Acta histochem. 88, 93-101 (1990)

VEB Gustav Fischer Verlag Jena

Institut fUr Anatomie der Martin-Luther-Universitiit Halle - Wittenberg zu Halle/Saale l) und Abteilung fiir Experi­

mentelie Zellforschung des Zentralinstitutes fiir Mikrobiologie und Experimentelle Therapie der Akademie derWissenschaften der DDR, Jena

Untersuchungen zum Wirkungsmechanismus des Alloxansauf B-Inselzellen unter besonderer Beriicksichtigung

der Alloxan-Metall-Komplex-Theorie

II. Wirkungen von Alloxan, Alloxansaure, Zn2+ und Ethylenglycol-bis-(~-aminoethyl­

ether)-N,N'-tetraessigsaure (EGTA) auf die Assemblierung von microtubularen Protei­nen (MTP) zu Microtubuli oder MTP-Sheets in vitro

Investigations of the alloxan effect on B-cells ofthe endocrine pancreas in special regardto the alloxan-metal-complex-theory

II. Effects of alloxan, alloxanic acid, znl+, and ethylenglycol-bis-(~-aminoethylether)­

N,N'-tetraacetic acid (EGTA) on the assembly of microtubulous proteins (MTP) intomicrotubules or MTP sheets in vitro

RAINER SCHMIDT l), HUBERT MULLER, EBERHARD UNGER und WOLFRAM VATER

Mit 2 Abbildungen

(Eingegangen am 3. Juli 1989)

Summary

Analyses of the cell structures in the islets of Langer}ulns revealed the presence of 2 predominant cations,calcium (~-granules and saccules, mitochondria, sac membranes, and cell membranes) and zinc (secretory granules,encasing membraneous sacs) in association with organelles which involve directional secretion. Both elements areknown to interact with microtubules influencing their structural and functional properties, e.g. movement ofsecretory granules. Influences of Zn2+ on microtubules are investigated with a view to interactions in vitro with andwithout diabetogenic substances.

Turbidimetry and electron microscopic investigations showed that under the conditions mentioned above,alloxan of a concentration of 2 x 10-5 moVI (alloxanltubuline I: 1) inhibits the formation of microtubules andincreases the portion of microtubules stabilized of 4°C. The Zn2+-induced formation of MTP sheets is notinfluenced by alloxan and the metal complex forming agent EGTA, if the molar concentrations of the substance andZn2+ are equally high. With a molar proportion of2: I (EGTA:Zn2+), the formation of sheets does not longer occurand only microtubules are formed, whereas neither sheets nor microtubules were assembled by alloxan with thismolar proportion. However, neither the assembly of microtubules nor the formation of Zn2+-induced sheets areinfluenced by alloxanic acid in both molar proportions.

It is shown that the diabetogenic alloxan influences the formation of microtubules and that performedmicrotubules are destroyed. This result of alloxan corresponds to its antimitotic activity analogously to thewellknown effect of colchicine (s: SCHMIDT et al. 1990). The question arises, wether alloxan causes the primaryhyperglycemia by desintegration or functional inactivation of microtubules, in contrary to the permanent alloxaninduced hyperglycemia resulting by secretory granules destruction.

8 Acta histochem.• Bd. 88. 2

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1. EinieituDg uDd ProblemstelluDg

Microtubuli sind, wie man seit mehr als 20 Jahren weill, konstitutive Strukturen eukaryotischerZellen. Sie werden als EiweiBstrukturen definiert und bestehen aus einem Zylindermantel parallelangeordneter - meist 13 - Protofilamente mit einem AuBendurchmesser von ca. 25 nm. DieProtofilamente setzen sich aus leicht gegeneinander verschobenen (¥- und ~-Untereinheiten desphylogenetisch konservativen Proteins Tubulin zusammen und ordnen sich linkshelical mit einemSteigungswinkel von etwa 10° in Microtubuli an. Den Microtubuli sind microtubulus-assoziierteProteine (MAPs) aufgelagert, die sie stabilisieren und funktionelle Eigenschaften mitbestimmen.Microtubuli sind nach In vitro-Untersuchungen gegen Kalte, hydrostatischen Druck und einigespezifische Chemikalien, wie Colchicin, empfindlich und zerfallen in Untereinheiten. DurchAssemblierung und Desassemblierung unterliegen Microtubuli Langenanderungen, die mor­phogene Eigenschaften und spezifische Funktionen, wie Mitose, Motalitat und intracellulareTransportvorgange (Sekretion u. a.), bewirken. Die Microtubuli konnen komplexe Strukturenaufbauen wie Mitosespindeln, Centriolen, Cilien, Axonemen, Neurotubuli u. a., die zeigen, inwelch fundamentaler Weise Microtubuli in eine ganze Reihe wesentlicher zellbiologischer Prozesseeinbezogen sind (Lit. s. HERZOG 1978; DUSTIN 1984; WARNER et al. 1989). Da die molekularenMechanismen der Assemblierung und Desassemblierung der Microtubuli in vivo nur sehr schwer zuerfassen sind, haben In vitro-Untersuchungen mit aus Him gewonnenem Tubulin bzw. rnicro­tubularem Protein (MTP = Tubulin + MAPs) flir das Studium der extracellularen Microtubulus­Assemblierung, fUr Strukturanalysen und Modelluntersuchungen zur Beeinflussung der Micro­tubulus-Bildung Bedeutung.

Eine Reihe von Substanzen, die an Tubulin binden, verhindem die MTP-Assemblierung undbedingen den Zerfall in Microtubuli. Zu den bekanntesten und als Tubulus-Gifte bezeichnetenSubstanzen gehoren Colchicin, Vincaalkaloide, Benzirnidazolverbindungen und Deuteriumoxid.Nach unseren Ergebnissen gehort zu dieser Gruppe von Substanzen auch das Alloxan. YomColchicin weiB man, daB Konzentrationen von weniger als 10-6 moUl bereits Microtubulibeeinflussen und entspreehende Storungen der Spindelfunktionen wahrend der Mitose und derSekretion in Driisenzellen - vor allem in B-Zellen Langerhansseher Inseln - verursaehen. MitHilfe solcher Microtubulus-Gifte versucht man, die Funktionen von Microtubuli in vivo zuergriinden.

Unsere Untersuchungen sollen dazu beitragen, die Frage einer regulatorisehen Bedeutung desreiehlieh in den B-Zellen vorkommenden Zinks fUr die Ausbildung von moglieherweise sekre­toriseh inaktiven Cytoskeletstrukturen zu klaren. Da die Assemblierung von Microtubuli schon beider Bindung von 2 oder 3 Zinkionen an das Tubulindimer in vitro ausbleibt und sich statt dessenflaehe Bander, sogenannte Zink-Sheets, ausbilden, konnen sieh altere, bisher nieht bewieseneVorstellungen von einer Bedeutung der Zinkionen u. a. ftir Speichervorgange in B-Zellen aufmolekularbiologischer Ebene morphologisch begriinden lassen. Da nun Alloxan - wie wir im Teil Iunserer Untersuchungen belegen konnten (SCHMIDT et al. 1990) - aueh als Mitosegift mitcolchieinahnliehen Effekten in Erseheinung tritt, wobei Zn2+ tiber die Bildung von Alloxan-Zink­Chelaten die Umwandlung von Alloxan zu Alloxansaure hemmt, pruften wir im Teil IT unsererUntersuchungen zum Wirkungsmeehanismus des Alloxans auf B-Inselzellen die Wirkung vonAlloxan, Alloxansaure, Zn2+ und Ethylglycol-bis-(~-aminoethylether)-N ,N' -tetraessigsaure(EGTA) auf die Assemblierung von microtubularen Proteinen zu Microtubuli oder MTP-Sheets invitro. Ziel dieser Untersuchungen war zu klaren, ob Alloxan Bildung und Stabilitat von Mierotubulibzw. Zn2+-Sheets beeinfluBt, letzteres im Vergleieh mit dem Metallkomplexbildner EGTA unddem Zerfallsprodukt des Alloxans, der Alloxansaure.

2. Material uDd VerfahreD

Die In vitro-Untersuchungen zur Wirkung von Alloxan und Alloxansiiure auf die Assemblierung von MTP zuMicrotubuli und von Alloxan, Alloxansiiure und EGTA auf die Bildung Zn2+-induzierter Sheets wurden mit

Wirkungsmechanismus des Alloxans auf B-Inselzellen 95

Schweinehirn-MTP durchgefiihrt, die Assemblierung von Microtubuli bzw. MTP-Sheets durch Triibungsmessungenquantifiziert und die Assemblate elektronenmikroskopisch iiberpriift.

2.1. Isolierung von MTP aus Schweinehim in Anlehnung an SHELANSKI et a1. (1973): Hirngewebe (750 g)wurde mit 550 mI eisgekiihIten Puffer (20 mrnol/I) N-Morpholinethansulfonsiiure (MES), 80 mrnol/I NaCI, I mmol/IEGTA, 0,5 mmol/I MgClz, I mrnol/I 2-Mercaptoethanol, pH = 6,4) bei 5 bis 7 °C homogenisiert und ultra­zentrifugiert. Aus dem Oberstand wurden Microtubuli assembliert nach Zugabe von Adenosin-5'-triphosphat (ATP)und Guanosin-5-triphosphat (GTP) sowie Glycerin (in Endkonzentrationen von 10-3 , 10-4 bzw. 8 mol/I) bei 37°C(45 min). Erneute Zentrifugation lieferte ein Sediment von Microtubuli, die im o. g. Puffer bei 4 °C erneutkiiItedesassembliert wurden und iiber einen 2. Assemblierungscyklus in Gegenwart von GTP als einzigem Nuc1eotidweitergereinigt wurden [ausfiihrliche Darstellung s. VATER (1986)]. Aile Assemblierungsexperimente wurden mitdiesem Standard-MTP in einem Assemblierungspuffer aus 100 mrnol/I N-Morpholinethansulfonsiiure (MES), 0,25mrnol/I MgClz, I mmol!l GTP bei pH = 6,4 und 37°C durchgefiihrt.

2.2. Herstellung der fUr die zu In-vitro-Untersuchungen eingesetzten Alloxan- und Alloxansiiurelosungen:Alloxan wurde in Form von Stammlosungen (2 x 10-5 , 2 X 10-4 und I x 10-3 mol/I) mit verdiinnter HCI auf pH =2,5 eingestellt und 5 min nach LOsung eingesetzt. Die Zugabe zur Probe erfolgte I min vor Beginn derAssemblierung bei 28°C. Zur Herstellung der Alloxansiiure diente eine 0,1 mol/I mit NaOH auf pH = 9 eingestellteAlloxanlosung, deren pH mindestens 120 min konstant blieb. Unter diesen Bedingungen sind ungeflihr 99,5% desAlloxans nach SELIGSON (1951) in Alloxansiiure umgewandelt. Die Konzentration der Alloxansiiure-Stamm-.losungen entsprachen denen des Alloxans, als LOsungsmittel diente jedoch ein Assemblierungspuffer von 100mmolll MES, 0,25 mmolll MgCIz und I mmolll GTP.

2.3. Trubungsmessungen: Assembliert eine Losung dimeren Tubulins (oder eines Gemisches aus dimerem undoligomerem Tubulin) zu Microtubuli oder zu iihnlichen Strukturen, so ist damit eine wesentliche Erhohung derlichtstreuenden Wirkung dieser Losung verbunden. Man kann deshalb den AssemblierungsprozeB bereits miteinfachen komrnerziellen Photometem verfolgen, indem man die optische Durchliissigkeit (OD) derAssemblierungslosung aufzeichnet (0 :s OD :s I). Diese sinkt, wenn sich lichtstreuende (triibende) Assemb­lierungsprodukte bilden. Oft wird als MaB fUr die Triibung die GroBe A = -Ig OD benutzt (in Analogie zurAbsorptionsmessung). Fiir Microtubuli wurde theoretisch und experimentell nachgewiesen, daB A in guterNiiherung proportional der Gesamtliinge aller Microtubuli ist und nicht von den Einzelliingen individuellerMicrotubuli abhiingt, vorausgesetzt, die Microtubuli-Einzelliingen sind wesentlich groBer als die Wellenliinge desverwendeten Lichtes. Gemessen wurde die Triibung am Spektrophotometer Specord UV VIS (VEB Carl ZeisslENA) in I em Glaskiivetten bei A= 350 nm.

Die Temperierung erfolgte mit dem Thermostat TB 150 (MLW) auf 37°C in einem erwiirmbaren Kiivettenhalter.

Elektronenmikroskopische Priiparationsveifahren

2.4.1. Negativkontrastierung von Assemblierungsprodukten: 10 bis 50 III Probenlosung wurden auf eine saubereTeflonunterlage pipettiert, Ibis 2 Grids mit 400 Maschen, iiberzogen mit Kohlefilm oder KohlelFormvar-Doppelfilm,fUr 20 bis 30 s angelegt. Die Negativkontrastierung erfolgte nach Absaugen der Fliissigkeit mit Filterpapier durchAuflegen der Grids auf 50 1l1-Tropfen einer 2%igen, wiiBrigen, frisch angesetzten Uranylacetatlosung fUr 20 bis 30 smit nachfolgender Lufttrocknung, die elektronenoptische Auswertung am Phillips EM 400 bei 10000- bis30000facher PrimiirvergroBerung.

2.4.2. Schnittpriiparation von Assemblierungsprodukten: In Ergiinzung zum Negativkontrastverfahren lieBensich mit der Schnittpriiparation Aussagen iiber die Art der Profile von Assemblierungsprodukten und iiber ihreProtofilamentanzahl gewinnen. Die Assemblierungsprodukte wurden zentrifugiert, die Sedimente mit 4 mlFixierungsmedium (20 mmolll) Phosphatpuffer, 1% Tannin, 2% Glutaraldehyd, pH = 7,0) iiberschichtet, diefixierten Materialien nach Acetonentwiisserung in Mikropal eingebettet und nach Polymerisation mit einem Ultrotom11/ (LKB) geschnitten. Die Nachkontrastierung der Schnitte auf triigerfilmlosen Grids geschah mit Bleicitrat nachREYNOLDS (1963).

3. Ergebnisse

3.1. Triibungsmessungen zum Einfluj3 von Alloxan und Alloxansiiure auf die Assemblierungvon MTP: Alloxan inhibierte (s. auch Abb. 1 und Legende) unter den angegebenen Bedingungen aneiner Konzentration von 2 x 10-5 moUI bei einem AlloxanITubulinverhaltnis > I: I die Bildung vonMicrotubuli und erhohte den Anteil an kaltestabilen Microtubuli. Alloxansaure hingegen hemmteunter den gleichen Bedingungen weder die Microtubulus-Assemblierung noch deren Desassem­blierung bei 4°C (s. Tabelle I).

8*

96 R. SCHMIDT u. a.

0.3r-----------'---------~

40 Zeitlminl 50

Abb. 1. Triibungsmessungen bei A. = 350 urn zum Einflu8 von Alloxan auf die Assemblierung und Desassem­blierung von Microtubuli. Die Microtubuli wurden aus microtubuHirem Protein (MTP, isoliert aus Schweinehirn,2,1 mglml) in Gegenwart von 0 molll(1), 2x 10-5 moVI(2), 2x 10-4 molll(3)und I x 10-3 moVI (4) Alloxanbei28°C assembliert und dann bei 4°C desassembliert. Alloxan wurde in einem Volumen von 5 III einer entsprechen­den Stammlosung in verdiinnter HCI, pH = 2,5, den MTP-Uisungen bei 4°C, I min vor Beginn der 28°C­Inkubation zugesetzt. Assemblierungspuffer: 100 mmolll MES, 0,25 mmoVI MgCI2, I mmoVI GTP, pH = 6,5.

Tabelle I. Einflu8 von Alloxan und Alloxansaure auf die Assemblierung und Desassemblierung von Microtubuli(MT) in vitro. Ergebnisse aus Triibungsmessungen und elektronenmikroskopischen Untersuchungen.

Wirkstoff MT-Bildung l ) MT-Abbau2)

bei 28°C bei 4°C[moVl] [%] [%]

Kontrolle0 100 97

Alloxan2 x 10-5 95 912x 10-4 45 811 x 10-3 31 5

Alloxansaure2x 10-5 98 952x 10-4 104 93I x 10-3 94 92

Wirkstoff')

o

I1050

11050

I) Bezogen auf das Ausma8 der Triibung bei A. = 350 urn in der Kontrolle nach 30 min Inkubation bei 28°C (A 28 0C).2) [(A 28°C)-(A 4°C)] x loo/(A 28°C) x (A 4°C) = Triibung beH= 350 urn nach 20 min Inkubation bei 4°C.3) Bezogen auf den Tubulingehalt der Proben (2 x lOS molll).

3.2. Trubungsmessungen unil elektronenmikroskopischeUntersuchungen zum Einjluj3 vonAlloxan, Alloxansiiure unil Ethylenglycol-bis~(f3-aminoethylether)-N,N' -tetraessigsiiure auf dieBildung von zrl+-induzierten Sheets aus MTP: 1m Verhiiltnis WiItstoff:Zn2+ = 1: 1 beeinflussenweder EGTA noch' Alloxansaure oder Alloxan die Bildung zinkinduzierter Sheets. Bei einemMolverhiiltnis von Wirkstoff:Zn2+ = 2:1 unterbleibt bei EGTA die Bildung von Sheets durchZn2+ -Entzug, und es werden wieder Microtubuli in Abwesenheit von Zn2+ assembliert.

Wiricungsmechanismus des Alloxans auf B-Inselzellen 97

Tabelle 2. EinfluB von Alloxan, Alloxansiiure und EGTAI) auf die Bildung Zn2+-induzierter Sheets aus mi­crotubuliirem Protein: Qualitative Befunde aus Triibungsmessungen und elektronenmikroskopischen Unter­suchungen.

Wirkstoff

Alloxan

Alloxansiiure

EGTA

Wirkstoff Assemblat

Zn2+bei 28°C

(moVmol)Sheets MP)

I +2

I +2 +I +2 +

I) EGTA Ethylenglycol-bis(~-aminoethyl-ether)-N,N'-tetraessigsiiure.2) Assemblierungspuffer: lOOmmoVI N-Morpholinethansulfonsiiure, O,20mmoVI ZnCI2 , O,25mmoVI MgCI2 ,

I mmoVI GTP, pH=6,5.3) MT Microtubuli.

Alloxan fiihrt in diesem Molverhiiltnis nicht zur Bildung von MTP-Assemblaten, wohingegenAlloxansiiure die Bildung von Zn2+-Sheets gleichermal3en ermoglicht (s. Tabelle 2, Abb. 2a bis c).

4. Diskussion der Befunde

Elememtanalysen der Zellstrukturen von B-Zellen Langerhansscher Inseln lassen an den die Zellsekretionbeeinflussenden Organellen 2 Kationen gehiiuft vorkommen, zum einen Ca2+, die sich in Mitochondrien, Golgi­Membranen, Zellmembranen und Granula lokalisieren und zum anderen Zn2+ in den B-Sekretgranula undumhiillenden Membranen. Nach der von LACY (1968) geiiuBerten Vermutung, Microtubuli und ein mikrofilamentiiresZellnetz seien fUr die Bewegung der Sekretgranula und Sekretionsvorgiinge ganz allgeimein verantwortlich,postulierte man, daB lokale Ca2+-Konzentrationsiinderungen und Calmodulin die Tubulin-Assemblierung undDesassemblierung im Sinne einer physiologischen Kontrolle der Microtubulus-Assemblierung beeinflussen konnen,lieB aber eine mogliche Bedeutung der ebenfalls reichlich vorkommenden Zn2+ fUr Assemblierungsvorgiinge langeZeit auBer acht. Nach geliiufigen Vorstellungen kann Calmodulin an Microtubulus-Proteine binden, wenn Ca2+anwesend sind. Konzentrationen von 10 mrnol/l Ca2+ und mehr hemmen die Bildung von Microtubuli bzw. bauenvorhandene Microtubuli abo

Ca2+ binden an Tubulin unter Vermittlung von Calmodulin, und endogene Ca2+-Variationen konnen einephysiolgische Kontrolle der Microtubulus-Assemblierung ausiiben. DaB der Ca2+-regulierende Mechanismus dereinzige - zumindest in B-Zellen von Langerhansschen Inseln - fUr Sekretionsvorgiinge ist, erscheint nach eigenenVorstellungen und neueren Untersuchungen anderer Autoren (FuJII et aI. 1986; HESKETH und BAUDIER 1986;DONATO 1985) fraglich. Von zunehmendem Interesse sind daher Untersuchungen, die der Frage nachgehen, ob nichtauch Zn2+ eine wichtige Rolle im Regulationsgeschehen der Microtubulus-Assemblierung zu anderen Regulations­mechanismen spielen konnen (s. DUSTIN 1984). Nach In vitro-Untersuchungen verliiuft der Assemblierungsvorgangvon Microtubuli unter bestimrnten Bedingungen auch polymorph ab, d. h. neben der Bildung von Microtubuli konnenvielgestaltige Formen von Tubulinvereinigungen, wie einfache oder doppelte Ringe oder gekriimrnte und flacheBiinder, sogenannte Sheets, in Erscheinung treten. Ein Typ soleh "anormaler" Assemblierung wurde erstmalig vonLARSON et aI. (1976) in Gegenwart von Zinksalzen beschrieben. Gegen Kiilte, Colehicin und Ca2+ resistenteSheetassemblate entstehen nach Zusatz von mehr als 5 x 10-5 moVI Zn2+ zu einem normalen Assemblierungspufferaus Himtubulinen (GASKIN und KRESS 1977; TSUPRUN und SURGUCHEVA 1979 U. a.). In den Zn2+-Sheets sind dieProtofilamente im Gegensatz zu den Microtubuli alternierend antiparallel angeordnet, woraus die flache undungekriimmte Struktur der Zink-Sheets im Vergleich zu Microtubuli begriindet ist. Zn2+ konnen demnach anMicrotubulus-Proteine binden und Assemblierung hervorrufen, wobei die Zugabe von Zn2+ zu MTP zu einemAnsteigen der Triibung fiihrt und Sheets in Abhiingigkeit von der freien Ziokkonzentration bildet.

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In unseren Versuchen wurde bei der Verabfolgung von Metallkomplexbildnern, wie Alloxan und EGTA, imMolverhiiltnis zu Zinkionen = I: I die freie Zn2+-Konzentration im Assemblierungsmedium zwar reduziert, aber dieVerminderung langle noch nicht aus, urn die Assemblierung von Zink-Sheets zu verhindern. Erst eine Steigerung dermolaren Konzentrationsverhiiltnisse yom Komplexbildner zu Tubulin auf 2: 1 entzog beim EGTA frei verfiigbareZn2+ soweit, daJ.I Zink-Sheets verschwanden und an ihrer Stelle normal strukturierte Microtubuli entstanden. BeimAlloxan fiihrte die Verdopplung des Alloxanverhiiltnisses zum Tubulin zwar auch zu einem Verschwinden der Zn2+_Sheets durch Abbinden freier Zn2+ in Form von Alloxan-Zink-Chelat, das aber im Gegensatz zum EGTA eineAssemblierung normaler Microtubuli verhinderte. Dieses Verhalten spricht damr, daJ.I Alloxan nieht nur in dergenannten Konzentration zum Tubulin die Zn2+ aus dem Assemblierungsmedium entzieht und damit die Bildung vonSheetassemblaten ausbleibt, sondern vermutlich auch als Alloxan-Zink-Chelat die Microtubulus-Bildung storenkann, wie die In vitro-Wirkungen des Alloxan-Zink-Chelates auf den Blutzucker vermuten lassen (SCHMIDT et al.1990).

Fiir eine Destruktion von Microtubuli bzw. Hemmung der Assemblierung, iihnlich dem Colehicineffekt,sprechen auch unsere Assemblierungsversuche mit Alloxan ohne Zn2+-Anwesenheit im Assemblierungsgemisch.Nach unseren Ergebnissen zerstort Alloxan in vivo primae die Zn2+-akkumulierenden Sekretgranula der B-Zellen. Zuerwarten ware damit eine ErhOhung von Zn2+ im Cytosol. In Abhangigkeit des Alloxan-Zink-Verhiiltnisses sollte einAbbau vorhandener Microtubuli beobachtet werden konnen, sowohl durch Wirkung freien Alloxans als auch vonAlloxan-Zink-Chelaten. Falls Zn2+ iiberschiissig bleiben, ware auch die Bildung von Zn2+-Sheets moglich. Es istallerdings daraufhinzuweisen, daJ.I blattformige Strukturen, denen man eine Zn2+-Sheetnatur zuweisen konnte, bisherin vivo nicht nachgewiesen werden konnten. B-Zellen, die durch vesiceldestruierende Noxen nicht beeintriichtigtwurden, sollten ebefalls - allerdings geringe - cytosolische Zn2+-Konzentrationen enthalten. Nach dem BeispielCa2+/Calmodulin ist zu erwarten, daJ.I durch geeignete Proteine die Zn2+ regulatorisch aktiviert werden. 1m S-IOOProtein (DoNATO 1985; Fum et al. 1986; HESKETH und BAUDlER 1986) scheint ein solehes Protein gefunden zu sein,daJ.I auBerdem die Fiihigkeit besitzt, an Microtubuli zu binden. Damit wird vorstellbar, daJ.I Zn2+ in kooperativerWirkung mit bestimmten Proteinen regulatorische Wirkungen auf microtubulare Funktionen ausiiben konnen,beispielsweise auf die Inkretion in B-Zellen Langerhansscher Inseln.

Zusammenfassung

Microanalysen von Zellstrukturen Langerhansscher Inseln lassen 2 Kationen, Calcium (J3-Granula undurnhiillende Membranen, Golgi-Vesicel, Mitochondrien, Zellmembranen) und Zink (Sekretgranula und ihreMembranen) an solehen Zellorganellen bevorzugt in Erscheinung treten, die direkt mit der Sekretion in Beziehungstehen. Beide Elemente sind fiir Interactionen mit Microtubuli bekannt und beeinflussen deren strukturelle undfunktionelle Eigenschaften, vor allem die Bewegung von Sekretgranula. Mit vorliegender Untersuchung wurden dieWirkungen von Zn2+ auf Microtubuli in bezug auf Interactionen in vitro mit und ohne diabetogene Substanzengetestet.

Triibungsmessungen und elektronenmikroskopische Untersuchungen in vitro zeigen, daJ.I Alloxan unter denangegebenen Bedingungen ab einer Konzentration von 2 x 10-5 molll bei einem AlloxanITubulin-Verhiiltnis > I: Idie Bildung von Microtubuli inhibiert und den Anteil an bei 4 °C stabilen Mierotubuli erhoht. Die Zn2+-induzierteBildung von MTP-Sheets wird von Alloxan und dem Metallkomplexbildner EGTA nicht beeinflu8t, wenn dieMolkonzentrationen dieser Substanz und die der zu Zn2+ gleich groB sind. Bei einem Molverhiiltnis von 2: I(EGTA:Zn2+) werden Sheets nicht langer gebildet, und es entstehen ausschlie81ich Microtubuli, wiihrend Alloxanweder Sheets noch Microtubuli bei diesem Molverhiiltnis assembliert. Alloxansiiure jedoch inhibiert unter dengleichen Bedingungen weder die Microtubulus-Assemblierung noch die Bildung Zn2+-induzierter Sheets. DieErgebnisse zeigen, daJ.I das diabetogene Alloxan die Microtubulus-Assemblierung beeinflussen und vorgebildeteMicrotubuli zerstoren kann. Dieser Alloxanbefund entspricht der antimitotischen Aktivitiit dieser Substanz analog derdes Colehicins (s. SCHMIDT et al. 1990). Die Frage entsteht, ob Alloxan die primare hyperglykaemische Phase durchDesintegration oder funktionelle Inaktivierung der Microtubuli hervorruft, im Gegensatz zur durch alloxanbedingteSekretgranula-Destruction erzeugten permanenten Hyperglykaemie.

Abb.2. Zn2+-induzierte Sheets aus microtubularem Protein'des Schweinehirns, 150000: I. a Darstellung vonProtofilamenten (PF) und globularen Tubulinmolekiilen. Totalpraparat, Negativkontrastierung mit I % Uranylacetat.b Darstellung von microtubulus-assoziierten Proteinen (MAPs) und Protofilamenten (PF). Ultradiinnschnitt,nachfolgend fixiert in Glutaraldehyd-Tannin, 0804 , Uranylacetat, Einbettung in Vestopal, Nachkontrastierung mitBleicitrat. c Darstellung von quergeschnittenen Protofilamenten (PF, Pfeil). Prliparation wie b.

Wirkungsmechanismus des Alloxans auf B-Inselzellen 99

100 R. SCHMIDT u. a.

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Anschrift p. a.: Prof. Dr. sc. med. Dr. rer. nat. RAINER SCHMIDT, Institut fur Anatomie der Martin-Luther­Universitiit, PSF 302, Halle (Saale), DDR-401O