Aus der Klinik für Rinderkrankheiten der Tierärztlichen Hochschule Hannover

und dem Institut für Tierernährung der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft in Braunschweig

Untersuchungen zur Kobalt-Versorgung von Milchkühen

INAUGURAL-DISSERTATION

zur Erlangung des Grades der Doktorin der Veterinärmedizin

(Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Kirsten Stemme

aus Auetal

Hannover 2002

Wissenschaftliche Betreuung: Univ.-Prof. Dr. med. vet. H. Scholz (TiHo)

Univ.-Prof. Dr. agr. G. Flachowsky (FAL)

Dr. sc. agr. P. Lebzien (FAL)

Dr. sc. agr. U. Meyer (FAL)

1. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. H. Scholz (TiHo)

Univ.-Prof. Dr. agr. G. Flachowsky (FAL)

2. Gutachter: Univ.-Prof. Dr. med. vet. M. Coenen

Tag der mündlichen Prüfung: 07.06.2002

Die vorliegende Arbeit wurde von der H. WILHELM SCHAUMANN-Stiftung gefördert.

Wissenschaftliche Veröffentlichungen STEMME, K., GÄDEKEN, D., MEYER, U., DAENICKE, R., FLACHOWSKY, G., SCHOLZ, H. (2001): Investigations on vitamin B12 concentration in the blood serum of dairy cows as related to cobalt concentration in the ration. Proc. Soc. Nutr. Physiol. 10, 152 STEMME, K., MEYER, U., GÄDEKEN, D., SCHOLZ, H., FLACHOWSKY, G. (2001): Investigations on the influence of cobalt supplements on the vitamin B12-status of dairy cows. In: Vitamins and Additives in the Nutrition of Man and Animal: September,26th and 27th,2001 Jena/Thuringia; 8th Symposium Micro Nutrients 2001, p. 26 [Abstract] STEMME, K., MEYER, U., GÄDEKEN, D., SCHOLZ, H., FLACHOWSKY, G. (2001): Untersuchungen zum Einfluss von Kobalt-Ergänzungen auf den Vitamin B12-Status von Milchkühen. In: R. Schubert, G. Flachowsky, G. Jahreis u. R. Bitsch (Hrsg.): Vitamine und Zusatzstoffe in der Ernährung von Mensch und Tier. 8. Symposium, 26./27.09.2001, Jena/Thüringen. Informations- und Datenzentrum der FAL, Braunschweig, S. 167-172 STEMME, K., MEYER, U. FLACHOWSKY, G., SCHOLZ, H. (2002): Vitamin B12-concentration in serum and liver tissue of dairy cows as affected by cobalt intake. Proc. Soc. Nutr. Physiol. 11, 59 STEMME, K. LEBZIEN, P., FLACHOWSKY, G., SCHOLZ, H. (2002): Investigations on the microbial vitamin B12-synthesis of dairy cows as related to the cobalt concentration in the ration. Proc. Soc. Nutr. Physiol. 11, 70 SPOLDERS, M., MEYER, U., GÄDEKEN, D., STEMME, K., FLACHOWSKY, G. (2001): Evaluation of the physical structure value of different rations for dairy cattle applying measurements on ruminanting activity. Proc. Soc. Nutr. Physiol. 10, 40

Inhaltsverzeichnis

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG 1

2 LITERATURÜBERSICHT 3

2.1 Kobalt-Vorkommen im Boden 3

2.2 Faktoren, die den Kobalt-Gehalt der Pflanze beeinflussen 5 2.2.1 Verfügbarkeit des Kobalts für die Pflanze 5 2.2.2 Einfluss der Pflanzenart auf ihren Kobalt-Gehalt 6 2.2.3 Weitere Faktoren, die den Kobalt-Gehalt von Pflanzen beeinflussen 7

2.3 Vitamin B12 9

2.4 Vitamin B12-Synthese im Pansen 10

2.5 Absorption, Exkretion und Speicherung von Vitamin B12 14

2.6 Absorption und Metabolismus von Kobalt 19

2.7 Vitamin B12 im Intermediärstoffwechsel 21 2.7.1 Adenosyl-Cobalamin-abhängige Reaktionen 22 2.7.2 Methyl-Cobalamin-abhängige Reaktionen 24

2.8 Auswirkungen eines Kobalt- bzw. Vitamin B12-Mangels auf den Intermediärstoffwechsel 25

2.9 Klinische Erscheinungen bei Kobalt-Mangel 28

2.10 Regionale Verteilung von Kobalt-Mangelgebieten 32

2.11 Möglichkeiten zur Vermeidung bzw. zur Behandlung eines Kobalt-Mangels 33

2.12 Bedarfsempfehlungen für Wiederkäuer 35

2.13 Kobalt-Intoxikation 37

2.14 Möglichkeiten zur Diagnostik eines Kobalt-Mangels 38 2.14.1 Bestimmung von Kobalt in verschiedenen Matrizes 39 2.14.2 Vitamin B12-Messungen in Proben tierischen Ursprungs 40 2.14.3 Ermittlung von Enzymaktivitäten 41 2.14.4 Messung von Methylmalonylsäure oder Fomiminoglutamat 42

2.15 Referenzwerte zur Beurteilung der Kobaltversorgung von Wiederkäuern 43

2.16 Ableitung der Aufgabenstellung 45

Inhaltsverzeichnis

3 MATERIAL UND METHODEN 47

3.1 Überblick über die durchgeführten Versuche 47

3.2 Beschreibung der verwendeten Futtermittel 47 3.2.1 Grundfutter 47 3.2.2 Kraftfutter 48

3.3 Untersuchungen an ruminal und duodenal fistulierten Milchkühen 49 3.3.1 Versuchsaufbau 49 3.3.2 Versuchstiere, Fütterung und Haltung 50 3.3.3 Rationsgestaltung 51 3.3.4 Bestimmung der pansenphysiologischen Parameter 51 3.3.5 Ermittlung des Nährstoff-Flusses am Dünndarm 52 3.3.5.1 Herstellung und Verabreichung des Chrommarkers 52 3.3.5.2 Gewinnung und Aufbereitung der Chymusproben 52

3.4 Vorversuch zum Fütterungsversuch 53 3.4.1 Versuchsaufbau, Versuchstiere, Haltung, Fütterung und Probenahme 53

3.5 Fütterungsversuch 54 3.5.1 Versuchsaufbau, Versuchstiere und Haltung (Teil I) 54 3.5.2 Versuchsaufbau, Versuchstiere und Haltung (Teil II) 55 3.5.3 Rationsgestaltung (Fütterungsversuch Teil I und II) 56 3.5.4 Probennahme 56 3.5.4.1 Futterproben 56 3.5.4.2 Blutproben 57 3.5.4.3 Milchproben 57 3.5.4.4 Leberproben 58

3.6 Kälberversuch 58

3.7 Chemische Analysenmethoden 58 3.7.1 Weender-Rohnährstoffe, ADF, NDF 58 3.7.2 Mengen- und Spurenelemente in den Futtermitteln 59 3.7.3 Chrom 59 3.7.4 Flüchtige Fettsäuren im Pansensaft 60 3.7.5 Ammoniak-Stickstoff im Pansensaft 60 3.7.6 Mikrobielles Rohprotein 60 3.7.7 Kobalt-Gehalt im Darmsaft 61 3.7.8 Vitamin B12 im Darmsaft 61 3.7.9 Blutparameter 62 3.7.9.1 Vitamin B12 und Folsäure 62 3.7.9.2 Glukose, Gesamtbilirubin, Harnstoff, ß-Hydroxy-Buttersäure, AST,

GLDH und γ-GT 62 3.7.9.3 Eisen 63 3.7.10 Milchinhaltsstoffe 63 3.7.11 Vitamin B12 in der Milch 63 3.7.12 Kobalt im Lebergewebe 63 3.7.12.1 Vitamin B12 im Lebergewebe 63

3.8 Statistische Auswertung 64

Inhaltsverzeichnis

4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION 65

4.1 Versuch an fistulierten Milchkühen 65 4.1.1 Versuchsablauf, Rohnährstoffgehalte der Futtermittel, Futteraufnahme

und Milchleistung 65 4.1.2 Mineralstoff-Aufnahme 67 4.1.2.1 Kobalt 67 4.1.2.2 Weitere Mineralstoffe 68 4.1.3 Pansenphysiologische Untersuchungen 70 4.1.3.1 pH-Werte 70 4.1.3.2 Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren 70 4.1.3.3 NH3-N-Konzentrationen 71 4.1.3.4 Bewertung der pansenphysiologischen Parameter 72 4.1.4 Fluss an Trockensubstanz und organischer Substanz 72 4.1.5 Stickstofffluss am Duodenum 74 4.1.6 Mikrobielle Proteinsynthese im Pansen 74 4.1.7 Kobalt- und Vitamin B12-Konzentrationen im Darmsaft 77

4.2 Vorversuch zum Fütterungsversuch 80

4.3 Fütterungsversuch (Teil I) 83 4.3.1 Versuchsverlauf 83 4.3.2 Rohnährstoffgehalte und Futteraufnahme 83 4.3.3 Mineralstoff-Aufnahme 86 4.3.3.1 Kobalt 86 4.3.3.2 Weitere Mineralstoffe 86 4.3.4 Milchleistung und Milchinhaltsstoffe 87 4.3.5 Lebendmasseentwicklung 89 4.3.6 Vitamin B12-Status der Milchkühe 90 4.3.6.1 Vitamin B12-Konzentration im Serum 90 4.3.6.2 Kobalt- und Vitamin B12-Konzentrationen in Lebergewebe und Milch 92 4.3.7 Beurteilung weiterer Blutparameter 92 4.3.7.1 Eisen 92 4.3.7.2 Folsäure 93 4.3.7.3 Glucose 94 4.3.7.4 Harnstoff, ß-Hydroxy-Buttersäure, Gesamtbilirubin und Leberenzyme

(AST, GLDH und γ-GT) 95

4.4 Fütterungsversuch (Teil II) 96 4.4.1 Versuchsverlauf, Rohnährstoffgehalte der Ration und Futter-aufnahme 96 4.4.2 Mineralstoff-Aufnahme 97 4.4.2.1 Kobalt 97 4.4.2.2 Weitere Mineralstoffe 98 4.4.3 Milchleistung und Milchinhaltsstoffe 98 4.4.4 Vitamin B12-Konzentration im Serum 100 4.4.5 Kobalt- und Vitamin B12-Konzentrationen im Lebergewebe 100 4.4.6 Vitamin B12-Konzentrationen in Milch und Kolostrum 104

4.5 Kälberversuch 106 4.5.1 Versuchsdurchführung 106 4.5.2 Vitamin B12-Konzentration im Serum 106

Inhaltsverzeichnis

5 VERGLEICHENDE DISKUSSION 108

6 SCHLUSSFOLGERUNGEN 114

7 ZUSAMMENFASSUNG 116

8 SUMMARY 119

9 LITERATURVERZEICHNIS 122

10 ANHANG 141

Tabellenverzeichnis

TABELLENVERZEICHNIS

Tabelle 1: Allgemeine Beziehung zwischen Gesteinstypen und Kobalt-Gehalten im Boden (nach PATERSON, 1988) 3

Tabelle 2: Kobalt-Gehalte verschiedener Pflanzenspezies bei gleichen Aufwuchsbedingungen (nach LATTEUR, 1962 und POOLE et al., 1972) 6

Tabelle 3: Relative Bioverfügbarkeit verschiedener Kobalt-Quellen beim Schaf (nach HENRY, 1995) 20

Tabelle 4: Vitamin B12 abhängige biochemische Reaktionen (nach ZAGALAK, 1982 und GRUNER et al., 1998) 21

Tabelle 5: Empfehlungen zur Kobalt-Versorgung von Milchkühen (mg Co/kg T) 37

Tabelle 6: Vitamin B12-Konzentrationen bei Rind und Schaf im Serum und deren Interpretation 43

Tabelle 7: Vitamin B12-Konzentrationen im Lebergewebe und deren Interpretation 44

Tabelle 8: Interpretation der Konzentrationen von Methylmalonylsäure (MMA) und Vitamin B12 im Plasma von Schafen (nach McMURRAY et al., 1985) 44

Tabelle 9: Übersicht über die durchgeführten Versuche 47

Tabelle 10: Kobalt-Gehalte (mg/kg T) von Grassilagen der Versuchsstation der FAL in Braunschweig 48

Tabelle 11: Zusammensetzung der Kraftfuttermischungen (%) 49

Tabelle 12: Versuchseinteilung 49

Tabelle 13 : Tägliche Milchleistung und –inhaltsstoffe der fistulierten Kühe (n=5) zu Versuchsbeginn 50

Tabelle 14: Leistungsdaten der im Fütterungsversuch verwendeten Tiere zu Versuchsbeginn (n=18; MW ± SD) 55

Tabelle 15: Zuteilung des Milchleistungsfutters (IV) in Abhängigkeit von der Milchleistung 56

Tabelle 16: Variationskoeffizienten (VK) in der Analysenpräzision der Mengen- und Spurenelemente 59

Tabellenverzeichnis

Tabelle 17: Variationskoeffizienten (VK) der Analysenpräzision der flüchtigen Fettsäuren 60

Tabelle 18: Übersicht über die verwendeten Testverfahren mit Variationskoeffizienten der Präzision 62

Tabelle 19: WEENDER-Rohnährstoff- und ADF/NDF-Gehalte der im Fistelkuhversuch eingesetzten Futtermittel 65

Tabelle 20: Mittlere tägliche Trockensubstanz- und Rohnährstoffaufnahme der Milchkühe während der Darmsaftsammelwochen (MW ± SD; n=10) 66

Tabelle 21: Energiegehalt der Ration, Energie- und nXP-Aufnahme sowie ruminale N-Bilanz (RNB) pro Tier und Tag 66

Tabelle 22: Milchleistung und Gehalt an Milchinhaltsstoffen (n=5; MW ± SD) 67

Tabelle 23: Kobalt-Gehalte der im Versuch mit fistulierten Kühen eingesetzten Futtermittel (mg Co/kg T) 67

Tabelle 24: Kobalt-Aufnahmen pro Tier und Tag in mg/Tag sowie mg/kg T 67

Tabelle 25: Mittlere Mengen- und Spurenelement-Aufnahmen pro Tier und Tag sowie die Mengen- und Spurenelement-Gehalte der Ration im Fistelkuhversuch 68

Tabelle 26: Empfehlung für die Versorgung von Milchkühen mit Mengenelementen (g/Tag) bei einer Milchleistung von 15 und 20 kg/Tag ( nach GfE, 2001) 68

Tabelle 27: Empfehlungen zur Versorgung von Milchkühen mit Spurenelementen (mg/kg Futter-T) (nach GfE, 2001) 69

Tabelle 28: Maximal tolerierbare Spurenelement-Konzentrationen in der Tagesration (mg/kg Futter-T) bei Milchkühen (NRC, 1980; PULS, 1988) 69

Tabelle 29: Gesamtkonzentration an flüchtigen Fettsäuren sowie molare Anteile der einzelnen Fettsäuren im Pansensaft der Milchkühe drei Stunden nach Beginn der Morgenfütterung (MW ±SD; n=5) 71

Tabelle 30: Mittlerer Fluss an Trockensubstanz und organischer Substanz am proximalen Duodenum von fistulierten Milchkühen (n=5) bei Fütterung von Rationen mit unterschiedlichem Kobalt-Gehalt (MW ± SD) 73

Tabelle 31: Stickstoffaufnahme und Stickstofffluss am Duodenum bei Milch- kühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=5; MW ± SD) 74

Tabellenverzeichnis

Tabelle 32: Anteil des mikrobiellen Stickstoffs (MN) am Nicht-Ammoniak- Stickstoff (NAN) sowie Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese (n=5; MW ± SD) 75

Tabelle 33: Mikroben-Protein je kg fermentierbarer organischer Substanz (g MP/kg FOS) nach verschiedenen Autoren 75

Tabelle 34: Kobalt-Konzentrationen im Duodenalinhalt sowie Kobalt-Flüsse und Wiederfindungsraten bei Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung 77

Tabelle 35: Maximal mögliche und tatsächlich analysierte Vitamin B12-Menge (mg/Tag) im Duodenalinhalt sowie die Effizienz der ruminalen Vitamin B12-Synthese (%) 78

Tabelle 36: Blutparameter von Milchkühen im Verlauf von 24 Stunden (MW ± SD; n=5) 81

Tabelle 37: WEENDER-Rohnährstoffe und ADF/NDF der im Fütterungsversuch verwendeten Futtermittel 83

Tabelle 38: Trockensubstanzaufnahme in Abhängigkeit von der Kobalt- Versorgung (SCHWARZ et al., 2000) 84

Tabelle 39: Tägliche Trockenmasse- und Rohnährstoffaufnahme (kg/Tag) der Milchkühe mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung im Mittel über 112 Versuchstage (n=18, MW ± SD) 85

Tabelle 40: Energiehalt der Ration, mittlere Energie- und nXP-Aufnahme sowie ruminale Stickstoffbilanz (RNB) pro Tier und Tag (n=54; MW ± SD; 112 Versuchstage) 85

Tabelle 41: Kobalt-Gehalte der im Fütterungsversuch eingesetzten Futtermittel (mg Co/kg T) 86

Tabelle 42: Tägliche Kobalt-Aufnahme im Mittel für die Versuchsgruppen (MW ± SD; n=18) 86

Tabelle 43: Mittlere Mengen- und Spurenelement-Aufnahmen pro Tier und Tag sowie deren Gehalte der Ration 87

Tabelle 44: Mittlere Milchmenge und Gehalt an Milchinhaltsstoffen über 112 Versuchstage (n=18; MW ± SD) 87

Tabelle 45: Tägliche Produktion an Fett, Protein und Laktose bei unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=18; MW ± SD) 89

Tabelle 46: Lebendmasse-Entwicklung von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=18; MW ± SD; Versuchsdauer 112 Tage) 89

Tabellenverzeichnis

Tabelle 47: Tägliche Lebendmassezunahme von Mastbullen mit unter- schiedlicher Kobalt-Versorgung (SCHWARZ et al., 2000) 90

Tabelle 48: Eisen-Konzentration im Serum von Milchkühen bei unter- schiedlicher Kobalt-Versorgung (µmol/l) 92

Tabelle 49: Folsäure-Konzentrationen (ng/ml) im Serum von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung im Verlauf der Laktation (n=18; MW ± SD) 93

Tabelle 50: Glucose-Konzentration im Plasma von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=18; MW ± SD) 94

Tabelle 51: WEENDER-Rohnährstoffe und ADF/NDF der im Fütterungsversuch (Teil II) verwendeten Futtermittel 96

Tabelle 52: Tägliche Rohnährstoffaufnahme (kg/Tag) von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (Dauer ca. 168 Tage; MW ± SD, n=10) 96

Tabelle 53: Energiegehalt der Ration, tägliche Energie- und nXP-Aufnahme sowie ruminale N-Bilanz (RNB) (n=10) 97

Tabelle 54: Kobalt-Gehalte der im Fütterungsversuch (Teil II) eingesetzten Futtermittel (mg Co/kg T) 97

Tabelle 55: Tägliche Kobalt-Aufnahme (n=10) 97

Tabelle 56: Mittlere Mengen- und Spurenelement-Aufnahmen pro Tier und Tag sowie Mengen- und Spurenelement-Gehalte der Ration 98

Tabelle 57: Mittlere Milchleistung und Gehalt an Milchinhaltsstoffen sowie mittlere täglich produzierte Menge an Fett und Eiweiß im zweiten Teil des Fütterungsversuchs (n=10; MW ± SD) 98

Tabelle 58: Vitamin B12-Konzentration (pg/ml) im Serum von Milchkühen während des Fütterungsversuchs (Versuchsdauer etwa 280 Tage; MW ± SD; n=10) 100

Tabelle 59: Kobalt-Konzentration im Lebergewebe von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (µg Co/kg FS; MW ± SD; n=4) 101

Tabelle 60: Mittlere Lebendmasse der zur Leberbiopsie verwendeten Milchkühe mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (MW ± SD) 103

Tabelle 61: Lebermassen von Milchkühen und Formeln zu deren Errechnung 103

Tabelle 62: Vitamin B12-Ressourcen in der Leber von 8 Milchkühen und geschätzte Gesamt-Cobalamin-Menge (mg) an drei Probenterminen (MW ± SD) 104

Tabellenverzeichnis

Tabelle 63: Vitamin B12-Konzentration (ng/ml) in Milch und Kolostrum von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=10; MW ± SD) 104

Tabelle 64: Vitamin B12-Konzentration in der Kuhmilch (ng/ml) und deren Interpretation in Bezug auf die Kobalt-Versorgung (nach PULS, 1994) 106

Tabelle 65: Vitamin B12-Konzentration im Serum von Kälbern am Tag der Geburt sowie am 1., 2. und 5. Lebenstag (MW ± SD; n=10) bei unterschiedlicher Kobalt-Versorgung der Muttertiere 107

Tabelle 66: Effizienz von Kobalt in der ruminalen Vitamin B12-Synthese 109

Tabelle 67: Cobalamin-Absorptionshöhe (%) nach verschiedenen Autoren 109

Tabelle 68: Gegenüberstellung von Versuchsergebnissen an Mastbullen (STANGL et al., 1999 a und b) und Milchkühen (eigene Versuche) 111

Abbildungsverzeichnis

ABBILDUNGSVERZEICHNIS

Abbildung 1: Kobalt-Gehalte zweier Weiden in Norwegen im Verlauf mehrerer Jahre (nach ULVUND und PESTALOZZI, 1996) 8

Abbildung 2: Strukturformel des Vitamin B12-Moleküls (nach SMITH, 1997) 9

Abbildung 3: Vitamin B12-Konzentration im Panseninhalt von Schafen mit bzw. ohne Kobalt-Zulage (n=2) (nach SMITH und MARSTON, 1970a) 11

Abbildung 4: Vitamin B12-Produktion im Pansen von Schafen nach Absetzen einer täglichen Co-Gabe von 1 mg/d (nach SMITH und MARSTON, 1970a) 12

Abbildung 5: Beziehung zwischen der Kobalt-Konzentration im Panseninhalt von Schafen und dem Prozentsatz, der als Vitamin B12 vorliegt (nach SMITH und MARSTON, 1970a) 13

Abbildung 6: Modelle für freien und gebundenen Intrinsic Factor (nach GRASBECK, 1969 und SEETHARAM, 1999) 16

Abbildung 7: Übersicht über die Endozytose von Cobalamin (nach SEETHARAM, 1999) 17

Abbildung 8: Wege des Vitamin B12 im Körper (nach GRUNER et al., 1998) 19

Abbildung 9: Vitamin B12 abhängige Umlagerung von Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA (nach GRUNER et al., 1998) 22

Abbildung 10: Metabolische Schlüsselstellung des Adenosyl-Cobalamins (nach ZAGALAK, 1982) 23

Abbildung 11: Bedeutung des Methyl-Cobalamins bei der Methylgruppen- Übertragung (nach FRIEDRICH, 1987) 24

Abbildung 12: Zusammenhänge zwischen Folsäure-, Vitamin B12- und Homocystein-Stoffwechsel (nach REFSUM, 2001) 25

Abbildung 13: Zeitliche Abfolge unterschiedlicher Phasen bei der Entstehung eines klinischen Kobalt-Mangels (nach UNDERWOOD und SUTTLE, 1999) 30

Abbildung 14: Schema einer Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen Spurenelement-versorgung und Wirkung (nach UNDERWOOD und SUTTLE, 1999) 35

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 15: Mittlerer pH-Wert-Verlauf im Pansensaft von Milchkühen ohne und mit Co-Zulage während der ersten 300 Minuten nach Beginn der Morgenfütterung (MW ± SD; n=5) 70

Abbildung 16: NH3-N-Konzentrationen im Pansensaft der Milchkühe mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung in den ersten 300 Minuten nach Fütterung (MW ± SD; n=5) 71

Abbildung 17: Vitamin B12-Synthese je kg T-Aufnahme (Mittel aus 4 Analysen) ohne und mit Co-Zulage bei den 5 Fistelkühen 79

Abbildung 18: Mittlere tägliche Trockensubstanzaufnahme der Versuchs- gruppen im Versuchsverlauf (n=18) (Gruppe I,II und III entsprechen den Kobalt-Versorgungsstufen 0,10 ; 0,20 und 0,30 mg Co/kg Futter-T) 84

Abbildung 19: Entwicklung der Milchleistung (FCM) bei unterschiedlicher Kobalt- Versorgung (n=18; Versuchsdauer 112 Tage) 88

Abbildung 20: Vitamin B12-Konzentration im Serum von Milchkühen in Abhängigkeit von ihrer Kobalt-Versorgung mit fortschreitender Laktation (n=18) 91

Abbildung 21: Milchmenge, -Fett und -Eiweiß im Versuchsverlauf (n=10) 99

Abbildung 22: Vitamin B12-Konzentration im Serum von Milchkühen im Verlauf der Laktation bei unterschiedlicher Kobalt- Versorgung (n=10) 100

Abbildung 23: Vitamin B12-Konzentration im Lebergewebe von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (mg/kg; n=4) 102

Abbildung 24: Beziehung zwischen Kobalt-Aufnahme und Vitamin B12- Konzentration im Lebergewebe von Schafen (nach MARSTON, 1970) 102

Abbildung 25: Vitamin B12-Konzentration in der Milch von Kühen in Abhängigkeit vom Laktationsstadium (nach GREGORY et al., 1958) 105

Abbildung 26: Vitamin B12-Konzentration in Serum und Lebergewebe von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=4) 111

Abbildung 27: Vitamin B12-Konzentration im Serum (pg/ml) und tägliche Milchmenge (kg/Tag) von Kühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=18) 112

Abkürzungsverzeichnis

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

γ-GT Gamma-Glutamyl-Transferase

ADF Säure-Detergentien-Faser (Acid detergent fiber)

ARC Agriculture Research Council

Ado-Cbl Adenosyl-Cobalamin

AST Aspatat-Aminotransferase

C2 Essigsäure

C3 Propionsäure

C4 Buttersäure

C5 Valeriansäure

Cbl Cobalamin

Co Cobalt

CoA Coenzym A

Cr2O3 Chromoxid

DM Dry matter

FAL Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft

FFS Flüchtige Fettsäuren

FCM Fettkorriegierte Milch (fat corrected Milk)

FOS Fermentierbare organische Substanz

FS Frischsubstanz

GfE Gesellschaft für Ernährungsphysiologie

GLDH Glutamat-Dehydrogenase

ICP Inductively-coupled-plasma

IF Intrinsic Factor

IF-Cbl Intrinsic Factor-Cobalamin

IFCR Intrinsic Factor – Cobalamin-Rezeptor

INRA Institut National de la Recherche Agronomique

LMZ Lebendmassezunahme

ME Umsetzbare Energie

Abkürzungsverzeichnis

Me-Cbl Methyl-Cobalamin

MJ Megajoule

MMA Methylmalonylsäure (Methylmalonic acid)

MN Mikrobieller Stickstoff

MP Mikrobenprotein

MW Mittelwert

n Stichprobenumfang

N Stickstoff

NAN Nicht-Ammoniak-Stickstoff

NDF Neutral-Detergentien-Faser (neutral detergent fiber)

NEL Nettoenergie Laktation

NH3 Ammoniak

NPN Nicht-Protein-Stickstoff

NRC National Research Council

nXP Verdauliches Rohprotein

OS Organische Substanz

p Irrtumswahrscheinlichkeit

RNB Ruminale Stickstoff-Bilanz

SD Standarddifferenz

T Trockensubstanz

TC (I –III) Transcobalamin (I – III)

U/min Umdrehungen pro Minute

VK Variationskoeffizient

XA Rohasche

XF Rohfaser

XL Rohfett

XP Rohprotein

XX n-freie Extraktstoffe (NfE)

Einleitung

1

1 EINLEITUNG Vitamin B12 (auch Cobalamin genannt) kann nur von einigen Bakterien und Hefen synthetisiert werden und ist aus diesem Grund in pflanzlichen Futtermitteln nicht enthalten (COSTIGAN und GERDES, 1991). Während der Mensch und die meisten Säugetiere auf eine Zufuhr von Vitamin B12 mit der Nahrung angewiesen sind, können die Mikroorganismen in den Vormägen der Wiederkäuer Vitamin B12 synthetisieren. Vorraussetzung hierfür ist jedoch eine ausreichende Versorgung mit Kobalt (Co), welches das Zentralatom des Vitamin B12-Moleküls darstellt. Bei ausreichender Kobalt-Zufuhr und physiologischem Pansenmilieu kann in den Vormägen genügend Cobalamin synthetisiert werden, um den Bedarf der Pansenmikroorganismen und des Wiederkäuers zu decken. Nach BIGGER et al. (1976) und ZINN et al. (1987) beläuft sich die Vitamin B12-Synthese auf Werte zwischen 0,33 und 2,0 mg/kg Trockensubstanzaufnahme. Angaben zur täglich am Dünndarm anflutenden Vitamin B12-Menge schwanken zwischen 0,6 und 10 mg/Tag (STEINBERG und KLÜNTER, 1995), von der etwa 1-3% absorbiert werden (GIRARD, 1998). Vitamin B12 fungiert im Stoffwechsel höherer Organismen als Co-Enzym bei bisher zwei bekannten Reaktionen. Bei der ersten handelt es sich um einen Reaktionsschritt beim Abbau der im Pansen durch Fermentationsprozesse entstehenden Propionsäure. Das Enzym Methylmalonyl-CoA-Mutase katalysiert die Umwandlung von Methylmalonyl-CoA in Succinyl-CoA. Weil die Propionsäure beim Wiederkäuer eine wichtige Energiequelle darstellt (SCOTT, 1999), kommt es durch Kobalt- bzw. Vitamin B12-Mangel zu Störungen im Energiehaushalt des Wiederkäuers. Bei der zweiten Reaktion, bei der Vitamin B12 Co-Enzym-Funktion hat, handelt es sich um die Umwandlung von Homocystein in Methionin. Durch die gleichzeitige Regenerierung von Folsäure wird beim Kobalt- bzw. Vitamin B12-Mangel auch der Folsäuremetabolismus beeinträchtigt. Bei Kobalt-Mangel zeigen betroffene Tiere verminderte Futteraufnahme bei gleichzeitig abnormem Appetit auf zum Teil unverdauliche Stoffe, wie zum Beispiel Holz, Erde aber auch verschmutzte Einstreu (WIESNER, 1970). Weiterhin können fortschreitender Gewichtsverlust und/oder Rückgang der Leistung sowie Fruchtbarkeitsstörungen beobachtet werden. Da die bisherigen Empfehlungen zur Spurenelementversorgung von Milchkühen hauptsächlich auf Versuchen mit Schafen und Mastrindern beruhen, war die Zielstellung der vorliegenden Untersuchung, den Einfluss von Kobalt-Ergänzungen auf die mikrobielle Vitamin B12-Synthese und die Vitamin B12-Konzentrationen in Serum, Lebergewebe und Milch von Kühen sowie weitere Parameter (Trockensubstanzaufnahme, Milchleistung, Gehalt an Milchinhaltsstoffen) zu untersuchen, um damit die Datenbasis für Empfehlungen zur Kobalt-Versorgung von Milchkühen auf experimenteller Grundlage zu erweitern.

Einleitung

2

Da nach ALLAWAY (1975) der Zusammenhang zwischen dem Kobalt-Gehalt in Boden und Pflanze einerseits und der Gesundheit vom Wiederkäuer andererseits ein eindrucksvolles Beispiel für die Beziehung Boden-Pflanze-Tier darstellt (The relationship of the levels of Co in soils and plants to the health of ruminants is one of the striking examples of a soil and plant relationship to animal health.), soll zunächst ein Literaturüberblick über Kobalt in Boden, Pflanze und Tier gegeben werden.

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2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Kobalt-Vorkommen im Boden Kobalt zählt zu den essentiellen Spurenelementen für Mensch und Tier sowie für einige Mikroorganismen. Während der Mensch und die meisten monogastrischen Säugetiere dieses Element jedoch nicht direkt verwerten können, ist der Wiederkäuer auf Grund seiner Pansenmikroorganismen dazu in der Lage. Da über Kobalt-Mangel nur aus regional stark begrenzten Gebieten berichtet wird, liegt die Vermutung nahe, dass die geochemischen Verhältnisse und der Zustand der Böden einen Einfluss auf die Kobalt-Versorgung der Tiere haben. Kobalt kommt im Boden in nur sehr geringer Konzentration vor (REID und HORVATH, 1980; SMITH, 1997), wobei die Angaben zwischen 0,05 und 300 mg/kg schwanken (SMITH und PATERSON, 1999). Der mittlere Kobaltgehalt liegt in unseren Breiten etwa in der Größenordnung von 10 bis 15 mg Co/kg und ist je nach Bodentyp in größerem Umfang schwankend. Grundsätzlich liegen nur wenige Daten über Kobalt-Gehalte in Böden vor und diese stammen in der Regel aus Gebieten, in denen Kobalt-Mangel beobachtet wurde (LATTEUR, 1962). Der Kobalt-Gehalt der Böden wird primär durch das jeweilige Ausgangsgestein bestimmt (SMITH und PATERSON, 1999). Als Faustregel kann folgendes angenommen werden: Hohe Kobaltgehalte treten in ultrabasischen Gesteinen mit Gehalten von 200-300 mg/kg auf. Deutlich geringere Gehalte weisen basische (30-45 mg/kg) sowie saure oder neutrale (5-10 mg/kg) Böden vulkanischen Ursprungs auf. Arm an Kobalt sind vor allem Sandböden, Kalksteine und Lehm (0,1-5 mg/kg; REID und HORVATH, 1980). Weiterhin gilt, dass Böden aus ariden und semi-ariden Gebieten höhere Kobalt-Gehalte aufweisen, als solche aus polaren, gemäßigten oder tropischen Zonen (AUBERT und PINTA, 1977). In Tabelle 1 ist eine vereinfachte Übersicht über den Zusammenhang zwischen Kobalt-Gehalt im Boden und Ausgangsgestein dargestellt.

Tabelle 1: Allgemeine Beziehung zwischen Gesteinstypen und Kobalt-Gehalten im Boden (nach PATERSON, 1988)

Erstarrungsgesteine Sedimentgesteine Metamorphite

Hohe Kobalt-Gehalte

Ultrabasische und basische Gesteine

z.B. Dunit

Tonige Gesteine z.B. Tonschiefer

Metamorphe Gesteine mit Fe-Mg-Mineralien

z.B. Serpentin

Niedrige Kobalt-Gehalte

Saure Gesteine z.B. Granit

Sandige Gesteine z.B. Sandsteine

Metamorphe silicatreiche Gesteine

z.B. Gneis

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Auch innerhalb der Böden ist die Verteilung des Kobalts recht unterschiedlich. So ist Kobalt in der Regel in solchen Zonen vermehrt, die reich an organischer Substanz und Tonen sind. Mit wenigen Ausnahmen kann bei der Beschreibung der vertikalen Verteilung von Kobalt im Boden das von LATTEUR (1962) aufgestellte Schema angewendet werden: - In der oberen, in der Regel durch Humus angereicherten Schicht befindet sich ein

befriedigender Kobaltgehalt. Diese Schicht ist meist nur gering ausgeprägt. Die meisten Pflanzen, deren Wurzeln sich in diesem Bereich befinden, können Kobalt nur in geringem Umfang verwerten.

- Die sich anschließende Zwischenschicht ist arm an Kobalt, da dieses größtenteils ausgewaschen wurde. Die in diesem Bereich wurzelnden Pflanzen wie z.B. die Leguminosen haben auf Grund ihrer im Wurzelbereich vorhandenen Rhizobium-Bakterien einen Kobalt-Bedarf.

- Unter diesen Schichten beinhalten die Bodenbereiche hohe Kobalt-Gehalte. Sie sind jedoch für die Wurzeln der Pflanzen meist nicht mehr zu erreichen.

Darüber hinaus ist es entscheidend, in welcher Form Kobalt vorliegt. Oxid-, Hydroxid- und Karbonatverbindungen sind nur schwer löslich und in alkalischer Umgebung immobil. In saurem Milieu sind sie leichter löslich, was Auswaschungsprozesse begünstigt. Aus diesem Grunde weisen alkalische Böden in der Regel höhere Gesamtkobaltgehalte auf als saure Böden (SMITH und PATERSON, 1999). Neben den Ausgangsgesteinen sind sowohl die Art der Bodenbearbeitung als auch die Art und Intensität der Düngung für den Kobalt-Gehalt von Bedeutung (CLARK, 1998). Durch Bodenbearbeitung können je nach Intensität die oben genannten Schichten mehr oder weniger miteinander vermischt werden. Auch Veränderungen des Wasserhaushalts des Bodens durch Drainage können den Auswaschungsprozess beschleunigen (LATTEUR, 1962) . Einen recht großen Einfluss hat die Verwendung von Düngemitteln, wobei Art und Menge des Düngers von entscheidender Bedeutung sind. Der Einfluss auf den Kobalt-Gehalt erfolgt, da die Düngemittel selbst meist nur wenig Kobalt enthalten (LATTEUR, 1962), über eine Veränderung des Bodenmilieus. Aus den dargestellten Zusammenhängen ist ersichtlich, dass eine pauschale Aussage über den Kobalt-Gehalt im Boden nicht zu treffen ist. Aus Struktur vom Boden und Ausgangsgestein können lediglich Anhaltspunkte gewonnen werden. Bei der Beurteilung eines Bodens bezüglich seines Kobalt-Gehalts ist demnach eine Analyse des Spurenelement-Gehalts von großer Bedeutung.

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2.2 Faktoren, die den Kobalt-Gehalt der Pflanze beeinflussen

2.2.1 Verfügbarkeit des Kobalts für die Pflanze Bisher gibt es keine Hinweise darauf, dass Kobalt auch für Pflanzen ein essentielles Spurenelement darstellt (MARSTON, 1952; SMITH und PATERSON, 1999). Ein Kobalt-Bedarf wurde bisher nur für Leguminosen nachgewiesen (WHITEHEAD, 2000), wobei das Kobalt von den stickstoff-fixierenden Bakterien im Wurzelbereich benötigt und angereichert wird (YOUNG, 1979; SMITH und PATERSON, 1999). Die Bakterien verwenden Kobalt zum einen zur Bildung von Vitamin B12, zum anderen dient es ihnen als Wachstumsfaktor. Bei höheren Kobalt-Gehalten im Boden sind die Bakterien in der Lage, mehr Stickstoff zu binden, was ein verstärktes Wachstum mancher Leguminosenarten zur Folge hat (YOUNG, 1979). Obwohl alle übrigen Grünpflanzen keinen Kobalt-Bedarf haben, nehmen sie es aus dem Boden auf, wobei die Höhe der Kobaltaufnahme durch eine Reihe von Faktoren beeinflusst wird. Neben der Art der Pflanze ist hierbei vor allem die Verfügbarkeit des Kobalts zu nennen. Generell gilt, dass Pflanzen auf kobaltarmen Böden geringere Kobalt-Gehalte aufweisen als vergleichbare Arten auf kobaltreicheren Böden (YOUNG, 1979; SMITH und PATERSON, 1999). Diese Beziehung ist jedoch nicht allgemeingültig (ULVUND und PESTALOZZI, 1996), da die Verfügbarkeit des Kobalts durch den Wassergehalt, den pH-Wert und die Präsenz anderer Mineralstoffe und Spurenelemente beeinflusst wird (SMITH und PATERSON, 1999). Böden mit hohem Wassergehalt weisen im Vergleich zu gut entwässerten Böden deutlich höhere Gehalte an extrahierbarem und für die Pflanzen verfügbarem Kobalt auf. Neben dem Wassergehalt spielt hierbei vor allem der pH-Wert eine große Rolle. Bei einem hohen Boden-pH-Wert ist nach WHITEHEAD (2000) die Verfügbarkeit von Kobalt für Pflanzen vermindert. MITCHELL (1972) stellte fest, dass durch einen Anstieg des pH-Wertes von 5,4 auf 6,4 der Kobalt-Gehalt in Rotklee um etwa 40 % reduziert wurde. Eine mögliche Erklärung hierfür ist eine Komplexbildung. Wie bereits in Kapitel 2.1 aufgeführt, liegt Kobalt bei hohen pH-Werten in nur schwer löslichen Verbindungen vor, so dass eine Aufnahme durch Pflanzen erschwert wird. Durch den pH-Wert wird auch ein weiterer Faktor beeinflusst, der bei der Diskussion der Kobalt-Verfügbarkeit für Pflanzen in Betracht gezogen werden muss. Kobalt ist in vielen Fällen in der Natur mit Mangan vergesellschaftet. Bei Bildung von Manganoxiden lagern sich schnell Kobalt-Ionen zunächst locker an (ADAMS et al., 1969), die später durch eine Oxidation das Mangan ersetzen können. Mit steigendem pH-Wert wird die Bildung dieser Komplexe gefördert. Untersuchungen in Australien ergaben, dass durchschnittlich 79 % des Boden-Kobalts in Manganmineralien enthalten ist (McKENZIE, 1972). Kobalt, das in dieser Form gebunden ist, kann von den Pflanzen nicht aufgenommen werden (SMITH und PATERSON, 1999).

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2.2.2 Einfluss der Pflanzenart auf ihren Kobalt-Gehalt Zwischen den verschiedenen Pflanzenarten gibt es unabhängig vom Einfluss des Bodens und der klimatischen Bedingungen große Unterschiede in ihrer Fähigkeit, Kobalt aufzunehmen und zu speichern (POOLE et al., 1972). Wiesenkräuter und Leguminosen weisen unter denselben Aufwuchsbedingungen höhere Kobalt-Gehalte auf als Gräser (MENKE und HUSS, 1987). Kleearten sind bei ausreichender Kobalt-Verfügbarkeit des Bodens reicher an Kobalt. Bei ungenügenden Kobalt-Gehalten im Boden kommt es unter Umständen aber auch zwischen den einzelnen Pflanzenspezies zu einer umgekehrten Reihung bezüglich der Kobalt-Gehalte (POOLE et al., 1972). Bei ausreichendem Kobalt-Gehalt im Boden können die verschiedenen Pflanzenspezies schematisch nach hoher, mittlerer und geringer Kobalt-Aufnahme und -Speicherung eingeteilt werden (LATTEUR, 1962 ; POOLE et al., 1972). Eine Übersicht über diese Gruppen mit typischen Vertretern gibt Tabelle 2.

Tabelle 2: Kobalt-Gehalte verschiedener Pflanzenspezies bei gleichen Aufwuchsbedingungen (nach LATTEUR, 1962 und POOLE et al., 1972)

Hoher Kobalt-Gehalt (über 0,1 mg/kg T)

Mittlerer Kobalt-Gehalt (0,07 – 0,1 mg/kg T)

Niedriger Kobalt-Gehalt (unter 0,07 mg/kg T)

Luzerne Straussgras Mais Klee Knaulgras Weizen Wicken Lieschgras Gerste Lupinen Weidelgras Hafer Rispengras Wiesenfuchsschwanz Roggen Einige Kräuter Einige Moorpflanzen

Aus dieser Aufstellung ist ersichtlich, dass die für Wiederkäuer gebräuchlichsten Grundfuttermittel mittlere bis niedrige Kobalt-Gehalte aufweisen. Diese Werte sind jedoch auf Böden ermittelt worden, wo kein Kobalt-Mangel vorlag. In Gebieten, aus denen über Kobalt-Mangel berichtet wird, liegen die Gehalte in den Pflanzen oftmals um ein Vielfaches niedriger.

Es gibt auch einige wenige Pflanzenarten, die in der Lage sind, Kobalt nicht nur aufzunehmen und zu speichern, sondern auch anzureichern. Bestimmte Süßhölzer (Astragalus sp.) weisen zum Teil Kobalt-Gehalte bis zu 100 mg/kg Trockenmasse auf.

CLARK (1998) stellt die These auf, dass durch Züchtung Einfluss auf den Kobalt-Gehalt der Pflanzen genommen werden kann. Er ist der Ansicht, dass vor allem Gräserarten, die auf höhere Erträge gezüchtet wurden, eine geringere Fähigkeit zur Aufnahme und Speicherung von Spurenelementen besitzen.

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2.2.3 Weitere Faktoren, die den Kobalt-Gehalt von Pflanzen beeinflussen Für die Beurteilung der Kobalt-Versorgung grasender Rinder und Schafe ist es wichtig, die Artenverteilung auf der Weide zu berücksichtigen. Weiden mit einem hohen Anteil an Klee weisen einen höheren Kobalt-Gehalt auf als solche, auf denen vornehmlich Gräser vorkommen (CLARK, 1998). Ebenso wirkt sich ein großer Anteil an Kräutern aus (YOUNG, 1979). Allgemein lässt sich feststellen, dass je artenreicher eine Weide ist, desto höher ist der Kobalt-Gehalt. Die Artenvielfalt wird neben dem Standort auch durch die Intensität der Nutzung beeinflusst. Extensiv genutzte Weiden zeigen ein größeres Spektrum verschiedener Arten als intensiv genutzte (YOUNG, 1979) oder Mahd-Weiden bzw. Wiesen. Je mehr Schnitte pro Jahr gemacht werden, desto weniger verschiedene Gräserarten kommen vor. Die unter 2.2.1 und 2.2.2 über den jeweiligen Kobalt-Gehalt der Pflanzen gemachten Angaben bezogen sich auf den Gehalt in den Ganzpflanzen. Da jedoch nicht immer alle Bestandteile der Pflanzen als Futtermittel verwendet werden, müssen für genauere Aussagen über für das Tier verfügbare Kobalt-Mengen, die einzelnen Teile der Pflanzen getrennt betrachtet werden. LATTEUR (1962) gibt Mittelwerte an, die er auf eine Reihe verschiedener Pflanzenspezies anwendet. Er fand in Blättern die höchsten Kobalt-Gehalte mit durchschnittlich 0,19 mg/kg T. Samen, Früchte, Wurzeln und Wurzelknollen lagen im Bereich von 0,06 bis 0,08 mg Co/kg T. Die mit Abstand niedrigsten Kobalt-Werte konnten in verholzten Teilen wie Schalen oder Kernen mit durchschnittlich 0,006 mg/kg T ermittelt werden. Demgegenüber macht WHITEHEAD (2000) die Aussage, dass generell bei Leguminosen und Gräsern der höchste Kobalt-Gehalt in den Wurzeln zu finden ist, wobei er nicht ausschließt, dass diese Verteilung durch die Menge des verfügbaren Kobalts beeinflusst werden kann. Gleiches gilt für die Verteilung des Kobalts zwischen Blatt und Stengel. FLEMING (1963) fand heraus, dass bei ausreichender Kobalt-Versorgung der Pflanzen die Anteile in den Blättern höher waren als in den Stengeln. Bei mangelhafter Versorgung mit Kobalt bestand dieser Unterschied nicht mehr. Bei Steck- und Runkelrüben befindet sich das meiste Kobalt in den Blättern. Der Rübenkörper beider Rübenarten zählt zu den kobaltarmen Futtermitteln (<0,07 mg/kg T).

Einen maßgeblichen Einfluss auf den Kobalt-Gehalt in den Pflanzen hat zudem ihr Vegetationsstadium. FLEMING und MURPHEY (1968) stellten mit zunehmendem Alter der Gräser einen abnehmenden Kobalt-Gehalt fest. Verantwortlich ist hierbei einerseits das Verhältnis von Blättern zu Stengeln, das bei jungem Gras höher ist. Andererseits kommt es bei fortschreitendem Vegetationsstadium zur Bildung von Samen, die nach LATTEUR (1962) niedrigere Kobalt-Gehalte aufweisen als Blätter. Deutlich wird dies beim Mais, der zu Beginn der Kolbenbildung einen Gehalt von 0,10 mg Co/kg T aufweist, in der Teigreife nur noch 0,04 mg Co/kg T (JEROCH et al., 1993).

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Ein Einfluss der Jahreszeiten auf den Kobalt-Gehalt konnte bisher nicht festgestellt werden. KLESSA et al. (1989) ermittelten auf schottischen Versuchsfeldern den niedrigsten Kobalt-Gehalt in Gräsern zwischen Juni und August. Sie machten hierfür zum einen das fortgeschrittene Vegetationsstadium und zum anderen den niedrigen Wassergehalt im Boden in diesen Monaten verantwortlich. Untersuchungen, die von ULVUND und PESTALOZZI (1996) von 1985 bis 1995 in Norwegen durchgeführt wurden, zeigen große Variationen im Kobalt-Gehalt sowohl zwischen den einzelnen Schnitten, die jeweils in der 21., 26. und 32. Kalenderwoche durchgeführt wurden, als auch über den gesamten Versuchszeitraum. (Abbildung 1).

Abbildung 1: Kobalt-Gehalte zweier Weiden in Norwegen im Verlauf mehrerer Jahre (nach ULVUND und PESTALOZZI, 1996)

Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass der Kobalt-Gehalt in den Pflanzen von einer Reihe Faktoren abhängt, die sich teilweise auch gegenseitig beeinflussen. Ebenso wie bei der Beurteilung des Kobalt-Gehalts und seiner Verfügbarkeit im Boden können auch bei den Pflanzen lediglich Tendenzen aufgezeigt werden. Zur Beurteilung, ob ein Futtermittel für Wiederkäuer ausreichend Kobalt enthält, ist deshalb eine Analyse des Kobalt-Gehalts unerlässlich. Eine Übersicht über den Kobalt-Gehalt ausgewählter Futtermittel ist im Anhang 1 enthalten.

Weide A

Weide B

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2.3 Vitamin B12 Vitamin B12 weist in vielerlei Hinsicht Besonderheiten innerhalb der Gruppe der Vitamine auf. So ist es das letzte Vitamin, welches entdeckt wurde. Seine Isolierung erfolgte erst im Jahre 1948, aber bereits lange vor seiner Entdeckung gab die Substanz Anlass zu Forschungen. Bereits im Jahre 1926 stellten MINOT und MURPHEY fest, dass der damals als Antiperniziosa-Faktor bezeichnete Bestandteil im rohen Lebergewebe dazu benutzt werden konnte, beim Menschen die pernizinöse Anämie zu heilen. Nach Aufklärung der Strukturformel (HODGKIN et al., 1955; Abb. 2) konnte eine Reihe von Eigenschaften am Molekül festgestellt werden, die es von anderen Vitaminen unterscheidet.

Abbildung 2: Strukturformel des Vitamin B12-Moleküls (nach SMITH, 1997)

So weist das Vitamin B12-Molekül im Vergleich zu anderen Vitaminen eine recht komplizierte Molekülstruktur auf, was auch durch das Molekulargewicht von 1355 deutlich wird und mit dem Kobalt-Atom als Zentralatom hat es als einziges Vitamin ein Metallzentralatom. Der Anteil des Kobalts am Gesamtmolekül beträgt 4,35% (UNDERWOOD, 1975; YOUNG, 1979). Bei der chemischen Grundstruktur der Cobalamine handelt es sich um ein Corrinringsystem aus vier teilweise hydrierten Pyrrolringen. In diesem Corrinring ist das Kobalt-Atom als dreiwertiges Kobalt über vier Bindungen fest eingebunden (FRIEDRICH, 1987; BUDDECKE, 1994). Darüber hinaus liegen am Kobalt-Atom noch zwei weitere Bindungen vor, wobei in α-Position eine 5,6 Dimethylbenzimidazol-Gruppe gebunden ist. Der Ligand in β-Position (Abb. 2: „R“) ist verantwortlich für die chemischen und biochemischen Eigenschaften des Cobalamins (FRIEDRICH, 1987). Bei den vier am häufigsten

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vorkommenden Vitamin B12-Verbindungen handelt es sich um eine 5´Desoxyadenosyl-, Methyl- oder Hydroxy-Gruppe sowie Wasser in β-Stellung (REHNER und DANIEL, 1999; FRIEDRICH, 1987), so dass die entstehenden Verbindungen Adenosyl-, Methyl-, Hydroxo- oder Äquocobalamin sind. Bei der als Cyanocobalamin bezeichneten Verbindung handelt es sich vermutlich nicht um eine physiologisch wirksame Verbindung, bei der der entsprechende Ligand eine Cyano-Gruppe ist (FRIEDRICH, 1987; SEETHARAM und ALPERS, 1982; SCOTT, 1999). Als Cobalamin-Analoga werden solche Verbindungen bezeichnet, die eine andere Gruppe als 5,6 Dimethylbenzimidazol an α-Position des Kobalt-Atoms aufweisen (FRIEDRICH, 1987; McDOWELL, 2000). Diese haben im Stoffwechsel höherer Tiere keine Bedeutung, da sie keine Co-Enzymfunktion ausüben (KÜNEMUND, 1977: ELLIOT, 1979).

2.4 Vitamin B12-Synthese im Pansen Kobalt wird als essentielles Spurenelement für alle Säugetiere bezeichnet. Während jedoch die meisten Säugetiere das Kobalt in gebundener Form als Vitamin B12 benötigen, sind die Wiederkäuer in der Lage das Kobalt in seiner elementaren Form zur mikrobiellen Vitamin B12-Synthese zu verwerten (LATTEUR, 1962; SMITH, 1987). Vitamin B12 wird ausschließlich von Bakterien, Blaualgen und einigen Hefearten produziert (FRIEDRICH, 1987; SMITH, 1987). Eine Synthese im Stoffwechsel höherer Organismen ist nicht möglich, weshalb den meisten Säugetieren Vitamin B12 mit der Nahrung zugeführt werden muss. Aus diesem Grund erfolgte die Einordnung der Cobalamine in die Gruppe der Vitamine, die per definitionem lebensnotwendige Stoffe und in kleinsten Mengen wirksam sind. Futtermittel pflanzlicher Herkunft enthalten kein Vitamin B12. Geringe Cobalamin-Mengen in Futtermitteln werden von McDOWELL (1992) auf eine Kontamination mit Bakterien bzw. Hefen zurückgeführt. Weil die beim Wiederkäuer im Pansen vorkommenden Bakterien unter strikt anaeroben Bedingungen Cobalamine synthetisieren können (COSTIGAN und GERDES, 1991), spricht man beim Wiederkäuer anstelle eines Vitamin B12-Bedarfs vom Kobalt-Bedarf, wobei es sich im engeren Sinne um den Kobalt-Bedarf der Pansen-Bakterien handelt. Von der Vielzahl der im Pansen auftretenden Bakterienstämme sind jedoch nur wenige in der Lage, Vitamin B12 zu bilden. DRYDEN et al. (1962) konnten unter 48 im Pansen auftretenden Bakterienstämmen nur 8 ermitteln, die Cobalamine oder deren Analoga synthetisieren. Vitamin B12-Produzenten sind zum Beispiel manche Nocardia-, Streptomyces- und Bacillusarten sowie Propionsäurebakterien (BENDER, 1970; ZAGALAK, 1982). Letztere zählen zu den aktivsten Vitamin B12-Bildnern, wobei besonders Propionibacterium shermanii zu erwähnen ist, das auch zur industriellen Herstellung von Cobalaminen verwendet wird (STÀRKA, 1968; FRIEDRICH, 1987). Die im Pansen vorkommenden Protozoen können kein Vitamin B12

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synthetisieren. Sie sind wie der Wiederkäuer auf das von den Bakterien produzierte Vitamin B12 angewiesen (LATTEUR, 1962). Hohe Kobalt-Konzentrationen senkten in Versuchen von KISIDAYOVÀ et al. (2001) sogar die Anzahl an Protozoen. Ob von Protozoen aufgenommenes Cobalamin für den Wiederkäuer noch zur Verfügung steht, ist bislang ungeklärt.

Der Zusammenhang zwischen Kobalt und Vitamin B12 wurde schon kurz nach der Entdeckung des Vitamins noch vor Aufklärung seiner Struktur in einer Reihe von Versuchen nachgewiesen. Verschiedene Autoren (HALE et al., 1950; HINE und DAWBARN, 1954; KERCHER und SMITH, 1956) stellten fest, dass die Konzentration des Vitamin B12 im Panseninhalt von der Anwesenheit von Kobalt in der Ration abhängig ist. Da hierbei jedoch keine konkreten Angaben zur erforderlichen Kobalt-Menge für die Cobalamin-Synthese gemacht werden konnten, wurden weitere Versuche durchgeführt. Eine umfangreiche Arbeit stellt in diesem Zusammenhang die von SMITH und MARSTON (1970a) durchgeführte Untersuchung zur Produktion, Absorption und Exkretion von Vitamin B12 beim Schaf dar. Hierbei wurden in einem Stoffwechselversuch pansenfistulierte Australische Merinoschafe mit einer kobaltarmen Grundration ernährt. Während eine Gruppe ohne Supplementierung blieb, wurde der anderen Gruppe täglich oral 1 mg Kobalt (als Kobalt-Chlorid) in Wasser gelöst eingegeben. Abbildung 3 zeigt die Vitamin B12-Konzentration im Panseninhalt innerhalb der ersten 8 Stunden nach Kobalt-Gabe. Hierbei wurde die erste Probe unmittelbar nach Kobalt-Gabe entnommen.

Abbildung 3: Vitamin B12-Konzentration im Panseninhalt von Schafen mit bzw. ohne

Kobalt-Zulage (n=2) (nach SMITH und MARSTON, 1970a)

Stunden nach Kobalt-Applikation

µg V

itam

in B

12/g

Pan

seni

nhal

t fris

ch

µg V

itam

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12/g

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Aus Abbildung 3 ist ersichtlich, dass nach Zulage von Kobalt die Vitamin B12-Konzentration deutlich höher ist als ohne Kobalt-Zulage. Offensichtlich setzt die Vitamin B12-Synthese unmittelbar nach Kobalt-Gabe ein, fällt aber bis etwa 4-6 Stunden nach der Fütterung auf das Produktionsminimum. In einem weiteren Versuch erhielten zwei Tiere zunächst über 16 Wochen täglich oral 1 mg Kobalt. Danach entfiel die tägliche Kobalt-Zulage, woraufhin innerhalb von 5 Tagen die aus den im Panseninhalt gemessenen Konzentrationen geschätzte tägliche Vitamin B12-Produktion von 600-750 µg/Tag auf ungefähr 50 µg/Tag fiel. Über die weiteren 115 Tagen wurde dieses Produktionsniveau beibehalten (Abbildung 4). Die Schätzung der Vitamin B12-Produktion erfolgte mittels Markermethode unter Verwendung von Lignin als Markersubstanz.

Abbildung 4: Vitamin B12-Produktion im Pansen von Schafen nach Absetzen einer täglichen Co-Gabe von 1 mg/d (nach SMITH und MARSTON, 1970a)

HALE et al. (1950) sowie HINE und DAWBARN (1954) stellten die These auf, dass Kobalt bei geringerer Verfügbarkeit im Pansen effizienter zur Vitamin B12-Synthese genutzt wird, was SMITH und MARSTON (1970a) bestätigten. Sie leiteten aus ihren Versuchen ab, dass es einen nahezu linearen Zusammenhang zwischen dem in Form von Vitamin B12 gebundenen Kobalt (%) und der Kobalt-Konzentration im Panseninhalt gibt. So wurde bei Tieren mit Kobalt-Mangel etwa 15 % des Kobalts zu Vitamin B12 umgewandelt, während es bei Tieren, die 1 mg Co/d erhielten nur etwa 3 % waren. In Abbildung 5 ist diese Beziehung dargestellt, wobei Lignin als Marker diente.

Tage nach Kobalt-Entzug

Vita

min

B12

-Pro

dukt

ion

(µg/

Tag)

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Abbildung 5: Beziehung zwischen der Kobalt-Konzentration im Panseninhalt von Schafen und dem Prozentsatz, der als Vitamin B12 vorliegt (nach SMITH und MARSTON, 1970a)

SINGH und CHHABRA (1995) stellten in einem Versuch mit pansenfistulierten Rindern fest, dass der Kobalt-Gehalt in der Ration einen signifikanten (p<0,01) Einfluss auf die Vitamin B12-Konzentration im Panseninhalt hatte. Bei höheren Kobalt-Gehalten in der Ration konnte auch ein Anstieg der Vitamin B12-Konzentration im Panseninhalt festgestellt werden. Es wurde jedoch beobachtet, dass nur bei Kobalt-Gehalten bis 0,37 mg Co/kg T ein linearer Zusammenhang zwischen Kobalt-Zulage und Vitamin B12-Konzentration bestand. Bei einer weiteren Erhöhung der Kobalt-Gaben konnte kein entsprechender Zusammenhang mehr festgestellt werden. Da das Verhältnis der einzelnen Bakterienarten im Pansen zueinander und die Gesamtzahl der Pansenmikroorganismen von der jeweiligen Rationsgestaltung abhängen, kann es auch bei ausreichender Kobalt-Versorgung zu einer Einschränkung der Vitamin B12-Synthese kommen (WALKER und ELLIOT, 1972; GIRARD, 1998). Die Effizienz der Vitamin B12-Synthese ist demnach nicht nur von der Menge an verfügbarem Kobalt sondern auch von weiteren Faktoren, wie Rohfasergehalt in der Ration und der Höhe der Trockensubstanzaufnahme abhängig (SMITH und MARSTON, 1970a; WALKER und ELLIOT, 1972; HEDRICH et al., 1973). Es gibt Hinweise, dass bei kraftfutterreicher Fütterung prozentual weniger Vitamin B12 synthetisiert wird (WALKER und ELLIOT, 1972; HALPIN et al., 1984). Gleichzeitig fördern Rationen mit hohem Kraftfutteranteil die Produktion von Propionsäure (BAUMAN et al., 1971; LEBZIEN, 1980). Da Vitamin B12 für den Abbau von Propionat benötigt wird (Kapitel 2.7.1), kommt es zusätzlich zu einem Anstieg des Vitamin B12-Bedarfs sowohl der Bakterien als auch des Wirtes.

µg Co/g Lignin

Ant

eil d

es C

o im

Vita

min

B12

(%)

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Die meisten Vitamin B12 synthetisierenden Bakterien bilden gleichzeitig auch unwirksame Analoga (Kap. 2.3). Bei Veränderung der Rationszusammensetzung kann auch das Verhältnis von Vitamin B12 zu den Analoga verschoben werden. Panseninhalte von Kühen (WALKER und ELLIOT, 1972) und Schafen (BIGGER et al., 1976), die kraftfutterreiche, rohfaserarme Rationen erhielten, wiesen signifikant höhere Analoga-Konzentrationen auf als solche von Tieren mit dominierendem Grundfuttereinsatz. Einen weitaus größeren Einfluss als die Zusammensetzung der Ration hat in Bezug auf die Synthese der Analoga der Kobalt-Gehalt in den Futtermitteln. Während bei einem Kobalt-Gehalt von 0,34 mg/kg T 35 % der Cobalamine vitaminwirksam sind, liegt dieser Anteil bei einer Kobalt-Versorgung mit 0,04 mg/kg T in der Ration bei 63% (GAWTHORNE, 1970a). Diese in-vivo-Ergebnisse konnten in einem in-vitro-Versuch bestätigt werden (GAWTHORNE, 1970b). Warum es zur verstärkten Bildung von Analoga bei höherer Kobalt-Zufuhr kommt, ist noch nicht bekannt. Als Ursache hierfür kommen nach GAWTHORNE (1970b) sowohl Verschiebungen in der Mikrobenpopulation als auch veränderte Produktionsmengen der Bakterien in Betracht. Auch eine Kombination aus beidem schließt er nicht aus. GALL et al. stellten 1949 bei Tieren mit Kobalt-Mangel eine deutlich reduzierte Anzahl an Mikroorganismen fest. Gleichzeitig war auch die Zahl der Bakterien-Arten reduziert. Es ist jedoch nicht bekannt, in wie weit Cobalamin-synthetisierende Arten davon betroffen sind. SINGH und CHHABRA (1995) konnten einen signifikanten Anstieg (p<0,05) der Bakterien- und Protozoen-Population bei höheren Kobalt-Gehalten in der Ration nachweisen, wobei jedoch nur die Gesamtzahl betrachtet wurde. Im Gegensatz dazu stellten KISIDAYOVA et al. (2001) fest, dass bei hohen Kobalt-Gehalten in der Ration die Zahl der Protozoen (Ciliaten) signifikant reduziert ist.

2.5 Absorption, Exkretion und Speicherung von Vitamin B12 Während der Mechanismus der Vitamin B12-Absorption beim Menschen weitestgehend aufgeklärt ist, wird dieser Vorgang beim Wiederkäuer im Allgemeinen und beim Rind im Speziellen in der Literatur sehr kontrovers diskutiert. Bei der Cobalamin-Absorption des Menschen wird zwischen der aktiven, durch verschiedene Co-Faktoren vermittelten Absorption und der Vitamin B12-Aufnahme durch Diffusion (FRIEDRICH, 1987; ELLENBOGEN und COOPER, 1991) unterschieden. Letztere findet im gesamten Dünndarm statt und spielt mit etwa 1 bis 2 % nur eine untergeordnete Rolle (ZAGALAK, 1982). Nach DONALDSON et al. (1967) wird ihre Effektivität beim Vorhandensein eines Intrinsic Factors stark eingeschränkt. Demgegenüber stellten einige Autoren (ELLENBOGEN und COOPER, 1991; SEETHARAM und ALPERS, 1991) fest,

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dass die Diffusion hauptsächlich bei großen Cobalamin-Mengen in der Nahrung bedeutsam wird. Da die im Darm von Monogastriern vorkommende Vitamin B12-Menge in der Regel nur unwesentlich größer ist als die zur Versorgung des Organismus benötigte Menge (SMITH, 1997), kommt der aktiven Form der Absorption eine besondere Bedeutung zu, über die selbst geringe Cobalamin-Mengen effektiv genutzt werden (ZAGALAK, 1982). Hierbei werden verschiedene Co-Faktoren benötigt. Den wichtigsten stellt der sogenannte Intrinsic Factor dar. Es handelt sich dabei um ein Glycoprotein, das beim Menschen in den Parietalzellen des Magens gebildet wird. Das mit der Nahrung aufgenommene Vitamin B12 liegt zum Großteil in gebundener Form vor und wird erst im Magen unter den dort herrschenden pH-Verhältnissen durch die vorhandenen Verdauungsenzyme freigesetzt (COOPER und CASTLE, 1960). SEETHARAM und ALPERS (1982) teilten den Mechanismus der aktiven Absorption in drei Abschnitte ein, wobei die bisher beschriebenen Vorgänge der gastrischen Phase zuzuordnen sind. In der sich anschließenden Luminalphase wird durch Bindung des Vitamin B12 an den Intrinsic Factor die Vorraussetzung für die aktive Absorption geschaffen. Der Intrinsic Factor weist zwei Bindungsstellen auf, eine für das Cobalamin-Molekül und eine weitere für den im Ileum vorhandenen Ileum-Rezeptor (FRIEDRICH, 1987). Eine Reihe von Untersuchungen hat gezeigt, dass die Bindungsstelle für Cobalamine sehr spezifisch ist (SEETHARAM et al., 1999). Bei der dafür verantwortlichen Gruppe am Vitamin B12-Molekül handelt es sich um die in α-Position gebundene 5,6 Dimethylbenzimidazol-Gruppe. Andere Gruppen an dieser Position, wie bei den sogenannten Analoga, führen zu keiner oder nur sehr schwacher Bindung mit dem Intrinsic Factor, so dass diese Substanzen nicht oder nur in sehr geringer Menge durch aktive Absorption aufgenommen werden können (SEETHARAM und ALPERS, 1982 und 1991). Ein Aufnahme der Analoga erfolgt fast ausschließlich durch Diffusion, wodurch im Vergleich zur aktiven Absorption der vitaminwirksamen Cobalamine deutlich geringere Mengen in den Blutkreislauf und die Leber des Tieres gelangen. Beim Menschen besteht hinsichtlich der Bindungskapazität des Intrinsic Factors für die vier aktiven Vitamin B12-Formen (Adenosyl-, Methyl-, Hydroxo- und Äquocobalamin) nur ein geringer Unterschied zwischen den einzelnen Formen (FRIEDRICH, 1987). Durch die Bindung eines Vitamin B12-Moleküls entsteht ein Komplex, der den Intrinsic Factor vor Verdauung im Intestinaltrakt schützt und gleichzeitig verhindert, dass das Vitamin B12 durch Darmbakterien aufgenommen wird (ELLENBOGEN und COOPER, 1991). Dies wird darauf zurückgeführt, dass der Intrinsic Factor durch den Bindungsprozess seine Form verändert (Abbildung 6). Dadurch wird gleichzeitig auch die Affinität des Komplexes für den Ileum-Rezeptor (auch Intrinsic Factor-Cobalamin-Rezeptor = IFCR) um den Faktor 10 verstärkt (HAGEDORN und ALPERS, 1977).

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Abbildung 6: Modelle für freien und gebundenen Intrinsic Factor (nach GRÄSBECK,

1969 und SEETHARAM, 1999) Während die Vorgänge in den beiden bisher beschriebenen Phasen der Absorption weitestgehend aufgeklärt sind, fehlen für die Mechanismen der dritten Phase noch Details. Sicher ist, dass es zu einer Anlagerung des Cobalamin-Intrinsic Factor-Komplexes an Ileum-Rezeptoren (IFCR) der Enterozyten im distalen Teil des Dünndarms kommt. Dieser Anlagerungsprozess wird vor allem durch pH-Wert und Kalzium-Ionen beeinflusst (FRIEDRICH, 1987). Lange ist darüber diskutiert worden, auf welchem Wege das an den Intrinsic Factor gebundene Cobalamin in die Blutbahn gelangt, wo es dann an Transcobalamin (Transportprotein) gebunden vorliegt. SEETHARAM (1999) stellt diesen Mechanismus als Cobalamin-Endocytose oder -Transzytose vor. Hierbei wird der Intrinsic Factor-Cobalamin-Komplex an der apikalen Zellmembran des Enterozyten nach Bindung an den Ileum-Rezeptor per Endozytose in die Zelle aufgenommen. Der Abbau des Intrinsic Factors findet in den Lysosomen statt, wobei Cobalamin freigesetzt wird. Es handelt sich um den klassischen endosomal-lysosomalen Abbauweg. Über den Syntheseort des Transcobalamins ist bisher noch nicht viel bekannt. Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass es in den Lysosomen gebildet wird, da es hier sofort Abbauvorgängen unterzogen wäre. Wahrscheinlicher ist das Vorkommen des Transportproteins in Vesikeln, die von den Lysosomen abgegrenzt sind. In diesen Vesikeln findet vermutlich auch die Bindung von Cobalamin an Transcobalamin statt. Hierbei ist bisher nicht geklärt, wie das in den Lysosomen freigesetzte Cobalamin in die Vesikel gelangt. Nach Bindung von Cobalamin an Transcobalamin wird der Komplex per Exocytose an der basolateralen Membran ins Blut abgegeben, wo er dann mit dem Blutstrom zirkuliert. Aus dem Blut wird der Cobalamin-Transcobalamin-Komplex von einer Vielzahl von Zellen aufgenommen, wobei der größte Anteil auf die Hepatozyten entfällt (Endozytose, die an der basolateralen Membran der Zellen stattfindet). Im Falle der Leberzellen wird das Transcobalamin in den Lysosomen zersetzt, während das Cobalamin unverändert das Lysosom verlässt und für Stoffwechselprozesse (Co-Enzym-Funktionen) zur Verfügung steht. Abbildung 7 gibt eine Übersicht dieser Vorgänge.

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links : Enterozyt; rechts: z.B. Hepatozyt unvollständig aufgeklärte Wege sind gestrichelt dargestellt

Abbildung 7:Übersicht über die Endozytose von Cobalamin (nach SEETHARAM, 1999) Die bisher dargestellten Mechanismen beziehen sich vor allem auf die Vitamin B12-Absorption beim Menschen. Während sich die verschiedenen Autoren dahingehend einig sind, dass die Absorption auch beim Wiederkäuer zum größten Teil im terminalen Ileum stattfindet (SMITH und MARSTON, 1970a; RICKARD und ELLIOT, 1978; SMITH, 1997), gibt es sehr unterschiedliche Aussagen darüber, in welcher Weise das Cobalamin absorbiert wird. So stellte zum Beispiel SANDERS (1989) fest, dass der Wiederkäuer keinen Intrinsic Factor besitzt und die Absorption lediglich über Diffusion stattfindet. Ähnlicher Meinung sind auch ELLIOT et al. (1971). Demgegenüber stellten RICKARD und ELLIOT (1978) die Hypothese auf, dass das Schaf über einen Intrinsic Factor verfügt. McKAY und McLEAY (1981) bestätigten mit ihrer Arbeit nicht nur einen ovinen Intrinsic Factor, sondern konnten belegen, dass dieser in den Parietalzellen des Labmagens gebildet wird. Auch beim Rind wird von einigen Autoren ein Intrinsic Factor postuliert. HOEDEMAEKER (1965) gibt als Sekretionsort ebenfalls die Parietalzellen des Labmagens an. Alle Autoren sind sich jedoch darin einig, dass das im Pansen gebildete Cobalamin an bzw. in den Vitamin B12-synthetisierenden Mikroorganismen gebunden ist, bis es im Labmagen durch die dort herrschenden Bedingungen (niedriger pH-Wert und Verdauungsenzyme) zur Freisetzung des Cobalamins kommt (SMITH und MARSTON, 1970a; RICKARD und ELLIOT, 1978). Nach SMITH und MARSTON (1970a) sind 91% des im Pansen gebildeten Vitamin B12 in Mikroorganismen gebunden.

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Über die Höhe der Absorptionsrate von Vitamin B12 gibt es in der Literatur recht unterschiedliche Angaben. KERCHER und SMITH bestimmten 1955 in ihrer Arbeit eine Absorptionsquote von etwa 3 %. SMITH und MARSTON (1970a) eine solche von 5 %. Nach HEDRICH et al. (1973) hängt die Höhe der Absorption indirekt proportional von der in der Ration vorhandenen Kobalt-Menge ab. Als Ursache für die recht geringe Absorption von Vitamin B12 beim Wiederkäuer wird von McDOWELL (1992) eine schnelle und starke Bindung des Vitamins an Mikroorganismen im Magen-Darm-Trakt angesehen. Des weiteren muss auch der Vitamin B12-Verbrauch durch Mikroorganismen in Betracht gezogen werden. Eine weitere Ursache für die geringe Absorption ist der hohe Anteil der nicht resorbierbaren und beim Säugetier unwirksamen Analoga. Eine Erhöhung der Absorption kann durch eine geringe Flussrate der Ingesta im Dünndarm erfolgen (HEDRICH et al., 1973; RICKARD und ELLIOT, 1978). Dabei stellen Futtermenge und Zusammensetzung der Ration einen wichtigen Faktor für die Aufnahme des Cobalamins dar. Bei höherer Futteraufnahme sind höhere Kobalt-Konzentrationen in der Ration notwendig, um mehr Vitamin B12 bilden und die gleiche Menge Vitamin B12 absorbieren zu können als bei niedrigerer Futteraufnahme. Ein Teil des absorbierten Cobalamins wird über die Gallenflüssigkeit ausgeschieden und gelangt wieder in den Dünndarm (Enterohepatischer Kreislauf). Hier steht es einer erneuten Absorption zur Verfügung. Einige Autoren, wie zum Beispiel SMITH und MARSTON (1970a) berichten, dass dieses rezyklisierte Vitamin B12 besser und in größeren Mengen absorbiert wird, da das über die Gallenflüssigkeit ausgeschiedene Cobalamin nicht oder nur gering an Mikroorganismen oder Proteine gebunden ist. Vitamin B12 wird von allen B-Vitaminen in den mit Abstand geringsten Mengen vom Wiederkäuer benötigt und im Gegensatz zu den übrigen wasserlöslichen Vitaminen über lange Zeit gespeichert (GIRARD, 1998). Den Hauptspeicherort für Cobalamine stellt die Leber dar (MINSON, 1990; SCOTT, 1999). Beim Menschen liegen etwa 60% der gespeicherten Vitamin B12-Reserven in der Leber vor. Weitere 30% befinden sich in der Muskulatur (FRIEDRICH, 1987). Ähnliche Verteilungen konnten auch beim Wiederkäuer nachgewiesen werden (CLARK, 1998). Die Leber ist neben ihrer Rolle als Speicherorgan auch das Gewebe, in dem die meisten Vitamin B12-abhängigen Stoffwechselreaktionen ablaufen (GRUNER et al., 1998).

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Abbildung 8: Wege des Vitamin B12 im Körper (nach GRUNER et al., 1998)

2.6 Absorption und Metabolismus von Kobalt Auch wenn Kobalt im Organismus höherer Lebewesen außer seiner Funktion im Vitamin B12-Molekül keine Wirkung hat (BONDI, 1987), wird es dennoch absorbiert. Hierzu werden die gleichen Mechanismen benutzt wie beim Eisen, wodurch es zu Interaktionen zwischen den beiden Elementen kommen kann. Im Gegensatz zum Eisen benötigt Kobalt jedoch kein Transportprotein. REUBER et al. (1994) stellten fest, dass Interaktionen zwischen Eisen und Kobalt nur beim Absorptionsprozess stattfinden. Auch POLLAK et al. (1965) und FOTH et al. (1966) beobachteten, dass bei einem Eisenmangel nicht nur die Absorption von Eisen, sondern auch die von Kobalt verstärkt war. Eine negative Beeinflussung der Eisenabsorption durch Kobalt ist nicht zu erwarten, da die Kobaltgehalte in der Ration normalerweise viel geringer sind als die Eisengehalte. Dagegen ist eine signifikante Verringerung der Kobaltabsorption durch größere Eisen-Mengen (> 400 mg/kg T) nachweisbar (REUBER et al., 1994). Bei den verschiedenen Spezies bestehen erhebliche Unterschiede in der Absorptionsquote. Beim Menschen und auch bei kleinen Nagetieren ist sie mit 20-97 % (HARP und SCOULAR, 1952; ENGEL et al., 1967) bzw. 26 % (TOSKES et al., 1973) relativ groß. Im Vergleich hierzu wird beim Wiederkäuer sehr wenig Kobalt absorbiert (2-16 %; MONROE et al., 1952; SMITH und MARSTON, 1970a; LOONEY et al., 1976). Als Erklärung für die sehr geringe Absorption wird ähnlich wie beim Vitamin B12 die Bindung an Mikroorganismen im Magen-Darm-Trakt herangezogen (ROTHERY et al., 1953; LOONEY et al., 1976; McDOWELL, 1992) oder aber auch der bereits oben erwähnte Anteil der Analoga, die das Kobalt einer möglichen Absorption entziehen. Für den Wiederkäuer wurde jedoch nicht zwischen freiem Kobalt und im Cobalamin gebundenem Kobalt unterschieden.

Exkretion

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Nur das Kobalt, das im Gastrointestinaltrakt in gelöster Form vorhanden ist, kann auch absorbiert werden. Kobalt-Sulfate, -Karbonate und –Glucoheptonate sind auf Grund ihrer besseren Löslichkeit für den Organismus in größerem Umfang verfügbar als Kobalt-Oxide (KAWASHIMA et al., 1997 a und b; HENRY, 1995). Eine Übersicht über die relative Bioverfügbarkeit der verschiedenen Kobalt-Quellen beim Schaf ist Tabelle 3 zu entnehmen.

Tabelle 3: Relative Bioverfügbarkeit verschiedener Kobalt-Quellen beim Schaf (nach HENRY, 1995)

Kobalt-Quelle Relative Bioverfügbarkeit*) Kobalt-Sulfat 100

Kobalt-Glucoheptonat 85 Kobalt-Oxid (Co3O4) 20

Kobalt-Karbonat 110 Kobalt-Oxid (CoO) 55

Kobalt-Chlorid -** *) Die Bioverfügbarkeit von Kobalt-Sulfat wurde gleich 100 gesetzt. **) keine vergleichbaren Daten vorhanden

Nach Untersuchungen von IBBOTSON et al. (1970) kam es bei Schafen mit Kobalt-Mangel nach Injektion von Kobalt in die Vena Jugularis zu einer Erhöhung des Vitamin B12-Gehalts im Lebergewebe. Offenbar kann das injizierte Kobalt in den Pansen sezerniert und für die mikrobielle Vitamin B12-Synthese verwendet werden. Auf Grund dessen ist nicht auszuschließen, dass auch absorbiertes Kobalt in gewissem Umfang diesem Zyklus folgt. Dieser These widerspricht jedoch eine von COMAR et al. (1946) durchgeführte Studie an einer pansenfistulierten Kuh mit radioaktiv markiertem Kobalt, bei der nach intravenöser Injektion kein radioaktives Kobalt im Pansen nachweisbar war. Das absorbierte Kobalt wird zum Großteil in der Leber und in der Niere gespeichert. Geringere Mengen sind im Muskelgewebe und im Knochen anzutreffen (UNDERWOOD, 1975). Während die Ausscheidung des Cobalamins hauptsächlich über den Kot stattfindet, wird das in freier Form aufgenommene Kobalt bei Mensch und Tier zum größten Teil über den Urin exkretiert. Hieraus resultiert vermutlich auch der recht hohe Kobalt-Gehalt im Nierengewebe (SMITH und MARSTON, 1970a).

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2.7 Vitamin B12 im Intermediärstoffwechsel In Bakterienzellen gibt es eine Reihe Vitamin B12-abhängiger Reaktionen, von denen die wichtigsten in Tabelle 4 aufgeführt sind. Bei einer Vielzahl von Bakterien konnte auch eine positive Wirkung der für höhere Organismen unwirksamen Analoga festgestellt werden (ZAGALAK, 1982). TRÖSCHER und MENKE (1985) sind der Meinung, dass diese Analoga, wenn sie in größeren Mengen per Diffusion aufgenommen werden, sogar toxische Wirkungen im Stoffwechsel höherer Organismen entwickeln können.

Tabelle 4: Vitamin B12 abhängige biochemische Reaktionen (nach ZAGALAK, 1982 und GRUNER et al., 1998)

Co-Enzym Enzym Nomenklatur Reaktion Ado-Cbl * Glutamat-Mutase 5.4.99.1 Glutamat ↔ Methylaspartat

Methylmalonyl-CoA-Mutase 5.4.99.2 Methylmalonyl-CoA ↔ Succinyl-CoA

Methylenglutarat-Mutase 5.4.99.4 Methylenglutarat ↔ Methylitaconat

Amino-Mutasen 5.4.3.- Intramolekulare Umlagerung der Aminogruppe z.B. α-Leucinmutase (Leucin ↔ β-Leucin)

1,2-Diol-Dehydratase 4.2.1.28 Ethylenglycol

1,2Propandiol → →

Acetaldehyd + H2O Propionaldehyd + H2O

Glycerin-Dehydratase 4.2.1.30 Glycerin → 3-Hydroxypropion-

aldehyd + H2O

Ethanolamin-Desaminase 4.3.1.7 Ethanolamin

2-Aminopropanol → →

Acetaldehyd + NH4-

Propionaldehyd + NH4-

Ribonucleotid-Reduktase 1.17.4.2 Ribonucleotid → 2-Desoxiribo-

nucleotid + H2O

Me-Cbl * Methionin-Synthase 2.1.1.13 Homocystein

Methyltetrahydrofolat→ →

Methionin Tetrahydrofolat

Methan-Synthase 2.1.1.- H+ → CH4

Acetat-Synthase 2.1.1.- CO2 → Acetat * Ado-Cbl = Adenosyl-Cobalamin Me-Cbl = Methyl-Cobalamin Im Säugetierorganismus vorkommende Enzyme sind hervorgehoben. Bei Säugetieren sind von den vier vitaminwirksamen Cobalaminen lediglich zwei als Co-Enzyme im Stoffwechsel von Bedeutung (ZAGALAK, 1982.) Es handelt sich hierbei um das Adenosyl- und das Methyl-Cobalamin, welches als Co-Faktor bei der Methionin-Synthase-Reaktion fungiert. Adenosyl-Cobalamin katalysiert die Umwandlung von Methylmalonyl-CoA in Succinyl-CoA. Einige Autoren, wie POSTON (1980), FRIEDRICH (1987) sowie REHNER und DANIEL (1999) schreiben dem Adenosyl-Cobalamin noch eine weitere Co-Enzymfunktion zu, die im Stoffwechsel von Säugetieren von Bedeutung ist. Hierbei handelt es sich um Abbau-Vorgänge innerhalb des Leucin-Stoffwechsels.

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2.7.1 Adenosyl-Cobalamin-abhängige Reaktionen Bei der Umwandlung von Methylmalonyl-CoA in Succinyl-CoA handelt es sich um eine intramolekulare Umlagerung, bei der es zum Austausch der SCoA-Gruppe gegen ein Wasserstoffatom vom Kohlenstoffatom C2 zum Kohlenstoffatom C3 kommt (SMITH, 1997). Sie dient dem Abbau von Propionsäure, da diese selbst nicht in den Citrazyklus eingebracht werden kann. Das hierfür notwendige Enzym ist die in den Mitochondrien der Zellen vorkommende Methylmalonyl-CoA-Mutase (EC 5.4.99.2; FRIEDRICH, 1987). Die Reaktionsgleichung ist Abbildung 9 zu entnehmen.

Abbildung 9: Vitamin B12 abhängige Umlagerung von Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA (nach GRUNER et al., 1998)

Der Abbau von Propionat findet beim Rind zu mehr als 90 % in den Mitochondrien der Leberzellen statt (BAIRD et al., 1980). Zunächst wird die Propionsäure mit Hilfe der Acyl-CoA-Synthase unter Anwesenheit von ATP acetyliert. Das entstehenden Reaktionsprodukt Propionyl-CoA wird anschließend in einer weiteren ATP-abhängigen Reaktion carboxyliert. Bei dem diesen Reaktionsschritt katalysierenden Enzym handelt es sich um die Propionyl-CoA-Carboxylase, die ebenfalls ein B-Vitamin als unterstützenden Faktor, das Biotin, benötigt. Das Endprodukt dieses Reaktionsschrittes ist S-Methylmalonyl-CoA, welches auf Grund der S-Form nicht durch die Methylmalonyl-CoA-Mutase umgesetzt werden kann. Eine weitere Verwertung dieses Zwischenprodukts ist erst nach Umwandlung in die R-Form möglich, was durch die Methylmalonyl-CoA-Racemase geschieht. Dieser Reaktionsschritt ist im Gegensatz zu den vorherigen reversibel, so dass in der Regel immer ein Gleichgewicht zwischen S- und R-Form vorliegt. Nach Isomerisation von R-Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA kann dieses in den Citratzyklus eingebracht werden (FROBISH und DAVIS, 1976; GRUNER et al., 1998). Die genannten Reaktionsschritte sind in Abbildung 10 schematisch dargestellt.

H H H-C3-C2-COOH H C=O S CoA (R)-Methylmalonyl-CoA

H H H-C3-C2-COOH O=C H S CoA Succinyl-CoA

Methylmalonyl-CoA-Mutase Coenzym B12

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Mikroflora im Pansen der Wiederkäuer

Propionat Propionyl-CoA (S)-Methyl-malonyl-CoA

(R)-Methyl-malonyl-CoA

Succinyl-CoA

Citrat-Zyklus und Gluconeogenese

ungeradzahlige Fettsäuren α-Ketobutyrat

Methionin Tryptophan Isoleucin

Valin

Valin

B12

Cellulose und andere

Kohlenhydrate

Abbildung 10: Metabolische Schlüsselstellung des Adenosyl-Cobalamins (nach ZAGALAK, 1982)

Da der Wiederkäuer den größten Teil seines Glucosebedarfs über die Gluconeogenese deckt, kommt diesem Reaktionsweg eine besondere Bedeutung zu. Nur so kann das im Pansen gebildete und absorbierte Propionat in den Citratzyklus eingebracht und der Gluconeogenese zugeführt werden (GRUNER et al., 1998). Je nach Zusammensetzung der Ration verändern sich die Verhältnisse der ruminalen flüchtigen Fettsäuren zueinander. So entsteht Propionat vor allem bei Verfütterung von Rationen mit hohem Anteil an leicht löslichen Kohlenhydraten. Jedoch können weder die vornehmlich celluloseabbauenden noch die stärkespaltenden Mikroorganismen direkt Propionat bilden (BALDWIN und ALLISON, 1983). Beide Arten von Mikroorganismen produzieren hauptsächlich Acetat und Succinat, wobei letzteres im Pansen durch andere Mikroorganismen, nämlich propionsäurebildende Bakterien, zu Propionat verstoffwechselt wird. Diese Umwandlung kann durch zwei Mechanismen erfolgen. Der eine Reaktionsweg stellt exakt die Umkehr der Reaktionen dar, die in der Leber der Wiederkäuer bei der Umwandlung von Propionat in Succinat ablaufen. Bei dem hierbei notwendigen Enzym handelt es sich ebenfalls um die Methylmalonyl-CoA-Mutase, die Vitamin B12 als Co-Enzym benötigt (KENNEDY et al., 1991). Diese Reaktionen kommen jedoch nur in Mikroorganismen vor. Der zweite Mechanismus soll hier nicht näher erläutert werden, da er zum einen nur maximal 30 % des anfallenden Succinats verstoffwechselt und zum anderen weder vom Cobalamin noch von Kobalt abhängig ist.

Nach BERGMAN et al. (1966) werden 50 bis 60 % des aus dem Pansen absorbierten Propionats in Glucose umgewandelt. Auch BROCKMAN (1993) und VAN HOUTERT (1993) fanden Anteile von 50 bis 80 %. Das restliche Propionat wird anderen Stoffwechselprozessen zugeführt.

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Neben der im Pansen gebildeten Propionsäure, die in Propionyl-CoA umgewandelt wird, fällt Propionyl-CoA auch beim Abbau von ungeradzahligen Fettsäuren und einigen Aminosäuren an. Auch dieses wird bei ausreichender Vitamin B12-Versorgung über die Zwischenprodukte Methylmalonyl-CoA und Succinyl-CoA in den Citratzyklus eingeschleust. Die zweite Co-Enzym-Funktion des Adenosyl-Cobalamins ist die Katalyse der Umwandlung von Leucin in β-Leucin durch das Enzym L-α-Leucin-Mutase und kommt in biologischen Systemen häufig vor (FRIEDRICH, 1987). Es handelt sich hierbei um einen Nebenweg des Leucinabbaus, bei dem zunächst die oben genannte Umwandlung in Form einer Verschiebung der Amino-Gruppe (NH3-Gruppe) vom C2- zum C3-Atom innerhalb des Moleküls stattfindet (FRIEDRICH, 1987; REHNER und DANIEL, 1999), dem sich dann die weiteren Abbauprozesse anschließen können. Endprodukte des Leucin-Abbaus sind Acetacetat und Acetyl-CoA, die für weitere Stoffwechselvorgänge zur Verfügung stehen. Acetyl-CoA wird in den Citrat-Zyklus eingebracht.

2.7.2 Methyl-Cobalamin-abhängige Reaktionen Bei dem im Cytosol der Zellen vorkommenden Enzym Methionin-Synthase handelt es sich um das einzige beim Säugetier vorkommende Enzym, das als Co-Enzym Methyl-Cobalamin benötigt (KENNEDY et al., 1992; REHNER und DANIEL, 1999). Das Prinzip der Methionin-Synthese beruht auf der Übertragung einer Methylgruppe auf Homocystein, wobei als Endprodukt Methionin entsteht. Vitamin B12 fungiert hierbei als Überträger dieser Gruppe und kommt sowohl als Methyl-Cobalamin (CH3-B12) als auch als methylfreies Cobalamin (B12) vor. Die Struktur von letzterem und die Art der Methylgruppen-Übertragung sind noch nicht genauer bekannt (ZAGALAK, 1982). Der vereinfachte Reaktionsablauf ist in Abbildung 11 dargestellt.

Abbildung 11: Bedeutung des Methyl-Cobalamins bei der Methylgruppen-Übertragung (nach FRIEDRICH, 1987)

N+H3

SH-CH2-CH2-C-COO-

H Tetrahydrofolsäure

N5-Methyl-Tetrahydrofolsäure

Methyl-B12

B12

Homocystein

Methionin

N+H3

CH3-S-CH2-CH2-CH2-COO-

H

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Aus der Reaktionsgleichung ist zu entnehmen, dass die Methylgruppe, die mit Hilfe von Vitamin B12 übertragen wird, ursprünglich von der 5-Methyl-Tetrahydrofolsäure stammt, wodurch es zu Interaktionen zwischen Methionin-Synthese und Folsäurestoffwechsel kommt. Bei dem dargestellten Mechanismus erfolgt nicht nur die Synthese von Methionin, sondern gleichzeitig wird auch die zur Bildung anderer Folat-Verbindungen im Stoffwechsel benötigte Tetrahydrofolsäure regeneriert (FRIEDRICH, 1987; SCOTT, 1999). Diese recht komplexen Zusammenhänge sind in Abbildung 12 dargestellt.

Abbildung 12: Zusammenhänge zwischen Folsäure-, Vitamin B12- und Homocystein-Stoffwechsel (nach REFSUM, 2001)

2.8 Auswirkungen eines Kobalt- bzw. Vitamin B12-Mangels auf

den Intermediärstoffwechsel Die meisten Vitamin B12-synthetisierenden Bakterien produzieren bei ausreichenden Kobalt-Versorgung Cobalamine im Überschuss. Die den Bedarf der Pansenmikroben übersteigenden Vitamin B12-Mengen werden von ihnen gespeichert und stehen dem Wiederkäuer nach Freisetzung durch Verdauungsprozesse im Labmagen zur Verfügung (SMITH und MARSTON, 1970a). Im Kobalt-Mangel wird von den Bakterien weniger Vitamin B12 gebildet, wodurch bei unverändertem Cobalamin-Bedarf der Mikroorganismen weniger Vitamin B12 im Bakterienkörper gespeichert wird und somit weniger Cobalamin vom Wirtsorganismus absorbiert werden kann. Bei hochgradigem Kobalt-Mangel kann die für den Wiederkäuer absorbierbare Menge an Cobalamin den Vitamin B12-Bedarf nicht mehr decken wodurch sich die Konzentrationen an Vitamin B12 in Blut und Geweben verringern. Durch seine Co-Enzym-Funktion bei der Umwandlung von Methylmalonyl-CoA in Succinyl-CoA hat Vitamin B12 eine zentrale Funktion im Energiehaushalt des Wiederkäuers

B12

Methionin

Homocystein

Cystein Folsäure

Methyl- Tetrahydrofolsäure

Methylen- Tetrahydrofolsäure

Tetrahydro- folsäure

Dihydrofolsäure

Adenosyl- Methionin

Adonosyl- Homocystein

Methyl-Akzeptor

Methylierter-Akzeptor

Betain

Dimethyl-glycin dTMP

dUMP Methionin- Synthase

B6

Metylentetrahydrofolat-Reduktase

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(McDOWELL, 1992; SCOTT, 1999). Hieraus folgt die Annahme, dass mit sinkendem Kobalt-Gehalt in der Ration die negativen Auswirkungen auf den Stoffwechsel zunehmen. Häufig werden jedoch abweichende Beobachtungen beschrieben (KENNEDY et al., 1996). Die Pansenmikroben produzieren Vitamin B12 zunächst für ihren eigenen Bedarf. Dem Wiederkäuer steht nur das Cobalamin zur Verfügung, das den Bedarf der Mikroorganismen übersteigt. Bei marginaler Kobalt-Versorgung synthetisieren die Bakterien im Pansen zwar ausreichend Propionsäure (MARSTON et al., 1972), die absorbierte Propionsäure wird jedoch in der Leber, nach Verbrauch der Vitamin B12-Reserven, nicht mehr vollständig in Succinat abgebaut (KENNEDY et al., 1990; McGHIE, 1991). Da alle Reaktionsschritte bis zum Methylmalonyl-CoA ungehemmt ablaufen können, kommt es zu einer Anhäufung dieses Stoffes in Blut und Gewebe (MILLS, 1987; KENNEDY et al., 1996). Ein Abbau von Methylmalonylsäure über andere Stoffwechselvorgänge ist nur bedingt möglich. Die hauptsächlich in der Leber gebildete und im Blut angehäufte Methylmalonylsäure wird letztendlich über den Harn ausgeschieden (GAWTHORNE, 1968). Bei sehr geringer Kobalt-Aufnahme kann selbst der Bedarf der Mikroorganismen nicht mehr gedeckt werden. Die Bildung von Propionsäure im Pansen ist dann stark beeinträchtigt, weil die Aktivität der bakteriellen Methylmalonyl-CoA-Mutase verringert ist (KENNEDY et al., 1990). Das während der Fermentationsprozesse im Pansen entstandene Succinat kann so von den propionsäurebildenden Bakterien nicht mehr über den in Kapitel 2.7.1 dargestellten Reaktionsweg in Propionsäure umgewandelt werden und reichert sich im Panseninhalt an (KENNEDY et al., 1991). Das Succinat wird an Stelle des Propionats aus dem Pansen absorbiert (KENNEDY et al., 1991) und in der Leber direkt in den Citratzyklus eingebracht. Es steht somit der Gluconeogenese zur Verfügung, wodurch das Glucosedefizit niedriger ausfällt als im Falle einer marginalen Kobalt-Versorgung (KENNEDY et al., 1996). Demnach können die Auswirkungen einer marginalen Kobalt-Versorgung stärker sein als die eines hochgradigen Kobalt-Mangels. Neben den Effekten auf den Propionat-Stoffwechsel beeinflusst der Vitamin B12-Mangel auch die Fettsäuren-Synthese. Als Ausgangsstoffe der Lipogenese fungieren Acetyl-CoA und Malonyl-CoA. Zu Beginn der Fettsäuren-Biosynthese steht zunächst das Acetyl-CoA, welches durch Malonyl-CoA mit Hilfe eines Fettsäure-Synthase-Komplexes um zwei Kohlenstoffeinheiten verlängert wird. Das Endprodukt der dargestellten Reaktionen sind geradzahlige, gesättigte Fettsäuren mit einer Länge bis zu maximal 18 Kohlenstoffatomen. Ungeradzahlige, gesättigte Fettsäuren entstehen durch Anlagerung von Propionyl-CoA an Stelle von Malonyl-CoA. Das Vermögen ungeradzahlige Fettsäuren zu bilden, ist beim Säugetier aber nur begrenzt (KOOLMANN und RÖHM, 1994). Im Falle eines Vitamin B12-Mangels kann eine Akkumulation von ungeradzahligen und verzweigten Fettsäuren in den Geweben nachgewiesen werden (KENNEDY et al., 1994b). Acetyl-CoA wird bei Vitamin B12-Mangel durch Propionyl-CoA (FRENKEL et al., 1973) und Malonyl-CoA durch Methylmalonyl-CoA (SCAIFE et al., 1978) ersetzt. Hierdurch entstehen

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die von der Norm abweichenden Fettsäuren (ungeradzahlig und verzweigt), die das Fett der Wiederkäuer weicher und öliger machen (GRUNER et al., 1998).

Neben den Auswirkungen auf die Konsistenz des Körperfettes bei Wiederkäuern wird ein Kobalt- bzw. Vitamin B12-Mangel von einigen Autoren auch in Verbindung mit dem sogenannten Low-Milk-Fat-Syndrom von Milchkühen gebracht, die kraftfutterreich und rohfaserarm gefüttert werden. Bei der Milchkuh findet zur Zeit der Laktation der größte Teil der Lipogenese in der Milchdrüse statt. FROBISH und DAVIS (1976) stellten die These auf, dass infolge einer erhöhten Propionsäure-Produktion bei gleichzeitigem Vitamin B12-Mangel durch Anreicherung der Methylmalonylsäure im Plasma die Milchfettsynthese gestört wird. Sie konnten in ihren Studien bei einigen Tieren eine tendenzielle Erhöhung des Milchfettgehaltes bei intramuskulärer Injektion von Vitamin B12 erreichen. ELLIOT et al. (1979) setzten den Milchfettgehalt in Verbindung mit der Vitamin B12-Konzentration in der Leber. Hierzu untersuchten sie Milchkühe in der frühen Laktation sowohl mit als auch ohne Vitamin B12-Injektion. Bei beiden Gruppen gab es keine Korrelation zwischen Milchfettgehalt und Vitamin B12-Konzentration in der Leber. Ähnliche Ergebnisse erzielten auch CROOM et al. (1981), die zu dem Schluss kamen, dass durch Injektion von Vitamin B12 kein Einfluss auf den Milchfettgehalt genommen werden kann. Sie sind der Ansicht, dass das komplexe Geschehen des Low-Milk-Fat-Syndroms von vielen Faktoren beeinflusst wird und Vitamin B12-Mangel allenfalls einen dieser Faktoren darstellt. Weiterhin beeinflusst ein Vitamin B12-Mangel neben den bisher aufgeführten Stoffwechselveränderungen auch den Folsäurehaushalt. Es ist bisher noch nicht ausreichend geklärt, durch welchen Mechanismus ein Vitamin B12-Mangel zu einem Mangel an Folsäure führt. Jedoch scheint sich die sogenannte „methyl trap“-Hypothese als wahrscheinlicher Reaktionsweg zu bestätigen (SMITH, 1997). Eine Verringerung der Enzymaktivität der Vitamin B12-abhängigen Methionin-Synthase führt infolge eingeschränkter Umwandlung in Methionin (GRUNER et al., 1998) zu einer Anreicherung von Homocystein in Blut und Gewebe (KENNEDY et al., 1994a; STANGL et al., 2000a). Da bei der Synthese von Methionin gleichzeitig N5-Methyl-Tetrahydrofolsäure nach Übertragung der Methylgruppe auf Homocystein zu Tetrahydrofolsäure regeneriert wird, kommt es bei Cobalamin-Mangel ebenfalls zu einer Akkumulation dieses Metaboliten (SMITH, 1997). Die Folsäureregeneration kann nicht mehr stattfinden und die im Körper vorhandene Folsäure wird nach und nach durch Übertragung einer Methylgruppe in die methylierte Form überführt. Die Folsäure steht in dieser Form für Stoffwechselprozesse nicht mehr zur Verfügung (SHANE und STOKSTAD, 1985; SMITH, 1987; SCOTT und WEIR, 1994). Bei ausgeprägtem Vitamin B12-Mangel kommt es nach Verbrauch der Folsäurespeicher in der Leber auch zu einem sekundären Folsäuremangel (SMITH, 1987). Dies macht sich durch eine Beeinflussung des Aminosäuren- und Nukleotidstoffwechsels bemerkbar (SHANE und

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STOKSTAD, 1985), da Folsäure in Form von Tetrahydrofolsäure-Derivaten im Stoffwechsel der Säugetiere in einer Vielzahl von Co-Enzym-Verbindungen vorkommt und bei einer Reihe von Reaktionen im Amino- und Nukleinsäurenmetabolismus als Kohlenstoff-Akzeptor oder –Donator bei der Übertragung von Kohlenstoffeinheiten fungiert. Versuche an Schafen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung zeigten, dass im mäßigen Kobalt-Mangel die Aktivität der Methionin-Synthase in Leber und Niere deutlich vermindert ist. Tiere mit ausgeprägtem Kobalt-Mangel wiesen zusätzlich noch eine Reduktion der Enzymaktivität im Rückenmarksgewebe auf, während das Enzym im Gehirn unbeeinflusst blieb (KENNEDY et al., 1992). Die Autoren schließen daraus, dass das Nervengewebe des Schafes relativ resistent gegenüber Kobalt- bzw. Vitamin B12-Mangel ist. Dies steht im Gegensatz zu Untersuchungen bei Menschen, wo bei Cobalamin-Mangel eine Beeinträchtigung des Nervengewebes nachgewiesen wurde (FRIEDRICH, 1987; SCOTT, 1992). Weiterhin werden Vitamin B12 und Folsäure in Verbindung mit der Entstehung der Alzheimer Erkrankung gebracht. WANG et al. (2001) wiesen in einer Studie nach, dass Personen mit niedrigen Vitamin B12- oder Folsäure-Konzentrationen im Serum ein doppelt so hohes Risiko haben, an Alzheimer zu erkranken. Durch welchen Mechanismus es beim Menschen und einigen Tierarten wie Rhesusaffen und Fledermäusen, nicht jedoch bei Ratten, Mäusen und Wiederkäuern zu Enzephalopathien und neurologischen Störungen kommt, ist bisher nicht nachgewiesen (SCOTT, 1992). Ähnliches gilt auch für die beim Menschen als charakteristisches Symptom eines Vitamin B12-Mangel auftretenden Veränderungen des Blutbildes. Während beim Menschen ein Cobalamin-Mangel fast immer mit hämatologischen Veränderungen einhergeht, können solche beim Tier nur selten nachgewiesen werden (FRIEDRICH, 1987).

2.9 Klinische Erscheinungen bei Kobalt-Mangel Die durch ein Kobalt-Defizit hervorgerufenen Krankheitssymptome beim Wiederkäuer sind recht unspezifisch und in vielen Fällen nicht oder nur sehr schwer von anderen Erkrankungen (z.B. Parasitosen) oder Mangelzuständen (z.B. Kupfer-Mangel) zu unterscheiden (WIESNER, 1970; HUMANN-ZIEHANK und GANTER, 2000). Neben Alter und Leistung der Tiere sind auch Dauer und Ausmaß des Kobalt-Defizits entscheidend für die Ausprägung der Symptomatik (WIESNER, 1970). Junge Tiere reagieren schneller und stärker auf unzureichende Kobalt-Zufuhr als ausgewachsene (CLARK und MILLAR, 1983; PIATKOWSKI et al., 1990; KENNEDY et al., 1994b; McDOWELL, 2000). Während Trächtigkeit und Laktation treten leichter Mangel-Erscheinungen auf als in Phasen mit geringerer Beanspruchung (WIESNER, 1970). Auch zwischen den einzelnen Wiederkäuerspezies bestehen Unterschiede bezüglich der Empfindlichkeit gegenüber einem Kobalt-Defizit. Schafe benötigen höhere Kobalt-Gehalte im

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Futter als Rinder und reagieren auf niedrige Kobalt-Zufuhr deutlich empfindlicher (POOLE et al., 1972; CLARK und MILLAR, 1983). Man unterscheidet beim Kobalt-Mangel zwischen schweren Mangel-Zuständen, die in der Regel mit einer starken Beeinträchtigung des Allgemeinbefindens einhergehen und leichten Mangel-Zuständen, die oftmals als solche gar nicht erkannt werden (LATTEUR, 1962; SMITH, 1987). Ein subklinischer Krankheitsverlauf kann bei länger andauerndem Mangel leicht in die klinische Erscheinungsform übergehen. Ein Kobalt-Mangel entwickelt sich sehr langsam. Dabei können nach UNDERWOOD und SUTTLE (1999) vier verschiedene Stadien beschrieben werden: 1. Verarmung 2. Defizit 3. Dysfunktion 4. Erkrankung Während der Phase der Verarmung wird zunächst das Vitamin B12 aus der Leber verbraucht. Dieser Zeitraum ist je nach Ausmaß des gespeicherten Cobalamins unterschiedlich lang. Nach Angaben von GRACE et al. (1986) reicht das in der Leber eines Sauglammes deponierte Vitamin B12 lediglich aus, um den Bedarf über einen Zeitraum von etwa 10 Tagen zu decken. Bei älteren Tieren mit größeren Leberspeichern verlängert sich der Zeitraum. Hierzu bestehen jedoch keine genaueren Angaben. Zum Vergleich soll erwähnt werden, dass sich der Gesamtspeicher an Vitamin B12 in Leber und Muskulatur beim erwachsenen Menschen auf durchschnittlich etwa 3-6 mg beläuft. Diese Menge würde bei ausschließlich vegetarischer Ernährung bei gesunden Menschen für 3-5 Jahre zur Vitaminversorgung des Körpers ausreichen (ZAGALAK, 1982; SCOTT, 1999). Die sich an die Verarmung anschließende Phase des Defizits ist durch Reduktion der im Blut (Transportpool) zirkulierenden Vitamin B12-Menge gekennzeichnet. Bei verminderter oder sogar fehlender ruminaler Vitamin B12-Produktion (Kapitel 2.4) wird nur noch wenig oder kein Cobalamin mehr absorbiert. Durch reduzierte Leberspeicher kann das Cobalamin-Niveau im Blut nicht mehr aufrecht erhalten werden. Während der sogenannten Phase der Dysfunktion treten die in Kapitel 2.8 dargestellten metabolischen Störungen auf, die im Laufe der Zeit zu klinischen Symptomen führen, wodurch die vierte Phase (Erkrankung) gekennzeichnet ist. Eine schematische Darstellung über die Zeit der einzelnen Phasen ist in der Abbildung 13 wiedergegeben, wobei es jedoch große individuelle Unterschiede gibt.

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Abbildung 13: Zeitliche Abfolge unterschiedlicher Phasen bei der Entstehung eines klinischen Kobalt-Mangels (nach UNDERWOOD und SUTTLE, 1999)

Die klinisch manifeste Form des Kobalt-Mangels wird häufig auch als „Enzootischer Marasmus“ bezeichnet. Charakteristisch hierfür ist ein starker Rückgang der Futteraufnahme (SMITH, 1987; PIATKOWSKI et al., 1990; UNDERWOOD und SUTTLE, 1999). Gleichzeitig entwickeln die betroffenen Tiere einen abnormen Appetit auf Erde, Holz, Baumrinde und zum Teil auch verschmutzte Einstreu (WIESNER, 1970; PIATKOWSKI et al., 1990). Bei Weidehaltung werden Pflanzen wie Seggen, Binsen, Heidekraut oder ähnliches bevorzugt aufgenommen, während gute Futterpflanzen gemieden werden (WIESNER, 1970; SCHUH und BRANDEIS, 1977). Weiterhin belecken oder benagen die Tiere erreichbare Gegenstände (WIESNER, 1970), weshalb in einigen Regionen Kobalt-Mangel auch als „Lecksucht“ bzw. „licking disease“ bezeichnet wird (RUSSEL und DUNCAN, 1956). Mit der verminderten oder sogar fehlenden Futteraufnahme geht ein starker Gewichtsverlust einher, der zum einen durch die verminderte Futteraufnahme und zum anderen auch dadurch hervorgerufen wird, dass die im Pansen gebildete Propionsäure nicht mehr ausreichend zu Glucose verstoffwechselt werden kann (Kap. 2.7.1). Vor allem bei wachsenden Tieren führt die Abmagerung schnell zum Tod (SMITH, 1987; PIATKOWSKI et al., 1990; UNDERWOOD und SUTTLE, 1999). Darüber hinaus sind erkrankte Tiere häufig apathisch, sondern sich von der Herde ab (McDOWELL, 1992) und können auf Grund von Muskelschwäche einen schwankenden, stolpernden Gang zeigen (LATTEUR, 1962). Neben derber und schuppiger Haut weisen Rinder ein langes und struppiges Fell auf, bei Schafen ist die Wolle stumpf und verfilzt (LATTEUR, 1962; WIESNER, 1970; McDOWELL, 1992). Die Veränderungen am Haarkleid sind beim Schaf stärker ausgeprägt als beim Rind. SUTTLE (1988) macht hierfür den wegen

Verarmung Defizit Dysfunktion Erkrankung Zeit

Speicher (in Leber und Niere)

Transport (Vitamin B12 im Blut)

Funktion(Methylmalonyl-CoA-Mutase, Methionin-Synthase)

Dysfunktion (Plasma-Homocystein, Methylmalonyl-Säure)

Klinische Symptome (Anorexie, Anämie,

White liver disease))

100

0

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hoher Methionin-Konzentrationen in der Wolle erhöhten Methionin-Bedarf der Schafe verantwortlich, welcher im Falle eines Kobalt-Mangels durch verminderte Aktivität der Methionin-Synthase (Kap. 2.7.2.) nicht gedeckt werden kann. Während Anämie beim Menschen das Leitsymptom bei Vitamin B12-Mangel darstellt, werden ähnliche Veränderungen des Blutbildes beim Wiederkäuer nur selten beobachtet. Meist zeigen nur Jungtiere blasse Schleimhäute (SMITH, 1987; PIATKOWSKI et al., 1990). Viel häufiger als ein ausgeprägter Kobalt-Mangel mit der bisher beschriebenen Symptomatik sind mildere Verläufe der Erkrankung. Oftmals werden die unspezifischen, zum Teil nur schwer erkennbaren Symptome nicht beachtet. Eine Verbindung zu Kobalt-Mangel wird nur in seltenen Fällen hergestellt (LATTEUR, 1962). Ein milder Kobalt-Mangel ist zunächst mit einer schlechten Futterverwertung verbunden. Trotz bedarfsdeckender Energie- und Proteinversorgung weisen die Tiere ein vermindertes Wachstum oder einen Rückgang der Milchleistung auf ( LATTEUR, 1962; SMITH, 1987; PIATKOWSKI et al., 1990; CLARK, 1998). Bei jungen Tieren tritt oftmals ein Wachstumsstop ein. Der Körperbau wirkt unproportioniert, wobei der Kopf unverhältnismäßig groß erscheint (WIESNER, 1970). Hinzu kommt, dass die betroffenen Rinder und Schafe durch Schwächung des Immunsystems eine höhere Anfälligkeit gegenüber Parasitenbefall (MacPHERSON et al., 1987; FERGUSON et al., 1989; SUTTLE und JONES, 1989) und Infektionskrankheiten (LATTEUR, 1962; SUTTLE und JONES, 1989; PATERSON und MacPHERSON, 1990a) aufweisen. Als weiterer Symptomkomplex können Fertilitätsstörungen auftreten. Hierbei sind beide Geschlechter gleichermaßen betroffen. Durch einen Kobalt-Mangel wird beim männlichen Tier die Spermatogenese beeinträchtigt (LATTEUR , 1962). Bei weiblichen Tieren ist vor allem die Implantation des Embryos gestört, während das Zyklusgeschehen weitestgehend unbeeinflusst bleibt (LATTEUR, 1962; LOTTHAMMER, 1999). Weiterhin sind häufig Aborte, Totgeburten und die Geburt lebensschwacher Feten zu beobachten (LATTEUR, 1962; BOSTEDT und DEDIÉ, 1996; LOTTHAMMER, 1999). Lämmer von Muttern mit subklinischem Kobalt-Mangel zeigen oftmals verminderte pre- und postnatale Überlebensfähigkeit (FISHER und MacPHERSON, 1992). Überlebende Tiere weisen ein deutlich vermindertes Wachstum auf (MARSTON, 1952) und haben im Vergleich zu Tieren, deren Mütter während der Trächtigkeit ausreichend mit Kobalt versorgt waren, eine deutlich reduzierte Saugfrequenz (FISHER und MacPHERSON, 1992). Ein bisher nur beim Schaf und gelegentlich bei Ziegen beobachtetes Krankheitsbild bei Kobalt-Mangel stellt die sogenannte „White liver disease“ dar. Betroffen sind auch hier wieder vor allem Jungtiere im Alter von 2 bis 6 Monaten (SMITH, 1987). Neben starkem Gewichtsverlust und Apathie fällt meist auch ein Ikterus auf (BOSTEDT und DEDIÉ, 1996). Die Leber erkrankter Tiere ist vergrößert, auffallend blass und von brüchiger Konsistenz (KENNEDY et al., 1994a; BOSTEDT und DEDIÉ, 1996). Neben einer fettigen Infiltration,

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die auf die centrolobulären Bereiche begrenzt ist, liegt eine Proliferation von Gallengangsepithel und mesenchymalen Zellen in den Venen vor. Weiterhin erfolgt die Ablagerung von Lipofuszin in den Hepatozyten (SUTTLE, 1988; KENNEDY et al., 1994a). Gelegentlich treten auch Photosensitivität und neurologische Symptome wie Ataxie, Tremor und tonische Krämpfe auf (SMITH, 1987; BOSTEDT und DEDIÉ, 1996), was mit den Leberfunktionsstörungen begründet wird (SUTTLE, 1988). Über die Pathomechanismen dieser Erkrankung liegen bisher nur geringe Kenntnisse vor. Lange Zeit wurden dieser Symptomatik neben Kobalt-Mangel auch Mykotoxine (RICHARDS und HARRISON, 1981) und niedrige Molybdän-Gehalte in der Ration (ULVUND und PESTALOZZI, 1990) als auslösende Faktoren zugeschrieben. In letzter Zeit wird dem Kobalt-Mangel als alleinige Ursache eine große Bedeutung beigemessen (BOSTEDT und DEDIÉ, 1996; UNDERWOOD und SUTTLE, 1999). 2.10 Regionale Verteilung von Kobalt-Mangelgebieten Kobalt-Mangel ist in vielen Gegenden der Welt ein schon lange bekanntes Krankheitsbild beim Wiederkäuer. Die Bezeichnungen für die Erkrankung sind regional unterschiedlich. In Australien wird Kobalt-Mangel, der dort „coast disease“ oder auch „wasting disease“ genannt wird, hauptsächlich in den küstennahen Regionen beobachtet (McDOWELL, 1992). Während der vorherrschende Bodentyp in den betroffenen Gebieten Australiens Sandboden ist, wird der als „bush sickness“ in Neuseeland bezeichnete Kobalt-Mangel vor allem auf Böden vulkanischen Ursprungs diagnostiziert (FRASER, 1984). Dabei sind die Nord- und Südinsel gleichermaßen betroffen. In den USA zählen die Neuenglandstaaten und die Küstenregion Floridas zu den Gebieten, in denen die Kobalt-Gehalte der Böden sehr niedrig sind und Kobalt-Mangelerscheinungen bei Schafen und Rindern häufiger beobachtet werden. Gelegentlich gibt es auch Krankheitsfälle im mittleren Westen sowie in der Region um die großen Seen (AMMERMAN, 1969; REID und HORVATH, 1980). Zusammen mit Natrium, Phosphor und Kupfer stellt Kobalt in tropischen Regionen einen der wichtigsten limitierenden Faktoren bei grasenden Wiederkäuern dar (McDOWELL et al., 1993). In Europa wird über Kobalt-Mangel in verschiedenen Regionen berichtet, wobei vor allem Schottland und Irland sowie Norwegen zu erwähnen sind. Auch hier sind Krankheitsfälle im Großen und Ganzen in küstennahen Gebieten eher zu beobachten als im Landesinneren (POOLE et al., 1972; ULVUND und PESTALOZZI, 1996). In Deutschland wurde schon zu Beginn des 20. Jahrhunderts wiederholt Kobalt-Mangel festgestellt. Die als „Hinsch“, „Semper“ oder „Dörre“ vor allem im Schwarzwald bekannte Erkrankung trat sehr häufig bei Rind und Schaf auf (RUSSEL und DUNCAN, 1956) und

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kann auch heute noch gelegentlich bei nicht mit Mineralfutter supplementierten Tieren festgestellt werden. Auch im norddeutschen Raum wird gelegentlich von Kobalt-Mangelerscheinungen bei Wiederkäuern in Schleswig Holstein (SPIEKERS et al., 1991) und in der Lüneburger Heide (RUSSEL und DUNCAN, 1956; GEITMANN, 2001) berichtet. Das südliche Bayern wird ebenfalls zu den Kobalt-Mangel-Gebieten gezählt (GEITMANN, 2000). Es gibt Grund zur Annahme, dass durch niedrige Kobalt-Gehalte in Boden und Pflanzen die Gesundheit der Tiere und deren Leistungsfähigkeit in vielen Regionen der Welt eingeschränkt wird (MARSTON, 1952).

2.11 Möglichkeiten zur Vermeidung bzw. zur Behandlung eines Kobalt-Mangels

Die Grundvoraussetzung, um einem Kobalt-Mangel vorbeugen zu können, sind Angaben über die Kobalt-Gehalte der vorhandenen Futtermittel. Nur dann kann eine dem jeweiligen Bedarf der Tiere entsprechende Ergänzung mit Spurenelementen vorgenommen werden (Bedarfsempfehlungen siehe Kapitel 2.12.). Da die meisten Futtermittel in der Regel weniger als 0,1 mg Co/kg T enthalten, muss Kobalt supplementiert werden (McDOWELL, 1992). Dies kann auf verschiedene Arten geschehen. Am häufigsten werden direkte kontinuierliche Verfahren angewendet, die vom zeitlichen und finanziellen Aufwand her sehr gering sind. Hierbei erhalten die Tiere über entsprechende Mineralstoffmischungen eine im Großen und Ganzen täglich gleichbleibende Dosis Kobalt (UNDERWOOD und SUTTLE, 1999). In den meisten kommerziell erhältlichen Mineralstoffmischungen liegt Kobalt als Kobalt-Sulfat vor (LATTEUR, 1962), was eine hohe Bioverfügbarkeit aufweist. Während der Stallhaltung wird Kobalt vornehmlich über das Kraftfutter ergänzt (UNDERWOOD und SUTTLE, 1999). Die Kobalt-Ergänzung bei grasenden Wiederkäuern ohne Kraftfutterzufuhr kann durch eine Mineralstoffmischung zur freien Aufnahme (Leckstein oder Leckmasse) oder durch Eingabe eines Bolus in den Pansen erfolgen. Bei der Verwendung von Lecksteinen oder Leckmassen kann die aufgenommene Dosis von Tag zu Tag variieren (LATTEUR, 1962; McDOWELL, 1992; UNDERWOOD und SUTTLE, 1999). Die Eingabe von Boli, die neben Kobalt auch weitere Spurenelemente enthalten können (ROGERS et al., 1998), stellt heute eine weitverbreitete Möglichkeit zur Vermeidung eines Kobalt-Mangels vor allem in Australien, Neuseeland und Irland dar (SMITH, 1987; MINSON, 1990; UNDERWOOD und SUTTLE, 1999). Die Boli bestehen aus einer Trägersubstanz (Eisen oder Glas), in die die jeweiligen Spurenelemente eingebracht worden sind (KENDALL et al., 2001). Unter den im Pansen herrschenden Bedingungen (pH-Wert,

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Redoxpotential) werden die Spurenelemente verzögert freigesetzt (LATTEUR, 1962; SMITH, 1987, UNDERWOOD und SUTTLE, 1999). Der Vorteil dieser Methode liegt in der langandauernden kontinuierlichen Versorgung der Tiere mit Kobalt auch bei Weidehaltung. KENDALL et al. (2001) ermittelten eine Wirkdauer zwischen 141 und 507 Tagen (durchschnittlich 278 Tage). Eine Reduzierung der Kobalt-Freisetzung aus dem Bolus kann durch chemische Reaktionen an der Oberfläche des Bolus durch Bildung einer schwer löslichen Schicht Kalziumphosphat auftreten (DEWEY et al., 1958; POOLE et al., 1972; SMITH, 1987; UNDERWOOD und SUTTLE, 1999). Dieser negative Effekt wird durch die Eingabe mehrerer Boli oder durch gleichzeitige Verwendung von Käfigmagneten gemindert, da so die Kalziumphosphatschicht abgerieben wird (MINSON, 1990; UNDERWOOD UND SUTTLE, 1999). Etwa ein Drittel der Tiere verliert den Bolus durch Regurgitation (MILLAR und ANDREWS, 1964). Bei jungen Schafen und Rindern mit nicht abgeschlossener Pansenentwicklung sowie bei Milchkühen mit hoher Futteraufnahme und damit verbundener intensiver Pansenmotilität ist die Verlustrate höher als bei erwachsenen Tieren bzw. Mastbullen (MILLAR und ANDREWS, 1964; POOLE und CONOLLY, 1967; MILLAR et al., 1984). Eine vor allem in Australien angewandte Methode ist die orale Kobalt-Gabe (SMITH, 1987; UNDERWOOD und SUTTLE, 1999) in regelmäßigen Abständen. Als Dosierung wird für Schafe bei wöchentlicher Eingabe 7 mg Kobalt pro Tier empfohlen. Bei zweimaliger Anwendung pro Woche liegt die Dosis bei 2 mg pro Tier. Je nach Größe und Alter wird bei Rindern die fünf- bis zehnfache Dosis verwendet (UNDERWOOD und SUTTLE, 1999). Der Nachteil dieser Methode liegt in dem hohen Arbeitsaufwand. Größere Abstände zwischen den Kobalt-Gaben können nicht gewählt werden, da Kobalt relativ schnell mit dem Kot ausgeschieden wird (vgl. Kapitel 2.6). Eine ebenfalls mit hohem Kosten- und Arbeitsaufwand verbundene Methode ist die intramuskuläre Injektion von Vitamin B12. Bei Schafen beträgt die Dosis 100 µg Vitamin B12 pro Tier bei wöchentlicher Injektion (ANDREWS und ANDERSON, 1954). Bei Mastrindern erachten JUDSON et al. (1982) eine Dosierung von 6 mg Vitamin B12 pro 50 kg Lebendmasse bei Applikation im Abstand von 6 Wochen als ausreichend. Für die Kompensation von Kobalt-Mangel-Auswirkungen kommt der parenteralen Applikation von Vitamin B12 die größte Bedeutung zu, da durch einmalige Gabe von Vitamin B12 schnell eine appetitanregende Wirkung erzielt wird. Ein ähnlicher Effekt wird bei oraler Kobalt-Gabe erst nach 7 bis 10 Tagen erzielt (MacPHERSON, 1982), wobei in Folge länger andauernder Appetitlosigkeit das Pansenmilieu stark gestört sein kann, so dass die Vitamin B12-Synthese nur langsam wieder einsetzt.

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Verfahren, die den Kobalt-Gehalt in den Pflanzen durch Düngung mit kobalthaltigen Düngemitteln erhöhen sollen, werden in Australien und Neuseeland angewendet. Ein Erfolg ist jedoch stark von Boden und Witterung abhängig, die verantwortlich für schwankende Kobalt-Gehalte der Pflanzen sind. Außerdem ist dieses Verfahren in den meisten Fällen unökonomisch (MacPHERSON, 1983).

2.12 Bedarfsempfehlungen für Wiederkäuer Es stehen verschiedene Möglichkeiten zur Ermittlung des Bedarfs an Energie, Nährstoffen, Mengen- und Spurenelementen sowie Vitaminen zur Verfügung. Während zur Ableitung des Bedarfs an Energie, Protein, Aminosäuren und Mengenelementen die faktorielle Methode Anwendung findet (FLACHOWSKY, 2001), bereitet die Bedarfsermittlung für Vitamine und Spurenelemente mit dieser Methode Schwierigkeiten, da nur ungenügende Daten vorliegen (GfE, 2001). Bei der faktoriellen Bedarfsableitung stellen der Bedarf für Erhaltung und für Leistungen wie zum Beispiel Wachstum, Laktation, Trächtigkeit usw. jeweils einzelne Faktoren dar, deren Summe dem Gesamtbedarf entspricht. Dies wird mit der folgenden Gleichung zum Ausdruck gebracht:

Bedarf = Σ Faktor Erhaltung + Faktor Wachstum + Faktor Laktation + Faktor.....

Das faktorielle Ableitungskonzept kann immer nur dann angewendet werden, wenn zu den jeweiligen Faktoren (Teilleistungen) Kenntnisse über den Nettobedarf sowie die Verwertung der entsprechenden Nährstoffe vorliegen (KAMPHUES et al., 1999). Da dies bei den Spurenelementen im Gegensatz zu den meisten Mengenelementen nicht gegeben ist, kann in solchen Fällen der Bedarf nur über Dosis-Wirkungs-Studien und Leistungsversuche ermittelt werden (Abb. 14). Die hierbei auftretende Problematik liegt in Unklarheiten der zu wählenden Dosierungsstaffelung (GfE, 2001).

Abbildung 14: Schema einer Dosis-Wirkungs-Beziehung zwischen Spurenelement-versorgung und Wirkung (nach UNDERWOOD und SUTTLE, 1999)

Wirk

ung

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Zur Ermittlung des Kobalt-Bedarfs wurde bisher eine Reihe von Dosis-Wirkungs-Versuchen an Schafen (MARSTON, 1970; SMITH und MARSTON, 1970a; HEDRICH et al., 1973; CORRIER et al., 1985; KENNEDY et al., 1990) und zum Teil auch an Mastrindern (JUDSON et al., 1997a; KIRCHGESSNER et al., 1997; SCHWARZ et al., 2000; STANGL et al., 1999a und b, 2000a und b) durchgeführt. Bei laktierenden Milchkühen dagegen wurden bisher nur wenige Versuche zur Kobalt-Versorgung durchgeführt (ELLIOT et al., 1965; GIRARD und MATTE, 1999), so dass bei der Erstellung der Versorgungsempfehlungen für Milchkühe auf Versuchsergebnisse von Schafen und Mastrindern zurückgegriffen werden musste (GfE, 2001). Dass Kobalt ein essentielles Spurenelement für Wiederkäuer ist, konnte bereits in den 30er Jahren in Australien festgestellt werden (LINES, 1935; MARSTON, 1935; UNDERWOOD und FILMER, 1935). Während jedoch zunächst über den Bedarf nur so viel bekannt war, dass sich die Tiere bei zu geringer Kobalt-Zufuhr schlecht entwickelten (sogenannte „coast disease“ beim Schaf oder „wasting disease“ beim Rind), konnte MARSTON (1970) bereits mit 0,7 mg Co/Tag einen Minimalbedarf bei Schafen festlegen. In anderen Versuchen wurde deutlich, dass bereits 0,07 mg Co/kg T für das Wachstum von Schafen und Rindern ausreichen (WINTER et al., 1977; ARC, 1980). Sogar Kobalt-Gehalte von 0,03 bis 0,05 mg Co/kg T hatten keine Auswirkungen auf Lebendmasse und Milchleistung von Milchkühen (QUIRK und NORTON, 1988). Auch die Geburtsgewichte der Kälber unterschieden sich nicht signifikant von denen, deren Mütter Kobalt-Ergänzungen erhielten. Als marginale Versorgung legen UNDERWOOD und SUTTLE (1999) für Schafe einen Kobalt-Gehalt von 0,05 – 0,08 mg Co/kg T fest. Für Rinder, Ziegen und Wildwiederkäuer, die weniger empfindlich auf Kobalt-Mangel zu reagieren scheinen, liegen diese Grenzen bei 0,04 – 0,06 mg Co/kg T. Diese Kobalt-Gehalte reichen jedoch nicht aus bei wachsenden, laktierenden oder tragenden Tieren. QUIRK und NORTON (1987) stellten bei Schafen einen direkten Zusammenhang zwischen der Kobalt-Zufuhr und der Höhe der Milchproduktion fest. Durch Kobalt-Zulagen konnte während der ersten 4 Wochen der Laktation die Milchmenge signifikant gesteigert werden. Gleichzeitig wurde auch die Gewichtszunahme der Lämmer gefördert. Für eine optimale Milchproduktion bei Schafen empfehlen die Autoren eine tägliche Aufnahmemenge von 0,15 mg Co/Tag. Auch Art und Zusammensetzung der Ration sind bei der Festsetzung von Bedarfszahlen zu beachten (Kap. 2.7.1). So werden z.B. bei kraftfutterreichen Rationen für Schafe und Ziegen Kobalt-Gehalte von 0,2 mg Co/kg T empfohlen (AFRC, 1997). Die derzeit gültigen Empfehlungen zur Kobalt-Versorgung von Milchkühen, die im Allgemeinen auch für Schafe und Ziegen Verwendung finden, sind in Tabelle 5 aufgeführt.

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Tabelle 5: Empfehlungen zur Kobalt-Versorgung von Milchkühen (mg Co/kg T)

INRA (1988)

ARC (1989)

GfE (2001)

NRC (2001)

0,11 0,11 0,20 0,10

Während drei wissenschaftliche Gesellschaften übereinstimmend Gehalte von 0,10-0,11 mg Co/kg T empfehlen, hat die GfE im Jahre 2001 ihre Empfehlungen von 0,10 mg Co/kg T auf 0,20 mg Co/kg T heraufgesetzt und weicht damit deutlich von den Empfehlungen der anderen Gesellschaften ab. Die Basis für diese Entscheidung stellen Versuchsergebnisse mit Mastbullen dar (KIRCHGESSNER et al., 1997; SCHWARZ et al., 2000; STANGL et al., 1999a und b, 2000a und b), die auf Milchkühe extrapoliert wurden. Bei einer Staffelung von 0,07 – 0,69 mg Co/kg T wurden Wachstum, Futter-, Energie- und Nährstoffaufnahme sowie Schlachtkörperqualität (SCHWARZ et al, 2000) sowie biochemische Kriterien (Vitamin B12-, Folsäure- und Homocystein-Konzentration im Serum, Blutglucose, Schilddrüsenhormone; STANGL et al., 1998) bewertet.

Von allen wissenschaftlichen Gesellschaften wird unabhängig von der Leistung ein gleichbleibender Kobalt-Gehalt pro kg Trockenmasse empfohlen. Um für die Leistungsgruppen genauere Empfehlungen aufstellen zu können, sind weitere Untersuchungen zum Bedarf notwendig. Problematisch dabei ist jedoch vor allem, dass der Kobalt-Gehalt im Grundfutter stark variiert (Kapitel 2.2), so dass eine Standardisierung nur schwer möglich ist.

2.13 Kobalt-Intoxikation Unter praktischen Bedingungen hat beim Wiederkäuer der Kobalt-Mangel eine um ein Vielfaches stärkere Bedeutung als eine Kobalt-Vergiftung, die vor allem bei monogastrischen Tieren beobachtet wird. Dennoch sind auch gelegentlich Kobalt-Vergiftungen beim Wiederkäuer zu beobachten. Sie treten dann auf, wenn einem Kobalt-Mangel durch Spurenelementergänzung vorgebeugt werden soll (z.B. Fehlmischungen) oder iatrogen bei der Behandlung eines Kobalt-Mangels (NRC, 1980). Ganz selten werden auch Kobalt-Vergiftungen in der Nähe von Industrieanlagen durch Kobalt-Emission beschrieben (SMITH, 1997). Kobalt-Vergiftungen treten erst bei sehr hohen Dosierungen auf. Bei Rindern liegen sie bei über 66 mg Co/100 kg LM (KEENER et al., 1949) bzw. 100 mg Co/100 kg LM (WIESNER, 1970; NRC, 1980), was in etwa dem 500fachen der therapeutischen Dosis entspricht. Schafe tolerieren sogar noch Dosierungen von 350 mg Co/100 kg LM (BECKER und SMITH, 1951). Bei länger andauernder Gabe höherer Kobalt-Dosen kann ein Gewöhnungseffekt eintreten (UNDERWOOD und SUTTLE, 1999).

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Die klinischen Symptome bei chronischer Kobalt-Intoxikation lassen sich nicht eindeutig von denen eines Kobalt-Mangels abgrenzen (NRC, 1980). Die betroffenen Wiederkäuer zeigen Inappetenz mit deutlichem Gewichtsverlust, Anämie, Hyperchromämie und Erschöpfungszustände (ELY et al., 1948; KEENER et al., 1949; NRC, 1980). Zur Feststellung, ob es sich um einen Kobalt-Mangel oder eine chronische Intoxikation handelt, kann die Bestimmung der Kobalt-Konzentration im Lebergewebe herangezogen werden, die im Falle einer Kobalt-Vergiftung stark erhöht ist (NRC, 1980). Sehr hohe Kobalt-Dosen führen beim Rind zu verminderter Wasseraufnahme und Koordinationsstörungen. Weiterhin treten Veränderungen am roten Blutbild, wie Erhöhung des Hämoglobingehalts, der Erythrozytenzahl sowie des Hämotokritwerts auf (KEENER et al., 1949). Akute Kobalt-Vergiftungen konnten bisher nur experimentell erzeugt werden. ANDREWS (1965) verabreichte Schafen einmalig oral 15-90 g Kobalt pro Tier. Alle Tiere starben innerhalb von 16 Stunden. Bei der Sektion war die Schleimhaut der Epiglottis und der Trachea stark gerötet und Flüssigkeit befand sich in Trachea, Bronchien und Lunge. Die Schleimhaut im Labmagen wies starke Rötungen auf und die Blutgefäße des Verdauungstraktes waren injiziert. 2.14 Möglichkeiten zur Diagnostik eines Kobalt-Mangels Da die klinischen Symptome eines Kobalt-Mangels beim Wiederkäuer recht unspezifisch sind und ähnliche Krankheitserscheinungen auch bei einer Vielzahl anderer chronischer Erkrankungen auftreten (SMITH, 1987; HUMANN-ZIEHANK und GANTER, 2000), kann die Diagnose eines Kobalt-Defizits nur durch labordiagnostische Hilfe gestellt werden. - Bestimmung von Kobalt in verschiedenen Matrizes - Ermittlung des Vitamin B12-Gehaltes in Proben tierischen Ursprungs - Messung der Enzymaktivität von Methylmalonyl-CoA-Mutase bzw. Methionin-

Synthase - Bestimmung von Metaboliten, die bei einer durch Cobalamin unterstützten Reaktion

entstehen Weil es sich beim Kobalt-Mangel um eine Herdenerkrankung handelt, bei der die Tiere je nach Alter unterschiedlich stark betroffen sein können, muss zur genauen Diagnosestellung eine repräsentative Anzahl an Tieren aus den unterschiedlichen Alterstufen beprobt werden (HUMANN-ZIEHANK und GANTER, 2000). Die verschiedenen Diagnostik-Möglichkeiten sollen im Folgenden mit ihren Vor- und Nachteilen kurz erläutert werden.

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2.14.1 Bestimmung von Kobalt in verschiedenen Matrizes Die direkte Messung von Kobalt im Serum der Tiere hat nur eine untergeordnete Bedeutung (BLANCHFLOWER et al., 1990), da die Kobalt-Konzentration im Blut von vornherein sehr niedrig ist und Kobalt schnell aus dem Blut durch Leber und Niere entfernt wird (SMITH, 1997). Kobalt ist deshalb im Blut nur schwer mit den bisher zur Verfügung stehenden Methoden nachweisbar. Bei der Graphitrohr-Atomabsorptionsspektrometrie (GFAAS) bestehen Unsicherheiten bezüglich der Nachweisgrenzen. Weiterhin liegen bei Schaf und Rind nur sehr wenige Daten über die Kobalt-Konzentrationen im Serum und ihre Dynamik vor, so dass die Interpretation dieser Messwerte äußerst schwierig ist (HUMANN-ZIEHANK und GANTER, 2000).

Ein weitaus besserer Parameter zum Nachweis eines Kobalt-Defizits ist die Kobalt-Konzentration im Lebergewebe (McDOWELL, 1992; UNDERWOOD und SUTTLE, 1999). Aus der ermittelten Kobalt-Konzentration kann dann ein Rückschluss auf die Vitamin B12-Konzentration im Lebergewebe gezogen werden (MITSIOLIS et al., 1995; SMITH, 1997). Auch eine Kobalt-Vergiftung wird über die Konzentration von Kobalt im Lebergewebe mit ausreichender Sicherheit festgestellt (NRC, 1980). Vorraussetzung für eine exakte Analytik ist eine relativ große Menge an Lebergewebe (ca. 1 g). Aus diesem Grunde ist die Mehrheit der Untersuchungsmethoden nur bei verendeten bzw. geschlachteten Tieren möglich, da die mittels Leberbiopsie (DIRKSEN, 1990) zu gewinnenden Mengen nur bedingt ausreichen. Ein weiteres Problem kann bei der Bestimmung von Kobalt im Gewebe mittels Atomabsorptions-Spektrometrie auftreten, wenn es bei hohen Eisen-Konzentrationen in der Leber zu Interferenzen mit Eisen-Atomen kommt. Diese können aber durch bestimmte Behandlungsschritte der Probe vor der Untersuchung minimiert werden (GELMAN, 1976). Bei der Interpretation der Ergebnisse vor allem im Hinblick auf den Vitamin B12-Status ist zu berücksichtigen, dass nicht das gesamte im Leberdepot vorhandene Kobalt als Vitamin B12 vorliegt (SMITH, 1987). Die häufigste Prüfmethode ist die Messung der Kobalt-Gehalte in Futtermittelproben. Bei der Interpretation solcher Werte müssen die in Kapitel 2.2 aufgeführten Einflüsse beachtet werden, so dass immer eine repräsentative Anzahl an Proben genommen werden muss (CLARK, 1998). Als alleiniger Test zur Diagnose eines Kobalt-Defizits beim Wiederkäuer ist diese Form der Untersuchung nicht geeignet (CLARK, 1998). Die Ergebnisse der Analysen können jedoch zur Interpretation von Ergebnissen in Blut- und Gewebe verwendet werden.

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2.14.2 Vitamin B12-Messungen in Proben tierischen Ursprungs Die Ermittlung der Vitamin B12-Konzentration in Blut und Gewebe hat gegenüber der Kobalt-Bestimmung eine deutlich größere Bedeutung. Besonders häufig wird die Bestimmung von Vitamin B12 im Serum durchgeführt, da Blut im Gegensatz zu Leber- und Nierengewebe leichter zu gewinnen ist (UNDERWOOD und SUTTLE, 1999). Des weiteren kommt es bei Kobalt-Mangel recht schnell zu einem Rückgang der Vitamin B12-Konzentration im Serum (HOEKSTRA et al., 1952; KERCHER und SMITH, 1956; DAWBARN et al., 1957), während in der Leber noch über längere Zeiträume Vitamin B12 gespeichert wird. Die genannten Autoren konnten die Vitamin B12-Konzentration im Serum in direkten Bezug zum Kobalt-Gehalt in der Ration setzen. Einige Referenzwerte sind in Kapitel 2.15 aufgeführt. Zur Bestimmung von Vitamin B12 kommen verschiedene Methoden zum Einsatz, wobei die Vergleichbarkeit der einzelnen Verfahren untereinander nicht immer gegeben ist. Die heute gebräuchlichsten Methoden Vitamin B12 zu bestimmen, sind kompetitive Assays (Radioimmuno- und Enzymimmuno-Assay). Sie haben die lange Zeit angewendete mikrobiologische Bestimmungsmethode weitestgehend ersetzt (MILLAR et al., 1984). Bei diesen Tests konkurriert das aus der Patientenprobe stammende Vitamin B12 mit radioaktiv bzw. enzymgebundenem Vitamin B12 um eine bestimmte Menge an gereinigtem Intrinsic Factor, der an eine feste Phase gebunden ist. In Waschvorgängen wird nicht gebundenes Vitamin B12 entfernt. Beim Radioimmuno-Assay kann nun über die messbare Radioaktivität die Konzentration Vitamin B12 in der Patientenprobe errechnet werden. Beim Enzymimmuno-Assay wird nach den Waschvorgängen ein Substrat zugegeben, welches durch das am markierten Vitamin B12 gebundene Enzym in ein farbiges Produkt umgewandelt wird. Die photometrisch ermittelte Extinktion der Färbung wird in die Vitamin B12-Konzentration umgerechnet. Probleme bei der Bestimmung von Vitamin B12 im Wiederkäuerserum treten dadurch auf, dass die Tests eigentlich für die Humanmedizin entwickelt worden sind (MILLAR et al., 1984). Die Vitamin B12-Konzentration im Serum von Rindern wird bei einigen dieser Tests unterschätzt, da das Vitamin B12 an bovines Transcobalamin gebunden ist. Dieses ist im Gegensatz zum humanen Transcobalamin stabiler, so dass das gebundene Vitamin B12 nicht durch alle Analysevorbereitungs-Verfahren vollständig freigesetzt wird. Gebundenes Vitamin B12 kann nicht gemessen werden (PRICE et al., 1993). Aus diesem Grunde entstehen bei unterschiedlichen Tests verschiedene Werte (SCHULTZ, 1987). Die Tatsache, dass bei Schafen in der Regel höhere Vitamin B12-Konzentrationen als bei Rindern gefunden werden, führen UNDERWOOD und SUTTLE (1999) darauf zurück, dass Schafe weniger Transcobalamine besitzen (PRICE et al., 1993). Ein weiterer Störfaktor könnte durch Vitamin B12-Analoga im Serum auftreten (SCHULTZ, 1987). Die Verwendung von gereinigtem

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Intrinsic Factor als Bindungsprotein verhindert jedoch die Messung von Analoga, da die Bindungsstelle des Intrinsic Factors Vitamin B12-spezifisch ist (Kap. 2.5). Die Vitamin B12-Konzentration im Lebergewebe hat nach SMITH (1987) größere Bedeutung für die Erkennung eines Kobalt-Mangels als Leber-Kobalt-Gehalte, da nicht das gesamte gespeicherte Kobalt im Vitamin B12 vorliegt. Umgekehrt besteht eine feste Relation zwischen der Kobalt- und Vitamin B12-Konzentration (MITSIOULIS et al., 1995). Der diagnostische Wert der Vitamin B12-Messung wird allerdings durch gleichzeitige Erkrankungen oder Hunger stark beeinträchtigt, da dies zu erhöhten Gewebekonzentrationen führt (MILLAR et al., 1984). Bei Leberverfettung überschätzt man in der Regel den Vitamin B12-Gehalt (UNDERWOOD und SUTTLE, 1999).

Vitamin B12-Messungen in der Milch werden genutzt, um die Störeinflüsse von Transcobalaminen im Rinderserum zu umgehen (UNDERWOOD und SUTTLE, 1999). In einigen Fällen konnte bei dieser Matrix ein engerer Zusammenhang zwischen Kobalt-Versorgung und Vitamin B12-Konzentration in der Leber ermittelt werden als beim Serum (JUDSON et al., 1997b). Zugelassene Testverfahren und Referenzwerte für Milch liegen jedoch kaum vor. Auch kann man über die Bestimmung von Vitamin B12 in der Milch die Vitamin-Versorgung bei saugenden Kälbern und Lämmern überprüfen (GRACE et al., 1986; TRAN, 1988). Vornehmlich von experimenteller Bedeutung ist die Bestimmung von Vitamin B12 im Pansensaft. Hierbei werden ebenfalls sowohl kompetitive als auch mikrobiologische Testverfahren angewendet. Bei kompetitiven Tests - vor allem bei Enzymimmuno-Assays – können durch die Eigenfarbe des Pansensafts Extinktionsveränderungen auftreten. Weiterhin können Pansenmikroben und Enzyme im Verdauungstrakt Störeinflüsse darstellen (HÜBNER, 2001). Bei den mikrobiologischen Tests ist noch mehr als bei anderen Matrizes zu berücksichtigen, dass E. coli auch auf Analoga reagiert. Bei der Messung gleicher Pansensaftproben von Schafen, die täglich 1 mg Kobalt pro Tag oral aufnahmen, lagen die mit E. coli ermittelten Werte um den Faktor 10 bis 20 höher als die unter Verwendung von O. malhamensis (HINE und DAWBARN, 1954). Vor dem Einsatz eines solchen Tests muss folglich feststehen, ob die Gesamtheit aller vitaminähnlichen oder nur vitaminwirksame Verbindungen gemessen werden sollen.

2.14.3 Ermittlung von Enzymaktivitäten Eine weitere Möglichkeit, den Kobalt-Status zu ermitteln, besteht in der Aktivitätsmessung der Methylmalonyl-CoA-Mutase und Methionin-Synthase (KENNEDY et al., 1990). Diese Methoden sind allerdings noch in der Entwicklung, schwierig durchführbar und kostspielig

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(GRUNER et al., 1998). Die Messung erfolgt zum Großteil radioenzymatisch (KENNEDY et al., 1990). PETERS und ELLIOT (1984) wiesen einen Aktivitäts-Anstieg des cobalamingebundenen Anteils Methylmalonyl-CoA-Mutase (Holo-Enzym) bei oraler Zufuhr bzw. bei intramuskulärer Injektion von Vitamin B12 nach. Ein Zusammenhang zwischen Kobalt-Zufuhr und den Holo-Enzymen der Methylmalonyl-CoA-Mutase und Methionin-Synthase konnte auch von KENNEDY et al. (1990) beobachtet werden. Eine Interpretation dieser Ergebnisse halten die Autoren jedoch für sehr schwierig, da bisher nur wenig Daten über den Umsatz beider Enzyme unter physiologischen Bedingungen oder bei Stresssituationen vorliegen. Weiterhin ist bisher zu wenig darüber bekannt, in welcher Weise Vitamin B12 den Enzymhaushalt beeinflusst, um die Enzymaktivität zur Diagnose einzusetzen.

2.14.4 Messung von Methylmalonylsäure oder Fomiminoglutamat Die neben der Bestimmung von Vitamin B12 in Serum und Lebergewebe zweithäufigste Art, einen Kobalt-Mangel beim Wiederkäuer zu diagnostizieren, ist die Messung der Methylmalonylsäure-Konzentration in Plasma oder Harn. Ihr Nachweis erfolgt heutzutage in der Regel mittels Gaschromatographie nach einer von McMURRAY et al. (1986) entwickelten Methode. Diese für Plasma- und Urinproben beim Schaf geprüfte Methode kann mit gleicher Sicherheit auch beim Rind angewandt werden (McGHIE, 1991), wird jedoch bis heute aus Kostengründen nur selten genutzt (GRUNER et al., 1998).

Wie bei den bisher beschriebenen Methoden zur Ermittlung des Kobalt-Status beim Wiederkäuer gibt es auch bei der Bestimmung der Methylmalonylsäure Einflüsse, die für die Interpretation der Ergebnisse problematisch werden können. Bei mangelhafter Futteraufnahme kommt es durch verminderte Propionsäure-Produktion im Pansen zu einer verminderten Methylmalonylsäure-Konzentration im Blut (PATERSON und MacPHERSON, 1990b). Um Fehlinterpretationen zu vermeiden, erscheint es sinnvoll, sowohl Methylmalonylsäure als auch Vitamin B12 im Serum bzw. Plasma zu bestimmen und die Ergebnisse miteinander in Relation zu setzen (PATERSON und MacPHERSON, 1990b). Darüber hinaus zirkuliert bei ausgeprägtem Kobaltmangel weniger Methylmalonylsäure im Plasma (KENNEDY et al., 1994b). Weiterhin konnten neben tierartlichen auch große individuelle Unterschiede in der Methylmalonylsäure-Konzentration im Blutplasma ermittelt werden (PATERSON und MacPHERSON, 1990b), so dass die Referenzwerte (Kapitel 2.15) nur bedingt verwendbar sind. Das im Falle eines Kobalt-Mangels im Folsäuremetabolismus entstehende Formiminoglutamat kann zum Nachweis eines Kobalt-Defizits noch nicht eingesetzt werden (GRUNER et al., 1998), da bisher keine Zusammenhänge zwischen der Konzentration dieses Metaboliten und der Vitamin B12-Konzentration im Serum oder dem Kobalt-Gehalt in der

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Ration aufgestellt werden konnten. Sowohl GAWTHORNE (1968) als auch MARSH und TURNER (1988) haben jeweils nur Formiminoglutamat und kein Vitamin B12 bestimmt. Da vermutlich nicht alle Tiere in ausreichender Menge Formiminoglutamat produzieren (RUSSEL et al., 1975), wurde an der Weiterentwicklung zu einer routinemäßigen Methode nicht gearbeitet.

2.15 Referenzwerte zur Beurteilung der Kobaltversorgung von Wiederkäuern

In Tabelle 6 sind einige Referenzwerte aufgeführt, die zur Beurteilung der Kobalt-Versorgung von Wiederkäuern herangezogen werden können.

Tabelle 6: Vitamin B12-Konzentrationen bei Rind und Schaf im Serum und deren Interpretation

Tierart Konzentration (pg/ml)

Interpretation Autor

Rind < 50 Co-Defizit 50 - 100 Marginale Co-Versorgung SUTTLE (1986)

< 50 Co-Mangel 200 - 400 Adäquate Co-Versorgung SCHOLZ (1990)

4 - 20 Co-Mangel 25 - 53 Marginale Co-Versorgung 40 - 90 Adäquate Co-Versorgung

PULS (1994)

Schaf < 200 Co-Defizit 300 Marginale Co-Versorgung

ANDREWS und STEPHENSON (1966)

< 250 Co-Defizit 250 - 500 Marginale Co-Versorgung > 500 Adäquate Co-Versorgung

CLARK und MILLAR (1983); SUTTLE (1986)

< 200 Co-Defizit 200 - 400 Marginale Co-Versorgung 400 - 2400 Adäquate Co-Versorgung

PULS (1994)

An Hand der aufgeführten Werte ist ersichtlich, dass Schafe physiologischerweise höhere Vitamin B12-Konzentrationen im Serum aufweisen als Rinder. Sie zeigen bei unzureichender Kobalt-Zufuhr mit der Ration schneller Krankheitssymptome als Rinder. Die Unterschiede in den Referenzbereichen einzelner Autoren basieren zum Teil auf verschiedenen Testverfahren und können deshalb nur als Anhaltspunkte dienen. Gleiches gilt auch für die in Tabelle 7 zusammengefassten Referenzwerte für Cobalamine in der Leber.

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Tabelle 7: Vitamin B12-Konzentrationen im Lebergewebe und deren Interpretation

Tierart Konzentration (pg/ml)

Interpretation Autor

Rind < 70 Starkes Co-Defizit 70 - 110 Co-Defizit 110 - 190 Marginale Co-Versorgung

ANDREWS et al. (1959)

< 100 Co-Defizit 100 - 300 Marginale Co-Versorgung > 300 Adäquate Co-Versorgung

CLARK und MILLAR (1983)

40 - 100 Co-Defizit 110 - 220 Marginale Co-Versorgung 250 - 2500 Adäquate Co-Versorgung

PULS (1994)

Schaf < 70 Starkes Co-Defizit 70 - 110 Co-Defizit 110 - 190 Marginale Co-Versorgung

ANDREWS et al. (1959) MARSTON (1970)

< 150 Co-Defizit 150 - 300 Marginale Co-Versorgung > 300 Adäquate Co-Versorgung

CLARK und MILLAR (1983) PULS (1994)

Neben der Vitamin B12-Konzentration in der Leber kann zur Diagnose auch die Kobalt-Konzentration herangezogen werden. Hierzu gibt es jedoch nur wenig Referenzwerte. ASKEW und WATSON (1943) ermittelten bei gesunden Schafen eine Kobalt-Konzentration im Lebergewebe von 0,15 mg Co/kg T, während Tiere mit Co-Mangel 0,02 mg Co/kg T aufwiesen. Gleiche Werte gibt auch SCHOLZ (1990) für das Rind an. Durch die in den vorhergehenden Kapiteln aufgeführten Nachteile der einzelnen Methoden und individuellen Einflüsse der Tiere werden in der Regel zur genauen Diagnose mehrere Parameter herangezogen und diese in Verbindung mit dem klinischen Bild gebracht. Als Beispiel sei hier die Interpretation von Methylmalonylsäure-Konzentrationen im Plasma von Schafen mit den Cobalamin-Konzentrationen erwähnt (Tabelle 8).

Tabelle 8: Interpretation der Konzentrationen von Methylmalonylsäure (MMA) und Vitamin B12 im Plasma von Schafen (nach McMURRAY et al., 1985)

MMA (µmol/l) Vitamin B12 (nmol/l) Interpretation < 4,6 > 0,2 Normaler Kobalt-Status < 4,6 < 0,2 Marginaler Kobalt-Status

4,6 - 15 < 0,2 Sub-klinisches Kobalt-Defizit> 15 < 0,2 Deutliches Kobalt-Defizit

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2.16 Ableitung der Aufgabenstellung Bereits im Jahre 1935 wurde in Australien festgestellt, dass Kobalt für Wiederkäuer ein essentielles Spurenelement ist, und dass sowohl Rinder als auch Schafe bei Kobalt-Mangel zum Teil recht unspezifische Krankheitssymptome zeigen. Von da an wurde eine Vielzahl von Untersuchungen zur Optimierung der Kobalt-Versorgung durchgeführt. Nach Entdeckung des Vitamin B12 und Aufklärung seiner Struktur wurde dieses Vitamin als ein Parameter zur Ermittlung der Kobalt-Versorgung herangezogen. Darüber hinaus konnte auch die Bedeutung von Vitamin B12 im Stoffwechsel von Säugetieren aufgeklärt werden. In der Mehrzahl der Untersuchungen zum Kobalt- und Vitamin B12-Bedarf des Wiederkäuers wurde das Schaf als Versuchstier verwendet. Zum einen reagieren Schafe deutlich sensibler auf eine mangelhafte Kobalt-Versorgung, zum anderen sind sie oftmals Modelltier für den großen Wiederkäuer. Beim Rind sind die meisten Versuche an Mastbullen durchgeführt worden. Demgegenüber stehen für Milchkühe nur wenige Daten über die Kobalt- und Vitamin B12-Konzentration im Lebergewebe sowie über die Vitamin B12-Konzentration im Serum zur Verfügung. Eine ähnliche Datenlage besteht auch bei der ruminalen Vitamin B12-Synthese unter Berücksichtigung der Rationsgestaltung für hochleistende Milchkühe. In den letzten Jahren konnte bei Mastbullen durch Erhöhung des Kobalt-Angebots (≈ 0,2 mg Co/kg T) eine Steigerung der täglichen Futteraufnahme und der Lebendmassezunahme erreicht werden. Eine Reihe biochemischer Stoffwechselparameter war ebenfalls verändert. Da bisher nur wenige Dosis-Wirkungsstudien zur Kobalt- bzw. Vitamin B12-Versorgung von Milchkühen vorliegen und wenig über den Bedarf an Kobalt bzw. Vitamin B12 bekannt ist, sollte in dem vorliegenden Versuchsansatz der Einfluss unterschiedlicher Kobalt-Zulagen auf eine Reihe von Kriterien untersucht werden. Dabei wurden folgende Untersuchungsschwerpunkte gesetzt: • Untersuchung des Einflusses von Kobalt-Zulagen auf die mikrobielle Vitamin B12-

Synthese sowie Auswirkungen auf das Pansenmilieu • Untersuchungen zu tageszeitlichen Schwankungen von biochemische Parametern

(Vitamin B12, Folsäure, Glucose, Harnstoff, ß-Hydroxy-Buttersäure, Gesamtbilirubin, Leberenzyme) und der Einfluss von Kobalt-Ergänzungen auf die Konzentration dieser Parameter im Serum von Milchkühen

• Einfluss von Kobalt-Zulagen auf die Kobalt- und Vitamin B12-Konzentration in der Leber

• Ermittlung des Einflusses von Kobalt-Zulagen auf Futteraufnahme, Milchleistung und –inhaltsstoffe hochleistender Milchkühe

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• Untersuchungen zum Einfluss verschieden hoher Kobalt-Gehalte in der Ration von Milchkühen auf die Vitamin B12-Konzentration im Kolostrum sowie im Serum ihrer neugeborenen Kälber

Diese Arbeit sollte neue Daten zur Aktualisierung des Kobalt-Bedarfs hochleistender Milchkühe erbringen.

Material und Methoden

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3 MATERIAL UND METHODEN

3.1 Überblick über die durchgeführten Versuche Um den Einfluss unterschiedlich hoher Kobalt-Zulagen in der Ration von Milchkühen untersuchen zu können, wurden in der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Braunschweig vier in-vivo-Versuche durchgeführt. Zunächst sollten in einem Versuch mit ruminal und duodenal fistulierten Tieren die Auswirkungen unterschiedlichen Kobalt-Angebots auf ruminale Parameter wie Milieu, mikrobielle Protein- und Vitamin B12-Synthese untersucht werden. Einen zweiten Schwerpunkt der Untersuchungen stellte ein Fütterungsversuch dar. Ihm war ein 24-stündiger Vorversuch vorgeschaltet, in dem die tageszeitliche Dynamik der im Fütterungsversuch zu erhebenden biochemischen Parameter (Vitamin B12, Folsäure, Glukose, Harnstoff, Gesamtbilirubin, Leberenzyme) bestimmt wurde. Im zweiteilig angelegten Fütterungsversuch wurde an 54 bzw. 20 Milchkühen der Einfluss verschiedener Kobaltgehalte auf Futteraufnahme, Milchleistung und Milchinhaltsstoffe sowie auf biochemische Parameter ermittelt. Um Aussagen über eventuelle Einflüsse der Kobalt-Versorgung der Muttertiere auf die der Kälber machen zu können, wurden die Kälber der im zweiten Teil des Fütterungsversuches verwendeten Tiere ebenfalls beprobt (Kälberversuch). Eine Übersicht über die durchgeführten Versuche ist Tabelle 9 zu entnehmen. Tabelle 9: Übersicht über die durchgeführten Versuche

Versuchsbezeichnung Versuchstiere Versuchsdauer

Versuch an fistulierten Milchkühen 5 laktierende, fistulierte Milchkühe 42 Tage

Vorversuch 5 laktierende Milchkühe 24 Stunden

Fütterungsversuch Teil I 54 laktierende Milchkühe 112 Tage

Fütterungsversuch Teil II 20 laktierende Milchkühe ca. 168 Tage

Kälberversuch 20 Kälber 5 Tage

3.2 Beschreibung der verwendeten Futtermittel

3.2.1 Grundfutter Die Rationen im Versuch mit fistulierten Milchkühen und in beiden Teilen des Fütterungsversuchs basierten auf angewelkter Grassilage als Grundfutter. In beiden Versuchen sollte für die Kontrollgruppe ein Kobalt-Gehalt von 0,10 mg Co/kg T eingehalten werden, was den derzeitigen Empfehlungen zur Kobalt-Versorgung von Milchkühen von INRA (1988), ARC (1989) und NRC (2001) bzw. den bis 2001 gültigen Empfehlungen der

Material und Methoden

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GfE entspricht. Da auf Grund des nativen Kobalt-Gehalts der Einzelkomponenten (Tabelle 11) das Ausgleichskraftfutter ohne Kobalt-Zulage bereits einen Kobalt-Gehalt von im Mittel 0,60 mg Co/kg T und das Milchleistungsfutter von 0,20 mg Co/kg T aufwiesen, musste der Kobalt-Gehalt in der Grassilage niedrig sein. Aus diesem Grund wurden verschiedene Grassilagen, die in der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Braunschweig zur Verfügung standen, auf ihren Kobalt-Gehalt hin untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 aufgeführt.

Tabelle 10: Kobalt-Gehalte (mg/kg T) von Grassilagen der Versuchsstation der FAL in Braunschweig

Bezeichnung Jahr Schnitt Co-Gehalt mg/kg Grassilage Silo 26/27 1999 2.Schnitt 0,17 Grassilage Silo 28/29*) 1999 1.Schnitt 0,04 Grassilage Silo 17*) 2000 1.Schnitt 0,12 Grassilage Silo 23*) 2000 1.Schnitt 0,10 Grassilage Silo 28*) 2000 2.Schnitt 0,08 Grassilage Silo 61 2000 1.Schnitt 0,09 Grassilage Silo 62 2000 3.Schnitt 0,31

*) in den Versuchen eingesetzte Silagen Die Silage aus Silo 61 kam trotz eines niedrigen Kobalt-Gehalts wegen ungenügend verfügbarer Mengen nicht in Betracht.

3.2.2 Kraftfutter Im Versuch an fistulierten Milchkühen sowie in beiden Teilen des Fütterungsversuchs wurden vier verschiedene Kraftfutter eingesetzt. Dabei handelte es sich um drei Ausgleichskraftfutter, die nachfolgend mit Kraftfutter I-III bezeichnet werden, und ein Milchleistungsfutter, das Kraftfutter IV genannt wird (Zusammensetzung siehe Tab. 11). Um in den einzelnen Kraftfuttermischungen die gewünschten Kobalt-Gehalte zu erzielen, wurde den Kraftfuttern II und III Kobalt in Form von Kobalt-Sulfat (CoSO4 * 7 H2O; Fa.

SIGMA C 6768) zugegeben.

Material und Methoden

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Tabelle 11: Zusammensetzung der Kraftfuttermischungen (%)

Kraftfuttermischung I, II und III

(Ausgleichskraftfutter)IV

(Milchleistungsfutter)

Sojaextraktionsschrot 30,5 35

Gerste 17,4 20

Weizen 17,4 20

Trockenschnitzel 18 21

Sojaöl 1,7 2,0

vitamin. Mineralstoff-Misch.1) 15 2,0 1) Zusammensetzung siehe Anhang 2

3.3 Untersuchungen an ruminal und duodenal fistulierten Milchkühen

3.3.1 Versuchsaufbau Zur Überprüfung der Auswirkungen unterschiedlicher Kobalt-Gehalte im Futter auf die mikrobielle Protein- und Vitamin B12-Synthese im Pansen sowie auf Parameter des Pansenmilieus wurde ein über 6 Wochen dauernder Versuch (2 Versuchsperioden à 3 Wochen) mit 5 Milchkühen durchgeführt. Die Tiere waren nach folgendem Schema den einzelnen Perioden zugeteilt (Tabelle 12):

Tabelle 12: Versuchseinteilung

Kuh 1. Versuchsperiode 2. Versuchsperiode Evelyn Kontrolle Co-suppl. Romke Kontrolle Co-suppl. Leisa Kontrolle Co-suppl.

Sanara Co-suppl. Kontrolle Ulane Co-suppl. Kontrolle

Kontrolle: 0,10 mg Co/kg Futter-T; Co-suppl.: 0,30 mg Co/kg Futter-T

Die dreiwöchigen Versuchsperioden gliederten sich wie folgt:

- 16 Tage Vorfütterung zur Adaptation der Tiere an die Ration - 5-tägige Darmsaftsammelperiode

Vier Tage nach Beginn der ersten Versuchsperiode wurde vor der ersten Markereingabe (Kap. 3.3.5) bei jedem Tier in einer Duodenalsaftprobe der Chromblindwert bestimmt.

Material und Methoden

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3.3.2 Versuchstiere, Fütterung und Haltung Für den Versuch an fistulierten Milchkühen standen 5 laktierende Milchkühe der Rasse „Deutsche Holstein“ mit einer durchschnittlichen Lebendmasse von 678 ± 45 kg bei Versuchsbeginn zur Verfügung. Die Tiere waren jeweils mit einer Pansenkanüle im dorsalen Pansensack und einer T-Kanüle im proximalen Duodenum (ca. 30 cm hinter dem Labmagenausgang vor Einmündung des Ductus choledochus) ausgestattet. In Tabelle 13 ist für jedes Tier die Milchmenge und der Gehalt an Milchinhaltsstoffen sowie der Laktationstag zu Versuchsbeginn aufgeführt. Romke hatte zu Versuchsbeginn bereits den 498. Laktationstag erreicht (Trächtigkeit erst nach wiederholter Besamung). Sie wurde dennoch im Versuch eingesetzt, da die Milchleistung für die Fragestellung des Versuches ausreichend war.

Tabelle 13 : Tägliche Milchleistung und –inhaltsstoffe der fistulierten Kühe (n=5) zu Versuchsbeginn

Kühe Milch (kg) Fett (%) Protein (%) Laktose (%) FCM (kg)1) Laktationstag

Evelyn 18,8 5,02 3,87 4,89 21,7 311

Romke 14,2 5,81 3,79 5,00 18,1 498

Leisa 19,0 5,57 3,61 4,52 23,5 222

Sanara 21,8 5,13 3,89 5,10 25,5 260

Ulane 24,0 5,65 3,55 4,98 29,9 190

MW ± SD 19,6 ± 3,7 5,44 ± 0,34 3,74 ± 0,15 4,90 ± 0,22 23,7 ± 4,4 296 ± 121 1)FCM = fat corrected milk = (Fett % x 0,15 + 0,4) x Milchmenge (kg)

Die Kühe wurden zweimal täglich (5.30 Uhr und 16.00 Uhr) gemolken. Während der Versuchsdauer wurde von jedem Tier zweimal wöchentlich jeweils ein Gemelksaliquot aus dem Morgen- und Abendgemelk zur Bestimmung der Milchinhaltsstoffe (Fett, Protein, Laktose) gewonnen. Die Aufstallung der Tiere in strohloser Einzelanbindung auf Gummimatten mit Metallgitterrost hinter der Standfläche gewährleistete eine individuelle Erfassung eventueller Futterrückwaagen. Die Tagesration wurde den Tieren in zwei Einzelgaben jeweils um 5.30 Uhr und um 16.00 Uhr von Hand vorgelegt. Wasser stand ständig über Selbsttränken zur freien Verfügung. Von der aus einem Fahrsilo entnommenen Grassilage wurden in der Adaptationszeit einmal, in der Darmchymussammelwoche dreimal Proben zur Bestimmung der Trockensubstanz gewonnen. Unter Berücksichtigung der Trockensubstanz erfolgte die Einwaage der täglichen Silagemenge (gleitendes Mittel der letzten drei Trockensubstanzbestimmungen).

Material und Methoden

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Von der Grassilage wurden während der Darmsaftsammlung jeden Tag bei der täglichen Einwaage jeweils 100 g abgenommen und daraus eine Sammelprobe erstellt. Die Lagerung erfolgte bei –20°C. Nach Beendigung der Darmsaftsammlung fand zur Bestimmung der Trockensubstanz die Trocknung bei 60°C statt. Anschließend wurde die getrocknete Probe für weitere Analysen vermahlen (Siebgröße 1mm). Vor Versuchsbeginn wurde eine Probe der Grassilage ebenfalls bei 60°C getrocknet und auf ihren Kobalt-Gehalt untersucht.

3.3.3 Rationsgestaltung Die Tiere erhielten als Grundfutter angewelkte Grassilage. Die tägliche Menge betrug 10 kg Trockensubstanz pro Tier. Zusätzlich wurden täglich 1,0 kg Ausgleichskraftfutter ohne bzw. mit Co-Zusatz (Kraftfutter I und III) sowie 3,0 kg Milchleistungsfutter (Kraftfutter IV) angeboten. Durch die aus der Rationsgestaltung resultierende tägliche Trockensubstanzaufnahme von ca. 13,5 kg war nicht bei allen Tieren der Energie- und Nährstoffbedarf der Tiere zu decken. Da jedoch im Versuch alle Tiere die gleiche tägliche Menge an Trockensubstanz aufnehmen sollten, wurde die Trockensubstanzvorlage an der „aufnahmeschwächsten“ Kuh ausgerichtet (siehe auch Kap. 4.1.1).

3.3.4 Bestimmung der pansenphysiologischen Parameter Während der zweiten Woche der Vorfütterung einer jeden Versuchsperiode wurden an drei aufeinander folgenden Tagen bei allen Versuchstieren Pansensaftproben genommen. Dies erfolgte mittels einer Sonde per fistulam aus dem ventralen Pansensack. Am ersten Entnahmetag fand die Entnahme um 5.30, 6.00, 6.30, 7.00, 7.30, 8.30 und 10.30 Uhr statt. An den beiden darauf folgenden Tagen wurde drei Stunden nach Beginn der Morgenfütterung (8.30 Uhr) die Pansensaftprobe gewonnen. Unmittelbar nach der Pansensaft-Entnahme wurde der pH-Wert der Probe mittels Glaselektrode ermittelt. Die Bestimmung der NH3-Konzentration (Kap.3.7.5) erfolgte mittels einer modifizierten Conway-Methode (VOIGT und STEGER, 1967). Die Zusammensetzung der dazu verwendeten Borsäure ist dem Anhang zu entnehmen (Anhang 3). Zur Bestimmung der Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren wurden nur die um 8.30 Uhr gewonnenen Pansensaftproben herangezogen. Hierzu wurde der Pansensaft 5 Minuten bei 5000 U/min (Varifuge GL) zentrifugiert. 10 ml des Überstands wurden anschließend mit 1,5 ml 25%iger Meta-Phosphorsäurelösung und 0,5 ml konzentrierter Ameisensäure versetzt und erneut 20 Minuten bei 5000 U/min zentrifugiert. Nach Zusatz von einem Tropfen HgCl-Lösung wurde die Probe bis zur gaschromatographischen Untersuchung bei –20°C tiefgefroren gelagert (siehe Kapitel 3.7.4).

Material und Methoden

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3.3.5 Ermittlung des Nährstoff-Flusses am Dünndarm

3.3.5.1 Herstellung und Verabreichung des Chrommarkers

Die Bestimmung der Flussmengen am Duodenum erfolgte unter Verwendung eines Markers aus Chromoxid, zu dessen Herstellung 18 kg handelsübliches Weizenmehl mit 4,5 kg Chrom(III)-Oxid (Cr2O3; Fa. Merck 102483) und 225 g Aluminiumsulfathydrat (Al2(SO4)3 x H2O; Fa. Merck 101100) in einem Mischer vermischt wurden. Nach dem Mischen wurde soviel Wasser hinzugegeben, dass ein zäher Brei entstand (Hefeteigkonsistenz). Diese Masse wurde bei 60°C getrocknet und anschließend grob vermahlen (3mm-Sieb). Die gemahlene Markersubstanz wurde in 50 g- bzw. 25 g-Portionen auf Rundfiltern eingewogen und mit Hilfe eines Klebestreifens verschlossen. Um ein Gleichgewicht zwischen Markerzufuhr und –ausscheidung bis zur Chymussammelwoche zu erreichen, wurde bereits 10 Tage vor der Sammlung mit der Markereingabe begonnen (ROHR et al., 1984). Dazu wurden jeweils um 5.45 Uhr und 17.45 Uhr 50 g Markermischung in den Pansen verabreicht und mit dem Panseninhalt gut vermischt. Einen Tag vor Beginn der Darmsaftsammlung wurde dazu übergegangen, viermal am Tag (5.45, 11.45, 17.45 und 23.45 Uhr) 25 g Markermischung zu verabreichen, was über die gesamte Dauer der Darmsaftsammlung beibehalten wurde. Die Chromkonzentration in der Markermischung betrug 132,2 mg Chrom pro g Marker-Trockensubstanz.

3.3.5.2 Gewinnung und Aufbereitung der Chymusproben

Die Darmsaftsammlung erfolgte nach der von ROHR et al. (1979) beschriebenen Methode an fünf aufeinanderfolgenden Tagen im Abstand von jeweils zwei Stunden, wobei pro Tier und Probennahme 4x100 ml Darmsaft aus der Duodenalkanüle entnommen wurden. Diese Stichprobensammlung ist zulässig, da nur geringe Unterschiede zur Totalsammlung hinsichtlich der ermittelten Flussmengen auftreten (ROHR et al., 1984). Unmittelbar an die Probengewinnung schloss sich die Messung des pH-Wertes im Darmsaft mittels Glaselektrode an. Nach ROHR et al. (1979) können durch Darmsekrete und rückgestauten Darminhalt Störeffekte bei der Analytik auftreten. Aus diesem Grund werden die Proben mit dem niedrigsten pH-Wert (geringste Kontamination) zu einer Tagessammelprobe zusammengefasst (12 Stichproben über 24 Stunden) und bei –20°C tiefgefroren. Ebenso wurde mit den Proben mit dem nächst höheren pH-Wert verfahren. Die beiden restlichen Proben wurden verworfen. Auf diese Weise erhielt man pro Tier und Versuchsperiode 5 Tagessammelproben mit niedrigstem pH-Wert (zur Ermittlung von Trockensubstanz- und Nährstoffflüssen) und

Material und Methoden

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ebenso viele Proben mit dem nächst höheren pH-Wert (zur Bestimmung der Vitamin B12-Konzentration). Die Tagessammelproben mit dem niedrigsten pH-Wert wurden zur Aufbereitung aufgetaut, gut gemischt und einer Gefriertrocknung (CHRIST-Gefriertrockner) unterzogen. Die Ermittlung des Trockensubstanzgehaltes schloss sich an. Die getrockneten Proben wurden anschließend für weitere Analysen auf 1mm vermahlen. Vor der Gefriertrocknung fand in der Frischsubstanz die Bestimmung des Stickstoffgehalts nach KJELDAHL statt. Als Grundlage zur Berechnung der Trockensubstanz-Flussmengen je Tier und Tag am Duodenum wurde die Chromkonzentration modifiziert nach WILLIAMS et al. (1962) in den Duodenalsaftsammelproben jedes Tages bestimmt (Kap. 3.7.3) und der Trockensubstanz-Fluss im Duodenum mit folgender Formel berechnet: mg Chrom pro Tier und Tag = mg Markertrockensubstanz * mg Chrom pro g Markertrockensubstanz

T-Fluss (kg/d) = mg Chrom pro Tier und Tag / 1000

mg Chrom pro g Chymus-T Hieraus wurden die Nährstoff-Flüsse mittels Trockensubstanz-Fluss pro Tag und den entsprechenden Nährstoffgehalten in der Trockensubstanz ermittelt (ROHR et al., 1979). Die Bestimmung des Vitamin B12-Gehalts erfolgte in der Frischmasse, die bis zur Analyse bei –20°C tiefgefroren blieb.

3.4 Vorversuch zum Fütterungsversuch

3.4.1 Versuchsaufbau, Versuchstiere, Haltung, Fütterung und Probenahme Für den Versuch standen 5 Tiere der Rasse „Deutsche Holstein“ zur Verfügung. Dabei handelte es sich um 4 Tiere in der ersten und eine Kuh in der 6. Laktation. Am Versuchstag betrug die mittlere Anzahl der Laktationstage 75 ± 10 Tage. Die Kühe wurden in einem Boxenlaufstall gehalten und nur zur Blutabnahme fixiert. Die Fütterung erfolgte betriebsüblich mit einer Mischung aus Gras- und Maissilage, sowie einer der Milchleistung entsprechenden Kraftfuttermenge. Zur Blutentnahme wurde bei den Tieren der Bereich beider Jugularvenen rasiert, gründlich gereinigt und desinfiziert. Die Blutentnahme erfolgte wechselseitig alle drei Stunden mittels

Material und Methoden

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Strauss-Kanülen mit 1,5 mm Durchmesser (Fa. Dispomed), wobei die erste Einstichstelle möglichst weit cranial und die folgenden immer caudal der vorhergehenden lagen. Pro Tier und Entnahmezeitpunkt wurden zwei 10 ml Serum-Röhrchen (Fa. Sarstedt, 26.367) und ein 2 ml Natrium-Fluorid-Röhrchen (Fa. Sarstedt, 32.333 PS) gefüllt. Natrium-Fluorid hemmt die Glykolyse wodurch der erythrozytäre Glukose-Verbrauch und die Entstehung von Laktat weitestgehend unterbunden werden. Die Plasmaproben wurden unmittelbar nach ihrer Entnahme bei 3000 U/Min und 15°C für 10 Minuten zentrifugiert (Varifuge 3.OR) und der Überstand (Plasma) in ein Neutralröhrchen (Fa. Sarstedt, 55.475) abgefüllt. Die Proben wurden anschließend bis zur Analyse bei –20°C tiefgefroren. Bevor die Serumproben bei gleichen Bedingungen zentrifugiert werden konnten, mussten die Proben erst vollständig geronnen sein. Dazu blieben die Proben nach der Blutentnahme für 2 Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Nach dem Zentrifugieren wurde in zwei Eppendorf-Cups (Fa. Sarstedt, 72.689) jeweils 1 ml Serum pipettiert. Das restliche Serum wurde auf 2 Neutralröhrchen gleichmäßig aufgeteilt. Auch hier erfolgte bis zur Analyse eine Lagerung bei –20°C.

3.5 Fütterungsversuch Der Fütterungsversuch gliederte sich in zwei Teile, die nachfolgend als Teil I und Teil II bezeichnet werden.

3.5.1 Versuchsaufbau, Versuchstiere und Haltung (Teil I) Um den Einfluss unterschiedlicher Kobaltgehalte im Futter auf Futteraufnahme, Leistung und Stoffwechsel der Tiere untersuchen zu können, wurde ein zunächst über 112 Versuchstage angelegter Fütterungsversuch durchgeführt. Dabei sollten vor allem die Vitamin B12-Konzentration im Serum, die Milchleistung und –zusammensetzung sowie der Kobalt- und Vitamin B12-Gehalt in der Leber ermittelt werden. Für diesen Versuchsteil standen 54 frisch laktierende Milchkühe der Rasse „Deutsche Holstein“ zur Verfügung. Sie wurden in drei Gruppen zu je 18 Tieren unterteilt, wobei die Einteilung nach den Kriterien Milchleistung, Milchinhaltsstoffe sowie Laktationsnummer und -tag erfolgte (Tabelle 14 ). Dabei konnten nicht für alle Parameter übereinstimmende Werte erreicht werden.

Material und Methoden

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Tabelle 14: Leistungsdaten der im Fütterungsversuch verwendeten Tiere zu Versuchsbeginn (n=18; MW ± SD)

Gruppe I Gruppe II Gruppe III

Anzahl der Tiere 18 18 18

Mittlere Milchleistung kg/d 31,0 ± 5,4 30,8 ± 5,6 31,1 ± 4,9

Mittlerer Fettgehalt % 4,17 ± 0,55 4,35 ± 0,50 4,44 ± 0,72

Mittlerer Eiweißgehalt % 3,20 ± 0,21 3,21 ± 0,29 3,24 ± 0,22

Mittlere Laktationsnummer 2,6 ± 1,6 2,4 ± 1,3 2,7 ± 2,1

Mittlerer Laktationstag 79 ± 21 75 ± 25 73 ± 24

Mittlere Lebendmasse kg 635 ± 73 655 ± 80 638 ± 76 Den Gruppen entsprachen folgende Kobalt-Versorgungsstufen:

- Gruppe I : ohne Co-Zulage (≈ 0,1 mg Co/kg T) - Gruppe II : mit 0,1 mg/kg Co-Zulage (≈ 0,2 mg Co/kg T) - Gruppe III : mit 0,2 mg/kg Co-Zulage (≈ 0,3 mg Co/kg T)

Die Versuchstiere wurden in einem Liegeboxenlaufstall mit Einzelfütterung gehalten. Die Zuteilung des Grundfutters erfolgte über computergesteuerte Wiegetröge, wobei Dauer und Menge der Grundfutteraufnahme jeder einzelnen Kuh erfasst wurden. Das Kraftfutter konnten die Tiere an Kraftfutterautomaten abrufen. Gemolken wurde die eine Hälfte der Tiere (jeweils neun pro Co-Versorgungsstufe) zweimal täglich um 6.00 Uhr und um 16.00 Uhr in einem Autotandem-Melkstand. Das Melken bei der anderen Hälfte erfolgte mittels eines automatischem Melksystems (Melkroboter). Diese Tiere konnten bis zu viermal täglich gemolken werden, die durchschnittliche Besuchshäufigkeit lag bei 2,7 Melkungen pro Tag. Die Milchmenge wurde in beiden Systemen täglich registriert. Die nach konventionellem System (Auto-Tandem-Melkstand) gemolkenen Tiere wurden täglich beim Verlassen des Melkstandes gewogen, während bei den mit Melkroboter gemolkenen Kühen die Lebendmasse einmal pro Woche ermittelt wurde.

3.5.2 Versuchsaufbau, Versuchstiere und Haltung (Teil II) Der unter Kapitel 3.5.1 aufgeführte Fütterungsversuch wurde im Anschluss an die 112 Tage mit reduzierter Tierzahl fortgesetzt, wobei aus betrieblichen Gründen (weiteres Versuchsgeschehen) nur noch die zwei dem Fistelkuhversuch entsprechenden Co-Versorgungsstufen (0,1 und 0,3 mg Co/kg T) weiter untersucht werden sollten. Pro Gruppe standen 10 laktierende, tragende Tiere zur Verfügung. Die Haltung der Tiere entsprach der im Fütterungsversuch Teil I. In Teil II wurden jedoch alle Tiere bis zum Trockenstellen mittels automatischem Melksystem gemolken.

Material und Methoden

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3.5.3 Rationsgestaltung (Fütterungsversuch Teil I und II) Analog zum Versuch mit fistulierten Kühen erhielten die Tiere angewelkte Grassilage. Im Fütterungsversuch stand diese wie auch das Wasser zur freien Aufnahme zur Verfügung. Auf Grund der höheren Milchleistung als im Versuch mit fistulierten Kühen wurde im Fütterungsversuch von einer Aufnahme an Grassilage von 12 kg T pro Tier und Tag ausgegangen. Zusätzlich zu den im Fisteltierversuch eingesetzten zwei Kobalt-Stufen (0,10 und 0,30 mg Co/kg T) wurde im Fütterungsversuch Teil I eine weitere Kobalt-Stufe (0,20 mg Co/kg T) eingeführt. Die Tiere erhielten auch in diesem Versuch täglich 1,0 kg Ausgleichskraftfutter ohne bzw. mit Co-Zulage (Kraftfutter I, II und III entsprechend der Gruppen I, II und III). Weiterhin wurde Co-armes Milchleistungsfutter (Kraftfutter IV) nach Leistung wie folgt zugeteilt (Tabelle 15).

Tabelle 15: Zuteilung des Milchleistungsfutters (IV) in Abhängigkeit von der Milchleistung

FCM1) kg / Tier und Tag Kraftfutter kg /Tier und Tag 20 – 25 4,0 25 – 30 7,0

> 30 10,0 1)FCM = fat corrected milk = ( Fett % x 0,15 + 0,4) x Milchmenge (kg)

Die Rationen im Teil II des Fütterungsversuches entsprachen weitestgehend denen von Teil I. Ab dem Zeitpunkt des Trockenstellens entfiel die Gabe von Milchleistungsfutter, so dass die Tiere nur noch das Co-arme bzw. mit Kobalt supplementierte Ausgleichskraftfutter erhielten.

3.5.4 Probennahme

3.5.4.1 Futterproben

Von der Grassilage wurden zweimal wöchentlich (Di. und Do.) über die gesamte Versuchsdauer Proben zur Trockensubstanzbestimmung entnommen. Aus diesen Einzelproben wurde alle 4 Wochen eine Sammelprobe für die WEENDER- und ADF/NDF-Analyse zusammengestellt.Vor Beginn des Versuchs wurde der Kobalt-Gehalt im Grundfutter bestimmt. Gleiches Vorgehen galt für jede neue Kraftfutter-Charge.

Material und Methoden

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3.5.4.2 Blutproben

Während des 112 Tage dauernden ersten Versuchsabschnitts wurden Blutproben (Vena jugularis externa; Strauss Kanülen 1,5 mm) an den Versuchstagen 0, 2, 7, 9, 14, 21, 28, 42, 56, 84 und 112 zur Bestimmung der Vitamin B12-Konzentration sowie weiterer Stoffwechselparameter wie Glukose, Harnstoff, ß-Hydroxybuttersäure und Gesamtbilirubin gewonnen. Weiterhin erfolgte auch die Bestimmung der leberspezifischen Enzyme GLDH, AST und γ-GT sowie von Eisen und der Folsäurekonzentration im Serum. Um eventuelle Auswirkungen von Leberfunktionsstörungen auf die Umsetzung und die Speicherung von Kobalt und Vitamin B12 erkennen zu können, wurden die Konzentrationen an Harnstoff und Bilirubin sowie der leberspezifischen Enzyme bestimmt. Während des zweiten Versuchsteils wurde der Abstand der Blutprobennahme zur Bestimmung der Vitamin B12-Konzentrationen auf 4 Wochen erweitert. Eine weitere Probennahme erfolgte unmittelbar nach der Abkalbung (etwa Versuchstag 280), wobei zwischen Abkalbung und Probennahme maximal eine Stunde lag. Weitere Informationen siehe Kapitel 3.4.1.

3.5.4.3 Milchproben

Zweimal wöchentlich wurde der Gehalt der Milchinhaltsstoffe bestimmt. Milchproben zur Bestimmung des Vitamin B12-Gehalts wurden zu Beginn des Versuchs und kurz vor dem Trockenstellen der Tiere am 220. Versuchstag gezogen. Bei den Milchproben handelte es sich jeweils um Gemelksaliquote. Bei den Tieren, die mit herkömmlichem System gemolken wurden, stand somit pro Tier und Probentag jeweils eine Morgen- und eine Abendprobe zur Verfügung. Von den Tieren im Melkroboter wurde pro Besuch eine Probe entnommen, jedoch mindestens zwei pro Probentag. Maximal eine Stunde nach Abkalbung wurde vom Muttertier eine Kolostralmilchprobe zur Bestimmung der Vitamin B12-Konzentration gewonnen. Die Proben zur Bestimmung der Gehalte an Milchinhaltsstoffen wurden mit Kaliumdichromat (Fa. Merck, 104858) konserviert und bis zur baldigen Analyse (2-3 Tage) im Kühlschrank verwahrt. Die Milch- und Kolostrumproben zur Vitamin B12-Analyse wurden ohne Konservierungsstoffe bei –20°C tiefgefroren.

Material und Methoden

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3.5.4.4 Leberproben

Zur Ermittlung des Kobalt-Gehalts in der Leber wurde am 110. Versuchstag bei jeweils vier nach dem Zufallsprinzip ausgewählten Tieren jeder Gruppe eine Leberbiopsie durchgeführt. Am 200. Versuchstag sowie zur Zeit der Abkalbung wurden weitere Leberbioptate gewonnen. Die Leberbiopsie wurde im Bereich des Leberperkussionsfeldes (rechte Flanke, handbreit ventral der Querfortsätze, vorletzter Intercostalraum) durchgeführt. Nach Vorbereitung des Operationsfeldes (Rasur, Reinigung, Desinfektion und lokale Anästhesie) wurde das Bioptat, wie von SCHOLZ et al. (1988) beschrieben, gewonnen. Allerdings wurde statt eines Trokars das Biopsiegerät Bard Magnum (Firma Bard) mit dazugehöriger Biopsienadel (Bard Magnum Biopsy Needle) mit einem Durchmesser von 2,8 mm und einer Länge von 200 mm verwendet. Das pro Biopsie entnommene Lebergewebe betrug pro Tier etwa 0,7 g. Die Leberproben wurden in einem Kunststoffröhrchen (Fa. Sarstedt, 55.475) bei –20°C bis zur Analyse tiefgefroren.

3.6 Kälberversuch Für die Überprüfung der Vitamin B12-Konzentration im Serum neugeborener Kälber in Abhängigkeit von der Kobalt-Versorgung der Muttertiere, wurden die 20 Kälber der im Fütterungsversuch Teil II verwendeten Milchkühe beprobt. Dazu erfolgte maximal eine Stunde nach der Geburt noch vor Aufnahme der ersten Kolostralmilch sowie am 1., 2. und 5. Lebenstag die Entnahme von venösem Blut aus der Vena Jugularis unter Verwendung einer Luer-Kanüle mit 1,2 mm Durchmesser. Das Probenvolumen betrug 10 ml. Die vollständig geronnene Probe (Röhrchen Fa. Sarstedt, 26.367) wurde mit 3000 U/Min über 10 Minuten bei 15°C zentrifugiert (Varifuge 3.OR). Das auf diese Weise gewonnene Serum wurde in Eppendorf-Cups (Fa. Sarstedt, 72.689) abgefüllt und bei –20°C gelagert.

3.7 Chemische Analysenmethoden

3.7.1 Weender-Rohnährstoffe, ADF, NDF Die Bestimmung der Trockensubstanz und der Rohnährstoffe (Rohprotein, Rohfett, Rohfaser, Rohasche) sowie von ADF und NDF in den Futtermitteln erfolgte im Institut für Tierernährung der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft in Braunschweig nach dem METHODENBUCH III der LUFA Vorschriften 3.1, 4.1.1, 5.1.2, 6.1.4, 6.5.1., 6.5.2. und 8.1 (1997). Die Abweichungen in der Analysenpräzision beliefen sich für ADF auf 0,6%-Punkte und für NDF auf 0,8%-Punkte.

Material und Methoden

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3.7.2 Mengen- und Spurenelemente in den Futtermitteln Zur Bestimmung der Mengen- und Spurenelemente wurde 1 g des Probenmaterials in einem Quarztiegel bei 550° C im Muffelofen verascht, die Asche mit 10 ml 25%iger Salzsäure (Fa. Merck 100316) aufgenommen und im Sandbad eingedampft. Die erneut aufgenommenen Rückstände wurden mit 10 ml verdünnter Salpertersäure (1 Teil HNO3 und 2 Teile H2O) im Sandbad innerhalb von 5 Minuten zum Sieden gebracht, anschließend mit heißem Wasser in einen 100 ml Messkolben überspült und mit 2 ml konzentrierter Salpetersäure (Fa. Merck, 100456) konserviert. Nach dem Abkühlen wurde auf 100 ml aufgefüllt. Die Messung der Mengen- und Spurenelement-Gehalte in den Proben erfolgte mit Hilfe der ICP-Analytik (ICP-MS : VGL Plasmaquad3; ICP-OES : Fa. Spectro) im Institut für Pflanzenernährung und Bodenkunde der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft in Braunschweig. In Tabelle 16 sind die Variationskoeffizienten für die Bestimmung der einzelnen Elemente aufgeführt.

Tabelle 16: Variationskoeffizienten (VK) in der Analysenpräzision der Mengen- und Spurenelemente

Ca P K Na Mg S Fe Mn Zn Cu Co Mo VK (%) 1,78 1,87 3,11 3,59 1,58 2,41 7,15 0,83 4,45 3,48 2,73 5,84

3.7.3 Chrom Zur Messung der Chrom-Konzentration wurde 1g des gefriergetrockneten und gemahlenen Darmsaftes in einen 45 ml Aschetiegel eingewogen und bei 105°C über Nacht getrocknet. Nach Bestimmung des Trockensubstanzgehaltes erfolgte die Veraschung bei 550°C im Muffelofen und die Rückwaage des Aschegehaltes. Zu der veraschten Probe wurden 3 ml Phosphorsäure-Mangansulfatlösung und 4 ml 4,5 %ige Kalium-Bromatlösung zugegeben und zum Sieden gebracht. Nach Abkühlung in Eiswasser wurde die Lösung vollständig in einen 250 ml-Kolben überspült und nach Zugabe von 25 ml Kalziumchloridlösung mit bidestilliertem Wasser auf 250 ml aufgefüllt. Nach Filtration (Filter: Fa. Schleicher & Schuell, Faltenfilter 595 ½, ∅ 270mm, No. 10311652) erfolgte die Chrom-Messung in dieser Lösung mittels Atomabsorptionsspektrometer (GBC 908AA) mit Hilfe einer vorher angefertigten Standardkurve. Auf gleiche Weise fand die Bestimmung des Blindwertes im chromfreien Darmsaft statt. Zur Bestimmung des Chrom-Gehaltes in der eingesetzten Markermischung (Chromkuchen) wurde 1 g chromfreier Darmsaft mit 10 mg feingemörsertem Chromkuchen eingewogen. Der weitere Analysengang erfolgte wie beschrieben. Die Zusammensetzungen der einzelnen Reagenzien ist im Anhang 4 dargestellt. Der Variationskoeffizient der Analysenpräzision belief sich auf 4,76 %.

Material und Methoden

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3.7.4 Flüchtige Fettsäuren im Pansensaft Die flüchtigen Fettsäuren im aufgetauten Pansensaft wurden in Anlehnung an GEISSLER et al. (1976) mittels Gaschromatographie (Hewlett Packard, 5880 A, FID) bestimmt. Die Trennung der Säuren erfolgte auf einer 200 cm langen Glassäule (15% Dioctylsebacinat und Sebacinsäure als stationäre Phase auf 60-100 mesh Kieselgur).

Tabelle 17: Variationskoeffizienten (VK) der Analysenpräzision der flüchtigen Fettsäuren

Essigsäure (C2)

Propionsäure (C3)

Iso-Buttersäure (C4-iso)

Buttersäure(C4)

Iso-Valeriansäure (C5-iso)

Valeriansäure(C5)

VK(%) 2,87 3,26 5,99 2,92 5,36 4,55

3.7.5 Ammoniak-Stickstoff im Pansensaft Die Bestimmung des Gehalts an Ammoniak-Stickstoff im Pansensaft erfolgte nach einer modifizierten Conway-Methode (VOIGT und STEGER, 1967) mit Hilfe einer Mikrodiffusionsapparatur, wobei der Variationskoeffizient 9,98 % betrug. Nach Ermittlung des pH-Wertes wurde der Pansensaft 5 Minuten bei 3000 U/min zentrifugiert (Varifuge 3.OR), 1 ml des Überstands in die Becher des Mikrodiffusionsgefäßes pipettiert und im Anschluss mit 1 ml gesättigter Kaliumkarbonat-Lösung vorsichtig unterschichtet. Der Kolben wurde mit 4 ml Borsäure (Zusammensetzung siehe Anhang 3) beschickt. Während der Ansatz bei Raumtemperatur über 24 Stunden im Dunkeln stand, konnte der in der Pansensaftprobe enthaltene Ammoniak-Stickstoff durch die Kaliumkarbonatlösung ausgetrieben und in der Borsäure eingefangen werden. Die anschließende Titration der Borsäurevorlage erfolgte mit 0,01 n HCl. Die Berechnung des Ammoniak-N-Gehalts im Pansensaft erfolgte nach folgender Formel:

mg NH3-N / 100 ml = ( ml 0,01 n HCl (titriert) – Blindwert ) * 14

Die Ermittlung des Blindwertes wurde in einem Ansatz ohne Probe durchgeführt.

3.7.6 Mikrobielles Rohprotein Die Bestimmung des mikrobiellen Rohproteins in den gefriergetrockneten Darmsaftproben erfolgte mittels NIRS nach der von LEBZIEN und PAUL (1997) beschriebenen Methode (VK = 4,83%). Dazu wurden Aliquote der einzelnen Tagessammelproben von jedem Tier pro Versuchsperiode anhand des täglichen Trockensubstanz-Flusses zu einer Wochensammelprobe zusammengefasst. In Anlehnung an SCHAFFT (1983) erfolgte die Berechnung der fermentierbaren organischen Substanz nach folgender Formel:

Material und Methoden

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FOS = OS-Aufnahme – (OS am Duodenum – Mikroben-OS)

Dabei gilt: Mikroben-OS = 11,8 * Mikroben-N. Die Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese (g Mikrobenprotein / kg FOS) errechnete sich ebenfalls in Anlehnung an SCHAFFT (1983).

3.7.7 Kobalt-Gehalt im Darmsaft Zur Bestimmung von Kobalt im Darmsaft siehe Kapitel 3.7.2. Der Variationskoeffizient betrug hierbei 4,64 %.

3.7.8 Vitamin B12 im Darmsaft Der Vitamin B12-Gehalt im Darmsaft wurde sowohl in der Frischsubstanz als auch im getrockneten Darmsaft ermittelt. Die Analyse in der Frischsubstanz erfolgte im VetMed-Labor in Ludwigsburg mit Hilfe eines Radioimmuno-Assays (SimulTRAC-SNB Radioassay Kit Vitamin B12). Bei diesem Testverfahren handelt es sich um einen kompetitiven Proteinbindungsassay, wobei nicht markiertes Vitamin B12 aus der zu untersuchenden Probe mit radioaktiv markiertem Vitamin B12 um eine begrenzte Anzahl von Bindungsstellen an Vitamin B12-Antikörpern konkurriert. Die Antikörper sind kovalent an einen festen Träger gebunden und das markierte Vitamin B12 enthält radioaktives 57Co. Die im Präzipitat gemessene Radioaktivität ist umgekehrt proportional zur Konzentration an Vitamin B12 in der Probe. Die Bestimmung des Vitamin B12-Gehalts im getrockneten Darmsaft wurde mittels Enzymimmunoassay (Firma r-biopharm, RIDASCREEN® Vitamin B12, No. R2101) im Institut für Tierernährung und im Institut für Pflanzenbau und Grünlandwirtschaft der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft durchgeführt. Dieser ursprünglich für Lebens- und Futtermittel entwickelte Test konnte für die Vitamin B12-Messung im gefriergetrockneten Darmsaft modifiziert werden. Das Testprinzip beruht ebenfalls auf einer Antigen-Antikörper-Reaktion. Im Gegensatz zu der vorhergehend beschriebenen Methode konkurriert hier enzymmarkiertes Vitamin B12 mit dem in der Probe vorhandenen Vitamin B12. Nach Zugabe von Substrat, Chromogen und Stopp-Reagenz entsteht aus dem farblosen Chromogen eine gelbe Lösung, in der anschließend bei 450 nm Wellenlänge die Extinktion bestimmt wird. Die Extinktion der Lösung ist umgekehrt proportional zur Vitamin B12-Konzentration der Probe. Bei Verwendung des Radioimmuno-Assays betrug der Variationskoeffizient 8,21 %, beim Enzymimmuno-Assay 3,56 %.

Material und Methoden

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3.7.9 Blutparameter Die Blutparameter wurden alle im Klinischen Labor der Klinik für Rinderkrankheiten der Tierärztlichen Hochschule Hannover bestimmt.

3.7.9.1 Vitamin B12 und Folsäure

Für die quantitative Bestimmung von Vitamin B12 im Serum wurde das automatische Chemilumineszenzsystem ACS 180® der Firma Bayer verwendet. Es handelt sich hierbei um einen kompetitiven Assay. Dabei konkurriert das in der Serumprobe befindliche Vitamin B12 mit markiertem Vitamin B12 um eine begrenzte Menge an Intrinsic Factor, der an eine feste Phase gebunden ist. Damit auch an Bindungsproteine im Serum gebundenes Vitamin B12 erfasst werden kann, wird bei dem Test das gebundene Vitamin freigesetzt und eine erneute Bindung an Proteine verhindert. Zwischen dem in der Probe enthaltenen Vitamin B12 und den vom System gemessenen relativen Lichteinheiten (RLU) besteht ein umgekehrt proportionales Verhältnis. Der Variationskoeffizient für die Vitamin B12-Bestimmung betrug 4,45 %. Die Folsäure-Konzentrationen im Serum wurden nach dem gleichen Prinzip am gleichen Gerät gemessen. Der Variationskoeffizient betrug hierbei 5,05 %.

3.7.9.2 Glukose, Gesamtbilirubin, Harnstoff, ß-Hydroxy-Buttersäure, AST, GLDH und γ-GT

Für die Bestimmung dieser Parameter wurden kommerzielle Test-Kits angewandt, wobei es sich in allen Fällen um enzymatische bzw. kinetische UV-Tests handelte (Tabelle 18 ). Die genaue Testbezeichnung und das jeweilige Testprinzip sind Anhang 5 zu entnehmen.

Tabelle 18: Übersicht über die verwendeten Testverfahren mit Variationskoeffizienten der Präzision

Parameter Test-Prinzip Einheit VK (%) Glukose enzymatisch mmol/l 3,27 Harnstoff enzymatischer mmol/l 2,83 ß-Hydroxybuttersäure kinetisch-enzymatisch mmol/l 8,65 Gesamtbilirubin kinetisch-enzymatisch µmol/l 4,22 AST kinetisch U/l 2,07 GLDH kinetisch U/l 3,51 γ-GT kinetisch U/l 3,95

Material und Methoden

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3.7.9.3 Eisen

Die Bestimmung des Eisengehaltes in den Blutproben erfolgte mittels Atomabsorptionsspektrometrie, wobei der Variationskoeffizient 9,74% betrug.

3.7.10 Milchinhaltsstoffe In den in beiden Versuchen gewonnenen Milchproben wurden im Milchlabor des Instituts für Tierernährung der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft Milchfett, Milcheiweiß sowie Laktose bestimmt. Die Messungen erfolgten mit Hilfe eines MILCOSCAN®-4000 der Firma Foss Electric. Dabei wurde durch die Milchprobe ein Infrarot-Strahl mit einer Wellenlänge von λ=573 µm geleitet. Durch Absorption des Lichtes an den Milchinhaltsstoffen wird der Lichtstrahl abgeschwächt und dieses im Vergleich zu einem Referenzstrahl gleicher Wellenlänge in einer Photozelle gemessen (KOTTERER und MÜNCH, 1985).

3.7.11 Vitamin B12 in der Milch Die Bestimmung der Vitamin B12-Konzentrationen in der Milch und im Kolostrum erfolgte im Veterinärmedizinischen Labor (VetMed®) in Ludwigsburg. Hierzu wurde der gleiche Radioimmunoassay verwendet, wie bei der Bestimmung von Vitamin B12 im Darmsaft (Kap. 3.7.8). Der Variationskoeffizient betrug hierbei 7,94%.

3.7.12 Kobalt im Lebergewebe Das bei der Leberbiopsie gewonnene Lebergewebe wurde nach dem Einwiegen einem Vollaufschluss mit 2 ml 65 %iger Salpetersäure (Fa. Merck, 100441) und 1 ml 30%igem Wasserstoffperoxid (Fa. Merck, 107298) in einem Mikrowellengerät (Typ 1200 Mega der Firma MLS) unterzogen. Die so entstandene Lösung wurde mit Reinstwasser auf ein definiertes Volumen (10 ml) aufgefüllt. Die Messung von Kobalt in der Lösung erfolgte anschließend mit einem ICP-OES-Spektrometer der Firma Spectro Analytical Instruments bei einer Wellenlänge von 228,6 nm, wobei sich der Variationskoeffizient auf 3,55% belief.

3.7.12.1 Vitamin B12 im Lebergewebe

Aus der mittels ICP-Analytik bestimmten Kobalt-Konzentration im Lebergewebe lässt sich nach folgender Formel die Vitamin B12-Konzentration im Lebergewebe berechnen (MITSIOULIS et al., 1995). Die Grundlage der Formel stellen Untersuchungen an über 9000

Material und Methoden

64

Lebern von Schlachtrindern dar, wobei ein hochsignifikanter Zusammenhang zwischen Kobalt und Vitamin B12 im Lebergewebe festgestellt wurde (r2=0,42; p<0,001).

Leber B12 in FS (nmol/kg) = 163 * Leber-Co (µmol/kg T) –109 oder

Leber B12 in FS (ng/kg) = [163 * Leber-Co (µmol/kg T) -109] * 1355

Da bei der angewendeten Methode die Kobalt-Konzentration nicht in der Trockensubstanz bestimmt wird, muss zur Umrechnung bei einem mittleren Trockensubstanzgehalt der Rinderleber von 30 % (MITSIOULIS et al., 1995) die Formel wie folgt verändert werden:

Leber B12 in FS (ng/kg) = [163 * Leber-Co (µmol/kg FS) * 3,33 –109] * 1355

3.8 Statistische Auswertung Aus den ermittelten Einzelwerten sind jeweils die arithmetischen Mittelwerte der einzelnen Parameter und die dazugehörigen Standardabweichungen errechnet worden. Die Gruppenmittelwerte sind ausreißerkorrigiert, wobei der Test unter Zuhilfenahme bestimmter Testgrößen für die jeweilige Gruppengröße mit speziellen Signifikanzgrenzen erfolgte (DIXON, 1953). Für die computergestützte mathematisch-statistische Auswertung stand das Statistikprogramm SAS ® (Statistical Analysis System), Version 6.12, für WINDOWS ® zur Verfügung. Dabei wurden Mittelwertvergleiche zwischen den unterschiedlichen Gruppen unter Anwendung des TUKEY-Tests durchgeführt. In allen Versuchen wurde als Signifikanzniveau in den Berechnungen eine Irrtumswahrscheinlichkeit von maximal 5 % (p<0,05) angenommen.

Ergebnisse und Diskussion

65

4 ERGEBNISSE UND DISKUSSION

4.1 Versuch an fistulierten Milchkühen

4.1.1 Versuchsablauf, Rohnährstoffgehalte der Futtermittel, Futter-aufnahme und Milchleistung

Während der 42 Versuchstage traten keine den Versuchsablauf beeinträchtigenden Störungen der Tiergesundheit oder sonstige Zwischenfälle auf. Lediglich Romke zeigte in der Woche vor der ersten Darmsaftsammelperiode eine leichte Mastitis catarrhalis im hinteren linken Euterviertel, die erfolgreich durch intramammäre Behandlung mit Cefoperazon (Peracef®) behandelt wurde. Eine Beeinflussung der zu untersuchenden Parameter konnte ausgeschlossen werden. Die Analysenwerte der verwendeten Futtermittel sind in Tabelle 19 aufgeführt. Rationsgestaltung und Zusammensetzung der eingesetzten Kraftfuttermischungen sind in Kapitel 3.2 (Tabelle 11) dargelegt.

Tabelle 19: WEENDER-Rohnährstoff- und ADF/NDF-Gehalte der im Fistelkuhversuch eingesetzten Futtermittel

T OS XA XP XL XF XX NDF ADF (%) in % der Trockensubstanz

Grassilage 1. Durchgang 63,5 89,2 10,8 20,9 3,8 28,4 36,1 53,2 27,4

Grassilage 2. Durchgang 60,0 89,1 10,9 21,2 3,8 29,0 35,1 52,6 27,7

Kraftfutter I 88,1 83,4 16,6 22,1 1,4 8,3 51,6 19,9 8,8

Kraftfutter III 88,3 82,8 17,2 21,2 1,2 7,8 52,6 20,1 8,2

Kraftfutter IV 1. Durchgang 88,6 94,2 5,8 24,0 2,4 8,7 59,1 21,0 9,6

Kraftfutter IV 2. Durchgang 88,1 94,1 5,9 23,1 1,6 8,6 60,8 21,5 10,0

Die eingesetzte Grassilage mit Kleeanteil stammte vom 2. Schnitt. Sie wies im Mittel beider Versuchsperioden mit 62 % einen sehr hohen Trockensubstanzgehalt auf. Neben dem Rohproteingehalt von im Mittel 21 % in der Trockensubstanz war der Gehalt an Rohfaser in der Trockensubstanz mit im Mittel 29 % vergleichsweise hoch. Der Rohfettgehalt lag mit 3,8 % in der Trockensubstanz in dem für Grassilage üblichen Bereich.

Sowohl während der Vorfütterungsperioden als auch in den beiden Darmsaftsammelwochen nahmen alle Tiere die vorgelegte Ration vollständig auf. Die mittleren täglichen

Ergebnisse und Diskussion

66

Trockensubstanz- und Rohnährstoffaufnahmen während der beiden Darmsaftsammelwochen sind in Tabelle 20 dargestellt.

Tabelle 20: Mittlere tägliche Trockensubstanz- und Rohnährstoffaufnahme der Milchkühe während der Darmsaftsammelwochen (MW ± SD; n=10)

Die mittleren täglichen Trockensubstanz- und Rohnährstoffaufnahmen der Tiere waren in beiden Versuchdurchgängen gleich. Zwischen den beiden Kobalt-Versorgungsstufen konnten geringfügige Unterschiede in der täglichen OS-Aufnahme beobachtet werden (12,2 kg vs. 12,1 kg). Aus den analysierten Rohnährstoffgehalten, den Verdaulichkeiten aus der DLG-Futterwerttabelle (1997) und den Formeln der GfE (2001) wurde die mit der Ration aufgenommene Nettoenergie (NEL), die umsetzbare Energie (ME), das nutzbare Rohprotein (nXP) und die ruminale Stickstoffbilanz (RNB) ermittelt (Tabelle 21).

Tabelle 21: Energiegehalt der Ration, Energie- und nXP-Aufnahme sowie ruminale N-Bilanz (RNB) pro Tier und Tag

Energiegehalt (MJ ME/kg T bzw. MJ NEL/kg T) 10,6 bzw. 6,4 Energieaufnahme (MJ NEL/Tag) 87

nXP-Aufnahme (g/Tag) 2078 RNB (g/Tag) 134

Aus den in Tabelle 22 aufgeführten Milchmengen und Gehalten an Milchinhaltsstoffen errechnete sich (Mittel der fünf Tiere) der tägliche Bedarf der Tiere an Nettoenergie und nutzbarem Rohprotein auf 99 MJ NEL bzw. auf 1945 g nutzbares Rohprotein. Hieraus wird ersichtlich, dass die Tiere im Mittel energetisch um 12 MJ unterversorgt waren. Da jedoch alle Versuchstiere die gleiche tägliche Futtermenge aufnehmen sollten, musste die Trockensubstanzvorlage nach dem „aufnahmeschwächsten“ Tier ausgerichtet werden. Hierdurch konnte nicht bei allen Tieren der Energiebedarf vollständig gedeckt werden.

kg/Tag T 13,5 ± 0,0

OS 12,2 ± 0,0 XP 2,9 ± 0,0 XL 0,4 ± 0,0 XF 3,2 ± 0,0 XX 5,7 ± 0,2

Ergebnisse und Diskussion

67

Tabelle 22: Milchleistung und Gehalt an Milchinhaltsstoffen (n=5; MW ± SD)

1)FCM = fat corrected milk = ( Fett % x 0,15 + 0,4) x Milchmenge (kg)

Dagegen war die Versorgung mit nutzbarem Rohprotein bei allen Tieren gedeckt. Bei den „aufnahmeschwächeren“ Tieren lag sogar eine leichte Proteinüberversorgung vor, was auf die hohen Rohprotein-Gehalte der Grassilage zurückzuführen war. Die ruminale Stickstoffbilanz (RNB), die ein Maß für die Stickstoffversorgung der Pansenmikroben ist, belief sich auf +134 g RNB/Tag. Grundsätzlich sollte bei der Rationsgestaltung darauf geachtet werden, dass die RNB durch Kombination von Futtermitteln mit positiver und negativer RNB ausgeglichen ist. Während Werte von bis zu + 50 g RNB/Tag von den Kühen problemlos vertragen werden und bis + 100 g RNB/Tag noch tolerierbar sind, sollte bei Werten von > 100 g RNB/Tag die Zusammensetzung der Ration geändert werden (GfE, 2001). Die hohe RNB resultiert aus dem hohen Rohproteingehalt der Grassilage. Da diese Bedingungen aber beide Versuchsgruppen gleichermaßen betrafen, bleiben die Versuchbedingungen dennoch vergleichbar.

4.1.2 Mineralstoff-Aufnahme

4.1.2.1 Kobalt

In Tabelle 23 sind Kobalt-Gehalte der verwendeten Futtermittel aufgeführt.

Tabelle 23: Kobalt-Gehalte der im Versuch mit fistulierten Kühen eingesetzten Futtermittel (mg Co/kg T)

Futtermittel Co-Gehalt (mg Co/kg T) Grassilage 0,09

Kraftfutter I 0,62 Kraftfutter III 2,56

Kraftfutter IV( 1. Mischung) 0,31 Kraftfutter IV (2. Mischung) 0,30

Tabelle 24 gibt eine Übersicht über die täglichen Kobalt-Aufnahmen pro Tier.

Tabelle 24: Kobalt-Aufnahmen pro Tier und Tag in mg/Tag sowie mg/kg T

Kontrollgruppe Co-suppl. mg/Tag mg/kg T mg/Tag mg/kg T

2,27 0,17 3,97 0,29

1. Versuchsperiode 2. Versuchsperiode Milchmenge (kg) 17,3 ± 2,7 16,3 ± 3,4 Fett (%) 4,88 ± 0,79 4,89 ± 0,79 Protein (%) 3,61 ± 0,23 3,61 ± 0,24 Laktose (%) 4,94 ± 0,05 4,92 ± 0,02 FCM (kg)1) 19,6 ± 3,7 18,6 ± 5,1

Ergebnisse und Diskussion

68

Wegen der relativ hohen Kobalt-Gehalte im Grundfutter lag die Versorgung in der Kontrollgruppe mit 0,17 mg Co/kg T um 0,7 mg höher, als angestrebt war (Kap. 3.3.1, Tabelle 12). Dagegen zeigte der Kobalt-Gehalt in der mit Kobalt supplementierten Gruppe mit 0,29 mg Co/kg T eine gute Übereinstimmung mit dem angestrebten Wert (0,30 mg/kg T).

4.1.2.2 Weitere Mineralstoffe

Aus den Mengen- und Spurenelement-Gehalten der verwendeten Futtermittel (Anhang 13) und der täglichen Futteraufnahme (Tabelle 20) sind die täglichen Aufnahmen der jeweiligen Elemente und deren Gehalte in der Ration errechnet worden (Tabelle 25).

Tabelle 25: Mittlere Mengen- und Spurenelement-Aufnahmen pro Tier und Tag sowie die Mengen- und Spurenelement-Gehalte der Ration im Fistelkuhversuch

tägliche Aufnahme Gehalt der Ration g/Tier und Tag g/kg Futter-T

Calcium 107 7,93 Phosphor 82,6 6,12 Kalium 323 23,9 Natrium 36,2 2,68

Magnesium 32,6 2,42 Schwefel 14,5 1,07

mg/Tier und Tag mg/kg Futter-T

Eisen 4300 319 Mangan 1850 137

Zink 1890 140 Kupfer 300 22

Molybdän 24,9 1,84 Beim Vergleich der Werte mit den Empfehlungen für die Versorgung mit Mengenelementen (GfE , 2001; Tabelle 26) ist ersichtlich, dass die Tiere ausreichend mit diesen Elementen versorgt waren.

Tabelle 26: Empfehlung für die Versorgung von Milchkühen mit Mengenelementen (g/Tag) bei einer Milchleistung von 15 und 20 kg/Tag ( nach GfE, 2001)

Milch (kg/Tag) Calcium Phosphor Kalium Natrium Magnesium

15 66 42 147 18 22 20 82 51 164 21 25

Gleiche Aussage trifft auch für die Spurenelemente zu, deren Versorgungsempfehlungen Tabelle 27 zu entnehmen sind.

Ergebnisse und Diskussion

69

Tabelle 27: Empfehlungen zur Versorgung von Milchkühen mit Spurenelementen (mg/kg Futter-T) (nach GfE, 2001)

Eisen Mangan Zink Kupfer Molybdän 50 50 50 10 0,1

Bei allen untersuchten Elementen übersteigt die tägliche Aufnahme-Menge die Empfehlungen zum Teil recht deutlich, wobei die maximal tolerierbare Konzentration (Tabelle 28) bei keinem Element überschritten wird. Für den vorliegenden Versuch war es wichtig, eine Kupfer-Intoxikation sicher ausschließen zu können, da die Symptome einer Kupfer-Intoxikation denen eines Kobalt-Mangels sehr ähnlich sind.

Tabelle 28: Maximal tolerierbare Spurenelement-Konzentrationen in der Tagesration (mg/kg Futter-T) bei Milchkühen (NRC, 1980; PULS, 1988)

Eisen Mangan Zink Kupfer Molybdän 1000 1000 500 100 10

Da es bei relativ hohen Mengen- und Spurenelement-Aufnahmen zu zum Teil erheblichen Interaktionen einzelner Elemente kommt, sollen einige relevante Werte näher betrachtet werden. Hierbei ist zum einen der relativ hohe Eisen-Gehalt in der Ration zu nennen, der vermutlich auf einer Verunreinigung der Grassilage mit Erdreich beruht (SPIEKERS et al., 1991). Obwohl die als Höchstgehalt in der Ration empfohlene Menge von 500 mg/kg Futter T (SCHENKEL und FLACHOWSKY, 1998) nicht erreicht wird, kann eine Beeinflussung der Kupfer-Versorgung nicht vollständig ausgeschlossen werden, da beide Elemente antagonistisch wirken. Ein Kupfer-Mangel ist aber nicht zu vermuten, da das kritische Eisen:Kupfer-Verhältnis (UNDERWOOD und SUTTLE, 1999) von 50:1 in der vorliegenden Ration (14,5:1) nicht überschritten wird. Gleiches gilt auch für die Interaktion von Eisen und Kobalt. Nach REUBER et al. (1994) ist erst bei Eisen-Gehalten von über 400 mg/kg Futter-T eine Interaktion beider Elemente bei der Absorption zu beobachten. Ein weiteres Beispiel für die gegenseitige Beeinflussung von Mengen- und Spurenelementen stellt der gesteigerte Kupferbedarf bei höheren Gehalten an Schwefel und Molybdän dar (SUTTLE, 1991). In Rationen mit mehr als 2 g S/kg T sollte das Verhältnis von Kupfer zu Molybdän nicht niedriger als 3:1 sein (UNDERWOOD und SUTTLE, 1999). Da in der gefütterten Ration zum einen nur 1,07 g S/kg T enthalten ist und zum anderen das Kupfer-Molybdän-Verhältnis mit 12:1 deutlich über dem kritischen Bereich liegt, ist eine solche Interaktion ebenfalls auszuschließen. Aus den vorliegenden Mengen- und Spurenelement-Gehalten und -Verhältnissen ist demnach keine den Versuchsablauf beeinträchtigende Interaktion zu erwarten.

Ergebnisse und Diskussion

70

4.1.3 Pansenphysiologische Untersuchungen

4.1.3.1 pH-Werte

In Abbildung 15 ist der zeitliche Verlauf des pH-Wertes im Pansensaft der Kühe gemittelt für die beiden Gruppen über die ersten 300 Minuten nach Beginn der Morgenfütterung dargestellt. Die Abbildung 15 zugrunde liegenden Daten sind im Anhang 6 aufgeführt.

5,60

5,80

6,00

6,20

6,40

6,60

6,80

7,00

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300

Minuten nach Beginn der Fütterung

pH-W

ert

Kontrolle (0,17 mg Co/kg T)

Co-suppl. (0,29 m Co/kg T)

Abbildung 15: Mittlerer pH-Wert-Verlauf im Pansensaft von Milchkühen ohne und mit Co-Zulage während der ersten 300 Minuten nach Beginn der Morgenfütterung (MW ± SD; n=5)

In der Gruppe ohne Kobalt-Zulage war der pH-Wert geringgradig höher als bei den mit Kobalt supplementierten Tieren. Zu keinem Zeitpunkt der Probennahme konnten jedoch Signifikanzen in Bezug auf den pH-Wert festgestellt werden. Alle gemessenen Werte bewegten sich im physiologischen Bereich (KAUFMANN, 1972).

4.1.3.2 Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren

Im Mittel von drei aufeinanderfolgenden Tagen konnte drei Stunden nach Beginn der Morgenfütterung weder zwischen den beiden Gruppen noch zwischen den beiden Versuchsperioden ein signifikanter Unterschied in der Gesamtkonzentration an flüchtigen Fettsäuren im Pansensaft beobachtet werden. In der mit Kobalt supplementierten Gruppe war die Konzentration allerdings tendenziell niedriger als in der Kontrollgruppe (110 ± 12 vs. 120 ± 10 mmol/l). Die molaren Anteile der Fettsäuren waren in beiden Gruppen gleich (Tabelle 29).

Ergebnisse und Diskussion

71

Tabelle 29: Gesamtkonzentration an flüchtigen Fettsäuren sowie molare Anteile der einzelnen Fettsäuren im Pansensaft der Milchkühe drei Stunden nach Beginn der Morgenfütterung (MW ± SD; n=5)

Kontrolle Co-Gruppe

Gesamtkonzentration an flüchtigen Fettsäuren (mmol/l) 120 ± 10 110 ± 12

Flüchtige Fettsäuren (molare Anteile %) Essigsäure (C2) 65,9 ± 0,3 65,8 ± 0,5

Propionsäure (C3) 17,4 ± 0,7 17,4 ± 1,0 Iso-Buttersäure (C4iso) 0,7 ± 0,2 0,8 ± 0,2

Buttersäure (C4) 12,9 ± 0,4 12,9 ± 0,3 Iso-Valeriansäure (C5iso) 1,4 ± 0,5 1,4 ± 0,4

Valeriansäure (C5) 1,7 ± 0,2 1,7 ± 0,1 C2:C3-Verhältnis 3,79 ± 0,18 3,78 ± 0,24

4.1.3.3 NH3-N-Konzentrationen

Durch den mikrobiellen Abbau der mit der Nahrung aufgenommenen Proteine und Verbindungen, die zu den Nicht-Protein-Stickstoff-Verbindungen (NPN) zählen (z.B. Harnstoff), entsteht im Pansen Ammoniak. Neben der aufgenommenen Menge an Proteinen und NPN-Verbindungen ist die Ammoniak-Konzentration im Pansensaft von der Intensität des mikrobiellen Proteinabbaus und damit der Ammoniakproduktion, der Verwertung für die mikrobielle Proteinsynthese, der Absorption sowie dem Fluss im weiterführenden Verdauungskanal abhängig. In Abbildung 16 ist die NH3-N-Konzentration in Abhängigkeit zum Zeitpunkt der Fütterung sowie der Kobalt-Versorgung dargestellt.

0

50

100

150

200

250

300

350

0 30 60 90 120 150 180 210 240 270 300Minuten nach Beginn der Fütterung

mg

NH

3N/l

Pans

ensa

ft

Kontrolle (0,17 mg Co/kg T)Co-suppl. (0,29 mg Co/k T)

Abbildung 16: NH3-N-Konzentrationen im Pansensaft der Milchkühe mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung in den ersten 300 Minuten nach Fütterung (MW ± SD; n=5)

Ergebnisse und Diskussion

72

In beiden Gruppen stellt sich der Verlauf der Konzentrationen in den ersten 5 Stunden nach Beginn der Morgenfütterung gleich dar, wobei die Maximalkonzentrationen etwa zwei Stunden nach Fütterungsbeginn erreicht wurden. Die Tiere in der Kontrollgruppe zeigten an allen Messzeitpunkten geringfügig niedrigere NH3-N-Konzentrationen als die mit Kobalt supplementierten Tiere. Die Unterschiede waren jedoch statistisch nicht abzusichern. Während des gesamten untersuchten Zeitraums (5 Stunden nach Fütterungsbeginn) lagen die ermittelten Konzentrationen über der für die mikrobielle Proteinsynthese angegeben Minimalkonzentration von 50 mg NH3-N/l Pansensaft (SATTER und ROFFLER, 1975; SLYTER et al., 1979). Trotz der hohen RNB wurden zu keiner Zeit des Versuches Konzentrationen mit toxischer Wirkung gemessen (> 60 mmol/l ≈ 1000 mg NH3-N/l ; JUHÁSZ, 1970).

4.1.3.4 Bewertung der pansenphysiologischen Parameter

Auf Grund der erhobenen pansenphysiologischen Parameter wie pH-Wert sowie Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren und Ammoniak (Kap. 4.1.3.1 bis 4.1.3.3.), die sich alle im physiologischen Bereich bewegt haben, kann davon ausgegangen werden, dass bei den Tieren im Versuchszeitraum ein ungestörtes Pansenmilieu vorgelegen hat. Es wurde auch kein Einfluss durch Kobalt-Zulage auf die untersuchten Parameter beobachtet. Zu teilweise gleicher Aussage kamen bereits MARSTON et al. (1972), die bei fistulierten Schafen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung keinen Zusammenhang zwischen der Kobalt-Versorgung und der Konzentration an flüchtigen Fettsäuren im Pansensaft ermitteln konnten. Dies wird durch Ergebnisse eines in-vitro-Versuchs bestätigt (KISIDAYOVA et al., 2001), wo ebenfalls kein Einfluss von Kobalt auf die Gesamtkonzentration der flüchtigen Fettsäuren und deren Verhältnis zueinander beobachtet wurde.

4.1.4 Fluss an Trockensubstanz und organischer Substanz In Tabelle 30 ist der am proximalen Duodenum gemessene mittlere Fluss an Trockensubstanz und organischer Substanz der Versuchstiere aufgeführt. Aus Anhang 8 sind die für jeden Tag und jedes Tier ermittelten Trockensubstanzflüsse (Fluss = pro Zeiteinheit in den Darm gelangte Menge an Trockensubstanz bzw. Nährstoffen) zu entnehmen.

Ergebnisse und Diskussion

73

Tabelle 30: Mittlerer Fluss an Trockensubstanz und organischer Substanz am proximalen Duodenum von fistulierten Milchkühen (n=5) bei Fütterung von Rationen mit unterschiedlichem Kobalt-Gehalt (MW ± SD)

Kontrolle Co-suppl. Fluss in g/Tag

T 7592 ± 777 7527 ± 622 OS 5692 ± 549 5679 ± 434

Fluss in % der Aufnahme T 56,1 ± 5,7 55,6 ± 4,6

OS 46,7 ± 4,9 46,8 ± 3,6

Für den Fluss an Trockensubstanz und organischer Substanz konnte zwischen beiden Gruppen eine gute Übereinstimmung beobachtet werden. Der Trockensubstanzfluss lag im Mittel der fünf Tiere bei 7,6 bzw. 7,5 kg pro Tag, dies entspricht etwa 56% der Trockensubstanzaufnahme. Für auf Grassilage basierenden Rationen ermittelten LEBZIEN und ENGLING (1995) Trockensubstanzflüsse am proximalen Duodenum von 63,4% bis 74,6% der Trockensubstanzaufnahme. Im Vergleich hierzu liegen die im vorliegenden Versuch ermittelten Trockensubstanzflüsse vergleichsweise niedrig, was für eine leichterfermentierbare Ration oder eine längere Verweildauer der Nahrung im Pansen (stärkerer Abbau der Nährstoffe) spricht. Die ermittelten Flussmengen für die organische Substanz in Relation zur Aufnahme waren ebenfalls niedriger, als die von LEBZIEN und ENGLING (1995) ermittelten Werte von 55,6% bis 63,4%. Die aus den in Tabelle 30 aufgeführten Werten für den Fluss in % der Aufnahme errechnete „ruminale Verdaulichkeit“ betrug im Mittel beider Gruppen 53,3% für die organische Substanz. Die für den Trockensubstanz- und OS-Fluss am Duodenum ermittelten Übereinstimmungen zwischen den Versuchsgruppen bestätigen Ergebnisse von SMITH und MARSTON (1970b), LOONEY et al. (1976) sowie KESSLER und ARRIGO (1996), die in Verdauungsversuchen an Schafen keinen Einfluss der Kobalt-Versorgung auf die Verdaulichkeit von Trockensubstanz, Rohnährstoffen sowie ADF und NDF feststellen konnten. Auch HUSSEIN et al. (1994) konnten in einer in-vitro-Versuchsreihe mit unterschiedlichen Kobalt-Gehalten (0, 5 und 10 mg Co/l Pansensaft) keine Unterschiede in der Verdaulichkeit von organischer Substanz und NDF ermitteln. DURAND und KAWASHIMA (1980) beobachteten hingegen, dass die von den Pansenmikroben benötigte Kobalt-Konzentration im Pansensaft für eine optimale ruminale Verdaulichkeit der Trockensubstanz bei rohfaserreicher Ration niedriger ist als bei kraftfutterreicher Ration, wobei sie hierfür unterschiedliche Bakterienpopulationen bei unterschiedlicher Rationsgestaltung verantwortlich machten.

Ergebnisse und Diskussion

74

4.1.5 Stickstofffluss am Duodenum In Tabelle 31 finden sich Angaben über die Stickstoffaufnahme und den Stickstofffluss am Duodenum im Mittel für die beiden Versuchsgruppen.

Tabelle 31: Stickstoffaufnahme und Stickstofffluss am Duodenum bei Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=5; MW ± SD)

Kontrollgruppe Co-suppl. N-Aufnahme (g/d ) 467,6 ± 0,6 466,3 ± 0,7 N am Duodenum (g/d) 362,6 ± 48,2 348,0 ± 35,4 N am Duodenum (% der Aufnahme) 77,5 ± 10,4 74,8 ± 7,6

In beiden Versuchsgruppen wurde unabhängig von der Kobalt-Versorgung am proximalen Duodenum weniger Stickstoff gefunden als die Tiere mit der Ration aufgenommen hatten. Die „ruminale Verdaulichkeit“ des Rohproteins betrug im Mittel beider Gruppen 23,9 % (errechnet sich aus Tabelle 31), was deutlich über Literaturwerten liegt, wo oftmals mehr Stickstoff am Darm gemessen wird (SCHAFFT, 1983; ENGLING, 1988 und KRASTANOVA, 1993) als mit der Ration aufgenommen wurde. Neben rezyklisiertem Stickstoff, der für die mikrobielle Proteinsynthese herangezogen wird, ist darin auch endogener Stickstoff enthalten. Der in Relation zur Aufnahme geringe Rohprotein-Fluss am Duodenum dürfte vor allem auf der hohen Zufuhr an abbaubarem Rohprotein relativ zur Aufnahme an pansenverfügbarer Energie beruhen, wodurch die hohe Menge an Stickstoff, die aus abgebautem Rohprotein freigesetzt wird, nur unvollständig zur mikrobiellen Proteinsynthese verwendet werden kann.

4.1.6 Mikrobielle Proteinsynthese im Pansen In Tabelle 32 sind Angaben über den Umfang und die Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese sowie die Mengen an endogenem Stickstoff und nutzbarem Rohprotein zu finden. Dies wurde untersucht, da ein Einfluss von Vitamin B12 (Wachstumsfaktor für Bakterien; STÁRKA, 1968) auf die mikrobielle Protein-Synthese vermutet wird. In beiden Gruppen belief sich jedoch der am proximalen Duodenum ermittelte Anteil des Mikroben-Stickstoffs (MN) am Nicht-Ammoniak-Stickstoff (NAN) auf 67,5%. Dieser Wert liegt nur geringfügig unter dem von LEBZIEN und PAUL (1997) bestimmten Mittelwert (n=158) für den Anteil an Mikroben-Stickstoff am Nicht-Ammoniak-Stickstoff von 69,3% (Spanne von 50,3 - 82,3%).

Ergebnisse und Diskussion

75

Tabelle 32: Anteil des mikrobiellen Stickstoffs (MN) am Nicht-Ammoniak-Stickstoff (NAN) sowie Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese (n=5; MW ± SD)

Kontrollgruppe Co-suppl. MN (% des NAN) 67,5 ± 5,9 67,5 ± 5,2

MN (g/d) 234 ± 45 224 ± 38 FOS (kg/d)1) 9,25 ± 0,09 9,10 ± 0,19

FOS in % der OS-Aufnahme 75,9 ± 0,8 75,0 ± 1,6 MN / FOS (g/kg) 25,2 ± 4,9 24,6 ± 4,1

Mikroben-Protein / FOS (g/kg) 158 ± 31 154 ± 26 MN / ME (g/MJ)2) 1,63 ± 0,31 1,56 ± 0,26

Endogener N (g/d)3) 27,3 ± 2,8 27,1 ± 2,2 nXP (g/d)4) 2239 ± 301 2148 ± 219

1) FOS (in den Vormägen fermentierte OS) = OS-Aufnahme – (OS am Duodenum – Mikroben OS) Mikroben OS = 11,8 * Mikroben-N 2) ME (MJ/kg T) ist Tabelle 21 zu entnehmen 3) Endogener N = 3,6 g/kg T am Duodenum 4) nXP = XP am Duodenum – endogenes XP Ein Maß für die Bewertung der Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese stellt die Menge an mikrobiellem Protein je kg fermentierbare organische Substanz (MN/FOS) dar.

Tabelle 33: Mikroben-Protein je kg fermentierbarer organischer Substanz (g MP/kg FOS) nach verschiedenen Autoren

Mittelwert Spanne g MP / kg FOS n

STERN et al. (1994) 188 63 - 313 nicht angegeben LEBZIEN und VOIGT (1999) 181 69 - 266 327

NRC (2001) 186 75 - 338 nicht angegeben Die im vorliegenden Versuch ermittelten Werte für das mikrobielle Protein bezogen auf die fermentierbare organische Substanz liegen mit 158 bzw. 154 g MP/kg FOS zwar unterhalb von in der Literatur angegebenen Mittelwerten (Tabelle 33), stellen jedoch keine Extremwerte dar. HAGEMEISTER et al. (1981) beobachteten bei Rationen mit sehr hohen Kraftfutteranteilen (über 70 % Kraftfutter in der Ration) eine verringerte Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese, was jedoch im vorliegenden Versuch keine Erklärung für die relativ niedrige Effizienz ist, da der Kraftfutteranteil in der Ration nur 26 % betrug. Der im vorliegenden Versuch bezogen auf die aufgenommene Menge an organischer Substanz (FOS in % der OS-Aufnahme) fermentierte Anteil organischer Substanz lag mit 75% bzw. 76% vergleichsweise hoch, was auf eine niedrige Passagerate und höhere Verweilzeiten im Pansen hindeutet. Hieraus resultiert eine geringere Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese (ROBINSON et al., 1986), da dann im Pansen neben Futterprotein auch bereits synthetisiertes Mikrobenprotein abgebaut wird. Am Duodenum

Ergebnisse und Diskussion

76

wird jedoch lediglich die Protein-Nettosynthese im Pansen ermittelt, die sich als Differenz zwischen dem im Pansen synthetisierten und dem im Pansen abgebauten Mikrobenprotein ergibt. Sie ist umso höher, je geringer der Turnover von mikrobiellem Protein im Pansen ist. Die Menge an mikrobiell gebildetem Protein wird maßgeblich durch die im Pansen verfügbare Energie- und Protein-Menge (CLARK et al., 1992) und deren Verhältnis zueinander bestimmt. Bei unzureichender Energiemenge kann der vorhandene Stickstoff (Ammoniak) nur in begrenztem Umfang für die mikrobielle Proteinsynthese genutzt werden, während ein vergleichsweise großer Anteil des Stickstoffs ungenutzt ausgeschieden wird. Mit der im vorliegenden Versuch verfütterten Ration nahmen die Tiere im Verhältnis zur Energieaufnahme reichlich Protein auf. Die für die mikrobielle Proteinsynthese zur Verfügung stehende Energie reichte somit nicht aus, um den verfügbaren Stickstoff effizient zu nutzen, wodurch der duodenale Stickstoff-Fluss relativ zur Aufnahme geringer war (Tabelle 31), das heißt, dass ein Großteil des Stickstoffs nach Absorption als NH3 in Form von Harnstoff ausgeschieden wurde und somit verloren ging. Die Werte für das mikrobielle Protein bezogen auf die umsetzbare Energie waren mit 10,0 g MP/MJ ME mit dem von LEBZIEN (1996) angegebenen Mittelwert von 10,3 g MP/MJ ME gut vergleichbar, wodurch bestätigt wird, dass die geringere Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese vor allem auf eine intensive Fermentation der organischen Substanz (basierend auf geringer Passagerate) zurückzuführen ist (15,7 MJ ME/kg FOS gegenüber 18,5 MJ ME/kg FOS, wie es aus LEBZIEN (1996) abgeleitet werden kann). Bislang gibt es in der Literatur keine direkten Hinweise auf einen Einfluss von Kobalt auf die mikrobielle Proteinsynthese. Es ist jedoch möglich, dass durch verminderte Vitamin B12-Synthese eine Beeinträchtigung einzelner Pansenmikroben erfolgt, da Vitamin B12

für einige Pansenorganismen ein wichtiger Wachstumsfaktor ist. Bei Kobalt-Mangel und daraus resultierendem Vitamin B12-Mangel kommt es zu einer Reduktion einzelner Bakterienarten, wodurch deren Verhältnis zueinander verschoben wird. GALL et al. (1949) wiesen bei Schafen mit Kobalt-Mangel eine deutlich reduzierte Zahl an Mikroorganismen im Panseninhalt nach, wodurch die mikrobielle Synthese vermindert sein könnte. Bei marginaler Kobalt-Versorgung reicht die von den Pansenmikroben synthetisierte Vitamin B12-Menge offensichtlich noch aus, um als Wachstumsfaktor für andere Mikroorganismen, die selber kein Cobalamin synthetisieren können, zu dienen, wodurch die Proteinsynthese nicht beeinflusst wird. Bei den im Fistelkuhversuch verfütterten Kobalt-Gehalten handelt es sich um Kobalt-Mengen, bei denen keine Mangelerscheinungen bei Milchkühen und Schafen beobachtet wurden. Es kann in diesem Fall davon ausgegangen werden, dass im Pansen ausreichend Kobalt zur Vitamin B12-Synthese vorhanden war, um zumindest den Bedarf der Pansenmikroorganismen zu decken, so dass negative Auswirkungen auf die Proteinsynthese nicht zu erwarten waren.

Ergebnisse und Diskussion

77

In Bezug auf die mikrobielle Proteinsynthese waren im vorliegenden Versuch zwischen der Kontrollgruppe (0,17 mg Co/kg T) und der mit Kobalt supplementierten Gruppe (0,29 mg Co/kg T) keine Unterschiede in der Effizienz der mikrobiellen Proteinsynthese feststellbar. Offensichtlich lässt sich durch eine gesteigerte Kobalt-Zufuhr unter den vorliegenden Versuchsbedingungen die mikrobielle Proteinsynthese nicht steigern, was dadurch bedingt sein kann, dass bereits in der Kontrollgruppe der Vitamin B12-Bedarf der Pansenmikroben gedeckt war und eine darüber hinaus zur Verfügung stehende Menge an Cobalamin keinen positiven Einfluss auf die Mikroben mehr hatte. 4.1.7 Kobalt- und Vitamin B12-Konzentrationen im Darmsaft Um Aussagen über den Einfluss von Kobalt auf die Vitamin B12-Synthese machen zu können, wurden die täglich aufgenommenen Mengen an Kobalt pro Tier und Tag und die Kobalt- und Vitamin B12-Konzentrationen im Darmsaft ermittelt (Tabelle 34) und in Relation zur aufgenommenen Kobalt-Menge (siehe Tabelle 24) gesetzt.

Tabelle 34: Kobalt-Konzentrationen im Duodenalinhalt sowie Kobalt-Flüsse und Wiederfindungsraten bei Milchkühen mit unterschiedlicher Co-Versorgung

Co-Aufnahme mg/Tag

Co-Fluss mg/Tag

Wiederfindungsrate %

KontrollgruppeEvelyn 2,27 2,21 97,2 Romke 2,27 2,07 91,1 Leisa 2,27 1,98 87,1

Sanara 2,26 2,13 94,3 Ulane 2,26 2,20 97,1

MW ± SD 2,27 ± 0,01 2,12 ± 0,09 93,4 ± 4,3

Co-suppl. Evelyn 3,97 3,44 86,6 Romke 3,97 3,22 81,2 Leisa 3,97 3,85 97,0

Sanara 3,98 3,44 86,4 Ulane 3,98 3,10 78,0

MW ± SD 3,97 ± 0,00 3,41 ± 0,28 85,8 ± 7,2 Hierbei konnte für das Kobalt eine mittlere Wiederfindungsrate am Duodenum von 93,4 ± 4,3% für die Kontrollgruppe und 85,8 ± 7,2% bei den mit Kobalt supplementierten Tieren ermittelt werden, was Literaturangaben entspricht (MONROE et al., 1952; SMITH und MARSTON, 1970a; LOONEY et al., 1976). Nach Einschätzung von UDÉN et al. (1980) hat Kobalt eine ähnlich hohe Wiederfindungsrate wie Chromoxid (83 – 98%; MacRAE und ARMSTRONG, 1969; VAN ´T KLOOSTER et al., 1972; ROHR et al., 1984). Wenn alles im Pansen vorhandene Kobalt durch Mikroorganismen zur Synthese von Vitamin B12 genutzt würde, läge das am Darm vorkommende Kobalt vollständig im Cobalamin-Molekül gebunden vor. Bei einem Kobalt-Anteil am Vitamin B12-Molekül von 4,35%

Ergebnisse und Diskussion

78

(UNDERWOOD, 1975; YOUNG, 1979), kann die maximal mögliche Vitamin B12-Menge am Darm aus der dort gemessenen Kobalt-Menge errechnet werden. In Tabelle 35 ist diese zusammen mit der tatsächlich am Darm analysierten Menge an Vitamin B12/Tag aufgeführt. Zur Ermittlung der Effizienz der Kobalt-Nutzung zur ruminalen Vitamin B12-Synthese wurden beide Werte zueinander in Beziehung gesetzt.

Tabelle 35: Maximal mögliche und tatsächlich analysierte Vitamin B12-Menge (mg/Tag) im Duodenalinhalt sowie die Effizienz* der ruminalen Vitamin B12-Synthese (%)

Maximal mögliches Vitamin B12

mg/Tag

Tatsächlich analysiertes Vitamin

B12 mg/Tag

Effizienz der ruminalen B12-

Synthese %

KontrollgruppeEvelyn 50,71 4,18 8,24 Romke 47,54 3,88 8,16 Leisa 45,47 3,57 7,85

Sanara 48,97 2,51 5,13 Ulane 50,46 4,19 8,30

MW ± SD 48,63 ± 2,18 3,67 ± 0,69 7,5 ± 1,4

Co-suppl. Evelyn 79,01 11,29 14,29 Romke 74,11 10,48 14,14 Leisa 88,51 7,17 8,10

Sanara 79,03 6,00 7,59 Ulane 71,36 8,21 11,50

MW ± SD 78,40 ± 6,53 8,63 ± 2,22 11,1 ± 3,2 * analysierte : max. mögliche Vitamin B12-Menge im Duodenalinhalt

Je nach Rationsgestaltung beträgt die Vitamin B12-Menge die in den Dünndarm gelangt zwischen 0,6 und 10 mg/Tag (STEINBERG und KLÜNTER,1995) bzw. zwischen 7,5 und 12,3 mg/Tag (ZINN et al., 1987). Die in den eigenen Untersuchungen im Darmsaft ermittelten täglichen Mengen an Vitamin B12 (3,67 bzw. 8,63 mg B12/Tag) liegen innerhalb der angegebenen Bereiche. Im Hinblick auf die Effizienz der mikrobiellen Vitamin B12-Synthese liegen in der Literatur ebenfalls nur wenige Daten vor. SMITH und MARSTON (1970a) ermittelten bei ähnlicher Kobalt-Versorgung der Tiere wie im Fistelkuhversuch eine deutlich höhere Effizienz der ruminalen Vitamin B12-Synthese bei Schafen mit Kobalt-Mangel im Vergleich zu ausreichend versorgten Tieren (15% gegenüber 3%). Die im Fistelkuhversuch ermittelten Werte für die Effizienz der ruminalen Vitamin B12-Synthese führte jedoch zu gegenteiligen Ergebnissen. Während in der mit Kobalt supplementierten Gruppe die Effizienz im Mittel 11% betrug, lag der Wert in der Kontrollgruppe mit im Mittel 7,5% signifikant (p<0,05) niedriger. Ursache für die gegensätzlichen Ergebnisse zwischen den Untersuchungen von SMITH und MARSTON

Ergebnisse und Diskussion

79

(1970a) und der eigenen Untersuchung könnte die Verwendung unterschiedlicher Kobalt-Quellen sein. Während im Fistelkuhversuch Kobalt-Sulfat zur Ergänzung der Ration verwendet worden ist, erfolgte bei SMITH und MARSTON (1970a) die Supplementierung mit Kobalt-Chlorid. Da hierfür bisher keine Angaben zur relativen Bioverfügbarkeit ( Kap. 2.6, Tabelle 3) vorhanden sind, ist eine Beeinflussung der Effizienz der Kobalt-Nutzung möglich. Werden die im vorliegenden Versuch gemessenen Vitamin B12-Werte auf die Trockensubstanz-Aufnahme der Tiere bezogen, ergeben sich die in Abbildung 17 dargestellten Werte für die Vitamin B12-Synthese je kg Trockensubstanz.

0,000,100,200,300,400,500,600,700,800,90

EvCo-

EvCo+

RoCo-

RoCo+

LeiCo-

LeiCo+

SanCo+

SanCo-

UlCo+

UlCo-

mg

B12

/kg

T

a<b; p<0,05 (Ev, Ro, Lei, San, Ul sind Abkürzungen der Tiernamen)

Abbildung 17: Vitamin B12-Synthese je kg T-Aufnahme (Mittel aus 4 Analysen) ohne und mit Co-Zulage bei den 5 Fistelkühen

Aus Abbildung 17 wird ersichtlich, dass eine Kobalt-Zulage zur Ration bei allen Tieren eine signifikante Steigerung der Vitamin B12-Synthese pro kg T (Mittel aus 4 Analysen) zur Folge hatte. Die ermittelten Werte liegen zwischen 0,19 und 0,31 mg Vitamin B12/kg T (ohne Co-Zulage) bzw. 0,44 und 0,84 mg/kg T (mit Co-Ergänzung). Im Vergleich zu Literaturangaben für die mikrobielle Vitamin B12-Synthese (0,33 – 2,0 mg B12/kg T; BIGGER et al., 1976; ZINN et al., 1987) liegen die ermittelten Werte in der Gruppe ohne Kobalt-Zulage relativ niedrig. Hierbei muss jedoch beachtet werden, dass sowohl BIGGER et al. (1976) als auch ZINN et al. (1987) zur Ermittlung der Werte die Vitamin B12-Konzentrationen im Pansensaft herangezogen haben, während in den eigenen Untersuchungen die Konzentrationen im Darmsaft gemessen wurden. Aus diesem Grund ist es möglich, dass Vitamin B12, das vor Erreichen des Darmes von Mikroorganismen verbraucht wird, bei BIGGER et al. (1976) und ZINN et al. (1987) miterfasst wurde, während dies bei den eigenen Untersuchungen nicht gegeben war. Zum anderen könnte auch der Gehalt an Kobalt in der Ration der Kontrollgruppe für eine optimale Vitamin B12-Synthese nicht ausreichend gewesen sein. Dieser These stehen jedoch die im Versuch ermittelten Angaben zur Effizienz der ruminalen Vitamin B12-Synthese entgegen (Tabelle 35).

a

b

a

b

a

b b

a

b

a

Ergebnisse und Diskussion

80

4.2 Vorversuch zum Fütterungsversuch In diesem Versuch wurden die im Fütterungsversuch zu untersuchenden Blutparameter auf ihre circadiane Dynamik untersucht. Dazu wurde bei fünf Tieren alle 3 Stunden eine Blutprobe im Wechsel aus der rechten bzw. linken Vena jugularis externa gezogen. Bei einem Tier musste auf Grund einer geringgradigen Hämatombildung an einer der beiden Jugularvenen an zwei Entnahmezeitpunkten das Blut aus der Schwanzvene (Vena coccygica) entnommen werden. Die über 24 Stunden ermittelten Konzentrationen an Vitamin B12, Folsäure, Glucose, Bilirubin, ß-Hydroxy-Buttersäure, Harnstoff, Eisen, AST, GLDH und γ-GT im Mittel der fünf Milchkühe sind in Tabelle 36 dargestellt. Die Verlaufskurven für die einzelnen Parameter und Tiere sind im Anhang 10 aufgeführt. Alle in diesem Versuch ermittelten Werte liegen im jeweiligen Referenzbereich (Anhang 9).

Die Konzentrationen an Vitamin B12 und Folsäure zeigten sowohl im Tagesverlauf als auch zwischen den einzelnen Tieren nur geringfügige Unterschiede (Anhang 10). Dies entspricht Untersuchungen zur circadianen Rhythmik von Vitamin B12, bei denen ausschließlich tierindividuelle Einflüsse auf die Cobalamin-Konzentration zu beobachten waren (SCHUH und STÖKL, 1975). In Studien zum tageszeitlichen Verlauf der Folsäure-Konzentration im Serum von Milchkühen konnte ebenfalls kein Einfluss der Tageszeit auf die Folsäure-Konzentration beobachtet werden (TREMBLAY et al., 1991). Bei den anderen untersuchten Parametern im Serum zeigen die in Tabelle 36 aufgeführten Werte nur geringfügige Schwankungen im Tagesverlauf, wobei jedoch auch hier tierindividuelle Unterschiede zu verzeichnen waren.

Ergebnisse und Diskussion

81

Tabelle 36: Blutparameter von Milchkühen im Verlauf von 24 Stunden (MW ± SD; n=5) G

LDH

8,04

±

3,25

8,19

±

3,34

7,98

±

2,89

7,31

±

2,77

8,20

±

2,34

8,27

±

2,68

7,36

±

2,62

7,20

±

2,27

7,08

±

2,46

γ-G

T

13,2

±

1,8

14,8

±

1,1

13,8

±

2,6

12,6

±

1,9

14,2

±

3,8

13,4

±

3,8

15,4

±

4,8

13,8

±

1,6

12,4

±

3,0

AST

(U/l)

31,8

±

4,7

32,4

±

5,3

30,4

±

3,8

30,8

±

5,2

29,8

±

3,7

30,2

±

4,4

28,4

±

2,9

28,2

±

2,5

28,6

±

3,0

Eise

n

30,9

±

4,2

34,1

±

9,1

31,0

±

6,8

27,2

±

8,9

29,2

±

5,0

28,2

±

7,3

27,1

±

3,6

26,3

±

3,5

26,9

±

3,9

Ges

amt-

bilir

ubin

(µm

ol/l)

2,09

±

0,25

2,03

±

0,27

1,81

±

0,31

1,72

±

0,19

1,97

±

0,45

1,82

±

0,15

1,94

±

0,25

2,45

±

0,46

1,90

±

0,09

Har

nsto

ff

2,88

±

0,43

2,87

±

0,43

2,66

±

0,34

2,78

±

0,28

2,64

±

0,41

2,49

±

0,22

2,49

±

0,31

2,95

±

0,44

2,98

±

0,13

ß-H

BS

0,67

±

0,13

0,61

±

0,19

0,64

±

0,19

0,71

±

0,13

0,60

±

0,17

0,57

±

0,12

0,55

±

0,16

0,53

±

0,12

0,59

±

0,18

Glu

cose

(mm

ol/l)

3,52

±

0,22

3,73

±

0,36

3,70

±

,029

3,59

±

0,35

3,78

±

0,34

3,82

±

0,33

3,84

±

0,22

3,83

±

0,25

3,73

±

0,35

Fols

äure

(ng/

ml)

14,9

±

1,7

15,5

±

1,4

14,6

±

1,5

15,2

±

1,4

14,9

±

1,2

15,5

±

1,3

14,7

±

0,8

14,1

±

1,0

14,4

±

1,3

Vita

min

B

12

(pg/

ml)

164

± 13

156

± 19

163

± 18

154

± 12

164

± 25

159

± 14

150

± 12

166

± 19

165

± 27

Para

- m

eter

U

hrze

it

09:0

0

12:0

0

15:0

0

18:0

0

21:0

0

24:0

0

03:0

0

06:0

0

09:0

0

Ergebnisse und Diskussion

82

Neben der Tageszeit und dem Zeitpunkt der Futteraufnahme müssen auch Einflüsse durch Blutentnahme und Blutentnahmetechnik bei der Beurteilung der jeweiligen Konzentrationen in Betracht gezogen werden. Das Einfangen der Tiere, die Fixation und der Schmerz bei der Punktion der Vene stellen einen individuell unterschiedlichen Stressfaktor für die Tiere dar (RIETSCHEL et al., 1975), woraus bei manchen Parametern Konzentrationsveränderungen von bis zu 15% resultieren können (RIETSCHEL et al., 1975, STÖBER und GRÜNDER, 1990). Als Beispiel gilt der Blutzuckerspiegel, der nach Stresseinwirkung unterschiedlich stark im Plasma ansteigt (stressbedingte Hyperglycämie; STÖBER und GRÜNDER, 1990). Um wie im vorliegenden Versuch mehrere Blutproben nacheinander zu entnehmen, kann ein Dauerkatheter in die Vena jugularis gelegt werden. Dies war im vorliegenden Versuch jedoch nicht durchführbar, da die Haltung der Tiere in einem Boxenlaufstall erfolgte (Herde von etwa 30 Tieren). Tiere mit Dauerkatheter sollten, solange der Katheter in der Vene belassen wird, angebunden werden. Dieses hätte im vorliegenden Fall die Tiere durch die ungewohnte Situation einem noch stärkeren Stress ausgesetzt als die wiederholte Punktion der Vene. Bei den durch die Blutentnahmetechnik bedingten Auswirkungen auf die Blutbestandteile ist zum Beispiel auch eine durch längerandauernde Stauung der Vene bedingte Erhöhung des Hämatokritwertes und des Hämoglobingehaltes (STÖBER und GRÜNDER, 1990) zu erwähnen, woraus eine Erhöhung des Eisengehaltes in der Probe resultiert. In der Literatur wird eine circadiane Rhythmik bei der Konzentration an ß-Hydroxy-Buttersäure und Harnstoff laktierender Milchkühe beschrieben (MANSTON et al., 1981), wobei offensichtlich weniger die Tageszeit als vielmehr der zeitliche Abstand zur Futteraufnahme (GUSTAFSSON und PALMQUIST, 1993) einen Einfluss hat. Ähnliches gilt auch für die Konzentration an Glucose, die etwa vier Stunden nach Futteraufnahme die höchste Konzentration im Plasma aufweist (EVANS et al., 1975). Da die Fütterung in der Regel zweimal täglich zu festgelegten Zeiten erfolgte, wurden Konzentrationsveränderungen oftmals fälschlicherweise mit der Tageszeit in Verbindung gebracht. Im vorliegenden Versuch hatten die Tiere zu jeder Tageszeit freien Zugang sowohl zum Grund- als auch zum Kraftfutter, wodurch sich ein tierindividuelles Futteraufnahmeverhalten ergab, aus denen unterschiedliche Verläufe der Serumkonzentrationen in Abhängigkeit von der Tageszeit resultierten (Anhang 10). Zusammenfassend kann gesagt werden, dass im vorliegenden Versuch in erster Linie weniger tageszeitliche als vielmehr tierindividuelle Einflüsse ähnlich wie bei HAGEMEISTER und UNSHELM (1968 und 1970) sowie UNSHELM (1969) bei der Konzentration der untersuchten Parameter im Serum bzw. Plasma von Milchkühen einen Einfluss gehabt haben. Aus diesem Grund konnte die Blutentnahme im Fütterungsversuch an die Arbeitseinteilung im Betrieb angepasst werden und fand an allen Entnahmeterminen zwischen 9.00 Uhr und 11.00 Uhr statt.

Ergebnisse und Diskussion

83

4.3 Fütterungsversuch (Teil I) 4.3.1 Versuchsverlauf Während der 112 Versuchstage traten bei fünf Tieren Lahmheiten in Folge von Sohlengeschwüren bzw. Gelenksentzündungen auf. Ein weiteres Tier zeigte eine rezidivierende Mastitis. Alle erkrankten Tiere wurden antibiotisch versorgt, wodurch jedoch keine Einflüsse auf den Vitamin B12-Status der Tiere zu erwarten waren. Am 86. Versuchstag schied aus der Gruppe II (Co-Versorgung mit 0,2 mg Co/kg T) ein Tier wegen einer nicht therapierbaren Strichverletzung aus.

4.3.2 Rohnährstoffgehalte und Futteraufnahme Bei der verwendeten Grassilage handelte es sich um den ersten Schnitt aus dem Jahr 1999. Der Pflanzenbestand setzte sich hauptsächlich aus Weidelgras (L. perenne) und Lieschgras (P. pratense) sowie einem geringen Anteil an Rotklee zusammen. Die Analysenwerte für das Grundfutter und die eingesetzten Kraftfuttermischungen (I-IV) sind in Tabelle 37 aufgeführt, die Zusammensetzung der Kraftfuttermischungen und die Rationsgestaltung sind Kapitel 3.2.2 (Tabelle 11) und Kapitel 3.5.3 zu entnehmen.

Tabelle 37: WEENDER-Rohnährstoffe und ADF/NDF der im Fütterungsversuch verwendeten Futtermittel

T OS XA XP XL XF XX NDF ADF (%) in % der T

Grassilage (n=5)

38,9 ± 1,8

91,0 ± 0,3

9,0 ± 0,5

12,8 ± 0,3

2,4 ± 0,2

29,4 ± 0,4

46,4 ± 0,4

48,5 ± 0,9

29,5 ± 0,4

Kraftfutter I 87,6 83,8 16,2 19,4 2,7 7,5 54,2 19,9 9,4

Kraftfutter II 89,2 83,4 16,6 19,4 3,0 7,5 53,5 19,6 8,7

Kraftfutter III 89,5 83,2 16,8 19,5 2,5 7,6 53,6 20,1 8,8

Kraftfutter IV (Milchleistungsfutter)

87,9 94,1 5,9 22,8 3,0 8,8 59,5 21,8 10,8

Durch die Verwendung von computergestützten Wiegetrögen für die Erfassung der Grundfutteraufnahme und Abrufautomaten für das Kraftfutter konnte für jedes einzelne Tier die tägliche Trockensubstanzaufnahme ermittelt werden, die in Abbildung 18 im Mittel für die Versuchsgruppen über den Zeitraum von 112 Tagen dargestellt ist.

Ergebnisse und Diskussion

84

15,0

16,0

17,0

18,0

19,0

20,0

21,0

22,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Versuchswoche

T-A

ufna

hme

(kg/

Tag)

Gruppe IGruppe IIGruppe III

Abbildung 18: Mittlere tägliche Trockensubstanzaufnahme der Versuchsgruppen im

Versuchsverlauf (n=18) (Gruppe I,II und III entsprechen den Kobalt-Versorgungsstufen 0,10 ; 0,20 und 0,30 mg Co/kg Futter-T)

Zwischen den Versuchsgruppen bestanden nur geringfügige Unterschiede in der Höhe der Trockensubstanzaufnahme, wobei Schwankungen von allen Gruppen gleichermaßen durchlaufen wurden. In Versuchen an Mastbullen (SCHWARZ et al., 2000) konnte bei unterschiedlich hoher Kobalt-Versorgung eine signifikante bzw. tendenzielle Erhöhung der täglichen Trockensubstanzaufnahme im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt werden (Tabelle 38), was durch den vorliegenden Fütterungsversuch nicht bestätigt werden konnte. Auch HENRY et al. (1997) erzielten bei Schafen durch Kobalt-Zulagen keine positiven Effekte auf die Trockensubstanzaufnahme.

Tabelle 38: Trockensubstanzaufnahme in Abhängigkeit von der Kobalt-Versorgung (SCHWARZ et al., 2000)

Kobalt-Gehalt der Ration (mg/kg T)

Trockensubstanzaufnahme (kg/Tag) Anzahl der Tiere

0,07 ± 0,003 6,01d ± 0,43 5 0,09 ± 0,002 6,70c ± 0,23 3 0,11 ± 0,005 7,01bc ± 0,46 3 0,15 ± 0,003 7,72a ± 0,26 4 0,18 ± 0,004 7,99a ± 0,27 3 0,26 ± 0,009 7,55ab ± 0,33 3 0,33 ± 0,001 8,16a ± 0,05 2 0,42 ± 0,004 7,99a ± 0,06 3 0,59 ± 0,005 7,91a ± 0,68 3 0,69 ± 0,015 8,01a ± 0,20 3

a>b>c>d; p<0,05

0

Ergebnisse und Diskussion

85

Für den Fütterungsversuch wurde die mittlere tägliche Nährstoffaufnahme der drei Versuchsgruppen aus den Analysewerten der verwendeten Futtermittel (Tabelle 37) und den täglichen Trockensubstanzaufnahmen ermittelt. Hierbei waren gute Übereinstimmungen zwischen den drei Gruppen zu beobachten (Tabelle 39).

Tabelle 39: Tägliche Trockenmasse- und Rohnährstoffaufnahme (kg/Tag) der Milchkühe mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung im Mittel über 112 Versuchstage (n=18, MW ± SD)

Gruppe I Gruppe II Gruppe III T 19,7 ± 1,5 19,7 ± 2,5 19,6 ± 1,8

OS 18,1 ± 1,4 18,1 ± 1,8 18,0 ± 1,7 XP 3,3 ± 0,3 3,2 ± 0,5 3,2 ± 0,4 XL 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,1 XF 4,1 ± 0,3 4,2 ± 0,5 4,2 ± 0,4 XX 10,2 ± 0,9 10,2 ± 1,1 10,1 ± 1,0

Aus den analysierten Rohnährstoffen und deren Verdaulichkeiten (ermittelt nach den Leitlinien zur Ermittlung der Verdaulichkeit von Rohnährstoffen an Wiederkäuern (GfE, 1991) im Institut für Tierernährung der FAL) sowie den Vorgaben der DLG (1997) und GfE (2001) wurden Energiegehalt, Gehalt an nutzbarem Rohprotein und ruminale Stickstoffbilanz errechnet.

Tabelle 40: Energiehalt der Ration, mittlere Energie- und nXP-Aufnahme sowie ruminale Stickstoffbilanz (RNB) pro Tier und Tag (n=54; MW ± SD; 112 Versuchstage)

Energiegehalt (MJ ME/kg T bzw. MJ NEL/kg T) 10,9 bzw.6,6 Energieaufnahme (MJ NEL/Tag) 131

nXP-Aufnahme (g/Tag) 3278 RNB (g/Tag) 32

Da die mittleren täglichen Trockensubstanzaufnahmen und damit auch die Nährstoffaufnahmen in allen drei Gruppen eine gute Übereinstimmung aufwiesen, waren auch hinsichtlich der mittleren Nettoenergieaufnahme und der Aufnahme an nutzbarem Rohprotein keine Unterschiede zwischen den Gruppen zu verzeichnen. Entsprechend der Milchleistung der Tiere (Tab. 44) wurde mit Hilfe der Empfehlungen der GfE für Milchkühe und Aufzuchtrinder (2001) der Bedarf der Tiere an Nettoenergie (133 MJ NEL/Tag) und nutzbarem Rohprotein (2880g nXP/Tag) errechnet. Der mittlere tägliche Bedarf der Tiere an Energie war mit 131 MJ NEL nahezu gedeckt, die täglich aufgenommene Menge an nutzbarem Rohprotein überstieg den Bedarf der Tiere im Mittel um 400 g. Im Gegensatz zum Fistelkuhversuch war die ruminale Stickstoffbilanz im Fütterungsversuch deutlich ausgeglichener. Mit einem Wert von +32 lag sie in einem Bereich, den die Tiere ohne gesundheitliche Probleme tolerieren (GfE, 2001). Der Unterschied zu der im Fistelkuhversuch verfütterten Ration beruhte vor allem auf der verwendeten Grassilage.

Ergebnisse und Diskussion

86

Während die Silage im Fistelkuhversuch eine RNB von +11,2 g/kg T ( 21 % Rohprotein) aufwies, betrug dieser Wert im Fütterungsversuch –1,8 g/kg T (13 % Rohprotein).

4.3.3 Mineralstoff-Aufnahme

4.3.3.1 Kobalt

Aus den aufgenommenen Trockensubstanzen pro Tier und Tag und den analysierten Kobalt-Gehalten im Grund- und Kraftfutter (Tabelle 41) lassen sich die aufgenommenen Kobalt-Mengen pro Tier und Tag ermitteln (Tabelle 42).

Tabelle 41: Kobalt-Gehalte der im Fütterungsversuch eingesetzten Futtermittel (mg Co/kg T)

Futtermittel Co-Gehalt (mg Co/kg T) Grassilage 0,04 Kraftfutter I 0,61 Kraftfutter II 1,70 Kraftfutter III 2,90 Kraftfutter IV 0,15

Tabelle 42: Tägliche Kobalt-Aufnahme im Mittel für die Versuchsgruppen (MW ± SD; n=18)

Gruppe I Gruppe II Gruppe III mg Co/Tier und Tag 2,53 ± 0,36 3,74 ± 0,33 5,06 ± 0,30 mg Co/kg Futter-T 0,13 ± 0,01 0,20 ± 0,01 0,27 ± 0,01

Zwischen den angestrebten Werten (Kap. 3.5.1) und den tatsächlich in der Ration enthaltenen Kobalt-Gehalten bestand eine gute Übereinstimmung.

4.3.3.2 Weitere Mineralstoffe

In Tabelle 43 sind die im ersten Teil des Fütterungsversuches aufgenommenen Mineralstoffmengen und deren Gehalte in der Ration aufgeführt. Da alle Versuchsgruppen die gleiche Ration erhielten, die sich für die einzelnen Versuchsgruppen lediglich im Kobalt-Gehalt unterschied (Kap. 3.5.1), konnte die Berechnung der weiteren Mineralstoffaufnahmen für alle Tiere zusammenfassend erfolgen.

Ergebnisse und Diskussion

87

Tabelle 43: Mittlere Mengen- und Spurenelement-Aufnahmen pro Tier und Tag sowie deren Gehalte der Ration

tägliche Aufnahme Gehalt der Ration g/Tier und Tag g/kg Futter-T

Ca 150 7,61 P 98,0 4,98 K 342 17,4 Na 45,0 2,28 Mg 44,2 2,24 S 17,7 0,90 mg/Tier und Tag mg/kg Futter-T

Fe 7010 356 Mn 2860 145 Zn 2730 139 Cu 440 22,3 Mo 34,6 1,76

Da sich die einzelnen Werte im Vergleich zum Fistelkuhversuch (Kap. 4.1.2.2) nicht wesentlich unterscheiden, sind auch im Fütterungsversuch (Teil I) keine negativen Auswirkungen der aufgenommenen Mineralstoffe auf die Versuchsfrage zu erwarten. Der Bedarf der Tiere ist auch hier in allen Fällen gedeckt, Gehalte mit toxischer Wirkung liegen nicht vor. 4.3.4 Milchleistung und Milchinhaltsstoffe Die Kobalt-Zulagen hatten in den 112 Versuchstagen keine signifikanten (p>0,05) Einflüsse auf die Milchleistung frischlaktierender Kühe (Tabelle 44).

Tabelle 44: Mittlere Milchmenge und Gehalt an Milchinhaltsstoffen über 112 Versuchstage (n=18; MW ± SD)

Gruppe I Gruppe II Gruppe III Milchmenge (kg/Tag) 28,3 ± 5,5 27,9 ± 5,6 27,1 ± 4,2

FCM (kg/Tag) 29,0 ± 5,2 29,7 ± 5,7 28,7 ± 4,4 Milchfett (%) 4,19 ± 0,43 4,43 ± 0,47 4,41 ± 0,44

Milcheiweiß (%) 3,33 ± 0,26 3,41 ± 0,28 3,39 ± 0,20 Milchzucker (%) 4,96 ± 0,13 5,02 ± 0,11 4,97 ± 0,14

1)FCM = fat corrected milk = ( Fett % x 0,15) + 0,4 x Milchmenge (kg)

Die täglich produzierte Milchmenge betrug in der Kontrollgruppe (Gruppe I) 28,3 ± 5,5 kg/Tag und lag damit geringfügig über den mittleren täglichen Milchmengen in den Versuchsgruppen (Gruppe II und III). Bei Berücksichtigung der fettkorrigierten Milch (FCM) wird dieser Unterschied weitgehend ausgeglichen. Die Entwicklung der FCM-Leistung war in allen Gruppen über den Versuchsverlauf (112 Tage) gleich (Abbildung 19).

Ergebnisse und Diskussion

88

Abbildung 19: Entwicklung der Milchleistung (FCM) bei unterschiedlicher Kobalt-

Versorgung (n=18; Versuchsdauer 112 Tage) In Bezug auf die Gehalte an Fett, Protein und Laktose waren ebenfalls keine signifikanten (p>0,05) Unterschiede zwischen den einzelnen Kobalt-Versorgungsstufen zu beobachten

Ergebnisse und Diskussion

89

(Tabelle 44). Grundsätzlich bleiben die Gehalte an Milchinhaltsstoffen im zu erwartenden physiologischen Bereich. Gleiches gilt für die täglich produzierten Mengen an Fett, Protein und Laktose (Tabelle 45) und deren Entwicklung im Versuchsverlauf (Anhang 11).

Tabelle 45: Tägliche Produktion an Fett, Protein und Laktose bei unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=18; MW ± SD)

Gruppe I Gruppe II Gruppe III Fett (g/Tag) 1179 ± 214 1242 ± 235 1198 ± 196

Protein (g/Tag) 936 ± 148 958 ± 156 917 ± 130 Laktose (g/Tag) 1404 ± 271 1414 ± 250 1344 ± 202

Die bisherigen Daten zum Einfluss unterschiedlicher Kobalt-Versorgung auf Milchleistung und Milchzusammensetzung wurden zumindest zum Teil an Tieren mit deutlichen Symptomen eines Kobalt-Mangels vorgenommen. Erfahrungen mit Einflüssen von Kobalt-Zulagen auf die Milchleistung hochleistender Milchkühe fehlen. Bei Fleischrindern (Hereford; QUIRK und NORTON, 1987) mit mittleren Leistungen von 6,1 kg Milch/Tag blieben Veränderungen nach Kobalt-Zulagen aus. Eine mangelhafte Kobalt-Versorgung und eine daraus resultierende mangelhafte Vitamin B12-Versorgung wird von einigen Autoren mit dem sogenannten Low-Milk-Fat-Syndrom in Verbindung gebracht. FROBISH und DAVIS (1976) wiesen bei einigen Tieren nach intramuskulärer Cobalamin-Injektion einen tendenziell höheren Milchfettgehalt nach, was von ELLIOT et al. (1979) und CROOM et al. (1981) allerdings nicht bestätigt werden konnte. Im vorliegenden Fütterungsversuch waren die mittleren Milchfettgehalte (Tabelle 44) in den mit Kobalt supplementierten Gruppen höher als in der Kontrollgruppe (p>0,05), wobei allerdings diese Unterschiede bereits bei Versuchsbeginn bestanden (Tabelle 14). Veränderungen im Milchfettgehalt sind in allen Gruppen nahezu gleichmäßig verlaufen, so dass im vorliegenden Versuch ein Einfluss auf den Milchfettgehalt durch die Kobalt-Versorgung ausgeschlossen werden kann. Gleiches gilt auch für die Gehalte an Eiweiß und Laktose in der Milch.

4.3.5 Lebendmasseentwicklung In Tabelle 46 sind die mittleren Lebendmassen der Tiere zu Versuchsbeginn und zu Versuchsende dargestellt. Hierbei konnte kein signifikanter Einfluss der Kobalt-Versorgung auf die Lebendmasseentwicklung beobachtet werden.

Tabelle 46: Lebendmasse-Entwicklung von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=18; MW ± SD; Versuchsdauer 112 Tage)

Gruppe I Gruppe II Gruppe III Lebendmasse zu Versuchsbeginn (kg) 635 ± 72 655 ± 79 638 ± 75 Lebendmasse zu Versuchsende (kg) 669 ± 77 687 ± 83 656 ± 64

Tägliche Zunahmen (g/Tag) 307 ± 214 303 ± 233 163 ± 206

Ergebnisse und Diskussion

90

In einer von SCHWARZ et al. (2000) an Mastbullen durchgeführten Versuchsreihe mit 10 verschiedenen Kobalt-Versorgungsstufen (Staffelung von 0,07 bis 0,69 mg Co/kg T-Aufnahme) konnte durch Kobalt-Zulage eine signifikante Erhöhung der täglichen Lebendmasse-Zunahmen beobachtet werden, wobei jedoch die geringe Tierzahl in den einzelnen Kobalt-Versorgungsstufen kritisch zu werten ist (Tabelle 47). Im Gegensatz hierzu wurde in den eigenen Untersuchungen in der am höchsten mit Kobalt supplementierten Gruppe die geringste tägliche Lebendmassezunahme beobachtet.

Tabelle 47: Tägliche Lebendmassezunahme von Mastbullen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (SCHWARZ et al., 2000)

Kobalt-Gehalt der Ration (mg/kg T)

Tägliche Lebendmassezunahme (g) Anzahl der Tiere

0,07 ± 0,003 1045c ± 136 5 0,09 ± 0,002 1130c ± 80 3 0,11 ± 0,005 1273ab ± 137 3 0,15 ± 0,003 1242ab ± 91 4 0,18 ± 0,004 1296ab ± 89 3 0,26 ± 0,009 1273ab ± 128 3 0,33 ± 0,001 1518a 2 0,42 ± 0,004 1413a ± 29 3 0,59 ± 0,005 1254ab ± 119 3 0,69 ± 0,015 1296ab ± 44 3

a>b>c, p<0,05 Bei Milchkühen mit hoher Leistung liegt auf Grund unzureichender Futteraufnahme zu Beginn der Laktation ein Energiedefizit vor, welches durch Mobilisierung von Körperfettreserven ausgeglichen wird. Da sich die im Fütterungsversuch verwendeten Tiere zu Versuchsbeginn im ersten Drittel der Laktation befanden (Laktationstag 76 ± 23) und zusätzlich der mittlere tägliche Energiebedarf von 133 MJ NEL durch die mittlere tägliche Energieaufnahme (131 MJ NEL) nicht vollständig gedeckt wurde, waren die täglichen Lebendmassezunahmen durchaus überraschend. Warum in beiden Versuchen durch Kobalt-Zulagen unterschiedliche Entwicklungen der Lebendmasse beobachtet werden konnten, konnte nicht geklärt werden. 4.3.6 Vitamin B12-Status der Milchkühe 4.3.6.1 Vitamin B12-Konzentration im Serum Die im Versuchsverlauf (112 Tage) ermittelten Vitamin B12-Konzentrationen im Serum der Kühe lagen alle innerhalb des von SCHOLZ (1990) angegebenen Referenzbereichs (siehe

Ergebnisse und Diskussion

91

Kap. 2.15). Der von SCHUH und STÖCKL (1975) ermittelte Mittelwert von 216 pg Vitamin B12/ml Serum (Spanne von 91 – 353 pg B12/ml) wird in allen Gruppen erst gegen Endes des Versuches (am 112. Versuchstag) erreicht. Signifikante Unterschiede in der Cobalamin-Konzentration konnten zu keinem Versuchszeitpunkt beobachtet werden. Die mittlere Cobalamin-Konzentration im Serum der drei Gruppen im Versuchsverlauf ist in Abbildung 20 dargestellt, wobei in Übereinstimmung mit Ergebnissen von GIRARD und MATTE (1999) mit fortschreitender Laktation ein Anstieg der Vitamin B12-Konzentration im Serum der Tiere ermittelt wurde.

100

120

140

160

180

200

220

240

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 112Versuchstag

Vita

min

B12

(pg/

ml)

Gruppe I

Gruppe II

Gruppe III

Abbildung 20: Vitamin B12-Konzentration im Serum von Milchkühen in Abhängigkeit

von ihrer Kobalt-Versorgung mit fortschreitender Laktation (n=18) Aus den Verlaufskurven ist etwa ab Versuchsmitte eine tendenziell höhere Vitamin B12-Konzentration in den mit Kobalt supplementierten Gruppen im Vergleich zur Kontrollgruppe zu erkennen, wobei die Unterschiede statistisch nicht abzusichern sind. In Anhang 12 sind die Vitamin B12-Konzentrationen für jedes einzelne Tier an jedem Probenahmetag aufgeführt. In der Literatur liegen Berichte vor, wonach Kobalt-Ergänzungen zur Ration zu signifikanten Erhöhungen der Vitamin B12-Konzentration im Serum von Wiederkäuern führten (MARSTON, 1970; JONES und ANTHONY, 1970; BAL und DWARKANATH, 1989). SOMERS und GAWTHORNE (1969) erreichten im Plasma von Schafen bei Fütterung einer Ration mit 0,34 mg Co/kg T signifikant höhere Vitamin B12-Konzentrationen gegenüber der Kontrollgruppe (0,04 mg Co/kg T). Allen Versuchen ist gemeinsam, dass die Kobalt-Gehalte der Kontrollgruppenration unterhalb der derzeitigen Empfehlungen zur Spurenelement-versorgung (INRA, 1988; ARC, 1989; GfE, 2001 und NRC, 2001) lagen. Im vorliegenden Fütterungsversuch enthielt die Ration aller Versuchsgruppen einen Kobalt-Gehalt von über 0,10 mg Co/kg T, was im allgemeinen als ausreichend betrachtet wird (Ausnahme: GfE, 2001). Offensichtlich führte keine der gewählten Kobalt-Zulagen zu einer

Ergebnisse und Diskussion

92

nennenswerten Erhöhung der Vitamin B12-Konzentration im Serum der Tiere. Schwankende Cobalamin-Konzentrationen sahen auch SOMERS und GAWTHORNE (1969) bei Kobalt-Gehalten über 0,10 mg Co/kg T. Größere Vitamin B12-Konzentrations-Unterschiede innerhalb der einzelnen Versuchsgruppen führten sie auf eine Verringerung der Absorption im Dünndarm zurück. Vermutlich sind hierbei die Bindungsstellen für Vitamin B12 an den Transportproteinen (Transcobalamine) im Blut schon zu einem großen Prozentsatz besetzt, so dass sie für die Vitamin B12-Absorptions-Mechanismen (Kapitel 2.5) nicht mehr zur Verfügung stehen. Ähnliches könnte auch Erklärung dafür sein, dass im vorliegenden Fütterungsversuch trotz Kobalt-Zulage eine Erhöhung der Vitamin B12-Konzentration im Serum ausblieb. 4.3.6.2 Kobalt- und Vitamin B12-Konzentrationen in Lebergewebe und Milch Die Ergebnisse hierzu sind den Kapiteln 4.4.5 und 4.4.6 zu entnehmen.

4.3.7 Beurteilung weiterer Blutparameter 4.3.7.1 Eisen In Tabelle 48 sind die im Fütterungsversuch (Teil I) ermittelten Eisen-Konzentrationen im Serum aufgeführt, wobei die Werte in allen Gruppen in dem für Milchkühe angegebenen Normbereich von 20 – 40 µmol/l liegen.

Tabelle 48: Eisen-Konzentration im Serum von Milchkühen bei unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (µmol/l)

Gruppe I Gruppe II Gruppe III Versuchstag

0 29,0 ± 4,8 29,0 ± 5,8 30,2 ± 5,8 2 26,5 ± 3,6 26,8 ± 4,0 27,3 ± 6,0 7 28,1 ± 3,7 26,5 ± 3,3 26,0 ± 4,9 9 24,7 ± 3,4 24,1 ± 2,9 25,4 ± 5,0 14 25,7 ± 4,9 24,5 ± 4,7 25,1 ± 5,4 21 28,4 ± 4,1 28,4 ± 4,0 26,6 ± 5,9 28 24,1 ± 4,3 23,9 ± 5,4 26,4 ± 7,2 42 28,2 ± 3,4 25,4 ± 4,6 26,8 ± 5,7 56 28,1 ± 2,9 25,9 ± 3,7 28,4 ± 3,8 84 25,5 ± 3,9 26,2 ± 3,2 24,3 ± 6,6 112 29,3 ± 4,0 27,5 ± 4,1 29,2 ± 4,7

Im untersuchten Zeitraum (112 Tage) konnte sowohl innerhalb der Gruppen als auch zwischen den Kobalt-Versorgungsstufen kein signifikanter Unterschied in der Eisen-Konzentration festgestellt werden.

Ergebnisse und Diskussion

93

Dieses Ergebnis ist nicht überraschend, da nach REUBER et al. (1994) eine Beeinflussung der Eisen-Absorption durch Kobalt erst bei exzessiver Kobalt-Gabe zu erwarten ist. Bei einem Eisen-Kobalt-Verhältnis von 1300:1 (Gruppe III) bzw. 1800:1 (Gruppe I) in der Ration (siehe auch Kap. 4.3.3) sind derartige Bedingungen nicht erfüllt. 4.3.7.2 Folsäure Die im Fütterungsversuch ermittelten Folsäure-Konzentrationen im Serum hochleistender Milchkühe sind in Tabelle 49 aufgeführt, wobei alle ermittelten Konzentrationen im Normbereich für laktierende Milchkühe von 7-19 ng/ml (SCHOLZ, 2001) gelegen haben. Signifikante Unterschiede zwischen den Kobalt-Versorgungsstufen waren nicht zu beobachten.

Tabelle 49: Folsäure-Konzentrationen (ng/ml) im Serum von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung im Verlauf der Laktation (n=18; MW ± SD)

Gruppe I Gruppe II Gruppe III Versuchstag

0 16,2 ± 3,0 16,7 ± 4,9 14,2 ± 3,6 2 17,7 ± 3,3 17,1 ± 4,7 16,3 ± 4,0 7 14,4 ± 2,8 14,4 ± 4,1 12,5 ± 4,2 9 15,8 ± 2,8 15,2 ± 4,2 14,0 ± 3,8 14 17,2 ± 2,9 17,1 ± 4,5 15,9 ± 3,5 21 14,3 ± 2,4 14,8 ± 4,0 13,4 ± 3,1 28 14,3 ± 1,9 13,8 ± 3,7 12,6 ± 3,9 42 12,9 ± 2,6 12,4 ± 3,7 11,5 ± 3,6 56 14,3 ± 3,3 14,4 ± 3,2 12,8 ± 3,1 84 14,6 ± 2,8 14,9 ± 3,7 15,3 ± 4,3 112 17,7 ± 3,6 15,5 ± 4,1 14,1 ± 3,9

Obwohl die genauen Zusammenhänge zwischen Vitamin B12 und dem Folsäuremetabolismus noch nicht geklärt sind, ist nachgewiesen, dass bei Kobalt-Mangel die Folsäure-Konzentration im Serum reduziert ist (DAWBARN et al., 1957; GAWTHORNE und SMITH, 1974). Da im vorliegenden Versuch zu keinem Zeitpunkt ein Vitamin B12-Mangel beobachtet werden konnte (Kap. 4.3.6.1), war somit auch kein Vitamin B12-bedingter Folsäure-Mangel zu erwarten. So konnten GIRARD et al. (1989) grundsätzlich eine Abhängigkeit der Folsäure-Konzentration im Serum vom Trächtigkeitsstadium beobachten (ab dem 3. Trächtigkeitsmonat ein Absinken der Folsäure-Konzentration mit Wiederanstieg nach der Kalbung). In Übereinstimmung hiermit wurde im vorliegenden Versuch eine zwischenzeitliche geringfügige, nicht signifikante Verringerung der Folsäure-Konzentration im Versuchsverlauf beobachtet (Tabelle 49 und Anhang 14). Demgegenüber beobachteten

Ergebnisse und Diskussion

94

GIRARD und MATTE (1999) niedrige Folat-Konzentrationen im Serum vor allem während der ersten zwei Laktations-Monate. 4.3.7.3 Glucose Zwischen den Versuchsgruppen waren keine Unterschiede in der Glucose-Konzentration im Plasma zu beobachten (Tabelle 50). Mit Ausnahme der Proben vom 28. Versuchstag waren alle ermittelten Glucose-Konzentrationen im Referenzbereich von 3,3 – 4,4 mmol/l Serum (STÖBER und GRÜNDER, 1990) anzusiedeln. Die am 28. Versuchstag beobachtete Verringerung der Glucose-Konzentration ist durch eine kurzzeitige Störung in der Kraftfutterversorgung bedingt, wodurch die Tiere am 27. und 28. Versuchstag zu wenig Kraftfutter erhalten haben und der Energiebedarf der Kühe in dieser Zeit nicht gedeckt war.

Tabelle 50: Glucose-Konzentration im Plasma von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=18; MW ± SD)

Gruppe I Gruppe II Gruppe III Versuchstag

0 3,47 ± 0,30 3,38 ± 0,39 3,50 ± 0,37 2 3,49 ± 0,23 3,48 ± 0,27 3,52 ± 0,27 7 3,61 ± 0,29 3,63 ± 0,35 3,62 ± 0,47 9 3,40 ± 0,21 3,37 ± 0,30 3,43 ± 0,26 14 3,65 ± 0,33 3,65 ± 0,30 3,66 ± 0,41 21 3,57 ± 0,25 3,53 ± 0,23 3,60 ± 0,38 28 3,08 ± 0,22 3,14 ± 0,24 3,12 ± 0,30 42 3,48 ± 0,25 3,24 ± 0,35 3,54 ± 0,26 56 3,80 ± 0,17 3,82 ± 0,23 3,79 ± 0,24 84 3,60 ± 0,20 3,63 ± 0,30 3,67 ± 0,38 112 3,48 ± 0,20 3,44 ± 0,42 3,49 ± 0,34

Informationen über Zusammenhänge zwischen der Kobalt-Aufnahme und den Glucose-Konzentrationen im Serum von Milchkühen sind rar. YOUNG (1979) berichtete über verminderte Glucose-Konzentrationen im Blut von Wiederkäuern mit klinischem Kobalt-Mangel. MacPHERSON et al. (1973) sahen bei Kobalt-Mangel ein deutliches Absinken der Glucose-Konzentration unter den Referenzbereich bei gleichzeitig zurückgehender Futteraufnahme. Nach intramuskulärer Injektion von Vitamin B12 normalisierte sich der Blutzuckerspiegel rasch, weshalb angenommen wurde, dass durch Kobalt-Zulage zur Ration die Glucose-Konzentration im Serum gesteigert werden kann. Dies konnte jedoch in Versuchen an Schafen und Mastbullen mit unterschiedlicher Kobalt-Aufnahme nicht bestätigt werden (KESSLER und ARRIGO, 1996; STANGL et al., 1999b). In Tests, bei denen Schafen Propionsäure intravenös verabreicht wurde (SMITH und MARSTON, 1971), zeigte sich nach der Injektion in der Gruppe mit Kobalt-Mangel ein deutlich langsamerer Anstieg der Glucose-Konzentration im Blut als in der ausreichend mit Kobalt versorgten Gruppe. Als Begründung hierfür geben die Autoren eine auf dem Kobalt-Mangel basierende geringere Vitamin B12-Konzentration im Serum der Schafe an, wodurch

Ergebnisse und Diskussion

95

die Aktivität der Cobalamin-abhängigen Methylmalonyl-CoA-Mutase vermindert ist. Somit kann das intravasale Propionat nicht in ausreichendem Maße über Succinat zur Gluconeogenese genutzt werden (KENNEDY et al., 1996). Bei einem ausgeprägtem Kobalt-Mangel kommt der in Kapitel 2.7.1 beschriebene Mechanismus zum Tragen, bei dem die Vitamin B12-abhängigen Reaktionsschritte umgangen werden. Die Gluconeogenese ist in einem solchen Fall in der Regel nicht eingeschränkt. Aus diesem Grunde ist bei ausgeprägtem Kobalt-Mangel nur selten eine Verminderung der Glucose-Konzentration im Blut feststellbar (UNDERWOOD und SUTTLE, 1999). Informationen über das Verhalten der Glucose-Konzentration im Versuchsverlauf sind Anhang 14 zu entnehmen. Auftretende Schwankungen waren in allen Gruppen gleichermaßen zu beobachten. 4.3.7.4 Harnstoff, ß-Hydroxy-Buttersäure, Gesamtbilirubin und Leberenzyme (AST,

GLDH und γ-GT) Die Werte für die im Serum ermittelten Konzentrationen sind in den Anhängen 15 bis 20 aufgeführt. Bei allen untersuchten Parametern konnten keine signifikanten Unterschiede zwischen den Kobalt-Versorgungsstufen beobachtet werden. Interaktionen zwischen der Kobalt-Versorgung und der Konzentration an Harnstoff, ß-Hydroxy-Buttersäure, Gesamtbilirubin, AST, GLDH und γ-GT sind bisher nicht beschrieben und auf Grund der in Kapitel 2.7 dargestellten Funktionen des Vitamin B12 im Intermediär-Stoffwechsel auch nicht zu erwarten. Zu Beginn des Versuchs wurden bei mehr als 50 % der Tiere zu hohe Konzentrationen an ß-Hydroxy-Buttersäure im Serum beobachtet (> 1 mmol/l). Sie beruhten auf einer energetischen Unterversorgung auf Grund eines Fehlers in der Computersteuerung der Kraftfutter-Versorgung. Nachdem eine bedarfsgerechte Versorgung aller Tiere sichergestellt war, konnte eine rasche Normalisierung der Konzentration an ß-Hydroxy-Buttersäure beobachtet werden. Die Konzentrationen an Harnstoff und Gesamtbilirubin bewegten sich bei allen Tieren im Versuchsverlauf innerhalb des entsprechenden Referenzbereichs (Anhang 9). Zur Beurteilung der Leberfunktion wurden die leberspezifischen Enzyme AST, GLDH und γ-GT gemessen. Hierbei konnten bei einer Reihe von Tieren geringgradig erhöhte Leberenzymwerte ermittelt werden, mit in etwa gleichen Anteilen an betroffenen Tieren in allen Gruppen. Eine Erklärung hierfür fehlt. Vermutlich handelte es sich um fütterungsbedingte Faktoren, da im Betrieb vor Versuchsbeginn Probleme mit Schimmelpilz-Befall bei der gefütterten Silage auftraten. Da es sich jedoch nur um eine geringfügige Erhöhung der Enzym-Konzentrationen handelte und alle Gruppen gleichermaßen betroffen waren, kann davon ausgegangen werden, dass die Vergleichbarkeit der Parameter gewährleistet blieb.

Ergebnisse und Diskussion

96

4.4 Fütterungsversuch (Teil II) 4.4.1 Versuchsverlauf, Rohnährstoffgehalte der Ration und Futter-

aufnahme Die im Anschluss an die ersten 112 Versuchstage durchgeführte Versuchsverlängerung mit den Kobalt-Versorgungsstufen I und III verlief ohne Störungen bis zum Abkalben der Tiere (etwa am Versuchstag 280). In Tabelle 51 sind die analysierten Rohnährstoffgehalte sowie der ADF- und NDF-Gehalt der im zweiten Teil des Fütterungsversuches eingesetzten Futtermittel aufgeführt.

Tabelle 51: WEENDER-Rohnährstoffe und ADF/NDF der im Fütterungsversuch (Teil II) verwendeten Futtermittel

T OS XA XP XL XF XX NDF ADF (%) in % der Trockensubstanz

Grassilage (n=10)

44,6 ± 17,2

89,9 ± 0,7

10,1 ± 0,7

16,3 ±2,4

2,5 ± 0,4

29,3 ± 1,5

41,8 ± 2,5

51,3 ± 2,8

29,7 ± 1,2

Kraftfutter I (n=3)

89,0 ± 1,2

83,2 ± 1,0

16,8 ± 1,0

19,6 ± 0,5

1,9 ± 0,1

7,5 ± 0,6

54,2 ± 1,2

19,9 ± 0,1

8,8 ± 0,1

Kraftfutter III (n=3)

89,3 ± 1,3

83,7 ± 0,7

16,3 ± 0,7

19,2 ± 0,1

1,9 ± 0,2

7,4 ± 0,3

55,2 ± 1,0

20,8 ± 0,1

9,0 ± 0,1

Kraftfutter IV (n=3) (Milchleistungsfutter)

87,9 ± 0,0

94,0 ± 0,1

6,0 ± 0,1

22,4 ± 0,6

3,3 ± 0,5

9,0 ± 0,3

59,3 ± 0,3

22,3 ± 0,7

11,0 ± 0,3

Für die Rationsgestaltung vor und nach dem Trockenstellen siehe Kapitel 3.5.3. Signifikante Unterschiede in der Trockensubstanz- und Rohnährstoffaufnahme zwischen der Kontrollgruppe (Gruppe I) und der mit Kobalt supplementierten Gruppe (III) können für den Teil II ausgeschlossen werden (Tabelle 52).

Tabelle 52: Tägliche Rohnährstoffaufnahme (kg/Tag) von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (Dauer ca. 168 Tage; MW ± SD, n=10)

Gruppe I Gruppe III T 17,2 ± 2,7 17,8 ± 2,1

OS 15,6 ± 2,6 16,1 ± 1,9 XP 3,2 ± 0,6 3,2 ± 0,4 XL 0,5 ± 0,1 0,5 ± 0,1 XF 3,7 ± 0,4 3,9 ± 0,3 XX 8,2 ± 1,5 8,5 ± 1,2

Demnach konnte durch Kobalt-Zulage zur Ration auch über einen längeren Versuchszeitraum (Gesamtdauer des Fütterungsversuches 280 Tage) keine signifikante Steigerung der Trockensubstanzaufnahme beobachtet werden.

Ergebnisse und Diskussion

97

Mit Hilfe der analysierten Rohnährstoffgehalte, den Verdaulichkeiten aus der Futterwerttabelle (DLG, 1997) und den Formeln der GfE (2001) wurden die Energiegehalte der Ration, der Gehalt an nutzbarem Rohprotein und die RNB der Ration berechnet (Tab. 54).

Tabelle 53: Energiegehalt der Ration, tägliche Energie- und nXP-Aufnahme sowie ruminale N-Bilanz (RNB) (n=10)

Gruppe I Gruppe III Energiegehalt (MJ ME/kg T bzw. MJ NEL/kg T) 10,7 bzw. 6,5

Energieaufnahme (MJ NEL/Tag) 112 116 nXP-Aufnahme (g/Tag) 3010 3115

RNB (g/Tag) 66 68 Der mittlere Energiebedarf der Tiere von 122 MJ NEL/Tag wurde bei einer mittleren Energieaufnahme von 114 MJ NEL/Tag nicht vollständig gedeckt. Da die Milchleistung im Versuchsverlauf mit fortschreitender Laktation physiologischer Weise sank, wurde das Energiedefizit im Mittel jedoch ausgeglichen. Der mittlere Bedarf an nutzbarem Rohprotein belief sich auf 2500 g/Tag, wodurch es bei einer mittleren täglichen Aufnahme von 3056 g/Tag im Mittel zu einer Überversorgung um etwa 500g/Tag kam. Die ruminale Stickstoffbilanz betrug 67 g/Tag. Nach GfE (2001) ist eine solche RNB von Milchkühen noch tolerierbar. Die Angaben gelten sowohl für marginal (Gruppe I) als auch für reichlich (Gruppe III) mit Kobalt versorgte Tiere. 4.4.2 Mineralstoff-Aufnahme

4.4.2.1 Kobalt

In Tabelle 54 sind die Kobalt-Gehalte der verwendeten Futtermittel aufgelistet. Hieraus wurde die mittlere tägliche Kobalt-Aufnahme und der Kobalt-Gehalt der aufgenommenen Ration errechnet (Tabelle 55).

Tabelle 54: Kobalt-Gehalte der im Fütterungsversuch (Teil II) eingesetzten Futtermittel (mg Co/kg T)

Futtermittel Co-Gehalt (mg Co/kg T) Grassilage (n=4) 0,10 ± 0,02 Kraftfutter I 0,62 Kraftfutter III 2,56 Kraftfutter IV 0,15

Tabelle 55: Tägliche Kobalt-Aufnahme (n=10)

Gruppe I Gruppe III mg Co/Tier und Tag 2,75 ± 0,50 4,98 ± 0,51

mg Co/kg Futter-T 0,16 ± 0,00 0,28 ± 0,01

Ergebnisse und Diskussion

98

Im Vergleich zum ersten Teil des Fütterungsversuchs liegen die Werte in der Gruppe I etwas höher als angestrebt (Kap. 3.5.1). Dennoch ergab sich für Gruppe III ein um 57% höheres Kobalt-Angebot als in Gruppe I.

4.4.2.2 Weitere Mineralstoffe

Aus der in Tabelle 56 aufgeführten Mengen- und Spurenelement-Aufnahme ist eine bedarfsgerechte Versorgung der Tiere abzuleiten. Analog zum Fistelkuhversuch (Kap. 4.1.2.2) und zum Fütterungsversuch Teil I (Kap. 4.3.3.2) ist keine Beeinträchtigung der Versuchsfrage zu erwarten. Tabelle 56: Mittlere Mengen- und Spurenelement-Aufnahmen pro Tier und Tag sowie

Mengen- und Spurenelement-Gehalte der Ration

tägliche Aufnahme Gehalt der Ration g/Tier und Tag g/kg Futter-T

Ca 150 7,61 P 98,0 4,98 K 342 17,4

Na 45,0 2,28 Mg 44,2 2,24

S 17,7 0,90 mg/Tier und Tag mg/kg Futter-T

Fe 7010 356 Mn 2860 145 Zn 2730 139 Cu 440 22,3 Mo 34,6 1,76

4.4.3 Milchleistung und Milchinhaltsstoffe Während der Verlängerung des Fütterungsversuchs konnten gegenüber den Ergebnissen der ersten 112 Versuchstage (Tabelle 43) keine nennenswerten Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe (Gruppe I) und der mit Kobalt supplementierten Gruppe (III) beobachtet werden (Tabelle 57).

Tabelle 57: Mittlere Milchleistung und Gehalt an Milchinhaltsstoffen sowie mittlere täglich produzierte Menge an Fett und Eiweiß im zweiten Teil des Fütterungsversuchs (n=10; MW ± SD)

Gruppe I Gruppe III Milchleistung (kg/Tag) 22,1 ± 6,5 20,4 ± 3,6

FCM (kg/Tag) 21,8 ± 5,5 22,2 ± 4,0 Milchfett (%) 3,97 ± 0,38 4,59 ± 0,36

Milcheiweiß (%) 3,36 ± 0,23 3,57 ± 0,21 Milchzucker (%) 4,85 ± 0,16 4,89 ± 0,19 Milchfett (g/Tag) 875 ± 197 937 ± 176

Milcheiweiß (g/Tag) 734 ± 178 728 ± 132 Milchzucker (g/Tag) 1074 ± 321 998 ± 170

Ergebnisse und Diskussion

99

In den nachfolgenden Diagrammen (Abbildung 21) ist die Entwicklung der Milchleistung und der täglich im Mittel produzierten Mengen an Fett und Eiweiß über den gesamten Versuchsverlauf (Fütterungsversuch Teil I und II) dargestellt.

Milch FCM (kg/Tag)

0,05,0

10,0

15,020,0

25,030,0

35,040,0

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35

Versuchswoche

kg

Gruppe I

Gruppe III

Fett (g/Tag)

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1400,0

1600,0

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35

Versuchswoche

g

Gruppe I

Gruppe III

Eiweiß (g/Tag)

0,0

200,0

400,0

600,0

800,0

1000,0

1200,0

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35

Versuchswoche

g

Gruppe I

Gruppe III

Abbildung 21: Milchmenge, -Fett und -Eiweiß im Versuchsverlauf (n=10)

Ergebnisse und Diskussion

100

4.4.4 Vitamin B12-Konzentration im Serum

Tabelle 58: Vitamin B12-Konzentration (pg/ml) im Serum von Milchkühen während des Fütterungsversuchs (Versuchsdauer etwa 280 Tage; MW ± SD; n=10)

Versuchstag 0 28 56 84 112 140 168 196 224 252 Abkalbung

Gruppe I 180

± 40

194

± 30

176

± 23

180

± 28

213

± 22

214

± 28

205

± 40

231

± 27

227

± 39

216

± 42

276

± 43

Gruppe III 155

± 21

193

± 18

176

± 23

181

± 30

208

± 20

194

± 27

218

± 55

209

± 32

241

±43

246

± 51

315

± 91 Der bereits im ersten Teil des Fütterungsversuchs beobachtete Anstieg der Vitamin B12-Konzentration mit fortschreitender Laktationsdauer setzte sich auch im zweiten Teil fort (Abb. 22). In der mit Kobalt supplementierten Gruppe war etwa ab dem 224. Versuchstag die Vitamin B12-Konzentration im Serum der Tiere tendenziell höher als in der Kontrollgruppe, der Unterschied konnte jedoch statistisch nicht abgesichert werden.

100

150

200

250

300

350

0 28 56 84 112

140

168

196

224

252

Abkalb

ung

Versuchstag

Vita

min

B12

(pg/

ml)

Gruppe IGruppe III

Abbildung 22: Vitamin B12-Konzentration im Serum von Milchkühen im Verlauf der Laktation bei unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=10)

4.4.5 Kobalt- und Vitamin B12-Konzentrationen im Lebergewebe Die gemessenen Kobalt-Konzentrationen im Lebergewebe von jeweils 4 Tieren aus den Gruppen I und III sind in Tabelle 59 aufgeführt.

Ergebnisse und Diskussion

101

Tabelle 59: Kobalt-Konzentration im Lebergewebe von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (µg Co/kg FS; MW ± SD; n=4)

Versuchstag 100 Versuchstagtag 200 Abkalbung

Gruppe I 58,4 Aa ± 6,1 57,2 Aba ± 8,0 48,9 Bb± 5,6

Gruppe III 67,0 Aa ± 3,4 63,1 Aa ± 4,3 59,1 Aa ± 5,4 Unterschiedliche Großbuchstaben kennzeichnen eine signifikante Differenz innerhalb einer Spalte in Bezug auf den Faktor ‚Kobalt-Konzentration’, unterschiedliche Kleinbuchstaben kennzeichnen eine signifikante Differenz innerhalb einer Zeile in Bezug auf den Faktor ‚Versuchsdauer’; a>b, A>B; p<0,05 Mit zunehmender Laktationsdauer nahm die Kobalt-Konzentration in der Leber in beiden Gruppen ab. An den Versuchstagen 100 und 200 war die Kobalt-Konzentration im Lebergewebe der Tiere mit Kobalt-Zulage (Gruppe III) tendenziell höher als bei den Tieren der Kontrollgruppe (Gruppe I). Zum Zeitpunkt der Abkalbung konnte in Gruppe III eine signifikante (p<0,05) Erhöhung der Kobalt-Konzentration im Lebergewebe festgestellt werden. Um Ergebnisse des Fütterungsversuches mit denen der Literatur vergleichen zu können, wurden die Konzentrationen auf die Leber-Trockensubstanz umgerechnet, wobei als Wert für die Trockensubstanz 30 % angenommen wurde (Mittelwert aus 9000 Analysen; MITSIOULIS et al., 1995). Daraus ergeben sich für den vorliegenden Versuch Kobalt-Konzentrationen zwischen 0,16 und 0,19 mg/kg T (Gruppe I) bzw. zwischen 0,20 und 0,22 mg/kg T (Gruppe III). ASKEW and WATSON (1943) ermittelten bei ausreichend mit Kobalt versorgten Tieren Kobalt-Konzentrationen im Lebergewebe von 0,15 mg Co/kg T, während Tiere mit Kobalt-Mangel Konzentrationen von unter 0,02 mg Co/kg T aufwiesen. McNAUGHT (1948) geht bereits bei Konzentrationen von unter 0,06 mg Co/kg T von einem Kobalt-Mangel aus. Aus dem Vergleich dieser Literaturdaten mit den im Versuch ermittelten Kobalt-Konzentrationen ist eine ausreichende Kobalt-Versorgung der Versuchstiere abzuleiten, was unter Umständen für die Erklärung ausbleibender Supplementierungseffekte herangezogen werden muss. Zur Beurteilung der Kobalt-Versorgung von Wiederkäuern wird in der Regel weniger die Kobalt-Konzentration als vielmehr die Vitamin B12-Konzentration im Lebergewebe herangezogen. Diese wurde im vorliegenden Fütterungsversuch aus der ermittelten Kobalt-Konzentration in der Leber mit Hilfe der von MISIOULIS et al. (1995) aufgestellten Regressionsgleichung (Kap. 3.7.12.1) berechnet. In Abbildung 23 ist die Vitamin B12-Konzentration im Lebergewebe im Mittel für beide Gruppen grafisch dargestellt.

Ergebnisse und Diskussion

102

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

Tag 100 Tag 200 Abkalbung

mg

Vita

min

B12

/kg

FS

Gruppe IGruppe III

a>b; p<0,05

Abbildung 23: Vitamin B12-Konzentration im Lebergewebe von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (mg/kg; n=4)

Mit Werten zwischen 0,51 und 0,75 mg Vitamin B12/kg FS liegen die Cobalamin-Konzentrationen im unteren Bereich der von RAMMELL und POOLE (1974) an 350 klinisch gesunden Rindern ermittelten Spanne von 0,58 bis 2,70 mg Vitamin B12/kg FS (Mittelwert 1,18 mg B12/kg). Symptome eines Kobalt-Mangels treten nach SKERMAN et al. (1959) erst bei Cobalamin-Konzentrationen im Lebergewebe von unter 0,30 mg B12/kg FS auf. Somit ist auch aus diesen Werten keine Kobalt-Mangelsituation bei den Kontrolltieren abzuleiten. MARSTON (1970) untersuchte die Einlagerung und Speicherung von Vitamin B12 im Lebergewebe von Schafen in Abhängigkeit von der Kobalt-Versorgung, wobei hochsignifikante (p<0,001) Unterschiede in der Vitamin B12-Konzentration zwischen Tieren höherer Kobalt-Versorgung (0,08 bis 10 mg Co/Tag) und der Kontrollgruppe (0,04 mg Co/Tag) nachgewiesen wurden. In diesem Versuch wurde die maximale Cobalamin-Konzentration (1,4 mg/kg FS) bei einer Kobalt-Aufnahme von 1,0 mg Co/Tag erzielt, eine Erhöhung der Kobalt-Zufuhr (bis 10 mg Co/Tag) hatte keinerlei weitere Effekte zur Folge (Abbildung 24). Ursache hierfür ist eine Begrenzung der Speicherkapazität der Leber, der mikrobiellen Vitamin B12-Synthese und der Cobalamin-Absorption (MARSTON, 1970).

Vita

min

B12

-Kon

zent

ratio

n (m

g/kg

FS)

Abbildung 24: Beziehung zwischen Kobalt-Aufnahme und Vitamin B12-Konzentration

im Lebergewebe von Schafen (nach MARSTON, 1970)

aa

aa a

b

Ergebnisse und Diskussion

103

Untersuchungen zur Dynamik der Vitamin B12-Konzentration fehlen bisher. Die im vorliegenden Versuch beobachtete Verringerung der Vitamin B12-Konzentration im Verlauf von Laktation und Trächtigkeit bei beiden Gruppen spiegelt den erhöhten Vitamin B12-Bedarf (zunehmender Bedarf des wachsenden Fetus, Bereitstellung von Vitamin B12 im Kolostrum) wider. Während beim Menschen die in Leber und Muskulatur gespeicherte Vitamin B12-Menge von im Mittel 3 – 6 mg (ZAGALAK, 1982) bei veganer Ernährung für 3 – 5 Jahre (SCOTT, 1999) ausreicht (täglicher Vitamin B12-Bedarf 3 µg B12/Tag; DACH, 2000), kann bisher keine Aussage über die Vitamin B12-Reserven bei Milchkühen gemacht werden. Aus den in den eigenen Untersuchungen ermittelten Vitamin B12-Konzentrationen wurden die Cobalamin-Reserven überschlägig geschätzt. Die dazu genutzten Lebendmassen der Tiere sind Tabelle 60 zu entnehmen.

Tabelle 60: Mittlere Lebendmasse der zur Leberbiopsie verwendeten Milchkühe mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (MW ± SD)

Tier-Nr. Mittlere Lebendmasse (kg) 417 682 ± 19 418 631 ± 14 556 605 ± 21

Gru

ppe

I

687 618 ± 61 438 672 ± 19 446 639 ± 16 652 711 ± 30

Gru

ppe

III

665 720 ± 16

Zur Errechnung der Lebermasse der Tiere in Abhängigkeit von der Lebendmasse gibt es verschiedene Formeln, die in Tabelle 61 zusammen mit den daraus resultierenden Lebermassen aufgeführt sind.

Tabelle 61: Lebermassen von Milchkühen und Formeln zu deren Errechnung

Lebermasse in kg Gruppe I Gruppe III Autor Formel

417 418 556 687 438 446 652 665 WILK (1988) y = (782 + 13,2 * x)/1000 9,78 9,11 8,77 8,94 9,65 9,22 10,17 10,29SCHMIDT-NIELSEN

(1990) y = 0,082 * 10000,87 * x0,87 9,75 9,12 8,79 8,95 9,63 9,22 10,11 10,23

GUTTE (1986) KÖNIG und

LIEBICH (1999)

y = x * 0,0135 9,21 8,52 8,17 8,34 9,07 8,63 9,60 9,72

Mittelwert 9,58 8,92 8,58 8,74 9,30 9,02 9,96 10,08x = Lebendmasse in kg, y = Lebermasse in kg

Ergebnisse und Diskussion

104

In Tabelle 62 sind die Cobalamin-Mengen in der Leber aufgeführt (Vitamin B12-Konzentration siehe Anhang 21). Unter der Annahme, dass etwa 60 % des Vitamins in der Leber gespeichert werden (FRIEDRICH, 1987; CLARK, 1998), kann die gesamte im Tierkörper gespeicherte Cobalamin-Menge abgeschätzt werden (Tabelle 62).

Tabelle 62: Vitamin B12-Ressourcen in der Leber von 8 Milchkühen und geschätzte Gesamt-Cobalamin-Menge (mg) an drei Probenterminen (MW ± SD)

Gruppe I Gruppe III Tier-Nr 417 418 556 687 438 446 652 665

Vitamin B12 in der Leber (mg)

4,66 ± 0,64

5,38 ± 1,19

5,75 ± 0,83

5,13 ± 0,05

6,11 ± 0,87

6,58 ± 0,16

6,97 ± 0,91

7,19 ± 0,55

Gesamt-Cobalamin im Körper (mg)

8,07 ± 0,76

9,72 ± 0,67

10,10 ± ,50

8,58 ± 0,03

10,75 ± 0,49

11,07 ± 0,09

11,73 ± 1,50

12,33 ± 0,32

Diese Mengen würden den Bedarf (0,3 µg Vitamin B12/kg Lebendmasse; MARSTON, 1970; GRACE et al., 1986; BONOMI et al., 1993) bei kobaltfreier Ration in der Kontrollgruppe (Gruppe I) etwa für 48 Tage und in der mit Kobalt supplementierten Gruppe für etwa 56 Tage decken. Da es sich bei diesen Werten um Angaben für Schafe handelt, Kühe in der Regel einen niedrigeren Bedarf haben als diese (POOLE et al., 1972; CLARK und MILLAR 1983; KENNEDY 1994 b) und kobaltfreie Rationen nicht zu erwarten sind, ist von einer diese Werte übersteigenden Bedarfsdeckung auszugehen. Dies entspricht Untersuchungen von MARSTON et al. (1961) und MARSTON (1970), die erst nach 3 – 6 Monaten bei einer täglichen Kobalt-Aufnahme von < 0,05 mg Co/kg Futter-T Kobalt-Mangelsymptome beobachten konnten. Der im Vergleich zum Menschen geringe Zeitraum ist mit einem höheren Cobalamin-Bedarf des Wiederkäuers (Abbau der Propionsäure) zu begründen (McDOWELL, 1992). 4.4.6 Vitamin B12-Konzentrationen in Milch und Kolostrum In Tabelle 63 sind die Vitamin B12-Konzentrationen in Milch und Kolostrum der 20 im Fütterungsversuch Teil II eingesetzten Kühe im Mittel beider Gruppen aufgeführt.

Tabelle 63: Vitamin B12-Konzentration (ng/ml) in Milch und Kolostrum von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=10; MW ± SD)

Milch Kolostrum Versuchstag 0 Versuchstag 220 Versuchstag 280

Gruppe I 3,77 ± 1,41 4,75 ± 3,05 16,69 ± 11,85 Gruppe III 3,66 ± 1,03 4,44 ± 0,96 21,01 ± 8,39

Ergebnisse und Diskussion

105

Während zu Beginn des Versuchs und auch am 220. Versuchstag zwischen beiden Gruppen keine Unterschiede bestanden, konnte zum Zeitpunkt der Abkalbung (ungefähr Versuchstag 280) in der Gruppe mit Kobalt-Zulage (III) eine tendenziell höhere Vitamin B12-Konzentration im Kolostrum ermittelt werden (p>0,05). Im Kolostrum lagen die Werte nahezu 4-fach höher als zu Versuchsbeginn. Bei Untersuchungen von HALPIN und CAPLE (1982) an Schafen war die Vitamin B12-Konzentration im Kolostrum im Mittel etwa 30-mal höher als in normaler Milch. Nach Untersuchungen an Schafen (O´HALLORAN und SKERMAN, 1961; HALPIN und CAPLE, 1982; RAMOS et al., 1994; GRACE, 1999) und Kühen (ANTHONY et al., 1951; GREGORY et al., 1958) nimmt die Konzentration an Vitamin B12 in der Kolostralmilch bereits wenige Stunden nach der Abkalbung deutlich ab und verharrt dann über Wochen auf diesem Niveau (Abb. 25).

Abbildung 25: Vitamin B12-Konzentration in der Milch von Kühen in Abhängigkeit

vom Laktationsstadium (nach GREGORY et al., 1958) Angaben zur Vitamin B12-Konzentration in der Kolostralmilch schwanken zwischen 5 und 30 ng/ml (GREGORY et al., 1958), wobei große tierindividuelle Unterschiede bestehen. Die in den eigenen Untersuchungen ermittelten Konzentrationen an Cobalaminen liegen in beiden Gruppen innerhalb dieser Spanne, wobei auch hier tierindividuelle Variationen zu beobachten sind (Anhang 22). Durch erhöhte Kobalt-Zufuhr kann die Vitamin B12-Konzentration in der Milch deutlich gesteigert werden (HART und ANDREWS, 1959; SKERMAN und O´HALLORAN, 1962; QUIRK und NORTON, 1988), wobei QUIRK und NORTON (1988) durch Kobalt-Zulage eine etwa 80fache Erhöhung erzielten. Die im vorliegenden Versuch ausbleibenden Reaktionen sind wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass in den eigenen Untersuchungen die Tiere in der Kontrollgruppe mit 0,13 mg Co/kg Futter-T bereits ausreichend mit Kobalt versorgt waren, während sie bei QUIRK und NORTON (1988) nur 0,03-0,05 mg Co/kg T

Vita

min

B12

(ng/

ml)

Ergebnisse und Diskussion

106

erhielten. Die bei QUIRK und NORTON (1988) durch Kobalt-Zulage erreichten Konzentrationen liegen in der Größenordnung, wie sie in den eigenen Untersuchungen sowohl in der Kontroll- als auch in der mit Kobalt supplementierten Gruppe gemessen worden ist. Ähnlich wie bei den Konzentrationen an Cobalaminen in Serum und Lebergewebe ist es auch bei der Milch denkbar, dass ab einer bestimmten Kobalt-Aufnahme pro Tag eine Erhöhung der Vitamin B12-Konzentration nicht mehr möglich ist, wobei hier als limitierender Faktor neben einer begrenzten Produktion im Pansen und Absorption im Dünndarm auch der Übergang vom Blut in die Milch eine Rolle spielen könnte. PULS (1994) gab für die Vitamin B12-Konzentration in der Milch im Zusammenhang mit der Kobalt-Versorgung die in Tabelle 64 aufgeführten Referenzwerte an.

Tabelle 64: Vitamin B12-Konzentration in der Kuhmilch (ng/ml) und deren Interpretation in Bezug auf die Kobalt-Versorgung (nach PULS, 1994)

Kobalt-Versorgung mangelhaft marginal ausreichend

< 0,01 – 1,00 1,00 – 2,00 > 2,00

4.5 Kälberversuch 4.5.1 Versuchsdurchführung Bei allen 20 Kälbern der im Fütterungsversuch (Teil II) eingesetzten Kühe wurde unmittelbar nach der Geburt eine Blutprobe zur Bestimmung der Vitamin B12-Konzentration im Serum gewonnen. Die Entnahme des venösen Blutes erfolgte maximal 30 Minuten nach der Geburt, ohne dass die Kälber zuvor Kolostrum aufnehmen konnten.

4.5.2 Vitamin B12-Konzentration im Serum In Bezug auf die Vitamin B12-Konzentration im Serum der Kälber bestanden zwischen beiden Gruppen keine Unterschiede. Die Kälber aus der Gruppe I wiesen eine Vitamin B12-Konzentration von 320 ± 67 pg/ml auf. In Gruppe III belief sich die Cobalamin-Konzentration auf 319 ± 123 pg/ml (Tabelle 65). Hiermit liegen die Konzentrationen höher als bei den Muttertieren (Tabelle 58). Durch Kobalt-Zulage zur Ration der Muttertiere konnte demnach keine Erhöhung der Vitamin B12-Konzentration im Serum der Kälber erreicht werden. Dies entspricht Ergebnissen von GRACE (1999), wo tragenden Schafen Vitamin B12 subcutan injiziert wurde. Bei den Lämmern konnten zwischen den Gruppen sowohl am Tage der Geburt als auch im weiteren Verlauf des Versuches bis zum 108. Lebenstag keine nennenswerten Unterschiede beobachtet werden. Auch hinsichtlich des Geburtsgewichts und der täglichen Zunahme der Lämmer waren keine Unterschiede zu beobachten, was sich mit den Ergebnissen der eigenen Untersuchungen deckt [43,6 ± 7,0 kg (Gruppe I) bzw. 41,8 ± 3,9 kg (Gruppe III)].

Ergebnisse und Diskussion

107

Die Vitamin B12-Konzentrationen im Serum der Kälber am Tag nach der Geburt sowie am 2. und 5. Lebenstag sind in Tabelle 65 aufgeführt.

Tabelle 65: Vitamin B12-Konzentration im Serum von Kälbern am Tag der Geburt sowie am 1., 2. und 5. Lebenstag (MW ± SD; n=10) bei unterschiedlicher Kobalt-Versorgung der Muttertiere

Tag der Geburt 1. Lebenstag 2. Lebenstag 5. Lebenstag Gruppe I 320 ± 67 342 ± 162 206 ± 56 185 ± 40

Gruppe III 319 ± 123 361 ± 186 211 ± 36 187 ± 30 Aus den ermittelten Vitamin B12-Konzentrationen im Serum der Kälber geht hervor, dass auch durch Aufnahme von Kolostralmilch, deren Vitamin B12-Konzentration in der mit Kobalt supplementierten Gruppe tendenziell höher war als in der Kontrollgruppe (Kapitel 4.4.6, Tabelle 63), kein Einfluss auf den Vitamin B12-Status des Kalbes ausgeübt werden konnte. In beiden Gruppen ist nach Aufnahme der ersten Kolostralmilch die Konzentration an Vitamin B12 im Serum der Kälber höher als unmittelbar nach der Geburt. Bereits am 2. Lebenstag sinken in beiden Gruppen die Cobalamin-Konzentrationen ab, was sich bis zum 5. Lebenstag fortsetzt. Ähnliches stellten auch HALPIN und CAPLE (1982) fest, die bei Lämmern in den ersten Lebenstagen ebenfalls einen Rückgang der Vitamin B12-Konzentration im Serum, parallel zum Verlauf im Kolostrum (Kapitel 4.4.6.), nachweisen konnten. Zur tiefergehenden Diskussion des Vitamin B12-Status der Kälber wäre die Untersuchung der Cobalamin-Konzentration im Lebergewebe notwendig, was im vorliegenden Versuch unterblieb. GRACE (1999) beobachtete signifikante Unterschiede der Cobalamin-Konzentrationen der Lebergewebe zwischen neugeborenen Lämmern von Muttern, denen zuvor Vitamin B12 injiziert worden war, und solchen, deren Mütter keine Behandlung erhielten. Der plazentäre Übergang von Vitamin B12 vom Muttertier auf den Foetus liegt nach Untersuchungen von HALPIN und CAPLE (1982) sowie GRACE et al. (1986) bei ungefähr 50 %.

Vergleichende Diskussion

108

5 VERGLEICHENDE DISKUSSION Die Kobalt-Zulage zur Ration führte bei fistulierten Milchkühen zu einer signifikanten (p<0,05) Erhöhung der Vitamin B12-Konzentration im Dünndarminhalt. Ähnliche Ergebnisse (p<0,01) erzielten SINGH und CHHABRA (1995) auch im Pansensaft von Jungrindern bei Kobalt-Aufnahmen von 0,38 – 6,48 mg/Tier und Tag, wobei bis zu einer täglichen Aufnahme von 1,9 mg Co ein linearer Zusammenhang zwischen Kobalt-Aufnahme und mikrobieller Vitamin B12-Synthese bestand. Darüber hinausgehende Kobalt-Aufnahmen hatten zwar eine weitere Steigerung der Vitamin B12-Synthese zur Folge, die Zunahme der Syntheseleistung war jedoch umso geringer, je mehr Kobalt die Ration enthielt. Dies kann zum einen mit einer nicht unbegrenzt steigerbaren Syntheseleistung der Pansenmikroorganismen erklärt werden. Andererseits nimmt mit höherem Kobalt-Gehalt in der Ration auch der Anteil an nichtvitaminwirksamen Verbindungen, den sogenannten Analoga, überproportional zu (GAWTHORNE, 1970b). Bei SINGH und CHHABRA (1995) konnte mit der verwendeten Messmethode der Anteil der Analoga nicht ermittelt werden. Gleiches gilt auch für die in den eigenen Untersuchungen angewandte Methode. Die Vitamin B12-Synthese wird neben der Kobalt-Versorgung auch durch Futteraufnahme und Rationszusammensetzung beeinflusst (HAYES et al., 1966; SMITH und MARSTON, 1970a; WALKER und ELLIOT, 1972; HEDRICH et al., 1973; HALPIN et al., 1984). Das Ausmaß dieser Einflüsse ist strittig. Während SUTTON und ELLIOT (1972) eine positive Korrelation zwischen Trockensubstanzaufnahme und Vitamin B12-Synthese aufzeigten, konnten SMITH und MARSTON (1970a) keinen direkten Zusammenhang zwischen diesen Parametern herstellen. Mögliche Fütterungseinflüsse wurden in den eigenen Untersuchungen durch gleiche Trockensubstanzaufnahmemenge der Tiere und die Rationsgestaltung ausgeschlossen. Die in den eigenen Untersuchungen bestimmte Effizienz der Kobalt-Nutzung für die mikrobielle Vitamin B12-Synthese betrug 5 – 14% und lag somit in dem von SMITH und MARSTON (1970a) ermittelten Bereich (3-15%). Während die Autoren bei Schafen eine effizientere Ausnutzung des Kobalts zur Vitamin B12-Synthese bei niedrigen Kobalt-Gehalten in der Ration beobachteten, war in den eigenen Untersuchungen die Ausnutzung des Kobalts in der supplementierten Gruppe signifikant (p<0,05) höher als bei den Kontrolltieren (11% vs. 7,5%). Eine mögliche Erklärung für diese gegensätzlichen Ergebnisse (Tabelle 66), könnte die Verwendung unterschiedlicher Kobalt-Verbindungen (Co-Chlorid gegenüber Co-Sulfat) und die unterschiedlichen Bioverfügbarkeiten darstellen. Zur Klärung dieser Frage sind allerdings weiterführende Untersuchungen notwendig.

Vergleichende Diskussion

109

Tabelle 66: Effizienz von Kobalt in der ruminalen Vitamin B12-Synthese

MARSTON (1970) Eigene Untersuchungen

Ohne Co-Zulage 15 % 7,5 ± 1,4 %

Mit Co-Zulage 3 % 11,1 ± 3,2 %

Verwendete Kobalt-Verbindung Kobalt-Chlorid Kobalt-Sulfat Mit verschiedenen Rationen wurden im Duodenum Flussmengen von 0,6 – 10 mg Vitamin B12/Tag ermittelt (STEINBERG und KLÜNTER, 1995). In diesen Bereich lassen sich auch die im eigenen Versuch ermittelten mittleren Cobalamin-Flussmengen von 3,67 mg/Tag (ohne Co-Zulage) und 8,63 mg/Tag (mit Co-Zulage) einordnen (Tabelle 35). Die am Darm anflutende Vitamin B12-Menge ergibt sich als Differenz zwischen der Menge an mikrobiell synthetisiertem Vitamin B12 (Literaturwerte von 0,33 – 2,0 mg/kg T-Aufnahme; BIGGER et al., 1976; ZINN et al., 1987) und durch die Mikroorganismen im Pansen verbrauchtem Vitamin B12. Hierbei ist vor allem der Vitamin B12-Bedarf der Protozoen zu berücksichtigen, da diese selbst kein Cobalamin synthetisieren können (LATTEUR, 1962). In wie weit sich der von SINGH und CHHABRA (1995) beobachtete Anstieg der Bakterien- und Protozoen-Population bei höheren Kobalt-Gehalten in der Ration auf die Vitamin B12-Synthese und den Vitamin B12-Verbrauch durch die Mikroorganismen auswirkt, ist bisher ungeklärt. Ebenso ungeklärt ist beim Wiederkäuer, durch welche Mechanismen das im Pansen gebildete Cobalamin absorbiert wird. Einer möglichen Diffusion über die Pansenschleimhaut widersprechen Studien mit radioaktiv markiertem Vitamin B12, in denen keine nennenswerte Absorption aus dem Pansen nachgewiesen werden konnte (SMITH und MARSTON, 1970a). Eine passive Aufnahme von Cobalaminen im Darm wird als möglich erachtet (ELLIOT et al., 1971; SANDERS, 1989), der Prozentsatz des auf diesem Weg aufgenommenen Cobalamins scheint jedoch äußerst gering zu sein (GRUNER et al., 1998). Offensichtlich wird beim Wiederkäuer der größte Anteil des Cobalamins ähnlich wie beim Menschen durch aktive Absorption (Kap. 2.5) unter Verwendung von Intrinsic Factor und Transcobalaminen aufgenommen. Zwischen den Angaben verschiedener Autoren zur Absorption von Vitamin B12 beim Wiederkäuer bestehen große Unterschiede darin, welcher Prozentsatz des am Darm anflutenden Cobalamins absorbiert wird (Tabelle 67).

Tabelle 67: Cobalamin-Absorptionshöhe (%) nach verschiedenen Autoren

Autor Kobalt-Versorgung Absorption (%) SMITH und MARSTON

(1970a) 1 mg/Schaf und Tag 5 %

GIRARD (1998) Keine Angaben 1-3 % HEDRICH et al. (1973) 0,06 – 1,02 mg Co/kg Futter-T bis zu 20 %

STEINBERG und KLÜNTER (1995) Keine Angaben 5 – 50 %

Vergleichende Diskussion

110

Über die Höhe der Absorption entscheidet neben der am Darm anflutenden Menge auch die Absorbierbarkeit des im Darm vorhandenen Vitamin B12. Nach SMITH und MARSTON (1970a) sind bis zu 91% des im Pansen gebildeten Cobalamins zunächst in Mikroorganismen gebunden und werden nach Freisetzung im Labmagen (niedriger pH-Wert und Verdauungsenzyme; SMITH und MARSTON, 1970a; RICKARD und ELLIOT, 1978) im Darm absorbiert. Einflüsse auf das Ausmaß der Cobalamin-Freisetzung im Labmagen sind bisher nicht bekannt. Dagegen beeinflusst die Höhe des Digestaflusses die Absorption: Je niedriger der Fluss, desto höher ist die absorbierte Vitamin B12-Menge (HEDRICH et al., 1973; RICKARD und ELLIOT, 1978). Insgesamt bestehen jedoch noch viele Unklarheiten über die Absorption von Vitamin B12, woraus große Unsicherheiten für die Beurteilung der Vitamin B12-Versorgung von Milchkühen resultieren. Auch durch die eigenen Untersuchungen konnte zu dieser Frage kein Beitrag geleistet werden, da durch den gewählten Versuchsansatz keine Bestimmung der Vitamin B12-Absorption möglich war. Neben einer Steigerung der Vitamin B12-Synthese wurde in den eigenen Untersuchungen durch eine höhere Kobalt-Versorgung auch eine Erhöhung der Vitamin B12-Konzentration im Lebergewebe beobachtet (0,51 vs. 0,64 mg Vitamin B12/kg FS; Tabelle 68). Dies bestätigt Ergebnisse von MARSTON (1970) und STANGL et al. (1999 a und b), die ebenfalls bei Kobalt-Zulagen zur Ration eine Erhöhung der Cobalamin-Konzentration im Lebergewebe ermittelten. Während jedoch bei STANGL et al. (1999 a und b) aus einer Verdopplung der Kobalt-Gehalte der Ration (von 0,08 auf 0,20 mg Co/kg T) eine Steigerung der Leber-Vitamin B12-Konzentration um den Faktor 6 resultierte, war bei einer Erhöhung des Kobalt-Gehaltes in der Ration in gleicher Größenordnung im vorliegenden Versuch nur ein sehr geringer Effekt (Faktor 1,3) zu beobachten (Tabelle 68). Im Vergleich zur Kontrollgruppe im eigenen Milchviehversuch wiesen die Mastbullen bei STANGL et al. (1999 a und b) mit 0,06 mg/kg FS eine deutlich geringere Vitamin B12-Konzentration in der Leber auf. Nach MARSTON (1970) deutet dieser Wert bereits auf einen Kobalt-Mangel hin (Grenzwert 0,10 mg Vitamin B12/kg FS). Offensichtlich wiesen die Milchkühe (mittleres Alter 4,7 ± 1,6 Jahre) deutlich größere Leberspeicher auf als die etwa 6 Monate alten Mastbullen. Da die Speicherkapazität der Leber für Cobalamin jedoch begrenzt ist (MARSTON, 1970), wird bei höheren Cobalamin-Konzentrationen im Lebergewebe eine weitere Einlagerung von Vitamin B12 zunehmend schwieriger (siehe auch Abb. 24), was ein Grund dafür sein dürfte, dass bei STANGL et al. (1999 a und b) durch Kobalt-Zulage ein erheblich größerer Effekt verzeichnet wurde. Im vorliegenden Milchviehversuch deutete sich jedoch in gewissem Maße ebenfalls ein Effekt an, da bei der letzten Messung während der Versuchsverlängerung ein signifikanter Unterschied in den Vitamin B12-Konzentrationen der Leber nachzuweisen war.

Vergleichende Diskussion

111

Tabelle 68: Gegenüberstellung von Versuchsergebnissen an Mastbullen (STANGL et al., 1999 a und b) und Milchkühen (eigene Versuche)

STANGL (1999 a und b) eigene Untersuchungen Versuche an Mastrindern Versuche mit Milchkühen Versuchsdauer 301 Tage Versuchsdauer ca. 280 Tage mg Co/kg Futter-T mg Co/kg Futter-T 0,08 0,20 0,13 - 0,16 0,27 - 0,28 Vitamin B12

1) Serum (pg/ml) 295 ± 137 1226 ± 457 276 ± 43 315 ± 91 Leber (mg/kg FS) 0,06 ± 0,03 0,35 ± 0,07 0,51 ± 0,06 0,64 ± 0,06 Folsäure im Serum (ng/ml) 2)

20,5 ± 9,71 21,9 ± 6,62 17,7 ± 3,6 14,1 ± 3,9

Glukose im Serum (mmol/l) 2)

4,48 ± 0,98 5,14 ± 1,65 3,48 ± 0,20 3,49 ± 0,34

T-Aufnahme (kg/Tag) 3) 6,24 ± 0,42 7,65 ± 0,28 18,5 ± 2,3 18,7 ± 1,9 Leistungsparameter 3) LMZ (g/Tag) 991 ± 1,75 1426 ± 75 - - FCM (kg/Tag) - - 27,9 ± 3,9 27,9 ± 3,8 1) Probennahme bei STANGL (1999 a und b) am 301. Versuchstag, in den eigenen Untersuchungen am

Versuchstag 280 2) Probennahme bei STANGL (1999 a und b) am 301. Versuchstag, in den eigenen Untersuchungen am

Versuchstag 112 3) Mittelwerte über den gesamten Versuchsverlauf Über die Dynamik der Kobalt- und Vitamin B12-Konzentration in der Leber im Laktationsverlauf sind bisher in der Literatur keine Angaben gemacht worden. In den eigenen Untersuchungen wurde sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der mit Kobalt supplementierten Gruppe im Verlauf der Laktation ein Rückgang beider Konzentrationen verzeichnet. Im gleichen Zeitraum nahm die Vitamin B12-Konzentration im Serum der Tiere zu (Abb. 26).

0

100

200

300

400

500

0 28 42 56 84 112 140 168 196 224 252 280 308

Versuchstag

Seru

m V

itam

in B

12

(pg/

ml)

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

Lebe

r Vita

min

B12

(mg/

kg)

Leber Gruppe I

Leber Gruppe III

Serum Gruppe I

Serum Gruppe III

Abbildung 26: Vitamin B12-Konzentration in Serum und Lebergewebe von Milchkühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=4)

Vergleichende Diskussion

112

Die Verringerung der Kobalt- und Vitamin B12-Konzentrationen im Lebergewebe im Verlauf der Laktation lassen sich zum einen durch eine erhöhte Abgabe von Vitamin B12 in die Milch erklären. Dies gilt insbesondere für die Kolostralmilch, die eine bis zu 30-mal (HALPIN und CAPLE, 1982) höhere Cobalamin-Konzentration aufweist. Darüber hinaus kann das placentagängige Vitamin B12 (HALPIN und CAPLE, 1982; GRACE et al., 1986) auch in den sich entwickelnden Fetus abfließen. Unter solchen Bedingungen wären zurückgehende Lebergehalte bei gleichzeitig erhöhten Serum-Konzentrationen vorstellbar. In die gleiche Richtung zielt die Beobachtung, dass zumindest bei Monogastriern (NEXO und OLSEN, 1982) die Absorptionsrate für Vitamin B12 im Verlauf der Laktation steigt, während auf der anderen Seite der Abfluss über die zurückgehende Milchleistung verringert ist (Abb. 27).

100110120130140150160170180190200210220230240

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110Versuchstag

Vita

min

B12

(pg/

ml)

15,0

17,0

19,0

21,0

23,0

25,0

27,0

29,0

31,0

33,0

Milc

h (k

g/Ta

g)

Serum Gr. ISerum Gr. IISerum Gr. IIIMilch Gr.IMilch Gr.IIMilch Gr. III

Abbildung 27: Vitamin B12-Konzentration im Serum (pg/ml) und tägliche Milchmenge

(kg/Tag) von Kühen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung (n=18) Der in den eigenen Untersuchungen in Übereinstimmung mit GIRARD und MATTE (1999) beobachtete Anstieg der Vitamin B12-Konzentrationen im Serum beider Gruppen kann darüber hinaus auch durch das Verhältnis von Grundfutter zu Kraftfutter in der Ration beeinflusst worden sein. Während zu Beginn der Laktation ein recht hoher Kraftfutteranteil in der Gesamtration enthalten ist, steigt mit zunehmendem Laktationstag der Grundfutteranteil. Im vorliegenden Versuch veränderte sich das Verhältnis von nahezu 1:1 im Versuchverlauf auf etwa 9:1. Nach WALKER und ELLIOT (1972) sowie HALPIN et al. (1984) ist die mikrobielle Vitamin B12-Synthese bei kraftfutterreichen Rationen reduziert. Da gleichzeitig auch durch erhöhte Propionat-Produktion (BAUMAN et al., 1971; LEBZIEN, 1980) ein gesteigerter Vitamin B12-Bedarf besteht (siehe Kap. 2.7.1), ist auch hierdurch eine geringere Vitamin B12-Konzentration im Serum zu Laktationsbeginn durchaus vorstellbar. Im Gegensatz zu Ergebnissen von MARSTON (1970) sowie BAL und DWARKANATH (1989) konnte in den eigenen Untersuchungen durch Kobalt-Zulage keine signifikante Steigerung der Vitamin B12-Konzentration im Serum der Kühe erzielt werden. Diese Ergebnisse stehen im Gegensatz zu denen von STANGL et al. (1999 a und b), die in der Tat

Vergleichende Diskussion

113

signifikante Unterschiede in der Vitamin B12-Konzentration im Serum der Mastrinder in Abhängigkeit von der Kobalt-Versorgung registrierten (Tabelle 68). Allerdings waren sie in der Lage, den Kobalt-Gehalt der Kontrollration auf 0,08 mg Co/kg T zu senken, wodurch eine marginale Kobalt-Versorgung vorlag. In Bezug auf weitere Blutparameter wie Folsäure und Glukose konnte weder bei STANGL et al. (1999 b) noch in den eigenen Untersuchungen ein Einfluss durch Kobalt-Zulagen zur Ration beobachtet werden (Tabelle 68). In wie weit der von STANGL et al. (1999 a und b) beobachtete Zugewinn an Lebendmasse von >40% bei gleichzeitiger Erhöhung der Trockensubstanz-Aufnahme um gut 20% auf die Kobalt-Versorgung zurückzuführen war (Tabelle 68), muss nach dem Vorliegen der Ergebnisse der eigenen Untersuchungen hinterfragt werden. Allenfalls das Alter der Tiere – Jungtiere reagieren auf Kobalt-Mangel heftiger als Adulte (ANDERWS, 1956; CLARK und MILLAR, 1983; McDOWELL, 2000), wahrscheinlich auf Grund geringeren Kobalt-Speicherungs-Vermögens – und die insgesamt schlechtere Versorgungssituation der Mastbullen (niedrige native Kobalt-Gehalte in den Futtrmitteln auf Grund geochemischer Strukturen) könnte eine Erklärung liefern. Zumindest deuten die niedrigeren Vitamin B12-Konzentrationen im Lebergewebe der Mastbullen eine solche Möglichkeit an.

Schlussfolgerungen

114

6 SCHLUSSFOLGERUNGEN Die Ergebnisse zeigen, dass durch nutritive Kobalt-Zulagen die mikrobielle Vitamin B12-Synthese im Pansen signifikant gesteigert wurde ohne ansonsten die Synthese- und Abbauvorgänge im Pansen nennenswert zu beeinflussen. Die Kobalt-Nutzung für die Cobalamin-Synthese betrug bei höherem Kobalt-Gehalt der Ration (0,29 mg Co/kg T) 11,1% gegenüber 7,5% (p<0,05) bei niedrigem Gehalt (0,17 mg Co/kg). Die gesteigerte Vitamin B12-Synthese im Pansen hatte jedoch nur geringe Auswirkungen auf den Vitamin B12-Status der Tiere. So wurde ein signifikanter Unterschied in der Cobalamin-Konzentration im Serum nicht beobachtet. Warum trotz gesteigerter Vitamin B12-Synthese die Konzentration im Serum nicht erhöht werden konnte, war nicht eindeutig zu klären. Es ist denkbar, dass für das durch die Kobalt-Zulage vermehrt gebildete Vitamin B12 keine Absorptionskapazitäten zur Verfügung standen und es ungenutzt ausgeschieden wurde. Möglich wäre auch eine begrenzte Vitamin B12-Transportkapazität im Blut oder eine Hemmung der Transcobalamin-Synthese in der Leber ab bestimmten Vitamin B12-Konzentrationen in Serum oder Lebergewebe. Im vorliegenden Versuch scheint neben der Transportkapazität des Blutes auch die Speicherkapazität der Leber ausgeschöpft gewesen zu sein, da eine weitere Einlagerung bei höherer Vitamin B12-Synthese nicht nachzuweisen war. Dies legt den Schluss nahe, dass die im Fütterungsversuch eingesetzten Tiere von vornherein über ausreichende Vitamin B12-Depots in der Leber verfügten, so dass das zusätzliche Kobalt-Angebot wenig Auswirkungen zeigte. Gleiches gilt auch für die ausgebliebenen eindeutigen Effekte auf die Vitamin B12-Konzentration in Milch und Kolostrum. Während des Laktationsverlaufs wurde eine Reduktion der Vitamin B12-Speicher in der Leber beobachtet, was vermutlich auf einer Mobilisierung von Cobalamin-Reserven für Kolostrum und Fetus beruht. Einflüsse höherer Kobalt-Aufnahme auf Leistungsparameter (Milchmenge, Gehalt an Milchinhaltsstoffen) und Trockensubstanzaufnahme wurden in den eigenen Untersuchungen nicht festgestellt. Dem stehen Ergebnisse mit Mastbullen gegenüber (SCHWARZ et al., 2000), in denen bei höherer Kobalt-Zufuhr tendenzielle bzw. signifikante Unterschiede zwischen den Kobalt-Versorgungsstufen in der Trockensubstanzaufnahme und der täglichen Lebendmassezunahme beobachtet wurden. Ob hieraus unterschiedliche Kobalt-Bedürfnisse für Muskulatur und Eutergewebe abzuleiten sind, müssen weitere Untersuchungen zeigen. Während in den vorliegenden Untersuchungen Kobalt-Gehalte in der Ration von 0,13 mg Co/kg T offensichtlich zur Versorgung der Milchkühe mit Kobalt bzw. Vitamin B12

Schlussfolgerungen

115

ausreichend waren, können darüber hinaus aus den ermittelten Daten keine allgemeingültigen Empfehlungen für die Kobalt-Versorgung von Rindern abgeleitet werden. Dies gilt vor allem für Kälber und wachsende Rinder, da diese auf Grund geringerer Depots auf unzureichende Kobalt-Zufuhr deutlich schneller reagieren als ausgewachsene Tiere (ANDREWS, 1956; CLARK und MILLAR, 1983; McDOWELL, 2000). Für Milchkühe der untersuchten Leistungsstufen kann aber auf Grund der ermittelten Daten davon ausgegangen werden, dass die Empfehlung der GfE (2001) von 0,20 mg Co/kg Futter-T zu hoch ist und 0,13 mg Co/kg Futter-T zur Bedarfsdeckung ausreichen.

Zusammenfassung

116

7 ZUSAMMENFASSUNG In einem Stoffwechselversuch an fistulierten Milchkühen und einem Fütterungsversuch wurde der Einfluss von Kobalt-Ergänzungen auf die mikrobielle Vitamin B12-Synthese im Pansen sowie auf den Kobalt- und Vitamin B12-Status von Milchkühen und deren Kälbern geprüft. Des weiteren wurden Einflüsse auf Futteraufnahme, Milchmenge und Milchinhaltsstoffe untersucht. Sowohl im Versuch mit fistulierten Milchkühen als auch im Fütterungsversuch erhielten die Tiere angewelkte Grassilage als Grundfutter sowie Milchleistungsfutter und mineralisiertes Ausgleichskraftfutter, das für die Kontrollgruppe nur den nativen Kobalt-Gehalt enthielt. Dem Ausgleichskraftfutter für die Gruppen mit Kobalt-Zulage war Kobalt-Sulfat (CoSO4 * 7 H2O)

zugesetzt. Der Versuch an fistulierten Tieren wurde mit 5 laktierenden, mit Pansen- und Duodenalfisteln versehenen Milchkühen („Deutsche Holstein“) in Form eines unvollständigen Cross-overs durchgeführt. Als Ration erhielten alle Tiere 10 kg T Grassilage, 3 kg Milchleistungsfutter und 1 kg des Ausgleichskraftfutters ohne bzw. mit Kobalt-Zulage. Der Kobalt-Gehalt der Ration betrug ohne Kobalt-Zulage 0,17 mg/kg T und mit Kobalt-Zulage 0,29 mg/kg T. Der Versuch unterteilte sich in zwei Versuchsperioden zu 21 Tagen, in denen nacheinander entweder die Ration ohne bzw. mit Kobalt-Ergänzung gefüttert wurde. Nach jeweils 14-tägiger Adaptation an die Ration wurden Pansensaftproben zur Charakterisierung des Pansenmilieus und Duodenalchymus-Proben zur Ermittlung der Trockensubstanz- und Nährstoffflüsse am Dünndarm gewonnen. Um Aussagen über die mikrobielle Vitamin B12-Synthese machen zu können, wurden die Kobalt- und Vitamin B12-Konzentrationen im Dünndarminhalt sowie deren Flussraten am Duodenum bestimmt. In einem zweiteiligen Fütterungsversuch wurde der Vitamin B12-Status von Milchkühen in Abhängigkeit von ihrer Kobalt-Versorgung untersucht. Hierfür standen zunächst (Teil I, 112 Versuchstage) 54 laktierende Milchkühe („Deutsche Holstein“) zur Verfügung, die in drei Gruppen mit unterschiedlicher Kobalt-Versorgung aufgeteilt wurden (0,13 ; 0,20 und 0,27 mg Co/kg Futter-T). Die Ration bestand aus Grassilage ad libitum (mittlere tägliche T-Aufnahme 11,4 kg), 1 kg Ausgleichskraftfutter (ohne bzw. mit Co-Zulage) und bis zu 10 kg Milchleistungsfutter. Im Anschluss an die ersten 112 Tage wurde der Fütterungsversuch mit jeweils 10 Tieren aus der Kontrollgruppe (0,13 mg Co/kg T) und der am höchsten supplementierten Gruppe (0,27 mg Co/kg T) bis zur Abkalbung (etwa Versuchstag 280) bei unveränderter Ration fortgesetzt. Während der beiden Versuchsperioden wurden Blutproben zur Bestimmung von Vitamin B12 und weiterer Parameter gewonnen. Zur Bestimmung der Kobalt- und Vitamin B12-

Zusammenfassung

117

Konzentration im Lebergewebe erfolgte die Entnahme von Lebergewebe mittels Leberbiopsie (Versuchstag 100, 200 und zur Abkalbung). Die Vitamin B12-Konzentration in der Milch wurde zu Versuchsbeginn, am Versuchstag 220 und nach der Abkalbung ermittelt. Die Erfassung der Trockensubstanzaufnahme aus Grund- und Kraftfutter sowie der Milchmenge erfolgte täglich, die Bestimmung der Milchinhaltsstoffe dagegen zweimal pro Woche. Den Kälbern wurde unmittelbar nach der Geburt venöses Blut zur Bestimmung der Vitamin B12-Konzentration entnommen. Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammenfassen:

1. Pansenparameter Der pH-Wert und die Konzentrationen an flüchtigen Fettsäuren und Ammoniak im Pansensaft lagen im Versuch mit fistulierten Milchkühen alle im physiologischen Bereich. Durch eine Kobalt-Ergänzung zur Ration konnten in Bezug auf diese Parameter keine signifikanten Unterschiede beobachtet werden.

2. mikrobielle Vitamin B12-Synthese

Bei Fütterung der Ration ohne Kobalt-Zulage (0,17 mg /kg T) und mit Kobalt-Zulage (0,29 mg/kg T) wurden signifikante Unterschiede in der täglich am Darm anflutenden Vitamin B12-Menge ermittelt. Unter Annahme einer mittleren Wiederfindungsrate für Kobalt im Duodenum von 89,6 ± 6,8% wurde ein signifikanter (p<0,05) Unterschied in der Kobalt-Nutzung für die mikrobielle Vitamin B12-Synthese beobachtet (7,5 ± 1,4% in der Kontrollgruppe und 11,1 ± 3,2% in der supplementierten Gruppe).

3. Vitamin B12-Konzentration im Serum Alle ermittelten Vitamin B12-Konzentrationen im Serum wiesen auf eine ausreichende Kobalt-Versorgung hin. Bei Kobalt-Gehalten von 0,13; 0,20 und 0,27 mg Co/kg Futter-T wurden keine statistisch abzusichernden Unterschiede zwischen den Gruppen beobachtet. In allen drei Versuchsgruppen war mit zunehmender Laktationsdauer ein leichter Anstieg der Vitamin B12-Konzentration festzustellen.

4. Kobalt- und Vitamin B12-Konzentration im Lebergewebe

Im Verlauf der Laktation sanken die Kobalt- und Vitamin B12-Konzentrationen im Lebergewebe unabhängig von der Kobalt-Zulage, wobei die Konzentrationen in der supplementierten Gruppe am Versuchstag 100 und 200 tendenziell höher waren. Zum Zeitpunkt der Abkalbung war der Unterschied von 0,51 ± 0,06 mg Vitamin B12/kg FS (Kontrollgruppe) gegenüber 0,64 ± 0,06 mg Vitamin B12/kg FS (supplementierte Tiere) signifikant (p<0,05).

Zusammenfassung

118

5. Vitamin B12-Konzentration in der Milch

Im Versuchsverlauf konnte ein geringfügiger Anstieg der Vitamin B12-Konzentration in der Milch in beiden Gruppen beobachtet werden (von 3,77 ± 1,41 auf 4,75 ± 3,05 ng/ml in der Kontrollgruppe bzw. von 3,66 ± 1,03 auf 4,44 ± 0,96 ng/ml in der mit Kobalt supplementierten Gruppe), dieser Unterschied war statistisch nicht abzusichern. Die Vitamin B12-Konzentrationen im Kolostrum waren etwa 4-6 mal höher als in der Milch, wobei durch die Kobalt-Zulage eine tendenzielle Erhöhung der Vitamin B12-Konzentration zu beobachten war (21,0 ± 8,4 vs.16,7 ±11,9 ng/ml).

6. Konzentrationen weiterer untersuchter Parameter im Serum

Eine Beeinflussung der Konzentrationen an Folsäure, Eisen, Glukose, ß-Hydroxy-Buttersäure, Harnstoff, Gesamtbilirubin und einigen leberspezifischen Enzymen (AST, GLDH, γ-GT) durch Kobalt-Zulage war nicht zu beobachten .

7. Trockensubstanzaufnahme

Die Kobalt-Ergänzungen hatten im Versuchszeitraum keine statistisch absicherbaren Einflüsse auf die tägliche Trockensubstanzaufnahme der Tiere.

8. Milchleistung und Gehalt an Milchinhaltsstoffen

Die Kobalt-Zulagen hatten im untersuchten Zeitraum keine signifikanten Einflüsse auf die Milchleistung und den Gehalt an Fett, Protein und Laktose. Die mittlere tägliche fettkorrigierte Milch-Menge (FCM) betrug während der ersten 112 Versuchstage 29,0 ± 5,2 kg/Tag in der Kontrollgruppe, während in den Versuchsgruppen im Mittel 29,7 ± 5,7 kg FCM/Tag (Gruppe II) bzw. 28,7 ± 4,4 kg FCM/Tag (Gruppe III) ermittelt wurden. Gleiches war auch im zweiten Teil des Fütterungsversuchs festzustellen.

9. Vitamin B12-Konzentration im Serum der Kälber

Durch Kobalt-Zulage an tragende Milchkühe konnten bei deren Kälbern keine Unterschiede in der Vitamin B12-Konzentration des Serums beobachtet werden, wenn diese noch kein Kolostrum aufgenommen hatten. Nach Aufnahme von Kolostrum nahm in beiden Gruppen die Vitamin B12-Konzentration im Serum der Kälber (342 ± 162 bzw. 361 ± 186 pg/ml) zu und sank ab dem 2. Lebenstag wieder ab.

Unter den geprüften Versuchsbedingungen wurde durch Kobalt-Zulagen zur Ration kein nennenswerter Einfluss auf den Vitamin B12-Status von Milchkühen ausgeübt. Es lässt sich deshalb ableiten, dass für Milchkühe ein Kobalt-Gehalt in der Ration von 0,13 mg/kg Futter-T ausreichend ist. Damit liegt dieser Wert unter den derzeitigen Empfehlungen von 0,20 mg Co/kg T der Gesellschaft für Ernährungsphysiologie (GfE).

Summary

119

8 SUMMARY Kirsten Stemme

Investigations on the cobalt supply of dairy cows To study the influence of cobalt supplements on the ruminal vitamin B12-synthesis and on the vitamin B12-status of dairy cows and their calves a metabolism experiment and a feeding trial were performed. Beside this the effect on feed intake, milk yield and milk composition was studied. In the metabolism experiment as well as in the feeding trial cows were fed wilted grass silage as roughage, additionally dairy concentrate and balancing concentrate, which contained for controls the natural cobalt only, whereas the balancing concentrate for the experimental groups was supplemented with cobalt sulfate (CoSO4 * 7 H2O). The metabolism experiment was carried out with 5 lactating German Holstein cows, which were fitted with rumen and duodenal canulae, using an incomplete cross over design. The ration consisted of 10 kg grass silage dry mater (DM), 3 kg dairy concentrate and 1 kg balancing concentrate with or without cobalt supplements. The cobalt content in the control ration amounts to 0.17 mg Cobalt/kg DM and 0.29 mg/kg DM in the experimental ration. The experimental was divided into two periods of 21 days each, in which subsequently the control and the experimental rations were fed. After a 14 day adaptation time samples of rumen fluid and duodenal chyme were taken to study the dry mater and nutrient flux in the small intestine. Additionally cobalt- and vitamin B12-concentrations were determined in the duodenal digesta to study the rate of microbial vitamin B12-synthesis. In the feeding trial, which comprised two periods, the vitamin B12-status of lactating cows was under study as dependent on the cobalt-supply. In the first period, lasting 112 days, 54 cows were divided into 3 groups of 18 animals each and allotted to 3 cobalt-levels in the ration (0.13, 0.20 and 0.27 mg Co/kg DM). They were fed 1 kg balancing and dairy concentrate according to milk yield up to 10 kg. Afterwards in the second period 10 cows of the control group (0.13 mg Co/kg DM) an 10 cow of the highest supplemented experimental group (0.27 mg Co/kg DM) were fed their rations till calving. During the experiment blood samples were taken at start and in different intervals. Beside this samples from the liver were taken on experimental day 100 and 200 and on the day of calving. Dry matter intake from roughage and concentrates as well as milk yield were

Summary

120

recorded daily, milk composition twice a week. Additionally venous blood samples of the calves were taken directly after birth for vitamin B12-determination in the serum. The results obtained can be summarised as follows:

1. Rumen parameters

The pH-value, the volatile fatty acid as well as the ammonia concentration in the rumen were found to be in the physiological range. Dietary cobalt supplements did not affect these parameters significantly, leading to the conclusion that these ruminal conditions did not impair vitamin B12-synthesis.

2. Microbial vitamin B12-synthesis The increase of the cobalt concentration in the ration from 0.17 mg/kg DM to 0.29 mg/kg DM resulted in significant different amounts of vitamin B12 reaching the duodenum. Assuming a recovery rate as found to be on average 89.6 ± 6.8% the efficiency of cobalt utilisation for ruminal vitamin B12-synthesis was calculated to be 7.5 ± 1.4% for the unsupplemented and 11.1 ± 3.2% for the supplemented ration. This difference proved to be statistically significant (p<0.05).

3. Vitamin B12-concentration in the serum The comparison of the cobalt levels of all cows used in the experiments with data from literature leads to the conclusion, that the cobalt supply was sufficient, as the various cobalt levels did not significantly affect vitamin B12-concentrations in the serum. However an increase of the vitamin B12-concentration was detected in the course of lactation for all dietary cobalt levels.

4. Cobalt- and vitamin B12-concentration in liver tissue The cobalt- and vitamin B12-concentration in the liver decreased in the course of lactation. However the experimental group showed a tendency towards higher values on experimental day 100 and 200. At calving this difference proved to be significant (0.51 ± 0,06 mg Vitamin B12/kg FW versus 0.64 ± 0,06 mg vitamin B12/kg FW).

5. Vitamin B12-concentration in milk

Dietary cobalt levels did not affect vitamin B12 concentration in milk. Only a marginal increase was detected in the course of lactation from 3.77 ± 1.41 to 4.75 ± 3.05 ng vitamin B12/ml for controls and from 3.66 ± 1.03 to 4.44 ± 0.96 ng vitamin B12/ml for the supplemented cows. Vitamin B12-concentrations in the colostrum were detected to be 4 to 6 times higher as compared to milk. Colostrum showed a tendency towards a

Summary

121

higher vitamin B12-concentration (21.0 ± 8.4 versus 16.7 ± 11.9 ng/ml) due to cobalt supplementation, but the results failed to reach significance.

6. Concentration of further parameters determined in the serum

Dietary cobalt supplements to the ration did not affect folic acid, iron, ß-hydroxic butyric acid, urea, total bilirubin and various liver specific enzymes, such AST, GLDH and γ-GT.

7. Dry matter intake

The cobalt supplements did not cause significant alterations in dry matter intake. 8. Milk yield and milk composition

In the period under study cobalt supplements did not significantly affect milk performance. The average FCM yield, calculated over the first 112 experimental days, amounts to 29.0 ± 5.2 kg for controls and 29.7 ± 5.7 kg or 28.7 ± 4.4 kg for the experimental groups (II and III) respectively. The same relations were found for the second part of the feeding trial. Fat, protein and lactose concentrations were also not affected by cobalt treatments.

9. Vitamin B12-concentration in the serum of calves

Cobalt supplements to the ration of pregnant cows did not result in increased vitamin B12-levels in the serum of their calves, before they received colostrum. After the intake of colostrum the vitamin B12-concentration in the serum of the calves increased in both groups (342 ± 162 vs. 361 ± 186 pg/ml) and decreased afterwards.

From the results it can be concluded that a cobalt content in the ration of 0.13 mg Co/kg DM seems to be sufficient. This value is lower as the GfE allowances of 0.20 mg Co/kg DM.

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Anhang

141

10 ANHANG

Anhang 1: Mittlere Kobalt-Gehalte ausgewählter Grund-Futtermittel (DLG, 1973; JEROCH et al., 1993) 143

Anhang 2: Zusammensetzung der Vitamin-Mineralstoffmischung für den Fistel- und Fütterungsversuch 143

Anhang 3: Zusammensetzung der Borsäure (NH3-Bestimmung im Pansensaft) nach VOIGT und STEGER (1967) 144

Anhang 4: Herstellung der Reagenzien zur Chrombestimmung in Darmsaft und Markersubstanz 144

Anhang 5: Zur Bestimmung von Glukose, Harnstoff, ß-Hydroxy-Buttersäure, Gesamtbilirubin und der leberspezifischen Enzyme AST, GLDH und γ-GT verwendete Tests 145

Anhang 6: Zeitlicher Verlauf des pH-Wertes im Pansen von fistulierten Milchkühen nach Fütterung einer Ration ohne bzw. mit Kobalt-Zulage (n=5; MW±SD) 146

Anhang 7: Zeitlicher Verlauf der NH3-Konzentration (mg/l) im Pansen von fistulierten Milchkühen nach Fütterung einer Ration ohne bzw. mit Kobalt-Zulage (n=5; MW±SD) 146

Anhang 8: Täglicher Trockensubstanzfluss am Duodenum (kg) der Versuchstiere im Fistelkuhversuch 147

Anhang 9: Referenzbereiche der im Fütterungsversuch ermittelten Blutparameter (nach SUTTLE 1986; STÖBER und GRÜNDER, 1991; SCHOLZ, 2001) 147

Anhang 10: Konzentrationen verschiedener Blutparameter bei 5 Milchkühen über 24 Stunden 148

Anhang 11: Gehalt an Fett, Eiweiß und Laktose im Versuchsverlauf (n=18; Versuchsdauer 112 Tage) bei unterschiedlicher Kobaltversorgung 152

Anhang 12: Vitamin B12-Konzentrationen (pg/ml) im Serum der Milchkühe bei unterschiedlicher Kobalt-Versorgung 155

Anhang 13: Mittlere Gehalte an Mengen- und Spurenelementen (mg/kg) in den verwendeten Futtermitteln 156

Anhang 14: Konzentrationen verschiedener Blutparameter im Serum von Milchkühen in Abhängigkeit von ihrer Kobalt-Versorgung mit fortschreitender Laktation (n=18; Versuchsdauer 112 Tage) 156

Anhang 15: Harnstoff-Konzentration (mmol/l) im Serum der Milchkühe in Abhängigkeit von der Co-Versorgung (n=18; MW ±SD) 157

Anhang 16: ß-HBS-Konzentration (mmol/l) im Serum der Milchkühe in Abhängigkeit von der Co-Versorgung (n=18; MW ±SD) 157

Anhang 17: Gesamtbilirubin-Konzentration (mmol/l) im Serum der Milchkühe in Abhängigkeit von der Co-Versorgung (n=18; MW ±SD) 158

Anhang

142

Anhang 18: AST-Konzentration (U/l) im Serum der Milchkühe in Abhängigkeit von der Co-Versorgung (n=18; MW ±SD) 158

Anhang 19: γ-GT-Konzentration (U/l) im Serum der Milchkühe in Abhängigkeit von der Co-Versorgung (n=18; MW ±SD) 158

Anhang 20: GLDH-Konzentration (U/l) im Serum der Milchkühe in Abhängigkeit von der Co-Versorgung (n=18; MW ±SD) 159

Anhang 21: Vitamin B12-Konzentrationen (mg/kg FS) im Lebergewebe der 8 Milchkühe bei unterschiedlicher Kobalt-Versorgung 159

Anhang 22: Vitamin B12-Konzentration (ng/ml) in Milch und Kolostrum 160

Anhang

143

Anhang 1: Mittlere Kobalt-Gehalte ausgewählter Grund-Futtermittel (DLG, 1973; JEROCH et al., 1993)

Futtermittel mg Co/kg T Grünfutter - frisch

Luzerne 1.Schnitt Luzerne 2. Schnitt Mais (Beginn Kolbenbildung) Mais (Teigreife) Wiese (1. Schnitt) Wiese (2. Schnitt)

0,19 0,25 0,10 0,04 0,07 – 0,09 0,12

Grünfutter - Silage Mais (Teigreife) Wiese (1. Schnitt)

0,09 0,10

Heu Luzerne (1. Schnitt) Luzerne (2. Schnitt) Wiese (1. Schnitt) Wiese (2. Schnitt)

0,15 – 0,19 0,17 0,06 – 0,18 0,15

Stroh Gerste Hafer Roggen Weizen

0,19 0,06 0,05 0,06

Anhang 2: Zusammensetzung der Vitamin-Mineralstoffmischung für den Fistel- und Fütterungsversuch

Rinder ADE 32 ohne Kobalt (DEUTSCHE VILOMIX) Inhaltsstoffe in % : Calcium 16 Natrium 10 Magnesium 3 Phosphor 8 Ca:P 2:1 Zusatzstoffe je kg : VitaminA 700.000 I.E. Vitamin D3 80.000 I.E. Vitamin E 400 mg Eisen 950 mg Kupfer 770 mg Mangan 4.000 mg Zink 6.000 mg Jod 50 mg Selen 50 mg

Anhang

144

Anhang 3: Zusammensetzung der Borsäure (NH3-Bestimmung im Pansensaft) nach VOIGT und STEGER (1967)

Chemikalien Menge H3BO3 5000 mg

Äthylalkohol 200 ml Bromkresolgrün 3,3 mg

Methylrot 6,6 mg Alkohol 10 ml

H2O bidest ad 1000 ml

Anhang 4: Herstellung der Reagenzien zur Chrombestimmung in Darmsaft und Markersubstanz

1. Phosphormangansulfatlösung - 7,579 g MnSo4 (Fa Merck 159265) in 100 ml bidest. Wasser lösen - von der Lösung 15 ml in einem 500 ml Kolben pipettieren und mit 85%iger

H3PO4 (Fa. Merck100552) auffüllen 2. Kaliumbromatlösung (4,5 %)

- 11,25 KBrO3 (Fa. Merck104904) in 250 ml bidest. Wasser lösen 3. Kalziumchlorid-Dihydrat-Lösung

- 29,344 g CaCl2 * 2 H2O (Fa. Merck 102382) in 2 l bidest. Wasser lösen

4. Blindlösung für Standards - 30 ml der Phosphormangansulfatlösung mit 40 ml Kaliumbromatlösung auf

der Heizplatte erhitzen und danach abkühlen lassen - vollständig in einen 2 l Kolben mit bidest. Wasser überspülen, 250 ml der

Calcium-Dihydrat-Lösung hinzugeben und auf 2 l auffüllen

5. Chromlösung (Stammlösung) für Standards - 2,8282 g K2Cr2O7 in einem 1 l Kolben lösen und mit bidest. Wasser auf 1 l

auffüllen

Anhang

145

Anhang 5: Zur Bestimmung von Glukose, Harnstoff, ß-Hydroxy-Buttersäure, Gesamtbilirubin und der leberspezifischen Enzyme AST, GLDH und γ-GT verwendete Tests

Im nachfolgenden werden die für die einzelnen Parameter verwendeten Tests mit ihrem jeweiligen Testprinzip genannt.

• Glukose (Fa. Roche; Glucose-GDH-Methode; Art. 0736716)

ß-D-Glukose + NAD+ + H2O GDH→ D-Glukonat + NADH + H+

Die photometrisch gemessene Konzentration des gebildeten NADH ist direkt proportional zur Glukosekonzentration.

• Harnstoff (Fa. Roche; Harnstoff; Art. 0736864)

Harnstoff + 2 H2O Urease→ 2 NH4+ + HCO3

- NH4

+ + 2 Oxoglutarat + NADH ←GLDH→ L-Glutamat + NAD+ + H2O Die photometrisch gemessene Abnahme der NADH-Konzentration ist direkt proportional zur Harnstoffkonzentration.

• ß-Hydroxy-Buttersäure (Fa. Randox; Ranbut; RB 1007)

D-3-Hydroxybutyrat + NAD+ Hydroxybutyrat-Dehydrogenase→ Acetoacetat + H+ + NADH Die Absorptionsänderung durch Reduktion von NAD+ zu NADH korreliert direkt mit der ß-Hydroxybuttersäure-Konzentration in der Probe.

• Gesamtbilirubin (Fa.Roche; Bilirubin Test; Art. 0710032)

Bilirubin wird mit 4-Sulfobenzoldiazoniumchlorid zum roten Azobilirubin gekoppelt. Die photometrisch gemessene Farbintensität ist direkt proportional zur Bilirubinkonzentration.

• AST (Fa. Roche; AST; Art. 0736422)

L-Aspartat + 2-Oxoglutarat ←AST→ L-Glutamat + Oxalacetat Oxalacetat + NADH + H+ ←MDH→ L-Malat + NAD+

Die photometrisch gemessene Geschwindigkeit der Oxidation von NADH ist direkt proportional zur AST-Aktivität.

Anhang

146

Fortsetzung Anhang 5: • GLDH (Fa. Boehringer ; GLDH; 124311)

α-Oxoglutarat + NADH + H+ ←GLDH→ Glutamat + NAD+ + H2O

Die photometrisch gemessene Geschwindigkeit der Oxidation von NADH ist direkt proportional zur GLDH-Aktivität.

• γ-GT (Fa. Nobis; γ-GT; Art. 030561)

L-γ-Glutamyl-3-carboxy-4-nitroanilid + Glycylglycin

↓ γ-GT L-γ-Glutamyl-glycylglycin + 5-Amino-2-nitrobenzoat

Die Aktivität der γ-GT berechnet sich wie folgt: γ-GT (U/l)= Mittelwerte der Extraktionsdifferenz pro Minute * 1158

Anhang 6: Zeitlicher Verlauf des pH-Wertes im Pansen von fistulierten Milchkühen nach Fütterung einer Ration ohne bzw. mit Kobalt-Zulage (n=5; MW±SD)

Minuten nach Beginn der Morgenfütterung

Ration ohne Co-Zulage (Kontrollgruppe)

Ration mit Co-Zulage (Co-suppl.)

0 6,61 ± 0,11 6,64 ± 0,15 30 6,20 ± 0,11 6,27 ± 0,16 60 5,99 ± 0,12 6,07 ± 0,22 90 5,95 ± 0,09 6,01 ± 0,24

120 5,97 ± 0,11 6,06 ± 0,29 180 6,02 ± 0,12 6,01 ± 0,37 300 6,03 ± 0,17 6,10 ± 0,32

Anhang 7: Zeitlicher Verlauf der NH3-Konzentration (mg/l) im Pansen von fistulierten Milchkühen nach Fütterung einer Ration ohne bzw. mit Kobalt-Zulage (n=5; MW±SD)

Minuten nach Beginn der Morgenfütterung

Ration ohne Co-Zulage (Kontrollgruppe)

Ration mit Co-Zulage (Co-suppl.)

0 90,3 ± 17,2 83,9 ± 13,6 30 146,2 ± 11,6 158,3 ± 50,2 60 187,1 ± 41,4 209,0 ± 41,0 90 197,8 ± 59,0 218,5 ± 63,9

120 228,7 ± 41,4 241,8 ± 78,4 180 214,3 ± 41,8 242,5 ± 74,8 300 129,9 ± 20,6 169,1 ± 71,9

Anhang

147

Anhang 8: Täglicher Trockensubstanzfluss am Duodenum (kg) der Versuchstiere im Fistelkuhversuch

Anhang 9: Referenzbereiche der im Fütterungsversuch ermittelten Blutparameter (nach SUTTLE 1986; STÖBER und GRÜNDER, 1991; SCHOLZ, 2001)

Parameter Referenzbereich Vitamin B12 > 100 pg/ml

Folsäure 7 – 19 ng/ml Eisen 20- 40 µmol/l

Glucose 3,3 – 4,4 mmol/l ß-Hydroxy-Buttersäure < 1 mmol/l

Harnstoff 1,7 – 7,5 mmol/l Gesamtbilirubin 0,9 – 7,0 µmol/l

AST 10 – 50 U/l γ-GT 7 – 14 U/l

GLDH 1,0 – 8,0 U/l

Ration

Periode I Co-arm Evelyn

Co-arm Romke

Co-arm Leisa

Co-reich Sanara

Co-reich Ulane

25.09.2000 10,46 8,59 8,84 7,82 9,18 26.09.2000 6,73 7,69 7,87 6,41 8,34 27.09.2000 7,47 7,75 7,64 6,66 8,19 28.09.2000 8,18 6,90 8,47 6,47 7,53 29.09.2000 8,04 7,35 7,40 6,52 8,69 MW ± SD 8,17 ± 1,40 7,66 ± 0,62 8,05 ± 0,60 6,78 ± 0,59 8,39 ± 0,61

Ration

Periode II Co-reich Evelyn

Co-reich Romke

Co-reich Leisa

Co-arm Sanara

Co-arm Ulane

16.10.2000 9,35 8,68 7,86 6,81 8,21 17.10.2000 7,41 7,06 8,52 6,11 8,15 18.10.2000 8,18 6,57 7,27 6,27 7,62 19.10.2000 6,46 6,47 7,27 6,23 7,85 20.10.2000 7,01 6,66 7,59 5,81 7,35 MW ± SD 7,68 ± 1,12 7,09 ± 0,92 7,70 ± 0,52 6,25 ± 0,36 7,84 ± 0,36

Anhang

148

Anhang 10: Konzentrationen verschiedener Blutparameter bei 5 Milchkühen über 24 Stunden

Vitamin B12

0

50

100

150

200

250

09.00 12.00 15.00 18.00 21.00 24.00 03.00 06.00 09.00

Uhrzeit

pg/m

l

140

704

705

713

715

Folsäure

02468

101214161820

09.00 12.00 15.00 18.00 21.00 24.00 03.00 06.00 09.00

Uhrzeit

ng/m

l

140704705713715

Eisen

0,05,0

10,015,020,025,030,035,040,045,050,0

09.00 12.00 15.00 18.00 21.00 24.00 03.00 06.00 09.00

Uhrzeit

µmol

/l

140704705713715

Anhang

149

Fortsetzung Anhang 10:

Glucose

3

3,2

3,4

3,6

3,8

4

4,2

4,4

09.00 12.00 15.00 18.00 21.00 24.00 03.00 06.00 09.00

Uhrzeit

mm

ol/l

140704705713715

ß-HBS

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

09.00 12.00 15.00 18.00 21.00 24.00 03.00 06.00 09.00

Uhrzeit

mm

ol/l

140704705713715

Harnstoff

2,002,202,402,602,803,003,203,403,603,80

09.00 12.00 15.00 18.00 21.00 24.00 03.00 06.00 09.00

Uhrzeit

mm

ol/l

140704705713715

Anhang

150

Fortsetzung Anhang 10:

Gesamtbilirubin

1,31,51,71,92,12,32,52,72,93,13,3

09.00 12.00 15.00 18.00 21.00 24.00 03.00 06.00 09.00Uhrzeit

µmol

/l140704705713715

AST

05

10152025303540

09.00 12.00 15.00 18.00 21.00 24.00 03.00 06.00 09.00

Uhrzeit

U/L 140

704705713715

gGT

0

5

10

15

20

25

09.00 12.00 15.00 18.00 21.00 24.00 03.00 06.00 09.00

Uhrzeit

U/l

140704705713715

Anhang

151

Fortsetzung Anhang 10:

GLDH

0

24

6

8

1012

14

09.00 12.00 15.00 18.00 21.00 24.00 03.00 06.00 09.00

Uhrzeit

U/l

140704705713715

Anhang

152

Anhang 11: Gehalt an Fett, Eiweiß und Laktose im Versuchsverlauf (n=18; Versuchsdauer 112 Tage) bei unterschiedlicher Kobaltversorgung

Anhang

153

Fortsetzung Anhang 11:

Anhang

154

Fortsetzung Anhang 11:

Anhang

155

Anhang 12: Vitamin B12-Konzentrationen (pg/ml) im Serum der Milchkühe bei unterschiedlicher Kobaltversorgung

Versuchstag Tier-Nr 0 2 7 9 14 21 28 42 56 84 112

526 126 121 150 112 153 151 135 147 142 169 176 682 149 126 124 110 182 145 143 156 162 146 204 683 138 122 119 121 131 163 171 168 132 152 184 273 138 132 129 149 174 195 198 207 179 223 224 444 161 143 176 157 201 210 184 186 195 174 222 464 212 249 201 192 179 177 310 207 193 192 244 244 250 229 185 181 202 186 210 215 154 197 182 623 248 220 221 205 217 269 257 250 205 212 256 332 136 153 135 157 151 181 170 135 181 144 192 534 184 192 190 199 238 224 197 203 252 179 253 661 173 146 132 157 164 147 164 168 181 165 215 680 125 121 132 152 160 168 154 162 190 166 217 113 173 161 138 148 180 187 175 184 177 163 223 687 139 145 142 126 162 157 174 167 132 151 179 556 182 213 196 200 191 217 205 178 176 195 226 417 174 206 185 161 194 185 202 177 181 147 210 668 168 191 168 158 184 169 177 156 176 209 175 418 187 150 206 185 175 192 191 160 203 193 208

Gru

ppe

I

MW ± SD 170 ± 38 168 ± 42 163 ± 33 159 ± 30 180 ± 25 185 ± 31 190 ± 41 179 ± 28 178 ± 29 177 ± 25 211 ± 26 Versuchstag Tier-Nr. 0 2 7 9 14 21 28 42 56 84 112

651 91 117 118 103 145 154 173 154 128 150 202 679 170 176 178 159 169 215 161 184 169 231 322 555 192 226 199 218 223 235 228 241 216 234 289 676 164 144 153 154 192 191 176 280 238 180 233 353 111 99 140 143 140 139 133 139 165 - - 542 151 156 155 166 239 165 192 190 168 228 245 422 145 230 143 120 159 130 134 173 125 152 234 249 141 130 189 139 160 159 177 182 160 186 226 516 167 165 155 125 160 163 163 178 164 181 223 557 177 169 141 145 186 188 186 184 161 206 197 645 140 133 147 174 179 182 218 183 171 161 190 677 135 187 211 120 158 179 168 161 129 133 156 613 195 172 132 175 200 179 178 183 194 198 230 689 172 126 184 137 172 156 182 197 174 173 232 656 176 221 165 167 160 163 170 195 172 185 212 440 121 113 114 144 164 124 159 190 217 150 205 426 125 128 104 119 148 141 173 150 146 130 175 312 199 223 232 195 187 188 221 191 187 169 194

Gru

ppe

II

MW ± SD 154 ± 30 162 ± 42 159 ±3 4 150 ± 29 175 ± 26 170 ± 29 177 ± 26 186 ± 32 171 ± 31 179 ± 32 221 ± 40 Versuchstag Tier-Nr. 0 2 7 9 14 21 28 42 56 84 112

709 101 147 133 122 153 135 163 189 167 172 206 640 132 133 121 157 179 217 188 188 154 190 214 405 130 120 136 144 158 171 174 164 154 202 235 684 102 135 135 138 186 199 179 175 188 188 227 920 190 222 218 184 199 190 182 299 218 216 282 620 159 171 225 212 266 207 234 164 233 347 316 441 158 142 175 161 193 241 197 196 194 184 237 471 166 128 129 112 167 179 176 162 151 140 215 628 180 185 221 159 191 169 208 196 176 175 217 717 173 169 132 143 122 184 198 158 179 167 190 271 157 167 186 160 178 173 211 186 173 182 197 665 134 139 112 109 135 174 179 243 161 169 181 652 176 153 182 161 182 185 216 198 180 225 203 238 163 182 190 204 167 197 224 203 199 199 262 438 171 131 151 165 152 168 223 181 225 221 228 166 160 166 155 148 140 176 206 254 182 208 245 625 194 162 204 199 214 226 203 175 192 180 238 446 134 117 158 183 142 178 172 140 186 138 187

Gru

ppe

III

MW ± SD 154 ± 27 154 ± 27 165 ± 37 159 ± 30 174 ± 34 187 ± 25 196 ± 21 193 ± 39 184 ± 24 195 ± 45 227 ± 35

Anhang

156

Anhang 13: Mittlere Gehalte an Mengen- und Spurenelementen (mg/kg) in den verwendeten Futtermitteln

Grassilage Kraftfutter 23 28a 29 17 28n I II III IV

Ca 5552 4805 4855 3010 6764 29917 29740 26650 9784 P 5270 3432 3702 4470 3546 16319 16426 14865 6107 K 30343 24110 26867 33243 27800 9577 9320 9607 4088 Na 950 1066 780 153 2000 12360 12625 11280 9406 Mg 1932 1425 1529 1954 2288 5760 6031 5861 3123 S 1190 1177 923 831 2038 1121 1077 1143 596 Fe 349 473 412 477 298 310 349 298 208 Mn 82 63 65 81 64 688 689 666 164 Zn 49 31 35 47 37 945 1049 951 215 Cu 9,64 6,31 6,94 8,39 7,75 120 117 111 37,6 Mo 1,79 1,43 1,97 2,45 0,98 2,81 3,07 2,78 1,72

Anhang 14: Konzentrationen verschiedener Blutparameter im Serum von Milchkühen in Abhängigkeit von ihrer Kobalt-Versorgung mit fortschreitender Laktation (n=18; Versuchsdauer 112 Tage)

Eisen

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 112

Versuchstag

µmol

/l

Gruppe IGruppe IIGruppe III

Folsäure

0,02,04,06,08,0

10,012,014,016,018,020,0

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 112

Versuchstag

ng/m

l

Gruppe IGruppe IIGruppe III

Anhang

157

Fortsetzung Anhang 14:

Glucose

2,002,202,402,602,803,003,203,403,603,804,00

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98 105 112

Versuchstag

mm

ol/l

Gruppe IGruppe IIGruppe III

Anhang 15: Harnstoff-Konzentration (mmol/l) im Serum der Milchkühe in Abhängigkeit von der Kobaltversorgung (n=18; MW ±SD)

Gruppe I Gruppe II Gruppe III Versuchstag

0 3,42 ± 0,43 3,61 ±1,04 3,53 ± 0,71 2 3,49 ± 0,62 3,31 ± 0,81 3,43 ± 0,58 7 3,72 ± 0,63 3,65 ± 0,98 3,50 ± 0,69 9 3,36 ± 0,82 3,43 ± 0,97 3,37 ± 0,52 14 3,77 ± 0,75 3,68 ± 1,11 3,41 ± 0,69 21 3,69 ± 0,88 3,54 ± 0,68 3,45 ± 0,52 28 3,22 ± 0,69 3,33 ± 0,76 3,44 ± 0,65 42 4,47 ± 0,89 4,41 ± 1,04 4,03 ± 0,84 56 3,84 ± 0,70 3,65 ± 0,74 3,83 ± 0,66 84 5,14 ± 0,74 4,97 ± 0,69 4,49 ± 0,70 112 3,75 ± 0,65 4,21 ± 1,26 3,56 ± 0,76

Anhang 16: ß-HBS-Konzentration (mmol/l) im Serum der Milchkühe in Abhängigkeit von der Kobaltversorgung (n=18; MW ±SD)

Gruppe I Gruppe II Gruppe III Versuchstag

0 0,96 ± 0,34 1,21 ± 1,15 0,91 ± 0,31 2 0,66 ± 0,26 0,82 ± 0,58 0,73 ± 0,20 7 0,69 ± 0,22 0,89 ± 0,31 0,78 ± 0,24 9 0,63 ± 0,17 0,79 ± 0,30 0,71 ± 0,15 14 0,70 ± 0,22 0,71 ± 0,18 0,75 ± 0,28 21 0,69 ± 0,22 0,64 ± 0,21 0,61 ± 0,14 28 0,68 ± 0,18 0,71 ± 0,20 0,72 ± 0,21 42 0,77 ± 0,23 0,83 ± 0,30 0,78 ± 0,12 56 0,59 ± 0,15 0,67 ± 0,21 0,56 ± 0,15 84 0,65 ± 0,20 0,66 ± 0,20 0,57 ± 0,14 112 0,59 ± 0,14 0,66 ± 0,21 0,66 ± 0,20

Anhang

158

Anhang 17: Gesamtbilirubin-Konzentration (mmol/l) im Serum der Milchkühe in Abhängigkeit von der Kobaltversorgung (n=18; MW ±SD)

Gruppe I Gruppe II Gruppe III Versuchstag

0 3,23 ± 1,07 3,13 ± 1,14 2,77 ± 1,28 2 3,40 ± 0,88 3,41 ± 1,30 3,19 ± 1,01 7 0,10 ± 1,02 3,15 ± 0,94 2,79 ± 1,02 9 3,06 ± 0,70 3,07 ± 0,99 2,69 ± 1,08 14 3,47 ± 0,75 3,38 ± 0,96 2,92 ± 1,04 21 2,81 ± 0,95 2,41 ± 0,81 2,53 ± 0,84 28 3,50 ± 1,07 3,23 ± 0,78 3,05 ± 0,85 42 2,58 ± 0,62 2,70 ± 0,93 2,19 ± 0,71 56 2,12 ± 0,72 2,18 ± 0,66 2,07 ± 0,53 84 3,09 ± 0,59 3,16 ± 0,38 3,15 ± 0,69 112 3,36 ± 0,57 3,38 ± 0,76 3,24 ± 0,40

Anhang 18: AST-Konzentration (U/l) im Serum der Milchkühe in Abhängigkeit von der Kobaltversorgung (n=18; MW ±SD)

Gruppe I Gruppe II Gruppe III Versuchstag

0 40,9 ± 13,6 38,7 ± 14,4 37,1 ± 12,5 2 39,1 ± 11,6 36,9 ± 14,2 37,4 ± 13,1 7 37,5 ± 10,5 37,2 ± 13,6 37,3 ± 13,6 9 36,6 ± 11,2 36,1 ± 13,5 35,6 ± 12,9 14 39,4 ± 13,7 38,1 ± 15,7 36,2 ± 13,9 21 37,6 ± 13,9 36,8 ± 15,8 35,7 ± 14,3 28 37,7 ± 13,6 36,8 ± 14,0 36,3 ± 13,0 42 38,6 ± 15,3 36,7 ± 15,7 37,9 ± 14,0 56 40,8 ± 17,0 37,4 ± 17,0 37,2 ± 13,5 84 40,3 ± 17,4 34,9 ± 10,2 37,6 ± 15,6 112 46,2 ± 23,9 37,5 ± 12,2 42,2 ± 18,3

Anhang 19: γ-GT-Konzentration (U/l) im Serum der Milchkühe in Abhängigkeit von der Kobaltversorgung (n=18; MW ±SD)

Gruppe I Gruppe II Gruppe III Versuchstag

0 13,3 ± 3,0 13,4 ± 2,4 13,0 ± 2,2 2 15,9 ± 3,5 15,3 ± 4,1 15,6 ± 3,5 7 14,2 ± 3,2 13,7 ± 4,4 13,3 ± 2,9 9 13,1 ± 2,5 14,0 ± 3,9 13,2 ± 2,4 14 14,4 ± 3,0 13,8 ± 4,7 13,1 ± 2,5 21 15,0 ± 4,0 14,6 ± 4,2 14,7 ± 3,0 28 12,5 ± 2,5 12,1 ± 4,2 12,2 ± 2,4 42 15,1 ± 2,4 16,9 ± 4,4 14,5 ± 3,7 56 12,9 ± 2,8 14,2 ± 6,2 12,5 ± 2,3 84 17,1 ± 2,5 17,4 ± 4,6 17,2 ± 3,3 112 16,6 ± 4,8 16,9 ± 5,2 17,1 ± 4,1

Anhang

159

Anhang 20: GLDH-Konzentration (U/l) im Serum der Milchkühe in Abhängigkeit von der Kobaltversorgung (n=18; MW ±SD)

Gruppe I Gruppe II Gruppe III Versuchstag

0 9,37 ± 6,12 8,96 ± 6,55 7,91 ± 3,38 2 6,38 ± 2,79 6,10 ± 3,42 6,23 ± 2,74 7 7,43 ± 3,33 9,34 ± 7,10 7,49 ± 2,96 9 7,64 ± 3,41 8,73 ± 6,55 7,50 ± 2,49 14 8,22 ± 6,26 8,56 ± 6,58 6,91 ± 3,18 21 8,48 ± 4,44 9,55 ± 7,00 9,24 ± 3,68 28 8,14 ± 3,30 8,80 ± 5,48 7,53 ± 2,79 42 9,34 ± 5,53 9,28 ± 6,75 9,07 ± 6,26 56 10,66 ± 5,83 10,19 ± 7,10 9,52 ± 4,07 84 11,03 ± 6,03 10,20 ± 4,72 9,74 ± 5,88 112 11,67 ± 6,51 10,36 ± 5,07 10,92 ± 6,13

Anhang 21: Vitamin B12-Konzentrationen (mg/kg FS) im Lebergewebe der 8 Milchkühe bei unterschiedlicher Kobaltversorgung

Tag 100 Tag 200 Abkalbung 417 0,56 0,47 0,43 418 0,67 0,69 0,45 556 0,74 0,71 0,56 687 0,59 0,60 0,58 G

rupp

e I

MW ± SD 0,64 ± 0,08 0,62 ± 0,11 0,51 ± 0,08 438 0,70 0,70 0,54 446 0,74 0,74 0,71 652 0,80 0,62 0,68 665 0,75 0,74 0,65 G

rupp

e II

I

MW ± SD 0,75 ± 0,04 0,70 ± 0,06 0,64 ± 0,07

Anhang

160

Anhang 22: Vitamin B12-Konzentration (ng/ml) in Milch und Kolostrum

Milch Kolostrum Tier-Nr. Versuchstag 0 Versuchstag 220 Versuchstag 280

113 1,70 6,78 46,5 244 3,43 1,78 11,3 273 3,55 2,40 6,89 417 3,20 9,25 8,90 418 6,08 10,5 12,4 444 4,84 3,91 24,0 556 2,52 3,67 14,4 623 5,32 3,85 14,7 682 4,66 2,46 20,8

Gru

ppe

I

687 2,45 2,88 7,03 MW ± SD 3,77 ± 1,41 4,75 ± 3,05 16,7 ± 11,9

405 3,15 6,27 29,3 438 5,01 3,70 12,8 441 2,95 5,62 24,0 446 4,67 3,53 20,2 471 2,62 4,72 9,69 628 3,75 3,68 18,1 640 1,85 3,40 34,1 652 4,90 4,02 21,2 665 3,95 4,61 10,8

Gru

ppe

III

717 3,78 4,84 29,7 MW ± SD 3,66 ± 1,03 4,44 ± 0,96 21,0 ± 8,4

Danksagung

161

DANKSAGUNG Ich danke den Herren Prof. Dr. H. Scholz und Prof. Dr. G. Flachowsky für die Überlassung des Themas und die gewährten Arbeitsmöglichkeiten am Institut für Tierernährung der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) in Braunschweig sowie für die Betreuung der Arbeit in Braunschweig und Hannover. Mein besonderer Dank gilt den Herren Dr. U. Meyer und Dr. P. Lebzien für die Unterstützung bei der Planung, Durchführung und Auswertung der Versuche. Ihnen danke ich weiterhin für die intensiven Diskussionen und hilfreichen Tipps zum Gelingen der vorliegenden Arbeit. Ein großes Dankeschön gilt allen, die während der fast einjährigen Versuchsphase die Tiere versorgt und betreut und mir jederzeit hilfreich zur Seite gestanden haben. Den Damen und Herren im Labor des Instituts für Tierernährung in Braunschweig sowie allen Mitarbeitern des Klinischen Labors in der Klinik für Rinderkrankheiten danke ich für ihre stete Hilfsbereitschaft bei den umfangreichen Analysen. Bei Herrn Dr. H. Böhme möchte ich mich nicht nur für die Hilfe bei der Erstellung der englischen Zusammenfassung bedanken. Für die Unterstützung bei der statistischen Auswertung der Versuchsergebnisse danke ich Herrn D.-D. Strauß. Weiterhin gilt mein Dank allen Mitarbeitern und Doktoranden, die mir während der Darmsaftsammlung geholfen haben. Sabine Hartinger, Katrin Kuhrmeier und Jacqueline Felix gilt ein ganz liebes Dankeschön für die aufmunternden Worte vor allem in Krisenzeiten. Der Satz: „Du schaffst das schon.“ hat mir so manches Mal geholfen. Meiner Familie danke ich für die Unterstützung auf meinem bisherigen Lebensweg und für das Verständnis während der Fertigstellung der Arbeit. Schließlich möchte ich noch all jenen danken, die mich in meiner Arbeit unterstützt und mir allzeit mit Rat und Tat zur Seite gestanden haben. Hierbei denke ich vor allem an Senta, deren „Telefonseelsorge“ nicht nur in der letzten Zeit häufiger notwendig war. Der H. WILHELM SCHAUMANN-Stiftung danke ich für die finanzielle Unterstützung der Arbeit.