Vorschläge zur Ermittlung geeigneter Merkmale (Features ...karo03.bplaced.net/karsten.rodenacker/Me/Misc_WWW/pdf/soost_.pdf · Vorschläge zur Ermittlung geeigneter Merkmale (Features)

Vorschläge zur Ermittlung geeigneter Merkmale(Features) für die automatisierte Krebszellbildanalyse1

H.-J. Soost K.H. Otto W. Kattner

unter Mitarbeit von

E. Bayer R. Dvorak Ch. Voeth

Institut für Klinische ZytologieTechnische Universität München

(Direktor: Prof. Dr. med. H.-J. Soost)8 München 80

Prinzregentenplatz 14

1973

... und was in 30 Jahren daraus geworden ist ...

Uta Jütting2 Karsten Rodenacker2 Peter Gais3

GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheit2Institut für Biomathematik und Biometrie

3Institut für PathologieIngolstädter Landstraße 1

85764 Neuherberg

Ulrich SchenckInstitut für Allgemeine Pathologie und Pathologische Anatomie

der Technischen Universität MünchenIsmaninger Straße 22

81675 München

2005

2

1Dieses Papier wurde aus einem Manuskript übernommen und mit einigen Korrekturen gesetztund ergänzt. Satz mit LATEX 2εdurch Uta Jütting, Karsten Rodenacker und Peter Gais, ©2005

Widmung

Prof. Hans-Jürgen Soost

Dieses Manuskript ist sowohl Herrn Prof. Dr. H.-J. Soost gewidmet, der durch seine Exper-tise die zytologische Seite der Projekte stark gefördert hat, als auch Herr PD Dr. G. Burger,der bis zu seinem tragischen Unfalltod 1992, die bildanalytische Seite mit all seiner Kraftweiterentwickelt hat.

iii

Inhaltsverzeichnis

1 Vorbemerkung 1

2 Zelltypen 112.1 Superfizialzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112.2 Intermediärzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112.3 Parabasalzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112.4 Metaplasiezellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152.5 Zellen aus regenerierendem Epithel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152.6 Endozervikalzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152.7 Endometriumzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 152.8 Freiliegende Kerne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192.9 Blut- und Bindegewebszellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192.10 Allgemeines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

3 Merkmalsvorschläge 273.1 Erste Merkmalsebene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 283.2 Zweite Merkmalsebene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 453.3 Dritte Merkmalsebene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4 Anwendung der Merkmale 65

Literatur 66

5 ... und was in 30 Jahren daraus geworden ist ... 695.1 Einführung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 695.2 Überblick über Anwendungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 705.3 Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

Literatur 73

v

Abbildungsverzeichnis

2.1 Superfizialzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122.2 Eosinophile Superfizialzelle mit pyknotischem Kern . . . . . . . . . . . . . . 122.3 Große zyanophile Intermediärzelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132.4 Große und kleine Intermediärzelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 132.5 Kleine Intermediärzelle mit bläschenförmigem Kern . . . . . . . . . . . . . . 142.6 Parabasalzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 142.7 Parabasalzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162.8 Metaplastische Plattenepithelzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162.9 Metaplastische Zellen des Plattenepithels . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172.10 Zellen aus Regenerationsepithel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172.11 Endozervikale Zylinderzellen im Verband . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182.12 Endozervikale Zylinderzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182.13 Endozervikale Zylinderzellen im kleinen Verband . . . . . . . . . . . . . . . 202.14 Endometriumdrüsenzellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 202.15 Stromazellen des Endometriums . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212.16 Ausgeprägte bakterielle Zytolyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212.17 Freiliegende, teils entrundete Kerne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222.18 Zellbild eines Plattenepithelkarzinoms . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222.19 Zellbild eines unreifen Plattenepithelkarzinoms . . . . . . . . . . . . . . . . 232.20 Entzündliches Zellbild bei schwerer Kolpitis . . . . . . . . . . . . . . . . . . 232.21 Zellen eines unreifen Plattenepithelkarzinoms . . . . . . . . . . . . . . . . . 252.22 Vier Histiozyten und fünf Granulozyten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

3.1 Invasives Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373.2 Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 373.3 Carcinoma in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383.4 Carcinoma in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 383.5 Zellen eines Carcinoma in situ in dichten Haufen . . . . . . . . . . . . . . . 393.6 Unreifes Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 393.7 Carcinoma in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 413.8 Invasives Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 413.9 Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 423.10 Unreifes Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

vii

viii ABBILDUNGSVERZEICHNIS

3.11 Schwere Dysplasie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 433.12 Verhornendes Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 433.13 Verhornendes Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 443.14 Hypothetische Histogrammformen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 443.15 Carcinoma in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 463.16 Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 463.17 Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 473.18 Carcinoma in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 473.19 Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 483.20 Mäßige Dysplasie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 483.21 Schwere Dysplasie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 493.22 Zellen einer Dysplasie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 493.23 Mäßige Dysplasie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513.24 Adenokarzinom der Cervix uteri . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 513.25 Adenokarzinom der Endozervix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 523.26 Endometriumkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 523.27 Regenerationsepithel . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 533.28 Schwere Dysplasie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 533.29 Schwere Dysplasie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 543.30 Unreifes Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 543.31 Carcinoma in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 553.32 Schwere Dyplasie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 553.33 Unreifes Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 563.34 Unreifes Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 583.35 Unreifes Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 583.36 Verhornendes Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 593.37 Schwere Dysplasie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 593.38 Schwere Dysplasie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 603.39 Dysplasie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 603.40 Carcinoma in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 613.41 Carcinoma in situ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 613.42 Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 623.43 Unreifes Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 623.44 Verhornendes Plattenepithelkarzinom . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 633.45 Schwere Dysplasie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 633.46 Dysplasie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

Tabellenverzeichnis

1.1 Diagnostische Merkmale nach Soost[7] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21.2 Diagnostische Merkmale nach Frost[2] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31.3 Diagnostische Merkmale nach Koss[3] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41.4 Diagnostische Merkmale nach Patten [4] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51.5 Diagnostische Merkmale nach Reagan [5] . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61.6 Parameter zur Zellbildanalyse bei Wied [1, 9] . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71.7 Parameter zur Zellbildanalyse bei Tanaka [8] . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81.8 Parameter zur Zellbildanalyse bei Sandritter [6] . . . . . . . . . . . . . . . . 9

3.1 Erste Merkmalsebene (Einzelzellen) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293.2 Feature-Schema zur 1. Merkmalsebene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 303.3 Zweite Merkmalsebene (intranukleäre Merkmale) . . . . . . . . . . . . . . . 313.4 Feature-Schema zur 2. Merkmalsebene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 323.5 Dritte Merkmalsebene (Zellpopulation) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 333.6 Feature-Schema zur 3. Merkmalsebene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 343.7 Vierte Merkmalsebene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

ix

Kapitel 1

Vorbemerkung

Seit 8-10 Jahren sind verschiedene Arbeitsgruppen in der Welt darum bemüht, die Tumor-diagnostik zu automatisieren. Dabei werden zwei Entwicklungsziele angestrebt:

1. Die Objektivierung der Zytodiagnostik durch Messungen an der Einzelzelle (Einzel-zellanalyse)

2. Die maschinelle Elimination eindeutig negativer zytologischer Befunde durch Unter-suchung des Gesamtabstrichs (automatisches Präscreening).

In beiden Arbeitsrichtungen wurden Anfangserfolge erzielt, ohne dass bisher jedoch abzu-sehen ist, wann die Zielsetzung erreicht sein wird.

Im Rahmen des vom BMFT-geförderten TUDAB-Projekts (Tumordiagnose durch auto-matische Bildverarbeitung) gilt es nunmehr, in die laufenden Untersuchungen, insbesondereder amerikanischen und japanischen Arbeitsgruppen mit einem möglichst aktuellen Standdes Wissens einzusteigen. Hierfür wird es notwendig sein, - da technisches Vorgehen undComputerprogramme über diese Arbeiten nur teilweise bekannt sind, - gewisse Untersu-chungen nachzuvollziehen, um Anschluss an den gegenwärtigen Stand der Erfahrungendieser Arbeitsgruppen zu finden.

Wichtigstes Ziel der Untersuchungen muss das automatisierte Präscreening von Zellab-strichen sein! Da die Einzelzellanalyse jedoch wichtige Grundkenntnisse hierfür erwartenlässt, sollten die Arbeiten zunächst im Vordergrund stehen. Gleichzeitig aber müssen, par-allel dazu, sowohl präparatorische als auch technische Vorarbeiten zu den Präscreening-Untersuchungen anlaufen.

Bisher verwendete Merkmale - Literaturübersicht

Geeignete Merkmale zur Beurteilung der potentiellen Malignität pathologischer Zellverän-derungen sind seit langem bekannt. Ein einzelnes Merkmal, so charakteristisch es auch fürdie maligne Zelle sein mag, bietet jedoch in keinem Fall ausreichende Sicherheit zur Be-gründung der Diagnose: maligne Zelle. Die zytomorphologische Diagnostik beruht darauf,aus einer Vielzahl von Merkmalen, die für sich allein genommen auch bei nicht malignenZellveränderungen auftreten können, diejenigen Kombinationen zu finden, die mit hoher

1

2 KAPITEL 1. VORBEMERKUNG

Wahrscheinlichkeit nur bei malignen Zellen anzutre�en sind. Diese Merkmalskombinatio-nen können nach Gewicht und Zahl der einzelnen Komponenten sehr verschieden sein. IhreErkennungsmöglichkeit hängt nicht zuletzt von der Erfahrung des jeweiligen Untersuchersab.

Im folgenden sollen zunächst die in der konventionellen Zytodiagnostik bisher ver-wendeten diagnostischen Merkmale in tabellarischer Form als Auszug aus der Literaturdargestellt werden (Tabellen 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5).

Bei genauer Betrachtung zeigt sich, dass diese Merkmale sich bei den führenden Ar-beitsgruppen fast vollständig decken. Der Zellkern spielt die dominante Rolle in der Tu-morzelldiagnostik! Am Zellplasma sind Fläche und Umfang von Interesse, weil sie etwasüber die Kern-Plasma-Relation aussagen. Die übrigen Zytoplasmamerkmale sind von unter-geordneter Bedeutung, wenn nicht gleichzeitig eindeutige Kernveränderungen vorliegen.

Tabelle 1.1: Diagnostische Merkmale aus der Literatur von Soost [7]

1. Zellkern größer

2. N/C ratio größer

3. Hyperchromasie

4. Chromatin irregulär verteilt

5. Eu/Heterochromatin verschoben

6. Nukleoli größer und vermehrt und irregulär

7. Anisonukleose

8. Kernpolymorphie

9. Kernrand irregulär

10. Kernrand verdichtet

11. Anisozytose

12. Zellpolymorphie

13. Zellrand unscharf

14. Zytolyse

15. Vakuolisation

3

Tabelle 1.2: Diagnostische Merkmale aus der Literatur von Frost [2]

1. normal (Euplasie)

• allgemein:

– roundness– uniformity– predictability (Nr. 1 entspricht Nr. n)

• Chromatin:

– runde Granula oder Fäden– gleichmäßig verteilt– Nukleoli variabel– Kernrand gleichförmig dünn– runde Form bei Doppelkernen: Spiegelsymmetrie

2. Degeneration:

• Kern größer und blass oder Kern kleiner und dunkel

• Chromatin blass, Pattern-Verlust

• Schrumpfung des Randes, keine Dickenvariation

• Hyperchromasie: verwaschen und rundliche Formen

• Nukleoli gewöhnlich kleiner

3. Neoplasie:

• N/C ratio vergrößert

• Angularity of otherwise rounded structures, irregularity of features,extremes of features

• Chromatinklumpen, spitz, scharf, Vorsprünge

• Kernrand: ungleich dick, Form

• Nucleolus variations size, shape, number; irregular outline

• Hyperchromasie bei irregulärer Chromatinverteilung,nuclear size and shape

Key features: Randdicke, Chromatinmuster, Chromasie, Nuclear Nr., Orientierung des Zellkernsim Plasma, Zellkontur simuliert Kernkontur (parallel)


Tabelle 1.3: Diagnostische Merkmale aus der Literatur von Koss [3]

1. Zellkern größer

2. Anisonukleose

3. Kernpolymorphie

4. N/C ratio größer

5. Hyperchromasie

6. abnormale Chromatinverteilung

7. Nukleoli größer und vermehrt

8. abnormale Mitosen

9. Anisozytose

10. Zellpolymorphie

11. Karikatur der physiologischen Aktivität

12. Adhäsion reduziert

13. irreguläre Form der Nukleoli

14. randständiges Chromatin

In Tabellen 1.6, 1.7 und 1.8 sind die für Zellbildanalysesysteme vorgesehenen bzw. inErprobung befindlichen Merkmale anderer Gruppen zusammengestellt.

Die von Wied und Mitarbeiter [1, 9] verwendeten Merkmale sind für ein System zurautomatischen Erstellung von Diagnosen an der Einzelzelle vorgesehen. Es handelt sich umca. 150 Einzelmerkmale. Die Arbeitsgruppe ist dabei, die Zahl der Merkmale auf etwa 25zu reduzieren, wobei jedoch noch nicht bekannt ist, welche Merkmale letztlich verwendetwerden sollen.

Tanaka und Mitarbeiter [8] verwenden für ihr Präscreening-System nur fünf Merkma-le, wobei drei für ein Grobscreening, zwei für ein Feinscreening eingesetzt werden. Einsechstes Merkmal zur Ermittlung feinerer Kernstrukturen wurde bisher wegen des damitverbundenen Zeitaufwandes nicht verwendet.

Bei den Merkmalen von Sandritter und Mitarbeitern [6], die sich ausschließlich mitder Analyse von Kernstrukturen beschäftigen, handelt es sich zunächst um ein Research-System. Die Untersuchungen wurden vorwiegend mit der Feulgenfärbung durchgeführt unddie angegebenen Parameter erlauben eine umfangreiche Analyse von Zellkernmustern.

5

Tabelle 1.4: Diagnostische Merkmale aus der Literatur von Patten [4]

1. Anzahl veränderter (altered) Zellen erhöht

2. Background:

• tumor diathesis (Erythrozyten, Leukozyten, Debris etc.) erhöht

3. Zytoplasma:

• cell size

• cell shape irregularity:elongate, spindle, adpole isodiametric, non-isodiametric

4. Nucleus:

• nuclear size

• rel. nuclear area A�� = NAZA

· 100• Nuclear shape

• number of nuclei

• nuclear position

• nuclear membrane (randständiges Chromatin)

• fine granularity, fine with clumps, coarse granular,opaque, hyperchromasia

• irregular size and shape of nucleoli

• macronucleoli


Tabelle 1.5: Diagnostische Merkmale aus der Literatur von Reagan [5]

(Endometrium Adeno-Ca)

• Cell area

• indistinct cellular outline

• nuclear area (%)

• cytoplasmic area

• cytoplasmic staining

• vacuoles, di�use, homogene or granular

• cytoplasmic outline

• mononucleated cells (97,5%)

• excentric nuclear position

• nuclear shape (round, oval, indented, irregular)

• ’nuclear membrane’ distinct-indistinct

• nuclear ’membrane’ verdickt

• Chromatinverteilung irregulär:

– fine clumped

– coarsely granular

– transparent opaque

• Hyperchromasia

– ohne Nucleoli 11,6%

– 1 oder mehr Nucleoli

– micro-macronucleoli

– Diathesis: Histiocytes, Erys, Detritus, Fibrin

7

Tabelle 1.6: Parameter zur Zellbildanalyse bei Wied und Mitarbeitern (insgesamt 100 features)

1. Globalparameter

• total extinction

• cell area

• mean extinction

• nuclear area

• N/C ratio

• (blau-grün-rot-Extinktion)

2. Formparameter

• degree of ellipsity

• contour length

• main semiaxes

• smoothness of contour

• concave area

• elongation spindle

• tadpole

• excentrycity of nucleus

• gravity

• center cell

• bean shape

• number of concavities

• hook

• end angle

• overlapping parameters

• und andere Parameters wie:Relationen, Ableitungen, Fourier-Tansformationen usw.

3. Strukturparameter

• extinction-distribution histogram (35 Klassen zu je 5 Werten)

• N-Di� (Granulationsmaß)

• frequence distribution di�erence

• peek to peak distance

• peak width

• cross histogram

• 3-D (isometric display)


Tabelle 1.7: Parameter zur Zellbildanalyse bei Tanaka und Mitarbeitern (insgesamt 6 features)

1. nuclear staining (TE)

2. nuclear area (AK )3. area of cytoplasm (AZ − AK )4. N/C-ratio = AK

AZ − AK

5. nuclear shape

6. chromatin structure (wird nicht verwendet wegen Zeitaufwand)

second di�erential histogram (Untergrund-Plasma-Kern)threshold-value-treatment

Coarse scan:

• nuclear area

• N/C-ratio

• nuclear density

zusätzlich:

• Tischposition

• flying-spot-scan-coordinates

• histogram

9

Tabelle 1.8: Parameter zur Zellbildanalyse bei Sandritter und Mitarbeitern (insgesamt 20features)

1. nuclear area

2. circumference (nucleus)

3. circumference ratio CR = C 24 · πA (CR(Kreis)=1)

4. average squared distance AD2 = 2 · π��

�=1

��2A

di = Euklid-distance from aritmetrical mean

5. maximum diameter

6. orthogonal diameter

7. M/O ratio:�

OD ∼ T E ,

wobei Verteilung von OD ∼ ME

8. cuto� point AD2 = CHEUCHHET

Anwendung der CR und AD Programme auf ChromatinpartikelRelationen etc.

Kapitel 2

Beschreibung normaler und gutartigveränderter Zellen

2.1 Superfizialzellen

Es handelt sich um große Zellen (50-60µm Durchmesser) von polygonaler Form, mit scharfbegrenzten Zytoplasmarand, zyanophiler oder eosinophiler Zytoplasmafärbung und sehrkleinem, pyknotischen Zellkern mit unter 6µm Durchmesser. Als Pyknose bezeichnet mandie Schrumpfung und Verdichtung des Kerns, bei der keine Kernstruktur mehr sichtbarist (Verhornungstendenz, nach Verlust des Kerns entstehen sogenannte kernlose Schollen).Bisweilen sind im Zytoplasma dunkel angefärbte Granula zu sehen. Die Superfizialzellenhaben das kleinste NC-Verhältnis von allen hier beschriebenen Zelltypen (Beispiele Abbn.:2.1, 2.2).

2.2 Intermediärzellen

Es handelt sich um polygonale, zyanophile oder eosinophile Zellen mit einem Durchmesservon 25-60µm. Der Kern ist bläschenförmig, also nicht pyknotisch und hat einen Durchmes-ser von 6-9µm. Die Kernstruktur beinhaltet regelmäßig verteiltes, fein granuliertes Chro-matin, und das Zellplasma ist im allgemeinen etwas dichter als das der Superfizialzellen.(Beispiele Abbn.: 2.3, 2.4, 2.5)

2.3 Parabasalzellen

Kleine, runde oder ovale Zellen mit normalerweise zyanophilem Zytoplasma, rundem oderovalem Kern von 8-11µm Durchmesser und fein granuliertem, regelmäßig verteiltem Kern-chromatin. Zelldurchmesser: bis 30µm. Weiterhin zeichnen sich die Zellen durch eine Va-kuolisation des Zytoplasmas und einen im guterhaltenen Zustand deutlichen Zellrand aus.Von den im normalen Ausstrich vorkommeneden epithelialen Zelltypen haben diese Zellendas größte NC-Verhältnis (Beispiele Abbn.: 2.6, 2.7 ).

11

12 KAPITEL 2. ZELLTYPEN

Abbildung 2.1: Zwei Superfizialzellen mit eosinophil gefärbtem Zytoplasma und pyknoti-schem Zellkern. Eine kleine zyanophil gefärbte Intermediärzelle mit bläschenförmigem Kern.Eine etwas größere Intermediärzelle mit präpyknotischem Kern (500-fach).

Abbildung 2.2: Eosinophile Superfizialzelle mit pyknotischem Kern und hellem perinukle-ärem Hof im Zellplasma (1250-fach).

2.3. PARABASALZELLEN 13

Abbildung 2.3: Große zyanophile Intermediärzelle mit bläschenförmigem Kern (1250-fach).

Abbildung 2.4: Große Intermediärzelle und kleine Intermediärzelle, je mit bläschenförmigemKern (1250-fach).


Abbildung 2.5: Kleine Intermediärzelle mit bläschenförmigem Kern und einigen mit einzel-nen Granula im Zytoplasma. Daneben zwei Parabasalzellen (1250-fach).

Abbildung 2.6: Drei Parabasalzellen in gutem Erhaltungszustand. Daneben eine in Dege-neration befindliche Parabasalzelle mit aufgeblähtem Zellplasma und leicht degeneriertemKern. In der Umgebung degenerierte Granulozyten und ein Erythrozyt (1250-fach).

2.4. METAPLASIEZELLEN 15

2.4 Metaplasiezellen

Dabei handelt es sich um Epithelzellen mit meist zyanophilem Zytoplasma, das eine ekto-plasmatische, meist dunkler angefärbte Randzone und eine endoplasmatische, helle Zoneaufweisen kann. Die Größe der Zellen variiert von der Größe der Parabasalzellen (15-30µmDurchmesser) bis zu der kleiner Intermediärzellen (30-40 µm Durchmesser). Die Zellensind oft straßenförmig gelagert. Kerngröße: 8-12 µm Durchmesser, oft leicht vergröbertesChromatin, zum Teil irreguläre Verteilung des Chromatins im Kern. Mäßige Abweichungenvon der runden oder ovalen Kernform kommen vor (Beispiele Abbn.: 2.8, 2.9).

2.5 Zellen aus regenerierendem Epithel

In lockeren Verbänden oder einzeln liegende Zellen variabler Form und Größe mit zyanophilgefärbtem, bisweilen streifenförmig ausgezogenen Zytoplasma. Die Kerne sind relativ groß,so dass sich ein hohes NC-Verhältnis ergibt. Sie besitzen ein feines, bis leicht vergröberteswirkendes Chromatin. Au�allend sind ein oder mehrere Nukleoli, die als Ausdruck dergesteigerter biologischen Aktivität der Zellen gelten können (Beispiel Abb.: 2.10).

2.6 Endozervikalzellen

Einzeln oder im Verband vorkommende Zellen mit zylindrischer Form und exzentrisch ge-lagerten Kernen. Man unterscheidet sekretorische Zellen und Flimmerzellen. Es handelt sichum zylindrische, langgestreckte, aber auch kurze becherförmige Zellen mit hellem, fein va-kuolisiertem, meist gelblichem Zytoplasma. Flimmerzellen besitzen am oberen Rand einenZiliensaum, der jedoch im zytologischen Präparat selten erkennbar ist. Die Kerne sind feingranuliert mit gelegentlich leicht irregulärer Chromatinverteilung. Die Form der Kerne vari-iert von rund bis oval. In der Aufsicht ergibt sich bei den Verbänden ein honigwabenartigesMuster, mit leicht exzentrisch liegenden Kernen. Das Zytoplasma von Endozervikalzellenunterliegt leicht degenerativen und/oder autolytischen Prozessen, so dass die Zellen inden Abstrichen meist nicht gut erhalten sind. Häufig findet man nur noch Reste einesunscharf begrenzten Zytoplasmas oder die Kerne liegen völlig nackt. Die Zellkerne könnendann ebenfalls deformiert sein. Der Kerndurchmesser beträgt 9-11 µm, kleinere und größereKerne kommen aber oft vor (Beispiele Abbn.: 2.11, 2.12, 2.12).

2.7 Endometriumzellen

Einzeln oder im Verband vorkommende Zellen geringer Größe (8-12µm Durchmesser) mitschmalem Zytoplasmasaum. Man untercheidet Epithel- und Stromazellen. Die Epithelzellenerscheinen oft in abgerundeter Form, während die Stromazellen ein unregelmäßiges, reichli-cheres Zytoplasma zeigen können. Im Verband ist oft ein Honigwabenmuster erkennbar. DieKerngröße beträgt ca. 6-8µm Durchmesser. Runde oder ovale, untereinander gleichförmigeKerne herrschen vor. Das Chromatin ist fein und gleichmäßig granuliert. Einzeln liegende


Abbildung 2.7: Drei Parabasalzellen in gutem Erhaltungszustand. Am Innenrand des Zell-kerns, der ganz links und ganz rechts gelegenen Zelle je ein X-Chromatin (1250-fach).

Abbildung 2.8: Metaplastische Plattenepithelzellen in mäßig ausgereiftem Zustand mit er-kennbarem Endo- und Ektoplasma (1250-fach).

2.7. ENDOMETRIUMZELLEN 17

Abbildung 2.9: Metaplastische Zellen des Plattenepithels mit Vakuolenbildung im Zytoplas-ma (1250-fach).

Abbildung 2.10: Zellen aus Regenerationsepithel mit kleinen aber deutlich erkennbarenNukleoli in den relativ großen Zellkernen. Zum Vergleich in der Umgebung normale Super-fizialzellen und eine große zyanophile Intermediärzelle (325-fach).


Abbildung 2.11: Endozervikale Zylinderzellen im Verband (500-fach)

Abbildung 2.12: Endozervikale Zylinderzellen. Die Verbandsstruktur ist teilweise noch erhal-ten, teils stark aufgelockert. An anderen Stellen freiliegende, teils unregelmäßig geformteKerne (325-fach).

2.8. FREILIEGENDE KERNE 19

Endometriumzellen können häufig nicht sicher von anderen ähnlichen Zellen unterschiedenwerden (Beispiele Abbn.: 2.14, 2.15 ).

2.8 Freiliegende Kerne

Für das Vorkommen freiliegender Kerne sind folgende Prozesse verantwortlich:

1. Bakterielle Zytolyse, die durch Döderleinbakterien an Intermediärzellen hervorgerufenwird. Freiliegende Intermediärzellen erscheinen fein granuliert mit deutlich erkenn-barem Kernrand (Beispiel Abb.: 2.16).

2. Autolytische bzw. heterolytische Prozesse, die sich besonders an endozervikalen undEndometriumzellen sowie unreifen Zellen des Plattenepithels abspielen. FreiliegendeKerne können aber auch von Tumorzellen stammen! Autolyse und Heterolyse führenzum teilweisen oder völligen Verlust des Zytoplasmas. Die Zellkerne können infolgeder Degeneration aufgebläht und verwaschen, oder verdichtet und dunkel angefärbterscheinen (Beispiel Abb.: 2.17 ).

2.9 Blut- und Bindegewebszellen

Granulozyten, Lymphozyten

Diese Zelltypen kommen in wechselnder Zahl in fast allen Ausstrichen vor. Sie sind relativklein mit meist dunkel angefäbten Kernen. Die Ganulozyten haben 10-15µm Durchmesserund sind durch ihre segmentierten Kerne gekennzeichnet, während Lymphozyten mit einemDurchmesser von 7-10µm runde und ovale Kerne besitzen, die das Zytoplasma oft völligzu verdrängen scheinen. Bei hoher Vergrößerung ist aber ein schmaler Zytoplasmasaumerkennbar. Manchmal treten die Zelltypen in so großer Menge auf, dass durch die Über-lagerung eine Diagnose an Epithelzellen nicht mehr möglich ist (Beispiele Abbn.: 2.18, 2.19,2.20 ).

Erythrozyten

Diese Blutzellen sind beim Menschen kernlos, von orange-gelblicher Färbung, scheibenför-mig rund mit etwa 7-8µm Durchmesser. Ihr Auftreten kann gelegentlich diagnostischeHinweise geben (Beispiel Abb.: 2.21 ).

Histiozyten

Histiozyten sind ubiquitäre Zellen, die partikuläre Substanzen phagozytieren können. Auf-grund der amöboiden Beweglichkeit der Zellen kann die Zellform sehr stark variieren.Zellgröße: 10-25µm Durchmesser. Das Zytoplasma ist schaumig vakuolisiert, oft unscharfbegrenzt und leicht zyanophil gefärbt. Der Zellkern liegt oft exzentrisch, er kann rund,oval, aber auch nierenförmig bis gelappt erscheinen. Seine Größe variiert zwischen 7-12µm


Abbildung 2.13: Endozervikale Zylinderzellen im kleinen Verband in der Aufsicht (1250-fach).

Abbildung 2.14: Endometriumdrüsenzellen in locker gelagertem Zellhaufen. In der Umge-bung auch einzelne Stromazellen des Endometriums (500-fach).

2.9. BLUT- UND BINDEGEWEBSZELLEN 21

Abbildung 2.15: Stromazellen des Endometriums in lockerer Lagerung (500-fach).

Abbildung 2.16: Ausgeprägte bakterielle Zytolyse durch Döderleinstäbchen. Es sind nur nochReste von Intermediärzellen erhalten. Im übrigen freiliegende Intermediärzellen, Bakterienund Zelldetritus (500-fach).


Abbildung 2.17: Freiliegende, teils entrundete Kerne von degenerativ veränderten endozer-vikalen Zellen (325-fach).

Abbildung 2.18: Zellbild eines Plattenepithelkarzinoms. Das Übersichtsbild zeigt neben zahl-reichen Tumorzellen einige normale Zellen des Plattenepithels sowie Granulozyten undganz vereinzelt Erythrozyten. Es fällt ferner der granulierte schmutzig wirkende Präparate-hintergund auf (500-fach).

2.9. BLUT- UND BINDEGEWEBSZELLEN 23

Abbildung 2.19: Zellbild eines unreifen Plattenepithelkarzinoms. Neben einigen gut erhal-tenen Tumorzellen fällt der schmutzige Präparathintergrund, bedingt durch Eiweißnieder-schläge sowie Zell- und Kerndetritus auf (325-fach).

Abbildung 2.20: Entzündliches Zellbild bei schwerer Kolpitis. Starke Überlagerung des gan-zen Zellbildes mit Leukozyten. Epithelzellen teilweise stark generativ verändert. In denBereichen der Überlagerung nicht mehr als Einzelzellen erkennbar (125-fach).


Durchmesser. Der Kern ist meist fein granuliert und kann Chromatinverdichtungen enthal-ten (Beispiel Abb.: 2.22).

2.10 Allgemeines

Es gibt eine Reihe von Mikroorganismen, die im vaginalen Abstrich morphologisch erkenn-bar sind (Trichmonaden, Pilze, Döderleinbakterien und andere Bakterientypen), auf derenBeschreibung aber hier verzichtet wird, um den Rahmen dieser Darstellung nicht zu spren-gen.

Erläuterung: Die im Text angegebenen Maße sind für Zellen und Zellkerne sind aus-nahmslos Durchschnittswerte. Sie sind nicht maßgebend für die diagnostische Einordnungder Zellen, sondern können sowohl über- als auch unterschritten werden. Zellen mit zya-nophil gefärbten Plasma zeigen gewöhnlich ein bläuliches-grünliches, machmal ins violettegehende Aussehen in der Papanicolaou-Färbung.

2.10. ALLGEMEINES 25

Abbildung 2.21: Zellen eines unreifen Plattenepithelkarzinoms. Au�allend sind die starkenGrößenunterschiede zwischen den im allgemeinen runden oder ovalen Tumorzellkernen(Anisonukleose). Zahlreiche Erythrozyten (500-fach).

Abbildung 2.22: Vier Histiozyten und fünf Granulozyten (1250-fach)

Kapitel 3

Merkmalsvorschläge für dasTUDAB1-Projekt

Im folgenden werden aus der Sicht der Zytomorphologen aufgrund einiger Erfahrungenin der konventionellen Diagnostik und unter Berücksichtigung der bisherigen Literatur,diejenigen Merkmale zusammengestellt, die für eine automatisierte Diagnostik im Rahmendes TUDAB-Projekts vorgeschlagen werden.

Die Merkmalsbeschreibung wird durch einen Bildteil ergänzt, in dem jedoch nur ein Teilder möglichen pathologischen Veränderungen gezeigt werden kann. Bei der Auswahl derBilder wurde vor allem Wert darauf gelegt, dass das jeweils beschriebene Merkmal deutlicherkennbar ist, obwohl fast stets andere, gleichzeitig vorhandene Merkmale nicht davonabzutrennen sind. Die Abbildungen sind nicht in jedem Falle für die gestellte zytologischeDiagnose typisch. Die Darstellung der Merkmale erfolgt in 4 Ebenen.

1. Merkmalsebene: (Tab. 3.1) mit dem Feature-Schema (Tab. 3.2)

Einzelmerkmale:

• Form

• Struktur

• Zytochemie


Intranukleäre Merkmale:

• Kernstruktur


Populationsmerkmale

1TUmor Diagnose mittels Automatischer Bildanalyse

27

28 KAPITEL 3. MERKMALSVORSCHLÄGE

• Vergleich von Parametern aus 1.

4. Merkmalsebene: (Tab. 3.7)

Szenariomerkmale

• Präparathintergrund

• Patientendaten

Die Merkmalsebenen sind in der Reihenfolge ihres voraussichtlichen Gewichts für die auto-matisierte zytologische Diagnostik geordnet. Die in der ersten Ebene genannten Merkmalewerden für die wichtigsten gehalten. Innerhalb der einzelnen Ebenen sind jeweils die amwichtigsten erscheinenden Merkmale zuerst genannt.

3.1 Erste Merkmalsebene

DNS-Gehalt

Desoxyribunukleinsäure (DNS) stellen das Substrat der genetischen Codes, nach denen so-wohl normale als auch bösartige Zellen aufgebaut und reproduziert werden. Die bekanntenbiologischen Unterschiede zwischen normalen, prämalignen und malignen Zellen spiegelnnach neueren Forschungen gewisse Unterschiede in der Qualität und Reaktionsfähigkeit derDNS wider.

Unterschiede im DNS-Gehalt zwischen normalen und tumorösen Zellen werden in derletzten Zeit von vielen Autoren als wichtigstes Merkmal der Tumorzelle betrachtet. In demKern einer normalen Zelle findet man regelmäßig den dipoiden (euploiden) DNS-Gehalt (2c).Im Kern einer Tumorzelle ist gewöhnlich ein aneuploider DNS-Gehalt vorhanden. Überwie-gend handelt es sich dabei um ein hyperdiploiden DNS-Gehalt (> 2c). Einen erhöhtenDNS-Gehalt findet man bei etwa 90% der Portio-Karzinome. Sehr viel seltener findet manin Tumorzellen einen hypodiploiden DNS-Gehalt (< 2c). Es gibt allderdings auch bösartigeGeschwülste mit euploidem (diploiden) DNS-Gehalt. Besonders bei Adenokarzinomen desEndometriums kann man oft keine deutlichere Abweichung vom euploiden DNS-Gehalterfassen.

Zum Unterschied von normalen Geweben findet innerhalb eines Malignoms gewöhnlicheine deutliche Schwankung des DNS-Gehaltes von Zelle zu Zelle statt. Trotz dieser generel-len Schwankung bestehen bei der Mehrheit der bösartigen Geschwülste (auch bei invasivenZervixkarzinomen) bestimmte Besonderheiten individueller Tumoren: Ein gewisser Anteilder Zellen (Stammlinie) des gegebenen Tumors besitzt nämlich einen gleichen aneuploidenDNS-Gehalt durch den dieser Tumor charakterisiert wird.

Regelmäßig gibt es eine enge Korrelation zwischen dem pathologischen DNS-Gehaltder Tumorzellen und aneuploiden Chromosomenzahlen (bzw. morphologischen Chromoso-menaberrationen). Durch einen abnormalen DNS-Gehalt wird ebenfalls die Kernmorpholo-gie der intermitotischen Zellen beeinflusst. Zellen mit einem erhöhten DNS-Gehalt zeigenin der Papanicolaou-Färbung im allgemeinen eine Vergrößerung der Kerne und verstärkteAnfärbung der Kernsubstanz.

3.1.ERSTE

MERKM

ALSEBENE

29

Tabelle 3.1: Erste Merkmalsebene (Einzelzellen)

Zytologisch diagnostischer Begri� Erfassung Feature

1.1 erhöhter DNS-Gehalt T EN = � ∆EN Totalextinktion Nukleus

1.2 Kernvergrößerung für 0,5 µm Messpunktabstand: Fläche NukleusMP

4 = AN

1.3 erhöhtes N/C-Verhältnis N/C = ANAZ − AN

N/C-Verhältnis

1.4 Hyper-/Hypochromasie MEN = T ENAN

DNS-Konzentration,

mittlere Extinktion

1.5 entrundete, unregelmäßige Kernform FN = U2N

ANKernform-Faktor

1.6 - �� gegen dE für Kerne und Plasma Extinktionsverteilungshistogramm


Tabelle 3.2: Feature-Schema zur 1. Merkmalsebene

Zytologisch dia-gnostischer Begri� Normal Pathologisch

1.1 DNS-Gehalt2c-DNS-Gehalt =6 · 10−12g DNS

DNS-Gehalt oft> 6 · 10−12g

1.2 Kerngröße

1.3N/C-Verhältnis

N/C < 0 N/C > 0

1.4DNS-Konzentration(Hyper-/Hypo-chromasie) messen messen

1.5Kernformfaktor

FN = 4π FN > 4π

1.6 Histogramm messen messen

3.1.ERSTE

MERKM

ALSEBENE

31

Tabelle 3.3: Zweite Merkmalsebene (intranukleäre Merkmale)


2.1vergröberte, regelmäßigeChromatinstruktur

Messung, rechnerische Analyse Chromatin Granula-Größe

(Varianz)

2.2 unregelmäßige Verteilung der Messung, rechnerische Analyse ChromatinverteilungChromatingranula im Kern

2.3 randständiges Chromatin N-Contour (Schwellenwerte?)� ∆E von N-Contour

2.4 opaques Chromatin Partialextinktionswerte im opaques ChromatinZellkern gleich hoch

2.5 Makronukleoli, mehrere Nukleoli, 3 Merkmale (färbungsabhängig) Nukleoli:irreguläre Nukleoli Größe, Zahl, Form

2.6 %-Anteil Heterochromatin bzw. Messung, Schwellenwertbildung %-Anteil HeterochromatinEuchromatin im Kern rechnerische Analyse

2.7 Kontrast im Zellkern Di�erenz der Partialextinktion benach- CHEUCHHET

(in Abhängigkeitbarter Messpunkte (?) (oder Quotient) von der Kerngröße

32KAPITEL

3.MERKM

ALSVORSCH

LÄGE


Zytologisch diagnostischerBegri�

Normal Pathologisch

2.1Chromatinstrukturgrob-fein

2.2Chromatinstrukturregulär-irregulär

2.3 randständiges Chromatin

2.4 opaques Chromatin

2.5 Nukleoli

2.6 %-Anteil Heterochromatin Messung Messung

2.7 Kontrast im Zellkern Messung Messung

3.1.ERSTE

MERKM

ALSEBENE

33

Tabelle 3.5: Dritte Merkmalsebene (Zellpopulation)


3.1 Anisonukleose Mittelwertsbildung, SD SD von Kernflächenverteilung AN

3.2 Kernpolymorphie Mittelwertsbildung, SD SD der Verteilungen von Kernumfangoder Form U2

A

3.3 Polychromasie der Kerne Mittelwertsbildung, SD oder SD der Kerntotalextinktions-2c-Standard, Nicht-2c-Fraktion? verteilungen T EN

3.4 Kernstrukturen in der Population Mittelwertsbildung, SD Varianz der Kernstrukturen aus 2.1 - 2.7uniform oder stark variabel?

3.5 Anisozytose Mittelwertsbildung, SD SD der Zellflächenverteilung AZ

3.6 evtl. Zellpolymorphie (?) Hyperspace-Clusteranalyse Euklid-Distanzen von Extinktions-verteilungshistogramm aus 1.6

34KAPITEL

3.MERKM

ALSVORSCH

LÄGE


Zytologisch diagnostischerBegri� Normal Pathologisch

3.1 Anisonukleose

3.2 Kernpolymorphie

3.3 Polychromasie der Kernevorwiegend 2c-DNS Nicht-2c-DNS-Fraktion erhöht

3.4 Varianz der Kernstrukturen(siehe 2.1-2.7)

gering (?) erhöht (?)

3.5 Anisozytose

3.6 Euklid-Distanzen gering (?) erhöht (?)

3.1.ERSTE

MERKM

ALSEBENE

35

Tabelle 3.7: Vierte Merkmalsebene


4.1 Unsauberer Präparatehintergrund Schwellenwertbestimmung des verminderete Transmission im(Tumor-Diathese) Präparatehintergrundes gesamten Präparatehintergrund

4.2 Erythrozyten im Zerfall ? StörfaktorenLeukozyten, Histiozyten (Elimination?)

4.3 Endometriumzellen nach Bestimmung von Endometriums- (zusätzliches) VerdachtsmomentMenopause merkmalen (?) in Abhängigkeit

von 4.4.1 und 4.4.2

4.4.1 Patientendaten Befundmitteilung Speicherung in der Datenbank4.4.2 Anamnese4.4.3 Alter


Chromatin stellt biochemisch betrachtet ein variables, unkonstantes Gemisch von zahl-reichen organischen, hochmolekularen Substanzen - besonders der DNS - dar. Eine stö-chiometrische Anfärbung des gesamten Chromatin-Komplexes ist kaum vorstellbar.

Die Messung des DNS-Gehaltes der Tumorzellkerne stellt eine Bereicherung der kon-ventionellen Diagnostik dar, da bei mikroskopischer Betrachtung der Chromatingehalt derKerne nur subjektiv durch Kerngröße und Chromatindichte erfassbar ist (Beispiele Abbn.:3.1, 3.2, siehe auch Kapitel 3.1.4).

Kerngröße

Die Kerne von Tumorzellen und ihrer Vorstufen sind infolge ihres erhöhten Chromatinge-halts im allgemeinen größer als die normaler Zellen. Dabei ist jedoch zu berücksichtigen,dass einerseits die Größe der Tumorzellen eine erhebliche Schwankungsbreite hat. Anderer-seits gibt es normale Zellen, insbesondere entzündlich und degenerativ veränderte Zellen,die größere Kerne haben als kleine Tumorzellen. Der Bereich, in dem sich maligne undnicht maligne Zellen ihrer Größe nach überschneiden, ist relativ groß.

Es wäre wichtig, folgendes zu eruieren:

1. Wieviel Prozent der Tumorzellen würde man nicht erfassen, wenn man alle Zellkerneunter einem bestimmten Grenzwert wegließe?

2. Wieviel Prozent der gutartigen Zellen würden fälschlich als verdächtig gezählt werden,wenn man alle Zellkerne, die über einem bestimmten Grenzwert liegen, berücksich-tigen würde? (Beispiele Abbn.: 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7).

Kern-Plasma-Relation

Ein zuverlässigeres Merkmal als die Kerngröße allein ist bei mikroskopischer Beurteilungdie Kern-Plasma-Relation (NC-Ratio). Sie ist bei Tumorzellen und bei atypischen Zellen fastimmer erhöht im Vergleich zu normalen Zellen gleicher Art und gleichen Di�erenzierungs-grades.

Da die Verschiebung der Kern-Plasma-Relation von Art und Di�erenzierungsgrad derAusgangszelle abhängt, kommt es vor, dass der objektive Wert einer pathologisch verscho-benen Kern-Plasma-Relation z.B. an der Zelle eines verhornenden Plattenepithelkarzinomsniedriger liegt als an einer normalen unreifen Metaplasiezelle oder einer degeneriertenParabasalzelle.

Für den Zytologen ist die Beurteilung der Kern-Plasma-Relation ein sehr wertvollesdiagnostisches Kriterium. Für eine automatische Diagnostik dürfte es von geringerem Wertsein, da die Beurteilung voraussetzt, dass man die Herkunft der Zelle kennt, wozu dieMaschine kaum in der Lage sein wird (Beispiele Abbn.: 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7).

Chromatindichte des Kerns

Infolge ihres erhöhten Chromatingehalts zeigen Tumorzellen meist eine verstärkte Anfär-bung der Kerne (Hyperchromasie). Diese kann sehr unterschiedlich in ihrer Intensität sein.

3.1. ERSTE MERKMALSEBENE 37

Abbildung 3.1: Zellen eines invasiven Plattenepithelkarzinoms. Vier etwas kleinere, stark hy-perchromatische Kerne, davon zwei opaque und fast strukturlos. Auch die übrigen Zellkernesind deutlich hyperchromatisch, lassen aber eine Struktur erkennen. Die Chromatinstrukturist deutlich vergröbert. Außerdem deutliche Anisonukleose (1250-fach).

Abbildung 3.2: Zellen eines Plattenepithelkarzinoms: Ein Zellkern mit stark vergröbertemChromatin und au�allend unregelmäßiger Verteilung. Die Chromozentren sind scharf undunregelmäßig begrenzt. Au�allende Unterschiede zwischen Hetero- und Euchromatin. Dieübrigen, ebenfalls stark vergrößerten Kerne zeigen eine mäßige, aber gleichmäßige Vertei-lung des Chromatins, abgesehen von einigen eingelagerten unregelmäßigen Chromozentren(1250-fach).


Abbildung 3.3: Zellen aus einem Carcinoma in situ. Starke Vergrößerung der Zellkernemit gleichzeitiger Verschiebung der Kern-Plasma-Relation. Vgl. daneben zwei mittelgroßenormale Intermediärzellen (325-fach).

Abbildung 3.4: Zellen aus einem Carcinoma in situ. Vergrößerte Kerne mit stark verscho-bener Kern-Plasma-Relation. Deutliche Hyperchromasie in einem Teil der Zellkerne. ZumVergleich normale Intermediärzellen (325-fach).


Abbildung 3.5: Zellen eines Carcinoma in situ in dichten Haufen. Extreme Verschiebung derKern-Plasma-Relation. Vom Zytoplasma ist nur teilweise noch ein schmaler Saum erkennbar.Daneben drei Zellen aus einer Dysplasie. Diese zeigen ebenfalls eine Verschiebung der Kern-Plasma-Relation. Diese ist zwar nicht so deutlich wie in dem danebenliegenden Zellhaufen,aber im Vergleich zu normalen Zellen erkennbar (500-fach).

Abbildung 3.6: Zellen aus einem unreifen Plattenepithelkarzinom (vgl. die daneben liegen-den Granulozyten). Die Kern-Plasma-Relation ist teilweise extrem verschoben, so dass dieZellkerne völlig frei liegen. Andere Kerne sind von unregelmäßigen Resten des Zellplasmasumgeben. - Außerdem fällt die relativ gleichmäßige, aber starke Vergröberung der Chroma-tinstruktur in den Kernen auf (500-fach).


Die Kernfärbung hängt einerseits vom Chromatingehalt der Kerne, andererseits vom Auf-lockerungszustand und der Größe der Kerne ab.

Die Begri�e Hyperchromasie und Hypochromasie werden im Sinne von chromatin-dicht und chromatinlocker gebraucht. Sie sagen nichts über den Gesamtchromatingehaltbzw. den DNS-Gehalt des Kernes aus. Dieser ergibt sich - mit Einschränkung - erst ausChromatindichte und Kerngröße.

Bei gleichem Chromatingehalt kann ein kleiner Kern tief schwarz, ein großer Kern sehrhell sein. Obwohl Tumorzellkerne im allgemeinen dunkler als normale Zellkerne sind, istder relativ kleine Kern einer Superfizialzelle dunkel und pyknotisch, während der Kern ei-ner im Chromatin stark aufgelockerten Tumorzelle hypochromatisch, d.h. heller als normalsein kann. Die entsprechend ihrem Di�erenzierungsgrad vergrößerten und hyperchromati-schen Kerns begründen jedenfalls den Verdacht, dass sie aus malignem oder prämalignemGewebe stammen (Beispiele Abbn.: 3.8, 3.9, 3.10 ).

Kernform

Die Zellkerne von Tumorzellen sind häufig stark entrundet, elongiert und unregelmäßig inder Form. Kerne normaler Zellen sind fast stets rund oder oval. Es gibt aber auch zahlreicheTumorzellen mit gleichförmigen, runden oder ovalen Kernen (Beispiele Abbn.: 3.11, 3.12, 3.13).

Extinktionsverteilungshistogramm

Dieses Merkmal besitzt kein zytologisch-diagnostisches Äquivalent. Wie die schematischeDarstellung von Histogrammformen in Abb. 3.14 zeigt, ist jedoch bei verschiedenen Zell-typen mit unterschiedlichen Histogrammformen zu rechnen. Die prozentuale Häufigkeitder Extinktionswerte (dn/n, aufgetragen gegen die Extinktionshöhe) ermöglicht es, dieseHäufigkeiten bei verschiedenen Zellen zu vergleichen. So unterscheiden sich die Kurven aund b der Schemazeichnung z.B. im Bereich des Zytoplasmagipfels (Extinktion 0,10) durchdie Häufigkeiten 0,3 (30%) für a und 0,10 (10%) für b. Übersetzt in die Zellmorphologiebedeutet dies, dass bei Zelle a 30% aller Messwerte eine geringe Extinktion (0,10) aufweisen(schwache Zytoplasmafärbung). Bei Zelle b fallen 10% aller Messwerte in diesen Bereich. DerAnteil sehr hoher Messwerte (Emax=1,0) bei dieser Zelle ist stark erhöht. Dies könnte aufChromatinverdichtungen (Heterochromatin) im Kern zurückgeführt werden. Entscheidendfür die Aussagekraft solcher Histogramme ist allein die prozentuale Verteilung der nachihrer Höhe geordneter Messwerte. Angaben über die räumliche Verteilung dieser Werte inder Zelle sind nicht möglich. Für Präscreening-Untersuchungen bietet das Extinktionsvertei-lungshistogramm die Möglichkeit zwischen Zellen und Nichtzellen zu unterscheiden (Abb.c).


Abbildung 3.7: Zellen eines Carcinoma in situ. Die drei Zellkerne in der Mitte sind starkvergrößert. Die Zellkerne in den eosinophil gold-gelb gefärbten Zellen zeigen nur einemäßige Vergrößerung. Die Kern-Plasma-Relation ist in den erstgenannten Zellen sehr stark,in den letztgenannten Zellen nur mäßig verschoben (1250-fach).

Abbildung 3.8: Zellen eines invasiven Plattenepithelkarzinoms. Vier etwas kleinere, stark hy-perchromatische Kerne, davon zwei opaque und fast strukturlos. Auch die übrigen Zellkernesind deutlich hyperchromatisch, lassen aber eine Struktur erkennen. Die Chromatinstrukturist deutlich vergröbert. Außerdem deutliche Anisonukleose (1250-fach).


Abbildung 3.9: Zelle eines Plattenepithelkarzinoms. Vier stark pyknotische Tumorzellkerne,die langgestreckt und unregelmäßig geformt sind. Im Inneren der Zellkerne keine erkenn-baren Strukturen mehr. Daneben eine Gruppe von vier Tumorzellen, deren Kerne nur einemäßige Hyperchromasie zeigen. Aber auch hier deutliche Verschiebung der Kern-Plasma-Relation und Vergröberung der Chromatinstruktur (1250-fach).

Abbildung 3.10: Zellen eine unreifen Plattenepithelkarzinoms. Mehrere, teils in Degenerationbefindliche Tumorzellen mit unterschiedlich stark vergrößerten Kernen. Darunter eine Zellemit sehr stark vergrößertem Kern. Der Kern zeigt ein für eine Tumorzelle au�allend hel-les Chromatin (Hypochromasie) mit unregelmäßig eingelagerten Chromatinverdichtungen.Außerdem eine Siegelringzelle mit großer Plasmavakuole und zwei angelagerten kleinerenVakuolen im Zellplasma (1250-fach).


Abbildung 3.11: Zelle einer schweren Dysplasie. An dem deutlich vergrößerten und hyper-chromatischen Zellkern fällt besonders der unregelmäßige, teils ausgezackte Kernrand auf(1250-fach).

Abbildung 3.12: Zellen eines verhornenden Plattenepithelkarzinoms. Die spindelförmigeneosinophil angefärbten Tumorzellen zeigen langgestreckte, teils spitz auslaufende, starkhyperchromatische Zellkerne. Daneben zwei kleinere rundliche Tumorzellen. In einer dieserZellen ist der vergrößerte, hyperchromatische Kern durch eine Plasmavakuole eingedellt(1250-fach).


Abbildung 3.13: Zellen eines verhornendes Plattenepithelkarzinoms. Die stark hyperchroma-tischen Kerne zeigen au�allend unregelmäßige Konturen (500-fach).

Abbildung 3.14: Hypothetische Histogrammformen

3.2. ZWEITE MERKMALSEBENE 45

3.2 Zweite Merkmalsebene

Vergröberung der Chromatinverteilung

Die Chromatinsubstanz, die sich während der Zellteilung in Form der Chromosomen dar-stellt, erscheint im Ruhekern gleichmäßig verteilt und fein granuliert. Im Zuge der Mali-gnisierung der Zelle kommt es meist zur Vergröberung der Chromatinstruktur in unter-schiedlichem Ausmaß. Die Chromatinverdichtungen färben sich intensiver an und hebensich dadurch deutlicher von der Umgebung ab. Die dunkel angefärbten Bezirke innerhalbder Kerne werden als Heterochromatin bezeichnet. Sie enthalten biologisch inaktive Chro-matinsubstanz. Die nur schwach angefärbten Bezirke in Ruhekernen, die u.a. die biologischaktive Chromatinsubstanz darstellen, werden Euchromatin bezeichnet (Beispiele Abbn.: 3.15,3.16, 3.17, 3.18, 3.19, 3.20)

Unregelmäßige Chromatinverteilung

Mit der Vergröberung der Chromatinstruktur ist in malignen Zellen im allgemeinen aucheine unregelmäßige Verteilung der heterochromatischen Chromatinanteile verbunden. DieChromatinverdichtungen können dabei entrundet und völlig unregelmäßig begrenzt sein.Au�allend große Chromatinverdichtungen werden als Chromozentren bezeichnet. Sie ent-stehen gewöhnlich durch Aneinanderlagerung heterochromatischer Anteile mehrerer Chro-mosomen. Hinsichtlich der verändereten Chromatinstruktur der Kerne kann man grob sche-matisch folgende Einteilung tre�en (Beispiele Abbn.: 3.15, 3.16, 3.17, 3.18, 3.19).

• Kernchromatin leicht vergröbert

• Kernchromatin stark vergröbert

• Kernchromatin fein granuliert und unregelmäßig

• Kernchromatin leicht vergröbert und unregelmäßig

• Kernchromatin stark vergröbert und unregelmäßig

Randständiges Chromatin

Bei unregelmäßiger Chromatinverteilung kommt es in malignen Zellen meist auch zur Anla-gerung heterochromatischer Chromatinsubstanz am inneren Rand des Zellkernes. Die auszwei Blättern bestehende Kernhülle ist lichtmikroskopisch normalerweise nicht zu erken-nen. Der Kernrand wird erst durch das Heterochromatin, das sich in sehr unterschiedlicherDicke am inneren Blatt der Kernhülle anlagern kann, deutlich sichtbar. Die Anlagerungvon Heterochromatin am Kernrand kann aber auch bei entzündlichen und degenerativenZellveränderungen auftreten (Beispiele Abbn.: 3.21, 3.22 ).


Abbildung 3.15: Zellen eines Carcinoma in situ. Die stark vergrößerten Zellkerne zeigenleichte, gleichmäßige Vergröberung des Kernchromatins (1250-fach).

Abbildung 3.16: Zellen eines Plattenepithelkarzinoms. Das Kernchromatin ist mäßig vergrö-bert, aber noch relativ gleichmäßig verteilt (1250-fach).


Abbildung 3.17: Zellen eines Plattenepithelkarzinoms. Mäßige Vergröberung, aber stark un-regelmäßige Verteilung des Kernchromatins. Chromozentren (1250-fach).

Abbildung 3.18: Zellen eines Carcinoma in situ. Starke Vergröberung, aber stark unregelmä-ßige Verteilung des Chromatins. Einzelne Chromozentren (1250-fach).


Abbildung 3.19: Zellen eines Plattenepithelkarzinoms. Ein Zellkern mit stark vergröbertemChromatin und au�allend unregelmäßiger Verteilung. Die Chromozentren sind scharf undunregelmäßig begrenzt. Au�allende Unterschiede zwischen Hetero- und Euchromatin. Dieübrigen, ebenfalls stark vergrößerten Kerne zeigen eine mäßige, aber gleichmäßige Vertei-lung des Chromatins, abgesehen von einigen eingelagerten unregelmäßigen Chromozentren(1250-fach).

Abbildung 3.20: Zellen einer mäßigen Dysplasie. Au�allend sind die stark hyperchromati-schen, pyknotischen Kerne in einigen Zellen. Andere Kerne zeigen nur eine mäßige Hy-perchromasie. In allen Zellen ist eine, wenn auch nicht sehr ausgeprägte Verschiebung derKern-Plasma-Ralation erkennbar (500-fach).


Abbildung 3.21: Zelle einer schweren Dysplasie. Au�allend unregelmäßige Verteilung desKernchromatins mit teilweise starker Anlagerung von Chromatin am Kernrand (500-fach).

Abbildung 3.22: Zellen einer Dysplasie. Stark vergrößerter Zellkern mit au�allend unregel-mäßiger Anlagerung von Chromatin am Kernrand. Auch im Inneren des Kerns zeigt sicheine unregelmäßige Verteilung des Chromatins. Die andere Zelle zeigt einen leicht vergrö-ßerten opaquen Kern. (1250-fach).


Opaques Chromatin

Bei gleichzeitigen degenerativen Veränderungen kann sich das Kernchromatin stark verdich-ten, so dass bei erhöhtem Chromatingehalt große dunkle Kerne entstehen, die im Innerenkeinerlei Strukturen mehr erkennen lassen. Man spricht von opaquen oder pyknotischenKernen. Diese Veränderung findet sich besonders häufig in Zellen maligner Tumoren.

Ebenfalls der Kern von Superfizialzellen ist pyknotisch. Er hat jedoch nur einen Durch-messer von höchstens 6µm. Größere pyknotische Kerne bedürfen der Beachtung. Sie kön-nen allerdings als Karyorhexis auch in degenerativ veränderten gutartigen Zellen vorkom-men (Beispiel Abb.: 3.23 ).

Nukleoli

Die Nukleoli (Kernkörperchen) erscheinen infolge ihres hohen RNS-Gehaltes auch in derPapanicolaou-Färbung oft rötlich. Allerdings kann diese rötliche Anfärbung durch an denNukleolus angelagerte DNS überdeckt sein. Maligne Zellen enthalten häufig mehrere odereinen stark vergrößerten Nukleolus (Makronukleolus). Er kann entrundet sein. Makronu-kleoli finden sich bei Plattenepithelkarzinomen in etwa 5% der Zellkerne, bei Adenokarzi-nomen des Endometriums in 15% der Zellkerne. Je unreifer die Geschwülste sind, umsohäufiger treten Makronukleoli auf. Bei gutartigem Gewebe finden sich vergrößerte Nukleoliin Zellen aus Regenerationsepithel (Beispiele Abbn.: 3.24, 3.25, 3.26, 3.27 ).

Prozentanteil Heterochromatin

Unabhängig von Chromatingehalt und Größe kann der Anteil des heterochromatisch ange-färbten Chromatins in malignen Zellen unterschiedlich sein. Hierüber liegen bisher nochwenig exakte Untersuchungen vor. Die endgültige Bewertung dieses Merkmale bleibt zu-künftigen Messungen vorbehalten (Beispiele Abbn.: 3.28, 3.29, 3.30 ).

Extinktionsdi�erenz zwischen Euchromatin und Heterochromatin

Heterochromatin und Euchromatin können sich verschieden stark anfärben. In malignenZellen sind die Kontraste zwischen dem dunkel angefärbten Heterochromatin und demhellen Euchromatin oft besonders stark. (Beispiele Abbn.: 3.31, 3.32, 3.33 )


Abbildung 3.23: Zellen einer mäßigen Dysplasie. Au�allend sind die stark hyperchromati-schen, pyknotischen Kerne in einigen Zellen. Andere Kerne zeigen nur eine mäßige Hy-perchromasie. In allen Zellen ist eine, wenn auch nicht sehr ausgeprägte Verschiebung derKern-Plasma-Relation erkennbar (500-fach).

Abbildung 3.24: Zellen eines Adenokarzinoms der Cervix uteri. In den vergrößerten Zellker-nen deutlich erkennbare Nukleoli. Im übrigen ist das Kernchromatin gleichmäßig verteiltund, abgesehen von zwei Kernen nur leicht vergröbert (1250-fach).


Abbildung 3.25: Zellen eines Adenokarzinoms der Endozervix. Die Zellkerne fallen durchihre stark vergrößerten Nukleoli (Makronukleoli) auf. Diese sind rund. Das Kernchromatinist mäßig vergröbert und unregelmäßig verteilt (1250-fach).

Abbildung 3.26: Zellen eines Endometriumkarzinoms. In zwei Zellkernen deutlich erkenn-bare Makronukleoli, die unregelmäßig geformt sind. Im übrigen zeigt sich im Zellplasmaeine au�allende Vakuolenbildung (1250-fach).


Abbildung 3.27: Zellen aus Regenerationsepithel mit kleinen, aber deutlich erkennbarenNukleoli in den relativ großen Zellkernen. Zum Vergleich in der Umgebung normale Super-fizialzellen und eine große zyanophile Intermediärzelle (325-fach).

Abbildung 3.28: Zellen einer schweren Dysplasie. Fünf Zellkerne mit deutlicher Hyperchro-masie; bei noch erkennbarer Chromatinstruktur erscheint der Anteil an Heterochromatinstark erhöht (1250-fach).


Abbildung 3.29: Zelle einer schweren Dysplasie. Hyperchromatischer Zellkern mit mäßigerVergröberung der Chromatinstruktur. Ohne au�allende Verschiebung des Eu- und Hetero-chromatinverhältnisses (500-fach).

Abbildung 3.30: Zelle eines unreifen Plattenepithelkarzinoms. Stark vergrößerter Zellkernmit extremer Verschiebung der Kern-Plasm-Relation. Au�allend geringer Anteil am Hetero-chromatin. In dem hellen Kern fallen nur einige Chromozentren auf (1250-fach).


Abbildung 3.31: Zellen eines Carcinoma in situ. Nur geringe Kontraste zwischen Hetero- undEuchromatin bei mäßiger Hyperchromasie und mäßige Vergröberung der Chromatinstrukturin den Kernen (500-fach).

Abbildung 3.32: Zelle einer schweren Dyplasie. Deutliche Kontraste zwischen heterochro-matischen und euchromatischen Bezirken im Kern, bei mäßiger Vergröberung des Kern-chromatins (1250-fach).


Abbildung 3.33: Zellen eines unreifen Plattenepithelkarzinoms. Au�allende Kontraste zwi-schen Eu- und Heterochromatin, wobei die euchromatischen Bereiche teilweise fast farbloserscheinen. (1250-fach), (vgl. 3.19).

3.3. DRITTE MERKMALSEBENE 57

3.3 Dritte Merkmalsebene

Anisonukleose

Darunter versteht man die unterschiedliche Größe der Kerne von Zellen des gleichen Typs.Sie kann in den atypischen Zellen eines Ausstriches sehr unterschiedlich sein. Die Grö-ße der Zellkerne normaler Zellen ist zwar auch sehr unterschiedlich. Zellen gleicher Artund gleichen Reifegrades zeigen jedoch im allgmeinen keine wesentlichen Unterschiede inder Kerngröße. Andererseits können auch Tumorzellen ein relativ gleichförmiges Aussehenaufweisen (Beispiele Abbn.: 3.34, 3.35).

Kernpolymorphie

Während die Kerne normaler Zellen im allgemeinen rund oder oval sind, können Kernevon Zellen maligner Tumoren oder deren Vorstufen erhebliche Abweichungen in der Formaufweisen. Die Kernformen können innerhalb eines Ausstriches sehr vielfältig sein. ÄhnlicheVeränderungen kommen in gutartigen Zellen gelegentlich bei degeneartiven Prozessen vor.Andererseits haben auch Tumorzellen häufig runde oder ovale Kerne (Beispiele Abbn.: 3.36,3.37, 3.38, vgl. 3.9 ).

Polychromasie der Kerne

Zellen maligner Tumoren und derer Vorstufen zeigen infolge ihres unterschiedlichen Chro-matingehalts innerhalb eines Abstriches häufig sehr unterschiedlich intensiv angefärbteKerne (Beispiele Abbn.: 3.39, 3.40, 3.41).

Varianz der Kernstrukturen

Bei Zellen maligner Tumoren und ihrer Vorstufen wechselt die Struktur der Kerne innerhalbeines Abstrichs häufig erheblich (Beispiele Abbn.: 3.42, 3.43, (vgl. 3.12, 3.36).

Anisozytose und Polymorphie der Zellen

Zellen aus malignen Tumoren und ihrer Vorstufen zeigen häufig erhebliche Unterschiedein der Größe (Anisozytose) und Form (Polymorphie) im Vergleich mit normalen Zellen.Es gibt Spindel-, Stachel-, Kaulquappenzellen usw.. Infolge degenerativer Autolyse kanndas Zellplasma weitgehend oder völlig verlorengehen. Allen diesen Veränderungen desZellplasmas kommt jedoch nur diagnostische Bedeutung zu, wenn auch die Zellkerneatypisch verändert sind (Beispiele Abbn.: 3.44, 3.45, 3.46 ).


Abbildung 3.34: Zellen eines unreifen Plattenepithelkarzinoms. Au�allend sind die starkenGrößenunterschiede zwischen den im allgemeinen runden oder ovalen Tumorzellkernen(Anisonukleose). Zahlreiche Erythrozyten (500-fach).

Abbildung 3.35: Zellen eines unreifen Plattenepithelkarzinoms. Einige au�allend große Tu-morzellkerne neben anderen relativ kleinen, unregelmäßig geformten Tumorzellkernen (Ani-sonukleose, Polymorphie (500-fach).


Abbildung 3.36: Zellen eines verhornenden Plattenepithelkarzinoms. Au�allende Vielgestal-tigkeit der Zellkerne (Polymorphie) bei gleichzeitig unterschiedlicher Zellkerngröße (Aniso-nukleose) (500-fach).

Abbildung 3.37: Zellen einer schweren Dysplasie. Au�allend unregelmäßige Formen dervergrößerten Zellkerne, die unterschiedliche Grade der Hyperchromasie zeigen. Außerdemzeigen die Zellen eine deutlich unterschiedliche Größe (Anisozytose) und teils auch unre-gelmäßige Formen (Polymorphie) (500-fach).


Abbildung 3.38: Zellen einer schweren Dysplasie. Deutlich unterschiedliche Formen der teilsstark vergrößerten Kerne (Polymorphie, Anisonukleose (1250-fach), (vgl. 3.21)

.

Abbildung 3.39: Zellen einer Dysplasie. Au�allend ist die deutlich unterschiedliche Anfär-bung der Zellkerne innerhalb des Bildes (Polychromasie der Kerne) (500-fach).


Abbildung 3.40: Zellen eines Carcinoma in situ. Starke Unterschiede in der Anfärbungeinzelner Kerne im gleichen Zellbild (Polychromasie der Zellkerne) (1250-fach).

Abbildung 3.41: Zellen eines Carcinoma in situ. Stark hyperchromatische Zellkerne nebenZellkernen, die nur eine mäßige Hyperchromasie aufweisen (Polychromasie) (1250-fach).


Abbildung 3.42: Zellen eines Plattenepithelkarzinoms. Ein Zellkern mit mäßig vergröberteraber stark unregelmäßiger Chromatinstruktur. Die übrigen Zellkerne zeigen eine mäßigeVergröberung aber relativ gleichmäßige Verteilung des Chromatins. Zwei in Degenerationbefindliche Zellen, deren Kerne eine relativ dunkle und verwaschene Kernstruktur zeigen(500-fach).

Abbildung 3.43: Zellen eines unreifen Plattenepithelkarzinoms. Zwei au�allend große Zell-kerne. Ein Kern zeigt eine leichte Vergröberung bei relativ gleichmäßiger Verteilung desKernchromatins. Nur einige kleine Chromozentren. Außerdem ein deutlich erkennbarer Ma-kronukleolus. Der andere Kern zeigt eine stärkere Vergröberung des Kernchromatins mitunregelmäßigerer Verteilung und deutlichen Chromozentren (1250-fach).


Abbildung 3.44: Zellen eines verhornenden Plattenepithelkarzinoms. Au�allende Vielgestal-tigkeit der Zellkerne (Polymorphie) bei gleichzeitig unterschiedlicher Zellkerngröße (Aniso-nukleose) (500-fach).

Abbildung 3.45: Zellen einer schweren Dysplasie. Au�allend unregelmäßige Formen dervergrößerten Zellkerne, die unterschiedliche Grade der Hyperchromasie zeigen. Außerdemzeigen die Zellen eine deutlich unterschiedliche Größe (Anisozytose) und teils auch unre-gelmäßige Formen (Polymorphie) (500-fach).


Abbildung 3.46: Zellen einer Dysplasie. Au�allend ist die deutlich unterschiedliche Anfär-bung der Zellkerne innerhalb des Bildes (Polychromasie der Kerne) (500-fach).

Kapitel 4

Überlegungen zur Anwendung derMerkmale in automatischenDiagnosesystemen

Bei der Anwendung der Merkmale in automatischen Diagnosesystemen ist zu berücksich-tigen, dass für die Einzelzellanalyse andere Merkmale benötigt werden als für das Präs-creening. Für die Einzelzellanalyse schlagen wir die Merkmale der Ebene 1 und 2 vor, fürdas Präscreening kommen in erster Linie die Merkmale der Ebene 1 und 3 in Betracht.Die hat folgende Gründe: Bei der Einzelzellanalyse wird die zu untersuchende Zelle vomArzt unter dem Mikroskop eingestellt und es werden Messungen an einer großen Zahl vonPunkten dieser Zellen vorgenommen. Dabei kommt es darauf an, nicht nur die in Ebe-ne 1 angegebenen Kern- und Zellmerkmale, sondern auch die Feinstruktur der Kerne zuerfassen. Aufgrund dieser Messungen soll dann eine objektivierte zytologische Diagnosegestellt werden, z.B. ob es sich um eine Zelle aus einem Carcinoma in situ, einem inva-sivem Karzinom oder einer Dysplasie handelt. Voraussetzung für den praktischen Einsatzdieses Diagnosesystems ist es, dass zunächst zahlreiche normale und pathologische Zellenmit bekannter Diagnose untersucht und die Messwerte in einer Datenbank gespeichertwerden. Erst dann kann man daran denken, Zellen, die bei der mikroskopischen Diagnostikschwierig zu beurteilen sind, durch den Vergleich mit den Messwerten exakt klassifizierterZellen einer objektivierten automatischen Diagnostik zuzuführen.

Beim Präsreening geht es darum, aus der großen Zahl der anfallenden zytologischenAbstriche die eindeutig negativen Befunde maschinell zu eliminieren. Es kommt nicht aufdie Stellung einer exakten Diagnose an der Einzelzelle an. Vielmehr genügt es, zwischeneindeutig negativen Befunden einerseits und positiven bzw. verdächtigen Befunden ande-rerseits zu unterscheiden. Dabei spielt es keine Rolle, wenn der Anteil der verdächtigenBefunde größer ist als in der konventionellen Diagnostik, da diese Befunde ohnehin demArzt zur Entscheidung zugeführt werden. Es dürfen aber unter den von der Maschineeliminierten Präparaten keine positiven Befunde sein.

Daraus ergibt sich, dass beim Präscreening eine maschinelle Durchmusterung des ge-samten Abstrichpräparates notwendig ist. Die erfordet - allein aus zeitlichen Gründen - die

65

66 KAPITEL 4. ANWENDUNG DER MERKMALE

Verwendung gröberer Merkmale, wie sie in der ersten Ebene enthalten sind. Die Erfassungintranukleärer Feinmerkmale, die im gegenwärtigen Zeitpunkt nur mit hohem Aufwand anoptischer und rechnerischer Kapazität möglich ist, dürfte sehr schwierig sein. Es erscheintjedoch denkbar, dass die Merkmale der Ebene 3 sich als nützlich erweisen, da sie sich alsPopulationsmerkmale aus der ersten Merkmalsebene ableiten lassen. Es müßten brauchbareSchwellenwerte zwischen normalen und pathologischen Befunden ermittelt werden.

Die Merkmale der vierten Ebene kommen im gegenwärtigen Zeitpunkt weder für einPräscreening noch für die Einzelzellanalyse in Frage, obwohl sie in der konventionellenDiagnostik eine gewisse Bedeutung haben. Sie zeigen aber, soweit es den Zellabstrich be-tri�t, eine Reihe von Faktoren (Zellüberlagerungen, Leukozyten, zerfallenes Blut, Eiweißnie-derschläge), auf, welche eine automatische Diagnostik erschweren und deshalb möglichsteliminiert werden sollten.

Nach dem gegenwärtigen Stand der Diskussion erscheint es für das Präscreening un-umgänglich, die Methodik der Zellabstrichherstellung festhalten. Es wird jedoch Ziel derUntersuchungen sein müssen, Zellüberlagerungen, soweit wie möglich, zu vermeiden, ohnedass es dabei zu einer völligen Zellvereinzelung kommt, weil sonst die in verdächtigenFällen anschließend notwendige mikroskopische Beurteilung durch den Zytologen nichtmehr möglich wäre. Bei der vorliegenden Merkmalsbesprechung wurden die Probleme,welche sich aus der Überlagerung von Zellmaterial für die automatische Diagnostik erge-ben, zunächst ausgeklammert, und es wurden bewusst nur die Merkmale der Atypie ander Einzelzelle zur Diskussion gestellt.

In weiteren Untersuchungen wird aber zu prüfen sein, wie weit bei, mit modifizierterTechnik hergestellten Präparaten - derartige Untersuchungen werden zur Zeit durchgeführt- die Zahl der einzeln liegenden Zellen für die maschinelle Auswertung des Gesamtabstrichsim Präscreening-Verfahren ausreicht oder ob evtl. doch noch für die in Gruppen liegendenTumorzellen maschinell erkennbare Merkmale ausgearbeitet werden müssen.

Parallel dazu müssen Untersuchungen zur Modifikation und Standardisierung der Fär-bung der Objektträgerpräparate durchgeführt werden, um eine möglichst maschinenge-rechte Darstellung der Zellmerkmale zu erreichen.

Aus alledem geht hervor, dass der hier vorgelegte Merkmalskatalog nur eine erste Ar-beitsunterlage bieten kann und nicht als endgültig zu betrachten ist. Es muss die Aufgabeder weiteren gemeinsamen Untersuchungen sein, zu prüfen, ob diese Merkmale wirklichfür eine automatisierte Krebszellbildanalyse geeignet sind, und ob sie durch Weglassungeinzelner Merkmale oder Hinzufügung anderer neuer Merkmale zu modifizieren sind.

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67

Kapitel 5

... und was in 30 Jahren darausgeworden ist ...

5.1 Einführung

Seit der Formulierung dieses Manuskriptes sind nun 30 Jahre vergangen, in denen an derautomatisierten Zellbildanalyse weltweit weitergearbeitet wurde. In der Zusammenarbeitzwischen Institut für Zytologie und GSF-Forschungszentrum für Umwelt und Gesundheitkonzentrierte sich die Arbeit zunächst auf das Prescreening von Papanicolaou-gefärbtenZervixabstrichen. Der Aufbau einer Zelldatenbank mittels interaktiver Erfassung von aus-gewählten Zelltypen, die Softwareentwicklung von Segmentierungsverfahren der digitali-sierten Zellbilder in Untergrund, Zytoplasma und Zellkern und die Entwicklung von Zell-und Kernmerkmalen, die die Morphologie, Densiometrie und Textur beschreiben, standenim Vordergrund. Das Ziel, die Entwicklung eines Entscheidungsbaumes zur Klassifikati-on zytologischer Präparate, konnte erreicht werden, wobei Präparate, die semiautomatischdurchgemustert wurden, den definierten PAP-Klassen überwiegend richtig zugeordnet wer-den. Die Entwicklung eines Prototypes für die Routine war nicht das Ziel dieses Projektes.Japanische und amerikanische Gruppen konnten in der Zwischenzeit solche Automatenfertigstellen. Einen Überblick über die Entwicklung dieser Automatisierung ist bei Banda-Gamboa et al. [31] beschrieben.

Bei der Entwicklung unseres Entscheidungsbaumes zur automatischen Präparateklas-sifikation konnte anhand von unverdächtigen Intermediärzellen die malignancy associatedchanges (MAC) wiederentdeckt werden, die bereits in den 60er Jahren von Nieburgs [97]beschrieben wurden. Andere Gruppen konnten danach dieses Phänomen ebenfalls nachwei-sen. Nach Ablauf des vom Bundesministerium für Forschung und Technologie gefördertenProjektes TUDAB1 1979 [41] wurde zunächst versucht an Giemsa-gefärbten Mammapräpa-raten Merkmale zu finden, die das Außenkriterium östrogenpositiv oder -negativ wider-spiegeln. Dazu wurde eine prospektive Studie begonnen, die ca. 500 Patientinnen enthält.Danach wurden zytologiche Studien über verschiedenste Organe und Fragestellungen be-arbeitet, auch wurden die MAC’s weiter verfolgt. Nachdem die Färbung von Giemsa auf

1TUmorDiagnose mittels Automatischer Bildanalyse

69

70 KAPITEL 5. ... UND WAS IN 30 JAHREN DARAUS GEWORDEN IST ...

die stöchiometrische Färbung nach Feulgen umgestellt wurde, konnten wir auch die unter-schiedlichen DNA-Verteilungshistogramme der Tumore untersuchen. In den ersten Jahrenkonzentrierte sich unsere Arbeitsgruppe ausschließlich auf zytologische Präparate. Dannkamen aus der pathologischen Routine histologische Schnitte hinzu, auf die wir die ent-wickelten Zytoplasma- bzw. Kernmerkmale anwendeten. Der Schwerpunkt hier lag hierbeibei Zervix, Mamma, Colon, Lunge und Pankreas. Für manche Fragestellungen war nur dieProliferation der Tumore von Bedeutung, so dass dies an verschiedenen Färbungen unter-sucht wurden. Mittels stereologischen Auswertungen konnte an Feulgen-gefärbten histologi-schen Schnitten die DNA-Verteilungsmuster berechnet werden. Graphentheoretisch wurdedie Verbandsstruktur der Zellen dargestellt und mathematisch die Unterschiede von Ge-weben berechnet. Immunhistochemische (MIB-1) Auswertungen und AgNOR Auswertungenergänzten die Proliferationsuntersuchungen.

Neben dem Aufbau der zytologischen und histologischen Bilddatenbank lag der Schwer-punkt unserer Arbeiten in der Entwicklung und Anwendung von neuen Merkmalen aus derTextur, Morphometrie und Densitometrie. Über die Jahre wurden je nach Problemstellungund Computerumstellung der Merkmalssatz erweitert und geändert. Dabei wurden auch dieMerkmalsnamen zum Teil neu definiert. Daher ist es nicht immer einfach die wichtigstenMerkmale aus den verschiedensten Projekten zu vergleichen. Der aktuelle Merkmalssatzwird mit genauen Erklärungen bei Rodenacker und Bengtsson [123] wiedergegeben. DieseVerö�entlichung wird im separaten Anhang angefügt. Der Merkmalssatz wurde bei ver-schiedensten Projekten aus der Zyto- und Histometrie angewendet, die im nächsten Kapitelaufgelistet wird. Abhängig von den Fragestellungen varieren die wichtigsten Merkmale. InKlassifikationsproblemen bei Unterscheidung von verschiedenen Zelltypen spielen Form-und einfache Dichtemerkmale die wichtigste Rolle, bei funktionalen Untersuchungen müs-sen Texturmerkmale zur Klassifikation herangezogen werden um eine Korrelation mit denjeweiligen Außenkriterium zu erhalten. Dies gilt sowohl in der Zytometrie als auch in derHistometrie.

In der folgenden Zusammenstellung sind Publikationen aus diesem Arbeitsgebiet unse-rer Arbeitsgruppe in Themen aufgelistet sowie als Ergänzung diejenigen Verö�entlichungen,die zusätzlich im Institut für Zytologie bzw. Pathologie entstanden sind, angehängt. Nachdem tragischen Tod von Herrn Burger verschob sich das Arbeitsgebiet von der quantitati-ven hochauflösenden Bildanalyse hin zur Auswertung von Immunmarkern, molekularbiolo-gischen Markern, FISH und 3D-Bildananalyse.

5.2 Überblick über Anwendungen

• Bildanalyse

– Bilderfassung und Systeme [3, 9, 69, 70, 71, 72, 73, 128, 130]

– Segmentierung [1, 4, 13, 14, 36, 74, 89, 98, 124, 129]

– Automatisierung [2, 8, 75, 136]

– Merkmalsextraktion [61, 62, 114, 115, 116, 118, 125, 126, 127, 131, 132]

– TUDAB-Projekt [2, 5, 6, 41, 42, 43]

5.2. ÜBERBLICK ÜBER ANWENDUNGEN 71

– Klassifikationen [53, 84]

– Überblick [39]

• Zytologie

– Zytodiagnostik [167, 168]

– Zervix

* Krebsfrüherkennung [32, 41]

* Malignancy associated changes [44, 48, 52, 54, 60]

* Entwicklung eines Prescreeners [10, 173, 175]

* Verschiedenes [35, 47, 85, 174]

– Mamma

* Krebsgrading und -diagnostik [47, 51, 83, 139, 141, 142, 148, 169]

* Prognose [15, 16, 18, 19, 23, 24, 49, 81, 86]

* Funktionale Diagnose by Hormonrrezeptorstatus [38, 86, 138, 144, 145, 146,147, 149, 150, 151, 152, 153, 155, 156, 159, 160, 161, 162, 163, 158]

* Morphologische Veränderungen bei hormonbehandelten Krebszelllinien derMamma [137]

– Schilddrüse:

* Unterscheidung von Adenomen, papillären Karzinomen und follikulärenKarzinomen [38, 47, 51, 84, 89, 140, 142, 143, 150, 157]

– Ösophagus:

* Unterscheidung von Dysplasien von Patienten mit unterschiedlicher Pro-gnose [76, 160, 177, 178]

– Prostata:

* Unterscheidung von hormon-sensitiven und -insensitiven Karzinomen [146,150, 154]

– Zellzyklusanalyse:

* Morphologie von Fibroblasten [11, 65, 78, 79, 80]

* Experimentelle Tumorgenese [28]

– Onkologie von Kulturzellen:

* Di�erenzierung von tumorigenen und nicht-tumorigenen virusinfizierterZellen [164, 165]

– Biologische Dosimetrie:

* Veränderungen der Morphologie und der Chromatinverteilung bei Mäuse-spermien [26, 29, 55]

* Einfluss der Arbeitsumgebung von Nickelarbeitern auf das zelluläre System[112, 113]

* Verschiedenes: [37, 40, 45, 46, 50, 63, 64]

72 KAPITEL 5. ... UND WAS IN 30 JAHREN DARAUS GEWORDEN IST ...

• Histometrie

– Mamma [57]

– Darm:

* Prognose beim Colonkarzinomen pT3 und pT4 [119, 120, 121]

– Ösophagus:

* Prognose beim Barrett Karzinom [93, 94]

– Hals-Nase-Ohren:

* Korrelation von STK15 mRNA Expression auf Prognose, FISH-Analyse undZentrosomenanzahl [111]

– Lunge

* Diagnose und Prognose bei neuroendokrinen Tumoren [33, 34, 87, 88]

– Pankreas:

* Neuroendokrine Tumoren bei Hunden [92]

– Leber

* Kernmorphologie [7, 12]

• Immunchemische Untersuchungen

– Mamma:

* AgNOR [17, 21, 22, 20, 25, 87]

* MIB-1 (KI-67) [33, 34, 87, 88]

– Lunge:

* verschiedene Lungenerkrankungen wie z.B. Sarkoidose, Mukoviszidose undUntersuchungen auf z.B. IgE, ICAM-1 oder CD23 [100, 101, 102, 103, 104, 105,106, 107]

• Messqualität

– Färbungsvergleiche und Berechnung, Messqualität und Stabilität

* Färbevergleich und Berechnung [122, 141, 170, 171]

* Messqualität und Stabilität [27, 30, 117]

5.3. AUSBLICK 73

5.3 Ausblick

Im Institut für Pathologie sind die Arbeiten an histologischen Schnitten fortgesetzt wor-den. Überwiegend sind Auswertungen immunchemischer Färbungen von Bedeutung, sowiedie Untersuchungen mittels FISH, die durch den Einsatz von Tissue Mircoarrays deutlichbeschleunigt werden konnten.

Die Vielfalt der heute möglichen Markierungsverfahren lässt langsam die Wiederent-deckung der hochauflösenden Bildanalyse zu. Ein neues Anwendungsgebiet unserer Ar-beitsgemeinschaft ist u.a. die automatisierte Untersuchung der Phytoplanktonzusammen-setzung in verschiedenen Gewässern, wobei der ganze Erfahrungsschatz aus der Zyto-metrie übernommen und darauf aufgebaut werden konnte [90, 133, 134, 135]. Das WortBakteriometrie ist noch nicht eingeführt worden, aber die von H.-J. Soost formuliertenBeschreibungskriterien sind auch in diesen Gebieten aktuell.

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