Ralf BartenschlagerAbteilung Molekulare Virologie, Hygiene Institut

INF345, 1. OGhttp://molecular-virology.uni-hd.de

Virusaufbau, Replikationszyklus, Klassifikation, Virusnachweisverfahren

Molekulare Mechanismen der Pathogenese bei Infektionskrankheiten

• Viren sind obligat intrazelluläre Parasiten

• Virusgenome können aus DNA oder RNA bestehen

• Das Virusgenom wird in der Wirtszelle repliziert.Es steuert die Synthese der übrigen Virusbestandteile

• Virusnachkommen werden aus neu gebildeten Komponentenzusammengesetzt (Assembly)

• Ein neu gebildetes Virion ist ein Vehikel, mit dem das virale Genomzur nächsten Wirtszelle oder Wirtsorganismus transportiert wird

• Dort beginnt der nächste Replikationszyklus

Definierende Eigenschaften von Viren

Virusaufbau am Beispiel Herpes Simplex Virus

aus: Flint, Principles in Virology, 2nd edition

Sphärische Partikelmeistens ikosaedrisch

Tubuläre Partikelmeistens helikal

Komplexe Partikelz. B. Phagen

Virus Morphologie

Grössenvergleich Eukaryonte Zelle – Bakterium - Virus

LogarithmischePhase

Lag-

Phas

e

1 2 3 4

Stunden

Zellz

ahl

101

102

103

104

Anpassung an die Kulturbedingungen (Lag-Phase)

logarithmische Vermehrung durch Zweiteilung

Verlangsamung der Teilung nach Aufbrauchen der Nährstoffe (Sättigung)

Vergleich der Vermehrungsstrategie von Bakterien und Viren in Kultur

Eklip

se

Late

nzpe

riode

Infektöse Partikel dringen in die Zelle ein und zerfallen (Eklipse)

Bildung und Freisetzung von vielen Virusnachkommen pro Zelle (Latenzperiode)

Ende der Wachstumsphase durch Tod der Wirtszellen

extrazellulär

PFU

/ml

12

102

104

106

108

24 36 48

Stunden

intrazellulär

Bsp: Adenovirus

Grundzüge der Virusvermehrung

Wirtszelle

ViruseintrittSpezifischer Wirt und spezifische ZelleRezeptor-vermittelt

Virusaustrittdurch Knospung oder Lyse der Zelle

UncoatingFreisetzung des Genoms

Replikationdes Genoms

Proteinsynthese

Non-enveloped enveloped

Montage und Freisetzung bei umhüllten und nicht-umhüllten Viren

Virusgenome kodieren Genprodukte und Informationen für

Partikelbildung und Verpackung des GenomsReplikation des VirusgenomsRegulation des Replikationszyklus (z.B. Umprogrammieren der Zellen)Ausschalten zellulärer AbwehrmechanismenVerbreitung auf andere Zellen und Wirtsorganismen

Virusgenome kodieren nicht

Proteinsynthese-Maschinerie (rRNA, Translationsfaktoren etc)Enzyme des EnergiestoffwechselsFaktoren der MembranbiosyntheseTelomere, Zentromere

Eigenschaften von Virusgenomen

Faktoren, die die Genomgrösse begrenzen

• Dauer der Genomreplikation

• Kapsidgrösse

• RNA-Stabilität

• Genauigkeit der viralen Polymerasen

Circoviridae1,7-2,3 kB ssDNA

Coronaviridae, 31 kB RNAMimivirus, 800 kBp DNA

Grösse viraler Genome

• DNA oder RNA• DNA mit kurzen RNA Segmenten• DNA oder RNA mit kovalent verknüpftem Protein• Einzelstrang DNA• Einzelstrang RNA: minus, plus, ambisense• Doppelstrang DNA oder RNA• Lineare DNA oder RNA• Zirkuläre DNA oder RNA• Segmentierte RNA• Doppelstrang DNA mit Unterbrechungen (gapped)

Variabilität von Virusgenomen

Klassifikation von Virusgenomen

GenomRNA-Viren

Plus-Strang (= mRNA)

Minus-Strang

Doppelstrang

DNA-Viren

Einzelstrang

Doppelstrang

Mit oder ohne Hülle (Envelope)umhüllt oder nackt

Segmentiertes oder nicht segmentiertes Genom

Klassifikation von Animalviren

Umhüllt Nackt

Pockenviren(Vaccinia, Variola, Molluscum contagiosum)

Herpesviren(HSV, VZV, EBV, CMV, HHV-6, -7, -8)

Hepadna-Viren(HBV)Retroviren(HIV, HTLV)

Orthomyxoviren(Influenza)

Paramyxoviren(Masern, Mumps,RSV, Parainfluenza)

Bunyaviren (Hanta)

Togaviren (Röteln)

Flaviviren(Gelbfieber, FSME, HCV, West-Nil-Virus, Dengue-V.)Arenaviren(Lassa)

Rhabdoviren(Tollwut)

Filoviren(Ebola, Marburg)

Coronaviren (SARS)

Adenoviren

Papovaviren(Papillom, JCV, BKV)

Parvoviren(B19, ssDNA)

dsRNAReoviren(Rota)

ssRNAPicornaviren(Polio, Rhino, Coxackie, HAV, FMDV)

Caliciviren (Noroviren: Norwalk)

DNA

RNA

Die Art des Genoms bestimmt den Replikationsweg

Virusgenom

Dient als mRNAPlusstrang RNA Viren

Virale RDRP transkribiert mRNAMinusstrang RNA Viren; dsRNA Viren

Virale RT schreibt Genom in dsDNA umTranskription von mRNA durch zelluläre DDRPRetroviren

Zelluläre DDRP synthetisiert mRNAdsDNA Viren außer Poxviren

Virale DDRP transkribiert mRNAPoxviren

Umschreiben des Genoms in dsDNA und Transkription durch zelluläre PolymerasenssDNA Viren

Klassifikation nach Replikationsstrategie:Unterschiedliche Wege vom Genom zur mRNA

Virale Replikationsstrategien („Baltimore-Schema“)

DNA Viren nutzenzelluläre DNA-Polymerasen

Replikation im Zellkern

Ausnahmen:Orthomyxo-, Bunyaviren: Nutzen splicing

Retroviren: Integration ins Zellgenom

Ausnahme Poxviren: Replikation im Zytoplasma;haben eigene Replikationsenzyme

Die Replikationsstrategie bestimmt den Ort der Replikation

RNA Viren benötigen eigene Polymerasen

Replikation im Zytoplasma

Grundlegende Eigenschaften des Replikationszyklus werden definiert durch:Polarität des RNA-Genoms

+Strang RNA: entspricht der mRNA-Strang RNA: komplementär zur mRNAAmbisense: eine RNA wird in beide Richtungen abgelesen

RNA-Genome können segmentiert vorliegenInfluenzavirus Genom besteht aus 8 -Strang RNA-Molekülen

RNA Viren

AUG.....................................UAA5‘ 3‘+

Plus-Strang: Genom = mRNA

UAC.....................................AUU3‘ 5‘-

Minus-Strang: Antigenom = mRNA

AUG.....................................UAA5‘ 3‘+

AUG..................UAA UUA.................. CAU5‘ 3‘

UAC..................AUU AAU..................GUA3‘ 5‘

Ambisense: Genom und Antigenom = mRNA

Genompolarität von RNA Viren

VIRUSES

Virologische Diagnostik: Was kann ich nachweisen?

Erregernachweis

Virus• Virusanzucht: infektiöses Agens• Elektronenmikroskopie: Partikel

Virusbestandteile

Proteine• Immunfluoreszenz• Antigen-ELISA (EIA)• Western-Blot (Immunblot)

Nukleinsäure• PCR• RT-PCR

Immunantwort auf Virusinfektion

Antikörper gegen virale Proteine• Komplement-Bindungsreaktion• Hämagglutinations-Hemmtest• Antikörper-ELISA• Westernblot• Immunfluoreszenz

=> IgG, IgM, IgA

Antikörpernachweis

Direkter Virusnachweis

Elektronenmikroskop

Anzucht des Virus• im Tier• in embryonierten Hühnereiern• in Zellkultur: cytopathischer Effekt, CPE

Bestimmung des Virustiters• Plaque-Test• Endpunkt-Verdünnung

Virologische Diagnostik: Virusnachweis

Methoden zur Analyse der Partikelmorphologie

Electron Microscopy

isolated HIV cores

Negative stainParticles are fixed andstained;simple method, revealingfew structural details

mature HIV particle

Thin sectionParticles are fixed, embedded in plastic,stained and sectioned;only section of particlevisible

mature HIV particle

Cryo-EMUnfixed and unstained particles invitreous ice;little contrast, superimposition of3D structure, signal results directlyfrom density, computer-aidedanalysis gives high resolution

X-ray crystallographyVery high resolution (atomic details), butvery regular organization required polio virus

Cytopathogener (Zellschädigender) Effekt von Viren

Infektion von epithelialen HeLa-Zellen mit Poliovirus (Picornavirus)

Aufnahmen zu verschiedenen Zeitpunkten nach Infektion (in Stunden)

fortschreitende Lyse der Zellen

0 5,5

8 24Bildung von Riesenzellen (= Syncytien)nach retroviraler Infektion

Plaque-Test: Titrierung von Viren

Serielle Verdünnung desAusgangsmaterials

Ausbringen der Virus-Verdünnungen auf suszeptible Zellen

Überschichten mit zähem Methylcellulose-Medium, um die freie Diffusion der Viren zu verhindern.

Kreisförmige „Löcher“ (= Plaques) im Zellrasendurch lokal beschränkte Ausbreitung der Viren und Zellzerstörung

1:1061:104 1:105

Plaque-Test: Titration von Viren

Nachweis der Anzahl infektiöser Partikel in einer Lösung

Phänotypische Analyse von Virusmutanten (Plaque Morphologie)

Serologische Nachweismethoden

Nachweis antiviraler Antikörper

Enzym-Immunassay (ELISA, EIA)

Westernblot (Immunblot)

Immunfluoreszenz (direkt oder indirekt)

Hämagglutinations-Hemmtest

Komplement-Bindungsreaktion (KBR)

Antikörper-Nachweis: ELISA

Antikörper-ELISA

z.B.HIV-Suchtestanti-HBsanti-HBc etc.

Antikörper gegen einvirales Antigen

Virusnachweis: Immunfluoreszenz

Direkt an Patientenmaterial, z.B.:Influenza (Rachenabstich)CMV (Granulozyten)

Nach Kurzkultur, z.B.:Adenovirus in Fibroblasten-Zellinie MRC-5

Vor- und Nachteile verschiedener diagnostischer Verfahren

Diagnostisches FensterNicht quantitativ, nicht automatisierbar

Hohe Spezifität, Differenzierung möglich; Bestätigungstest

Western Blot

Diagnostisches Fenster bei akuten Infektionen; ‚Serumnarben‘

Automatisierbar; sensitiv; weitverbreitet; QualitätssicherungEtabliert; Suchtest

Ak-ELISA

Falsch Positive durch Kontamination möglich

Schnell; quantifizierbarPCRRT-PCR

Wenig sensitivSchnell; quantitativ; gut standardisierbar

Ag-ELISA

Auswertung schwer objektivierbar; nur für manche Erreger möglich

Schnell; Differenzierung möglichIF

Sehr insensitivTeure Ausstattung benötigt

‚Catch all‘, auch nicht kultivierbare Viren; keine virusspezifischen Reagentien benötigt

EM

Sehr langsam, teuer, schwierigAuch für unbekannte VirenBeweist Infektiösität

Virusanzucht

NachteileVorteile

Nächste Woche

Verlaufsformen viraler Infektionen

Virus-vermittelte Zellschädigung (CPE)