Erwin R. SchmidtInstitut für Molekulargenetik

2. VL

Thema Gentechnologie

gibt 4 ,IV

Restriktionsenzyme

• Statistik:Enzymes: Total: 15093 • Restriction Enzymes 3843 • Type I 92 • Type II 3735 • Type III 11 • Type IV 5• Weirdo REs 1• Putative REs 3484 • Kommerziell erhältlich 278

Struktur R-Enzym HincII

Struktur der R-Endonuklease Bam HI

Erkennungssequenz

Hochmolekulare DNA

Typ II-Restriktionsenzyme erkennen und schneiden die DNA an palindromischen Sequenzen

z. B. 5´-GGAATTCC-3´

Restriktionsenzyme

• Sternaktivität? R-Enzyme können bei suboptimalen Bedingungen eine reduzierte Spezifität bezüglich der Erkennungssequenz aufweisen

Restriktionsenzyme

Alles über R-Enzyme:http://rebase.neb.com

• http://www.neb.com/nebecomm/products/category1.asp

In der Gentechnologieist die Neukombinationunterschiedlicher DNA-Moleküle wichtig.

Das Verknüpfen von DNA-Molekülen erledigt das Enzym „DNA-Ligase“

Komplementäreüberhängende Enden („Sticky ends“)erleichtern das Wiederverknüpfen von DNA-Molekülen

Die DNA-Ligase verknüpft zwei DNA-Moleküle

Die DNA-Ligasen sind in der Lage, Phospho-diesterbindungen zu knüpfen. Sie brauchen dafüEnergie, die entweder durch ATP oder NAD+geliefert wird

T4-DNA-Ligase

E. coli DNA-Ligase

Ligase AMP

Ligase

AMP

In der Gentechnologieist die Neukombinationunterschiedlicher DNA-Moleküle wichtig.

Das Verknüpfen von DNA-Molekülen erledigt das Enzym „DNA-Ligase“

Für die Selektionder gewünschtenrekombinantenKlone braucht mandie Vektor-DNA

Asymmetrische Restriktion von Vektor und Integrat-DNA

AATTGGCC

CCGGAATT

Funktionen der Vektor DNA

• Sorgt für Replikation in der Wirtszelle• Stellt selektierbare Markergene bereit• Hat Vielzweck-Klonierungsstelle• Trägt Signalsequenzen für Genexpression• Verschiedenste Modifikationen für

spezielle Anwendungen (z. B. „Shuttle“zwischen Pro- und Eukaryoten; Elemente für künstl. Chromosomen)

Typische Vektoren besitzen einen Replikationsorigin,selektierbare Marker-Gene und eine multiple Klonierungsstelle

Typische Vektoren besitzen einen Replikationsorigin,selektierbare Marker-Gene und eine multiple Klonierungsstelle

Inzwischen gibt es die verschiedensten Farbvariationen als Marker oder Reportergene

Plasmide als Vektoren

Plasmide sind extrachromosomale, autonom replizierende,meist zirkuläre DNA-Moleküle,die natürlicherweise in vielen Bakterien vorkommen

Plasmid-DNA

E. coli DNA

Elektronenmikroskopische Aufnahme eines Plasmids in der Zustandsform

„supercoiled“(rechts) bzw. „relaxed circle“ (links)

http://www.gen.cam.ac.uk/Images/summers/plasmids.jpg

aus Weaver/Hedrick

z.B. Resistenzplasmide

Plasmide als Vektoren