten Enterokokken durchweg in den o.g. Zuflüssen nachgewiesen werden. Bei den Tiefenprofilen gab es im Obersee bei 0 und 60 m lediglich je 1 positives Ergebnis von 1 KBE/100 mL, im Überlinger See konnten Enterokokken bis in eine Tiefe von 140 m zwischen 1 – 12 KBE/100 mL detektiert werden.

Die molekularbiologischen Untersuchungen am FZKa bestätigten die positiven Befunde in den Zuflüssen (vgl. Daten im Anhang 9.1.3). Im Tiefenprofil des Obersees wurde enterokokkale DNA an weit mehr Probenahmestellen als kultivierbare Enterokokken gefunden. Mikrobiologisch wurden Enterokokken einmal in 60m Tiefe (Februar 2005) und einmal an der Oberfläche (Dezember 2005) nachgewiesen. Molekularbiologisch konnte enterokokkale DNA im gesamten Probenahme von Januar 2005 bis Juni 2006 bis auf den Probemonat Juni 2005 (negative Oberflächenprobe) detektiert werden. In der Tiefe von 60 m konnte bis auf den Probemonat Dezember 2005 über den gesamten Probenahmezeitraum Enterokokken-DNA nachgewiesen werden. Im Überlinger See konnten 2005 allerdings 16% der mikrobiologisch positiven Befunde molekularbiologisch nicht bestätigt werden. Da es sich bei den mikrobiologischen Befunden jedoch um Rohdaten handelt (ZV BWV lieferte keine verbindlichen Ergebnisse, siehe 5), können diese Ergebnisse nicht näher interpretiert werden.

In den Zuflüssen konnten die mikrobiologischen Ergebnisse molekularbiologisch reproduziert werden. Eine Ausnahme macht der Zufluss Schussen. Dieser ist sehr belastet und trägt einen hohen Anteil an Huminsäuren im Wasserkörper. Diese Huminsäuren können molekularbiologische Analyseverfahren hemmen und sind nur zum Teil eliminierbar (siehe auch Ergebnisse aus Baikalproben). Diese Diskrepanz könnte möglicherweise auch auf die Erfassungsgrenze der Real-Time PCR-Methode zurückzuführen sein.

Insgesamt wurden also am Bodensee ähnliche Ergebnisse generiert wie am Baikalsee, nämlich kultivierbare Enterokokken in den Zuflüssen und meist an der Oberfläche, enterokokkale DNA auch bis in grössere Tiefen.


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Während die kultivierbaren Enterokokken hauptsächlich wieder an der Oberfläche zu finden waren, wurden sie auch vereinzelt bis unter 300 m Tiefe detektiert (Abb. 24).

Die Erklärung für diese Befunde liegt wahrscheinlich in den höheren Temperaturen der Wasserschichten des Baikalsees im Sommer 2007 (an der Wasseroberfläche durchschnittlich 2 – 3°C wärmer, in der Selenga-Mündung sogar bis zu 8°C wärmer), die möglicherweise eine metabolisch aktive Form der Enterokokken zuliess. Von den Enterokokken-Isolaten wurden einige Enzymaktivitäten und Antibiotika-Resistenzen bestimmt. Es wurden multiple Resistenzen ermittelt, u.a. auch gegen Vancomycin (1%) und Ciprofloxacin (10%). Ein wesentlich höherer Prozentsatz (Vancomycin 12%, Ciprofloxacin 36%) wurde als zwischen empfänglich und resistent eingestuft, ist also auch nicht mehr völlig sensitiv gegenüber den genannten Antibiotika.

Detektion enterokokkaler DNA: Expedition 2007

Im Südbaikal (Bereich um Kultuk und zwischen Kultuk und Baikalsk) konnte mit den molekularbiologischen Systemen (vgl. Methoden 3.3.3.) keine enterokokkale DNA detektiert werden.

Im Bereich direkt vor Baikalsk konnte an jeder Probenahmestelle von 1 km bis 6 km Entfernung enterokokkale DNA in Bodennähe detektiert werden, jedoch nicht an der Oberfläche (Daten im Anhang). Im östlichen Bereich vor Baikalsk konnte in 6 km Entfernung in Bodennähe ebenfalls Enterokokken-DNA nachgewiesen werden.

Im Selenga-Delta wurde ebenfalls ein horizontales und vertikales Profil beprobt. Explizit wurde Enterokokken-DNA in einer Entfernung von 14,5 km in einer Tiefe von 270 m und bei einer Entfernung von 10 km in Bodennähe detektiert. Bei Ukhan Tonky wurde ein Tiefenprofil bis 1649 m beprobt. Hier konnte enterokokkale DNA an der Oberfläche, in 200 m-600 m Tiefe sowie in Bodennähe bei 1649 m detektiert werden.

Somit konnten tendenziell die Ergebnisse von 2005 bestätigt werden, dass enterokokkale DNA vorwiegend in grösseren Enterfernungen oder Tiefen von den potentiellen Einleitungsstellen gefunden wurde. Allerdings ist der DNA-Nachweis in Baikalsee-Proben weiterhin problematisch, da eine Störung durch PCR-Hemmstoffe wie Huminstoffe o.ä. nicht ausgeschlossen werden kann.


50

3.4.4 Untersuchungen an Biofilmen

Im März 2005 wurden Aufwuchsflächen (Coupons) aus V4A-Stahl in die Probenahmestelle „Polygon“ des Limnologischen Instituts am Baikalsee eingebracht. Die Coupons wurden im August 2005 geerntet vgl. Abb. 25a).

Elektronenmikroskopische Aufnahmen des Limnologischen Instituts zeigten, dass die Stahl-Coupons in den 6 Monaten der Exposition nur spärlich bewachsen waren (Abb. 25 a), jedoch sowohl eine bakterielle Population (Abb. 25 b – d) als auch eine Diatomeen-Population (Abb. 25 e, f) aufwies.

Abb. 25: Biofilm auf Stahlcoupon Molekularbiologische Untersuchung der Biofilme 2005

Insgesamt wurden 4 Biofilmproben untersucht:

Tabelle 6 : Biofilmproben Probename Tiefe [m] N1 0,5 0,5 ml Biofilmsuspension N2 2,9 0,5 ml Biofilmsuspension N3 7 0,5 ml Biofilmsuspension N4 16 0,5 ml Biofilmsuspension N4 16 Freie Wasserphase

a) Coupon nach der Entnahme b) Bakterien auf Oberfläche c) stäbchenförmige Bakterien

d) Kokken e) Diatomeenschalen f) Diatomeen


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Mittels Realtime-PCR (vgl. Methodenteil 3.3.5) konnten in den Biofilmen keine enterokokkale DNA nachgewiesen werden. Es wurden alle im Methodenteil 3.3.3. aufgeführten Primersysteme auf diese Proben angewendet. Um Optimierungen für weitere molekularbiologische Nachweismethoden (DGGE) durchzuführen, war die DNA-Menge zu gering (siehe 2.3.3.1: Probenahme und –transport).

Um natürliche Bedingungen zu simulieren wurden zur selben Zeit und am selben Ort vom Limnologischen Institut verschiedene Aufwuchsträger aus Gesteinen (Marmor, Granit, Amphibolit) ausgebracht und im September 2005 geerntet. In Bewuchsdichte (Abb. 26) und enzymatischer Aktivität (Ergebnisse nicht aufgeführt) waren keine signifikanten Unterschiede zu erkennen.

Im Vergleich zu einem natürlichen Stein am ufernahen Seegrund war jedoch ein dichter Biofilmaufwuchs zu erkennen (Abb. 27). Biofilmbildung ist also, sogar in verhältnismässig kurzer Zeit, auch in einem oligotrophen und kalten Gewässer wie dem Baikalsee zu beobachten.

Abb. 26: Mikrobielle Biofilme von verschiedenen eingebrachten Stein-Aufwuchskörpern.

Granite

Marble

Amphibolite

Morphological diversity of cultivated microbial community on different substrates revealed by method of epifluorescent microscopy

Granite

Marble

Amphibolite

Morphological diversity of cultivated microbial community on different substrates revealed by method of epifluorescent microscopy


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Abb. 27: Vergleich des Bewuchses auf einem natürlichen Stein und eingebrachten Stein-Aufwuchskörpern

3.4.5 Diskussion der Ergebnisse Ausgangspunkt des Projekts war, die Faktoren für die offensichtliche Eliminination von Enterokokken im Baikalsee zu eruieren oder zumindest einzukreisen. Hypothetisch wurde enzymatischer Verdau/Lyse, natürliche Hemmstoffe wie Cyanotoxine und ggf. Parasitenbefall z.B. durch Phagen angenommen. Diese Annahmen sollten durch Probenahmen am Baikal, vor allem während der Expedition im August 2005 überprüft werden.

Parallel dazu sollten entsprechende molekularbiologische Untersuchungen am Bodensee durchgeführt und mit den vom ZV BWV erhobenen mikrobiologischen Daten verglichen werden.

Antagonistische Effekte durch Cyanobakterien/Cyanotoxine wurden hauptsächlich vom Partner der Uni Stuttgart sowie vom eigenen biochemischen Labor untersucht.

Eine erste signifikante Schwierigkeit ergab sich durch den notwendigen Transport der angereicherten Wasserproben von Irkutsk zum FZKa, die ausschliesslich zu Lasten

The stone from the bottom of Baikal Marble

Amphibolite Granite

The staining by DAPI of microorganisms from different stone substrates

The stone from the bottom of Baikal Marble

Amphibolite Granite

The staining by DAPI of microorganisms from different stone substrates


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der Transportfirmen geht. Trotz aufwendiger Vorbereitungen, Anweisungen, gekühlter Verpackung und entsprechenden Absprachen war es den beteiligten Logistikunternehmen offenbar nicht möglich, einen möglichst schnellen Transport und eine ununterbrochene Kühlkette zu gewährleisten. So dauerte der (Luft-) Transport der Proben von August 2005 ca. 3 Wochen, der der Expedition 2007 ca. 2,5 Wochen. Die Folge war, dass nur eine verhältnismässig geringe Menge Gesamt-DNA zur weiteren Verarbeitung aus den Proben gewonnen werden konnte. Eine vollständige Populationsanalyse bzw. die Detektion weiterer hygienisch relevanter Bakterien ausser den Enterokokken war damit nicht möglich. Auch der Nachweis von Enterokokken musste aufgrund der geringen Menge Ausgangsmaterial und möglicher geschädigter DNA-Anteile mehrfach und aufwendig optimiert werden. Primer-Probe-Systeme für den quantitativen Nachweis konnten nicht erfolgreich eingesetzt werden. Die besten Resultate wurden erzielt, indem man eine zweite PCR aus einer vorgeschalteten - mit der zweiten PCR identischen - PCR mit den unter im Methodenteil 3.3.3. angegebenen Primern durchführte. Somit ergaben sich letztendlich belastbare qualitative Daten (siehe Anhang, 9.1.1.1 und 9.1.2.1 enterokokkale DNA Baikal-See).

Trotz dieser Probleme war nach Auswertung der Ergebnisse offensichtlich, dass an mehr Stellen im Baikal enterokokkale DNA detektiert werden konnte als kultivierbare Enterokokken. Die den Immissionsstellen am nächsten liegenden Probenahmestellen zeigten häufig kultivierbare Enterokokken als Fäkalindikatoren an, was zumindest t.w. durch den Nachweis weiterer hygienisch relevanter Bakterien wie E. coli, Clostridium spec. und Pseudomonas aeruginosa bestätigt wurde. Die mikrobiologischen Befunde konnten teilweise mit dem Auftreten enterokokkaler DNA korreliert werden. Negative molekularbiologische Befunde dürften eine Folge der oben geschilderten Transportschwierigkeiten sein. Enterokokkale DNA ohne Korrelation zu kultivierbaren Enterokokken wurde dagegen in grösserer Entfernung und Tiefe zu den Immissionsstellen detektiert. Diese Befunde liessen zunächst an das Vorhandensein abgestorbener und lysierter Bakterienzellen denken. Dagegen sprach, dass intakte und mit dem verwendeten Primer-Probe-System einwandfrei zu detektierende enterokokkale DNA-Sequenzen auch in sehr grosser Tiefe (bis 1500 m) und weiter Entfernung (See-Mitte) von den Einleitungen gefunden wurde, d.h. also in lokalen und zeitlichen Distanzen. Nukleinsäuren im allgemeinen sind in der aquatischen Umwelt nur zeitlich begrenzt stabil. In morphologisch intakten Bakterien sind DNA-Moleküle deutlich stärker vor Abbau durch DNasen geschützt als freie DNA, die bei Lyse der Bakterien dann deutlich rascher abgebaut werden. Ein Befund von ribosomalen DNA-Fragmenten in der freien Wasserphase, die charakterisitisch für spezifische Bakterienspezies sind, kann nicht unmittelbar als Beweis für physiologisch aktive Bakterien herangezogen werden, ist jedoch ein deutliches Indiz, dass intakte Bakterienzellen in dem jeweiligen Habitat präsent waren, bevor ubiquitär vorhandene DNasen diese DNA-Moleküle abbauen konnten und damit ein molekularbiologischer Nachweis nicht mehr möglich ist.

Zu etwa demselben Zeitpunkt, als auch die o.g. Ergebnisse generiert wurden, publizierte die Gruppe von Maria del Mar Lleo [Lleo et al., 2005] eine Arbeit zur Überlebensfähigkeit von Enterokokken in der aquatischen Umwelt. So konnte von


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Lleo und Mitarbeitern nachgewiesen werden, dass Enterococcus faecalis zum VBNC-Stadium (Viable but not Culturable) fähig ist und damit unter natürlichen Bedingungen persistieren kann [Leo et al., 2001]. Die Annahme, dass durch Zuflüsse und andere Immissionen in den Baikal eingetragene Enterokokken nicht eliminiert werden, sondern in einen metabolischen Ruhe oder „Schlaf“-Zustand fallen, wurde als neue Arbeitshypothese aufgegriffen. Gestützt wurde diese Annahme dadurch, dass keine erhöhte Enzymaktivitäten der autochthonen Mikroflora aufgrund der Lyse eingetragener Kontaminanten gefunden wurden (Versuche der russischen Partner, Daten nicht aufgeführt) und auch weder toxinbildende Cyanobakterien (siehe Kap. 4, Teilprojekt der Universität Stuttgart) noch Cyanotoxine chemisch nachgewiesen werden konnten (siehe Anhang, Kap. 9).

Entsprechende Untersuchungen im Bodensee erbrachten ebenfalls Nachweise enterokokkaler DNA in grösseren Tiefen ohne mikrobiologischen Befund. Diese Ergebnisse können jedoch nicht in vollem Umfang zur Bestätigung der Arbeitshypothese herangezogen werden, da keine validen mikrobiologischen Werte vom Partner ZV BWV geliefert wurden.

Da die molekularbiologischen Ergebnisse der Expedition 2005 unter dem mangelhaften Transport litten, wurden durch kostenneutrale Mittelverschiebungen eine partielle Teilnahme an einer weiteren Expedition auf dem Baikal ermöglicht. Hierbei wurden 55 Wasserproben und 20 Sedimentproben an signifikanten Probenahmestellen gezogen. Die Ergebnisse bestätigten weitgehend die bis dahin getroffenen Annahmen, dass enterokokkale DNA vornehmlich in größeren Tiefen detektiert werden konnte. Gestützt wird die neue Arbeitshypothese dadurch, dass im vergleichsweise heissen Jahr 2006 (Auskunft Limnologisches Institut Irkutsk) mit kürzerer Eisperiode und höheren Wassertemperaturen im Spätsommer an deutlich mehr Probenahmestellen und grösseren Tiefen kultivierbare Enterokokken gefunden wurden (Abb. 23). Dies deutet erneut daraufhin, dass in den Baikal eingetragene Enterokokken nicht durch natürliche Faktoren eliminiert werden, sondern je nach Umweltbedingungen metabolisch aktiv oder im Ruhezustand, jedoch lebensfähig verdriftet werden. Diese Erkenntnis ist umso schwerwiegender, da Enterokokken nicht nur als Fäkalindikatoren sondern auch als opportunistische Pathogene und Resistenzträger gelten.


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3.4.6 Änderung des Arbeitsplanes Die im Herbst 2005 aufgestellte Arbeitshypothese der Ruhestadien (VBNC, siehe auch Kap. 3.5) von Enterokokken im Baikalsee wurde durch zahlreiche Untersuchungsreihen überprüft. Die Versuche erstreckten sich dabei auf die Fähigkeit von Enterokokken unter Stress (Nährstoffmangel, Kälte, Licht) in ein Ruhestadium zu fallen, aus diesem Ruhestadium bei Wegnahme der Stressfaktoren wieder in die Kultivierbarkeit überführt zu werden sowie auf die Etablierung geeigneter Parameter und Methoden, kultivierbares, VBNC- , rekultivierbares und totes Zellstadium erkennen und unterscheiden zu können.

Die Arbeitsgruppen in Karlsruhe und Irkutsk arbeiteten in Abstimmung gemeinsam an diesem Programm, dessen Grundlagen und Ergebnisse in Kap. 3.5 beschrieben sind.


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3.5 Versuche mit Enterokokken zum Viable but not culturable (VBNC) - Stadium

3.5.1 Einleitung 1982 wurde von Colwell und Mitarbeitern ein Ruhestadium von Vibrio cholerae und E. coli festgestellt, das diese Bakterien nicht mehr dazu befähigt, auf den üblicherweise zum Nachweis verwendeten Nährböden zu wachsen [Xu et al., 1982]. Trotz des Verlusts der Kultivierbarkeit waren die Zellen jedoch nicht abgestorben, sondern lebensfähig. Dies konnte mit einer mikroskopischen Methode zur Zählung vitaler Zellen [Kogure et al., 1979] bewiesen werden. Während dieses Ruhestadiums („viable but not culturable“ – VBNC) ist der Metabolismus verlangsamt, die Zellwand verändert sich in der Fettsäure- und Proteinzusammensetzung und die Nukleinsäuren kondensieren zu einem gewissen Mass [Byrd, 2000; Oliver, 2005]. Die Folge dieses Ruhe- oder Winterschlafstadiums („dormancy“) ist eine erhöhte Toleranz oder Persistenz gegenüber für die Bakterien feindlichen Umweltbedingungen. Ausgelöst wird der VBNC-Zustand durch Stress wie Nährstoffmangel, gravierende Temperatur- oder osmotische Veränderungen sowie sublethale Biozidgaben. Hygienisch relevant werden die VBNC-Stadien, da sie sich bei erneuter Veränderung zu für die Bakterien günstigen Umweltbedingungen wieder in voll metabolisch aktive, kultivierbare Zellen zurückverwandeln. Hygienisch relevante oder pathogene Bakterien können damit lebensungünstige Barrieren passieren und unter geeigneten Umweltbedingungen wieder zur vollen Lebensfähigkeit und Infektiosität gelangen. So konnten Colwell und Mitarbeiter die Verdriftung von VBNC-Vibrio cholerae an Zooplankton im Meer nachweisen [Tamplin et al., 1990; Colwell, 1996]. Auch Pathogenitätsfaktoren wie die Adhäsion an Wirtszellen bleiben offenbar im VBNC-Stadium erhalten [Oliver and Bockian, 1995; Pruzzo et al., 2002].

Das Potential zur Erlangung des VBNC-Zustands unter Stress und das Wiedererlangen der vollen metabolischen Aktivität unter günstigen Lebensbedingungen ist genetisch determiniert und sowohl unter Labor- als auch unter Freilandbedingungen induzierbar [Colwell, 2000; Oliver, 2005]. Es gleicht dem Verhalten von Bakterien in der Plateauphase des Wachstums [Roszak and Colwell, 1987; Oliver, 2005]. Viele Gram-negative und Gram-positive Bakterien unterschiedlicher Spezies weisen dieses genetische Potential auf [Oliver, 2005]. Eine typische VBNC-Gensequenz scheint jedoch nicht zu bestehen. Das VBNC-Potential ist offenbar ein Aspekt der vielfältigen bakteriellen Stressantworten und wie andere Resistenzmechanismen ähnlichen Regulationen unterworfen [Heim et al., 2002; Aertsen and Michiels, 2004; Oliver, 2005]. Der VBNC-Zustand gehört zu den in der Fachwelt vieldiskutierten mikrobiellen Phänomenen und ist noch nicht gänzlich erforscht. Es ist jedoch anzunehmen, dass neben dem Auftreten in natürlichen Habitaten in vielen Bereichen wie der Medizin, der Lebensmittel- und Trinkwasseraufbereitung etc. bislang unerkannte VBNC-Stadien auftreten, die aufgrund des konventionellen kulturellen Nachweises nicht erfasst werden und möglicherweise der Grund für unerklärliche „Ausbrüche“ in aufbereiteten und desinfizierten Bereichen darstellen [Oliver, 2000; Huq et al., 2000; Colwell, 2000]. So wurden von McFeters und LeChevallier Versuche mit Chlordesinfektion unter


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Trinkwasserbedingungen und die dabei auftretenden VBNC-Zustände sowie Wiedererlangung der metabolischen Aktivität beschrieben [McFeters and LeChevallier, 2000].

In den letzten Jahren konnte von Lleo und Mitarbeitern nachgewiesen werden, dass Enterococcus faecalis zum VBNC-Stadium fähig ist und damit unter naürlichen Bedingungen persisitieren kann [Leo et al., 2001; Lleo et al., 2005]. Der Übergang in VBNC ist von Veränderungen in der Zellmembran gekennzeichnet, die sogar zum spezifischen Nachweis dieser Stadien verwendet werden können. Besonders signifikant ist die vermehrte Expression der Penicillin-binding Proteins (PBP), insbesondere des PBP5 [Lleo et al., 2000; Lleo et al., 2001]. E. faecalis wird im VBNC-Zustand ebenfalls über Zooplankton verdriftet, weist höhere Persistenz auf und kann zu voller metabolischer Aktivität wiedererweckt werden [Signoretto et al., 2005]. Diese Ergebnisse werfen völlig neue Gesichtspunkte der Interpretation von konventionellen Ergebnissen mit Fäkalstreptokokken auf.

In dem folgenden Arbeitspaket sollte die Arbeitshypothese, dass in Baikal- und Bodensee eingetragene Enterokokken zumindest teilweise in einen VBNC-Zustand fallen können, durch Laborexperimente erhärtet werden. Hierbei sollte untersucht werden, wie Referenzstämme von Enterococcus feacium und Enterococcus faecalis (Umweltisolate von Bodensee, Baikalsee, Enterococcus faecium B7641, vgl. Tabelle 6) aufr verschiedene Stressfaktoren (Temperatur, Nährstoffmangel, Licht) reagieren (Vgl. Tabelle 7: Stressfaktoren). Dies wurde mittels Rekultivierungpotential auf einem enterokokkenspezifischem Nährmedium (Kanamycin-Aesculin-Agar) in Abhängigkeit von der vorhandenen enterokokkenspezifischen DNA-Menge (RealTime-PCR (TaqMan)) überprüft. Als weiteres bioanalytisches Verfahren wurde Intact Cell MALDI-ToF zur Untersuchung und Abgrenzung verschiedener physiologischer Stadien (tot, nicht kultivierbar, kultivierbar) adaptiert und eingesetzt.

3.5.2 Material und Methoden

Geräte und Materialien:

entsprechen weitgehend Abschnitt 3.2, mit Ausnahme:

- ESEM (siehe entsprechende Beschreibung bei Methoden)

- MALDI-Time of Flight- Massenspektrometer (siehe entsprechende Beschreibung bei Methoden)


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Enterokokkenstämme für Stress- und Resuszitationsversuche:

Tabelle 7: Verwendete Enterokokken-Stämme

Name Herkunft

S21 Umweltisolat E. faecium, Bodensee

N8 (Umweltisolat E. faecium, Baikalsee)

S24 (Umweltisolat E. faecalis, Bodensee)

Enterococcus faecium B7641 (Patienten-Isolat, vanA-positiv)

Kulturmedien

Für die Anzucht der o.g. Referenzstämme wurde Hirn-Herz-Bouillon (Merck No. 1.10493.0500) verwendet. Die Enterokokken wurden während des Versuchverlaufes mittels dem Selektivmedium Kanamycin-Aesculin-Agar (Merck No. 1.05222.0500) im Plattengussverfahren detektiert.

Stressfaktoren

Oligotrophe Bedingungen wurden mittels verschiedener Medien bei jeweils verschiedenen Temperaturen eingestellt:

Tabelle 8: Stressparameter

Medium Temperatur [°C]

Trinkwasser Baikalsee 37, 20, 4 mit Licht

Rohwasser Bodensee 37, 20, 4 mit Licht

Trinkwasser FZKa 37, 20, 4 mit Licht

NaClphys. 37, 20, 4 mit Licht

PBS-Puffer 37, 20, 4 mit Licht

Die Inkubationsvolumina derc Stressansätze betrugen zwischen 100 mL bis zu 3 Liter.


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Methoden

Stress- und Resuszitationansatz

Versuchsparameter und Versuchsablauf:

Abb. 28: Überführung von Enterokokken in den nicht kultivierbaren Zustand, Rekultivierung und Probenahme

Um Enterokokken in den nicht kultivierbaren Zustand zu überführen wurde der o.g. (Abb. 28) Versuchsablauf angewendet:

Eine Reinkultur (Aliqot der jeweiligen Referenzkultur in NaClphys., gelagert bei -80°C) des jeweiligen Referenzstammes diente als Inokulum für die Anreicherung in 30 ml Hirn-Herz-Bouillon für 4 h bei 37°C.

Durch Zentrifugation wurden die Zellen pelletiert, zweimal mit physiologischer NaCl-Lösung gewaschen und in die jeweiligen Streß-Ansätze (vgl. Tab: 8 Stressansätze) überführt, so dass eine Zellzahl von 1·105 Zellen/mL bestand.

Danach wurden täglich Proben zur KBE–Bestimmung entnommen (1 mL Zellsuspen-sion in Plattengusstechnik, KAA-Selektivmedium, Inkubation 37°C 24-48 h). Wenn die KBE bei 0 Zellen / 10 mL lag, wurde ein nicht kultivierbarer Zustand (VBNC) des jeweiligen Enterokokken- Stammes definiert.

Die Rekultivierungsversuche erfolgten mit Zugabe von Nährstoffen (BHI, 10% (v/v)), Erhöhung der Temperatur auf 37°C direkt im Stressansatz und ohne Licht. Es wurde stündlich eine zweifache Probe zur KBE-Bestimmung (1ml), zur massenspektro-metrischen Untersuchung (100 ml), DNA-Quantifizierung (100 µl) (vgl. Abb. 28).

Inokulation des jeweiligen Testsystems mit 105 Zellen/mL ( Stressparameter: Nährstoffmangel, Licht, Temperatur:4°C, 20°C, 37°C)

Tägliche Probenahme zur KBE-Bestimmung0 KBE/mL (>>VBNC)

Rekultivierung durch Zugabe von 10% BHI, keine Stressparameter

Stündliche Probenahme: - Filtration 100 mL auf Polycarbonatfilter, steril abschaben und in 75 µL NaClphys.aufnehmen, zentrifugieren, Zellen in 20-50µL Standard-Zellwaschpuffer aufnehmen

- KBE/mL-Bestimmung auf KAA. Plattengussmethode(Inkubation: 24h, 37°C, ohne Licht)

- 100 µL Aliqot für DNA-Quantifizierung

MALDI-ToF/MS Messung Bestimmung der KBE/mL DNA-Quantifizierung


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Definiertes Abtöten von Zellen

- UV-Strahlung

Die Enterokokken-Referenzstämme wurden durch UV-Strahlung (CL-1000 Ultraviolet Crosslinker, UVP) mit 6x800 Joule/cm2 abgetötet.

- Natriumazid

Ca. 105 Zellen/ml der Referenzstämme wurden in 10 ml 5%ige, sterile Natriumazid-Lösung (Sigma-Aldrich) überführt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.

Kontrolliert wurde die Abtötung mittels KAA-Selektivagar in Plattengussmethode. Im Dreifachansatz wurden jeweils 1ml Zellsuspension ausplattiert und 24-48h bei 37°C inkubiert.

Für die Cluster-Versuche (vgl. 3.5.3) mit MALDI-ToF und RAMAN-Spektroskopie (nicht beschrieben) wurden die Zellen abfiltriert (Polycarbonatfilter, 0,2 µm Porendurchmesser), steril abgeschabt, zweimal gewaschen und auf die Messobjektträger aufgebracht.

Vitalitätstest (CTC-Dehydrogenasen-Test und Gegenfärbung mit DAPI): Der CTC-Test ist ein Nachweisverfahren zur Bestimmung von stoffwechselaktiven, also lebenden Bakterien. Er erfasst im Gegensatz zur Bestimmung der ”Koloniebildenden Eunheiten(KBE)”, bei der nur die kultivierbaren Keime nachgewiesen werden, auch solche, die nicht auf einem Nährboden angezüchtet werden können. Außerdem ist der CTC-Test sehr schnell durchzuführen und mit einer Gegenfärbung mit DAPI kann parallel zur Lebendzellzahlbestimmung durch CTC die Gesamtzellzahl ermittelt werden.

Der CTC-Test ist ein Dehydrogenasenaktivitätstest. Dehydrogenasen sind Schlüsselenzyme der Atmungskette von Bakterien, also kann deren Anwesenheit als Nachweis für lebende Bakterien gewertet werden.

CTC (5-Cyano-2,3-Ditolyltetrazoliumchlorid), ein fluorogenes Dehydrogenase-Substrat, ist eine ursprünglich farblose und nicht fluoreszierende Verbindung, die durch enzymatische Aktivität zu einem rotfluoreszierenden Formazankristall reduziert wird und in der Zelle akkumuliert. Während der Inkubation der Keime mit CTC ist der Lösung Brenztraubensäure (Pyruvat) zugesetzt, um die Stoffwechsel- und damit auch die Dehydrogenasenaktivität der Bakterien zu steigern.


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DAPI (4,6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid) ist ein Farbstoff, der unspezifisch an Nukleinsäure bindet. Nach Anlagerung fluoresziert der DAPI-DNA-Komplex bei entspechender Lichtanregung blau, nicht gebundene DAPI-Moleküle erscheinen gelb.

Reagenzien: CTC: 5-Cyano-2,3-Ditolyltetrazoliumchlorid (Polyscience) DAPI: 4,6-Diamidino-2-Phenylindol-Dihydrochlorid (Merck) Polycarbonat (PC)-filter weiß, 25mm Durchmesser (nucleopore, Costar) Eindeckmittel/Antfadinglösung Citifluor (Glycerin/PBS-Lösung) Citiflour England Pyruvatlösung: 100mM-Stammlösung

Durchführung

in 50 mL Zentrifugenröhrchen 200 µL 100 mM Pyruvat-Lösung und 10mL autochtones Wasser (wenn eine ”Keimzahlbestimmung” von einer Wasserpobe gemacht werden soll entspricht die Wasserprobe dem autochtonem Wasser) pipettieren. 15,6mg CTC-Pulver zugeben (Achtung GIFTIG !!). Entweder Material mit dem zu untersuchenden Biofilm in die Lösung geben oder definierten Bereich des Coupons mittels Zellschaber abkratzen und in der Lösung suspendieren (wird eine ”Keimzahlbestimmung” einer Wasserprobe durchgeführt, muß nichts mehr zugefügt werden).

Ca. 3 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren (auch längere Inkubation möglich). Wurde ein Material in der CTC-Lösung inkubiert, Biofilm mittels Zellschaber abnehmen und in CTC-Lösung suspendieren

Gegenfärbung mit DAPI

20 µL DAPI-Lösung (Endkonzentration:1µg/mL) zugeben, 10 Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren.

Lösung (eventuell Aliquot, wenn mit hoher Keimkontamination zu rechnen ist) über Polycarbonatfilter (glänzende Seite oben) filtrieren und Membran trocknen lassen.

Filter auf Objektträger legen, mit 1 Tropfen Citifluor benetzen, mit Deckglas bedecken.

10 Gesichtsfeldern DAPI und CTC im Vergleich im Epifluoreszenzmikroskop auzählen, Fluoreszenzlampe zuvor etwa 15 Minuten einbrennen lassen.

DAPI:Filter BP365/FT 395/ LP 397


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CTC Filter BP 546/FT 580/LP 590

Auswertung

- gezählter Ausschnitt 0,0156 mm² = gezählte Keime

- gesamter Filter 490 mm2 = x Keime

-falls ein Aliquot filtriert wurde Keimzahl multiplizieren

- Keime insgesamt/eingesetztem Volumen

-Zählung wachsender Zellen mit Nalidixinsäure/Pipemidinsäure

Bestimmung lebender Mikroorganismen mit Direct Viable Count (DVC)

Prinzip

Die Bestimmung der Gesamtzellzahl mit Epifluoreszenzfarbstoffen liefert keine Aussage über den physiologischen Zustand der Zellen. Zu diesem Zweck wurde der ‚direct viable count’ entwickelt (Kogure et al. 1979). Bei dieser Methode wird der natürlichen Gemeinschaft ein Antibiotikum oder mehre Antibiotika zugesetzt, welche die Verdopplung der DNA unterbindet. Die Zellen können zwar wachsen und Biomasse aufbauen, sich aber nicht teilen. Man geht davon aus, dass lebensfähige Zellen wachsen und übernimmt die Zahl wachsender, deutlich „längerer“ Zellen als ‚direct viable count’ (DVC).

Benötigte Chemikalien

Nalidixinsäure und Pipemidinsäure, je 1 mg in 10 ml-1 dest. Wasser lösen und sterilfiltrieren

Hefeextrakt, 10 g·l-1, autoklaviert

Durchführung

10 ml Wasserprobe werden mit sterilem Hefeextrakt versetzt (Endkonzentration (50 mg·l-1). Dann wird Nalidixinsäure/Pipemidinsäure-Mix zugesetzt (Endkonzentration 20 μg·ml-1) bzw. das gleiche Volumen steriles Wasser in Kontrollversuchen und für 8 bis 24 Stunden inkubiert (37°C, leicht schwenken). Danach wird die Probe mit


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Formaldehyd fixiert und die Gesamtzellzahl mittels DAPI bestimmt, sowie die Anzahl unnatürlich langer ungeteilter Zellen.

Analysiert werden:

- Probe ohne Hefeextrakt und ohne Nalidixinsäure/Pipemidinsäure

- Probe mit Hefeextrakt und ohne Nalidixinsäure/Pipemidinsäure

- Probe mit Hefeextrakt und mit Nalidixinsäure/Pipemidinsäure

Bei geringen Zellzahlen sollten die Zellen auf einem Filter (0.2 μm Porenweite) konzentriert werden.

Diskriminierung lebender und toter Zellen mit Propidium-Monoazid (PMA)

PMA ist eine zweifach positiv geladene Substanz und kann deshalb nicht in Zellen mit einer intakten Membran eindringen. In tote bzw. membrangeschädigte Zellen dringt PMA ein und lagert sich in die DNA ein. Durch Bestrahlung mit Licht von einer Wellenlänge von 464 nm bildet sich eine kovalente Bindung zwischen dem PMA und der DNA aus. DNA, die auf diese Weise gebunden ist, steht für nachfolgende molekularbiologische Analysen nicht mehr zur Verfügung.[Nocker et.al]

Abb. 29: Prinzip des Lebend-Tot-Nachweises mit PMA

Zellaufkonzentrierung

lebendEinlagerung

PMA++

tot

h*νh*νh*νAbs 464nm

Crosslinking Tot + lebend

lebend


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Für die Aufkonzentration von Mikroorganismen wurde eine Pressfiltrationsanlage der Firma Millipore verwendet. Diese arbeitet mit Überdruck bis 6 bar und kann mit Druckluft, oder wenn notwendig, mit einem inerten Gas betrieben werden. Die Überdruckfiltration ist „leistungsfähiger“ als die Unterdruckfiltration,, .Zusätzlich kann ein Rührer eingesetzt werde, um den entstehenden Filterkuchen zu „zerteilen“ und damit eine Tiefenfiltration zu verhindern. Anschliessend kann der Filter (Polycarbonat, Porengröße 0,2µm, Durchmesser 63 mm) steril entnommen und das Zellmaterial abgeschabt werden.

4

3

2

4

Abb. 30: Pressfiltrationsanlage

Environmental scanning electron microscope (ESEM)

Allgemeines Funktionsprinzip

Wie bei einem konventionellen Rasterelektronenmikroskop wird die Probe von einem fokussierten Elektronenstrahl abgerastert und das bei der Wechselwirkung mit der Probe entstehende Signal zur Bilderzeugung verwendet. Allerdings befindet sich die Probenkammer hierbei nicht unter Hochvakuum, sondern um die Probe herum befindet sich ein Gas mit einem Gasdruck von typischerweise 1 bis 10 Torr (130-1300 Pa). Als Gase werden üblicherweise Wasserdampf oder Stickstoff eingesetzt.

Die Druckdifferenz zwischen dem Hochvakuumbereich mit Kathode (ca. 10-9 – 10-10 Pa) und der Probenkammer mit niedrigem Vakuum (ca. 130 Pa) wird durch eine Reihe von feinen Blenden im Strahlengang und durch ein differenzielles Pumpsystem realisiert.

1. Ablauf 2. Filterauflage 3. Vorlagegefäß 4. Anschluss für

Überdruck


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Trifft der Elektronenstrahl dann auf die Probe, so kommt es an der Probenoberfläche zu verschiedenen Wechselwirkungen. Für die Abbildung im ESEM-Betrieb ist die Entstehung von niederenergetischen Sekundärelektronen (0-50 eV) wichtig, welche die Probenoberfläche als langsame Elektronen verlassen und mit einem speziellen Gasphasen-Sekundär-Elektronen-Detektor (GSED) nachgewiesen werden.

Zur Signalverstärkung im ESEM wird das Gas in der Probenkammer genutzt. Durch eine angelegte Spannung zwischen Probe und Detektor werden die Sekundärelektronen zum Detektor hin beschleunigt. Auf dem Weg zu Detektor kommt es zu Stößen zwischen den Elektronen und den Gasatomen. Die Atome werden hierbei ionisiert und es entstehen neue Elektronen (Verstärkungskaskade). Das aus diesem Signal entstehende Bild entspricht hauptsächlich einem Topographiekontrast.

Die ionisierten Gasatome werden aufgrund ihrer positiven Ladung entgegengesetzt in Richtung Probe beschleunigt und sorgen dort für eine Neutralisierung von Aufladungen, welche bei Proben mit nichtleitenden Oberflächen entstehen könnten.

Abb. 31: Prinzip eines Environmental Scanning Electron Microscope (ESEM)

Die Visualisierung der nicht kultivierbaren Enterokokken (Kap. 3.5.3) wurde mit einem Enviromental Scanning Electron Microscope (ESEM) mit zusätzlichem Gaseous Secondary Detector (GSE) und einem EDAX Energy Dispersive Spectroscopy (EDS) System durchgeführt,.

Probenpräparation: Die Zellsuspension der nicht kultivierbaren Enterokokken wurden auf einen Mikroskopie-Deckglas (thin glass) ausgestrichen, bei Raumtemperatur luftgetrocknet und direkt mit dem ESEM gemessen.

Messparameter: Accelerating voltage:20,0 KV, Detection: GSE, Druck: 0,9 Torr


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Intact Cell Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time of Flight (MALDI-ToF) Massenspektrometrie

Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation (engl. Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI) ist ein Verfahren zur Ionisation von Molekülen. Es erwies sich seit seiner Entwicklung in den 1980er Jahren als besonders effektiv für die Massenspektrometrie an großen Molekülen und Polymeren sowie Biopolymeren (z.B. Proteine).

MALDI beruht auf der Kokristallisation von Matrix und Analyt mit einem 100–100.000fachem molaren Überschuss an Matrix. Analytmoleküle müssen in die Kristalle der MALDI Matrix „eingebaut“ werden während sich die Kristalle bilden. Typischerweise erfordert die erfolgreiche Kokristallisation ein Matrix-zu-Analyt-Verhältnis von etwa 5000:1 (mol/mol). Als Matrixsubstanzen werden kleine organische Moleküle gewählt, die bei der verwendeten Laserwellenlänge (z.B. Stickstoff-Laser bei einer Wellenlänge von 337 nm) Energie stark absorbieren (z.B. Sinapinsäure, 4,5-Dihydroxybenzoesäure, Cyano-4-hydroxyzimtsäure). Mit kurzen hochenergetischen Laserimpulsen von 2–5 ns Pulsdauer erfolgt die Anregung, die nach Relaxation im Kristallgitter zu explosionsartigen Teilchenablösungen an der Oberfläche des Kristalls führt. Gemeinsam mit der Matrix werden dabei die eingeschlossenen Analytmoleküle mit in das Vakuum des Massenspektrometers überführt und so der massenspektrometrischen Analyse zugänglich. Mittels MALDI-ToF-Massenspektroskopie lässt auch die Analyse ganzer Zelleb zu. Bei diesem als Intact-Cell-MALDI-ToF-Massenspektroskopie (ICM-MS) bezeichnete Verfahren werden zunächst ganze Zellen mit einer Matrixsubstanz auf einer Trägerplatte cokristallisiert. Von diesen Zellen wird anschließend mit Hilfe der MALDI-ToF-MS ein massenspektrometrisches Profile aufgezeichnet, das als Fingerprint-Massenspektrum charakteristisch für die untersuchten Zellen ist. Die ICM-MS wird daher häufig zur schnellen Identifizierung von Zellisolaten, insbesondere im medizinischen Bereich, herangezogen (Edwards-Jones et al. (2000); Walker et al. (2002); Jackson et al. (2005)). Stressfaktoren führen zu Veränderungen in den Profilen (Marvin-Guy et al. (2004)). Die resultierenden Spektren sind nicht nur charakteristisch für den jeweiligen Organismus, sondern hängen auch stark von dessen physiologischen Zustand ab. Die oben beschriebenen Screening-Verfahren liefern mit den Fingerprint-Spektren sehr komplexe, multivariate Daten, auf deren Grundlage eine Unterscheidung von Zellzuständen mit starken bzw. schwachen zellulären Veränderungen möglich sein sollte. Hierfür muss der gesamte Datensatz auf eine mögliche latent verborgene Gruppenstruktur untersucht werden, was geeignete Methoden zur Clusterbildung notwendig macht. Zu diesen Verfahren zählt die hierarchische Clusteranalyse. Sie eignet sich insbesondere für die Analyse von Daten mit einer gewissen natürlichen Hierarchie, was bei den Fingerprint-Spektren der verschiedenen Zellzuständen gegeben war (Handl (2002)). Ein weiteres Verfahren der explorativen Datenanalyse ist die Hauptkomponentenanalyse, die ebenfalls dazu dient, komplexe Datensätze zu strukturieren. Im Gegensatz zur hierarchischen Clusteranalyse sind bei dieser Methode die Verbindungen zwischen den einzelnen Clustern nicht ersichtlich (Gemperline (2006)). Auch wird die hierarchische Clusteranalyse bei der Auswertung spektroskopischer Daten von

http://de.wikipedia.org/wiki/Massenspektrometrie

http://de.wikipedia.org/wiki/Analyt

http://de.wikipedia.org/wiki/Nanometer

http://de.wikipedia.org/wiki/Nanosekunde

http://de.wikipedia.org/wiki/Relaxation


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biologischen Proben häufig angewandt (Bright et al. (2002), Keys et al. (2004), Dieckmann et al. (2005), Rösch et al. (2005), Dissertation Katharina Fund, 2008), (vgl. Kap. 3.5.3, Abb. 41 – 44 und Intact-Cell MALDI S. 71)

Abb. 32: MALDI-ToF - Prinzip

Verwendete Parameter:

Die Referenzstämme wurden für die massenspektrometrischen Messungen pelletiert und zweimal in Standardzellwaschpuffer (5 mM Magnesiumacetat, 10 mM Tris Base, pH 8,0 ) gewaschen.

Jede Probe wurde in 3 Schritten auf die Messplatte aufgebracht: 0,5 µL Probe, 0,5 µL konz. Ethanol, 0,5 µL Matrix (alpha-Cyano-4-hydroxyzimtsäure, Acetonitril, Trifluoressigsäure). Zwischen jedem Schritt wurde die Probe getrocknet.

Folgende Parameter wurden für die Aufnahme der Spektren angewendet:

Accelerating voltage: 20000 V, grid voltage: 91%, delay time: 200 ns, range: 2000 – 25000 m/z, low mass gate: 2000, laser intensity: around 2000.


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3.5.3 Ergebnisse

3.5.3.1: Methodenentwicklung

Vitalitätstest: Nachweis lebender Organismen mittels Direct Viable Count (DVC)

Eingesetzte Mikroorganismen: Enterococcus faecium (Bodenseeisolat), Pseudomonas aeruginosa SG81(Universität Duisburg)

Stressparameter: Nährstoffmangel (Trinkwasser), Osmotischer Stress (0,5 M NaCl – Lösung), Temperatur (10°C).

DVC-Test mit Pipemidin/Nalidixin, gefärbt mit DAPI, detektiert mit Epi-Fluoreszenz-Mikroskop (Zeiss)

Abb35: Enterokokken mit Salzstress Abb. 35 Enterokokken bei 10°C

In Abb. 33 liegen die DAPI-gefärbten Enterokokken-Zellen als kokkoide Formen vor.

In Abb. 34 bis 35 lässt sich nach 3 Tagen Inkubation mit den beiden Antibiotika eine „unnatürliche“ Zellverlängerung dieser Enterokokken erkennen. Dies lässt die

Abb. 33: Enterokokken ohne Antibiotika

Abb. 34: Enterokokken in Leitungswasser


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Aussage zu, dass die Zellen Biomasse aufbauen, sich aber nicht teilen. Sie sind somit physiologisch aktiv.

Pseudomonas aeruginosa

Abb. 37: P.aruginosa in Leitungswasser Abb. 38 P. aeruginosa mit Salzstress

Abb.39 P. aeruginosa bei 10°C

Bei P.aeruginosa zeigt sich nach 3 Tagen Inkubation mit den beiden Antibiotika und Nährstoffmangel eine Clusterbildung (Abb. 37). Eine signifikante Zellverlängerung lässt sich hierbei nicht erkennen. Bei Temperaturstress lässt sich ebenfalls keine explizite Zellverlängerung erkennen. Daraus lässt sich schließen, dass die physiologische Aktivität extrem eingeschränkt bzw. nicht vorhanden ist. (Abb. 39)

Bei Salzstress ist eine deutliche Zellverlängerung erkennbar. Dies lässt die Aussage zu, dass die Zellen physiologisch aktiv sind. (Abb.38).


70

Nachweis lebender und toter Zellen mit PMA und Quantifizierung mit Real Time PCR (TaqMan-PCR) Zur Unterscheidung zwischen lebenden und toten Zellen und deren Quantifizierung wurde die „Unterscheidung lebender und toter Zellen nach dem PMA Prinzip“ (Nocker et al, 2006) optimiert und etabliert.

Testorganismen und Anzucht

Organismuns: Enterococcus feacium 1266. Die Anzucht erfolgte in flüssigem Brain-Heart-Medium (Merck). Für die Versuche wurden die lebenden bzw. mit Isoporpanol (Endkonzentration 70%) abgetöteten Zellen pelletiert und in PBS resuspendiert (OD600nm 0,6 ).

In einer Mikrotiterplatte (24 Kavitäten, Nucleon™ Surface, Nunc) wurden jeweils 600 µl (in 3 parallellen Ansätzen) der Zellsuspensionen vorgelegt und mit 1,5 µl PMA (Endkonzentration 50 µmol) versetzt. Zum Vergleich wurden alle Proben ohne PMA-Behandlung mit einbezogen.

Die beladene Mikrotiterplatte wurde 5 min unter Lichtausschluss bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend für 10 min unter mehrmaligem Mischen bestrahlt. Durch diesen Schritt wird überschüssiges PMA inaktiviert und das PMA kovalent an die DNA toter Zellen gebunden.

Für die molekularbiologische Quantifizierung mittels Real Time-PCR wurden die 3 parallellen Ansätze vereinigt, die Zellen pelletiert und eine DNA-Extraktion durchgeführt. Um inhibierende Effekte durch überschüssiges PMA zu minimieren wurden die DNA-Extrakte vor der Quantifizierung 1:10 und 1:100 verdünnt.

Als Real Time PCR System wurden die Primer Ent1tuf618 und Ent2tuf729 verwendet, welche das enterokokkenspezifische tuf-Gen (elongation factor EF-Tu) detektieren. [DanbingkeFranc, 1999]

Sequenzen:

Ent1tuf618: TACTGACAAACCATTCATGATG

Ent2tuf729: AACTTCGTCACCAACGCGAAC


71

Abb. 40: E. faecium tot und vital mit / ohne PMA, DNA Isolation mit Prepman (Applied Biosystem)

Wie sich aus der Abb. 40 entnehmen lässt,lag die Differenz der CT-Werte (∆CT) zwischen PMA-behandelten lebenden und toten Enterokokkenzellen bei 16. Da ein ∆CT von 3,3 einer Logstufe entspricht, konnte mit der eingesetzten PMA-Methode eine Reduktion von ca. 5 Logstufen nachgewiesen werden.

Intact Cell-MALDI

Für den Nachweis von VBNC-Stadien gibt es nur relativ wenige Methoden, die für die entsprechende spezielle Problemstellung zurechtgeschnitten bzw. sogar neu entwickelt werden müssen. So wurden seit Herbst 2005 im Labor der Abt. Umweltmikrobiologie/ITC-WGT des Forschungszentrums Karlsruhe intensiv molekularbiologische Methoden entwickelt, um a) Enterokokken auch in den niedrigen Konzentrationen in oligotrophen Bereichen möglichst sensitiv mit quantitativer PCR nachzuweisen sowie b) Genexpressionen, die für den enterokokkalen VBNC-Zustand offenbar typisch sind, unmittelbar über mRNA-Synthese und RT-PCR zu bestimmen. Im März 2006 wurden diese Methoden, soweit sie bis dahin bereits optimiert waren, durch uns im Labor des Limnologischen Instituts/Irkutsk eingearbeitet, so dass bei beiden Projektpartnern nun ein gezielter Nachweis von VBNC-Enterokokken möglich sein sollte. Zusätzlich erwies sich eine neue Methode, das Muster der Molekülzusammensetzung in Bakterien verschiedener Lebensstadien massenspektrometrisch (Intact Cell-MALDI) zu bestimmen, als äusserst erfolgversprechend (Abb. 44).

lebend/tot ohne PMA

lebend mit PMAtot mit PMA


72

Abb. 41. Original Massenspektrum Enterococcus faecium vital

Abb. 42. Original Massenspektrum Enterococcus faecium nicht kultivierbar (VBNC)


73

Abb. 43: Original Massenspektrum Enterococcus faecium UV-behandelt (tot), (6x800 Joule/cm2) Diese Fingerprint-Spektren kann man mittels einer Statistik-Software (hier Opus 5.5) in Cluster zusammenfassen und jedem Zellzustand zuordnen. Für eine belastbare statische Aussage ist eine größere Anzahl (mind. 20) an Spektren notwendig.

Abb. 44: Clusteranalyse eines Intact Cell-MALDI-Massenspektrums von vitalen, ruhenden und toten Enterococcus faecium-Zellen.

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

2

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t

8UV

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0

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l.0

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vita

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N82

vita

l.0

N85

vita

l.0

VBN

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VBN

C2.

0

VBN

C3.

0

VBN

C4.

0

VBN

C5.

0

Datenvorbehandlung: Vektornormierung

tot vital VBNC

0

0.2

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1

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VBN

C2.

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VBN

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C4.

0

VBN

C5.

0


tot vital VBNC


74

Die für eine Auswertung normalerweise recht unübersichtlichen Fingerprint-Muster der bakteriellen Zellmoleküle konnten durch Anwendung der statistischen Clusteranalyse, wie sie sonst als Dendrogramm z.B. in der Taxonomie angewandt wird, in übersichtliche und signifikant unterschiedliche Stadien unterteilt werden. In Abb. 44 sind 3 verschiedene physiologische Stadien ein und derselben Enterococcus faecium-Kultur zu sehen, bei denen eindeutig zwischen vitalem (kultivierbarem), totem und ruhendem (VBNC) Stadium unterschieden werden kann. Die Methode der Intact Cell-MALDI-TOF-Massenspektrometrie wird aufbauend auf diese Versuchen weiter verfeinert.

Mikroskopische Aufnahmen von nicht kultivierbaren Enterokokkenzellen mittels ESEM

Abb. 45: ESEM-Aufnahmen von Enterokokken im VBNC-Stadium, luftgetrocknet in Phosphatpuffer Die Abb. 45 zeigt Enterokokken im nicht kultivierbaren Stadium (VBNC). Es lässt sich in den ESEM-Aufnahmen erkennen (1-4), dass die Zellen noch morphologisch intakt sind. Weiter konnte oftmals beobachtet werden, dass die nicht kultivierbaren Zellen kleiner (ca. 500 nm ) als „normale“, vegetative Zellen (ca. 1 µm)) sind.

1

2

3 4


75

3.5.3.2 Stressversuche mit Enterococcus faecium

Nachdem die Hypothese immer wahrscheinlicher wurde, dass die Enterokokken im Baikalsee und grösseren Tiefen des Bodensees nicht eliminiert werden, sondern aufgrund bakterieller Stressmechanismen nach Eintrag in ein oligotrophes, kaltes und in den oberen Schichten sonnendurchstrahltes Gewässer in den „Viable but not culturable (VBNC)“-Zustand fallen, mussten diese Annahmen im Labor experimentell überprüft werden.

Wir konnten dieses Phänomen sowie die Wiederbelebung mit einem Enterokokken-Patientenisolat und Trinkwasser bzw. Baikal-Wasser im Labor nachweisen E. faecium-Isolate aus dem Bodensee (freundlicherweise von der LUBW Langenargen zur Verfügung gestellt) ebenfalls die Fähigkeit zu VBNC und Wiederbelebung aufweisen.

Am Beispiel von Enterococcus faecium (Patientenisolat und Isolat aus dem Baikalsee) konnte nachgewiesen werden, dass kultivierbare Zellen nach Nährstoffentzug (Inkubation in filtriertem Baikal- oder Trinkwasser) und Temperaturschock (Abkühlung von 37°C auf 20°C bzw. 5-9°C) in ein nicht kultivierbares Stadium fallen, aus dem sie nach Nährstoffzugabe (siehe auch Abb. 48, 49) auch reaktiviert werden können (Abb. 46).

Abb. 46: Wiederbelebung von Enterococcus faecium nach Stress in Baikalwasser

Enterokokken in Baikalwasser nach 9 Tagen (6 – 9°C)

Enterokokken in Baikalwasser nach 12 Tagen (37°C)

Wiederbelebung

Die Ergebnisse sind vergleichbar mit Versuchen mit FZK-Trinkwasser

Wiederbelebung von Enterokokkennach Zugabe von 1mL BHI Bouillon zu 99 mL Baikalwasser


76

Abb. 47:: Stressversuch mit Enterococcus faecium in Baikalwasser (6-9°C, Licht): Kultivierbarkeit und Atmungsaktivität nehmen ab, mikroskopisch sichtbare Zellen werden zu Zwergformen, aber DNA-Gehalt bleibt konstant

In detaillierten Untersuchungen mit verschiedenen Indikatoren waren nach 3 Tagen keine Kolonien mehr auf Kanamycin-Äsculin-Agar nachweisbar. Mikroskopisch (DAPI) verringerte sich die Zellzahl und Zwergformen wurden vermehrt detektiert. Die Respirationsaktivität (CTC) sank bereits nach 2 Tagen unter die Nachweisgrenze. Der DNA-Gehalt (quantitative PCR) blieb jedoch während des gesamten Versuchs konstant (Abb.47).

Kolonien (%)

0

20

40

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80

100

0 1 2 3Tage

Kolonien (%)

0

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0 1 2 3Tage

aktive Zellen (%)

0

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0 1 2 3Tage

aktive Zellen (%)

0

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0 1 2 3Tage

Zellzahl (%)

0

20

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0 1 2 3Tage

Zellzahl (%)

0

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0 1 2 3Tage

DNA (%)

0

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0 1 2 3Tage

DNA (%)

0

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0 1 2 3Tage

Kein Wachstum auf Medium

Keine Atmungs-aktivität

Zwergformen


77

Abb. 48: Wiederbelebungsversuch mit paralleler DNA-Quantifizierung

Nach der Wiederbelebung (Zugabe von 1 mL Nährlösung zum Versuchsansatz und Temperaturerhöhung auf 37°C unter Lichtausschluss) (Abb. 48a) wurden nach 2-3 Stunden wieder Kolonien nachgewiesen, der DNA-Gehalt blieb jedoch weiterhin konstant Abb. 48b-d). Erst nach 5-6 Stunden stieg auch der DNA-Gehalt an, was erst ab diesem Zeitpunkt auf eine Vermehrung von Zellen schliessen lässt (Abb. 48e). Die davor detektierten Kolonien müssen demnach aus „wiederbelebten“ VBNC-Zellen entstanden sein.

Die Versuche wurden mit einem Enterokokken-Isolat aus dem Baikalsee wiederholt und bestätigten die Beobachtungen. In beiden Fällen handelte es sich um Enterococcus faecium, der bislang nicht für eine Wiedererlangung der Lebensfähigkeit nach VBNC bekannt war [Lleo et al., 2001].

Im Labor in Irkutsk konnten wir zusammen mit den russischen Kollegen ebenfalls die Fähigkeit von Enterococcus faecium zum Ruhe- und Wiederbelebungsstadium nachweisen (Abb. 49).

48a) keine Kolonien, DNA konstant (ct 29,75)

48b) erste Kolonien, DNA konstant (ct 30,3)

48c) vermehrte Kolonien, DNA konstant (ct 30,3)

48d) viele Kolonien, DNA konstant (ct 30,3)

48e) total überwachsen, DNA zunehmend (ct 29,3)

erst ab dieser Phase Wachstum, vorher nur „Wiederbelebung“


78

Abb. 49: Stressversuch mit Enterococcus faecium- Isolat aus dem Baikal in Baikalwasser bei verschiedenen Temperaturen Interessant hierbei war, dass dasselbe Isolat aus dem Baikal-See sich bei der Wiederbelebung unterschiedlich verhielt, je nach der Bebrütungstemperatur der Vorkultur. Eine bei 37°C gezüchtete Vorkultur liess sich hier nach 11 Tagen VBNC nicht wiederbeleben, während bei 4° und 24°C angezüchtete Vorkulturen wiederbelebt werden konnten.

Die Untersuchungsreihen zu den der Ruhestadien (VBNC) wurden in grösseren Volumina weitergeführt, um ausreichend Probenmaterial für weitere Untersuchungen wie Intact Cell-MALDI-MS zu erhalten. Hierbei ergaben sich 2 grundsätzliche Probleme: die Anreicherung des Zellmaterials aus grossen Volumina und Erreichen des Ruhestadiums und der Wiederbelebung in grösseren Probevolumina. Während das Problem der Zellanreicherung durch Anwendung der Pressfiltration grösstenteils gelöst werden konnte (siehe auch 3.5.2., Zellaufkonzentrierung), ergaben die in kleineren Volumina (100 mL) erfolgreich durchgeführten Stressversuche in Volumina bis zu 3 L keine messbaren Ruhestadien bzw. wieder belebten vegetativen Zellen. Nach mehreren Monaten (mehrwöchige Inkubationszeiten) wurden die Versuche auf Kultivierungsbasis abgebrochen. Ein weiterer Grund war, dass derartige Versuche nur unter Laborbedingungen durchgeführt werden können, jedoch zukünftig Indikatoren für in situ-Proben benötigt werden. Im Limnologischen Institut wurden ebenfalls VBNC-Versuche mit E. faecium-Isolaten aus dem Baikal durchgeführt, jedoch andere Parameter erfasst. Wichtige Ergebnisse erbrachte hierbei die Transmissions-Elektronenmikroskopie (TEM).

0,0001

0,001

0,01

0,1

1

10

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0 24 48 120 144 168 192 216 240 264 288 290 291 292 293 294 295 296 297 298

hours

cells

/ml*

1000

0

t=4t=24t=37

Wiederbelebung


79

Abb. 50: TEM-Aufnahmen: Enterokokken vor und während Stress sowie nach der Wiederbelebung (Limnlologisches Institut Irkutsk, Dr. Valentina Parfenova und Mitarbeiterinnen)

Besonders auffällig an den Enterococcus faecium-Isolaten in den Stress- und Wiederbelebungsversuchen, die wir mit den russischen Kolleginnen durchführten, war, dass nach der Ruhephase auch bei wiederbelebten Zellen eine im Elektronenmikroskop deutlich verdickte Zellwand ersichtlich war (Abb. 51, Pfeile). Es wurden auch andere strukturelle Veränderungen wie Zelleinschlüsse beobachtet (siehe Abb.450, oben links: a), die bis dato nicht weiter erklärt werden können.

Abb. 51: Transmissionselektronische Aufnahmen von E. faecium nach Stress und Wiederbelebung (Limnologisches Institut Irkutsk, Dr. Valentina Parfenova und Mitarbeiterinnen)

Versuche, die bei vorhergehenden TEM-mikroskopischen und massenspektrometrischen Veränderungen in der Zellstruktur und im Molekülmuster näher zu identifizieren, waren nur bedingt erfolgreich. So konnte bislang eine Fraktionierung von Zellwand und Cytosol nicht erfolgreich etabliert werden. Zur näheren chemischen Beschreibung wurden erste Versuche mit einem neu etablierten

vor Stress

während Stress

nach Wiederbelebung

a


80

Raman-Mikroskop durchgeführt, die allerdings noch weitergehender Optimierung bedürfen. Die TEM-mikroskopischen Untersuchungen werden in Irkutsk intensiviert hinsichtlich einer Projektfortführung fortgesetzt, um die Reproduzierbarkeit der beobachteten strukturellen Veränderungen zu beweisen. Zu Veränderungen der Zellwandstrukturen werden derzeit Verfahren zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der bekannten Penicillin-Bindeproteine durchgeführt, die strukturelle Funktionen repräsentieren, die ggf. für eine höhere Umweltpersistenz relevant sein können.

3.5.4. Diskussion

Methodenentwicklung

Aufgrund der vielversprechenden Ergebnisse wurde die Entwicklung und Etablierung neuer Methoden vorangetrieben. Neben den oben geschilderten mikrobiologischen und PCR-Methoden sind vor allem die Transmissionselektronenmikroskopie der russischen Kollegen zu nennen, bei denen distinkte morphologische Veränderungen der Zellen während und nach VBNC-Stadium zu erkennen sind, sowie der Einsatz massenspektrometrischer Verfahren (Intact Cell-MALDI), mit denen deutliche Unterschiede des zellulären Molekülmassenmusters während und nach VBNC-Stadium festzustellen waren. Auch tote Zellen konnten damit von VBNC-Zellen diskriminiert werden. In einer Dissertation (Miriam Brändle) , die aufgrund der neuen Erkenntnisse begonnen wurde, werden nun charakteristische Genexpressionen, die möglicherweise bei Stressantworten eine Rolle spielen, untersucht und methodisch verwendet und unterstützen die genannten Projektarbeiten. Hierbei konnte gezeigt werden, dass bei E. faecalis (Bodenseeisolat) die Expression von pbp5 im nicht kultivierbaren Stadium (VBNC) im Vergleich zu kultivierbaren Zellen am höchsten ist (Lleo et.al, 2000). Dagegen konnte bei E. faecium (Bodenseeisolat) keine ansteigende Expression vom pbp5 in den verschiedenen physiologischen Stadien kultivierbar – nicht kultivierbar – nachgewiesen werden.

Weitere Methoden zur tot-lebend-Unterscheidung von Zellen sowie zur Anreicherung sind derzeit in Erprobung.

Feldversuche

Die erheblichen Probleme, die sich nach der Expedition 2005 mit dem Nachweis bakterieller bzw. enterokokkaler DNA ergaben, lassen sich neben den niedrigen Konzentrationen im Baikal-See wahrscheinlich ebenfalls auf VBNC-Stadien zurückführen. Aus der Literatur ist bekannt, dass die DNA in VBNC-Zellen durch DNA-bindende Proteine geschützt wird, die den Nachweis und die Amplifizierung mit PCR erheblich komplizieren.


81

VBNC

Am Beispiel von Enterococcus faecium (Patientenisolat und Isolat aus dem Baikalsee) konnte nachgewiesen werden, dass kultivierbare Zellen nach Nährstoffentzug (Inkubation in filtriertem Baikal- oder Trinkwasser) und Temperaturschock (Abkühlung von 37°C auf 20°C bzw. 5-9°C) in ein nicht kultivierbares Stadium fallen. Es waren nach 3 Tagen keine Kolonien mehr auf Kanamycin-Äsculin-Agar nachweisbar. Mikroskopisch (DAPI) verringerte sich die Zellzahl und Zwergformen wurden vermehrt detektiert. Die Respirationsaktivität (CTC) sank bereits nach 2 Tagen unter die Nachweisgrenze. Der DNA-Gehalt (quantitative PCR) blieb jedoch während des gesamten Versuchs konstant. Nach der Wiederbelebung (Zugabe von 1 mL Nährlösung zum Versuchsansatz und Temperaturerhöhung auf 37°C unter Lichtausschluss) wurden nach 2-3 Stunden wieder Kolonien nachgewiesen, der DNA-Gehalt blieb jedoch weiterhin konstant. Erst nach 5-6 Stunden stieg auch der DNA-Gehalt an, was erst ab diesem Zeitpunkt auf eine Vermehrung von Zellen schliessen lässt. Die davor detektierten Kolonien müssen demnach aus „wiederbelebten“ VBNC-Zellen entstanden sein.

Im Labor in Irkutsk konnten wir zusammen mit den russischen Kollegen ebenfalls die Fähigkeit von Enterococcus faecium zum Ruhe- und Wiederbelebungsstadium nachweisen. Interessant hierbei war, dass dasselbe Isolat aus dem Baikal-See sich bei der Wiederbelebung unterschiedlich verhielt, je nach der Bebrütungstemperatur der Vorkultur. Eine bei 37°C gezüchtete Vorkultur liess sich hier nach 11 Tagen VBNC nicht wiederbeleben, während bei 4° und 24°C angezüchtete Vorkulturen wiederbelebt werden konnten. Das könnte bedeuten, dass Enterokokken aus frischen Kontaminationen nicht, bereits an das aquatische Milieu adaptierte jedoch sehr wohl wiederbelebt und damit zur erneuten Kontamination werden können.

Die bisher generierten Ergebnisse lassen jedoch den Schluss zu, dass E. faecium ebenso zu VBNC und Wiedererweckung fähig ist wie E. faecalis. Dieser Fakt würde auch Ergebnisse aus Arbeiten unserer Gruppe in der Vergangenheit erklären. So wurde mehrfach und reproduzierbar enterokokkale DNA bei Uferfiltratpassagen detektiert, ohne Nachweis kultivierbarer Enterokokken [Abschlussbericht, 2005]. Auch bei weiteren von unseren (unveröffentlichten) Untersuchungen an Uferfiltratgewinnungen an anderen Gewässern trat diese Phänomen auf. Zudem reagieren Enterokokken mit einer verzögerten Stress-Antwort auf z.B. UV-Desinfektion, das in ihnen eine Wiedererholung und evt. Wiederaufkeimung im Trinkwasserverteilungsnetz ermöglicht [Schwartz et al., 2003; Jungfer et al., 2006].

Da Folgen eines VBNC-Zustands eine erhöhte Toleranz gegenüber lebensfeindlichen Umweltbedingungen sowie eine gesteigerte Persistenz gegenüber Bioziden und Desinfektionsmaßnahmen sein können [Oliver 2005], kann das Auftreten von VBNC-Enterokokken auch unmittelbare Auswirkungen auf die Aufbereitung von Trinkwasser haben, bei der durch Entzug von Nährstoffen, Abkühlung etc. vergleichbare Bedingungen zum Baikal geschaffen werden. In der internationalen Literatur sind hierzu nur relativ wenige, ausschließlich unter Laborbedingungen durchgeführte Experimente aufgeführt. Die Wasserversorgung


82

und die öffentliche Gesundheitsüberwachung haben das Problem der bakteriellen VBNC-Stadien offenbar noch nicht perzipiert und dementsprechend weder experimentelle Untersuchungen durchgeführt noch Überlegungen dazu angestellt.

In Anbetracht der Notwendigkeit mikrobiologisch stabilen Wassers während der Wasserverteilung halten wir Untersuchungen zum potentiellen VBNC-Zustand von Fäkalbakterien während der Trinkwasseraufbereitung sowie die Entwicklung von Vermeidungsstrategien für unabdingbar.

Ein zusätzlicher Aspekt, der bei dieser Fragestellung einzukalkulieren wäre, ist die Bildung und das Vorhandensein von VBNC-Stadien hygienisch relevanter Bakterien im Sediment der für die Trinkwassergewinnung genutzten Gewässer. Die Gewässersedimente könnten in diesem Fall ein Reservoir für fäkale und pathogene Bakterien darstellen, die durch im Zusammenhang mit Sturmereignissen wieder in das Freiwasser und damit in den hygienischen Kreislauf wieder eintreten könnten. Vergleichende Untersuchungen an Fluß- und Seesedimenten sowie experimentelle Untersuchungen zeigten ausnahmslos ein deutlich erhöhtes Überlebenspotenzial von Fäkalkeimen in Sedimenten im Vergleich zum Wasserkörper, wobei dieses bei Enterokokken gegenüber E. coli noch ausgeprägter war. (Güde, 2001; Wessels et al., 2006; Gasse et al., 2006). Da diese Ergebnisse auf der Grundlage klassischer Nachweisverfahren erhalten wurde, stellt sich die Frage, ob in Sedimenten der Übergang zum VBNC-Stadium verlangsamt oder die Revitalisierung der VBNC Stadien erleichtert wird.

3.6 Zusammenfassung des Teilprojektes FZKa

Der Arbeitsplan des Teilprojekts FZKa umfasste die molekularbiologische Charakterisierung von Bakterienpopulationen in Baikal- und Bodensee mit Fokussierung auf Fäkalindikatoren wie Enterokokken. Beim Probentransport und der nachfolgenden Aufarbeitung traten jedoch Probleme mit Qualität und Quantität der extrahierten Ziel-DNA auf (siehe Kap. 3.2.3.). Diese konnten hinsichtlich der Erfassung der Enterokokken weitgehend gelöst werden. Populationsanalysen der gesamten Mikroflora waren allerdings nicht möglich. Es zeigte sich jedoch, dass die Fokussierung auf Enterokokken äusserst relevante Informationen ergab. Bei den Beprobungen am Baikalsee wurden deutlich mehr positive Befunde enterokokkaler DNA (16S rDNA) als kultivierbarer Enterokokken erzielt. Da die DNA-Befunde vorwiegend in grösseren Tiefen und weiterer Entfernung von Immissionstellen vorlagen, war die Hypothese ruhender, nicht kultivierbarer Enterokokken-Stadien naheliegend. Weitere Indizien für eine Elimination von Enterokokken wurden denn auch nicht gefunden. Ähnliche Befunde ergaben sich im Bodensee, wobei die molekularbiologischen Daten nicht völlig mit mikrobiologischen Daten abgeglichen werden konnten, die der ZV BWV nicht lieferte. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde mit dem Zuwendungsgeber eine grundlegende Änderung des Arbeitsplans vereinbart (siehe Kap. 5).


83

Laborexperimentelle Überprüfungen der Hypothese ergaben ein nachweisbares Potential von Enterococcus faecium-Isolaten aus Baikal- und Bodensee zu metabolischen Ruhestadien (viable but not cultivable = VBNC) unter Nährstoff- und Temperaturstress. Diese Ruhestadien konnten durch Nährstoffzugabe und Temperaturerhöhung wieder zum voll metabolisch aktiven, kultivierbaren Zustand überführt werden (Kap. 3.5.3.2). Die unbedingt notwendige Reproduzierbarkeit und Belastbarkeit solcher Daten erforderte die Entwicklung und Anpassung einer Vielzahl von Methoden zur Erfassung von Stressindikatoren, die bis dato nicht etabliert waren (Kap.3.5.2.). In enger Zusammenarbeit mit den russischen Partnern konnten unsere eigenen Laborversuche zu Stress und Reaktivierung von Enterokokken nicht nur bestätigt, sondern es konnten auch signifikante strukturelle Veränderungen in den Zellen während der verschiedenen physiologischen Stadien beobachtet werden (Kap. 3.5.3.2.). Insbesondere Verstärkungen der äusseren Zellwand und Schleimbildung könnten zur Persistenz der Zellen unter widrigen Milieubedingungen beitragen. Dieser Erkenntnis wurde sowohl durch methodische Entwicklungen zum Nachweis geeigneter Marker als auch durch die Beantragung eines Folgeprojekts Rechnung getragen.


84

4. Teilprojekt Uni Stuttgart

4.1. Ziel des Teilprojektes Ziel des Teilprojektes der Uni Stuttgart war die Entwicklung eines DNA-Microarrays zur Detektion von Cyanobakterien, insbesondere von Cyanotoxin produzierenden Microcystis Stämmen und dessen Anwendung zur Analyse von Wasserproben aus Bodensee und Baikal. Zusätzlich sollte ein Protokoll entwickelt werden, welches eine Vor-Ort-Hybridisierung des DNA-Microarrays ermöglichen sollte, um direkt am Baikalsee Cyanobakterien oder deren Toxingene zu identifizieren.

4.2. Erzielte Ergebnisse

4.2.1. Primer Design zur Amplifizierung der Ziel-DNA

Der erste Schritt auf dem Weg zur Entwicklung des DNA-Microarrays war die Wahl geeigneter Ziel-DNA-Abschnitte. Zur speziesspezifischen Identifikation eignet sich ribosomale DNA am besten. Da eine Klassifizierung von Bakterien über die ribosomale DNA eine gängige Methode ist, stehen umfangreiche Sequenzinformationen über diesen Genabschnitt zur Verfügung. Die Sequenzinformation der rDNA reicht allerdings nicht aus, um toxische und nicht toxische Cyanobakterien, z.B. der Spezies Microcystis aeruginosa voneinander zu unterscheiden. Daher haben wir ein weiteres Zielgen zur Detektion von toxischen Microcystis Stämmen herangezogen, das mcyA-Gen, dessen Produkt (Microcystin-Synthetase-A) direkt an der Synthese der hepatotoxischen Microcystine beteiligt ist und daher nur in Toxin produzierenden Stämmen vorkommt (Tillett et al. 2000), (siehe Abb. 52). Das mcyA-Gen ist Teil eines größeren, an der Microcystinsynthese beteiligten Gen-Clusters, welcher auch in anderen Microcystin produzierenden Familien konserviert ist, wie z.B. in Planktothrix Arten und ist daher besonders gut als Marker einsetzbar (Christiansen et al. 2003).

Um die korrekte Amplifikation der Zielgene zu testen mussten zunächst Cyanobakterien als Referenzmaterial angezüchtet und deren genomische DNA isoliert werden.


85

Abb. 52: Aufbau des Gen-Clusters der Microcystin Biosynthese (verändert nach Tillett et al. 2000).

4.2.2. Isolierung genomischer DNA aus Cyanobakterien Um cyanobakterielle Referenz-DNA für die PCR-Amplifikation und die anschließenden Microarray Experimente zur Verfügung zu haben, wurde eine Reihe relevanter Cyanobakterien im Lichtinkubator kultiviert (siehe Tabelle 9).

Tabelle 9: Am Institut für Technische Biochemie kultivierte cyanobakterielle Referenzstämme Gattung, Art Stammbe-

zeichnung Herkunft Toxizität Referenz

Synechococcus elongatus PCC 7942 USA - Grigorieva & Shestakov, 1976

Synechocystis PCC 6803 USA - Rippka et al., 1979 Microcystis aeruginosa NIES 89 Japan + M.H.Watanabe, 1981 Microcystis aeruginosa NIES 98 Japan - M.H.Watanabe, 1982 Microcystis aeruginosa NIES 102 Japan + M.H.Watanabe, 1982 Microcystis aeruginosa (ursprünglich wesenbergii)

NIES 107 Japan + M.H.Watanabe, 1981

Microcystis aeruginosa NIES 112 Japan - M.H.Watanabe, 1982 Cylindrospermopsis raciborskii NIES 991 Japan + D.Chonudomkul, 2001 Anabaena circinalis NIES 41 Japan + M.H.Watanabe, 1974 Nodularia, Cluster 1 PCC 73104 Kanada - Rippka et al., 1979 Nodularia PCC 7804 Frankreich + Rippka et al., 1966 Aphanizomenon flos-aquae NIES-1258 Japan - T.Sano, 2000 Aphanizomenon flos-aquae NIES 81 Japan - M.Watanabe, 1978

Die Isolierung cyanobakterieller DNA ist aufgrund der bei einigen Spezies sehr starken Zellwand eine besondere Herausforderung und meist nur durch sehr aufwendige Methoden möglich. Es wurden daher verschiedene Methoden zur Isolierung cyanobakterieller DNA erprobt und optimiert (siehe Abb. 53).


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Etabliert wurde ein Verfahren, welches sich sowohl zur Extraktion genomischer DNA von im Labor gezüchteten Referenzstämmen, als auch zum Aufschluss der aus den Wasserproben (Baikalsee und Bodensee) stammenden Zellen, eignet.

Die beste DNA-Ausbeute lieferte die Anwendung eines speziellen Natriumchlorat-Phenol-Chloroform Protokolls (siehe Abb. 53, Bande 2), welches sich allerdings nur bedingt für den Aufschluss von Umweltproben eignet, da es sehr material- und zeitintensiv ist (über 4 Stunden Arbeitsaufwand). Als viel praktikabler zeigte sich ein Gefrier-Tau-Zyklus, mit dem man ohne großen Arbeitsaufwand in weniger als 15 min, DNA beliebiger Mengen von Wasserproben (1-30 Stück) oder Referenzstämmen gleichzeitig aufschließen kann. Dieses Protokoll lieferte ausreichend genomische DNA für die nachfolgende PCR-Amplifikation (siehe Abb. 54). Es eignet sich außerdem besonders gut für die Extraktion der DNA von auf Mikrofiltern fixierten Cyanobakterien, wie sie durch die Filtration der Wasserproben am Baikalsee und Bodensee vorliegen.

4.2.3. Etablierung einer Multiplex-Amplifizierung der Zielgene 16S rDNA und mcyA

Bevor DNA von Umweltproben extrahiert und amplifiziert werden konnte, wurde die DNA aller zur Verfügung stehenden Referenzstämme amplifiziert. Sowohl die 16S rDNA aller Cyanobakterien, als auch das mcyA-Gen der toxischen

Abb. 53: Analytisches Agarosegel der verschiedenen Methoden zur genomischen DNA-Isolierung aus Cyanobakterien.M: 1kb Leiter, 1: Ultraschallaufschluß+DNeasy Kit von Qiagen, 2: NaClO4-Phenol-Chloroform-Aufschluß-Verfahren, 3: DNeasy Kit von Qiagen, 4: Nexttec Genomic DNA Kit, 5: DNeasy gram positive von Qiagen, 6: Gefrier-Tau-Zyklen mit flüssig-Stickstoff und 50°C Wasserbad

Abb. 54: Analytisches Agarosegel der PCR-Produkte von 16S rDNA (1500 bp Fragment) der obigen genomischen DNA-Isolate.Verfahren 2 (Phenol-Chloroform Aufschluß) liefert zwar die größte Ausbeute, ist aber nur bedingt für den Aufschluß von Umweltproben geeignet.Verfahren 6 (Gefrier-Tau-Zyklus) liefert ausreichendes PCR-Produkt und ist sowohl für Wasserproben, als auch Referenzstämme geeignet (siehe Pfeil).


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Cyanobakterienstämme konnte erfolgreich amplifiziert werden. Um eine maximale Ausbeute der PCR zu erzielen, wurden folgende Faktoren spezifisch an die benötigten Bedingungen angepasst und optimiert:

Temperatur und Zeit der Schmelz-, Anlagerungs- und Elongationsphasen; PCR-Zyklenzahl, Polymerasemenge und Salzkonzentration.

Die Optimierung der Anlagerungstemperatur anhand des 16S-rDNA-Fragments, und die Amplifizierung der mcyA-Gene von drei toxischen Referenzstämmen, sind in Abb. 55 dargestellt. Anschließend konnten beide Zielgene bei 55 °C Anlagerungstemperatur gleichzeitig mittels Multiplex-PCR amplifiziert werden.

Abb. 55: Analytische Agarosegele: (A) Optimierung der Anlagerungstemperatur durch Gradienten-PCR der mcyA-Toxingene. (B) Amplifikation des mcyA-Gens unter Verwendung der optimalen Temeratur von 55 °C, angewendet auf drei Toxin produzierende Referenzstämme.

4.2.4. Entwicklung des Cyano-Chips (DNA Microarray) Der erste Prototyp des Cyanochips bestand aus über 72 verschiedenen Sonden zur Detektion cyanobakterieller Gene. Davon dienten 34 Sonden der Detektion cyanobakterieller Gruppen und Familien, 30 Sonden der speziesspezifschen Detektion von Cyanobakterien und 8 Sonden der Detektion von Toxingenen (mcyA).

Die Sonden dieses Arrays wurden mit Hilfe aller zur Verfügung stehenden Referenzstämmen validiert. In der ersten Phase der Array Validierung wurden die Zielgene zunächst getrennt amplifiziert und auch getrennt voneinander mit den

A B


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Sonden hybridisiert, um eventuelle Kreuzhybridisierungen auszuschließen. Zur Validierung wurden 40 Arrays in Duplikaten (2 Arrays pro Slides) hybridisiert. Kreuzhybridisierungen zwischen den beiden Zielgenen und deren Sonden wurden nicht festgestellt. Um alle nachfolgenden Hybridisierungen von Referenzstämmen und die Untersuchungen der Wasserproben zu beschleunigen, wurde die zuvor entwickelte Multiplex-PCR eingesetzt, die es uns nun ermöglichte beide Zielgenabschnitte (16S-rDNA und mcyA) gemeinsam zu amplifizieren und hybridisieren.

Da sich im Bereich der Microcystis Gruppensonden einige Kreuzhybridisierungen zeigten, wurden diese Sonden entfernt und durch verbesserte Sonden ersetzt.

Der daraufhin entwickelte Cyano-Chip (Version 2) wurde außerdem um 46 weitere Sonden zur Speziesidentifikation erweitert. Hierbei handelte es sich hauptsächlich um Sonden zur Detektion von Synechococcus Spezies, die von unseren Projektpartnern am Limnologischen Institut in Irkutsk über viele Jahre aus dem Baikalsee isoliert und anschließend kultiviert worden waren. Durch diese Zusammenarbeit wurde es möglich die relevanten Referenzstämme und deren DNA-Sequenzen zu erhalten. Mit Hilfe dieser Sequenzdaten konnten ebenso 8 gruppenspezifische Sonden entwickelt werden, die es ermöglichten, die am Baikalsee gefundenen Synechococcus Spezies vom Rest der Gattung Synechococcus zu unterscheiden. Zusätzlich wurde der DNA-Microarray um Sonden zur Detektion von Enterococcus faecalis und Enterococcus faecium erweitert.

Alle neu entwickelten Sonden wurden mit Hilfe der zur Verfügung stehenden Referenz-DNA validiert und falls nötig wieder überarbeitet.

Der im Rahmen dieses Projektes entwickelte DNA-Microarray (Cyano-Chip), besteht nun in seiner optimierten Version (Version 5) aus 570 „Spots“. Diese setzen sich zusammen aus Prozesskontrollsonden, Sonden zur Detektion von Bakterien und Cyanobakterien allgemein, Gruppensonden zur Detektion verschiedener cyanobakterieller Gruppen (z.B. Microcystis, Anabaena, Synechococcus, Cylindrospermopsis, Nodularia), sowie Sonden zur spezifischen Detektion cyanobakterieller Spezies. Abschließend enthält der DNA-Microarray Sonden zur Detektion der Microcystingene, wie sie in toxischen, Microcystin produzierenden Cyanobakterien vorkommen. Jede Sonde wurde als „sense-„ und „antisense-“ Sonde in Triplikaten auf den Chip gedruckt. Ein Layout des DNA-Microarrays ist in Abb. 56 dargestellt.

Durch die, während des letzten Forschungsaufenthaltes in Irkutsk (August 2007), von den russischen Kollegen zur Verfügung gestellten Cyanobakterienkulturen, konnte auch das Verhalten der noch ausstehenden, nicht validierten, neu entwickelten Sonden getestet werden. Bei den Kulturen handelte es sich um 8 weitere Baikal Referenzstämme der Gattung Synechococcus, deren DNA vor Ort in Irkutsk isoliert werden konnte.


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Zusammen mit den in Stuttgart kultivierten Cyanobakterien, konnten inzwischen insgesamt über 150 Hybridisierungen des Arrays mit Referenz-DNA durchgeführt werden. Hierdurch wurden umfangreiche Informationen über das Verhalten jeder einzelnen Sonde erhalten, sowie über deren Spezifität und Sensitivität (siehe Abb. 72).

Abb. 56: Cyano-Chip Array-Layout. Die farblich gekennzeichneten und in Form von Rechtecken dargestellten Bereiche entsprechen jeweils einem Sondensatz (6 Spots), bestehend aus 3 Replikaten der Sense-und Antisende Sonde. In Orange sind Sonden zur Detektion ganzer phylogenetischer Gruppen dargestellt. Blaue Felder entsprechen Sonden zur Detektion von Cyanobakterien auf Speziesebene. Die in rosa dargestellen Felder markieren die Sonden, die zur Detektion der Microcystin Synthetase A verwendet werden. In rot umrahmte Felder gehören zu Sonden, die basierend auf der 16S rDNA, potentiell Toxin produzierende Organismen nachweisen können. Dunkelgrün gefärbte Bereiche markieren Sonden, welche zur Detektion von Enterokokken verwendet werden. S: Cy3-Spotting Kontrolle, B: Biotin-Spotting-Kontrolle, PH: Positive Hybridisierungkontrolle, NH: Negative Hybridisierungkontrolle, PC: Prozesskontrolle. Die Hybridisierungsignale der meisten Sonden sind eindeutig, und daher in der Lage die cyanobakteriellen Spezies genau zu detektieren. Obwohl alle Sonden, die mit Hilfe der Software ARB entwickelt wurden, in der Theorie (in silico) optimal funktionieren müssten, zeigt die Praxis, dass einige der Sonden doch Kreuzhybridisierungssignale geben. Außerdem sind Unterschiede in den maximalen


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Signalstärken jeder Sonde festzustellen, was häufig auf die Spezifität der Sonde zurückzuführen ist. Allerdings war auch zu beobachten, dass sich Sense- und Antisense Sonden, welche sich gleich verhalten sollten, in ihren positiven maximalen Signalstärken teilweise sehr unterschieden. Dies scheint besonders von der Position der Sonde in der Ziel DNA abhängig zu sein. Dieser Sachverhalt ist von DNA-Microarray-Daten aus anderen Projekten schon bekannt. Jede Sonde lässt sich trotzdem für sich gut auswerten (gute Diskriminierung zwischen positiver und negativer Fluoreszenssignalstärke), allerdings müssen dafür individuelle Grenzwerte (cut-offs), zur Unterscheidung von positiven und negativen Signalen, für jede Sonde einzeln festgelegt werden.

4.2.5. Mathematische Betrachtungen: ROC-Analyse Um für jede Sonde einen optimalen cut-off zu berechnen, wurden die Hybridisierungsergebnisse einer umfangreichen mathematischen Analyse unterzogen. Das mathematische Verfahren, welches zur Validierung aller Sonden und zur Festlegung individueller cut-offs herangezogen wurde, ist die ROC-Analyse (Receiver Operating Characteristics).

Hierzu haben wir auf der Basis von Microsoft Excel ein umfangreiches Softwaretool entwickelt, welches halbautomatisch, basierend auf über 100 Referenzexperimenten, ROC-Analysen für jede der Sonden durchführt. Die Software berechnet für jede Sonde eine ROC-Kurve (Abb. 57a), welche eine Aussage über die genaue Spezifität und Sensitivität der jeweiligen Sonde gibt. Ebenso lässt sich über die Berechnung der Fläche unterhalb der Kurve ein Bewertungskriterium für jede Sonde definieren. Je größer die Fläche, um so qualitativ hochwertiger ist die Sonde (=hohe Sensitivität und hohe Spezifität). Die schlechtesten Sonden wurden auf Basis dieser Werte eliminiert. Für alle anderen Sonden wurden individuelle cut-offs berechnet und diese für die Auswertung der DNA-Microarray-Daten verwendet. In Abb. 57b sind ROC-Kurven von 32 Sonden, der insgesamt 180 durchgeführten Berechnungen, dargestellt.

Abb. 57a: Beispiel einer Receiver Operating Characteristic (ROC); ROC-Kurve der Sonde SynPro_418_r; Fläche unter der Kurve: 0.9491, entspricht einer exzellenten (A) Sonde. Der optimale cut-off wurde hier bei 100 relativen Fluoreszenseinheiten berechnet.


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Abb. 57b: Ausschnitt (32 Sonden) der insgesamt 180 durchgeführten ROC-Analysen,


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4.3. Entwicklung eines portablen Formates zur Durchführung von DNA-Microarray-Experimenten vor Ort (Baikalsee/Schiff) bzw. im Feldversuch Ein weiteres Ziel war die Etablierung eines Verfahrens, welches es uns ermöglichen sollte, direkt vor Ort am Baikalsee (Forschungsstation) bzw. an Bord des Forschungsschiffs Analysen der Wasserproben durchzuführen.

Die bisher verwendeten Protokolle zur Hybridisierung von DNA-Microarrays konnten nur in gut ausgerüsteten Microarray-Laboren durchgeführt werden.

Insbesondere der für das Auslesen der Fluoreszensignale der Microarrays benötige sehr große konfokale Laserscanner macht den Einsatz von Microarray Experimenten im Feldversuch nahezu impraktikabel.

Eine transportable Alternative ist die Verwendung eines schwarz/weiß Array Scanners, wie z.B. dem handlichen Silverquant Scanner von Eppendorf. Um allerdings diese Art von Scanner verwenden zu können, mussten wir eine alternative DNA Markierungsmethode etablieren.

Anstelle DNA mit Fluoreszenzfarbstoffen zu markieren, haben wir ein Protokoll etabliert, welches Biotin-11-dUTP während der PCR-Amplifikation einbaut. Das Biotin-11-dUTP bietet sich insbesondere auch aus Kostenerparnisgründen an, da es mehr als um den Faktor 10 günstiger ist, als vergleichbare Biotin-Spacer-dNTPs (A,G,C,T) oder Fluoreszenz markierte dNTPs (Cy3, Cy5). Für eine Markierungs-PCR zeigte sich der Einsatz von Biotin-11-dUTP und dTTP im Verhältnis 1:1 (0,05 mM jeweils) als die beste Lösung. Alle anderen dNTPs wurden in einer Endkonzentration von 0,1 mM eingesetzt. Die Biotin markierte DNA konnte nun mit den Sonden des Cyano-Chips hybridisiert werden und anschließend mit Streptavidin-Gold/Silber nachgewiesen werden (Silverquant, Eppendorf). Das sich auf der Array-Oberfläche abscheidende Silber lässt sich durch Transmissionsmessungen mit dem Silberquantscanner detektieren.

Alle Arbeitsschritte im Ablauf eines Microarray-Protokolls wurden des Weiteren auf Zeit, Ausbeute und Robustheit hin optimiert, bzw. Verfahren durch andere ersetzt, die ohne großen Aufwand im Feldversuch durchführbar sind.

Die nötigen Arbeitsschritte konnten um 90 min verkürzt werden, ohne einen signifikanten Verlust der Sensitivität zu verzeichnen. Bevor das System am Baikalsee eingesetzt werden sollte, wurde es in einem leerstehenden Labor der Universität Stuttgart auf seine „Feldtauglichkeit“ getestet. In diesem Raum befanden sich nur die Materialen, die auch mit auf die Baikalexpedition (das Forschungsschiff) genommnen werden sollten. Auf diese Weise konnte sichergestellt werden, dass alle benötigten Materialen vorhanden waren. Um eventuell auftretende Fehlerquellen zu identifizieren und das System für einen Vor-Ort Einsatz robust zu machen, wurden 32 Arrays in Stuttgart mit Biotin markierter DNA hybridisiert und mit Hilfe des Silverquant Scanners ausgewertet. Diese Testreihe beinhaltete die Hybridisierung der DNA aller zu dem Zeitpunkt vorhandenen Referenzstämme, DNA der im März 2006 vom


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Limnologischen Institut in Irkutsk erhaltenen Synechococcus Stämme (BAC9810 und BAC9803), als auch DNA aus Umweltproben von Bodensee und Baikalsee (Expedition August 2005). Die Auswertung der Hybridisierungen zeigte, dass die Ergebnisse mit denen der fluoreszensmarkierten Arrays sehr gut zu vergleichen waren, und das System daher für den Einsatz am Baikalsee verwendet werden konnte.

Abb. 58: Beispiel eines mit Hilfe des Silverquant System markierten und in schwarzweiß eingescannten DNA-Microarrays. Eine anschließende Umwandlung in eine Falschfarbendarstellung dient der besseren Veranschaulichung der Signalintensitäten.

4.4. Durchführung von Feldexperimenten am Baikalsee auf der Forschungsstation in Bolshie Kotie und dem Forschungsschiff Vereshagin im August 2006 Auf der Forschungsreise an den Baikalsee im August 2006 konnte das transportable System erfolgreich vor Ort angewendet werden. Insgesamt wurden 48 Arrays auf 24 Slides hybridisiert und ausgewertet.

Um für die Experimente auf der Forschungsstation zusätzlich zu den Wasserproben auch Referenzmaterial zu haben, wurde vor Abreise zur Forschungsstation DNA von 10 weiteren cyanobakteriellen Referenzstämmen im Labor in Irkutsk isoliert. Es handelte sich dabei um DNA von Cyanobakterien, die in früheren Jahren aus dem Baikalsee isoliert worden waren und am Limnologischen Institut in Irkutsk als Referenzstämme kultiviert werden.

Zur weiteren Validierung der Sonden des DNA-Microarrays und zur Testung des Systems, wurden im Labor in Irkutsk zunächst 4 der Referenzstämme (BAC 98102,


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BAC9821, BAC9884 und BAC98105) mit dem Cyano-Chip analysiert, d.h. es wurde eine komplette Array-Hybridisierung, einschließlich der Daten-Auswertung erfolgreich durchgeführt.

An der Forschungsstation in Bolshie Kotie wurden Oberflächenwasserproben an drei Beprobungsstellen genommen (direkt vor der Forschungsstation, 500 m und 1000 m nördlich entlang der Uferlinie). Zusätzlich wurden zum Vergleich Benthosproben vor der Forschungssation von mit Grünalgen bewachsenen Steinen genommen (20 cm Wassertiefe).

Alle Wasserproben wurden anschließend durch 0.45 µm Filter abfiltriert. Die Benthosproben wurden zuvor durch 3 µm Filter von größeren Partikeln befreit. Nachfolgend wurden die Zellen mit 70% Ethanol auf den 0.45 µm Filtern fixiert und deren DNA mit Hilfe des Gefrier-Tau-Zyklus-Protokolls extrahiert. Die bakterielle DNA aller Wasserproben konnte danach erfolgreich amplifiziert, mit Biotin markiert und zur Hybridisierung der DNA-Microarrays verwendet werden.

Abschließend konnte während des zweitägigen Aufenthaltes auf dem Forschungsschiff Vereshagin die Anwendbarkeit des transportablen Systems an Bord gezeigt werden. Als Positivkontrolle für Toxingene, diente die vom Limnologischen Institut zur Verfügung gestellte DNA des Toxin produzierenden Stammes Microcystis aeruginosa CAL 972. Dessen Toxingene konnten erfolgreich an Bord nachgewiesen werden. Desweiteren konnten in allen Oberflächenproben Cyanobakterien nachgewiesen werden. Toxingene wurden in keiner der Wasserproben detektiert.

4.5. Baikalexpeditionen 2005, 2006 und 2007 In Tabelle 10 ist eine Zusammenfassung der auf den Expeditionen genommenen Wasserproben dargestellt:

Tabelle 10: Wasserproben Baikal 2005, 2006, 2007 Beprobungsstelle 2005

(Anzahl Proben) 2006 2007

Kultuk 1 3 Baikalsk 26 26 Listvyanka 2 4 4 Bolshie Kotie 41 Selenga River 15 10 CS South Baikal 14 24 CS Middle Baikal 17 16 Barguzin Bay 15 Chivyryki Bay 2 Olkhon Island 4 CS North Baikal 11 Severo-Baikalsk 7 Summe: 114 45 83 (2x) Gesamtzahl: 325 Wasserproben


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4.5.1. Expedition 2005: Die umfangreichste Beprobung des Baikalsees konnte im August 2005 mit Hilfe des Forschungsschiffs Vereshagin durchgeführt werden.

Insgesamt wurden 114 Wasserproben an 11 verschiedenen Beprobungsstellen genommen.

Die Beprobungsstellen erstreckten sich vom Süden des Baikalsees (Kultuk) bis in den Norden (Severo-Baikalsk). Zusätzlich zu Oberflächenwasserproben wurden auch Vertikalprofile an den Kontrollstation Süd-, Mittel- und Nord-Baikal bis zu Wassertiefen von 1650 m genommen.

4.5.2. Forschungsaufenthalt 2006: Während des Forschungsaufenthaltes 2006 konnte das zuvor in Stuttgart entwickelte transportable System zur Vor-Ort-Hybridisierung von DNA-Microarrays am Baikalsee getestet werden.

Da das Forschungsschiff in diesem Jahr nur für 2 Tage zur Verfügung stand, wurde das System zunächst auf der Forschungsstation in Bolshie Kotie getestet. Es konnte erfolgreich zur Analyse von Baikal-Wasserproben und Referenzstämmen aus Irkutsk eingesetzt werden.

Hierzu wurden Wasserproben aus der Bucht vor Bolshie Kotie gesammelt und abfiltriert.

Während des zweitägigen Aufenthaltes auf dem Forschungsschiff konnte die Anwendbarkeit des transportablen Systems an Bord gezeigt werden.

(Eine detaillierte Beschreibung der Experimente des Forschungsaufenthaltes ist im Abschnitt 4.4. dargestellt)

Abb. 59: Hybridisierung von DNA-Microarrays (Cyano-Chip) an Bord der MS Vereshagin, Harald Peter


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4.5.3. Forschungsaufenthalt Irkutsk / Expedition Baikalsee August 2007 Während der Expedition im August 2007 konnte der Baikalsee im Süden bis vor Olchon (Control Station Middle Baikal) beprobt werden. Die Wasserproben (83 Stück) die zur Untersuchung von Cyanobakterien genommen worden, wurden diesmal größtenteils in Duplikaten genommen, um Doppelbestimmungen durchzuführen. Dies war erst in diesem Jahr ohne größeren Aufwand möglich geworden, dank des Einsatzes des neuen Wasserprobennehmers („Rosetta Sampler“), welcher bis zu 24 Proben bei nur einem Tauchgang aufnehmen kann. Zur Ermittlung der Robustheit des Cyano-Chip-Systems, wurden an ausgewählten Stellen bis zu sechs Wasserproben genommen. Die Proben der Tiefenprofile wurden diesmal zusätzlich zur Filtrierung auch zur Zellzahlbestimmung verwendet, indem 50 ml mit 1 ml Formalin fixiert wurden. Außerdem wurden, zur späteren Zellmassebestimmung im Labor, von jeder Probe 500 ml mit Lugolscher Lösung fixiert. Die Auszählung der Zellen, welche sehr zeitintensiv ist, wurde von Irina Tikhonova und Anya Gladkikh am Limnologischen Institut in Irkutsk fortgesetzt. Im Labor wurde zusätzlich aus folgenden Baikal Referenzstämmen DNA isoliert, welche im letzten Jahr noch nicht zur Verfügung standen (BAC 22, BAC 103, BAC 39, BAC 11, BAC 18, BAC 9721 and BAC 9984).

4.6. Auswertung der Baikalseeproben von 2005, 2006 und 2007 Alle 114 Wasserproben, die im August 2005 am Baikalsee entnommen wurden, konnten nach der Hybridisierung inzwischen auch mit der jetzt zur Verfügung stehenden neuen Auswertemethode quantifiziert werden. Als Beispiel ist in Abb. 60 die Quantifizierung der Wasserproben des Tiefenprofils der Control Station South Baikal für Synechococcus Spezies dargestellt.

Abb. 60: Detektion von Synechococcus sp. bei Control Station South Baikal, 2005, als Dopppelbestimmung (Array 1 und Array 2). Die blaue Kurve stellt das Tiefenprofil dar

Synechococcus – Control Station South Baikal – absolute values – samplesize corrected


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Um alle relevanten Sondensignale eines Probennahmepunktes übersichtlich in einem Schaubild darzustellen, haben wir eine komprimierte Darstellungweise gewählt.

Die Signalstärke wird darin farblich in 4 Abstufungen prozentual zum maximalen Signal der Messreihe wiedergegeben. (Signalstärke: 80-100%=hellgrün, 20-80%=dunkelgrün, 1-20% =blassgrün, 0-1% bzw. unterhalb cut-off=weiß), (siehe Abb. 61).

Diese Darstellungsweise wurde etabliert, um die gesamte Dynamik jeder einzelnen Sonde hervorheben zu können. Da jede Sonde eine eigene maximale Signalstärke aufweist, welche mit ihrer Sensitivität korreliert, ist diese Art der Darstellung, gegenüber einer Darstellung reiner Fluoreszenssignale zu bevorzugen, da sonst sehr viel Information verloren gehen würde. Als Beispiel sind in Abb. 62 die Hybridisierungsergebnisse der wichtigsten Sonden der Wasserproben der Control Station South Baikal von 2005 dargestellt.

Abb. 61: Vereinfachte Darstellung der Sondensignale, für eine übersichtliche Zusammenfassung großer Datenmengen


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Eine Darstellung wie Abb. 62 wurde für jeden Beprobungsort am Baikalsee erstellt. Tabellen dieser Daten sind im Anhang in Kap. 9 aufgeführt.

Ein Überblick aller Beprobungspunkte der Baikalexpedition 2005 und deren Ergebnisse bezüglich Cyanobakterien, sind in Abb. 63, in der komprimierten Darstellungsform abgebildet.

Abb. 62: Komprimierte Darstellung der Hybridisierungssignale von Control Station South Baikal (Beprobung 2005)


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Abb. 63: Überblick aller Beprobungspunkte des Baikalsees 2005, und deren Wasseranalytik bezüglich Cyanobakterien


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Zusammenfassend konnte am Baikalsee cyanobakterielle DNA bis in 50 m Tiefe mit starken Signalen detektiert werden. Es handelt sich dabei hauptsächlich um DNA von Synechokokken, welche im Baikalsee dominieren. Dies konnte auch von unseren Projektpartnern am Limnologischen Institut in Irkutsk bestätigt werden (mikrobiologisch und mikroskopisch). Unterhalb von 50 m sind nur noch sehr schwache Signale für cyanobakterielle DNA zu erhalten, die ab 750 m ganz verschwinden. Die von uns entwickelten Sonden zur Unterscheidung von zwei Synechococcus Gruppen („upper“ und „lower“ Cluster), konnten beide Gruppen im Baikalsee detektieren. DNA des „upper Cluster“ wurde hauptsächlich in 10-15 m Tiefe detektiert und DNA des „lower Clusters“ in 15-25 m Tiefe. Dies konnte ebenso von unseren Projektpartnern in Irkutsk bestätigt werden, da die Cyanobakterien des „lower Clusters“ einen anderen Photokomplex zur Photosynthese verwenden, welcher Licht auch unterhalb von 15-25 m Tiefe noch verwerten kann. Es wurde weder DNA von toxischen Microcystin produzierenden Stämmen, noch von Microcystis Stämmen allgemein in den Wasserproben gefunden. Weitere potentiell toxische Cyanobakterien, wie Cylindrospermopsis raciborskii, oder Nodularia (PCC 3104, PCC 7804) wurden ebenfalls nicht gefunden. Die nicht toxischen Spezies Synechococcus elongatus PCC 7942 und Synechocystis sp. PCC 6803, wurden in keiner der Baikalproben nachgewiesen. Ribosomale DNA von Bakterien allgemein konnte in jeder Wassertiefe bis hin zu 1649 m Tiefe (CSMB) detektiert werden. Eine detailierte Darstellung der erhaltenen Sondensignale jeder Beprobungsstelle ist im Anhang zu finden.

4.7. Auswertung der Bodenseewasserproben: Cyanobakterielle DNA konnte am Bodensee in allen Wasserproben nachgewiesen werden. Die stärksten Signale wurden in den oberen 0-15 m detektiert. Schwächere Signale bis hin zu 30 m Wassertiefe. Im Vergleich zum Baikalsee, ist dies durch die schlechteren Lichtbedingungen im Bodensee (Schwebeteilchen) sehr gut erklärbar. Im Bodensee ist die Sichtweite, besonders nach Regenfällen, in 15 m Tiefe geringer als 1 m, so dass kaum noch Tageslicht in diese Tiefe gelangt. DNA von Synechokokken konnte bis 30 m Tiefe detektiert werden. Auch im Bodensee konnten beide Synechococcus Guppen („upper“ und „lower“ Cluster) detektiert und unterschieden werden. DNA des „upper“ Clusters in 10-15 m Tiefe (entsprechend dem Baikalsee), und des „lower“ clusters bis 20 m Tiefe.

Im Bodensee wurde in den analysierten Wasserproben keine DNA von toxischen Microcystis Stämmen detektiert. Ebenfalls konnten keine toxischen Cylindrospermopsis raciborskii Stämme oder Nodularia Arten im Bodensee gefunden werden. Ein Zusammenfassung aller mit Bodenseewasserproben durchgeführten Cyano-Chip Hybridisierungen, sind im Anhang, Kap. 9 dargestellt.


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Tabelle 11: Zusammenfassung der am Bodensee analysierten Wasserproben Beprobungsstelle Datum Anzahl Proben Bodensee Flüsse 11.5.2005 4 - Mündung Schussen 7.6.2005 13 - Mündung Argen 28.6.2005 4 - Mündung Stockacher Aach 26.7.2005 13 - Mündung Seefelder Aach 6.9.2005 4 Obersee + Untersee 20.9.2005 10 Überlinger See 11.10.2005 13 2.11.2005 14 6.12.2005 13 17.1.2006 10 18.1.2006 4 Summe: 102 In Abb. 64 sind die Ergebnisse der Probennahme vom 20. September 2005 des Überlinger Sees in der komprimierten Ansicht dargestellt. Eine Ausführliche Darstellung der absoluten (Cyanobakterien) Sondensignale derselben Wasserprobe ist in Abb. 65, zusammen mit einer Tiefenprofilkurve, gezeigt.

Abb. 64: Komprimierte Darstellung der Hybridisierungssignale vom Überlinger See (Tiefenprofil, 20. Sept, 2005)

Abb. 65: Absolute Fluoreszenssignalintensitäten der Cyanobacteriensonde Cya_358_f, des Tiefenprofils vom Überlinger See (20.9.2005). Verglichen wurden 2 getrennt hybridisierte Array-Experimente (Array 1 und 2).


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4.8. Nachweisgrenze, Sensitivität des Cyano-Chip-Systems Für die mikrobiologische Anwendung des DNA-Microarrays ist es wichtig die Detektionsgrenzen des Systems zu kennen.

Um den DNA-Microarray-Ergebnissen eine semi-quantitative Aussage zu geben, wurden umfangreiche Testreihen zur Bestimmung der Nachweisgrenze durchgeführt.

Hierzu wurden zunächst Konzentrationsreihen verschiedener cyanobakterieller Referenzstämme angesetzt und deren genaue Zellzahl mit Hilfe einer Tomakammer bestimmt. Anschließend wurde deren DNA mit Hilfe des Gefrier-Tau-Zyklus aufgeschlossen, amplifiziert und zur Hybridisierung des Cyano-Chips eingesetzt.

Um eine realistische Detektionsgrenze von toxischen Cyanobakterien zu erhalten, wurden des Weiteren Konzentrationsreihen von Cyanobakterien erstellt, die mit Baikalisolaten gemsicht wurden. So konnte die Nachweisgrenze vor dem Hintergrund der im Baikalsee vorhandenen DNA bestimmt werden. Dies wurde mittels Baikalproben verschiedener Tiefen durchgeführt.

Auf diese Weise lässt sich die Nachweisgrenze des gesamten Systems feststellen, da Faktoren wie Zellaufschluss-Ausbeute, PCR-Amplifikation, Aufreinigungsverluste und die Sensitivität des Arrays mit eingeschlossen sind.

Zur Bestimmung der Sensitivität des Arrays allein wurden zusätzliche Experimente mit Hilfe aufgereinigter DNA durchgeführt.

Der erste Schritt zur Bestimmung der Detektiongrenzen des Systems, war das Abstecken realistischer Cyanobakterienzahlen in Süßwasser allgemein, bzw. im Baikalsee.

Das am häufigsten vorkommende Cyanobakterium im Baikalsee, ist die endemische Art Synechocystis limnetica, welche einen Anteil von 10% des Pikoplanktons ausmacht. Es tritt in Größenordnung von 10 000 bis hin zu 100 000 Zellen/ml auf, in Abhängigkeit der Jahreszeit.

Im Sommer kann das APP (Autotrophe Pikoplankton), welches Cyanobakterien und Algen zwischen 0,2 bis 0,3 µm umfasst, am Baikalsee bis zu 1 Mio. Zellen/ml anwachsen.

Im Winter nehmen die Zellzahlen häufig bis zu 2 Zellen/ml ab.

Diese Größenordnungen (entsprechend, 2000 Zellen pro Liter) gelten allerdings als irrelevant klein.

Selbst die in manchen Sommern in diesen Größenordnungen in Süßwasser-reservoirs vorkommenden Microcystiszellen gelten nach Aussagen des Limnologischen Instituts Irkutsk, als nicht relevant (low abundance).


103

Basierend auf diesen Informationen wäre eine Detektionsgrenze oberhalb von 2000 Zellen pro Liter für das Array-System völlig ausreichend.

Die maximalen Zellzahlen von Cyanobakterien, die bei sog. Wasserblüten auftreten können, liegen teilweise bei 6.7*109 Zellen/ Liter, also 3,7 Mio. Zellen/ml, wie z.B. im Lake Sanctury, Pensilvania 1989 (Storch, T., 1990).

Zur Bestimmung der Detektiongrenze des DNA-Micorarray-Systems wurden Zellkonzentrationsreihen verschiedener Cyanobakterienstämme erstellt. Die Zellzahl wurde mit Hilfe einer Tomakammer genau bestimmt.

Die Ausbeute an DNA, welche mit verschiedenen Aufschlussverfahren erzielt werden konnte, wurde für jede Methode bestimmt (siehe Abb. 66).

Zellaufschluss - 9 ml - Microcystis viridis N102 [48,3 Mio. Zellen/ml]

0

10

20

30

40

50

60

70

Qiagen DNeasyTissue Kit

Gefrier-Tau-Zyklus + DNeasy

Phenol-Chloroform

NaClO4-Phenol-Chloroform

Aufschluss-Verfahren

DN

A-A

usbe

ute

[mg]

Zellaufschluss - 9 ml - Synechocystis PCC7942 [292,5 Mio. Zellen/ml]

010203040506070

Qiagen DNeasyTissue Kit

Gefrier-Tau-Zyklus + DNeasy

Phenol-Chloroform

NaClO4-Phenol-Chloroform

Aufschluss-Verfahren

DN

A-A

usbe

ute

[mg]

Abb. 66: DNA-Ausbeute verschiedener Zellaufschlussmethoden. Es wurden jeweils 9 ml Cyanobakterienkultur als Ausgangsmaterial eingesetzt. Die Zellaufschlüsse wurden abschließend alle in 100 µl H2O eluiert und deren DNA-Konzentration mit Hilfe eines Tropfenphotometers (Nandrop) bestimmt. Aufgrund der relativ zum Zeitaufwand großen Ausbeute des Gefrier-Tau-Zyklus, wurde dieses Verfahren für alle weiteren Experimente verwendet.

Anhand einer Microcystis viridis N102 Kultur, die bis zu einer Zelldichte von 48375 Zellen/µl kultiviert worden war, wurden vier Zellaufschlussverfahren getestet.

Zum Vergleich dazu wurden dieselben Aufschlussverfahren an einer Synechocystis Kultur getestet (PCC7942), dessen Zellen aufgrund ihrer dicken Zellwände viel schwieriger aufzuschließen sind. Diese Kultur hatte zum Zeitpunkt der Ernte eine Zelldichte von 292599 Zellen/µl.

Für jedes Verfahren wurden jeweils 9 ml Kultur verwendet. Alle Aufschlussprotokolle wurden doppelt durchgeführt.


104

Da alle weiteren DNA Isolierungen mit Hilfe des Gefrier-Tau-Zyklus Protokolls durchgeführt wurden, basieren alle folgenden Rechnungen auch auf mit dieser Methode erhaltenen DNA-Mengen.

Im Durchschnitt konnten aus 50*106 Zellen Stammkultur (Microcystis viridis N102), 2124,1 ng DNA isoliert werden. Rein rechnerisch, liegt dieser Wert mit einer angenommenen Genomgröße von 4,7 Mb, in der richtigen Größenordnung, von 257,5 ng DNA.

Aus 50*106 Zellen Synechococcus PCC7942 konnten im Durchschnitt 630 ng DNA isoliert werden. Rein mathematisch, basierend auf einer Genomgröße von 2,7 Mb, liegt das Gewicht des Genoms von 50*106 Zellen bei 148 ng.

Mit Hilfe der aus Microcystis viridis N102 isolierten DNA wurden Konzentrationsreihen entsprechend der zu detektierenden Zellzahlen erstellt. Für alle folgenden Sensitivitäts-Experimente wurde diese Konzentrationsreihe verwendet (siehe Tabelle 12). Der DNA-Konzentrationsbereichbereich der von Interesse ist, liegt zwischen 42,48 ng (=1 Mio. Zellen) und 0,42 pg (=10 Zellen). Da alle Umwelt-Wasserproben zunächst immer mit Hilfe von Mikroporenfiltern aufkonzentriert werden, würde eine Nachweisgrenze von zehn Zellen, zehn Zellen pro Liter bedeuten. Eine Nachweisgrenze zwischen 43 und 212 ng DNA, entspräche damit 1000 bis 5000 Zellen von Microcystis viridis, was ausreichend wäre.

Tabelle12: Microcystis viridis N102 – DNA Konzentrationsreihe nach Zellaufschluss

Ansatz Zellen Microcystis viridis N102 – DNA Konzentration experimentell rechnerisch experimentell erhaltene DNA-Mengen 50 000 000 412357518 2124 100 pg 1 1 000 000 8247150 42482 pg 2 100 000 824676 4248 pg 3 50 000 412338 2124 pg 4 10 000 82468 424,8 pg 5 5000 41234 212,4 pg 6 1000 8247 42,48 pg 7 100 825 4,248 pg 8 10 82 0,4248 pg

Wie viel Liter Wasser je Wasserprobe durch den Mikroporenfilter aufkonzentriert werden können, hängt stark vom Verschmutzungsgrad des Wassers ab. Je mehr Schwebeteilchen sich im Wasser befinden, umso schneller verstopfen die Poren des Filters. Da die Sauberkeit des Wassers am Baikalsee stark mit der Tiefe zunimmt, konnten in größeren Tiefen teilweise 5 bis sogar über 10 Liter Wasser durch einen Filter gesaugt werden. Dadurch kann bei Tiefenwasserproben die Nachweisgrenze des Systems noch um den Faktor 10 gesteigert werden.


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Tabelle 13: Synechocystis PCC7942 – DNA Konzentrationsreihe nach Zellaufschluss

Ansatz Zellen Synechocystis PCC7942 – DNA Konzentration experimentell rechnerisch experimentell erhaltene DNA-Mengen 50 000 000 224583765 664577 pg 1 1 000 000 4491493 13291 pg 2 100 000 449115 1329 pg 3 50 000 224389 664 pg 4 10 000 44912 132,9 pg 5 5000 22473 66,5 pg 6 1000 4491 13,29 pg 7 100 449 1,33 pg 8 10 45 0,133 pg

Die zur Bestimmung der Sensitivität verwendeten Konzentrationsreihen entsprachen den durch Zellaufschluss erhaltenen, experimentell bestimmten DNA-Mengen. Da sich diese Mengen geringfügig von rein mathematisch bestimmten Werten unterschieden, wurden beide Werte in die Tabellen mit aufgenommen. Die folgenden Berechnungen werden sich allerdings jeweils auf die mathematisch bestimmten Werte beziehen.

Basierend auf einer Genomgröße von 4.7 Mb für Microcystis viridis N102 berechnet sich das Gewicht eines Genoms zu 5,15 fg. Am Beispiel von Ansatz 6 würden 42,48 pg DNA somit rechnerisch 8247 Zellen entsprechen.

Berechnet man diese Werte für Synechocystis PCC7942 erhält man bei einer Genomgröße von 2.7 Mb, ein Gewicht von 2.96 fg pro Genom. Dadurch würden am Beispiel von Ansatz 6, die 13,29 pg einer Anzahl von 4491 Zellen entsprechen (siehe Tabelle 13).

Die DNA-Konzentrationsreihe diente als Ausgangsmaterial für die folgende Markierungs-PCR, welche nach Standard Protokoll durchgeführt wurde.

Abb. 67: (A) Analytisches Agarosegel zur Kontrolle der Markierungs-PCR. Amplifiziert wurde das 16S-rDNA und mcyA-Fragment, ausgehend von absteigenden Konzentrationen genomischer DNA. 43 ng – 0,43 pg DNA, entsprechend 8 Mio –

A B


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82 Zellen Microcystis viridis N102. (B) Am Spektrophotometer gemessene DNA-Konzentrationen nach PCR und Aufreinigung. Durch rein optische Analyse des Agarosegels konnte ein PCR-Produkt noch bis zu Ansatz 5 nachgewiesen werden, welches einer Ausgangskonzentration von 212 pg entspricht.

Zur genauen Quantifizierung der PCR-Produkte wurde jeder Ansatz aufgereinigt und dessen DNA-Konzentration spektrophotometrisch bestimmt.

DNA konnte noch bis Ansatz 8 in einer Konzentration von 5,9 ng/µl nachgewiesen werden. Die Schwankungen in den photometrischen Messungen in Ansatz 6-8 sind durch die sehr geringen DNA-Konzentrationen zu erklären, welche sich nahe der Detektionsgrenze des Spektrophotometers befanden (2 ng/µl).

Für die anschließenden Hybridisierungen wurde jeweils die gesamte PCR-Produktmenge verwendet (421 ng – 165 ng).

Abb. 68: Vergleich der absoluten Intensitäten der Sonden Cya_16S_378_f und EtcFae_f von 8 verschiedenen Arrays, die mit einer DNA Konzentrationsreihe von Microcystis viridis N102 hybridisiert worden waren.

Abb. 69: Vergleich der absoluten Intensitäten der Sondensätze von methyl_326 und EtcFae_183 von 8 verschiedenen Arrays, die mit einer DNA Konzentrationsreihe von Microcystis viridis N102 hybridisiert worden waren

Die Quantifizierung der Arraysignale zeigte, dass eine Diskriminierung zwischen positiven und negativen Signalen noch bis hin zu Ansatz 6 möglich war.


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Dies ist in Abb. 68 am Beispiel der Sonden Cya_16S_378_f und EtcFae_183_f gezeigt. Cya_16S_378_f wird zur Detektion von Cyanobakterien allgemein eingesetzt, wobei die Sonde EtcFae_183_f zum Nachweis von Enterokokken verwendet wird und hier zur Veranschaulichung als Negativ-Kontrolle dient. Ab Ansatz 7 (4,3 pg) können positive von negativen Signalen nicht mehr diskriminiert werden. Ausgehend von Ansatz 6 (43 pg) entspricht dies einer Nachweisgrenze von 8247 Genomäquivalenten Microcystis viridis N102. Bei einem durchschnittlichen Filtrationsvolumen von einem Liter und der Verwendung von 1/150 der DNA-Menge für die PCR können daher 1237 Zellen/ml Umweltprobe nachgewiesen werden.

In Abb. 69 ist am Beispiel des Sondensatzes von methyl_326 gezeigt, wo die Nachweisgrenze der Toxingene (Microcystin Synthetase A) liegt. Als Negativkontrolle wurde zum Vergleich der Sondensatz EtcFae_183 dargestellt. Hier konnte ebenso noch eine ausreichende Diskriminierung bis hin zu Ansatz 6 erreicht werden. Das Microcystingen kann daher noch in Wasserproben nachgewiesen werden, in denen sich 1237 Zellen/ml befinden.

Da jede Sonde eine andere maximale Signalstärke haben kann, beeinflusst dies auch ihre Sensitivität bei niedrigen DNA Konzentrationen. Jede Sonde hat daher auch eine eigene Detektionsgrenze. Eine wichtige Sonde zur Detektion von Microcystis Stämmen ist die Gruppensonde Micro_988_f, welche in Abb. 70 zusammen mit der Synechocystis Gruppensonde BAC_UG_584_f dargestellt ist.

Abb. 70: Vergleich der absoluten Intensitäten der Microcystis Gruppensonde Micro_988_f und der Synechocystis Gruppensonde BAC_UG_584_f von 8 verschiedenen Arrays, die mit einer DNA Konzentrationsreihe von Microcystis viridis N102 hybridisiert worden waren. Die Signale der Microcystis Gruppensonde konnten ebenfalls bis hin zu Ansatz 6 vom Hintergrund diskriminiert werden. Die Nachweisgrenze liegt damit auch bei 43 pg DNA oder 8247 Genomäquivalenten.

Um die Detektionsgrenze des Systems unter realistischen Umweltbedingungen zu testen, wurde außerdem die gleiche DNA-Konzentrationsreihe zusammen mit aus


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dem Baikalsee isolierter genomischer DNA amplifiziert. Hierzu wurde die aus 1 Liter Baikalseewasser isolierte gesamtgenomische DNA der Wasserprobe CSSB-5m (Control Station South Baikal aus 5 m Wassertiefe, 2005) verwendet. Diese Wasserprobe wurde ausgesucht, da das Vorkommen an Mikroorganismen in 1-5 m Wassertiefe am höchsten ist, und damit dem Experiment den höchsten Grad an Hintergrundsignalen liefert. Die reale Sensitivität des gesamten Systems würde dann zwischen der mit diesem Experiment und der mit Referenzstämmen allein durchgeführten ermittelten Sensitivität liegen.

Die Anzahl an Cyanobakterien der Wasserprobe CSSB-5m (2005) wurde am Limnologischen Institut in Irkutsk mikroskopisch auf 249750 Zellen/ml bestimmt (249 Mio. Zellen pro Liter) (Belykh, Tomberg, 2005). In der Umweltprobe wurden keine Microcystisstämme nachgewiesen.

Abb. 71: Oben: Vergleich der absoluten Intensitäten der Microcystis Gruppensonde Micr_610_f und der Bakteriensonde Bacteria_343_f von 8 verschiedenen Arrays, die mit einer DNA Konzentrationsreihe von Microcystis viridis N102 und DNA der Umweltprobe CSSB-5m (2005) hybridisiert worden waren. Unten: Zum Vergleich die Sonde methyl_326_f zum Nachweis des Microcystingens (mcyA). Die Hybridisierung der mit Microcystis viridis N102 gemischten Umweltprobe CSSB-5m (2005) ergab eine Detektionsgrenze von 2124 pg DNA (Ansatz 3) für die Sonde Micr_610_f, welche zur Detektion von Microcystisstämmen allgemein eingesetzt wird. Dies entspricht rechnerisch einer Zellzahl von 412 338 Zellen.

Die Sonde methyl_326_f zur Detektion des Microcystingens (mcyA) ist noch sensitiver. Hier lässt sich sogar bis Ansatz 5 (212,4 pg) ein Signal im Hintergrund der Umweltprobe detektieren. Mit einem festgelegten cut-off-Wert dieser Sonde von 300 Fluoreszenseinheiten liegt die Detektionsgrenze allerdings bei Ansatz 4 und damit bei 424 pg DNA, was 82468 Zellen entspricht. Da in diesem Experiment 5 µl der insgesamt 1500 µl DNA-Lösung der Umweltprobe für die PCR eingesetzt wurden,


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entspricht dies, ausgehend von 249 Mio. Cyanobakterien/Liter der Umweltprobe, einer Anzahl von 830 000 Genomäquivalenten DNA. Vergleicht man die Nachweisgrenze mit dieser Zellzahl ergibt sich an Anteil von 9,9%.

Tabelle 14: Zusammenfassung der Sensitivitätsexperimente 1 und 2. Ansatz Vor PCR

eingesetzte DNA-Menge

Nach PCR erhaltene und zur Hybridisierung eingesetzte

DNA-Menge

Durchschnittliche Signalstärken der für

Microcystis relevanten Sonden

DNA von N102 Experiment 1 (N102)

Experiment 2 (N102+Bkgrd)

Exp. 1 (N102)

Exp. 2 (N102+Bkgrd)

1 42482 pg 347,3 ng 420,0 ng 14212 5942 2 4248 pg 264,5 ng 419,8 ng 5652 1500 3 2124 pg 236,9 ng 287,5 ng 5153 791 4 424,8 pg 200,1 ng 448,5 ng 2087 320 5 212,4 pg 172,5 ng 430,1 ng 1404 186 6 42,4 pg 140,3 ng 328,9 ng 383 116 7 4,2 pg 177,1 ng 453,1 ng 10 94 8 0,4 pg 135,7 ng 349,6 ng 95 94

In Tabelle 14 sind zusammenfassend die Detektionsgrenzen beider Experimente (1. Microcystis viridis N102 Referenz; 2. Microcystis mit Baikal Hintergrund DNA) dargestellt. Die Nachweisgrenzen sind rot umrandet hervorgehoben und basieren auf einem cut-off-Wert von 300.

Die Nachweisgrenze des Systems für Microcystisstämme konnte hieraus zu folgenden Werten bestimmt werden: Für Reinkulturen und Tiefenwasserproben liegt die Nachweisgrenze bei 42 pg DNA (8 247 Genomäquivalenten), wohingegen in Oberflächenwasser mit hohen Hintergrundbakterienkonzentrationen die Nachweisgrenze für toxische Microcystisstämme im Durchschnitt bei 424 pg DNA Eingangsmaterial liegt (82 468 Genomäquivalente).

Die Nachweisgrenze für die am Baikalsee sehr häufig vorkommenden Synechococcus Cyanobakterien wurde zu 66 pg DNA bestimmt (22 473 Genomäquivalente), siehe Tabelle 5.

Die Anzahl der Cyanobakterien am Baikalsee schwankt in den Sommermonaten zwischen 13 Mio. – 500 Mio. Zellen/Liter in den oberen 1-10 Metern. Sie nimmt dann stark mit der Tiefe ab, wobei in 100 m Tiefe teilweise noch bis zu 700 000 Zellen/Liter gezählt werden konnten. In 500 m Tiefe können mikroskopisch nur noch selten und vereinzelt Zellen nachgewiesen werden.

Die Sensitivität des Systems ist daher sowohl für Oberflächewasserproben, als auch für Tiefenwasserproben völlig ausreichend. Bei einer durchschnittlichen Filtrationsmenge von 5 Litern bei Tiefenwasserproben, verbessert sich die


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Sensitivität noch um den Faktor 5. Die Detektionsgrenze des Systems liegt dadurch in Tiefenwasserproben bei 4500 Genomäquivalenten. Da allerdings jeweils nur 1/150 (10 µl aus 1500 µl) der isolierten DNA für eine PCR eingesetzt werden, kommt man rechnerisch auf 674 Zellen/ml [(22473 Zellenx150)/5000 ml)].

4.9. Bestätigung der Funktionalität des Cyano-Chips anhand relevanter Referenzstämme In Abb. 72 sind die wichtigsten der über 150 durchgeführten Validierungs-Hybridisierungen dargestellt. Die zur Hybridisierung eingesetzte DNA wurde entweder aus Referenzstämmen der am Limnologischen Institut in Irkutsk vorhanden Stammsammlung isoliert, oder aus am Institut für Technische Biochemie in Stuttgart kultivierten Referenzstämmen der japanischen NIES-Kollektion oder des Institute Pasteur in Paris (PCC). Alle Stämme konnten mit Hilfe der optimierten Sonden korrekt ihren phylogenetischen Gruppen oder Spezies zugeordnet werden.

Abb. 72: Ausschnitt der über 150 durchgeführten Referenzexperimente. Alle Referenzstämme konnten korrekt identifiziert und den richtigen phylogenetischen Gruppen oder Spezies zugeordnet werden.

4.10 Zusammenfassung Teilprojekt Universität Stuttgart Im Rahmen dieses Projektes wurde am Institut für Technische Biochemie (Universität Stuttgart) ein DNA-Micorarray zur Detektion von Cyanobakterien in Wasserproben entwickelt. Er konnte erfolgreich zur Analyse von Wasserproben aus

fluorescent signal intensity in % of maximal value


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Bodensee und Baikalsee eingesetzt werden. Bei der Entwicklung wurde ein besonderer Fokus auf die Detektion von Cyanotoxinen gelegt, insbesondere von lebertoxischen Microcystinen, die in verschiedenen cyanobakteriellen Gruppen vorkommen können. Deren Auftreten in Seen und Trinkwasserreservoirs stellt weltweit ein großes Gefahrenpotential dar. Um diese Cyanobakterien nachzuweisen, wurde ein Verfahren zur schnellen Isolierung ihrer genomischen DNA aus Wasserproben entwickelt. Als Zielgen zur speziesspezifischen Identifikation wurde ein Abschnitt der 16S rDNA verwendet. Zur Detektion der Toxingene wurde das mcyA-Gen verwendet, welches für die Microcystin-Synthetase-A codiert, die an der Biosynthese von Microcystinen beteiligt ist. Die Entwicklung einer robusten Multiplex-PCR ermöglichte uns die gleichzeitige Amplifizierung beider Zielgene, wodurch die für die anschließende Array-Hybridisierungen benötigen DNA-Mengen aus den Wasserproben in weniger als einer Stunde erhalten werden konnten. Der von uns entwickelte DNA-Microarray (Cyano-Chip) besteht nun in seiner optimierten Version aus 570 „Spots“. Diese setzen sich zusammen aus Prozesskontrollsonden, Sonden zur Detektion von Bakterien und Cyanobakterien allgemein, Gruppensonden zur Detektion verschiedener cyanobakterieller Gruppen (z.B. Microcystis, Anabaena, Synechococcus, Cylindrospermopsis, Nodularia), sowie Sonden zur spezifischen Detektion cyanobakterieller Spezies. Abschließend enthält der DNA-Microarray Sonden zur Detektion der Microcystingene, wie sie in toxischen, Microcystin produzierenden Cyanobakterien vorkommen. Jede Sonde wurde als „sense-„ und „antisense-“ Sonde in Triplikaten auf den Chip gedruckt. Alle Sonden wurde basierend auf Referenzexperimenten validiert und deren Auswertung mit Hilfe einer im Rahmen dieses Projektes entwickelten Software-Tools auf maximale Sensitivität und Spezifität optimiert. Es handelt sich bei dem Tool um eine in Microsoft Excel integrierte ROC-Analyse (Receiver Operating Characteristic), die in der Lage ist jede einzelne Sonde zu bewerten, und ihr für die Datenauswertung optimierte individuelle Grenzwerte (cut-offs) zuzuweisen. Nur Sonden mit optimalen Bewertungskriterien wurden für die abschließende Datenanalyse verwendet. Des Weiteren wurde ein transportables DNA-Microarray-Protokoll entwickelt, um das System auch im Feldversuch am Baikalsee (Foschungsstation) oder auf einem Forschungsschiff einsetzen zu können. Es erfüllte dabei alle nötigen Ansprüche eines robusten Systems, ohne dabei an Sensitivität oder Spezifität zu verlieren. Hierzu haben wir ein Protokoll etabliert, welches Biotin anstelle von Fluoreszenzfarbstoffen während der PCR-Amplifikation in die Ziel-DNA einbaut. Nach der Hybridisierung kann diese DNA auf der Arrayoberfläche mit Hilfe von an Streptavidin gebundenen Goldnanopartikeln und einer anschließenden Anlagerung von Silber nachgewiesen werden. Das Auslesen der Arrays wurde mit einem transportablen, kommerziell erhältlichen Scannersystem durchgeführt (Silverquant, Eppendorf). Das transportable Protokoll konnte erfolgreich vor Ort am Baikalsee zur Analyse von Wasserproben, als auch von Referenzstämmen getestet werden (Baikal Expedition 2006). Hierdurch ist ein Vor-Ort-Einsatz, ohne einen aufwendigen Probentransport in ein voll ausgerüstet Labor möglich geworden. Zur Ermittlung der Detektionsgrenzen des Arraysystems wurden umfangreiche Experimente mit Konzentrationsreihen von Referenzstämmen durchgeführt. Hierdurch konnte die Sensitivität jeder einzelnen Sonde ermittelt werden. Zusätzlich wurde die Nachweisgrenze des Systems unter Berücksichtung der Hintergrundsignale des Baikalsees in verschiedenen Tiefen ermittelt. Die maximale Nachweisgrenze des Arrays wurde zu 42,4 pg DNA Ausgangsmaterial (vor PCR)


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bestimmt, was rechnerisch ca. 8000 Genomäquivalenten (Zellen Cyanobakterien) entspricht. Unter Berücksichtigung der durch die verschiedene Proben-vorbereitungsschritte (Filtration, DNA Isolierung, Aufkonzentration) potentiell auftretenden Sensitivitätsverluste, konnte die Detektionsgrenze des gesamten Systems im Durchschnitt zu 674 Zellen/ml Wasserprobe bestimmt werden. Insgesamt wurde der Cyano-Chip zur Analyse von über 420 Wasserproben aus Baikalsee und Bodensee eingesetzt, die auf Expeditionen in den Jahren 2005-2007 genommen worden waren. Um diese Menge an Daten in einer übersichtlichen Form darstellen und auswerten zu können, wurde eine vereinfachte Darstellungsform der Arraysondensignale entwickelt, die dennoch alle relevanten Informationen enthält. Zusammenfassend konnte am Baikalsee cyanobakterielle DNA bis in 50 m Tiefe mit starken Signalen detektiert werden. Es handelte sich dabei hauptsächlich um DNA von Synechokokken, welche am Baikalsee dominieren. Unterhalb von 50 m konnten nur noch schwache Signale detektiert werden. Dies konnte auch mikrobiologisch durch unsere Projektpartner am Limnologischen Institut in Irkutsk bestätigt werden. Am Bodensee konnte cyanobakterielle DNA nur bis in Tiefen von 15 m nachgewiesen werden (schwache Signale bis 30 m Tiefe). Dies ist durch die schlechteren Lichtbedingungen im Bodensee (Schwebeteilchen) zu erklären. In keiner der Wasserproben, weder vom Baikal, noch vom Bodensee, konnten Microcystingene nachgewiesen werden. Ebenso wurden keine Microcystis Stämme detektiert. Die Wasserproben wurden außerdem auf die toxischen Cyanobakterien Cylindrospermopsis raciborskii und Nodularia sp. hin untersucht, welche ebefalls nicht nicht detektiert werden konnten. Der in diesem Projekt entwickelte Cyano-Chip kann in Zukunft für weitere Populationsstudien von Cyanobakterien und zu Gewässeruntersuchungen, insbesondere von Microcystingenen eingesetzt werden.


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5. Teilprojekt ZV BWV

Bis zum Zeitpunkt der Abfassung des vorliegenden Abschlussberichts lagen seitens des ZV BWV weder gemäss des bewilligten Arbeitsplans auswertbare Daten noch ein Abschlussbericht vor. Proben und Datenmaterial zur Durchführung der Stressversuche mit E. faecium-Isolaten aus dem Bodensee wurden uns freundlicherweise von Dr. Hans Güde, LUBW Baden-Württemberg, Langenargen, zur Verfügung gestellt.

6. Diskussion des Gesamtergebnisses

Das Projekt „Vergleichende molekularbiologische und mikrobiologische Untersuchung der Wasserqualität von Bodensee und Baikalsee unter dem Aspekt der Trinkwasseraufbereitung“ wurde mit der Arbeitshypothese begonnen, dass im oligotrophen Baikalsee chemische oder biologische Eliminationsmechanismen für Fäkalkeime vorliegen müssen, die aufgedeckt und nach Möglichkeit auf andere trinkwasserliefernde Gewässer wie den Bodensee übertragen werden und zur naturnahen Reinigung beitragen sollten. Postuliert wurden enzymatische (durch autochthone Bakterien), lytische (durch Phagen) oder toxische (z.B. durch Cyanotoxine) Effekte. Der grundlegende Prozess, nämlich eine vollständige Elimination von Fäkalkeimen wie Enterokokken im Baikalsee, der bis dato durch mikrobiologische Untersuchungen belegt wurde, bei denen keine Enterokokken detektiert werden konnten, erwies sich jedoch bereits bei der ersten Untersuchungsreihe (Expedition 2005) als unzutreffend.

6.1 Kultivierbare Enterokokken und enterokokkale DNA

Bei den Probenahmen im Baikalsee (Expeditionen August 2005 und September 2007) wurden etwa doppelt soviel positive Befunde für enterokokkale 16S rDNA erzielt als für auf Nährmedien kultivierbare Enterokokken. Während die DNA-Befunde vorwiegend in grösseren Entfernungen (bis zu mehreren km) von den Einleitungsstellen und in grösseren Tiefen (mehrere Hundert m) erzielt wurden, waren kultivierbare Enterokken vorwiegend in der Nähe von Abwassereinleitungen (z.B. Kultuk, Baikalsk) oder bei Mündungen belasteter Fliessgewässer wie der Selenga oder dem Barguzin-Fluss zu finden. Ausserdem wurden diese Ergebnisse vorwiegend im oberflächennahen Wasser erzielt. Besonders bemerkenswert war, dass deutliche DNA-Signale bis in die Tiefe des Sees (unterhalb 1500 m) detektiert werden konnten. Die Ergebnisse aus Bodensee-Proben konnten nicht ganz eindeutig ausgewertet werden, da die mikrobiologischen Daten von der ZV BWV nicht an die Partner weitergegeben wurden. Auch hier bestätigte sich jedoch, dass enterokokkale


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16S rDNA in Tiefen bis 60 m und auch in weiterer Entfernung von belasteten Zuläufen detektiert werden konnte. Der Nachweis von DNA bedeutet nicht zwangsläufug, dass auch intakte Zellen in der probe vorliegen. Freie DNA wird jedoch gemeinhin im Wasser relativ schnell abgebaut, so dass bei Vorliegen spezifischer DNA-Abschnitte wie im vorliegenden Fall von enterokokkenspezifischer 16S rDNA mit ungeschädigter Basensequenz von DNA aus noch intakten, unlysierten Zellen ausgegangen werden kann. Nicht entschieden werden kann, ob diese Zellen tot oder noch lebend sind. Für das Vorliegen intakter lebensfähiger Zellen sprachen auch die Ergebnisse der Expedition von 2007, bei der aufgrund höherer Wassertemperaturen etwa 20% mehr positive Befunde für kultivierbare Enterokokken als in 2005 gefunden wurden. Sedimentuntersuchungen im Baikalsee im September 2007 ergaben keine weiteren positiven Befunde, jedoch war der Probenumfang für entsprechende Untersuchungen auch vergleichsweise gering. Aufgrund des weiten Transports der Baikalproben und der eingeschränkten Möglichkeiten für aufwendigere molekularbiologische Untersuchungen vor Ort (sowohl an Baikal- als auch an Bodensee) mussten weiterführende Experimente im Labor in Karlsruhe mit Enterokokken-Isolaten aus den jeweiligen Habitaten vorgenommen werden. Die Felduntersuchungen an Baikal- und Bodensee widerlegten also die Arbeitshypothese einer vollständigen Elimination von Fäkalindikatoren und damit auch von daran beteiligten natürlichen Eliminationsmechanismen.

6.2 Cyanobakterien:

Die für die Cyano-Chip-Entwicklung relevanten Beobachtungen wurden zusammen mit den Ergebnisse in Kapitel 4.2 bis 4.8 ausführlich diskutiert. Die mit Hilfe des Cyano-Chips erhaltenenen molekularbiologischen Ergebnisse lassen sich hervorragend mit denen klassischer mikrobiologischer Methoden vergleichen. Durch die Verwendung des Cyano-Chips entstand zusätzlich ein großer Zeitvorteil, so dass Ergebnisse schon nach 4 Stunden an Bord des Forschungsschiffs erhalten werden konnten. Ein direkter Vergleich der 2005 erhaltenen Mikrobiologischen Daten mit denen des Cyano-Chips, zeigt sogar eine Übereinstimmung in den absoluten Signalen. Die höchsten Signale für Cyanobakterien konnten in 10-15 m Wassertiefe erhalten werden (vergleiche Abb. 60 und 61). Dies konnte ebenfalls mikrobiologisch bestätigt werden (siehe Abb. 73, (Belykh et al. 2007).


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Das erhöhte Auftreten an Cyanobakterien in 10-15 m Wassertiefe ist ein bekanntest Phänomen. Die größte Anzahl an Cyanobakterien ist nicht, wie zu erwarten wäre, direkt an der Wasseroberfläche anzutreffen, wo die höchsten Lichtintensitäten sind, sondern etwas unterhalb des Lichtstärksten Bereiches. Die Cyanobakterien ziehen sich in diese Wasserschichten zurück, um sich vor der starken UV-Strahlung zu schützen. Auch dieser Unterschied in der Cyanobakterienkonzentration konnte mit Hilfe des Cyano-Chips detektiert werden. Schwankungen in den Cyanobakterienzahlen sind meist nur in den oberen Wasserschichten festzustellen, und relativ konstant in Wasserschichten unterhalb von 20 m. Dieser Sachverhalt konnte ebenfalls mikrobiologisch und molekularbiologisch bestätigt werden und ist auf die geringe Wasserdurchmischung in diesen Tiefen zurückzuführen. In den oberen Wasserschichten hingegen wirken sich Regenfälle und Wind stärker aus, was zu einer verstärkten Durchmischung dieser Wasserschichten führt. Tiefenprofile, die nach Regenfällen genommen wurden weisen meist höhere Cyanobakterienkonzentrationen in den oberen Wasserschichten auf. Die nach klassischen Zellzahlbestimmungen durchgeführten Wasseruntersuchungen wurden meist nur bis in 50 m Tiefe durchgeführt, da unterhalb dieser Grenze nur noch sehr geringe Mengen an Cyanobakterien vorkommen. Die Sensitivität des Cyano-Chips ist auch für diese Zellzahlen noch ausreichend (bis ca. 700 Zellen/mL),

Abb. 73: (A) Vertikale Verteilung der Cyanobakterien an den 3 Kontrollpunkten Süd-, Mittel-, und Nord-Baikal, im August 2005, mittels Zellzahlbestimmung nach Standardmethode (Belykh et al. 2007) (B) Im Vergleich dazu die absoluten Intensitäten einer Cyanobakteriensonde eines DNA-Microarray-Experiments, ebenso Listyanka-Tankhoi (CSSB), vom August 2005

A A B


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wobei in diesem Bereich die Signalstärken nur noch schwach oberhalb der Grenzwerte liegen und somit deutlich von Wasserproben mit höheren Zellzahlen zu unterscheiden sind. Bezogen auf Cyanotoxine konnten auch mit Hilfe der klassischen Methoden keine toxischen Microcystisstämme nachgeweisen werden. Dies bestätigt die mit dem Cyano-Chip erhaltenenen Daten. Die Vorkommen von Synechococcus Stämmen, welche hauptsächlich mit Hilfe des Cyano-Chips detektiert wurden, konnten auch mikrobiologisch, bzw. mikroskopisch bestätigt werden. Ebenso konnte das überwiegende Auftreten der kurzen Synechococcus Formen im Gegesatz zu S. elongatus mikrobiologisch bestätigt werden. Die toxischen Spezies C. raciborskii und Nodularia sp. wurden sowohl mit Hilfe des Cyano-Chips, also auch mit Standardmethoden nicht detektiert.

Der Cyano-Chip kann daher in Zukunft sehr gut für eine schnelle und semi-quantitative Untersuchung von Cyanobakterienpopulationen in Umweltwasserproben, bzw. für eine Überwachung von Gewässern hinsichtlich Microcystingenen eingesetzt werden.

6.3 VBNC: Versuchsergebnisse der Labors Karlsruhe und Irkutsk

Aufgrund der in 6.1 diskutierten Daten der Felduntersuchungen wurden intensive Experimentalreihen in den Labors Karlsruhe und Irkutsk durchgeführt. Ziel war es, die potentielle Fähigkeit von Enterokokken, speziell Enterococcus faecium, aus Baikal- und Bodensee, unter Stress in Ruhestadien zu fallen, zu beweisen und die Möglichkeit zur Reaktivierung dieser Ruhestadien zu überprüfen. Als Stressfaktoren wurde die Einleitung abwasserbürtiger Enterokokken in den kalten oligotrophen Baikalsee mittels Nährstoffmangel (Trinkwasser) und niedriger Temperatur (6 – 9°C) simuliert.

Paralleluntersuchungen von Koloniebildung, Gehalt an 16S rDNA, Gesamtzellzahl und Zahl atmungsaktiver Zellen ergaben unter Nährstoff- und Kältestress eine schnelle Abnahme von metabolisch aktiven Zellen bei Koloniebildung und Atmungsaktivität, während der DNA-Gehalt konstant blieb (Abb. 47). Das mikroskopische Bild ergab zwar eine relative Abnahme der Gesamtzellzahl, es waren jedoch im Lichtmikroskop und ESEM morphologisch intakte, wenn auch deutlich verkleinerte Zellen ersichtlich (Abb. 44). Unsere Ergebnisse aus dem Karlsruher Labor konnten von den russischen Kolleginnen bestätigt werden. Darüberhinaus wurde in Irkutsk nachgewiesen, dass bei höherer Temperatur angezüchtete Enterokokken nach Kältestress weniger gut reaktiviert werden können als solche, die bereits bei niedrigeren Temperaturen kultiviert wurden (Abb. 49): Dies könnte bedeuten, dass Enterokokken aus verhältnismässig frischen Kontaminationen zumindest teilweise unter Stress absterben, während sich länger adaptierte persistenter verhalten.

Bei diesen Versuchsreihen konnte erstmals nachgewiesen werden, dass auch E. faecium zu VBNC-Stadien und Reaktivierung fähig ist, was bislang nur für den


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weniger umweltrelevanten E. faecalis nachgewiesen war (Lleo et al.). Für E. faecalis sind auch bereits molekularbiologisch detektierbare Stressmarker wie der Anstieg der pbp5-Expression (Lleo et al.) etabliert, deren Hochregulierung bei E. faecium nicht abläuft. Es ergab sich dadurch die Notwendigkeit, Stressmarker für E. faecium und andere Fäkalkeime zu identifizieren und geeignete Nachweismethoden zu entwickeln. Durch die Etablierung der Intact Cell-MALDI-ToF-Massenspektrometrie im Karlsruher Labor und der Transmissionselektronenmikroskopie im Labor Irkutsk konnten signifikante Veränderungen in der Zellstruktur bei Enterokokken im Ruhestadium und nach Reaktivierung nachgewiesen werden (Abb. 50 und 51). Diese betreffen offenbar besonders die Zellwand und Schleimexkretionen, die möglicherweise besonders zur Persistenz der bakterien unter widrigen Umweltbedingungen beitragen. Neben einer Reihe von neu etablierten Methoden wie Lebend-tot-Diskriminierungen wird daher derzeit im Karlsruher Labor intensiv nach spezifischeren Nachweismethoden für Zellwandveränderungen geforscht. Im Mittelpunkt stehen Nachweismethoden für Veränderungen des PBP-Musters (zellwandinterne Proteine) sowie der Peptidoglycanschicht (Methoden nicht Bericht aufgeführt). Parallel hierzu werden in einer laufenden Dissertation geeignete Stressgene und deren Expression untersucht.

6.4 Fazit und Perspektiven

Das im vorliegenden Bericht aufgeführte Projekt ergab völlig unerwartete, aber wissenschaftlich und hygienisch hochrelevante Ergebnisse. Als Fazit ergibt sich: 1. Fäkalkeime wie Enterokokken werden bei Einleitung und Aufenthalt im Baikalsee nicht vollständig eliminiert, sondern persistieren dort bis in grosse Tiefen als metabolisch inaktive, aber lebensfähige Ruhestadien. Ähnliche Beobachtungen gelten für den Bodensee.

2. Natürliche Eliminationsmechanismen wie Toxine (Cyanotoxine) konnten nicht nachgewiesen werden.

3. In Laborexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass Enterokokken im Ruhestadium durch geeignete Milieubedingungen wieder zur metabolisch voll aktiven und vermehrungsfähigen Formen reaktiviert werden können.

4. Enterokokken. die diese Stadien durchlaufen haben, weisen strukturelle Veränderungen auf, die möglicherweise zu ihrer Persistenz beitragen.

5. Es wurde eine Vielzahl neuer Methoden entwickelt und etabliert, die Stressmarker nachweisen können.


118

6. Es wurde eine anwendungsreife Nachweismethodik für Cyanobakterien inkl. Toxinbildner als Chip-Technologie entwickelt und erprobt. Sie wurde erfolgreich mit Hilfe relevanter Referenzstämmen validiert und auf 420 Umweltproben aus Baikalsee und Bodensee angewendet. Die Ergebnisse lassen sich mit denen von Standardmethoden vergleichen, stehen allerdings in viel kürzerer Zeit zur Verfügung.

Die denkbaren Folgen aus diesen Erkenntnissen sind eminent, da reaktivierbare Ruhestadien hygienisch relevanter Bakterien auch in anderen Wasserkörpern und bei der Trinkwasseraufbereitung denkbar sind.

Da Folgen eines VBNC-Zustands eine erhöhte Toleranz gegenüber lebensfeindlichen Umweltbedingungen sowie eine gesteigerte Persistenz gegenüber Bioziden und Desinfektionsmaßnahmen sein können [Oliver 2005], kann das Auftreten von VBNC-Enterokokken auch unmittelbare Auswirkungen auf die Aufbereitung von Trinkwasser haben, bei der durch Entzug von Nährstoffen, Abkühlung etc. vergleichbare Bedingungen zum Baikal geschaffen werden. In der internationalen Literatur sind hierzu nur relativ wenige, ausschließlich unter Laborbedingungen durchgeführte Experimente aufgeführt. Die Wasserversorgung und die öffentliche Gesundheitsüberwachung haben das Problem der bakteriellen VBNC-Stadien offenbar noch nicht perzipiert und dementsprechend weder experimentelle Untersuchungen durchgeführt noch Überlegungen dazu angestellt.

In Anbetracht der Notwendigkeit mikrobiologisch stabilen Wassers während der Wasserverteilung halten wir als unmittelbare Perspektive Untersuchungen zum potentiellen VBNC-Zustand von Fäkalbakterien während der Trinkwasseraufbereitung sowie die Entwicklung von Vermeidungsstrategien für unabdingbar.

Ein zusätzlicher Aspekt, der bei dieser Fragestellung einzukalkulieren wäre, ist die Bildung und das Vorhandensein von VBNC-Stadien hygienisch relevanter Bakterien im Sediment der für die Trinkwassergewinnung genutzten Gewässer. Die Gewässersedimente könnten in diesem Fall ein Reservoir für fäkale und pathogene Bakterien darstellen, die im Zusammenhang mit Sturmereignissen wieder in das Freiwasser und damit auch in den hygienischen Kreislauf wieder eintreten könnten. Vergleichende Untersuchungen an Fluß- und Seesedimenten sowie experimentelle Untersuchungen zeigten ausnahmslos ein deutlich erhöhtes Überlebenspotenzial von Fäkalkeimen in Sedimenten im Vergleich zum Wasserkörper, wobei dieses bei Enterokokken gegenüber E. coli noch ausgeprägter war. (Güde, 2001; Wessels et al., 2006; Gasse et al., 2006). Da diese Ergebnisse auf der Grundlage klassischer Nachweisverfahren erhalten wurde, stellt sich die Frage, ob in Sedimenten der Übergang zum VBNC-Stadium verlangsamt oder die Revitalisierung der VBNC Stadien erleichtert wird.


119

7. Zusammenfassung

In einem gemeinsamen Projekt von Forschungszentrum Karlsruhe, Limnologischem Institut der RAS in Irkutsk, der Universität Stuttgart sowie des Zentralverbands der Bodenseewasserversorgung (ZV BWV) wurde die Frage untersucht, durch welchen natürlichen Prozess Fäkalbakterien in oligotrophen und für die Trinkwasserversorgung genutzten Gewässern wie dem Baikalsee eliminiert werden. Als hygienisch wichtige Vertreter der Fäkalbakterien wurden Enterokokken gewählt, Untersuchungen von biogenen Toxinen, lytischen Enzymaktivitäten und Phagen sollten mögliche natürliche Eliminationsvorgänge erklären. Da geplant war, die verantwortlichen Prozesse nach Möglichkeit auf den Bodensee zu übertragen, wurden entsprechende Untersuchungen am Bodensee einbezogen.

Da für derartig komplexe Untersuchungen neue Methodenansätze erforderlich waren, wurde eine ganze Reihe molekularbiologischer Techniken für das Projekt optimiert bzw. neu entwickelt. Während in Karlsruhe vor allem Extraktion und Methoden zum Nachweis enterokokkaler DNA an die Verhätnisse angepasst wurden, konnte in Stuttgart erfolgreich ein neuartiger DNA-Micorarray zur Detektion von Cyanobakterien in Wasserproben entwickelt werden. Bei dieser Entwicklung wurde ein besonderer Fokus auf die Detektion von toxigenen Spezies gelegt, insbesondere auf Produzenten lebertoxischer Microcystine, die in verschiedenen cyanobakteriellen Gruppen vorkommen können. Nach abgeschlossener Etablierung konnte der Array erfolgreich zur Analyse von Wasserproben aus Bodensee und Baikalsee eingesetzt werden. Darüberhinaus wurde ein transportables DNA-Microarray-Protokoll entwickelt, um das System auch im Feldversuch am Baikalsee (Foschungsstation) oder auf einem Forschungsschiff einsetzen zu können.

Bereits bei der ersten Expedition am Baikalsee wurde klar, dass in den See eingetragene Enterokokken nicht vollständig eliminiert, sondern in einen grösstenteils inaktiven Dauerzustand versetzt wurden. Dies wurde durch Nachweis von entsprechenden DNA-Sequenzen bis 1500 m Tiefe sowie auch durch das Fehlen der erwarteten natürlichen Eliminationsfaktoren (z.B. Cyanotoxine) untermauert. Weitere Probenahmen in den folgenden Jahren bestätigten die Hypothese. Bei den Bodensee-Untersuchungen wurden ähnliche Phänomene beobachtet, konnten jedoch nicht durch mikrobiologische Untersuchungen abgesichert werden, die vom ZV BWV nicht zur Verfügung gestellt wurden.

In nachfolgenden, sehr umfangreichen Laborexperimenten konnte nachgewiesen werden, dass neben E. faecalis auch E. faecium zu einem solchen Dauerstadium nebst Reaktivierung fähig ist. Zur Absicherung dieser Untersuchungen wurde ein umfangreiches Methodenspektrum entwickelt, das für weitergehende Untersuchungen bakterieller Stressstadien zur Verfügung steht. Sowohl Methoden als auch Untersuchungsergebnisse wurden intensiv mit den russischen Partnern ausgetauscht, wobei vor allem molekularbiologische Methoden von den deutschen Partnern in Irkutsk eingearbeitet wurden. Experimente mit E. faecium-Isolaten aus


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Baikal- und Bodensee bestätigten die Fähigkeit zu Ruhestadien und Reaktivierung, wobei distinkte Veränderungen in der molekularen Struktur der Zellen beobachtet wurden. Obwohl die Veränderungen noch nicht eindeutig chemisch identifiziert werden konnten, deuten sie auf eine erhöhte Persistenz der gestressten Zellen gegenüber schädlichen Umwelteinflüssen hin. Da dies erheblichen Einfluss z.B. auf die Desinfektionseffizienz bei der Trinkwasseraufbereitung haben kann, halten wir vertiefende Untersuchungen für unabdingbar.


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130 9. Anhang 9.1 FZKa 9.1.1. Beprobungsplan Expedition Baikalsee 2005

sampling point depth acronym date time depthruss.

Stellenbez.Cl. perfringens1ml

Cl. perfringens10ml

Cl. perfringens 50ml

Cl. perfringens 100ml

Kultuk (south point) K surface K-S 19.08.2005 07:20 0 m 1 0 0 5 sewage pond (Baikalsk) 19.08.2005 2 1 4 35 Baikalsk west BW near surface BW0-S 19.08.2005 15:00 0 m 3 0 0 0

near ground BW0-G 19.08.2005 70 m 4 0 0 1

1.5 km surface BW1-S 19.08.2005 15:20 0 m 5 0 0 0

near ground BW1-G 19.08.2005 143 m 6 0 0 0

3 km surface BW3-S 19.08.2005 15:50 0 m 7 0 0 0

near ground BW3-G 19.08.2005 290 m 8 0 0 0

4.5 km surface BW5-S 19.08.2005 16:35 0 m 9 0 0 0

near ground BW5-G 19.08.2005 10 0 0 0

6 km surface BW6-S 19.08.2005 17:25 0 m 11 0 0 0

near ground BW6-G 19.08.2005 689 m 12 0 0 0

Baikalsk east 1 BE1 near surface BE10-S

near ground BE10-G

1.5 km surface BE11-S 19.08.2005 20:50 0 m 19 0 0 0

near ground BE11-G 19.08.2005 220 m 20 0 0 0

3 km surface BE13-S 19.08.2005 20:30 0 m 17 0 0 0


131

near ground BE13-G 19.08.2005 295 m 18 0 0 0

4.5 km surface BE15-S 19.08.2005 19:40 0 m 15 0 0 0

near ground BE15-G 19.08.2005 364 m 16 0 0 0

6 km surface BE16-S 19.08.2005 18:40 0 m 13 0 0 0

near ground BE16-G 19.08.2005 696 m 14 0 0 0


Stellenbez. Cl. perfringens1ml

Cl. perfringens10ml

Cl. perfringens50ml

Cl. perfringens100ml

Baikalsk east 2 BE2 near surface BE20-S

near ground BE20-G

1.5 km surface BE21-S 19.08.2005 21:15 0 m 21 0 0 0

near ground BE21-G 19.08.2005 58 m 22 0 1 0

3 km surface BE23-S 19.08.2005 21:35 0 m 23 0 0 0

near ground BE23-G 19.08.2005 130 m 24 0 0 0

4.5 km surface BE25-S 19.08.2005 22:00 0 m 25 0 0 0

near ground BE25-G 19.08.2005 263 m 26 0 0 0

6 km surface BE26-S 19.08.2005 22:40 0 m 27 0 0 0

near ground BE26-G 19.08.2005 256 m 28 0 0 1

Listvyanka L Angara river outflow surface L-S 28.08.2005 109 0 (0/700ml)

110 0 Selenga river SR 29-43


132 effluent Ust-Kharauz 1 km surface SR1-S 21.08.2005 00:30 42 1 1 4

near ground SR1-G 21.08.2005 43 0 0 4

3 km surface SR2-S 20.08.200524:00:

00 40 0 2

near ground SR2-G 20.08.2005 41 0 2

5 km surface SR3-S 20.08.2005 23:30 38 0 1

near ground SR3-G 20.08.2005 39 1 1

7 km surface SR4-S 20.08.2005 23:00 35 0 0 in 25mL 1 5 m SR4-5 20.08.2005 36 1 0

near ground SR4-G 20.08.2005 28 m 37 0 0

10 km surface SR5-S 20.08.2005 22:20 32 0 5 m SR5-5 20.08.2005 33 0

near ground SR5-G 20.08.2005 100 m 34 2

14.5 km surface SR6-S 20.08.2005 21:30 29 0 5 m SR6-5 20.08.2005 30 1

near ground SR6-G 20.08.2005 270 m 31 0


Stellenbez. Cl. perfringens1ml

Cl. perfringens10ml

Cl. perfringens50ml

Cl. perfringens100ml

control station South

Baikal CSSB

trans-sect. Listvyanka-Tankhoj (L-T) 0 m CSSB-0

95 0

5 m CSSB-5 96 1 10 m CSSB-10 97 0 25 m CSSB-25 98 0 50 m CSSB-50 99 0 100 m CSSB-100 100 0 200 m CSSB-200 101 0


133 400 m CSSB-400 102 0 600 m CSSB-600 103 0 800 m CSSB-800 104 0

1000 m CSSB-1000 105 0

1200 m CSSB-1200 106 0

1300 m CSSB-1300 107 0

1400 m CSSB-1400 108 0

Barguzin Bay BB auf vielen Platten, schwärmendes Wachstum mit Schwarzfärbung (und Geruch (Proteus?)

station 1 surface BB1-S 22.08.05 11:00 0 m 73 0 0

near ground BB1-G

station 2 surface BB2-S 22.08.2005 10:30 0 m 71 0 3

near ground BB2-G 5 m 72 0 2

station 3 surface BB3-S 22.08.2005 10:00 0 m 69 0

near ground BB3-G 11 m 70 0

station 4 surface BB4-S 22.08.2005 09:30 0 m 66 2 5 m BB4-5 5 m 67 0







Stellenbez. Cl.

perfringens1ml Cl.

perfringens10ml Cl.

perfringens50ml

Cl. perfringens100

ml


134 control station Middle Baikal CSMB

trans-sect. Ukhan-Tonkij (U-T) 0 m CSMB-0 21.08.2005 09:30 44 0

5 m CSMB-5 21.08.2005 16:10 45 0 10 m CSMB-10 21.08.2005 16:00 46 0 25 m CSMB-25 21.08.2005 16:00 47 0 50 m CSMB-50 21.08.2005 15:40 48 0 100 m CSMB-100 21.08.2005 15:30 49 0 200 m CSMB-200 21.08.2005 14:30 50 0 400 m CSMB-400 21.08.2005 13:40 51 0 600 m CSMB-600 21.08.2005 13:00 52 0 800 m CSMB-800 21.08.2005 11:40 53 0

1000 m CSMB-1000 21.08.2005 15:10 54 0

1200 m CSMB-1200 21.08.2005 14:00 55 0

1300 m CSMB-1300 21.08.2005 14:00 56 0

1400 m CSMB-1400 21.08.2005 13:40 57 0

1500 m CSMB-1500 21.08.2005 12:00 58 0

1649 m CSMB-1649 21.08.2005 11:00 59 0

Small Sea/ Olkhon Island SS point 1 surface SS1-S 25.08.2005 15:30 91 0 Chuzir 5 m SS1-5 92 0 point 2 surface SS2-S 25.08.2005 18:40 93 0 vor Mrs point 3 surface SS3-S 25.08.2005 19:10 94 0 nach Durchgang small sea Izhimey Cape (Slava) IC

Severo-Baikalsk/ Nizhveangarsk SB


135 station 1 depth 1 SB1-S 24.08.2005 09:10 88 1 river Nishne Angara station 2 depth 1 SB2-S 24.08.2005 15:30 89 0 Severobaikalsk depth 2 SB2- station 3 depth 1 SB3-S 24.08.2005 18:00 90 0 river Reel/Baikalskoje depth 2 SB3-

station 4 depth 1 SB4-S 24.08.2005 08:30 86 1 1 km vor Nishne Angarsk depth 2 SB4-G 87 0


Stellenbez. Cl.

perfringens1ml Cl.

perfringens10ml Cl.

perfringens50ml

Cl. perfringens100

ml control station North Baikal CSNB

trans-sect. Davsha-Elokhin (D-E) 0 m CSNB-0 23.08.2005 11:35

76 0

5 m CSNB-5 23.08.2005 12:05 77 0 10 m CSNB-10 23.08.2005 12:20 78 0 25 m CSNB-25 23.08.2005 12:30 79 0 50 m CSNB-50 23.08.2005 12:35 80 0 100 m CSNB-100 23.08.2005 12:45 81 0 200 m CSNB-200 23.08.2005 13:10 82 0 400 m CSNB-400 23.08.2005 13:30 83 0 600 m CSNB-600 23.08.2005 14:00 84 0 800 m CSNB-800 23.08.2005 14:30 85 0 Chivyrkyi Bay CB 22.08.2005 19:00 hot springs surface CB-S 74 0 5 m CB-5 75 0


136

9.1.1.1. Enterokokkale DNA Baikal-See Expedition 2005 Baikal-Beprobung August 2005 PCR-Nr.

russ. Nr. Acronym

Enterococcus KBE/100mL Taqman GPL813TQ

PCR 23SOF/985R

1 K Probe nicht vorhanden

2 1 K-S 16 pos. 39 pos. 3 2 Absetzbecken 42 ≥50 pos. 4 3 BW0-S 0 39,7 pos. 5 7 BW3-S 1 pos. 42 (neg.) 6 8 BW3-G 0 pos. 40 pos. 7 14 BE16-G 0 pos. 40 pos. 8 19 BE11-S 12 ≥50 pos. 9 20 BE11-G 1 ≥50 pos.

10 21 BE21-S 10 ≥50 (neg.) 11 23 BE23-S 15 ≥50 neg 12 25 BE25-S 10 ≥50 neg 13 28 BE26-G 0 pos. 43,5 pos. 14 29 SR6-S 0 neg. 43,6 (neg.) 15 31 SR6-G 0 pos. 44 (neg.) 16 33 SR5-5 0 pos. 44 neg 17 39 SR3-G 0 pos. 33 neg 18 40 SR2-S 0 >40 neg 19 42 SR1-S 22 neg. 39,4 neg 20 48 CSMB-50 0 pos. 41 fragl. pos. 21 50 CSMB-200 1 ≥50 pos. 22 65 BB5-G 67 ≥50 (neg.) 23 71 BB2-S 13 ≥50 neg 24 BB river pos. 33 neg 25 74 CB-S 0 pos. 43 (neg.) 26 75 CB-5 0 pos. 41 neg 27 78 CSNB-10 0 neg. 35 neg 28 82 CSNB-200 3 ≥50 (neg.) 29 88 SB1-S 2 ≥50 neg 30 89 SB2-S 0 pos. 44 31 90 SB3-S 4 ≥50 pos. 32 91 SS1-S 2 ≥50 33 96 CSSB-5 24 ≥50 (neg.) 34 99 CSSB-25 0 pos. 41 pos. 35 102 CSSB-150 0 pos. 43 (neg.) 36 105 CSSB-750 0 pos. 42 pos. 37 CB surface II neg 38 CB-5m II pos.

39 pos. Kontr. Piper '2' (1.

PCR) pos. 40 NTC (1. PCR) (neg.)

PCR-Nr.

russ. Nr. Acronym

Enterococcus KBE/100mL Taqman

PCR 23SOF/985R


137

41 4 BW0-G 0 >40 (neg.) 42 5 BW1-S 0 >40 (neg.) 43 6 BW1-G 0 >40 (neg.) 44 9 BW5-S 0 >40 neg. 45 10 BW5-G 0 >40 pos. 46 11 BW6-S 0 >40 neg. 47 12 BW6-G 0 >40 pos. 48 13 BE16-S 0 >40 neg. 49 15 BE15-S 0 >40 (neg.) 50 16 BE15-G 0 >40 pos. 51 17 BE13-S 0 >40 neg. 52 18 BE13-G 0 >40 (neg.) 53 22 BE21-G 0 >40 pos. 54 24 BE23-G 0 >40 55 26 BE25-G 0 >40 pos. 56 27 BE26-S 0 >40 neg. 57 30 SR6-5 0 >40 pos. 58 32 SR5-S 0 >40 (neg.) 59 34 SR5-G 0 >40 pos. 60 35 SR4-S 0 >40 pos. 61 36 SR4-5 0 >40 neg. 62 37 SR4-G 0 >40 neg. 63 38 SR3-S 0 >40 neg. 64 41 SR2-G 0 >40 neg. 65 43 SR1-G 0 >40 neg. 66 44 CSMB-0 0 >40 67 45 CSMB-5 0 >40 neg. 68 46 CSMB-10 0 >40 (neg.) 69 47 CSMB-25 0 >40 pos. 70 49 CSMB-100 0 >40 pos. 71 51 CSMB-400 0 >40 pos. 72 52 CSMB-600 0 >40 pos. 73 53 CSMB-800 0 >40 pos. 74 54 CSMB-1000 0 >40 pos. 75 55 CSMB-1200 0 >40 pos. 76 56 CSMB-1300 0 >40 (neg.) 77 57 CSMB-1400 0 >40 pos. 78 58 CSMB-1500 0 >40 fragl. pos.

79 pos. Kontr. Piper '2'

(1.PCR) pos. 80 NTC (1. PCR) neg.

81 pos. Kontr. Piper '2' (

2.PCR) pos. 82 NTC (2. PCR) neg.


138 9.1.2. Beprobungsplan Baikal Expedition 2007 near ground: direkt über der Sedimentsäule genommen aerob Kultuk Vol.mL date poresize Sedimente bereich name 1 surface Kultuk 2 near bottom 500 15. Aug 45 PrepMan 1cm PM_Kultuk S1

3200m near bottom 500 22

Baikalsk left

4 0km surface 1L 45 Baikalsk left transect 1 cm 0km S2 5 near bottom 250 ölig 22

6 1km surface 1l 45 1cm 1 km S3 7 near bottom 1l ölig 45

8 2km surface 250 2µ 1cm 2km S4 9 near bottom 250 2µ

10 3km surface 250 2 1cm 3km S5 BL PM 3km S5

11 near buttom 250 2µ

12 6km surface 500 BL6kmsurf 45 1cm S6 BL PM 6km S6

13 near buttom 500 45 Baikalsk central BC Xkm surf/NeBot

14 1 km surface 1L 1cm S7 15 near buttom

16 2km surface 750 1cm S8 17 near buttom 500

18 3km surface 750 1cm S9 19 near buttom 200

20 6km surface 750 45 1cm S10


139 21 near buttom 750 45

Baikalsk right

22 1km surface 750 45 1cm S11 23 near buttom 500 45

24 2km surface 1L 45 1cm S12 25 near buttom 250 45



17.08.2007 Volumen

Selenga S-km-Tiefe Tiefe 14,5 km S-14-X

30 0 750 45 1cm S15 31 5 750 45 32 270 (Wasser frei) 1000 45

S-10-X 10 km

33 0 600 45 1 cm S16 34 5 750 45 35 near ground(100) 100 45


140 S-5-X 5 km

36 0 600 45 1 cm S17 37 25 (near ground) 500 45

S-1-X 1 km

38 0 500 1cm S18 39 5 (near ground) 500

Ukhan-Tonky UT-X Tiefe Volumen poresize

40 0 750 45 41 5 650 45 42 10 650 45 43 25 1000 45 44 50 1000 45 45 100 1000 45 46 200 900 20 47 400 1000 20 48 600 1000 20 49 800 1000 20 50 1000 1000 20 51 1200 1000 20 52 1300 1000 20 53 1400 konnte nicht beprobt werden 54 1500 konnte nicht beprobt werden

55 1649(near ground) 250 45 1cm S19


141 56 iol bubbles 0 1200 45 1cm S20


142

9.1.2.1. enterokokkale DNA Baikal-See, Expedition 2007 Enterokokken Kultuk Vol.mL date 23S0F/985R 1 surface 2 near bottom 500 15. Aug

3 200m near bottom 500

Baikalsk left

4 0km surface 1L 5 near bottom 250 ölig

6 1km surface 1l 7 near bottom 1l ölig

8 2km surface 250 9 near bottom 250

10 3km surface 250 11 near buttom 250

12 6km surface 500 BL6kmsurf 13 near buttom 500

Baikalsk central BC Xkm surf/NeBot

14 1 km surface 1L 15 near buttom pos.

16 2km surface 750 pos. 17 near buttom 500 pos.

18 3km surface 750 19 near buttom 200 pos.


Baikalsk right


24 2km surface 1L 25 near buttom 250



143


17.08.2007 Volumen

Selenga Tiefe 14,5 km

30 0 750 45 31 5 750 45 32 270 (Wasser frei) 1000 45 pos.

10 km

33 0 600 45 34 5 750 45 35 near ground(100) 100 45 pos.

5 km

36 0 600 45 37 25 (near ground) 500 45

1 km

38 0 500 39 5 (near ground) 500

Ukhan-Tonky Tiefe Volumen poresize

40 0 750 45 pos. 41 5 650 45 42 10 650 45 43 25 1000 45 44 50 1000 45 45 100 1000 45 46 200 900 20 pos. 47 400 1000 20 pos. 48 600 1000 20 pos. 49 800 1000 20 50 1000 1000 20


144

51 1200 1000 20 52 1300 1000 20

53 1400konnte nicht beprobt werden

54 1500konnte nicht beprobt werden

55 1649(near ground) 250 45 pos.

56 iol bubbles 0 1200 45 Sedimente Ort Entfernung [km] Tiefe S1 Kultuk S2 Baikalsk left 0 near ground S3 Baikalsk left 1 near ground S4 Baikalsk left 2 near ground S5 Baikalsk left 3 near ground S6 Baikalsk left 6 near ground S6 Baikalsk central 0 near ground S7 Baikalsk central 1 near ground S8 Baikalsk central 2 near ground S9 Baikalsk central 3 near ground S10 Baikalsk central 6 near ground S11 Baikalsk right 1 near ground S12 Baikalsk right 2 near ground S13 Baikalsk right 3 near ground S14 Baikalsk right 6 near ground S15 Selenga 14,5 near ground S16 Selenga 10 near ground S17 Selenga 5 near ground S18 Selenga 1 near ground pos. S19 Ukhan-Tonky 1649

9.1.3. enterokokkale DNA Bodenseeproben, Beprobungsplan

Probe Datum Filtrations-menge Kürzel Enterokokken

KBE/100mL

Taqman GPL

813TQ

PCR 23SOF/985R

1 Schussen 08.03.2005 500 mL Schus 03/05 518 neg. 2 Argen 08.03.2005 900 mL Argen 03/05 76 neg. 3 Seefelder Aach 08.03.2005 500 mL Seef A 03/05 272 neg. 4 Stockacher Aach 08.03.2005 500 mL StockA 03/05 196 neg. 5 Schussen 11.05.2005 400 ml Schus 05/05 250 neg. 6 Argen 11.05.2005 600 mL Argen 05/05 150 neg. 7 Seefelder Aach 11.05.2005 600 mL Seef A 05/05 120 neg. 8 Stockacher Aach 11.05.2005 600 mL StockA 05/05 280 neg.


145

9 Schussen 29.06.2005 300 mL Schus 06/05 480 neg. 10 Argen 29.06.2005 400 mL Argen 06/05 80 neg. 11 Seefelder Aach 29.06.2005 400 mL Seef A 06/05 340 neg. 12 Stockacher Aach 29.06.2005 400 mL StockA 06/05 820 neg. 13 Schussen 06.09.2005 300 mL Schus 09/05 2000 neg. 14 Argen 06.09.2005 300 mL Argen 09/05 300 neg. 15 Seefelder Aach 06.09.2005 300 mL Seef A 09/05 2100 neg. 16 Stockacher Aach 06.09.2005 300 mL StockA 09/05 2800 neg. 17 Schussen 02.11.2005 400 mL Schus 11/05 100 neg. 18 Argen 02.11.2005 400 mL Argen 11/05 30 neg. 19 Seefelder Aach 02.11.2005 400 mL Seef A 11/05 90 neg. 20 Stockacher Aach 02.11.2005 400 mL StockA 11/05 190 neg. 21 Schussen 18.01.2006 300 mL Schus 01/06 K.A. neg. 22 Argen 18.01.2006 500 mL Argen 01/06 K.A. neg. 23 Seefelder Aach 18.01.2006 400 mL Seef A 01/06 K.A. neg. 24 Stockacher Aach 18.01.2006 400 mL StockA 01/06 K.A. neg. 25 Schussen 07.03.2006 400 mL Schus 03/06 1040 neg. 26 Argen 07.03.2006 500 mL Argen 03/06 150 neg. 27 Seefelder Aach 07.03.2006 400 mL Seef A 03/06 400 neg. 28 Stockacher Aach 07.03.2006 400 mL StockA 03/06 470 neg. 29 Schussen 08.05.2006 400 mL Schus 05/06 70 neg. 30 Argen 08.05.2006 500 mL Argen 05/06 20 neg. 31 Seefelder Aach 08.05.2006 500 mL Seef A 05/06 160 neg. 32 Stockacher Aach 08.05.2006 400 mL StockA 05/06 90 neg.


KBE/100mL

Taqman GPL

813TQ

PCR 23SOF/985R

1 Ober-See 0 11.01.2005 1 L Ober0 01/05 nn pos. 2 Ober-See 5 11.01.2005 Ober5 01/05 3 Ober-See 60 11.01.2005 1L Ober60 01/05 nn pos. 4 Ober-See 0 09.02.2005 1L Ober0 02/05 nn pos. 5 Ober-See 5 09.02.2005 Ober5 02/05 6 Ober-See 60 09.02.2005 1L Ober60 02/05 1 pos. 7 Ober-See 0 05.04.2005 1L Ober0 04/05 nn neg. 8 Ober-See 5 05.04.2005 Ober5 04/05 9 Ober-See 60 05.04.2005 1L Ober60 04/05 nn pos.

10 Ober-See 0 07.06.2005 700 mL Ober0 06/05 nn neg. 11 Ober-See 5 07.06.2005 Ober5 06/05 12 Ober-See 60 07.06.2005 700 mL Ober60 06/05 nn neg. 13 Ober-See 0 26.07.2005 500 mL Ober0 07/05 nn neg. 14 Ober-See 5 26.07.2005 Ober5 07/05 15 Ober-See 60 26.07.2005 1 L Ober60 07/05 nn neg. 16 Ober-See 0 11.10.2005 700 mL Ober0 10/05 nn neg. 17 Ober-See 5 11.10.2005 Ober5 10/05 18 Ober-See 60 11.10.2005 1 L Ober60 10/05 nn neg. 19 Ober-See 0 06.12.2005 1 L Ober0 12/05 1 pos. 20 Ober-See 5 06.12.2005 Ober5 12/05 21 Ober-See 60 06.12.2005 1 L Ober60 12/05 nn neg. 22 Ober-See 0 15.02.2006 1 L Ober0 02/06 nn neg. 23 Ober-See 5 15.02.2006 24 Ober-See 60 15.02.2006 700 mL Ober60 02/06 nn pos. 25 Ober-See 0 31.05.2006 1 L Ober0 05/06 neg.


146

26 Ober-See 5 31.05.2006 1 L Ober5 05/06 27 Ober-See 60 31.05.2006 700 mL Ober60 05/06 neg. 28 Ober-See 0 15.06.2006 1 L Ober0 06/06 29 Ober-See 5 15.06.2006 1 L Ober5 06/06 30 Ober-See 60 15.06.2006 1 L Ober60 06/06


KBE/100mL

Taqman GPL

813TQ

PCR 23SOF/985R

1 Überlinger-See 0 11.01.2005 1L Über 0 01/05 1 pos. 2 Überlinger-See 2 11.01.2005 Über 2 01/05 3 Überlinger-See 5 11.01.2005 Über 5 01/05 4 Überlinger-See 10 11.01.2005 1 L Über 10 01/05 nn pos. 5 Überlinger-See 15 11.01.2005 Über 15 01/05 6 Überlinger-See 20 11.01.2005 Über 20 01/05 7 Überlinger-See 30 11.01.2005 1 L Über 30 01/05 nn pos. 8 Überlinger-See 60 11.01.2005 1 L Über 60 01/05 2 pos.

9 Überlinger-See 100 11.01.2005 Über 10 01/05

10 Überlinger-See 140 11.01.2005 1 L Über 140 01/05 nn pos.

11 Überlinger-See 0 09.02.2005 1 L Über 0 02/05 nn pos. 12 Überlinger-See 2 09.02.2005 Über 2 02/05 13 Überlinger-See 5 09.02.2005 Über 5 02/05 14 Überlinger-See 10 09.02.2005 1 L Über 10 02/05 nn pos. 15 Überlinger-See 15 09.02.2005 Über 15 02/05 16 Überlinger-See 20 09.02.2005 Über 20 02/05 17 Überlinger-See 30 09.02.2005 1 L Über 30 02/05 nn pos. 18 Überlinger-See 60 09.02.2005 1 L Über 60 02/05 nn pos.


20 Überlinger-See 140 09.02.2005 1 L Über 140 02/05 2 pos.

21 Überlinger-See 0 15.03.2005 1 L Über 0 03/05 nn neg. 22 Überlinger-See 2 15.03.2005 Über 2 03/05 23 Überlinger-See 5 15.03.2005 Über 5 03/05 24 Überlinger-See 10 15.03.2005 1 L Über 10 03/05 nn neg. 25 Überlinger-See 15 15.03.2005 Über 15 03/05 26 Überlinger-See 20 15.03.2005 Über 20 03/05 27 Überlinger-See 30 15.03.2005 1 L Über 30 03/05 1 neg. 28 Überlinger-See 60 15.03.2005 1 L Über 60 03/05 1 neg.


30 Überlinger-See 140 15.03.2005 1 L Über 140 03/05 1 neg.

31 Überlinger-See 0 06.04.2005 800 mL Über 0 04/05 1 neg. 32 Überlinger-See 2 06.04.2005 Über 2 04/05 33 Überlinger-See 5 06.04.2005 Über 5 04/05 34 Überlinger-See 10 06.04.2005 800 mL Über 10 04/05 nn neg. 35 Überlinger-See 15 06.04.2005 Über 15 04/05 36 Überlinger-See 20 06.04.2005 Über 20 04/05 37 Überlinger-See 30 06.04.2005 800 mL Über 30 04/05 nn neg. 38 Überlinger-See 60 06.04.2005 1 L Über 60 04/05 nn neg.


40 Überlinger-See 06.04.2005 750 mL Über 140 04/05 nn neg.


147

140 41 Überlinger-See 0 10.05.2005 1 L Über 0 05/05 1 neg. 42 Überlinger-See 2 10.05.2005 Über 2 05/05 43 Überlinger-See 5 10.05.2005 Über 5 05/05 44 Überlinger-See 10 10.05.2005 1 L Über 10 05/05 nn neg. 45 Überlinger-See 15 10.05.2005 Über 15 05/05 46 Überlinger-See 20 10.05.2005 Über 20 05/05 47 Überlinger-See 30 10.05.2005 1 L Über 30 05/05 3 neg. 48 Überlinger-See 60 10.05.2005 1 L Über 60 05/05 12 neg.




KBE/100mL

Taqman GPL

813TQ

PCR 23SOF/985R

51 Überlinger-See 0 07.06.2005 700 mL Über 0 06/05a nn neg. 52 Überlinger-See 2 07.06.2005 Über 2 06/05a 53 Überlinger-See 5 07.06.2005 Über 5 06/05a 54 Überlinger-See 10 07.06.2005 1 L Über 10 06/05a nn neg. 55 Überlinger-See 15 07.06.2005 Über 15 06/05a 56 Überlinger-See 20 07.06.2005 Über 20 06/05a 57 Überlinger-See 30 07.06.2005 1 L Über 30 06/05a 1 neg.

58 Überlinger-See 60 07.06.2005 1 L Über 60 06/05a nn neg.

59 Überlinger-See 100 07.06.2005 Über 10 06/05a

60 Überlinger-See 140 07.06.2005 1 L

Über 140 06/05a 1 neg.

61 Überlinger-See 0 28.06.2005 800 mL Über 0 06/05b nn neg. 62 Überlinger-See 2 28.06.2005 Über 2 06/05b 63 Überlinger-See 5 28.06.2005 Über 5 06/05b 64 Überlinger-See 10 28.06.2005 800 mL Über 10 06/05b nn neg. 65 Überlinger-See 15 28.06.2005 Über 15 06/05b 66 Überlinger-See 20 28.06.2005 Über 20 06/05b 67 Überlinger-See 30 28.06.2005 1 L Über 30 06/05b nn neg.

68 Überlinger-See 60 28.06.2005 1 L Über 60 06/05b nn neg.

69 Überlinger-See 100 28.06.2005 Über 10 06/05b

70 Überlinger-See 140 28.06.2005 1 L

Über 140 06/05b nn neg.

71 Überlinger-See 0 26.07.2005 700 mL Über 0 07/05 nn neg. 72 Überlinger-See 2 26.07.2005 Über 2 07/05 73 Überlinger-See 5 26.07.2005 Über 5 07/05 74 Überlinger-See 10 26.07.2005 500 mL Über 10 07/05 nn neg. 75 Überlinger-See 15 26.07.2005 Über 15 07/05 76 Überlinger-See 20 26.07.2005 Über 20 07/05 77 Überlinger-See 30 26.07.2005 1 L Über 30 07/05 nn neg. 78 Überlinger-See 60 26.07.2005 1 L Über 60 07/05 nn neg.


80 Überlinger-See 140 26.07.2005 1 L Über 140 07/05 nn neg.

81 Überlinger-See 0 20.09.2005 700 mL Über 0 09/05 nn neg. 82 Überlinger-See 2 20.09.2005 Über 2 09/05


148

83 Überlinger-See 5 20.09.2005 Über 5 09/05 84 Überlinger-See 10 20.09.2005 700 mL Über 10 09/05 2 neg. 85 Überlinger-See 15 20.09.2005 Über 15 09/05 86 Überlinger-See 20 20.09.2005 Über 20 09/05 87 Überlinger-See 30 20.09.2005 1 L Über 30 09/05 2 neg. 88 Überlinger-See 60 20.09.2005 1 L Über 60 09/05 nn neg.



91 Überlinger-See 0 11.10.2005 800 mL Über 0 10/05 nn neg. 92 Überlinger-See 2 11.10.2005 Über 2 10/05 93 Überlinger-See 5 11.10.2005 Über 5 10/05 94 Überlinger-See 10 11.10.2005 1 L Über 10 10/05 nn neg. 95 Überlinger-See 15 11.10.2005 Über 15 10/05 96 Überlinger-See 20 11.10.2005 Über 20 10/05 97 Überlinger-See 30 11.10.2005 1 L Über 30 10/05 nn neg. 98 Überlinger-See 60 11.10.2005 1 L Über 60 10/05 1 neg.




KBE/100mL

Taqman GPL

813TQ

PCR 23SOF/985R

101 Überlinger-See 0 02.11.2005 500 mL Über 0 11/05 nn neg. 102 Überlinger-See 2 02.11.2005 Über 2 11/05 103 Überlinger-See 5 02.11.2005 Über 5 11/05 104 Überlinger-See 10 02.11.2005 1 L Über 10 11/05 nn neg. 105 Überlinger-See 15 02.11.2005 Über 15 11/05 106 Überlinger-See 20 02.11.2005 Über 20 11/05 107 Überlinger-See 30 02.11.2005 1 L Über 30 11/05 nn neg. 108 Überlinger-See 60 02.11.2005 750 mL Über 60 11/05 nn neg.



111 Überlinger-See 0 06.12.2005 900 mL Über 0 12/05 nn neg. 112 Überlinger-See 2 06.12.2005 Über 2 12/05 113 Überlinger-See 5 06.12.2005 Über 5 12/05 114 Überlinger-See 10 06.12.2005 900 mL Über 10 12/05 nn neg. 115 Überlinger-See 15 06.12.2005 Über 15 12/05 116 Überlinger-See 20 06.12.2005 Über 20 12/05 117 Überlinger-See 30 06.12.2005 1 L Über 30 12/05 nn neg. 118 Überlinger-See 60 06.12.2005 1 L Über 60 12/05 nn neg.



121 Überlinger-See 0 17.01.2006 1 L Über 0 01/06 2 neg. 122 Überlinger-See 2 17.01.2006 Über 2 01/06 123 Überlinger-See 5 17.01.2006 Über 5 01/06 124 Überlinger-See 10 17.01.2006 1 L Über 10 01/06 nn neg. 125 Überlinger-See 15 17.01.2006 Über 15 01/06 126 Überlinger-See 20 17.01.2006 Über 20 01/06


149

127 Überlinger-See 30 17.01.2006 1 L Über 30 01/06 nn neg. 128 Überlinger-See 60 17.01.2006 1 L Über 60 01/06 nn neg.



131 Überlinger-See 0 15.02.2006 1 L Über 0 02/06 nn neg. 132 Überlinger-See 2 15.02.2006 Über 2 02/06 133 Überlinger-See 5 15.02.2006 Über 5 02/06 134 Überlinger-See 10 15.02.2006 1 L Über 10 02/06 nn neg. 135 Überlinger-See 15 15.02.2006 Über 15 02/06 136 Überlinger-See 20 15.02.2006 Über 20 02/06 137 Überlinger-See 30 15.02.2006 1 L Über 30 02/06 1 neg. 138 Überlinger-See 60 15.02.2006 1 L Über 60 02/06 nn neg.


140 Überlinger-See 140 15.02.2006 900 mL Über 140 02/06 3 neg.

141 Überlinger-See 0 31.05.2006 1 L Über 0 05/06 neg. 142 Überlinger-See 2 31.05.2006 Über 2 05/06 143 Überlinger-See 5 31.05.2006 Über 5 05/06 144 Überlinger-See 10 31.05.2006 800 mL Über 10 05/06 neg. 145 Überlinger-See 15 31.05.2006 Über 15 05/06 146 Überlinger-See 20 31.05.2006 Über 20 05/06 147 Überlinger-See 30 31.05.2006 1 L Über 30 05/06 neg. 148 Überlinger-See 60 31.05.2006 1 L Über 60 05/06 neg.


150 Überlinger-See 140 31.05.2006 1 L Über 140 05/06 neg.

151 Überlinger-See 0 15.06.2006 1 L Über 0 06/06 152 Überlinger-See 2 15.06.2006 Über 2 06/06 153 Überlinger-See 5 15.06.2006 Über 5 06/06 154 Überlinger-See 10 15.06.2006 1 L Über 10 06/06 155 Überlinger-See 15 15.06.2006 Über 15 06/06 156 Überlinger-See 20 15.06.2006 Über 20 06/06 157 Überlinger-See 30 15.06.2006 1 L Über 30 06/06 158 Überlinger-See 60 15.06.2006 1 L Über 60 06/06


160 Überlinger-See 140 15.06.2006 900 mL Über 140 06/06


150

9.2. Rohdaten Limnologisches Institut Irkutsk, 2007 9.2.1. Mikrobiologische Ergebnisse freie Wasserphase 2007

Date

Number of

station Name of station

Number of

RosettaDepth,

m FPA PYA R2A T.N.B. T.K.B. T.K.B. Pseud. Enterococcus

5° С 37° С 37° С 43° С

cells/ml cells/ml cells/ml cells/ml cells/100

ml cells/100

ml cells/100 ml cells/100 ml 15.08.2007 2 3 km from Kultuk 3 0 57 52 27 3 9 0 40 45 25 960 786 178 2 0 0 8 0 100 640 495 96 0 0 0 3 0 200 293 315 11 0 0 0 0 3 400 1180 544 680 0 0 0 1 0 15.08.2007 4 0 km from Solzan 5 0 204 200 113 7 1 0 130 1 50 758 520 137 0 0 0 580 1

15.08.2007 5 1 km from Solzan L 6 0

57 309

6 0 054 1

150 405 389 268 0 0 0 0 0

15.08.2007 6 2 km from Solzan L 7 0

127 1146

18 7 028 0

150 380 328 364 0 0 0 1 0

15.08.2007 7 3 km from Solzan L 8 0

127 369

10 0 026 0

250 380 166 74 1 0 0 14 0

15.08.2007 8 6 km from Solzan L 9 0

96 858

3 0 00 0

600 40 110 52 0 0 0 0 0

15.08.2007 9 6 km from Solzan С 10 0

80 8537

5 0 06 0

700 121 92 28 0 0 0 1 0

15.08.2007 10 3 km from Solzan С 11 0

104 9218

6 11 016 13

300 310 240 320 0 0 0 1 0

15.08.2007 11 2 km from Solzan С 12 0

133 10118

7 9 019 0


151 250 111 120 45 0 0 0 3 0

15.08.2007 12 1 km from Solzan С 13 0

141 6923

3 5 133 5

200 36 49 6 0 0 0 2 0

15.08.2007 13 1 km from Solzan R 14 0

280 7513

4 5 012 4

50 340 282 56 11 1 0 3 3

15.08.2007 14 2 km from Solzan R 15 0 214

11415

0 6 034 7

150 220 230 184 2 0 0 1 0

15.08.2007 15 3 km from Solzan R 16 0 210

24545

4 0 045 2

250 137 116 56 3 8 0 3 0

15.08.2007 16 6 km from Solzan R 17 0 40

16061

2 0 015 15

250 92 83 42 1 0 0 1 1 16.08.2007 18 14.5 km Kharauz 0 570 932 540 37 0 0 30 2 5 678 776 216 2 0 0 2 0 275 198 728 100 0 0 16.08.2007 19 10 km Kharauz 21 0 247 207 166 7 0 0 46 1 5 800 932 206 1 0 0 0 0 100 1212 1880 340 270 0 0 0 0 16.08.2007 20 5 km Kharauz 0 138 242 200 52 0 0 104 0 5 358 416 280 2 3 0 12 0 25 132 168 125 0 0 0 6 0 16.08.2007 21 1 km Kharauz 0 578 94 520 220 0 0 80 7 5 130 580 366 7 12 0 50 0 17.08.2007 22 mp Ukhan - Tonkii 22 0 978 1132 126 150 0 0 0 0 5 196 708 25 0 0 0 0 0 25 738 1260 180 0 0 0 0 0 100 790 1600 640 0 0 0 0 0 600 352 182 26 1 0 0 17 0 1000 61 128 22 0 0 0 28 0 1300 2460 1776 720 280 0 0 63 0 1400 316 330 240 60 0 0 79 0 FPA - heterotrophes


152

PYA - oligotrophes R2A - psychrophiles T.N.B. - total microbial count T.K.B. (37°) - total coliform bacterium T.K.B. (43°) - total coliform bacterium t not 9.2.2. Mikrobiologische Ergebnisse Sedimente 2007

Date Number of station Координаты Name of

station Depth,

m FPA, 5°C T.N.B., 37°C T.K.B., 37°C Pseud. Enteroc

cells/ml cells/ml cells/100 ml cells/50 ml cells/100

ml х 1000 х 1000 х1000 х 1000 х 1000

15.08.07 3 51 41.408 103 43.232 Bc1 195 9 13 0 14 015.08.07 4 51 30.1537 104 14.5684 Bc1 60 18 6 0 1 215.08.07 5 51 30.7065 104 14.0795 Bc1 180 4 1 0 1 015.08.07 6 51 31.1397 104 13.6489 Bc1 178 37 2 0 0 015.08.07 7 51 31.5972 104 13.3132 Bc1 313 31 15 0 0 015.08.07 8 51 33.1557 104 12.2745 Bc1 621 9 1 0 0 015.08.07 9 51 32.3533 104 18.3008 Bc1 764 4 3 0 1 015.08.07 10 51 31.1330 104 16.1407 Bc1 303 14 6 0 1 015.08.07 11 51 30.8495 104 15.5582 Bc1 250 12 0 0 0 015.08.07 12 51 30.5600 104 15.1012 Bc1 197 7 111 0 0 015.08.07 13 51 30.0875 104 15.3226 Bc1 51 3 2 0 2 015.08.07 14 51 30.0206 104 16.0981 Bc1 189 5 3 0 1 015.08.07 15 51 29.9465 104 17.0752 Bc1 251 9 7 0 0 015.08.07 16 51 29.6598 104 19.5396 Bc1 276 3 1 0 0 016.08.07 18 52 20.8091 106 03.7462 Gr1 275 24 10 0 2 016.08.07 19 52 19.2512 106 07.5429 Bc1 98 7 14 0 0 016.08.07 20 52 17.8952 106 11.1320 Bc1 27 10 28 0 1 016.08.07 21 52 16.8918 106 13.9925 Bc1 5 34 7 0 0 0

17.08.2007 22 52 53.7673 107 31.6245 Bc1 1633 90 19 0 1 017.08.2007 23 52 38.4060 107 21.7115 Bc1 270 114 31 0 0 0


153

9.2.3. Chemische Parameter Wasser 2007 Baikalsk mg/l № п/п depth НСО3

- Cl- NO3- SO4

2- station St4 0 60,93 0,16 2,00 6,18

0 2,5 62,65 0,30 2,14 8,66 5 59,52 0,16 1,81 8,37 St5 0 60,03 0,38 0,00 5,81

1 5 60,76 0,57 0,00 3,14 7 60,81 0,72 0,00 1,08 9 71,81 0,52 0,00 0,74 15 78,45 0,50 0,00 0,74 20 83,08 0,55 0,00 0,57 25 85,60 0,49 0,33 0,39 40 86,97 0,43 0,65 0,42 60 94,16 0,47 0,00 1,02 St6 0 66,02 0,94 0,74 5,91

2 1 54,13 0,73 0,58 5,95 3 71,26 0,65 0,51 5,01 5 80,33 0,55 0,49 3,83 7 71,66 0,59 0,00 3,03 9 68,54 0,53 0,00 2,07 11 71,43 0,59 0,00 1,85 15 79,81 0,59 0,00 1,07 20 68,28 0,84 0,81 1,00 St7 0 66,26 0,74 0,73 5,32

3 2 59,84 0,69 0,00 3,80 10 77,23 0,47 3,96 0,45 15 111,56 0,58 0,00 1,56 20 120,26 0,77 0,48 0,99 St8 0 60,21 0,32 0,39 4,08

6 1,5 63,53 0,50 0,00 3,23 10 81,37 0,52 0,47 0,64 15 78,02 0,71 0,52 0,73 St9 0 58,36 0,34 0,60 4,00

6 1 64,16 0,81 0,99 3,38 3 79,76 0,55 0,00 2,80 St10 0 66,02 0,84 0,71 5,49

3 0,5 62,90 0,60 0,00 3,05 1,5 63,09 0,18 1,12 0,57 5 87,16 0,67 0,00 0,62 10 103,06 0,65 0,92 0,59 15 103,46 0,65 0,77 0,90 20 111,97 0,65 0,73 1,02 27 73,61 0,71 0,00 1,03 30 111,40 0,82 0,56 0,96 35 127,84 1,00 0,40 1,20 40 142,98 0,58 0,46 0,54


154

50 153,38 0,66 0,69 0,72 60 173,23 0,69 0,39 0,40 70 161,62 0,60 0,95 0,44 St11 0 66,19 0,59 0,31 5,51

2 1 47,62 0,65 0,00 3,48 3 66,89 0,70 0,00 1,13 5 72,49 0,73 0,00 0,84 8 80,03 0,60 0,00 0,58 12 88,10 0,64 0,00 0,82 17 89,45 0,64 0,00 1,04 35 99,17 0,63 0,00 0,74 45 126,74 0,70 0,00 0,76 St12 0 66,11 1,47 0,59 5,13

1 0,5 38,56 1,22 0,00 9,33 1,5 45,28 1,82 0,00 5,74 5,5 63,84 0,79 0,00 0,69 10 61,39 0,77 0,00 0,98 15 59,35 1,60 0,00 2,15 20 22,26 0,85 0,00 3,03 30 71,35 0,65 0,00 0,44 40 72,71 0,74 0,00 0,46 50 83,37 0,93 0,00 0,48 60 150,77 0,68 0,00 0,69


155

9.2.3. Temperaturdaten Wasser 2007

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

1100

1200

1300

1400

3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Ver072St1r10814

Ver072St2r30815

Ver072St3r40815

Ver072St4r50815

Ver072St5r60815

Ver072St6r70815

Ver072St7r80815

Ver072St8r90815

Ver072St9r100815

Ver072St10r110815

Ver072St11r120815

Ver072St12r130815

Ver072St13r140815

Ver072St14r150815

Ver072St15r160815

Ver072St19r210816

Ver072St22r220817

Ver072St23r230817

Tabellarische Zusammenfassung Station Ort Tiefe Grad[C] Tiefe Grad[C]

1 Listvyanka 2 17,8 1349 3 2 3km vorKultuk 2 17,7 421 3,5 3 1km vor Kultuk 2 17,2 204 3,9 4 0km vor Sulzan 2 17,4 51 4,1 5 1km vor Sulzan left 2 17,8 174,5 3,7 6 2km vor Sulzan left 2 17,9 176,5 3,6 7 3km vor Sulzan left 2 17,9 302 3,6 8 6km vor Sulzan left 2 17,9 564 3,4 9 6km vor Sulzan central 2 17,4 739 3,4

10 3km vor Sulzan central 2 18,8 296 3,6 11 2km vor Sulzan central 2 19 249 3,6 12 1km vor Sulzan central 2 18,8 204 3,6 13 1km vor Sulzan right 2 18,3 64 4 14 2km vor Sulzan right 2 18,3 180 3,7 15 3km vor Sulzan right 2 18,4 260 3,6 19 10km vor Kharauz 2 16,2 111 3,9 22 Ukhan Tonkii 2 16,3 1369 3,2 23 Near Tolstii 2 15 258 3,8

Temperatur [°C]

Tief

e [m

]


156

9.3. Universität Stuttgart 9.3.1 Tabellen, Zusammenfassung Cyano-Chip Sondensignale Bodensee 2005-2006

Fluoreszenssignal-stärke in Prozent, bezogen auf den

Maximalsignalwert der jeweiligen Sonde


157




158




159

9.3.2 Tabellen - Zusammenfassung Cyano-Chip Sondensignale Baikalsee

(Die Verwendeten Abkürzungen entsprechen denen, der Probenahmeliste aus Abschnitt 9.1.1, und wurden daher hier nicht noch einmal abgedruckt)

Control Station South Baikal (CSSB), Transsekte, Listyanka-Tankhoj (L-T), 21.Aug. 2005

Control Station Middle Baikal (CSMB), Ukhan-Tonky (U-T), 21.Aug. 2005


160

Control Station North Baikal (CSNB), Transsekte Davsha-Elokhin (D-E), 23.Aug. 2005

Kultuk, Listyanka, Angara, Aug. 2005

Baikalsk (west, east1, east2), Aug. 2005


161

Selenga (1-14,5 km Entfernung), Aug. 2005

Barguzin Bay (station 1-6), Aug. 2005


162

Small-Sea Olchon, Aug. 2005

Severobaikalsk (Station 1-4), Aug. 2005

Documents

Untersuchung der Wasserqualität von Bodensee und Baikalsee · Vergleichende Untersuchung der Wasserqualität von Bodensee und Baikalsee 2 Berichtsblatt 1. ISBN oder ISSN ISBN 2