Vitalfarbung von Lysosomen und anderen

Zellorganellen der Ratte mit Neutralrot

Vital Staining of Lysosomes and OtherCell Organelles of the Rat with Neutral Red

JURGEN WINCKLER

Mit 83 Abbildungen

GUSTAV FISCHER VERLAG· STUTTGART· 1974

Privat-Dozent Dr. med. JDRGEN WINCKLER,Anatomisches Institut der Universitat

D - 87 Wiirzburg,Kollikerstr.6

Prof. Dr. T. H. SCHIEBLER danke ich fUr vielfaltigen Rat, Anregung und Kritik bei der Durchfiihrung derUntersuchung und die griindliche Durchsicht des Manuskripts. Die Arbeit ist ihm zu seinem 50. Geburtstaggewidmet.

Die Untersuchung wurde durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft unterstiitzt.

ISBN 3-437-10353-9

© Gustav Fischer Verlag· Stuttgart· 1973 . Aile Rechle vorbehallenGesamtherstellung: Druckerei Mayr, MiesbachPrinted in Germany

Inhaltsverzeichnis

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68

5757

77

9°

Zusammenfassung

Literatur .

Register

Reaktionen des Organismus aufNR ..a) Das NR-Krinom im Darm .b) Atypisches »Krinom« in phagozytie­

renden Zellen der Leber, Milz undLymphknoten

c) Weitere Wirkungen des NR

Erganzende Tierexperimentea) Durstversuch .b) NR-Vitalfarbung nach Priimedikation

mit Desmethylimipramin (Pertofran®)und Reserpin (Serpasil®)

c) NR-Vitalfarbung nach »Vakuolen«­Induktion im Epithel des proximalenHauptstiicks der Niere .

SchluB ..a) Faktoren, die das Ergebnis der NR­

Vitalfarbung bedingen .b) Das »Granu!umproblem« (GICKLHORN

1931)c) Die Anfarbung der Lysosomenmatrix

durch NR .. 73d) Die Bedeutung der NR-Vitalfarbung 74e) NR als Modell 75

76

Die Ausscheidung von NR in Niere undDarm 48

a) Niere 48b) NR-Ausscheidung 1m Magendarm-

trakt 52

Altersveranderungen der NR-Vita)f;irbung 54a) Alte Tiere 54b) Junge Tiere .. 56c) Diaplacentare NR-Farbung von Rat-

tenfeten . 56

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4

2

7

II

15

15

41

Normalverteilung von NR nach einmaligerintravenoser Injektion . . 17

a) NR im Blut .. 17b) NR-Eirbung der Interzellularsubstanz 17c) Cytoplasmafarbung 17d) Cytoplasmafarbung endokriner Zellen 19

e) Vitale Kernfarbung durch NR .. 26

f) NR-Vitalfarbung von Lysosomen 27

g) NR-Farbung von Sekretgranula exo-kriner Driisenzellen 39

NR-Vitalfarbung in einzelnen Organen undGeweben

Methodische Untersuchungena) Lokalisation vital applizierten NRs im

konventionell hergestellten Paraffin­und Kryostatschnitt

b) Versuche zur Stabilisierung der NR­Vita)f;irbung am gefriergetrocknetenKryostatschnitt

c) Modellversuche zur direkten ReaktionwaBriger, nichtwaBriger undgasformi­ger Fixantien mit NR in gefarbtemFilterpapier ..

d) Schnittfarbung verschiedener Gewebemit NR, Methylenblau und PAS

e) Schnittfarbung vitalgeLirbten Gewebesnach AOYAMA.

f) Folgerungen aus den methodischenUntersuchungen ..

Tierversuche

Material und Methoden

Einleitung

Abstract ..

Der Farbstoff .

Contents

Normal distribution of NR following asingle intravenous injection ofNR .. 17

a) NR in the blood .. 17b) NR-staining of intercellular substan-

ces . . 17

c) Cytoplasmic staining .. 17d) Cytoplasmic staining of endocrine cells 19

e) NR staining ofvital cell nuclei .. 26f) NR vital staining oflysosomes .. 27

g) NR staining of secretory granules ofexocrine gland cells 39

NR vital staining in different organs andtissues .. 41

Excretion ofNR in the kidney and intestine 48a) Kidney . . 48b) Intestine . 52

Changes ofNR vital staining due to the age 54

a) Old rats . 54

b) Young rats .. 56

c) Diaplacentar NR vital staining of ratfetusses .. 56

57

57

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Reactions of the organism following NRinjection.

a) NR-»Krinom« in the intestinal epithe­lium

b) Atypical »Krinom« in phagocytoticcells of liver, spleen and lymph node 61

c) Further effects ofNR 63

Additional experiments 64

a) Thirsting. 64

b) NR vital staining following premedi­cation with desmethylimipramin (Per­tofran®) and reserpin (Serpasil®) .

c) NR vital staining following the induc­tion of »vacuoles« in the epithelium ofthe kidney proximal convolution

Conclusions .. 70a) Factors governing NR vital staining 71b) The »Granulumproblem« (GICKLHORN

193 1)c) Staining of the lysosomal matrix with

NR. 73d) The significance of NR vital staining 74

e) NR as a model 75

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77

Subject Index.

Summary

Literature

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9

9

7

15

II

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Examination ofthe methodsa) Localization of intravital injected NR

in paraffm and cryostat sections ..b) Experiments to stabilize NR-vital stain­

ing in frozen-dried cryostat sections ..c) Model experiments on the direct reac­

tion ofaqueous, not aqueous and gase­ous fixatives with NR on filter paper

d) Staining of tissue sections of differentorigin with NR, Methylene blue andPAS.

e) AOYAMA staining oftissue sections fromNR-vital stained tissue .

f) Conclusions ..

Abstract ..

Introduction .

Thedye .

Material and methods ..

Experiments with rats ..

Abstract

Microscopical studies on cells or tissues vitallystained with Neutral red (NR) were hithertoalmost invariably confmed to a few objects thatcould be investigated without tissue sectioning,for instance tissue culture. For NR, a cationic dye(molecular weight 289, PK 6,75) is easily solublein water and organic solvents and diffuses duringhistological preparation for paraffm sectioningand even from cryostat sections. Thus compre­hensive studies of vital staining of laboratoryanimals such as mouse and rat don't exist yet.

This explains why it still remains doubtful,wether NR stains 'preexisting' or 'newly formed'granules, 'paraplasmic' cytoplasmic inclusionbodies or - complete or only partially - lyso­somes and why it does so. We tried to solvethese problems. Moreover we found that afterintravital injection of the dye NR 'stained' thecells of the APUD-series (PEARSE) rather selec­tively as do catecholamines or catecholamineprecursors. So it was to follow up wether NRcould serve as a model for distribution studies ofbiogenic amines, too.

The histological method that allows the locali­zation of intravitally injected NR in tissue sec­tions is freeze-drying. We applied freeze-dryingto cryostat sections. The main advantages of thismodifIcation are both the short time needed forthe drying procedure and the large number ofdifferent tissues that can be cut and frozen-driedin the same time. In this way nearly all organsand tissues of the rat could be investigated.

I min after the intravenous injection of thedye NR has disappeared from the blood - at leastin concentrations that are demonstrable in tissuesections. By using fluorescence microscopy thedye instead can be localized in all tissues beinginvestigated mainly intracellularly. Apart fromthe diffuse staining of the cytoplasm in sometissues stained cell nuclei are observed. Intenselycoloured nuclei together with a diffuse to scatter­ed staining of the cytoplasm are signs of celldeath.

In some endocrine cells - mostly belonging tothe APUD-series - a strong, often granular,

VitalHirbung mit Neutralrot . I

reddening of the cytoplasm is seen; the nucleiare not stained. While the dosis and the form ofapplication necessary to stain these endocrinecells, the intracellular localization and even thereactive groups (presumably carboxylic groupsof the granule matrix) to which NR and cate­cholamines and their precursors are bound seemto be rather identic, some essential differencesdo exist: NR is easily and rapidly taken up andstored for a relatively short period, whereasbiogenic amines accumulate in APUD - cellsby active transport in a time - consuming pro­cess; their precursors are only stored followingdecarboxylation. - Secretory granules of someexocrine gland cells, too, may be vitally stainedbyNR.

NR-staining of lysosomes is a well-known fact.We can add some details: a) There are-verycharacteristic for each of the tissues investigated­differences in the time needed to stain lysosomesas well as in the duration of lysosomal staining:For instance lysosomes in the kidney proximalconvolution are stained very rapidly directlyafter the injection of the dye and are destained inabout 24 h, lysosomes in the thyroid epitheliumare rapidly stained and destained, lysosomes inother organs need 45 to 60 min to get stained.c) There is no correlation between the vitalstaining of lysosomes and the characteristicsIysosomes exhibit when stained by histological­histochemical methods in tissue sections. Thismay be due to the extraction from the tissuesection of that particular component that, intra­vitally, binds the dye to lysosomes. - Differen­ces in the composition of the lysosomal matrixin various organs are discussed as one majorpoint of the heterogeneity of lysosomal vitalstaining with cationic dyes. d) NR vital stainingof lysosomes of younger animals is less, that ofolder animals much more pronounced; lipopig­ment may, but must not neccessarily do so,exhibit a strong binding capacity for the cationicdye. e) In dehydration experiments the bindingcapacity oflysosomes is stronger, after premedi­cation with reserpine less pronounced than

2 • J. WINCKLER

normally. Desmethylimipramin has no effect atall.

The so-called NR-crinolll appears only in afew organs, resulting from autophagic as wellas from heterophagic cell activity.

Following albumin injection enlarged lyso­somes are stained vitally in the renal proximalconvolution. 'Vacuoles' induced by premedica­tion with Macrodex® and glycerol remainunstained.

NR is concentrated in the urine of the distalnephron and in the gastric lumen. Reabsorbtionoccurs in the distal intestine.

Essentially two factors are believed to beresponsible for the pattern of NR vital staining:a) Its solubility that explains the distribution ofthe dye all over the organism, its diffusionthrough cell membranes and its elimination fromthe organism by 'Non-ionic diffusion'. b) Itsqualities as a light cationic dye that cause its ­electrostatical - binding ('storage') to anionicsites of the tissue, for instance to carboxylicgroups of the secretory granules of the APUD­cells and carboxylic and/or phosphate groups ofthe lysosomal matrix.

Einleitung

Unter Vitalfiirbung verstehen wir in Anleh­nung an v. MOLLENDORFF (1920, 1926), GICKL­HORN (1931) und ZEIGER (1938) die Anfarbunglebender Zellen, Gewebe oder Organismen, dienennenswerte Zeit uberlebt wird. In dieserDefmition ist enthalten, daB die Farbstoffgabeyom Versuchsobjekt nicht reaktionslos vertra­gen wird und das Bild der Vitalfarbung deshalbnicht unbedingt den mativen> Zustand wieder­gibt (vgl. S. 6, 57ff.). Trotz dieser Einschrankunghat die Vitalfarbung in der Biologie eine unge­heure Verbreitung erfahren (umfassende Refe­rate: FISCHEL 1910; V. MOLLENDORFF 1920,1926;VONWILLER 1928; GICKLHORN 1931; ZEIGER1938; KIYONO et al. 1938; STOCKINGER 1964;DRAWERT 1968; BARBOSA und PETERS 1971).Denn die Moglichkeit, durch die Anfarbunglebender Strukturen etwas uber die Funktionender lebenden Zelle und die <Verteilungsgesetzedes Organismus fur Vitalfarbstoffe> (VON-

WILLER 1928) zu erfahren, machte die Methodegerade fur physiologische und pharmakologi­sche Fragestellungen interessant, zumal <a colour­less substance is concentrated in the same wayas are coloured substances> (DANIELLI 1950,S.20). Demgegenuber trat die Anwendung derVitalfarbungstechnik als ausschlieBlich <mor­phologisch-anatomisches Hilfsmittel> (DRAWERT1968) bald in den Hintergrund. In der Immun­histologie und -histochemie, die STOCKINGER(1964) mit Recht der Vitalfarbung zuordnet,tritt dieser funktionelle Gesichtspunkt ganz inden Vordergrund. Das Interesse der Pharma­kologen an der Vitalfarbung wird vielleicht ameindrucklichsten durch die Aussage von EHRLICH(19II) belegt, daB die <Chemotherapie anfang­lich Farbentherapie wan (vgl. auch EHRLICH undSHIGA 1904). Bei STOCKINGER (1964) finden sichzahlreiche Hinweise fur die innige Verbindungvon Vitalfarbung und Pharmakologie.

Die Vitalfarbung als wissenschaftliche Unter­suchungsmethode ist durch zwei Faktoren inMiBkredit geraten: I. Die zahlreichen Wider­spruche und die haufig mangelnde Reproduzier­barkeit der Ergebnisse sind nicht zu ubersehen.Es ist verwirrend, die Befunde der Literatur beiAnwendung auch nur eines Farbstoffs (z. B.Neutralrot, NR) zu einer einigermaBen einheit­lichen Aussage zusammenzufassen. Neben derUnvergleichbarkeit der verwendeten Versuchs­objekte spielen hier unterschiedliche, haufignicht genugend definierte Versuchsbedingungendie Hauptrolle (GICKLHORN 193 I; ZEIGER 1938).Daneben ist allerdings zu beri.icksichtigen, daBnach GICKLHORN (1931) die sog. <Launenhaftig­keit> der Vitalfarbung als Ausdruck des Lebensgerade das eigentlich Interessierende sein kann. ­2. Die Komplexitat der Lebensvorgange er­schwert eine eindeutige Interpretation des Er­gebnisses der Vitalfarbung. Erklarende Hypo­thesen, z. B. chemische Konstitution (EHRLICH1885; Kritik: SCHULEMANN 1912, 1920; V.MOLLENDORFF 1920, 1926), Lipoidloslichkeit(OVERTON 1900; NIRENSTEIN 1920), Dispersitat(v. MOLLENDORFF 1915; Kritik: FAUTREZ undLISON 1937; vgl. PISClliNGER 1927), Teilchen­groBe (RUHLAND und HOFFMANN 1925), Wasser­stoffionenkonzentration (BETHE 1905, 1922;

ROHDE 1917; Kritik: v. MOLLENDORFF 1923),elektrischer Ladungssinn (KARCZAG 1925; KELLER1928; Kritik: DRAWERT 1968) werden dannfalsch, wenn sie einseitig verwendet werden(GICKLHORN 1931; ZEIGER 1938). <Es hat keinenZweck, eine bestimmte Eigenschaft als die flirdas Zustandekommen der LebendCirbung aus­schlaggebende hinzustellen> (v. MOLLENDORFF1926, S.712; vgl. auch GICKLHORN 1931, S·396).Die Vielzahl der Faktoren, die das Ergebnis derVitalfarbung bestimmen, hat den von v.MOLLENDORFF (1926) geauBerten Optimismusgedampft, die Vitalfarbungstechnik zum histo­chemischen Substanznachweis einzusetzen; denndie Analyse und Abgrenzung der einzelnen Teil­faktoren ist schwierig.

Trotzdem kann kein zweifel darliber be­stehen, daB die Vitalfarbung wertvolle Hinweiseflir die Erfassung und Charakterisierung derKrafte liefern kann, die im lebenden Organismusdie Aufnahme, Verteilung, Speicherung (Bin­dung) und Eliminierung von Stoffen beein­flusscn. Verglichen mit den erheblich groBerenSchwierigkeiten bei Verteilungsstudien mitfarblosen Substanzen ist der Weg von Farb­stoffen im Organismus leicht zu verfolgen. 1mHinblick auf die begrenzte Zahl der in ihrerPharmakokinetik grlindlich untersuchten Ver­bindungen (DOST 1968) ist deshalb der Einsatzvon Vitalfarbstoffen und die Auswertung derBefunde mit histologisch-histochemischer Me­thodik dann angebracht, wenn eine ortsrichtigeLokalisation in Geweben und Zellen moglich ist.

Der Schwerpunkt der vorliegenden Unter­suchung Iiegt deshalb in der Beschreibung desVerlaH[s der NR-Bindwlg in Orgal1ell I/Ild Ge­wehen der Ratte nach eilllllaliger intravel1oser1)

Gabe des Farbstoffs. Entsprechende Untersuchun­gen bei Laborsaugetieren fehlen, obwohl NRals <bester Granulafarber aus der Reihe der basi­schen Farben> (VONW1LLER 1928, S.483) wegenseiner geringen Toxizitat (vgl. S. 6) und glinsti­ger Farbeigenschaften als Diachrom und Fluoro­chrom besonders haufig angewendet wurde.

I) v. MOLLENDORFF (1923, 1930) betont, daB cine£unktionelle Interpretation der VitaWirbung nurnach cinmaligcr Farbstoffgabe moglich ist.

VitaWirbung mit Neutralrot . 3

Die Ursachen hierflir sind klar: NR - wie diemeisten kationischen Vitalfarbsto/fe - ist inWasser und organischen Losungsmitteln leichtloslich und deshalb im aufgetallten Kryostat­schnitt nicht ortsrichtig und im konventionellverarbeiteten Parafimschnitt liberhaupt nichtnachzuweisen. Deshalb ist die Vitalfarbungs­technik mit NR weitgehend auf Lebendbe­obachtung und ausgewahlte Objekte beschrankt,z. B. Zellkulturen (NAGEL 1929; v. MOLLEN­DORFF 1936; STOCKINGER 1964, Lit.; ALLISONund YOUNG 1964, 1969, Lit.; WITTEKIND et al.1970, Lit.), Einzeller und kleine Mehrzeller(Paralllaecilllll: NIRENSTEIN 1920; KOEHRING1930; Daphl1ia: KOEHRING 1930; GICKLHORN1931, Lit.; SCHMIDT 1962; Opalina ral1arUlIl:KEDROWSKI 1931). Die Lebendbeobachtung derNR-Vitalfarbung bei Laborsaugern ist dagegennur an wenigen gceigneten Organen moglich(Auge: VONWILLER 1928, Lit.; Pankreas:COVELL 1929; HIRSCH 1932 u. a.).

Die histologisch-mikroskopischen Schwierig­keiten der Aufarbeitung NR-vitalgefarbtenGewebes haben gelegentlich dazu geflihrt, diebei Einzellern oder an Zellkultur gewonnenenErgebnisse weitgehend ungepriift auf kompli­ziertere Organsysteme zu iibertragen, oder dasErgebnis einer Vitalfarbung durch indirekteAnzeichen und Folgen der Farbung (z. B.Krinom; s. S. 57) am konventionell verarbei­teten histologischen Schnitt zu rekonstruieren. ­Auch die Elektronenmikroskopie (SCHMIDT1962; STOCKINGER 1964) hat in der Frage derNR-Lokalisation im Gewebe bisher versagt.

Die vorliegende Arbeit konnte daher erstnach Einflihrung einer flir die breitere Anwen­dung in der Vitalfarbungstechnik l1euen histo­logischen Methode in Angriff genommen werden.Die zunachst flir die Katecholamin- und Enzym­histochemie zur Routinemethode entwickelteGefriertrocknung von Kryostatschnitten (HEENE1968; WINCKLER 1970a, b, c) ermoglicht dieAnfertigung histologischer Dauerpraparate miteinwandfreier Lokalisation intravital appliziertcnNRs.

NR beansprucht neben seiner glinstigenEigenschaft als Dia- und Fluorochrom unserInteresse, weil es aufgrund seiner physikoche-

4 . J. WINCKLER

Der Farbstoff

1) Eigene Angaben unter Verwendung von NRder Firma Merck, Darmstadt.

Tab.1. Loslichkeit von NR (in %) bei 15° C nachGURR (1965).

Athylenglycol- 3,75monoathylather

Wasser 4,00Nelkenol 10,00Glycerin 12,25

0,71,82,13,0

Lipofuscin und Ceroid (GEDIGK und ProCH 1965,Lit.) verzichtet, zumal Lipopigment - u. a. auchhinsichtlich seiner Anfarbbarkeit mit NR - in ver­schiedenen parenchymatosen Organen aile Charak­teristika des Ceroids aufweisen kann. PEARSE (1972)spricht in demselben umfassenden Sinn von <Lipo­fuscins>. Von der Lysosomenmatrix zum Lipopig­ment sind aile Obergange moglich; u. a. hat dieIysosomale Matrix im Tubulusepithel der Ratten­niere schon beim Jungtier lichtmikroskopisch­farberisch Lipopigment-Charakter.

]. Krinol1l: s. S. 57.

NR ist ein kationischer molekulardisperserDiazinfarbstoff (Abb. I). Seine Loslichkeit inverschiedenen Losungsmitteln ist in Tab.1 zu­sammengestellt. In Wasser geht NR vorwiegenddissoziiert, in organischen Losungsmitteln vor­wiegend als <freie Base> (d. h. nicht dissoziiert)in Losung. Der Dissoziationsgrad des Farbstoffsin Wasser ist PH-abhangig; mit steigendem PHnimmt die Loslichkeit in Wasser ab, wahrendgleichzeitig im Ausschuttelungsversuch mitorganischen Losungsmitteln der Obertritt derFarbstoffbase in die nicht-waBrige Phase gefor­dert wird (DRAWERT 1968; Tab.6; vgl. auchENGHUSEN und ENGHUSEN 1961). KIRK (1970)benutzt die Farbbase von NR zur Fettfarbung(Fluorescenzmethode) .

Abb.1. Neutralrot (2-amino-3-methyl-7-dimethyl­amino-phenazoniumchlorid). Molgew. 289. AusHARMS (1965).

Figure 1. Neutral red (2-amino-3-methyl-7-dime­thylamino-phenazoniumchloride). MW. 289. FromHARMS (1965).

XylolAceton1)

AthanolMethanol!)Athylenglycol

(wasserfrei)

Zur Nomenklatur (Lichtmikroskopie)

mischen Eigenschaften und bestimmter pharma­kologischer Effekte als Modellsubstanz furPsychopharmaka yom Typ des Chlorpromazinsgelten kann (KOENIG 1968), deren histotopischeLokalisation auBerordentlich schwierig ist.AuBerdem ist uns aufgefallen (WINCKLER 1972 a),daB NR nach intravenoser Injektion in bestimm­ten endokrinen Zellen akkumuliert wird, dieu. a. durch die Aufllahme und Speicherungbiogener Amine und deren Vorlaufer gekenn­zeichnet sind (s. S. 19). Es ist daher zu prufen, obNR als Modellsubstanz fur biogene Aminebrauchbar ist. SchlieBlich bietet NR als <Granula­farber> die Moglichkeit, die trotz einiger elektro­nenmikroskopischer Untersuchungen noch vol­lig offene Frage zu klaren, inwieweit NR beiVitalfarbung der Ratte <praexistente Granula>(HERZFELD 1917; V. MOLLENDORFF 1920, 1926,Lit.), Lysosomen (DE DUVE 1958, 1969; DEDUVE et al. 1955; DE DUVE und WATTIAUX1966) NR-Krinom (CHLOPIN 1927; WITTE­KIND et al. 1970; REz und KOVACS 1971;WITTEKIND und KRETSCHMER 1972) oder mehroder weniger unspezifisch paraplastische Zell­einschliisse unterschiedlichster Herkunft undNatur anfarbt (vgl. BARGMANN 1967). Auch dieletzte Frage beansprucht nicht nur das Interesseder Morphologen, denn die seit SCHULEMANN(1912, 1920) immer wieder entwickelten Vor­stellungen zur <Entgiftungsfunktion> der NR­Granula werden leichter nachprufbar, wenn esgelingt, die Natur der NR-Speichergranula inden verschiedenen Geweben einwandfrei zuanalysieren.

1. Lysosom1): In unserer Untersuchung werdenwir nicht zwischen primaren und sekundaren Lyso­somen unterscheiden. Auch eine Abgrenzung gegenSame Phosphatase-haltige Sekretgranula (z. B. inReninzellen) wird nicht versucht.

2. Lipopigment: In Anlehnung an PORTA undHARTROFT (1969) wird auf eine Differenzierung von

1) Der Name <Lysosom> (oder <Katalysosom»findet sich erstmalig bei CHAMPY (1913), der damitdurch Osmium anfarbbare lipopigmenthaltige Gra­nula bezeichnet, deren teilweise Identitat mit dennach Vitalfarbung sichtbaren Farbstoffgranula be­tontwird.

VitalHirbung mit Neutralrot . 5

Tab.2. Farbton von NR in Ausschiittelungsversuchen mit Losungsmitteln verschiedener Dielektrizitats­konstanten (DK). Aus HOLLO und DEUTSCH (1926).

Losungsmittel Propanol Athanol

DKFarbton

94blaurot

81rot

31

rotgelb26gelbrot

25 22gelbgriin1) gelb

4griingelb

Tab.3. Neutralrotfiuorescenz in 10 fLm dickenKryostatschnitten 10%iger waBriger Gelatine unter­schiedlicher Farbstoffkonzentration (Hel\£e1d; Er­regerfilter II, Sperrfllter 50 des Zeiss-Fluorescenz­mikroskops).

Gelbfluorescenz nachzuweisen. Mit steigenderFarbstoffkonzentration verschiebt sich der Farb­ton allmahlich nach rot; gleichzeitig nimmt dieFluorescenzintensitat wieder ab (Tab. 3). DerFarbwechsel ist durch das Vorliegcn von NR­Dimeren bei hoherer Konzentration verstand­lich (BARTELS 1956b; BRADLEY 1961; vgl. auchSTRUGGER 1940a); die Annahme unterschied­licher Fluorescenzeigenschaften des dissoziiertenbzw. nicht-dissoziierten Farbstoffmoiehiis(STRUGGER 1940b; TOTH 1952) ist demgegen­tiber recht unwahrscheinlich. Besonders kraftiggefarbte Gewebsstrukturen lassen jede Farbstoff­Fluorescenz vermissen (s. Abb.2, 3); bei An­farbung der Lysosomcn im proximalen Kon­volut der Niere mit NR wird deren normaIer­weise vorhandene kraftige Autofluorescenzvollig iiberdeckt und ausgeloscht (Abb.4, 5). ­Die Bedeutung der fluorescenzmikroskopischenUntersuchung NR-vitalgcfarbten Gcwebes Iiegtim Nachweis geringer Farbstoffmengen, z. B.ist die diffuse Durchtrankung des Cytoplasmasin der ersten Phase der NR-Vitalfarbung nur

Farbstoffkonzen- F btration in % ar ton

1) In eigenen Versuchen lachsrot.

PH der Farblo5ung: NR liegt als Salz d~r Salz­s1ure vor. Die Farbstoffkisungen sind deshalbsauer. Der PH der NR-Losung in Wasser istabhangig von der Farbstoffkonzentration: DieI%ige NR-Losung hat einen PH um 2,7, dieo,l%ige NR-Losung von 3,3-4,3, die o,ol%igeNR-Losung von 4,3-5,5 und die o,ool%igeNR-Losung von 5,1-6,0 (DRAWERT 1968,Tab.3). Diese Werte streuen erheblich aufgrundder Verunreinigungen der verwendeten Farb­stoffcharge und dem Alter der Farbstofflosung(NISTLER 1929; DRAWERT 1968; BARBOSA undPETERS 1971). Die l%ige Losung des von unsverwendeten NR hat einen PH von 2,9, diel%ige NR-Losung in Ringer einen PH von 3,3(EinfluB von Salzen auf den Dissoziationsgradder NR-Molehile). - Der PK von NR wird mit6,75 angegeben (KOLTHOFF 1924).

Farbe VOIl NR. NR wird vielfach als pH-Indi­kator verwendet (WIERCINSKI 1955, Lit.;STOCKINGER 1964, Lit.). Es zeigt in waBrigersaurer L6sung weinrote, in alkalischem Milieubraungelbe bis gelbe Farbe. Die Brauchbarkeitder NR-Vitalfarbung als Indikatorfarbung wirdjedoch dadurch eingeschrankt, daB NR meta­chromatisch farben kann (LISON 1935, 1941)und in unterschiedlichen Losungsmitteln unter­schiedliche Farbtone zeigt (HOLLO und DEUTSCH1926; s. Tab. 2). REALE und LUCIANO (1970) be­richten iiber betrachtliche Differenzen der NR­<Indikatorfarbung> und elektrometrischen PH­Bestimmungen in Gewebsblocken. - NR ist einrelativ schwaches Fluorochrolll (STRUGGER 1940b;KOLBEL 1948; TOTH 1952; BARTELS 1956b).Eigene Versuche (vgl. auch BARTELS 1956b)zeigen, daB die Fluorescenzfarbe weitgehendkonzcntrationsabhangig ist. In 10 f.lm dickenKryostatschnitten NR-gefarbter Gelatine ist NRin Konzentrationen von 0,0015% an durch

0,001 50,0030,006 bis 0,012

0,0250,050,10,51,02,0

gelbgelbzunehmendkraftiger gelbbuttergelbgelb-orangeorangeorange-rotrotrot

F1uorescenz­intensitat

(+)++ bis++

++++++++++++++

6 . J. WINCKLER

Abb.2. NR-VitaWirbung. Ratte. 3 min nach Farbstoffgabe. Fluorescenzmikroskopie. Pankreas. Die Fluo­rescenz in einer - bei Betrachtung im Mischlicht tiefrot gefarbten (vergl. Abb. 13) - Langerhansschen Inselist weit schwacher als in exokrinen Driisenabschnitten. Dort f1uorescieren bevorzugt die Sekretgranula (vergl.Abb. 3). 2Iofach.Abb.3 wie Abb.2. 60 min nach Farbstoffgabe. Die Langerhansschen Inseln zeigen jetzt intensive NR­Fluorescenz. 1m Mischlicht sind sie weitgehend entfarbt. 2Iofach.

Figure 2. NR vital staining. Rat. 3 min following the dye injection. Fluorescence microscopy. Pancreas. TheNR-f1uorescence of a deep purple stained Langerhans islet is less intensive than that of the exocrine glandparenchyma. Here the secretory granules exhibit strong NR-f1uorescence. Magn. X210.Figure 3 as Figure 2, but 60 min following the injection of the dye.While having lost most of its NR stainingthe NR fluorescence shows a remarkable increase of intensity. Magn. X 210.

fluorescenzmikroskopisch sichtbar zu machen(s. S. 17).

Toxizitiit von NR. Verglichen mit anderenVitalfarbstoffen ist NR als relativ ungiftig zubezeichnen (ALLISON und PATON 1965; BAR­BOSA und PETERS 1971, Lit.). GL.ASSNER et al.(1925) und WINKELSTEIN und MARCUS (1929)haben NR deshalb auch fiir diagnostischeZwecke in der Humanmedizin vorgeschlagen(s. S. 52). Bei Ratten kann NR iiber Monatehinweg in einer Dosis von 1/5der LD 50 (s. u.)­das ist die Farbstoffmenge, die wir injizieren ­2 mal wochentlich ohne erkennbare Schadenverabfolgt werden (STOLARSKY und HALEY 195I).

Toxische Wirkungen des NR sind jedoch un­bestreitbar. WIEDE und MEYER (1955) charak­terisieren NR als einen Farbstoff mit Spattoxizi­tat; eigene Beobachtungen (s. S. 63) bestatigendies. Bei Ratten liegt bei i. v. Gabe von NR dieLD 50 bei 112 mg/kg Korpergewicht (STOLARSKYund HALEY 1951). Der Tod erfolgt durch zen­trale Krampfe (s. auch KOENIG 1968), respira­torisches und Herzversagen (partieller Herz­block). Weitere Wirkungen sind Antiheparin­wirkung, Blutdrucksenkung (HALEY undLEITCH 1953), Storungen des Glukosemetabolis­mus (OKUDA und GROUMAN 1966; PERINGSet al. 1968; s. S. 39) und phototoxische Eigen-

Vital£arbung mit Neutralrot . 7

Abb.4. Autofluorescenz der Lysosomen der Rattenniere. 360fach.Abb.5. NR-Vital£arbung, Ratte. 30 sec nach Farbstoffgabe. Fluorescenzmikroskopie. Niere. Diffuse Durch­trankung des Cytoplasmas der Epithelzellen samrlicher Harnkanalchen. Die Farbstoffakkumulation in Lyso­somen des proximalen Konvoluts (pfeile) unterdriickt deren Autofluorescenz (vergl. Abb.4, 6 und 32-34).300fach.

Figure 4. Autofluorescence of the lysosomes of a rat kidney cortex. Magn. X 360.Figure 5. NR vital staining. Rat. 30 sec following the injection of the dye. Fluorescence microscopy. Kidney.Diffuse staining of the cytoplasm of the epithelial cells. The accumulation of the dye in lysosomes of theproximal convolution extinguishes their autofluorescence (arrows). Magn. X 300.

schaften (POLITZER 1924a, b, 1953; POLITZERund STOCKINGER 1954; STOCKINGER 1964;ALLISON und PATON 1965; WITTEKIND undRENTSCH 1967). Angaben tiber die Zellatmungnach NR-Gabe findet man bei KIYONO et al.(1938). Die Inhibition von Enzymen wird vonZACKS (1964: Cholinesterase), KOENIG (1968:Cholinesterase) GOMBA et al. (1966: saure Phos­phatase) beschrieben. MORGAN (1958) fmdetdemgegentiber nach NR-Vitalfarbung imPankreas normale Amylaseaktivitat und unver­minderte Proteinsynthese.

Methodische UntersuchungenDiese Untersuchungen wurden durchgeflihrt,

um die histologische Aufarbeitung des Gewebes

nach NR-Vitalfarbung zu vereinfachen und zuverbessern und um Aufschhisse tiber das Zu­standekommen und die Art der vitalen Farb­stoffbindung - besonders an die Lysosomen­matrix - zu erhalten. Daneben interessierte unsNR als ein Modell fur Studien der Lokalisationwasserloslicher Verbindungen im Gewebe unterden verschiedenen Bedingungen der Gewebs­aufarbeitung und Fixierung.

a) Die Lokalisation vital appliziertenNRs im konventionell hergestelltenParaf6n- nnd Kryostatschnitt

Am Paraffinschnitt ist, wie man seit Einflihrungdes NR in die Mikroskopie (EHRLICH 1894)weiB, kein vital an Gewebsstrukturen angelager-

8 . J. WINCKLER

ter Farbstoff nachweisbar. Die BETHE-DOGIEL­Methode der Fixierung vor Methylenblau invital gefarbtem Gewebe (BETHE, 1896; ROMEIS1968; § 1979) erweist sich fur NR als wirkungs­los. - Auch am durch Auftauerz lIIorztierterzKryostatschrzitt ist vital appliziertes NR weit­gehend diffundiert. SCHMIDT (1962) u. a. habendaraus auf das Fehlen einer granularen Farb­stoffbindung in der Mauseniere geschlossen.Relativ ortstandig bleibt NR an Mastzellgranulagebunden, wahrend es - in der Reihenfolge derAufzahlung - zunehmend diffundiert: Lipopig­ment (ZNS, Niere), Lysosomen des proximalenKonvoluts der Niere, Lysosomen der Leber,Lysosomen der Schilddruse, Cytoplasmafar­bung endokriner Zellen (s. S. 19). Wegen derDiffusion des Farbstoffs im aufgetauten Kryostat­schnitt ist der Versuch einer Schnittfixierungwenig aussichtsreich.

Anders ist es bei der Verwendung ge!rierge­trockrzeter Kryostatschrzitte. Hier unterbleibt eineVerlagerung von NR. Offenbar kommt es zurFarbstoffdiffusion erst, wenn Kryostatschnitteaufgetaut werden (s. a. Katecholamine: HEENE1968; WINCKLER 1970b; WINCKLER und HEM­PEL 1971 und Tetracycline: WINCKLER undWESTPHAL 1973). Das Einfrieren des Gewebesfuhrt dagegen zu keiner - lichtmikroskopischfaBbaren - Substallzverlagerung (s. dagegenALLISON und YOUNG 1969).

KOENIG (1968) hat im AnschluB an die NR­Vitalfarbung mit 4%igem Formaldehyd durchPerfusion fixiert und am Kryostatschnitt einegute Lokalisation des Farbstoffs in Lysosomengefunden. In eigenen Versuchen kam dieses Ver­fahren mit unterschiedlichem Erfolg zur An­wendung: die Lokalisation des Farbstoffs inLysosomen der Niere gelingt reproduzierbar,wahrend z. B. in Leber und Schilddruse derGefriertrocknung vergleichbare Befunde derNR-Lokalisation nicht erhalten werden.

Bei GOLOVINE (1902) und GATENBY (193 I)finden sich Hinweise aufeine NR-Fallung durchSublimat. Da dies fur die ElektronenmikroskopieNR-vitalgefarbten Gewebes interessant ist,wurden die Angaben experimentell licht- undelektronenrnikroskopisch nachgepruft. Wederder HgC12-Zusatz zur Fixierlosung bei Immer-

sionsfixierung noch der Versuch, durch i. v.Injektion von o,s%iger Sublimatlosung inRinger eine NR-Fallung in situ zu erreichen, urndie NR-Extraktion durch die nachfolgendehistologische Aufarbeitung zu unterbinden,waren erfolgreich. Eine Relation der elektronen­mikroskopisch am nichtkontrastierten Schnittsichtbaren Quecksilberprazipitate zu NR-ge­farbten Strukturen war nie vorhanden. Trotz­dem kann eine Reaktion zwischen NR undSublimat nicht ausgeschlossen werden (s. GOLO­VINE 1902), die jedoch hinsichtlich der Fixierungdes Farbstoffs keine Wirkung hat.

b) Versuche zur Stabilisieruug derNR-Vitalfarbuug am gefrier­getrockneten Kryostatschnitt

I. Aufziehen der gefriergetrockneten Kryostat­schnitte mit wafJrigen und nicht-wafJrigerz Medien(vgl. WINCKLER 1970C), die (nach Bedecken derSchnitte mit Deckglaschen) lichtmikroskopischbeurteilt werden.

WaBrige Medien

4%ige FormaldehydlOsung, Baker-Formol, l%igewaBrige oder mit 0,1 M Phosphatpuffer auf PH 7,2gebrachte OsO.-Lasung, IO%ige Phosphormolyb­dansaure.

Ergebnis: In allen Versuchen bleibt ein Teildes nach Vitalfarbung ans Gewebe gebundenenNR ortsrichtig nachweisbar. Eine NR-Fixierungerfolgt nicht; in jedem Fall wird der Farbstoffin der aufsteigenden Alkoholreihe (Isopropanol)herausgelost. Es bestehen keine erkennbarenUnterschiede zwischen den verwendeten Fixier­losungen.

Nicht-waBrige Medien

Methanol, Athanol, Isopropanol, Butanol, Ace­ton, Ather, Chloroform, Xylol, Durcupan@,Entellan@, Celloidinlasung (0,4 g Celloidin in Ather:Athanol: Methanol 40: 40: 20). Die in die Celloidin­lasung eingebrachten Schnitte werden nach Ein­trocknen der Lasung mit Entellan eingedeckt unddann beurteilt.

Ergebnis: Bei Einbringen gefriergetrockneterKryostatschnitte vitalgefarbten Gewebes in

Xylol, Chloroform, Ather, Athanol, Isopro­panol, Butanol wird keine Farbstoffdiffusion ausLysosomen beobachtet. Nach Einbringen derSchnitte in EnteUan® und das CeUoidingemischwird eine leichte, nur fluorescenzmikroskopischerkennbare Farbstoffdiffusion beobachtet. InDurcupan® kommt es zu einer protrahierten,nach 24 Std. fast voUstandigen Farbstoffdiffusionaus dem Gewebe. Aceton fLihrt zu einer par­tieUen Entfarbung der Schnitte und zu einemFarbumschlag nach Weinrot, Methanol zu einervoUstandigen Entfarbung der Schnitte. - Wasser­zusatz zu den organischen Solventien, die aUeinkeine erkennbare Farbstoffextraktion bewirken,fLihrt rasch zu einer vollstandigen Entfarbungder Schnitte. Entsprechend wirkt die absteigendeAlkoholreihe, wobei die NR-Extraktion aus demSchnitt in 60- und 50%igem Isopropanol amausgepragtesten ist. Die NR-Farbung vonLipopigment halt sich dabei relativ am langsten.

2. Die Wirkung der DaJllpffiximlllg gefrier­getrockneter Kryostatschnitte auf die Stabilitatder NR-Vitalfarbung.

Geprtift wurden Formaldehyddampfe (aus trok­kenem Paraformaldehyd; Exposition 1 oder mehrereStunden bei Zimmertemperatur), Joddampfe (OVER­TON 1890; Exposition tiber Jodkristallen im Ther­mostaten bei 45° C zur Ausbildung einer leichtenGelbfarbung der Schnitte) und Os04-Dampfe(Exposition tiber Os04-Kristallen bei 35° C bis zurAusbildung einer leichten Graufarbung der Schnitte).

Ergebllis: Die Jodbedal11pfung ist fLir eineStabilisierung des Farbstoffs il11 Schnitt unwirk­sam. Die OsmiumfIxierung zeigt eine geringeNR-stabilisierende Wirkung, die - besondersnach Montage der Schnitte im Celloidinge­misch - eine leicht verringerte Extraktion desFarbstoffs in der absteigenden Alkoholreihe er­kennen la/k Daneben ist die gewebsfIxierendeWirkung wasserfreier Osmiumdampfe gLinstig­im Gegensatz zur Wirkung der DampffIxierungdurch waBrige OSl11iumlosungen auf gcfrier­getrocknetes Gewebe (WINCKLER 1970c). DieFormaldehydbedampfung gefriergetrocknetenGewebes hat den deutlichsten Effekt: die Diffu­sion des Farbstoffs in Entellan® (s. 0.) wird weit­gehend unterbunden und halt sich auch nachMontage im Celloidingemisch in vertretbarem

Vitalfarbung mit Neutralrot . 9

Rahmen. Die NR-Fluorescenz der Gewebe istdeshalb nach Formaldehydbedampfung derSchnitte besser lokalisiert und erscheint inten-sIver.

In Celloidin montierte gefriergetrocknete,formaldehydbedampfte Kryostatschnitte kon­nen - bei geringem Verlust des vital an Lyso­somcn gebundenen NRs - durch die absteigendeAlkoholreihe in waBrige Farbstofflosungen(z. B. Methylenblau) fur Gegenjarbullgell einge­bracht werden. Jedoch geht bei der anschlieBen­den Entwasserung in der aufsteigenden Alkohol­reihe NR (mit Ausnahme des an Lipopigmentgebundenen Farbstoffs) in Losung, so daB esvorteilhafter ist, diese Schnitte in Karion F oderahnlichem einzudecken.

c) Modellversuche zur direktenReaktion waBriger, nicht-waBrigerund gasformiger Fixantien mit NRin gefarbtem Filterpapier

Keines der von uns gepruften Fixantien (s. 0.)reagiert mit NR in der Weise, daB die Extrak­tion des Farbstoffs durch 50%ige Aceton- bzw.Athanollosung erkennbar verzogert wird. Farb­wechsel des NR wahrend des Einwirkens derverschiedenen Fixantien sind in Wasser bzw.nach Trocknung der Filterpapierstreifen wiederdickgangig zu machen.

d) Schnittfarbung verschiedenerGewebe mit NR, Methylenblau undPAS

Gefarbt wurden unflxierte und mit 4%igerFormaldehydlosung nachfixierte Kryostat­schnitte und gefriergetrocknete, formaldehyd­bedampfte Kryostatschnitte von samtlichen aufS.16 genannten Organen der Ratte. Zusatzlichwurden Kryostatschnitte von blockflxiertenNiercn (in Baker-Formol oder 6%igem Gluta­raldehyd) mitgefarbt.

1. NR-Farbung am histologischenSchnitt (Tab. 4)

Verwendet wurde waBrige I%ige NR-Lasunga) ungepuffert (Lasung I, PH 2,9), b) mit 0,1 mol

10 • J. WINCKLER

Phosphatpuffer auf PH 7,3 eingestellt (Losung II).Die alkalische Losung ist durch Ausfallung desFarbstoffs nur ca. o,I%ig und farbt entsprechendschwacher.

Ergebnis: Die Schnittfarbung mit NR inwaBriger ungepufferter Losung farbt dieselbenStrukturen wie Methylenblau in waBriger unge­pufferter Losung, u. a. Zellkeme, Ergasto­plasma, Mastzellgranula, Knorpelgrundsub­stanz. Lysosomen der Niere werden lediglichnach Blockfixierung angefarbt; diese Lyso­somenfarbung ist in der Alkoholreihe und selbstnach Lufttrocknung und direktem Eindeckender Schnitte in Xylol oder Entellan weitgehendextrahierbar.

Losung II (PH 7.4) farbt Mastzellgranula undKnorpelgrundsubstanz; das Cytoplasma allerZellen wird schwach angefarbt, die Keme blei­ben ungefarbt. Deshalb erscheint die Lyso­somenfarbung, die wiederum nur nach Block­fixierung beobachtet wird, starker als nach Far­bung mit Losung I; auch hier ist NR in derAlkoholreihe und - nach Lufttrocknung - inXylol oder Entellan extrahierbar. - Lipopig­mente des ZNS und der Niere sind stets starkerangefarbt als die Lysosomen dieser Organe.

Lysosomen anderer Organe (z. B. Leber,Schilddriise) sind weder mit Losung I noch mit IIanzufarben. Die Affinitat von NR zu univaku­olarem Fett ist in keiner der beiden Losungenausgepragt und auch nach Farbung mit Losung IInur fluorescenzmikroskopisch auszumachen (s.KIRK 1970).

Beim Vergleich der Anfarbung der Lyso­somen durch NR nach Schnittfiirbung und nachVita/fiirbung ist neben der unvollstandigerenDarstellung der Lysosomen verschiedener Or­gane nach Schnittfarbung der entscheidendeUnterschied die Extrahierbarkeit des Farbstoffsaus dem dehydrierten Gewebe: Nach Vital­farbung bleibt NR in Xylol und Entellan zumgroBten Teil an Lysosomen gebunden, wahrendder Farbstoff nach Schnittfarbung und Luft­trocknung in Xylol bzw. Entellan weitgehendin Losung geht. Die einfachste Erklarung ist,daB NR bei Schnittfarbung - wahrscheinlichvorwiegend als freie Base in physikalischerLosung - an extrahierbare Lipoide gebunden ist,wahrend bei Vitalfarbung eine elektrostatischeFarbstoffbindung an weniger leicht extrahier­bare und durch Formaldehyd teilweise stabilisier­bare Lipoide vorliegt (s. u.).

Tab.4. NR-Farbung der Lysosomen des proximalen Hauptstiicks der Rattenniere am Kryostatschnitt inAbhangigkeit von der histologischen Aufarbeitung. Der nach Blockfixierung an Lysosomen angelagerteFarbstoff ist in der Alkoholreihe vollstandig extrahierbar. Werden luftgetrocknete Kryostatschnitte an­scWieBend an die Farbung direkt in Entellan eingedeckt, bleibt lediglich nach Calcium-Formol-Blockfixierungan Lysosomen gebundenes NR in Spuren nachweisbar. Vgl. Tab. 5.

Kryostatschnitte

gefriergetrockneter Schnitt; Schnitt nach Block-Farblosung

unfixierter mit nach Formaldehyd- fixierung mitSchnitt Ca-Formol bedampfung aufgezogen innativen nachfixierter

Gewebes Schnitt Celloidin- Glutaral-losung l )

Methanol Ca-Formol dehyd

I%ige 0 0 der ganze o bis (+) +bis+++ (+)ungepufferte Lipopigment Schnitt bleibtNR-Losung (+) ungefarbtPH 2,9

o,I%ige 0 0 der ganze 0 + bis ++ (+)gepufferte Lipopigment Schnitt bleibtNR-Losung (+) ungefarbtPH 7,3

I) 0,4 g Celloidin in Ather:Athanol:MethanoI40:40:20.

VitaWirbung mit Neutralrot . II

Tab.5. Methylenblau£arbung der Lysosol1len des proxil1lalen Hauptstiicks der Rattenniere am Kryostat­schnitt (ungepufferte o,r%ige Losung, PH 3,4) in Abhangigkeit von der histologischen Au£arbeitung. Dernach Ge£riertrocknung und Blockfixierung an Lysosol1len angelagerte Farbstoff wird in der Alkoholreihebzw. nach Eindecken von in Anschlu13 an die Farbung luftgetrockneten Kryostatschnitten direkt in Entellannur geringgradig herausgelost.

Unflxierter Mit Ca-FormolGe£riergetrockneter Schnitt;

nach Formaldehydbedamp£ung Schnitt nach Blockfixierung inSchnitt nachfixierter au£gezogen innativen Schnitt

Gcwebes Celloidinlosung1) I Methanol Ca-Formol I Glutaraldehyd

0 0 +++ ++ ++ +++Lipopigment

(+)

1) 0,4 g Celloidin in Ather: Athanol: Methanol 40: 40: 20.

2. Lysosomenfarbung am histologischenSchnitt mit Methylenblau

Ein Vergleich der Tab.4 und 5 zeigt, daB dieLysosomenfarbung am histologischen Schnittmit NR I/icht reprasentativ fiir kationische Vital­farbstoffe ist. Methylenblau (kationischer Thia­zinfarbstoff; gefarbt wurde mit einer o,I%igenwaBrigen Losung) farbt Lysosomen am histo­logischen Sclmitt sehr viel intensiver als NR.Die Farbstoffextraktion in der Alkoholreihebzw. in Xylol und Entellan ist nicht so ausge­pragt. Auch bei Schnittfarbung wird dieserFarbstoff offensichtlich elektrostatisch an eineflxierbare Komponente der Lysosomenmatrixgcbunden. Wahrend die NR-Vital-und Schnitt­farbung von Lysosomen wenig miteinander ge­meinsam haben, liefert die NR-Vitalfarbungund die Methylenbbufarbung desselben Schnittshaufig vergleichbare Ergebnisse (Abb.6, 7). Inverschiedenen Organen ist jedoch auch mitMethylenblau keine der NR-Vitalfarbung ent­sprechende Lysosomenfarbung am histologi­schen Schnitt zu erzielen (z. B. Schilddriise).Auch nach vorausgegangener Oxydation (PIL­GRIM, pers. Mitt.) oder Beizung (PUGH undWALKER 1965; PUGH 1967) erfaBt die Schnitt­farbung mit basischen Farbstoffen die Lyso­somen nur partiell.

3. PAS-Farbung der Lysosomen amhistologischen Schnitt

(Vgl. LEBLOND 1950; DAVIES 1954; NOVI­KOFF 1961, Lit.; KOENIG 1962): Durch die PAS-

Reaktion werden dieselben Lysosomen gefarbt,die mit Methylenblau anzufarben sind, vgl.Tab.8. Da auBerdem fur den positiven Ausfallder PAS-Reaktion dieselbe Gewebsvorbehand­lung notig ist wie fur die Anfarbung mit Me­thylenblau, ist wahrscheinlich fur die Basophilieund die PAS-Reaktion die gleiche Komponenteder Lysosomenmatrix verantwortlich. - Ab­schlieBend sei betont, daB unvollstandige Dar­stellung der Lysosomen am histologischenSchnitt durch NR, Methylenblau und PAS nichtauf eine Zerstorung der Lysosomen wahrendder histologischen Aufarbeitung zuruckzu­£Lihren ist. Zumindest nach Blockflxierung(vgl. HOLT 1959) und am gefriergetrocknetenKryostatschnitt (WINCKLER 1970c; 1972b) sindsie durch den Nachweis lysosomaler Hydrolasenvollstandig darstellbar.

e) Schnittfarbung vitalgefarbtenGewebes nach AOYAMA (1929)

Einige Untersucher (Lit. s. S. 32) nehmen an,daB durch die Impragnation nach AOYAMA (1929)jene Strukturen am Schnitt sichtbar gemachtwerden konnen, die mit NR vitalgefarbt wer­den. Da dies nie iiberpruft wurde, haben wir anzahlreichen Organen den Ausfall der NR-Vital­farbung am gefriergetrockneten Kryostatschnittmit dem Ergebnis der AOYAMA-Impragnationverglichen. Es bestatigt sich, daB eine voraus­gegangene Vitalfarbung die Impragnierbarkeitder peribilaren Korperchen der Leber erleichtert(MORGAN et al., 1966); sie werden kraftiger und

12 • J. WINCKLER

Abb.6. NR-VitaWirbung. Ratte. I min nach Farbstoffgabe. LysosomenHirbung des proximalen Hauptstucksder Niere. X = MitteIstuck. 360fach.Abb. 7. Dieselbe Stelle des Praparats wie in Abb. 6. Der Schnitt wurde in waBriger MethylenblaulOsung nach­gefarbt. Die durch Vital- und Schnittfarbung dargestellten Lysosomen sind weitgehend identisch. X = Mittel­stuck. 360fach.

Figure 6. NR vital staining. Rat. I min following the injection of the dye. Staining of lysosomes in the renalproximal convolution. X = Distal segment. Magn. X 360.Figure 7. The same area as in Figure 6. The section now is post-stained in aqueous solution of Methylene blue.The Iysosomes stained intra vitam with NR are rather identical with those that are stained in tissue section withMethylene blue. X = Distal segment. Magn. X 360.

vollstandiger geschwarzt als beim Kontrolltier.Doch ist weder im Pankreas noch in der Leberdie vorausgegangene NR-Injektion die unbe­dingte Voraussetzung flir eine Impragnierungdieser Strukturen. Die <erleichterte> Impragnier­barkeit peribiliarer Korperchen ist noch 24 hnach NR-Gabe zu beobachten (Abb.8), zueinem Zeitpunkt, an dem die Leber keine NR­gefarbten Grana mehr aufweist und die vonALOUSI et al. (1968) nach NR-Gabe elektronen­optisch beobachteten Autophagosomen volligverschwunden sind. Der Wert der AOYAMA­Technik als Nachweis flir NR-vitalgefarbteStrukturen wird weiter eingeschrankt durchBefunde an anderen Organen: In der Niere

stellen sich - mit und ohne vorausgegangeneNR-Injektion und unabhangig vom Intervallzwischen Farbstoffgabe und Gewebsentnahme ­die Lysosomen des proximalen Hauptstlicksstets unvollstandig dar (vgl. Abb.9). In derSchilddrlise werden - ungefarbte oder NR­vitalgefarbte - Lysosomen nie impragniert;stattdessen kommt es hier zu einer distinktenAnfarbung des Golgiapparats. Weder der Farb­stoff selbst noch der Ort der vitalen Farbstoffbindungwerden damit zuverliissig impriigniert. Versucheder AOYAMA-Impragnierung nach Trypanblau­Vitalfiirbung zeigen liberdies, daB die <erleich­terte> Impragnierbarkeit peribiliarer Korper­chen ein ganz unspezifischer Effekt ist, der auch

VitaWirbung mit Neutralrot . 13

Abb.8. AOYAMA-Impragnation der Rattenleber 24 Std. nach NR-Vitalfarbung. Nahezu vollstandige Dar­stellung der peribiliaren Lysosomen und v. Kupffer-Zellen. 300fach.Abb.9. AOYAMA-Impragnation der Rattenniere 60 min nach NR-Vitalfarbung. Unvollstandige Lysosomen­farbung im proximalen Hauptstlick; kraftige Schwarzung der Epithelzellen in Mittelstiicken und Sammel­rohren. 300fach.Figure 8. AOYAMA-impregnation of rat liver. 24 h following NR vital staining. Nearly selective staining ofperibiliary and Kupffer celllysosomes. Magn. X 300.Figure 9. AOYAMA-impregnation of rat kidney. 60 min following NR vital staining. Incomplete lysosomalstaining in the proximal convolution. Intensive blackening of the cytoplasm of epithelial cells in the distaltubules and collecting ducts. Magn. X 300.

durch andere Farbstoffe als NR (und wahr­scheinliche viele andere Noxen) erzielt werdenkann. Das NR-Kril1olll ill Kryptellzellm desDar/lis (s. S. 57ff.) ist mit der AOYAMA-Techniknicht zu impdignieren.

f) Folgerungen aus den methodischenUntersuchungen

1. Zur Methodik der histologischenAufarbeitung des mit NRvitalgefarbten Gewebes

Die verschiedenen Versuche belegen die be­grenzten Moglichkeiten einer Fixierung wasser-

und lipidloslicher Verbindungen. Fur NR gibtes nur zwei Moglichkeiten eines ortsrichtigenNachweises des Farbstoffs im histologischenSchnitt: I. Das Gewebe wird in toto gefrier­getrocknet, anschlieBend in Paraffin eingebettet

und geschnitten (LACY und BLUNDELL 1955).

2. Erheblich einfacher ist die Gefriertrocknung

von Kryostatschnitten, die anschlieBend direktin Entellan eingedeckt werden. Am aufgetauten

Kryostatschnitt und am Quetschpraparat von

Frischgewebe sind keine Aussagen tiber die

intrazellulare Lokalisation des Farbstoffs mog­

lich. Die AOYAMA-Technik ist als Nachweis­methode NR-vitalgefarbter Strukturen und desNR-Krinoms ungeeignet.

14 . J. WINCKLER

Durch Formaldehydgas-Fixierung gefrier­getrockneten Gewebes - wahrscheinlich durchFixierung der NR-bindenden Strukturen - isteine Verlagerung des an Gewebsstrukturen an­gelagerten Farbstoffs in Xylol und Entellanweitgehend ausgeschlossen. Ein direkt am Farb­stoff im Sinn einer NR-Fallung angreifendesFixans ist jedoch derzeit nicht verfugbar. Dierasche Extrahierbarkeit des Farbstoffs wahrendder Dehydrierung von Gewebe in organischenSolventien und die langsame, aber vollstandigeExtraktion von NR in Durcupan® lassen Unter­suchungen der ultrastrukturellen Lokalisationmarkierten Farbstoffs selbst unter Einsatz derGefriertrocknung als wenig aussichtsreich er­scheinen.

2. Zur Farbstoffbindung an dieLysosomenmatrix

Die elektrostatische Bindung vital applizier­ten NRs an saure Gruppen der Lysosomenmatrixist experimentell gut belegt (COHN und WIENER1961; ALLISON und YOUNG 1964, 1969; DINGLEund BARRETT 1969; KOENIG 1969, Lit.). Die ins­gesamt unbefriedigendenVersuche einer Schnitt­farbullg von Lysosomen mit NR lassen sichweitgehend aus der Annahme erk!aren, daB dieNR-bindende Komponente der Lysosomen­matrix wahrend der Gewebsaufarbeitung extra­hiert wurde. Die begrenzt stabilisierende Wir­kung der Formaldehydbedampfung gefrierge­trockneten Gewebes auf die NR-Lokalisationnach Einbringen in wasserfreie Solventien wer­den auf die Stabilisierung der NR-bindendenKomponente zuruckgefuhrt. Dieser Effekt derFormaldehydbedampfung (vgI. JONES undGRESHAM 1966) und die rasche Extrahierbarkeitder NR-Vitalfarbung in waBriger Acetonlosung(vgI. ELLEDER und LOJDA 1971) sind Hinweisedafiir, eine vitale NR-Bindung an polare Lipoideder Lysosomenmatrix anzunehmen. Damitunterstreichen unsere Befunde das Ergebnis derUntersuchung von DINGLE und BARRETT (1969).Die von diesen Autoren isolierte NR-bindendeKomponente ist in Methanol-Chloroform undTriton XlOO lOslich, basophil, sudanophil undPAS-reagibeI.

Der Nachweis basophiler und PAS-reagiblerGruppen bei Schnittfarbung macht deutlich,daB diese auch neben der NR-bindenden Sub­stanz, die (s. 0.) wahrend der Gewersaufarbei­tung weitgehend extrahiert wird, in Lysosomenvorhanden sein mi.issen. Wir halten fiir unwahr­scheinlich, daB die PAS-Reaktion dabei mit denlysosomalen Hydrolasell erfolgt, die als basischeGlykoproteide (ZEYA et aI., 1966) als Reaktions­partner diskutiert werden (KOENIG 1969). Denndie PAS-Reaktion wird erst Ilach Formaldehyd­bedampfung gefriergetrockneter Schnitte - unddann nur bei einem kleineren Teil aller Lyso­somen - beobachtet, wahrend der histochemi­sche Nachweis saurer Hydrolas~n auch ohneFormaldehydbedampfung am gefriergetrock­neten Kryostatschnitt in der Regel gut lokali­siert gelingt (WINCKLER 1970c, 1972 b). - Ausdemselben Grund erscheint eine NR-Bindungvital applizierten NR an Enzyme nicht sehrwahrscheinlich. Diese auf MARSTON (1923) zu­ruckgehende Annahme von KOEHRING (1930)und KEDROWSKI (1931, 1933) wird von KOENIG(1969) wieder aufgegriffen, der unter anderel1leine NR-Bindung an Sulfhydrilgruppen derEnzymmolekule diskutiert. Am histologischenSchnitt gibt es keinen Hinweis fi.ir eine soIeheBindung. Die hauftg auffallige Lokalisation vitalapplizierten NRs an Hydrolase-reichen Struk­turen, die die Annahme von KOEHRING (1930)zunachst zu bestatigen scheint, !aBt sich wahr­scheinlich aus einer Bindung des Farbstoffs an die­selbe Matrix erklaren, die auch zur Bindung derEnzymmolekule befahigt ist (vgI. KOENIG 1969).

Die Diskrepanzell zwischen der Lokalisationvon NR bei Vital- und Schnittfarbung und derunterschiedliche Modus der Farbstoffbindungsind betrachtlich. Es ist nicht moglich, vomErgebnis einer Schnittfarbung das Ergebnis derVitalfarbung vorauszusagen. Rrns und GERSCH(1936; vgI. auch KIYONO et aI., 1938) ist deshalbbei ihrer Aussage zuzustimmen: <Das Ladungs­mosaik der ftxierten Praparate lieB keine Be­ziehung zum pwMosaik der lebenden Zelleerkennen (S. 32).> Wir mochten hinzufugen,daB diese Diskrepanz aufgrund des groBerenSubstanzverlustes am unfixierten Gewebsschnitteher groBer sein muB.

Tierversuche

Material und Methoden

Nelltralrot. Die Versuche wurden mit Neutralrot(NR) von MERCK (Darmstadt) - Art. 1369 - durch­gefiihrt. BARTELS (I956a) hat bei einer NR-Chargedieser Firma 7% Verunreinigung gefunden. AuchWITTEKIND (1971) hat elektrophoretisch in der vonuns verwendeten Charge mehrere farbgebendeKomponcnten aufgetrennt. Da nach seiner Erfah­rung die Verunreinigungen das Ergebnis der Vital­farbung mit NR nicht erkennbar beeinflussen,scheint uns die Verwendung des ungereinigten Farb­stoffs vertretbar zu sein. Wir haben den Farbstoffin Ringerlosung fUr Warmbliiter als I,5%igeLosung angesetzt (zur Bedeutung physiologischerSalzlosungen flir die Losung von Vitalfarbstoffenvgl. GATENBY 193 I), unter Riihren auf ca 600 C er­hitzt und durch Papierfilter gefiltert. Etwa 1/3 desFarbstoffs werden dabei als hohermolekulare Farb­stoffaggregate abgefangen, so daB eine I%ige Lo­sung resultiert. Vor jedem Versuch wurde die Farb­stofflosung frisch angesetzt, da altere Losungenhaufig veranderte Eigenschaften zeigen und toxischersein sellen (NISTLER 1929; DRAWERT 1968, S.I07,138; BARBOSA und PETERS 1971). Die Injektion derkorperwarmen NR-Losung erfolgte in die Schwanz­vene von Ratten. Dosierung: I ml der Losung auf100 g Korpergewicht (KG). Dauer der Injektion:~~. 30 sec. Die Tiere wurden dabei in maBig tieferAther-Urethan-Narkose gehalten (I ml einerlO%igen Urethanlosung in Ringerlosung 15-20 minvor Versuchsbeginn i. p.; bei Bedarf wahrend derInjektion zusatzlich ein leichter Atherrausch). Diekombinierte Narkosc ist der reinen Athernarkoseiiberlegen, weil sie die sonst nicht selten beobach­teten durch NR ausgelosten zentralen Krampfe mitAtemstillstand unterdriickt (STOLARSKY und HALEY1951; HALEY und LEITSCH 1953; KOENIG 1968). InVorvcrsuchen wurde gesichert, daB Urethan dasErgebnis der Vitalfarbung nicht beeinfluBt.

Trypanblall. (CHROMA, Stuttgart-Untertiirkheim)wurdc als I%ige Losung in Ringer, bei einer Ober­lebenszeit iiber 6 Std. intraperitoneal verabfolgt(2 ml pro 100 g KG).

Die Versuche wurden an Wistarratten eigenerZucht durchgefiihrt (insgesamt 263 Tiere). Die Tierewurdcn im klimatisierten Tierstall (240 C; Kunstlichtvon 7-1900) gehalten und erhielten Altromin®Standarddiat ad lib. Einzelbefunde zur Normalver­teilung von NR bei intravenoser Injektion des Farb­stoffs bei MeersdHvehlchen liegen vor (Abb.I2, 14,34).

An 45 mannlichen und 30 weiblichen ca. 6 Mon.alten Ratten wurde die Norlllalllerteilung lion NRnach einillaliger Injektion des Farbstoffi untersucht

Vitalfarbung mit Neutralrot . 15

(Totung der Tiere 1/2, I, 3, 5, 10, 15, 30, 60 min und2,3,6, 12,24 Std. nach i. v. Injektion). Bei 10 mann­lichen ca. 6 Mon. alten Tieren wurde 2, 6, 8, 12 und24 Std. nach der ersten Injektion die gleiche Dosisnachinjiziert (Totung 5 oder 30 min nach Reinjek­tion). Die Abhiingigkeit der Farbstoffllerteilung vomAlter der Tiere wurde an 12 iiber 15 Mon. alten,10 ein Monat alten und 6 einen Tag alten mannlichenRatten untersucht; bei 20 Feten vom 12., 14., 16.,18. und 20. Tag der Graviditat wurde die Farbstoff­lokalisation nach diaplazentarem Obertritt des Farb­stoffs durch Injektion des Muttertieres untersucht.Bei allen nachfolgend beschriebenen Versuchenwurden ca. 6 Mon. alte Rattenmannchen verwendet.10 Tiere wurden nach unterschiedlich langemDursten (s. Tab. 10) NR injiziert. NR-Vitalfarbungnach Induktion von hyalintropfiger Entmischung desCytoplasmas der Epithelzellen des proximalenHauptstiicks der Niere wurde bei je 5 Tieren durchHiihnereiweij3 (6 ml Io%iger Losung pro 100 g KGi. p. ; Farbstoffgabe nach 24 Std. ; Totung der Tiere Iund 15 min nach Injektionsende) und Glycerin (s. c.Injektion von 2 ml einer 50%igen LOSWIg pro100 g KG; Farbstoffgabe 2 Std. spater; TotWIg lund15 min nach Beendigung der NR-Injektion) durch­gefiihrt. NR-Vitalfarbung der Epithelzellen de-sproximalen Konvoluts der Niere bei hydropischerDegeneration durch Macrodex ®(0,6 g pro 100 g KGi. v.; 6 Std. darauf Farbstoffgabe; Totung lund15 min spater) wurde bei 5 Tieren untersucht. Bei5 Ratten wurde von der Farbstoffgabe DOPA in­jiziert (5 mg I-DOPA pro 100 g KG i. v.; NR-Gabe30 und 60 min danach; Totung nach lund 3 min);8 Ratten erhielten vor Farbstoffgabe Serpasi/®(0,5 mg pro 100 g KG i. p.; nach 24 Std. NR i. v.,Totung 2 und 60 min nach Farbstoffgabe), 2 TierePertoJran® (2,5 mg pro 100 g KG i. p. 6 Std. vor Farb­stoffgabe; Totung 2 und 60 min danach). Bei5 Tieren war wahrend der intravenosen NR-In­jektion der Nierenstiel abgebunden; die Ligatur wurdelund 2 min nach Beendigung der Farbstoffinjektiongelost, das Organ nach weiteren 2 min entnommen.Bei 5 Tieren wurde NR in die V. portae injiziert;Totung der Tiere nach 3, 15, 20, 30, 45 min. Bei6 Tieren wurde NR in das Lumen eines proximalenHauptstiicks der Niere ityiziert (0,2%ige NR-Losungin Ringer; Laufgeschwindigkeit 16 nano-l/min;Entnahme des Organs nach I WId 3 minI). Bei3Tieren wurdeNR in eine abgebundenejejunum- bzw.Colonschlinge injiziert (0,5%ige Losung; Gewebsent­nahme nach 1,5 und 10 min). Bei 6 Tieren wurdeTrypanblau injiziert (Totung I, 3,6, 12,24 Std. nachFarbstoffgabe); bei 6 weiteren Tieren wurde 12 und

1) Herrn Dr. H. VICK, Max-Planck-Institut fUrBiophysik, Frankfurt/Main (Direktor: Prof. Dr.K. J. ULLRICH), danke ich fiir die Durchfiihrung derMikropunktionen.

16 . J. WINCKLER

14 Std. nach Trypanblaugabe NR nachinjiziert (Ti::itungnach 3 min). - Gleichzeitig mit den Geweben derExperimentaltiere wurden Gewebe von 30 Normal­tieren als Kontrolle mitverarbeitet.

Von samtlichen Tieren - auBer in den Versuchenmit Abbindung des Nierenstiels, der Mikroinjektionin das Hauptstiick der Niere und der Farbstoffinjek­tion in eine Darmschlinge, wobei nur das betreffendeOrgan (Niere bzw. Darmabschnitt) weiter unter­sucht wurde - wurden folgende Organe aufgearbei­tet: Magen, Duodenum, Ileum, Colon, Leber,Pankreas, Gl. parotis, Gl. submandibularis, Gl.sublingualis, Milz, Niere, Ovar, Hoden, Samenblase,Kehlkopf (mit Schilddriise und Nebenschilddriise),Hypophyse, Nebenniere, GroBhirn, Kleinhirn,Riickenmark. Einzelbefunde von weiteren Organenbzw. Geweben (Herz- und Skelettmuskulatur, uni­und plurivakuolares Fettgewebe, Ductus deferens,Lunge, Epiphyse) liegen vor. - Nach Ti::itung derTiere in leichter Athernarkose wurden die Organerasch entnommen, vonjedem Tier auf zwei Kryostat­objekthaltern gesammelt und in Stickstoff-gekiihl­tern Propan eingefroren (WINCKLER 1970b). Dannwurden Kryostatschnitte· hergestellt (Schnittdicke10 fLm); der gri::iBte Teil der Schnitte wurde gefrier­getrocknet (HEENE 1968, WINCKLER 1970a).

Histologische und histochemischeUntersuchungsmethoden

RegelmiijJig durchgefuhrte Untersuchungen bzw.Reaktionen: Die Beurteilung der NR-Lokalisationam gefriergetrockneten Kryostatschnitt (Unter­suchung der Schnitte im Mischlicht und U.V.-Licht),Methylenblaufiirbung, PAS-Reaktion und enzymhisto­chemischer Nachweis der sauren Phosphatase:

Fiir die Untersuchung der NR-Lokalisation wurden60 min (oder langer) iiber trockenem Paraformal­dehyd (MERCK, Darmstadt) bei Zimmertempera­tur fixierte gefriergetrocknete Kryostatschnitte inEntellan eingeschlossen. Hierzu wurde der Objekt­trager diinn mit Entellan bestrichen und dann dieSchnitte rasch (wegen des schnellen Eintrocknens vonEntellan) aufgelegt. Zum Eindecken wurde einweiterer Entellantropfen aufgebracht und an­schlieBend das Deckglaschen langsam von einer Seiteiiber den Schnitt gesenkt. Unsere Praparate sind seitzwei Jahren unverandert; nur die fluorescenzmikro­skopische Untersuchung NR vitalgefarbten Ge­webes sollte mi::iglichst gleich nach Anfertigung derPraparate erfolgen (s. S. 9). - Die Methylenblau­fiirbung erfolgte in o,I%iger waBriger Farbstoff­li::isung; gefarbt wurden durch Auftauen auf Objekt­trager montierte Kryostatschnitte nach Nachfixie­rung in Ca-Formol und gefriergetrocknete, Formal­dehydbedampfte Kryostatschnitte, die in Ather:Athanol: Methanol (40:40:20) + 0,4 g Celloidin

auf Objekttrager montiert wurden (vgl. WINCKLER197oc). DiePAS-Reaktion wurde am gefriergetrock­neten formaldehydbedampften Kryostatschnittdurchgefiihrt (vgl. WINCKLER 1970c). - Vor demhistochemischen Nachweis der sauren Phosphatase (nachBARKA und ANDERSON 1962) wurden gefriergetrock­nete Kryostatschnitte 10 min iiber trockenem Para­formaldehyd fixiert (WINCKLER 1970C; WINCKLER1972 b).

Nicht regelmiifJig durchgefuhrte Nachweise undFiirbun­gen: Am konventionell durch Auftauen auf Objekt­trager montierten, Ca-Formol nachfixiertem Kryo­statschnitt wurde mit Sudan III (ROMEIS 1968, § 1951)und Sudanschwarz B (ROMEIS 1968, § 1055) gefarbt.Am gefriergetrockneten Formaldehyddampf-fixier­ten Kryostatschnitt nach Montage auf Objekttragermit Methanol und/oder Celloidinli::isung wurdendurchgefiihrt: Cholesterin-Nachweis nach SCHULTZE(ROMEIS 1968, § IOn), Eisennachweis nach LISON(ROMEIS 1968, § 1262), Hamoglobinnachweis nachLEPEHNE (ROMEIS 1968, § 1459), Hamosiderinnach­weis nach BUNTING (ROMEIS 1968, § 1268), Blei­hamatoxylinfarbung endokriner Zellen nach SOLCIAet al. (1968).

Golgiversilberung nach AOYAMA (ROMEIS 1968,§ 1026). Hierzu wurden 8 Ratten verwendet (2 Kon­trolltiere, 3 Tiere, die 30 min, 5 und 24 Std. nachNR-Injektion geti::itet wurden und 3 Tiere, die I, 12und 24 Std. nach Trypanblaugabe geti::itet wurden).Folgende Organe wurden untersucht: Niere, Leber,Pankreas, Magen, Duodenum, Jejunum, Colon,Milz, Gl. submandibularis, Schilddriise, Riicken­mark.

Die lichtmikroskopischen Untersuchungen wurdenam ZEIss-Universalmikroskop mit Fluorescenzein­richtung durchgefiihrt. Fiir Mikrophotos derLokalisation von NR nach Vitalfarbung empfiehltsich die Verwendung von Interferenz- und Blaufilter.Fluorescenzmikroskopie mit Dunkelfeldkondensor.Quecksilberhi::ichstdrucklampe HBO 200 W. Er­regerfilter II, Sperrfilter 50.

Elektronenmikroskopie. Untersucht wurden 28 Tiere(4 Kontrolltiere, 20 Tiere, die I, 3, IS, 60 min und3, 6 und 24 Std. nach NR-Injektion geti::itet und4 Tiere, die 6, 12, 24 Std. nach Trypanblauinjektiongeti::itet wurden). Samtliche Tiere wurden gleich­zeitig lichtmikroskopisch ausgewertet. Entnommenwurden Niere, Leber, Pankreas, Magen (Corpus,Pylorus), Duodenum, Jejunum, Ileum, Colon, Milz,Samenblase, Schilddriise, Nebenniere, Hypophyse.Immersionsfixierung des lebendfrischen Gewebesin l%iger gepufferter OsO4-Li::isung, meist nach Vor­fixierung mit 6%igem Glutaraldehyd. Einbettungin Durcupan® (FWKA) Diinnschnitte mit einemPORTER-BLuM-Mikrotom. Nachkontrastierung derSchnitte mit Uranylacetat und Bleizitrat. Elektronen­mikroskop: ZEISS EM 9 A.

Quantitative Katec/zo!aminbestillll1nmg an Neben­nieren noch NR-Gabe' ). Hierfiir wurden 15 Tiereverwendet (3 Kontrolltiere, 12 Tierc, die 1/2, 3. 24und 48 Std. nach NR-Injektion getotet wurden).

Normaiverteilung von NR nacheinmaliger intravenoser Injektion

a) NR im Hlut

NR wird auBerordentlich rasch aus dem Ge­faBlumen an die Gewebe abgegeben und istbereits eine Minute nach Injektionsende kaumnoch im Blut nachweisbar; das Blutserum istungefarbt, dem Blutkuchen sind mit Methanol­Aceton nur sparliche Farbstoffreste zu entziehen.1m histologischen Praparat ist lichtmikrosko­pisch im Mischlicht und u. V. Licht der Inhaltder BlutgefaBe frei von Farbstoff; Erythrozytensind nicht angefarbt (Abb.IO). Eine Unter­drlickung von NR-Fluorescenz durch dasHamoglobineisen (HAMPERL 1934, 1955) ist we­nig wahrscheinlich. I min nach Beendigungeiner NR-Injektion ist die im Blut zirkulierendeFarbstoffmenge bereits zu gering, um, nachLosung einer flir die Zeit der Injektion bestehen­den Nierenstielligatur, die Lysosomen des proxi­malen Hauptstlicks anzufarben; deren Fahig­keit, NR zu akkumulieren, ist dabei besondersausgepragt.

Flir das Verschwinden des Farbstoffs aus demBlut sind zwei Faktoren maBgeblich beteiligt:Die von DOLADILHE und MAZILLE (1939) be­schriebene Bindung von NR an Serumproteineist offenbar fllichtig und verzogert die Eliminie­rung aus dem Blut nicht in der Weise, wie diesELir die Bindung von Trypanblau und anderen ­auch basischen - Vitalfarbstoffen bekannt ist(vgl. FRANKE 195 I; BENNHOLD und SEYBOLD1952; BENNHOLD und OTT 1961). Daneben be­glinstigt die Fahigkeit von NR, in seiner nicht­dissoziierten Form durch Lipidmembranen zudiffundieren (vgl. S. 50) den Obertritt in denInterzellularraum und in die Zellen; Basalmem­bran und Zellmembran sind - auch im ZNS ­ELir NR keine Barriere.

1) Herrn Dr. HENNEMANN, Medizinische Klinikder Universitat Wiirzburg (Dir. Prof. Dr. H. A.KUHN). danke ich fUr die DurchfUhrung der Messun­gen.

Vitalfarbung mit Neutralrot . 17

Wahrend die Erythrozytel1 (s. 0.) NR allenfallsfliichtig binden, wird in Lymphozyten desstromenden Bluts eine den Lymphozyten inLymphknoten vergleichbare verzogerte An­farbung ihrer Lysosomen beobachtet (s. S. 30).Basophile Leukozyten bleiben ungefarbt, wah­rend - 15 bis 30 min nach Injektionsende - ineosinophilen und l1eutrophilen Leukozyten einigeperinuklear gelegene Lysosomen erkennbar sind.

b) NR-Farbung der Interzellular­substanz

Kollagene, elastische Fasern und die Basal­membran binden NR in fluorescenzmikrosko­pisch nachweisbaren Konzentrationen. In derGrundsubstanz hyalinen Knorpels ist die NR­Einlagerung besonders ausgepragt; in Arealenvon Knorpelasbestose wird gelegentlich sogareine im Mischlicht auffallende Rotfarbung beob­achtet. Bemerkenswert ist, wie rasch der Farb­stoff in den Knorpel eindringt; bereits I minnach Injektionsende ist z. B. das Knorpelskelettdes Kehlkopfs der Ratte vollstandig durchtrankt.Chondrozytenfarbung s. S. 43. Knochengewebewurde histologisch nicht untersucht; makro­skopisch bleibt Knochen nach NR-Injektionungefarbt.

c) Cytoplasmafarbung

NR wird von allen Zellen rasch aus dem Blutaufgenommen. Am histologischen Schnitt istdies in den Zellen, die reich an NR-anfarbbarenGranula sind. leicht zu belegen. In anderenZellen. denen NR-anfarbbare Granula fehlenbzw. deren Organellen sich erst verzogert mitNR darstellen, ist die diffuse Durchtrankung desCytoplasmas im histologischen Praparat imMischlicht zumeist nicht erkennbar, obwohl diemakroskopische Betrachtung des betreffendenOrgans keinen Zweifel an einer hohen Farbstoff­konzentration im Gewebe laBt (z. B. Leber).Erst die fluorescenzmikroskopische Unter­suchung der Schnitte gestattet hier eine exakteLokalisation des Farbstoffs (Abb.IO). Es wirdsichtbar, daB NR in kiirzester Zeit in allen Zellenzu einer Zunahme der Cytoplasmafluorescenzfiihrt (NR- und Autofluorescenz). Die Fluores-

18 • J. WINCKLER

Abb.IO. NR-VitaWirbung. Ratte. I min nach Farbstoffgabe. Fluorescenzmikroskopie. Schilddriise. DerFarbstoffhat Follikelepithelzellen und Kolloid diffus durchtdinkt. Die Kapillaren (Pfeile) sind frei von Farb­stoff. *= »Freie« Zellen im Kolloid. 210fach.

Figure 10. NR vital staining. Rat. I min following the injection of the dye. Fluorescence microscopy. Thyroidgland. Diffuse staining of epithelial cells and colloid. Capillaries (arrows) are free from NR. * = "Free" cellsswimming in the colloid. Magn. X 210.

cenzzunahme des Cytoplasmas ist in Leber,Speicheldrusen, Darm (Schleimhaut), Pankreas,Niere, Nebenniere (vor aHem in der Rinde) undim ZNS am ausgepragtesten, mittelstark inglatter und schwach in quergestreifter (Herz­und Skelett-) Muskulatur. Eine Beziehung zwi­schen Ergastoplasmareichtum und NR-Fluores­cenz ist nicht sicher erkennbar. Fur eine lIlito­chondriale Lokalisation von NR (GERSCH undRIEs 1937; WEISS 1955; SCHMIDT 1960, 1962a)haben wir keinen Anhalt. Eine Anfarbung desGolgiapparats (SCHMIDT 1960a, 1962) wurde niegesehen. - Werden unfixierte frische Kryostat­schnitte in Ringerlosung aufgezogen und dannfluorescenzmikroskopisch untersucht, wird eineschwache NR-Fluorescenz in uni- und pluri­vakuolarem Fett beobachtet. Die vitale Farbstoff-

bindung an Myelin ist viel starker; dies zeigt,daB nicht die Loslichkeit des NR, sondern dasVorkommen reagibler Gruppen in Lipoiden dasAusmaB der Bindung intravital appliziertenFarbstoffs bestimmt (vgl. S.14).

Die Vielzahl der Faktoren, die die NR­Fluorescenz hinsichtlich des Farbtons und derFluorescenzintensitat beeinflussen (vgl. Tab. 2und 3), erschwert die exakte Korrelation der imhistologischen Schnitt vorgefundenen NR­Fluorescenz mit den Konzentrationsangaben derTab. 3. Wenn dernnach die Cytoplasmafluores­cenz der Leber 1 min nach Injektionsende dereines gleich dicken Gelatineschnitts mit 0,012%NR entspricht, kann dies nur als grober Anhaltfur die tatsachlich im Gewebe vorkommendeNR-Menge dienen.

Die fluoreseenzmikroskopisehe Untersuehungder Gewebsschnitte hat uns die Dynamik derersten Phase der Farbstoffverteilung im Organis­mus (Diffusfarbung: v. MOLLENDORFF 1920;SCHMIDT 1962) eindrucksvoll vor Augen ge­flihrt. Die Schnelligkeit, mit der NR aus demBlut entfernt und in Zellen aufgenommen wirdund der Nachweis einer diffusen Cytoplasma­fluorescenz aller Zellen sind dabei die wichtigstenTeilergebnisse. Die Aufnahme des Farbstoffsdutch (Mikro-) Pinozytose (vgl. noeh ROSEN­BAUM 1965 und ALLISON und YOUNG 1969) istunwahrscheinlich (5. LEWIS 1931; MAUNSBACH1969). - Nahere Angaben zum Mechanismusder <Non-ionic diffusion>, der nach unserer

Vitalfarbung mit Neutralrot . 19

Oberzeugung flir die Farbstoffverteilung imOrganismus die entscheidende Rolle zukommt,finden sich auf S. 50ff.

d) Cytoplasmafarbung endokrinerZellen

Wahrend bei den bisher beschriebenen Zellendie NR-Konzentration im Cytoplasma so geringist, daB sie nut fluorescenzmikroskopisch nach­gewiesen werden kann, akkumulieren einigeendokrine Zellen den Farbstoff in erheblichhoherer Konzentration (Tab. 6). Die in diesenZellen nachweisbare Rotfarbung des Cyto­plasmas entspricht im Modellversuch (Tab. 3)

Abb. 11. NR-VitaWirbung. Ratte. I min nach Farbstoffgabe. Pankreas. Kraftige Anfarbung der endokrinenZellcll. Der exokrine Driisenabschnitt bleibt im Mischlicht ungefarbt. 36ofach. Inset: Bei 1400facher Ver­groBerung wird die NR-Farbung der Sekretgranula der Inselzellen erkennbar.Abb.12. NR-Vitalfarbung. Meerschweinchen. I min nach Farbstoffgabe. Pankreas. Die a-Zellen sind kraf­tiger angC£arbt als die ~-Zellen. 36ofach.

Figure 11. NR vital staining. Rat. I min following the injection of the dye. Pancreas. Intensive staining of theislet cells. The exocrine parenchyma remains unstained. Magn. X 360. Illset;With 1400 fold magnification NRstaining can be localized in the secretory granules of the islet cells.Figure 12. NR vital staining. Guinea-pig. I min following the injection of the dye. Pancreas. The A-cells arestained more intensive than the B-cells. Magn. X360.

20 . J. WINCKLER

Farbstoffkonzentrationen iiber 2%. Damit sinddie Zellen im histologischen Schnitt auch imMischlicht leicht erkennbar.

1m Pankreas werden die Zellen der Langer­hansschen Inseln kraftig - und in der erstenPhase nach Farbstoffgabe praktisch selektiv ­angefarbt (Abb. II, 12); bereits BENSLEY (I9II)und LACY (1954) haben diese Beobachtung ge­macht. Die NR-Vitalfarbung der Reninzellendes juxtaglomerularen Apparats der Niere ist seitSUGIYAMA et al. (1942; s. a. WORTHINGTON1957; ROSENBAUER 1965) bekannt. Die Dar­stellung der Mastzellen durch Vitalfarbstoffe(EHRLICH 1894; ARNOLD 1904) ist wahrschein­lich die erste Selektivfarbung von Zellen iiber­haupt (Abb. 13).

Dber die Moglichkeit, auch andere endokrineZellen vital mit NR anzufarben, haben wir(WINCKLER I972a) erstmalig berichtet. So far­ben sich in der Nebenniere die Adrenalin- undNoradrenalin-synthetisierenden Zellen (A- und

N-Zellen) kraftig an. Beide Zelltypen sind zu­nachst gleich intensiv gefarbt. Da die Vitalfar­bung der A-Zellen rascher wieder zuriickgeht,sind nach 20-30 min nur noch die N-Zellen an­gefarbt und dadurch selektiv sichtbar zu machen(Abb.20, 21). Die Identifizierung der beidenZelltypen bereitet keine Schwierigkeiten; denndurch Formaldehydbedampfung der gefrier­getrockneten Kryostatschnitte ist griine Kate­cholamin-spezifische Fluorescenz leicht auszu­machen, wahrend bei kiirzerer Formaldehyd­exposition die Katecholaminfluorescenz derA-Zellen schwach ausfallt. - In der Schilddriisewerden die C-Zellen angefarbt (Abb. 16). <Helle>und <dunkle> C-Zellen (KRSTIC 1969) lassen sichnicht unterscheiden. Die Abgrenzung gegeninterfollikulare Mastzellen, die bei der Rattenicht selten sind, ist durch die grob granulareVitalfarbung der Mastzellen gegeben. - In derHypophyse kommt es zu einer kraftigen FarbunggroBer Zellen des Vorderlappens, deren Identi-

14Abb.I3. NR-VitaWirbung. Ratte. I min nach Farbstoffgabe. Mastzelle. NR hat die Sekretgranula selektivangefarbt. 22oofach.Abb. 14. NR-Vitalfarbung. Meerschweinchen. I min nach Farbstoffgabe. Duodenum. Feingranulare Lokali­sation des Farbstoffs in den "Mucosal mast cells" des Zottenstromas. 360fach.Abb. IS. NR-Vitalfarbung. Ratte. 2 min nach Farbstoffgabe. GranuHire Anfarbung von durchwanderndenMastzellen und »gelben« Zellen im respiratorischen Epithel des Vestibulum laryngis. 300fach.Figure 13. NR vital staining. Rat. I min following the injection of the dye. Mast cell. Selective staining of thesecretory granules. Magn. X 2200.Fig. 14. NR vital staining. Guinea-pig. I min following the injection of the dye. Duodenum. Granularlocalization of the dye in "Mucosal mast cells" of the villus stroma. Magn. X 360.Figure IS. NR vital staining. Rat. 2 min following the injection of the dye. Granular staining of invadingmast cells and "gelben Zellen" of the respiratory epithelium of the Vestibulum laryngis. Magn. X 300.

VitaWirbung mit Neutralrot . 21

Abb. 16. NR-VitaWirbung. Ratte. 2 min nach Farbstoffgabe. Diffuse AnHirbung des Cytoplasmas der para­follikularen C-Zellen (Pfeile). In den Follikelepithelzellen sind die Lysosomen noch unvollstandig angefarbt.Der Doppelpfeil zeigt auf eine Mastzelle. 360fach.Abb. 17. NR-Vitalfarbung. Ratte. 2 min nach Farbstoffgabe. Pylorus. 1m unteren Drittel der Pylorusdriisesind Gastrinzellen angefarbt. 300fach.

Figure 16. NR vital staining. Rat. 2 min following the injection of the dye. Diffuse staining of the parafollicu­Jar C-cells (arrows). Incomplete staining of lysosomes in the follicular epithelium. The thick arrow demon­strates a mast cell. Magn. X 360.Figure 17. NR vital staining. Rat. 2 min following the injection of the dye. Pylorus. Staining of gastrin cells inthe lower third of the pyloric glands. Magn. X 300.

tat mit den sog. basophilen Zellen dureh Lage,Anzahl, Form und die PAS-Reaktion sowieBleihamatoxylinfarbung (SOLCIA et ai., 1968)gcsiehert ist. Es ist bemerkenswert, daB dieseZellen, deren Basophilie bei Sehnittfarbungweniger ausgepragt ist als die der sog. Aeido­philen (GRAUMANN und HINRICHSEN 1960), intravitam als einzige Zellart des Vorderlappensbasophil sind. Die Zellen des Zwisehenlappenssind stets sehwaeher gefarbt.

Die Identiflzierung der NR-gefarbten Zellendes Verdau/./l1gstrakts ist sehwieriger. FolgendeArgumente spreehen dafur, daB die im Pylorusangefarbten Zellen Gastrinzellen sind (Abb. 17):I. Ihre intraepitheliale Lage im basalen Drittelder Pylorusdriisen eines sehmalen prapylori-

sehen Absehnitts. 2. Gegen durehwanderndeMastzellen konnen sie dureh Fehlen einer granu­laren Cytoplasmafarbung abgegrenzt werden.3. Gegen die enteroehromaffinen Zellen derPylorussehleimhaut sind sie dureh Fehlen vonKateeholaminfluoreseenz naeh Formaldehyd­bedampfung abzutrennen (enteroehromaffineZellen zeigen naeh NR-Vitalfarbung normaleKateeholaminfluoreseenz). 4. Die Abgrenzunggegen intestinale Glueagonzellen erfolgt a) durehdie Fluehtigkeit der NR-Markierung der Ga­strin-Zellen, wahrend in Glueagonzellen derFarbstoff etwa gleieh lange wie in rx-Zellen desInselorgans verweilt und b) dureh ihre charak­teristisehe Lage in der Sehleimhaut; die NR-ge­farbten Zellen des Pylorus erreichen hauflg das

22 . J. WINCKLER

diffus

granular

granular

granulargranular und diffus

diffusgranular und diffus

diffus und granulargranular und diffus

Basophile Zellen desHypophysenvorderlappens

Zellen des Hypophysen­zwischenlappens

C-Zellen der SchilddriiseC(- und ~-Zellender Langer­

hansschen Inseln(BENSLEY 1911)

Adrenalin- und Noradrenalin- diffus; ausnahms­zellen des Nebennierenmarks weise granular

Extramedullare chromaffine diffusZellen

Gastrinzellen des MagensGlukagonzellen des Magen­

Darm-TraktsMastzellen (EHRLICH 1894;

ARNOLD 1904)Mucosal mast cellsgelbe Zellen des

respiratorischen EpithelsReninzellen des juxtaglomeru- granular

laren Apparats der Niere(SUGIYAMA et al. 1942;WORTHINGTONjr. 1957)

<interstitielle Zellem des Ovars granular

Cytoplasmafarbung

Tab. 7. Gesamt-Katecholaminkonzentration in Ho­mogenaten ganzer Rattennebennieren nach Gabevon Neutralrot. Fiir jede Probe wurden beideNebennieren vonje 4 Tieren verwendet.

1) 1m Unterschied zur Erstmitteilung (WINCKLER1972a) sind hier enterochromaffine und entero­chromaffin-like cells (s. S.52) nicht erwahnt. Entero­chromaffine Zellen sind nur ausnahmsweise mit NRanfarbbar.

Tab. 6. NR-gefarbte endokrine ZelIen)l.

Probe Organgewicht Katecholaminkonz.Nr. (inmg) (in flg/g)

I 143,8 139 KontrolleII 145,9 165 30 min nach NRIII 145,0 304 3 hnachNRIV 158,8 339 24hnachNRV 123,5 326 48 hnachNR

Innerhalb des Cytoplasmas der genanntenZellen wird NR vorzugsweise an die spezifischenGranula gebunden (vgI. Tab.6). Eine granulareLokalisation intravital injizierten NRs ist auch

Normalwerte fUr Katecholamine in der Neben­niere der Ratte zwischen 120 und 140 flg/g (v. EULER1956).

Drusenlumen, nicht dagegen die intestinalenGlukagonzellen (FORSSMANN et aI., 1968). 5. DieUnterscheidung von Gastrin-Zellen und En­terochromaffm-like cells (AURES und HAKAN­SON 1968; HAKANSON et aI., 1970; LEFRANC undPRADAL 1971) ist durch die charakteristischeLage beider Zellarten in der Magenschleimhautgegeben: enterochromaffin-like cells findet manvorwiegend in der Gegend des Corpus; dort sindkraftig NR-gefarbte Zellen nie nachweisbar(vgI. auch S. 52).

Die Anfarbung der Mucosal mast cells(ENERBACK 1966; ENERBAcK und HAGGENDAL1970) wurde durch NR-Farbung von Tierengesichert, die zuvor DOPA erhalten hatten. Eszeigt sich, daB diese Zellen nicht vollstandigdurch die NR-Vitalfarbung erfaBt werden.

Die Zellen der Tab. 6 gehoren fast ausnahms­los zur ApuD-Reihe (amine and precursor uptakeand decarboxylation; PEARSE 1966, 1968). NRwird vital also an Zellen gebunden, die Poly­peptidhormone produzieren und deren beson­deres Charakteristikum die Aufnahme vonKatecholaminen bzw. deren Vorlaufern ist. DieseZellen lassen sich am histologischen Schnittnach HCI-Hydrolyse mit basischen Farbstoffenanfarben «maskierte Metachromasie>: SOLCIAet aI., 1968). Fiir die Reaktion werden Carbo­xylgruppen des Cytoplasmas verantwortlichgemacht (SOLCIA et aI., 1969; MAUNDER undROST 1972), die durch HC1-Hydrolyse demas­kiert werden mussen. Es ist denkbar, daB die­selben Carboxylgruppen in der vitalen Zellenicht maskiert vorliegen und intravital appli­ziertes NR binden. Es ist bekannt, daB biogeneAmine an Carboxylgruppen gebunden werdenkonnen (Mastzellen: UVNAS et aI., 1970; Throm­bozyten: ABORG und UVNAS 1971). In Hinblickauf die weitreichende Bedeutung, die biogeneAmine bei der Synthese und Abgabe der in denZellen der ApuD-Reihe produzierten Poly­peptidhormone haben sollen (PEARSE 1966;ULLBERG und HAMMARSTROM 1969, Lit.; ME­LANDER et aI., 1971 a, b; TJALVE 1971), ist es nichtuninteressant zu wissen, daB die die Katechola­mine bindenden Gruppen auch andere basischeSubstanzen, z. B. das vollig unphysiologischeNR, einfangen.

VitaWirbung mit Neutralrot . 23

Abb. 18. NR-Vitalbrbung. Ratte. I min nach Farbstoffgabe. Hypophyse. A = Adenohypophyse. Z = Zwi­schenlappen. N = Neurohypophyse. Kraftige Anfarbung einzelner Zellen der Adenohypophyse (vergl.Abb. 19); gleichmafiige, schwachete Anfarbung der Zellen des Zwischenlappens; kraftige Anfarbung desNeurosekrets. Pfeile zeigen auf Herring-Karper. 180fach.Abb. 19. NR-Vitalfarbung. Ratte. 5 min nach Farbstoffgabe. Adenohypophyse. Vorwiegend granulare Far­bung basophiler Zellen mit »Nebenkern({ (Pfeil). 12oofach.

Figure 18. NR vital staining. Rat. I min following the injection of the dye. Hypophysis. A = Adenohypo­physis. Z = Intermediate lobe. N = Neurohypophysis. Intensive staining of so-called basophilic cells of theadenohypophysis (comp. Figure 19); the cells of the intermediate lobe are uniformly stained with lessintensity. Neurosecretory products are intensely stained. Arrows demonstrate Herring-bodies. Magn. X 180.Figure 19. NR vital staining. Rat. 5 min following the injection of the dye. Adenohypophysis. Mostly granularstaining in basophilic cells with "Nebenkern" (arrows). Magn. X 1200.

in den Nebennierenmark-Zellen aufgrund derZusammensetzung der Granulummatrix anzu­nehmen (KOENIG 1964a, 1965 a, 1967, 1969), ob­wohl wir dies - wohl wegen des begrenztenAuflosungsvermogens des Lichtmikroskops ­nur ausnahmsweise beobachten konnten. Daandererseits z. B. in C-Zcllen der Schilddriise,in denen NR stets gleichmaBig das Cytoplasmafarbt, auch fi.ir biogene Amine eine extragranu­lare Bindung ans Cytoplasma erortert wird(DAHLSTROM und ERICSON 1972; vgl. auchERANKO 1972), ist ersichtlich, daB die intrazellu­lare Lokalisation von NR und biogenen Aminen

in den Zellen der ApuD-Reihe weitgehend iiber­einstimmen (zur Lokalisation von Histamin inMastzellen s. JANSSON 1971, Lit.; Aminlokali­sation in weiteren Zellen der ApuD-Reihe

s. GRIMELIUS 1968; LEFRANC et aI., 1971; LE­

FRANC et PRADAL 1971; HAKANSON et aI., 1971 a,b; TJALVE 1971; ERICSON und EKHOLM 1971;ERICSON 1972).

In der Dynamik der Aufnahme und Spei­cherung von NR und - beispielsweise - DOPAlassen sich jedoch unschwer deutliche Unter­schiede sichtbar machen (vgl. auch S. 75). Zwarmi.issen NR und DorA in vergleichbar hoher

24 . J. WINCKLER

21Abb.20. NR-VitaWirbung. Ratte. I min nach Farbstoffgabe. Nebennierenmark. GleichmaBige Anfarbungvon A- und N-Zellen. 360fach.Abb.21. NR-Vitalfarbung. Ratte. 20 min nach Farbstoffgabe. Nebennierenmark. Die A-Zellen sind weit­gehend entfarbt. 360fach.

Figure 20. NR vital staining. Rat. I min following the injection of the dye. Adrenal medulla. Uniform stainingof A- and N-cells. Magn. X360.Figure 21. NR vital staining. Rat. 20 min following the injection of the daye. A-cells are nearly destainedagain. Magn. X 360.

Dosis intravenos angeboten werden, will manihre Akkumulation in den Zellen der ApUD­Reihe demonstrieren (nach i. p. Gabe von NRlassen sich lediglich die Inselzellen des Pankreasanfarben; s. auch LACY 1954). Wahrend jedochNR gleich nach Injektionsende in hoher Kon­zentration im Cytoplasma der Zellen nachge­wiesen und dann mehr oder weniger raschwieder ans Blut abgegeben wird (Abb. 22), wirdDOPA allmahlich in die Zellen aufgenommen,dort decarboxyliert (vgl. ENERBACK und HAG­GENDAL 1970; ERICSON 1972) und als Amin ge­speichert; das Maximum der Speicherung isterst nach Stunden erreicht. Es besteht keineKorrelation zwischen der Intensitat und Dauerder NR-Farbung und der Aminspeicherung,z. B. ist die NR-Anfarbung der C-Zellen inten-

siv, aber besonders fliichtig (Abb.22), wahrenddie Aminakkumulation in diesen Zellen ausge­sprochen verzogert ablauft (TJALVE und SLA­UNA 1971).

Die NR-Speicherung kann in einigen endo­krinen Zellen ohne erkennbare Veranderungder Ultrastruktur erfolgen (Mastzellen, C-Zellender Schilddriise). Andere Zellarten zeigen gering­gradige Abweichungen yom Normalbefund:z. B. wird in Reninzellen 30 min nach NR-In­jektion eine Erweiterung des rauhen endoplas­matischen Retikulums sichtbar; die spezifischenGranula bleiben jedoch in Form, GroBe undDichte unverandert. In anderen Zellarten, amausgepragtesten in den Inselzellen des Pankreasund den Zellen des Nebennierenmarks, entfaltetdas NR toxische Wirkungen:

Vitalfarbung mit Neutralrot . 25

a) Inselorgan. In den ~-Zellen (Abb.23, 24) isteine Volumenzunahme der spezifischen Granulaum ca. 30% auffallig. Die Verquellung derGranula hinkt der NR-Anfarbung der Zellennach; sie setzt IS min nach NR-Injektion ein,erreicht nach I Std. ihr Maximum und ist nach24 Std noch nicht normalisiert. Gleichzeitig mitder Verquellung erfolgt eine Kondensation desGranuluminhalts. Nebenbefunde sind dilatierteGolgifelder und -Sacke; nicht selten fmden sichKernpyknosen mit Erweiterung des perinuklea­ren Hofs, Mitochondrienschwellungen und er­weitertes endoplasmatisches Retikulum, ins­gesamt also schwere Schadigungszeichen (Abb.26). Die lichtmikroskopisch intensiver gefarbten<x-Zellen zeigen elektronenmikroskopisch ledig­lich eine gerade erkennbare Abhebung derGranulummembran von der Matrix als Folgeder NR-Gabe.

b) NebennierenlHark. Auch hier sind die Sekret­granula nach NR-Gabe vergroBert. In denA-Zellen bleiben die elektronendichteren Gra­nula geringeren Durchmesser von der Ver­quellung weitgehend verschont (Abb. 25). Mito­chondrienschwellungen sind hauflg, Kern­pyknosen dagegen nur selten zu sehen. - DieBefunde zeigen, daB NR-Farbung und Gradder Schadigung durch den Farbstoff nicht mit­einander korreliert sind.

Die elektronenmikroskopischen Befunde amInselorgan des Pankreas nach NR-Gabe bringenneue Aspekte in der Diskussion der Frage dercytotoxischen Wirkung von NR. OKUDA und

GROLLMAN (1966) haben in aufgetautenKryostat­schnitten nach NR-Vitalfarbung lediglich in<x-Zellen den Farbstoff nachweisen konnen. Dievon ihnen gleichzeitig beobachtete Hyperglyk­amie der Tiere wurde deshalb auf eine Schadi­gung der <x-Zellen mit konsekutiver Glukagon­ausschi.ittung zuri.ickgefi.ihrt.

PERINGS et al. (1968) haben die Befunde vonOKUDA und GROLLMAN erheblich eingeschranktunci die Hyperglykamie als Folge einer Adrena­linausschi.ittung gedeutet. Wir haben gezeigt,daB NR im Pankreas <x- und ~-Zellen anfarbt undin ~-Zellen schwerwiegendere Schaden bewirktals in <x-Zellen; auch Methylenblau, ebenfalls einbasischer Vitalfarbstoff, wirkt vorwiegend aufdie ~-Zellen schadigend (RUMKE und GAAREN­STROM 1955). Daneben bestatigen die kraftigeVitalfarbung der Zellen des Nebennierenmarksund die ultrastrukturellen Veranderungen anden spezifischen Granula der Markzellen dieVorstellung von PERINGS et al. (1968), die dasNebennierenmark als Angriffsort flir NR disku­tieren. Eine quantitative Bestimmung der Ge­samtkatecholamine der Nebenniere zeigt(Tab. 7), daB NR den Gehalt an Katecholaminenim Organ betrachtlich steigert. Vor allem der48 Std.-Wert ist interessant, da hier eine Inter­ferenz des fluorescierenden Farbstoffs mit derKatecholaminfluorescenz weitgehend ausge­schlossen werden kann. Ob die Verdopplung desKatecholamingehalts der Nebennieren auf eineverzogerte Abgabe oder eine Synthesesteigerungzuri.ickzuflihren ist, muB hier offen bleiben.

51020o

Gostrlnzellen des gens

o -Zellen d r Longer­honsschen Inseln

n-Zellen der Longer­honsschen Inseln

-lei n desebennterenmorks

A Zellen esebennlerenmorks

'Basophlle' lellen desHypophy n-vorderloppens

Zellen d Hypophysen-ZWlSChenloppens

C-Zellen der Schl~ruse

Abb.22. Intensitat (Ordinate) und Dauer (Ab­szisse) der NR-Vitalfarbung endokriner Zellennach intravenoser Gabe des Farbstoffs.

Figure 22. Intensity (ordinate) and duration(abscissa) of NR vital staining of endocrine cellsfollowing the intravenous injection of the dye.

26 . J. WINCKLER

Abb. 23-26. Elektronenmikroskopische Aufnahmen. Ratte. Fixierung: GlutaraldehydfOs04'

Abb.23. Ausschnitt aus einer ~-Zelle des endokrinen Pankreas. Kontrolltier. 22700fach. - Abb.24 wieAbb.23. 60 min nach NR-Gabe. Verquellung der Sekretgranula; in ihnen ist der elektronendichte Inhaltkondensiert und teilweise kristallin ausgefallen. 22700fach. - Abb.25. Sekretgranula der A-Zellen des Neben­nierenmarks. 2 min nach Farbstoffgabe. Verquellung der groBen weniger e1ektronendichten Granula. Diekleineren e1ektronendichten Sekretgranula behalten dagegen weitgehend ihre GroBe und Dichte. 61 700fach.

Figure 23-26. Electron microscopic photographs. Rat. Fixation: GlutaraldehydefOs04'

Figure 23. Detail from a B-cell of an pancreatic islet. Control Magn. X22,700. - Figure 24 as Figure 23,but 60 min following the intravenous injection of NR. Swelling of the secretory granules. The electron densecontent is partly condensed or shows crystalline forms. Magn. X22,700. - Figure 25. Secretory granules of theadrenal medulla. 2 min following NR injection. Swelling of the bigger, less electron dense granules while thesmaller electron opaque granules are unaltered. Magn. X61,700.

e) Vitale Kernfarbung durch NR

Eine im MiscWicht erkennbare intensive Rot­farbung der Kerne mit NR ist sicheres Zeichendes Zelltodes (RIES 1937; MICHAELIS 1947;NOESKE 1966; HAWKINS et aI., 1972). Damit ver­bunden ist eine diffuse oder (Abb.27) scholligeAnfarbung des Cytoplasmas der Zellen. VitaleKerne miissen jedoch nach NR-Vitalfarbungnicht vollig ungefarbt bleiben. Vielmehr hat diefluorescenzmikroskopische Untersuchung ge­zeigt, daB NR in zahlreichen Geweben an vitaleKerne angelagert wird (Nebennierenrinde,Stratum granulosum des Kleinhirns (Abb.29,30). In Neuronen des Riickenmarks und - ge­legentlich - im braunen Fettgewebe ist sogareine im Mischlicht erkennbare Rosafarbung

vitaler Kerne moglich (Abb.28). Die Nachin­jektion des Farbstoffs beweist, daB die vital ge­farbten Zellen bzw. Zellkerne iiberleben (vgI.W ALLBACH 193 I; ALEXANDROV 1933; KLINGEN­BERG et aI., 1961; STOCKINGER 1964, Lit.). NachKLINGENBERG et aI. (1961) hat die vitale Kern­farbung glatter Muskelzellen deren Kontraktionzur Folge (vgI. auch ZACKS 1964). Es WIt auf,daB die NR-Fluorescenz gefarbter Kerne imU. V.-Licht weniger rasch ausbleicht als dieCytoplasmafluorescenz, moglicherweise in Zu­sammenhang mit der starkeren Affmitat vonbasischen Farbstoffen zu DNS als zu RNS(BRUYIN et aI., 1953). NASSONOV (1930) berich­tet iiber reversible Kernfarbung mit NR unteranaeroben Bedingungen. Wir haben nachReserpingabe eine verstarkte Anfarbbarkeit derKerne gesehen (vgI. S. 68).

VitaWirbung mit Neutralrot . 27

Abb.26. Abgestorbene ~-Zellen im Pankreas. 60 min nach NR-Gabe. Dichter Kern, weiter perinuklearerRaum, erweitertes ER, verquollene Mitochondrien mit zerstorten Cristae. 71Oofach.Figure 26. Dead B-cell in rat pancreas, 60 min following NR application. Pycnotic nucleus, extended peri­nuclear space, dilated ER, swollen mitochondria with destructed cristae. Magn. X 7100.

f) NR-Vitalfarbung von Lysosomen

Seit der Anwendung von NRals Vitalfarbstoffgeht der Streit, ob NR praexistente Granula oderneu entstandene Gebilde farbt. V. MaLLENDORFF(1915, 1918a, b, 1920, 1922, 1923, 1936) hat dieVorstellung vertreten, daB NR im Cytoplasmader Zellen bereits vorhandene Granula farbt; diemit Trypanblau angefarbten Granula seien da­gegen neu gebildet. Seit CHLOPIN (1927) ist dieseMeinung immer wieder bestritten worden(WITTEKIND et al., 1970, Lit.; WITTEKIND undKRETSCHMER 1972, Lit.). Unsere Untersuchungzeigt nun, daB beides moglich ist; die Mehrzahl

der nach NR-Vitalfarbung sichtbaren Farbstoff­granula sind praexistente Organellen; mit Aus­nahme einiger Sekretgranula endokriner (s. S. 19)und exokriner (s. S.39) Zellen handelt es sichum Lysosomen. Daneben wird in einigen Ge­weben die Induktion von NR-Krinom beobach­tet (s. S. 57). 1m folgenden soll die NR-Vital­farbung von Lysosomen behandelt werden.

Riickblickend ist NAGEL (1929) der erste ge­wesen, der die Identitat praexistenter Organellendes Cytoplasmas mit den NR-Granula inFibroblastenzellkultur einwandfrei belegt hat.Der Hinweis auf in den Granula enthalteneEnzyme wird erstmals von KOEHRING (1930)

28 . J. WINCKLER

gegeben: <Whereever proteolytic enzymes areknown to exist there will be found azine dyestaining>. STRAUS (1954) und COHN und WIENER(1963) haben gezeigt, daB intravital appliziertesNR in der Fraktion der sauren Hydrolasenwiedergefunden wird. BRACHET (1957) hat be­reits die Identitat von NR-Granulum undLyso­som vermutet (STOCKINGER 1964, Lit.). OGAWA etai. (1962), EICHNER (1962) und KOENIG 1962, 1963a, b,c, 1964a, b, 1965 a, b,c, 1968,1969;KoENIGet aI., 1963) haben schlieBlich die intralysosomaleLokalisation von NR und anderen basischenVitalfarbstoffen auch histochemisch zweifelsfreigesichert (vgI. auch ALLISON und YOUNG 1969;

DINGLE und BARRETT 1969). Auch der Modusder Farbstoffbindung an das Lysosom ist alselektrostatische Bindung von NR an saureGruppen eines Glykolipoproteids der Lyso­somenmatrix weitgehend aufgeHirt (COHN undWIENER 1963; ALLISON und YOUNG 1964,1969;DINGLE und BARRETT 1969; KOENIG 1969, Lit.,vgI. auch S. 14, 73).

So kann der Eindruck entstehen, es handlesich bei der Vitalfarbung mit NR urn eine gutfundierte Methode, die Lysosomen des gesam­ten Organismus vollstandig und einfach anzu­farben. Unter anderen bringen PUGH (1967) undHIRSCH (1971; vgI. auch KOENIG 1963 a) die

.28Abb.27. SupravitaWirbung. Ratte. Die intravenose Injektion von NR wurde 2 min tiber den Tod des Tiereshinaus fortgesetzt. Leber. Kern- und NukleolenHirbung; auBerdem sind grobscholIige Cytoplasmastrukturenangefarbt. Erythrozyten auchjetzt praktisch ungefarbt. 480fach.Abb.28. NR-Vitalfarbung. Ratte. I min nach Farbstotfgabe. GroBhirnrinde. Die Kernfarbung ist reversibelund mit dem Oberleben des Tieres vereinbar. 2Iofach.

Figure 27. Supravital staining. Rat. During the intravenous NR injection the animal died; the injection wascontinued for 2 min. Liver. Staining of nuclei and nucleoli; furthermore bizarre structures of the cytoplasmare heavily stained. Even now erythrocytes remain nearly unstained. Magn. X 480.Figure 28. NR vital staining. Rat. I min following the dye injection. Cerebral cortex. The nuclear stainingas seen here is reversible and is not followed by cell degeneration. Magn. X 210.

VitaWirbung mit Neutralrot . 29

Abb.29. NR-VitaWirbung. Ratte. 10 min nach Farbstoffgabe. Zona fasciculata der Nebennierenrinde.Fluorescenzmikroskopie. Kraftige giftgrline NR-Fluorescenz der Kerne. 580fach.Abb.30. NR-VitaWirbung. Ratte. 2 min nach Farbstoffgabe. Kleinhirn. Fluorescenzmikroskopie. 1m Str.granulosum zahlreiche Zellen mit Kern- und Cytoplasmafluorescenz. 2Iofach.

Figure 29. NR vital staining. Rat. 10 min following the dye injection. Adrenal cortex; Zona fasciculatata.Fluorescence microscopy. Intensive green NR-fluorescence of cell nuclei. Magn. x 580.Figure 30. NR vital staining. Rat. 2 min following the dye injection. Cerebellum. Fluorescence microscopy.Many cells of the Str. granulosum show fluorescence of nuclei and cytoplasm. Magn. X 210.

NR-VitalHirbung in diesem Sinn zur Anwen­dung. Unsere Untersuchung zeigt demgegen­i-iber, daB es - bei der verwendeten Farbstoff­dosis und Applikationsform - Ilieht mog/ieh ist,siimtliehe Lysosomerl des RattellorgallislllUs g/eieh­zeitig allzu[iirben; etliche Lysosomen bleibenimmer ungefarbt. Die unterschiedliche Affinitatder Lysosomen verschiedener Organe zu NR istdabei ein allffalliger reprodllzierbarer Befund,der durch Erhohllng der injizierten Farbstoff­menge nicht entscheidend verandert wird (vgl.GATENBY 1931; HIRSCH 1932). Unter Zugrunde­legung der Tab. 3 werden nach einmaliger NR­Injektion in den Lysosomen des proximalenHauptstiicks der Niere, der Schilddriise und desZNS lokale Farbstoffkonzentrationen tiber 2%

erreicht (vgl. SCHMIDT 1906; WEISMANN undGILGEN 1956; SCHMIDT 1962). - In Abb. 3Iwurde versucht, die Einzelbefunde zusammen­zufassen.

In der Niere (Abb. 32-35) kommt es zu einersofortigen und vollstandigen Anfarbung samt­licher Lysosomen des Sc und S2-Segments. DieLysosomen des SrSegments sind unvollstandigund nur im Anfangsteil dargestellt. Lysosomender Mittelsti.icke und Sammelrohre werden beimNormaltier nicht angefarbt. Die Intensitat derLysosomenfarbung kann innerhalb einer Tubu­lusepithelzelle z. T. betrachtlich differieren(Abb.35). Eine Relation zwischen GroBe undAnfarbbarkeit der Lysosomen besteht, entgegeneiner weir verbreiteten, auf NIRENSTEIN (1905)

30 • J. WINCKLER

III

2 5 10 15 30

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Abb.31. Obersicht iiber Auftreten, Dauer, Intensitat und Vollstandigkeit der NR-Farbung von Lysosomenin verschiedenen Geweben nach einmaliger intravenoser Injektion des Farbstoffs (leere, glatt konturierteDreiecke). Die schraffierten Felder geben den Ablauf der GewebsverHirbung bei makroskopischer Betrach­tung wieder. u* = wlvollstandige Lysosomenfarbung; d. h. es sind weniger Lysosomen vital gefarbt, alsdurch Nachweis der sauren Phosphatase sichtbar zu machen sind. ** Die lichtmikroskopische Abgrenzungvon Lysosomen und NR-induziertem Krinom ist in diesen Organen nicht auf den ersten Blick moglich (s.S·57)·Figure 31. Diagram demonstrating beginning, duration, intensity and the degree of NR staining of lysosomesin different tissues following one intravenous injection of the dye. The striated figures represent the macro­scopically detectable tissue staining, the clear fields show the course of lysosomal staining. u* = not all lyso­somes, that can be demonstrated by application of histochemical methods for acid phosphatase are stained.** In these organs the differentiation of lysosome and NR-induced "Krinom" is rather difficult (see p. 57).

zuruckgehenden Ansicht, nicht. Lipopigmentdes Tubulusepithels farbt sich stets besondersintensiv (vgl. S. 9).

Auch die Lysosomen des ZNS sind gleichnach Beendigung der Farbstoffinjektion ange­farbt. Der anschlieBend am selben Schnittdurchgefuhrte histochemische Nachweis dersauren Phosphatase zeigt, daB nur ein Bruchteilder Lysosomen durch Vitalfarbung mit NR dar­zustellen sind. Vorwiegend werden jene Lyso­somen angefarbt, deren Matrix Lipopigment­Charakter hat (Autofluorescenz, gelbe odergelbbraune Eigenfarbe, in der Alkoholreihenicht extrahierbar, mit der PAS-Reaktion anzu­farben).

In der Schilddriise stellt sich die Lysosomen­Anfarbung erst Ibis 2 min nach Injektionsendeein (Abb.36-39). Die Lysosomen sind hier sokraftig angefarbt wie im proximalen Haupt­stuck der Niere, doch sind die Lysosomen derSchilddruse schon nach 30 min wieder entfarbt,wahrend die Lysosomen der Niere noch nach24 Std angefarbt sein konnen. Intensitat undDauer der Anfarbung sind demnach - wie beider Cytoplasmafarbung endokriner Zellen ­nicht miteinander gekoppelt. - Wahrend derNR-Farbung ist die Autofluorescenz der Lyso­somen unterdruckt (vgl. S. 5). Der zweifels­freie Nachweis, daB die autofluorescierenden,mit NR vital anfarbbaren Granula auch saure

Hydrolasen enthalten, ist nicht ohne weiteresmoglich: erst nach Vorflxierung gefrierge­trockneter Kryostatschnitte mit Formaldehyd­gas bei Zimmertemperatur (WINCKLER 1972 b)war eine einwandfreie Lokalisation lysosomalerHydrolasen in den NR-Granula des FoIIikeI­cpithels moglich. Auch die nicht selten vorwie­gend bei alteren Tieren durch Vitalfarbungnachweisbaren bizarren stabchenformigen Ge­bilde des FoIIikeIepitheis (Abb.38) sind durchhistochemischen Nachweis der sauren Phos­phatase darzustellen.

In anderen Organen wird der Farbstoff erstnach Iangerer Zeit angereichert. 1m Pankreascrfolgt eine im Mischlicht erkennbare Anfar­bung der Lysosomen erst IS min nach der In-

VitaWirbung mit Neutralrot • 31

jektion (Abb.40). - In der Mehrzahl der wei­teren Gewebe steIIen sich die Lysosomen mehroder weniger voIIstandig 45-60 min nach derNR-Injektion dar. Am ausgepragtesten ist die<Latenz> zwischen NR-Gabe und Lysosomen­farbung in der Cl. vesiculosa. Hier findet maneine intensive Lysosomenfarbung erst ca. 12 Std.nach der NR-Gabe, zu einem Zeitpunkt, an demdie Lysosomen der anderen Organe, mit Aus­nahme der Niere, bereits wieder entfarbt sind(Abb·42).

Das lange IntervaII zwischen Farbstoffgabeund Lysosomenfarbung legt den Verdacht einerNeogenese farbstoffinduzierter NR-Granula inder Samenblase nahe, zumal Krinombildung imEpithel dieses Organs nach Gabe verschiedener

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Abb·32· NR-VitaWirbung. Rattenniere. 30 sec nach Farbstoffgabe. Obersicht. Vollstandige und kraftigeAnfarbung der Lysosomen des S1- und S2-Segments. Die Lysosomen des S3-Segments sind nur im Anfangsteil(unvollstandig) dargestellt. Mittelstiick (M) im Mischlicht frei von Farbstoff 160fach.

Abb. 33 wie Abb. 32 bei 420facher VergroBerung.

Figure ]2. NR vital staining. Rat kidney. 30 sec following the dye injection. Survey. Complete and intensivestaining of the lysosomes of S1- and S2-segment. In the S3-segment only in the beginning lysosomes are ­incomplete - stained. Distal segments (M) are not stained. Magn. X 160.Figure 33 as Figure ]2; Magn. X 420.

32 • J. WINCKLER

35 ••••

Abb.34. NR-VitaWirbung. Meerschweinchen. Niere. 1m proximalen Konvolut wird neben verhaltnismaBigkIeinen Lysosomen ein unter dem Biirstensaum gelegener Abschnitt der Tubulusepithelzellen diffus ge£arbt.360fach.Abb.3S. NR-Vitalfarbung. Ratte. 24 Std. nach Farbstoffgabe. Niere. Teilweise Entfarbung der Lysosomen.Eine Abhangigkeit der Dauer der Farbstoffbindung von der GroBe der Lysosomen ist nicht erkennbar.s80fach.

Figure 34. NR vital staining. Guinea-pig. Kidney. In the proximal convolution small lysosomes are stainedand a narrow band of the cytoplasm lying just beneath the microvilli. Magn. X 360.Figure 35. NR vital staining. Rat. 24 h following the dye injection. Kidney. The lysosomes are partiallydestained. There exists no correlation between the duration of lysosomal staining and the size of lysosomes.Magn. X 580.

Agentien, u. a. auch NR, beschrieben wird(KOVACS 1966, 1969, 1971). Vergleicht manjedoch elektronenmikroskopische Bilder desSamenblasenepithels von Normaltieren mitdenen nach NR-Gabe, ist eine Zunahme derAnzah! autophagischer Vakuolen als Folge derNR-Injektion nicht ersichtlich. EntsprechendeVergleiche haben wir an Niere, Schilddriise,Pankreas, Leber, Nebenniere erhoben. VonKOENIG (1968) liegen gleichlautende Befundevom ZNS vor. - Neben der elektronenmikro­skopischen Kontrolle hat in dieser Frage auchder Versuch mit Reinjektion des Farbstoffs undlichtrnikroskopischem Vergleich der Anzahl der

NR-Granula in verschiedenen Organen nacheinmaliger und wiederholter NR-Gabe seineBedeutung. Eine Zunahme NR-gefarbter Gra­nula nach wiederholter NR-Gabe ist in unserenVersuchen nicht erkennbar.

Unsere Befunde und ihre Interpretationstehen im Gegensatz zu denen von MORGAN undMitarb. (MORGAN 1953, 1958, 1968; ALOUSIet aI., 1964, 1966, 1968; MORGAN et aI., 1966;vgI. auch HAFIEK und KOVACS 1964; KOVACSund HAFIEK 1964a, b; KARPATI 1966; KOVACS1966, 1968, 1970; REz und KOVACS 1971;WITTEKIND et aI., 1970; WITTEKIND undKRETSCHMER 1972; WITTEKIND 1972). Demnach

VitaWirbung mit Neutralrot . 33

Abb.36. Autofluorescenz der Lysosomen im Follikelepithel der Rattenschilddriise. Normaltier. 210fach.Abb. 37. NR-VitaWirbung. Ratte. 10 min nach Farbstoffgabe. Kraftige Anfarbung der Lysosomen im Follikel­epithel der Schilddriise. Die Cytoplasmafarbung der C-Zellen (Pfeile) ist bereits wieder abgebla13t (vergl.Abb. 16). 2Iofach.

Figure 36. Autofluorescence of lysosomes in the follicular epithelium of the rat thyroid gland. Control.Magn. X2IO.Figure 37. NR vital staining. Rat. 10 min following the injection of the dye. Intensive staining of lysosomes inthe follicular epithelium of the thyroid gland. Cytoplasmic staining of C-cells (arrows) already fades away(comp. Figure 16). Magn. X 210.

sind die NR-Granula in Pankreas und Lebernach Vitalfarbung sall/tlieh nellgebildet lind mitNR-indllzierten Autophagosoll/ell (NR-Krinoll/)identiseh (s. dagegen bereits GATENBY 193 I;HIRSCH 1932; RIBs 1934). Bis auf eine neuereGegendarstellung (LACY 1954) blieben genannteArbeiten bisher unwidersprochen. Da die Ver­suche an der Malis mit 3 bis 4 mal hoherer Farb­stoffdosis als in unserer Versuchsreihe durchge­fohrt wurden, ist eine Gegeniiberstellung derErgebnisse nicht ohne weiteres moglich; eineandere Reaktionsweise dieses Versuchstiers undein hoherer Grad der Zellschadigung mogeneine Krinombildung begiinstigen. Wichtiger ist,daB die in genannten Arbeiten verwendetenMethoden leicht zu Fehlschliissen fiihren kon-

nen. MORGAN und Mitarb. beziehen sich nebender unbefriedigenden Beurteilung von Quetsch­und Zupfpraparaten aufBefunde nach AOYAMA­Impragnierung NR-vitalgefarbten Gewebes.Wie erwahnt (S. II), ist diese histologischeMethode weder zum Nachweis NR-vitalge­farbter Strukturen noch zur Anfarbung vonNR-Krinom geeignet. KOVACS und Mitarbeiterstiitzen ihre Ergebnisse auf eine Nachfarbungvitalgefarbten Gewebes mit basischen Farb­stoffen. Dabei ist zu berocksichtigen, daB - nachgeeigneter Fixierung, deren Bedeutung bereitsCHLOPIN (1927) klar erkannte - auch <praexi­stente> Lysosomen angefarbt werden konnen,deren Anfarbbarkeit nach Vitalfarbung mog­licherweise begiinstigt wird (s. S. II und 38).

34 . J. WINCKLER

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Abb.38. NR-VitaWirbung. Ijahriges virginelles Rattenweibchen. 5 min nach Farbstoffgabe. Kraftige Anfar­bung stabchenfOrmiger Gebilde im Cytoplasma der Follikelepithelzellen der Schilddriise. 600fach.Abb.39. NR-Vitalfarbung. Ratte. Schilddriise. 5 min nach Farbstoffgabe. Unterschiedliche Intensitat derLysosomenfarbung in verschiedenen Follikeln. 210fach.

Figure 38. NR vital staining. 1 year old virginal rat. 5 min following the dye injection. Intensive staining ofrod-shaped structures in the cytoplasm of the follicular epithelium of the thyroid gland. Magn. X 600.Figure 39. NR vital staining. Rat. 5 min following the dye injection. The intensity of lysosomal staining variesin different thyroid follicles. Magn. X 210.

Daneben sei auf die Schwierigkeit quantifizie­render Aussagen aufgrund elektronenmikro­skopischer Praparate hingewiesen.

Nachfolgend werden unsere Argumente furdie Identitat von NR-Granulum und Lysosomnoch einmal zusammengestellt :I. Die Zeitspanne zwischen NR-Injektion und

Granulumfarbung ist in den meisten Organenzu kurz, als daB die Neuentstehung farbstoff­induzierter Vakuolen wahrscheinlich ware.

2. Die Identitat von NR-Granulum und Lyso­som ist durch nachfolgenden histochemischenNachweis saurer Hydrolasen wahrscheinlichgemacht (OGAWA et aI., 1962; KOENIG 1962,

1965).3. Der Nachweis lysosomaler Enzyme in NR­

Granula schlieBt eine Anfarbung farbstoff-

induzierter Autophagosomen weitgehend aus;diese sind zunachst frei von sauren Hydrolasen(PFEIFER 1971, Lit.).

4. Die NR-Granula sind mit den autofluores­cierenden Granula identisch, deren Identitatmit Lysosomen KOENIG (1963) in Niere undZNS elegant demonstriert hat.

5. Bei Induktion von NR-Krinom muBte beiReinjektion des Farbstoffs die Zahl NR-ge­farbter Granula groBer sein als nach einmaligerGabe von NR. Dies ist in unseren Versuchennicht der Fall.

6. Der elektronenmikroskopische Vergleich vonNormal- und NR-Tieren erbringt in unserenVersuchen keinen Hinweis auf die Neuent­stehung farbstoffinduzierter Autophagosomenin Pankreas, Leber und anderen Organen.

Ursachen der heterogenen NR-Vitalfarbung VOII

Lysosolllell verschiedener Organe. a) Wenig ent­scheidende Faktoren: Die Aufnahme von NR indie Zelle ist ein passiver ProzeB (NAGEL 193I;DINGLE und BARRETT 1969). Die Zellwand istnicht in der Lage, den Einstrom von NR - innicht dissoziierter Form (s. S. 50) - zu verhindem.Eine in verschiedenen Geweben oder ZellartenIIllterschiedliche Perllleabilitat der Zellwalld als derdie intrazellulare Farbstoffkonzentration unddamit die Lysosomenfarbung bestimmenderFaktor ist unwahrscheinlich (vgl.auch S. 67. )Gegen ein von der Gewebsdurchblutung abhangi­ges unterschiedliches extrazellulares Farbstoff­angebot als Ursache der heterogenenLysosomen­farbung in verschiedenen Organen spricht vorallem die unvollstandige bzw. unterschiedlichstarke Lysosomenfarbung innerhalb einer Zelle,z. B. in groBen Neuronen oder Nierenepithel­zellen (vgl. Abb. 35 und 39): in diesen Zellensind samtlic;le Lysosomen dem gleichen Farb­stoff.mgebot ausgesetzt. Auch zeigen die Lyso­somen der im vorangehenden Kapitel genann­ten endokrinen Zellen keineswegs eine beson­ders ausgepragte Farbung, obwohl die intra­zellu];ire Farbstoffkonzentration hier besondershoch sein muB. Diese Zellen entwickeln erstnach Entfarbung des Cytoplasmas eine maBig

VitaWirbung mit Neutralrot . 35

starke Lysosomenfarbung. Auch die unter­schiedlich starke Lysosomenfarbung der Zelleneinzelner Schilddriisenfollikel (Abb.39) ist nichtdurch unterschiedliches Farbstoffangebot erklar­bar; zumindest die angrenzende Wand desNachbarfollikels, die yom gleichen Kapillametzversorgt wird, miiBte vergleichbar intensiveLysosomenfarbung zeigen. AufschluBreich istauch der Versuch, peribiliare Korperchen derLeber durch Injektion des Farbstoffs in die V.portae anzufarben. Zwar wird unter diesenBedingungen die Zeitspanne zwischen Injektionund Lysosomenfarbung leicht verklirzt. Dochkommt es selbst jetzt zu einer sofortigen undkraftigen Lysosomenfarbung der Sc und S2­Segmente der Niere, wahrend noch 15 minnach Injektionsende peribiliare Lysosomen nichtlind Lysosomen der Kupfferzellen nur schwachangedeutet erkennbar sind (vgl. Abb.41). ­Eine A IIfnahlIIe NR-vitalgefarbter Cytoplasma­strukturell ill sekundare Lysosolllen ist bei sehr ver­zogertcr Vitalfarbung der Lysosomen licht­mikroskopisch nicht auszuschlieBen, aufgrundder elektronenmikroskopischen Kontrollen je­doch sehr unwahrscheinlich (vgl. MAUNSBACH1969).

b) Entscheidende Faktoren: Vergegenwartigtman sich den raschcn Abfall der Farbstoffkon-

Abb.40. NR-VitaWirbung. Ratte. 15 min nach Farbstoffgabe. Pankreas. Lysosomenfarbung. Die Zymogen­granula sind im Mischlicht ungefarbt. 360fach.Figure 40. NR vital staining. Rat. 15 min following the dye injection. Pancreas. Lysosomal staining. Thezymogen granules remain unstained. Magn. X 360.

36 . J. WINCKLER

Abb.41. NR-VitalHirbung. Ratte. 45 min nach Farbstoffgabe. Leber. LysosomenHirbung in Hepatozyten undSternzellen (Pfeile). 280fach.

Figure 41. NR vital staining. Rat. 45 min following the dye injection. Liver. Lysosomal staining in hepato­cytes and Kupffer cells (arrows). Magn. X 280.

Abb.42. NR-VitalHirbung. Ratte. 18 Std. nach Farbstoffgabe. Samenblase. Anfarbung der basal gelegenenLysosomen.360fach.Figure 42. NR vital staining. Rat. 18 h following the dye injection. Gl. vesiculosa. Staining of basally locatedlysosomes. Magn. X 360.

zentration im Blut nach Beendigung der NR­Injektion, erweist sich das Phanomen der so­fortigen bzw. verzogerten Anfarbung vonLysosomen im wesentlichen als eine Folge vonUnterschieden in der intrazellular vorhandenenBindungskapazitat fur NR einerseits und derLokalisation der bindungsfahigen Gruppen in Lyso­somen, extralysosomalem Cytoplasma und

Kern andererseits. Innerhalb der Zelle erfolgtdie Farbstoffbindung an Lysosomen umso eher,je mehr bindungsfahige Gruppen fur den Farb­stoff in Lysosomen vorliegen (z. B. Niere),wahrend umgekehrt der Reichtum an NR­bindenden Gruppen des extralysosomalen Cyto­plasmas - oder eine relativ geringe Bindungs­kapazitat der Lysosomen - die Farbstoffbindung

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38 . J. WINCKLER

an das Lysosomenkompartiment verzogert.Schon NASSONOW (1930; Abblassen der Granu­lumfarbung und reversible Kernfarbung beiSauerstoffentzug) demonstriert das labile Gleich­gewicht zwischen intra- und extralysosomalenbindungsfahigen Gruppen eindrucksvoll. HAw­KINS et al. (1972) beschreiben die Umlagerunglysosomal gebundenen Farbstoffs (Acridin­orange) auf Cytoplasma und Kern bei irrever­sibler Zellschadigung durch Inhibition der Enzy­me der Atmungskette; dabei ubersteht dieLysosomenmatrix die letale Zellschadigunglangere Zeit ohne morphologisch und enzym­histochemisch erkennbare Veranderung. - Frag­los begunstigt die Lipophilie des NR die Um­lagerung von Cytoplasma und Kern auf dieLysosomen «Ausschuttelungstheorie>: NlREN­STEIN 1920; SEKI 1933; RIBS und SCHOLZEL 1934),ohne jedoch der eigentlich bedingende Faktorzu sein (vgl. S. 14).

Wenn auch extralysosomale Faktoren fur dieunterschiedliche Vitalfarbung der Lysosomenverschiedener Organe wichtig sind, legen dieBefunde doch nahe, in einer heterogenen Zusam­mensetzung der lysosomalen Matrix den maBgeb­lichen Grund fur die in verschiedenen Organenbeobachteten Differenzen anzunehmen. Nur sokann z. B. auch die unterschiedliche Lysosomen­farbung innerhalb einer Zelle erklart werden.Erganzende Hinweise bringt eine Gegeni.iber­stellung der Befunde nach Vitalfarbung mit demErgebnis verschiedener Lysosomenfarbungenam Schnitt (Basophilie s. S.9; PAS-Reaktions. S. II; AOYAMA-Impragnation s. S. II; histo­chemischer Nachweis der sauren Phosphataseund Autofluorescenz der Lysosomen, vgl. auchS]OSTRAND 1944; KOENIG 1963, 1969; GEDIGKund PlOCH 1965; KOHL 1968; TAPPEL 1969).Die Tab.8 zeigt, daB sich die unterschiedlichgroBe Affmitat von NR zu Lysosomen ver­schiedener Gewebe im heterogenen Verhaltender Farbung von Lysosomen am Schnitt undihrer Autofluorescenz widerspiegelt. Das Er­gebnis der Vitalfarbung ist andererseits nicht ausden vorliegenden Befunden zur Lysosomen­farbung am Schnitt abzuleiten. Lediglich in derNiere scheint in den einzelnen Abschnitten desNephrons und Sammelrohrsystems eine weit-

gehende Obereinstimmung von Autofluores­cenz, Basophilie, PAS-Farbung und histoche­misch nachweisbarer Enzymaktivitat (saurePhosphatase) mit der NR-Vitalfarbung derLysosomen vorzuliegen (WINCKLER 1973).Gerade in diesem Organ wird jedoch die Inter­pretation der Vitalfarbung durch einen weiteren,bisher nicht berucksichtigten Faktor wesentlichmitbestimmt: die PH-Differenz im Lumen derverschiedenenHarnkanalchenabschnitte (s. S. 48).Urn diesen Faktor und die bereits erorterte Bin­dungsfahigkeit der extralysosomalen Zellkom­partimente fur NR auszuschlieBen, muBte dieBestimmung der NR-Bindungsfahigkeit anLysosomenfraktionen der verschiedenen Or­gane durchgeflihrt werden.

Veranderungen der Lysosomen durch NR-Auf­nahme: NR unterdruckt bei hoherer lokalerKonzentration die Autofluorescenz der Lysoso­men (vgl. Abb. 5 und ro). Dieser Vorgang ist re­versibel. In einigen Organen (Leber: Abb. 43/44;SrSegment der Niere: Abb.44) wird einenoch 48 Std. nach Farbstoffgabe erkennbareZunahme der Fluorescenz normalerweise kaumf1uorescierender Lysosomen beobachtet. InZusammenhang mit der <erleichterten> Anfarb­barkeit peribiliarer Lysosomen mit der Ao­YAMA-Technik nach NR-Gabe (s. S. 11) konntedie verstarkte Fluorescenz ein Anzeichen furdurch NR induzierte Veranderungen in derZusammensetzung und chemischen Strukturder Lysosomenmatrix sein. Eine relative Sta­bilitat der Fluorescenz im UV-Licht spricht da­gegen, daB es sich urn NR handelt, das noch andie Lysosomen gebunden ist und deren Auto­f1uorescenz verstarkt; ganzlich auszuschlieBenist dies jedoch nicht. - Eine Abnahme der histo­chemisch faBbaren Aktivitat der sauren Phos­phatase in Lysosomen nach NR-Gabe ist mit derAzomethode in keinem unserer Experimente zubeobachten (s. dagegen KOENIG et al. 1963;HAFIEK und KovAcs 1964; GOMBA et al 1966;KOENIG 1968). Auch Basophilie und PAS­Reaktion der Lysosomen nach NR-Gabe sindunveriindert. - Die vor allem von KOENIG (1968)beschriebene VergroBerung der Lysosomennach NR-Gabe bis auf das Dreifache des nor­malen Durchmessers (unter Zunahme der

Vitalfarbung mit Neutralrot . 39

Abb.43. NR-Vitalfarbung. Ratte. 36 Std. nach Farbstoffgabe. Fluorescenzmikroskopie. Die Anzahl fluo­rescierender peribiliarer Korperchen ist groBer als normal. 420fach.Abb.44. NR-VitaWirbung. Ratte. 36 Std. nach Farbstoffgabe. Fluorescenzmikroskopie. Niere. Zunahme derAnzahl fluorescierender Lysosomen im S3-Segment. 420fach.

Figure 43. NR vital staining. Rat. 36 h following the injection of the dye. Fluorescence microscopy. Liver.There are more fluorescent peribiliary bodies than normally. Magn. X420.

Figure 44. NR vital staining. Rat. 36 h following the injection of the dye. Fluorescence microscopy. Kidney.There is an increase in the number of fluorescent lysosomes in the Srsegment. Magn. X420.

Doppelbrechung und Abnahme der Phasen­differenz gegenLiber dem Cytoplasma) sehenwir nicht: In der Niere werden Durchmesser­zunahmen urn ca. 25% beobachtet, in anderenOrganen ist die GroBenzunahme der Lyso­somcn weder licht- noch elektronenmikrosko­pisch erkennbar. Die VergroBerung der Lyso­somen und die Farbstoffkonzentration in ihnensind nicht miteinander korreliert. Vielmehr ver­quellen die Lysosomen nach Farbstoffau61ahmcerst allmahlich; auch nach volliger Entfarbungkonnen die Lysosomen noch vergroBert sein.Eine VergroBerung der Lysosomen durch dieAufnahme einer <segregierten NR-Losung>(SCHMIDT 1962, S.608) ist deshalb unwahr­scheinlich. - Elektronenoptisch erkennbare

Veranderungen der Lysosomenmatrix werdenzu keinem Zeitpunkt gesehen.

g) NR-Farbung von Sekretgranulaexokriner Driisenzellen

Die Sekretfarbung geht der Anfarbung derLysosomen voraus (Abb. SO--53). Das Maxi­mum der Sekretfarbung ist 5 min nach Farb­stoffgabe erreicht.

Magendarl/ltrnkt. In Hauptzellen des Magenswird gelegentlich eine Anfarbung der Sekret­granula beobachtet. - Die BecherzeJlen desDuodenums und oberen DLinndarms farben sichstets kraftig an (Abb. 45); dagegen bleiben dieBecherzellen des unteren Ileums und Colons un-

40 • J. WINCKLER

Abb.45. NR-VitaWirbung. Ratte. 5 min nach Farbstoffgabe. Duodenum. AnHirbung des Sekrets der Becher­zellen. AuBerdem sind Makrophagen und "Mucosal mast cells" im Zottenstroma angeHirbt. 2Iofach.

Figure 45. NR vital staining. Rat. 5 min following the dye injection. Duodenum. Staining of the secretorygranules of goblet cells. Furthermore macrophages and "Mucosal mast cells" in the villus stroma are stained.Magn. X2IO.

gefiirbt. Obwohl die Sekretfarbung der Becher­zellen auch iiber eine Farbstoffinjektion insDarmlumen erreicht werden kann (vgl. auch v.MOLLENDORFF 1913), ist aufgrund der raschenAnfarbbarkeit der Becherzellen nach Injektioneine Anfarbung direkt iiber das Blut weit wahr­scheinlicher. Die Anfarbung der Sekretgranulader Becherzellen ist haufig mit einer Abgabe desSekrets ans Darmlumen verbunden: deere>Becherzellen werden nach NR-Gabe haufigbeobachtet; daneben wird nach NR-Gabe derInhalt des Darmlumens haubg PAS-, seltenerauch saure Phosphatase-positiv. - Besondersausgepragt ist die fast selektive Anfarbung derSekretgranula in den Paneth'schen Kornerzellen.(Abb.46). Die auch hier beobachtete gesteigerteAbgabe des Sekrets nach NR-Gabe geht haufigmit Kernpyknose, intensiver Rotfarbung derKerne und weiteren Zeichen toxischer Zell­schadigung (Abb.48) einher, die wir in Becher­zellennicht beobachten (Abb. 49). InZusammen­hang mit den erwahnten Analogien in der Ver­teilung und Speicherung i. v. applizierter bio-

gener Amine und des NR in Zellen der APUD­Reihe (S.I9f() ist interessant, daB Paneth-ZellenMonoamine und deren vorlaufer akkumulierenund sezernieren konnen (AHONEN und PEN­TILLA 1971); diese Zellen werden deshalb zurAPUD-Reihe <im weiteren Sinn> gerechnet. ­Zur Bindung von Metallkationen an Paneth­Zellgranula vgl. HALHUBER et al. (1971). - 1mColon sehen wir nach ca. 15 min eine granulareNR-Farbung im Cytoplasma schmaler Zellendes unteren Kryptendrittels; diese Zellen sindwahrscheinlich mit den <vakuolenreichen Zellen>(HOLLMANN 1965) identisch.

Speicheldriisen und Pankreas; Parotis: NichtregelmaBig wird eine Anfarbung der apikalenSekretgranula gesehen (Abb. 50). - GI. submandi­bularis: Hier farbt sich regelmaBig das Sekret derverschleimten Schaltstiicke an (Abb.52). DieIntensitat der Farbung kann von Zelle zu Zellestark schwanken. - Eine Sekretgranula-Farbungder GI. sublingualis wird im Mischlicht niebeobachtet. Das gleiche gilt fur das exokrinePankreas, wo nur fluorescenzmikroskopisch eine

VitaWirbung mit Neutralrot . 41

46

Abb.46. NR-VitaWirbung. Ratte. 3 min nach Farbstoffgabe. Anfarbung des Sekrets der Panethschen Komer­zellen im Kryptengrund des Jejunum. pofach.Abb.47 wie Abb.46. Bei 640facher VergroBerung erkennt man, daB die Sekretgranula selektiv ange£arbt sind.Abb.48 wie Abb. 46 und 47. 20 min nach Farbstoffgabe. Verquellung der Zellkeme der Panethschen Komer­zellen (PfeiJe). 640fach.

Figure 46. NR vital staining. Rat. 3 min following the dye injection. Staining of Paneth cells in the jejunum.Magn. xpo.Figure 47 as Figure 46; with higher magnification (X 640) the selective staining of the secretory granules canbe demonstrated.Figure 48 as Figures 47 and 46; 20 min following the dye injection. Swollen cell nuclei of Paneth cells(arrows). Magn. X 640.

verstarkte NR-Fluorescenz der Zymogen­granula nachweisbar ist (vgl. Abb. 2 und 3).

NR-Vital£arbung in einzelnenOrganen und Geweben

ZNS: NR diffundiert sofort nach i. v. Gabein die weiBe und graue Substanz. Die Blut­Himschranke ist fur NR keine wirksameBarriere. Makroskopisch ist die graue Substanzstets starker angefarbt als die weiBe (vgl. KOENIG1968). Die Lysosomenfarbung ist - auch inner-

halb eines Neurons - unvollstandig. NR-indu­zierte Autophagosomen oder NR-Krinom an­derer Genese werden nicht beobachtet. DieEntfarbung des Organs ist in unseren Versuchennach 2 h im wesentlichen abgeschlossen. Ledig­

lich Lipopigment kann langer angefarbt bleiben.- Die von uns beobachtete NR-Anlagerung anMyelin (s. S. 18) und Keme (s. S. 26) wird von

KOENIG (1968, 1969) nicht beschrieben. Ge­legentlich lassen sich auch bei Vitalfarbung wienach Schnittfarbung <helle> und <dunkle> Neu­rone aufgrund einer angedeuteten diffusen

42 . J. WINCKLER

Abb.49. Panethsche K6rncrzelle 6 Std. nach NR-Gabe. Die Zelle ist durch Sekretgabe erheblich geschrumpft.1m Cytoplasma fmdet man einen gro13en, u. a. aus Myelinfiguren zusammengesetzten Einschlu13k6rper.Fixierung: Glutaraldehyd/Os04 • I07oofach.

Figure 49. Paneth cell 6 h following NR injection. Loss of cytoplasmic mass following the discharge of secre­tory granules. A big cytoplasmic inclusion body containing myelin figures can be seen. Fixation: Glutaraldy­hyde/Os04 • Magn. X 10,700.

Cytoplasmafarbung unterscheiden. - Gliazellensind nicht selektiv sichtbar zu machen. Pericytenzeigen stets eine kraftige Anfarbung ihrer Lyso­somen. PI. chorioideus: Nach CAMERON (1953)wird NR - im Gegensatz zu Phenolrot undOrange G - nicht aktiv aus dem Liquor cere­brospinalis resorbiert. Wir fmden eine leichtverzogerte Anfarbung der Lysosmen des Epi­thels nach ca. 20 min. Der Obertritt von NR inden Liquor cerebrospinalis wird nicht beobach­tet.

Auge. Wir fmden nur im Pigmentepithel einemaBig starke Lysosomenfarbung (ca. 20 min

nach NR-Gabe). In der Sklera wird eine kraftigeKollagenfluorescenz durch NR-Anlagerung be­obachtet. Literatur zur NR-Vitalfarbung findetsich bei VONWILLER (1928). HARRIS et aI. (1958)berichten tiber eine Beeinflussung des Kationen­transports in der Linsenkapsel durch NR.

Hypophyse. Neben der NR-Vitalfarbungbasophiler Zellen des Hypophysenvorderlappenund einer schwiicheren Anfarbung der Zellendes Zwischenlappens (S. 19ff.) haben wir regel­maBig eine deutliche Anfarbung des Neurose­krets im Hypophysenhinterlappen beobachtet.Sie setzt gleich nach Injektionsende ein und laBt

VitaWirbung mit Neutralrot . 43

makroskopisch den Hinterlappen tief weimotgeCirbt gegen die weniger kraftig getonteAdenohypophyse hervortreten; schon 2-3 minspater ist die Anfarbung des Hypophysenhinter­lappens wieder abgeblaBt. Mikroskopisch sinddie Herring-Korper bevorzugt angefarbt (vgl.Abb. 18); vergleichbare Abbildungen fmdensichschon bei KOHN (1910: Tafel XV, Abb.2 und 3).MILROYE und KOENIG (1971) haben im Neurose­kret saure Lipoproteine nachgewiesen, die alsBindungsort flir intravital appliziertes NR inFrage kommen konnten.

Epiphyse. Die Epiphyse ist makroskopischimmer nur schwach angefarbt. Die Lysosomen­farbung (Maximum nach ca. 30 min) istschwach.

Schi/ddruse. Das Organ farbt sich makrosko­pisch sofort sehr kraftig an und ist dadurchleicht gegen die umgebenden Gewebe abzu­grenzen. Mikroskopisch folgt der Anfarbungder C-Zellen (s. S. 20) nach 1-2 min einekraftige Lysosomenfarbung in den Follikel­epithelzellen (Abb. 37). Das Organ ist nach etwaI Std. wieder entfarbt.

Nebenschilddri-ise. Hier wird eine maBig starkeLysosomenfarbung nach ca. 30 min beobachtet.

Keh/kopf, Trachea und Lunge. a) EpitheJ. Schonnach 15 min stellen sich zahlreiche supranukleargelegene Lysosomen im respiratorischen Epitheldar. Daneben werden <gelbe> Zellen (Identi­flzierung durch kombinierte Injektion vonDOPA und NR; vgl. ERICSON et al. 1972;

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Abb·50. NR-VitaWirbung. Ratte. I min nach Farbstoffgabe. Gl. Parotis. An£;irbung der apikalen Sekret­granula. 360fach.

Abb·51 wie Abb.50. 45 min nach Farbstoffgabe. Jetzt sind die Lysosomen angefarbt, wahrend die Sekret­granula wieder entfarbt sind. 360fach.

Figure 50. NR vital staining. Rat. 1 min following the dye injection. G. parotis. Staining of apical secretorygranules. Magn. X 360.Figure 51 ans Figure 50, but 45 min following the dye injection. Now the lysosomes are stained, where as thesecretory granules now are destained. Magn. X 360.

44 . J. WINCKLER

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53Abb.52. NR-VitaWirbung. Ratte. I min nach Farbstoffgabe. GI. submandibularis. Kraftige Anfarbung derSekretgranula der verschleimten Schaltstiicke. 2Iofach.

Abb.53 wie Abb. 52. 45 min nach Farbstoffgabe. Weitgehende Entfarbung der Sekretgranula, wahrend dieLysosomenjetzt angefarbt sind. 360fach.

Figure 52. NR vital staining. Rat. I min following the dye injection. GI. submandibularis. Intensive stainingof secretory granules in cells of the mucous tubules. Magn. X 210.

Figure 53 as Figure 52, but 45 min following the dye injection. Secretory granules are nearly destained,whereas the Iysosomes now are stained. Magn. X 360.

EWEN et al. 1972) und durchwandernde Mast­zellen angefarbt (Abb. IS). b) Hyaliner Knorpel.Die Knorpelsubstanz ist sofon vollstandig vondem Farbstoff durchtrankt (s. S. 17). Die Lyso­somenfarbung der Chondrozyten beginnt nach10 min (Erstbeschreiber ARNOLD 1900); dabeifarben sich zunachst die Lysosomen in Chondro­zyten peripher gelegener Territorien und erstspater auch Lysosomen in zentral gelegenenTerritorien. Knorpelasbestose ist besonderskraftig angefarbt. Die Entfarbung des Knorpelsist nach 4 Std. fast abgescWossen. c) Lunge.Makroskopisch verzeichnen wir eine maBigestarke, rasch abblassende Anfarbung des OrgansMikroskopisch wird eine Lysosomenfarbung inLysosomen der Makrophagen des Interstitiums

und in Alveolarphagozyten (HAYEK 1953) be­obachtet.

Speicheldriisen. Die makroskopische Verfar­bung der Organe ist etwas schwacher als die desPankreas. Mikroskopisch wird nach Abblassender Anfarbung der Sekretgranula (s. S. 40) nachca. I Std. eine vollstandige Lysosomenfarbungin den Driisenzellen erreicht (Abb.50-53). Ge­ringe NR-Mengen konnen wahrscheinlich mitdem Speichel sezerniert werden (vgl. KRAUSE1901; v. MOLLENDORFF 1925; MATHYS 193 I). ­Die Drusen sind makroskopisch nach ca. 4 Std.wieder entfarbt.

Pankreas. Die altere Literatur (vgl. BENSLEYI9II; PARAT 1928; LUDFORD 1928, 1930;GATENBY I9JI, 1954; LACY 1954; HIRSCH 1932,

1955) beschaftigt sich im wesentlichen mit derBeziehung bzw. Identitat von NR-Granulumund Golgi-Apparat. HIRSCH (1932; vgl. auchALOUSI et al. 1966) bezieht die im Hungerzu­stand und nach Pilocarpingabe unterschiedlichgroBe Anzahl mit NR anfarbbarer Granula aufdie unterschiedliche Permeabilitat der Zellwandfur den Farbstoff (Disk. s. S. 67). RIES (1934)erkennt das NR-Granulum eindeutig als pra­existente Organelle «Lipochondrium» und ord­net diese dem Sekretionszyklus zu (vgl. auchBENSLEY 19II; LUDFORD 1930; HIRSCH 1955).JARVI (1941) und SLUITER (1944) bestreiten jedeVerbindung von NR- und Zymogengranulum(vgl. auch COVELL 1929 und GATENBY 193 I).LUDFORD (1930); MORGAN (1953, 1958, I968a);MORGAN et al. (1966); ALOUISI et al. (1964, 1966,1968); KOVACS und REZ (1970); REZ undKOVACS (1971) halten samtliche NR-Granulaflir neuentstandene Gebilde; JARVI (1941) willKrinombildung im Pankreas nach NR-Gabe nurbei ganz jungen Tieren bzw. nach intravenoserVerabfolgung des Farbstoffs gesehen haben(Disk. s. S. 32ff. und S. 57ff.)

Die eigellen Beobachtl/nge1l stimmen mit denAngaben von LACY (1954) liberein. Makro­skopisch sind die exokrinen Anteile des Pan­kreas zunachst kraftig violett, die Langerhans­schen Inseln tiefrot gefarbt. Die InselzellfarbungverblaBt innerhalb von 2 Std. (s. S. 25); dieEntfarbung der exokrinen Drlisenteile ist da­gegen erst nach ca. 24 Std. abgeschlossen. Licht­mikroskopisch (in Obereinstimmung mit LACY1954) werden von vornherein in den Zellen vor­handene Lysosomen angefarbt; ihre Zahl bleibtinnerhalb der folgenden Stunden (auch nachReinjektion des Farbstoffs) konstant. Dement­sprechend haben wir bei unseren elektronen­mikroskopischen Kontrollen die von BYRNE(1964a, b); MORGAN et al. (1966); ALOUSI et al.(1968) und REz und KOVACS (1971) beobach­teten Segregationsvorgange nicht gesehen.Lediglich in einem Fall waren - bei normalemlichtmikroskopischem Befund der Vitalfar­bung - in vereinzelten Drlisenendstlicken zahl­reiche <myelinated bodies> sichtbar; die Totungdieses Tiers erfolgte 30 min nach NR-Gabe, alsoerheblich vor der Zeitspanne, die zur Entwick-

ViraWirbung mit Neutralrot . 45

lung von NR-Krinom angegeben wird (vgl.REZ und KOVACS 1971). Wir erwahnen dies,weiI offensichtlich atypische Autophagosomenauch ohne NR-Induktion gebildet werden kon­nen (vgl. WITTEKIND et al. 1970, S.280). - DieExkretion geringer Farbstoffmengen mit demPankreassaft ist anzunehmen, deren Ausschei­dung tiber Exocytose NR-gefarbter Lysosomen(COVELL 1929; MORGAN 1968a) halten wir da­gegen fur unwahrscheinlich.

Leber. Die Leber ist das nach Vitalfarbung mitNR ncben Niere und Schilddruse am intensiv­sten gefarbte Organ. Trotzdem liegen uberdieses Organ relativ wenig Untersuchungen zurNR-Vitalfarbung VOL BERG (1922) hat peribili­are Korperchen in Gewebsproben menschlicherLeber supravital gefarbt. CHLOP1N (1927) hatNR-Krinom - im Gegensatz zu den nachfolgen­den Untersuchern - ausschlieBlich in Kupffer­schen Sternzellen beobachtet. PFUHL (1938) be­richtet, daB die in der Leber mit Trypanblauanfarbbaren Granula auch mit NR darstellbarsind (vgl. NASSONOW 1930; SEK1 1933,1935) undbetont im ubrigen die groBen Speciesunter­schiede in der Anfarbbarkeit peribiliarer Korper­chen (vgl. auch SJOSTRAND 1944). Mit Einfuh­rung der AOYAMAtechnik und der Elektronen­mikroskopie hat die NR-Farbung der Leber er­neut Interesse gefunden, besonders in Hinblickauf die Genese des NR-Krinoms (HAFIEK undKOVACS 1964; KOVACS 1964; KOVACS undHAFIEK 1964; MORGAN et al. 1966; ALOUS1 et al.1968; MADARASZ und KOVACS 1968; KOVACS1968). HAFIEK und KOVACS (1964) und KOVACSund HAFIEK (1964) finden sich Hinweise auf dieInhibition der sauren Phosphatase durch NR.Diese Autoren vermuten <certain relationship(s)between lysosomes and dye granules. Either thedye is accumulated in the lysosomes or the latterfuse with the forming dye granule while loosingpartly or completely their acid phosphataseactivity.>

In den eigenen Versuchen ist der auffalligstemakroskopische Befund die nach NR-Injektionsich allmahlich entwickelnde Gewichtszunahmedes Organs bis uber das 1,3fache des Normal­gewichts. Die Ursache ist wahrscheinlich cineWassereinlagerung in durch NR geschadigte

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Hepatozyten (s. S. 63). Die Massenzunahmeiiberdauert die Entfarbung des Organs (zwischen24 und 36 Std.; vgl. auch HAFIEK und KOVACS1964) und besteht unvermindert noch nach48 Std. 1m Gegensatz zur - sehr intensiven ­Verfarbung der Leber gleich nach Beendigungder Farbstoffinjektion setzt die Lysosomen­farbung erst nach 30 bis 45 min ein; die Lyso­somen sind nach ca. 3 Std. wieder entfarbt. Dieausgepragte Differenz zwischen Organ- undLysosomenfarbung wird durch extralysosomaleFarbstoffbindung verstandlich (s. S. 36ff). - JmGegensatz zu HAFIEK und KOVACS (1964) undKovAcs und HAFIEK (1964) sehen wir keineMinderung der histochemisch faBbaren Aktivi­tat der sauren Phosphatase. Auch fur die Ent­stehung von NR-Krinom gibt es in unserenVersuchen keinerlei licht- und elektronen­mikroskopischen Anhalt (vgl. S. 32). - Erstaun­lich ist, daB - abgesehen von REz und KOVACS(1973) - keiner der genannten Autoren die An­gaben von CHLOPIN (1927) hinsichtlich derKrinomansammlung in Kupfferschen Sternzellenbestatigt. In ihnen kommt es innerhalb von12 Std. nach der NR-Injektion zu einer unver­kennbaren Zunahme schmutzig braun gefarb­ter, saure Phosphatase-negativer, PAS-negativer,nicht oder schwach mit Methylenblau anfarb­barer Cytoplasmaeinschliisse, die die Zelleninsgesamt betrachtlich vergroBern (Abb. 67). DieAnzahl der Lysosomen scheint in diesen Zellenvermindert zu sein. Nicht aIle Sternzellen zeigendie beschriebenen Veranderungen; die vergro­Berten Zellen fmden sich vorwiegend in der Naheder Glisson-Trias. Die Cytoplasmaeinlagerungensind nach nach 48 h ohne Schwierigkeit erkenn­bar (vgl. S. 61 f[) - Der Inhalt der Gallengange ist60 minnachFarbstoffgabe schwach angefarbt. DieFarbstoffeliminierung mit der Galle diirfte sichin begrenztem Rahmen halten. Den von MOR­GAN et al. (1966) beschriebenen Obertritt vonNR-gefarbten Granula in das Lumen der Gallen­kapillaren haben wir weder licht- noch elek­tronenoptisch beobachtet.

Milz. 1m Unterschied zu allen anderen Orga­nen wird hier eine verzogert einsetzende und inden ersten Stunden nach NR-Gabe allmahlichstarker werdende makroskopische Anfarbung

des Organs beobachtet. Die Entfarbung ist in36 h noch nicht abgeschlossen. Wie bei derLeber (s. 0.) bzw. nach Trypanblau-Gabe(BARKA et al. 1961) ist eine zeitweise erheblicheVergroBerung des Organs zu beobachten, dieerst nach ca. 6 h erkennbar wird und nach Ent­farbung des Organs fortbestehen kann. Erst30 min nach NR-Gabe kommt es allmahlich zueiner Anfarbung der kleinen nicht sehr haufigenLysosomen der Lymphozyten und einer krafti­geren Anfarbung der groBeren Lysosomen vonMakrophagen. Diese Zellen findet man in derRattenmilz an zwei Stellen: locker verstreutinnerhalb der Lymphfollikel und als ziemlichdichten Saum urn die Lymphfollikel herum(s. auch STREEFKERK und VEERMAN 1972 undAbb.68 und 69). Die innerhalb des Lymphfol­likels gelegenen Makrophagen zeigen dabeineben der Lysosomenfarbung zunehmend wein­rot angefarbte groBe runde Cytoplasmaein­schliisse, die im wesentlichen Kernfragmentephagozytierter Zellen darstellen, wie wir sie inLymphknoten-Makrophagen wiederfmden (s.S. 61). Die im Randbereich der Lymphfollikelgelegenen Makrophagen zeigen dagegen fastausschlieBlich die Einlagerung eines schmutziggraubraunen Pigments, das mit dem der Kupffer­Zellen identisch sein durfte (s. S. 61 und Tab. 9).Wie dort ist es PAS- und saure Phosphatase­positiv sowie nicht oder schwach mit Methylen­blau anfarbbar. Es scheint, soweit lichtmikro­skopisch erkennbar, auch extrazellular auf demSinusendothel abgelagert werden zu konnen(vgl. STOLARSKY und HALEY 1951). ZahlreicheMakrophagen in der roten Pulpa phagozytierendieses Material nicht (Abb. 69).

Lymphknoten und Lymphjollikel des Darms. Siesind nach NR-Gabe sofort kraftig gefarbt. DieLysosomenfarbung der Lymphozyten ist ver­zogert (Maximum nach 60 min). Die Lysosomender Makrophagen werden dagegen eher undkraftiger angefarbt. Daneben sieht man inMakrophagen (wie in denen der Milzfollikel)schon nach 15 min und dann innerhalb dernachsten Stunden zunehmend groBe, weinrotgefarbte Cytoplasmaeinschllisse, die durch Nach­farbung mit Kernfarbstoffen und elektronen­mikroskopisch als Kernfragmente erkennbar

werden (Abb.71-74 und S.61). Wie bei vonKupfferschen Sternzellen der Leber konnen dieZellen durch die Inkorporation derartiger Frag­mente erheblich vergroBert werden. Diese ZeIl­vergroBerung der Makrophagen ist noch nach48 Std. nachweisbar. Die Lymphknoten und-Follikel sind nach 4 Std. praktisch entfarbt;die Cytoplasmaeinschllisse der Makrophagenkonnen auch nach Entfarbung noch durch Rein­jektion von NR sichtbar gemacht werden. ­Das in Leber und Milz beobachtete Pigment mitgraubrauner Eigenfarbe wird in Lymphknotenund Lymphfollikeln nicht gesehen.

Nebenniere. In Organguerschnitten erkenntman in den ersten 30 min nach NR-Gabe nebendem tiefroten Mark (s. S. 20) eine weniger in­tensivc rotbraune Anfarbung der Zona glomeru­losa und reticularis. Die NR-Farbung der Zonaglomcrulosa scheint an Lysosomen der Drlisen­zellen, die der Zone reticularis vorwiegend anlipopigmenthaltige phagozytierende Zellen imSinusendothel (BACHMANN 1955, S.217-218)gebunden zu sein. Bei alteren Tieren werden inder Zona fasciculata vereinze!t 6-10 (Lm groBerunde, in den Drlisenzellen gelegene Korperangefarbt. Sie geben eine positive PAS-Reaktion,zeigen maBige Aktivitat beim histochemischenNachweis der sauren Phosphatase, maBige oderfehlende Autofluorescenz bei ausgepragter Dop­pelbrechung und sind dadurch den Spharoid­korpern verwandt (BACHMANN und BOHLKE1955; BACHMANN et al. 1962).

Hodcn. Makroskopisch ist das Organ stetsschwach angefarbt. Die Lysosomen des samen­bildenden Epithe!s sind nie, die der LeydigschenZwischenzellen stets schwach gefarbt. Danebenwerden in einzelnen Tubuli in der Schicht derSpermatozyten I. Ordnung reihenweise toteKerne dargestellt; offenbar handelt es sich hierum den Untergang ganzer Zellgenerationen. ­Die u. a. bei H1RSCHLER und MONNE (1928) ab­gebildcte NR-Farbung des Akrosoms haben wirnie beobachtet.

Nebenhode1l uud Ductus deferens sind stetsschwach gefarbt. Supranuklear lassen sich nachca. 30 min einige Lysosomen darstellen.

Cl. vesiwlosa. Bei maBig starker Anfarbungdes Organs werden die Lysosomen erst nach

VitaWirbung mit Neutralrot . 47

ca. 12 Std. verzogert angefarbt (s. S.31). DasLumen bleibt ungefarbt.

Ovar. Bei mittelstarker Organverfarbungwerden 15 min nach NR-Gabe in interstitiellenZellen grobgranulare Cytoplasmaeinschli.isseangefarbt. Die gefarbten Zellen entsprechen den<Fluorocyten> und sollen mit den Stromalutein­zellen identisch sein (HAMPERL 1969), werdenjedoch von anderen Autoren (vgl. UNSICKER1971) als <Pigmentzellen> gegen die hormon­produzierenden Zellen abgegrenzt. Eine Zu­nahme der Cytoplasmaeinschllisse dieser Zellennach NR-Gabe wird - im Gegensatz zu denMakrophagen der Milz und der Lymphknoten­nicht beobachtet; einige dieser Einschllisse blei­ben stets ungefarbt. - Die Lysosomen des Folli­kelepithels sind nach 30 min schwach angefarbt;NR-gefarbte Strukturen der Eizelle haben wirnie beobachtet. In Corpus luteum-Zellen wirdeine schwache und unvollstandige Lysosomen­farbung erst nach 45-60 min gesehen.

Uterus. In den Epithelzellen der Mucosa wirdeine schwache, in kleinen Makrophagen derTunica propria eine kraftige Lysosomenfarbungbeobachtet.

Placenta. Bei makroskopisch schwacher Or­ganfarbung wird in den Deziduazellen derBasalplatte, die in der Nahe weitlumiger Venenliegen, eine kraftige granulare Farbung desCytoplasmas beobachtet (Abb.54). DieselbenGranula sind auch durch histochemischen Nach­weis der sauren Phosphatase darstellbar. 1mzweiten Drittel der Tragzeit zeigt ein Teil dieserZellen intensive Kernfarbung als Zeichen desZelluntergangs. - In der librigen Placenta undim Amnion wird keine Lysosomenfarbung ge­sehen.

Muskulatur. Wahrend die Herzmuskulaturre!ativ kraftig angefarbt ist, sind Skelett- undglatte Muskulatur nur schwach gefarbt. Nur inder Herzmuskulatur wird gelegentlich eineschwache Lysosomenfarbung in Kernnahe er­kennbar. Hier kann auch (innerhalb der ersten30 min nach NR-Gabe) der A-Streifen leichtgetont sein. - In der Skelettmuskulatur werdenneben vollig ungefarbten kraftig rosa gefarbteMuskelfasern beobachtet, haufig mit leichterKernfarbung. Eine Zuordnung zu den Muske!-

48 . J. WINCKLER

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54

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Abb.54. NR-VitaWirbung. Ratte. IO min nach Farbstoffgabe. Uterus eines trachtigen Tiers am 16. Tag derGraviditat. Anfarbung groBer Zellen in der Wand weitlumiger Venen des maternen Teils der Placenta.420fach.

Figure 54. NR vital staining. Rat. IO min following the dye injection. Uterus at day 16 of gravidity. Granularstaining in big cells in the wall of wide venous blood vessels of the maternal part of the placenta. Magn. X 420.

fasertypen steht aus. Motorische Endplattenhaben wir nie angefarbt gesehen (vgl. ZACKS1964).

Epidermis. Da eine Lysosomenfarbung derEpidermiszellen nicht gesehen wird und dieCytoplasmafarbung nur f1uorescenzmikro­skopisch erkennbar ist, diirfte die nach NR-Gabesichtbare Rotung der Haut vor allem auf einerNR-Farbung der Kollagenfasem des Coriumsberuhen.

Mesothel und serose Hohlen. In Mesothelzellenwerden keine Lysosomen dargestellt. Eine NR­Exkretion in den Pleura- bzw. Peritonealraumist nicht erkennbar.

Die Ausscheidung von NRin Niere und Darm

NR wird vorwiegend in der Niere ausge­schieden (Ausscheidungsdiagramm s. Abb.82).

Mit den Faeces werden dagegen nach eigenerSchatzung innerhalb von 48 Std. unter 5% derinjizierten Farbstoffmenge eliminiert (vgl. KIN­DEL 1960). Nach MORGAN (1968b) sollen nuretwa 40% der applizierten Dosis im Ham er­scheinen; ein Abbau des Farbstoffs im Organis­mus wird deshalb diskutiert (MORGAN et al.1966).

a) NR-Ausscheidung in der Niere

Nach NR-Injektion farben sich als erstes dieLysosomen des proximalen Hauptstiicks an(s. S. 27). 1m Endham erscheint erst nach10-15 min. Dem entspricht, daB im histologi­schen Schnitt der Farbstoff erst 15 min nachi. v. Injektion im Lumen des distalen Nephronsund Sammelrohrsystems in einer im Mischlichterkennbarer Konzentration nachgewiesen wer­den kann (Abb. 55). 1m Glomerulum undLumendes proximalen Hauptstiicks ist NR nicht, im

Lumen der Henle-Schleife nur in fluorescenz­mikroskopisch erfaBbarer Konzentration sicht­bar.

Es stellen sich vor allem drei Fragen: I. Wiekommt es zur Lysosomenfarbung im Epitheldes proximalen Hauptstiicks? Dringt der Farb­stoff iiber das basale Labyrinth oder vom Tubu­luslumen her (v. MOLLENDORFF 1930) in dieEpithelzelle ein? 2. Warum farben sich nur dieLysosomen des proximalen, nicht aber die desdistalen Nephrons und Sammelrohrsystems?3. Welcher Mechanismus bewirkt die Konzen­trierung von NR im Endham?

VitaWirbung mit Neutralrot . 49

Zur Klarung der Fragen haben wir NR durchMikroinjektion direkt in den Tubuluslumeninjiziert. Grundsatzlich erhalt man das gleicheBild wie nach i. v. Injektion des Farbstoffs(Abb. 57): Die Lysosomen der Sc, S2- und be­ginnenden SrSegmente werden vollstandig an­gefarbt; in Mittelstiicken und Sammelrohren istkeine Lysosomenfarbung erkennbar. Lediglichdie Anfarbung eines schmalen unter den Mikro­villi gelegenen Saums (s. auch S. 65) und derAusfall von NR iiber dem Biirstensaum (s. Insetzu Abb.57) aufgrund der Alkalitat des Primar­hams werden bei i. v. Injektion des Farbstoffs

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Abb. 55. NR-VitaWirbung. Ratte. 20 min nach Farbstoffgabe. Niere. 1m Sammelrohrlumen (X) ist der Farb­stoff in hoher Konzentration nachweisbar. Der Pfeil zeigt auf eine abgestorbene Zelle mit Cytoplasma- undKernEirbung. pofach.

Abb.56. NR-VitaWirbung. Ratte. 5 min nach Farbstoffgabe. Fluorescenzmikroskopie. Niere. Intensivediffuse NR-Fluorescenz im Cytoplasma vereinzelter Zellen des Verbindungsstiicks (vgl. BUCHER undKRSTlC, 1971). Die Lumina sind zu diesem Zeitpunkt noch £rei von Farbstoff. M = Mittelstiick. P = proxi­males Konvolut.V = Verbindungsstiick. 210fach.

Figure 55. NR vital staining. Rat. 20 min following the dye injection. Kidney. The dye has been accumulatedin the lumen of a collecting duct (X). The arrow shows a dead cell characterized by staining of the cytoplasmand nucleus. Magn. X po.

Figure 56. NR vital staining. Rat. 5 min following the dye injection. Fluorescence microscopy. Kidney.Intensive diffuse NR-fluorescence in the cytoplasm of some cells of the connecting tubule (see BUCHER andKRSTlC, 1971). The lumina seem to be free from the dye. M = distal segment. P = proximal convolution.V = connecting tubule. Magn. X 210.

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123

4Abb. 57. NR-VitaWirbung. Ratte. Niere. 2 min nach Mikroinjektion von NR ins Tubuluslumen. Anfarbungder Lysosomen im proximalen Konvolut. AuBerdem wird ein unter dem Biirstensaum gelegener apikalerCytoplasmaabschnitt diffus gefarbt. Ferner sind an den injizierten Tubulus angrenzende Nephrone mit ange­farbt; hier feWt die Anfarbung des apikalen Cytoplasmasaums. I1oofach. Inset: Tubulusepithel nahe der In­jektionsstelle: 1m alkalischen Primarharn ausgefallenes NR hat sich iiber dem Biirstensaum abgelagert (I);der Biirstensaum ist ungefarbt (2); das apikale Cytoplasma ist diffus bis feingranular angefarbt (3); Basal­membran (4). 1450fach.

Figure 57: NR vital staining. Rat. Kidney. 2 min following microinjection of NR into the tubulus lumen.Lysosomal staining in the proximal convolution. Furthermore staining of a narrow band just beneath themicrovilli. The proximal tubules in the vicinity, too, show lysosomal staining here; the staining of the apicalcytoplasm ist not seen. Magn. X I100. Inset: Tubular epithelium more proximal to the place where NR wasinjected. In the alkaline ultrafiltrate a part of the injected NR is forced to fall out from solution and lies on topof the microvilli (I); the microcilli are unstained (2); the apical cytoplasm shows diffuse to fine granularstaining (3); basement membrane (4). Magn. X 1450.

Normaltieren nicht gesehen. Abb.57 demon­striert zugleich, daB NR erstaunlich rasch dieTubulusepithelzelle basal wieder verlaBt undnun in benachbarten Tubuli eine Lysosomenfar­bung bewirkt. Damit ist bewiesen, daB NR so­wohl von der GefaB- als auch von der Lumen­seite her (vgl. auch HAYMAN 1925) eine Lyso­somenfarbung bewirken kann. Die Geschwin­digkeit, mit der nach Mikropunktion des Tu­buluslumens benachbarte Hauptstucke gefarbtwerden, legt die Vermutung nahe, daB dieLysosomenfarbung der proximalen Konvolute

nach i. v. Injektion vorwiegend von der Blut­seite und nicht uber das Ultrafiltrat erfolgt.

Die Fragen zwei und drei hangen eng mit­einander zusammen; sie werden deshalb ge­meinsam beantwortet: NR erfullt als schwacheBase die Bedingungen, urn uber <Non-ionicdiffusion> (ALBERT 1952; BRODIE und HOGBEN1957; WEINER et al. 1960; LEW et al. 1962;DEETJEN 1964; HEIDLAND 1968) im Endhamkonzentriert zu werden. Eine Farbstoffkonzen­trierung im Ham durch Wasserentzug im dista­len Nephron und Sammelrohrsystem ist dagegen

Zellwond

Abb. 58. Schema der «Non-ionic diffusion» von NR.Die nicht-dissoziierte Form des Farbstoffs passiertLipidmembranen in beiden Richtungen. Die Mengedes nicht-dissoziierten Farbstoffs ist damit auf beidenSeitcn der Mcmbran etwa gleich groB. Mit sinken­dem PH liegt NR (PK 6,75) verstarkt dissoziiert vat.Der Farbstoff wird deshalb im Lumen des distalenNephrons und Magens akkumuliert.

Figure 58. Schematic drawing of "non-ionicdiffusion" of NR. The dye in the non-ionized formpasses lipid membranes in both directions. Thereforeon both sides of the membrane nearly the samequantity of non-ionized NR will be found. Withlow PH NR is increasingly ionized. By this the totalamount of dye is higher in the more acid solution.This explains the accumulation of NR in the lumenof the distal nephron and in the stomach.

stark sauren Hams, NR in betrachtlicher Kon­zentration in Losung zu halten, mit der mog­licherweise vorhandenen Fahigkeit der Lyso­somen, den Farbstoff zu binden. - Bestarkt wer­den wir in diesem Erklarungsversuch durch einekraftige Lysosomenfarbung in dilatierten, offen­sichtlich nicht mehr durchstromten Sammel­rohren der Nieren alter Tiere. - Die PH-Diffe­renzen des Hams im proximalen Hauptstuckund Mittelstiick sind dagegen nicht groB genug,um die hier beobachteten Unterschiede derAnfarbbarkeit der Lysosomen hinreichend zuerklaren (GOTTSCHALK et al. 1960). Hier kanndie unterschiedliche Zusammensetzung derLysosomenmatrix die maBgebliche Rolle spie­

len. - Fur eine Exkretion von NR durch Exo­cytose NR-gefarbter Lysosomen bzw. von NR­

Krinom (HOBER und KONIGSBERG 1905 ; SCHMIDT1960, 1962) fmdet sich in unseren Praparaten ­auch elektronenmikroskopisch - kein Anhalt(vgl. v. MOLLENDORFF 1915, 1923).

nur schwer mit der universellen Membran­gangigkeit von NR vereinbar. Hinweise fLireinen aktiven Transport fehlen bisher (vgl.

NAGEL 1931; CAMERON 1953; DINGLE undBARRETT 1969).

Unter <Non-ionic diffusion> versteht man dieFahigkeit schwacher Sauren und Basen, aufgrundihrer Lipoidloslichkeit in nichtdissoziierter Form

lipoidhaltige Membranen, z. B. die Zellwand(OVERTON 1900; KEDROWSKI 1931; DAVSON undDANIELL! 194-3; vgl. auch ROBBINS 1960: Pene­trationsrate von Acridinorange in Zellen in Ab­hangigkeit yom PH) zu durchdringen und sichauf beiden Seiten dieser Membran in Konzen­trationen einzustellen, die durch den Disso­ziationsgrad bei vorliegendem PH auf beidenSeiten der Trennwand bestimmt werden. FlirNR, das als basischer Farbstoff in saurem Milieuvorwiegend dissoziiert vorliegt (PK = 6,75;KOLTH)FF 1924-), ist damit die Wanderungs­richtung in den zunehmend sauren Ham desdistalen Nephrons (GOTTSCHALK et al. 1960)vorgegeben (Abb. 58), d. h., daB es hier zu einerAkkumulation des Farbstoffs im Lumen kommt.

Ober denselben Mechanismus ist im proxi­malen Hauptstiick die Ri~ckdi.BiISioll ultraflltrier­ten NR aus dem Tubuluslumen erklarbar

(PH des Primarhams wie des Bluts etwa 7,4-:GOLDSTEIN et al. 1962, S. 202; intrazellular PH7,0: FINGLE und WOODBURY 1970). 1m Kllrzzeit­versuch mit Mikroinjektion des Farbstoffs in dasTubuluslumen erganzen und potenzieren sichhier <Nonionic diffusion> und Bindungsfahig­keit der Lysosomen des proximalen Hauptstucks;die Riickbindung des injizierten Farbstoffs kanndeshalb sehr vollstandig sein. 1m Langzeitver­such mit Mikroinjektion von NR werden dieBindungskapazitaten in den Lysosomen all­mahlich erschopft; das gleiche ist nach i. v.Injektion von NR wahrscheinlich sehr bald derFall, da hier der Farbstoff nicht allein yomTubuluslumen, sondem - wahrscheinlich sogar

vorwiegend - von GefaBseite angeboten wird.Ais Erklarung fiir das Ausbleiben einer Lyso­

somenfarbung in den Epithelzellen der Sammel­rohre bietet sich folgende Moglichkeit: Hierkonkurriert die - sich durch den dauemdenHamfluB standig emeuemde - Fahigkeit des

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VitaWirbung mit Neutralrot . 51

Horn d 5 dlstolen ephrons P... 5,0ogensof PH ,5

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52 . J. WINCKLER

b) NR-Ausscheidung im Magen­Darmtrakt

Die groBe PH-Differenz zwischen Blut (7,4)und Magensaft (1,5) legt zwingend nahe, fur dieKonzentrierung von NR im Magenlumen denMechanismus der Non-ionic diffusion als Ur­sache anzusehen (vgl. Abb.58). Nach BRODIEund HOGBEN (1957) stammt von SHORE dererste Hinweis auf die Non-ionic diffusion vonBasen ins Magenlumen: SHORE hat Levorphanol(Dromoran®) parenteral verabfolgt und dann imMagensaft in 40 ml hoherer Konzentration alsim Blut wiedergefunden. Entsprechende Be­obachtungen sind jedoch weit alter: HARVEYund BENSLEY haben bereits 1912 die Ausschei­dung parenteral gegebenen NRs ins Magen­lumen mitgeteilt (vgl. auch SAXL und SCHERF1922; FINKELSTEIN 1923; DAWSON und Ivy 1925;GLASSNER et al. 1925; WINKELSTEIN und MAR­CUS 1929; HOERR 1936; OSTROUCH 1937).GLASSNER et al. (1925) und WINKELSTEIN undMARCUS (1929) haben die Beziehung zwischenNR-Konzentration im Magensaft und der Bil-

dung des Magensafts klar erkannt und die NR­Ausscheidung durch die MagenscWeimhaut alsTest fur Achylia gastrica vorgeschlagen. NRwurde jedoch als Indikator der Sekretmenge undnicht des PH angesehen (vgl. KOEHRING 1930).

In den eigenen Versuchen erfolgt die Aus­scheidung von NR durch die Magenschleimhauterstaunlich rasch: Bereits 30 sec nach Injektions­ende liegt der Farbstoff der Schleimhaut alsdicke tiefrote Schicht auf. IO min spater scheintdie Farbstoffeliminierung hier zum groBten Teilabgeschlossen zu sein. Es ist - im Gegensatz zuAngaben von HARVEY und BENSLEY (1912),HOERR (1936) und OSTROUCH 1937) - unwahr­scheinlich, daB NR ausschlie13lich durch die Be­legzellen ausgeschieden wird. Vielmehr findetsich NR auch im Lumen der Pylorusdrusen inbetrachtlicher Konzentration und auch dieSekretgranula der Hauptzellen konnen rot ge­farbt sein (vgl. auch HOERR 1936, Abb.l). DieAnfarbung der Belegzellen ist in den eigenenPraparaten nie besonders kraftig und am leichte­sten noch fluorescenzmikroskopisch zu erkennen(Abb. 59 und 60).

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Abb. 59. NR-VitaWirbung. Ratte. 2 min nach Farbstoffgabe. Mucosa des Corpus ventriculi. NR fmdet sich inhoher Konzentration im Lumen der Magendriisen. Auch in den Sekretkapillaren der Belegzellen kann derFarbstoffnachgewiesen werden (pfeil). Das Cytoplasma der Belegzellen bleibt weitgehend ungefarbt. 42ofach.

Figure 59. NR vital staining. Rat. 2 min following the dye injection. Mucosa of the oxyntic part of thestomach. NR is found in high concentration in the lumen of the stomach glands. It can be demonstrated inintracellular secretory capillaries of the parietal cells (arrow). The cytoplasm of the parietal cells shows nearlyno reddening. Magn. X 420.

VitaWirbung mit Neutralrot . 53

Abb.60. NR-VitaWirbung. Ratte. 30 sec nach Farbstoffgabe. Fluorescenzmikroskopie. Mucosa des Corpusventriculi. Kraftige NR-Fluorescenz im Cytoplasma der Belegzellen. AuBerdem fluoresciert ein schmalerapikaler Saum der Hauptzellen (Pfeil). 260fach.Abb.6I. NR-Vitalfarbung. Ratte. 60 min vor Totung erhielt das Tier DOPA i. v., I min vor Totung NR i. v.Fluorescenzmikroskopie eines gefriergetrockneten Kryostatschnitts 1 Std. nach Formaldehydbedampfungbei 50° C. Mucosa des Corpus ventriculi. Die NR-Fluorescenz im Cytoplasma der Belegzellen (vgl. Abb. 60)ist im UV-Licht recht instabil und in diesem Bild nur noch fein granular erkennbar (Pfeile). Die Dopamin­fluorescel1Z der «Enterochromaffin-like cells» ist relativ stabil. Belegzellen zeigen keine Affinitat zu DOPA,«Enterochromaffin-like cells» keine zu NR. G = GefaB mit adrenergen Terminalfasern. 260fach.

Figure 60. NR vital staining. Rat. 30 sec following the dye injection. Fluorescence microscopy. Oxyntic partof the stomach. Intensive NR-fluorescence in the cytoplasm of parietal cells. Furthermore some fluorescencein the apical cytoplasm of schief cells is seen (arrows). Magn. X 260.

Figure 61. NR vital staining. Rat. 60 min before sacrifice DOPA was intravenously injected; I min beforesacrifice in addition NR was injected. Fluorescence microscopy of a frozen dried cryostat section that wastreated with formaldehyde vapour (1 h; 50° C). Mucosa of the oxyntic part of the stomach. The NR-fluores­ccnce in the cytoplasm of the perietal cells (comp. fig. 60) rapidly fades away, 1 min following the expositionto UV light only some granular staining remains (arrows). In contrast the dopamin-fluorescence of the"enterochromaffm-like cells" is relatively stable. Parietal cells show no affmity to intravenously injectedDOPA, "enterochromaffin-like cells" no affmity to NR. G = artery with adrenergic terminals. Magn. X 260.

54 . J. WINCKLER

Die am Grund der Magendriisen gelegenenBelegzellen sind fluorescenzmikroskopisch inder Regel kraftiger tingiert als die lumennahen.1m Hinblick auf die beschriebenen Analogienin der Verteilung von Katecholaminvorlaufernund NR nach parenteraler Verabfolgung (s.S. 22/£) stellte sich uns die Frage, ob mit derNR-Vitalfarbung die <Enterochromaffin-like cells>(AmEs und HAKANSON 1968; HAKANSON et al.1970; LEFRANC und PRADAL 1971) sichtbar ge­macht werden; denn diese sollen nach PENTILLAund HIRVONEN (1969) und PENTILLA (1970) mitbasal gelegenen undifferenzierten Stammzellender Belegzellen identisch sein. Urn dies zupriifen, haben wir 30 bzw. 60 min vor NR­Gabe DOPA i. v. appliziert und nach Formal­dehydbedampfung der gefriergetrocknetenKryostatschnitte die Verteilung der NR-ge­farbten Zellen (Gelb-Orange-Fluorescenz; insta­bil) mit der der Zellen mit Katecholaminfluores­cenz (Gelbgriin-Fluorescenz; relativ stabil)fluorescenzmikroskopisch untersucht (Abb.61).Die Praparate sprechen dafiir, daB DOPA­speichernde Zellen und Belegzellen nichts mit­einander zu tun haben, zumal jedes Obergangs­stadium fehlt.

Das ans Lumen des Magen-Darmtrakts abge­gebene NR wird dort wahrscheinlich an Schleimgebunden, wodurch die Riickdiffusion des Farb­stoffs verzogert wird. So ist der lnhalt des Duo­denums und oberen Diinndarms noch nach3-6 Std. kraftig rot gefarbt (die maximale NR­Konzentration im Darmlumen kann nach Tab. 3Werte iiber 2% erreichen). Es ist durch unsereVersuche nicht auszuschlieBen, daB NR auch inoberen Darmabschnitten iiber <Non-ionic dif­fusion> ans Lumen abgegeben wird (PH-Wertes. u.). Eine nach distal wandernde Farbstoffwellewie nach Trypanblau-Gabe (v. MOLLENDORFF1925) wird bei NR nicht gesehen. Vielmehrnimmt die Farbstoffkonzentration im distalenIleum relativ rasch ab und Coloninhalt undFaeces sind nur noch schwach gefarbt. Dies laBtsich aus dem PH im Lumen der einzelnen Darm­abschnitte zwanglos erklaren: Duodenum 6,5 bis7,6; Jejunum 6,3-7.3; Ileum 7,6; Colon 7,9-8,0(DAVENPORT 1966; Hund).

Die vori.ibergehende Abgabe von NR ans

Darmlumen halt die akute Belastung der Niereund des Gesamtorganismus in Grenzen. Derrasche Konzentrationsabfall des Farbstoffs imBlut und die verzogerte Eliminierung aus demOrganismus konnen dadurch mit erklart wer­den. - 1m Unterschied zur NR-Konzentrierungim distalen Nephron und Sammelrohr erfolgtim Darm die Farbstoffabgabe und \X/iederauf­nahme weitgehend in Richtung des Wasserein­und -ausstroms aus dem Darmlumen.

Altersveranderungen derNR-Vitalfarbung

a) Alte Tiere (iiber 15 Mon.)

Die NR-Vitalfarbung setzt in allen Organen,am ausgepragtesten in der Niere, verziJ'gert ein;sie Wit haufig intensiver aus und besteht iiberlangere Zeit als bei jiingeren Tieren. Diese Ver­anderungen in der Dynamik der NR-Vitalfar­bung sind in der Niere besonders deutlich: Erstnach 3 min wird eine vollstandige Lysosomen­farbung erreicht, die noch nach 36 Std. erkenn­bar ist. Zusatzlich findet man zahlreiche mitLipopigmentzellen beladene Zellen am Ober­gang yom S2- zum SrSegment, ahnlich wienach langerem Durst (Abb.62). Der Teil desSrSegments, in dem Lysosomen angefarbtwerden, verlangert sich zur Henleschleife hin.1m Sammelrohrsystem werden dilatierte Ab­schnitte mit deutlicher Lysosomenfarbung er­kennbar (s. S. 51). - Reninzellen des juxa­glomerularen Apparats sind selten (vgl. CAINund KRAUS 1970); sie sind teilweise vergroBertund enthalten wenige groBe, unterschiedlichintensiv angefarbte Sekretgranula (Durchmesserhaufig iiber 2,5 [J.m).

Die verzogerte Anfarbbarkeit der Lysosomenkann teilweise auf eine temporare Farbstoffan­lagerung an vermehrte lnterzellularsubstanz undverdickte Basalmembran zuriickgefiihrt werden:eine verstarkte NR-Fluorescenz von Kollagen­fasern und Basalmembranen ist bei alten TierenregelmaBig zu beobachten (s. auch HAMPERL1934). Die intensivere und langerdauerendeVitalfarbung der Lysosomen geht parallel mit

Vitalfarbung mit Neutralrot ' 55

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Abb.62. NR-VitaWirbung. Altes Rattenmannchen. 5 min nach Farbstoffgabe. Niere. Charakteristisch sindeine generelle Abnahme des Durchmessers der Lysosomen im proximalen Hauptstiick und zahlreiche mitLipopigmentschollen iiberladene Zellen am Ubergang vom S2- zum SrSegment (pfeile). 360fach.Abb.63. NR-Vital£arbung. 12 Mon. altes virginelles Rattenweibchen. 5 min nach Farbstoffgabe. Niere. 1mSI-Segment finden sich groBe, kraftig mit NR anfarbbare Lysosomen. 360fach.

Figure 62. NR vital staining. Old male rat. 5 min following the injection of the dye. Kidney. In the proximalconvolution the lysosomes are smaller than normal; at the Sz-S3junction numerous cells occupied with Iipo­pigmcnt are to be seen (arrows). Magn. X 360.Figure 63. NR vital staining. 12 month old virginal rat. 5 min following thc dye injection. Big heavilystaincd Iysosomes in thc SI-segment. Magn. X 360.

einer verstarkten Bindungsfahigkeit der Lyso­somen flir basische Farbstoffe bei Schnittfarbungund in Lysosomenfraktionen, die bei der Aut­oxydation der Lysosomen zum Lipopigmentalternder Gewebe beobachtet wird (CASSELMAN195 I; GEDIGK und PlOCH 1965; DE DuvE undWATTIAUX 1966; GOLDFISCHER et al. 1966;SLATER 1969). STREHLER (1964; vgl. auchDINGLE und BARRETT 1969) hat dem Bindllngs­vermogen von Lipofuscin fiir basische Verbin­dungen groBe physiologische Bedeutung beiEntgiftungsprozessen des alternden Organismuszugeschrieben. Nicht in allen Organen hatLipopigment eine vermehrte Bindungskapazitat

fiir NR; z. B. zeigt das Lipopigment in Speichel­drusen lind N ebenhoden alter Ratten nur geringeFahigkeit, vital appliziertes NR zu binden. ­Eine eingeschrankte Exkretionsleistung derNiere, die als Ursache einer verstarkten Lyso-

somenfarbllng lind verzogerten Entfarbung derLysosomen in Frage kame, wird nach CAIN undKRAUS (1971) erst bei uber 2,25 J. alten Rattengesehen.

Deutlichstes Zeichen des Umbaus der Lyso­domenmatrix im Alter ist deren Resistenz gegendiverse Extraktionsversuche (HAMPERL 1950,1969; GEDIGK lind PlOCH 1965; PEARSE 1972).Nach BRUNK und BRUN (1972; Untersuchungan Neuronen junger und alter Ratten) sollen dieAltersveranderungen der Lysosmen mit einerLabilisierung der lysosomalen Enzyme (d. h. miteiner verringerten Latenz) einhergehen. Wenn

im BITENSKY-Test (BITENSKY 1963; GAHAN 1967,Lit.) Enzymaktivitat in Lipopigment fruher alsin Lysosomen lokalisierbar ist, kann dies jedochebensogut bedeuten, daB hier die Enzyme be­sonders ortsstandig, d. h. fester strukturgebundenvorliegen, wahrend die Hydrolasen in Lyso-

56 . J. WINCKLER

somen junger Neurone im unfixierten Kryostat­schnitt weitgehend diffundieren. In Hinblickaufdie Hypothese einer elektrostatischenEnzym­bindung an Lysosomen (KOENIG 1969, Lit.) hatdie ausgepragte Farbstoffbindung an Lipopig­ment (s. auch S. 75) eine erhebliche Bedeutung.

Die Altersveranderungen der Lysosomen­matrix sind beim Weibchen erheblich eher alsbeim Mannchen zu beobachten. Unabhangigdavon, ob das Tier trachtig gewesen war odernicht, fmdet man haufig bereits bei 6 Mon. altenTieren im proximalen Hauptstiick der Nierezahlreiche, teilweise iiber 3 fLm groBe Lipopig­mentgranula (Abb.63), in denen, meist mitleichter Verzogerung (s. CASSELMAN 1951),Hydrolasen nachweisbar sind. Granula dieserArt fehlen bei Mannchen (ZELLER 1973). Auchin der Schilddriise, in Speicheldriisen und demPankreas werden lipopigmenthaltige Lysosomenbei Weibchen friiher als bei Mannchen gesehen.Moglicherweise sind diese Veranderungen hor­monal induziert: HARRIS (1966) hat gezeigt, daBdurch Ostrogengabe Lipopigment im Haupt­stiick der Niere mannlicher und weiblicherRatten akkumuliert. WEISSMAN und SESSA (1968)berichten, daB Ostradiol im Modellversuch aufLipidtropfen <stabilisierend> wirkt. KOHL (1968)diskutiert weitere Befunde zur hormonbeding­ten Lipopigmentbildung. - Der von uns durch­gefiihrte Durstversuch (S.64) beweist, daB, un­abhangig yom Alter und Geschlecht der Tiere,innerhalb weniger Tage Veranderungen an derLysosomenmatrix eingeleitet werden konnen,die denen alter Tiere entsprechen. Zahlreiche,z. T. noch unbekannte Faktoren, beeinflussendeInnach die Lipopigmentbildung aus derMatrix der Lysosomen.

b) Junge Tiere (1 Mon. undjiinger)

1m Gegensatz zu den Befunden bei altenTieren fiihrt die NR-Vitalfarbung hier - beikraftiger makroskopischer Anfarbung allerOrgane - zu einer relativ schwachen und ausge­sprochen fluchtigen Lysosomenfarbung. In derNiere farben sich die Lysosomen sofort nachInjektionsende und sind haufig bereits nach30 min wieder entfarbt; in anderen Organen

wird iiberhaupt keine Lysosomenfarbung be­obachtet. Dabei sind die saure Phosphatase,Autofluorescenz und PAS-Reaktion der Lyso­somen (vgl. DAVIES 1954) in der Niere und eini­gen anderen Organen bereits wie bei alterenTieren nachweisbar. - Langerhanssche Insel­zellen werden ab 10., C-Zellen der Schilddriiseerstmals ab 20. Lebenstag angefarbt. Ein Farb­stoffiibertritt in das Lumen des Magens-Darm­trakt ist bis zum 20. Lebenstag nicht erkennbar.

Bine beschleunigte Eliminierung des Farbstoffsals Ursache der fliichtigen Lysosomanfarbungist unwahrscheinlich; dagegen sprechen die An­gaben zur Chemodifferenzierung der Niere(MUHLENFELD 1969) und die begrenzte Leistungs­fahigkeit des Organs in der ersten postpartalenPhase (FALK 1955; vgl. GOLDSTEIN et al. 1968,S.200). Umgekehrt kann auch die Unreife desOrgans nicht die Ursache der schwachen Lyso­somenfarbung sein (im Gegensatz zur Trypan­blau-Vitalfarbung: DE HAAN und BAKKER 1923),da die glomerulare Filtration fiir die NR-Far­bung der Niere sekundare Bedeutung hat(s. S. 48). - Eine Erhohung der FarbstoffdosisbeeinfluBt das Ergebnis der Vitalfarbung derJungtiere nicht wesentlich.

Zwei Ursachen scheinen zur flauen Lyso­somenfarbung bei jungen Ratten beizutragen:Eine geringere Bindungsfahigkeit der Lyso­somenmatrix (s. 0.) und eine relativ groBereBindungsfahigkeit des extralysosomalen Cyto­plasmas (zur Basophilie des Cytoplasmas un­differenzierter Zellen vgl. KEDROWSKI 1941).

c) Diaplacentare NR-Hirbung vonRattenfeten

NR tritt - im Gegensatz zu Trypanblau(NEBEL und HAMBURGH 1966; KRZYZOWSKA­GRUCA und SCHIEBLER 1967) - diaplacentarrasch zum Feten iiber. Diese sind makroskopischmittelstark angefarbt. Eine lysosomale Lokali­sation haben wir - auch nach Verdopplung derFarbstoffdosis - nur in Chondrozyten reprodu­zierbar nachweisen konnen (nach ca. 30 min).Daneben ist eine kraftige Rotfarbung von ZelI­kemen in Lebersinusoiden (Blutmauserung?)ein regelmaBiger auffalliger Befund. - Eine

Anfarbung endokriner Zellen haben wir nichtbeobachtet. - Der Obertritt von NR aus demmi.itterlichen Organismus in die Mutterl/li/ch unddie Anfarbung junger Ratten tiber die Mutter­milch wurde - im Gegensatz zu Trypanblau(v. MOLLENDORFF 1923) - ebenfalls nicht be­

obachtet.

VitaWirbung mit Neutralrot . 57

Reaktion des Organismus auf NR

a) Das NR-Krinom im Darm

Umer Krinom versteht man seit CHLOPIN(1927) neugebildete Cytoplasmaeinschliisse als

vitale Reaktion der Zelle (NASSONOW 1930;

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Abb.64. NR-VitaWirbung. Ratte. 6 Std. nach Farbstoffgabe. Jejunum. 1m Epithel der Krypten sind zahl­reiche, weinrot geHirbte Granula erkennbar. 400fach.

Abb.65. NR-VitaWirbung. Rattc. 6 Std. nach Farbstoffgabc. II1lJ11crsionsfixicrung des Gewebes in Bouin,H. E. Jejunum. Zahlreiche, haufig von einem hellen Hof umgebene, mit Hamalaun und/oder Eosin anfarb­bare Granula im Kryptenepithel. 960fach.

Figure 64. NR vital staining. Rat. 6 h following the dye injection. Jejunum. In the crypt epithelium numerouspink stained granula are discernable. Magn. X 400.

Figure 65. NR vital staining. Rat. 6 h following the dye injection. Immersion fixation of the tissue withBouin, H. E. Jejunum. Numerous granules, often surrounded by a bright halo, are seen; they are stainablewith hemalum and/or eosin. Magn. X 960.

58 . J. WINCKLER

ALEXANDROV 1933; MAKAROV 1934; WEISS­MANN und GILGEN 1956; EICHNER 1959) auflangerdauernde (KEDROWSKI 1941) Belastungmit basischen Vitalfarbstoffen. Sie entstehen ­zumindest primar - unabhangig von Lysosomen.Nach geeigneter Fixierung (WITTEKIND undKRETSCHMER 1972) ist <Krinom> am histologi­schen Schnitt licht- und elektronenmikrosko­pisch darstellbar. RNS und DNS wurde in ihmnachgewiesen (SCHMIDT 1958, 1960). Seine for­male Genese ist in einigen Modellgeweben ein­gehend untersucht worden (SCHMIDT 1960,1962; FEDORKO et al. 1968a, b; WITTEKIND et al.1970; vgl. auchPFEIFFER 1972).

3 bis 6 Std. nach i. v. Gabe von NR werden imEpithel der Krypten von Duodenum, Jejunumund Ileum und im unteren Drittel der Colon­krypten zahlreiche unterschiedlich groBe undunterschiedlich intensiv gefarbte Granula sicht­bar, die in den nachsten Stunden allmahlichwieder verschwinden (Abb.65). Durch Nach­injektion von NR und elektronenmikroskopi­sche Kontrolle (s. u.) konnen diese Cytoplasma­einschliisse auch nach Entfarbung noch in der

Zelle nachgewiesen werden (vgl. HAWKINS et al.1972). Ihre ZaW nimmt innerhalb der nachsten12 Std. allmahlich abo Sie scheinen demnachnicht direkt in den ProzeB der Farbstoffeliminie­rung aus der Zelle eingeschaltet zu sein (s. da­gegen SCHMIDT 1962). Die NR-gefarbten Cyto­plasmaeinschlusse der Kryptenzellen enthaltenkeine saure Phosphatase; sie sind - unvollstan­dig - mit Methylenblau oder Hamalaun nach­zufarben, zum kleineren Teil auch mit Eosinoder Lichtgrun. Auch nach sukzedaner Farbungder Schnitte mit einem sauren und einem basi­schen Farbstoff werden stets weniger Granuladargestellt als nach Vitalfarbung; Granula, diesich mit dem sauren und dem basischen Farbstoffanfarben, sind selten. Bei konventioneller Fixie­rung und Nachbehandlung des Gewebes sind dieNR-Granula hauflg von einem Schrumpfspaltumgeben (Abb.65). Weitere Charakteristikas. Tab.9.

Elektronenmikroskopisch unterscheiden sichdie einzelnen Cytoplasmaeinschlusse z. T. er­heblich: einige sind homogen mit elektronen­dichtem Material gefullt, andere enthalten u. a.

Tab. 9. <Krinom> in Kryptenzellen des Darms, Kupferschen Sternzellen der Leber und Makrophagen in Milzund Lymphknoten (Methoden s. S. 16).

NR-VitaWirbungAutofluorescenzEigenfarbe

Schnitifiirbungen:Methylenblau

Eosin o. Lichtgriin

PAS

Nachweis vonEisenCholesterinHamoglobin

Histochemischer Nachweis dersauren PhosphatasePeroxydase

Kryptenzellen I+

+(unvollstandig)

+(unvollstandig)

Kupferzelle

graubraun

(+)

(+)

+

(+)

Makrophag

1) I

graubraun

(+)

(+)

+

(+)

+

+

1) Makrophagen in dec Peripherie der Milzfollikel.2) Makrophagen im Zentrum der Milzfollikel, Lymphfollikeln des Darms und in Lymphknoten.

VitaWirbung mit Neutralrot . 59

Abb.66. Ultrastruktur des Kryptenepithels im Jejunum einer Ratte 6 Std. nach NR-Gabe. 1m Cytoplasmafmden sich zahlreiche gro13e Einschlu13karper, die teilweise Mitochondrien (Pfeil) und freie Ribosomen(Doppelpfeil) enthalten. Ein soIcher Karper ist durch homogene elektronendichte Matrix charakterisiert (X);es halldelt sich hier maglicherweise urn den Kern eines phagozytierten Lymphozyten. Fixierung: Glutaral­dehyd/Os04·10700fach.Figure 66. Ultrastructure of the crypt epithelium of the rat jejunum 6 h following NR injection. Numerousbig cytoplasmic inclusion bodies that partially contain mitochondria (arrows) and free ribosomes (thickarrow). One inclusion body is characterized by a homogenous matrix (X); this could be a nucleus of anincorporated lymphocyte. Fixation: Glutaraldehyde/Os04. Magn. X 10700.

scholliges Material, glattes und rauhes endo­plasmatisches Retikulum, freie Ribosomen,Myelinfiguren (Abb. 66). Eine umhlillendeMembran ist nicht immer einwandfrei erkenn­bar (vgl. PFEIFFER 1971). Unsere licht- undelektronenmikroskopischen Befunde entspre­chen damit den Angaben zum NR-Krinom

weitgehend (CHLOPIN 1927; NASSONOV 1930;

LEBER 1932; ALEXANDROV 1933; MAKAROV

1934; KEDROWSKI 1937a, b, 1941; JARVI 1941;MORGAN 1953; SCHMIDT 1958, 1960, 1962, Lit.;BYRNE 1964a; KOVACS und HAFIEK 1964a, b;

KARPATI 1966,1970; KOVACS 1966, 1968, 1969;MORGAN et al. 1966; MADERASZ und KOVACS

1968; ALOUsletal. 1968; KOVACS undREz 1970;REZ und KOVACS 1971; WITTEKIND 1960, 1972;

Lit.; WITTEKIND und VOLCKER 1957; WITTE­KIND und RENTSCH 1966, 1967; WITTEKIND et al.1970; STOCKINGER 1964, Lit.)

Wir nehmen an, daB das Kryptenepithel auf­grund seiner relativen Lysosol11e1larl11ut (s. u.),seinem ReichtulII an RNS und seiner relativen

Undifferenziertheit zur Krinombildung besonders

disponiert ist. Zahlreiche Autoren, am eindeu­

tigsten wohl MORGAN et al. (1966; vgl. auch

CHLOPIN 1927; GICKLHORN 1931, Lit.; KE­

DROWSKI 1941; MORGAN et al. 1953; SCHMIDT

1958, 1960; STOCKINGER 1964, Lit.) haben dieBedeutung des Ergastoplasmareichtums von

Zellen fiir die Krinomentstehung hervorge­

hoben (Einschrankungen s. SCHMIDT 1960). In­wieweit die Unreife von Zellen die Krinom-

60 . J. WINCKLER

*

Abb.67. NR-VitaWirbung. Ratte. 6 Std. nach Farbstoffgabe. Leber. Die in v. Kupfferschen Sternzellen er­kennbaren Zelleinschli.isse sind nicht mit NR geHirbt, sondern zeigen eine schmutzig-braune Eigenfarbe, diebei Weiterverarbeitung der gefriergetrockneten Kryostatschnitte erhalten bleibt. Wahrscheinlich handelt essich urn phagozytiertes Hamoglobin. 360fach. 1m Inset ist die mit * bezeichnete Zelle II20fach vergroBert.

Figure 67. Rat. 6 h following the dye injection. Liver. The cytoplasmic inclusions as seen here are not stainedwith NR but exhibit a grey-brown colour that remains stable during further histological preparation of thefrozen dried sections. In all probability the incorporated substance is hemoglobin. Magn. X 360. The insetshows the cell marked with asterix in higher magnification (x 1120).

bildung begunstigt, ist bisher noch nicht ein­

gehender untersucht worden; JARVI (1941) fmdet

Krinom bevorzugt im Pankreas junger Tiere,

GICKLHORN (193 I) bei Pflanzen nur bei plasma­

reichen und/oder <embryonalem Zellen. Fur einen

Einflu13 des Differenzierungsgrads von Zellen

aufderen Eihigkeit, Farbstoff-Krinom zu bilden,

spricht die besonders ausgepragte Neigung von

Zellen in Zellkultur, auf Farbstoffbelastung mit

Krinombildung zu reagieren (STOCKINGER 1964;Lit.; FEDORKO et al. 1968 a, b). Bezeichnender­weise hatte v. MOLLENDORFF (1936) erheblicheSchwierigkeiten, seine These zu verteidigen, daBNR auch in Zellkultur nur praexistente Granula

fark

Die Lysosomenarmut der Kryptenzellen weistaufdie mogliche Bedeutung der Krinombildung

hin. Es ist unwahrscheinlich, daB der Farbstoff

durch Exocytose von NR-Krinom aus der Zelleausgeschleust wird (s. 0.). Dagegen kann das

Krinom als eine Art von Puffersystem die Funk­

tion der Lysosomen ubemehmen, die u. a. die

Aufgabe haben, das Cytoplasma von Stoffenfreizuhalten, deren Eindringen in die Zelle nicht

verhindert werden kann (GABATHULER und

RYSER 1969).Unklar ist, weshalb wir in unseren Versuchen

das typische NR-Krinom, das andere Autorenin vielen Organen und Geweben beschriebenhaben, nur im Kryptenepithel des Darms fmden.

VitaWirbung mit Neutralrot . 61

Abb.68. NR-VitaWirbung. Ratte. 12 Std. nach Farbstoffgabe. Inkorporation eines schmutzig-braunen Pig­ments in Makrophagen am Rand der Milzfollikel. 16ofach.Abb.69 wie Abb. 68. AusschnittsvergroBerung. Zahlreiche mit Lipopigmentschollen beladene Makrophagensind an der durch NR induzierten Phagozytose des braunen Pigments nicht oder kaum beteiligt (Pfeil).36ofach.

Figure 68. NR vital staining. Rat. 12 h following the dye injection. Incorporation of a grey-brown pigmentinto macrophages in the periphery of spleen follicles. Magn. X 160.Figure 69 as Figure 68. With higher magnification (X 360). Numerous lipopigment-Ioaded macrophages arenot involved in phagocytosis of the grey-brown pigment (arrows).

Farbstoffdosis, Applikationsform und Versuchs­tier mogen hier bestimmende Faktoren sein.

b) Atypisches <Krinom> in phago­zytierenden Zellen der Leber, Milzund Lymphknoten

Einige Eigenschaften der nach NR-Gabe in

den von KupBerschen Sternzellm auftretendenCytoplasmaeinschhisse (s. S. 45) sind in derTab.9 zusammengestellt. Elektronenmikrosko­pisch handelt es sich urn scholliges, meist lockergepacktes Material betrachtlicher Elektronen­dichte, das in von einer Einheitsmembran um­gebenen Vesikeln liegt. Haufig liegt es auch demPlasmalemm der Zelle auBen an (Abb.70). Dielicht- und elektronenoptischen Befunde sprechendafi.ir, daB es sich urn Hamoglobin (und Abbau-

produkte) handelt. Hinweise fur hamolysierendeEigenschaften des NR fehlen bisher. Eineschadigende Wirkung des Farbstoffs auf dieErythrozytenmembran erscheint aufgrund sei­ner Lipidloslichkeit, Membrangangigkeit etc.wie etwa beim Chlorpromazin (vgl. PALM etal. 1968) nicht unwahrscheinlich zu sein. Nachi. v. Gabe konnte diese Nebenwirkung beson­ders ins Gewicht fallen; andererseits ist die i. v.Applikationsform von NR offensichtlich nicht

die Grundbedingung fur eine gesteigerte Phago­zytose von Erythrozyten in Kupffer-Zellen

(5. CHLOP1N 1927; REZ und KOVACS 1973). Be­merkenswert ist, daB bei chronischer Verab­folgung von NR an Ratten Erythrozytenzahlund Zusammensetzung des Blutes unverandertbleiben (STOLARSKY und HALEY 1951).

62 • J. WINCKLER

Abb. 70: Ultrastruktur einer v. Kupfferschen Sternzelle in einer Rattenleber 6 Std. nach NR-Gabe. Die Auf­nahme des elektronendichten Materials in Cytoplasmaeinstiilpungen (Pfeile) und seine Ablagerung in Kern­nahe in groBen membranumhlillten Sacken (Doppelpfeil) ist erkennbar. Fixierung: Glutaraldehyd/OsO•.22700fach.

Figure 70. Ultrastructure of a Kupffer cell in the rat liver 6 h following the NR injection. The uptake of anelectron opaque material in cell membrane invaginations (arrows) and its deposition in membrane surroundedvesicles (thick arrow) is seen. Fixation: Glutaraldehyde/OsO•. Magn. X 22700.

Makrophagen in Milz, LYl1lphknoten undLymph­follikeln. Das schmutzig braune Pigment der inder Peripherie von Milzfollikeln gelegenenMakrophagen (S .46) entspricht den Blutabbau­produkten in Kupffer-Zellen (vgl. Tab.9). Wiein der Leber ist in der Milz nur ein Teil derMakrophagen mit dem Erythrozytenabbau be­traut (Abb.69; vgl. auch FAHIMI 1970; WID­MANN et al. 1972; BISELL et al. 1972). - Dem-

gegeniiber entsprechen Cytoplasmaeinschliissein Makrophagen innerhalb der Milzfollikel,Lymphfollikel des Darmtrakts und Lymph­knoten heterophagisch aufgenommenen Kernenbzw. Kernfragmenten, wahrscheinlich vonLymphozyten. Es ist denkbar, daB auch ein Teildes <DNS-Krinoms> (SCHMIDT 1958, 1960) imDarmepithel phagozytierte Kerne durchwan­dernder Lymphozyten sind, zumal <die Zellkerne

(der Epithelzellen) nach der Krinombildungkeine auffalligen Veranderungen erkennenJieBen> (SCHMIDT 1962, S. 623).

c) Weitere Wirkungen des NR

1. Leber. Hier fmden sich Zeichen einer Spat­toxizitat des NR (WIEDE und MEYER 1955).Noch nach 24 Std. ist das Organ vergroBert(s. S. 45). Elektronenmikroskopisch ist die Er­weiterung der Dissl(schen Raume besonders auf­fallig. Die Mitochondrien der Hepatozyten sindverquollen; ihre Matrix ist elektronendichter alsnormal. WEISS (1955) hat aus vergleichbarenBefunden auf die Einlagerung von NR inMitoc:hondrien geschlossen. GroBe Glycogen­rosetten, denen nach DAVID (1970) pathogno­monische Bedeutung zukommt, werden sehrhaufig beobachtet.

2. MagelldaYllltrakt. Nach Imaliger Injektionvon NR, haufiger jedoch nach Reinjektion desFarbstoffs, werden tote Belegzellell im Mittel­abschnitt der MagendrLisen angefarbt. In Elltero-

VitaWirbung mit Neutralrot . 63

zyten des Darms sind vakuolisierte Golgi­Systeme, verquollene Mitochondrien (SCHMIDT1960; s. auch Abb.66) mit verdichteter Matrix,erweiterte Interzellularraume Regelbefunde.12 bis 18 Std. nach NR-Gabe sind diese Veran­derungen weitgehend behoben. - 1m Ileum undColon sind erweiterte, prall mit Lymphozyten ge­/illite LYlllphge[iijJe der Tunica propria mucosaeund Submucosa 12 und 24 h nach FarbstoffgabeRegelbefunde. STOLARSKY und HALEY (1951)haben bei chronischer NR-Belastung von Rattenoffensichtlich almliches gesehen und als <activelymphoid hyperplasia> beschrieben. - Massivezellodeme glatter Muskelzellen Ibis 12 Std. nachNR-Gabe sind keine Seltenheit. - FLir die vonPOLITZER (1924a, b, 1953) und POLITZER undSTOCKINGER (1954) beschriebenen Storungen derMitose durch NR in Zellkulturen findet sichdagegen - trotz massiver Krinombildung - imKryptenepithel kein Anhalt. Mitosezahl undHaufigkeit der einzelnen Teilungsschritte ent­sprechen dem Normalbefund. - Veranderungenan Paneth-Zellen s. S. 40.

Abb·7I. NR-VitaWirbung. Ratte. 6 Std. nach NR-Gabe. Lymphfollikel im Ileum. Fluorescenzmikroskopieeines mit Hamalaun ge£arbten ge£riergetrockneten Kryostatschnitts. Autofluorescenz von Lipopigment imCytoplasma von Makrophagen. Die Hamalaun-gC£arbten Kernfragmente inkorporierter Lymphozytenzeigen keine Fluorescenz. 36ofach.

Figure 71. NR vital staining. Rat. 6 h following the dye injection. Lymph follicle in the Tunica propria of theileum. Fluorescence microscopy of a frozen dried section stained with hemalum. Autofluorescence of lipo­pigment in macrophages. No autofluorescene in fragments of nuclei from incorporated lymphocytes. Magn.X3 60.

64 . J. WINCKLER

Abb. 72. Dieselbe Stelle wie in Abb. 71 bei Betrachtung im Mischlicht.

Figure 72. The same area as in fig. 71 as viewed with normal light.

3. Pankreas. In exokrinen Dri.isenzellen werdennicht selten ein erweiterter vakuolisierter Golgi­apparat und verquollene Mitochondrien ge­sehen. - Endokriner Pankreas s. S. 20.

4. Niere. 1m akuten Versuch wird eine Er­weiterung der Interzellularraume und des ba­salen Labyrinths beobachtet.

Erganzende Tierexperimente

a) Durstversuch

Die unterschiedliche Bindungsfahigkeit derLysosomen in jungen und alten Organismen furNR haben wir vor allem auf die Autoxydationder Lysosomenmatrix bei alteren Tieren zuruck­gefuhrt (s. S. 54). Da im Durstversuch die NR­Vitalfarbung z. T. uberraschende Ahnlichkeitmit der alterer Tiere hat, ist es denkbar, daB derWassergehalt der Gewebe als zusatzlicher Faktorbei der Farbstoffbindung an Lysosomen beruck­sichtigt werden muG.

In Tab. 10 sind die fur die Versuche verwen­deten Tiere und deren Gewichtsverlust im Durst­versuch zusammengestellt. Die Totung derTiere erfolgte 1 und 30 min nach NR-Injektion.Da bei Wasserentzug uber 24 Std. die Aufuahmevon Trockenkost verweigert wird, handelt essich bei der Gewichtsreduktion um das Produktvon Flussigkeits- und Nahrungsentzug.

Ergebnis. Die Farbstoffeliminierung aus demBlut erfolgt vergleichbar rasch wie beim Nor­maltier. Die durch NR anfarbbaren Strukturen­Lysosomen, Sekretgranula exo- und endokrinerZellen - sind z. T. erheblich kraftiger angefarbtals beim Normaltier. Die intensivere Anfarbungist - im Gegensatz zur Vitalfarbung alter Tiere ­schon nach 1 min erkennbar. Die in verschie­denen Geweben unterschiedlich lange Zeitzwischen Injektionsende undLysosomenfarbungbleibt nach Dursten der Tiere unverandert. DerObertritt von NR in das Lumen des Magen­Darmtrakts erfolgt verzogert. Eine Rehydrie­rung der Tiere (Nr. 8-10 der Tab. 10) normali­siert die Cytoplasmafarbung in den endokrinenZellen; der Obertritt von NR ins Darmlumenbleibt jedoch weiter verzogert und die Lyso­somenfarbung und Sekretfarbung bleibt ineinigen Organen verstarkt.

Einzelbefunde an Nieren. Wahrend der Kem­durchmesser der Tubulusepithelzellen nichtwesentlich abnimmt, ist eine Schrumpfung derLysosomen im Sc und S2-Segment des Haupt­stucks unverkennbar. Dieser auch bei Nachweisder sauren Phosphatase sichtbare Befund wirdauch von ZELLER (1973) beschrieben; in anderenOrganen ist die Verkleinerung der Lysosomendurch Wasserentzug wenig ausgepragt. 1mSl- und S2-Segment wird - wie nach Mikro-

VitaWirbung mit Neutralrot . 65

73,

Abb.73. Pdiparat vom selben Gewebsstiick wie bei Abb.7I und 72. Gefriergetrockneter Kryostatschnitt.NR-VitaWirbung. Noch 6 Std. nach NR-Gabe sind die Kerne der phagozytierten Lymphozyten kraftigweimot ange£arbt. 360fach.

Figure 73. Frozen dried cryostat section of the same tissue as in fig. 71 und 72. NR vital staining. 6 h followingNR-injection vital staining of nuclei of phagozytozed lymphozytes persists. Magn. X360.

injektion des Farbstoffs ins Tubuluslumen(s. S. 49) - ein schmaler apikaler Cytoplasma­saum angefarbt (Abb.75). Wie bei alten Tierenfmdet man bei Dursttieren am Obergang desS2- zum SrSegment mit Lipopigment i.iber­ladene Zellen; die Pigmentkorper diirften denvon MAUNSBACH (1966) beschriebenen kristalli­nen Korpern entsprechen.

Besprechung. Eine verzogerte Exkretion vonNR nach Durst ist verstandlich. Die verlang­samte Ausscheidung von Farbstoff ins Darm­lumen kaun teilweise auf eine verminderte An­sauerung des Magensafts bei Hunger zuriick­gefLihrt werden. Die schon nach 1 min - alsounabhangig von einer verzogerten Farbstoff­eliminierung - beobachtete verstarkte Anfarb-

Tab. 10. Die fUr die Durstversuche vcrwendeten Tiere (3-4 Monate alte Rattenmannchen), Versuchsgruppen,Gewichtskontrolle wahrend des Versuchs.

Tier Ausgangs- Gewicht nachNr. gew. 4 Tagen 5 Tagen 7 Tagen 7 Tagen 7 Tagen

(in Gramm) Durst und Durst undI Tag 2 Tagen

Wasser Wasserad lib. ad lib.

4 Tage Dursten I 29° 2332 268 2°7

5 Tage Dursten 3 286 226 2154 245 195 186

7 Tage Dursten 5 296 230 218 2°76 265 2°9 201 1887 311 256 24° 229

7 Tage Dursten, 8 286 2}2 223 203 237 252anschlieBend 9 270 219 2II 192 217 2412 Tage Wasser 10 342 274 251 23 8 287 293ad lib.

66 . J. WINCKLER

barkeit von Lysosomen und Sekretgranula istdagegen unerwartet. Ob NR dabei durch dieerhohte Osmolaritat des intra- und extrazellu­laren Wassers (ULLRICH 1967) aus der Losunggedrangt wird (DRAWERT 1968, Lit.) und da­durch die Anlagerung an Gewebsstrukturengefordert wird, muB offen bleiben. Danebenzeigen die Versuche mit 2-tagiger Rehydrierungder Dursttiere, daB auch unabhangig vom Grad

der Hydrierung die Bindungsfahigkeit vonLysosomen und Sekretgranula gesteigert isr.Die Zunahme der Autofluorescenz von Lyso­somen in verschiedenen Organen, vor allem inder Leber, (vgl. auch SJOSTRAND 1944, Niere)spricht fur cine Beschleunigung der Autoxyda­tion der Lysosomenmatrix im Durstversuch.Inwieweit diese Veranderungen reversibel sind(BACHMANN 1953), ist ungeklart.

Abb.74. Ultrastruktur eines Makrophagen in einem Lymphfollike1 des Ileums 6 Std. nach NR-Gabe. Das­selbe Tier wie bei Abb. 71-73. Die Mehrzahl der Cytoplasmaeinschliisse diirften Kernfragmenten phago­zytierter Lymphozyten entsprechen. Fixierung: Glutaraldehyd/OsO4' 13 6oofach.

Figure 74. Ultrastructure of a macrophage in a lymph follicle from rat ileum. The same animal as forfigs. 71-73. It seems most likely that the majority of cytoplasmic inclusion bodies represent fragments oflymphocyte nuclei. Fixation: Glutaraldehyde/OsO4. Magn. X 13600.

.. ,

VitaWirbung mit Neutralrot . 67

Abb.75. NR-VitaWirbung. 3 min nach NR-Gabe. Ratte. Niere eines Dursttiers. 1m 52-Segment sind unterdem Mikrovillussaum zahlreiche kleine Granula angeEirbt wie nach Mikroinjektion des Farbstoffs insTubuluslumen (vgl. Abb. 57). 96ofach.Abb.76. NR-VitaWirbung. Ratte. 30 min nach Farbstoffgabe. Mit Reserpin vorbehandeltes Tier. Niere. DieEntEirbung der Lysosomen erfolgt viel rascher als beim Normaltier (vgl. Abb. 35). 640fach.

Figure 75. 3 min following the dye injection. Rat. Kidney of a thirsted animal. Numerous small granules inthe apical cytoplasm of the 52 epithelium are to be seen (comp. fig. 57). Magn. X 960.Figure 76. NR vital staining. Rat. 30 min following the dye injection. Animal premedicated with reserpine.Kidney. The lysosomes are far more rapidly destained as in control animals (comp. fig. 35). Magn. X 640.

In unseren Versuchen ist <die wechselndePermeabilitat der (Pankreas-) Zelle als limi­tierender Faktor der NR-Farbung> (HIRSCH1932) nicht erkennbar. Diese Feststellung ist flirdie Bewertung der heterogenen Lysosomen­farbung in verschiedenen Organen (5.27) vongroBer Bedeutung. \Ifahrend HIRSCH (1932) erstnach Nahrungsaufnahme bzw. Pilocarpingabeeine Anfarbung der NR-Granula der Zellen desexokrinen Pankreas sieht (vgl. auch ALOUSI etal. 1966), ist in den eigenen Versuchen nachmehrtagigem Fasten die Zahl anfarbbarer

Granula normal, die zur Anfarbung benotigte

Zeit normal oder verklirzt und die Granula­farbung intensiver. Dies kann nicht dahin­gehend interpretiert werden, daB die Perme­abilitat der Pankreaszellwand unter den Be­dingungen des kombinierten Hunger-Durst­versuchs gesteigert sei. Denn <aus der Intensitatder Vitalfarbung und der Geschwindigkeit, mitder eine mikroskopisch leicht erkennbare Farb­

stoffspeicherung eintritt, darf nichts tiber dasAusmaB der Permeabilitat gefolgert werden>(G1CKLHORN 1931, 5.417), die unabhangig vonder Farbstoffspeicherung groB oder klein sein

kann (s. auch 5. 45 und 71 if).

68 . J. WINCKLER

..

.'

Abb.77. NR-VitaWirbung. Ratte. 3 min nach Farbstoffgabe. Mit Reserpin vorbehandeltes Tier. Kernfarbungder Herzmuskelzellen. 8oofach.Abb.78. NR-Vitalfarbung. Ratte. 3 min nach Farbstoffgabe. Niere. Durch Albumininjektion 24 Std. vorNR-Gabe ist die AnzaW vital gefarbter groBer Lysosomen im ScSegment deutlich erhoht. pofach.

Figure 77. NR vital staining. Rat. 3 min following the dye injection. Animal premedicated with reserpine.Nuclear staining in myocardial cells. Magn. X 800.Figure 78. NR vital staining. Rat. 3 min following the dye injection. Kidney. The number of big lysosomesin the SI-Segment is increased caused by albumin injection 24 h before sacrifice. Magn. X po.

b) NR-VitalHirbung nach Pramedi­kation mit Desmethylimipramin(Pertofran®) und Reserpin(Serpasil®)

Beide Substanzen hemmen die Aufnahme undBindung von biogenen Aminen in der Zelle.Desmethylimipramin wirkt ahnlich dem Cocainan der Zellmembran, Reserpin inhibiert denEinbau in die spezifischen Speichergranula(MALMFORS und SACHS 1968, Lit.). Wegen derauf S.22 beschriebenen Analogien der Ver­teilung von i. v. appliziertem NR und DOPAwurde die Wirkung der Pharmaka auf die NR­Vitalfarbung untersucht.

Pertofran® beeinfluBt in der verwendetenDosis die NR-Vitalfarbung nicht. Serpasil® fiihrt

zu einer Abschwachung der Anfarbung derZellen des Nebennierenmarks. Weniger ausge­pragt ist eine Abschwachung der Anfarbung der~-Zellen der Langerhansschen Inseln, so daB ­wie beim Meerschweinchen (s. Abb.12) - die~-Zellen gegen die weiterhin kraftig gefarbtenIX-Zellen abzugrenzen sind. AuBerdem wird dieLysosomenfarbung in allen Geweben abge­schwacht und fliichtig; beispielsweise sind in derNiere zahlreiche Lysosomen nach 1 Std. bereitswieder entfarbt (Abb.76). In der Niere und an­deren Organen sind die Lysosomen durchQuellung vergroBert. In einigen Organen(Leber) ist die Cytoplasmafarbung ausgepragterals normal. Die Vitalfarbung von Kernen inglatter und Herzmuskulatur (Abb.77) und imZNS ist deutlich verstarkt.

• • '.•,

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VitalHirbung mit Neutralrot . 69

Abb.79 und 80: NR-VitalHirbung. Ratte. 6 Std. nach Dextran-,s min nach NR-Gabe. Die Dextran-indu­zierten <Nakuolen» im 51-Segment der Niere bleiben ungeEirbt. Pfeile weisen auf Dextran-Vakuolen beioffener und (Abb. 80) geschlossener Kontrastblende. 640fach.

Figure 79 and 80. NR vital staining. Rat. 6 h following dextran- and 5 min following NR injection. Thedextran-induced "vacuoles" in the epithelium of the 51-Segment of the kidney remain unstained. Arrowsshow dextran-"vacuoles": Fig. 79 with open, fig. 80 with closed contrast aperture. Magn. X 640.

Die Abschwachung der Farbung der Zellendes Nebennierenmarks werten wir als indirektenBeweis dafiir, daB NR hier an die katecholamin­speichernden Granula gebunden ist, deren Zahldurch Reserpin erheblich zuriickgeht. Fiir dieiibrigen Befunde fehlt uns z. Zt. jede ErkIarung.Wenn man beriicksichtigt, daB Reserpin aneiner Vielzahl biologischer Membranen angreift(PALM et al. 1969), ist denkbar, daB das Pharma­kon auch direkt am Lysosom wirksam wird.

c) NR-VitalHirbung nach (Vakuolen)­Induktion im Epithel des proximalenHauptstiicks der Niere

Die hier beschriebenen Experimente wurdendurchgefiihrt, urn die Spezifitat der NR-Vital­farbung fiir Lysosomen zu sichern.

1. Hyalintropfige Entlllischung (ERICCSON 1969a,b, Lit.). HiihnereiweifJ (OLIVER et al. 1954) ver­ursacht eine VergroBerung der Lysosomen durchEiweiBaufnahme (STRAUS 1957; MAUNSBACH1969; THOENES et al. 1969). Dieser Befund kannauch nach NR-Vitalfarbung erhoben werden(Abb. 78). Die Intensitat der Lysosomenfarbungist dabei ganz unterschiedlich; teilweise sindinnerhalb groBer Lysosomen kraftig gefarbtePartikel erkennbar. Insgesamt ist die Lysosomen­farbung schwacher als normal.

Glycerin (ERICCSON 1969a) fLihrt zur Hamo­lyse; in der Niere kommt es zu einer Riick­resorption und Speicherung von Hamoglobin.Bereits am ungefarbten Praparat sowie nachhistochemischem Hb-Nachweis sind im api­kalen Cytoplasma massenhaft Hamoglobin­schollen zu erkennen. Diese bleiben bei Vital-

70 . J. WINCKLER

Abb. 81. Dasselbe Gewebsstiick wie bei Abb.79 und 80. Durch OsO.-Bedampfung eines gefriergetrocknetenKryostatschnitts wird die groBe Zahl Dextran-induzierter Vakuolen im Tubulusepithel der Niere besondersdeutlich. 860fach.

Figure 81. The same tissue as in fig.79 and 80. The dextran-"vacuoles" can more easily be detected whenfrozen dried sections are exposed to OsO. vapour. Magn. X 860.

farbung ungefiirbt. Die mehr basal gelegenenLysosomen lassen sieh normal anfarben.

2. Hydropische Degeneration (ERICCSON 1969a,Lit.) dureh Maerodex®. Die hierdureh indu­zierten Vakuolen sind vollig ungefarbt. DieAnzahl NR-gefarbter Lysosomen und die In­tensitat ihrer Anfarbung sind normal bis leiehtvermindert (Abb. 79- 81). Aueh die groBenapikalen Vesikel der Tubulusepithelzellen desSj- und S2-Segments, die bei Normaltieren imPhasenkontrast unsehwer zu erkennen sind,farben sieh nie mit NR.

Diese Versuehe zeigen, daB NR zur Vital­farbung paraplasmatiseher Einsehliisse unge­eignet ist. In der Niere ist die granulare NR­Farbung aussehlieBlieh an die Lysosomcnmatrixgebunden. Dureh Albumin-Inkorporation inLysosomen ist eine Absehwaehung der NR-

Farbung zu erziclen, die dureh Verdiinnung und!oder Labilisierung der Lysosomenmatrix (s.STRAUS 1957; DAVIES und LLOYD 1968; MAACKet al. 1971; WINCKLER 1973) erklart werdenkann. - Die unter bestimmten Bedingungen(Mikroinjektion von NR ins Tubuluslumen:Abb. 57; Durstversueh: Abb.75) siehtbare An­farbung staubehenfeiner Granula unter denMikrovilli werten wir als Hinweis fiir die direkteUmwandillng pnmarer Resorptionstropfen(Phagosomen) in Lysosomen (MILLER undPALADE 1963,1964; THOENES et al. 1969).

Schlu6Die vorliegende Studie zur Verteilung, Spei­

eherung und Eliminierung intravenos applizier­ten NRs bringt neue Befunde: u. a. waren die

Affmitat der APUD-Zellen zu NR, die sehrdifferente Anfarbung der Lysosomen verschie­dener Organe und Unterschiede der NR-Vital­farbung bei Tieren verschiedenen Alters bisherweitgehend unbekannt. In der Frage des NR­Krinoms ergeben sich wichtige neue Gesichts­punkte (S. 57). In anderen Fallen hilft unsereUntersuchung, andere, teilweise bekannte Be­obachtungen zur NR-Vitalfarbung erst ver­standlich zu machen: z. B. be; der Farbstoff­eliminierung in der Niere und der Farbstoffaus­scheidung im Magen und der Riickbindung vonNR im distalen Darl11. - Im Folgenden sollenzunachst einige die NR-Vitalfarbung bestil11­mende Faktoren erortert werden. Dann wollenwir - riickblickend - das <Granulumproblem>(GICKLHORN 193 I) aus unserer Sicht zu losenversuchen. SchlieBlich sollen einige Oberlegun­gen zur Signiflkanz unserer Befunde mitgeteilt

werden.

a) Faktoren, die das Ergebnis derNR-VitalHirbung bedingen

Tab. I I faBt einige uns klar erkennbare dieNR-Vitalfarbuug bestil11mende Faktoren zu­sal11men. Die Gegeniiberstellung der Eigen­schaften von FarbstoJr und ZII [iirbendelll Objektwurde von KEDROWSKI (193 I) iibernommen; erhat die Abhangigkeit des Eintritts von Farbstoffin Zellen von der Wasserstoffionenkonzentra-

VitaWirbung mit Neutralrot . 71

tion des umgebenden Milieus erkannt und rich­tig interpretiert (vgl. ROBBINS et al. 1960). Inunserer Untersuchung wird darLiber hinaus­gehend lediglich demonstriert, wie weitgehenddie Verteilung und Eliminierung des Farbstoffs auchilll kOlllplizierten Siiugerorganislllus dell Gesetzender <Non-ionic diJrusion> [olgt (S. 48 ff.).

Fiir einen aktiven Transport des Farbstoffs gibtes - il11 Gegensatz z. B. zu Phenolrot (CAMERON

1953; vgl. ROLLHAUSER 1957, 1960; ROLLHAUSERund VOGELL 1957) - keinen gesicherten Hinweis

(vgl. NAGEL 1929, 193 I; CAMERON 1953;DINGLE und BARRETT 1969). Auch die Aufnahmevon NR durch Pinozytose und/oder Mikro­pinozytose ist ganz unwahrscheinlich «No evi­dence exists that lysosomes accumulate cationicsubstances through hetereo - or autophago­

cytosis> MAUNSBACH 1969, S.I49). Dessen un­geachtet steigert NR die Pinozytoseaktivitat(LEWIS 1930; ALLISON und YOUNG 1969, Lit.)und Mikripinozytose kann durch Oberflachen­vergroBerung der Zelle mittelbar den Eintrittvon NR fordern. Ein gerichteter Farbstofftrans­port durch Exocytose von NR-Krinom ist nachunserer Oberzeugung ebenftlls unwahrschein­lich, zumindest mengenmaBig unerheblich

(S. 58; vgl. auch HAWKINS et al. 1972). - Es seihier noch einmal betont, daB anhand histologi­scher Praparate vitalgefarbten Gewebes keinRLickschluB auf die in Zellen eindringende bzw.durch Zellen hindurchwandernde Farbstoff-

Tab. 11. Einige die NR-VitaWirbung bedingende Faktoren (A) und einige fiir die Verteilung von NR relativirrelevante Faktoren (B).

Farbstoff

A. 1. Liislichkeit: molekulardispers; in Wasser vor­wiegend dissoziiert, in organischen Solven­ventien vorwiegend nicht-dissoziiert gelost;PK 6,75

2. Ladungssinn: schwache Base

3. Melllbrangiingigkeit: als <freie Base>4. Toxizitiit

zu farbendes Objekt

I. Zusammensetzung und PH der Korperfliissigkeit

2. Reagible Gruppen in und auBerhalb der Zellen3. Aufbau der Zellwand4. Reagibilitiit des Organismus «KrinOlm)

B. I. Die absolute GroBe der Permeabilitiit der Zellwand fUr NR2. Pinozytose (und Mikropinozytose)

3. Aktiver Transport4. Bindung an BluteiweiBe

72 . J. WINCKLER

Tab. 12. Gegeniiberstellung einiger die VitaWirbung mit NR und Trypanblau beeinflussender Faktoren.

Aufnahme in die ZelleLysosomenHirbung

Wirkung der Farbstoff­aufnahme auf das Lysosom

vitale Kernfarbung

<Vitalfarbung> toter Zellen

Bindung an BluteiweiBeBluthirnschranke

Placentarschranke

NR

<Non-ionic diffusion>rasch; Anfarbung der Matrixpraexistenter Lysosomenkeine Inhibition von Enzymaktivitat,keine Labilisierung (WINCKLER 1973)

ohne irreversible Schadigung anvitalen Zellen bestimmter Gewebemoglichvorwiegend Kernfarbung; Ursache:demaskierte Nukleinsauren

fliichtigleicht permeabel

leicht permeabel

Trypanblau

Pinozytose (vgl. SCHMIDT 1962)verzogert durch Verschmelzung vonPhagosom und LysosomInhibition und Labilisierung derIosomalen Hydrolasen (DAVIES undLLOYD 1968; LLOYD und BECK 1969)nur an toten Zellen moglich

vorwiegend Cytoplasmafarbung;U rsache: Durchlassigwerden der Zell­membran (TRUMP und GINN 1969)fest (BENNHOLD und OTT 1961, Lit.)nicht permeabel (Ausn. s. BERNSEN192 7)nicht permeabel (KRYZZOWSKA­GRUCA und SCRIEBLER 1967, Lit.)

menge moglich ist. Die mikroskopische Unter­

suChWlg vitalgefarbter Praparate informiert

iiber die Lokalisation und Menge gebundenen«gespeichertem) Farbstoffs: man denke nur an die­

meist negative - Vitalfarbung der Zellen des

Glomerulumfilters (PETER 1924; GICKLHORN

19JI; KEDROWSKI 1931).

Der Stoffwechsel-passive Mechanismus des

Durchtritts von NR durch die Zellmembran

gilt in gleicher Weise fiir die Anfarbung intra­

zellular gelegener Lysosomen bzw. anderer

membranumhiillter Organellen. Aussagen wie

<Die NR- oder Trypanblau-Granula sind nicht

die Folge eines passiven Anfarbevorgangs, son-

Konz. in %

A'~

B I,~:~----~-Konz.in%

C

:1'16~~4~:.·::/L"·"""""·~--', ............................................................... .

, , I, ! ,.

2 3 4 5 6 7 8 9 ill ~ ~&d

Abb.82. Blutkonzentration (A), Intensitat der Lysosomenfarbung im proximalen Hauptstiick der Niere (B)und Farbstoffkonzentration im Endharn (C) nach Gabe von NR (....) und Trypanblau (--) bei der Ratte.In A und B sind die Unterschiede der Verteilung von NR und Trypanblau schematisch gegeniibergestellt;die Verlaufskurven in C wurden nach Angaben von v. MOLLENDORFF (1915) und HERZFELD (1917) zusammen­gestellt (vgl. auch BENNHOLD und SEYBOLD, 1952).

Figure 82. Dye concentration in the blood (A), intensity of lysosomal staining in the proximal convolutionof the kidney (B) and dye concentration in the urine following the application of NR (....) and Trypanblue (- -) to rats. A and Bare schematical diagrams to characterize differences between the two dyes. Thecurves in C are derived from data found by v. MOLLENDORFF (1915) and HERZFELD (1917; see BENNHOLD andSEYBOLD, 1952, too).

dem das Produkt der intrazellularen Verarbei­tung des eingedrungenen Farbstoffs> oder <Diepassive Anfarbung der Cytosomen zur NR­Granula fmdet also erst nach der Segregation desFarbstoffs durch die Vakuolenmembran (Cyto­somenmembran) start> (SCHMIDT 1962, S. 547und 630) lassen sich heute nicht mehr vertreten.

Ein Vergleich der Vitalfiirbl/llg lion NR uudTrypanblarl (anionischer, semikolloidaler Farb­stoff, der wie die als <Tracen verwendete Meer­rettich-Peroxydase von Zellen aufgenommenund gebunden vgl. STRAUS 1969, Lit.) verdeut­licht das Gesagte (Abb. 82; Tab. 12). Es wirdersichtlich, daB, abgesehen von der verzogertenEliminierung beider Farbstoffe im Ham undeiner nur schcinbar glcichartigen Anfarbungtoter Zellen, ihre Gegentiberstellung als dasklassische Gegensatzpaar eines kationischen undanionischen Farbstoffs weiter gerechtfertigt ist.

b) Das <Granulumproblem>(GICKLHORN 1931)

Die Summe vorliegender elektronenmikro­skopischer Befunde (Lit.: NOVIKOFF 1958;SCHMIDT 1962; STOCKINGER 1964; MAUNSBACH1969; ERICCSON I969a, b; THOENES et al. 1969)hat die Unklarheiten in der Interpretation derlichtmikroskopisch faBbaren Phanomene nachTrypanblau-Vitalfarbung beseitigt. Dagegenfehlte ftir eine befriedigende Erklarung derErgebnisse der Granulumfarbung nach Doppel­injektion saurer und basischer Vitalfarbstoffe(HOBER und KONIGSBERG 1905; HERZFELD 1917;v. MOLLENDORFF 1918, 1920, 1926; GICKLHORN1931 ; KEDROWSKI 1931; LEBER 1932; SCHLOTTKE1932; SEKI 1933) eine neuere lichtmikroskopischeUntersuchung der NR-Vitalfarbung des Sauger­organismus. Diese haben wir hier vorgelegt.Unter Berticksichtigung der gegenwartigenKenntnis der Vitalfarbung hat v. MOLLENDORFF(I91R, 1920) mit seiner klaren Abgrenzung<saurer> und <basischen Farbstoffgranula nur hin­sichtlich ihrer GCllese recht behalten; seine an

HERZFELD (1917) anschlieBende Interpretationder Oberfarbung saurer und basischer Farbstoff­granula als Fallungsphanomen ist nicht aufrecht­zuhalten. Die gegen v. MOLLENDORFF ent-

VitaWirbung mit Neutralrot . 73

wickelte Vorstellung, NR- und Trypanblau­granulum seien letztlich identische Gebilde (u. a.

NASSONOW 1930; GICKLHORN 1931; SCHLOTTKE1932; SEKI 1933) hat sich bestatigt: beide Farb­stoffe farben schlieBlich Lysosomen. Dagegen istdie von genannten Autt. entwickelte Hypotheseeiner fur das NR- und Trypanblaugranulumvergleichbaren Genese als Ausflockungsphano­

men (GICKLHORN 1931; KEDROWSKI 1931,1941)heute nicht mehr haltbar.

Unter Ausklammerung der NR-Farbung vonSekretgranula endokriner (S. 57ff.) und exo­kriner (S.57) Drtisenzellen lassen sich die Anga­ben der Literatur mit den eigenen Befunden wiefolgt zusammenfassen:

I. NR wird - im Gegensatz zu Trypanblau ­unabhangig von Zellaktivitat in primaren undsekundaren Lysosomen angereichert.

2. Nicht aile Lysosomen sind vital mit NR an­farbbar.

3. Als Reaktion des Organismus auf die Gabevon NR entsteht in einigen Organen NR­Krinom, eine heterogene Gruppe von durchAuto- oder Heterophagie entstandenen Cyte­plasmaeinschlussen (s. S. 57ff).-

Die teilweise Identitat von NR- und Trypan­blaugranulum ist in Abb. 83 schematisch dar­gestellt.

Den Begriff der FarbstoH-Vakuole sollte manals Relikt des beendeten Disputs um die Identitatvon Golgi-Apparat und <Vakuom> heute nichtmehr verwenden (PARAT 1928; vgl. POLICARD1910; NASSONOW 1926; HIRSCHLER und MONNE1928; HERTWIG 1928; LUDFORD 1928; COVELLund SCOTT 1928; GATENBY 1931, 1954; PFUHL1937, 1938; LACY 1954; SCHMIDT 1960, 1962,1965; STOCKINGER 1964).

c) Die AnHirbung derLysosomenmatrix durch NR

Sie ist zur Zeit Gegenstand ausgedehnterUntersuchungen (TAPPEL 1969, Lit.; KOENIG

1969, Lit.). Heute wird ein Glycolipoproteid furdie NR-Bindung an das Lysosom verantwortlich

gemacht (KOENIG 1969). Nach KOENIG (1969)ist aufgrund der bisher vorliegenden Teiler­gebnisse, deren Analyse durch die Heterogenitat

74 . J. WINCKLER

°0 0 0 0o 0 0 °00~8 OO~O

A

c

B

oAbb.83. Darstellung der Lysosomen des proximalen Hauptstiicks der Rattenniere nach VitaWirbung mitNR (A), Trypanblau (B), Trypanblau und NR (C) und Trypanblau mit anschliel3endem histochemischenNachweis der sauren Phosphatase (D). - NR farbt die Matrix vorhandener Lysosonien (A); histochemischerNachweis der sauren Phosphatase und NR-VitaWirbung liefem hier vollig deckungsgleiche Bilder. Trypan­blau kommt durch Verschmelzung von Phagosom und Lysosom in Lysosomen hinein (B, C); die VitaWir­bung mit Trypanblau farbt die Lysosomen verzogert und unvollstandig. Bei einem Anschlul3 an eine Trypan­blau-Vitalfarbung durchgefiihrten Nachweis der sauren Phosphatase iiberfarbt das inkorporierte Trypanblaudas gesamte Lysosom (D). Aus WINCKLER (1973).

Figure 83. Demonstration of lysosomes in the proximal convolution of the rat kidney following vital stainingwith NR (A), Trypan blue (B), Trypan blue and NR (C) and Trypan blue with consecutive histochemicaldemonstration of acid phosphatase (D). - NR stains the lysosomal matrix (A); histochemical demonstrationof acid phosphatase and NR vital staining reveal here identical results. Trypan blue is located in lysosomesfollowing the fusion of phagosmes with lysosomes (B, C); vital staining of lysosmes with Trypan blue isdelayed and incomplete. When, following Trypan blue vital staining, the acid phosphatase is demonstratedhistochemically, there appears slight diffusion of the incorporated dye and Trypan blue stains the wholelysosome (D). From WINCKLER (1973).

der Lysosomen und die KO!ltamination derFraktionen in gleicher Weise erschwert ist, einedefinitive Aussage iiber die reagierenden Grup­pen und die Bindungskapazitat in vivo nichtunmittelbar abzulesen. Hier kann die Vitalfar­bung wichtige erganzende Information liefern(s. u.). Besonders aufffallig ist, daB die Zusam­mensetzung der ausLeber- undNierenlysosomenisolierten Lipoide einander weitgehend gleichtund kaum von der in Mitochondrien und Ery­throzyten abweicht. Unterschiede der Baso­philie der Lysosomen seien nur durch Aufkla­rung der <molecular morphology> desPolyanion­Komplexes moglich.

Die elektrostatische Farbstoffbindung an dasLysosom (COHN und WIENER 1963; KOENIG1969, Lit.; ALLISON und YOUNG 1964, 1969;DINGLE und BARRETT 1969) wird an Carboxyl­und/oder Phosphatgruppen der Matrix ange­nommen. Hinsichtlich des pwBereichs, in demnoch eine Farbstoffbindung moglich ist, klaffen

die Angaben weit ameinander. AuBerdem be­steht Uneinigkeit tiber die Extrahierbarkeit dervital angefarbten Substanz: Nach KOENIG (1969)sei - gegen KOENIG (1962); DINGLE und BARRETT(1969) und ALLISON und YOUNG (1969) - auchnach Methanol-Chloroform-Extraktion nocheine Farbstoffbindung an Lysosomen moglich;NR wiirde dann an Sulfhidrylgruppen der lyso­somalen Hydrolasen gebunden (entsprechendder direkten Reaktion von NR mit dem En­zym: MARSTON 1923; KEDROWSKI 1931; KOEH­RING 1930). Eigene Befunde (s. S. 14) sprecheneher gegen eine die Extraktion in organischenLosungsmitteln iiberdauernde Bindungskapazi­tatfiir NR.

d) Die Bedeutung der NR-Vitalfarbung

<It is possible that the presence of the bindingcomponent within some or all lysosomes signi­ficantly modifies their response to a number ofphysiologically active compounds in vivo>

(DINGLE und BARRETT 1969). Unabhangig von

einer Strukturanalyse der Lysosomenmatrix in

Zellen verschiedener Herkunft durch verfeinertebiochemische und histochemische Methoden

liegt die Bedeutung der NR-Vitalfarbung in derSichtbarlllachung der in situ-Bindungsfahigkeit derLysoso1l1en fiir kationische Substanzell. Wichtig istdabei die tmterschiedliche Bindungskapazitat der

Lysosomen verschiedener Gewebe (S.27ff.),

die Herausarbeitung einiger sie beeinflussenderFaktoren (Alter, Geschlecht) (S. 54ff.) und die

Demonstration dec Labilitat des Gleichgel/lichtsvon LYSOS01l1 lilld extralysosollwlelll Zellraulll (vgl.

S. 35; S. 68). Entsprechende, £lir das Verstandnisder Physiologie und Pharmakologie wichtige

Angaben sind in der gesamten von uns Liber­

blickten Literatur zur Vitalfarbung lLickenhaft:

Altersabhangigkeit s. v. MaLLENDORFF (1925);

BEHNSEN (1927); NAGEL (1929, 193 I); GICKL­HORN (1931) und JARVI (1941); Emahrtmg s.NIRENSTEIN (1920); HIRSCH (1932); RIES und

SCHaLZEL (1934) und ALOUSI et al. (1966);NR-F'arbung unter aeroben und anaeroben Bedin­gungen s. NASSONOW (1930); ALEXANDROV(1933) und HAWKINS et al. (1972). - Die Diskus­sion Ulll die <Entgiftungsfunktion> der Lysoso­

men (SCHULEMANN 1912,1920; HERZFELD 1917;

v. MaLLENDoRFF 1918, 1920, 1923; GICKLHORN

1931; KEDROWSKI 1931, 1933, 1941; KIYONO etal. 1938; ALEXANDROV 1939; SCHMIDT 1962,1965; STREHLER 1964; ALLISON und PATON 1965;WITTEKIND und RENTSCH 1967; ALLISON und

YOUNG 1969; DINGLE und BARRETT 1969;DIANZANI et al. 1969; MAUNSBACH 1969;WITTEKIND et al. 1970) muB die unterschiedlicheBindungskapazitat der Lysosomen in verschie­denen Geweben und ihre BeeinfluBbarkeit durch

endogene und exogene Faktoren berlicksichti­gen. Unsere Untersuchung hat hierflir zahl­reiche Beispiele geliefert. Die <drug accumulat­

ing ability> (MAUNSBACH 1969) weist damit eine

der unterschiedlichen Enzymausstattung der

Lysosomen verschiedener Gewebe (BARRETT

1972) vergleichbare Heterogenitat auf, die ineiner unterschiedlichen Ansprechbarkeit der

Zellen gegenliber physiologisch oder pharma­

kologisch wirksamen Verbindungen resultierenmuB.

VitaWirbung mit Neutralrot . 75

Die unterschiedliche Bindungskapazitat der

Lysosomen gewinnt zusatzlich an Bedeutung

dadurch, daB sie die Festigkeit der Enzymbin­dung an das Lysosom und damit die <Latenz>Iysosomaler Hydrolasen (KOENIG 1969, Lit.; vgl.auch S. 55), die durch lokales PH und Art derMatrixbindung bestimmte Enzylllaktivitat im

Mikromilieu der Organelle (MOSBACH 1969)und selbst die Auswahl und Quantitat intralyso­sOll1al verarbeiteter Substrate mitbestimmt (ROSEN­

BERG und JANOFF 1968). Dieser Gesichtspunkt

erscheint von groBerer Wichtigkeit zu sein als

die <Segregation> (EVANS und SCOTT 1921) zell­

schadigender Agentien. Denn letztlich verzogertdie Farbstoffbindung an das Lysosom deren

wlinschenswerte Eliminierung aus der Zelle

(vgl. DIANZANI et al. 1969; MAIER-RUGE 1972).Entgiftend wirkt die Gesamtheit der Lysosomen

des Organismus lediglich bei akuter Belastungmit hochtoxischer Dosis (GABATHULER und RYSER

1969).

e) NR als Modell

Die Erwartung, NR konne aufgrund seinerselektiven Anfarbung der Zellen der APUD­

Reihe und einiger weiterer Analogien (s. u.) als

Modell flir die Verteilung biogener Amine

dienen, hat sich nicht bestarigt. Wie bereits dar­gelegt (s. S. 50), liegt der Hauptunterschied inder ausgepragten, durch Desmethylimipraminnicht hemmbaren Membrangangigkeit des NR(s. S. 68). Bei den biogenen Aminen spielt akti­ver Transport eine bedeutende Rolle (vgl.

ENERBACK und HAGGENDAL 1970; ERICSON1972); u. a. ist die Bluthirnschranke fiir dieKatecholamine eine praktisch uniiberwindbare

Barriere (GEY und PLETSCHER 1964; BERTLERet al. 1966). Eine selektive intraneuronaleSpeicherung wird bei NR vermiBt; Terminal­

fasern aminerger Nerven sind durch NR-Vital­

farbung nicht darzustellen. Trotzdem ist die

Reihe von Geweben, in denen NR und Katc­

cholamine nach intravenoser Gabc gespeichcrt

werden, auffallend: Bindung an Kollagen und

Knorpel (vgl. IVERSEN 1967; MALMFORS 1967);

Aufnahme ins Darmepithel und Exkretion ins

Darmlumen (HENNINGSEN 1969); Aufnahmeund Exkretion durch das exokrine Pankreas

76 . J. WINCKLER

(EKHOLM und ERICSON 1971); Speicherung inden Sekretgranula der Paneth-Zellen (AHONENund PENTILLA 1971); Placentagangigkeit (PEN­TILLA und HrnVONEN 1969; PENTILLA 1970);weitere Angaben bei LEDER und HARMS (1970),LEDER et al. (1970), LEDER und SCHMIDT-HIEBER(1972). Diese Gemeinsamkeiten erklaren sichwahrscheinlich aus der relativ unspezifischenVerteilung der Katecholamine bei unphysio­logisch hoher Dosierung (<uptake 2>; IVERSEN1967).

Bei der intrazellularen Verteilung von NR undKatecholaminen liegt der entscheidendc Unter­schied darin, daB biogene Amine und ihre Vor­laufer weitgehend extralysosomal gebundenwerden. Angaben zur intralysosomalen Lokali­sation (KOENIG 1963, 1964, 1965) haben sich bis­her nicht bewahrheitet (SMITH und WINKLER1969, Lit.), obwohl aufgrund der Heterogenitatder Lysosomenmatrix die Katecholarninbindungan Lysosomen nicht ganzlich ausgeschlossenwerden kann. In Verbindung mit dem Vor­kommen von Melanin in Lysosomen wird dessenSynthese aus DOPA an Ort und Stelle diskutiert(GOIDFISCHER et al. 1966: Leber; OKUN et al.1971: ZNS). Der entscheidende Faktor fur dieunterschiedliche Affinitat von NR und biogenenAminen zu Zellorganellen scheint dabei derenLipoidgehalt zu sein; wo dieser anteilmaBig imHintergrund steht (Thrombozyten: ABORG undUVNAS 1971; Mastzellgrana: UVNAS et al. 1970;Paneth-Zell-Sekretgrana: AHONEN und PEN­TILLA 1971; Sekretgrana der Zellen der APUD­Reihe: vgl. S. 19£[), ist die elektrostatischeBindung von biogenen Arninen und NR anidentische Strukturen wahrscheinlich oder be-wiesen.

Diese Hinweise zeigen, daB es nicht angeht,uberraschende Analogien der Verteilung vonNR und biogenen Aminen nach intravenaserGabe auf einem Teilgebiet zu verallgemeinem.Auch geringere Abweichungen der chemischenKonstitution, der Lasungseigenschaften und desPK, als sie zwischen NR und z. B. Dopamin oderNoradrenalin bestehen, kannen bei der <Ver­arbeitung> dieser Substanzen im Organismusbetrachtliche Unterschiede verursachen. DerModellcharakter des physikochemisch recht gut

defrnierten, vielfach angewendeten und nuneinwandfrei im histologischen Schnitt lokalisier­baren NR wird durch diese Feststellung einge­schriinkt. Trotzdem sollte z. B. die ausgespro­chen fluchtige Farbstoffbindung des NR anNeurosekret (s. S. 42) und die Zellender APUD­Reihe, besonders die C-Zellen (s. S. 20£[), dierelativ selektive Farbung und Schadigung derPaneth-Zellen (s. S. 40) die Krinombildung imKryptenepithel (s. S. 57£[) und die gesteigerteErythrozyten-Phagozytose nach NR-Gabe (s.S. 61) fur einige pharmakologisch relevantcVerbindungen wie Mepacrin und zyklischeAntidepressantien nachgepriift werden. Auchdie bei jungen und alten Tieren so differente<Pharmakokinetik> (s. S. 54£[) des NR ist sicher­lich nicht aufNR allein beschrankt.

Zusammenfassung

Mikroskopische Untersuchungen von Zellenoder Geweben, die vital mit Neutralrot (NR)gefarbt wurden, liegen nur fur einige wenigeObjekte vor, vorwiegend fur solehe, die ohneAnfertigung von Gewebsschnitten untersuchtwerden kannen, z. B. Gewebekultur. Umfas­sende Studien zur Vitalfarbung von Labortieren(z. B. Ratte und Maus) fehlen dagegen, weil NR,ein kationischer Vitalfarbstoff (Molgewicht289, PK 6,75) wahrend der histologischen Auf­arbeitung mehr oder weniger vollstandig ver­lagert wird, es sei denn, man bringt die Gefrier­trocknung von Geweben zur Anwendung. Dadies bisher nicht geschehen ist, liegen die wider­spruchlichsten Ansichten vor uber den Bindungs­ort vital applizierten NRs. U. a. ist es ungewiB,ob NR <praexistierende> oder meu gebildeteGranula> «NR-Krinom», <paraplasmatischeCytoplasmaeinschlusse> oder - vollstandig odernur partiell- Lysosomen farbt und warum diesgeschieht. - Daruber hinaus fanden wir, daBintravenas gegebenes NR nahezu selektiv dieZellen der APUD-Reihe (PEARSE) farbt, dieu. a. Katecholamine und deren Vorlaufer akku­mulieren; nachzuprufen war, inwieweit NR alsModell fur das Studium der Verteilung intra­venas gegebener Katecholamine und verwandter

Verbindungen geeignet ist. SchlieBlich wirdNR Modellcharakter fiir Pharmaka yom Typdes Chlorpromazins zugesprochen. - UnsereBefunde zur NR-Vitalfarbung der Ratte nachintravenoser Gabe des Farbstoffs wurden angefriergetrockneten Kryostatschnitten erhoben.Die Ergebnisse lassen sich wie folgt zusammen­fassen:

1 min nach Injektionsende ist NR im GefaB­lumen nicht mehr nachweisbar. Fluorescenz­mikroskopisch laBt sich der Farbstoff zu diesemZeitpunkt in allen Geweben vorwiegend intra­zellular lokalisieren. N eben einer diffusen Ver­teilung im Cytoplasma wird in einigen Ge­weben eine schwache Kernfarbung beobachtet.Intensive Rotfarbung von Kernen, verbundenmit diffuser oder scholliger Anfarbung desCytoplasmas, sind Zeichen des Zelltods.

Die Cytoplasmafarbung der Zellen derAPUD-Reihe ist vorwiegend granular. Wahr­scheinlich wird NR an Carboxylgruppen derMatrix der Sekretgranula gebunden. Zwischender Aufnahme und Speicherung intravenos ge­gebenen NRs und biogener Amine bestehenerhebliche Unterschiede. - NR farbt auch ineinigen exokrinen Driisenzellen Sekretgranula.

Zur Vitalfarbung von Lysosomen konnen er­ganzende Befunde mitgeteilt werden: a) ineinigen Organen sind Lysosomen nicht odernur unvollstandig anzufarben. b) die Lyso­somenfarbung wird in verschiedenen Organenunterschiedlich schnell erreicht und ist unter­schiedlich lange nachweisbar. c) durch Farbungder Lysosomen am histologischen Schnitt kon­nen die unter a) und b) mitgeteilten Differenzender Anfarbbarkeit der Organelle nicht reprodu-

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VitaWirbung mit Neutralrot . 77

ziert werden. Alle methodischen und tierexperi­mentellen Untersuchungen sprechen dafiir, daBdie heterogene Anfarbung der Lysosomen in vivodie Folge einer unterschiedlichen Zusammen­setzung der Lysosomenmatrix ist, deren NR­bindende Komponente wahrend der histologi­schen Aufarbeitung groBenteils extrahiert wird.

Die NR-Vitalfarbung der Lysosomen ist beiJungtieren weniger, im Alter starker ausgepragt.Lipopigment kann, muB jedoch nicht in jedemFall, vermehrt NR binden. - Durst verstarkt dieBindungskapazitat der Lysosomen der NR,Reserpin hat den entgegengesetzten, Desmethyl­imipramin keinen erken:tbaren Effekt.

NR-Krinom wird nur in wenigen Organengesehen.

Mit Macrodex® und Glyzerin im Epithel desproximalen Hauptstiicks der Niere induzierte<Vakuolen> sind nicht mit NR vital anzufarben;nach Albumininjektion stellen sich hier vergro­Berte, NR-bindende Lysosomen dar.

NR wird im distalen Nephron und im Magenausgeschieden; im distalen Darm erfolgt eineRiickbindung des Farbstoffs.

1m wesentlichen bestimmen zwei Faktorenden Ausfall der NR-Vitalfarbung: a) seineLosungseigenschaften, die die ubiquitare Ver­teilung von NR im Organismus, den Durchtrittdurch Zellmembranen und die Ausscheidungtiber <Non-ionic diffusion> befriedigend erklarenund b) die Ladung des Farbstoffs, die die Ursacheseiner - elektrostatischen - Bindung «Speiche­rung» im Gewebe, u. a. an Carboxylgruppender Sekretgranula der Zellen der APUD-Reiheund Carboxyl- undjoder Phosphatgruppen derLysosomenmatrix ist.

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