Einführung in die Gentechnologie - Wilkommenmolgen.biologie.uni-mainz.de/.../Skript_SS2015_Gentechnologie.pdf · Einführung in die Gentechnologie Institut für Molekulargenetik,

Einführung

in die

Gentechnologie

Institut für Molekulargenetik, gentechnologische Sicherheitsforschung und Beratung Johannes Gutenberg-Universität Mainz Leiter: Prof. Dr. Erwin R. Schmidt Betreuer: Dr. Christiane Kraemer, Dr. Steffen Rapp

Dipl.Biol.s Nicholas Bachtadse, Sarah Brunck, Birte Ding, Sabine Fischer, Tobias Lautwein, Regina Stiehl

Dipl. Bioinformatiker (FH) Benjamin Rieger Rudolf Baader

F1-Laborpraktikum SoSe 2015

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Inhalt F1-Laborpraktikum Gentechnologie ....................................................................................................... 4

Zeitplan (nicht bindend) .................................................................................................................... 11

Teil 1: Herstellen einer DNA-Bibliothek für die Illumina-Sequenzierung ...................................... 11

Teil 2: Seminarvorträge ................................................................................................................. 11

Teil 3: Bioinformatische Analyse der „NGS“-Daten ....................................................................... 11

Theorie Teil 1: Herstellen einer DNA-Bibliothek für „NGS“ .................................................................. 12

Praxis Teil 1: Herstellen einer DNA-Bibliothek für die Sequenzierung ................................................. 14

Allgemeine Laborsicherheit und Verhaltensregeln ........................................................................... 14

DNA-Isolierung aus Chironomus-Larven ........................................................................................... 14

Agarose-Gelelektrophorese .............................................................................................................. 15

Herstellung eines 0,8%-igen Agarosegels ...................................................................................... 15

Vorbereitung der GENterphorese-Apparatur ............................................................................... 16

Durchführung der Elektrophorese ................................................................................................ 17

Erstellen einer DNA-Library mit dem Illumina TruSeq Nano DNA Kit ............................................... 17

Allgemeine Hinweise und Vorbereitungen ................................................................................... 17

Fragmentierung der DNA .............................................................................................................. 17

Aufreinigung der fragmentierten DNA .......................................................................................... 18

End Repair ..................................................................................................................................... 19

Größenselektion ............................................................................................................................ 19

Adenylierung der 3‘ Enden ............................................................................................................ 20

Adapterligation .............................................................................................................................. 20

Zweifache Aufreinigung ................................................................................................................. 20

Enrichment .................................................................................................................................... 21

Aufreinigung .................................................................................................................................. 21

Quantifizierung der Library mit Qubit HS Assay ............................................................................ 22

Qualitätskontrolle, Molekulargewichtsverteilung und Quantifizierung der Library mit Agilent

Bioanalyzer Nano-Assay ................................................................................................................ 23

Theorie Teil 2: Bioinformatische Analyse von „Next-Generation Sequencing“-Daten ......................... 25

Sequenzalignment ............................................................................................................................. 25

Assemblierungsmethoden ................................................................................................................ 25

BLAST ................................................................................................................................................. 26

De-Bruijn-Graph (DBG) ...................................................................................................................... 27

Arbeitsablauf Sequenzverarbeitung .................................................................................................. 30

Möglichkeiten der Parallelisierung .................................................................................................... 30


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Praxis Teil 2: Bioinformatische Analyse von „NGS“-Daten .................................................................... 31

Sequenzierung und Basecalling ......................................................................................................... 32

Datenformat FASTQ .......................................................................................................................... 33

Quality Scores .................................................................................................................................... 34

Bioinformatische Analyse der „Next-Generation Sequencing“ Daten mit Hilfe der „CLC Genomics

Workbench“ ...................................................................................................................................... 36

Import der „Next-Generation Sequencing“-Daten........................................................................ 36

„Trimmen“ der Reads .................................................................................................................... 37

Assemblierung der Reads .............................................................................................................. 39

De novo-Assemblierung ................................................................................................................. 39

„Mapping“ der Reads gegen eine Referenzsequenz ..................................................................... 40

„Large Gap Read Mapping“ ........................................................................................................... 41

Anhang........................................................................................................................................... 44


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F1-Laborpraktikum Gentechnologie Das FI-Praktikum „Methoden der Gentechnologie - NGS“ soll technische Fähigkeiten im Bereich der

Molekulargenetik sowie in der bioinformatischen Auswertung von Sequenzdaten vermitteln. Dabei

soll einerseits die Isolation von DNA aus Larven der Arten Chironomus (C.) annularius, C. luridus und

C. piger mit der anschließenden Konstruktion einer DNA-Bibliothek für die Sequenzierung auf dem

Illumina HiSeq 2500TM erlernt werden. Des Weiteren sollen bioinformatische Kenntnisse in der

Analyse von NGS-Daten mit Hilfe von gängiger Software vermittelt werden.

Die Familie der Chironomiden (Zuckmücken) gehört zur Ordnung der Diptera (Zweiflügler; Abbildung

1). Chironomiden haben keine typischen Geschlechtschromosomen wie z. B. die X- und Y-

Chromosomen von Säugern. Trotzdem konnte durch genetische Analysen nachgewiesen werden,

dass der Geschlechtsbestimmungsmechanismus bei Chironomiden die männliche Heterogametie ist.

In C. thummi und C. piger konnte darüber hinaus durch zytogenetische Analysen festgestellt werden,

dass der dominante männchenbestimmende Faktor M in einer Chromosomenregion nahe dem

Telomer von Chromosom III liegt.

In situ-Hybridisierungen an Polytänchromosomen von

Chironomiden mit hoch repetitiven Cla-Elementen als Sonde

zeigen ein hemizygotes Signal in genau dieser

Chromosomenregion bei männlichen Tieren der Art

C. thummi, welches in den Präparaten weiblicher Tiere fehlt.

Da dieses Cla-Element-Cluster in der geschlechts-

bestimmenden Chromosomenregion liegt und nur bei

männlichen Tieren und dort immer nur hemizygot zu finden ist, muss dieses Cluster eng gekoppelt

mit dem dominanten Faktor M sein. Um einen molekularen Zugang zu dieser hochinteressanten

Chromosomenregion zu bekommen, wurden von unserer Arbeitsgruppe genomische Lambda-

Bibliotheken von C. thummi mit den hochrepetitiven Cla-Elementen als Sonde gescreent.

Alle positiven Klone wurden anschließend durch in situ-Hybridisierung an Polytänchromosomen von

C. thummi und piger auf ihre chromosomale Herkunft hin überprüft. Die dabei gefundenen Lambda-

Klone λCla1.1Y und λCla1.8Z flankieren das männchenspezifische hemizygote Cla-Element-Cluster

links und rechts (siehe Abbildung 2).

Abbildung 2 Geschlechtsbestimmende Region

Abbildung 1 Stammbaum der Diptera


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Abbildung 3 Ausschnitt aus dem Chironomiden-Stammbaum

Ausgehend von den genomischen Klonen λCla1.1Y und λCla1.8Z wurden sowohl mit λ- als auch

später mit BAC-Bibliotheken von C. thummi sowie C. piger „chromosomal walks“ durchgeführt. Auf

diese Art wurden insgesamt mehr als 200 kb aus der geschlechtsbestimmenden Region (sex

determining region, SDR) kloniert und größtenteils sequenziert (Abbildung 4). Innerhalb dieser

Chromosomenregion konnten repetitive Hind-Elemente und Kopien von transposablen Elementen

wie TFB1 oder CCE entdeckt werden. Zudem zeichnet sich diese Region durch das Auftreten von

zahlreichen invertierten Sequenzwiederholungen (inverted repeats, IR) aus.


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Abbildung 4 Gesamtüberblick der Geschlechtsbestimmenden Regionen von C. thummi, C. piger und C. luridus


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Um Genstrukturen innerhalb des ca. 200 kb großen Sequenzabschnitts (auch „Contig“ genannt) zu

identifizieren, wurden verschiedene Programme (Genescan, PROSCAN, ORF-Finder) eingesetzt. Des

Weiteren wurde die NCBI-Datenbank mit Hilfe der BLASTn-, BLASTp- und BLASTx-Algorithmen auf

mögliche Gene hin untersucht. Auf diese Art und Weise konnten 14 Gene identifiziert werden. Die

Namensgebung erfolgte dabei nach den Treffern der NCBI-Datenbank (Tabelle 1Fehler! Ungültiger

Eigenverweis auf Textmarke.).

Tabelle 1 Gene aus der geschlechtsbestimmenden Region von C. thummi und C. piger

* zu diesem Gen lieg bei C. piger keine Sequenzinformation vor

Die Funktion der meisten dieser Gene bei Chironomus ist bis jetzt unbekannt. Ob es sich bei einem

dieser Gene tatsächlich um den dominanten Männchenbestimmer M handelt, kann also nur

vermutet werden. Teilweise ist die Funktion der homologen Gene z.B. in Drosophila melanogaster

bekannt. Da es aber nur abschnittsweise Übereinstimmungen zu der Sequenz in C. thummi, C. piger,

C. annularius und C. luridus gibt, können diese Informationen nur als Hinweise auf die Eigenschaften

der entsprechenden Gene in der geschlechtsbestimmenden Region dienen.

Besonders interessant im Hinblick auf die Identität des Männchenbestimmers M sind

Sequenzunterschiede zwischen Proto-X- und Proto-Y-Chromosom. Ein solcher Unterschied konnte in

Form eines duplizierten Abschnitts im Bereich der Gene WD74-like und fs(1)K10-like gefunden

werden. Des Weiteren wurden kurz hinter dem Gen d-Laktat-DH-like ein Hinf(lur)-Element und der

vermutliche Beginn des Cla-Element-Clusters identifiziert. Derzeit wird mit verschiedenen Methoden

daran gearbeitet, weitere Sequenzinformationen des Proto-Y-Chromosoms zu erhalten.

Gen Orient. Lage im Contig Funktion (in urspr. Organismus) Besonderheiten

spitz-like 1 - 47157-22928

TGF-Alpha-Homolog (Drosophila melanogaster) spitz-like 2 + 74218-107229

mi-er1-like - 113150-111177 Differenzierung zu mesodermalen Zellen (Xenopuslaevis)

LUC7p-like + 114983-118814 Komponente des U1snRNPs

WD74-like - 120316-116570 unbekannt (Drosophila melanogaster) WD40-Domäne

fs(1)K10-like + 120500-122353 Etablierung der dorso-ventralen Achse der Oocyte (Drosophila melanogaster)

liegt auf dem Proto-Y-Chromosom dupliziert vor

bcn92-like + 122575-123309 evtl. Oxidoreduktase (Drosophila melanogaster)

d-Lactat-DH-like - 128444-122597 Oxidation von d-Lactat zu Pyruvat

polyhomeotic + 132545-139599 Kontrolle der homöotischen Genexpression (Drosophila melanogaster)

hypothetical-protein-like

+ 144127-171075 unbekannt (Drosophila melanogaster)

Rpn5-like* + 173725-175435 Untereinheit und Regulator des 26S-Proteasoms

hermansky-pudlak-like*

- 180208-175467 Komponente des "biogenesis of lysosome-related organelles complex" (Dm)

rpS5-like* + 180785-182242 28S ribosomales Protein S5 (Dm)

CtY* - 197584-181917 DmX-Homolog (Drosophila melanogaster) WD-Repeat-Protein


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Zur näheren Analyse der Gene in der geschlechtsbestimmenden Region und einer möglichen

geschlechtsspezifischen Expression dieser Gene wird eines der modernsten Sequenzierverfahren

eingesetzt. Die Illumina „HiSeq 2500“-Plattform ist Teil einer Reihe von neuen Technologien im

Bereich der Hochdurchsatzsequenzierung, dem sogenannten „Next-Generation Sequencing“ (NGS).

Die meist verbreiteten Technologien dieser Gruppe sind die SOLiDTM-, 454- und Illumina-Verfahren.

Sie machen es möglich, immer günstiger und in immer kürzerer Zeit große Mengen an

Sequenzinformation zu generieren. Hat die Sequenzierung des menschlichen Genoms im Rahmen

des humanen Genom-Projekts (1990-2003) noch über 3 Mrd. US$ und 13 Jahre Forschung benötigt,

so sind Resequenzierungen menschlicher Genome heute innerhalb von einiger Tage und mit Kosten

im Bereich von unter 10.000 € möglich. Neben dem auf Ligation von Oligonukleotiden basierenden

SOLiDTM-System und der Pyrosequenzierung der 454 Roche-Plattform dürften die „NextSeq“- und

„HiSeq“-Systeme der Firma Illumina weltweit den größten Anteil an Sequenzierprojekten haben.

Zurzeit sind hier mit bis zu 250 nt im Vergleich zur SOLiD-Platform größere und im Vergleich zur 454-

Technologie (~800 nt) deutlich kürzere Leseweiten möglich. Allerdings bietet Illumina mit wesentlich

geringeren Fehlerraten und mehr Sequenzinformation eindeutige Vorteile gegenüber der Roche-

Technologie. Während bei der 454-Technologie von

Roche auf Emulsions-PCR und Picotiterplatten

zurückgegriffen wird, findet die spezifische

Amplifikation bei den Illumina-Systemen erst nach

dem Immobilisieren der DNA-Fragmente auf der

Oberfläche des Reaktionsraums, der „Flow Cell“,

statt (Abbildung 5). Diese ist in 8 physisch

voneinander getrennte Reaktionsräume („Lanes“)

unterteilt. Auf den Oberflächen sind

Oligonukleotide mit zwei unterschiedlichen

Sequenzen verankert. Komplementäre Adapter, die

an die DNA-Fragmente ligiert wurden, können an

die Oligonukleotide binden und bilden beim Prozess

der „Bridge Amplification“ Cluster mit tausenden Kopien eines Moleküls (Abbildung 6, A - D). Bei der

„Bridge Amplification“ folgt in mehreren Runden auf eine Synthesephase, in der der Zweitstrang

synthetisiert wird, eine Denaturierung. Da jeweils an das andere auf der Oberfläche der „Flow Cell“

verankerte Oligonukleotid angenüpft wird, ist der Zweitstrang nun auch kovalent an die Oberfläche

gebunden und kann im nächsten Amplifikationschritt mit dem anderen Fragmentende an ein freies

Oligonukleotid binden. Von dessen 3‘ Ende kann die neue Zweitstrangsynthese beginnen. Vor der

eigentlichen Sequenzierung werden die Moleküle über eine adapterspezifische Schnittstelle im

Bereich der verankerten Oligonukleotide einheitlich ausgerichtet (Abbildung 6, C). Letztlich erfolgt

die Sequenzierung ausgehend von einem im Adapterbereich bindenden Primer nach dem Prinzip der

Neusynthese der DNA. Verwendet werden fluoreszenzmarkierte Nukleotide in einem Vier-Farben-

System. Die Markierungen befindet sich an einer reversiblen 3‘-Schutzgruppe am Nukleotid. Diese

verhindert den Einbau von mehreren Nukleotiden in einem Sequenzier-Zyklus. Nach der Detektion

wird die Schutzgruppe mit dem Fluoreszenzfarbstoff chemisch abgespalten und der nächste Zyklus

kann beginnen. So entstehen keine Probleme mit homopolymeren Sequenzabschnitten. Durch

chemische Einflüsse und Laserbestrahlung bei der Detektion werden die Cluster in geringem Umfang

ausgedünnt und/oder geschädigt, wodurch die Signalintensitäten und Qualität der Sequenzierung

sinkt. Zurzeit sind auf dieser Plattform einfache Leseweiten von 250 nt (HiSeq 2500) bzw. 300 nt

(MiSeq) mit bis zu 1000 Gb pro Lauf möglich.

Abbildung 5 Flow Cell


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Mit der im Praktikum verwendeten Chemie werden pro „Lane“ ca. 250 - 400 Mio. Sequenzen mit

einer Länge von 200 bp generiert, welche als „Reads“ bezeichnet werden. Dies entspricht einer

Sequenzinformation von ca. 50-80 Gbp. Diese Masse an Daten aus recht kurzen Sequenzfragmenten

stellt ganz neue Anforderungen an die computertechnische Ausstattung und die Analysealgorithmen.

Es werden neue oder angepasste Strategien für die Auswertung der Sequenzdaten benötigt. Die im

Kurs generierten Daten können in vielerlei Hinsicht bioinformatisch ausgewertet werden: Die Daten

können assembliert und somit in einen genomischen Kontext gebracht werden (de novo Assembly),

das sogenannte „Mapping“ erlaubt es, einzelne Reads gegen eine bereits vorhandene

Referenzsequenz zu kartieren. Dabei werden die Reads Koordinaten in der Referenzsequenz

zugeordnet.

Ziel ist es, die einzelnen Datensätze nach erfolgreicher Assemblierung hinsichtlich art- und

geschlechtsspezifischer Unterschiede zu untersuchen (Abbildung 7). In unserem Fall bedeutet dies,

Assemblierungen aus selbst generierten Sequenzdaten der Chironomusarten C. piger, C. luridus und

C. annularius zu erstellen. Des Weiteren ist es möglich, die Daten gegen die bereits vorhandenen

Referenzen von C. thummi, C. piger und C. luridus zu mappen. Hierfür wurden im Vorfeld des

Praktikums jeweils Larven der drei zu untersuchenden Arten nach ihrem Geschlecht sortiert

(„gesext“). Es soll nun DNA aus Pools von je ca. 20 Larven gewonnen und aufgereinigt werden.

Nach erfolgreicher DNA-Isolierung wird eine DNA-Bibliothek für die Illumina-Sequenzierung

konstruiert und ein „HiSeq2500“-Lauf gestartet. Bei der anschließenden bioinformatischen Analyse

der Daten sollen die Sequenzen dann insbesondere in Hinblick auf Unterschiede in der SDR analysiert

werden.

Abbildung 6 „Bridge Amplification“ und Sequenzierung


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A

B

Abbildung 7 A De novo-Assemblierung eines Genoms. B Mapping kurzer Reads gegen eine Referenzsequenz


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Zeitplan (nicht bindend)

Teil 1: Herstellen einer DNA-Bibliothek für die Illumina-Sequenzierung

Mo, 08.06.2015 - DNA-Isolierung aus Chironomus-Larven

- Agarose-Gelelektrophorese - Konzentrationsbestimmung mit NanoDrop und Qubit Di, 09.06.2015 - Fragmentierung der DNA mit Covaris - Aufreinigung der fragmentierten DNA - End Repair - Größenselektion - optional: Größenbestimmung mit Bioanalyzer Mi, 10.06.2015 - A-Tailing des 3´Endes - Adapter-Ligation - Aufreinigung - Enrichment - Aufreinigung - Qualitätskontrolle mit Bioanalyzer - Quantifizierung mit Qubit Do, 11.06.2015 - Vorbereitung der Sequenzierung - Besichtigung des HiSeq2500 Fr, 12.06.201 - Vorbereitung der Sequenzierung

Teil 2: Seminarvorträge

Nach Terminvereinbarung Mo, 15.06. bis Fr, 19.06.2015

Teil 3: Bioinformatische Analyse der „NGS“-Daten

Mo, 22.06. bis Fr, 26.06.2015


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Theorie Teil 1: Herstellen einer DNA-Bibliothek für „NGS“ Zur Whole Genome Sequenzierung verschiedener Chironomus Spezies wird zunächst genomische

DNA dieser Zuckmücken benötigt. Als Ausgangsmaterial für die DNA-Isolierung dienen gesexte (d.h.

anhand der Genitalimaginalscheiben nach Geschlechtern getrennte) Larven des L4-Stadiums der

verschiedenen Spezies. In einem ersten Schritt wird das Gewebe mechanisch mit einem Potter sowie

chemisch mittels milder Detergenzien (Triton-X-100) aufgeschlossen. Dies dient dazu, die Zellen aus

dem Verbund zu lösen und sie zugänglich für die bei der folgenden Extraktion verwendeten

Detergenzien zu machen. Im Anschluss werden die Kerne mittels Zentrifugation isoliert und mit

scharfen Detergenzien (SDS) lysiert, sodass die DNA austritt. Vorhandene Proteine werden

denaturiert und mit organischen Lösungsmitteln (PCI) extrahiert. Dabei verbleiben Proteine aufgrund

ihrer hydrophoben Bestandteile in der phenolischen unteren Phase oder an der Grenzfläche, der so

genannten Interphase. Die obere wässrige Phase enthält die hydrophilen Nukleinsäuren. Im

Anschluss kann die DNA mit Hilfe von Ethanol gefällt werden. Die Qualität und Quantität der DNA

kann anhand einer Agarose-Gelelektrophorese abgeschätzt werden. Genauere Aussagen zur

Konzentration ermöglichen der NanoDrop und das Qubit Fluorometer.

Da mit dem verwendeten Protokoll zur DNA-Isolierung in der Regel recht hochmolekulare DNA

isoliert werden kann, die Leseweiten der Illumina-Sequenzierung jedoch sehr begrenzt sind (je nach

verwendeter Chemie 100-200 bp), wird die DNA zu Beginn der Library-Präparation mittels Ultraschall

geschert (Abbildung 8-A). Dabei entstehen dsDNA-Fragmente mit 3‘ oder 5‘ Überhangen. Diese

werden während des End Repair in glatte Enden umgewandelt (Abbildung 8-B). Zu große und zu

kleine Fragmente werden bei einer Größenselektion mit magnetischen Beads entfernt (Abbildung 8-

C). Im Anschluss werden die verbleibenden DNA-Fragmente beidseitig mit Adaptern versehen. Um

sicherzustellen, dass ein DNA-Fragment auf beiden Seiten einen Adapter erhält und zu verhindern,

dass zwei DNA-Fragmente oder zwei Adapter miteinander reagieren, werden beim vorangehenden

A-Tailing die Enden der Fragmente mit einem A-Überhang versehen (Abbildung 8-D). Die Adapter

tragen an einem Ende einen komplementären T-Überhang, wodurch die Ligation zwischen DNA-

Fragment und Adapter gefördert wird (Abbildung 8-E). Für die so genannte Bridge Amplification

werden Fragmente benötigt, die an den Enden unterschiedliche Adapter tragen. Dies wird durch

spezielle Y-Adapter gewährleistet. Die beiden Stränge eines Adapters bilden über einen Bereich

komplementärer Sequenzen einen Doppelstrang aus, wohingegen sie sich in einem anderen

Abschnitt unterscheiden und keinen Doppelstrang ausbilden. Werden diese Y-Adapter nun mit den

doppelsträngigen DNA-Fragmenten ligiert, sollte jeder Einzelstrang für sich betrachtet die beiden

unterschiedlichen Adaptersequenzen tragen. Durch wenige Runden einer Enrichment-PCR mit

adapterspezifischen Primern werden DNA-Fragmente, die beidseitig einen Adapter tragen, spezifisch

angereichert. Nach diesem Schritt erhält man eine fertige DNA-Bibliothek, die nach Verdünnung für

die Generierung der Cluster mittels Bridge Amplification auf dem cBot verwendet werden kann

(Abbildung 8-F). Hierbei hybridisieren die denaturierten linearen Fragmente mit den Enden der

Adapter an komplementäre Oligonukleotid-Anker auf der Flow Cell Oberfläche. Die Amplifikation

findet ausgehend von den Flow Cell-Ankern statt, wodurch die Fragmente kovalent an die Flow Cell

gebunden werden. Eine anschließende Denaturierung mit Wasch-Schritt entfernt den ursprünglichen

DNA-Strang. Die neu-synthetisierten, am Anker immobilisierten DNA-Moleküle hybridisieren über ihr

freies Ende mit benachbarten Ankern, die wiederum als Primer für die Amplifikation dienen. Da die

DNA-Moleküle dabei Brücken bilden, wird diese Technik auch als Bridge Amplification bezeichnet.

Durch die wiederholte Amplifikation mit anschließender Denaturierung und Bildung neuer Brücken

entstehen Cluster, die aus tausenden Kopien des zuvor gebundenen Fragments bestehen.


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Abbildung 8 Herstellen einer DNA-Bibliothek


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Praxis Teil 1: Herstellen einer DNA-Bibliothek für die Sequenzierung

Allgemeine Laborsicherheit und Verhaltensregeln

1. Tragen Sie für alle Arbeiten im Labor einen Laborkittel. 2. In den Laborräumen sollten nur Schreib- und Arbeitsmaterialien aufbewahrt werden.

Straßenkleidung und Taschen sind in die dafür vorgesehenen Spinde (SBI = benachbartes Gebäude) einzuschließen. Bitte hierfür ein geeignetes Vorhängeschloss mitbringen. In den Laborräumen ist das Essen, Trinken und Rauchen verboten.

3. Arbeiten Sie umsichtig und bewusst. Gefährden Sie weder sich selbst noch Ihre Kommilitonen. 4. Studentinnen, die sich in anderen Umständen befinden, teilen dies dem Kursleiter mit. Er wird

diese Mitteilung vertraulich behandeln, eine erfolgreiche Kursteilnahme ermöglichen und Sie von gesundheitsschädlichen Stoffen fernhalten.

5. Wir arbeiten mit organischen Lösungsmitteln, Laugen und Säuren. Vermeiden Sie unbedingt Hautkontakt bzw. orale Aufnahme. Nutzen Sie die angebotenen Schutzmittel wie Handschuhe und Schutzbrillen.

6. Falls Sie sich verletzen sollten, informieren Sie sofort den Kursleiter. Im Bedarfsfall sind in jedem Laborraum Augenduschen vorhanden.

7. Beschriften Sie alle Proben ausreichend mit einem wasserfesten Stift (z.B. Inhalt, Gruppennr., Datum)!

DNA-Isolierung aus Chironomus-Larven

Die DNA-Isolierung erfolgt in folgenden Schritten:

Gewebeaufschluss

Kernisolation

Kernlyse

Extraktion der Proteine

Ethanol-Fällung der DNA

Lösen der DNA

Bitte notieren Sie sich ihre Gruppennummer, die verwendete Chironomus Spezies und das

Geschlecht der Larven!

1. Larven in Potter (auf Eis) überführen.

2. 2 ml "Homogenisierungspuffer" hinzufügen (eiskalt), 1/10 Vol. 10% Triton-X-100 zugeben.

3. Unter Eiskühlung homogenisieren.

4. Homogenat durch Gaze filtrieren und mit 1 ml Homogenisierungspuffer Glas und Gaze

nachspülen.

5. Filtrat in kleinen Falcons 15 min., 5.000 Upm, 4 °C zentrifugieren.

6. Überstand sauber abheben, verwerfen und Sediment in 2 ml Homogenisierungspuffer

resuspendieren, zentrifugieren (wie 5), diesen Schritt gegebenenfalls ca. 3x wiederholen bis

Kern-Pellet „sauber“ erscheint.

7. Das Kern-Pellet in etwa 2 ml eiskaltem Homogenisierungspuffer resuspendieren.

8. Proteinase K (eine Spatelspitze) hinzufügen.

9. 1/10 Vol. 10% SDS und 1/10 Vol. 10x Dialysepuffer zur Kernlyse hinzufügen – durch Invertieren

vorsichtig mischen. (Lösung sollte viskos werden! Warum?)


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10. 1-2 Std. (evtl. auch über Nacht) bei 60 °C inkubieren (Kernlyse).

11. Inkubationsgemisch auf Raumtemperatur abkühlen (optional).

12. 0,1 Vol. gesättigtes Tris, pH 8,5 hinzufügen (zur pH-Einstellung!)

13. 0,25 Vol. 5 M NaClO4 (Natriumperchlorat) hinzufügen, gut invertieren (es bildet sich ein

weißlicher Niederschlag).

14. Gleiches Vol. Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Gemisch (25:24:1) hinzufügen.

15. Mind. 5 min. durch Invertieren gut mischen.

16. 10 min., 5000 Upm bei RT zentrifugieren.

17. Wässrige Phase (immer „oben“!) ohne das Interphase-Material mit einer „weiten“ Pipette

(abgesägt) abheben und in ein neues Falcon-Röhrchen überführen (enthält die DNA), damit die

Schritte 14-17 ca. 3 bis 5x wiederholen (Betreuer fragen!).

18. Zuletzt die DNA-Phase 1x mit gleichem Vol. Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) versetzen,

extrahieren und zentrifugieren (zur Entfernung sämtlicher Phenolreste aus der DNA-Phase).

19. Nach dem Zentrifugieren obere, wässrige Phase mit einer "weiten" Pipette (abgesägt) ohne

Interphase-Material abheben und in vorgekühltes (mögl. graduiertes) Falcon-Röhrchen

überführen - in Eis abkühlen lassen.

20. Noch einmal 1/10 Vol. 10x Dialysepuffer zugeben und mischen, dann mit 2 Vol. kaltem Ethanol

abs. überschichten und invertieren.

21. 30 min. bei -20°C inkubieren.

22. 45 min., Höchstgeschwindigkeit bei 4 °C zentrifugieren.

23. Überstand abheben, Pellet mit 1 ml 70% EtOH überschichten (nicht resuspendieren!)

24. 10 min., Höchstgeschwindigkeit bei RT zentrifugieren.

25. Überstand abheben, Pellet trocknen.

26. Pellet in 100-150 µl HPLC-H2O lösen (Betreuer fragen!)

27. 1/10 Vol. der Probe in ein neues Eppendorfgefäß überführen (Agarose-Gelelektrophorese)

28. Restliche genomische DNA bis zum Fragmentieren bei -20 °C wegfrieren. (Beschriftung!)

Agarose-Gelelektrophorese

Durch Agarose-Gelelektrophorese werden DNA-Fragmente entsprechend ihres Molekulargewichts

aufgetrennt. Die Gelelektrophorese wird mit Hilfe des Gelkammersystems GENterphorese der Firma

GENterprise durchgeführt. Die DNA kann im Gel durch den interkalierenden Fluoreszenzfarbstoff

Ethidiumbromid unter UV-Licht (312 nm) direkt sichtbar gemacht werden.

Herstellung eines 0,8%-igen Agarosegels

1. 0,8 g Agarose in Schott-Flasche einwiegen.

2. 100 ml 1x TBE zugeben.

3. In Mikrowellengerät bis zum Kochen erhitzen, ggf. mit VE-H2O auf 100 ml auffüllen.

4. Gelkassette in Ständer stellen, mit Tesafilm seitlich verschließen, Kamm einstecken.

5. „Sockel“ zur Abdichtung der Gelkassette gießen.

6. Gellösung auf ca. 60°C abkühlen lassen, dann luftblasenfrei mit Pipette einfüllen.

7. Während der Abkühlphase Agaroselösung nach Bedarf nachfüllen.

8. Nachdem die Agarose erstarrt ist, Kamm vorsichtig aus dem Gel ziehen.

9. Probentaschen mit Pasteurpipette ausspülen.


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Vorbereitung der GENterphorese-Apparatur

1. Füllen Sie die Kammer mit 1 x TBE-Laufpuffer bis etwa 3 mm über die obere Elektrode (Kathode).

2. Setzen Sie das Gel über die Führungsnut in die Kammer ein und drücken Sie es nach unten (Abb.). Wenn die Anschlüsse der Kammer nach rechts zeigen, muss sich die kurze Platte der Gelkassette vorne befinden.

3. Schieben Sie den GENterphorese-Deckel auf die Pufferkammer.

4. Verbinden Sie den roten Stecker mit dem roten Anschluss des Spannungsgerätes und den schwarzen Stecker mit dem schwarzen Anschluss. Prüfen Sie vor dem Auftragen der Proben, ob Strom (Einheit: mA) durch das Gel fließt (Netzgerät kurz einschalten; Betreuer fragen!).

5. Spannungsgerät ausschalten und Deckel entfernen.


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Durchführung der Elektrophorese

Achtung: EtBr ist mutagen! Alles, was mit diesem Stoff in Berührung kommt, nur mit Einweghandschuhen aus Nitril anfassen! Nicht direkt in das UV-Licht hineinschauen und UV-undurchlässige Schutzbrillen tragen oder hinter Glas arbeiten! 1. 1/10 Vol. der isolierten genomischen DNA in ein neues Eppendorfgefäß überführen und mit 1/6

Vol. Gelladepuffer versetzen. 2. Die mit Ladepuffer versetzen Proben auf das Agarosegel auftragen. Zusätzlich werden Spuren mit

Hind III-restringierter Lambda-DNA und einem weiteren Molekulargewichtsstandard für kleine DNA-Fragmente (z.B. 100 bp-Leiter) beladen.

3. Deckel der GENterphorese-Kammer schließen und Spannungsgerät anschließen. 4. Elektrophorese bei 100 V (ca. 20 min.). 5. Elektrophorese durch Ausschalten des Spannungsgeräts beenden, wenn die Bromphenolblau-

front ca. 2-3 cm vom unteren Gelrand entfernt ist. Kabelverbindungen lösen. 6. Gel mithilfe des Schiebers aus der Gelkassette herausschieben und in die EtBr-Färbelösung legen. 7. Gel für 2-5 min. färben und kurz wässern. 8. Gel auf UV-Tisch dokumentieren.

Erstellen einer DNA-Library mit dem Illumina TruSeq Nano DNA Kit

Allgemeine Hinweise und Vorbereitungen

1. Alle Puffer werden erst kurz vor Gebrauch aufgetaut und auf RT gebracht, danach sofort wieder

eingefroren.

2. Enzyme werden stets auf Eis gelagert und nach Gebrauch sofort wieder bei -20°C eingefroren.

3. Enzyme werden knapp unter dem Meniskus pipettiert. Es ist darauf zu achten, dass kein

überschüssiges Enzym an der Außenseite der Pipettenspitze hängt.

4. Bevor Enzymreaktionen inkubiert werden, werden sie kurz gemischt und abzentrifugiert.

5. Das 80%-ige EtOH wird am Ende des Arbeitstages bei -20°C eingefroren.

6. Die Beads werden 30 min. vor Nutzung auf RT gestellt und direkt vor dem Gebrauch gut

gevortext.

Fragmentierung der DNA

Achtung: Für die Library-Generierung sollten laut Illumina 100-200 ng DNA verwendet werden.

Jedoch kann maximal 50 µl fragmentierte DNA eingesetzt werden. Zum Scheren werden ca. 1 µg

genomische DNA in ca. 100 µl eingesetzt, damit im Anschluss ein Testgel durchgeführt und falls

nötig das Scheren wiederholt werden kann. Bitte Rücksprache mit dem Betreuer halten!

1. 100 µl genomische DNA (ca. 1 µg) in ein Covaris-Tube überführen.

2. Probe im Covaris-Tube abzentrifugieren.


18

3. Scheren:

Setting 350 bp Insert 550 bp Insert

Duty cycle 10 %

Intensity 5,0 2,0

Cycles per burst 200

Duration 45 s

Mode Frequency sweeping

Displayed Power 23 W 9 W

Temperature 5,5 - 6,0 °C

4. Probe im Covaris-Tube abzentrifugieren.

5. Gescherte DNA in neues Gefäß überführen.

6. Teil der DNA (z.B. 1/10 Vol.) auf Gel testen (Agarose-Gelelektrophorese).

7. Falls Fragmentierung nicht ausreichend: Scheren wiederholen.

Aufreinigung der fragmentierten DNA

1. Sample Purification Beads gründlich vortexen.

2. 80 µl Sample Purification Beads zu 50 µl fragmentierter DNA geben und durch Auf- und

Abpipettieren gut mischen.

3. 5 min. bei RT inkubieren.

4. Probe in den Magnetständer stellen, warten bis die Lösung klar ist.

Folgende Schritte 5-10 werden im Magnetständer durchgeführt:

5. 125 µl Überstand entfernen ohne die Beads zu lösen.

6. 200 µl 80 % EtOH zugeben ohne die Beads zu lösen und 30 s inkubieren.

7. Überstand entfernen ohne die Beads zu lösen und nochmals mit 200 µl EtOH waschen.

8. Verbleibenden EtOH mit 10 µl Pipette entfernen.

9. 5 min. bei RT im Magnetständer trocknen lassen. (Beads sollten nicht „bröseln“)

10. 62,5 µl Resuspension Buffer über die Beads laufen lassen, dabei die Beads nicht mit der

Pipettenspitze berühren, da sie sonst an der Spitze hängen bleiben.

11. Probe aus dem Magnetständer nehmen und die Beads durch wiederholtes Auf- und

Abpipettieren resuspendieren.

12. 2 min. bei Raumtemperatur inkubieren


14. 60 µl klaren Überstand in ein neues Gefäß überführen, dabei die Beads nicht lösen.

Umgehend mit End Repair fortfahren!


19

End Repair

1. 40 µl End Repair Mix 2 zur Probe geben und durch Auf- und Abpipettieren gut mischen.

2. Probe kurz anzentrifugieren.

3. Probe bei 30 °C für 30 min. im Thermocycler inkubieren.

Umgehend mit Größenselektion fortfahren!

Größenselektion


2. Sample Purification Beads in Eppendorfgefäß mit HPLC-Wasser verdünnen:

350 bp Insert Size Formel

Sample Purification Beads # der Proben x 109,25 µl

HPLC-H2O # der Proben x 74,75 µl

550 bp Insert Size Formel

Sample Purification Beads # der Proben x 92 µl

HPLC-H2O # der Proben x 92 µl

3. Verdünnte Beads gründlich vortexen.

4. 160 µl verdünnte Sample Purification Beads zur Probe geben und durch Auf- und Abpipettieren

gut mischen.

5. 5 min. bei RT inkubieren


7. 250 µl Überstand (enthält die gewünschte DNA!!!) in ein neues Gefäß überführen.


9. 30 µl unverdünnte Sample Purification Beads zur Probe geben und durch Auf- und Abpipettieren

gut mischen.



Folgende Schritte 12-18 werden im Magnetständer durchgeführt:



14. Überstand entfernen und nochmals mit 200 µl EtOH waschen.



17. 20 µl Resuspension Buffer über die Beads laufen lassen, dabei die Beads nicht mit der





20

19. 2 min. bei Raumtemperatur inkubieren.


21. 17,5 µl klaren Überstand in ein neues Gefäß überführen, dabei die Beads nicht lösen.

Möglichkeit zum Lagern bei -20°C

Adenylierung der 3‘ Enden

1. 12,5 µl A-Tailing Mix zur Probe geben und durch Auf- und Abpipettieren gut mischen.


3. Probe bei folgendem Programm im Thermocycler inkubieren:

37 °C für 30 min. 70 °C für 5 min. 4 °C für 5 min. Hold at 4 °C


Umgehend mit Adapterligation fortfahren!

Adapterligation

1. 2,5 µl Resuspension Buffer zur Probe geben

2. 2,5 µl Ligation Mix 2 zur Probe geben

3. 2,5 µl DNA Adapter Index zur Probe geben (Rücksprache mit dem Betreuer halten! Index

notieren!)

4. Probe durch Auf- und Abpipettieren gut mischen.


6. Probe bei 30 °C für 10 min. im Thermocycler inkubieren.

7. 5 µl Stop Ligation Buffer zur Probe geben und durch Auf- und Abpipettieren gut mischen.

Zweifache Aufreinigung


2. 42,5 µl Sample Purification Beads zur Probe geben und durch Auf- und Abpipettieren gut

mischen.



Folgende Schritte werden im Magnetständer durchgeführt:







21









16. 50 µl Sample Purification Beads zur Probe geben und durch Auf- und Abpipettieren gut mischen.

















Enrichment

1. 5 µl PCR Primer Cocktail zur Probe geben

2. 20 µl Enhanced PCR Mix zur Probe geben und durch Auf- und Abpipettieren gut mischen.


4. Probe bei folgendem Programm im Thermocycler inkubieren:

95 °C für 3 min.

8 Zyklen: 98 °C für 20 s

60 °C für 15 s

72 °C für 30 s

72 °C für 5 min

Hold at 4 °C

5. Probe kurz anzentrifugieren

Aufreinigung


2. 50 µl Sample Purification Beads zur Probe geben und durch Auf- und Abpipettieren gut mischen.



22
















Quantifizierung der Library mit Qubit HS Assay

Der Qubit ermöglicht eine fluorometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren.

Verwendet wird das Qubit dsDNA HS Assay Kit, das zur Messung von DNA-Konzentrationen zwischen

10 pg/µl und 100 ng/µl geeignet ist. Ein im Qubit Reangenz enthaltender Farbstoff bindet spezifisch

an doppelsträngige DNA und kann daraufhin mit einem Fluorometer detektiert werden. Die Stärke

des Fluoreszenzsignals ist proportional zur Konzentration der DNA-Probe. Die Verwendung eines

Eichstandards ermöglicht eine exakte Konzentrationsbestimmung.

Lassen Sie alle Lösungen 30 min auf RT equilibrieren. Die Farbstoffe sollten dabei nicht direktem

Sonnenlicht ausgesetzt sein. Die Qubit-Tubes werden nur mit Handschuhen angefasst.

1. Qubit-Tubes auf dem Deckel beschriften: eines je Probe und zwei Standards (S1 und S2)

2. Qubit-Arbeitslösung herstellen:

Volumen der Arbeitslösung = [(Zahl der Proben + 1) x 199 µl] + [2 x 190 µl]

Zusammensetzung der Arbeitslösung: Qubit dsDNA HS Reagent 1:200 verdünnt in Qubit

dsDNA HS buffer

3. In die Qubit-Tubes für die Standards 190 µl Arbeitslösung vorlegen.

4. In die Qubit-Tubes für die Proben 199 µl Arbeitslösung vorlegen.

5. 10 µl der Standards zur vorgelegten Arbeitslösung pipettieren und gut vortexen.

6. 1 µl der Probe zur vorgelegten Arbeitslösung pipettieren und gut vortexen.

7. Proben 2 min. inkubieren und zügig messen.


23

Qualitätskontrolle, Molekulargewichtsverteilung und Quantifizierung der Library mit Agilent

Bioanalyzer Nano-Assay

Die Messmethode des Bioanalyzers entspricht dem einer Mikrokapillargelelektrophorese. Die Proben

werden durch Anlegen einer geeigneten Spannung elektrophoretisch aufgetrennt, wobei ein sehr

sensitiver, interkalierender Fluoreszenzfarbstoff von einer Kamera detektiert wird. Die gemessene

Fluoreszenz wird gegen die Laufstrecke (in Sekunden) ausgegeben. Durch Verwendung eines

Molekulargewichtsstandards (Leiter) kann dann aus der Laufstrecke das Molekulargewicht der

einzelnen Fragmente bestimmt werden. Wie auch bei normalen Gelelektrophoresen entscheidet die

Konzentration des Gels über die Auftrennungseigenschaften. Mit dem DNA High Sensitivity Kit

können Fragmente zwischen 50 und 7000 Basenpaaren mit Quantitäten von 5-500 pg/µl detektiert

werden.

Richtiges Pipettieren: niemals an den Rand der Wells, sondern immer auf den Boden pipettieren.

Ein Gelaliquot versetzt mit dem Farbstoff (Gel-Dye-Mix) wird Ihnen bereitgestellt. Lassen Sie alle

Lösungen 30 min auf RT equilibrieren. Die Farbstoffe sollten dabei nicht direktem Sonnenlicht

ausgesetzt sein.

1. Nehmen Sie einen neuen DNA High Sensitivity Chip aus der Packung und legen Sie Ihn in die

Vorbereitungsstation.

2. Pipettieren Sie 9 µl Gel-Dye-Mix in das mit gekennzeichnete Well (weißer

Punkt in der unten aufgeführten Grafik). Bitte entnehmen Sie das Gel aus dem

Aliquot knapp unterhalb des Meniskus, da sich am Boden Schwebstoffe absetzen,

die den Lauf beeinträchtigen können.

ACHTUNG: Lesen Sie an dieser Stelle bitte die Punkte 5-7 und bereiten Sie Pipetten und Lösungen

vor, bevor Sie weiterarbeiten

3. Stellen Sie die Spritze auf 1 ml ein, schließen Sie die Vorbereitungsstation und drücken Sie die

Spritze herunter, bis diese vom Clip gehalten wird.

4. Warten Sie exakt 60 Sekunden (Timer) und lösen Sie den Clip.

5. Warten Sie 5 Sekunden und ziehen Sie dann die Spritze LANGSAM wieder in die

Ausgangsposition zurück.

6. Öffnen Sie die Vorbereitungsstation und pipettieren Sie 9 µl Gel-Dye-Mix in die

mit gekennzeichneten Wells.

7. Pipettieren Sie nun 5µl DNA High Sensitivity Marker (grün •) in die verbleibenden

12 Wells.


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8. Pipettieren Sie 1 µl der DNA High Sensitivity Ladder (gelb •) in das mit

gekennzeichnete Well.

Pipettieren Sie nun jeweils 1 µl Ihrer Proben in die 11 vorhandenen Wells und

notieren Sie die Reihenfolge. In alle unbenutzten Wells pipettieren Sie 1 µl DNA

High Sensitivity Marker (grün •).

9. Legen Sie den Chip in den beigestellten IKA Vortexer (nur eine Orientierung ist

möglich!) und starten Sie diesen.

HINWEIS: Der IKA Vortexer stoppt automatisch nach einer Minute

10. Legen Sie den Chip in den Bioanalyzer (vermeiden Sie ruckartige Bewegungen) und beginnen Sie

den Lauf innerhalb von 5 min nach Präparation des Chips durch Betätigung des Start-Knopfes

(wird grün wenn der Chip erkannt wurde).


25

Theorie Teil 2: Bioinformatische Analyse von „Next-Generation Sequencing“-

Daten

Sequenzalignment

In der Bioinformatik wird unter einem Alignment der Vergleich von zwei (paarweises Alignment) oder

mehreren (multiples Alignment, MSA) Zeichenketten oder Sequenzen verstanden. Voraussetzung für

einen Vergleich ist, dass beide Sequenzen derselben Notation (Alphabet) folgen. Beide Sequenzen

werden für das Alignment untereinander gelegt und die einzelnen Stellen der Zeichenkette

miteinander verglichen. Sind beide Stellen identisch, so spricht man von einem match, sind sie

ungleich von einem mismatch. Da auch ganze Abschnitte der einen Sequenz innerhalb der anderen

fehlen können, müssen diese Stellen im Alignment berücksichtigt werden. Diese Lücken (gaps)

stellen eine große Herausforderung in der Bioinformatik dar, da sie nicht direkt erkennbar sind.

Für die Visualisierung von Sequenzalignments gibt es verschiedene

Methoden. Die einfachste ist der sogenannte Dot-Plot (Abbildung 9).

Hier werden in einer Matrix, aufgespannt durch die orthogonal

zueinander liegenden Sequenzen, mögliche matches entsprechend

eingetragen, wodurch sich spezielle Muster ergeben. Diese Muster

deuten auf verschiedene Eigenschaften hin, wie z.B. längere

Abschnitte mit Übereinstimmung (lange Diagonalen),

Wiederholungen der Sequenz (repeats, horizontale oder vertikale

wiederkehrende Diagonalen), oder Poly-Nukleotid-Abschnitte bzw.

sehr kurze Wiederholungen (dunkle Blöcke). Da es für zwei

Sequenzen alleine schon mehrere Möglichkeiten des Alignments gibt, müssen die jeweiligen

Anordnungen einzeln bewertet werden. Hierbei vergibt man für matches, mismatches sowie gaps

Punkte, welche zusammengezählt am Ende zu einem score führen. Dieser stellt ein Maß für die Güte

des Alignments dar. Für die Berechnung des scores werden scoring-Matrizen benutzt. Diese geben

für jedes mögliche Alignment einen Wert aus. Für Nukleotidsequenzen sind diese Matrizen sehr

einfach gehalten. Auf Ebene der Aminosäuren gibt es komplexer aufgebaute Matrizen, da ein

Basenaustausch nicht zwangsläufig auch eine Veränderung der Aminosäuresequenz zufolge hat.

Sogenannte Substitutionsmatrizen spiegeln hier die Wahrscheinlichkeit einer Mutation durch

entsprechend angepasste scoring-Werte wider. (Dayhoff et al. 1978; Henikoff & Henikoff 1992).

Assemblierungsmethoden MSAs bilden die Grundlage der ersten Assemblierungsmethoden. Mit dem Aufkommen der ersten

Sequenziertechniken war es nötig, die Ursprungssequenz(en), welche durch Scherung des

genetischen Materials zerstört wurden, wieder zu rekonstruieren. Das Scheren - ob chemisch oder

mechanisch - bildet bis heute einen Bestandteil der Herstellung von Sequenzbibliotheken, da keine

Technik über eine Leseweite von mehr als einer Kilobase (kb) verfügt und neuere Ansätze,

sogenannte next-generation sequencing - Methoden noch kürzere Sequenzschnipsel (Reads) liefern.

Durch Amplifizierungschritte vor der Scherung entstehen Reads, welche sich in der Ursprungsequenz

überlagern und somit einen Überlapp (overlap) besitzen. Diesen macht man sich im

Assemblierungsprozess zunutze, indem man durch Sequenzalignments der Randregionen größere

Abbildung 9 Dot Plot (http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/3/33/Zinc-finger-dot-plot.png)


26

Sequenzstücke produziert. Im optimalen Fall kann man so die Ursprungssequenz rekonstruieren.

Erschwert wird das Ganze durch eine, jeder Technik zugrunde liegende Fehlerrate, welche z.B. zu

falschen Basen innerhalb der Reads führt.

Erste Assemblierungsalgorithmen aus den 70er und 80er Jahren beruhen auf der Tatsache, dass

relativ wenige, lange Reads aus der damals am weitesten verbreiteten Technik, der Sanger-

Sequenzierung vorliegen. Sogenannte greedy-Algorithmen, die schnelle, suboptimale Lösungen

lieferten, waren die ersten Ansätze für die Implementierung solcher Assemblierungsstrategien.

Obwohl die Hard- und Softwareindustrie in den letzten Jahrzehnten große Fortschritte gemacht hat,

konnten die Algorithmen mit den immer riesiger werdenden Datenmengen nicht mithalten, da ihre

Rechenzeit mit dem Wachstum der Daten exponentiell anstieg. Neuere Strategien bedienen sich

Methoden der dynamischen Programmierung, heuristischen Ansätzen sowie mathematischen

Methoden aus den Graphentheorien.

BLAST

Einer der bekanntesten Algorithmen, welcher sich dieser Methoden bedient, ist der BLAST-

Algorithmus („Basic Local Alignment Search Tool“, Altschul et. al. 1990). Er basiert auf der Annahme,

dass Sequenzen mit großer Ähnlichkeit kurze, identische Abschnitte besitzen.

Abbildung 10 BLAST-Algorithmus

Durch das Erstellen einer Liste mit kurzen Teilsequenzen (words) aus der Anfrage- (query) und

Zielsequenz (subject) und durch beidseitiges Verlängern dieser Übereinstimmungen werden so

gezielt kurze, lokale Alignments zwischen nahe verwandten Sequenzen erzeugt. Diese geben

Aufschluss über ihre Funktion oder die Beziehung zueinander. Mithilfe dieser Technik wird die Anzahl

der Sequenzvergleiche deutlich reduziert und somit eine Lösung in endlicher Zeit möglich gemacht.


27

Obwohl der BLAST-Algorithmus keine Assemblierungsmethode ist, findet man diese Technik in vielen

neueren kommerziellen Assemblierungsprogrammen (DNAStar, SeqMan, NGEN etc.) wieder. So

werden im Vorfeld schon gezielt Sequenzen für einen näheren Vergleich (Alignment) aufgrund

identischer Subsequenzen in Betracht gezogen.

Trotz dieser heuristischen Ansätze sind auch neuere Implementierungen bisweilen mit der Menge

der Daten überfordert, da ein simples Alignment zweier Sequenzen sehr speicherintensiv sein kann.

So wurden in den letzten Jahren verstärkt Ansätze aus den Graphentheorien zu Rate gezogen. Vor

allem Sequenzierungen aus NGS-Projekten erfordern eine veränderte Denkweise für

Assemblierungsstrategien. Da hier mehr qualitativ hochwertigere, kürzere Reads mit einer höheren

Abdeckung (coverage) der Nukleotidpositionen erzeugt werden, rückt der Fokus weg von

rechenintensiven Alignments einzelner Sequenzpaare hin zu speicherentlastenden Vergleichen von

identischen Subsequenzen auf Nukleotidebene. Unterschiede, wie Punktmutationen (SNPs) spiegeln

sich hier in Aufgabelung der Graphen wider, sich wiederholende Abschnitte in Blasen innerhalb des

Graphen. Einer der erfolgreichsten dieser Methode ist der Ansatz des De-Bruijn-Graphen.

De-Bruijn-Graph (DBG)

Die Grundlage des DBG sind Datensätze, welche:

- Eine hohe Abdeckung der Ursprungssequenz besitzen,

- eindeutig in ihrer Notation sind (kein IUPAC-Code),

- Reads gleicher Länge besitzen (wenn möglich).

Da der DBG keine Alignments im klassischen Sinne durchführt (und somit keine gaps einbaut), wird

der Überlapp durch eine Präprozessierung der Rohdaten gewährleistet. Dieser 'Rückwärtsschritt'

besteht in der Zerlegung der Eingangsdaten in eine Menge von Subsequenzen (kmers). Diese

Zerlegung geschieht in nukleotidlangen Schritten, wodurch sich die kmers eines einzelnen Reads

überlappen und zwar mit der Länge kmer–1. Obwohl dieser Schritt eine Amplifizierung der

Datenmenge bedeutet, kann durch geschickte Implementierung die Menge des Speichers reduziert

werden, da Subsequenzen, die öfters auftreten, nur einmal gespeichert werden müssen.

Der Ablauf des Algorithmus sieht nun wie folgt aus:

1. Beginne bei einem beliebigen kmer.

2. Schneide am 5' Ende ein Nukleotid ab.

3. Erzeuge 4 mögliche Nachbar-kmere, indem am 3' Ende einzeln alle 4 Nukleotide anhängt werden.

4. Wiederhole die Schritte 1-3 mit dem Ursprungs-kmer mit dem 5' und dem 3' Ende vertauscht.


28

Abbildung 11 Mögliche Nachbar-kmere

Dadurch erhält man für ein einzelnes kmer 8 mögliche Nachbar-kmere (Fehler! Verweisquelle konnte

nicht gefunden werden.). Für jedes Nachbar-kmer, das im Datenpool existiert, wird im Graphen eine

Kante zwischen den beiden kmeren gezogen. Der so entstandene Graph zeichnet sich durch eine

Vielzahl komplexer Strukturen (Blasen, Schleifen) aus, welche auf verschiedene Charakteristiken der

Ursprungssequenz wie SNPs oder repeats hindeuten. Zur Auflösung dieser Strukturen werden Meta-

Informationen über die Abdeckung oder Qualität der Sequenzdaten hinzugezogen. Durch den Ablauf

des Graphen können nun im letzten Schritt die mögliche(n) Ursprungssequenz(en) ermittelt werden.

Abbildung 12 Schematische Darstellung einer Assemblierung mithilfe des De Bruijn Graphen


29

Abbildung 13 De Bruijn-Graph

Obwohl Ansätze aus der Graphentheorie sehr viele Probleme der klassischen Ansätze umgehen,

entstehen auch neue Schwierigkeiten, da z.B. Repeat-Regionen, die von den kmeren nicht

überspannt werden, nicht überwunden werden können. Um dieses Problem zu lösen, werden schon


30

während der Sequenzierung neue Techniken angewandt, welche Datensätze mit read-Paaren

erzeugen (paired-end-Reads, mate-pairs). Der Abstand dieser Paare innerhalb der Ursprungssequenz

ist bekannt und kann somit im Assemblierungsprozess berücksichtigt werden.

Arbeitsablauf Sequenzverarbeitung

Aufgrund der immer stärker wachsenden Menge der Daten werden im Institut für Molekulargenetik

gezielt Methoden der parallelen Datenverarbeitung etabliert, sei es durch Nutzung neuer, bereits

parallel implementierter Algorithmen oder durch parallele Verarbeitung auf Ebene der voneinander

unabhängigen Eingangsdaten. Als Beispiel dient hierfür die Parallelisierung des Blast-Prozesses.

Die Blast-Option des NCBI (National Center for Biotechnology Information) bietet nur beschränkte bis

keine Möglichkeiten der Hochdurchsatzdatenverarbeitung, da Sequenzen einzeln eingegeben

werden müssen oder nur kleinere Datensätze hochgeladen werden können. Durch die Verlagerung

der Berechnungen auf lokale Desktop-PCs, wird die Verarbeitung der Daten zwar unabhängig von

Aspekten wie Serverauslastung und Netzwerkverbindungen, jedoch bildet der PC selbst aufgrund der

(z. Zt.) geringen Ausstattung den Flaschenhals des Verarbeitungsprozesses. Des Weiteren müssen für

lokale Blast-Suchen entsprechende Datenbanken zuerst heruntergeladen oder eigene

Sequenzdatenbanken erzeugt werden.

Möglichkeiten der Parallelisierung Es gibt mehrere Ansätze der Parallelisierung der Blast-Suche. Durch die Nutzung von Multicore-

Systemen oder HPC (High-Performance-Cluster, vernetzte Computer mit zentraler Steuerung und

Verwaltung durch entsprechende Software) ist es möglich, voneinander unabhängige Aufgaben

parallel zu verarbeiten, deren Ergebnisse zu speichern und am Ende wieder zusammenzuführen.

Durch gezielte parallel implementierte Algorithmen ist es möglich auf Softwareebene die vorhandene

Hardware maximal auszunutzen und somit eine (im optimalen Falle) lineare Skalierung zu erzielen.

Ein Ansatz für paralleles Arbeiten mit dem Blast-Prozess ist die Aufteilung der Datenbank. Dies

erfordert aber eine intensive Kommunikation zwischen den Prozessen, da dieselbe Sequenz

gleichzeitig in mehreren Datenbankuntereinheiten gesucht wird. Durch Aufteilung der Datenbank

wird darüber hinaus die Berechnung des E-value komplizierter, da dieser von der Datenbankgröße

abhängig ist. Ein anderer Ansatz ist die Aufteilung auf Sequenzebene. Das bedeutet, dass die

Eingangsdaten im Vorfeld in mehrere Datensätze aufgeteilt werden, um diese unabhängig

voneinander auf getrennten Systemen zu verarbeiten. Der Vorteil dieses Prozesses ist, dass die

Statistik nicht verändert wird. Nachteil dieser Art der Prozessierung ist allerdings, dass die Datenbank

für jeden einzelnen Prozess geladen werden muss und somit eine erhöhte Auslastung des

Arbeitsspeichers erfolgt.


31

Praxis Teil 2: Bioinformatische Analyse von „NGS“-Daten

In diesem Teil des Praktikums analysieren Sie Ihre in Teil 1 gewonnenen Genom-Daten im Hinblick

auf folgende Fragestellungen:

Vergleichen Sie Ihre Daten mit der bekannten geschlechtsbestimmenden Genomregion (SDR)

aus C. thummi bzw. C. piger.

Können neue Gene identifiziert werden?

Stimmt die Genabfolge bzw. deren Orientierung mit den Genen aus der SDR von C. thummi

bzw. C. piger überein?

Identifizieren Sie mögliche strukturelle Variationen bzw. repetitive Sequenzen.

Vergleichen Sie die SDR hinsichtlich des Geschlechts (♀ / ♂) auf Unterschiede.

Vergleichen Sie die SDR aller Arten (C. thummi, C. piger, C. luridus und

C. annularius)miteinander.

Dabei sollen Sie verschiedene Analyseverfahren wie Mapping, „Read Count“, DotPlot, BLAST, „Large

Gap Read Mapping“ und Assembly mit verschiedenen Programmen kennen lernen. Zentrale, aber

nicht ausschließliche, Analysesoftware soll dabei die schon letzte Woche benutzte „CLC Genomics

Workbench“ sein.

Sequenzierung und Basecalling

Da auf der HiSeq Flow Cell lediglich 8 seperate Reaktionsräume, sogenannte Lanes vorhanden sind,

wurde zusätzlich zur eigentlichen Sequenzierung ein Index Read durchgeführt. Schon bei der

Konstruktion der Libraries wurden leicht variierte Adapter eingesetzt. Diese tragen noch vor der

Bindestelle für den Sequenzierprimer eine 6 Basenpaar lange Erkennungssequenz. Im Index Read

werden ausgehend vom revers-komplementären Sequenzierungsprimer diese 6 Nukleotide

ausgelesen. Dies wird notwendig, wenn verschiedene Libraries in einer Lane zusammen sequenziert

werden. Dies kann unterschiedliche Gründe haben. Beispielsweise benötigen viele Projekte nicht die

Masse an Daten einer kompletten Lane, oder - wie in diesem Fall - der Organismus besitzt einen

extremen A/T oder G/C –Gehalt. Nach dem Mischen der Libraries in den gewünschten Verhältnissen,

werden diese auf eine Endkonzentration von ca. 7 pM gebracht. Erfahrungsgemäß sollte diese

Konzentration eine Clusterdichte auf der Flow Cell-Oberfläche von ca. 450.000 bis 500.000 Cluster

pro mm2 ergeben. Mit dieser nahezu optimalen Clusterdichte sind ca. 80-100 Mio. Reads pro Lane

möglich.

Bei der Sequenzierung wird die Flow Cell zunächst in 16 Analysebereiche, sogenannte „Tiles“,

unterteilt. Dies sind zwei 8er Reihen mit Bildabschnitten, die zusammen die gesamte

Abbildung 14 Analysepipeline – vom Bild zur Sequenz


33

Oberfläche der Flow Cell abdecken. Ausgehend von dem Bild im TIFF-Format jedes einzelnen Tiles

werden die Clusterintensitäten im „Firecrest“-Modul der RTA („Real Time Analysis“ Software)

verarbeitet (Abbildung 13). Die daraus resultierenden CIF-Dateien („cluster intensity files“) werden

dem „Bustard“-Modul zum eigentlichen Basecalling übergeben. Dieses erstellt zunächst binäre

Sequenz-Dateien, die BCL-Dateien („basecall files“). Diese werden separat in das Standardformat für

NGS-Daten, das FASTQ-Format, gebracht.

Datenformat FASTQ

Wichtigstes Dateiformat für NGS-Daten ist das FASTQ-Format. Dieses besteht immer aus 4 Zeilen pro

Sequenz (Abbildung 15). Die durch ein „@“ eingeleitete erste und die mit einem „+“ beginnende

dritte Zeile stellen dabei den Namen der Sequenz dar. In der zweiten Zeile folgt die Basensequenz. Im

Fall von „+“ folgen in der vierten Zeile die Qualitätswerte („ Quality Scores“) für jede einzelne Base

im ASCII-Code.

Abbildung 15 Aufbau des FASTQ-Formats

Im Namen der Sequenz finden sich weitere Informationen kodiert. Diese reichen vom Namen des

Geräts, auf dem sequenziert wurde bis zur Koordinate des Clusters auf der Flow Cell (Abbildung 15).

Abbildung 16 Aufbau des Sequenznamens der ersten und dritten Zeile


34

Quality Scores

Vielen bekannt aus der herkömmlichen Sangersequenzierung, lassen sich auch die ASCII kodierten

Quality Scores der NGS-Daten in einen dezimalen Zahlenwert (Phred score) umrechnen und geben

dann eine Wahrscheinlichkeit für die fehlerhafte Sequenzierung der jeweiligen Base an (Abbildung

16).

Abbildung 17 Phred Score

Sie erhalten Ihre Daten als zusammengefasste FASTQ-Datei.

Jede Gruppe erhält zunächst den selbst generierten Datensatz, wobei der Austausch der

Rohdaten und von Teilergebnissen im weiteren Verlauf notwendig wird. Der Kursablauf

selbst wie auch die verschiedenen Analyseverfahren und Verwendung verschiedener

Programme werden sehr von den erarbeiteten Ergebnissen abhängen. Der schematische

Ablauf soll nur einige Möglichkeiten zusammenfassen und als Anhaltspunkt dienen.


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FASTQ „Trimming“ / „Quality Filtering“

CLC oder PERL-Skript

ASSEMBLY

MAPPING

BLAST

Assembly Cell Workbench

Workbench

gegen SDR-Contig C. piger / thummi / luridus

je ♂ bzw. ♀

Annotation - Annotation von Genen bzw. mRNA über DotPlot erstellen bzw. (optional) LGRM durchführen

Intra-Spezies Vergleich der geschlechtsbestimmenden Region

- Vergleich zwischen ♂ und ♀aus C. piger, C. thummi, C. annularius oder C. luridus

Inter-Spezies Vergleich der geschlechtsbestimmenden Region

- Vergleich zwischen C. piger, C. thummi, C. annularius , C. luridus

Blast-Pipeline auf

dem ZDV Cluster bzw.

CLC Workbench

- gegen SDR aus C.

thummi/ C. piger

-optional:

gegen Datenbanken

unbekannte Contigs

SDR-Contig


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Bioinformatische Analyse der „Next-Generation Sequencing“ Daten mit Hilfe der

„CLC Genomics Workbench“

Laden Sie sich bitte das ausführliche Manual der „CLC Genomics Workbench“ unter dem folgenden

Link herunter, da das Skript auf verschiedene Abschnitte innerhalb dieser Beschreibung verweisen

wird:

http://www.clcbio.com/files/usermanuals/CLC_Genomics_Workbench_User_Manual.pdf

Die Analyse beinhaltet folgende Schritte:

Import der „Next-Generation Sequencing“-Daten

„Trimming“ der Reads

„Mapping“ der Reads an eine genomische Referenzsequenz

Vergleichende Analyse der „gemappten“ Reads zwischen weiblichen und männlichen

Genomen sowie zwischen den unterschiedlichen Arten (C. piger, C. luridus, C. annularius)

Import der „Next-Generation Sequencing“-Daten Weitere Informationen hierzu finden Sie im „CLC Genomics Workbench-Manual“ unter folgenden Punkten: 1.6 When the program is installed: Getting started S.37 6.1 Standard import S.97 6.3 Import high-throughput sequencing data S.101

Öffnen Sie die „CLC Genomics Workbench 8“ durch die Verknüpfung auf Ihrem Desktop und machen

Sie sich mit der Softwareoberfläche vertraut, die im Wesentlichen aus 3 Bereichen besteht:

Oben links: die „Navigation Area“ zeigt alle importierten Daten an, die der Software zur

Verarbeitung zur Verfügung stehen

Unten links: in der „Toolbox“ befindet sich die Analysesoftware, durch Auswahl des Reiters

„Processes“ ist es später möglich, den Fortschritt einzelner Analysen nachzuverfolgen

Rechts: in der „View Area“ werden Daten durch eine grafische Oberfläche dargestellt

Erstellen Sie sich zunächst einen eigenen Ordner innerhalb der „Navigation Area“, indem Sie auf dem

Lokalen Datenträger (D:) einen Ordner „F1CLC“ erstellen und diesen in der Funktionsleiste der

„Navigation Area“ durch folgende Auswahl hinzufügen:

Add file location

Laden Sie Ihre Illumina-qseq-Dateien über den folgenden Pfad oder den Button „Import“

„Illumina“ der oberen Funktionsleiste in Ihren neu erstellten Ordner ein:

File | Import | Illumina

http://www.clcbio.com/files/usermanuals/CLC_Genomics_Workbench_User_Manual.pdf


37

Beachten Sie hierbei, dass es sich eventuell um Reads ohne „paired-end“-Information handelt.

Verwerfen Sie beim Import die Reads ohne erfolgreiche Sequenzierungsreaktion. Erhalten Sie dabei

jedoch die Informationen über die automatisch ausgelesenen Qualitätsscores sowie die Readnamen.

Die importierten Sequenzen werden jetzt in der „Navigation Area“ in einer Liste zusammengefasst,

die Sie durch einen Doppelklick in der „View area“ öffnen können. Die einzelnen Reads enthalten

außer der eigentlichen Sequenz auch die Information über die Sequenzierungsqualität der einzelnen

Basen („Quality score“), die für die weitere Bearbeitung der Reads genutzt werden kann.

Die Reads enthalten noch Sequenzabschnitte, die bei der Assemblierung zu einem nicht optimalen

oder sogar falschen Ergebnis führen könnten.

Erkennen Sie in der Liste Ihrer Reads solche Abschnitte, und wenn, welche sind dies und

wodurch werden diese verursacht?

Welche Auswirkungen hätten diese Abschnitte auf die Assemblierung?

„Trimmen“ der Reads Weitere Informationen hierzu finden Sie im „CLC Genomics Workbench-Manual“ unter folgenden Punkten: 23.1 Trim sequences S.517

Die „CLC Genomics Workbench“ beinhaltet unterschiedliche Möglichkeiten, Reads auf den optimalen

Bereich für eine Weiterverarbeitung in einer Assemblierung zu verkürzen:

Bewertung der Qualitätsangaben einzelner Basen

Erkennung uneindeutiger Basenfolgen

Entfernung der Adaptersequenzen (können variieren)

o UNIV_adapter:

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT

o TAG_adapter:

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT*6bpINDEX*GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC

Eliminierung einer spezifischen Anzahl von Basen am 5’- bzw. 3’-Ende

Ausschluss einzelner Reads aufgrund von Längenbeschränkungen

Lesen Sie Kapitel 23.1 im „CLC Genomics Workbench-Manual“ und bewerten Sie dabei, welche

Bereiche Ihrer Reads im „Trimm“-Prozess berücksichtigt werden müssen und welche

Parametereinstellungen Sie hierfür verwenden.

Starten Sie dann den „Trim“-Prozess durch:

Toolbox | NGS Core Tools | Trim Sequences


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Lassen Sie hierbei eine Übersicht (report) des „Trim“-Prozesses erstellen und wählen Sie die Option

zur Generierung einer Liste der verworfenen Reads. Nach der Fertigstellung öffnen Sie beide

Dokumente und bewerten, ob es sich hier um ein optimales „Trim“-Ergebnis handelt.

Wenn durch Ihre Bearbeitung kein optimales Ergebnis erzielt wurde, wiederholen Sie diesen Schritt.

Falls Sie nur eine zusätzliche Option hinzufügen möchten und dabei keine Parameter der bisherigen

Analyse verändern, können Sie die Bearbeitungszeit durch die Verwendung der bereits „getrimmten“

Sequenzen verkürzen.


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Assemblierung der Reads Weitere Informationen hierzu finden Sie im „CLC Genomics Workbench-Manual“ unter folgenden Punkten: 29.1 De novo assembly S.839 25.1 Map reads to reference S.576 25.3 Mapping reports S.586 25.5 Mapping result S.598

Folgende für unsere Fragestellung nutzbare Möglichkeiten der Assemblierung sind im

Programmpaket „CLC Genomics Workbench“ implementiert:

De novo-Assemblierung: Erstellung von „Contigs“ durch Assemblierung aller Reads nach „De

Bruijn Graphen“, die Reads werden danach in den „Contig“-Referenzsequenzen abgebildet

(„gemapped“)

Abbildung/Kartierung der Reads gegen eine genomische Referenzsequenz („Map reads to

reference“).

Abbildung/Kartierung der (transkriptomischen) Reads gegen eine genomische

Referenzsequenz („Large gap read mapping“)

De novo-Assemblierung Weitere Informationen hierzu finden Sie im „CLC Genomics Workbench-Manual“ unter folgenden Punkten: 29.1 De novo assembly S. 839

Das de novo Assembly der Genomdaten wird durch die „CLC Genomics Workbench“ mit Hilfe des „De

Bruijn Graphen“ berechnet. Das Ziel ist dabei, aus den relativ kurzen Reads größere genomische

Contigs zusammenzusetzen.

Durch die BLAST-Analyse gegen Datenbanken ist es möglich, die zusammengesetzten Contigs zu

charakterisieren.

Für eine Einführung in die de novo-Assemblierung führen Sie das Tutorial „De novo assembly und

BLAST“ (siehe „Help“) durch und informieren sich über die verschiedenen Parameter im „CLC

Genomics Workbench-Manual“.

Starten Sie dann den „Trim“-Prozess durch:

Toolbox | DeNovo Sequencing | DeNovo Assembly


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„Mapping“ der Reads gegen eine Referenzsequenz Weitere Informationen hierzu finden Sie im „CLC Genomics Workbench-Manual“ unter folgenden Punkten: 25.1 Map reads to reference S.576 25.3 Mapping reports S.586 25.5 Mapping result S.598

Mit Hilfe der Funktion “map reads to reference” können z.B. genomische Reads gegen eine

genomische Referenz kartiert werden. Für weitere Informationen lesen Sie das Kapitel 25.1 im „CLC

Genomics Workbench-Manual“.

Starten Sie dann das Mapping durch:

Toolbox | NGS Core Tools | Map Reads to Reference


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„Large Gap Read Mapping“ Weitere Informationen hierzu finden Sie im „CLC User-Manual“ unter folgenden Punkten: Transcript Discovery Plugin 2.0 2. Map reads to reference S.5

Das Large Gap Read Mapping ermöglicht Ihnen das Mappen von transkriptomischen Reads gegen

eine genomische Referenz. Da in Transkriptomdaten keine Informationen über die Intronsequenzen

vorhanden sind, muss der Algorithmus das Einfügen langer Lücken (gaps) gewährleisten, sodass die

Introns überspannt werden können. Das „Large Gap Plug-in“ der „CLC Genomics Workbench“

erreicht dies durch folgende Schritte:

Für jeden Read wird der beste „match“ in der Referenzsequenz ermittelt („seed“ Segment)

Wenn der „match“ den definierten Parametern entspricht, wird die passende Region auf der

Referenzsequenz „gemappt“ und die nicht alignierten Enden werden bei ausreichender

Länge (>17 bp) erneut assembliert („non seed“ Segment)

Dabei sind zwei zusätzliche Parameter zu beachten:

Die maximale Anzahl der Treffer für ein Segment: wenn ein „non seed“ Segment diese

Anzahl überschreitet, wird der Read als „nicht gemappt“ klassifiziert


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Maximale Distanz zwischen „seed“ Segment und „non seed“ Segment. Treffer, die eine

größere Distanz haben, werden verworfen.

Alternative Methoden zu dieser „Seed-extend“-Methode (b) nutzen den „Exon-first“-Ansatz (a), der

erst alle perfekten Übereinstimmungen zur Referenzsequenz mappt und dann die Reads untersucht,

die sich nur zum Teil mit der Referenz decken (Abbildung 17). Diese werden dann geteilt und den

einzelnen Exon-Bereichen zugeordnet. Daraus ergibt sich das Problem, dass Reads von Genen mit

einer Pseudogen-Kopie im Genom besser am Pseudogen mappen, wenn diese durch eine mRNA als

Intermediat entstanden ist.

Abbildung 17: Vergleich zwischen Exon-first- und Seed-extend-Ansatz

Sie starten das „Mapping“ durch:

Toolbox | Transcriptomic Analysis | RNA-Seq Analysis | Large Gap Read Mapping


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Anhang

Documents

Einführung in die Gentechnologie - Wilkommenmolgen.biologie.uni-mainz.de/.../Skript_SS2015_Gentechnologie.pdf · Einführung in die Gentechnologie Institut für Molekulargenetik,