15~ J. SC~IOI~MULLEI~ End W. ANDRi~SS :

J~thylwnillingehalt yon 95,5% des Sollwertes auf 89,3% nach 16 Tagen und auf 84,2 % nach 33 T~gen verminderte. Damit ist bereits w&hrscheinlich gemacht, dul~ J~thylv~nillin eine etwas hShere Best~ndigkeit ~ls Vanillin besitzt; die mathematische Behandlung der Ergebnisse, die in den Tabellen wiedergegeben ist, erweist die grSl~ere Best£ndigkeit des ~thylv~nillins einwandfrei.

Analytilc. Die Bestimmung erfolgte durch Titration yon je 5 g Vanillin- bzw. Jithylvanillin- zucker, in 20 ml 96%igem Alkohol suspendiert, mit 0,1 n-NaOH gegen Phenolphth~lein, wobei 1 ml 0,1 n-L~uge 15,21 mg V~nillin bzw. 16,62 mg Athylwnillin entspricht. Der Blindwert des Alkohols betrug 0,15 m] Lauge ffir 20 ml Alkohol und wurde bei der Berechnung berficksiehtigt. Es sind in den T~bellen jeweils die Mittelwerte aus zwei Bestimmungen angegeben.

Pri~/ung au/ Reinheit der verwendeten Sto//e Zur Priifung auf l~einheit wurde die P~pierchromatogr~phie herangezogen. Es

wurde n~ch BE~G~V.~ und SPWRLICH ~ aufsteigend rnit Petrol~ther als FlieBmittel auf vorher mit Wasserdampf ges£ttigtem Wh~tman-Papier ehromatogr~phiert. Die Laufzcit betrug 1 bis l~/e Std; die Entwicklung erfolgte mit Hydrazinsulf~treagens, wobei sich lebhaft gelbe Fleeken ausbildeten. Vor der Entwieklung wurden die Bogen ira UV-Lieht betrachtet, wobei sich die Flecken ~n derselben Ausdehnung dureh ihre Fluoreseenz zu erkennen g~ben.

Es wurde bei samtlichen Proben nur ein Fleck beobachtet, woraus sieh ergibt, daI~ die Substanzen als rein zu betrachten sind.

Zusammen/assung D~s Verh~ltnis der Gesehmacksintensit~ten yon Vanillin und ~thylvanillin ver-

schiedener I-Ierkunft wurde bestimmt. Auf Grund der Schwellenwerte wurde das Verh~ltnis bei Verreibungen mit Milchzucker zu 1:2,05 und 1:2,5, bei Ver- dfinnungen mit Milch zu 1 : 4,17 ermittelt, w~hrend auf Grund yon Verg]eichen einer 0,1%igen Verreibung yon Vanillin mit Milchzucker mit ~thylvanillin-Verreibungen gleicher Gesehmacksintensit~t die Verh~ltnisz~hlen (1 : 3,31), 1 : 4,17 und 1 : 4,44 gefunden wurden.

In Lagerungsversuchen, die unter verschiedenen Bedingungen durchgeffihrt wurden, konnte eine bessere Best/~ndigkeit des ~thylv~nillins beobachtet werden.

Verhalten von Penicillium candidum gegentiber TriphenyltetrazoUumchlorid und Beeinflussung der Tetra-

zoliumreduktion dutch quatern~ire Ammoniumverbindungen Von

J. SCHORM()LLER und W. ANDR.~SS

Mitteilung aus dem Institut /i~r Lebensmittelchemie und Lebensmitteltechnologie der Technischen UniversitSt Berlin* **

Mit 5 Text~bbildungen

(Eingegangen am 15. Jul i 1958)

Hygienische Probleme der Milchwirtsehaft bedingen erheblichen Arbeits- und M~terialaufwand, um den Anforderungen zu entsprechen, wie sie bei der Gewinnung,

1 B~G-~E~, K., u. It. SPE~LICn: D~sch. Lebensmiftel-Rdsch. 47, 134 (1951). * Bei Durchfiihrung der Untersuchungen wurden wir durch eine Forschungsbeihilfe Bus

ERP-Mitteln unterst~itzt. Hierfiir danken wir auch ~n dieser Stelle verbindlich. ** Herrn Prof. Dr. W. LVDO~FF zum 60. Geburtst~g gewidmet.

Verhalten yon Penicillium candidum gegeniiber Triphenyltetrazoliumchlorid 155

Verarbe i tung und be im Ver t r ieb yon Milch und Mileherzeugnissen dureh Hers te l ler , Verbraueher End n ieh t zule tz t du t ch den Gesetzgeber geste l l t werden. F ragen der Rein igung und Des infek t ion s tehen hier im Mi t t e lpunk t , ohne dab es b isher gelang, beide Arbeitsg&nge in einer ProzedEr befr iedigend zu vereinigen. Hoffnungen, die m a n auf G r u n d ihrer he rvor ragenden Eigenschaf ten in die qua te rn£ren A m m o n i u m - ve rb indungen (QAV) setzte, haben sich leider n ich t in dem gewfinsehten AusmaI~ erfiillt . T ro t zdem f inder gerade diese Verbindungsklasse , wenn aueh n ieh t zur l~e~ni- gung, SO doch zur Des infekt ion immer mehr E ingang in mi lchvera rbe i t ende Betr iebe. Die s ta rke bac ter ic ide W i r k u n g dera r t iger Subs t~nzen auf wer tminde rnde oder gesundhei tsseh£dl iche Mikroorganismen b r ing t jedoch eine Gef~hr m i t sich. D a umfangre iehe Gebiete der Mi lehverwer tung sieh wesent l ieh auf mikrobiologische Prozesse gri inden, bei denen erwfinsehte Mikrof loren in ihrer En twiek lung und in ihren Lebensbed ingungen op t ima l gefSrder t werden sollen~ is t die Fr~ge von wesent- l icher Bedeutung , ob und in welehem Ausma~ derar t ige Mikroorganismen dureh Des infekt ionsmi t te l , hier also dureh QAV gesehi~cligt werden kSnnen. A]s Be i t rag zum l e t z tgenann ten P rob l em haben wir in der vor l iegenden Arbe i t un te rsueh t , in welehen K o n z e n t r a t i o n e n End un te r welehen Bedingungen QAV einen sch/~digenden EinflEB auf den bei der Camember t -Re i fung wicht igen P i l z s t a m m Penicillium candidum ausi iben kSnnen.

E n g ve rkn i ip f t m i t Bes t rebungen der Des infek t ion bei Milch und Mi lchproduk ten is t die Suche nach neuen einfachen Methoden zur sehnellen Gi i tekont ro l le in H ins i eh t auf mikrobie l le Verunreinigungen. Hierf i i r haben zahlreiche Au to ren die enzym~tisch bedingte R e d u k t i o n yon Tet razo l iumsalzen zu F o r m a z a n e n vorgeschlagen i. Wi r zogen deshalb aueh in unseren Un te r suehungen die genann te l~eakt ion als Test- me thode ffir die D e h y d r a s e n a k t i v i t £ t yon Penicillium candidum heran mi t dem Ziel, dam~t g]eiehzeitig die ana ly t i sche Verwer tba rke i t der Te t r azo l iumreak t ion wel ter zu fSrdern.

Als Indikator der Enzymaktiviffit benutzten wir dus f~rblose, w~sserlSsliche Triphenyltetra- zoliumchlorid (TTC), das bei enzymatischer Reduktion in das tiefrot gef~rbte, wasserunlSsliche, durch organisohe Solventien extrahierbare ]%rm~zan tibergeht. Uber Einzelheiten zur Analytik und zur Erfassung bestimmter Fermenttypen haben wir in einer friiheren Arbeit 2 berichtet. Das Verfahren hat neben der oben erw~ihn~en Anwendung bei der bakteriologischen Milchkontrolle weitgehend Eingang in andere Arbeitsrichtungen gefunden, so beim ~opographischen Nachweis der Keimfi~higkeit yon Getreidefriichten, zur Fixierung bestimmter Enzymzentren in der Histo- chemie, bei Vit~lfi~rbungen oder zur Tumor-Friihdiagnose.

Was den Angriffspunkt des TTC in der Kette der Dehydrasen anlangt, so diirfte, wie an anderer Stelle ~ eingehend erSrtert wurde, TTC vor allem in der Lage sein, einen Teil des Fermentwasser- stoffes yon Diaphorasen (Flavoproteiden) ~ufzunehmen. Es verh~tlt sich damit grunds~itzlich so wie das in der Thunberg-Technik als Wasserstoffaoceptor benu~zte ~ethylenblau. Vergleichende Untersuchungen an Penicillium candidum zur Klirung dieser Frage unter Einbeziehung der Warburg-Methode werden demni~chst mitgeteilt.

I. Verhal ten yon Penici l l ium candidum gegeniiber TTC

1. Methode

Die Methode, wie sie yon uns benutzt wurde, geht auf einen Vorschlag yon FAHMY 3 zuriick. Einzelheiten fiber das yon uns nach eingehenden Vorversuchen entwickelte Standardverfahren werden auf S. 157 gebracht.

1 LAXm~AXA¥iNA, H., u. K. K. L ¥ i : Indian J. Dairy Sci. 7, 83 (1954). - - GAI~GA~I, G., U. G. I~ISSI-MAI~RACOINI : Nuovi ann. igiene e microbiol. 6, 278 (1955). - - HEYL, W., H.-J. HOLT~OrF U. W. SC~6~BOR~: Milchwiss. 12, 213 (1957).

SC~OXMi2LLEg, J., u. H. G~RTE: Diese Z. 106, 13 (1957). 3 FA~MY, A. R., u. E. O. WiLS~: Biochemic. J. 51, 55 (1952).

156 J. SC~O~t tL~R und W. A~DRXSS:

Zur Aufstellung der Eiehkurve diente ein Formazanprgparat des Handels (Schuehardt, Miinehen), das zweimal aus Xthanol umkristallisiert wurde. Im Me]3bereieh yon 10--40 • 10 -8 rag pro ml verlguft die Extinktion linear (Filter S 49, Elko-Zeiss, Cuvette 1 cm. Formazan-Stamm- 15sung in To]uo]. Messung wie spgter beschrieben in Eisessig-Toluo]). Aus den Me•werten der Eichkurve errechnet sieh der molare Extinktionskoeffizient zu:

s = 1 5 , 2 . 1 0 s , die molare Konzentration bei der Extinktion J~ ~ 1 zu:

CM = 6,55 - l0 -s (too]/1).

Der aus diesem Wert resultierende Extinktionsfaktor F gestattet eine sofortige Umreehnung der gemessenen Extinktionen in die entspreehende Formazanmenge, angegeben in #g Formazan pro Ansatz. Verwendet man, wie im Standardverfahren (S. 157) besehrieben, 6 ml Toluol zur Formazanextraktion, so hat F den Wert

F = 118,1 #g Formazan/Ansatz. 2. Testorganismus Der Testorganismus Penieillium candidum 1 spielt zusammen mit Penieillium eamemberti bei der

Camembertreifung eine bedeutsame Rolle. Seine Bezeiehnung wurde aus einer Vie]zahl yon Synonymen nach Vorseh]ggen yon ROGER 2 nnd WEIGMA~ s ausgewghlt. Nach L~OSIDSE 4 hgndelt es sich bei den beiden Pilzarten um zwei Rassen, die weder morphologisch noeh physiologisch prinzipielle Unterschiede aufweisen.

Der auf Sehrggagarkulturen iiberimpfte Pilz (Bierwiirzeagar , ,Bram", Berlin) wurde mit Wasser steril in Erlenmeyerkolben abgesehwemmt, die je 80 ml Molkenghrboden enthielten und 3 ~ 4 Tage auf einer im Thermostaten (27 ° C) gehaltenen Schiittelmaschine bei etwa 120 Touren pro rain geztichtet waren. Anschliel3end wurde das Pitzmycel sterfi abgesaugt, mit wenig Wasser gespiilt, in Phosphatpuffer (ps 7,6) suspendiert nnd homogenisiert. Derart hergestellte Suspen- sionen dienten fiir die folgenden Versuehe. Die Gewinnung des Mo]ken~hrbodens haben wir an anderer Stel]e 5 beschrieben.

3. Ein]luf l verschiedener Palctoren a) Um eine gut pipettierbare und homogene Pilzsuspension zu erhalten, erwies es sich ais

notwendig, das Myeel in der Puffer]Ssung mit Hilfe eines Homogenisators (wir verwendeten den , ,Ultraturrax" der Firma Janke & Kunkel, Stanfen) fein zu verteilen. Dabei ist zu bedenken, dat~ der Zerkleinerungsgrad, bedingt durch die Homogenisierungsdauer, wesentliehen Einflul3 auf die TTC-Reduktion ausiibt. Einmal kann durch OberflgehenvergrSl3erung eine ErhShung der Re- duktionsbereitsehaft und darait der Formaz~nbildung eintreten, zum ~nderen ist aber auch mit einer Schgdigung der Zellgewebe und dadurch mit einem Riiekg~ng der Aktivitgt zu reehnen. Um diese Frage zu klgren, h~ben wir versehiedene 4 und 7 T~ge alte Pilzkulturen bei steigender Homogenisierungsduuer (bis zu 10 rain) auf ihre TTC-Reduktion gepriift nnd gefunden, d~l~ eine 2 rain iiberschreitende Beh~ndlnng zu Aktivitgtshemmung fiihren kann. D~bei kSnnen die An- s~tze je n~eh den in allen Einzelheiten nicht streng lenkbaren Waehstumsverhgltnissen ~uf die ttomogenisierung versehieden reagieren; besonders empfindlich sind Kulturen, die an sich geringe TTC-Aktivit~t aufweisen.

b) Die Pipettiergenauiglceit homogenisierter Suspensionen ist befriedigend. Troekensubst~nz- bestimmungen an 20 pipettierten Proben (je 20 ml) erg~ben einen mittleren Fehler yon -t- 3%.

e) Um die yon verschiedenen Autoren, u. u. yon ZIEGLEI~ 6 besehriebene Gi]twirlsung der Tetra- zoliumsalze auszuseh~lten, h~ben wir den Einflul3 der TTC-Konzentration studiert und fiir Xul- tnren verschiedenen Alters das F~rbmaximum, also die optimale Dehydrasen~ktivitgt bei 2 ml einer l°/oigen TTC-LSsung gefunden. Wir ~rbeiten in den folgenden Versuchen mit 1 ml der l°/oigen TTC-LSsung pro Ans~tz, bei einem mittleren Fehler yon 2%.

d) Pilz/conzentration und Form~zanbildung verlaufen innerhalb eines weiten Suspensions- bereiehes (bis 17,5 mg Trockenpilzsubstanz pro Ans~tz) linear. Wenngleich die Pilzkonzentr~tion zur quantitativen Extrakt ion des gebildeten Form~zans nicht allzu hoch gewghlt werden soil,

Fiir die t)berlassung yon Pilzkulturen danken wir t terrn Prof. Dr. LI~MBKE, Kiel, verbindlieh. t~O~Sa, A. : Fabrication des fromages de Brie et Communication faite ~ la Societ@ de 1' Agrie.

de Me~ux 1898. W~s~A~¢¢, I-I. : Pilzkunde der Milch. 2. vo]lst, neubearb. Aufl. der Mykologia der Milch.S. 379

Berlin: P. Parey (1924). LEOXIDSE, n. : Zbl. ]3akter. II , 8 ~,, 211 (1930). Scgo~i~nnv.~, J. , u. H. I-Iv~J~: Diese Z. 107, 153 (1958). Z~E~LE~, H. : Z. N~turforsch. 8b, 662 (1953). '

Verhalten yon Penieillium eandidum gegeniiber Triphenyltetrazoliumehlorid 157

so sind doch mgBige Konzentrationsschwankungen wegen der erwghnten Proportionalitgt ohne EinfluB auf die Versuehsergebnisse.

e) Auch die Bebri~tungsdauer gehoreht einer linearen Funktion, die selbst naeh 12 Std Be- briitung noch Giiltigkeit hat. In friiheren Untersuehungen 1 hatten wir bei reifendem S~uermilch- kgse beobachtet, dab dort nach 4 Std die Formazanbildung praktisch den Endwert erreieht hatte. Diese beim komplexen System des Kgses festgestellte Erscheinung gilt offenbar fiir Penicillium candidum nieht. Damit is t bier bei Kulturen geringer Aktivitgt die 5~6glichkeit gegeben, dutch Verlgngerung der Bebriitungsd~uer die Formazanbildung bis zu meBteehnisch gut erfaBbaren Mengen zu steigern.

f) Um den Ein/lufi des Pilzalters auf die TTC-Reduktion kennenzulernen, haben wir RfihrkuRuren naeh friiher gemachten An- ga.ben 2 geziiehtet and ~us ihnen zu ver- schiedenen Zeiten sterile Proben entnom- men. Abb. 1 zeigt die Ergebnisse.

Daraus geht hervor, dab die Pilzaktivi- tg~ bis zum 4. Tag ansteigt, und dann, vor allem am 7. Tag, betrgchtlieh abfgllt. An dieser Erscheinung diirfte die Verarmung der Nghrl5sung einen erhebliehen Anteil haben. Dies bleibt jedoeh auf die Ver- suchsfiihrung ohne EinfluB, wenn die Mol- kenmenge geniigend grog ist und nnr Pilz- kulturen im Versueh eingesetzt werden, die nicht glter als 3 ~ Tage sind.

Zusammen/aasend lgBt sich sagen, dab die TTC-Methode ffir Untersu- chungen an Penicillium candidum aus- gezeichnet geeignet ist. Der re la t ive Feh le r be t rgg t m a x i m a l 3 %, bei den b e n u t z t e n TTO-Konzent ra~ionen t r i t t keine S ch~tdigung der P i l z a k t i v i t g t ein. Wesent ] ich und en t sche idend i s t eine m6gl ichs t in tens ive Homogen is ie rung der Suspensionen, ohne dabe i den Or- ganismus zu schgdigen. Mit Hilfe der yon uns benu t z t en A p p a r a t u r s ind 2 rain ausre ichend und opt imal . Die F o r m a z a n b i l d u n g is t sowohl der Pilz- konzen t r a t i on wie der Bebrf i tungs- dauer in r e l a t i v wei tem t~ahmen pro-

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ffehrUtung, dguer A b b . 1. Formazanbildung in Jbhgngigkeit yon der Bebr~tungs- dauer an au/einander]olgenden Wachstumstagen einer Kultur

2 - - , 3 - - - - , 4 - - - , 5 . . . . . , 6 . . . . . . . u n d 7 . . . . . . . . T a g e

por t ional , wodurch eine elast ische Versuchsff ihrung gewghr le is te t wird. Znr Erz ie lung m a x i m a l e r P i l z a k t i v i t g t werden zweckmgBig 3 - - 4 Tage a r e K u l t u r e n un te rsuch t . Ausdrf ickl ich is t d a r a u f hinzuweisen, dab t ro tz E i n h a l t u n g aller Versuchsbedingungen wegen der fiir jede K u l t u r verschiedenen Akt ivRgtsverhg l tn i s se abso lu t vergleich- bare MeBwerte nur innerha lb eines Ansa tzes gewonnen werden k6nnen.

Standardver/ahren Auf Grund der erarbeiteten Befunde wurde folgendes Verfahren fiir die Messung der TTC-

Reduktion entwiekelt: 1. Als ReaktionsgefgBe dienen mit Glass~opfen versehlieBbare Reagenzglgser (25--28 m]

Inhalt).

1 SC]tO]~iiLLEn, J., u. H. GnnT~: Zit. S. 155, Anm. 2. 2 Zit. S. 156, Anm. 5.

158 J. SCItOtCMI~LLER und W. ANDRASS:

2. Der Ansatz enthalt 3 ml Pilzsuspension (mit etwa 5--12 mg Trockensubstanz pro Ansatz) in m/30-Phosphatpuffer PH 7,6, auJ3erdem 1 ml einer l°/oigen TTC-LSsung; er wird mit Wasser (2 ml) zu 6 ml erg~nzt. Homogenisierung 2 rain, Pilzalter 3 ~ Tage.

3. ]~ebriitung erfolgt 2 Std bei 30 ° C im verdunkelten Thermostaten. Wi~hrend der Bebriitung ist mehrmals umzuschiitteln.

4. Zur Extraktion des gebildeten Formazans versetzt man mit 10 ml Eisessig und 6 ml Toluol, schiittelt sofort sehr krii]tig dureh und pipettiert die Toluol-~ormazansehicht ab. Naeh Filtration durch ein kleines, bedeektes Filter spektrophotometriert man wie oben angegeben. Die Eisessig- menge mu8 im Rahmen der angegebenen Konzentration gehalten werden, da iiberschiissiger Eisessig sich in dem zur Aussch~i.ttelung des Formazans benutzten Toluol 15st und damit die Formazankonzentration falseht. Uber die Berechnung der Ergebnisse vgl. die Angaben auf S. 156.

I I . Beeinflussung der TTC-Reduktion bei Penici l l ium candidum durch QA¥ definierter Zusammense tzung

Die Des in fek t ionswi rkung quaterni~rer A m m o n i u m v e r b i n d u n g c n 1 is t in verschie- denen Eigenschaf ten dieser Verbindungsklasse begrf indet . Zun~chs t kSnnen weit- gehend unspezif ische Umse tzungen P la t z greifen, wie Komplexbf ldung , Dena tu - r ierung, l~eakt ion m i t den Anionen der Zel lprote ine bzw. m i t B a k t e r i e n s y m p l e x e n oder A b b a u des Fe rmen tp ro te ins . D~rfiber h inaus vermSgen QAV auch speziel le Enzymsys t eme , wie eine l~eihe yon Dehydrogenasen ~ zu hemmen. Hic rbe i spiel t die ausgesprochene Ober f l£chenak t iv i t~ t solcher Verb indungen offenbar eine ent- scheidende Rolle. I n n iederen K o n z e n t r a t i o n e n k a n n jedoch, bed ing t du t ch eben diese Oberfl i~chenaktivierung, eine S t imul ie rung der Pi lzaktivi t i~t und d a m i t der F o r m a z a n b f l d u n g erfolgen. Hier i iber wird gleichfalls im folgenden ber ichte t .

W ~ h r e n d die klass ischen Ver t r e t e r der QAV yore , ,Zephi ro l" -Typus , also Alkyl - d i m e t h y l b e n z y l a m m o n i u m c h l o r i d e un te rha lb p~ 6 eine s t a rke W i r k u n g s m i n d e r u n g erfahren, b le ib t bei vielen Alky l -py r id in iumch lo r iden die W i r k s a m k e i t bis zu p~ 3 c rha l t en ; de ra r t ige Subs tanzen haben vor a l lem E ingang in die Mi lchwir t schaf t gefunden.

1. Zur quantitativen Er/assung der Hemmwirlcung yon QAV auf Penicillium candidum haben wir zun~chst die beiden Grenzkonzentrationen (einsetzende und totale Hemmung) in Vorversuchen ermittelt. DieVersuchsfiihrung entsprach den auf Seite 157/8 gemachten Angaben, wobeiim Hemm- versueh die dort geforderte W&ssermenge (2 ml) durch die entsprechende QAV-LSsung ersetzt wurde.

Zur Untersuchung benutzten wir folgende definierte, in reinem Zustand zug~ngliche Ver- bindungen 3 :

1. Benzyl-trimethylammoninmchlorid, 2. Cetyl-trimethylammoniumchlorid, 3. Cetyl-benzyl-dimethylammoniumchlorid, 4. Cetyl-pyridininmchlorid, 5. Cetyl-trimethylammoniumbromid, 6. Cetyl-pyridiniumbromid und 7. Lauryl-pyridiniumchlorid. Vorversuche zeigten, dal~ 0,1°/oige LSsungen der genannten QAV br&uehbare Standards

lieferten, die nach Bedarf mit Wasser verdfinnt zum Ansatz gelangten. Alle Kurven bzw. MeG- werte wurden aus oben erSrterten Griinden an einer Kultur zur selben Zeit ermitte]t. Die bei der Schichtdicke s gemessenen Extinktionen wurden in ~g Formazan umgerechnet und auf mg

Trockengewicht (K) bezogen. Die Ordinate zeigt also jewefls die Werte -~-(#g/rag) (vg]. S. 156) an.

Die e rw~hnten ober f l~chenakt iven Eigenschaf ten der QAV brach ten es m i t sich, dal~ bei vielen P i l zku l tu ren zuni~chst kein sch~digender Einflul3 zu beobach ten war.

SCHO~iiLLER, J. : Diese Z. 1{)7, 259 (1958). CROCKER, C. H.: J. Milk Food Technol. 14, 138 (1951).

3 Fiir die Uberlassung der angefiihrten Proben danken wir den Firmen L. Light & Co., London (1--~) und Goldschmidt AG, Essen (5--7) verbindlieh.

Verhalten von Perdcillium eandidum gegenfiber Triphenyltetrazoliumehlorid 159

Dureh Permeab i l i t / t t sgnderung der Zel len und d a m i t ve rbundene Dehydrasenf re i - legung t r a t v ie lmehr eine be t rgeht l iche Ste igerung der F o r m a z a n b i l d u n g ein. E r s t dann, weun Oberfl / iehenaktivi t i~t und Enzymseh~d igung im Gleiehgewieht s tehen, er- re ieht die Ak t iv i t~ t sku rve ihr Maximum, u m sehlieBlieh bei T o t a l h e m m u n g die Abszisse zu sehneiden. Die be iden oberen K u r v e n b i l d e r der Abb . 2 veransehaul iehen einen solehen Versueh.

Derartige Aktivit~tsstimulierung haben wir aueh unter dem Einflug yon UV-Strahlen beobach~e~. Aueh dort tr i t t unter der Wirkung geringer Strahlendosen Aktiviti~tssteigerung, oft sogar Aktivit&tsentwickhng ein, die nieht- bestrahlten Kulturen abgeht. Hierfiber werden wir an anderer Stelle berichten. Zusammen- fassende Literatur fiber die stimulierende Wir- kung verschiedener Bacteriostatica oder bac- tericider Stoffe bringt L]~ISTST~R ~.

Daneben wurden aber aueh K u l t u r e n un te r sueh t , bei denen sehon ffir die nie- dersten, b ier gepr t i f ten K o n z e n t r a t i o n e n t I e m m u n g e in t r a t (vgl. die beiden un te ren K u r v e n der Abb. 2).

I m zwei ten Fa] l hande l t es sieh often- ba r um besonders empf indl iehes oder dehyd ra sena rmes Pi lzmyeel . Ff i r diese A n n a h m e spr ieht aul]erdem die Tatsache , dab bei abs te igenden K u r v e n die Tota l - h e m m u n g meis t dureh niedrigere Konzen- ~rat ionen erre ieht wird als bei den zu- n~ehst zum M a x i m u m ans te igenden K u r v e n b i l d e r n ( , ,Normalkurve") (Tab. 1).

Diese Ergebnisse maehen es wahr- seheinlieh, dal3 die waehs tumsbeding te , untersehiedl iehe Empf ind l i chke i t yon P e n i c i l l i u m c a n d i d u m - S t i ~ m m e n gegen- fiber Hemms to f f en den wi rksamen Kon-

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Abb. 2. Die Dehydrasenaktivit~it von 2 Stiimmen Penicil- lium candidum unter dem EinfluB yon Cetyl(D- bzw. Lau- ryl(ID pyridiniumchlorid steigende~ Konzentration. Stamm

a: - - (I) bzw. - . . . . (II); Stamm b: . . . . (l) bzw. . . . . . . . (II)

zent ra t ionsbere ieh der QAV, insbesondere abe r die A b t 6 t u n g s k o n z e n t r a t i o n zu verschieben vermag.

Tabelle 1. Totalhemmung durch QA V-Priiparate /iir beide Hemmungsbilder

Verwendete QAV

Cetyl-benzyl-dimethyl-ammoniumchlorid . . . . . . . . . Ce~yl-trimethyl-ammoniumchlorid . . . . . . . . . . . . Laurylpyridinium chlorid . . . . . . . . . . . . . . . .

TotMhemmung

,,Normalkurve" bei tool/1.10 -~

130 149 220

Sofor$ absteigende Kurve

bei mol]l - 10 -~

85 124 200

Wesen t l i eher jedoeh ffir die oft beobaeh te t en Sehwankungen der no twendigen Inh ib i t o rmengen is t verst/~ndlieherweise die in den Ansgtzen weehseinde Pilz-

1 L~mT~R, L. : l~'leischwirtsch. 9, 13 (1957).

160 J. SCHORMiILLER und W. AI~DI~XSS:

T~belle 2. Totalhemmwerte /i~r Cetyl- trimethyl.ammoniumchlorid bei annShernd gleicher t)ilz]conzentration (6,8--8,2mg/

A nsatz )

P i l z k o n z e n t r a t i o n T o t a l h e m m u n g

A n s a t z m g t o o l / 1 • 1 0 - 6

7,3 7,6 8,1 6,8 7,6 8,2 7,1 6,9

58 48 56 42 42 46 51 51

konzen t ra t ion . W i r haben zu verschiedenen Versuchszei ten m i t ann/~hernd gleichen Pilz- mengen verschiedener K u l t u r e n gewonnene Ergebnisse in Tab. 2 zusammenges te l l t . Dar- aus geh t hervor , dal~ bei geringen Konzen- t r a t ionsun te r sch ieden auch die To ta lhemm- wer t -Sehwankungen sieh in engen Grenzen hal ten, die wachs tumsbed ing te SLreubreite also verh~ltnism~Big gering ist.

Die im Mittelpunkt des Interesses stehende Totalhemmkon,entration k~nn ermittelt werden, in- dem die aus den MeBwerten gewonnenen Kurven- ziige jewefls bis zum Schnittpunkt mit des Abszisse verl/~ngert werden.

Als MaB des Hemmungsbeginnes wurde der

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$5

Schnittpunkt der Kurve mit der ,,Eo-Linie" festgelegt (vgl. Abb. 2). Diese Linie verlauft parallel zur Abszisse in HShe des jeweils ohne QAV-Zusatz ermittelten 1Nullwertes. Der Schnittpunkt

der Kurve mit der ,,Eo-Linie" liefert / ~ £Z se]bstverst~ndlich nicht die QAV-Kon-

/ zentration, bei der die erste Pilzsch~i- digung eintritt. Er zeigt nur die tat-

: si~chlich bei der TTC-Reduktion f~B- J /o 7M bare tIemmwirkung als Result~nte der

Oberfl/~chenaktivititt und der an- / / / / schlieBend einsetzenden Dehydrasen-

hemmung.

°" / / / / z / 2. Die TTC-Akt iv i t /~ t yon P i l zku l tu ren zeigt im R a h m e n

/ / der nn t e r sue h t e n QAV-Konzen- / t r a t i onen p rak t i s eh l ineare Ab- / , o

/ o Z£g / /" h~ngigkei t yon der Bebrf i tungs- //i ././*

dauer , i b b . 3 b r ing t ein Beispie l / / "°/ -°"/ derar t iger , fiber 12 S t d geff ihrter

/ / / / / /// Messungen.

] / / o/ ./o 3z8 Die der Hemmsto f fmenge pro- / . / . / por t iona le D e h y d r a s e n m i n d e r u n g

/ / / i . .~.o., zeigt, dal] QAV als ,,eehte" Des- / / / . j / ° t - inf iz ient ien im Sinne der yon

o/ / / / / ,o / . / '~_ . . . . _ . ~ 3 s . , S c ~ c L ~ 1 ve r t r e t enen Auffas- ~/%../o ........o--" ° sungen anzusehen sind.

3. Ein/li~sse des Pilzalters auf die QAV-Empf ind l i chke i t haben wir mi t Hi l fe der oben besehrie-

s / . . . . . . . . . ¢y.7 benen Rf ih rku l tu r un te r such t .Wie . . . . . . - . . . . Abb. 4 zeigt, s te ig t die Wider-

-~" F r ~ I standsfi~higkeit des Pilzes bis o 2 ~ s 8 z ~td. /z 8B~r[/lun~'s~ouer zum 4. Tage, s inkt dann e twas

A b b . 3 . Die Wirkung yon Cetyl-trimethylammoniumcldorid in Ab- ab, b le ib t a m 5. u n d 6. Tag an- hgngigkeit yon der Bebt'i~tungsdauer bei steigenden QAV-Ko~zen- n/ihernd gleich und vermindert trationen. 5 , 2 , 1 0 , 3 - - - , 2 5 , 4 . . . . . , 3 2 , 8 . . . . . . . , 3 5 , 9 . . . . . .

und 49,7 . . . . . . . mol/1, i0-° sich a m 7. Tag erheblich. I n

1 SCE~L~R, W. : Schweiz. reed. Wschr. 1945, 63.

Verhalten von Penicillium candidum gegeniiber Triphenyltetrazoliumehlorid 161

allen Fgllen ist aueh hier zungehst eine starke Aktivierung der Pilzaktivitgt zu be- obachten.

4. Die Wirkung verschiedener Halogensubstitution ist gering. Versuehe mit Cetyl- trimethylammoniumehlorid nnd Cetyl-pyridiniumehlorid bzw. mit den entsprechen- den Bromiden zeigten, dab die Chloride nur wenig wirksamer sind als die ent- I

spreehenden Bromide. 5. Auf Grund der Untersuehungen

konnten Schlugfolgerungen fiber den Wir]cungseffe]ct einzeIner QAV gezogen m- werden. In der Tab. 4 sind einige gleieh- zeitig an gleiehen Pilzkulturen gemessene TotMhemmwerte f/Jr eine I~eihe derar- .,g tiger Verbindungen zusammengestellt. /~//

Nine Sonderstellung hinsiehtlieh der is-////' deutlieh geringeren Desinfektionskraft ] - ] ~7 . J nimmt Lauryl-pyridiniumchlorid ein. "t'/I.,'" Hier seheint die geringe L£nge des Alkyl- I~ / restes verantwortlieh ffir die besehriebene Desinfektionsminderung (gemessen an der TTC-Reduktion) zu sein. Beim

Tabelle 3. W i r k s a m ] c e i t v o n T r i m e t h y l b e n z y l - a m m o n i u m c h l o r i d gegeni~ber P e n i c i l l i u m c a n - d i d u m i n A b h S n g i g ] c e i t y o n d e r K o n z e n t r a t i o n . Pilzalter 7 Tage, Bebriitung 2 Std, t tomo- genisierung 4 min, Pilzkonzentration 18,1 rag/

Ansatz

Versuch QAV QAV Fs % moll1 ' 10 -2 ~ - ~g/mg

0 0,33 3,33 5,75 6,5

10,5 13,0

0 1,8

17,9 31,0 35,0 56,5 70,0

11,6 11,6 17,3 7,6 2,2 1,5 0,8

o._~-\ ' 64" ~ ] kK /

I ! , %, \ ' . / k _ % "o

, I / / " % . , \

\ \ %

"~'~o %

7o b .11~'~'""-o...o ~ I / ',

0; D D D D ~,o~ low ~A V- Zonzeztpati'Qz

Abb. 4. Die Emp]indlichkeit yon Penicillium candidum gegeni£ber Cetyl-trimethylammoniumchlorid an verschie- denen Wachstumstagen. - - 3 . - - - 4 . . . . . . 5., . . . . . . .

6. und . . . . . 7. Tag

Trimethylbenzyl-ammoniumchlorid fehlt der lange Alkylrest v611ig, dementspreehend sinkt, wie Tab. 3 zeigt, die TTC-Reduktion extrem stark ab.

Entsprechende Vergleiehsmessungen mit der analog gebauten (langkettigen) Verbindung Cetyl-dimethylbenzy]-ammoniumehlorid zeigten, dab diese etwa 11200- real wirksamer ist als die hier untersuchte Substanz. Einer unbeschr£nkten Ver- l£ngerung der Alkylkette steht allerdings die Tatsache gegeniiber, dab mit waehsender Kettenl/inge nicht nur die Oberfl£chenaktivit£t w£chst, sondern gMchzeitig die Dissoziation zurfiekgeht. Kv~x u. Mitarb5 haben fiir Dialkylverbindungen die bei bestimmter Kettenl/inge maximale Wirksamkeit gegen~ber versehiedenen Bakterien experimentell best£tigt.

Zur Kl£rung dieser Frage im gahmen unserer Problemstellnng haben wit die Oberfl/~ehenspannung 0,1%iger, hier untersuehter QAV-LSsungen mit ttilfe eines

1 K v ~ - , R., H.-J. BIELIG, O. DAN/g, D. JE~CKEL ll. O. WESTPtIAL: Chem. Ber. 73, 941 (1941). 7~. Lebensmitt.-Untersuch., Band 109 11

162 J. SCt[ORMi]LLER und W. AND~XSS:

Stalagmometers nach der Tropfenz/ihlmethode ermittelt und zum Totalhemmwert in Beziehung gesetzt (Tab. 4).

Tabelle 4. Vergleich zwischen Totalhemmwert und Ober]liichenspannung mehrerer gleichzeitig an einer Kultur gepri~/ten QA V

Tota lhemmwer t OberfNchen- Substanz too l /1 .10 -G . spannung 1

Cetyl-trimethyl-ammoniumchlorid . . . . . . . . . . . . Cetyl-benzyldimethyl-ammoniumchlorid . . . . . . . . . Cetyl-pyridiniumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . Lauryl-pyridiniumchlorid . . . . . . . . . . . . . . . . W a s s e r . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

148 120

120--135 325

0

87 95 85 65 50

Die hier gefundcnen Werte best/itigen gleiehfalls die Abhgngigkeit der Desinfek- tionswirkung yon der Oberflgehenaktivit~t.

6. In einer weiteren Untersuehungsreihe haben wir die Frage gepr/ift, ob die in MilehgefgBen zur/ickbleibenden Desinfektionsmittelreste k/~screiteehnisch wiehtige

Tabelle 5. QA V-Mengen in mit Milch ge/i~llten Ge]ii[3en nach vorheriger Spiilung mit Desin/ektionsmitteln (berechnet nach

SEELEMANN und WEGENEI~ 2)

Desinfekt ions- m i t t e n

konzen t r a t ion

0,1 0,2 0,5 1,0 5,0

10,0 Desinfekt ions-

mi t te l - konzen t r a t ion

%

0,1 0,2 0,5 1,0 5,0

10,0

An der Innenwandung haf tenble ibende Desinfekt ionsrni t te lmengen bei

F laschen Kannen

1/2 1 1 1

g g

0,0022 0,0037 0,0044 0,0074 0,0110 0,0185 0,022 0,037 0,11 0,185 0,22 0,37

20 1 40 1 g g

0,025 0,04 0,05 0,08 0,125 0,2 0,25 0,4 1,25 2,0 2,5 4,0

QAV-Konzen t ra t ion in den milchgefi i l l ten Gefiigen

% • 10-4

4,4 8,8

22,0 44,0

220,0 444,0

% - 1 0 - 4

3,7 7,4

18,5 37,0

185,0 370,0

% . 10-~

1,25 2,5 6,25

12,0 62,5

125,0

% • 10-4

1,0 2,0 5,0

10,0 50,0

100,0

Mikroorganismen (hier speziell P enicillium candidum ) zu schg- digcn vermSgen. Angaben fiber die verbleibenden Reste wur- den einer Arbcit yon SEELE- M A N N und WEGENEI~ 2 ent- nommen. Mit Hilfc des dort gegebenen Zahlenmaterials haben wir die nach Fiillung der Gef/~Be mit Milch herr- sehende QAV- Konzentration errechnet.

Zur Beurteilung, ob die in gespfilten und anschliegend mit Milch geffillten Gef~l?en vorhandenc QAV-Menge zur unerwfinschten Schgdigung von Mikroorganismen (hicr Penicillium candidum) aus- reieht, haben wir aus unseren Untersuchungcn den nied- rigsten ,, E 0- Schnit tpunkt" einer QAV herangezogen. Wie oben erSrtert, ist darunter die

QAV-Konzentration zu verstehen, wie sie gerade zur Dehydrasensehi~digung (Minde- rung der Formazanbildung) ausreicht. Dieser Schwellenwert der Inaktivierung bc- deutet gleichzeitig die minimale Inhibitorkonzentration und ber/icksichtigt mit Sieher- heir die ungiinstigsten Verh/iltnisse.

F/ir Cetyl-trimethylammoniumehlorid wurde der Minimalwert, also der niedrigste ,,E0-Sehnittpunkt" bei einer Konzentration yon 5,5 • 10 .8 mol/1, entsprechend etwa 2,2 • 10-4% gefunden. Ein Blick in die Tab. 5 zeigt, dab mit QAV gcspfilte Flaschen

1 Angegeben in Anzahl Tropfen pro Einheitsvolumen. 2 SEEr.EMiN~, U., u. K. W. WE~E~v.R: Kieler 3/iilchwirtsch. Forsch. Ber. 8, 381 (1956).

Verhalten von Penicillium candidum gegeniiber Triphenyltetrazoliumchlorid 163

normalerweise im aktivitgtssehi~digenden Konzentrationsbereieh liegen, dab jedoeh bei K a n n e n und anderen Gef/~Ben mit grSl3erem Inhal t 0,1%ige QAV-LSsungen in Hinsicht auf die hier erSrterte Pilzschgdigung ohne Bedenken zur Desinfektion benutzt werden k6nnen.

III . Beeinilussung der TTC-Reduktion bei Penicillium candidum durch QAV-Priiparate des Itandels

I m AnsehluB an die Untersuehung definierter QAV haben wir eine Reihe yon Handelsprodukten iiberprfift, die auf der Grundlage soleher Desinfizientien aufgebaut sin& Lediglieh bei 2 Pr/~paraten war die Art der verwendeten QAV bekannt, ni~m- lieh bei Probe 4 (Alkoxygthyl-oxyi~thyl- methylbenzyl-ammoniumehlorid) und Pro- be 5 (Dodeeyl-dimethyl-3,4-diehlor-benzyl- ammoniumchlorid). F/it alle in der Tab. 6 zusammengefaBten Untersnchungsproben fehlten jedoch Konzentrationsangaben. Wit haben deshalb alle untersuehten L6- sungen als 100 % ig angenommen und dureh Verdtinnen mit Wasser im Bereieh yon 0- - 16,6 • 10 -s % die wirksame Konzentra- tion ermittelt. Tab. 6 bringt eine Zusam- menfassung yon Versuehsergebnissen, wit sie an 3 Tage (a) und 4Tage (b) alten Pflz- kulturen erhalten wurden.

Tabelle 6. Totalhemmwerte und ,,Eo-Schnitt- punkte" einiger QA V-Handelsprodukte

! ,,No- Schni t tpunkte" Totalhemmung bei iErs~esichtbare Dehy-

drasensehiidigung bei

Probe 3 Tage (a)[4 Tage ( b ) 3 Tage (oQ[4 Tage (b)

alten Pilzkulturen alten Pilzkulturen

1 % " 1 0 - ' % . 10 -3 %. 10 -3 %- 10 -~

18,5 28 13,6

10,6 19,2

18,3 15,8 11,1 18,3

9 13,3 6,7 6

6,6 9,4 3,4 8,5

6,7

DiG graphisehe Darstellnng der Megreihen (auf deren Wiedergabe hier verzichtet wurde) zeigt lediglich, dag zur Erreichung des gleiehen Hemmeffektes sehr unter- schiedliehe Nengen der Handelsprodukte angewendet werden m/issen. So sind yon den Proben 1, 2, 4 und 6 gegentiber der Probe 5 doppelte Konzentrationen notwendig, um denselben Effekt zu erreiehen. Ffir ein Desinfektionssalz des Handels war die

- ~ . ~ . . . . . . ~ o \\

~ . ~ ' ~ 5 _ ' - . .

0 I i P T I 0 ?0 20 20 ~ mo!.~o-6/t $0

~A V- i¢onz2iT, ffoti'Oil Abb. 5. Wirkungsvergleich eines Handelsprodulctes taCt reinem CetylpyridiniumcJdorid in zwei getrennten Persuehs- /iihrunge~. (Testorganismus Pen. cand., Pilzkulturen ~-ier (a) und drei (b) Tage alt) Handelsprodukt (a) und . . . . (b)

Ce t ylpyridiniumchlorid . . . . . (a) und . . . . . . . (b)

11"

164 Zeitschriftenreferate. - - Die einzelnen Lebensmittel

Konzentration an wirksamer QAV bekannt (50 %). Wir haben dieses Salz gegen oben untersuchte, definierte QAV gemessen und gefunden, dab die Wirkung des erw~hnten S~lzes etwa der yon Cetyl-pyridiniumchlorid entspricht. ~Tur bei einem ttandels- produkt dgnischer Herkunf t war uns sowohl Art der QAV (Cetyl-pyridiniumchlorid) wie auch deren Konzentrat ion (10 %ig) bekannt. Wir haben dieses Pr/~parat mit der reinen, uns zug/~nglichen Verbindung in zwei getrennten Versuchsffihrungen fiber- prfift und im Kurvenver lauf (Abb. 5) ausgezeichnete ~bereinst immung gefunden.

Wegen der meist ungekl£rten Konzentrationsverhgltnisse k~nn ffir fast glle hier geprfiften Handelsprodukte der Schwellenwert einer Pilzsch~digung nicht angegeben werden. Auf Grund der in Tab. 6 zusammengestellten MeBergebnisse lgBt sich jedoch sagen, dab die untersuchten Proben des Handels in 0,1--0,2% iger LSsung ohne EinfluB auf k/isereitechnisch wichtige Mikroorganismen yon der Art des Peni- cillium candidum sind.

Zusammen]assung Penicillium candidum enth~lt Dehydrasensysteme, die TTC zu Formazan redu-

zieren. Die Reduktion kann oft durch niedrige QAV-Konzentrationen aktiviert werden, hShere hemmen stark. Die konzentrationsabh~ngigen Kurven steigen folg- lich anfangs bis zu einem Maximum an und fallen dann bis zum Nullpunkt ab. In manchen F/~llen ist keine Aktivierung zu beobachten. Als MaB beginnender Hem- mung wird die eben sichtbare Minderung der Formazanbildung (,,E0-Schnittpunkt") angesehen; den Totalhemmwert gibt der Schnit tpunkt der Aktivitgtskurve mit der Abszisse an. Der QAV-Wirkungsbereich wird vor allem durch die Pilzkonzentration daneben weniger entscheidend durch die wechselnde Pilzempfindlichkeit beeinfluBt. Der pilzsch/~digende EinfluB beginnt bei QAV-Konzentrationen yon etwa 5,5 • 10 -6 tool/l, entsprechend 2 ,2 .10-4%. Die Totalhemmkonzentrat ion liegt fiir definierte QAV im Mittel bei 3 - -5 • 10 -s tool/l, ffir t tandelsprodukte bei 1--2 • 10-2%. Kon- zentrationen der QAV-LSsungen fiber 0,2 % bringen die Gefahr einer Sch/idigung des Penicillium candidum mit sich. Ffir definierte QAV l/~Bt sich mit Hilfe des TTC-Testes die Wirksamkeit der einzelnen Verbindungen vergleichend ermitteln. Zunehmende Verl£ngerung des Alkylrestes bedingt steigende QAV-Wirksamkeit bis zu einem Optimum der Kettenl/~nge. Die AbhSngigkeit der Aktivit~t yon der Bebrfitungsdauer bleibt auch nnter dem hemmenden EinfluB der QAV pr~ktisch linear. Die Aktivit~t yon Penicillium candidum erreicht am 4: W~chstumstag ein Maximum; gleichzeitig ist auch die Empfindlichkeit gegenfiber QAV am geringsten.

Zeitschriftenreferate Die einzelnen Lebensmittel (Chemie, Technologie, Analytik)

Getreide, Getreideerzeugnisse u. dgl. Getreide und sonstige mehllie/ernde Samen

A. D. Kerimow: Der Einilui~ mineraliseher Diingemittel au[ die bioehemisehe Zusammen- setzung verschiedener Weizensorten in Aserbajdshan. [Russisch]. Dokl. Akad. Nauk Aserb~jdshan. SS~, 18, 893--900 (1957).

Bei Bew~sserung ohne Diingung verminderte sich der EiweiBgeha]t im Weizenkorn im Ver- gleich zu den gleichen Sorten ohne Bew~sserung; dagegen stieg der Eiweil~gehalt sehr wesentlich, wenn bei der Bew~sserung mineralische Diingung gegeben wurde. Ebenso sank bei den meisten

* Einschliel]lich Referate yon Arbeiten in Fo~tschrittsberlchten u. dgl.