Weil et al NoD 2009

8/13/2019 Weil et al NoD 2009

1/9

Author's personal copy

T i me - of - da y d e te r mi n es n e ur o na l d a ma g e a n d m o rt a li t y a f te r c a rd i ac a r re s t

Z a ch a ry M . W e il , K a te K a re l i na , A l an J . S u , J a cq u el i ne M . B a rk e r, G r eg J . N o rm a n, N i ng Z h an g,A . C o ur t ne y D e Vr i es , R a nd y J . N e ls o n

Department of Psychology, The Ohio State University, Columbus, OH 43210, USA

Department of Neuroscience, The Ohio State University, Columbus, OH 43210, USA

Institute for Behavioral Medicine Research, The Ohio State University, Columbus, OH 43210, USA

a b s t r a c ta r t i c l e i n f o

Article history:

R e c ei v e d 2 2 M a y 2 0 0 9

R e v i s e d 1 3 J u l y 2 0 0 9

A c c e pt e d 3 0 J u l y 2 0 0 9

A v a i la b l e o n l i n e 5 A u g us t 2 0 9 9

Keywords:

Glo bal ische mia

Circadian rhy thms

M icro g lia

P ro inammato ry cy to kine s

Cardiac arre st

H e a r t d i s e as e

I s c h em i c e v e n t s i n h u m an s a r e n o t e v e nl y d i s t ri b u te d a c r o ss t h e d a y . T o d i s cr i m i na t e b e t w e e n t e m p o r al

d i f fe r e n ce s i n t h e i n c i d e n ce o f i s c h em i a a n d s u s ce p t ib i l i ty t o i s c h em i c e v e n t s , w e e x a mi n e d t h e o u t co m e o f

g l ob a l i s c h em i a i n a m ur i ne m od e l a t t h re e t i me p oi n ts d ur i ng t h e d a y . G l ob a l c er e br a l i s ch e mi a i n m i ce

d u r i n g t h e l i g h t p h a s e i m p a i r s s u r v i v a l a n d e x a c e r b a t e s o u t c o m e c o m p a r e d t o i s c h e m i a a t o t h e r t i m e s o f t h e

d a y . S p e cic a ll y , m i ce t h at u n de r we n t c a rd i ac a r re s t d ur i ng t h e l i gh t p h as e h a d g r ea t er n u mb er s o f

d e g en e r a ti n g n e u r on s , g r e at e r m i c ro g l i al a c t i va t i o n, a n d i n c r ea s e d p r o ina m ma t o r y c y t ok i n e p r o du c t i on i n

the ische m ia-vulne rab le hippocam pus, as we ll as incre ase d locom otor activity. Tim e -of-day diffe re nce s we re

n o t a l t er e d b y t h e m e l a t o n in r e c ep t o r a n t a g o n is t l u z i nd o l e. O u r r e s u l t s d o c u m en t t h a t b r a i n t i s s ue d i s pl a y s

endogenous u c t u a t i o n s i n s u s c e p t i b i l i t y t o i s c h e m i c d a m a g e a n d d e m o n s t r a t e t h a t s m a l l d i f f e r e n c e s i n t i m e

o f o n se t c a n s i g n ic a n tl y i nue nce ische m ic outcom e s.

2 0 09 E l s ev i e r I n c . A l l r i g h t s r e s er v e d.

Introduction

Isc hemic c ardiovasc ular events inc luding silent myoc ardial isc he-

m i a , a c u t e m y o ca r d i al i n f ar c t i on , s u d d en c a r di a c d e a t h, a n d s t r ok e ,

e x hi b it m a rk e d t i m e -o f -d a y v a ri a ti o n w i t h a n e x ce s s o f o c cu r re n ce s i n

t h e e a rl y m o rn i ng h o ur s (C oh en e t a l. , 1 99 7; M ul le r e t a l. , 1 98 7; R oc co

e t a l . , 1 9 8 7 ; T h o m p s o n e t a l . , 1 9 8 5 ; W i l l i c h e t a l . , 1 9 8 7 ) . A c o nuenc e

o f p h y si o l o gi c a l f a c t o r s m a y c o n t ri b u t e t o t h i s t e m p o r a l v a r i a ti o n i n

i s ch e mi c e v en t s, i n cl u di n g d a il y m a xi ma i n b l oo d p r es su r e, b l oo d

c o a g ul a b i li t y , h e a rt r a t e , v a s c u l ar a n d s y m pa t h et i c t o n e , a n d s e v er a l

n e u r oe n d oc r i ne s y s te m s (P o r t al u p p i a n d L e m me r , 2 0 0 7) . A l t h ou g h

t h e r e i s l i t t l e d o u b t t h a t t e m p o r a l v a r i a t i o n e x i s t s i n t h e i n c i d e n c e o f

i s c h e m i c c a r d i o v a s c u l a r e v e n t s , i t r e m a i n s u n k n o w n w h e t h e r t h e r e i s

d a i l y v a r i a t io n i n s u s ce p t i bi l i t y o f t h e b r a i n a n d o t h e r o r g a n s y s t e mst o i s c he m i c d a m ag e .

C i rc a di a n o r ga n iz a ti o n o f p h ys i ol o gi c al p r oc e ss e s h a s b e en

d e m o ns t r a te d a c r os s p h y lo g e n y r a n g in g f r o m u n i ce l l ul a r o r g a ni s m s

t o t h e h i gh e st o r de r v e rt e br a te s ( I s hi u ra e t a l ., 1 9 98 ; R e pp e rt a n d

W e a ve r , 2 0 0 1) . A m o ng v e r te b r a te s , e n d o ge n o us c i r ca d i a n r h y t hm s

c a n b e d e te c te d i n w h ol e o r ga n is m s, i n di v id u al o r ga n s a n d t i ss u es ,

a n d e v e n s i n g l e c e l l s ( A b e e t a l ., 2 0 02 ; S t ok k an e t a l ., 2 0 01) . I n d e ed ,

n e u r on s e x h ib i t d a i l y r h y th m s i n t r a n sc r i pt i o n , t r a n sl a t i on , s y n a pt i c

ac tivity, and neurotransmitter and neuropeptide sec retion ( A b e e t a l . ,

2002; Herzog, 2007 ) . T h e o v e r r i d i n g q u e s t i o n m o t i v a t i n g t h i s s t u d y i s

d o d a il y r hy th ms i n p hy si o lo gy a nd b eh av io r h av e p ot e nt i al

c o n s eq u e nc e s f o r s u s ce p t ib i l it y t o d i s ea s e s t a t es ?

T h e c e n tr a l n e r vo u s s y s t em ( C N S) i s d i f fe r e nt i a l ly s u s ce p t i bl e t o

d a m a ge i n c a s e s o f w h o l e- b o dy i s c he m i a a n d C N S i n j u ry i s o f t e n t h e

p r o x i m a t e c a u s e o f d e a t h a n d l o n g t e r m d i s a b i l i t y f r o m c a r d i a c a r r e s t

( B e ck e r e t a l ., 1 9 91 ; R o in e e t a l ., 1 9 93 ; K r au s e e t a l ., 1 9 86) . D e s pi t e

e x t e ns i v e r e s e a r c h i n t o t h e p a t h op h y si o l o gy o f c e r eb r a l i s c he m i a, n o

b r o a dl y e f f ec t i ve p h a rm a c o th e r ap y e x i st s ( Jastremski et al., 1989;

Koe r e t a l. , 2 00 4; R oi ne e t a l. , 1 99 3) . T he re fo re , t he s tu dy o f

e n d o ge n o us n e u r op r o t ec t i v e m e c ha n i sm s t h a t m i g ht p r o v id e i n s ig h t s

i n t o p o t e nt i a l i n t e r v e nt i o ns i s i m p o rt a n t ( Perez-Pinzon, 2007) . T hee x p er i m en t s i n t h i s s t u d y w e r e d e s i gn e d t o t e s t t h e h y p o th e s is t h a t

C N S t i ss u e e x hi b it s d a il y u c t u at i o ns i n s u s ce p t i bi l i ty t o i s c he m i c

d am ag e a nd t o b eg in t o u nc ov er t he m ec ha ni sm s t ha t u nd er li e

temporal u ct u at i on s i n s us ce pt ib il it y. I n o rd er t o a dd re ss t hi s

q u es t io n , a s t an d ar d iz e d i s ch e mi c c h al l en g e, c a rd i ac a r re s t a n d

c a r d io v a sc u l ar r e s u sc i t a ti o n , ( C A / CP R ) w a s a d m in i s t er e d t o h e a lt h y

a d ul t m a le m i ce a t t h re e d i ff e re n t p h a s es o f t h e d a y [ M id d le o f t h e

l i g h t p e r i o d , ( M i d - Li g h t) a t t h e l i g h td a r k t r a ns i t i on ( L i g htDark),

a nd i n t he m id dl e o f t he d ar k p er io d ( Mi d- Da rk )] . T o c on tr ol f or

nonspec ic e f fe ct s o f t h e s u rg i ca l p r oc ed u re , w e a l so c o nd u ct e d t h e

c a r d ia c a r r e st a n d c a r di o p u lm o n a ry r e s u sc i t a ti o n p r o c ed u r e o n m i c e

w i th h y po t he rm i c h e a d s ( 2 7 C , a c o nd i ti o n t h at p r ot e ct s t h e C N S

f r o m v i r t u a l ly a l l i s c h e m ic d a m a ge ( N e i g h e t a l . , 2 0 0 4 ) ) . S u r v i v a l, a s

w e l l a s b e h av i o r al , h i s t ol o g i ca l , i n

a m m a to r y , a n d n e u r oe n d oc r i ne

N e u ro b i ol o g y o f D i s e as e 3 6 ( 2 0 0 9) 3 5 2360

Co rre spo nding autho r. Curre nt addre ss: Labo rato ry o f Ne uro bio lo g y and Be hav io r,

Labo rato ry o f Ne uro e ndo crinolo g y , Ro cke fe lle r Univ e rsity , 1230 Yo rk Av e ., Ne w Yo rk,

N e w Y o r k 1 0 0 6 5 , U S A .

E-mail address: zwe il@ro cke felle r.e du (Z .M . We il).

Available online on ScienceDirect (www.sciencedirect.com).

0969-9961/ $ s e e f r o n t m a t t e r 2 0 0 9 E l s e v ie r I n c . A l l r i g h t s r e s e r v ed .

do i:10.1016/ j.nbd.2009.07.032

Contents lists available at ScienceDirect

N e ur o bi o lo g y o f D i se a se

j o u r n a l h o m e p a g e : w w w. e l s e v i e r. c o m / l o c a t e / y n b d i

8/13/2019 Weil et al NoD 2009

2/9


e n d p oi n t s w a s a s s es s ed ; o u t c om e s w e r e c o n si s t en t l y w o r s e i n m i c e

t ha t u nd er we n t n or mo t he rm ic C A /C PR i n t h e M id -L ig ht p ha se

r e la t iv e t o t h os e t h at e xp e ri e nc ed C A /C P R a t d i ff e re n t t i me s o f t h e

d a y , t h e r e b y i n d i c a t i n g t h a t d a i l y v a r i a t i o n e x i s t s i n t h e s u s c e p t i b i l i t y

t o i s ch e mi c e v en t s. W e t h en t e st e d t h e h y po t he si s t h at d a ynight

d i f fe r e nc e s i n t h e c i r cu l a t in g c o n ce n t r at i o n s o f e n d o ge n o us m e l a to n i n

m e di a te d t i me o f d a y d i ff e re n ce s i n i s ch e mi c o u tc o me s ; m e l a to n in i s ah o rm o ne r e le a se d o n ly d u ri n g t h e d a rk p h as e t h at u n de r li e s m a ny

d ai ly r hy t hm s i n p hy si ol og y a nd b eh av io r ( re vi ew ed i n Pandi-

P e r u m a l e t a l . , 2 0 0 6) a n d b o t h e n d o g e n o u s a n d e x o g e n o u s m e l a t o n i n

h a v e n e u ro p r o te c t iv e p r o p er t i es ( R e it e r e t a l ., 2 0 05) . W e a l so e xa m in e

p o t e nt i a l m e d ia t i o n b y d a i l y r h y t hm s i n c o r t ic o s te r o ne . C o r t ic o s t e-

r o n e c o n c e n t r a t i o n s i n r o d e n t s i n c r e a s e t o w a r d s t h e b e g i n n i n g o f t h e

a c t i ve p h a s e ( d a r k p e r i o d ) p e a k s e v er a l h o u r s t h e re a f te r a n d d e c l i n e

t h r o u g h t h e r e s t o f t h e d a y . C i r c u l a t i n g c o r t i c o s t e r o n e i s a n i m p o r t a n t

d e te r mi na n t o f i s ch e mi c o u tc o me s a n d c a n r e nd e r t a rg e t t i ss u es m o re

v u ln e ra b le t o i s ch e mi c d a ma g e (B ai n e t a l. , 1 99 2; S ap ol sk y a nd

Pulsinelli, 1985) . T o g et h e r, t h e se s t u d ie s w i l l c l a ri f y w h e t h e r t i m e o f

day af f ec ts isc hemic vulnerability.

Methods

Animals

A d u l t m a l e C 3 H /e m i c e w e r e p u r c h a s ed f r o m H a r la n ( I n d ia n a p ol i s ,

I n di a na ) . U p on a r ri v al i n o u r l a bo r at o ry , m i ce w e re i n di v id u al l y

h o us e d a n d m a in t ai n ed i n a 1 4 :1 0 l i gh td a rk c y cl e . A l l m i ce h a dad

libitum a c ce s s t o f o o d ( H a r l a n T e k l ad # 8 6 4 0) a n dl t e r e d t a p w a t e r .

A ll e xp er i me n ta l c on d it i on s w er e a pp r ov ed b y t he O hi o S t at e

U n iv e rs i ty I n st i tu t io n al L a b A n im a l C a re a n d U s e C o mm i tt e e a n d

w e r e i n a c c o rd a n ce w i t h N a t i o n a l I n s t i t u te s o f H e a lt h g u i d el i n es .

M i c e w e r e r a n d o m l y a s s i g n e d t o u n d e r g o C A / C P R a t o n e o f t h r e e

p o i n ts i n t h e d a i l y c y c le , M i d -l i g ht ( s u r ge r i es 68 h a ft er l ig ht s o n;

n = 4 h i st o lo g yn = 4 r t -P C R) , L i gh tD a rk ( s ur g er i es w i th i n 1 h o f

l i g ht s o f f ;n = 5 h i s to l o g yn = 6 r t -P C R) , a n d M id - da r k ( s ur g er i es 4

6 h a ft er l ig ht s o ff ; n = 6 h i st o lo g y n = 6 r t -P C R) a n d h y po t he r mi c

(n = 9 h i st o lo g y a n d n = 1 0 r t- PC R) . I n o rd er t o i nd uc e C A/ CP R a t

d i f f e r e n t s u b j e c t i v e t i m e s o f t h e d a y , b u t s t i l l h a v e t h e s u r g e r i e s o c c u r

d u r i n g a s i m i l a r w i n d o w f o r t h e s u r g e o n s a n d a n i m a l c a r e s t a f f , m i c e

w e re h o us e d i n v e nt i la t ed l i gh t -t i gh t c a bi n et s w i th p h as e -s h if te d

lightd a r k c y c l e s ( s e e Supplementary Table 1 ) . A f t e r a t l e a s t 2 w e e k s

i n t h e r e s p e c t i v e l i g h t c o n d i t i o n s , m i c e w e r e b r i ey a n e s t h e t i z e d a n d

a b l o o d s a m p l e c o l le c t e d f r o m t h e r e t ro o r b it a l s i n u s ( a p p r o x im a t el y

100 l ) . A p pr o xi ma t el y 2 4 h l a te r , m i ce u n de r we n t e i th e r n o rm o -

t h er m ic ( h ea d t em p er a tu r e = 3 7 C ) o r h y po t he rm i c ( h ea d

t e mp e ra t ur e = 2 7 C ) c a rd i ac a r re s t a n d C P R ( s ee Supplementary

methods f o r d e s c r i p t i o n o f t h e s u r g i c a l p r o c e d u r e ) .

Cardiac arrest/CPR procedure

M i c e w e r e a n e s t h et i z e d w i t h 3 % h a l o th a n e i n a i r , i n t u b a te d , a n d

m a in t ai n ed o n 1 . 5% h a lo t ha n e. A t e mp e ra t ur e p r ob e w a s p l ac e d i n t h e

t e mp o ra l is m u sc l e o n t h e l e ft s i de o f t h e h e ad . T e mp o ra l is m u sc l e

t e m p er a t u re w a s u s e d a s a n i n d e x o f b r a in t e m p er a t u re . A p r e vi o u s

s t u d y v a l i d a t e d t h i s m e a s u r e i n r a t s ( Jiang and N orth, 1991) , a n d w e

h a v e p r e v i o u sl y d e m o ns t r at e d i n m i c e t h a t b r a in t e m pe r a t ur e a n d

t e m p or a l is t e m pe r a t ur e a r e h i g hl y c o r re l a t ed (r2 = 0 . 94 ) o ve r t he

r a ng e o f t e mp e ra t ur e s e x pe r ie n ce d d u ri n g o u r c a rd i ac a r re s t/ C PR

p r o c e d u r e ( 2 4 t o 3 9 . 5 C ) (N e i g h e t a l . , 2 0 0 4) . H e a d t e m p e r a t u r e w a s

m a n i p u l a t e d i n d e p e n d e n t l y o f b o d y t e m p e r a t u r e t h r o u g h t h e u s e o f a

d o ub l e l u m en c o il t h at w a s p l a c ed a r ou n d t h e h e ad a n dl l e d w i t h

c i rc u la t in g w a te r t o a c hi e ve a b r ai n t e mp e ra t ur e o f 3 7 C ( n or m o-

t h e rm i c ), o r 2 7 C ( h y p ot h e rm i c ). A s e c o nd t e m p er a t u re p r o b e w a s

p l a c ed t o m o n it o r r e c t a l t e m p e r a tu r e . A P E 1 0 c a t h e t er w a s i n s e r t edi nt o t he r ig ht j u gu la r v ei n f or p ot as si um c hl or id e ( K Cl ) a nd

e p in e ph r in e ( E PI ) a d mi n is t ra t io n . A c a nn u la ( F in e S ci e nc e , F o st e r

C it y, C A, U SA ) w as i ns er te d i nt o t he r ig ht f em or al a rt er y, a nd

c o n ne c t ed t o a b l o o d p r e s s u r e t r a n s d uc e r ( C o l um b u s I n s t r u m e nt s ,

C o lu m bu s , O H ) t o a l lo w c o nt i nu o us m o ni t or i ng o f a r te r ia l b l oo d

p re ss ur e. T he i nt ub at i on t u be w as c on ne ct e d t o a v en ti l at o r

( C ol u mb u s I n st ru me nt s, C o lu mb us , O H, U S A) a n d m ic e w er e

v e nt i la t ed w i th a t i da l v o lu m e o f 1 5 0 l a nd a r es pi ra to ry r at e o f

1 6 0 b r e a t h s / m i n . M i c e w e r e s t a b i l i z e d f o r 1 0 m i n d u r i n g w h i c h t i m eb l o o d p r e s s u r e a n d t e m p e r a t u r e s w e r e r e c o r d e d a t o n e m i n i n t e r v a l s .

A t t h e e n d o f t h e a c cl i ma t io n p e ri o d, b o dy t e mp e ra t ur e w a s d e cr e as e d

t o 2 7 C b y c i r c u l a t i n g c o l d w a t e r t h r o u g h a c o i l s y s t e m b e n e a t h t h e

a n i m a l a n d p l a c e m e n t o f a n a l c o h o l p a t c h o n t h e v e n t r u m . T o i n d u c e

c a rd i ac a r re s t, K C l ( 5 0l , 0 .5 M , 4 C) w as i nj ec te d v ia t he j u gu la r

c at he te r. T he m ic e w er e d et ac he d f ro m t he v en ti la to r. S lo w r e-

w a rm i ng v i a h ea t in g l a mp a n d t h er m al b l an k et b e gi n w h en b o dy

t e mp e ra t ur e r e ac he d 2 7 C a f te r a p pr o xi ma t el y 4 m i n o f a r re s t. A t

7 m i n 4 5 s i n to t h e a r r es t p e ri o d, t h e m o u se w a s r e a t ta ch e d t o t h e

v e nt i la t or a n d v e nt i la t ed w i th 1 0 0% o x yg e n w i t h a t i da l v o lu m e o f

150l a n d a r e s pi r a t or y r a t e o f 1 6 0 b r e a th s / mi n . E i g h t m i n u t e s a f t e r

i n j e c t i o n o f K C l , C P R w a s i n i t i a t e d v i a i n j e c t i o n o f e p i n e p h r i n e ( 1 6 g

E P I i n 0 . 6 c m3 s a li n e, 3 7 C ) i n to t h e j u gu l ar v e in c a th e te r a n d c h e s t

c o m p re s s io n s ( 3 0 0 /m i n ). A d d i ti o n al E P I w a s a d m in i s t er e d i n i n c re -m e nt s o f 0 . 5g i n c o n j un c t i on w i t h c o n t i n u ed c h e st c o m p re s s io n s

u n ti l t h e m o u s e w a s r e su s ci t at e d ( m ax i ma l d o se o f E P I : 3 2 g ) . T en

m i nu t es a f te r r e tu r n o f s p on t an eo u s c i rc u la t io n ( R OS C ) b l oo d w a s

d r a w n f r o m t h e f e m o r a l a r t e r y c a t h e t e r ( a p p r o x i m a t e l y 1 0 0l ) . M i c e

w er e m ai nt ai ne d o n 1 00 % o xy ge n f or 2 5 m in f ol lo w in g R OS C.

C a t h et e r s w e r e t h e n r e m o v ed a n d s k i n s u t u re d .

Openeld testing

M i c e w e r e t e s t e d i n t h e o p e n e l d t a s k t w o d a y s p r i o r t o C A / C P R

a n d s i x d a ys p o st - re p er f us i on . T h e t e st c h am b er w a s e n cl o se d i n a

s o un d a n d l i gh t a t te n ua t in g c a bi n et t h at c o ns i st e d o f a 6 0 c m2 c lear

P l e xi g l a s a r e n a w i t h c o r n c o b b e d d i ng o n t h e b o t t o m . T h e a r e n a w a s

s u rr o un d ed b y a s e ri e s o f i n fr a re d l i gh t s t h a t t r ac ke d t h e m o ve m en t o f

t h e m o us e i n t h re e- d im e ns i on s . E a ch m o us e w a s t e s t ed f o r 6 0 m i n

d u r i n g t h e d a r k c y c l e . T h e t e s t c h a m b e r w a s c l e a n e d t h o r o u g h l y w i t h

a 7 0 % e t h a n o l s o l u t io n a n d t h e b e d d i n g c h a n ge d b e t w e e n e a c h t e s t .

T h e r e s u l t s w e r e g e n e r a t e d o n l i n e b y t h e P A S s o f t w a r e p a c k a g e ( S a n

D i e g o I n s t r u me n t s, S a n D i e g o , C A , U S A ) . T h e t o t a l l o c o mo t o r a c t i v i t y

( n u m be r o f b e a m b r e a k s) , p e r c e n t ag e o f t i m e s p e n t i n t h e p e r i p h er y

v e r s u s t h e c e n t e r o f t h e a r e n a w e r e r e c o r d e d .

Tissue collection, processing, and analysis

D ur in g t he e ar ly p or ti on o f t he l ig ht c yc le , s ev en d ay s p os t-

r e pe r fu s io n m i ce w e re d e ep l y a n es t he t iz e d, a b l oo d s a mp l e w a s

c o ll e ct e d f r o m t h e r e t r oo r bi t al s i nu s , a n d t h en t h ey w e re g i ve n a l e th a l

d o s e o f s o d i u m p e n t o b a r b i t a l . M i c e w e r e t h e n p e r f u s e d t r a n s c a r d i a l l y

w i th i ce - co l d 0 . 1 M P B S a n d 4 % p a ra f or m al d eh y de . B r ai n s w e reremoved, post-x e d f o r 4 h , c r yo p ro t ec t ed i n 3 0 % s u c r os e u n ti l t h ey

s u n k , f r o z e n o n c r u s h e d d r y i c e , a n d t h e n s t o r e d a t 7 0 C u n t i l t h e y

w e r e s e c t i o n e d a t 1 4m o n a c r yo s ta t a n d t h a w- mo u nt e d o n t o S u pe r

F r o s t P l u s s l i d e s ( F i s h e r , H a m p t o n , N H , U S A ) . S e c t i o n s w e r e s t o r e d a t

2 0 C u n t i l f u r t h er p r o c es s i ng .

Fluoro Jade C histochemistry

F l u o r o J a d e C ( F J ) i s a uoresc ein derivative that labels degenerat-

i n g n e u r o n s . M o u n t e d s e c t i o n s w e r e s t a i n e d a c c o r d i n g t o e s t a b l i s h e d

p r o t o c o l s ( S c h m u e d a n d H o p k i n s , 2 0 0 0 a , 2 0 0 0 b ) . B r i ey , s l i d e s w e r e

d r ie d a t r o om t e mp e ra t ur e , i m me r se d i n a b a si c e t ha n ol s o lu t io n ( 8 0%

c o n t a i n i n g 1 % s o d i u m h y d r o x i d e ) a n d t h e n r i n s e d i n 7 0 % e t h a n o l a n d

d i s t il l e d w a t er ( d H2O ). S li de s w er e t he n t re at ed w it h p ot as si ump e r ma n g an a t e ( . 0 6 % i n ( d H2O ) f or 1 0 m in , r in se d w it h w at er , a nd

t h e n i n c u b a t e d i n F l u o r o J a d e C ( 0 . 0 0 0 1 % i n a 1 % a c e t i c a c i d s o l u t i o n ) ;

353Z.M. Weil et al. / Neurobiology of Disease 36 (2009) 352360

8/13/2019 Weil et al NoD 2009

3/9


s e ct i on s w e re s i mu l ta n eo u sl y c o un t er s ta in e d w i th D A PI ( S ig m a-

A l dr i ch , S t . L o ui s , M O , U S A) , r i ns e d i n d H2O , a n d t h or o ug h ly d r ie d

o n a s l i d e - w a r m e r , c l e a r e d f o r 1 m i n i n x y l e n e , a n d c o v e r s l i p p e d w i t h

D P X ( S i g m a ) .

F l u o ro J a d e p o s i t i v e c e l l s w e r e c o u n t e d i n m u l t ip l e h i p p o c a mp a l

r eg io ns ( ap pr ox im at el y 2 m m c au da l t o b re gm a; C A1 , C A2 , C A3 ,

d e nt a te g y ru s , d e nt a te h i lu s , a n d s u bi c ul u m) o n li n e b y a n e xp e ri -m e n t e r u n a w a r e o f t h e e x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s a s s o c i a t e d w i t h e a c h

s a mp l e. B o th s i de s o f t h e h i p p oc a mp u s w e r e c o un t ed i n a s i ng l e

s e ct i on a n d a v er a ge d . B l ac k a n d w h it e i m ag e s o f uoresc ently-stained

s ec ti o ns w er e c ap t ur ed w it h a d ig it al c am er a ( Ax io ca m, Z ei ss )

c on ne ct ed t o a u o r es c e nt m i c ro s c op e ( Z e i ss A x i os k o p) u s i ng

A x io v is i on s o ft w ar e ( Z ei s s) . S e ct i on s w i th D A PI a n d F l uo r o J a de C

w e r e p h o t o gr a p he d s e q ue n t i al l y u s i ng a p p r op r i at e e x c it a t i on w a v e -

l e n g th s ( 3 6 5 a n d 4 8 5 n m r e s pe c t i ve l y ), t h e n p s e u d o c ol o r ed , s u p e r-

i m p o s e d , a n d m e r g e d .

M i c ro g l ia w e r e v i s u al i z e d u s i ng a n a n t i bo d y d i r e ct e d a g a i ns t M A C -

1 . S l id e s w e r e a i r d r ie d , r i ns e d i n d i st i ll e d w a te r , a n d t h en b l oc k ed

w i t h r a b b i t s e r u m a n d b o v i n e s e r u m a l b u m i n ( B S A ) . S l i d e s w e r e t h e n

i n c u ba t e d f o r 2 4 h a t r o o m t e m p er a t u re w i t h r a t a n t i - CD 1 1 b a n t ib o d y

( S e r ot e c , R a l e i g h, N C ) d i l u t e d 1 : 1 0 0 i n P B c o n t ai n i ng 0 . 3 % T r i t o n -X ,r a bb i t s e ru m a n d B S A. S l id e s w e r e t h en r i ns e d a n d i n cu b at e d w i th

r a b b it a n t i- r a t s e c on d a r y a n t i b o d y ( 1 : 5 00 ; V e c t or L a b s, B u r l in g a me ,

C A , U S A ) f o r 2 h . S e c t io n s w e r e q u en c he d i n H2O2 i n m e t ha n o l a n d

t h en r i ns e d a n d t r ea t ed w i th E l it e A B C r e a g en t f o r 6 0 m i n. S e ct i on s

w e r e a g a i n r i n s e d w i t h P B S a n d t h e n v i s u a l i z e d w i t h D A B c o n t a i n i n g

n i c ke l . A f t er v i s u al i z a ti o n , s l i d e s w e r e r i n se d i n d i s t il l e d H 2O , t h en

dehydrated, c leared, and c overslipped.

P h ot o gr a ph s o f m u lt i pl e h i pp o ca mp a l r e gi o ns ( C A1 , C A 2, C A 3,

d e n t at e g y r u s, s u b ic u l u m, a n d o v e r ly i n g p a r i e t a l c o r t e x w e r e t a k e n

w i th a N i ko n E 8 00 m i cr o sc o pe a t 2 0 . I m ag e s w e r e d i gi t iz e d a n d

p r op o rt i on al s t ai n ed a r ea s w e re a s se ss e d u s in g I m ag e J s o ft w ar e

( N I H ) . B r i ey , i m a g es f r o m e a c h a n a t om i c al r e g i on w e r e a s s e s se d b y

t h e s o f tw a r e t o d e t e rm i n e t h e i m m un o r e ac t i v e r e g i o n s. T h e nx e d s i z e

rec tangular s c a n b o x e s w e r e s u p e r im p o se d o v e r t h e i m a ge a n d t h e

p e r c e n t a g e o f s t a i n e d a r e a w i t h i n t h e b o x w a s r e c o r d e d . P r o p o r t i o n a l

a r e a w a s t h e n e x p r e s se d a s t h e p e r ce n t a ge o f t h e t i s su e s t a in e d r e l a ti v e

t o t h e e n t i r e s i z e o f t h e s c a n b o x . I t i s i m p o r t a n t t o n o t e t h a t i n c r e a s e s

i n p r o p or t i o na l a r e a d o n o t n e c es s a ri l y i n d i ca t e t h e p r e se n c e o f g r e at e r

n um be rs o f m ic ro gl ia , b ut d oe s p ro vi de a n a ss es sm en t o f t he

a c ti v at i on a l s t a t e o f t h is c e ll t y pe a s i t b e co m es h y pe r tr o ph i c i n t h e

i n j u r e d C N S ( C o g g e s h a l l a n d L e k a n , 1 9 9 6 ; P o p o v i c h e t a l . , 1 9 9 7 ).

Real-time PCR

T w e n t y - f o u r h o u r s a f t e r C A / C P R , f r e s h b r a i n s w e r e c o l l e c t e d f r o m

a n a d d i ti o n a l 5 a n i m al s / ti m e p o i n t/ h e ad t e m p er a t u re . A t t h a t p o i n t ,

m i c e w e r e e u t h a n iz e d , a t r u nk b l o o d s a m p l e w a s c o l l e c t ed , a n d t h e n

b r a i n s w e r e r e m o v e d u s i n g a s e p t i c t e c h n i q u e s a n d s t o r e d i n R N A l a t e r

R N A s t ab i li z at i on s o lu t io n ( A mb i on , A u st i n, T X , U S A) o v er n ig h t a t4 C . H i pp o ca m pi w e re d i ss e ct e d o u t a n d t o ta l R N A w a s e x t r ac t ed

f rom N3 0 m g o f i n d iv i d u al h i p p oc a m pi u s i n g a h o m og e n iz e r ( U l t r a -

T u r r a x T 8 , I K A W o r k s , W i l m i n g t o n , N C , U S A ) a n d a n R N e a s y M i n i K i t

a c co r di n g t o m a nu f ac t ur e r' s p r ot o co l ( Q ia g en , V a le nc i a C A , U S A) .

E x tr a ct e d R N A w a s s u sp e nd e d i n 3 0 l R N as e -f r ee w a te r a n d R N A

c o n ce n t r at i o n w a s d e t e rm i n ed b y s p e ct r o p ho t o me t e r ( N a no d r o p-

1 0 00 , N an o dr o p T ec h no l og i es , W il mi n gt o n, D E , U S A) . A l l R NA

s a mp l es w e re s t or e d a t 7 0 C u n ti l f u rt h er a n al y si s . c D NA w a s

c r ea t ed v i a r e ve r se t r an s cr i pt i on o f 2 g o f R NA f ro m e a c h s a mp le w it h

M M L V R e v e r s e T r a n s c r i p t a s e e n z y m e ( I n v i t r o g e n , C a r l s b a d , C A , U S A )

a c c o r d i n g t o t h e m a n u f a c t u r e r ' s p r o t o c o l .

Il-1 and Tnf p ri me rs a nd p ro be s (O ve rb er gh e t a l. , 1 99 9)

w e re s yn t he s iz e d a s f o ll ow s, w it h p ro b es l a be le d w it h 6 -F AM

(u o re s ce n t d y e) a n d M GB ( n on -u o re s ce n t q u en c he r ) a t t h e 5a nd 3 e n d s , r e s p e ct i v e l y : Il-1 f o rw ar d 5-CAACCAACAAG TG A-

TATTCTCCATG -3, Il-1 r e v e r s e 5-AG ATCCACACTCTCAG CTG CA-3, Il-

1 p r o b e 5-CTG TG TAATG AAAG ACGG CACACCCACC -3;Tnf f orward

5-CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA-3 , Tnf r e ve r se 5-GGGAGTA-

G A C A A G G T A C A A C C C - 3, Tn f p ro b e 5- C A C G T C G T A G C A A A -

CCACCAAG TG A-3. A T a qM a n 1 8 S R i bo s om a l R N A p r im er a n d p r o b e

s e t ( l a b el e d w i th V I C u o r e sc e n t d y e ; A pp l i e d B i o s ys t e ms , F o s t er C i t y ,

C A , U S A) w a s u s ed a s t h e c o nt r ol g e ne f o r r e la t iv e q u an t ic ation. Mac-

1 andBcl-2 p r e m a d e p r i m e r p r o b e k i t s w e r e p u r c h a s e d f r o m A p p l i e dBiosystems. Amplic a t i o n w a s p e r f o r m e d o n a n A B I 7 0 0 0 S e q u e n c i n g

D e t e ct i o n S y s t e m b y u s i ng T a q ma n U n i v e r sa l P C R M a s te r M i x . T h e

u n iv e rs a l t w o- st e p R T -P C R c y cl i ng c o nd i ti o ns u s ed w e re : 5 0 C f o r

2 m i n , 9 5 C f o r 1 0 m i n , f o l l o w e d b y 4 0 c y c l e s o f 9 5 C f o r 1 5 s a n d

6 0 C f o r 1 m i n . R e l a t i v e g e n e e x p r e s s i o n o f i n d i v i d u a l s a m p l e s r u n i n

d u p l ic a t e w a s c a l cu l a t ed b y c o m pa r i so n t o a r e l at i v e s t a n d a r d c u r v e

a n d t h e n e x p r e s s e d r e l a t i v e t o t h e r i b o s o m a l R N A s u b u n i t 1 8 s .

Radioimmunoassay procedures

T h e b l o o d s a m p l e s w e r e c o l l e c t e d i n t o h e p a r i n i z e d m i c r o c a p i l l a r y

t ub es a nd t he n k ep t o n i ce u nt il t he y w er e s pu n f or 3 0 m in a t

3 5 00 r p m. T h e r e su l ta n t s u pe r na t an t w a s r e mo v ed a n d s t or e d a t

8 0 C. A ll b lo od s am pl es w er e a ss ay ed f or t ot al c ir cu la ti ngc or ti co st er on e, i n a s in gl e a ss ay , u si ng a d ou bl e a nt ib od y I125

r a d i oi m m un o a ss a y ( M P B i o me d i ca l s I r v i n e , C A , U S A ). T h e a s s a y w a s

c o n d uc t e d f o l l o w i ng t h e g u i d el i n es s e t b y t h e m a n uf a c tu r e r. T h e se

k i t s a r e h i g h ly s p e cic a n d c r o s s r e a c t i v i t y w i t h o t h e r s t e r o i d s i s l e s s

t h an 1 % . I n tr a -a s sa y v a ri a nc e w a s l e ss t h an 1 0 % a n d t h e m i ni m um

d e t e c t i o n l i m i t w a s 5 n g / m l .

Luzindole manipulation

I n o r d e r t o d e t er m i ne w h e t he r e n d og e n o us m e l a to n i n m e d i a t ed

t h e n e u r o p r o t e c t i v e p h e n o t y p e a s s o c i a t e d w i t h t h e L i g h tD a r k a n d

M i d -D a r k g r o u p s ( b o t h n o r m o - a n d h y p o th e r mi c ) w e t r e at e d m i c e

w i t h t h e m e l at o n in r e c e pt o r a n t a go n i st l u z i n do l e ( 3 0 m g /k g i n 0 . 1 m l

o f 4 % e t ha n ol / sa l in e ; I P ) o r i t s v e h i cl e ( 0 .1 m l E t OH s a li n e) 3 0 m i n

p ri or t o c ar di ac a rr es t. T hi s d os e w as u se d b ec au se i t h as b ee n

p r e v io u s ly s h o wn t o b l o c k i m m u n o lo g i ca l r e s po n s es t o e x o ge n o us

m e la t on in i n h o us e m i ce (D r az e n e t a l ., 2 0 01) . A n im a ls w e re t h en

p r o c es s ed f o r b e h av i o r al a n d h i s t ol o g i ca l r e s po n s es t o i s c he m i a a s

desc ribed above.

Data analyses

A l l a n a l ys e s w e r er s t c o n d u c t e d a s a 2 3 A N O V A f o r t i m e p o i n t

( M id - L ig h t , L i g htD a rk a nd M id - Da rk ) a n d h ea d t e mp er at u re

(normothermic versus hypothermic ). Preplanned c omparisons were

c o n d u c t e d w i t h i n e a c h h e a d t e m p e r a t u r e b e t w e e n t i m e p o i n t s . A t n o

p o in t d i d h y po t he rm i c a n i m al s d i ff e r a c r o ss t i me p o in t s a n d s o f u rt h er

a n al y se s w e re c o nd u ct e d a s a f o ur l e ve l o n e- w ay A NO V As ( g ro u p)

w it h t he t hr ee n or mo t he rm ic t im e p oi nt s a nd a ll h yp ot he rm ica n im a ls . H e ad a n d b o dy t e mp e ra t ur e a r te r ia l b l oo d p r es s ur e , a n d

l o co m ot o r a c ti v it y w e re a l l a n al y ze d w i th r e pe a te d m e as u re s

a na ly se s. I f a s ig nic a n t F s co r e w a s d e te c te d , t h en m u lt i pl e

c o m p ar i s on s w e r e c o n d u c te d w i t h T u k e y ' s H S D t e s t s. M e a n d i f f e r-

e n c es w e r e c o n si d e re d s t a t is t i ca l l y s i g nic a n t i f p0.05.

Results

N o r mo t h er m i c c a r d ia c a r r es t s u r g ic a l p a r a me t e rs w e r e s i m il a r

r e ga r dl e ss o f t h e t i me - of - da y a t w h ic h t h ey o c cu r re d ( s ee Supple-

m e n t a r y F i g . 1).

Survival

T he t im e o f d ay i n w hi ch c ar di ac a rr es t o cc ur re d s ig nic antly

a l t e r e d 7 - d a y s u r v i v a l ( s e e F i g . 1) . E i g h t y - f o u r p e r c e n t o f m i c e i n t h e

354 Z.M. Weil et al. / Neurobiology of Disease 36 (2009) 352360

8/13/2019 Weil et al NoD 2009

4/9


h y po t he rm i c g r ou p s s u rv i ve d C A /C P R. A m on g t h e n o rm o th e rm ic

g r ou p s, m i ce i n t h e L i g h tD a rk a n d M i d- D ar k g r ou p s s u rv i ve d a t

7 6. 9% a nd 7 5% , r es pe ct iv el y. I n c on tr as t, o nl y 3 3% o f m ic e t ha t

u n de r we n t C A /C P R d u ri ng t h e l ig h t p e ri o d ( M id - Li g ht g r ou p )

s u rv i ve d t o d a y 7 p o st - re p er f us i on . T hu s , t i mi n g o f C A /C P R s i gn i-

c a n t ly a l t er e d s u r vi v a l ( K a p la nM e i er S u r v iv a l A n a l ys i s ;2 = 1 0 . 1 9 .

P os t- ho c a na ly se s i nd ic at e t ha t t hi s e ff ec t i s m ed ia te d b y t he

r e d u ct i o n i n s u r vi v a l i n t h e M i d - L i gh t g r o u p (pb0.05).

Behavioral outcomes

C a r d ia c a r r es t - i nd u c ed h y p er a c t iv i t y w a s o b s e rv e d o n l y i n m i c e

t h a t u n d e rw e n t c e r e b r al i s c he m i a d u r i n g t h e M i d -L i g ht p e r i od . P o s t -

i s ch e mi c h y pe r ac t iv i ty h a s b e en p o si t iv e ly c o rr e la t ed w i th C A 1

n e u ro n a l l o s s a n d i m p a i r s s p a t i a l m e m o r y b y b l o ck i n g f o r m a t io n o f

c o g ni t i v e m a p s (W a n g a n d C o r b e t t , 1 9 9 0 ) t h a t i s i n c re a s ed e x p lo r a -

t io n m ay r ep re se nt a n i na bi li ty t o r em em be r w ha t h ad b ee n

p r e v io u s ly i n v e st i g a te d . R e p e at e d m e a su r e s a n a l ys i s d i d n o t d e t e ct

a n o v e r a l l e f f e c t o f c a r d i a c a r r e s t o n t o t a l l o c o m o t o r a c t i v i t y (F1, 24 =

0.119,pN0 . 0 5 ; s e e F ig . 2) . H o we v er , t h er e w a s a s i gn ic a n t i n t e ra c t i on

b e tw e en c a rd i ac a r re st a n d g r ou p (F3, 24 = 6 . 1 7 , pb0 . 01 ) t h at w a s

m e di a te d b y a s i gn ic a nt i n cr e as e i n t o ta l l o co m ot o r a c ti v it y i n t h e

M id - Li gh t g ro u p f ol l ow in g c a rd i ac a rr es t (pb0 . 0 5 ) . C o n v e r s el y ,

c e nt r a l t e n d e nc y i n t h e o p e n e ld w as r ed u ce d b y c ar di a c a r re st

(F1, 23 = 1 4 4 . 4 2 , p b0 . 0 0 0 1 ; d a t a n o t s h o w n ) , b u t w a s n o t a l t e r e d b y

s u rg i ca l t i m e o f d a y (pN 0 . 05 ) . A v oi d a nc e o f t h e c e n t e r o f a n o p e neld

c h a mb e r c a n b e c o n si d e re d i n d ic a t iv e o f a n a n x ie t y -l i k e s t a t e a s m o re

a n xi ou s r o de nt s t en d t o p re f er t h e a r e as c lo s e t o t he o u te r w a ll s o f a n

u n f a m i li a r s p a c e ( C r a w l e y , 2 0 0 0) . T h e r e f o r e i t a p p e a r s t h a t n o r m o -

t h er m ic C A /C P R i n du c es a n a n xi e ty - l ik e s t at e i n de p en d en t o f

s u r g i c a l t i m i n g .

Histology

T he re w e re e s se nt i al ly n o d a ma g ed n eu r on s i n m i ce t ha t

u n de r we n t h y po t he r mi c C A /C P R, r e ga r dl e ss o f t i me - of - da y . I nc o n t ra s t , m i c e t h a t u n d er w e nt n o r mo t h er m i c c a r d i a c a r r es t d u r i ng

t h e M i d -L i g ht p e r io d e x h ib i t e d g r e a t e r h i p p o c a mp a l d a m a ge t h a n a l l

o t he r g r ou p s. C e ll d e at h d a ta a r e p r es e nt e d i n F i g. 3. N ormothermic

c a r d ia c a r r e st - i n du c e d h i p po c a m pa l n e u r on d a m a ge a s i n d i ca t e d b y

F l uo r o J a de s t ai n in g (F i gs . 3AD ). I n b ot h t he C A1 r eg io n (F3, 39 = 3 . 5 6 ,

pb 0 . 0 5; s e e F i g . 4E ) a n d a c r o ss t h e w h o le h i pp o ca m pu s t h er e w a s a

m ai n e f fe ct o f g r o up o n F J + c el ls (F3, 39 = 9 8 . 9 9 ,pb0 . 0 0 01 ; s e e F ig . 3 F ).

I n b o t h t h e e n t i re h i p p oc a m pu s a n d C A 1 r e g i o n s, t h e s e e f f e ct s w e r e

m e d i a t e d b y g r e a t e r d a m a g e t o t h e M i d - L i g h t a n i m a l s t h a n a n y o t h e r

g r ou p (pb0 . 0 5 i n a l l c a s es ) . I n t e re s t in g l y, M i d -d a r k m i c e w e r e t h e o n l y

g r o u p w i t h s t a t is t i ca l l y s i g nic a nt n u mb e rs o f d e ad F J + n e u r on s i n t h e

d e n t a t e h i l u s (pb0 . 0 5 ) . H o w e v e r , i n f o u r o t h e r r e g i o n s , ( t h e C A 2 a n d

C A 3 s u be l d s , d e n t a t e g y r u s a n d s u b i c u l u m ) o n l y M i d - l i g h t m i c e h a d

g r ea t er n u mb e rs F J + n e ur o ns t h an d i d h y po t he rm i c c o nt r ol s . T hee a r ly p o s t -i s c he m i c m R N A e x p r e s si o n o f t h e a n t i -a p o p t ot i c p r o t ei n

B C L - 2 w a s a l s o d e c r e a s e d i n m i c e t h a t u n d e r w e n t C A / C P R d u r i n g t h e

m i d d l e o f t h e l i g h t p e r i o d (F3, 22 = 4 . 3 2 ,pb0 . 0 5 s e e F i g . 3 H).

Inammatory responses

A s e pa r at e c o ho r t o f a n im a ls u n de r we n t c a r d ia c a r re st a s d e sc ri b ed

a b ov e , b u t w e re e u th a ni z ed 2 4 h f o ll o wi n g c a r d ia c a r re st f o r t h e

a s s es s m en t o f e a r ly g e n e e x p r e s si o n c h a ng e s . R e a l - t i m e P C R a n a l ys i s

o f t h e m R N A e n c o d i n g t h e p r o i nammatory c ytokines interleukin-1

(IL-1) i n di c at e d t h at t h e f o ur g r ou p s e x hi b it e d d i ff e re n ti a l Il-1

m R N A e x p r e s si o n (F3, 26 = 1 0 . 3 0 ,p b0 . 0 0 01 ; s e e F i g. 4A ) . T h i s e f f ec t

w a s m e d i a t e d b y e l e v a t e d e x p r e s s i o n i n t h e h i p p o c a m p i o f m i c e t h a t

u n de rw e nt n o rm o th e rm ic C A /C P R d u ri n g t h e M id - li g ht p e ri o d

(pb0 . 05 i n a l l c a se s ). N o o t he r n o rm o th e rm ic g r ou p d i ff er e d f r om

hypothermic in Il-1 gene expression. Tnf e x p r e s si o n a l s o d i f f er e d

a c r o ss g r o u ps (F3, 22 = 4 . 0 1 ,p b0 . 0 5 ; s e e F i g . 4B ) . T h e n o r m ot h e rm i c

M i d - l i g h t m i c e w e r e t h e o n l y g r o u p t h a t h a d g r e a t e r Tnf expression

t h an h y po t he rm i c m i ce , a l th o ug h t h er e w e re n o s i gn ic a n t d i f fe r -

e n ce s a m on g t h e n o rm o t he r mi c a n im a ls . I m po r ta n t ly , n o o t he r

n o r mo t h e rm i c g r o u p e x h ib i t e d s i g n ic a nt l y e l ev a te d ( r el a ti v e t o

h y p o th e r mi c a n i m al s ) c y t o ki n e g e n e e x p re s s io n (pN0 . 0 5 i n a l l c a s e s ) .

M i c ro g l i al d a t a a r e s u m ma r i ze d i n F i gs . 4CG . T h er e w a s a n o v er a ll

m ai n e ff ec t o f g ro u p o n m ic r og l ia l a ct i va t io n i n t he i sc he mi a-

v u l n er a b le C A 1 r e g i o n , a s a s s es s e d b y t h e p r o p o r t io n a l a r e a o f M A C -

1 s t a i n i n g (F3, 20 = 7 . 2 3 ,pb0 . 0 1 ) . T h i s e f f e c t p r i m a r i l y r ee c t s a l a r g e

i n c r e a s e i n m i c r o g l i a l a c t i v a t i o n i n M i d - l i g h t m i c e r e l a t i v e t o a l l o t h e r

g r o u p s (pb0 . 0 5 i n a l l c a s e s ; s u m m a r i z e d i n 4 g ) . N o o t h e r n o r m o t h e r -

m i c g r ou p w a s s i gn ic a n t ly d i f fe r e nt f r o m h y p o th e r mi c m i c e (pN0.05i n a l l c a s es ) . I n t h e C A 2 , d e n ta t e g y r u s , a n d o v e r ly i n g p a r i e t al c o r t ex

t h er e w a s s i gn ic a n t m i c ro g l i al a c t i va t i o n ( r e la t i v e t o h y p o th e r mi c

m ic e) o nl y i n t he m id -l ig ht g ro up . I mp or ta nt ly , t he re w as n o

statistic ally signic a nt m i cr o gl i al a c ti v at i on i n a n y b r ai n r e gi o n o f

m i c e t h a t u n d e rw e n t n o r m o t he r m ic C A / C PR d u r i ng t h e L i g htDark

t r a n si t i o n o r i n t h e M i d -D a r k w h e n c o m pa r e d t o h y p o th e r mi c a n i ma l s .

W e a l s o c o nr m e d h i s t o l o g i c a l e v i d e n c e o f m i c r o g l i a l a c t i v a t i o n w i t h

r t - P CR ; a n i ma l s t h a t u n d er w e nt c a r di a c a r r es t d u r i ng t h e M i d -L i g ht

p e r i o d h a d s i g n ic antly greaterMac-1 gene expression (immunohis-

t o c h em i c al a n t i ge n u s e d t o d e t e ct m i c ro g l i a) 2 4 h f o l l ow i n g c a r d i ac

a r r e s t r e l a t i v e t o a l l o t h e r g r o u p s (F3,22 = 6 . 2 1 ,pb0 . 0 1 ; s e e F i g . 4 H).

Glucocorticoids

B a s a l g l u c o c o r t i c o i d s c o n c e n t r a t i o n s w e r e a l t e r e d b y t h e p h a s e o f

s a m p li n g (F2, 27 = 1 3 . 2 0 , pb0 . 0 0 01 ; s e e F ig . 5A ) , a n e f fe c t t h a t w a s

Fig. 1. Time -o f-day de te rmine s cardiac arre st surv iv al. Cardiac arre st re duce d surv iv al

i n n o r mo t h er m i c m i c e t h a t u n d er w e nt C A / CP R d u r i ng t h e M i d -L i g h t p e r i o d . E i g ht y -

f o ur p er c en t o f m i ce i n t h e h y po t he rm i c g ro u ps s u rv i ve d C A /C P R. A m on g t h e

n o r mo t h er m i c g r o u p s , m i c e i n t h e L i g h tD a r k t r a n s i t io n g r o up a n d t h e M i d - D a rk

g r ou p s u rv i ve d a t 7 6 .9 % a n d 7 5 % , r es p ec t iv el y . I n c o nt r as t , o nl y 3 3 % o f m i ce t h at

u n d er w e nt C A / CP R d u r i ng t h e l i g h t p e r i od ( M i d -L i g h t g r o u p ) s u r v i v ed t o d a y 7 p o s t -

r e pe r fu s io n. T h us , t i mi n g o f C A /C P R s i gn ic a n tl y a l t e re d s u r v iv a l ( K a p la nM e ie r

S urv iv al Analy sis;2 = 1 0 . 1 9 ,pb0.05). S ig nic a n t l y d i f f e r e n t f r o m a l l o t h e r g r o u p s a t

pb0.05.

Fig. 2. Time -of-day de te rmine s the be hav io ral co nse que nce s o f cardiac arre st. Cardiaca r r es t - i nd u c ed b e h av i o ra l h y p er a c ti v i t y w a s o b s er v e d o n l y i n m i c e t h a t u n d er w e nt

c e r eb r a l i s c h em i a d u r i ng t h e M i d -L i g ht p e r io d . M i d -L i g h t d i f f er s f r o m a l l o t h er g r o up s

po st-CA/ CP R (pb0 . 0 5 ; d a t a a r e p r e s e n t e d a s m e a n S E M ) . n =610/ g ro up.


8/13/2019 Weil et al NoD 2009

5/9


m e d i at e d b y i n c re a s ed c i r cu l a t in g c o r t ic o s te r o ne w h e n m i c e w e r e

s a mp l ed d u ri n g t h e L i gh tD a rk t r an s it i on (pb0.05, F ig . 5A). As e pa r at e s u bs e t o f m i ce u n de r we n t c a rd i ac a r re s t a n d w e re e u th a -

n iz ed 2 4 h p os t- re pe rf us io n, b ut i n t he s am e t im e- of -d ay a s t he

s u rg e ry h a d o c cu r re d; g r ou p s d i ff e re d s i gn ic a n t ly i n c i r cu l a t in g

c o rt i co s te r on e a t t h is t i me p o in t (F3, 22 = 1 1 . 3 2 ,pb0 . 0 0 01 ; s e e F ig . 5B)

a s b o th M i d- L ig h t a n d L i gh tD a r k g r o u p s h a d e l e va t e d g l u c oc o r t i-

c o id s r e la t iv e t o h y po t he r mi c m ic e (pN0 . 05 i n b o th c a se s ). C i rc u la t in g

c o r t ic o s te r o ne i n t h e e a r l y p o r t i o n o f t h e i n a c t i v e ( l i g h t s o n ) p e r io d

s e v e n d a y s a f t e r c a r d i a c a r r e s t d i d n o t d i f f e r a m o n g g r o u p s (pN0.05;

see F i g . 5C).

Melatonin manipulation

T h is e xp e ri m en t r e pl i ca t ed t h e m a in t i me - of -d a y n d in g s o f

t h e i n it i al e x pe r im e nt a n d r e ve a le d n o e v id e nt r o le f o r m el a to n inr e ce p to r s i n m e di a ti n g t h e t i me - of - da y d i ff e re n ce s i n i s ch e mi c

o u t c om e . T h e re w e r e n o s t a t is t i c al l y s i g nic ant dif f erenc es observed

a mo ng t he h yp ot he rm ic g ro up s e it h er b y t im e- of -d ay o r d ru g

t r ea t me nt s a nd s o t he y w er e c ol la ps ed f or f ur th er a na ly se s.N o rm o th e rm i c c a rd i ac a r re s t d i d n o t s i gn ic a n tl y a l t e r l o c om o t o r

b e ha v io r (F1 , 1 3 = 1 . 5 7 5 , pN0 . 05 ; s e e F ig . 6A ) a cr os s a ll a ni ma ls

h ow ev er t he re w as a n i nc re as e i n t ot al l oc om ot or a ct iv it y i n

m ic e t ha t u nd er we nt C A/ CP R d ur in g t he m id dl e o f t he l ig ht

(F1 , 1 3 = 5 . 6 2 3 , pb0 .0 5) . T he re w as n o e ff ec t o f d ru g t re at me nt

(F1, 13 = 0 . 1 9 , p N0 . 05 ) o r a n i n te r ac t io n w i th b e tw e en t h e d r u g a n d

t i m e o f d a y . R e g a r d le s s o f d r u g t r e a t m en t , c a r d i a c a r r e s t r e s u l te d i n

signic a n t l y m o r e F J + n e u r o n s i n t h e C A 1 (F1,17 = 5 . 2 5 ,pb 0 . 0 5 ) a n d

a c ro s s t h e w h ol e h i pp o ca m pu s (F1,17 = 5 . 9 6 , pb 0 . 05 ; s e e F ig . 6B)

w h e n i n d u c e d a m o n g t h e n o r m o t h e r m i c a n i m a l s i n t h e m i d d l e o f t h e

l i gh t p e ri o d c o mp a re d t o t h e m i dd l e o f t h e d a rk p e ri o d. L i ke w is e ,

m i c ro g l ia l r e s po n s es t o c a r di a c a r r e s t i n t h e C A 1 w e r e e n h a n ce d b y

s u rg e ry d u ri n g t h e l i gh t c o mp a re d t o t h e d a r k p e ri o d (F1, 17 = 9 . 6 9 ,

pb0 . 0 1 ; F ig . 6C ) a nd t he re w as n o e ff ec t o f d ru g t re at me nt(F1 , 1 7 = 0 . 1 4 , pN0 .0 5) o r a n i nt er ac ti on b et we en t im e o f d ay a nd

drug treatment.

Fig. 3. Time -o f-day de te rmine s that ce ll de ath re spo nse s to ische mia. Re pre se ntativ e se ctio ns o f F luo ro Jade C (de g e ne rating ne uro ns; g re e n) and DAP I (nucle ar co unte rstain; blue )

s t a i ne d t i s s u e f r o m t h e C A 1 r e g io n o f m i c e t h a t u n d e r w en t h y p ot h e rm i c C A / C P R ( A ) o r n o r m o t he r m ic C A / C PR d u r i ng t h e M i d - L i gh t ( B ) , L i g h tD a r k t r a n s i t io n ( C ) , o r M i d -D a r k

p e r i o d ( D ) . Q u a n t ic a t i on o f F l u o r o J a d e p o s i ti v e n e u r o ns i n t h e C A 1e l d ( E ) a n d a c r o s s t h e w h o l e h i p p o ca m p u s ( F ) . T a b l e o f m e a n ( S E M ) f o r F l u o r o J a d e p o s i t i ve n e u r o n s i n

s e l e ct e d r e g io n s ( G ) . H i p p oc a m pa l bcl-2 g en e e x p r es s io n r e l a ti v e t o 1 8 s r R N A g e n e e x p re s si o n a t 2 4 h p o st - CA /C P R ( H ) . S c a l e b a r = 1 0 0 m . C AC o r nu A m m on i s , D . G . d e n t a t e g y r u s ,

S ub. subiculum. indicate s sig nic a n tl y d i f f er e n t f r o m a l l o t h er g r o u p s a tpb0 . 0 5 ; # i n d i ca t e s s i g n icantly diffe re nt fro m hy po the rmic mice atpb 0.05. n =711/ g ro up fo r histo lo g y

a nd 41 0 / gr o u p f o r P C R & i n d i ca t e s s i gn ic a n tl y d i f f er e n t f r o m a l l o t h er n o r mo t h er m i c g r o up s .


8/13/2019 Weil et al NoD 2009

6/9


Discussion

I s ch e mi c o u tc o me s v a ry a c co r di n g t o t h e t i m e o f d a y w h en t h e

i n ju r y o c cu r re d . I n o u r s t ud y , m i ce t h at u n de r we n t C A /C P R d u ri n g t h e

m i dd l e o f t h e l i g h t p e r io d s u rv i ve d a t a s i gn ic a n t ly l o w er r a t e , a n d

t h os e t h at s u rv i ve d d i sp l ay e d d e cr e as e d Bcl-2 m R N A e x p re s s io n ,

e l e va t e d m i c ro g l ia l a c t i va t i on , i n c re a s ed p r o i na m m at o r y c y t o ki n e

g e ne e x pr e ss i on , m o re d e ge n er a t in g h i pp o ca m p al n e ur o ns , a n d

b e h av i o r al a b n o rm a l it i e s, r e l a ti v e t o m i c e t h a t e x p er i e nc e d c a r di a c

a r r e s t a t o t h e r t i m e s o f t h e d a y . O n e p a r t i c u l a r l y s a l i e n t r e s u l t o f t h i s

s t u d y i s t h a t a d i f f e r e n c e o f o n l y a f e w h o u r s i n t h e o n s e t o f c e r e b r a l

i s c he m i a d r a m at i c al l y a f f e ct s t h e p a t h op h y si o l o gi c a l p r o c es s e s t h a t

e v o l ve f o r s e v er a l d a y s a f t er s u c ce s s fu l r e s us c i t at i o n . A l t h o u g h t h er s t s i g n s o f n e ur o na l d e at h a r e d e l a ye d m a ny h o ur s o r d a ys a f te r

c a r d ia c a r r e s t , t h e t e m p or a l w i n d o w i n w h i ch t h e o u t c o m e t r a j e c t o-

r i e s a r e e s t a b l i s h e d i s r e l a t i v e l y n a r r o w ( K i r i n o e t a l . , 1 9 8 4 ; P u l s i n e l l i ,

1985) . T hi s i s i ll us tr at ed b y t he r ed uc ed e xp re ss io n o f t he a nt i-

apoptotic bcl-2 g en e a t 2 4 - ho u r s p o s t r e p er f u si o n , w h i c h o c c u rr e d

s e ve r al d a ys b e fo r e h i st o lo g ic a l e v id e nc e o f n e ur o n l o ss . B C L- 2 i s

e xp re ss ed a t v er y l ow l ev el s i n h ea lt hy a du lt b ra in s, b ut i s u p-

r e gu l at e d f o ll o w in g n e ur o na l i n ju r y, u l ti m at e ly s e rv i ng a s a n

e n d o ge n o us n e u ro p r ot e c t an t ( B e rg e ro n a n d Y u an , 1 9 98) . W h e re a s

bcl-2 o v e r -e x p re s s io n p r o t ec t s a g a i ns t n e u ro n a l l o s s a f t e r i s c he m i a

(K it ag aw a e t a l. , 1 99 8; M ar ti no u e t a l. , 1 99 4; Z ha o e t a l. , 2 00 3) a

d e c re a s e i n bcl-2 e x p re s s io n i s a s s o ci a t e d w i t h i n c re a s e d n e u ro n a l

d e at h (C h en e t a l ., 2 0 00 ; D e Vr i es e t a l ., 2 0 01) . T h us , r e du c ed p o st -

isc hemic hippoc ampalBcl-2 g e n e e x p r e s s i o n a m o n g m i c e i n t h e M i d -

L i g h t g r o u p m a y h a v e p r e d i s p o s e d t h e m t o i n c r e a s e d n e u r o n a l d e a t h .I n c om mo n w it h h um an s, m ic e e xh ib it d ai ly u c tu a t io n i n

s u s c e p t i b i l i t y t o C A . P r e v i o u s s t u d i e s h a v e p r o v i d e d i n d i r e c t e v i d e n c e

Fig. 4. Time -o f-day de te rmine s inammato ry re spo nse s to cardiac arre st. P ro inammato ry cy to kine g e ne e xpre ssio n was po te ntiate d by CA/ CP R during the M id-Lig ht. (A) Il-1and

(B) Tnf m R N A g en e e x pr es s i on r e la t iv e t o 1 8 s r R NA . M i cr o gl i al a c ti v at i on w a s a l so p o te n ti a te d i n m i ce t h at u n de r we nt i s ch e mi a d u ri n g t h e m i d d le o f t h e l i gh t p e ri o d.

Re pre se ntative se ctio ns o f M AC-1 staine d se ctio ns thro ug h the CA1 e l d o f t h e h i p po c a mp u s i n m i c e t h a t u n d er w e nt h y p o t he r m i c C A / CP R ( C ) o r n o r mo t h er m i c C A / C PR i n t h e M i d -

L i g ht ( D ) , L i g h tD a r k T r a n s i ti o n ( E ) o r i n t h e M i d - D ar k ( F ) . T a b l e o f p r o po r t i on a l a r e a s o f m i c r og l i a l a c t i v at i o n a c r o s s t h e h i p p oc a m pu s a n d a s s o c i a te d r e g i o n s ( G ) . ( H ) M A C - 1

p r o po r t i on a l a r ea i n t h e C A 1 e l d . ( I ) I m m un o h is t o ch e m ic a l e v i de n c e o f i n c r ea s e d m i c ro g l i al a c t i va t i on w a s c o nr m ed w i th M A C- 1 r a t- P CR 2 4 h p o st - CA / CP R . D a t a a r e p r es e nt ed a s

t h e m e a n S E M . sig nic a n t ly d i f f er e n t f r o m a l l o t h er g r o up s (pb0 . 0 5 ) ; # s i g n ic a n tl y d i f f er e n t f r o m h y p ot h e rm i c m i c e (pb0 . 0 5 ) ; c s i g n ic a n tl y d i f f er e n t f r o m m i d - da r k m i c e

(pb0 . 0 5 ); d s i g n icantly diffe re nt fro m Lig htD a r k m i c e (pb0 . 0 5 ). S c a l e b a r = 1 0 0m . C AC o r nu A m m on i s , D . G . d e n ta t e g y r u s , S u b . s u b i c u l u m, C T X , p o s t e r i or p a r i et a l c o r te x

n =7

1 1 / gr o u p f o r h i s t ol o g y a n d 4

10/ g ro up fo r P CR.


8/13/2019 Weil et al NoD 2009

7/9


f o r d a i l y u c t u at i o ns o f i s c he m i c s e n s i t iv i t y a s i n d i ca t e d b y d i f fe r e n-

t i a l i n d u c t i on o f c a s p as e p r o t ei n s f o l l o w i ng c a r di a c a r r e s t a c r os s t h e

day (T is ch ka u e t a l. , 2 00 7) a l th o ug h t h ey r e po r te d t h e g r ea t es t

i n di c at i on o f n eu r on a l d a ma g e d u ri n g t h e d a rk p h as e . C o nv e rs e ly ,

s u r v i v a l a n d t h e i n c i d e n c e o f h e m o r r h a g e a f t e r t r a u m a t i c b r a i n i n j u r y

a l so v a ri e d a c r o ss t h e d a y b u t w i th m o re d a ma g e d u r i ng t h e l i g h t

p e r i o d (M a r ti n e z- V a rg a s e t a l . , 2 0 0 6) . I n o u r s t u d y , t h e t i m i n g o f t h e

i n cr e as ed t i ss u e s u sc e pt i bi l it y t o i s ch e mi a i n m i ce ( m id - li g ht ; t h e

m i dd l e o f t h e i n ac t iv e p e ri o d f o r n o ct u rn a l m i ce ) i s d i ff e re n t t h an

t h e p e r i o d d u r i n g w h i c h m o s t C A o c c u r i n h u m a n s ( b e g i n n i n g o f t h e

a c t i ve p e r io d f o r p u t a ti v e ly d i u r na l h u m a ns ) . H o w ev e r , t h e m e t ho d s

f o r d e t er m i ni n g m a x i m a l s u s c e p ti b i li t y i n t h e s e t w o t y p e s o f s t u d ie s

d i ff e r; i n h u m a ns i t i s d i f c u l t t o d i f fe r e nt i a t e b e t w e e n f a c t o r s t h a t

a ff ec t t he i nc id en ce o f C A, s uc h a s u ct ua ti on s i n B P, H R, a nd

s y mp a th et i c t o ne , a n d t h os e t h at m a y a f fe c t t h e s e ve r it y o f C A , s u ch a s

neuroina m m a t i o n . I n c o n t r a s t , t h i s m o u s e s t u d y u s e s a s t a n d a r d i z e dp ro ce du re t o i nd uc e C A, a nd t he n f oc us es o n t he p hy si ol og ic al

p r oc es s es t h at r e su l t. N o ne t he l es s , t h es e m u ri n e d a ta p r ov i de

e v i d en c e t h a t b r a i n t i s su e d i s p la y s u c t u at i o n s i n s u s ce p t i bi l i t y t o

i s ch e mi a a n d t h a t a d i ff e re n ce o f j u st a f e w h o u rs i n o n se t t i me c a n

signic a nt l y a f fe c t m o rt a li t y a n d f u nc t io n al r e co v er y a m on g t h os e

m i c e t h a t s u r v iv e .

I t i s t em pt in g t o s pe cu la te t ha t t he e nh an ce d i nammatory

r e sp o n se s ( m ic r og l i al a c ti v a ti o n a n d c y to k i ne g e n e e x pr e ss i on )

d r i v e t h e t i m e o f d a y v a r i a t i o n i n i s c h e m i c o u t c o m e s . T h e d e l e t e r i o u s

e f f ec t s o f i na m m at o r y r e s p o n se s i n t h e C N S f o l l o w i ng i s c he m i a a r e

w e l l d o c u m e nt e d (S t ol l e t a l ., 1 9 98 ; S t re i t e t a l ., 1 9 88 ; Y r ja n he i kk i

e t a l. , 1 99 8) ( bu t s ee (H a ya s hi e t a l ., 2 0 06) ) a n d M id - Li g ht m i ce

exhibited inc reased proina m m a t o r y c y t o k i n e g e n e e x p r e s s i o n (Il-1

and Tnfa) , g r e at e r m i c ro g l ia l a c t i va t i o n a n d i n c re a s ed c e l lu l a r d a m a ge .T he i nc re as e i n i na mm at or y r es po ns es i n M id -L ig ht m ic e ( or

p o te n ti a ll y t h e d a mp e ni n g o f i na mm at io n a t o th er t im es o f t he

d a y) c o ul d b e t h e p r o x im a te m e di a to r o f p o or e r o u t c om es i n M i d-

L i gh t m i ce . I n a d di t io n , e xp r es si o n o f e a ch g e ne w e e xa m in e d w a s

e q u i v a l e n t a c r o s s t h e h y p o t h e r m i c g r o u p s , t h e r e b y s u g g e s t i n g t h a t i n

t h e a b s e n c e o f n e u ro n a l d a m a g e t i m e - of - d ay d i d n o t i nuenc eIl-1,

Tnf, BCL-2, or Mac-1 e x p re s s io n i n t h e h i p p oc a m pu s ( Supplementary

T a b l e 2).

T h e s e c o n d s t u d y a d d r es s e d w h e t h er m e l at o n i n w a s t h e m e c ha -n i sm t h ro u gh w h ic h t i me o f d a y i nuenc ed neuroina m m a ti o n a n d

n eu r on al d am ag e a ft er C A/ CP R . M el at o ni n i s a n eu ro en do cr in e

t r a n s d u c e r o f t i m e i n f o r m a t i o n a n d a p o t e n t i a l m o d u l a t o r o f i s c h e m i c

o u t c o m e s (Poeggeler, 2005) . B e c au s e m e l a t o ni n i s s e c re t e d f r o m t h e

p i ne a l g l a n d d u r in g t h e d a r k , t h e o n ly g r ou p t h at w o ul d n o t h a v e

p i n e a l m e l a t o n i n i n c i r c u l a t i o n ( a n d i n t h e C S F ) a t t h e t i m e o f C A \ C P R

i s t h e m i d - l i g h t g r o u p . A l t h o u g h m e l a t o n i n h a s l o n g b e e n s t u d i e d f o r

i ts r ol e i n b io lo gi ca l t im in g, i t i s n ow b ec om in g a pp ar en t t ha t

m e la t on in i s a p o te n t a n ti o xi d an t (P o eg g el e r e t a l ., 1 9 93) a nd c an

a c t a s a p r ot e ct i ve f a ct o r a g ai n st i s ch e mi c d a ma g e i n a n u mb er o f

d i f f e r e n t o r g a n s a n d t i s s u e s ( C u z z o c r e a a n d R e i t e r , 2 0 0 1 ; R e i t e r e t a l . ,

2005) . T h e p r o t e c t i v e e f f e c t s o f m e l a t o n i n h a v e b e e n a t t r i b u t e d t o i t s

p o t e nt a n t i ox i d an t p r o p er t i e s t h a t a c t s b o t h v i a r e c ep t o r -d e p en d e nt

m e c ha n i sm s t o u p r eg u l a te g e n e e x p re s s io n o f a n t i ox i d an t e n z ym e sa n d d i re c tl y v i a s c av e ng i ng o f f r ee r a di c al s (A n to l in e t a l ., 1 9 96 ;

Fig. 5. Circulating g luco co rtico ids may no t e xplain time -o f-day diffe re nce s in ische mic

o u t c o m e . S e r u m c o r t i c o s t e r o n e ( A ) 2 4 h p r i o r t o C A / C P R , ( B ) 2 4 h p o s t - r e p e r f u s i o n o r

( C ) s e v e n d a y s p o s t - r e p e r f u s i o n . D a t a a r e p r e s e n t e d a s t h e m e a n S E M . Signicantly

d i f f er e n t f r o m a l l o t h er g r o up s (pb 0 . 0 5 ). # S i gn ic a n tl y d i f f er e n t f r o m h y p ot h e rm i c

m i c e (pb0 . 0 5 ) . + S i g n icantly diffe re nt than Lig htD a r k (pb0.05).n =410/ g ro up.

Fig. 6. M e lato nin re ce pto r antag o nists do no t alte r time -o f-day diffe re nce s in ische mic

o u t c om e . T r e a t me n t w i t h l u z i n d ol e 3 0 m i n p r i o r t o C A / CP R d i d n o t a l t e r t i m e o f d a y

d i f f er e n ce s i n ( A ) p o s t- i s c he m i c h y p e r a ct i v i ty ( B ) , o r t i m e- o f -d a y d i f f er e n ce s i n F J +

c e l l s t h r o u g ho u t t h e h i p p o c a mp u s ( C ) a n d m i c r og l i a l a c t i v a t io n i n t h e C A 1

eld.pN

0.05i n e a ch c o mp a ri s on b e tw e en l u zi n do l e a n d v eh i cl e . D at a a r e p r es e nt ed a s t he

m e a n S E M . F J F luo ro Jade . indicate s sig nic a n tl y d i f f er e n ce s b e t we e n t h e M i d -

L i g h t a n d M i d -d a r k g r ou p s .n =710/ g ro up.


8/13/2019 Weil et al NoD 2009

8/9


B a r l o w - W a l d e n e t a l . , 1 9 9 5 ; R e i t e r e t a l . , 2 0 0 5 ) . I n a d d i t i o n , r e p e a t e d

t r e a t m e n t w i t h h i g h d o s e s o f m e l a t o n i n e n h a n c e s i s c h e m i c i n d u c t i o n

o f B C L- 2 a f te r e x pe r im e nt a l s t ro k e ( S un e t a l. , 2 00 2) . I n t h e C NS , s h o rt -

t e rm t r ea t me n t w i th p h ys i ol o gi c al o r p h ar m ac o lo g ic a l d o se s o f

e xo g en o us m el a to n in r e du c es c el l d ea t h, o x id a ti ve s t re s s, a n d

f u n ct i o n al d ec it s i n b o th f o ca l a n d g l ob a l i s c h em i a m o d e ls ( Kilic

e t a l ., 1 9 99 ; L e te ch i pi a -V a ll e jo e t a l ., 2 0 01 ; M a ne v e t a l ., 1 9 96 ; S u ne t a l. , 2 00 2; S te hl e e t a l. , 2 00 2) . H o we v er , a d mi n is t ra t io n o f t h e

m e l at o n i n r e c e pt o r a n t a g o n is t l u z i n d o le j u s t p r i o r t o i s c he m i a d i d n o t

a f fe ct b e ha v io r al o r h i st o lo g ic a l o u tc o me s. I t s e em s p r ob a bl e t h at

m e l a t o n i n r e c e p t o r a c t i v a t i o n ( p a r t i c u l a r l y M T 1 a s l u z i n d o l e h a s a 1 0

f o ld g r ea t er a f n it y f or M T1 t ha n M T 2) p ri or t o a nd d ur in g t he s ur ge ry

a r e n o t n e c es s a ry f o r t i m e- o f -d a y d i f fe r e nc e s i n i s c he m i c o u t c o m e s.

N e u ro p r o te c t iv e e f f ec t s o f m e l a to n i n t h a t a r e i n d ep e n d en t o f r e c ep t o r

a c ti v at i on h a ve b e en r e po r te d a n d a t tr i bu t ed t o d i re c t f r ee r a di c al

s c a ve n g in g b y m e l at o n i n a n d a s i m il a r p h e n o m e no n c a n n o t b e r u l ed

o ut h er e (C a ze v ie i ll e e t a l ., 1 9 97) . I f e nd o ge no u s p i ne a l m e la t on i n w a s

r e s p o n s i b l e f o r p r o t e c t i o n a g a i n s t i s c h e m i c d a m a g e d u r i n g t h e n i g h t ,

t h an w e w o ul d e x pe c t t h at l u zi n do l e w o ul d e x ac e rb a te i s ch e mi c

o u tc o me s d u ri n g t h e d a rk b u t n o t l i gh t p h as e s. F u tu r e s t ud i es a r e

p l a n ne d t o i n v es t i g at e t h e p h y s io l o g ic a l t r a n sd u c t io n o f t i m e- o f -d a yi n fo r ma t io n a s i t a p pe a rs t o b e i n de p en d en t o f m e la t on in r e ce p to r

s i g na l i n g. O n e s u c h s i g na l i ng m o l e cu l e i s c o r t ic o s te r o ne , a n i m p o rt a n t

m e d i a t o r o f n e u r o n a l d e a t h f o l l o w i n g i s c h e m i a ( D e V ri e s e t a l . , 2 0 0 1 ;

Sapolsky and Pulsinelli, 1985) t h a t d i s p l a y s a w e l l - c h a r a c t e r i z e d d a i l y

r h y t hm . W e h a d h y p o th e s iz e d t h a t d a i l y u c t u at i o n s i n c i r cu l a t in g

g l u co c o r ti c o i ds c o u l d u n d er l i e t i m e- o f -d a y d i f f er e n ce s i n i s c he m i c

o u tc o me s i n o u r s t ud y . C i rc ul a ti n g c o rt i so l c o nc e nt r at i on s a r e

p r e d ic t i v e o f i n f ar c t s i z e a n d m o r ta l i t y f o l l o w i ng m y o c ar d i a l i n f a r c -

t io n ( B ai n e t a l. , 1 99 2; S tu bb s e t a l. , 1 99 9) , i n h um an s, a nd

g l u co c o r ti c o i ds c a n e x a ce r b at e t h e n e u ro n a l i n j u ry f o l lo w i n g g l o b al

a n d f o c a l i s c h e m i a ( D e V r i e s e t a l . , 2 0 0 7 ; D e V r i e s e t a l . , 2 0 0 3 ) a t l e a s t

i n p a rt v i a s u pp r es si o n o f b cl - 2 e xp r es s io n (D e Vr i es e t a l ., 2 0 01).

H o we v er , i t i s u n li k el y t h at p r e- i sc h em ic , i n tr a -i s ch e mi c , o r p o st -

i s ch e mi a g l uc o c or t ic o i d c o n ce n tr a t io n s m e di a te t h e t i me - o f- d a y

e f fe c ts o n i s ch e mi c o u tc o me s i n t h is s t ud y b e ca u se t h er e w a s n o

o b vi o us r e la t io n sh i p b e t we e n c o rt i co s te r o ne c o nc e nt r a ti o n s a n d

e x te n t o f n e ur o na l d e at h . F o r e x am p le , c i rc u la t in g c o rt i co s te r on e

c o n c e n t r a t i o n w a s h i g h e r d u r i n g t h e s u r g i c a l w i n d o w f o r m i c e i n t h e

LightD a rk g r ou p t h an t h e o t he r t w o g r ou p s ( M i d -L i gh t a n d M id -

D a rk ) , b u t t h e L i gh tD a r k a n d M i d -D a r k g r o u p s d i s p la y e d s i m i l a r

l e ve l s o f n e ur o na l d a ma g e a n d n e ur o ina m m at i o n. L i k ew i s e, p r e -

i s c he m i c c o r t ic o s te r o ne c o n ce n t ra t i o ns w e r e s i m il a r f o r t h e M i d -L i g ht

a n d M i d- D ar k g r ou p s, b u t t h ey e x hi b it e d v e ry d i ff e re n t o u tc o me s .

A ls o, c or ti co st er on e c on te nt w as s im il ar a mo ng a ll g ro up s a t

r e p er f u si o n a n d a t 2 4 h p o s t -i s c he m i a. T h u s, c i r cu l a t in g c o r t ic o s te -

r on e d oe s n ot a pp ea r t o m ed ia te t he t im e- of -d ay d if fe re nc es i n

isc hemic outc ome.

T h e ra p e ut i c h y p o th e r mi a i s a p o w e rf u l n e u r op r o t ec t a nt t h a t c a n

p r o t ec t n e u r o n s f r o m i s c h e m i c c e l l d e a t h v i a i n h ib i t i on o f i namma-t o ry r e sp o ns e s, i n du c ti o n o f n eu r op r ot e ct a nt g e ne s a n d g r ow t h

f a c t or s , a n d a s l o wi n g o f o v e r al l c e l lu l a r m e t a b o l is m a n d e x c it o t o xi c

transmission (L i u a n d Y e n a r i , 2 0 0 7) . T h e h y p o t h e r m i a m o d e l u s e d i n

t h i s s t u d y w a s a p p a re n t l y s o p r o f ou n d ly n e u r op r o t ec t i ve t h a t i t w a s

n o t p o s s ib l e t o d e te r mi n e i f t h er e a r e d a i l y r h y t hm s i n t h e e x t en t t o

w h i ch h y p o th e r mi a i s n e u ro p r o t ec t i ve . H o w e ve r , i t s e e ms l i k el y t h a t

t h e e f c a c y o f v a r i o u s n e u r o p r o t e c t a n t s t r a t e g i e s w i l l v a r y a c r o s s t h e

d a y a n d t h e i n t e r a c ti o n b e t w e e n h y p o t h er m i a a n d d a i l y r h y t h ms i n

i s c he m i c v u l n e r a bi l i ty a r e l i k el y t o b e i n s t ru c t i ve .

T h e d i f fe r e nt i a l s u r v i v a l o f a n i ma l s t h a t u n d e r w e nt c a r d ia c a r r es t

a t d i ff er e nt t i me s o f t h e d a y i s l i ke l y m ed i at e d b y g r ea t er n e ur o na l

d a m a ge a s t h i s e f f e ct c a n b e b l o ck e d b y l o w er i n g h e a d t e m p e r a tu r e .

A s t h e a n im a ls w i th t h e m o st i s ch e mi c d a ma g e a r e p r es u ma b ly t h e

o n e s m o s t l i k e l y t o d i e t h e d i f f e r e n c e s i n b e h a v i o r a l a n d p h y s i o l o g i c a lo u t c o m e s b e t w e e n a n i m a l s t h a t u n d e r w e n t c a r d i a c a r r e s t a t d i f f e r e n t

t i m e s o f t h e d a y r e p o r t e d h e r e a r e p o t e n t i a l l y u n d e r e s t i m a t e d .

T o g et h e r , t h e s e d a t a i n d i ca t e t h a t C N S t i s s u e u n d e rg o e s e n d o g e -

nous u c t ua t i o ns i n s u s ce p t i bi l i ty t o i s c he m i a -i n d uc e d i nammation

a n d c e l l d e a t h . A l t h o u g h a s i n g l e s p e c ic mec hanism driving time-of -

d a y d i ff e re n ce s i n i s ch e mi c o u tc o me s w a s n o t i n de n tie d i n t hi s

e x p er i m en t i t s e e ms p r o b ab l e t h a t a n u m b er o f s i g na l i ng p a t h wa y s

b o th c o mm u ni ca t e t i me - of - da y i n fo r ma t io n t o t a rg e t t i ss u es a n d

p a rt i ci p at e i n t h e u c t u at i o n s i n v u l ne r a bi l i t y, f u t u re s t u d ie s w i l lc on ti nu e t o s ea rc h f or t ho se m ed ia to rs . I n a ny c as e, a r ol e f or t he M T- 1

m e la t on i n r e ce p to r h a s b e en r u le d o u t, b u t i t r e ma i ns p o ss i bl e t h at

t h is r h yt hm i n n eu ro na l s us ce pt i bi li t y i s c oo rd i na t ed b y t h e

e n d o ge n o us m e l a to n i n r h y t h m . D a i l y r h y t hm s i n a l m os t a l l p h y s io -

l og ic al p ro ce ss es a re c oo rd in at ed b y t he m as te r c lo ck i n t he

s u p r ac h ia s m a ti c n u c le u s ( S C N) o f t h e h y p o th a l a mu s , w h i ch i n t u r n

i s e nt ra in ed p ri ma ri ly b y p ho ti c c ue s. T he r ol e o f t he S CN i n

d e t e rm i n in g i s c he m i c o u t c o m e h a s n o t p r e v io u s l y b e e n e x a mi n e d.

I n a n y c a s e , i m p r o v e d u n d e r s t a n d i n g o f t h e e n d o g e n o u s r h y t h m s t h a t

inu e nc e s u rv i va l a n d r e co v er y f r om c e re b ra l i s ch e mi a c o ul d h e lp

e x p la i n s o m e o f t h e v a r i a b i li t y i n i s c he m i c o u t c o m e t h a t e x i st s a f t e r

c o n t ro l l i ng f o r t r a d i t i o na l v a r i ab l e s, a n d m a y i n t u r n i d e n t i fy n o v el

t h e r ap e u t ic t a r g et s a n d p r o v id e b a s ic i n s ig h t s i n t o t h e p h y s io l o g ic a l

c onseq uences of daily rhythmic ity.

Acknowledgments

T h e a u t h o r s t h a n k K a t h l e en B r o d er i c k, J o n a t ho n W a d e, S t e ph a n i e

K i dd e r a n d M . S i ma F i ny f o r e x ce l le nt t e ch n ic a l a s si s ta n ce a n d D r s,

H o ll y C h al k , L y nn M a rt i n a n d C a mi l le F o nt a in e, f o r h e lp f ul d i sc u ss i on s

o f t h e d a t a a n d c o m me n t s o n e a r l ie r v e r s i o n s o f t h e m a n u s c ri p t . W e

a l s o t h a n k D r . G e o rg i a B i s h o p f o r t e c hn i c al a s s is t a n ce a n d t h e u s e o f

h e r m i cr o sc o pe . T h is r e se a rc h w a s s u pp o rt e d b y N SF g r an t I B N 0 4 -

1 6 8 97 ( R J N ), N I H g r a n t s M H 5 7 5 35 ( R J N ), N S 4 02 6 7 , a n d H L 0 8 02 4 9

( A C D ), T h e A m e r i ca n H e a r t A s s oc i a ti o n ( E I A a w a r d t o A C D ) a n d T h e

O h io S t at e U n iv e rs i ty P r es i de nt i al F e ll o ws hi p ( Z MW ) . A d di t io n al

s u p p o r t w a s p r o v i d e d b y N I H P 3 0 N S 0 4 5 7 5 8 .

Appendix A. Supplementary data

S u p p le m e nt a r y d a t a a s s oc i a t ed w i t h t h i s a r t i cl e c a n b e f o u n d, i n

t h e o n l i n e v e r s i o n , a t doi:10.1016/j.nbd.2009.07.032.

References

A b e, M . , e t a l ., 2 0 02 . C i rc a di a n r h y t hm s i n i s ol a te d b r ai n r e gi o ns . J . N e ur os c i. 2 2 ,350356.

A n t o l i n , I . , e t a l . , 1 9 9 6 . N e u r o h o r m o n e m e l a t o n i n p r e v e n t s c e l l d a m a g e : e f f e c t o n g e n ee x p re s s i on f o r a n t i o x i da n t e n z y m e s. F A S EB J . 1 0 , 8 8 2890.

B a i n , R . J . , e t a l . , 1 9 9 2 . S e r u m c o r ti s o l l e v el s p r e di c t i n f ar c t s i z e a n d p a t i en t m o r ta l i t y. I n t . J. Cardio l. 37, 145150.

B a r l ow - W al d e n, L . R . , e t a l . , 1 9 9 5 . M e l at o n in s t i m ul a t e s b r a i n g l u t a t h io n e p e r ox i d a s ea c t i v i t y . N e u r o c h e m . I n t . 2 6 , 4 9 7502.

B e c ke r , L . B . , e t a l . , 1 9 9 1 . O u t c o me o f C P R i n a l a r g e m e t r o p ol i t a n a r e aw h er e a r e t h es u r v i v o r s ? A n n . E m e r g . M e d . 2 0 , 3 5 5361.

B e r ge r o n, L . , Y u a n , J . , 1 9 9 8 . S e a l i ng o n e 's f a t e: c o n tr o l o f c e l l d e a t h i n n e u ro n s . C u r r .O p i n . N e u r o b i o l . 8 , 5 563.

C a z e v i e i l l e , C . , e t a l . , 1 9 9 7 . M e l a t o n i n p r o t e c t s p r i m a r y c u l t u r e s o f r a t c o r t i c a l n e u r o n e sfro m NM DA e xcito to xicity and hy po xia/ re o xy ge natio n. Brain Re s. 768, 120124.

C h en , J . , e t a l ., 2 0 00 . S u pp r es s io n o f e n do g en ou s b c l- 2 e x pr e ss i on b y a n ti s en s et r e at m e nt e x a ce r b a te s i s c h em i c n e u ro n a l d e a t h . J . C e r eb . B l o od F l o w M e t a b . 2 0 ,10331039.

C o g ge s h al l , R . E . , L e k a n , H . A . , 1 9 9 6. M e t ho d s f o r d e t e r m in i n g n u m b e rs o f c e l l s a n ds y n a p s e s : a c a s e f o r m o r e u n i f o r m s t a n d a r d s o f r e v i e w . J . C o m p . N e u r o l . 3 6 4 , 615.

C o h en , M . C . , e t a l . , 1 9 9 7 . M e ta - a na l y s i s o f t h e m o r n i ng e x c es s o f a c u t e m y o ca r d i ali n f ar c t i on a n d s u d d e n c a r d i a c d e a t h . A m . J . C a r di o l . 7 9 .

C r aw l ey , J . N. , 2 0 00 . W h at ' s W r on g w i th M y M ou s e? : B eh a vi o ra l P h en ot y pi n g o f T r a ns g e ni c a n d K n o ck o u t M i c e . W i l ey - L i ss , N e w Y o r k .

C u zz o cr e a, S . , R e it e r, R . J. , 2 0 01 . P h ar m ac o lo g ic a l a c ti o n o f m e la t on i n i n s h oc k ,ina m m a t i o n a n d i s c h e m i a / r e p e r f u s i o n i n j u r y . E u r . J . P h a r m a c o l . 4 2 6 , 110.

D e V ri e s , A . C . , e t a l . , 2 0 0 1. S o c ia l s t r es s e x a ce r b a te s s t r o ke o u t co m e b y s u p p re s s i ng B c l - 2e x p re s s i on . P r o c . N a t l . A c a d . S c i . U . S . A . 9 8 , 1 1 8 2 411828.

D e V ri e s , A . C . , e t a l . , 2 0 0 3 . S o c i a l m o d u l a ti o n o f s t r es s r e s po n s es . P h y si o l . B e h a v . 7 9 ,399407.

D e V ri e s , A . C . , e t a l . , 2 0 0 7 . 2 0 0 6 C u r t P . R i c ht e r a w a rd w i n n e r: s o c i a l i nu e n ce s o n s t r e s sre spo nse s and he alth. P sy cho ne uro e ndo crinolo g y 32, 587603.


8/13/2019 Weil et al NoD 2009

9/9


D r az e n, D . L. , e t a l ., 2 0 01 . M el a to n in e n ha n ce m en t o f s p le no c yt e p r ol i fe r at i on i sa t t en u a te d b y l u z i nd o l e, a m e l at o n in r e c ep t o r a n t a g o ni s t . A m . J . P h y si o l . R e g u l .I n t eg r . C o m p . P h ys i o l . 2 8 0 , R 1 4 7 6R1482.

H a y as h i , Y . , e t a l . , 2 0 0 6. T h e i n t r a- a r te r ia l i n j e c t io n o f m i c ro g li a p r ot e c ts h i p po c am p al C A 1ne uro ns ag ainst g lo bal ische mia-induced functio nal dec i t s i n r a t s. N e u ro s c ie n ce1 4 2 , 8 796.

H e r z og , E . D . , 2 0 0 7 . N e u r on s a n d n e t w o rk s i n d a i l y r h y th m s . N a t . R e v ., N e u ro s c i . 8 ,790802.

I s h i ur a , M . , e t a l . , 1 9 9 8. E x p re s s i on o f a g e n e c l u s t e r k a i A B C a s a c i r c a d i a n f e e db a c kp r o ce s s i n C y a no b a ct e r ia . S c i en c e 2 8 1 , 1 5 1 91523. Jastre mski, M ., e t al., 1989. Gluco co rtico id tre atme nt do e s no t impro v e ne uro lo g ical

r e c ov e r y f o l l o w in g c a r d ia c a r r es t . B r a i n R e s u s c i ta t i o n C l i n i c a l T r i a l I S t u dy G r o up . JAM A 262, 34273430.

Jiang , Z .G., No rth, R.A., 1991. M e mbrane pro pe rtie s and sy naptic re spo nse s o f rat striataln e u ro n es i n v i t ro . J . P h y s i o l . ( L o n d on ) 4 4 3 , 5 3 3553.

Kilic, E ., e t al., 1999. P ine ale cto my ag g rav ate s and me lato nin administratio n atte nuate sb r a i n d a m a ge i n f o c a l i s c h em i a . J . C e r eb . B l o o d F l o w M e t ab . 1 9 , 5 1 1516.

K i ri n o, T . , e t a l ., 1 9 84 . D el a ye d n eu r on a l d ea t h i n t he r a t h i pp o ca m pu s f o ll o wi n gtransie nt fo re brain ische mia. Acta Ne uro patho l. 64, 139147.

K i t a ga w a , K . , e t a l . , 1 9 9 8 . A m e l io r a ti o n o f h i p p oc a m pa l n e u ro n a l d a m a g e a f t e r g l o ba li s ch em i a b y n e ur o na l o ve r ex p re s si o n o f B C L- 2 i n t r an s ge ni c m i ce . S t ro k e 2 9 ,26162621.

Koe r , J . , e t a l . , 2 0 0 4. H i s t op a t ho l o gi c a l a n d b e h av i o r al c h a ra c t er i z a ti o n o f a n o ve lm o d el o f c a r d ia c a r r es t a n d c a r d i o p u lm o na r y r e s u sc i t a ti o n i n m i c e. J . N e u ro s c i .M e t h o d s 1 3 6 , 3 344.

K r a u se , G . S . , e t a l . , 1 9 8 6 . I s c h e m ia , r e s us c i t at i o n, a n d r e p e r f us i o n : m e c h a ni s m s o f t i s s u ei n j u r y a n d p r o s p e c t s f o r p r o t e c t i o n . A m . H e a r t J . 1 1 1 , 7 6 8780.

L e t ec h i pi a - V al l e j o, G . , e t a l . , 2 0 0 1 . N e u r o pr o t ec t i v e e f f e ct o f m e l a to n i n o n b r a i n d a m a g ei n d u ce d b y a c u t e g l o b al c e r eb r a l i s c h e mi a i n c a t s . A r c h. M e d . R e s . 3 2 , 1 8 6192.

Liu, L., Ye nari, M ., 2007. The rape utic hy po the rmia: ne uro pro te ctiv e me chanisms. F ro nt.B i o s c i . 1 2 , 8 1 6825.

M a n ev , H . , e t a l . , 1 9 9 6 . I n c re a s ed b r a i n d a m a ge a f t er s t r ok e o r e x c it o t ox i c s e i z u r e s i nme lato nin-dec i e n t r a t s . F A S E B J . 1 0 , 1 5 4 61551.

M a r ti n e z- V a r ga s , M . , e t a l . , 2 0 0 6 . R e c ov e r y a f t e r a t r a um a t i c b r a i n i n j u r y d e p e n d s o nd i u r na l v a r ia t i o ns : e f f ec t o f c y s t a t i n C . N e u ro s c i . L e t t . 4 0 0 , 2 124.

M artino u, J.C., e t al., 1994. Ov e re xpre ssio n o f BCL-2 in transg e nic mice pro te cts ne uro nsfro mnaturally o ccurring ce ll de ath ande xpe rimentalische mia.Ne uron 13, 10171030.

M u l l er , J . E . , e t a l . , 1 9 8 7 . C i r c a d i a n v a r i a ti o n i n t h e f r e q u en c y o f s u d d en c a r d ia c d e a t h .C i r c ul a t i on 7 5 , 1 3 1138.

Ne ig h, G.N., e t al., 2004. Cardiac arre st/ cardio pulmo nary re suscitation increase s anxiety -like be hav io rand de crease sso cial inte raction. J. Ce reb. Blo o dF lo w M e tab. 24, 372382.

O v e rb e r gh , L . , e t a l . , 1 9 9 9 . Q u a nt ic a t i on o f m u r i n e c y t o k i ne m R N As u s i n g r e a l t i m equantitativ e re v e rse transcriptase P CR. Cy to kine 11, 305312.

P a n di - P er u m al , S . R . , e t a l . , 2 0 0 6 . M e l a t o ni n : n a t ur e ' s m o s t v e r s a t i le b i o l og i c a l s i g n a l ?F E B S J . 2 7 3 , 2 8 1 32838.

P e re z-P inzon, M .A., 2007. M e chanisms o f ne uro pro te ctio n during ische mic pre co ndi-t i o ni n g : l e s s o n s f r o m a n o xi c t o l er a n c e. C o m p. B i o c he m . P h y s i o l . A M o l . I n t e g r .P h y s i o l . 1 4 7 , 2 9 1299.

P o e gg e l er , B . , 2 0 0 5 . M e l at o n in , a g i ng , a n d a g e -r e l a te d d i s e as e s : p e r s pe c t iv e s f o rpre v e ntio n, inte rv e ntio n, and the rapy . E ndo crine 27, 201212.

P o e g g e le r, B., e t al., 1993. M e lato nin, hy dro xy l radical-me diate d o xidativ e damag e , anda g i ng : a h y p ot h e si s . J . P i n ea l R e s . 1 4 , 1 5 1168.

P o p ov i c h, P . G . , e t a l . , 1 9 9 7 . C e l l u la r i na m m at o r y r e s p o ns e a f t er s p i n al c o r d i n j u r y i nS prag ueD a w le y a n d L e w is r a t s . J . C o m p . N e u r o l . 3 7 7 , 4 4 3464.

P o r ta l u p pi , F . , L e m me r , B . , 2 0 0 7 . C h r o n ob i o l og y a n d c h r on o t he r a py o f i s c h em i c h e a rtd i s e a s e . A d v . D r u g D e l i v . R e v . 5 9 , 9 5 2965.

P u l s i ne l l i , W . A . , 1 9 8 5 . S e l ec t i v e n e u r on a l v u l ne r a bi l i t y : m o r ph o l og i c a l a n d m o l ec u l a rc h a ra c t er i s t i cs . P r o g. B r a i n R e s . 6 3 , 2 937.

R e i t er , R . J . , e t a l . , 2 0 0 5 . W h e n m e l at o n in g e ts o n y o u r n e r ve s : i t s b e n ec i a l a c t i o n s i ne x p er i m en t a l m o d e l s o f s t r ok e . E x p . B i o l . M e d . ( M a y w oo d ) 2 3 0 , 1 0 4117.Re ppe rt, S .M ., We av er, D.R., 2001. M o le cular analy sis o f mammalian circadian rhythms.

A n n u. R e v . P h y s io l . 6 3 , 6 4 7676.R o c c o, M . B . , e t a l . , 1 9 8 7 . C i r c a d i an v a r ia t i o n o f t r a ns i e n t m y o c a r di a l i s c h em i a i n p a t i en t s

w i t h c o r o n ar y a r t er y d i s e as e . C i r c ul a t i on 7 5 , 3 9 5400.R o i n e, R . O . , e t a l . , 1 9 9 3 . N e u ro p s yc h o l og i c al s e q ue l a e o f c a r d ia c a r r es t . J A M A 2 6 9 ,

237242.S a p ol s k y , R . M . , P u l s i n e ll i , W . A . , 1 9 8 5. G l u c oc o r ti c o i ds p o t en t i at e i s c h em i c i n j ur y t o

ne uro ns: the rape utic implicatio ns. S cie nce 229, 13971400.S c h mu e d , L . C . , H o p k i n s, K . J . , 2 0 0 0 a. F l u or o - Ja d e B : a h i g h a f nity uo re sce nt marke r fo r

t h e l o c a l i z a ti o n o f n e u ro n a l d e g e n er a t i on . B r a i n R e s . 8 7 4 , 1 2 3130.S c h mu e d , L . C . , H o p ki n s , K . J . , 2 0 0 0 b . F l u or o - Ja d e : n o ve l uo ro chro mes fo r de te cting

to xicant-induced ne uro nal de g e ne ratio n. To xico l. P atho l. 28, 9199.S t e hl e , J . H . , e t a l . , 2 0 0 2. O r g an i s a ti o n o f t h e c i r c a d i an s y s t em i n m e l a to n i n- p r ocie nt

C3H and me lato nin-dec i e n t C 5 7 B L m i c e : a c o m p a r a t i v e i n v e s t i g a t i o n . C e l l T i s s u eR e s . 3 0 9 , 1 7 3182.

S t o kk a n , K . A . , e t a l . , 2 0 0 1 . E n t r a i nm e n t o f t h e c i r ca d i a n c l o c k i n t h e l i v e r b y f e ed i n g .S c i e n c e 2 9 1 , 4 9 0493.

S t o l l , G . , e t a l . , 1 9 9 8 . I na m m at i o n a n d g l i a l r e s p o n se s i n i s c h em i c b r a i n l e s i on s . P r o g.N e u r o b i o l . 5 6 , 1 4 9171.

S t r ei t , W . J . , e t a l . , 1 9 8 8. F u n ct i o na l p l a s ti c i t y o f m i c r o g l ia : a r e v ie w . G l i a 1 , 3 0 1307.S t u b b s , P . J . , e t a l . , 1 9 9 9 . C i r c u l a t i n g s t r e s s h o r m o n e a n d i n s u l i n c o n c e n t r a t i o n s i n a c u t e

co ro nary sy ndro me s: ide ntic a t i on o f i n s u li n r e s i st a n ce o n a d m i s s i o n. C l i n . S c i .( L o nd ) 9 6 , 5 8 9595.

S u n , F . Y . , e t a l . , 2 0 0 2 . N e u ro p r ot e c ti o n b y m e l at o n i n a g a i n st i s c h em i c n e u ro n a l i n j u r ya s so c ia t ed w i th m od u la t io n o f D NA d a ma ge a n d r e pa i r i n t h e r a t f ol l ow i ng at r a ns i e n t c e r e br a l i s c h e m i a . J . P i n ea l R e s . 3 3 , 4 856.

T h o m p s o n , D . R . , e t a l . , 1 9 8 5 . T i m e o f o n s e t o f c h e s t p a i n i n a c u t e m y o c a r d i a l i n f a r c t i o n .I n t . J . C a r d i o l . 7 , 1 3 9148.

T i s c hk a u ,

Documents

Weil et al NoD 2009