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Tierärzliche Hochschule Hannover
Institut für Parasitologie, Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung
Untersuchungen zu Übertragungswegen der Koi-Herpesvirose (KHV) in
Wildfischen
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
-Doctor rerum naturalium-
(Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Marc Fabian
aus Hannover
Hannover 2015
Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Dieter Steinhagen
Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung
Zentrum für Infektionsmedizin
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Dieter Steinhagen
2. Gutachter: Univ. Prof. Dr. Georg Herrler
Tag der mündlichen Prüfung: 17.02.2016
Die Bearbeitung des Forschungsvorhabens erfolgte im Auftrag des Sächsischen Landesamts
für Umwelt, Landwirtschaft und Geologie. Das Vorhaben wurde aus Mitteln des
Europäischen Fischereifonds gemäß Verordnung (EG) 1198/2006 gefördert.
Für meine Familie
-In Liebe und Dankbarkeit-
Auf den Daten dieser Dissertation basierend wurden folgende Artikel in internationalen Fachzeitschriften publiziert: Fabian M, Baumer A, Steinhagen D. (2013) Do wild fish species contribute to the transmission of koi herpesvirus (KHV) to carp in hatchery ponds? Journal of Fish Diseases 36: 505-514 (DOI: 10.1111/jfd.12016) und
Fabian M, Baumer A, Adamek M, Steinhagen D. (2015) Short communication: Transmission of Cyprinid herpesvirus 3 by wild fish species - results from infection experiments. Journal of Fish Diseases (on-line, doi: 10.1111/jfd.12399)
Des Weiteren wurden Teile dieser Arbeit bereits in folgender Schriftenreihe veröffentlicht:
Füllner G, Steinhagen D, Baumer A, Fabian M, Runge M, Bräuer G, Böttcher K, Mohr K, Göbel S, Neumann E, Thiem A, Gahsche J, Striese M, Teufert S (2011) Untersuchung zu Infektionswegen der Koi-Herpesvirus-Erkrankung von Karpfen und Untersuchungen zur Auswirkung von KHV-Bekämpfungsmaßnahmen auf Ökonomie und Ökologie. Schriftenreihe: LfULG, Heft 34/2011, ISSN: 1867-2868
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG ................................................................................................... 19
2 LITERATURÜBERSICHT.............................................................................. 23
2.1 Charakterisierung des KHV ............................................................................ 23
2.1.1 Systematische Stellung........................................................................................ 23
2.1.2 Morphologie ........................................................................................................ 23
2.1.3 Molekulare Struktur ............................................................................................ 24
2.1.3.1 Genom.......................................................................................................................................... 24
2.1.3.2 Proteom........................................................................................................................................ 25
2.1.3.3 In vitro Replikation ...................................................................................................................... 25
2.2 Krankheitsmuster und Wirtsfaktoren ............................................................ 26
2.2.1 Pathogenese......................................................................................................... 26
2.2.2 Klinische Symptomatik ....................................................................................... 28
2.2.3 Empfänglichkeit .................................................................................................. 29
2.2.3.1 Übertragung und Vektoren........................................................................................................... 30
2.2.4 Wirtsspektrum ..................................................................................................... 31
2.2.5 Einfluss der Temperatur und Inkubationszeit .....................................................34
2.2.6 Latenz .................................................................................................................. 35
2.3 Geschichte, Verbreitung und Epidemiologie des KHV ................................. 36
2.3.1 Geschichte ........................................................................................................... 36
2.3.2 Globale Verbreitung............................................................................................ 37
2.3.3 Nationale Verbreitung......................................................................................... 38
2.3.4 Epidemiologie ..................................................................................................... 38
2.3.5 Molekulare Epidemiologie.................................................................................. 39
2.4 Therapie, Kontrolle und Prophylaxe............................................................... 40
2.5 Tenazität und Desinfektion .............................................................................. 41
2.6 Diagnostik von KHV......................................................................................... 42
2.6.1 PCR ..................................................................................................................... 43
2.6.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ............................................... 43
2.6.3 Zellkultur............................................................................................................. 44
2.6.4 Elektronenmikroskopie ....................................................................................... 45
2.7 Differentialdiagnose .......................................................................................... 45
2.8 Rechtslage .......................................................................................................... 45
3 MATERIAL UND METHODEN .................................................................... 47
3.1 Virus ................................................................................................................... 47
3.1.1 Herkunft .............................................................................................................. 47
3.1.2 Zellkultur............................................................................................................. 47
3.1.3 Virusvermehrung................................................................................................. 48
3.1.4 Virustitration ....................................................................................................... 48
3.2 Versuchstiere ..................................................................................................... 49
3.2.1 SPF-Fische .......................................................................................................... 49
3.2.2 Aufzucht und Haltung ......................................................................................... 50
3.2.3 Handling .............................................................................................................. 50
3.2.4 Narkose und Tötung............................................................................................ 50
3.2.5 Entnahme von Gewebeproben bei Karpfen ........................................................ 51
3.2.5.1 Gewebeproben für DNA-Extraktion ............................................................................................ 51
3.2.5.2 Gewebeproben für RNA-Extraktion ............................................................................................ 51
3.2.6 Laborinfektion zur Prüfung der Empfänglichkeit von Karpfen für das KHV .... 52
3.3 Wildfische........................................................................................................... 52
3.3.1 Fang und Transport von Wildfischen.................................................................. 52
3.3.2 Auswahl und Haltung von Wildfischen für die Laborinfektionsversuche.......... 53
3.3.3 Entnahme von Gewebeproben bei Wildfischen .................................................. 53
3.3.3.1 Gewebeproben für DNA-Extraktion ............................................................................................ 53
3.3.3.2 Gewebeproben für RNA-Extraktion ............................................................................................ 53
3.4 Felduntersuchungen.......................................................................................... 54
3.4.1 Arbeitsplan in der Feldstudie .............................................................................. 54
3.4.1.1 Wildfische aus der Biozönose der Teiche .................................................................................... 56
3.4.1.2 Wildfische aus Teichen mit akutem KHV-Geschehen................................................................. 57
3.4.1.3 Wildfische aus Ablaufgräben von Teichen mit akutem KHV-Geschehen................................... 57
3.4.1.4 Wildfische aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen............................................................... 58 3.4.1.4.1 Kohabitation von Wildfischen aus latent infizierten Teichen mit SPF-Karpfen ........................................... 59 3.4.1.5 Wildfische aus Teich und Ablauf mit saniertem Bestand ............................................................ 60
3.5 Laborinfektion von Wildfischen ...................................................................... 61
3.5.1 Infektionsversuch 1 (Badinfektion)..................................................................... 61
3.5.2 Infektionsversuch 2 (Kohabitation)..................................................................... 63
3.6 Molekularbiologische Methoden...................................................................... 65
3.6.1 Zellkulturen ......................................................................................................... 65
3.6.2 Gewebeproben..................................................................................................... 65
3.6.3 DNA-Extraktion mittels QIAamp® DNA Mini-Kit (Qiagen, Hilden) ................ 65
3.6.4 RNA-Extraktion mittels peqGOLD TriFast Reagenz ......................................... 66
3.6.5 Reverse Transkription mittels Maxima™ Reverse Transcriptase....................... 68
3.6.6 Real-time PCR..................................................................................................... 69
3.6.6.1 SYBR Green real-time PCR zur relativen Quantifizierung für das Thymidinkinase-Gen
(ADAMEK et al. 2012) mittels Housekeeping Gene (FORLENZA et al. 2008)........................ 70
3.6.6.2 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung der KHV-Replikation unter Verwendung
des Thymidinkinase-Gens (ADAMEK et al. 2012) mit externem Standard ............................... 72
3.6.6.3 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung des Gens kodierend für das Major Capsid
Protein-Gen (ORF92) des KHV (ADAMEK et al. 2012) mit externem Standard zum Nachweis
einer KHV-Replikation ................................................................................................................ 73
3.6.6.4 SYBR Green real-time PCR zur Qualitätskontrolle der TaqMan real-time PCR nach GILAD et
al. (2004) mittels Capsid Triplex Protein-Gen (ORF72)............................................................. 73
3.6.7 Quantitative real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis von KHV .
............................................................................................................................. 74
3.6.7.1 Berechnung der Kopienzahl des Plasmids, Erstellen der Standardkurve und Datenanalyse....... 76
3.6.8 Klonierung des PCR-Produktes für einen externen Standard ............................. 77
3.6.8.1 Endpunkt-PCR ............................................................................................................................. 77
3.6.8.2 Agarosegelelektrophorese und Aufreinigung der PCR-Produkte ................................................ 78
3.6.8.3 Vektor .......................................................................................................................................... 79
3.6.8.4 Ligation........................................................................................................................................ 80
3.6.8.5 Transformation............................................................................................................................. 80
3.6.8.6 Plasmidpräparation....................................................................................................................... 81
3.6.8.7 Plasmidverdau mit FastDigest® EcoRI (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) ................................. 82
3.6.8.8 Sequenzierung.............................................................................................................................. 82
3.7 Statistische Auswertung.................................................................................... 83
4 ERGEBNISSE ................................................................................................... 84
4.1 Methodik ............................................................................................................ 84
4.1.1 Quantitative real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis von KHV .
............................................................................................................................. 84
4.1.1.1 Klonierung der KHV-Zielsequenz ............................................................................................... 84
4.1.1.2 Standardkurve für das KHV-Plasmid........................................................................................... 84
4.1.1.3 Sequenzierung.............................................................................................................................. 86
4.1.2 SYBR Green real-time PCR zur relativen Quantifizierung für das
Thymidinkinase-Gen (ADAMEK et al. 2012) mittels Housekeeping Gene
(FORLENZA et al. 2008).................................................................................... 86
4.1.3 SYBR Green real-time PCR zur Qualitätskontrolle der TaqMan real-time PCR
nach GILAD et al. (2004) mittels Capsid Triplex Protein-Gen (ORF72)........... 86
4.1.4 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung der KHV-Replikation unter
Verwendung des Thymidinkinase-Gens (ADAMEK et al. 2012) mit externen
Standard............................................................................................................... 87
4.1.4.1 Klonierung der Thymidinkinase-Zielsequenz .............................................................................. 87
4.1.4.2 Standardkurve für das Thymidinkinase-Plasmids........................................................................ 87
4.1.5 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung des Gens kodierend für das
Major Capsid Protein-Gen (ORF92) des KHV (ADAMEK et al. 2012) mit
externem Standard zum Nachweis einer KHV-Replikation ............................... 90
4.1.5.1 Klonierung der Major Capsid Protein-Zielsequenz...................................................................... 90
4.1.5.2 Standardkurve für das Major Capsid Protein-Plasmid ................................................................. 90
4.1.6 Laborinfektion zur Prüfung der Empfänglichkeit von Karpfen für das KHV .... 93
4.2 Ergebnisse der Felduntersuchungen ............................................................... 94
4.2.1 Proben aus Teichen mit akutem KHV-Geschehen............................................ 100
4.2.1.1 Pathologisch-anatomische Untersuchungen der den Teichen entnommenen Wildfische ......... 100
4.2.1.2 Molekularbiologische Untersuchungen...................................................................................... 100
4.2.2 Proben aus Ablaufgräben von Teichen mit akutem KHV-Geschehen.............. 102
4.2.2.1 Pathologisch-anatomische Untersuchungen der den Teichen entnommenen Wildfische ......... 102
4.2.2.2 Molekularbiologische Untersuchungen...................................................................................... 102
4.2.3 Proben aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen.......................................... 103
4.2.3.1 Pathologisch-anatomische Untersuchungen der den Teichen entnommenen Wildfische ......... 103
4.2.3.2 Molekularbiologische Untersuchungen...................................................................................... 103
4.2.4 Kohabitation von Wildfischen aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen..... 111
4.2.4.1 Pathologisch-anatomische Untersuchungen............................................................................... 111
4.2.4.2 Molekularbiologische Untersuchungen...................................................................................... 111
4.2.5 Untersuchungen eines sanierten Teiches nach Besatz mit KHV-freier
Karpfenbrut ....................................................................................................... 112
4.2.5.1 Pathologisch-anatomische Untersuchung der Teichkarpfen und der Expositionskarpfen ........ 113
4.2.5.2 Molekularbiologische Untersuchungen...................................................................................... 113
4.3 Ergebnisse der Laborinfektion ...................................................................... 114
4.3.1 Infektionsversuch 1 (Badinfektion)................................................................... 114
4.3.1.1 Pathologisch-anatomische und molekularbiologische Voruntersuchungen an kommerziell
erworbenen Wildfischen und an Expositionskarpfen................................................................. 114
4.3.1.2 Molekularbiologische Untersuchungen...................................................................................... 115
4.3.2 Infektionsversuch 2 (Kohabitation)................................................................... 116
4.3.2.1 Pathologisch-anatomische und molekularbiologische Voruntersuchungen an kommerziell
erworbenen Wildfischen und Expositionskarpfen ..................................................................... 117
4.3.2.2 Molekularbiologische Untersuchungen...................................................................................... 117
5 DISKUSSION .................................................................................................. 120
6 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................ 139
7 SUMMARY...................................................................................................... 141
8 LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................... 143
9 DANKSAGUNG.............................................................................................. 158
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Aufbau der Badinfektion von Wildfischen in Laborversuch 1 .......................... 62
Abbildung 2: Probennahme an Tag 7 der Laborinfektion........................................................ 62
Abbildung 3: Infektion von SPF-Karpfen in Laborstudie 2..................................................... 64
Abbildung 4: Für die Klonierung des KHV-Amplifikates verwendeter Vektor pGEM®-T Easy
(Promega, Mannheim).............................................................................................................. 79
Abbildung 5: Amplifikationsplots aus der real-time PCR nach GILAD et al (2004) für eine
logarithmische (log10) Verdünnungsreihe des KHV-Plasmids (pGEM®-T Easy) wie unter
3.6.7.1 beschrieben................................................................................................................... 85
Abbildung 6: Quantifizierung von KHV-Genomkopien mittels Standardkurve. Dargestellt ist
die Korrelation der KHV-Plasmidkonzentration (pGEM®-T Easy) und den Schwellenwerten
(Ct) für die Anzahl an Amplifikationszyklen in der unter 3.6.7.1 beschriebenen real-time
PCR. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist: Y = -3.296 x LOG(X) + 39,76...................... 85
Abbildung 7: Amplifikationsplots der RT-PCR für das Thymidinkinase-Gen nach ADAMEK
et al. (2012) für eine logarithmische (log10) Verdünnungsreihe des Thymidinkinase-Plasmids
(pGEM®-T Easy) wie unter 3.6.6.2 beschrieben..................................................................... 88
Abbildung 8: Quantifizierung von Thymidinkinase-Genomkopien mittels Standardkurve.
Dargestellt ist die Korrelation der Thymidinkinase-Plasmidkonzentration (pGEM®-T Easy)
und den Schwellenwerten (Ct) für die Anzahl an Amplifikationszyklen in der unter 3.6.6.2
beschriebenen real-time RT-PCR. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist: Y = -3.401 x
LOG(X) + 36.94....................................................................................................................... 88
Abbildung 9: Dissoziationskurve zur Qualitätskontrolle der quantitativen real-time PCR mit
SYBR Green nach ADAMEK et al. (2012) zum Nachweis einer KHV-Replikation.............. 89
Abbildung 10: Amplifikationsplots der RT-PCR für das Major Capsid Protein-Gen (ORF92)
nach ADAMEK et al. (2012) für eine logarithmische (log10) Verdünnungsreihe des Major
Capsid Protein-Plasmids (pGEM®-T Easy) wie unter 3.6.6.3 beschrieben. ........................... 91
Abbildung 11: Quantifizierung von Major Capsid Protein-Genomkopien mittels
Standardkurve. Dargestellt ist die Korrelation der Major Capsid Protein-Plasmidkonzentration
(pGEM®-T Easy) und den Schwellenwerten (Ct) für die Anzahl an Amplifikationszyklen in
der unter 3.6.6.3 beschriebenen real-time RT-PCR. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist:
Y = -3.283 x LOG(X) + 34.77 ................................................................................................. 91
Abbildung 12: Dissoziationskurve zur Qualitätskontrolle der quantitativen real-time PCR mit
SYBR Green nach ADAMEK et al. (2012) zum Nachweis einer KHV-Replikation.............. 92
Abbildung 13: KHV infizierte Karpfen mit akuter Symptomatik. Konfluierende
Schleimhautläsionen mit „Sandpapier“-artiger Textur und Hämorrhagien (dargestellt durch
Pfeile) ....................................................................................................................................... 93
Abbildung 14: Prozentuales Vorkommen von Wildfischen aus Teichen mit einem Besatz von
akut an der KHV-Infektion erkrankten Karpfen ...................................................................... 97
Abbildung 15: Prozentuales Vorkommen von Wildfischen aus Teichen mit einem Besatz von
latent mit KHV infizierten Karpfen ......................................................................................... 98
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Taxonomie des KHV............................................................................................... 23
Tabelle 2: Bestandteile Kulturmedium CCB-Zellen................................................................ 47
Tabelle 3: Übersicht der Probennahmen bei Karpfenteichen mit akutem KHV-Geschehen... 55
Tabelle 4: Übersicht der Probennahmen bei Karpfenteichen mit latentem KHV-Geschehen. 55
Tabelle 5: Übersicht der Probennahmen bei einem sanierten Karpfenteich ............................ 55
Tabelle 6: Gesamtzahl beprobter Wildfische unterschiedlicher Arten aus sächsischen
Karpfenteichwirtschaften, die auf KHV spezifische DNA-Sequenzen untersucht wurden..... 56
Tabelle 7: Probenumfang aus Ablaufgräben von Teichen mit akutem KHV-Geschehen ....... 58
Tabelle 8: Probenumfang aus Teichen mit latent infiziertem Karpfenbesatz und
Kohabitationskarpfen ............................................................................................................... 59
Tabelle 9: Probenumfang sanierter Teich und Ablaufgraben mit Kohabitationskarpfen ........ 60
Tabelle 10: Verwendete Fischarten in Laborinfektion 1.......................................................... 63
Tabelle 11: Verwendete Fischarten in Laborinfektion 2.......................................................... 64
Tabelle 12: Reaktionsmix für die Reverse Transkription DNase I Verdau ............................. 68
Tabelle 13: Reaktionsmix für die Reverse Transkriptase ........................................................ 69
Tabelle 14: Temperaturprofil für die reverse Transkriptase .................................................... 69
Tabelle 15: Primersequenzen des von FORLENZA et al. (2008) beschriebenen 40S
Ribosomal Protein S11 Housekeeping Gene ........................................................................... 71
Tabelle 16: Primersequenzen für den Nachweis einer KHV-Replikation mittels
Thymidinkinase-Gen (ADAMEK et al. 2012) ......................................................................... 71
Tabelle 17: Pipettierschema für die SYBR Green real-time PCR mit Primersequenzen für das
Thymidinkinase-Gen zur relativen Quantifizierung (ADAMEK et al. 2012) ......................... 71
Tabelle 18: Temperaturprofil für die SYBR Green real-time für das Thymidinkinase-Gen
(ADAMEK et al. 2012)............................................................................................................ 71
Tabelle 19: Pipettierschema für die SYBR Green real-time RT-PCR zur Amplifikation des
Thymidinkinase-Gens zur Quantifizierung der KHV-Replikation (ADAMEK et al 2012) .... 72
Tabelle 20: Primersequenzen für den Nachweis einer KHV-Replikation mittels Major Capsid
Protein-Gen (ORF92) (ADAMEK et al. 2012) ........................................................................ 73
Tabelle 21: Primersequenzen für den Nachweis einer KHV-Replikation mittels Capsid
Triplex Protein-Gen (ORF72) (ADAMEK et al. 2012) ........................................................... 74
Tabelle 22: Primer- und Sondensequenzen die in der TaqMan real-time PCR nach GILAD et
al. (2004) zur Detektion des KHV und zur Qualitätskontrolle der Reaktion verwendet wurden
.................................................................................................................................................. 75
Tabelle 23: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes für die real-time PCR nach GILAD et
al. (2004) zum Nachweis von KHV......................................................................................... 75
Tabelle 24: PCR-Programm für die real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis
von KHV .................................................................................................................................. 75
Tabelle 25: Primer für den Nachweis des KHV-Genoms nach GILAD (2004) ...................... 77
Tabelle 26: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes für die PCR zum KHV-Nachweis ..... 78
Tabelle 27: Touchdown-PCR-Programm für die Endpunkt-PCR nach GILAD et al. (2004) . 78
Tabelle 28: Zusammensetzung der Reaktionskomponenten für Ligationsansatz .................... 80
Tabelle 29: Reaktionsansatz für die Restriktionsverdau des Plasmids .................................... 82
Tabelle 30: Probenumfang der gefangenen Wildfischarten aus sächsischen
Karpfenteichwirtschaften, die auf KHV spezifische DNA-Sequenzen untersucht wurden und
der Bereich der nachgewiesenen Kopienzahl an KHV-Genomsequenzen (sanierter Teich hier
nicht berücksichtigt). ................................................................................................................ 95
Tabelle 31: Quantitativer Nachweis von KHV-Genomsequenzen in Organen von Wildfischen
und Karpfen aus Teichen und deren Ablauf mit Besatz von akut an einer KHV-Infektion
erkrankten Karpfen................................................................................................................. 100
Tabelle 32: Nachweis von KHV-Genomsequenzen in Organen von Wildfischen aus
Ablaufgräben von Teichen aus sächsischen Teichwirtschaften mit Besatz von akut mit KHV
infizierten Karpfen ................................................................................................................. 102
Tabelle 33: Nachweis von KHV-Genomsequenzen in Organen von Wildfischen und Karpfen
aus Teichen und Ablaufgräben aus sächsischen Teichwirtschaften mit Besatz mit latent mit
KHV infizierten Karpfen........................................................................................................ 104
Tabelle 34: Anzahl der KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen aus Teichen mit
latentem KHV-Geschehen in Abhängigkeit von der Wassertemperatur zum Zeitpunkt der
Probennahme.......................................................................................................................... 106
Tabelle 35: Anzahl der KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen aus Teichen mit
latentem KHV-Geschehen in Abhängigkeit vom Besatz der Teiche mit Karpfen
unterschiedlichen Alters......................................................................................................... 108
Tabelle 36: Anzahl der KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen aus Teichen mit
latentem KHV-Geschehen in Abhängigkeit des Jahres in dem sich der akute Ausbruch der
KHVD ereignete..................................................................................................................... 109
Tabelle 37: Nachweis von KHV-Genomsequenzen in den Organen von SPF-Karpfen nach
Kohabitation mit Wildfischen aus Teichen mit Besatz von latent mit KHV infizierten
Karpfen................................................................................................................................... 111
Tabelle 38: Anzahl der KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen und mit diesen
kohabitierten SPF-Karpfen aus dem sanierten Teich und dessen Ablaufgraben ................... 113
Tabelle 39: Anzahl der mittels TaqMan real-time PCR nach GILAD et al. (2004) ermittelten
KHV-Genomäquivalente in Proben von im Labor über das Bad infizierten Wildfischarten, mit
diesen kohabitierten SPF-Karpfen und Karpfen der Infektionskontrolle............................... 116
Tabelle 40: Anzahl der mittels TaqMan real-time PCR nach GILAD et al. (2004) ermittelten
KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen, die mit akut an einer KHV-Infektion
erkrankten Karpfen kohabitiert wurden, sowie deren Infektionskontrolle und im
Infektionswasser inkubierten SPF-Karpfen ........................................................................... 119
Abkürzungsverzeichnis
% Prozent
°C Grad Celsius
+ KHV-PCR positiv
- KHV-PCR negativ
Abb. Abbildung
AlCl ₂ Aluminiumchlorid
A. dest. Aqua destillatum Destilliertes Wasser
Au Goldfischflossen Zelllinie
AW Ablaufwasser
bp Basenpaare
bzw. beziehungsweise
ca. circa
CCB Common Carp Brain Zelllinie
CCG Common Carp Gill Zelllinie
CCO Channel Catfish Ovary Zelllinie
CCV Channel Catfish Virus
cDNA komplementäre DNA
CHSE Königslachs Embryo Zelllinie
cm Zentimeter
Ct-Wert Cycle Treshold (Schwellenwert)
CPE cytopathogener Effekt
CyHV-1 Cyprinides Herpesvirus-1, Herpesvirus cyprini,
Virus der Karpfenpocken
CyHV-2 Cyprinides Herpesvirus-2, Virus der
hämatopoetischen Nekrose der Goldfische
CyHV-3 Cyprinides Herpesvirus-3, Koi-Herpesvirus
DEPC Diethylpyrocarbonat
DNA desoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat
EBV Eppstein-Barr-Virus, Virus des Pfeifferschen
Drüsenfiebers
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EHNV Epizootische Hämatopoetische Nekrosevirus
EK Expositionskarpfen (SPF-Karpfen, in 20l
Ablaufwasser gehalten, welches aus dem
Ablaufgraben entnommen wurde)
ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay
et al. et alii (und andere)
Fa. Firma
FHM Fathead minnow-Zelllinie
FRET Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer
g Gramm
g Erdbeschleunigung
HPLC-Wasser High Performance Liquid Chromatography,
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-
Wasser
HSV-1 Herpes simplex Virus -1
IBR Bovine Rhinotracheitis
IFAT Immunofluorescent antibody test
IHN Infektiöse Hämatopoetische Nekrose
ISH In situ hybridization
i.p. intraperitoneal
kbp Kilobasenpaare
K0 Karpfenbrut
K v vorgestreckte Karpfenbrut
K1 einsömmrige Karpfen
K2 zweisömmrige Karpfen
K3 dreisömmrige Karpfen
KF-1 Koi-Fin-1-Zelllinie
KHV Koi-Herpesvirus
KHVD Koi-Herpesvirus Erkrankung
KID ₂₄ Zellkultur-infektiöse Dosis
K.I.S.S. Koi Immune System Suppressing Disease
l Liter
lat. Lateinisch
LAMP Loop Mediated Isothermal Amplification
LC-MS/MS Liquid Chromatography Tandem Mass
Spectrometry
LB-Agar-Platten lysogeny broth-Agar-Platten
max. Maximum
MEM Minimal Essential Medium
MgCl ₂ Magnesiumchlorid
min. Minimum
min Minute(n)
mg Milligramm
ml Milliliter
mM millimolar
mRNA messenger-ribonucleic-acid
(Boten-Ribonukleinsäure)
MS 222 Tricaine Methanesulfonate 222
NaCl Natriumchlorid
ng Nanogramm
nm Nanometer
n.u. nicht untersucht
µl Mikroliter
µg Mikrogramm
OD optische Dichte
OIE Organisation for Animal Health
ORF Open Reading Frame
p. appl. post applicationem
PBS phosphate buffered saline (Phosphatpuffer)
PCR Polymerase-Chain-Reaction
p.i. post infectionem
pmol pikomol
rel. relativ(e)
RSIVD Red Sea Bream Iridovirus
RTG-2 Regenbogenforellen Gonaden-Zellinie
s Standardabweichung
s. siehe
s.o. siehe oben
SDS sodium dodecyl sulfate
SNT Neutralisationstest
sec Sekunden
sp. Spezies
SPF spezifisch-pathogen-frei
ssp. Subspezies
SVC Frühlingsvirämie der Karpfen
t Tonne, Einheitenname, 1t=103 kg
Tab. Tabelle
TBE TRIS-Borat-EDTA
TCID Tissue Culture Infectious Dosis
TK Teichkarpfen
Tol/FL Silberkarpfenflossen Zelllinie
TW Teichwasser
u. und
U Unit(s) (Einheit(en))
UV Ultraviolett
V Volt
VHS Virale Hämorrhagische Septikämie
WP Wasserprobe
Einleitung 19
1 Einleitung
Das Koi-Herpesvirus (KHV) auch bekannt als Cyprinides Herpresvirus-3 (CyHV-3) infiziert
Karpfen und Koi-Zuchtformen (Cyprinus carpio). Die durch das Virus verursachte Koi-
Herpesvirose stellt eine virulente und hochkontagiöse Krankheit dar, doch beschränkt sich das
Krankheitsgeschehen mit Morbidität und Mortalität auf die Spezies Cyprinus carpio und
wurde bislang nur in Koi- und Speisekarpfenpopulationen in der Karpfenteichwirtschaft und
in Wildbeständen beobachtet (ARIAV et al. 1999; BRETZINGER et al. 1999; WALSTER
1999; GARVER et al. 2010). Erste mit dieser Erkrankung in Zusammenhang gebrachte
Verluste wurden in Israel und den USA beobachtet (HEDRICK et al. 2000). Seitdem hat sich
das KHV durch den unkontrollierten, internationalen Handel mit Zierkarpfen weltweit
verbreitet und beeinträchtigt mittlerweile ernsthaft den Handel mit Koi und die Produktion
von Speisekarpfen für den menschlichen Konsum (PIKARSKY et al. 2004). Durch intensive
und unkontrollierte Fischtransporte breitete sich die Infektion mit KHV im Folgenden rasant
schnell in Karpfenpopulationen aus. Verluste wurden daraufhin in vielen Ländern
dokumentiert und beschrieben. Gegen Ende des Jahres 2000 waren zum Bespiel in Israel
90 % der Karpfenbestände mit KHV infiziert. Diesem Umstand geschuldet machte die
israelische Aquakulturindustrie Verluste in Höhe von 300 Millionen Dollar jährlich
(PERELBERG et al. 2003). Eine großflächige Ausbreitung der Infektion und hohe
ökonomische Verluste, die mit der Infektion assoziiert waren, konnten auch in verschiedenen
Regionen im Osten Deutschlands beobachtet werden. Im Jahre 2004 berichtete beispielsweise
ein karpfenteichwirtschaftliches Unternehmen aus Thüringen über einen durch KHV
verursachten Verlust von 80 t Karpfen mit einem direkten Schaden von 310.000 Euro und
weiteren Folgeschäden in Höhe von 106.000 Euro (BOCKLISCH et al. 2006).
Um geeignete Schutzmaßnahmen für wertvolle Karpfenpopulationen gegen die Infektion mit
KHV zu entwickeln, müssen alle potentiellen Übertragungswege, durch die naive
Populationen in Kontakt mit dem Virus kommen können, analysiert und bewertet werden.
Neben infizierten Karpfen gibt es mehrere potentielle Vektoren, die an einer Übertragung der
Infektion beteiligt sein könnten.
Einleitung 20
Solche Vektoren sind unter anderem das Teichwirtschaftspersonal, die teichwirtschaftlich
genutzte Ausrüstung, verschiedene Wasserpflanzen und Tiere, einschließlich Amphibien und
Vögel. Insbesondere fischfressende Vögel, wie Reiher und Kormorane, werden in Betracht
gezogen an der Verbreitung von KHV maßgeblich beteiligt zu sein (MATSUI et al. 2008).
Ein anderer wichtiger Vektor ist sicherlich das Wasser, insbesondere das Ablaufwasser,
welches aus Teichen mit KHV-infizierten Karpfenpopulationen stammt. Das Absenken des
Wasserspiegels der Teiche und das Sammeln der Fische in der Fischgrube, während des
Befischungsprozesses im Frühjahr und im Herbst, wurde als geeigneter Stressor für Karpfen
betrachtet eine latente KHV-Infektion zu reaktivieren und außerdem eine erneute, intensive
Ausschüttung von Viruspartikeln zu induzieren (MEYER 2007b; BAUMER 2011). Im Zuge
von Studien zur Umweltüberwachung, die in japanischen Flüssen zum Vorkommen von KHV
durchgeführt wurden, konnten Viruspartikel über das ganze Jahr hinweg im Wasser detektiert
werden (MINAMOTO et al. 2009a; MINAMOTO et al. 2009b). Weiterhin wurde aufgezeigt,
dass auch Ablaufwasser von verschiedenen infizierten Standorten KHV-Partikel enthielt.
Als weitere potentielle Vektoren der Infektion könnten Individuen verschiedener
Wildfischarten in Frage kommen, die in Zuchtanlagen oder Ablaufkanäle von
Teichwirtschaftsbetrieben migrieren.
Erste Untersuchungen indizierten, dass das Wirtsspektrum von KHV auf Karpfen begrenzt zu
sein scheint, weil Vertreter der Wildfischarten, welche im Labor infiziert wurden oder mit
Virus ausschüttenden Karpfen kohabitiert wurden, bei permissiven Temperaturen keine
klinischen Symptome einer KHVD oder Mortalität zeigten (ARIAV et al. 1999; WALSTER
1999; RONEN et al. 2003; PIKARSKY et al. 2004). Des Weiteren konnten auch unter
Feldbedingungen, während Phasen akuter Ausbrüche der KHVD, keine deutlichen Anzeichen
einer klinischen Erkrankung oder Mortalität bei Individuen anderer Arten als Karpfen
beobachtet werden (HOFFMANN et al. 2000). Anschließende Studien zeigten jedoch, dass
KHV-spezifische Genomabschnitte mittels PCR in Geweben von Goldfischen (Carassius
auratus auratus) gefunden werden konnten, die mit infizierten Koi zusammen gehältert
wurden (EL-MATBOULI et al. 2007; SADLER et al. 2008). Überdies wurden auch Störe in
Aquakulturanlagen, die in Karpfenteichwirtschaften mit einer KHVD-Historie kultiviert
wurden, positiv mittels PCR auf KHV-Genomsequenzen getestet (KEMPTER et al. 2009).
Einleitung 21
Diesen Beobachtungen zufolge wurde das Konzept der vorliegenden Studie erarbeitet, welche
sich schwerpunktmäßig mit der Rolle der in der Karpfenteichwirtschaft vorkommenden
Wildfischarten bei der Verbreitung der KHV-Infektion unter Feldbedingungen
auseinandersetzt. In der vorliegenden Arbeit soll abgeklärt werden, inwiefern Wildfische aus
Karpfenteichen an der Verbreitung der KHV-Infektion beteiligt sind und inwiefern sie ein
epidemiologisches Risiko darstellen.
Karpfenteichgebiete in Bayern und der Lausitz im Freistaat Sachsen sind dadurch
charakterisiert, dass die Einzelteiche meist miteinander verknüpft sind und sich in enger
Nachbarschaft zueinander befinden, sodass ein breites Spektrum an Wildfischen dazu befähigt
ist sich zwischen einer Vielzahl an Teichen eines Systems frei zu bewegen. Die sächsische
Oberlausitzer Heide- und Teichlandschaft mit über 335 Teichen stellt das größte für die
Karpfenzucht wirtschaftlich genutzte Teichgebiet Europas dar. Erste mit der Koi-
Herpesvirose in Zusammenhang gebrachte Verluste wurden im Jahre 2002 diagnostiziert. Seit
diesem Jahr hat sich die Anzahl der betroffenen Betriebe von drei auf 26 erhöht (BÖTTCHER
et al. 2009). Die Erkrankung nimmt zumeist einen seuchenhaften Verlauf und erfasst ganze
Teichgruppen einzelner Betriebe und verursachte seit Beginn der KHV-Problematik einen
wirtschaftlichen Gesamtschaden von mehreren Millionen Euro und gefährdet laut
Sächsischem Landesamt für Umwelt, Landwirtschaft und Geologie die Wirtschaftlichkeit der
sächsischen Teichwirtschaft.
Um das Risiko einer KHV-Verbreitung durch Wildfische abschätzen zu können, wurden in
der vorliegenden Arbeit zuerst Methoden etabliert, um quantitativ die Viruslast in Geweben
von Wildfischen bestimmen sowie eine potentielle Virusvermehrung erfassen zu können.
Daraufhin wurden diverse Vertreter der Cypriniden sowie auch andere häufig vorkommende
Wildfischarten zu verschiedenen Zeitpunkten aus der Teichbiozönose entnommen. Zum einen
fanden diese Probennahmen im Sommer an Teichen statt, die mit akut an einer KHV-
Infektion erkrankten Karpfen besetzt waren. Zum anderen wurden diese während der
Befischung im Frühjahr oder Herbst an Teichen mit latent infizierten Karpfenbeständen sowie
an einem zuvor mit Branntkalk sanierten Teich durchgeführt. Die entnommenen Fische
wurden in Hälterungsbecken mit naiven Karpfen kohabitiert und anschließend auf das
Vorhandensein von KHV-Genomsequenzen untersucht. Darauf basierend wurden im Labor
Einleitung 22
häufig in der Teichbiozönose vorkommende Arten mit KHV infiziert und hinsichtlich ihrer
Empfänglichkeit und einer potentiellen Virusvermehrung in ihren Geweben untersucht.
Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war eine abschließende Aussage über die
epidemiologische Relevanz von Wildfischen für die Verbreitung des Koi-Herpresvirus
(KHV) in der sächsischen Karpfenteichwirtschaft zu generieren. Dies beinhaltete die
Beantwortung folgender Fragen:
• Welche Fischarten kommen in den Teichwirtschaften überhaupt vor?
• In welchen Fischarten können KHV-Genomsequenzen nachgewiesen werden?
• Welchen Einfluss haben die Faktoren Jahreszeit, Wassertemperatur, Altersklasse und Infektionsstatus des Karpfenbestandes auf die Infektion mit KHV bei Wildfischen?
• Können Wildfische aus der Teichbiozönose naive Karpfen mit KHV infizieren?
• Wie groß ist die Rolle der Wildfische bei der Verbreitung der KHV-Infektion?
• Findet eine Virusvermehrung in den Geweben von Wildfischen statt?
• Hat diese eine Relevanz für die Verbreitung der Infektion bei Karpfen?
• Können sie eine klinische Erkrankung bei Karpfen induzieren?
• Ist eine Sanierung von KHV- kontaminierten Teichen im Rahmen eines Koi-Herpesvirus-Tilgungsprogramms möglich?
Literaturverzeichnis 23
2 Literaturübersicht
2.1 Charakterisierung des KHV
2.1.1 Systematische Stellung
Das Koi-Herpesvirus (KHV, CyHV-3) ist ein Mitglied der Ordnung Herpesvirales und wird
nach neuesten Erkenntnissen systematisch der Familie der Alloherpesviridae zugeordnet
(DAVISON et al. 2009; WALTZEK et al. 2009), welche mit Vertretern der Familie
Herpesviridae eng verwandt sind, taxonomisch aber mittlerweile isoliert betrachtet werden.
Vertreter der Alloherpesviridae infizieren Fische und Amphibien, wohingegen Reptilien,
Vögel und Säugetiere das Wirtsspektrum der Vertreter der Herpesviridae darstellen
(MCGEOCH et al. 2006; WALTZEK et al. 2009). Phylogentischen Analysen spezifischer
Gene zufolge unterteilt sich die Familie der Alloherpesviridae in zwei Gruppen. Die erste
Gruppe umfasst die Gattung Cyprinivirus, welche aus den cypriniden Herpesviren 1,2 und 3
(CyHV1, 2, 3) sowie dem anguilliden Herpesvirus (AngHV1) besteht, die mit Genomen von
245–295 kb innerhalb der Ordnung Herpesvirales die größten Vertreter darstellen. In der
zweiten Gruppe befinden sich ictaluride, salmonide, acipenseride und ranide Herpesviren
(WALTZEK et al. 2009; MICHEL et al. 2010a) mit kleineren Genomen (134–235 kb).
Tabelle 1: Taxonomie des KHV
Systematik Doppelsträngige DNA-Viren
(dsDNA: double stranded DNA) Größe Morphologie Ordnung Herpesvirales Familie Alloherpesviridae Gattung Cyprinivirus
Art Cyprinides Herpesvirus-3 279 kb Ikosaedrisches Kapsid
2.1.2 Morphologie
Das KHV ist strukturell ein typischer Vertreter der Ordnung Herpesvirales. Das Genom
befindet sich in einem ikosaedrischen Nucleokapsid, welches einen Durchmesser von
Literaturverzeichnis 24
100-110 nm aufweist und besteht aus einem einzelnen, linearen, doppelsträngigen DNA-
Molekül (HEDRICK et al. 2000; HOFFMANN 2001; PERELBERG et al. 2003; RONEN et
al. 2003). Der Durchmesser des gesamten Viruspartikels beträgt 170–200 nm (HEDRICK et
al. 2000; NEUKIRCH u. KUNZ 2001; HEDRICK et al. 2005) und mit einem Genom von 295
kb stellt es den größten Vertreter der Ordnung Herpesvirales dar (AOKI et al. 2007). Das
Kapsid ist mit einer wässrigen Proteinmatrix bedeckt, die als Tegument bezeichnet wird und
welche ihrerseits von einer aus der Trans-Golgi-Membran der Wirtszelle hergestellten
Lipidhülle umgeben wird (METTENLEITER et al. 2009).
2.1.3 Molekulare Struktur
2.1.3.1 Genom
Das Genom des KHV ist ein 295 kb großes, lineares, doppelsträngiges DNA-Molekül
bestehend aus einem umfangreichen Mittelabschnitt flankiert von zwei 22 kb
Wiederholungsregionen (AOKI et al. 2007; MICHEL et al. 2010a). Die Größe des Genoms ist
vergleichbar mit dem des CyHV-1. Die Cypriniden Herpesviren stellen die größten Vertreter
der Ordnung Herpesvirales dar, während andere Angehörige dieser Ordnung Genomgrößen
zwischen 125–240 kb aufweisen. Das Genom des CyHV-3 kodiert 156 potentielle, für
Proteine kodierende offene Leserahmen (ORFs), welche auch acht ORFs beinhalten, die von
den Wiederholungsregionen kodiert werden. Diese sind permanent in Form von zwei Kopien
im Genom zugegen (AOKI et al. 2007). Es wurden bisher fünf weitere Familien mit
verwandten Genen beschrieben. Hierzu gehören der ORF2, der Tumor Necrosis Factor
Receptor, ORF22 und 25 sowie die RING-Familien (MICHEL et al. 2010a).
In der Familie Alloherpesviridae ist das anguillide Herpesvirus 1 der engste Verwandte des
Koi-Herpesvirus, der bislang sequenziert wurde (VAN BEURDEN et al. 2010). Beide Viren
besitzen 40 ORFs, die erhebliche Ähnlichkeiten aufweisen.
Literaturverzeichnis 25
Bislang wurden drei unterschiedliche und nicht verwandte Virusstämme sequenziert (AOKI et
al. 2007). Hierzu gehören die Isolate aus Isreal (CyHV-3 I), Japan (CyHV-3 J) und aus den
USA (CyHV-3 U). Trotz der großen Distanz ihres geographischen Ursprungs herrscht unter
ihnen eine hohe Sequenzgleichheit. Eine nur geringe Diversität unter den jeweiligen
Virusstämmen scheint für das KHV charakteristisch zu sein (KURITA et al. 2009).
2.1.3.2 Proteom
Eine strukturelle Analyse des KHV-Proteoms erfolgte mittels LC-MS/MS (MICHEL et al.
2010b). Beschrieben wurden insgesamt 40 Strukturproteine, die sich in drei Kapsid-, 13 Hüll-,
zwei Tegument- und 22 unklassifizierte Proteine aufgliedern. Das Genom des CyHV-3 besitzt
30 potentielle Transmembran kodierte ORFs (AOKI et al. 2007). Allerdings wurde bislang
einzig das ORF81, welches für ein auf der Virushülle exprimiertes Typ 3 Membranprotein
kodiert (ROSENKRANZ et al. 2008; MICHEL et al. 2010b), untersucht. Es wird
angenommen, dass ORF81 eines der wichtigsten immunogenetischen Membranproteine ist.
2.1.3.3 In vitro Replikation
Die Kultivierung des KHV erfolgt zumeist auf den Zelllinien KF-1, CCB und CCG. Andere
Zelllinien wurden getestet, erwiesen sich aber als nicht permissiv für eine Infektion
(HEDRICK et al. 2000; NEUKIRCH u. KUNZ 2001; OH et al. 2001; PERELBERG et al.
2003; DAVIDOVICH et al. 2007). Mittels Elektronenmikroskopie konnte der
Replikationszyklus des KHV anschaulich untersucht werden (METTENLEITER et al. 2009).
Bei Betrachtung der morphologischen Veränderungen im Verlauf der Replikation kann ein
für die Familie Herpesviridae ähnliches Muster wiedererkannt werden.
Eine optimale Virusvermehrung in Zellkulturen ist auf Temperaturen zwischen 15 °C und
25 °C beschränkt. Eine Vermehrung und Transkription viraler Gene ist in vitro bei
Temperaturen über 30 °C nicht mehr zu beobachten. Obwohl unter diesen Umständen keine
Virusreplikation mehr detektierbar ist, kann in infizierten Zellkulturen die über 30 Tage bei
Literaturverzeichnis 26
30 °C inkubiert wurden jedoch nach einer Erniedrigung der Temperatur wieder replizierendes
Virus beobachtet werden (DAVIDOVICH et al. 2007).
2.2 Krankheitsmuster und Wirtsfaktoren
2.2.1 Pathogenese
Bezüglich der Eintrittspforte des Virus in den Organismus und des Mechanismus der
Virusausbreitung werden in der Literatur verschiedene Modelle vorgeschlagen und es herrscht
unter einer Vielzahl an Wissenschaftlern stetige Uneinigkeit. Das KHV konnte während der
Infektion in Schleim, Haut, Kieme, Niere und Milz detektiert werden. Außerdem erfolgte ein
Virusnachweis in Darm, Leber, Gehirn sowie in Blut (GILAD et al. 2004; PIKARSKY et al.
2004). Auf Grund der Verteilung der Viruslast im Fisch und der beobachteten
Krankheitssymptome wurde ein Tropismus zur Haut, den respiratorischen Organen und dem
Nervensystem angenommen (GILAD et al. 2004). Die Frage wie sich das Virus Zugang zum
Wirtsorganismus verschafft ist weiterhin nicht eindeutig geklärt. Anfangs wurde das
Kiemenepithel als primäre Eintrittspforte angenommen, da hier hohe Viruskonzentrationen
und nekrotische Veränderungen im Verlauf der Pathogenese beobachtet wurden. Eine weitere
Verbreitung erfolgte dann in den Leukozyten des Blutes zur Niere (DISHON et al. 2005).
Repliziertes Virus wird den Autoren zufolge ebenfalls durch die Kiemen an das
Umgebungswasser abgegeben (PIKARSKY et al. 2004). In anderen Studien wurden ebenfalls
das Darmgewebe und die Haut als primäre Eintrittspforten thematisiert. Die Becherzellen
könnten hier der Virusvermehrung dienen und die anfänglich zu beobachtete Hypersekretion
des epidermalen Mukus erklären (BRETZINGER et al. 1999; HEDRICK et al. 2000;
PERELBERG et al. 2003). BERGMANN (2007) geht bei einer akuten Infektion davon aus,
dass das Virus in erster Linie über den Verdauungstrakt aus dem Umgebungswasser
aufgenommen wird und nur sekundär über die Haut und die Kiemen. Es erfolge anfänglich
eine Verbreitung über den Blutstrom im Organismus, welches mit einer stetig abnehmenden
Viruslast in den Leukozyten begründet wurde. Diese Hypothesen wurden allerdings
widerlegt. Mittels Bioluminescent Imaging nach Klonierung einer Luciferase in ein
rekombinantes Plasmid und eines originellen Versuchsaufbaus, welcher nur eine Infektion
Literaturverzeichnis 27
über die Haut des posterioren Teil des Fisches erlaubte, konnte veranschaulicht werden, dass
die Haut als das primäre Eingangsportal für KHV angesehen werden muss (COSTES et al.
2009). Auch frühere Arbeiten an Rhabdoviren der Salmoniden lassen vermuten, dass die Haut
eine effiziente Eingangspforte für verschiedene aquatische Viren zu sein scheint
(HARMACHE et al. 2006). Es kommt zur Virusreplikation in der Haut von wo aus es sich
rasch im ganzen Körper ausbreitet (COSTES et al. 2009). Bereits 24 Stunden p.i. erfolgt ein
positiver Virusnachweis in allen inneren Organen inklusive des Gehirns, wo eine weitere
Vermehrung zu verzeichnen ist und später Läsionen auftreten (GILAD et al. 2004). Acht bis
12 Tage p.i. wird die höchste Mortalität bei natürlich infizierten Fischen beobachtet, die bei
permissiven Temperaturen zwischen 18 und 28 °C gehalten werden (PERELBERG et al.
2003). Der Tod der Fische ist durch einen Verlust der osmoregulatorischen Funktionen der
Kieme, Niere und des Darm zu erklären (GILAD et al. 2004; NEGENBORN et al. 2015).
Alle Vertreter der Herpesviridae sind durch eine lytische Replikationsphase und eine Phase
der Latenz in ihrem Lebenszyklus gekennzeichnet (FRASER et al. 1981; MODROW et al.
2010). Diese Latenz ist gekennzeichnet durch das Verweilen des viralen Genoms in
infizierten Zellen als nicht integriertes Episom und durch die Expression einer geringen
Anzahl viraler Gene und microRNAs. Bei einer Reaktivierung wird die latente Phase durch
die lytische Replikation ersetzt (MICHEL et al. 2010a). Diese Latenz konnte für Vertreter der
Familie Alloherpesviridae noch nicht eindeutig bewiesen werden, jedoch gibt es Anzeichnen,
dass KHV eine Latenz im Wirt etablieren kann (GRAY et al. 2002). Mittels real-time PCR
konnten 65 Tage p.i. in klinisch gesunden Fischen KHV spezifische Genomabschnitte in
niedriger Konzentration nachgewiesen werden (GILAD et al. 2004). Auch zwei Jahre nach
einem Ausbruch der Virose in einer Wildkarpfenpopulation konnten den Gewässern noch
latente Virusträger entnommen werden (MINAMOTO et al. 2009b). KHV-Genomäquivalente
wurden auch in Leukozyten von symptomlosen Karpfen gefunden, die lediglich in Anlagen
mit KHV-Historie gehältert wurden. In diesem Zusammenhang konnten jedoch weder
infektiöse Viruspartikel noch mRNAs festgestellt werden, die einer lytischen Infektion
zugeordnet werden konnten (EIDE et al. 2011). Letztendlich demonstrierten ST-HILAIRE et
al. (2005), dass es nach Infektionen mit KHV zu temperaturabhängigen Virusreaktivierungen
auch Monate nach der Erstinfektion kommen kann und im Folgenden bei Temperaturen über
20 °C auch eine Übertragung auf naive Karpfen stattfindet. Weitere Untersuchungen zeigten,
Literaturverzeichnis 28
dass in Karpfen mit einer latenten Infektion nach Stresssituationen, ausgelöst durch Transport,
Temperaturwechsel oder eine simulierte Befischung, eine Virusreaktivierung mit Mortalität
induziert werden kann (MEYER 2007b; BERGMANN u. KEMPTER 2011).
2.2.2 Klinische Symptomatik
KHV-Ausbrüche, die mit einem perakuten bis akuten Verlauf der Erkrankung einhergehen,
äußern sich in einer Morbidität von 80–100 % und einer Mortalität von 70–80 % im
betroffenen Bestand (BRETZINGER et al. 1999; WALSTER 1999). Erkrankte Fische können
auffällige Verhaltensstörungen zeigen, wie Apathie, Anorexie, Lethargie, Dyspnoe,
eingeklemmte Dorsalflosse und unkontrollierte Schwimmbewegungen. Oft zeigen Fische
auch im Laufe der Pathogenese unregelmäßige Schwimmaktivität mit sporadischer
Hyperaktivität. Sie können aber auch regungslos auf dem Teichboden verharren oder in
Bereichen mit wenig Strömung, wie an Teichzuläufen in der Wassersäule stehen (BLOOM
1998; ARIAV et al. 1999; WALSTER 1999).
Die äußerlichen Symptome der Erkrankung können sich teilweise sehr verschieden darstellen
oder sogar völlig symptomlos bis zum Eintritt der Mortalität verlaufen. Die Ausprägung des
Krankheitsbildes wird von Faktoren, wie dem Alter und der Kondition der Karpfen, der
Wassertemperatur und der Wasserqualität, der Populationsgröße und verschiedenen anderen
Stressoren bestimmt (WALSTER 1999). Oft wird zu Beginn der Erkrankung eine erhöhte
Schleimproduktion auf den Kiemen und der Haut beobachtet sowie das Auftreten von
Farbveränderungen über den ganzen Fisch (GRAY et al. 2002). Des Weiteren sind erkrankte
Tiere oft an einem bilateralen Enophtalmus, teilweise aber auch an einem Exophthalmus
zuerkennen. Die anfängliche Hypersekretion an Schleim wird im weiteren Verlauf der
Infektion von einer deutlichen Verringerung der Schleimmenge auf der Haut abgelöst. Die
massivsten pathologischen Veränderungen betreffen meist die Kiemen. Anfänglich wird oft
eine Kiemenschwellung beobachtet, worauf fokale und ausgedehnte Nekrosen und
Entzündungen des Kiemengewebes folgen. Diese Veränderungen äußern sich in weißen,
scharf abgegrenzten Zellarealen zwischen weiterhin gesunden, weinroten Kiemenlamellen.
Die Haut wirkt rau und zeigt schleimfreie Areale mit „Sandpapier“-artiger Textur und
Literaturverzeichnis 29
gelegentlich auftretenden Hämorrhagien. Später sind auch Blutungen am Flossenansatz, in
den Flossen und in der Haut zu beobachten sowie das Auftreten von kreisrunden bis
konfluierenden Schleimhautläsionen, verbunden mit Schleimhautablösungen und
großflächigen Entzündungen. Pathologisch-anatomische Veränderungen in den Organen
erkrankter Tiere sind in der Sektion nicht zu erkennen (BLOOM 1998; ARIAV et al. 1999;
BRETZINGER et al. 1999; WALSTER 1999; HEDRICK et al. 2000; PERELBERG et al.
2003). Es besteht aber eine gesteigerte Sensibilität gegenüber Sekundärinfektionen mit
Parasiten, Bakterien und Pilzen (BLOOM 1998; ARIAV et al. 1999). Histopathologische
Untersuchungen zeigen allerdings, dass es zu ausgeprägten Veränderungen in fast allen
Organen kommt, welche sich in Form von unspezifischen Entzündungsreaktionen bis hin zu
Degeneration von ganzen Zellverbänden und Nekrosen des Gewebes darstellen (PIKARSKY
et al. 2004). Die deutlichsten Veränderungen verzeichneten sich im Kiemen- und
Nierengewebe (HEDRICK et al. 2000).
Im Kiemengewebe bildeten sich Hyperplasien, Hypertrophien und Nekrosen des Epithels aus,
die teilweise mit Verschmelzungen der Kiemensekundärlamellen einhergehen (HEDRICK et
al. 2000). Einen Verlust der Kiemensekundärlamellen nur kurze Zeit nach der Infektion und
einen totalen Zusammenbruch der Kiemenlamellenstruktur im weiteren Verlauf beobachteten
PIKARSKI et al. (2004). Im Nierengewebe kann eine interstitielle Nephritis auftreten und in
infizierten Geweben von Niere, Milz, Herz, Gehirn und Leber können eosinophile
intranukleäre Einschlusskörperchen in einzelnen Zellen festgestellt werden (MIYAZAKI et
al. 2008). Histopathologisch konnten auch starke Schädigungen in der Haut festgestellt
werden. Eine Degeneration von spezialisierten Zellen und eine Ablösung des Epithels von der
Basalmembran wurden von BRETZINGER et al. (1999) beschrieben. Einige Fische wiesen
im Endstadium der Erkrankung neurologische Symptome, wie fokale menigeale und
paramenigeale Entzündungen des Zentralnervensystems, auf (PIKARSKY et al. 2004).
2.2.3 Empfänglichkeit
Karpfen aller Altersgruppen sind für das KHV empfänglich (BRETZINGER et al. 1999;
SANO et al. 2004). Wobei Jungfische (1–3 Monate mit 2,5–6 g) unter experimentellen
Literaturverzeichnis 30
Bedingungen anfälliger für die KHV-Erkrankung zu sein scheinen als vollentwickelte Fische
nach einem Jahr mit einem Gewicht von ca. 230 g (OH et al. 2001; PERELBERG et al.
2003). In Japan wurde eine Studie durchgeführt, um die Empfänglichkeit von jungen Karpfen
für das KHV zu bestimmen. Nach experimenteller Infektion von Karpfenlarven, drei bis vier
Tage nach dem Schlupf, konnten keine Anzeichen einer Erkrankung beobachtet werden,
stattdessen schienen sie in diesem Stadium über eine gewisse Resistenz zu verfügen.
Wohingegen die gleichen Fische zwei Monate später nach einer erneuten Virusexposition
einer Mortalität von 100 % unterlagen (ITO et al. 2007).
2.2.3.1 Übertragung und Vektoren
Die gegenwärtigen Erkenntnisse der Wissenschaft können die genauen Umstände der
Übertragung des KHV noch nicht eindeutig beschreiben. Bekannt ist aber, dass eine
horizontale Übertragung unter Karpfen jeder Altersstufe möglich ist. Der abiotische Faktor
Wasser als natürlicher Lebensraum spielt in diesem Zusammenhang die wohl wichtigste Rolle
als Medium der Übertragung (PERELBERG et al. 2003). Die Autoren demonstrieren, dass
Fische virale Partikel ins Umgebungswasser sekretierten, welche für mindestens vier Stunden
infektiös blieben und eine Mortalität in naiven Karpfen induzierten.
Als Reservoir der KHV-Erkrankung werden klinisch infizierte Karpfen, latente „Carrier“ aus
kultivierten und wilden Karpfenbeständen und verschiedene Wildfischarten beschrieben.
Neben anderen Fischarten werden aber auch diverse weitere Vektoren aufgeführt, die an der
Übertragung und Verbreitung des KHV beteiligt seien können.
WALSTER (1999) schreibt dem Faktor Mensch bei der Verschleppung des Erregers eine
übergeordnete Rolle zu und sieht einen Zusammenhang zwischen mangelnder
Betriebshygiene und Krankheitsausbrüchen in gezüchteten Karpfenbeständen. Kritisch
einzustufen sei vor allem ein zu hoher Personenverkehr an den Teichen und die Verwendung
von unzureichend desinfizierten Arbeitsgeräten. Des Weiteren wird die Karpfenlaus (Argulus
sp.) als potentieller Überträger der Infektion diskutiert. MATSUI et al. (2008) bezeichnen
ebenfalls einen hohen Personenverkehr und die Verwendung von kontaminierten
Literaturverzeichnis 31
Gerätschaften als Risikofaktoren. Außerdem sind ihrer Ansicht nach weitere potentielle
Vektoren wie fischfressende Vögel (Fischreiher und Kormorane), Pflanzen und Amphibien an
der Verbreitung des KHV beteiligt.
Akut an KHV erkrankte Karpfen tragen hohe Viruslasten, die auch im Kot und im Urin
(DISHON et al. 2005; YUASA et al. 2008; NEGENBORN et al. 2015) oder in der Haut und
im Schleim gefunden wurden (GILAD et al. 2004).
DISHON et al. (2005) wiesen mittels PCR und ELISA virale Proteine und DNA in
Exkrementen von mit KHV infizierten Karpfen nach. I.p. infizierte Fische schieden an Tag
vier und über das Bad infizierte Fische an Tag fünf p.i. KHV-DNA mit dem Kot aus. Die
Autoren beobachteten einen CPE in mit Kot infizierten Zellkulturen und induzierten KHV-
spezifische Krankheitssymptome bei naiven Karpfen.
Andere Autoren sehen die Haut als Haupteingangspforte des CyHV-3 in den Organismus an
und beschreiben diese auch als Ort der ersten Virusreplikation (COSTES et al. 2009). Diese
Virusvermehrung in der Haut ist somit nicht nur als Ausgangspunkt für die Virusvermehrung
im Fisch anzusehen sondern auch als Ausgangspunkt für die Verbreitung der Infektion in
einer ganzen Population. Zwei bis drei Tage p.i. begannen die Karpfen sich aneinander oder
an Gegenständen zu reiben. Diese Verhaltenweise könnte den Verbreitungsmechanismus über
die Haut entscheidend verstärken. Auch die Tatsache, dass gesunde Fische makroskopisch
kleine Hautbestandteile oral von erkrankten Fischen aufnehmen kann als zusätzlicher Faktor
für die Erregerübertragung angesehen werden.
Nach derzeitigem Wissensstand sind noch keine Beweise erbracht worden, die als
Anhaltspunkte für eine vertikale Übertragung des KHV verstanden werden könnten.
2.2.4 Wirtsspektrum
Das Wirtsspektrum der Herpesviren ist mit wenigen Ausnahmen sehr eng, sodass
Übertragungen auf andere Spezies die Ausnahme sind. Zoonosen durch Herpesviren sind
daher unbekannt (DAVISON 2002; ROLLE u. MAYR 2007; MODROW et al. 2010). Die
Literaturverzeichnis 32
Koi-Herpesvirose stellt eine virulente und hochkontagiöse Krankheit dar, doch beschränkt
sich das Krankheitsgeschehen mit Morbidität und Mortalität auf die Spezies Cyprinus carpio
und wurde bislang nur in Koi- und Speisekarpfenpopulationen beobachtet (ARIAV et al.
1999; WALSTER 1999). In Kohabitationsversuchen mit Virus ausschüttenden, erkrankten
Karpfen und nach Laborinfektionen mit Zellkulturvirus bei permissiven Temperaturen
konnten bei anderen Fischarten keine klinischen Anzeichen einer durch KHV induzierten
Erkrankung festgestellt werden (BODY et al. 2000; RONEN et al. 2003; PIKARSKY et al.
2004).
In Teichwirtschaften werden Karpfen oft zusammen mit verschiedenen Beifischarten
kultiviert. Während akuter KHV-Ausbrüche in diesen Polykulturen konnten bei anderen
Spezies keine Verluste wahrgenommen werden (HOFFMANN et al. 2000) und auch in
weiteren Studien, in denen mit KHV infizierte Karpfen mit anderen Cypriniden und Nicht-
Cypriniden zusammen gehältert wurden, wird beschreiben, dass sich das Wirtsspektrum auf
die Art C. carpio zu beschränken scheint. In verschiedenen Beobachtungen konnten bei
Goldfischen (Carassius aurata), Stören (Acipenseridae), Schleien (Tinca tinca), Goldorfen
(Leuciscus idus), Graskarpfen (Ctenopharyngodon idella), Hechten (Esox lucius) und
Zandern (Sander lucioperca) nie Anzeichen einer Erkrankung durch KHV festgestellt werden
(BLOOM 1998; BRETZINGER et al. 1999). GILAD et al. (2002) und PERELBERG et al.
(2003) zeigten ebenfalls, dass Goldfische und Karauschen (Carassius carassius), als nahe
Verwandte des Karpfens, weder nach Kohabitationsversuchen noch nach experimenteller
Infektion klinische Symptome entwickelten. PERELBERG et al. (2003) kohabitierten
außerdem infizierte Karpfen mit Tilapien (Oreochromis niloticus), Silberbarschen (Bidyanus
bidyanus), Silberkarpfen (Hypophthalmichthys molitrix), Goldfischen, Graskarpfen und
naiven Karpfen als Infektionskontrolle. Diese wurden wiederum im Anschluss mit naiven
Karpfen zusammengesetzt, um zu überprüfen, ob es zu einer Übertragung des Virus kommen
kann. Die aufgeführten Arten äußerten keinerlei Anzeichen einer Erkrankung, sowie die mit
ihnen kohabitierten naiven Karpfen, während sowohl die infizierten als auch die mit ihnen
kohabitierten naiven Karpfen eine Mortalität von ca. 70 % zeigten. HUTORAN et al. (2005)
konnten auch nach Vergesellschaftung von Goldfischen mit erkrankten Karpfen über mehrere
Monate keine krankhaften Veränderungen feststellen. In den ersten PCR-Untersuchungen
nach GILAD et al. (2002) an mit Zellkulturvirus infizierten Goldfischen wurden keine KHV-
Literaturverzeichnis 33
spezifischen Genomsequenzen nachgewiesen (HEDRICK et al. 2006). Mittels LAMP
detektierten EL-MATBOULI et al. (2007) jedoch das KHV in Gewebepools aus Kieme, Milz,
Niere und Gehirn in natürlich infizierten Goldfischen. Untersuchungen derselben Proben mit
dem von BERCOVIER et al. (2005) entwickelten PCR-System bestätigten diese Ergebnisse.
MEYER et al. (2007a; MEYER 2007b) kohabitierten zuvor dem KHV ausgesetzte
Graskarpfen, Schleien und Silberkarpfen mit SPF-Karpfen und zeigten, dass es sich bei diesen
um symptomlose „Carrier“ handelt, da Genomfragmente des Virus anschließend auch bei den
zuvor naiven Karpfen gefunden wurden. SADLER et al. (2008) beschrieben, dass nach
Ausbruch einer durch KHV bedingten Tierseuche mit massenhaften Verlusten an Koi in einer
kommerziellen Zuchtanlage auch Goldfische des gleichen Zirkulationssystems als „Carrier“
ausgemacht werden konnten. Die Goldfische waren somit dem KHV natürlich ausgesetzt. Der
Nachweis erfolgte mittels quantitativer real-time PCR nach GILAD et al. (2004) lange Zeit
nach Auftreten der Mortalität, was die Autoren weiter vermuten lässt, dass infizierte
Goldfische auch infektiöses Virus ausschütten und sich somit als potentielle Vektoren für das
KHV darstellen könnten. Auch BERGMANN et al. (2009) bestätigten, dass der Goldfisch
Träger des KHV sein kann ohne selbst zu erkranken. Außerdem wurde beschrieben, dass
Goldfische nicht nur als Vektoren für das Virus anzusehen sind. Es konnte zudem eine
Virusreplikation in infizierten Fischen beobachtet werden, die unter Stress auslösenden
Umständen auch Virus ausschütten und auf naive Karpfen übertragen (EL-MATBOULI u.
SOLIMAN 2010). BERGMANN et al. (2010a) zeigten, dass sich Goldfische mit
Zellkulturvirus in einer Konzentration von 103 TCID 50 reproduzierbar mit KHV-I infizieren
lassen und dass das Virus anschließend mit verschiedenen Nachweismethoden wie PCR,
IFAT und ISH nachgewiesen und ebenfalls infektiöses Virus auf naive Karpfen übertragen
werden kann. In weiteren Studien zeigten BERGMANN et al. (2010d), dass auch Hybriden
(Koi x Goldfisch, Koi x Karausche) für das Virus empfänglich waren und nach einer
Infektion sogar Anzeichen einer symptomatischen Erkrankung mit Mortalität aufwiesen.
Das Spektrum der Arten, die für das Virus empfänglich sind, wurde stetig erweitert.
Russische und atlantische Störe (A. gueldenstaedtii and. A. oxyrinchus), die häufig in
Aquakulturanlagen zusammen mit Karpfen gehalten werden, wurden positiv getestet. In
diesem Zusammenhang wurde allerdings nicht überprüft, ob diese Fische das Potential haben
Literaturverzeichnis 34
gesunde Karpfen zu infizieren und wie hoch dieses ist (KEMPTER et al. 2009). Des Weiteren
wurde die Rolle von Mollusken und Crustaceen, die mittels nested-PCR positiv auf KHV-
spezifische Genomsequenzen getestet wurden, diskutiert. Diese Detritus verarbeitenden und
filtrierenden Organismen stehen im Verdacht, befähigt zu sein, das KHV oder Virusfragmente
in ihren Organen zu akkumulieren, ohne dass eine Virusreplikation stattfindet (KIELPINSKI
et al. 2010).
2.2.5 Einfluss der Temperatur und Inkubationszeit
Die Inkubationszeit bis zum Auftreten der ersten klinischen Symptome und die Schwere des
Verlaufes der Erkrankung werden bei wechselwarmen Tieren wie Fischen vor allem durch die
Wassertemperatur bestimmt. Das humorale und zelluläre Immunsystem, sowie die
Virusvermehrung im infizierten Organismus werden vorrangig von der Temperatur
beeinflusst (BLY u. CLEM 1992). GILAD et al. (2003) stellte fest, dass der
Krankheitsverlauf stärker durch die Wassertemperatur beeinflusst wurde als durch die
Konzentration der verabreichten Viruslösung und Karpfen auch schon für geringe
Viruskonzentrationen in einem bestimmten Temperaturbereich hoch empfänglich sein
können. WALSTER et al. (1999) beschrieben KHV-Ausbrüche bei Temperaturen zwischen
15 und 28 °C. Infizierte Fische, die bei Temperaturen unter 13 °C und über 30 °C gehalten
wurden, zeigten keine Symptome der Erkrankung (POKOROVA et al. 2005). GILAD et al.
(2003) infizierten Karpfen mit 1,2 KID50/ml und 12 KID50/ml KHV-haltiger Lösung mittels
Immersionsbad und hälterten diese bei 13, 18, 23 und 28°C. Unterschiede in der Mortalität
bezüglich der verschiedenen Infektionsbäder waren nicht signifikant. Allerdings zeichnete
sich bezüglich der Hälterungstemperatur ein deutlicher Unterschied in der Mortalität ab. Bei
18, 23 und 28 °C betrug die Mortalität mehr als 90 %. Die bei 13 °C gehälterten Fische
zeigten hingegen weder Krankheitssymptome noch Mortalität. 30 Tage nach der Infektion
wurde die Wassertemperatur bei der Hälfte beider Gruppen, die bei 13 °C gehalten wurden
auf 23 °C erhöht und es konnte ebenfalls eine Mortalität von 90 % mit nicht signifikantem
Unterschied in der Inkubationszeit zu den anderen Infektionsgruppen beobachtet werden. Die
verbliebenen Fische wurden nach zwei Monaten einer Temperaturerhöhung von 13 auf 23° C
unterzogen und zeigten keine Anzeichen einer Erkrankung. Die Autoren deuteten daraus, dass
Literaturverzeichnis 35
ein seuchenhafter Ausbruch der KHV-Infektion eine durch den Anstieg der Wassertemperatur
im Frühjahr oder Sommer hervorgerufene Aktivierung einer Infektion darstellen kann, die bei
geringen Temperaturen übertragen wurde, bei denen keine Virusvermehrung möglich war.
Die Erkrankung manifestierte sich innerhalb von drei Tagen nach dem Zusetzen naiver
Karpfen in einen Teich, der mit an KHV erkrankten Fischen besetzt war (WALSTER 1999).
Während andere Autoren die Erkrankung erst acht bis 21 Tage nach der Kohabitation in zuvor
naiven Fischen diagnostizierten (BRETZINGER et al. 1999; HEDRICK et al. 2000).
2.2.6 Latenz
Das charakteristische Merkmal aller Herpesviren ist die Fähigkeit, nach der Erstinfektion
lebenslang latent im Wirtsorganismus zu verbleiben. Die Zellen überleben in dieser Phase und
(ROIZMAN u. PELLET 2001) die Produktion von Viruspartikeln ist unterbunden. Eine
Reaktivierung aus diesem Zustand zurück zum lytischen Infektionszyklus ist jedoch
wiederholt möglich. Diese äußert sich meist in einem Krankheitsbild, das dem der
Primärinfektion entspricht (MODROW et al. 2010). Ein latent mit KHV infizierter Fisch trägt
somit das Virus, welches sich in einem inaktiven Zustand befindet, ohne Anzeichen der
Erkrankung zu zeigen. Solche Fische werden als „Carrier“ bezeichnet und sie können nach
einer stressinduzierten Virusreaktivierung vermehrungsfähige Virionen ausscheiden und auf
naive Karpfen übertragen (GILAD et al. 2004; ST-HILAIRE et al. 2005). Sowohl nach
experimenteller Infektion, als auch nach Kontakt mit KHV unter natürlichen Umständen
können Karpfen, die eine Infektion überlebt haben, als potentielle „Carrier“ betrachtet werden
(GILAD et al. 2004; HEDRICK et al. 2005). In diesem Zusammenhang scheint die
physiologische Verfassung des Wirtes von großer Bedeutung zu sein (ROIZMAN u. PELLET
2001). MEYER (2007b) setzte in ihren Experimenten Karpfen mit einer latenten Infektion
diversen Stresssituationen, wie zum Beispiel einem simulierten Transport oder einer
Befischung aus und induzierte so eine Virusreaktivierung verbunden mit einer erneuten
Virusausscheidung und einem subklinischen Verlauf. Die Dauer der Persistenz wird vor allem
durch die Wassertemperatur beeinflusst, ist aber auch von der Virulenz des Virus, dem Alter,
der Kondition und der Populationsdichte der Karpfen sowie anderen Stressfaktoren
Literaturverzeichnis 36
(Transport, Laichzeit, Wasserqualität) abhängig. Typischerweise tritt die Erkrankung bei
Temperaturen zwischen 16 und 25 °C vermehrt auf (HEDRICK et al. 2000; DENHAM 2003;
GILAD et al. 2003; ADKISON et al. 2005).
Eine ähnliche Situation konnte bei Infektionen mit CyHV-1 beobachtet werden. Das dem
KHV nah verwandte Virus verursacht die „Karpfenpocken“ als Krankheitsbild. Typisch für
das CyHV-1 ist ebenfalls die Etablierung einer Latenzphase nach der Primärinfektion in der
das äußere Erscheinungsbild der Fische nicht durch „Pocken“ geprägt ist. Jedoch kann
beobachtet werden, dass abhängig von verschiedenen Umweltparametern diese Hautläsionen
erneut auftreten können, was vorzugsweise bei niedrigen Wassertemperaturen der Fall ist,
wenn Fische hauptsächlich auf die angeborene Immunantwort angewiesen sind (SANO et al.
1991; SANO et al. 1993; ADKISON et al. 2005).
2.3 Geschichte, Verbreitung und Epidemiologie des KHV
2.3.1 Geschichte
Die erste Infektion von Koi mit dem Koi-Herpesvirus wurde im Jahr 1998 beschrieben
(BLOOM 1998). Das Krankheitsbild kennzeichnete sich durch eine Vielgestaltigkeit der
Symptome und einen hohen Befall mit anderen Pathogenen. Deshalb wurde angenommen,
dass die Primärinfektion eine Immunsuppression zur Folge hatte, weshalb die Erkrankung als
K.I.S.S. (Koi Immune System Suppressing Disease) bezeichnet wurde. Im Jahre 1998 wurde
ebenfalls von massenhaften Verlusten in Koi- und Konsumkarpfenbeständen in Israel und den
Vereinigten Staaten berichtet (ARIAV et al. 1999; HEDRICK et al. 2000). Spätere Analysen
von archivierten Proben bestätigten, dass das Virus bereits im Jahre 1996 zu Verlusten in
Wildkarpfenbeständen in Großbritannien geführt hatte (WALSTER 1999). Kurz nach dem
ersten Bericht traten bereits Ausbrüche mit Massenverlusten in verschiedenen Ländern
Europas, Asiens und Afrikas auf. Heutzutage ist das Virus weltweit verbreitet und verursacht
massive finanzielle und ökonomische Verluste in der Koi- und Speisekarpfenindustrie
(POKOROVA et al. 2005). BRETZINGER et al. (1999) beschrieben vor allem dominante
Hautveränderungen und Nekrosen im Bereich des Kiemenepithels. Im Jahre 2000 wurde das
Literaturverzeichnis 37
Virus erstmals isoliert und einzelne Partikel mittels Elektronenmikroskopie nachgewiesen
(HEDRICK et al. 2000). Anhand von vergleichenden Studien stellten WALTZEK et al.
(2005) eine hohe morphologische und antigenetische Ähnlichkeit zu den bereits bekannten
Cypriniden Herpesviren (CyHV) wie CyHV-1, dem Verursacher der Karpfenpocken und zu
CyHV-2, welches die hämatopoetischen Nekrose bei Goldfischen auslöst, fest. Auf Grund
dieser Tatsachen bezeichneten sie es als CyHV-3 oder alternativ als KHV, da es zuerst in Koi
beschrieben wurde.
2.3.2 Globale Verbreitung
Infektionen mit dem Koi-Herpesvirus stellen seit Ende 90er Jahre eine zunehmende
Bedrohung für die Karpfenteichwirtschaft und die Koizucht dar. Krankheitsausbrüche, die in
Zusammenhang mit KHV gebracht werden konnten, wurden vor allem in Israel und den USA
in Koi- und Speisekarpfenbeständen beschrieben (ARIAV et al. 1999). Durch intensiven
Fischhandel wurde eine rasche Verbreitung des Virus vorangetrieben. So waren
beispielsweise Ende der 2000er Jahre über 90 % der israelischen Fischfarmen von KHV-
Infektionen betroffen. Der Aquakultursektor beklagte wirtschaftliche Verluste in Höhe von
bis zu 300 Millionen US Dollar jährlich (PERELBERG et al. 2003). Durch unkontrollierten
Handel vorwiegend mit Zierkarpfen kam es schnell zu einer weltweiten Verbreitung der
viralen Erkrankung. In Europa wurden KHV-Ausbrüche zum Beispiel in Belgien, Dänemark,
Deutschland, Frankreich, Großbritannien, Italien, Österreich, Luxemburg, den Niederlanden,
Polen und der Schweiz (DENHAM 2003; HAENEN et al. 2004; SCHLOTFELDT 2004;
BERGMANN et al. 2006) beschrieben. In Asien wurde über Ausbrüche in China (HAENEN
et al. 2004), der Provinz Taiwan (TU et al. 2004), Indonesien (SUNARTO et al. 2005), Japan
(SANO et al. 2004), Korea (CHOI et al. 2004), Malaysia (HAENEN et al. 2004), Singapur
und Thailand (HAENEN et al. 2004), Taiwan und Thailand berichtet (HAENEN et al. 2004).
Auch Südafrika und die USA beschrieben durch das KHV verursachte Verluste in
Karpfenbeständen (HEDRICK et al. 2000; GRAY et al. 2002; TERHUNE et al. 2004).
Derzeit wird lediglich Australien als KHV-frei angesehen (BAUR 2010).
Literaturverzeichnis 38
2.3.3 Nationale Verbreitung
In Deutschland wurden Infektionen mit KHV bei Koi und seit 2003 auch bei Speisekarpfen in
Teichwirtschaften der meisten Bundesländer beobachtet. Außerdem erfolgte bereits ein
Nachweis der Infektion bei Fischen in öffentlichen Gewässern Deutschlands, wie
beispielsweise im Jahre 2008 als der Landesbetrieb Hessisches Landeslabor in Gießen eine
Infektion mit KHV amtlich in zwei verendeten Karpfen aus der Lahn festgestellte. Vor allem
sind aber die teichwirtschaftlich intensiv genutzten Regionen in Bayern und Sachsen von
Verlusten betroffen. Die sächsische Oberlausitzer Heide- und Teichlandschaft mit über 335
Teichen stellt das größte für die Karpfenzucht wirtschaftlich genutzte Teichgebiet Europas
dar. Erste mit der Koi-Herpesvirose in Zusammenhang gebrachte Verluste wurden im Jahre
2002 diagnostiziert. Seit diesem Jahr hat sich die Anzahl der betroffenen Betriebe von drei
auf 26 erhöht (BÖTTCHER et al. 2009). Die Erkrankung nimmt zumeist einen seuchenhaften
Verlauf und erfasst ganze Teichgruppen einzelner Betriebe und verursachte seit Beginn der
KHV-Problematik einen wirtschaftlichen Gesamtschaden von mehreren Millionen Euro. In
bayrischen Teichwirtschaften sind die wirtschaftlichen Verluste durch Infektionen mit dem
KHV weniger drastisch. Ein KHV-Monitoring mittels ELISA im Jahre 2008 ergab allerdings,
dass 63 % der untersuchten Betriebe positiv auf Antikörper gegen KHV getestet werden
konnten, 21 % der Betriebe als verdächtig eingestuft wurden und nur in 16 % der Betriebe
keine Antikörper nachgewiesen werden konnten (FENEIS et al. 2009). Aber auch andere
Bundesländer wie beispielsweise Thüringen hatten teilweise empfindliche Verluste zu
beklagen. Im Jahre 2004 kam es in einer thüringer Karpfenteichwirtschaft zu einem KHV-
Ausbruch, der einen Ausfall von 80 t Karpfen mit einem Marktwert von 310.000 Euro
verursachte. Zusätzlich mussten 106.000 Euro für die Desinfektion und Sanierung
aufgebracht werden (BOCKLISCH et al. 2006).
2.3.4 Epidemiologie
Infektionen mit KHV stellen ein erhebliches Problem für die Speisekarpfen produzierende
Industrie und den Koihandel dar (HAENEN et al. 2004). Intensive Fischereiwirtschaft mit
unzureichenden Hygienemaßnahmen, internationaler Handel ohne Gesundheitskontrollen und
Literaturverzeichnis 39
Zierfischausstellungen sind ursächlich für die rasante weltweite Verbreitung des KHV.
Krankheitsausbrüche in den betroffenen Betrieben sind oft mit erheblichen finanziellen
Verlusten verbunden (GILAD et al. 2002; GILAD et al. 2003; WAY et al. 2004). KHV-
Ausbrüche in zuvor unauffälligen Zier- und Nutzbeständen sind häufig nach Zukauf und
Einbringen neuer Fische zu beobachten. Eine besondere Rolle bei der Verbreitung spielen in
diesem Zusammenhang gesund erscheinende Carrierfische. Diese symptomlosen Virusträger
sind trotz Einhalten der Quarantänevorschriften als größtes Risiko bei der Virusverbreitung
anzusehen. Neben diesen Lebendfischbewegungen stehen auch Kontakte durch Personen,
Geräte und Wasser zu anderen Betrieben, das Aussetzen von KHV-infizierten Zier- und
Speisekarpfen und weitere Fischspezies als symptomlose Überträger im epidemiologischen
Zusammenhang (BLOOM 1998; BRETZINGER et al. 1999; WALSTER 1999; NEUKIRCH
u. KUNZ 2001).
2.3.5 Molekulare Epidemiologie
Drei nicht verwandte Virusstämme des KHV, isoliert in Israel (KHV-I), Japan (KHV-J) und
den USA (KHV-U) wurden bislang komplett sequenziert (AOKI et al. 2007). Trotz der hohen
geographischen Distanz ihrer Herkünfte besitzen sie eine sehr hohe
Sequenzübereinstimmung. Eine geringe Diversität der Sequenzen unter verschiedenen
Stämmen scheint charakteristisch für das CyHV-3 zu sein. KURITA et al. (2009)
untersuchten die Nukleotidsequenzen von drei verschiedenen Regionen des KHV-Genoms
und verglichen diese. Verwendet wurde die Sph I-5 Region von GRAY et al. (2002), die 9/5
Region von GILAD et al. (2002) und eine erweiterte Region, die des Thymidinkinase-Gens
von BERCOVIER et al. (2005). Untersucht wurden 34 Virusisolate aus Japan, sechs aus
Indonesien, zwei aus Taiwan, 13 Isolate aus den Niederlanden und jeweils eins von den
Philippinen, aus Großbritannien, den USA und Israel. Die Virusisolate aus den asiatischen
Ländern waren untereinander äußerst homogen, sowie die Europäischen untereinander auch
durch eine hohe Homogenität gekennzeichnet waren. Die Ergebnisse suggerieren, dass
zwischen asiatischen und europäischen KHV-Isolaten ein klarer genetischer Unterschied
besteht, inklusive der einzelnen Isolate aus den USA und Israel.
Literaturverzeichnis 40
2.4 Therapie, Kontrolle und Prophylaxe
Therapeutische Maßnahmen wie Chemotherapie oder Behandlung mit Immunstimulantien
sind derzeit nicht bekannt und sind des Weiteren auch als wenig sinnvoll zu betrachten, da es
lediglich zur Verschleierung des Krankheitsverlaufes kommen würde. Auf Grund des meist
akuten Verlaufs würde sich die Frage auch nur in wenigen Fällen stellen. Als wirkungsvolle
Bekämpfungsmaßnahme nach Ausbruch der Fischseuche hat sich in der Praxis eine
längerfristige Trockenlegung des betroffenen Gewässers mit begleitenden
Desinfektionsmaßnahmen erwiesen (BAUR 2010).
Für die Kontrolle des KHV wurden drei verschiedene Ansätze beschrieben:
1) Ein verbessertes Management und diverse wirtschaftliche Maßnahmen um einen
internationalen Handel mit zertifizierten KHV-freien Karpfen zu begünstigen.
2) Die Zucht mit KHV-resistenten Karpfen
Eine Resistenz von Karpfen gegen das KHV scheint durch verschiedene genetische
Wirtsfaktoren bedingt zu sein. Anhand von Kreuzungsversuchen zwischen verschieden
domestizierten Karpfenstämmen und einem resistenten Wildkarpfenstamm demonstrierten
SHAPIRA et al. (2005) sowie DIXON et al. (2009) Unterschiede in der Überlebensrate der
jeweiligen Karpfenkreuzung. Weitere Studien über die Rolle der genetischen Wirtsfaktoren
bezüglich der Resistenz gegen das KHV zeigen, dass Gene der MHC-Klasse-II diese
Resistenz beeinflussen (RAKUS et al. 2009).
3) Die Prophylaxe mit Vakzinen
RONEN et al. (2003) entwickelten nach der Charakterisierung des KHV einen Ansatz zur
Induktion einer Immunantwort in Karpfen, welcher auf der Tatsache basierte, dass
Literaturverzeichnis 41
krankheitsspezifische Symptome nur zwischen 18 und 28 °C zu beobachten sind. Uninfizierte
Karpfen wurden drei bis vier Tage dem KHV bei permissiven Temperaturen (22–23 °C)
ausgesetzt und anschließend für 30 Tage bei nicht permissiven Temperaturen über 30 °C
gehältert. Nach einer erneuten Infektion waren 60 % der Fische resistent gegen das Virus.
Allerdings überwiegen bei dieser Methode die Nachteile. Die hohen Wassertemperaturen
begünstigen Sekundärinfektionen und auch der Energieverbrauch ist hoch, nur 60 % der
Fische sind resistent, die Fische stellen eine potentielle Gefahr für naive Populationen dar, da
sie mit virulenten Virus vom Wildtyp infiziert wurden. Nur attenuierte Lebendvakzine
scheinen für die Massenimpfung geeignet. Derzeit wird nur ein attenuierter Impfstoff
produziert. Der Vertrieb durch die Firma KoVax Ltd. (Jerusalem, Israel) ist allerdings auf
Israel beschränkt und das Produkt hat den Nachteil, dass die molekulare Basis der
Virulenzreduktion nicht bestimmt ist und außerdem nicht ausgeschlossen werden kann, dass
eine Reversion zum pathogenen Phänotyp stattfindet (PERELBERG et al. 2008). Des
Weiteren wurde ein Vakzin durch YASUMOTO et al. (2006) beschrieben, welches oral über
das Futter verabreicht wird. Es gewährleistet eine Schutzeffizienz von 70 %. Hierbei handelt
es sich um ein formalininaktiviertes Virus, welches von liposomalen Kompartimenten
umschlossen ist. BOUTIER et al. (2015) entwickelten den ersten Ansatz zur Massenimpfung
von Karpfen mittels eines rekombinanten, attenuierten Vakzins gegen KHV.
2.5 Tenazität und Desinfektion
In israelischen Studien wurde gezeigt, dass KHV-Partikel außerhalb des Wirtsorganismus in
Wasser nach vier Stunden bei Temperaturen zwischen 23–25 °C noch aktiv sind, aber nicht
mehr nach 21 Stunden (PERELBERG et al. 2003). SHIMIZU et al. (2006) demonstrierten in
ihren Studien, dass eine signifikante Reduktion des Virustiter nach drei Tagen in natürlichen
Gewässern oder in Sedimentproben bei 15 °C zu beobachten war. In vergleichbarem Wasser,
welches zuvor autoklaviert oder filtriert wurde, blieb das Virus über einen Zeitraum von mehr
als sieben Tagen infektiös. Bei pH-Werten zwischen 5–8 können Herpesviren über mehrere
Wochen stabil bleiben und erst Temperaturen über 25 °C führen zu einer leichten
Schwächung der Infektiosität (ROLLE u. MAYR 2007). Aufgrund ihrer Lipidhülle zeigen
Literaturverzeichnis 42
sich die Virionen allerdings gegenüber gängigen Desinfektionsmitteln nur als geringfügig
widerstandsfähig (NEUKIRCH 2003). Viruslösungen verlieren bei pH-Werten unter drei und
über 11 innerhalb von zwei Stunden ihre Infektiosität gegenüber Zellkulturen.
Eine Inaktivierung des KHV ist außerdem bei einer UV-Strahlendosis von 4,0 x 10³ µWs/cm²
und bei Temperaturen über 50 °C für eine Minute gegeben. Eine effektive Inaktivierung wird
ebenfalls durch Auftragen einer Iodophor-Lösung in einer Konzentration von 200 mg/l, einer
Benzalkoniumchlorid-Lösung in einer Konzentration von 60 mg/l oder durch 30 %iges
Ethanol jeweils mit einer Einwirkzeit von 20 min erreicht. Ebenfalls kann eine
Natriumhypochloritlösung in einer Konzentration von 200 mg/l und einer Einwirkzeit von
30 sec verwendet werden (KASAI et al. 2005).
Laut World Organisation for Animal Health (OIE 2010) sollten alle Methoden zur Kontrolle
und Prävention einer Erkrankung mit KHV darauf beruhen, eine Exposition mit infektiösen
Viruspartikeln zu vermeiden, unter gleichzeitigem Aufrechterhalten des erforderlichen
Hygienestatus.
2.6 Diagnostik von KHV
Die Diagnose einer KHV-Infektion am lebendigen Fisch ist bis heute mit den zur Verfügung
stehenden Nachweismethoden nicht eindeutig möglich. Nicht letale Probennahmen in Form
von Kiemen- und Flossenbioptaten unter Narkose sind als zweifelhaft bezüglich eines
Nachweises des KHV-Genoms anzusehen, da bei klinisch unauffälligen und gesunden
„Carriern“ spezifische DNA-Sequenzen nicht sicher nachgewiesen werden können
(PIKARSKY et al. 2004). Auch die Untersuchung von Kot, Blut, Haut und Schleim mit
direkten Nachweismethoden ist möglich, aber auch hier gelingt ein Virusnachweis nicht
zuverlässig und birgt die Gefahr ungenauer Ergebnisse (DISHON et al. 2005; POKOROVA
et al. 2005). Indirekte antikörperbasierte Nachweisverfahren wie der ELISA oder der Serum
Neutralisationstest (SNT) können ebenfalls mit in nicht letalen Untersuchungen gewonnen
Blutproben durchgeführt werden, doch besteht auch hier die Gefahr infizierte Fische im
Literaturverzeichnis 43
Frühstadium der Infektion oder gesund erscheinende „Carrier“ nicht zu detektieren
(POKOROVA et al. 2005).
2.6.1 PCR
PCR-basierte Detektionssysteme stellen zurzeit die aussagekräftigsten Mittel zur KHV-
Nachweisführung dar und eine Vielzahl an genomischen Methoden, wie Standard-PCRs,
nested PCRs, TaqMan PCRs und die Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) mit
jeweils unterschiedlicher Sensitivität und Spezifität wurden bereits publiziert (GILAD et al.
2002; GRAY et al. 2002; GILAD et al. 2004; BERCOVIER et al. 2005; HUTORAN et al.
2005; BERGMANN et al. 2006; BERGMANN et al. 2010c; SOLIMAN u. EL-MATBOULI
2010) und werden auch von der (OIE 2010) empfohlen. Die real-time PCR nach GILAD et al.
(2004) zusammen mit einem internen Qualitätskontrollsystem (HOFFMANN et al. 2006),
wird zurzeit als goldener Standard in der Routinediagnostik angesehen und erlaubt die
Detektion von fünf bis 10 Viruspartikeln im Ausgangsmaterial. Diese wird neben der etwas
weniger sensitiven PCR nach Gilad (GILAD et al. 2002) und der nested PCR (BERGMANN
et al. 2006) mit den Primerpaaren KHV-1Fn-1Rn auch vom Nationalen Referenzlabor für die
Koi-Herpesvirusinfektion, Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesinstitut für Tiergesundheit, Insel
Riems empfohlen. Wohingegen von der weiterhin von der OIE empfohlen PCR nach
BERCOVIER et al. (2005) für diagnostische Zwecke abgeraten wird, da mit dieser PCR
DNA-Sequenzen von in Europa neu vorkommenden KHV-Stämmen nicht detektieren werden
können (BERGMANN et al. 2010c).
2.6.2 Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Der ELISA stellt eine indirekte Nachweismethode dar, die verwendet wird, um durch
Messung des Antikörperspiegels die Immunantwort infizierter Fische zu quantifizieren
(HEDRICK et al. 2000). Detektiert werden dabei KHV-spezifische Antikörper im
Karpfenserum (ADKISON et al. 2005). ELISA-Testverfahren verfügen über eine hohe
Sensitivität, jedoch sind sie wenig spezifisch. Beschrieben wurden bereits Kreuzreaktionen
Literaturverzeichnis 44
mit dem CyHV-1 (ADKISON et al. 2005). Das KHV-Monitoring in England und Wales
basiert primär auf Daten, die mittels ELISA-Untersuchungen erstellt wurden. TAYLOR et al.
(2010) konnten Kreuzreaktionen mit dem CyHV-1 in Serumverdünnungen bis 1:400
beobachten. In höheren Verdünnungsstufen, von 1:800 bis 1:1600, hingegen traten diese nicht
mehr auf, allerdings verringert sich dadurch die Konzentration der spezifischen Antikörper im
Serum. Eine weitere Schwachstelle dieser indirekten, antikörperbasierten Methode ist, dass
Antikörper produzierende Immunzellen einen gewissen Zeitraum der Aktivierung benötigen,
sodass zu Beginn der Infektion noch keine Antikörper in Serum vorliegen. Außerdem
produziert ein Fisch nach überstandener Erkrankung nur noch wenig bis keine KHV-
spezifischen Antikörper, weshalb auch die nachweisbare Konzentration im Serum abnimmt.
Also können Fische im Frühstadium einer Infektion, sowie latente Virusträger Jahre nach der
Erstinfektion nicht erfasst werden (HARTMANN et al. 2004). Des Weiteren sind die
serologischen Zusammenhänge der Antikörperkinetik nach einer KHV-Infektion noch nicht
eindeutig beschrieben (ADKISON et al. 2005; PERELBERG et al. 2008) und auf Grund
dieser Tatsache empfiehlt die OIE, ELISA-Verfahren nicht in der Routinediagnostik zu
verwenden.
2.6.3 Zellkultur
Die Isolation des Virus in Zellkulturen war die erste Methode, mit der KHV in Geweben von
erkrankten Fischen nachgewiesen werden konnte (HEDRICK et al. 2000). Die Virusanzucht
kann auf der KF-1 Zelllinie nach HEDRICK et al. (2000) und der CCB Zelllinie nach
NEUKIRCH et al. (1999) durchgeführt werden. Der Virusnachweis gelingt in Zellkulturen
allerdings nur zuverlässig bei Fischen mit einer klinischen Erkrankung und ist außerdem sehr
zeitaufwendig. Da die Sensitivität der Virusisolation geringer ist als die der zurzeit
verwendeten PCR-Methoden, können Proben die keinen CPE in der Zellkultur verursachen,
nicht als zwingend negativ angesehen werden und müssten somit im Anschluss an die
Kultivierung noch mit einem der zuvor beschriebenen molekularen Ansätze weiter untersucht
werden (HAENEN et al. 2004). Auf Grund dieser Tatsachen eignet sich die Zellkultur nicht
zur Routinediagnostik.
Literaturverzeichnis 45
2.6.4 Elektronenmikroskopie
Der elektronenmikroskopische Nachweis erfolgt durch Visualisierung von
Einschlusskörperchen und Viruspartikeln in den Organen (MIYAZAKI et al. 2008).
Herpesviruspartikel wurden bereits in Zellkernen und Zytoplasma von Kiemenepithelzellen,
im Darmgewebe und Leukozyten von Fischen mit einer akuten Infektion nachgewiesen
(BRETZINGER et al. 1999; HEDRICK et al. 2000; HOFFMANN et al. 2000; PIKARSKY et
al. 2004; HUTORAN et al. 2005). Allerdings ist die Identifizierung KHV-spezifischer
Partikel sehr schwierig. Es sind außerdem sehr hohe Viruskonzentrationen für den Nachweis
erforderlich, weshalb Fische aus latent infizierten Beständen nicht als Virusträger zu erfassen
sind. Auf Grund dieser Unzulänglichkeiten sollte der elektronenmikroskopische Nachweis in
der Routinediagnostik nicht angewandt werden.
2.7 Differentialdiagnose
Eine differentialdiagnostische Aussage gestaltet sich zu meist kompliziert. Eine hohe
Morbiditäts- und Mortalitätsrate kann ebenfalls auf eine für die Fischhaltung unzureichende
Wasserqualität zurückzuführen sein und beispielsweise auch durch hohe Ammonium- und
Nitritkonzentrationen ausgelöst werden (ARIAV et al. 1999). Symptome wie Haut- und
Kiemenschäden, Dyspnoe, Apathie und zentralnervöse Ausfallerscheinungen, die typisch für eine
KHV-Infenktion sind, können ebenfalls durch Probleme in der Wasserchemie ausgelöst werden
(BAUR u. RAPP 2003). Bakterielle, mykotische und parasitologische Primärinfektionen sollten
ebenfalls berücksichtigt werden, da diese ebenfalls zu Dermatitiden und Kiemennekrosen führen
können. Gleichermaßen sollten andere bei Karpfen auftretende virale Krankheiten ausgeschlossen
werden (HARTMANN et al. 2004). Die Diagnosefindung sollte möglichst durch
differentialdiagnostische Untersuchungen erfolgen.
2.8 Rechtslage
Seit Dezember 2005 ist die Koi-Herpesvirose in Deutschland in die nationale Verordnung für
anzeigepflichtige Tierseuchen aufgenommen worden. Außerdem wurde die Infektion mit dem
Literaturverzeichnis 46
Erreger in die Liste der bedeutsamen, nicht exotischen Krankheiten in der Neufassung der
Aquakulturrichtlinie (EU-Richtlinie 2006/88/EG) eingefügt. KHV-Ausbrüche sowie der
Verdacht auf einen Ausbruch unterliegen der Anzeigepflicht und sind unverzüglich der
zuständigen Behörde, an das Veterinäramt des Landkreises oder der kreisfreien Stadt anzuzeigen.
Bei Bestätigung der Verdachtsdiagnose muss mit der Tilgung des Krankheitsherdes unverzüglich
begonnen werden. In Deutschland dürfen allerdings mit Genehmigung der zuständigen Behörde
offensichtlich gesund erscheinende, ansteckungsverdächtige, bereits vermarktungsfähige Fische
geschlachtet oder an einen Betreiber verkauft werden, dessen Fische ebenfalls an KHV erkrankt
sind (BAUR 2010), um somit die wirtschaftlichen Schäden zu begrenzen.
3
Material und Methoden 47
4 Material und Methoden
4.1 Virus
4.1.1 Herkunft
Das für die Klonierung und in den Infektionsversuchen verwendete Virusisolat KHV-I- mit
der Listennummer 182 wurde aus dem deutschen Nationalen Referenzlabor für die Koi-
Herpesvirusinfektion, Friedrich-Loeffler-Institut, Bundesinstitut für Tiergesundheit, Insel
Riems, bezogen. Anwendung fand die 6. Passage des während eines Ausbruches in Israel
isolierten Virusisolates (HEDRICK et al. 2000), welches auf Zellen der Cyprinus Carpio
Brain Zelllinie (CCB) vermehrt wurde. Der Virustiter betrug 5000 KID50/ml.
Die in den Infektionsversuchen mit Wildfischen eingesetzte Viruslösung hatte eine
Infektiosität von 102,75 (275) KID50/ml bzw. 105,62 (562) KID50/ml.
4.1.2 Zellkultur
Zur Virusvermehrung und Virustitration wurde die Karpfenzelllinie CCB verwendet
(NEUKIRCH et al. 1999). Kultiviert wurden die Zellen in supplementiertem Minimum
Essential Medium wie in Tabelle 2 dargestellt.
Tabelle 2: Bestandteile Kulturmedium CCB-Zellen
Komponenten Volumen Minimum Essential Medium (MEM) mit Earle´s Salz und L-Glutamin (PAA, Pasching) 500 ml D(+)-Glukose wasserfrei für die Zellkultur (Applichem, Darmstadt) 1,75 g Foetal Bovine Serum Standard Quality (PAA, Pasching) 50 ml Amino Acids Non Essential (PAA, Pasching) 5 ml Penicillin/Streptomycin (PAA, Pasching) 10 ml
Material und Methoden 48
Die Zellen wurden bei 20 °C bebrütet und in einem Abstand von vier bis fünf Tagen
subkultivert. Zur Subkultivierung wurde dem konfluenten Monolayer in einer 75 cm²
Zellkulturflasche (Nunc, Wiesbaden) 5 ml einer Lösung aus „Dulbecco`s“ PBS (PAA,
Pasching), 0,05 % Trypsin (PAA, Pasching) und 0,0 2% EDTA (PAA, Pasching)
hinzugegeben, um die Zellen vom Boden der Zellkulturflaschen zu lösen. Um eine
schädigende Wirkung des Trypsins zu vermeiden, wurden zur Neutralisation 5 ml
Zellkulturmedium hinzupipettiert. Durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren mit einer 15 ml
Einmalpipette wurden die Zellen suspendiert und die Lösung anschließend im Verhältnis 1:2
auf zwei neue mit jeweils 10 ml Zellkulturmedium befüllten 75 cm² Zellkulturflaschen verteilt
werden.
4.1.3 Virusvermehrung
Zur Virusvermehrung wurden 5 ml von mit Virus versetztem Zellkulturmedium auf
24 Stunden alte CCB-Monolayer in 75 cm2 Zellkulturflaschen gegeben und eine Stunde unter
Schwenken bei 25 °C inkubiert. Anschließend wurden 10 ml Zellkulturmedium hinzugegeben
und die Flaschen weiter bei 25 °C gelagert. Täglich erfolgte eine mikroskopische
Untersuchung des Zellrasens und morphologische Veränderungen wurden dokumentiert. Am
sechsten Tag der Inkubation wurden die Kulturflaschen nach Auftreten eines cytopathischen
Effekts bei -80 °C eingefroren. Bis zum Erhalt der benötigten Menge an Viruslösung wurde
dieser Prozess wiederholt. Im Anschluss wurden definierte Aliquote hergestellt und bei
-80 °C gelagert. Zur Bestimmung der Infektiosität des Virus und zur Anwendung in den
Infektionsversuchen wurde die zellhaltige Viruslösung bei Raumtemperatur aufgetaut und
unmittelbar weiterverarbeitet.
4.1.4 Virustitration
Die Bestimmung der Infektiosität des Virus wurde durch Titration mit der logarithmischen
Endpunktverdünnungsmethode auf einer Mikrotiterplatte nach Kärber (KÄRBER 1931)
durchgeführt. Zur Titration wurden Mikrotiterplatten (Nunc, Wiesbaden) mit 96 Vertiefungen
Material und Methoden 49
mit Flachboden und Nunclon-Beschichtung mit CCB-Zellen beimpft. 24 Stunden später
wurden in jede Vertiefung mit einem konfluenten Monolayer jeweils 0,2 ml einer
dekadischen, logarithmischen Verdünnungsreihe (10-1–10-9) der Viruslösung pipettiert. Je
Verdünnungsstufe wurden vier Vertiefungen beimpft. Zusätzlich wurde auf jeder
Mikrotiterplatte eine Kontrolle mitgeführt. Hierfür wurden vier Vertiefungen mit 0,2 ml
Zellkulturmedium inokuliert. Die beimpften Mikrotiterplatten wurden 14 Tage bei 25 °C in
einer Atmosphäre mit 2 % CO2 inkubiert. Täglich wurde der Zellrasen mikroskopisch
untersucht und Veränderungen dokumentiert. Es wurde speziell auf Verfärbungen des
Zellkulturüberstandes, abgelöste Zellen, Bildung von Riesenzellen und Plaques im Zellrasen
geachtet. Anhand der nach Bonin (1973) zitierten, modifizierten Methode nach Kärber (1931)
wurde die Infektiosität anschließend berechnet (KÄRBER 1931; BONIN 1973). Die
verwendete Viruslösung hatte einen Titer von 1.000 KID50/0,2 ml Medium. Sie diente als
Ausgangsmaterial für die Infektion von Karpfen, Wildfischen, für die Klonierungsversuche
sowie zur Herstellung positiver PCR-Kontrollen.
4.2 Versuchstiere
Alle Tierversuche wurden vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und
Lebensmittelsicherheit unter dem Aktenzeichen 09/1626 genehmigt.
4.2.1 SPF-Fische
In den Kohabitations- und Infektionsversuchen wurden Karpfen (Cyprinus carpio) aus
Laborzucht verwendet. Diese wurden parasiten- und virusfrei aufgezogen und entstammten
als Geschwistertiere einer Kreuzung von Karpfen der Karpfenstämme R8 und R3:
R8F10 x R3F10 (Agricultural University Wageningen, Niederlande). Zum Zeitpunkt der
Versuchsreihen betrug das Gewicht der sechs Monate alten SPF-Karpfen durchschnittlich
15 g. Um auszuschließen, dass es zu einem vorherigen Zeitpunkt zu einer KHV-Infektion
kommen konnte, wurden vor Versuchsbeginn Gewebeproben von sechs Fischen auf die
Material und Methoden 50
Abwesenheit des KHV-Genoms überprüft. Die gleiche Anzahl an Fischen wurde gleichzeitig
mit KHV infiziert, um die Empfänglichkeit der Tiere für das Virus zu testen.
4.2.2 Aufzucht und Haltung
Die Karpfen wurden als befruchtete Eier von der Agricultural University Wageningen
(Niederlande) bezogen. Die Fische wurden in der Abteilung Fischkrankheiten und
Fischhaltung des Zentrums für Infektionsmedizin der Tierärztlichen Hochschule Hannover
unter spezifisch parasiten- und virusfreien (SPF) Bedingungen aufgezogen und in einer mit
rezirkulierendem Leitungswasser befüllten Kreislaufanlage bei 18–23 °C gehalten. Zur
Fütterung der Karpfen wurde handelsübliches Karpfenfutter (Skretting, Niederlande)
verwendet, welches einmal täglich in einer Menge von 1 % des Körpergewichts den Tieren
angeboten wurde.
Versuchsfische wurden in mit Leitungswasser befüllten 20–80 l desinfizierten Glasaquarien
gehalten. Teilwasserwechsel wurden regelmäßig durchgeführt. Des Weiteren wurden das
Allgemeinbefinden der Tiere und die Wassertemperatur täglich dokumentiert.
4.2.3 Handling
Während der Manipulation der Fische wurden Einmalhandschuhe getragen. Für jedes Becken
wurden separate Kescher (Rebie, Bielefeld), Schläuche (Eheim, Deizisau), Stabheizungen
(Eheim, Deizisau), Thermometer (Rebie, Bielefeld) und Narkosebecken (Rebie, Bielefeld)
verwendet. Vor dem Umsetzen von Versuchsfischen in andere Becken wurden diese mit
heißem Wasser gespült und anschließend mit 0,5 M Natronlauge (Applichem, Darmstadt)
desinfiziert.
4.2.4 Narkose und Tötung
Für die Narkose wurden die Fische in mit Leitungswasser befüllte 1,5 l Plastikaquarien
(Rebie, Bielefeld) umgesetzt. Das Narkosemittel MS 222 (Sigma-Aldrich, Taufkirchen)
Material und Methoden 51
wurde mit 150 mg/l Wasser dosiert. Die Fische verblieben bis zum Erlöschen des
Augendrehreflex in der Lösung. Für die Euthanasie wurde eine Dosierung von 500 mg/l
verwendet. Die Fische wurden dem Wasser entnommen, wenn keine Atembewegung mehr
festgestellt werden konnte.
4.2.5 Entnahme von Gewebeproben bei Karpfen
4.2.5.1 Gewebeproben für DNA-Extraktion
Von allen zu beprobenden Versuchskarpfen wurden Organproben bestehend aus Leber, Niere,
Milz, Gehirn und Kieme entnommen. Von Karpfen, die in Laborinfektion 2 zum Einsatz
kamen, wurden außerdem separat Proben von Haut und Flossen angefertigt. Die Organe
wurden in sterilisierte 2 ml Reaktionsgefäße (Eppendorf, Hamburg) überführt und pro Fisch
gepoolt. Für jeden Fisch wurde eine eigene sterilisierte Schere und Pinzette verwende. Die
entnommenen Gewebepools wurden für eine spätere Untersuchung mittels PCR auf KHV-
spezifische DNA-Sequenzen bei -80 °C gelagert.
4.2.5.2 Gewebeproben für RNA-Extraktion
Von allen zu beprobenden Kontroll- und Infektionskarpfen aus den Versuchen zur
Laborinfektion von verschiedenen Wildfischarten mit Zellkulturvirus wurden Organproben
bestehend aus Leber, Niere, Milz, Gehirn und Kieme entnommen. Von Karpfen, die in
Laborinfektion 2 zum Einsatz kamen, wurden außerdem separat Proben von Haut und Flossen
angefertigt. Die Organe wurden in zuvor mit 1 ml RNALater (QIAGEN, Hilden) sterilisierten
2 ml Reaktionsgefäße (Eppendorf, Hamburg) überführt und gepoolt. Für jeden Fisch wurde
eine eigene sterilisierte Schere und Pinzette verwende. Die entnommenen Gewebepools
wurden über Nacht bei 4 °C aufbewahrt und danach für eine spätere cDNA-Analyse bei
-20 °C gelagert.
Material und Methoden 52
4.2.6 Laborinfektion zur Prüfung der Empfänglichkeit von Karpfen für das KHV
Vor Versuchbeginn wurden sechs SPF-Karpfen mit in der Zellkultur vermehrtem KHV
infiziert, um die Empfänglichkeit der Tiere für das Virus zu testen. Zuvor narkotisierte
Versuchstiere wurden mit 0,1 ml KHV-Lösung (1000 KID50/0,2 ml) per Injektion i.p.
infiziert. Gleichzeitig wurde eine negativ-Kontrollgruppe bestehend aus sechs weiteren
Versuchskarpfen mit 0,1 ml PBS-Lösung (PAA, Pasching), wie bereits beschrieben, behandelt.
Die zwei Versuchsgruppen wurden jeweils in 20 l Plastikaquarien umgesetzt und für 14 Tage
bei 23 °C unter Durchführung regelmäßiger Teilwasserwechsel gehältert. In diesem Zeitraum
wurden die Karpfen im Hinblick auf das Auftreten von klinischen Symptomen unter
besonderer Berücksichtigung der für eine KHV-Infektion typischen Veränderungen
beobachtet. Nach 14 Tagen erfolgte die Euthanasie beider Gruppen. Anschließend wurden
Gewebeproben wie unter 3.2.5 beschrieben entnommen und bei -80 °C bis zur weiteren
Verwendung gelagert.
4.3 Wildfische
Die Haltung, das Handling, die Narkose und das Töten der Wildfische erfolgte wie unter 3.2
für Versuchskarpfen beschrieben.
4.3.1 Fang und Transport von Wildfischen
Für den Fang von Wildfischen aus Teichen mit akut mit KHV infizierten Karpfenbeständen
kamen vorrangig Reusen und Wurfnetze zum Einsatz. So konnte ein Ablassen des
Teichwassers vermieden werden, welches zusätzlichen Stress für die Tiere bedeutet hätte und
vermutlich zu weiteren Verlusten in den Karpfenbeständen geführt hätte. Fische aus
Ablaufgräben wurden mit Gleichstrom-Elektrobefischungsgeräten oder Bockreusen gefangen.
Fische aus Teichen mit latent mit KHV infizierten Karpfenbeständen wurden während der
Frühjahrs- oder Herbstbefischung aus der Fischsammelgrube nahe dem Mönch nach
Herablassen des Wasservolumens abgesammelt. Die Tiere wurden vor Ort zusammen mit
Material und Methoden 53
Teichwasser in lebensmittelechte Tüten (Lacers, Berlin) überführt, mit Sauerstoff versetzt,
verschlossen nach Hannover transportiert und wie unter 3.2 beschrieben in Hälterungsbecken
überführt.
4.3.2 Auswahl und Haltung von Wildfischen für die Laborinfektionsversuche
Die in diesem Versuchsteil verwendeten Fische wurden von einem Fischgroßhändler
bezogen, in dessen Beständen zuvor bei Kontrolluntersuchungen keine KHV-
Genomsequenzen nachgewiesen werden konnten und auch keine KHV-bedingten Verluste in
den Fischbeständen beobachtet wurden. Die Auswahl der verwendeten Fischarten orientierte
sich an dem zuvor in der Biozönose der Teichwirtschaften beobachteten Artenspektrum,
sowie nach der Verfügbarkeit beim Großhändler. Des Weiteren sollten auch Fischarten im
Versuch vertreten sein, die nicht der Familie der Karpfenfische angehören. Fünf Fische der
jeweiligen Art wurden vor Versuchsbeginn wie unter 3.2. beschrieben auf die Abwesenheit
von KHV-Genomsequenzen überprüft.
4.3.3 Entnahme von Gewebeproben bei Wildfischen
4.3.3.1 Gewebeproben für DNA-Extraktion
Gewebeproben wurden von Wildfischen für die DNA-Extraktion wie unter 3.2.5.1
beschrieben entnommen. Das Kiemengewebe von Wildfischarten aus der Feldstudie wurde
nicht für die Untersuchung auf KHV-Genomsequenzen herangezogen um falsch-positive
Ergebnisse durch von außen anhaftendes Virus auszuschließen.
4.3.3.2 Gewebeproben für RNA-Extraktion
Gewebeproben für die RNA-Extraktion von Wildfischen wurden wie unter 3.2.5.2
beschrieben entnommen. Das Kiemengewebe von Wildfischarten aus der Feldstudie wurde
Material und Methoden 54
nicht für die cDNA-Analyse herangezogen, um falsch-positive Ergebnisse durch von außen
anhaftendes Virus auszuschließen.
4.4 Felduntersuchungen
Die Auswahl der zu beprobenden Unternehmen und Teiche erfolgte in enger Zusammenarbeit
und in Absprache mit der Sächsischen Tierseuchenkasse (Fischgesundheitsdienst, Dresden)
und der Sächsischen Landesanstalt für Landwirtschaft und Geologie (LfULG, Königswartha).
Des Weiteren wurden die Termine für die Beprobung von akut infizierten Teichen mit den
Teichwirten an den betroffenen Teichen direkt abgesprochen, um zu Beginn des
Krankheitsausbruches eine Probennahme zu gewährleisten. Der Fang der Fische erfolgte in
Abstimmung und mit Unterstützung durch den betroffenen Betrieb und der LfULG.
Untersucht wurden Wildfische der Teichbiozönose, die mit latent infizierten Karpfen (K1–K3)
und mit akut infizierten Karpfen (K1, K3) besetzt waren sowie Ablaufgräben unterhalb dieser
Teiche. Außerdem wurden ein sanierter Teich und dessen Ablaufgraben in den
Untersuchungsumfang mit einbezogen. Dieser Teich wurde mit Branntkalk desinfiziert,
trocken gelegt und ein Jahr nach dem durch KHV bedingten Verlustgeschehen erneut mit
Karpfenbrut (KV) einer anderen zuvor negativ auf KHV getesteten Population besetzt.
Probenentnahmen wurden während des gesamten Untersuchungszeitraumes erst nach der
amtlichen Feststellung eines KHV-Ausbruches durch den sächsischen Fischgesundheitsdienst
und parallel zu zusätzlichen Kontrolluntersuchungen an zehn aus diesen Teichen entnommen
Karpfen inklusive Teichwasser. Diese Untersuchungen wurden in der Abteilung für
Fischkrankheiten und Fischhaltung der Tierärztlichen Hochschule Hannover durchgeführt.
4.4.1 Arbeitsplan in der Feldstudie
Innerhalb des Untersuchungszeitraumes wurden Teiche und Ablaufgräben während eines
akuten Ausbruches der KHV-Erkrankung insgesamt achtmal beprobt. Teiche, die mit einem
latent mit KHV infizierten Karpfenbestand besetzt waren, wurden im gleichen Zeitraum
ebenfalls achtmal beprobt. Fische aus dem sanierten und neu besetzten Teich wurden einmal
Material und Methoden 55
während der Herbstbefischung entnommen. Die Ablaufgräben des sanierten Teiches wurden
insgesamt an vier verschiedenen Terminen beprobt (siehe Tabellen 3, 4, und 5)
Tabelle 3: Übersicht der Probennahmen bei Karpfenteichen mit akutem KHV-Geschehen
Teich Besatz Anzahl der
Probennahmen Jahr der KHV-Infektion A K3 1 (07.2009) 2009 B K3 2 (09.2009) 2009 C K1 2 (09.2009/10.2009) 2009 D K1 2 (10.2009) 2009 E K3 1 (09.2009) 2009
Tabelle 4: Übersicht der Probennahmen bei Karpfenteichen mit latentem KHV-Geschehen
Teich Besatz Anzahl der
Probennahmen Jahr der KHV-Infektion 1 K2 1 (06.2009) 2007 2 K1 2 (07.2009/04.2010) + SPF 2008 3 K1 1 (11.2009) + SPF 2009 4 K2 1 (09.2009) 2008 5 Kv 1 (10.2009) 2009 6 Kv 1 (10.2009) + SPF 2009 7 K1 1 (09.2009) 2009
Erkärung: SPF: Kohabitation mit SPF-Karpfen
Tabelle 5: Übersicht der Probennahmen bei einem sanierten Karpfenteich
Ablauf/Teich Besatz Probennahme Jahr der KHV-Infektion Ablauf K1 05.2009 2008 Ablauf K1 06.2009 2008 Ablauf K1 07.2009 2008 Ablauf K1 09.2009 2008 Teich K2 04.2010 2008
Material und Methoden 56
4.4.1.1 Wildfische aus der Biozönose der Teiche
Bei den jeweiligen Probennahmen wurden Wildfische aus der Teichbiozönose entnommen.
Entsprechend des Vorkommens an Wildfischen sollten pro Teich jeweils mindestens 20
Fische pro relevanter Art einzeln beprobt werden. Das Artenspektrum, sowie die Anzahl an
Fischen variierten in den jeweiligen beprobten Teichen sehr stark, weshalb nicht immer die
gleichen Arten und Mengen in den Probenumfang einbezogen werden konnten. Eine
Übersicht über die beprobten Fischarten und die Anzahl untersuchter Individuen ist in Tabelle
6 zu finden. Die Wassertemperatur wurde ebenfalls vor Ort aufgenommen.
Tabelle 6: Gesamtzahl beprobter Wildfische unterschiedlicher Arten aus sächsischen
Karpfenteichwirtschaften, die auf KHV spezifische DNA-Sequenzen untersucht wurden
Beprobte Fischarten Akute Teiche Latente Teiche Gesamt Cyprinidae Brachse (Abramis brama) 2 0 2 Giebel (Carassius carassius gibelio) 0 10 10 Gründling (Gobio gobio) 0 10 10 Moderlieschen (Leucaspius delineatus) 2 0 2 Döbel (Leuciscus cephalus) 0 1 1 Hasel (Leuciscus leuciscus) 0 10 10 Plötze (Rutilus rutilus) 13 33 46 Rotfeder (Scardinius erythrophthalmus) 32 26 58 Schleie (Tinca tinca) 33 58 91 Ictaluridae Zwergwels (Ictalurus nebulosus) 21 18 39 Gasterosteidae Stichling (Gasterosteus aculeatus) 13 21 34 Percidae Kaulbarsch (Gymnocephalus cernua) 8 39 47 Flußbarsch (Perca fluviatilis) 43 40 83 Zander (Sander lucioperca) 5 0 5 Esocidae Europäischer Hecht (Esox lucius) 7 8 15 Gesamt 179 274 453 Sanierter Teich nicht berücksichtigt
Material und Methoden 57
4.4.1.2 Wildfische aus Teichen mit akutem KHV-Geschehen
In fünf Teichen mit akutem KHV-Geschehen wurden im Jahr 2009 insgesamt 179 Wildfische
während des Ausbruches der KHV-Erkrankung sowie 14 Tage nach der ersten Probenahme
gefangen. In diesem Probenumfang vertreten waren Arten der Familien Cyprinidae,
Ictaluridae, Gasterosteidae, Percidae und Esocidae (siehe Tabelle 6). Die Fische aus diesen
Teichen wurden nach Arten getrennt, auf separate, desinfizierte 80 l Aquarien, welche mit gut
durchlüftetem Leitungswasser befüllt waren, verteilt und zeitnah drei bis vier Tage nach dem
Fang beprobt.
4.4.1.3 Wildfische aus Ablaufgräben von Teichen mit akutem KHV-Geschehen
In drei Ablaufgräben von zwei Teichen mit akutem KHV-Geschehen wurden in 2009
insgesamt 112 Wildfische während des Ausbruches der KHV-Erkrankung und 14 Tage nach
der ersten Probenahme gefangen. In diesem Probenumfang vertreten waren Arten der
Familien Cyprinidae, Ictaluridae, Gasterosteidae, Percidae und Esocidae (siehe Tabelle 7).
Bei Teich B wurden Wildfische aus zwei verschiedenen Ablaufgräben des gleichen Teiches
entnommen (siehe Tabelle 7). Die Fische der jeweiligen Arten dieses Probenumfanges
wurden auf separate, desinfizierte 80 l Aquarien, welche mit gut durchlüftetem
Leitungswasser befüllt waren, verteilt und zeitnah drei bis vier Tagen nach dem Fang beprobt.
Material und Methoden 58
Tabelle 7: Probenumfang aus Ablaufgräben von Teichen mit akutem KHV-Geschehen
Ablaufgraben Teich A Teich B Gesamt Graben 1 Graben 1 Graben 2 Cyprinidae Brachse (Abramis brama) 2 2 Giebel (Carassius carassius gibelio) 0 Gründling (Gobio gobio) 0 Moderlieschen (Leucaspius delineatus) 2 2 Döbel (Leuciscus cephalus) 0 Hasel (Leuciscus leuciscus) 0 Plötze (Rutilus rutilus) 2 2 Rotfeder (Scardinius erythrophthalmus) 10 20 30 Schleie (Tinca tinca) 1 9 9 19 Ictaluridae Zwergwels (Ictalurus nebulosus) 9 9 Gasterosteidae Stichling (Gasterosteus aculeatus) 6 6 Percidae Kaulbarsch (Gymnocephalus cernua) 3 1 4 Flußbarsch (Perca fluviatilis) 4 8 14 26 Zander (Sander lucioperca) 1 4 5 Esocidae Europäischer Hecht (Esox lucius) 2 3 2 7 Gesamtzahl 18 31 63 112
4.4.1.4 Wildfische aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen
In sieben Teichen mit latentem KHV-Geschehen wurden bei acht Probennahmen insgesamt
274 Wildfische zwischen 2008 und 2010 gefangen. Die Fische aus diesen Teichen wurden
während der Frühjahrs- oder Herbstbefischung beim Absenken des Teichwasserspiegels in
der Sammelgrube nahe dem Mönch gefangen. Es wurden 12 verschiedene Wildfischarten der
Teichbiozönose gefangen. Im Probenumfang enthalten waren Arten der Familien Cyprinidae,
Ictaluridae, Gasterosteidae, Percidae und Esocidae (siehe Tabelle 6 und 8).
Material und Methoden 59
Tabelle 8: Probenumfang aus Teichen mit latent infiziertem Karpfenbesatz und Kohabitationskarpfen
Beprobte Fischarten Latente Teiche SPF Cyprinidae Giebel (Carassius carassius gibelio) 10 6 Gründling (Gobio gobio) 10 6 Hasel (Leuciscus leuciscus) 10 6 Plötze (Rutilus rutilus) 33 6 Rotfeder (Scardinius erythrophthalmus) 26 6 Schleie (Tinca tinca) 58 18 Ictaluridae Zwergwels (Ictalurus nebulosus) 18 6 Gasterosteidae Stichling (Gasterosteus aculeatus) 21 6 Percidae Kaulbarsch (Gymnocephalus cernua) 39 12 Flußbarsch (Perca fluviatilis) 40 10 Esocidae Europäischer Hecht (Esox lucius) 8 5 Gesamt 273 87
4.4.1.4.1 Kohabitation von Wildfischen aus latent infizierten Teichen mit SPF-Karpfen
Aus latent infizierten Teichen entnommene Wildfische wurden teilweise in einen
Kohabitationsversuch eingesetzt. Dazu wurden die jeweiligen Arten dieses Probenumfanges
auf separate, desinfizierte 80 l Aquarien verteilt, welche mit gut durchlüftetem
Leitungswasser befüllt waren. Das Hälterungswasser wurde schrittweise auf 25 °C aufgeheizt
und die Fische durch eine simulierte Befischung mittels Handkescher gestresst wie unter 3.5.1
beschrieben. Eine Hälfte der Fische wurde zwei Tage später getötet und wie unter 3.2.5
beprobt. Die andere Hälfte der nach Arten aufgeteilten Fische wurde über einen Zeitraum von
14 Tagen mit jeweils sechs SPF-Karpfen kohabitiert. Täglich erfolgten ein Wasserwechsel
von 90 % sowie die Beobachtung der Fische auf das Auftreten von klinischen Symptomen
einer Erkrankung mit dem KHV. Die Wildfische sowie die Karpfen wurden anschließend wie
unter 3.2 beschrieben euthanasiert und beprobt.
Material und Methoden 60
4.4.1.5 Wildfische aus Teich und Ablauf mit saniertem Bestand
Dem Ablauf des sanierten Teiches wurden im Jahr 2009 insgesamt 71 Wildfische
entnommen. Der Fang der Fische erfolgte mit einfachen Bockreusen, die am Abend vor der
Probennahme im Gewässer platziert wurden. Nach dem Transport wurde das
Hälterungswasser schrittweise auf 25 °C aufgeheizt und die Fische anschließend wie unter
3.5.1 beschrieben beprobt. Während der Herbstbefischung im Jahr 2010 wurden 74
Wildfische im Teich gefangen. Diese wurden dann mit SPF-Karpfen wie unter 3.4.1.4.1
beschrieben kohabitiert und beprobt (siehe Tabelle 9).
Tabelle 9: Probenumfang sanierter Teich und Ablaufgraben mit Kohabitationskarpfen
Beprobte Fischarten Teich SPF Ablauf Cyprinidae Gründling (Gobio gobio) 20 6 1 Plötze (Rutilus rutilus) 19 6 16 Rotfeder (Scardinius erythrophthalmus) 3 - - Schleie (Tinca tinca) 1 - 5 Ictaluridae Zwergwels (Ictalurus nebulosus) - - 18 Percidae Kaulbarsch (Gymnocephalus cernua) 11 1 20 Flußbarsch (Perca flviatilis) 20 6 11 Gesamtzahl 74 19 71
Material und Methoden 61
4.5 Laborinfektion von Wildfischen
In den Laborinfektionen sollte das Spektrum an für das KHV empfänglichen Fischen
experimentell untersucht werden. Die in den Versuchen verwendeten Wildfische wurden von
einem Großhändler bezogen, der bisher nachweislich nur KHV-freie Fischbestände führte
(siehe Tabelle 10). Pro Fischart wurden vor Versuchsbeginn jeweils fünf Individuen einer
allgemeinen Kontrolluntersuchung und einer speziellen parasitologischen Untersuchung von
Kiemen und Haut unterzogen. Diese wurden danach mit einem Handkescher wie unter 3.5.1
beschrieben gestresst und drei Tage später euthanasiert. Die angefertigten Gewebepools der
jeweiligen Fische wurden anschließend auf KHV-Genomsequenzen mittels real-time PCR
nach GILAD et al. (2004) untersucht. Die Ergebnisse der KHV-Kontrolluntersuchungen
waren alle negativ.
4.5.1 Infektionsversuch 1 (Badinfektion)
Für die Infektion von Wildfischen über das Bad wurde eine in Zellkultur hergestellte
Viruslösung verwendet (siehe 3.1.1). Hierzu wurden die 151 Wildfische sowie die Karpfen
der Infektionskontrolle auf zwei 20 l Plastikaquarien aufgeteilt, welche mit jeweils 5 l
Leitungswasser befüllt waren. In jedes Plastikaquarium wurden daraufhin 250 ml einer
Viruslösung mit einer Infektiosität von 275 KID50/ml gegeben und die Fische bei 25 °C für
60min inkubiert (siehe Abbildung 1). Anschließend wurden die Fische nach Spezies getrennt
und in separate, desinfizierte 80 l Aquarien umgesetzt, welche mit gut durchlüftetem
Leitungswasser befüllt waren. Die Haltung erfolgte bei 25 °C unter Durchführung
regelmäßiger Teilwasserwechsel. In diesem Zeitraum wurden die Fische im Hinblick auf das
Auftreten von klinischen Symptomen unter besonderer Berücksichtigung der für eine KHV-
Infektion typischen Symptome beobachtet. Verendete Karpfen wurden dokumentiert und
abgesammelt. An Tag 7 p.i. wurden 50 % der Fische der jeweiligen Arten euthanasiert und
beprobt. Im Anschluss daran wurden die verbliebenen Individuen mittels simulierter
Befischung gestresst, daraufhin in desinfizierte 100 l Aquarien umgesetzt und mit jeweils
Material und Methoden 62
sechs SPF Karpfen kohabitiert. Für die simulierte Befischung wurden die Fische fünfmal
aufeinander folgend für 30 sec im Kescher über dem Hälterungsbecken der Luft exponiert.
Zwischen den Intervallen fand eine Erholungsphase von jeweils 1 min statt. An Tag 17 p.i.
erfolgte die Euthanasie der restlichen Wildfische, Kontrollkarpfen sowie der kohabitierten
SPF-Karpfen. Anschließend wurden Gewebeproben wie unter 3.2.5 beschrieben entnommen
und entweder bei -80 °C eingefroren oder in 1 ml RNALater (QIAGEN, Hilden) bei 4 °C bis
zur weiteren Verwendung gelagert (siehe Abbildung 2).
Abbildung 1: Aufbau der Badinfektion von Wildfischen in Laborversuch 1
Abbildung 2: Probennahme an Tag 7 der Laborinfektion
Material und Methoden 63
Tabelle 10: Verwendete Fischarten in Laborinfektion 1
Fischart Tag 7 Tag 17 SPF 20 Gründling (Gobio gobio) 8 10 6 15 Nase (Chondrostoma nasus) 7 8 6 20 Orfe (Leuciscus idus) 10 10 6 20 Rotfeder (Scardinius erythrophthalmus) 10 10 6 20 Schleie (Tinca tinca) 10 10 6 30 Stichling (Gasterosteus aculeatus) 0 8 6 20 Flussbarsch (Perca fluviatilis) 7 8 6 12 Infektionskontrolle Karpfen (Cyprinus carpio) 6 6 6 Während der Inkubation in der Infektionslösung verstarben 2 Gründlinge, 22 Stichlinge und 5 Flussbarsche, welche nicht in den Untersuchungsumfang mit eingezogen wurden
4.5.2 Infektionsversuch 2 (Kohabitation)
In diesem Versuchsteil erfolgte die Infektion von Wildfischen durch Kohabitation mit zuvor
über das Bad mit KHV infizierten SPF-Karpfen. Dazu wurden sechs SPF-Karpfen in ein 2 l
Plastikaquarium gesetzt, welches mit Leitungswasser befüllt war. Daraufhin wurden 50 ml
einer Viruslösung mit 562 KID50/ml in dieses Plastikaquarium gegeben und die Fische bei
25 °C für 90 min inkubiert (siehe Abbildung 3). Anschließend wurden die Karpfen in ein
desinfiziertes, mit Leitungswasser befülltes 400 l Aquarium umgesetzt. Das Wasser hatte eine
Temperatur von 25 °C und wurde stetig durchlüftet. Bei Bedarf wurden Teilwasserwechsel
durchgeführt. Daraufhin erfolgte die Kohabitation mit den in Tabelle 11 dargestellten
Wildfischen. Um die Infektiosität des von den infizierten Karpfen ausgeschiedenen Virus zu
überprüfen, wurden weitere sechs Kontrollkarpfen mit markierten Flossen hinzugesetzt. An
Tag 7 p.i. wurden die Fische mittels Kescher gestresst und die jeweiligen Arten in separate,
desinfizierte 80 l Aquarien verteilt, welche mit gut durchlüftetem, 25 °C warmem
Leitungswasser befüllt waren. Im Anschluss erfolgte die Kohabitation jeder Gruppe mit sechs
SPF-Karpfen. Innerhalb dieses Zeitraumes wurden die Fische im Hinblick auf das Auftreten
von klinischen Symptomen unter besonderer Berücksichtigung der für eine KHV-Infektion
typischen Symptome beobachtet. Verendete Karpfen wurden dokumentiert und abgesammelt.
72 h nach Entnahme der Fische aus dem 400 l Aquarium, wurden sechs SPF-Karpfen in das
Hälterungswasser gesetzt um die Tenazität des Virus in der Infektionslösung zu prüfen. An
Tag 17 p.i. erfolgte die Euthanasie der Wildfische, der Kontrollkarpfen, der kohabitierten
Material und Methoden 64
SPF-Karpfen und der Karpfen aus dem 400 l Aquarium. Anschließend wurden Gewebeproben
wie unter 3.2.5 beschrieben entnommen und entweder bei -80 °C eingefroren oder in 1 ml
RNALater (QIAGEN, Hilden) bei 4 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Abbildung 3: Infektion von SPF-Karpfen in Laborstudie 2
Tabelle 11: Verwendete Fischarten in Laborinfektion 2
Fischart SPF 10 Gründling (Gobio gobio) 6 10 Goldfische (Carassius auratus) 6 10 Orfe (Leuciscus idus) 6 10 Schleie (Tinca tinca) 6 6 Kontroll-SPF (Cyprinus carpio) 6 6 Kontroll-SPF-Infektionwasser (Cyprinus carpio) Während der Inkubation mit den infizierten SPF-Karpfen verstarben 6 Gründlinge, welche nicht in den Untersuchungsumfang mit eingezogen wurden
Material und Methoden 65
4.6 Molekularbiologische Methoden
4.6.1 Zellkulturen
Stabilate virushaltiger Zellkulturen wurden aufgetaut und das Zellmaterial vor der
Weiterverarbeitung 20 min bei 3.000 x g abzentrifugiert. Das Pellet wurde in 200 µl
Zellkulturüberstand aufgenommen und danach 100 µl der Virussuspension in 2 ml
Reaktionsgefäße (Eppendorf, Hamburg) überführt und wie unter 3.6.3 beschrieben
weiterverarbeitet.
4.6.2 Gewebeproben
Gewebeproben wurden aufgetaut und 25 mg des zuvor angefertigten Organpools in ein 2 ml
Reaktionsgefäß (Eppendorf, Hamburg) überführt, mit einer Stahlkugel (Isometall,
Pleidelsheim) bestückt und in einer Schwingmühle (Qiagen, Hilden) bei 20 Hz 2 Minuten
homogenisiert. Anschließend wurde wie unter 3.6.3 beschrieben weiterverfahren.
4.6.3 DNA-Extraktion mittels QIAamp® DNA Mini-Kit (Qiagen, Hilden)
Bei den molekularbiologischen Arbeiten wurde darauf geachtet, dass es zwischen den
Schritten der DNA-Extraktion, der Präparation des Mastermixes und der Durchführung der
PCR zu einer räumlichen Trennung kam. Bei jeder Extraktion wurden stets eine positive und
eine negative Kontrolle mitgeführt. PCR-positives Probenmaterial wurde von Karpfen nach
einer Laborinfektion mit KHV entnommen, die KHV-spezifische Krankheitssymptome
zeigten. PCR-negativ Kontrollen wurden aus dem Gewebe von Flundern (Platichthys flesus)
hergestellt. Alle Positivkontrollen wurden in einer separaten Eppendorf MiniSpin®
(Eppendorf, Hamburg) Zentrifuge behandelt. Bei allen molekularbiologischen Arbeiten
wurden zwischen den verschiedenen Arbeitsschritten die Einmalhandschuhe gewechselt. Alle
verwendeten Pipetten, Zentrifugen und Arbeitsflächen wurden in regelmäßigen Abständen
Material und Methoden 66
gereinigt, danach abschließend mit Kohrsolin 1,5 % (Bode Chemie, Hamburg) desinfiziert
und 30 min mit UV-Licht bestrahlt.
Genomische DNA aus Zellkulturen und Gewebeproben wurde ausschließlich mit dem
QIAamp® DNA Mini-Kit (Qiagen, Hilden) extrahiert. Dazu wurden in 2 ml Reaktiongefäße
mit den jeweiligen Proben 180 µl ATL-Puffer (Qiagen, Hilden) und 20 µl Proteinase K
(Qiagen, Hilden) gegeben und für 60 min bei 56 °C in einem Heizblock (Thermomixer
Comfort, Eppendorf, Hamburg) mit 900 Hz Schüttelfrequenz bis zur vollständigen Lyse des
Gewebes inkubiert. Anschließend wurden 200 µl AL-Puffer zugegeben und bei 70 °C weitere
10 min im Heizblock inkubiert. Durch Zugabe von 200 µl 99 %-igem Ethanol wurde im
Anschluss die DNA ausgefällt. Die gesamte im 2 ml Reaktionsgefäß befindliche Probe wurde
daraufhin in eine Silicagel-Säule (Qiagen, Hilden), welche sich in einem deckellosen 2 ml
Reaktionsgefäß (Qiagen, Hilden) befand, überführt und für 60 s bei 6.800 x g zentrifugiert.
Das durchgelaufene Filtrat wurde verworfen und die Säule in ein neues Reaktionsgefäß
gesteckt. Darauf folgten zwei Waschschritte der in der Säule befindlichen DNA. Der erste mit
500 µl AW1-Puffer (Qiagen, Hilden) und einer Zentrifugation von 60 s bei 6.800 x g und ein
zweiter mit 500 AW2-Puffer (Qiagen, Hilden). Um die Reste der Waschlösung zu entfernen,
wurde daraufhin 60 s bei und 20.800 x g zentrifugiert. Um die DNA zu eluieren, wurden 150
µl AE-Puffer (Qiagen, Hilden) auf die Silicagel-Säule (Qiagen, Hilden) aufgetragen und 5
min bei Raumtemperatur inkubiert. Dadurch erfolgte die Resuspension in der Säule und nach
Zentrifugation für 60 s bei 6.800 x g wurde die DNA ausgewaschen und das Eluat bei -80 °C
in 0,2 ml Reaktionsgefäßen (Eppendorf, Hamburg) gelagert.
4.6.4 RNA-Extraktion mittels peqGOLD TriFast Reagenz
RNA aus Gewebeproben wurde ausschließlich mittels peqGOLD TriFast Reagenz (Peqlab
Biotechnologie GmbH, Erlangen) extrahiert. Bei jeder Extraktion wurden stets eine positive
und eine negative Kontrolle mitgeführt. KHV-positives Kontrollprobenmaterial für die RNA-
Extraktion wurde infizierten Karpfen aus der Laborinfektion zur Prüfung der Empfänglichkeit
entnommen, die KHV-spezifische Krankheitssymptome zeigten. Negative RNA-
Extraktionskontrollen stammten von SPF-Karpfen aus eigener Aufzucht.
Material und Methoden 67
Um eine Kontamination mit RNasen zu verhindern, wurden Wasser, SDS-Lösungen (Sigma-
Aldrich, Taufkirchen), sowie Metallkugeln (Isometall, Pleidelsheim), die zum Lösen der RNA
eingesetzt wurden, vorher mit Diethylpyrocarbonat (AppliChem GmbH, Darmstadt)
behandelt. Während aller Arbeitsschritte erfolgte eine Kühlung der Proben auf Eis.
Es wurden 20 bis 100 mg des in RNALater (QIAGEN, Hilden) gelagerten Gewebes in ein
zuvor mit 1 ml peqGOLD TriFast (Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen) befülltes 2 ml
Reaktiongefäß (Eppendorf, Hamburg) überführt, mit einer Metallkugel bestückt und in einer
Schwingmühle (Qiagen, Hilden) bei 20 Hertz 2 Minuten homogenisiert. Danach wurden die
Proben 5 min bei Raumtemperatur bis zur Dissoziation der Nukleotidkomplexe stehen
gelassen. Anschließend wurden sie in ein neues Reaktionsgefäß überführt, 0,2 ml Chloroform
(Sigma-Aldrich, Taufkirchen) hinzugegeben und danach für 15 s kräftig geschüttelt. Die
Proben wurden daraufhin 5 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und im Anschluss
10 min bei 11.500 x g und 4 °C bis zur Phasenauftrennung zentrifugiert. Die mittlere,
wässrige RNA-Phase wurde in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt, mit 0,5 ml
Isopropanol (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) gemischt und für 5 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Daraufhin folgte ein Zentrifugationsschritt von 20 min bei 4 °C und 11.500 x g. Der
Isopropanolüberstand wurde vorsichtig entfernt und das entstandene RNA-Pellet zweimal mit
0,9 ml 75 % Ethanol (AppliChem GmbH, Darmstadt) durch Aufrütteln (Vortexen) und
anschließendes Zentrifugation für 8 min bei 9.100 x g und 4 °C gewaschen und der Überstand
verworfen. Zum Lösen der RNA wurde das Pellet 10 bis 15 min an der Luft getrocknet und
durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren in 50 µl RNase-freiem Wasser gelöst und
anschließend für 10 min bei 56 °C in einem Heizblock (Thermomixer Comfort, Eppendorf,
Hamburg) inkubiert. Bis zur weiteren Verwendung wurde die RNA bei -80 °C gelagert.
Material und Methoden 68
4.6.5 Reverse Transkription mittels Maxima™ Reverse Transcriptase
Die reverse Transkription wurde mit dem Maxima™ Reverse Transcriptase Kit (Fermentas
GmbH, St. Leon-Rot) durchgeführt und während aller Zwischenschritte erfolgte die
Aufbewahrung der Proben auf Eis.
Tabelle 12: Reaktionsmix für die Reverse Transkription DNase I Verdau
Reaktionskomponenten Volumen RNA (200 ng/µl) 6,5 µl 5X RT-Buffer 1 µl RiboLock™ RNase Inhibitor 0,5 µl DNase I, RNase-free 2 µl Endvolumen 9,5 µl
Die verwendete, zuvor extrahierte Template-RNA wurde auf 200 ng/µl verdünnt und
anschließend im Verhältnis wie in Tabelle 12 angegeben in ein 0,2 ml Reaktionsgefäß
(Eppendorf, Hamburg) überführt, vorsichtig gemischt und 30 min bei 37 °C in einem
Mastercycler Gradient (Eppendorf, Sarstedt) inkubiert. DNase I (Fermentas GmbH, St. Leon-
Rot) wurde zusätzlich hinzugegeben, um verbliebene genomische DNA zu entfernen. Im
Anschluss wurde 1 µl EDTA (Applichem, Darmstadt) hinzugefügt und bei 65 °C für 10 min
inkubiert. Darauf folgten die Zugabe der in Tabelle 13 angegebenen Reaktionskomponenten
und eine fünfminütige Inkubation bei 65 °C. Anschließend wurden 5 µl RT-Buffer, 0,5 µl
RiboLock und 0,5 µl Maxima® Reverse Transkriptase in die Reaktionsgefäße pipettiert, die
reverse Transkription nach dem Protokoll wie in Tabelle 14 beschrieben durchführt und
anschließend die Reaktion durch eine fünfminütige Inkubation bei 85 °C gestoppt. Die
resultierende cDNA wurde bei -20 °C bis zur weiteren Verwendung gelagert.
Material und Methoden 69
Tabelle 13: Reaktionsmix für die Reverse Transkriptase
Reaktionskomponenten Volumen Oligo(dT)18Primer (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) 0,5 µl Random Hexamer Primer (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) 0,25 µl dNTPs (10 mM) (Roth, München) 0,25 µl A. dest 8,5 µl RNA 5 µl Endvolumen 14,5 µl
Tabelle 14: Temperaturprofil für die reverse Transkriptase
Zeit Temperatur (°C) Zyklen (n)
15 min 95 1
60 sec 95 1 30 sec 60 1
4.6.6 Real-time PCR
Real-time PCR-Systeme bieten die Möglichkeit des direkten Nachweises mit gleichzeitiger
Quantifizierung von PCR-Produkten (STERNER-KOCK et al. 2002). Mit diesen Systemen
können Fluoreszenzsignale detektiert werden. Die Fluoreszenz ist in der Regel proportional
zur Menge der entstandenen PCR-Produkte. So ist es möglich, die Ausgangsmenge an DNA-
Template zu quantifizieren (LEE et al. 1993; LIVAK et al. 1995). Grundsätzlich kann hier
zwischen zwei verschiedenen Detektionssystemen unterschieden werden. Unspezifische
Detektionssysteme basieren auf der Verwendung von mit Doppelstrang-DNA
interkalierenden Farbstoffen, wie beispielsweise SYBR Green I oder Ethidiumbromid.
Dagegen werden in spezifischen Detektionssystemen sequenzspezifische fluorogene
Sondensysteme unter Ausnutzung des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)
verwendet (CARDULLO et al. 1988; WITTWER et al. 1997). Dies ist beispielsweise bei
TaqMan-Sonden (Hydrolyse-Sonden), Hybridisierungssonden (FRET-Sonden) oder
„Molecular Beacons“ der Fall.
Material und Methoden 70
4.6.6.1 SYBR Green real-time PCR zur relativen Quantifizierung für das
Thymidinkinase-Gen (ADAMEK et al. 2012) mittels Housekeeping Gene
(FORLENZA et al. 2008)
Um zu Überprüfen, ob in den Geweben der mit Zellkulturvirus infizierten Fische eine
Virusreplikation stattgefunden hatte, wurde im Anschluss an die reverse Transkription der
RNA eine SYBR Green-basierte real-time PCR durchgeführt. Die Überprüfung der Spezifität
erfolgte über die Schmelzkurvenanalyse. Dafür wurden die von ADAMEK et al. (2012)
publizierten Primer verwendet (siehe Tabelle 16), welche ein bestimmtes DNA-Fragment des
Thymidinkinase-Gen amplifizieren. Die Expression des Zielgens wurde mit der Expression
eines Referenzgens verglichen. Somit konnte eine relative Quantifizierung der Menge an Ziel-
DNA durchgeführt werden. Hierfür wurde das von FORLENZA et al. (2008) beschriebene
Housekeeping Gene 40S Ribosomal Protein S11 kloniert (siehe Tabelle 15). Von diesem
Plasmid wurde eine serielle Verdünnungsreihe hergestellt, welche als interner Standard zur
Normalisierung diente. Für den Mastermix wurde das Maxima™ SYBR Green qPCR Master
Mix (2X), ROX Solution provided (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) Kit eingesetzt. Dieser
wurde in einer eigens dafür vorgesehenen DNA-Workstation in einem PCR-Kühlrack (beide:
IsoFreeze PCR-Rack, Kisker Biotech GmbH & Co. KG, Steinfurt) wie in Tabelle 17 angeben
zusammengestellt und Aliquots von 20 µl in 8-er Soft Strips (Biozym, Hess. Oldendorf) auf
die jeweiligen Vertiefungen verteilt. In einer wiederum eigens dafür vorgesehen DNA-
Workstation wurde anschließend die Template-DNA den Reaktionsgefäßen zugegeben. In
jedem PCR-Lauf wurden eine serielle Verdünnungsreihe des 40 S Plasmids, sowie eine
Negative Template Control (NTC) bestehend aus 5 µl A. dest. und eine Positivkontrolle,
welche aus unter Laborbedingungen mit Zellkulturvirus infizierten Fischen hergestellt wurde,
im Doppelansatz mitgeführt. Verwendet wurde dazu das in Tabelle 18 dargestellte
Temperaturprofil.
Material und Methoden 71
Tabelle 15: Primersequenzen des von FORLENZA et al. (2008) beschriebenen 40S Ribosomal Protein S11 Housekeeping Gene
Gen Primer Sequenz (5´ � 3´) Produkt 40 S q40S.FW1 CCG TGG GTG ACA TCG TTA CA 69 bp q40S.RV1 TCA GGA CAT TGA ACC TCA CTG TCT
Tabelle 16: Primersequenzen für den Nachweis einer KHV-Replikation mittels Thymidinkinase-Gen (ADAMEK et al. 2012)
Gen Primer Sequenz (5´ � 3´) GenBank ID KHV CyHV3_TK_qF1 TGG CTA TGC TGG AAC TGG TG DQ177346 CyHV3_TK_qR3 GCT GGT CTA TGG CGT GCT TG
Tabelle 17: Pipettierschema für die SYBR Green real-time PCR mit Primersequenzen für das Thymidinkinase-Gen zur relativen Quantifizierung (ADAMEK et al. 2012)
Reaktionskomponenten Volumen Maxima™ SYBR Green qPCR Master Mix (2X), ROX Solution provided (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) 12,5 µl
CyHV3_TK_qF1 0,5 µl
CyHV3_TK_qR3 0,5 µl
q40S.FW1 0,5 µl
q40S.RV1 0,5 µl
A. dest 5,5 µl
Template-DNA 5 µl
Endvolumen 25 µl
Tabelle 18: Temperaturprofil für die SYBR Green real-time für das Thymidinkinase-Gen (ADAMEK et al. 2012)
Zeit Temperatur (°C) Zyklen (n)
Initiale Denaturierung 10 min 95 1
Denaturierung 30 sec 95
Annealing 30 sec 60
Elongation 30 sec 72
40
Schmelzkurve 60 sec 95
30 sec 55
30 sec 95 90 x 0,5 °C
Material und Methoden 72
4.6.6.2 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung der KHV-Replikation
unter Verwendung des Thymidinkinase-Gens (ADAMEK et al. 2012) mit
externem Standard
Die Durchführung der SYBR Green reverse transcriptase (RT) real-time PCR für das
Thymidinkinase-Gen mit externen Standard (ADAMEK et al. 2012) erfolgte wie bereits unter
3.6.6.1 beschrieben mit dem Unterschied, dass zur absoluten Quantifizierung der
Virusvermehrung in den Geweben in jedem PCR-Lauf eine serielle Verdünnungsreihe des
Plasmids mitgeführt wurde.
Dieses Plasmid mit der klonierten Zielsequenz wurde wie unter 3.6.7 beschrieben hergestellt.
Die Berechnung der Kopienzahl des Plasmids, die Erstellung der Standardkurve und die
Datenanalyse erfolgten wie unter 3.6.7.1 beschrieben.
Es wurden die in Tabelle 16 dargestellten Primersequenzen verwendet. Das Pipettierschema
folgte Tabelle 17 und das Temperaturprofil wurde wie in Tabelle 18 dargestellt verwendet.
Tabelle 19: Pipettierschema für die SYBR Green real-time RT-PCR zur Amplifikation des Thymidinkinase-Gens zur Quantifizierung der KHV-Replikation (ADAMEK et al 2012)
Reaktionskomponenten Volumen Maxima™ SYBR Green qPCR Master Mix (2X), ROX Solution provided (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot) 12,5 µl
CyHV3_TK_qF1 0,5 µl
CyHV3_TK_qR3 0,5 µl
A. dest 6,5 µl
Template-DNA 5 µl
Endvolumen 25 µl
Material und Methoden 73
4.6.6.3 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung des Gens kodierend
für das Major Capsid Protein-Gen (ORF92) des KHV (ADAMEK et al.
2012) mit externem Standard zum Nachweis einer KHV-Replikation
Die Durchführung der SYBR Green real-time RT PCR für das Major Capsid Protein-Gen mit
externen Standard (ADAMEK et al. 2012) erfolgte wie bereits unter 3.6.6.2 beschrieben.
Dieses Plasmid mit der klonierten Zielsequenz wurde wie unter 3.6.7 beschrieben hergestellt.
Die Berechnung der Kopienzahl des Plasmids, die Erstellung der Standardkurve und die
Datenanalyse erfolgten wie unter 3.6.7.1 beschrieben.
Es wurden die in Tabelle 20 dargestellten Primersequenzen verwendet. Das Pipettierschema
folgte Tabelle 17 und das Temperaturprofil wurde wie in Tabelle 18 dargestellt verwendet.
Tabelle 20: Primersequenzen für den Nachweis einer KHV-Replikation mittels Major Capsid Protein-Gen (ORF92) (ADAMEK et al. 2012)
Gen Primer Sequenz (5´ � 3´) Produkt KHV CyHV3_O92_qF1 AGC CAC CTC TTG GTC GTG 128 bp CyHV3_O92_qR1 ACT CCC TGT CCC AGC ACT C
4.6.6.4 SYBR Green real-time PCR zur Qualitätskontrolle der TaqMan real-time
PCR nach GILAD et al. (2004) mittels Capsid Triplex Protein-Gen
(ORF72)
Die Durchführung der SYBR Green real-time PCR für das Capsid Triplex Protein-Gen mit
externen Standard (ADAMEK et al 2012) erfolgte wie bereits unter 3.6.6.2 beschrieben.
Überprüft wurden die Gewebepools der Fische aus der Feldstudie, die mittels TaqMan real-
time PCR nach GILAD et al. (2004) positiv auf KHV-Genomsequenzen getestet wurden.
Material und Methoden 74
Es wurden die in Tabelle 21 dargestellten Primersequenzen verwendet. Das Pipettierschema
folgte Tabelle 17 und das Temperaturprofil wurde wie in Tabelle 18 dargestellt verwendet.
Tabelle 21: Primersequenzen für den Nachweis einer KHV-Replikation mittels Capsid Triplex Protein-Gen (ORF72) (ADAMEK et al. 2012)
Gen Primer Sequenz (5´ � 3´) Produkt KHV CyHV3_O72_qF1 CGA GAA GCA GGG TAT GGT C 132 bp CyHV3_O72_qR1 GGC GTG TAG GGC ACA AAG
4.6.7 Quantitative real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis von KHV
Für den PCR-basierten KHV-Nachweis wurden in der vorliegenden Arbeit die von GILAD et
al. (2004) publizierten Primer- und Sondensequenzen verwendet (siehe Tabelle 22). Als
interne Positivkontrolle der Reaktion dienten in jedem Ansatz die Primer- und
Sondensequenzen nach HOFFMANN et al. (2006), welche zusätzlich zu einer exogenen
Kontroll-DNA (INTYPE IC-DNA, Labor Diagnostik GmbH Leipzig, Leipzig) in jeden
Reaktionsansatz hinzugesetzt wurden (siehe Tabelle 22). Diese Oligonukleotide basieren auf
dem EGFP-Gen (enhanced green fluorescent protein) und wurden als Qualitätskontrolle der
PCR verwendet. Das Temperaturprofil folgte den von GILAD et al. (2004) publizierten
Angaben.
Für den Mastermix wurde das QuantiTect®Multiplex PCR Kit (Qiagen, Hilden) eingesetzt.
Dieser wurde in einer eigens dafür vorgesehenen DNA-Workstation in einem PCR-Kühlrack
(beide: IsoFreeze PCR-Rack, Kisker Biotech GmbH & Co. KG, Steinfurt) wie in Tabelle 23
angeben zusammengestellt und Aliquots von 20 µl in 8-er Soft Strips (Biozym, Hess.
Oldendorf) auf die jeweiligen Vertiefungen verteilt. In einer wiederum eigens dafür
vorgesehen DNA-Workstation wurde anschließend die Template-DNA den Reaktionsgefäßen
zugegeben. In jedem PCR-Lauf wurden eine serielle Verdünnungsreihe des Plasmids (siehe
Tabelle 23), sowie eine Negative Template Control (NTC) bestehend aus 5 µl A. dest. und
eine Positivkontrolle, welche aus unter Laborbedingungen mit Zellkulturvirus infizierten
Material und Methoden 75
Fischen hergestellt wurde, im Doppelansatz mitgeführt. Das PCR-Programm wurde wie in
Tabelle 24 dargestellt verwendet.
Tabelle 22: Primer- und Sondensequenzen die in der TaqMan real-time PCR nach GILAD et
al. (2004) zur Detektion des KHV und zur Qualitätskontrolle der Reaktion verwendet wurden
Gen Primer Sequenz (5´ � 3´) Produkt KHV KHV_86 for GAC GCC GGA GAC CTT GTG 78 bp KHV_163 rev CGG GTT CTT ATT TTT GTC CTT GTT
Sonde KHV_109P FAM-CTT CTT CTG CTC GGC GAG CAC G-BHQ1
EGFP EGFP-1-F GAC CAC TAC CAG CAG AAC AC 176 bp
EGFP-10-R CTT GTA CAG CTC GTC CAT GC
Sonde EGFP1-HEX HEX-AGC ACC CAG TCC GCC CTG AGC A-BHQ1
Tabelle 23: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes für die real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis von KHV
Reaktionskomponenten Volumen Probe Master Mix (2-fach) QuantiTect®Multiplex PCR Kit (Qiagen, Hilden) 12,5 µl
KHV-Primer Mix (KHV_86 for, KHV_163 rev, KHV_109P_FAM) 2 µl
IC2-Primer Mix (EGFP-1-for, EGFP-10-rev, EGFP-HEX) 2 µl
A. dest 3,25 µl
IC2 0,25 µl
Template-DNA 5 µl
Endvolumen 25 µl
Tabelle 24: PCR-Programm für die real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis von KHV
Zeit Temperatur (°C) Zyklen (n)
Initiale Denaturierung 15 min 95 1
Denaturierung 60 sec 95
Annealing 30 sec 60
40
Material und Methoden 76
4.6.7.1 Berechnung der Kopienzahl des Plasmids, Erstellen der Standardkurve und
Datenanalyse
Der DNA-Gehalt der Lösung mit dem unter 3.6.8 hergestellten Plasmid mit der klonierten
Zielsequenz wurde spektralphotometrisch bestimmt und es erfolgte die Berechnung der
Plasmidkonzentration in g/µl des Eluates nach der Formel:
Größe des Plasmids = 3015 bp, Größe des Inserts = 69 bp
Gewicht eines Plasmids:
5,535 x 10-22 g/ Base x (Länge des Vektors + Insert) x 2 = 3,38 x 10-18 g/ Plasmid
Anzahl der Plasmide pro ml:
DNA-Konzentration (g/ ml) / Gewicht pro Plasmid (g) = 7,2 x 1010 Plasmide/µl
Die ermittelte Konzentration an Plasmiden in der Lösung entspricht somit auch gleichzeitig
der Konzentration der spezifischen KHV-Genomäquivalente (Kopienzahl), also der
Zielsequenz. Aus der Plasmidlösung wurde eine logarithmische Verdünnungsreihe
angefertigt, die zwischen 1 und 108 Plasmide/µl für das Plasmid nach GILAD et al. (2004)
enthielt und zwischen 101 und 107 Plasmide/µl für die SYBR Green real-time PCR-Ansätze
nach ADAMEK et al. (2012). Hierbei war eine präzise Arbeitsweise unerlässlich. Von den
jeweiligen Verdünnungsstufen wurden Aliquotes hergestellt und bei -20 °C gelagert um sie
jeweils nur einmal direkt vor Gebrauch aufzutauen. Der hergestellte Standard wurde in jedem
real-time PCR-Lauf im Doppelansatz mitgeführt und so die zu untersuchenden Proben einer
absoluten Quantifizierung unterzogen. Eine optimale Effizienz der PCR-Reaktion liegt bei
100 %, welches sich in einer Steigung der Standardkurve von -3,322 widerspiegelt (HEID et
al. 1996). Die Proben wurden im Stratagene Mx3005PTM (Agilent Technologies, CB
Amsterdam Zuidoost, Niederlande) untersucht und mit der mitgelieferten Software analysiert.
Material und Methoden 77
4.6.8 Klonierung des PCR-Produktes für einen externen Standard
Ziel der Klonierung war die Herstellung eines Standards, der die absolute Quantifizierung
eines Teilstückes des Zielgens, welches auch für die Zielsequenz der real-time PCR kodiert,
in einen Vektor zu ligieren. Kompetente E. coli-Zellen wurden mit dem Vektor transformiert
und auf Agarplatten vermehrt. Die Zielsequenz enthaltende Plasmide wurden isoliert und für
die Quantifizierung der KHV-Genomfragmente in den Fischen verwendet.
4.6.8.1 Endpunkt-PCR
Für die Klonierung wurde in Zellkultur vermehrtes Virus hergestellt. Das
Amplifikationsprodukt aus der Endpunkt-PCR diente hierbei als Insert für die Ligation. Die
PCR-Reaktion wurde in einem Mastercycler Gradient (Eppendorf, Hamburg) durchgeführt
und das Platinum® Taq DNA Polymerase Kit (Invitrogen, Darmstadt) benutzt.
Die Reaktionsbedingungen, die verwendeten Primer und die Zusammensetzung der
Reaktionsansätze für die PCR sind in den Tabellen 25, 26 und 27 einzusehen.
Tabelle 25: Primer für den Nachweis des KHV-Genoms nach GILAD (2004)
Primer Sequenz (5´ � 3´) Produktgröße KHV 86 for 5´- GAC GCC GGA GAC CTT GTG -3´ 78 bp KHV163 rev 5´- CGG GTT CTT ATT TTT GTC CTT GTT -3´
Material und Methoden 78
Tabelle 26: Zusammensetzung des Reaktionsansatzes für die PCR zum KHV-Nachweis
Reaktionskomponenten Volumen Platinum® Taq DNA Polymerase 0,2 µl Primer KHV_86 for (10 pmol/µl) 2,5 µl Primer KHV_163 rev (10 pmol/µl) 2,5 µl dNTPs (10 mM) (Roth, München) 1 µl 10X PCR Buffer, Minus Mg 2,5 µl
MgCl2 (50 mM) 1,5 µl A. dest 12,8 µl Template-DNA 2,0 µl Endvolumen 25 µl
Tabelle 27: Touchdown-PCR-Programm für die Endpunkt-PCR nach GILAD et al. (2004)
Zeit Temperatur (°C) Zyklen (n)
Initiale Denaturierung 10 min 95 1
Denaturierung 15 sec 95
Annealing 60 sec 55,9-61,9
Elongation 30 sec 72
35
Finale Elongation 10 min 72 1
∞ 4
4.6.8.2 Agarosegelelektrophorese und Aufreinigung der PCR-Produkte
Ein Aliquot der PCR-Reaktion wurde vor der Ligation auf einem Agarosegel analysiert und
gleichzeitig aufgereinigt, um zu überprüfen, ob in der PCR das gewünschte Produkt
amplifiziert wurde.
Dazu wurden die Amplifikationsprodukte nach Zugabe von Roti®-Load DNA-Puffer (Roth,
München) mit der Flachbett-Apparatur Compact XS/S (Biometra, Göttingen) in einem
3 %igen Agarosegel (Invitrogen, Karlsruhe) bei einer Spannung von 90 V Power (Supply
EV243, Roth, Karlsruhe) größenfraktioniert. Als Größenstandard diente eine 100 bp DNA-
Leiter, äquimolar (Roth, Karlsruhe). Als Lauf- und Gelpuffer wurde TBE-Puffer verwendet.
Material und Methoden 79
Die Analyse der DNA-Banden erfolgte mittels UV-Transilluminator (Biometra, Tl 1,
Göttingen).
Für die Ligation wurden artifizielle Amplifikate, Reste des PCR-Reaktionsansatzes und des
Agarosegels durch Aufreinigung des PCR-Produktes mit dem Wizard SV Gel and PCR
Clean-up System (Promega Corporation, Madison) nach Herstellerangaben entfernt. Dafür
wurden zuvor die 78 bp großen Banden mit einem Skalpell aus den Gelen ausgeschnittenen.
4.6.8.3 Vektor
Im Anschluss an die Aufreinigung der PCR-Produkte erfolgte die Ligation in den Vektor
pGEM®-T Easy (Promega, Mannheim). Dieser verfügt über einen Einzel-3’terminalen
Thymidin-Überhang an beiden freien Enden und liegt linearisiert vor. Diese T-Überhänge der
„multiple cloning site“ (siehe Abbildung 4) verhindern eine Rezirkulation und gestatten
gleichzeitig eine effiziente Ligation der synthetisierten PCR-Produkte, an deren 3’Enden
thermostabile Polymerasen kompatible Einzel-3’Deoxyadenosin-Überhänge erstellen.
Abbildung 4: Für die Klonierung des KHV-Amplifikates verwendeter Vektor pGEM®-T Easy (Promega, Mannheim)
Material und Methoden 80
4.6.8.4 Ligation
Die Ligation des KHV-Amplifikates wurde nach Herstellerangaben wie in dem Protocol for
Ligations Using the pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vectors and the 2X Rapid Ligation
Buffer (Promega, Mannheim) beschrieben durchgeführt. Die Reaktionskomponenten (siehe
Tabelle 28) wurden durch vorsichtiges Pipettieren vermischt und über Nacht bei 16 °C
inkubiert, um die Anzahl an Transformanten zu erhöhen.
Tabelle 28: Zusammensetzung der Reaktionskomponenten für Ligationsansatz
Reaktionskomponenten Volumen 2X Rapid Ligationspuffer 5 µl T4 DNA Ligase 1 µl pGEM®-T Easy Vector (50 ng) 1 µl PCR-Produkt 3 µl Nucleasenfreies Wasser 1 µl Endvolumen 10 µl
4.6.8.5 Transformation
Für die Transformation wurden kompetente Escherichia (E.) coli Zellen (JM109 High
Efficiency Competent Cells, Promega, Mannheim) verwendet. 25 µl der aufgetauten
Bakteriensuspension wurden mit 2 µl des Ligationsansatzes durch vorsichtiges Auf- und
Abpipettieren vermischt und für 20 min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte ein Hitzeschock
für 50 s in einem Heizblock (Thermomixer Comfort, Eppendorf, Hamburg) bei 42 °C ohne
Schütteln. Die Zellen wurden daraufhin 2 min auf Eis gekühlt und danach 90 min unter
leichtem Schütteln in 950 µl LB-Flüssigmedium ohne Antibiotikazusatz inkubiert. Daraufhin
wurden 100 µl des Transformationsansatzes auf Selektivnährböden (LB-Agar-Platten mit 25
µl/ml Ampicillin), die mit 60 µl IPTG-Lösung (100 mM Isopropyl-β-D-Galaktopyranosid)
und 40 µl X-Gal (50 mg/ml 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-Galaktopyranosid) behandelt
worden waren, gleichmäßig mit einer sterilen Glaspipette ausplattiert und über Nacht bei
37 °C inkubiert. Das pGEM®-T-Easy Vector System verfügt über ein Ampicillin-
Resistenzgen, weshalb nur mit dem Vektor transformierte Zellen auf den mit Ampicillin
Material und Methoden 81
präparierten LB-Platten wachsen können. In der Klonierungsstelle ist zudem ein Gen
vorhanden, welches inaktiviert wird, wenn der Vektor ein DNA-Insert aufgenommen hat.
Dieses erleichtert anschließend die Selektion der gewünschten Klone. Bei einer erfolgreichen
Klonierung in den pGEM®-T-Easy Vector wird das LacZ`-Gen unterbrochen, welches für das
N-terminale α-Fragment der β-Galactosidase kodiert. Durch die Insertion des DNA-
Fragmentes wurde das LacZ`-Gen inaktiviert, wodurch sich nach einer Inkubation mit IPTG
und X-Gal die E. coli-Kolonien weiß färbten. Rekombinante Klone können nun durch ein
Farbscreening identifiziert werden. Weiße Kolonien tragen ein Insert, blaue Kolonien
hingegen in der Regel nicht. Es wurden fünf einzelne weiße Kolonien mit einer Pipettenspitze
von der Agarplatte aufgenommen, in 4 ml LB-Medium mit Ampicillin überführt und über
Nacht unter leichtem Schütteln bei 37 °C inkubiert.
4.6.8.6 Plasmidpräparation
Für die Präparation der Plasmid-DNA aus den Bakterienzellen wurden 1,5 ml des Gemisches
aus LB-Medium und weißen Kolonien für 1 min bei 15.000 x g zentrifugiert und der
Überstand verworfen. Das verbliebene Pellet wurde anschließend in 100 µl GTE-Lösung (50
mM Glukose (0,9 g), 25 mM Tris/HCL (3,5 ml 1 M Tris/HCL), 10 mM EDTA (2 ml 0,5 M
EDTA) ad 100 ml ddH2O) resuspendiert, für 30 sec geschüttelt und dann für 10 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluss wurden 200 µl Lösung 2 (100 µl 10% SDS, 100 µl
2 M NaOH, 700 µl ddH2O, pH 8) hinzugegeben und leicht geschüttelt. Nach einer
fünfminütigen Inkubation auf Eis wurden 150 µl eiskalter Lösung 3 (10 ml 5 M KAc, 1,91 ml
kalte Essigsäure, 4,75 ml ddH2O, pH 4,8) hinzugegeben, leicht geschüttelt und erneut 5 min
auf Eis inkubiert. Danach folgte ein Zentrifugationsschritt von 15 min bei 13.000 x g und
4 °C. 400 µl des Überstandes wurden in ein neues 2 ml Reaktionsgefäß (Eppendorf,
Hamburg) überführt und zweimal 900 µl 96 % Ethanol (AppliChem GmbH, Darmstadt)
hinzugefügt. Daraufhin wurde das Gemisch bei Raumtemperatur 5 min inkubiert,
anschließend 5 min bei 13.000 x g zentrifugiert und der Überstand abgesaugt. Das
resultierende Pellet wurde mit 500 µl 70 % Ethanol (AppliChem GmbH, Darmstadt)
gewaschen, ein weiteres Mal 5 min bei 13.000 x g zentrifugiert und der Überstand verworfen.
Material und Methoden 82
Anschließend wurde das Pellet getrocknet und in 50 µl zuvor mit RNaseA (10mg/ml)
behandeltem TE-Puffer aufgenommen. Bis zur weiteren Verwendung wurde die Plamid-DNA
bei 4 °C gelagert.
4.6.8.7 Plasmidverdau mit FastDigest® EcoRI (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot)
Um zu prüfen, ob die Klonierung des PCR-Produktes in den Vektor erfolgreich war, wurde
das Insert aus dem Vektor mittels Plasmidverdau mit EcoRI (Fermentas GmbH, St. Leon-Rot)
geschnitten. Dafür wurden 7,5 µl des Verdauungsansatzes mit 2,5 µl Plasmid-DNA (siehe
Tabelle 29) gemischt und 120 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend erfolgte die Beurteilung
auf einem Agarosegel. Es konnten zwei Banden visualisiert werden. Die erste bei 3015 bp,
welches der Größe des Vektorsystems entspricht und eine zweite bei 78 bp, welches der
Größe des KHV-Inserts entspricht.
Tabelle 29: Reaktionsansatz für die Restriktionsverdau des Plasmids
Reaktionskomponenten Volumen EcoRI 0,5 µl
SH Buffer 1,5 µl
A. dest 5,5 µl
Plasmid-DNA 2,5 µl
Endvolumen 10 µl
4.6.8.8 Sequenzierung
Um die mittels Gelelektrophorese aufgetrennten DNA-Fragmente als die von den jeweiligen
Primern amplifizierte, KHV-spezifische Sequenz verifizieren zu können, wurden die
entsprechenden DNA-Proben zum Sequenzieren an die Firma Eurofins MWG Operon
Sequencing Department gesendet. Die benötigte DNA-Menge von 100–300 ng/µl wurde in
10 µl ddH2O aufgenommen. Die Konzentration der Sequenzierungsprimer betrug 2 pmol/µl in
Material und Methoden 83
einem Gesamtvolumen von 15 µl. DNA, die nicht direkt als PCR-Produkt versandt werden
konnte, wurde mit dem Wizard SV Gel and PCR Clean-up System (Promega Corporation,
Madison) aus den vorher aus den Gelen ausgeschnittenen Banden isoliert und aufgereinigt
4.7 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm Sigmastat® 3.5 (Systat Software,
Inc., Kalifornien).
Zur Bestimmung signifikanter Unterschiede zwischen Teichen, die mit akut an KHV
erkrankten Karpfen besetzt waren und Teichen, die mit latent infizierten Karpfen besetzt
waren sowie bei den gemessenen Genomäquivalenten in Abhängigkeit von der
Wassertemperatur und vom Besatz der Teiche mit Karpfen unterschiedlichen Alters wurden
die Messwerte dem Rank Sum Test und dem ANOVA on ranks für normalverteilte
Messergebnisse unterzogen. Unterschiede zwischen den Gruppen wurden bei einem p-Wert
unter 0,05 als signifikant bewertet.
Ergebnisse 84
5 Ergebnisse
5.1 Methodik
5.1.1 Quantitative real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis von KHV
5.1.1.1 Klonierung der KHV-Zielsequenz
Zur Untersuchung der Gewebeproben von Wildfischen aus Teichwirtschaften,
Laborinfektionen und Karpfen aus Kohabitationsversuchen wurde ein DNA-
Nachweisverfahren etabliert, welches auf den Primer- und Sondensequenzen der real-time
PCR nach GILAD et al. (2004) basierte. Die Quantifizierung der Viruslast in den jeweiligen
Organen erfolgte mittels einer Verdünnungsreihe des Plasmids. Hierzu wurde das in der PCR
amplifizierte KHV-DNA-Fragment in den Vektor pGEM®-T Easy ligiert und anschließend in
E. coli Bakterien transformiert. Die Konzentration der Plasmide nach Aufreinigung betrug
244,096 ng/µl und entsprach 1,38 x 1011 pro µl.
5.1.1.2 Standardkurve für das KHV-Plasmid
Für die Quantifizierung der Viruslast wurde eine Verdünnungsreihe des KHV-Plasmids
angefertigt. In jeder PCR wurden Plasmide in den Konzentrationen von 1–108 Kopien im
Doppelansatz mitgeführt. Die Steigung der Standardkurve betrug -3,3 und die Effizienz der
Reaktion lag bei 101,1 % (siehe Abbildung 5 und 6). Diese Standardkurve diente der
Ermittlung der Kopienzahl der KHV-DNA in den Geweben der im Rahmen dieser Studie
untersuchten Fische.
Ergebnisse 85
F
luor
esze
nz (
dR)
Amplifikations Plots
Anzahl Zyklen
1 x 108
1 x 107
1 x 106
1 x 105
1 x 104
neg. PCR-Kontrolle
1 x 103
1 x 102
1 x 1001 x 101
Flu
ores
zenz
(dR
)
Amplifikations Plots
Anzahl Zyklen
1 x 108
1 x 107
1 x 106
1 x 105
1 x 104
neg. PCR-Kontrolle
1 x 103
1 x 102
1 x 1001 x 101
1 x 108
1 x 107
1 x 106
1 x 105
1 x 104
neg. PCR-Kontrolle
1 x 103
1 x 102
1 x 1001 x 101
Abbildung 5: Amplifikationsplots aus der real-time PCR nach GILAD et al (2004) für eine logarithmische (log10) Verdünnungsreihe des KHV-Plasmids (pGEM®-T Easy) wie unter 3.6.7.1 beschrieben.
Standardkurve
Initiale Quantität (Kopien)
Ct(
dR)
Standardkurve
Initiale Quantität (Kopien)
Ct(
dR)
Abbildung 6: Quantifizierung von KHV-Genomkopien mittels Standardkurve. Dargestellt ist die Korrelation der KHV-Plasmidkonzentration (pGEM®-T Easy) und den Schwellenwerten (Ct) für die Anzahl an Amplifikationszyklen in der unter 3.6.7.1 beschriebenen real-time PCR. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist: Y = -3.296 x LOG(X) + 39,76
Ergebnisse 86
5.1.1.3 Sequenzierung
Das Amplifikationsprodukt der PCR nach GILAD et al. (2004) wurde sequenziert, und mit
der in der Genbank hinterlegten Sequenz für KHV verglichen. Die Sequenzanalyse der PCR-
Produkte ergab eine 100 %ige Übereinstimmung zu den KHV-I und KHV-U Sequenzen
(Accession DQ177346 and DQ657948) (AOKI et al. 2007) die in der Datenbank (NCBI)
hinterlegt sind was bestätigte, dass es sich bei dem in der PCR amplifizierten DNA-Fragment
um KHV-spezifische DNA handelte.
5.1.2 SYBR Green real-time PCR zur relativen Quantifizierung für das
Thymidinkinase-Gen (ADAMEK et al. 2012) mittels Housekeeping Gene
(FORLENZA et al. 2008)
Diese PCR diente der Qualitätskontrolle der RNA-Extraktion und der reversen Transkription.
Für alle untersuchten Karpfen, die mit KHV infiziert wurden, konnte aufgrund positiver PCR-
Ergebnisse festgestellt werden, dass nach der Infektion eine Virusreplikation in den Geweben
stattgefunden hatte. Des Weiteren konnte eine genügende Qualität der extrahierten RNA
sowie der reversen Transkription bestätigt werden.
5.1.3 SYBR Green real-time PCR zur Qualitätskontrolle der TaqMan real-time PCR
nach GILAD et al. (2004) mittels Capsid Triplex Protein-Gen (ORF72)
Um die Ergebnisse real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zu bestätigen, wurden die zuvor
positiv auf KHV-Genomäquivalente getesteten Proben mit einer weiteren PCR, basierend auf
einem anderen Genomabschnitt, wiederholt. Für diese Analyse wurde das Capsid Triplex
Protein-Gen (ORF 72) nach ADAMEK et al. (2012) verwendet.
Die Quantifizierung der Viruslast in den jeweiligen Organen erfolgte mittels einer
Verdünnungsreihe des Plasmids. Hierzu wurde das in der PCR amplifizierte Capsid Triplex
Protein-Fragment in den Vektor pGEM®-T Easy ligiert und anschließend in E. coli Bakterien
transformiert. Die Konzentration der Plasmide nach Aufreinigung betrug 33,37 ng/µl und
entsprach 7,63 x 1010 pro µl.
Ergebnisse 87
5.1.4 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung der KHV-Replikation
unter Verwendung des Thymidinkinase-Gens (ADAMEK et al. 2012) mit
externen Standard
5.1.4.1 Klonierung der Thymidinkinase-Zielsequenz
Zur Untersuchung der Gewebeproben von Wildfischen und Karpfen aus den Laborinfektionen
und aus den Kohabitationsversuchen hinsichtlich einer Virusmehrung wurde ein SYBR Green
basiertes RT-PCR System zur Analyse der Transkription von Virusproteinen nach ADAMEK
et al. (2012) für das Thymidinkinase-Gen etabliert. Die Quantifizierung der Virusvermehrung
in den jeweiligen Organen erfolgte mittels einer Verdünnungsreihe des Plasmids. Hierzu
wurde das in der PCR amplifizierte Fragment des Thymidinkinase-Gens in den Vektor
pGEM®-T Easy ligiert und anschließend in E. coli Bakterien transformiert. Die Konzentration
der Plasmide nach Aufreinigung entsprach 3,46 x 1010 pro µl.
5.1.4.2 Standardkurve für das Thymidinkinase-Plasmids
Für die Quantifizierung der Virusvermehrung wurde eine Verdünnungsreihe des Plasmids
angefertigt. In jeder PCR wurden Plasmide in den Konzentrationen von 101–107 Kopien im
Doppelansatz mitgeführt. Die Steigung der Standardkurve betrug in etwa -3,4 und die
Effizienz der Reaktion lag bei 96,8 (siehe Abbildung 7 und 8). Diese Standardkurve diente
der Ermittlung der Virusvermehrung in den Geweben der untersuchten Fische.
Die Qualitätskontrolle der quantitativen real-time PCR mit SYBR Green nach ADAMEK et
al. (2012) zur Quantifizierung der KHV-Replikation wurde mittels Dissoziationskurve
durchgeführt, wodurch Artefakte der Reaktion ausgeschlossen werden konnten (siehe
Abbildung 9).
Ergebnisse 88
Anzahl Zyklen
Flu
ores
zenz
(dR
)
Amplifikations Plots
1 x 1071 x 1061 x 1051 x 1041 x 1031 x 1021 x 101neg. PCR-Kontrolle
Anzahl Zyklen
Flu
ores
zenz
(dR
)
Amplifikations Plots
1 x 1071 x 1061 x 1051 x 1041 x 1031 x 1021 x 101neg. PCR-Kontrolle
1 x 1071 x 1061 x 1051 x 1041 x 1031 x 1021 x 101
1 x 1071 x 1061 x 1051 x 1041 x 1031 x 1021 x 101neg. PCR-Kontrolle
Abbildung 7: Amplifikationsplots der RT-PCR für das Thymidinkinase-Gen nach ADAMEK et al. (2012) für eine logarithmische (log10) Verdünnungsreihe des Thymidinkinase-Plasmids (pGEM®-T Easy) wie unter 3.6.6.2 beschrieben.
Standardkurve
Initiale Quantität (Kopien)
Ct(
dR)
Standardkurve
Initiale Quantität (Kopien)
Ct(
dR)
Abbildung 8: Quantifizierung von Thymidinkinase-Genomkopien mittels Standardkurve. Dargestellt ist die Korrelation der Thymidinkinase-Plasmidkonzentration (pGEM®-T Easy) und den Schwellenwerten (Ct) für die Anzahl an Amplifikationszyklen in der unter 3.6.6.2 beschriebenen real-time RT-PCR. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist: Y = -3.401 x LOG(X) + 36.94
Ergebnisse 89
Dissoziationskurve
Flu
ores
zenz
(-R
‘(T
))
Temperatur (°C)
Dissoziationskurve
Flu
ores
zenz
(-R
‘(T
))
Temperatur (°C)
Abbildung 9: Dissoziationskurve zur Qualitätskontrolle der quantitativen real-time PCR mit SYBR Green nach ADAMEK et al. (2012) zum Nachweis einer KHV-Replikation
Ergebnisse 90
5.1.5 SYBR Green real-time RT-PCR zur Quantifizierung des Gens kodierend für
das Major Capsid Protein-Gen (ORF92) des KHV (ADAMEK et al. 2012) mit
externem Standard zum Nachweis einer KHV-Replikation
5.1.5.1 Klonierung der Major Capsid Protein-Zielsequenz
Zur Untersuchung der Gewebeproben von Wildfischen und Karpfen aus den Laborinfektionen
und aus den Kohabitationsversuchen auf eine Virusmehrung wurde ein SYBR Green basiertes
RT-PCR System zur Analyse der Transkription von Virusproteinen nach ADAMEK et al.
(2012) für das Major Capsid Protein-Gen (ORF92) etabliert. Die Quantifizierung der
Virusvermehrung in den jeweiligen Organen erfolgte mittels einer Verdünnungsreihe des
Plasmids. Hierzu wurde das in der PCR amplifizierte Fragment des Major Capsid Protein-
Gens in den Vektor pGEM®-T Easy ligiert und anschließend in E. coli Bakterien
transformiert. Die Konzentration der Plasmide nach Aufreinigung betrug 42,72 ng/µl und
entsprach 8,78 x 1010 pro µl.
5.1.5.2 Standardkurve für das Major Capsid Protein-Plasmid
Für die Quantifizierung der Virusvermehrung wurde eine Verdünnungsreihe des Plasmids
angefertigt. In jeder PCR wurden Plasmide in den Konzentrationen von 101–107 Kopien im
Doppelansatz mitgeführt. Die Steigung der Standardkurve betrug in etwa -3,3 und die
Effizienz der Reaktion lag bei ca. 101,7 % (siehe Abbildung 10 und 11). Diese Standardkurve
diente der Ermittlung der Virusvermehrung in den Geweben der untersuchten Fische.
Die Qualitätskontrolle der quantitativen real-time PCR mit SYBR Green nach ADAMEK et
al. (2012) zum Nachweis einer KHV-Replikation wurde mittels Dissoziationskurve
durchgeführt, wodurch Artefakte der Reaktion ausgeschlossen werden konnten (siehe
Abbildung 12).
Ergebnisse 91
Anzahl Zyklen
Flu
ores
zenz
(dR
)
1 x 1071 x 1061 x 1051 x 1041 x 1031 x 1021 x 101neg. PCR-Kontrolle
Amplifikations Plots
Anzahl Zyklen
Flu
ores
zenz
(dR
)
1 x 1071 x 1061 x 1051 x 1041 x 1031 x 1021 x 101neg. PCR-Kontrolle
1 x 1071 x 1061 x 1051 x 1041 x 1031 x 1021 x 101
1 x 1071 x 1061 x 1051 x 1041 x 1031 x 1021 x 101neg. PCR-Kontrolle
Amplifikations Plots
Abbildung 10: Amplifikationsplots der RT-PCR für das Major Capsid Protein-Gen (ORF92) nach ADAMEK et al. (2012) für eine logarithmische (log10) Verdünnungsreihe des Major Capsid Protein-Plasmids (pGEM®-T Easy) wie unter 3.6.6.3 beschrieben.
Initiale Quantität (Kopien)
Standardkurve
Ct(
dR)
Initiale Quantität (Kopien)
Standardkurve
Ct(
dR)
Abbildung 11: Quantifizierung von Major Capsid Protein-Genomkopien mittels Standardkurve. Dargestellt ist die Korrelation der Major Capsid Protein-Plasmidkonzentration (pGEM®-T Easy) und den Schwellenwerten (Ct) für die Anzahl an Amplifikationszyklen in der unter 3.6.6.3 beschriebenen real-time RT-PCR. Die Gleichung der Steigungsgeraden ist: Y = -3.283 x LOG(X) + 34.77
Ergebnisse 92
Dissoziationskurve
Flu
ores
zenz
(-R
‘(T
))
Temperatur (°C)
Dissoziationskurve
Flu
ores
zenz
(-R
‘(T
))
Temperatur (°C)
Abbildung 12: Dissoziationskurve zur Qualitätskontrolle der quantitativen real-time PCR mit SYBR Green nach ADAMEK et al. (2012) zum Nachweis einer KHV-Replikation
Ergebnisse 93
5.1.6 Laborinfektion zur Prüfung der Empfänglichkeit von Karpfen für das KHV
KHV-spezifische DNA-Sequenzen wurden in allen Geweben von Karpfen nachgewiesen,
denen eine Lösung mit KHV i.p. injiziert wurde. Individuen der Infektionsgruppe zeigten
zudem starke Symptome einer klinischen Erkrankung durch das KHV, begleitet von
auffälligen Verhaltensänderungen und Mortalitäten (siehe Abbildung 13). In den untersuchten
Geweben lag die Konzentration der virusspezifischen DNA zwischen 1 x 105–3 x 107 Kopien
pro 25 mg Gewebeprobenmaterial. In Geweben der nicht infizierten Kontrollgruppe waren
KHV-spezifische DNA-Sequenzen nicht nachweisbar. Des Weiteren wurden bei dieser
Gruppe keine KHV-spezifischen Krankheitssymptome oder pathologische Veränderungen
beobachtet.
Abbildung 13: KHV infizierte Karpfen mit akuter Symptomatik. Konfluierende Schleimhautläsionen mit „Sandpapier“-artiger Textur und Hämorrhagien (dargestellt durch Pfeile)
Ergebnisse 94
5.2 Ergebnisse der Felduntersuchungen
Probenumfang
Während eines akuten Ausbruches der KHV-Erkrankung und 14 Tage nach Feststellen der
Erkrankung wurden aus fünf Teichen und drei Ablaufgräben, die diese Teiche entwässerten,
insgesamt 291 Individuen aus 11 verschiedenen Fischarten gefangen. Aus insgesamt sieben
Teichen, die mit latent infizierten Karpfen besetzt waren wurden insgesamt 274 Individuen
aus 12 verschiedenen Fischarten gefangen. Alle Fische wurden auf für KHV-spezifische
Genomsequenzen untersucht (siehe Tabelle 30). Des Weiteren wurden 145 Individuen aus
sieben verschiedenen Fischarten untersucht, die einem zuvor sanierten Teich und dessen
Ablauf nach Neubesatz mit KHV-freier Karpfenbrut entnommen wurden.
Arteninventar
Das im Probenumfang enthaltene Artenspektrum spiegelt den Fischbestand in den
untersuchten Teichen wider. In Teichen mit akut an KHV infizierten Karpfen und Teichen mit
latent infizierten Beständen waren als Arten der Familie Cyprinidae vor allem Schleien als
wirtschaftlich genutzte Fische mit 20 bzw. 18 %, Rotfedern mit 9 bzw. 18 % und Plötzen mit
12 bzw. 8 % Vorkommen vorhanden. Eine hohe Präsenz von Fischen aus anderen Familien
hatten vor allem Individuen der Arten Flußbarsch mit 15 bzw. 25 %, gefolgt von Kaulbarsch,
Zwergwels und Stichling (siehe Tabelle 30, Abbildung 14 und 15).
Eine einheitliche Beprobung des gesamten Artenspektrums war nicht umsetzbar, da nicht alle
Fischarten in allen Teichen vorhanden waren
Ergebnisse 95
Tabelle 30: Probenumfang der gefangenen Wildfischarten aus sächsischen Karpfenteichwirtschaften, die auf KHV spezifische DNA-Sequenzen untersucht wurden und der Bereich der nachgewiesenen Kopienzahl an KHV-Genomsequenzen (sanierter Teich hier nicht berücksichtigt).
Beprobte Fischarten Akute Teiche MW WF Latente Teiche MW WF Cyprinidae Brachse 1/2 1,3x100 0 0 Giebel 0 0 0/10 0 Gründling 0 0 2/10 1,2x100 Moderlieschen 0/2 0 0 0 Döbel 0 0 0/1 0 Hasel 0 0 1/10 1,2x100 Plötze 2/13 4,2x100 8/33 1,3x101 Rotfeder 5/32 1,1x100 1/26 1,6x100 Schleie 4/33 1,2x100 10/58 1,5x101 Ictaluridae Zwergwels 1/21 4,0x10-1 1/18 4,0x10-1 Gasterosteidae Dreistacheliger Stichling 0/13 0 1/21 1,8x102 Percidae Kaulbarsch 0/8 0 0/39 0 Flußbarsch 10/43 2,7x100 1/40 4,3x10-1 Zander 0/5 0 0 0 Esocidae Europäischer Hecht 1/7 4,1x10-1 0/8 0 Gesamt WF 24/179 1,6x100 25/274 2,6x101
Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2
KHV-Nachweis
In allen an dieser Studie beteiligten Teichen konnten Karpfen gefangen werden, die positiv
auf KHV-Genomäquivalente getestet wurden (siehe Tabelle 31 und 33 sowie Daten aus
(BAUMER 2011)) mit Ausnahme des sanierten Teiches. Insgesamt wurden aus diesen
Teichen 453 Wildfische analysiert und bei 49 Individuen wurden mittels quantitativer real-
time PCR nach GILAD et al. (2004) KHV-spezifische DNA-Sequenzen festgestellt (siehe
Tabelle 30).
Mit einer (hoher) Variation in der Prävalenz und in der Viruslast von 4,3 x 10-1 bis 1,8 x 102
Kopien pro 1250 ng DNA wurden in den Gewebeproben von Brachse (Abramis brama),
Gründling (Gobio gobio), Hasel (Leuciscus leuciscus), Plötze (Rutilus rutilus), Rotfeder
(Scardinius erythrophthalmus), Schleie (Tinca tinca), Zwergwels (Ictalurus nebulosus),
Ergebnisse 96
Dreistacheliger Stichling (Gasterosteus aculeatus), Flußbarsch (Perca fluviatilis) und
Europäischer Hecht (Esox lucius) KHV-Genomäquivalente nachgewiesen.
In den Gewebeproben von Giebel (Carassius carassius gibelio), Moderlieschen (Leucaspius
delineatus), Döbel (Squalius cephalus), Kaulbarsch (Gymnocephalus cernua) und Zander
(Sander lucioperca) wurden hingegen keine KHV-spezifischen DNA-Sequenzen gefunden
(siehe Tabelle 30).
Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurden die zuvor positiv auf KHV-Genomäquivalente
getesteten Proben mit einer weiteren PCR, basierend auf einem anderen Genomabschnitt,
erneut untersucht. Für diese Analyse wurde das ORF72 (Capsid Triplex Protein) nach
(ADAMEK et al. 2012) verwendet und es konnten KHV spezifische DNA-Sequenzen in den
Proben von Schleie, Flußbarsch und Plötze nachgewiesen werden.
Die statistische Auswertung ergab für den Vergleich von Wildfischen aus Teichen mit akut an
KHV-infizierten Karpfen und latentem Besatz keine signifikanten Unterschiede bezüglich der
Anzahl an Genomkopien. Die gemessenen Genomäquivalente in Abhängigkeit von der
Wassertemperatur, der Altersklasse des Karpfenbesatzes und des Jahres, in dem sich der akute
KHV-Ausbruch ereignete, wiesen ebenfalls keine signifikanten Unterschiede auf.
Ergebnisse 97
Abbildung 14: Prozentuales Vorkommen von Wildfischen aus Teichen mit einem Besatz von akut an der KHV-Infektion erkrankten Karpfen
Vorkommen von Wildfischen in Teichen mit akut an KHV infizierten Karpfen
1% 0% 0%
1%
0% 0%
7%
18%
18%
12%
7%
4%
25%
3% 4%
Abramis brama Carassius gibelio Gobio gobio Leucaspius delineatus Leuciscus cephalus Leuciscus leuciscus
Rutilus rutilus Scardinius erythrophthalmus Tinca tinca
Ictalurus nebulosus Gasterosteus aculeatus Gymnocephalus cernua
Perca fluviatilis Sander lucioperca Esox lucius
Ergebnisse 98
Abbildung 15: Prozentuales Vorkommen von Wildfischen aus Teichen mit einem Besatz von latent mit KHV infizierten Karpfen
Vorkommen von Wildfischen in Teichen mit latent an KHV infizierten Karpfen
0% 4% 4%
0% 0%
4%
12%
9%
20% 7%
8%
14%
15% 0%
3%
Abramis brama Carassius gibelio Gobio gobio Leucaspius delineatus Leuciscus cephalus Leuciscus leuciscus
Rutilus rutilus Scardinius erythrophthalmus Tinca tinca
Ictalurus nebulosus Gasterosteus aculeatus Gymnocephalus cernua
Perca fluviatilis Sander lucioperca Esox lucius
Ergebnisse 99
Folgende Aufstellung dient der Beschreibung der in den nachfolgenden Tabellen verwendeten
Abkürzungen:
Kopien Mittelwert der positiv auf KHV-Genomsequenzen getesteten Wildfische
K1: einsömmrige Karpfen
K2: zweisömmrige Karpfen
K3: dreisömmrige Karpfen
MW Mittelwert der Anzahl an Kopien
nb nicht beprobt bzw. Probennahme unmöglich
neg. negativ
T Teich
TK Teichkarpfen
TW Teichwasser
WF Wildfisch
WT Wassertemperatur
x/n KHV-PCR positive Individuen/Gesamtzahl Individuen im Probenumfang
Ergebnisse 100
5.2.1 Proben aus Teichen mit akutem KHV-Geschehen
5.2.1.1 Pathologisch-anatomische Untersuchungen der den Teichen entnommenen
Wildfische
Die pathologisch-anatomische Untersuchung verlief für alle Wildfische ohne besonderen
Befund. Die Fische erschienen alle klinisch unauffällig und makroskopisch gesund. Es konnte
keine für eine KHV-Infektion typische Symptomatik beobachtet werden.
5.2.1.2 Molekularbiologische Untersuchungen
Tabelle 31: Quantitativer Nachweis von KHV-Genomsequenzen in Organen von Wildfischen und Karpfen aus Teichen und deren Ablauf mit Besatz von akut an einer KHV-Infektion erkrankten Karpfen
Teich T A T B T C T D T E Gesamt MW Besatz K3 K3 K1 K1 K3 WT 21 °C 18,5 °C 17,5 °C 17 °C 19 °C Cyprinidae Brachse 1/2 1/2 1,3x100 Giebel 0 0 Gründling 0 0 Moderlieschen 0/2 0/2 0 Döbel 0 0 Hasel 0 0 Plötze 0/2 2/11 2/13 4,2x100 Rotfeder 5/30 0/2 5/32 1,1x100 Schleie 0/1 2/18 2/14 4/33 1,2x100 Ictaluridae Zwergwels 1/9 0/12 1/21 4,0x10-1 Gasterosteidae Stichling 0/6 0/7 0/13 0 Percidae Kaulbarsch 0/3 0/1 0/4 0/8 0 Flußbarsch 0/4 8/22 2/17 10/43 2,7x100 Zander 0/5 0/5 0 Esocidae Hecht 0/2 1/5 1/7 4,1x10-1 Gesamt WF 0/18 18/94 0/16 2/24 4/27 24/179 Prävalenz % - 19,15 - 8,33 14,81 13,41 MW WF (Teich) 0 2,1x100 0 2,4x100 2,7x100 2,3x100 Gesamt TK* 10/10 5/6 15/20 3/3 - 33/39 Median TK* 3,8x101 5,7x103 2,5x102 8,4x104 nb 3,0x103 Median TW* neg neg 1,4x100 neg nb 1,4x100 Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2, *aus Baumer (2011)
Ergebnisse 101
Bei Wildfischen, die Teichen entnommen wurden, die mit akut an einer KHV-Infektion
erkrankten Karpfen besetzt waren, oder zu einem Zeitpunkt 14 Tage nach Abklingen der
KHV-bedingten Mortalität, konnten in den Organproben von 24 aus 179 Individuen KHV-
spezifische Genomsequenzen nachgewiesen werden. Dies entspricht einer kumulativen
Häufigkeit von 13,41 %. Bei Temperaturen zwischen 17 und 21 °C wurden Individuen aus
drei von fünf beprobten Teichen positiv auf KHV-Äquivalente getestet, welche den Familien
der Cyprinidae, Ictaluridae, Percidae und Esocidae zugeordnet wurden. Diese entstammten
aus Teichen, welche mit Karpfen der Altersklassen K1 und K3 besetzt waren. Eine hohe
Präsenz in den Teichen hatten vor allem Schleien (33), Rotfedern (32) und Flußbarsche (43),
die jeweils in zwei oder drei Teichen zugegen waren (siehe Tabelle 31). Positiv auf KHV-
Äquivalente getestet wurden Individuen der Arten Brachse, Plötze, Rotfeder, Schleie und als
Vertreter der nicht karpfenartigen Arten Zwergwels, Flußbarsch und Hecht. Fische der Arten
Moderlieschen, Stichling, Kaulbarsch und Zander wurden hingegen negativ getestet. Die
höchste Prävalenz zeigte sich mit 23,26 % bei Flußbarschen (10 von 43) und die geringste mit
4,76 % wiesen Zwergwelse auf (1 von 21). Die Ergebnisse veranschaulichen insgesamt eine
mäßige Variation bezüglich der Prävalenzen zwischen den jeweiligen Teichen. Bei 2 von 24
(8,33 %) Fischen in Teich D und 18 von 94 (19,15 %) Fischen in Teich B konnten KHV-
spezifische DNA-Sequenzen nachgewiesen werden. Ein Nachweis auf KHV in Wildfischen
aus den Teichen A und C war hingegen nicht möglich. In den Organen der beprobten Fische
wurden Viruslasten im Bereich von 4,1 x 10-1 bis 4,2 x 100 Kopien pro 1250 ng DNA
nachgewiesen. Zum jeweiligen Zeitpunkt der Probennahme wurden ebenfalls Karpfen
entnommen und auf KHV-Genomkopien hin untersucht. In allen beprobten Teichen wurden
bei einer Vielzahl an Karpfen KHV-spezifische DNA-Sequenzen nachgewiesen mit KHV-
Äquivalenten von 3 x 101 bis 8,4 x 104 Kopien. Im Teichwasser von Teich D wurden
zusätzlich KHV-spezifische DNA-Sequenzen in geringer Konzentration gefunden (siehe
Tabelle 31).
Ergebnisse 102
5.2.2 Proben aus Ablaufgräben von Teichen mit akutem KHV-Geschehen
5.2.2.1 Pathologisch-anatomische Untersuchungen der den Teichen entnommenen
Wildfische
Die pathologisch-anatomische Untersuchung verlief für alle Wildfische ohne besonderen
Befund. Die Fische erschienen alle klinisch unauffällig und makroskopisch gesund. Es konnte
keine für eine KHV-Infektion typische Symptomatik beobachtet werden.
5.2.2.2 Molekularbiologische Untersuchungen
Tabelle 32: Nachweis von KHV-Genomsequenzen in Organen von Wildfischen aus Ablaufgräben von Teichen aus sächsischen Teichwirtschaften mit Besatz von akut mit KHV infizierten Karpfen
T A T B Gesamt MW WF Ablaufgraben Graben Graben 1 Graben 2 Besatz K3 K3 WT 21 °C 19 °C 18 °C Cyprinidae Brachse 1/2 1/2 1,3x100 Giebel 0/0 Gründling 0/0 Moderlieschen 0/2 0/2 Döbel 0/0 Hasel 0/0 Plötze 0/2 0/2 Rotfeder 1/10 4/11 5/30 1,1x100 Schleie 0/1 1/9 1/9 2/19 1,2x100 Ictaluridae Zwergwels 1/9 1/9 4,0x10-1 Gasterosteidae Stichling 0/6 0/6 Percidae Kaulbarsch 0/3 0/1 0/4 Flußbarsch 0/4 5/8 3/14 8/26 2,8x100 Zander 0/1 0/4 0/5 Esocidae Europäischer Hecht 0/2 0/3 0/2 0/7 Gesamt WF 0/18 7/31 10/63 17/112 1,4x100 Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2
Ergebnisse 103
Bei Wildfischen, die Ablaufgräben von Teichen entnommen wurden, die mit akut an einer
KHV-Infektion erkrankten Karpfen besetzt waren, oder zu einem Zeitpunkt 14 Tage nach
Abklingen der KHV-bedingten Mortalität, konnten in den Organproben von 17 aus 112
Individuen KHV-spezifische Genomsequenzen nachgewiesen werden. Dies entspricht einer
kumulativen Häufigkeit von 15,19 %. Bei Temperaturen zwischen 18 und 21 °C wurden
Individuen aus Ablaufgräben in einem von zwei beprobten Teichen positiv auf KHV-
Äquivalente getestet, welche den Familien der Cyprinidae, Ictaluridae und Percidae
zugeordnet wurden. Diese entstammten aus den Ablaufgräben 1 und 2 von Teich B, der mit
K3 besetzt war. Eine hohe Präsenz in den Ablaufgräben hatten Rotfedern (30), Flußbarsche
(26) und Schleien (19). Positiv auf KHV-Äquivalente getestet wurden insgesamt Individuen
der Arten Brachse, Rotfeder, Schleie und als Vertreter der nicht karpfenartigen Arten
Zwergwels und Flußbarsch. Die höchste Prävalenz zeigte sich bei Flußbarschen mit 30,77 %
(8 von 26) und bei Rotfedern mit 16,67 % (5 von 30). In den Organen von beprobten Fischen
wurden Viruslasten im Bereich von 4,0 x 10-1 bis 2,8 x 100 Kopien pro 1250 ng DNA
nachgewiesen (siehe Tabelle 32).
5.2.3 Proben aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen
5.2.3.1 Pathologisch-anatomische Untersuchungen der den Teichen entnommenen
Wildfische
Die pathologisch-anatomische Untersuchung verlief für alle Wildfische ohne besonderen
Befund. Die Fische erschienen alle klinisch unauffällig und makroskopisch gesund. Es konnte
keine für eine KHV-Infektion typische Symptomatik beobachtet werden.
5.2.3.2 Molekularbiologische Untersuchungen
Ergebnisse 104
Tabelle 33: Nachweis von KHV-Genomsequenzen in Organen von Wildfischen und Karpfen aus Teichen und Ablaufgräben aus sächsischen Teichwirtschaften mit Besatz mit latent mit KHV infizierten Karpfen
T 1 T 2 T 3 T 4 T 5 T 6 T 7 Gesamt MW Besatz K2 K1 K2 K3 K3 K1 K3 Jahr KHVD 2007 2008 2009 2009 2009 2009 2008 WT 19,5 °C 19,5 °C 6 °C 14 °C 6 °C 5 °C 15 °C Cyprinidae Brachse 0 0 Giebel 0/10 0/10 0 Gründling 2/10 2/10 1,2x100 Moderlieschen 0 0 Döbel 0/1 0/1 0 Hasel 1/10 1/10 1,2x100 Plötze 1/3 0/4 7/10 0/16 8/33 1,3x101 Rotfeder 0/1 1/15 0/10 1/26 1,6x100 Schleie 0/11 2/10 0/1 0/14 4/9 4/13 10/58 1,5x101 Ictaluri dae Zwergwels 1/8 0/10 1/18 4,0x10-1 Gasterosteidae Stichling 0/4 0/10 1/7 1/21 1,8x102 Percidae Kaulbarsch 0/5 0/16 0/7 0/1 0/10 0/39 Flußbarsch 0/2 1/11 0/9 0/17 0/1 1/40 4,3x10-1 Zander 0 0 Esocidae Hecht 0/8 0/8 0 Gesamt WF 1/21 3/47 10/50 2/77 0/19 4/40 5/20 25/274 Pravalenz % 4,8 6,34 20,0 2,6 0 10,0 25,0 9,1 MW WF (Teich) 2,0x100 1,5x100 1,1x101 1,0x100 0 3,5x100 6,1x101 1,3x101 Gesamt TK* 1/8 5/20 10/10 7/10 nb 5/10 7/7 35/65 Median TK* 9,4x10-1 7,5x100 2,5x102 4,7x100 nb 6,5x101 nb 6,6x101 Median TW* - - - - nb 7,6x10-1 2,0x10-1 4,8x10-1 Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2, *aus Baumer (2011)
Ergebnisse 105
Bei Wildfischen, die Teichen entnommen wurden, die mit latent an einer KHV-Infektion
erkrankten Karpfen besetzt waren, konnten in den Organproben von 25 aus 274 Individuen
KHV-spezifische Genomsequenzen nachgewiesen werden. Dies entspricht einer kumulativen
Häufigkeit von 9,12 %. Bei Temperaturen zwischen 5 und 19,5 °C wurden Individuen aus
sechs von sieben beprobten Teichen positiv auf KHV-Äquivalente getestet, welche den
Familien der Cyprinidae, Ictaluridae, Gasterosteidae und Percidae zugeordnet wurden. Diese
entstammten aus Teichen, welche mit Karpfen der Altersklassen K1, K2 und K3 besetzt waren.
Eine hohe Präsenz in den Teichen hatten vor allem Schleien (58), Kaulbarsche (39) und
Flußbarsche (40), die jeweils in fünf oder sechs von sieben beprobten Teichen zugegen waren
(siehe Tabelle 33). Positiv auf KHV-Äquivalente getestet wurden Individuen der Arten
Gründling, Hasel, Plötze, Rotfeder, Schleie und als Vertreter der nicht karpfenartigen Fische
Zwergwels, Stichling und Flußbarsch. Fische der Arten Brachse, Giebel, Döbel, Kaulbarsch
und Hecht wurden hingegen negativ getestet. Die höchste Prävalenz mit 24,24 % zeigte sich
bei Plötzen (8 von 33) und die geringste mit 2,5 % bei Flußbarschen (1 von 40). Die
Prävalenz bezüglich der Teiche zeigt eine Variation von 2,6 % (2 aus 77) der Fische in Teich
4 und 25 % (5 aus 20) der Fische in Teich 7. Ein Nachweis auf KHV in Wildfischen aus
Teich 5 war hingegen nicht möglich. In den Organen von beprobten Fischen wurden
Viruslasten im Bereich von 4,3 x 10-1 bis 1,8 x 102 Kopien pro 1250 ng DNA nachgewiesen.
In allen beprobten Teichen wurden bei Karpfen KHV-spezifische DNA-Sequenzen
nachgewiesen mit einer hohen Variation der Prävalenzen und mit KHV-Äquivalenten von
9,4 x 10-1 bis 2,5 x 102 Kopien. Im Teichwasser von Teich 6 und 7 wurden zusätzlich KHV-
spezifische DNA-Sequenzen in geringer Konzentration gefunden (siehe Tabelle 33).
Ergebnisse 106
Tabelle 34: Anzahl der KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen in Abhängigkeit von der Wassertemperatur zum Zeitpunkt der Probennahme
Teich T 3, 5, 6 T 4, 7 T 1, 2 Gesamt MW WF Besatz K1, K3 K3 K1, K2 WT 5-6 °C 14-15 °C 19,5 °C Cyprinidae Brachse 0 0 Giebel 0/10 0/10 0 Gründling 2/10 2/10 1,2x100 Moderlieschen 0 0 Döbel 0/1 0/1 0 Hasel 1/10 1/10 1,2x100 Plötze 7/10 0/16 1/7 8/33 1,3x101 Rotfeder 0/10 1/15 0/1 1/26 1,6x100 Schleie 4/10 4/27 2/31 10/58 1,5x101 Ictaluridae Zwergwels 0/10 1/8 1/18 4,0x10-1 Gasterosteidae Stichling 0/10 1/7 0/4 1/21 1,8x102 Percidae Kaulbarsch 0/11 0/7 0/21 0/39 Flußbarsch 0/10 0/17 1/13 1/40 4,3x10-1 Zander 0 0 Esocidae Hecht 0/8 0/8 0 Gesamt WF 14/109 7/97 4/68 25/274 2,6x101 Spanne WF 7,0x10-2-9,0x101 5,0x10-1-1,8x102 4,3x10-1-2,1x100 MW WF 8,7x100 4,4x101 1,6x100 Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2
Ergebnisse 107
KHV-spezifische Genomsequenzen wurden im gesamten Wassertemperaturbereich der
Felduntersuchung zwischen 5 und 19,5 °C in Wildfischen aus Teichen mit latentem KHV-
Geschehen mittels der verwendeten real-time PCR nachgewiesen. Im Bereich von 5 bis 6 °C
lag der Anteil an für KHV positiv befundenen Individuen bei 12,8 % (14 von 109) und im
Temperaturbereich von 14 bis 15 °C waren es 7,2 % (7 von 97) der Individuen. Bei 19,5 °C
wurden 5,9 % (4 von 68) der beprobten Wildfischen positiv getestet. Somit lag die höchste
Prävalenz mit 12,8 % bei den niedrigsten Temperaturen zwischen 5 und 6 °C vor. Bei
Temperaturen von 14 bis 15 °C ist der höchste Mittelwert mit 4,4 x 101 und einer Spanne der
Einzelwerte von 5,0 x 10-1 bis 1,8 x 102 Kopien zu verzeichnen. Bei 19,5 °C ist der niedrigste
Wert mit 1,6 x 100 Kopien im Mittel zu verzeichnen mit Einzelwerten von 4,3 x 10-1 bis
2,1 x 100 Kopien (siehe Tabelle 34). Die statistische Auswertung ergab allerdings keine
signifikanten Unterschiede für die verschiedenen Temperaturbereiche.
Ergebnisse 108
Tabelle 35: Anzahl der KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen in Abhängigkeit vom Besatz der Teiche mit Karpfen unterschiedlichen Alters
Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2
Wildfische wurden Teichen mit latentem KHV-Geschehen entnommen, die mit ein- bis
dreisömmrigen Karpfen besetzt waren. KHV-spezifische DNA-Sequenzen ließen sich bei
verschiedenen Wildfischen in Teichen nachweisen, unabhängig der Alterstufe des jeweiligen
Karpfenbesatzes. In Teichen mit einsömmrigen Karpfen (K1) wurden 8 % (7 von 87), in
Teichen mit K2-Besatz 15,5 % (11 von 71) und in Teichen mit Besatz von dreisömmrigen
(K3) Karpfen wurden 6 % (7 von 116) der Individuen positiv in der PCR auf KHV-
Genomsequenzen getestet. Wildfische aus Teichen mit K3-Besatz wiesen trotz der niedrigsten
Teich T 2, 6 T 1, 3 T 4, 5, 7 Gesamt MW Besatz K1 K2 K3 Jahr KHVD 2008-2009 2007-2009 2008-2009 WT 5°C-19,5°C 6°C-19,5°C 6°C-15°C Cyprinidae Brachse 0 0 Giebel 0/10 0/10 0 Gründling 2/10 2/10 1,2x100 Moderlieschen 0 0 Döbel 0/1 0/1 0 Hasel 1/10 1/10 1,2x100 Plötze 0/4 8/13 0/16 8/33 1,3x101 Rotfeder 0/1 1/25 1/26 1,6x100 Schleie 6/19 0/12 4/27 10/58 1,5x101 Ictaluridae Zwergwels 0/10 1/8 1/18 4,0x10-1 Gasterosteidae Stichling 0/4 0/10 1/7 1/21 1,8x102 Percidae Kaulbarsch 0/36 0/5 0/8 0/39 Flußbarsch 1/12 0/11 0/17 1/40 4,3x10-1 Zander 0 0 Esocidae Hecht 0/8 0 Gesamt WF 7/87 11/71 7/116 25/274 Spanne WF 7,0x10-2-1,4x101 5,7x10-1-9,0x101 7,0x10-2-1,8x102 MW WF 2,6x100 9,9x100 2,9x101
Ergebnisse 109
Prävalenz von 6 % die höchste mittlere Viruslast mit 3,1 x 101 und einer Spanne der
Einzelwerte von 7,0 x 10-2 bis 1,8 x 102 Kopien auf, während für Wildfische aus Teichen mit
Besatz von K1 die niedrigste mittlere Viruslast mit 2,5 x 100 Kopien und einer Spanne der
Einzelwerte von 7,0 x 10-2 bis 1,4 x 101 Kopien ermittelt wurde (siehe Tabelle 35). Die
statistische Auswertung ergab allerdings keine signifikanten Unterschiede für den Besatz mit
Karpfen verschiedenen Altersklassen.
Tabelle 36: Anzahl der KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen in Abhängigkeit des Jahres in dem sich der akute Ausbruch der KHVD ereignete
Teich T 1 T 2, 7 T 3, 4, 5, 6 Gesamt MW Besatz K2 K1, K3 K1-K3 Jahr KHVD 2007 2008 2009 WT 19,5°C 15°C-19,5°C 6°C-14°C Cyprinidae Brachse 0 0 Giebel 0/10 0/10 0 Gründling 2/10 2/10 1,2x100 Moderlieschen 0 0 Döbel 0/1 0/1 0 Hasel 1/10 1/10 1,2x100 Plötze 1/3 0/4 7/26 8/33 1,3x101 Rotfeder 0/1 1/25 1/26 1,6x100 Schleie 0/11 6/23 4/24 10/58 1,5x101 Ictaluridae Zwergwels 1/18 1/18 4,0x10-1 Gasterosteidae Stichling 1/11 0/10 1/21 1,8x102 Percidae Kaulbarsch 0/5 0/16 0/18 0/39 Flußbarsch 0/2 1/11 0/27 1/40 4,3x10-1 Zander 0 0 Esocidae Hecht 0/8 0/8 0 Gesamt WF 1/21 8/67 16/186 25/274 Spanne WF 2,0x100 5,0x10-1-1,8x102 7,0x10-2-9,0x101 MW WF 2,0x100 3,9x101 7,7x100 Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2
Ergebnisse 110
Im Untersuchungszeitraum der Feldstudie wurden Teichen mit latentem KHV-Geschehen
Wildfische entnommen, in denen sich zuvor in den Jahren 2007 bis 2009 ein akuter KHV-
Ausbruch mit erheblichem Verlustgeschehen ereignet hatte. KHV-spezifische DNA-
Sequenzen ließen sich bei verschiedenen Wildfischen nachweisen, unabhängig von dem Jahr
in dem sich der Ausbruch ereignete. In dem Teich mit einem KHV-Ausbruch im Jahr 2007
wurden 4,76 % der untersuchten Fischen (1 von 21) positiv auf KHV-spezifische
Genomsequenzen getestet. In den Teichen mit einem KHV-Ausbruch in den Jahren 2008 und
2009 waren es 11,94 % der Fische (8 von 67) bzw. 8,60 % (16 von 186). Die höchste
Prävalenz zeigte sich in Teichen mit einem KHV-Ausbruch im Jahr 2008 mit 11,94 % sowie
die höchste mittlere Viruslast mit 3,9 x 101 und einer Spanne der Einzelwerte von 5,0 x 10-1
bis 1,8 x 102 Kopien, während für Wildfische aus Teichen mit einem KHV-Ausbruch im Jahr
2007 die niedrigste mittlere Viruslast mit 2,0 x 100 Kopien aufwiesen (siehe Tabelle 36). Die
statistische Auswertung ergab keine signifikanten Unterschiede für die verschiedenen Jahre,
in denen sich der akute Ausbruch der KHVD ereignete.
Ergebnisse 111
5.2.4 Kohabitation von Wildfischen aus Teichen mit latentem KHV-Geschehen
5.2.4.1 Pathologisch-anatomische Untersuchungen
Die pathologisch-anatomische Untersuchung verlief für alle Wildfische und die mit diesen
kohabitierten Karpfen ohne besonderen Befund. Die Fische erschienen alle klinisch
unauffällig und makroskopisch gesund. Es konnte keine für eine KHV-Infektion typische
Symptomatik beobachtet werden.
5.2.4.2 Molekularbiologische Untersuchungen
Tabelle 37: Nachweis von KHV-Genomsequenzen in den Organen von SPF-Karpfen nach Kohabitation mit Wildfischen aus Teichen mit Besatz von latent mit KHV infizierten Karpfen.
WF MW WF Kohabitierte Karpfen MW Karpfen Cyprinidae Giebel 0/10 - 0/6 - Gründling 2/10 1,2x100 1/6 2,6x100 Hasel 1/10 1,2x100 0/6 - Plötze 8/33 1,3x101 0/6 - Rotfeder 1/26 1,6x100 4/6 5,0x10-1 Schleie 10/58 1,5x101 3/18 4,6x103 Ictaluridae Zwergwels 1/18 4,0x10-1 0/6 - Gasterosteidae Stichling 1/21 1,8x102 0/6 - Percidae Kaulbarsch 0/39 - 1/12 1,7x100 Flußbarsch 1/40 4,3x10-1 0/10 - Esocidae Hecht 0/8 - 1/5 1,2x100 Gesamt/MW 25/273 2,6x101 10/87 9,2x102 Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2
Ein Kohabitationsexperiment wurde durchgeführt, um zu überprüfen, ob Wildfische aus der
Teichbiozönose das Koi-Herpesvirus auf empfängliche Karpfen übertragen können.
Ergebnisse 112
Wildfische, die Teichen entnommen wurden, die mit latent an einer KHV-Infektion
erkrankten Karpfen besetzt waren, wurden in einem Kohabitationsexperiment eingesetzt und
14 Tage zusammen mit SPF-Karpfen gehalten. Insgesamt wurden 11 verschiedene Fischarten
aus den Familien Cyprinidae, Ictaluridae, Gasterosteidae, Percidae und Esocidae verwendet.
Nach der Kohabitation wurden KHV-spezifische Genomsequenzen in Karpfen nachgewiesen,
die mit Gründlingen, Rotfedern und Schleien als Vertreter der Cyprinidae kohabiert wurden
sowie in Karpfen, die mit Kaulbarschen und Hechten zusammen gehältert wurden, ohne dass
bei Kaulbarschen und Hechten KHV-Äquivalente nachgewiesen werden konnten (siehe
Tabelle 37). Die Prävalenz lag zwischen eins bis vier von sechs kohabitierten Karpfen.
Insgesamt wurden 10 von 87 Karpfen positiv mittels PCR getestet, was einer Prävalenz von
11,5 % entspricht. Die mittlere Kopienzahl für Kohabitationskarpfen lag mit einem Wert von
9,2 x 102 Kopien über dem für Wildfische mit 2,6 x 101 Kopien. Mit Schleien zusammen
gehälterte Karpfen wiesen nach 14 Tagen mit 4,6 x 103 Kopien die höchste
Viruskonzentration auf.
5.2.5 Untersuchungen eines sanierten Teiches nach Besatz mit KHV-freier
Karpfenbrut
In einen nach einem KHV-Ausbruch sanierten Teich wurden Karpfenbrütlinge aus Beständen
eingesetzt, die bisher nicht mit KHV infiziert waren. Über eine Wachstumsperiode von
Frühjahr 2009 bis Herbst 2009 wurden an vier Probennahmen auch Wildfische untersucht.
Außerdem wurden im Frühjahr 2010 bei der Abfischung Wildfische dem Teich entnommen
und nach einer anschließenden Kohabitation mit naiven Karpfen auf Infektion mit KHV
untersucht.
Ergebnisse 113
5.2.5.1 Pathologisch-anatomische Untersuchung der Teichkarpfen und der
Expositionskarpfen
Die pathologisch-anatomische Untersuchung verlief für alle Wildfische und die mit diesen
kohabitierten Karpfen ohne besonderen Befund. Die Fische erschienen alle klinisch
unauffällig und makroskopisch gesund. Es konnte keine für eine KHV-Infektion typische
Symptomatik beobachtet werden.
5.2.5.2 Molekularbiologische Untersuchungen
Tabelle 38: Anzahl der KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen und mit diesen kohabitierten SPF-Karpfen aus dem sanierten Teich und dessen Ablaufgraben
WF Ablauf WF Teich Kohabitationskarpfen Cyprinidae Gründling 0/20 0/1 0/6 Plötze 0/19 0/16 0/6 Rotfeder 0/3 - - Schleie 0/1 0/5 - Ictaluridae Zwergwels - 0/18 - Percidae Kaulbarsch 0/11 0/20 0/1 Flußbarsch 0/20 0/11 0/6 Gesamtzahl 0/74 0/71 0/19 Erklärungen siehe Auflistung unter 4.2
Bei 74 Wildfischen, die dem Ablaufgraben des sanierten Teiches bei Temperaturen zwischen
16 und 21°C entnommen wurden, konnten keine KHV-spezifische Genomsequenzen
nachgewiesen werden. Wildfische aus dem Teich wurden bei 7 °C während der
Frühjahrsbefischung aus der Fischsammelgrube nahe dem Mönch gesammelt und
anschließend für 14 Tage mit SPF-Karpfen kohabitiert. Weder in den Geweben der 71
Wildfische noch in den Geweben der 19 Kohabitationskarpfen konnten KHV-spezifische
Ergebnisse 114
Genomsequenzen nachgewiesen werden (siehe Tabelle 38). Außerdem wurden innerhalb
dieses Zeitraumes auch Karpfen und Teichwasser während der Frühjahrs- und
Herbstbefischung beprobt. Bei 100 Karpfen und allen Wasserproben Proben konnten keine
KHV-Genomsequenzen gefunden werden (BAUMER 2011).
5.3 Ergebnisse der Laborinfektion
In den Versuchen zur Laborinfektion sollten vornehmlich Fische des Artenspektrums,
welches in der Feldstudie beobachtet wurde, mit Zellkulturvirus infiziert werden, um die
Empfänglichkeit dieser Wildfischarten für das KHV experimentell zu überprüfen. Es konnten
allerdings nur Arten verwendet werden, die beim Großhändler verfügbar waren, weshalb
etwas vom ursprünglich angedachten und in den Teichen beobachteten Artenspektrum
abgewichen werden musste. Es wurden zwei Infektionsversuche durchgeführt. Zuerst wurden
verschiedene Wildfische direkt über ein KHV-haltiges Infektionsbad mit Zellkulturvirus
infiziert und in einem zweiten Versuch wurden Karpfen mit KHV über das Bad infiziert und
diese anschließend mit verschiedenen Wildfischen über einen definierten Zeitraum
kohabitiert. Organproben dieser Fische wurden daraufhin mit verschiedenen
molekularbiologischen Methoden auf das Vorhandensein von KHV-Genomsequenzen und
eine potentielle Virusvermehrung in verschiedenen Gewebepools untersucht.
5.3.1 Infektionsversuch 1 (Badinfektion)
5.3.1.1 Pathologisch-anatomische und molekularbiologische Voruntersuchungen
an kommerziell erworbenen Wildfischen und an Expositionskarpfen
Die pathologisch-anatomische Untersuchung sowie die parasitologische Untersuchung von
Kiemen und Haut verliefen für alle Wildfische und die mit diesen kohabitierten Karpfen ohne
besonderen Befund. Die Fische erschienen alle klinisch unauffällig und makroskopisch
Ergebnisse 115
gesund. Es konnte keine für eine KHV-Infektion typische Symptomatik beobachtet werden.
Vor Versuchsbeginn wurden pro Fischart fünf Individuen auf das Vorhandensein von KHV-
spezifischen Genomsequenzen untersucht. Die Untersuchung verlief sowohl für die
verwendeten SPF-Karpfen als auch für die Wildfische mittels PCR negativ.
5.3.1.2 Molekularbiologische Untersuchungen
Nach der Infektion über das Bad mit Zellkulturvirus wurden über den gesamten
Versuchszeitraum keine pathologischen Veränderungen bei Wildfischen beobachtet. Die
Fische zeigten durchgehend physiologisches Schwimmverhalten und keinerlei Anzeichen für
eine KHV-Infektion typische Symptomatik. Auch Karpfen, die mit Wildfischen kohabitiert
wurden, zeigten keine KHV-spezifischen Symptome. Bei den molekularbiologischen
Untersuchungen mittels PCR nach GILAD et al. (2004) konnten lediglich bei Flußbarschen,
Orfen und Stichlingen KHV-Genomsequenzen in den Geweben einzelner Individuen in
geringer Kopienzahl gefunden werden. Die Viruslast lag zwischen 6,8 x 10-1 bei einer Orfe an
Tag 17 und 1,07 x 101 Kopien bei einem Stichling an Tag 17. Einer von sechs SPF-Karpfen,
die mit Orfen kohabitiert wurden, konnte mit 5,24 x 10-1 Kopien positiv auf KHV-
Genomsequenzen getestet werden (siehe Tabelle 39). Mit den RT-PCR Systemen zur Analyse
der Transkription von Virusproteinen, basierend auf den Primerpaaren nach ADAMEK et al.
(2012) ließen sich keine KHV-spezifischen RNA-Sequenzen des Thymidinkinase-Gens oder
des Major Capsid Protein-Gens (ORF92) nachweisen.
Karpfen, die mit der ursprünglichen Viruslösung infiziert wurden und Karpfen, die mit diesen
zusammen gehältert wurden, zeigten hingegen nach der Infektion starke Symptome einer
klinischen Erkrankung durch das KHV, begleitet von auffälligen Verhaltensänderungen und
Mortalitäten. An Tag 2 p.i. konnte eine vermehrte Schleimbildung beobachtet werden, welche
sich im weiteren Verlauf deutlich verringerte. An Tag 4 zeigte die Haut schleimfreie Areale
mit „Sandpapier“-artiger Textur und Hämorrhagien, sowie Blutungen an den Flossenansätzen.
Die 12 Karpfen der Infektionskontrolle verstarben zwischen Tag 5 und 17. Von den ab Tag 7
mit diesen Karpfen kohabitierten Karpfen verstarben drei bis zum Tag der Probennahme an
Tag 17. Im Gegensatz zu Wildfischen wiesen die Gewebeproben von infizierten Karpfen
Ergebnisse 116
KHV-Genomsequenzen in hoher Kopienzahl zwischen 2,26 x 102 und 3,55 x 107 auf (siehe
Tabelle 39). In Geweben der nicht infizierten Kontrollgruppe waren KHV-spezifische DNA-
Sequenzen hingegen nicht nachweisbar. Des Weiteren wurden bei dieser Gruppe keine KHV-
spezifischen Krankheitssymptome oder pathologische Veränderungen beobachtet.
Mit den RT-PCR Systemen zur Analyse der Transkription von Virusproteinen ließen sich mit
den Primerpaaren für das Thymidinkinase-Gen zwischen 1,11 x 101 und 1,12 x 103 Kopien
und 1,03 x 100 bis 9,5 x 101 Kopien mit den Primerpaaren für das Major Capsid Protein-Gen
(ORF92) nachweisen.
Während der Inkubation in der Infektionslösung verstarben zwei Gründlinge, 22 Stichlinge
und fünf Flussbarsche auf Grund der physiologischen Belastung und des Mangels an
Sauerstoff in den Infektionsbecken. Diese Individuen wurden nicht in den
Untersuchungsumfang einbezogen.
Tabelle 39: Anzahl der mittels TaqMan real-time PCR nach GILAD et al. (2004) ermittelten KHV-Genomäquivalente in Proben von im Labor über das Bad infizierten Wildfischarten, mit diesen kohabitierten SPF-Karpfen und Karpfen der Infektionskontrolle
Fischart Tag 7 Kopien Tag 17 Kopien SPF Kopien Cyprinidae Gründling (Gobio gobio) 0/8 - 0/10 - 0/6 - Nase (Chondrostoma nasus) 0/7 - 0/8 - 0/6 - Orfe (Leuciscus idus) 0/10 - 1/10 6,80x10-1 1/6 5,24x10-1 Rotfeder (Scardinius erythrophthalmus) 0/10 - 0/10 - 0/6 - Schleie (Tinca tinca) 0/10 - 0/10 - 0/6 - Gasterosteidae Stichling (Gasterosteus aculeatus) - - 1/8 1,07x101 0/6 - Percidae Flussbarsch (Perca fluviatilis) 1/7 1,17x100 0/8 - 0/6 - Infektionskontrolle Karpfen (Cyprinus carpio)
6/6 1,43x105-3,53x107
6/6 4,31x105-4,48x106
6/6 2,26x102-3,55x107
5.3.2 Infektionsversuch 2 (Kohabitation)
Ergebnisse 117
5.3.2.1 Pathologisch-anatomische und molekularbiologische Voruntersuchungen
an kommerziell erworbenen Wildfischen und Expositionskarpfen
Die pathologisch-anatomische Untersuchung sowie die parasitologische Untersuchung von
Kiemen und Haut verliefen für alle Wildfische und die mit diesen kohabitierten Karpfen ohne
besonderen Befund. Die Fische erschienen alle klinisch unauffällig und makroskopisch
gesund. Es konnte keine für eine KHV-Infektion typische Symptomatik beobachtet werden.
Vor Versuchsbeginn wurden pro Fischart fünf Individuen auf das Vorhandensein von KHV-
spezifischen Genomsequenzen untersucht. Die Untersuchung verlief sowohl für die
verwendeten SPF-Karpfen als auch für die Wildfische mittels PCR negativ.
5.3.2.2 Molekularbiologische Untersuchungen
Nach der Kohabitation mit akut an KHV erkrankten Karpfen wurden über den gesamten
Versuchszeitraum keine pathologischen Veränderungen bei Wildfischen beobachtet. Die
Fische zeigten durchgehend physiologisches Schwimmverhalten und keinerlei Anzeichen für
eine KHV-Infektion typische Symptomatik. Auch Karpfen, die mit Wildfischen kohabitiert
wurden, zeigten keine KHV-spezifischen Symptome. Bei den molekularbiologischen
Untersuchungen mittels PCR nach GILAD et al. (2004) konnten bei einzelnen Individuen
aller im Versuchsumfang eingesetzten Arten KHV-Genomsequenzen in den Geweben von
Haut und Flosse oder Organpools in geringer Kopienzahl gefunden werden. Die Viruslast lag
zwischen 1,9 x 10-1 und 1,04 x 101 Kopien in den Geweben. Bei drei von sechs mit
Goldfischen kohabiterten SPF-Karpfen wurden KHV-Genomsequenzen in Konzentrationen
zwischen 1,84 x 100 und 2,08 x 100 detektiert und zwei der drei Goldfische verstarben an Tag
13 und 14. Bei allen anderen mit Wildfischen kohabitierten Karpfen konnten keine KHV-
spezifischen Genomsequenzen festgestellt werden (siehe Tabelle 40). Mit den RT-PCR
Systemen zur Analyse der Transkription von Virusproteinen, basierend auf den Primerpaaren
nach ADAMEK et al. (2012) ließen sich keine KHV-spezifischen RNA-Sequenzen des
Thymidinkinase-Gens oder des Major Capsid Protein-Gens (ORF92) nachweisen.
Ergebnisse 118
Karpfen, die mit der ursprünglichen Viruslösung infiziert wurden und Karpfen, die mit diesen
zusammen gehältert wurden, zeigten hingegen nach der Infektion starke Symptome einer
klinischen Erkrankung durch das KHV (s. Infektionsversuch 1). Die sechs Infektionskarpfen
verstarben zwischen Tag 5 und 7 p.i. und wiesen hohe Kopienzahlen zwischen 5,29 x 103 bis
5,67 x 105 für Haut- und Flossengewebepools und 7,07 x 103 bis 3,77 x 106 für
Organgewebepools auf. Fünf der sechs markierten Infektionskontrollkarpfen verstarben
zwischen Tag 8 und 15 nach Kohabitation und wiesen ebenfalls eine hohe Anzahl an KHV-
Genomäquivalenten auf. Zwei der mit den markierten Kontrollkarpfen kohabitierten Karpfen
verstarben an Tag 7 nach Kohabitation. Nur drei dieser Karpfen wiesen virusspezifische
Sequenzen in geringer Konzentration auf mit 7,5 x 10-1 bis 5,76 x 100 Kopien auf (siehe
Tabelle 40). Die sechs Karpfen, die 72 Stunden nach Entnahme der anderen zuvor infizierten
Fische zur Kontrolle der Tenazität des Virus in das Hälterungswasser eingesetzt wurden,
zeigten hingegen weder klinische Symptome einer KHVD noch wurden spezifische
Genomsequenzen in ihren Geweben detektiert. In Geweben der nicht infizierten
Kontrollgruppe waren KHV-spezifische DNA-Sequenzen hingegen nicht nachweisbar. Des
Weiteren wurden bei dieser Gruppe keine KHV-spezifischen Krankheitssymptome oder
pathologische Veränderungen beobachtet.
Mit den RT-PCR Systemen zur Analyse der Transkription von Virusproteinen ließen sich mit
den Primerpaaren für das Thymidinkinase-Gen in Haut- und Flossengewebepools 1,19 x 105
bis 7,76 x 105 und in Gewebepools 4,53 x 105 bis 1,70 x 107 Kopien bei Karpfen nachweisen.
Mit den Primerpaaren für das Major Capsid Protein-Gen (ORF92) wurden in Haut- und
Flossengewebepools 1,26 x 104 bis 5,21 x 105 und in Gewebepools 3,76 x 103 bis 1,30 x 106
Kopien bei Karpfen nachgewiesen.
Ergebnisse 119
Tabelle 40: Anzahl der mittels TaqMan real-time PCR nach GILAD et al. (2004) ermittelten KHV-Genomäquivalente in Proben von Wildfischen, die mit akut an einer KHV-Infektion erkrankten Karpfen kohabitiert wurden, sowie deren Infektionskontrolle und im Infektionswasser inkubierten SPF-Karpfen
Fischart HF Kopien GP Kopien SPF Kopien Infektionsgruppe Karpfen (Cyprinus carpio)
6/6 5,29x103 - 5,67x105
6/6 7,07x103 - 3,77x106
s. IK s. IK
Kohabitationsgruppe Goldfisch (Carassius auratus) 1/10 2,22x100 0/10 - 3/6 1,84 x 100 -
2,08 x100 Orfe (Leuciscus idus) 0/10 - 2/10 1,01x100 -
3,03x100 0/6 -
Schleie (Tinca tinca) 2/10 1,90x10-1 - 1,04x101
3/10 9,80x10-1 - 2,98x100
0/6 -
Gründling (Gobio gobio) 0/3 - 1/3 2,07 0/6 - Infektionskontrolle Karpfen (Cyprinus carpio)
6/6 1,24x104 - 2,24x105
6/6 1,56x102 - 2,70x106
3/6 7,50x10-1 - 5,76x100
Kontrolle Infektionswasser Karpfen (Cyprinus carpio)
0/6 - 0/6 - - -
Erkärung: HF: Haut/Flosse; GP: Gewebepool; IK: Infektionskontrolle; IG: Infektionsgruppe; Kohabitationsgruppe: KG
Diskussion 120
6 Diskussion
Seit dem Erstnachweis im Jahre 1998 hat sich das KHV weltweit verbreitet und übt
mittlerweile einen enormen Einfluss auf die Karpfenteichwirtschaft und den Zierfischhandel
mit Koi (PIKARSKY et al. 2004) aus. In Europa werden Karpfen überwiegend in
traditionellen Karpfenteichen mit einem natürlichen limnischen Ökosystem kultiviert, welche
einen hohen Wert als Landschaft, Erholungsgebiet und als natürliches Habitat aufweisen
(BILLARD 1999; SEVRIN-REYSSAC 1999). Karpfenteiche stellen Habitate für ein weites
Spektrum an planktischen und benthischen Organismen dar, zu welchem auch eine Vielzahl
verschiedener Fischarten der natürlichen Fischfauna zählen, die durch Zu- und Abläufe aus
den Teichen in verschiedene aufnehmende Gewässer migrieren können. Zusätzlich werden
häufig andere Cyprinidenarten wie Schleien oder Fischarten wie Zander und Hecht in Teichen
zusammen mit gewöhnlichen Karpfen aufgezogen (BILLARD 1999).
In diesem Zusammenhang eröffnet sich die Frage, ob Fischarten aus Polykulturen oder
Fische, die zum natürlichen Artenumfang der Teichbiozönose in der traditionellen
Karpfenteichwirtschaft gehören, eine Infektion mit KHV tragen und auch die Quelle eines
Krankheitsausbruches darstellen können.
Von vielen aquatisch verbreiteten Viren, die poikilotherme Vertebraten als Wirt nutzen, ist
bekannt, dass eine Empfänglichkeit verschiedener Fischarten für eine Infektion mit dem
gleichen viralen Erreger besteht, und dass Wirtsarten teilweise auch ohne selbst Symptome
der Erkrankung zu entwickeln infektiöses Virus an die Umgebung abgeben können.
Dies ist typischerweise bei Rhabdoviren zu beobachten. Prominente Vertreter sind zum
Beispiel das Virus der Viralen Hämorrhagischen Septikämie (VHS-V) die hauptsächlich
Regenbogenforellen betrifft (MEYERS u. WINTON 1995; SKALL et al. 2005; ZAK et al.
2007), die SVC (Frühlingsvirämie der Karpfen), welche hauptsächlich Cypriniden infiziert
(HAENEN u. DAVIDSE 1993; AHNE et al. 2002; SIWICKI et al. 2003; JEREMI et al. 2006)
sowie die IHN (Infektiöse Hämatopoetische Nekrose) zu deren Wirtsspektrum auch eine
Reihe verschiedener Fischarten unterschiedlicher Familien gehören (OIE 2010). Infektionen
mit Vertretern der Iridoviridae, wie dem Red Sea Bream Iridovirus (RSIVD) (SATORU
MATSUOKA 1996; KAWAKAMI u. NAKAJIMA 2002) oder dem Epizootische
Diskussion 121
Hämatopoetische Nekrosevirus (EHNV) (LANGDON et al. 1986; LANGDON u.
HUMPHREY 1987; LANGDON 1989) sind ebenfalls bei einer Vielzahl von Fischen zu
beobachten und unter experimentellen Bedingungen erweisen sich meist noch weitere Arten
als empfänglich und zeigen mitunter sogar Mortalitäten.
Im Vergleich dieser Fischseuchen auslösenden Viren scheint das Koi-Herpesvirus ein sehr
enges Wirtsspektrum, wie es für Vertreter der Herpesviren typisch ist, zu besitzen, sodass
Übertragungen auf andere Spezies Ausnahmen sind. Zoonosen durch Herpesviren sind daher
bisher unbekannt (DAVISON 2002; ROLLE u. MAYR 2007; MODROW et al. 2010).
Die Koi-Herpesvirose stellt eine virulente und hochkontagiöse Krankheit dar, doch
beschränkt sich das Krankheitsgeschehen mit Morbidität und Mortalität auf Fische aus der
Spezies Cyprinus carpio und wurde bislang nur in Koi- und Speisekarpfenpopulationen
beobachtet (ARIAV et al. 1999; WALSTER 1999).
In Experimenten, in denen Cypriniden und andere Wildfischarten mit Karpfen kohabitiert
wurden, die an einer manifesten klinischen KHVD erkrankt waren, konnten keine
Krankheitsausbrüche bei anderen Arten als gewöhnlichen Karpfen und Koi beobachtet
werden. Goldfische und Karauschen (Carassius carassius), welche phylogenetisch eng mit
dem gewöhnlichen Karpfen (Cyprinus carpio) verwandt sind (HE et al. 2008), ebenso wie
Silberbarsche (Carassius aurata) und Silberkarpfen (Hypophthalmichthys molitrix) (HE et al.
2008) mit geringerem Verwandtschaftsgrad entwickelten keine klinischen Symptome einer
durch KHV bedingten Erkrankung nach einer experimentellen Infektion mit dem Virus oder
nach Kohabitation mit erkrankten Karpfen (GILAD et al. 2002; PERELBERG et al. 2003;
PIKARSKY et al. 2004; HEDRICK et al. 2006). Deshalb wurde angenommen, dass diese
Arten nicht für eine Infektion mit KHV empfänglich sind. Später konnte das KHV-Genom
jedoch in Geweben von Goldfischen nachgewiesen werden, die mit an einer KHVD
erkrankten Karpfen zusammen gehalten wurden (EL-MATBOULI et al. 2007; SADLER et al.
2008). Das Spektrum der Arten, die für das Virus empfänglich sind, scheint sich stetig zu
erweitern. Russische und atlantische Störe (A. gueldenstaedtii und A. oxyrinchus), die häufig
in Aquakulturanlagen zusammen mit Karpfen gehalten werden, wurden positiv auf KHV
getestet, ohne dass bei diesen Fischen klinische Symptome beobachtet werden konnten. In
diesem Zusammenhang wurde allerdings nicht überprüft, ob diese Fische das Potential haben,
Diskussion 122
gesunde Karpfen zu infizieren und wie hoch dieses ist, weshalb von einer sehr geringen
Viruslast, wie bei latent infizierten Karpfen, auszugehen ist (KEMPTER et al. 2009).
Verglichen mit der zellkulturbasierten Virusisolation, welche sich trotz hoher Titer in den
Geweben als schwierig erweist (POKOROVA et al. 2005) oder ELISA-Nachweisverfahren,
anhand welcher keine Aussagen darüber getroffen werden können, ob der getestete Fisch das
Virus noch trägt (ADKISON et al. 2005; MATSUI et al. 2008), stellt die PCR ein Verfahren
dar, welches dies gewährleistet und sich dabei außerdem als äußerst sensitiv erweist.
Auf Grund dieser Tatsache wurde in der vorliegenden Arbeit für die Detektion des KHV und
die Quantifizierung der Viruslast in Wildfischen aus der sächsischen Teichbiozönose
vorrangig die quantitative real-time PCR nach GILAD et al. (2004) zum Nachweis von KHV
verwendet. Dieses Protokoll stellt eines der sensitivsten Nachweismethoden für die Detektion
von KHV-DNA in frischen Gewebeproben dar und ermöglicht ebenfalls die Detektion von
subklinischen Virusinfektionen (BERGMANN et al. 2010c; BAUMER et al. 2013). Bei
gesund erscheinenden Karpfen, die eine KHVD überlebt haben, liegen meist nur
Viruskonzentrationen im Bereich von 5–10 Viruspartikel pro 25–30 µg
Gewebeprobenmaterial vor (BERGMANN et al. 2010c). Diese Karpfen mit einer latenten
Infektion sind deshalb nur schwer mit einer Nachweismethode zu erfassen. Durch einen
Stressor induziert kann die Viruskonzentration in den Geweben von Karpfen mit einer
persistierenden Infektion allerdings rapide zunehmen. Als geeignet dazu stellten sich
beispielsweise eine simulierte Befischung mittels Handkescher und der Fischtransport dar,
wodurch im Anschluss ein erheblich zuverlässigerer Virusnachweis gewährleistet wird
(MEYER 2007b; BERGMANN u. KEMPTER 2011). Um eine Virusreaktivierung zu
induzieren, wurden die Fische in der vorliegenden Studie im Anschluss an den Fang und den
Transport zusätzlich durch eine simulierte Befischung gestresst.
Diskussion 123
Feldstudie
In der Feldstudie dieser Arbeit konnten mittels der verwendeten PCR-Methode KHV-
Genomäquivalente in Geweben von Fischen unterschiedlichster Arten detektiert werden, die
der sächsischen Teichbiozönose entnommen wurden. Die Probennahmen fanden während
akuter KHV-Ausbrüche in den Sommermonaten und überwiegend zu Zeitpunkten im Herbst
oder Frühjahr bei nicht permissiven Wassertemperaturen an Teichen mit latent infizierten
Karpfenbeständen statt, während der Wasserspiegel in diesen abgesenkt wurde, um die
Bestände abzufischen.
Die Prävalenz des KHV bei den Wildfischen war gering, aber nicht nur auf Fische begrenzt,
die während einer akuten KHVD oder bei Wassertemperaturen über 20 °C gefangen wurden.
Insgesamt wurden zwischen 2008 und 2010, aus allen an dieser Studie beteiligten Teichen,
453 Wildfische aus 15 unterschiedlichen Fischarten analysiert und bei 49 Individuen aus 10
unterschiedlichen Arten wurden mittels quantitativer real-time PCR nach GILAD et al. (2004)
KHV-spezifische DNA-Sequenzen festgestellt. Diese positiv auf KHV-Genomäquivalente
getesteten Individuen aus der Wildfischpopulation waren nicht nur Vertreter der Cypriniden,
sondern konnten auch anderen Familien, wie Ictaluridae, Percidae und Esocidae zugeordnet
werden. Bei insgesamt 10 % der untersuchten Fische konnten in den Gewebeproben von
Brachse (Abramis brama), Gründling (Gobio gobio), Hasel (Leuciscus leuciscus), Plötze
(Rutilus rutilus), Rotfeder (Scardinius erythrophthalmus), Schleie (Tinca tinca), Zwergwels
(Ictalurus nebulosus), Dreistacheliger Stichling (Gasterosteus aculeatus), Flußbarsch (Perca
fluviatilis) und Europäischer Hecht (Esox lucius) KHV-Genomäquivalente nachgewiesen
werden. In den Gewebeproben von Giebel (Carassius carassius gibelio), Moderlieschen
(Leucaspius delineatus), Döbel (Squalius cephalus), Kaulbarsch (Gymnocephalus cernua)
und Zander (Sander lucioperca) wurden hingegen keine KHV-spezifischen DNA-Sequenzen
gefunden.
Auf Grund der geringen Stichprobengröße in den letztgenannten Arten kann nicht
ausgeschlossen werden, dass bei einer umfangreicheren Beprobung KHV-Genomsequenzen
auch bei Individuen dieser Arten nachweisbar werden.
Diskussion 124
Neben einer geringen Prävalenz konnten KHV-spezifische Sequenzen in Wildfischen auch
nur in niedrigen Konzentrationen nachgewiesen werden, während vergleichsweise Karpfen
aus der Biozönose zum gleichen Zeitpunkt hohe Viruslasten trugen.
Der Vergleich von Teichen mit Besatz von akut infizierten Karpfen und Beständen mit einer
latenten KHV-Infektion bezüglich der Prävalenzen und Viruslasten verdeutlicht, dass der
Infektionsstatus des Bestandes und die Jahreszeit kaum Auswirkungen auf die Virusbelastung
der Wildfische haben. Bei Wildfischen, die Teichen oder Ablaufgräben von Teichen, die mit
akut an einer KHV-Infektion erkrankten Karpfen besetzt waren bei Temperaturen zwischen
17 und 21 °C entnommen wurden, konnten in 24 Organproben aus 179 Individuen KHV-
spezifische Genomsequenzen nachgewiesen werden. Dies entspricht einer Prävalenz von
13,41 % und einer mittleren Viruslast von 2,3 x 100 Kopien. Von 39 Karpfen aus den gleichen
Gewässern ließ sich das Virus jedoch bei 33 Individuen mit einer mittleren Viruslast von
3,0 x 103 Genomkopien finden (BAUMER et al. 2013).
Bei Wildfischen, die bei Temperaturen zwischen 5 und 19,5 °C Teichen entnommen wurden,
die mit latent an einer KHV-Infektion erkrankten Karpfen besetzt waren, konnten in 25
Organproben aus 274 Individuen KHV-spezifische Genomsequenzen nachgewiesen werden.
Dies entspricht einer Prävalenz von 9,12 % mit einer mittleren Viruslast von 1,3 x 101
Kopien. Bei 35 von 65 Karpfen aus den gleichen Gewässern wurde das Virus nachgewiesen
mit einer mittleren Viruslast von 6,6 x 101 Genomkopien.
Akut mit KHV infizierte Karpfen tragen hohe Viruslasten, die beispielsweise auch in
Ausscheidungen wie Kot und Urin nachweisbar sind und ebenfalls geeignet sind
karpfenbasierte Zellkulturen zu infizieren (DISHON et al. 2005; NEGENBORN 2009). Des
Weiteren lassen sich hohe Viruskonzentrationen auch im Hautgewebe und Schleim feststellen
(GILAD et al. 2004; YUASA et al. 2008; COSTES et al. 2009). Deshalb können vor allem
auf den Boden absinkende Exkremente sowie der direkte Fischkontakt über Haut oder
Schleim als Übertragungsquelle angesehen werden. In dieser Situation wären nicht nur
Karpfen, sondern auch verschiedene Wildfische der Teichbiozönose dem Risiko einer
Infektion durch Viruspartikel ausgesetzt, die von erkrankten Karpfen mit hohen Viruslasten
ausgeschiedenen wurden. Eine Übertragung auf Cypriniden wie Schleien und Plötzen könnte
durch den direkten Hautkontakt mit erkrankten Karpfen, die eine verminderte Fluchtreaktion
Diskussion 125
zeigen oder durch Exkremente vom Gewässerboden bei der Nahrungsaufnahme, erfolgen.
Dieses erkrankungsbedingt verminderte Fluchtverhalten ermöglicht außerdem
Verfolgungsjägern wie Flußbarschen, Hechten und Zwergwelsen einen erleichterten
Beutefang. Bei dieser Art des Erwerbs der Beute sehen sich räuberische Arten ebenfalls
hohen Viruskonzentrationen ausgesetzt.
Das charakteristische Merkmal aller Herpesviren ist die Fähigkeit, nach der Erstinfektion
lebenslang latent im Wirtsorganismus zu verbleiben. Infizierte Zellen überleben in dieser
Phase und die Produktion von Viruspartikeln ist unterbunden (ROIZMAN u. PELLET 2001).
Eine Reaktivierung aus diesem Zustand zurück zum lytischen Infektionszyklus ist jedoch
wiederholt möglich. Dieses äußert sich meist in einem Krankheitsbild, das dem der
Primärinfektion entspricht (MODROW et al. 2010). Diese Reaktivierung mit erneuter
Virusausschüttung wird vor allem unter Einwirkung von Stressoren beobachtet (GILAD et al.
2004; MEYER 2007b; BERGMANN et al. 2009; BAUMER 2011).
Der Abfischvorgang in der Karpfenteichwirtschaft ist verbunden mit einem langsamen
Absenken des Wasserspiegels, um die Fische vor dem Mönch in einem sehr geringen
Wasservolumen zu sammeln (BOHL 1999), was vermutlich mit einer Stressbelastung für die
Fische verbunden ist.
Dieser Prozess scheint der Grund dafür zu schein, dass auch bei nicht permissiven
Temperaturen im Frühjahr oder im Herbst, im Anschluss an die Befischung, bei
verschiedenen Arten aus der Wildfischpopulation wie Plötze, Schleie und Zwergwels KHV-
Genomäquivalente nachgewiesen wurden, die Teichen mit latentem KHV-Geschehen
entstammten. Karpfen des selben Wasservolumens trugen zu diesem Zeitpunkt teilweise hohe
Viruslasten und schieden darüber hinaus auch infektiöse Viruspartikel aus, die als
Infektionsquelle für andere Karpfen und Wildfische angesehen werden können (BAUMER
2011). Ebenfalls konnte beobachtet werden, dass das Zusammendrängen der
Karpfenpopulation vor der Befischung einen geeigneten Stressor darzustellen scheint, da bei
Temperaturen von 5 und 8 °C bis zu 6,0 x 103 Virusgenomäquivalente in einzelnen
Individuen nachgewiesen werden konnten. Zum selben Zeitpunkt wurden außerdem in
geringen Mengen auch Viruspartikel in Plankton, Teichwasser und Ablaufwasser detektiert
(BAUMER et al. 2013), was weiterhin für das Ausscheiden größerer Virusmengen spricht.
Diskussion 126
Die Haut, besonders an den Extremitäten durch Schleimhaut reduzierende Verletzungen, dient
als Eingangspforte des CyHV-3 in den Wirtsorganismus und auch als Ort der Replikation.
Diese Virusvermehrung in der Haut ist somit nicht nur als Ausgangspunkt für die
Virusvermehrung im Fisch anzusehen, sondern auch als Ausgangspunkt für die Verbreitung
der Infektion in einer ganzen Population (COSTES et al. 2009; RAJ et al. 2011).
In der vorliegenden Studie wurden die Karpfen gemeinsam mit den Wildfischen in einem
geringen Wasservolumen unter Stresseinwirkung mit Netzen aus den Fischgruben
entnommen. Bei diesem Prozess findet ein intensiver Hautkontakt der Fische statt. Weiterhin
kommt es auch zu verschiedenen Verletzungen an den Schleimhäuten und den Extremitäten,
weshalb zu diesem Zeitpunkt eine Übertragung des Virus von Karpfen auf Wildfische als sehr
wahrscheinlich anzusehen ist.
Auch japanische Studien im Lake Biwa haben gezeigt, dass in natürlichen Gewässern die
Viruskonzentrationen sehr gering sind, es allerdings während der Laichzeit zu einem
erheblichen Anstieg in Bereichen der Laichplätze der Karpfen kommt. Durch das
Laichgeschäft bilden sich partielle, saisonale „hot spots“ für das Virus (UCHII et al. 2011).
Zudem verdeutlicht diese Tatsache, dass das Auftreten von KHV nicht zwangsläufig an hohe
Temperaturen gebunden sein muss, sondern auch in latenten Beständen unter natürlichen
Bedingungen bei nicht permissiven Temperaturen in Erscheinung treten kann.
UCCHI et al. (2014) stellten fest, dass die Virusmehrung meist im Frühjahr begann. Sie sind
der Auffassung, dass zu diesem Zeitpunkt das Immunsystem geschwächt sein muss und es
deshalb auch bei nicht optimalen Temperaturen zu einer Virusmehrung kommen kann.
In der vorliegenden Studie konnten diese Beobachtungen für Wildfische bestätigt werden, da
bei dem Vergleich der Temperaturen zum jeweiligen Zeitpunkt der Befischung bei Teichen
mit latent und akut infizierten Karpfen keine signifikanten Unterschiede bezüglich der
Viruslast in den Geweben der Wildfische festgestellt werden konnten.
Außerdem geht aus der vorliegenden Studie hervor, dass weitere Faktoren scheinbar wenig
Einfluss auf die Infektion von Wildfischen mit KHV haben. Die statistische Auswertung der
Diskussion 127
Felddaten zeigt ebenfalls, dass neben dem Infektionsstatus des Karpfenbestandes, der
Temperatur auch die Altersklasse des Karpfenbestandes und der Zeitpunkt der Erstinfektion
keine signifikanten Auswirkung auf die Viruslast und die Prävalenz des Virus bei Wildfischen
haben.
Des Weiteren deuten die Ergebnisse daraufhin, dass auch die phylogenetische Nähe der
Wildfische in der Verwandtschaftssystematik zu Karpfen nicht entscheidend für die
Empfänglichkeit für das Virus ist. Vielmehr scheint hierfür die Ökologie bezogen auf die
Lebensweise und den Aufenthaltsort der Fische in der Wassersäule entscheidend zu sein.
Entgegen vorheriger Erwartungen konnte in der Feldstudie kein signifikanter Unterschied in
der Virusprävalenz und Viruslast zwischen Cypriniden und Vertretern anderer Arten
festgestellt werden.
Somit ist davon auszugehen, dass die Nähe und der Kontakt zu infizierten Karpfen den
wesentlichen Beitrag zum Infektionsstatus des Wildfisches leisten und die Höhe der
Wahrscheinlichkeit einer Infektion davon direkt abhängig ist. Dies verdeutlicht beispielsweise
die Tatsache, dass Flussbarsche aus Teichen und Abläufen mit Besatz von akut an einer
KHV-Infektion erkrankten Karpfen die höchste Prävalenz aller Wildfische mit 23,3 % bzw.
30,8 % besitzen und in Teichen mit latent infizierten Beständen nur eine Prävalenz von 2,5%
aufwiesen. Diese Werte könnten sich durch die Ernährungsweise der Flussbarsche als
Raubfisch erklären. Da sich diese während einer KHVD von moribunden und frisch toten
Fischen am Gewässergrund ernähren, wenn der Fluchtreflex der Karpfen herabgesetzt ist bzw.
nicht mehr vorhanden ist. In Teichen mit latent mit KHV infizierten Fischen kommen
hingegen solche Szenarien zu Untersuchungszeitpunkten im Frühjahr oder im Herbst
vergleichsweise extrem selten vor.
Eine potentielle Sonderstellung könnte jedoch den Schleien als Vertreter der Karpfenfische
zugesprochen werden, da diese in akut und latent infizierten Karpfenbeständen eine relativ
hohe Prävalenz der Infektion von bis zu 17 % aufweisen und in latenten Beständen sogar eine
mittlere Viruslast von 1,5 x 101 Kopien, während bei einem Einzelindividuum zudem ein
Höchstwert von 1,2 x 102 Kopien pro 1250 ng DNA ermittelt wurde.
Diskussion 128
Die Frage, ob das Virus sich in positiv auf KHV-Genomsequenzen getesteten Wildfischarten
aus der Teichbiozönose vermehrt oder nicht, konnte in der Feldstudie nicht abschließend
aufgeklärt werden, da die Viruslasten sowie die Menge an Gewebe in den untersuchten
Individuen zu gering waren. Alle in der Feldstudie beprobten Wildfische wurden Teichen
entnommen, die mit infizierten Karpfen besetzt waren. Somit konnte keine Aussage über die
Dauer der Persistenz des Virus in den Fischen getroffen werden, da diese nicht über einen
längeren Zeitraum in Wasser gehältert werden konnten, welches frei von KHV war. Des
Weiteren konnte keine Aussage darüber getätigt werden, ob sich das Virus in den Geweben
der Wildfische vermehrt oder ob sie lediglich als reine Träger für das Virus anzusehen sind.
Die Ergebnisse der Feldstudie verdeutlichen außerdem, dass die im Rahmen des Programms
des Freistaates Sachsen zur Tilgung der Koi-Herpesvirus-Infektion gemäß Artikel 32 der
Verordnung (EG) Nr. 1198/2006 (KHV-Tilgungsprogramm) umgesetzte Sanierungsstrategie,
bestehend aus einer Phase der Trockenlegung über mindestens vier Wochen, einer darauf
folgenden Branntkalkapplikation und einem anschließendem Besatz mit KHV-freiem
Besatzmaterial, geeignet zu sein scheint, das KHV erfolgreich aus Teichwirtschaftsbetrieben
zu verdrängen. In dem in dieser Studie untersuchten sanierten Teich konnte eine KHV-
Infektion bei insgesamt fünf Probennahmen weder in Wildfischen aus den Ablaufgräben noch
in Fischen aus dem Teich während der Frühjahrsbefischung nachgewiesen werden oder in mit
diesen kohabitierten naiven Karpfen. Außerdem wurden auch sämtliche Karpfen-, Plankton-
und Teichwasserproben negativ auf KHV-Genomäquivalente getestet, die innerhalb des
Studienzeitraums zu verschiedenen Zeitpunkten genommen wurden (BAUMER 2011).
Insofern kann die durchgeführte Maßnahme als erfolgreich bewertet werden und weiterhin
wird deutlich, dass das Infektionsrisiko durch Wildfische als vergleichsweise gering bewertet
werden kann.
Um die Frage nach der Höhe des epidemiologischen Risikos einer Virusübertragung von
KHV-positiven Wildfischen auf naive Karpfen abzuschätzen und zu bewerten inwiefern
Wildfische an der Verbreitung der Infektion beteiligt sind, wurden die Fische aus der
sächsischen Teichwirtschaft, die in der Feldstudie gefangen wurden in
Kohabitationsversuchen mit naiven Karpfen eingesetzt. Des Weiteren wurden virusfreie
Diskussion 129
Wildfische in zwei weiteren Studien unter Laborbedingungen nach Infektion mit
Zellkulturvirus auf ihr Verbreitungspotential bezüglich einer KHVD überprüft.
In den in dieser Studie durchgeführten Kohabitationsexperimenten, wurden Wildfische aus
mit KHV infizierten Teichen im Anschluss an eine vorherige simulierte Befischung mit
naiven Karpfen zusammen gehältert und anschließend auf KHV-Genomsequenzen untersucht.
Die Ergebnisse zeigen, dass nach zwei Wochen der Kohabitation Virusgenomfragmente mit
einer geringen Anzahl an Kopien in einigen Karpfen detektiert werden konnten. Zu einer
Übertragung des Virus kam es nach Kohabitation mit Gründlingen, Rotfedern und Schleien
als Vertretern der karpfenartigen Fische sowie bei Stichlingen, Kaulbarschen und Hechten aus
Reihen der nicht karpfenartigen Fische. Die zuvor bereits beschriebene eventuelle
Sonderstellung der Schleie wurde in den Kohabitationsversuchen durch die Tatsache
unterstrichen, dass in den Geweben von Karpfen, die mit Schleien kohabitiert wurden, eine
mittlere Viruslast von 4,6 x 103 Kopien pro 1250 ng DNA nachgewiesen werden konnte,
während es bei anderen Fischarten maximal 2,6 x 100 waren. Klinische Symptome oder
Mortalitäten wurden über diesen Zeitraum jedoch nicht beobachtet.
Darüber hinaus zeigt dieser experimentelle Ansatz, dass die Nachweismethode durch ein
gewisses Detektionslimit in Bezug auf ihre Sensitivität begrenzt ist, da bei Kaulbarschen und
Hechten aus Teichen mit latent infizierten Besatz keine KHV-Genomfragmente ermittelt
werden konnten, jedoch in Karpfen, die mit ihnen kohabitiert wurden. Aus diesem Umstand
ist anzunehmen, dass einige Carrierfische aus der Teichbiozönose möglicherweise nicht
erfasst werden konnten.
Dieser Umstand könnte weiterhin auch dafür sprechen, dass sich das Artenspektrum eventuell
noch um andere Fische erweitern könnte und auch die Prävalenz weitaus höher sein könnte
als es aus den Ergebnissen dieser Studie hervorgeht.
In der vorliegenden Studie wurden weiterhin Viruslasten bei Wildfischen aus der
Teichbiozönose bestimmt, welche zuvor unter natürlichen Bedingungen in dieser Form und
Umfang noch nicht aufgenommen wurden.
Diskussion 130
Diese Studie ermöglicht es so, eine Aussage über das tatsächliche epidemiologische Risiko zu
tätigen, welches den im Feld erhobenen Ergebnissen zufolge nach als eher niedrig zu
bewerten ist. Die Relevanz von Wildfischen bei der Verbreitung des KHV scheint daher
vergleichbar mit der von abiotischen Faktoren wie unzureichend desinfizierten Arbeitsgeräten
und weiteren Vektoren wie Fischreihern, Kormoranen, Amphibien und Pflanzen zu sein, über
welche das Virus passiv durch Kontakt übertragen wird.
Jedoch konnten KHV-Genomsequenzen in geringer Kopienzahl in Geweben von Wildfischen
aus der sächsischen Teichwirtschaft ermittelt werden und auch geringfügig bei Karpfen, die
mit diesen Individuen über einen gewissen Zeitraum kohabitiert wurden. Es ist somit nach
Exposition nicht vollständig zu negieren, dass verschiedene Wildfischarten eine Infektion
weitergeben können.
Um diese Beobachtungen nachhaltig bestätigen zu können, wurden im Folgenden
weiterführende Studien mit Infektionsversuchen im Labor unter standardisierten Bedingungen
durchgeführt.
Laborstudie
Der Literatur zufolge sind andere Fischarten als Karpfen wie zum Beispiel Goldfische,
Graskarpfen oder Karauschen nicht für eine Infektion mit KHV empfänglich und es konnte
nach Kohabitation mit erkrankten Karpfen sowie nach experimenteller Infektion keine
Anzeichen einer KHVD beobachtet werden (GILAD et al. 2002; PERELBERG et al. 2003;
RONEN et al. 2003).
Sowie in der Feldstudie, konnte auch im Rahmen der Laborstudie keine KHV-bedingte
Symptomatik oder Mortalität bei Wildfischen beobachtet werden, welche in eine Viruslösung
eingesetzt oder mit KHV-ausschüttenden Karpfen kohabitiert wurden. Somit konnte auch in
dieser Studie die Vermutung bestätigt werden, dass nur bei Karpfen mit einer durch das Virus
bedingen Erkrankung zu rechnen ist.
Diskussion 131
Das Vorkommen von Koi-Herpesvirus wurde bisher zumeist in Geweben von karpfenartigen
Fischen beschrieben (EL-MATBOULI et al. 2007; MEYER 2007b; SADLER et al. 2008;
KEMPTER et al. 2009; BERGMANN et al. 2010a; KEMPTER et al. 2012).
Genomsequenzen des Virus wurden vor allem in Goldfischen detektiert (EL-MATBOULI et
al. 2007; SADLER et al. 2008; BERGMANN et al. 2010a), wobei diese Fische nicht an einer
Infektion erkrankten. SADLER et al (2008) generierten in diesem Zusammenhang mittels
quantitativer real-time PCR Ergebnisse, die eine Aussage über die Viruslast in den Geweben
der Fische erlaubten. Diese Beobachtungen lassen vermuten, dass bei Goldfischen, die
zusammen mit erkrankten Koi gehalten wurden, eine geringere Viruslast in den Geweben
vorlag als bei Koi desselben Bestandes.
Diese Daten decken sich ebenfalls mit den in dieser Arbeit beobachteten Ergebnissen aus der
Feldstudie sowie auch mit denen der experimentellen Ansätze aus der Laborstudie, in
welchen sich ein ähnliches Bild abzeichnet.
Wurden virusfreie Wildfische in einer KHV-haltigen Lösung im Labor inkubiert,
entwickelten sie keine Anzeichen einer Erkrankung und des Weiteren konnten auch nur in
Geweben von Einzelindividuen Genomsequenzen des Koi-Herpesvirus gefunden werden und
dies auch nur mit einer sehr geringen Viruslast. Ein Höchstwert von 1,17 x 100 wurde bei
einem Stichling ermittelt. Bei Karpfen, die mit diesen über das Bad infizierten Fischen
kohabitierten wurden, konnte nur bei einem Einzelfisch virusspezifische DNA in geringer
Konzentration nachgewiesen werden. Zur Prüfung der Virulenz des eingesetzten Virus in die
virushaltige Lösung des Infektionsbeckens eingesetzte Karpfen zeigten jedoch eine Mortalität
von 100 % mit ausgeprägter KHV-I Symptomatik und hohen Viruslasten von bis zu
3,55 x 107 Kopien in den Geweben. Dieser Tatsache zufolge kann ausgeschlossen werden,
dass die Infektiosität der Viruslösung für eine erfolgreiche Infektion nicht ausreichend
gewesen wäre und verdeutlicht die unterschiedliche Empfänglichkeit der Fische für KHV.
Diesen Beobachtungen zugrunde liegend lässt sich vermuten, dass eine Infektion von
verschiedenen Fischen aus einem breiten Artenspektrum der Teichbiozönose möglich ist, eine
verstärkte Virusvermehrung in den Geweben, gepaart mit einer starken Ausschüttung von
infektiösen Viruspartikeln, jedoch nicht stattfindet.
Diskussion 132
Um diese Vermutung zu bestätigen, wurde eine zweite Strategie für eine experimentelle
Infektion von Wildfischen entwickelt. In diesem Ansatz wurden die natürlichen Bedingungen
nachempfunden, indem mit Zellkulturvirus infizierte Karpfen mit Wildfischen über einen
längeren Zeitraum zusammen gehältert wurden. Diese wurden daraufhin gestresst und im
Anschluss nochmals mit naiven Karpfen kohabitiert. Des Weiteren wurden in diesem Ansatz
pro Fisch jeweils eine Gewebepoolprobe und eine Probe bestehend aus Flossen- und
Hautmaterial entnommen, um eine Konzentrationsverteilung des Virus im Fischorganismus
genauer bestimmen zu können.
In diesem Zusammenhang konnten jedoch keine signifikanten Unterschiede dokumentiert
werden. Fünf von 20 Proben aus Geweben von Schleien wurden beispielsweise positiv auf
KHV-Genomsequenzen getestet, die sich zwei zu drei auf die beiden untersuchten
Gewebepools verteilten. Die Viruslast lag hier zwischen 1,9 x 10-1 und 1,04 x 101 Kopien,
während Karpfen der Kontrollgruppen eine Mortalität von 100 % mit Viruslasten zwischen
7,07 x 103 und 3,77 x 106 Kopien aufwiesen. Bei drei, der mit Goldfischen kohabitierten
Karpfen, konnten Viruslasten von 1,84 x 100 bis 2,08 x 100 Kopien festgestellt werden und
zwei der infizierten Karpfen verstarben im folgenden Verlauf, jedoch ohne eindeutige
Symptomatik einer KHVD. Auch dies lässt vermuten, dass die Karpfen mit einer nur sehr
geringen Menge an Virus durch die Wildfische infiziert wurden.
Dies spricht dafür, dass in Wildfischen eine erheblich geringere Virusreplikation stattfindet
oder sie lediglich als ein Reservoir für das KHV in attenuierter Form angesehen werden
können, welche das Virus zwar passiv verbreiten, es jedoch aktiv in ihren Geweben nicht zu
einer Vermehrung kommt.
BERGMANN et al. (2010a) stellten die Vermutung auf, dass eine Replikation von KHV in
Goldfischen stattfinden könnte und in diesem Zusammenhang auch infektionsfähiges Virus
auf Koi übertragen werden könnte. Des Weiteren demonstrierten EL-MATBOULI et al.
(2010), dass in den Geweben von Goldfischen eine Expression von viralen Genen, assoziiert
mit einer Replikation von KHV, stattfindet. Dieser Nachweis erfolgte mit einer nicht
quantitativen RT-PCR, mittels den Primern KHV-TKf und KHV-TKr in Anlehnung an
BERCOVIER et al. (2005). Für eine Replikation des Virus in den Geweben einiger andere
Fischarten als Karpfen sprechen auch die Ergebnisse von DAVIDOVIC et al. (2007). In
Diskussion 133
Zellkulturexperimenten konnte eine Virusreplikation in Zelllinien abgeleitet von Goldfischen
(Au) und Silberkarpfenflossen (Tol=FL) beobachtet werden (DAVIDOVICH et al. 2007). Die
Zelllinien CHSE (chinook salmon embryo), RTG-2 (rainbow trout gonad) oder CCO (channel
catfish ovary) erwiesen sich hingegen als resistent (OH et al. 2001; DAVIDOVICH et al.
2007). Das Virus zeigte in den Zellen der Goldfisch- und Silberkarpfenflossen ähnliche
Replikationsmuster wie in den Karpfenzellen CCB und KFC, es wurden jedoch geringere
Mengen an Virus produziert. Ob zelluläre Barrieren oder die zelluläre Immunantwort dies
bedingt konnte in diesem Zusammenhang nicht beantwortet werden.
Um zu überprüfen, ob in den Geweben der häufig in der sächsischen Teichbiozönose
vorkommenden Fischarten ebenfalls eine Replikation des KHV zu beobachten ist, wurden
zwei quantitative RT-PCR Systeme nach ADAMEK et al. (2012) etabliert, um eine mögliche
Virusreplikation ggf. auch quantitativ zu erfassen. Mittels dieser Systeme wurden die Gewebe
aller Fische beider Laborexperimente hinsichtlich einer Transkription von Virusproteinen
untersucht.
KHV-spezifische RNA-Sequenzen des Thymidinkinase-Gens oder des Major Capsid Protein-
Gens (ORF92) ließen sich mit diesen Systemen nicht in Wildfischen nachweisen, sondern nur
in den Geweben von Karpfen. Der Vergleich der Transkriptionsraten der Virusproteine bei
Karpfen aus den beiden Laborinfektionen veranschaulicht allerdings, dass es in Bezug auf die
Anzahl der Kopien deutliche Unterschiede zwischen beiden experimentellen Ansätzen gibt.
Im Zuge der Badinfektion wurden Konzentrationen von 1,03 x 100 bis 1,12 x 103 Kopien mit
beiden Primerpaaren ermittelt. Bei der Transkriptionsanalyse der Karpfen aus dem
Kohabitationsversuch konnten mit den gleichen Primerpaaren nach ADAMEK et al. (2012)
Konzentrationen zwischen 3,76 x 103 und 1,70 x 107 Kopien ermittelt werden. Der Vergleich
der Kopienzahl im Pool aus Haut- und Flossengewebe mit konventionellen Gewebepools
bestehend aus Leber, Niere, Milz, Gehirn und Kieme zeigt, dass in den Organgewebeproben
nur eine geringfügig höhere Virusvermehrung stattgefunden hat und für die Diagnosefindung
bezüglich einer Replikation des KHV unterschiedliche Gewebetypen geeignet zu sein
scheinen.
Auf Grund der Tatsache, dass in Karpfen eine sehr hohe Transkriptionsrate von KHV-
spezifischen Virusproteinen beobachtet werden konnte und diese Daten mit zwei auf
Diskussion 134
unterschiedlichen Genen basierten Primerpaaren generiert wurden, kann im Folgenden
ausgeschlossen werden, dass durch einen Mangel an Sensitivität der Nachweismethode keine
Anzeichen einer Virusmehrung bei Wildfischen beobachtet werden konnten.
Die These von BERGMANN et al. (2010a), dass in Goldfischen eine Virusvermehrung
stattfinden könnte, konnte in dieser Studie nicht bestätigt werden. Ebenfalls konnten die
Ergebnisse der Studie von EL-MATBOULI et al. (2010) nicht reproduziert werden, obwohl
ebenfalls ein auf dem Thymidinkinase-Gen basiertes RT-PCR Protokoll verwendet wurde.
Der Goldfisch sowie die anderen in der Laborstudie eingesetzten Wildfische agieren nicht wie
bei EL-MATBOULI et al.(2010) beschrieben als „True Carrier“, sondern den Daten dieser
Arbeit folgend eher als Vektoren, die das Virus passiv verbreiten.
Es kann allerdings nicht völlig ausgeschlossen werden, dass eine Virusvermehrung auf einem
so niedrigen Level stattfindet, dass selbst sensitivste PCR-Methoden noch über der
Nachweisgrenze liegen, da DAVIDOVIC et al. (2007) zumindest auf kultivierten Zellen von
Goldfischen einen CPE beobachten konnte.
Jedoch ist dies bei Betrachtung der Ergebnisse dieser Studie als ziemlich unwahrscheinlich zu
bewerten, da die Fische bei permissiven Temperaturen gehältert wurden, welche bei Karpfen
eine starke Virusvermehrung induzierten und zusätzlich vor den Probennahmen einem
nachweislich geeigneten Stressoren ausgesetzt wurden. Diese Vermutung wird durch die
Tatsache, dass auf DNA-Ebene bei Wildfischen nur sehr geringe Kopienzahlen des KHV
festgestellt werden konnten, ebenfalls unterstützt.
Die über den gesamten Studienzeitraum ermittelten Virusmengen bei Wildfischen, die mit der
quantitativen real-time PCR nach GILAD et al. (2004) ermittelt wurden, entsprachen in etwa
den geringen Viruskonzentrationen, die auch in Teichen mit latent KHV-infizierten
Beständen für Karpfen mit persistierender Infektion sowie für Wasser- und Planktonproben
ermittelt wurden.
UCCHI et al. (2014) erkannten saisonale Expressionsmuster verschiedener KHV-spezifischer
Gene. Sie stellten fest, dass verschiedene mit dem lytischen Zyklus in Verbindung stehende
Gene nur ab bestimmten permissiven Temperaturen exprimiert werden oder zu Zeitpunkten
Diskussion 135
im Frühjahr kurz vor der Paarung, wenn das Immunsystem der Fische noch geschwächt ist.
Virale Genexpression, die mit dem latenten Zyklus in Verbindung steht, lässt sich jedoch
mittels RT-PCR auch in Phasen ermitteln, wenn sich KHV unter nicht permissiven
Konditionen nicht im Wirtsorganismus vermehrt.
Da die Virusmengen bei Wildfischen dieser Studie und Karpfen im latenten Stadium, die zum
selben Zeitpunkt gefangen wurden nahezu identisch sind (BAUMER 2011; BAUMER et al.
2013; FABIAN et al. 2013), könnte vermutet werden, dass das KHV sich in Wildfischen nicht
replizieren, sondern nur Gene exprimieren kann, die am latenten Zyklus beteiligt sind, jedoch
keine, die der lytischen Phase zugeordnet werden können. Somit wären die Wildfische nur ein
passives Reservoir für das KHV und eine Reaktivierung des Virus durch Stress oder
permissive Temperaturen könnte nicht stattfinden. Dies würde die Ergebnisse dieser Studie
bestätigen und die niedrigen Virusmengen und die geringe Ausschüttung erklären.
Andererseits könnte die Resistenz der Wildfische auch in einem Fehlen spezifischer
Virusrezeptoren, einer angeborenen zellulären Immunität oder einer wesentlich intensiveren
Immunantwort des Wirtsorganismus begründet sein (DAVIDOVICH et al. 2007).
Methodik
Eine abschließende Betrachtung der in dieser Arbeit verwendeten Methodik zeigt auf, wie
belastbar die in dieser Studie generierten Daten angesehen werden können.
Da bei Wildfischen bisher noch keine Symptome einer durch KHV-bedingten Erkrankung
festgestellt werden konnten, war davon auszugehen, dass potentiell detektierte
Viruskonzentrationen, ähnlich wie bei symptomlosen, latent mit KHV infizierten Karpfen,
sich als sehr gering darstellen würden. Deshalb sollte in dieser Studie eine sehr sensitive
Nachweismethode verwendet werden.
Diskussion 136
Des Weiteren sollte mittels dieser Studie die epidemiologische Relevanz von Wildfischen aus
der Teichbiozönose ermittelt werden, weshalb eine standardisierte Methode mit der
Möglichkeit zur Quantifizierung die Grundlage für die Erfassung der Daten sein sollte.
Infolgedessen wurde ein quantitatives real-time PCR-Verfahren ausgewählt, da alternative
KHV-Nachweismethoden, die auf Zellkulturen oder ELISA-Verfahren basieren, entweder
nicht sensitiv genug sind oder keine Aussage darüber erlauben, ob der Fisch noch Träger des
Virus ist (ADKISON et al. 2005; POKOROVA et al. 2005; MATSUI et al. 2008).
Zur Auswahl standen hier das von GILAD et al (2004) sowie das von BERCOVIER et al.
(2005) entwickelte PCR-Verfahren. Der Vergleich der beiden auf unterschiedlichen Primern
basierten Nachweismethoden zeigte, dass das PCR-Verfahren nach GILAD et al. (2004)
kombiniert mit einem internen Kontrollsystem (HOFFMANN et al. 2006) dem von
BERCOVIER et al. (2005) nicht nur in Bezug auf die Spezifität, sondern auch auf die
Sensitivität überlegen war. Mittels eines internen Standards eines zuvor klonierten Plasmids
(GILAD et al. 2002; BERGMANN et al. 2010c; BAUMER 2011) ermöglichte diese Methode
einen Nachweis von KHV-DNA bis zu einer Konzentration von 1–5 Kopien.
Dieses Protokoll stellt eines der sensitivsten Nachweismethoden für die Detektion von KHV-
DNA in frischen Gewebeproben dar und ermöglicht ebenfalls die Detektion von
subklinischen Virusinfektionen (BERGMANN et al. 2010c; BAUMER et al. 2013). Bei
gesund erscheinenden Karpfen, die eine KHVD überlebt haben, liegen meist nur
Viruskonzentrationen im Bereich von 5–10 Viruspartikel pro 25–30 µg
Gewebeprobenmaterial vor (BERGMANN et al. 2010c).
Auch das Nationale Referenzlabor für die Koi-Herpesvirusinfektion, Friedrich-Loeffler-
Institut, Bundesinstitut für Tiergesundheit, Insel Riems, rät dazu, diese PCR weiterhin für die
Diagnostik zu verwenden und bezeichnet es nach heutigem Stand der Wissenschaft als den
Goldstandard (BERGMANN et al. 2010b).
Durch die größtenteils sehr geringen Konzentrationen an KHV-DNA in den Geweben von
Wildfischen, die im Rahmen dieser Studie untersucht wurden, bestand teils auch das Risiko
einer potentiellen Fehlinterpretation der Ergebnisse, da es trotz der hohen Spezifität des
Diskussion 137
verwendeten PCR-Systems zu Artefaktbildung kommen konnte. Um falsch-positive
Ergebnisse basierend auf dieser Tatsache auszuschließen, wurden über den Zeitraum der
Studie alle Fluoreszenzmuster vergleichend betrachtet. Es wurde somit eine Art
Qualitätsmanagement betrieben. Dies beinhaltete die Wiederholungen für Proben mit sehr
geringer Viruslast, welche meist bestätigt werden konnten. Proben mit etwas höheren
Viruslasten ließen sich hingegen immer bestätigen. Des Weiteren fand auch ein
epidemiologischer Vergleich mit Proben statt, die in einer parallel an Karpfen aus diesen
Teichen entnommen Studie generiert wurden (BAUMER 2011). In diesem Zusammenhang
konnte festgestellt werden, dass wenn in Teichen mit latent infizierten Beständen wenig
KHV-DNA bei Karpfen gefunden wurde, auch die Viruslasten und die Prävalenz für
Wildfische sehr gering war. So konnte ein immer gleiches Muster zwischen den Viruslasten
bei Karpfen und Wildfischen beobachtet werden, was weiterhin für die Belastbarkeit der
Ergebnisse spricht. Außerdem erfolgte, um die Ergebnisse zu bestätigen, eine weitere Analyse
der zuvor positiv auf KHV-Genomäquivalente getesteten Proben mit einer SYBR Green real-
time PCR mittles Primersequenzen nach ADAMEK et al (2012), die auf einem anderen
Genomabschnitt des KHV basierend entwickelt wurden. Für diese Analyse wurde das Capsid
Triplex Protein-Gen (ORF 72) verwendet und es konnten KHV spezifische DNA-Sequenzen
in den Proben von Schleie, Flußbarsch und Plötze nachgewiesen werden.
Ein weiterer Nachteil von konventionellen PCR basierten Methoden ist es, dass anhand dieser
keine Aussage über den Infektionsstatus des Fisches ermittelt werden kann, beziehungsweise
keine Unterscheidung zwischen infektiösem Virus, uninfektiösen Viruspartikeln und viraler
Nukleinsäure möglich ist.
Im Rahmen dieser Studie sollte aber vor allem eine Aussage über die Rolle der Wildfische bei
der Verbreitung, also über die epidemiologische Relevanz ermittelt werden.
Mit Reversen Transkriptions (RT)-PCR-Analysen, die auf exprimierte Gene abzielen, kann
dieser Umstand allerdings umgangen werden, da hierbei in situ der Nachweis viraler Aktivität
möglich ist. Dieser Ansatz ist besonders bei Viren interessant, die einen lytischen und einen
latenten Zyklus haben, wie es der Fall bei Herpesviren ist. Aktives Virus, welches auf andere
Wirte übertragbar ist, kann somit von persistierendem, nicht aktivem Virus unterschieden
Diskussion 138
werden, wenn eine Expression von Genen, die der Replikation zugeordnet werden, nicht
stattfindet (UCHII et al. 2014).
Deshalb wurden im Folgenden zwei RT-PCR basierte Ansätze nach ADAMEK et al. (2012)
auf Grundlage zweier Gene des KHV etabliert, um zusätzlich zu der quantitativen Aussage
über die Menge an DNA auch eine Aussage zum Verbreitungspotential und der
epidemiologischen Relevanz der Wildfische zu ermitteln.
KHV-spezifische RNA-Sequenzen des Thymidinkinase-Gens oder des Major Capsid Protein-
Gens (ORF92) ließen sich mit diesen Systemen jedoch nicht in den Geweben von
Wildfischen nachweisen. Karpfen, die mit der gleichen Viruslösung oder durch Kohabitation
infiziert wurden, wiesen allerdings sehr hohe Transkriptionswerte von 1,03 x 100 bis zu 1,70 x
107 Kopien auf. Dies kann als Beleg für die hohe Sensitivität der Methode angesehen werden.
Die im Rahmen der Kohabitationsversuche gemachten Beobachtungen bestätigen weiterhin
auch die mittels RT-PCR ermittelten Ergebnisse und veranschaulichen eindeutig, dass die in
dieser Arbeit verwendete Methodik qualitativ und quantitativ geeignet war, eine fundierte
Aussage über die Rolle von Wildfischen bei der Übertragung einer KHVD in der sächsischen
Teichwirtschaft zu treffen.
Fazit
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, die Rahmen dieser Studie im Feld sowie im Labor
generiert wurden, dass bei Cypriniden und Vertretern anderer Wildfischarten aus der
Teichbiozönose eine Infektion einzelner Individuen mit KHV erfolgen kann. Allerdings ist
bei diesen Fischen nur eine sehr geringe Viruslast in den Geweben zu beobachten. Somit
können diese Arten als epidemiologisches Risiko bei der Infektion von Karpfen mit KHV
nicht ausgeschlossen werden, allerdings kann ihnen wesentlich weniger Bedeutung als zuvor
angenommen zugesprochen werden, da in ihren Geweben weder eine Virusreaktivierung noch
eine Virusvermehrung stattzufinden scheint.
Zusammenfassung 139
7 Zusammenfassung
Marc Fabian (2015):
Untersuchungen zu Übertragungswegen der Koi-Herpesvirose (KHV) in Wildfischen
In der vorliegenden Arbeit wurde die epidemiologische Relevanz von Wildfischen für die
Verbreitung des KHV in der sächsischen Karpfenteichwirtschaft untersucht. Hierzu wurden
verschiedene Fischarten aus der Teichbiozönose hinsichtlich ihrer Empfänglichkeit für KHV
untersucht. In diesem Zusammenhang wurde die Viruslast in den Geweben infizierter Fische
bestimmt, untersucht inwiefern durch Stressoren eine Ausschüttung von infektiösen
Viruspartikeln induziert werden kann und somit eine Übertragung auf virusfreie, naive
Karpfen möglich ist. Um dies zu überprüfen, wurden verschiedene Fischarten aus
Karpfenteichen mit einer KHV-Historie entnommen. Die Probennahmen fanden während
akuter Ausbrüche der Infektion bei Karpfen im Sommer sowie in latent infizierten Beständen
während der Frühjahrs- und Herbstbefischung statt. Die Ergebnisse zeigen, dass unabhängig
von Jahreszeit, Wassertemperatur, Altersklasse und Infektionsstatus des Karpfenbestandes
einzelne Individuen aus verschiedene Fischarten der Wildfischfauna in Karpfenteichen und
aus Ablaufgräben in der Teichwirtschaft mittels real-time PCR positiv auf KHV-
Genomäquivalente getestet werden konnten. Bei allen im Rahmen dieser Feldstudie
untersuchten Fischarten wies die Virusinfektion eine niedrige Prävalenz auf und bei
infizierten Fischen lagen nur geringe Viruslasten in den Geweben vor, unabhängig von der
phylogenetischen Verwandtschaft der Fischart zum Karpfen. In einem Kohabitationsversuch
von Wildfischen mit virusfreien Karpfen konnte ein Virustransfer nur auf einzelne Karpfen
festgestellt werden, jedoch ohne bei diesen hohe Viruslasten oder Symptome einer KHVD zu
erzeugen. Um diese Beobachtungen zu bestätigen, wurden zwei Infektionsversuche im Labor
unter standardisierten Bedingungen durchgeführt. Nach experimenteller Infektion von
Wildfischen mit Zellkulturvirus sowie nach Kohabitation von Wildfischen mit Virus
ausschüttenden Karpfen konnten auch unter Laborbedingungen vergleichbare Ergebnisse wie
im Feld beobachtet werden. Infektionen traten bei Wildfischarten in niedriger Prävalenz und
mit geringer Viruslast auf. Eine Übertragung des Virus von Wildfischen auf Karpfen erfolgte
nur bei einzelnen Individuen, die keine Krankheitssymptome entwickelten. Eine
Zusammenfassung 140
Transkription von Genen die Virusproteine codieren konnte in Geweben PCR-positiver
Wildfische mittels RT-PCR nicht beobachtet werden, was dafür spricht, dass sich das Virus in
Wildfischen nicht oder nur in sehr geringem Maße repliziert und es nicht zu einer
Reaktivierung kommt. In einem nach einem KHV-Ausbruch sanierten Teich konnte in dieser
Studie eine KHV-Infektion bei Wildfischen aus dem Teich und aus den Ablaufgräben nicht
nachgewiesen werden. Des Weiteren konnte auch nach Kohabitation der Wildfische mit
virusfreien Karpfen kein Virustransfer auf naive Karpfen festgestellt werden.
Den Ergebnissen dieser Arbeit zufolge können Cypriniden und Vertreter anderer
Wildfischarten aus der Teichbiozönose als epidemiologisches Risiko bei der Infektion von
Karpfen mit KHV nicht ausgeschlossen werden, allerdings mit weniger Bedeutung als zuvor
angenommen.
Summary 141
8 Summary
Marc Fabian (2015):
Examination of the transmission of koi herpesvirus (KHV) by wild fish species
The current work examines the epidemiological relevance of wild fish species from carp
farms in Saxony for a spreading of KHV. For this purpose, various wild fish species were
sampled from carp ponds with a history of KHV infection and examined for their
susceptibility to the virus. In this context, the viral load in the tissues of these fish was
determined and it was tested whether a release of the virus could be induced by stress and the
virus then could be transferred to naïve carp by cohabitation. Wild fish were sampled from
carp ponds during acute outbreaks of virus-induced mortality in summer and from ponds
stocked with carp carrying a latent KHV infection. From these ponds, wild fish were collected
during the harvesting process in autumn or spring, when the ponds were drained. The results
show that regardless of season, water temperature, age and infection status of the carp stock,
individuals from various wild fish species in carp ponds and its outlets could be found
positive for KHV genome equivalents by real-time PCR. The sampled fish as part of the field
study showed only a low prevalence and a low virus load in the tissues regardless of their
phylogenetic relationship to common carp. Furthermore, virus transfer to individual naive
carp was observed, but without producing high virus loads or symptoms of KHVD in the
tissues after a period of cohabitation.
To confirm these observations, two further infection experiments were carried out in the
laboratory under standardized conditions. After experimental infection of wild fish from
various species with cell culture derived virus or by cohabitation with virus shedding carp,
comparable results were observed as in the field study. Individuals from the wild fish species
were found positive for KHV with a low virus load, in a low prevalence and a low rate of
virus transfer to individual naive carp. Recipient carp as well showed no symptoms of the
disease while carp used as infection controls experienced 100 % mortality with high virus
loads in the tissue. Futhermore by RT-PCR no transcription of viral proteins was found in
tissues of KHV exposed wild fishes, which suggests no replication of the virus or a replication
at a very low rate in the tissues of wild fish species and it presumably will not be reactivated.
Summary 142
In a pond which had been disinfected after an outbreak of KHV D, no KHV specific DNA
sequences could be observed in wild fishes collected from the pond and its outlet at five
different time points during one year of observation. Furthermore, KHV could also not be
detected in naïve carps after cohabitation with wild fishes taken from this pond.
According to the results of the present study, fishes from different cyprinid species and from
other wild species can not be excluded as epidemiological risk of transmitting KHV to carp
form the ponds in carp farms, however, with less importance than previously assumed.
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Danksagung 158
10 Danksagung
An erster Stelle möchte ich Herrn Prof. Dr. Dieter Steinhagen für die Überlassung des
Themas, die Bereitstellung der Arbeitsmöglichkeiten, die äußerst kompetente und über alle
Maße geduldige Betreuung, auf die ich mich zu jeder Zeit verlassen konnte, bedanken. Einen
besseren Doktorvater hätte ich mir weder fachlich noch persönlich wünschen können. Vielen
Dank.
Bedanken möchte ich mich auch bei Dr. Gert Füllner, Dr. Kerstin Böttcher, Dr. Grit Bräuer
und Dr. Cornelia Mohr, die Agnes und mir stets zur Seite standen und uns immer herzlich in
Sachsen aufgenommen haben.
Dr. Agnes Baumer gilt mein ganz besonderer Dank für die wunderbare Zeit, die wir
gemeinsam in Sachsen und im Labor verbracht haben.
Weiterhin möchte ich mich bei Dr. Verena Jung-Schroers, Dr. Karina Retter, Marian van der
Marel PhD, Dr. Mikolaj Adamek, Graham Brogden PhD, Birgit Luckardt, Patricia Lowels
und bei meinem ehemaligen Kollegen Dr. Arne Hübner für die theoretische und praktische
Hilfe bei der Durchführung dieser Arbeit bedanken. Des Weiteren danke ich meinem lieben
Fastkollegen Adam Rosalski für die nicht selbstverständliche Hilfestellung mit Spinnern und
Blinkern.
Ganz besonders danke ich meiner Oma, meiner Mama, meinem Papa und Angela sowie
meiner Schwester Miriam, Benny, Christian und Damian, die wirklich eine schwere Zeit mit
mir hatten, aber trotzdem bis zum Schluss nicht aufgehört haben an mich zu glauben.
Des Weiteren gilt auch ein ganz herzlicher Dank meinem außergewöhnlichen Freund und
Lebensberater Jürgen Keller, ohne den diese Arbeit nicht zustande gekommen wäre, was nicht
nur auf der Kostenübernahme für das Binden dieser Arbeit beruht.
Zu guter letzt gilt ein riesiger Dank meiner lieben Melanie für die persönliche Unterstützung
und den wertvollen Rückhalt, den ich während dieser nicht leichten Zeit genießen durfte. Ich
danke dir sowie Luise und Lenny von Herzen.
Danksagung 159
Lieber Opa, am meisten hätte ich mich gefreut, wenn ich dich noch zu meiner
Promotionsfeier hätte einladen können.