Zur Bedeutung von Arzneistofftransportern für die Therapie ... · Clarithromycin und Erythromycin nachweisen [15]. Es ist daher möglich, dass die Makrolide Es ist daher möglich,

Zur Bedeutung von Arzneistofftransportern für die Therapie

pulmonaler Infektionen mit Makrolidantibiotika und Rifampicin

bei Fohlen

I n a u g u r a l d i s s e r t a t i o n

zur

Erlangung des akademischen Grades eines

doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)

an der Mathematisch-Naturwissenschaftlichen Fakultät

der

Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald

vorgelegt von

Jette Peters

geboren am 20. November 1982

in Demmin

Greifswald, den 15.08.2011

Dekan: Prof. Dr. K. Fesser

1. Gutachter : Prof. Dr. W. Siegmund

2. Gutachter: Prof. Dr. M. Fromm

Tag des Promotionskolloquiums: 05.12.2011

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung und Aufgabenstellung ..................................................... 4

2 Methoden ............................................................................................ 9

3 Ergebnisse........................................................................................ 12

4 Diskussion ........................................................................................ 16

5 Zusammenfassung .......................................................................... 22

6 Literaturverzeichnis ......................................................................... 25

7 Publikationen ................................................................................... 32

7.1 LC-MS/MS method for the simultaneous determination of

clarithromycin, rifampicin and their main metabolites in horse plasma,

epithelial lining fluid and broncho-alveolar cells (Journal of

Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2011; 55(1):194-201). 33

7.2 Concentration of the macrolide antibiotic tulathromycin in broncho-

alveolar cells is influenced by comedication of rifampicin in foals

(Naunyn Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology

2010;381(2):161-9) 42

7.3 Oral absorption of clarithromycin is nearly abolished by chronic

comedication of rifampicin in foals (Drug Metabolism and Disposition,

accepted for publication June 20th, 2011;

doi:10.1124/dmd.111.039206) 53

7.4 Clarithromycin is absorbed by an intestinal uptake mechanism which

is sensitive to major inhibition by Rifampicin – results of a short-time

drug interaction study in foals (Drug Metabolism and Disposition,

under review) 76

1 Einleitung und Aufgabenstellung

4


Der klinische Erfolg einer Arzneimitteltherapie wird maßgeblich von den

pharmakokinetischen Eigenschaften des Arzneistoffes, sowie von den individuellen

Besonderheiten der Absorption, Verteilung und Elimination des Arzneimittels beeinflusst.

Neben der Arzneistoff-Biotransformation (Metabolismus) waren in den letzten 20 Jahren vor

allem Arzneistofftransporter als Ursache pharmakokinetischer Variabilität Gegenstand

intensiver Forschung. Es konnte überzeugend belegt werden, dass membranale Aufnahme-

und Auswärtstransporter nicht nur von funktioneller Bedeutung für die Pharmakokinetik von

Arzneimitteln sind, sondern dass ihre Funktion auch durch genetische Faktoren,

Arzneimittelwechselwirkungen und krankhafte Prozesse beeinflusst werden kann [1].

Allerdings beschränken sich die bisherigen Forschungen vorwiegend auf die Organe der

Absorption und Elimination (Darm, Leber, Niere) sowie auf einige Gewebe mit

Barrierefunktion (Blut-Hirn-Schranke, Plazenta-Schranke) [2;3].

Weniger umfassend untersucht ist dagegen die Rolle von Transportproteinen bei der

Verteilung an den Ort der Wirkung. Ein Beispiel ist die pulmonale Penetration. Es gibt erste

Hinweise, dass Transportproteine an der Akkumulation von Substanzen (z.B.

Makrolidantibiotika) in der pulmonalen Epithelialflüssigkeit (ELF) sowie in

bronchoalveolären Lavagezellen (BALC, v. a. pulmonale Makrophagen) beteiligt sein

könnten [4]. Jedoch ist der Erkenntnisgewinn limitiert durch die methodischen

Herausforderungen bei derartigen Untersuchungen. Um Messungen in der ELF oder den

BALC durchführen zu können, eignen sich die üblicherweise genutzten experimentellen

Tiermodelle Maus und Ratte nur bedingt.

Bessere methodische Möglichkeiten bieten dagegen Großtiere wie Schweine oder Pferde.

Aufgrund der vorhandenen regionalen strukturellen Voraussetzungen im Umfeld des

Instituts für Pharmakologie in Greifswald, haben wir uns für Untersuchungen an Fohlen

entschieden. Fohlen sind in der Größe mit erwachsenen Menschen vergleichbar und

erlauben mit vorhandenen diagnostischen Verfahren (z.B. Sonographie, Bronchoskopie,

Biopsie, bronchoalveoläre Lavage (BAL)) die Entnahme ausreichend großer Mengen an

Probenmaterial. Pferde sind auch im Hinblick auf die genetische Homologie von

Arzneimitteltransportern aus der Familie der ABC-Transporter (ATP-binding cassette) und

der Familie der OATPs (organic anion transporting polypeptides) dem Menschen näher als

Nager (Übereinstimmung der Proteinsequenz von Pferd und Mensch: ABCB1, 92%;

ABCC2, 82%; OATP1A2, 85%; OATP2B1 89%, Übereinstimmung der Proteinsequenz

zwischen Mensch und Ratte: Abcb1a, 86%; Abcb1b, 79%; Abcc2, 77%; Oatp1a5, 72%;

Oatp2b1, 76, www.ncbi.nih.gov, www.ebi.ac.uk).


5

Zudem besteht für Fohlen ein klinisch relevanter Bedarf an Informationen zur Expression

und Funktion pulmonaler Arzneistofftransporter. Fohlen erkranken in frühen

Lebensabschnitten häufig an einer lebensbedrohlichen abszedierenden Pneumonie [5].

Diese wird ausgelöst durch Rhodococcus equi (R. equi), einem in bronchoalveolären Zellen

intrazellulär persistierenden Keim, der sich der mütterlichen Immunabwehr entzieht und

medikamentös schwer zugängig ist. Seine Eradikation kann nur dann erfolgreich sein, wenn

sich ein geeignetes antiinfektiv wirksames Arzneimittel mit ausreichend hoher Konzentration

in der Umgebung des Keims in der ELF und in den BALC anreichert, um eine schnelle

extrazelluläre und verzögerte intrazelluläre Wirkungen zu erzielen. Arzneimittel mit solchen

Eigenschaften sind Makrolide, von denen bereits bekannt ist, dass sie in den pulmonalen

Kompartimenten kumulieren können [6-8]. So betragen die Konzentrationen von

Clarithromycin in der ELF etwa das 60-fache und in den BALC etwa das 300-fache der

Konzentrationen im Plasma [6]. Auch wenn derartig hohe Konzentrationsgradienten

zwischen BALC und Plasma durch base trapping erklärbar sind, bleibt die Frage offen,

durch welche Transportmechanismen die makrozyklischen Antibiotika vom Blut über die

Zellmembranen in die ELF und weiter in die BALC, ihren eigentlichen Wirkort gelangen.

Nach gegenwärtigem Erkenntnisstand werden auf der apikalen Seite der Zellen des

Bronchialepithels Auswärtstransporter wie ABCB1 und ABCC2 exprimiert [9], die als aktive

Pumpen fungieren und so zur Kumulation der Substrate in der ELF führen können. In den

BALC führen sie hingegen zur Minderung der intrazellulären Konzentration durch den

Auswärtstransport [10-14].

Die Expression von Aufnahmetransportern ist bisher deutlich weniger erforscht und die

zelluläre Lokalisation weitestgehend unbekannt. Daher können hier noch keine Aussagen

zur etwaigen Transportrichtung getroffen werden. Als Aufnahmetransporter können sie an

der basolateralen Seite der Bronchialepithelzellen (BEC) für die Aufnahme von Substraten

aus dem Blut und in den BALC für die Aufnahme aus der ELF in diese Zellen verantwortlich

sein. Abbildung 1 gibt einen Überblick zum Stand des aktuellen Wissens bezüglich der

Expression von Transportproteinen in der Lunge wieder.


6

BMInterstitium

Basalzelle

ABCG2

ABCC3

ABCC1ABCC2,4,5*

ABCC1 *

ABCB1

ABCC1

OCTN1

AlveolarmakrophageOATP2B1†

BronchialepithelzellePEPT1*

ELF

ABCB1

ABCC2* ABCC7

OCT1,2 *

PEPT2

Abb. 1: Expression und Lokalisation von Transportproteinen in den Lungenzellen - modifiziert nach

van der Deen et al. 2005 und Bosquillon 2010 [4;9]; BM, Basalmembran; ELF,

Epithelialflüssigkeit; ABC, ATP-binding cassette; OATP, organic anion transporting

polypeptide; OCT, organic cation transporter; OCTN, organic cation/carnitine transporter;

PEPT, peptide transporter; *widersprüchliche Datenlage zur zellulären Lokalisation;

†zelluläre Verteilung noch unbekannt

Bislang gibt es nur unzureichende Informationen, ob die o.g. Transporter an der pulmonalen

Penetration von Makroliden beteiligt sind.

Makrolide wie Azithromycin und Clarithromycin sind makrozyklische, lipophile Basen (log P

Werte Clarithromycin 3,16, Azithromycin 4,02; pKA-Werte um 8,8), die hauptsächlich zur

Therapie von Atemwegserkrankungen sowohl beim Menschen als auch bei Fohlen

eingesetzt werden. Sie sind Substrate der Auswärtstransporter ABCB1 und ABCC2 [12-14]

und könnten somit durch diese aus dem Blut in die ELF und aus den BALC in die ELF

gepumpt werden. In Bezug auf die Aufnahmetransporter konnten Seithel et al. in einem in

vitro-Experiment an überexprimierenden Zelllinien die Inhibition des Transportes des

etablierten Substrates Bromsulfophthalein (BSP) für OATB1B1 und OATP1B3 durch

Clarithromycin und Erythromycin nachweisen [15]. Es ist daher möglich, dass die Makrolide

selbst auch Substrate dieser Transporter sein könnten und durch diese in die Zellen der

Lunge aufgenommen werden. Somit könnte die Anreicherung von Makroliden in der ELF


7

und den BALC das Ergebnis des Wechselspiels von Aufnahme- und Auswärtstransportern

sein.

Die pharmakokinetische Bedeutung von Transportern in vivo kann durch Interaktionsstudien

mit Induktoren bzw. Inhibitoren untersucht werden. So sind bestimmte Transporter (ABCB1,

ABCC2, OATP1A2) durch chronische Gabe von pregnane X receptor (PXR)-Liganden (z.B.

Rifampicin, Carbamazepin, Johanniskraut) [16-19] induzierbar. In begrenztem Umfang gibt

es auch die Möglichkeit, Transporter selektiv zu inhibieren (z.B. ABCB1 durch PSC833,

Verapamil , Ritonavir, [20], ABCC2 durch Probenecid [21], OATP1A2 durch Naringin [22],

OATP2B1 sowie OATP1B1 und OATP1B3 durch Statine [23], durch die akute Gabe von

Rifampicin und durch HIV-Proteaseinhibitoren [24;25]. Dennoch besteht aufgrund

überlappender Inhibitorenspektren eine nur schwach ausgeprägte Selektivität und somit

eine zu berücksichtigende Limitation.

Rifampicin, ein PXR-Typ-Induktor bei chronischer Gabe sowie ein kompetitiver Inhibitor bei

akuter Gabe zahlreicher Transporter ist fester Bestandteil von Therapieschemata zur

Behandlung von durch R. equi verursachten abszedierenden Pneumonien bei Fohlen. Aus

einer retrospektiven Analyse ist bekannt, dass die Kombination von Rifampicin und

Clarithromycin den Kombinationen Rifampicin-Erythromycin bzw. Rifampicin-Azithromycin

klinisch überlegen ist [26]. Da Rifampicin nach bisherigen in vitro-Befunden substantiell mit

der Pharmakokinetik von Makroliden sowohl durch Regulation von Transportern als auch

durch Kompetition mit ihrer Funktion interagieren kann, lassen sich Unterschiede in der

Wirkung dieser Kombinationen sehr wohl auch durch Interaktionen auf

Arzneistofftransporterebene erklären.

Kombinationen von Makrolidantibiotika mit Rifampicin stellen bereits etablierte Therapien

von R. equi-Infektionen bei Fohlen dar. Mittels Interaktionsstudien, in denen das duale

Interaktionspotential von Rifampicin als experimentelles Modell verwendet wird, könnten so

tiefere Einblicke in die Mechanismen der pulmonalen Verteilung durch membranale

Transporter erhalten werden. Bei diesen pharmakokinetischen Interaktionsstudien ist

jedoch zu beachten, dass Rifampicin auch andere pharmakokinetisch relevante Funktionen

wie Biotransformation und Transport in anderen, pharmakokinetisch bedeutsamen Organen

(z.B. Darm, Leber) beeinflussen kann. In Bezug auf die Makrolide ist ferner zu

berücksichtigen, dass sie eine unterschiedliche Affinität zu Enzymen der Biotransformation

(z.B. CYP3A4) sowie zu Arzneistofftransportern haben können. Tulathromycin und

Azithromycin werden beispielsweise im Gegensatz zu Clarithromycin und Erythromycin

kaum oder nicht metabolisiert. Dagegen ist bekannt, dass Clarithromycin und Erythromycin

bessere Substrate für ABCB1 sind als Azithromycin [27]. Zur Affinität zu ABCC2 liegen

bislang nur Daten für Azithromycin vor [12].


8

In der vorliegenden Dissertationsarbeit sollten deshalb durch pharmakokinetische

Interaktionsstudien mit den bei Fohlen klinisch indizierten Arzneimitteln Tulathromycin,

Clarithromycin und Rifampicin erste Einblicke in die Mechanismen der pulmonalen

Verteilung von Arzneimitteln gewonnen werden. Dabei sind Tulathromycin und

Clarithromycin als experimentelle Modellsubstrate für Transporter zu verstehen und

Rifampicin als Modellsubstanz zur PXR-Typ-Induktion nach chronischer Gabe sowie als

Hemmstoff nach einmaliger oder kurzzeitiger Gabe, bei der induktive Effekte noch nicht

auftreten oder zu vernachlässigen sind. Zur Beurteilung der pharmakokinetischen Befunde

wurden die in vivo-Untersuchungen durch in vitro-Experimente mit geeigneten Zellmodellen

für Arzneistofftransporter ergänzt.

Im Einzelnen ergaben sich folgende detaillierte Aufgabenstellungen:

1. Entwicklung und Validierung einer sensitiven analytischen Methode zur

Quantifizierung von Clarithromycin, 14-Hydroxyclarithromycin, Rifampicin und 25-O-

Desacetylrifampicin im Blut, in der pulmonalen Epithelialflüssigkeit und den

bronchoalveolären Zellen von Fohlen (Publikation 1)

2. Untersuchung der Expression von Transportproteinen in der Lunge inklusive der

Regulation durch Rifampicin (Publikation 2 + 3)

3. Bestimmung der Affinität der Makrolide für ausgewählte Auswärts- und

Aufnahmetransporter an geeigneten in vitro-Modellen (Publikation 2 + 4)

4. Charakterisierung der Pharmakokinetik und Verteilung der Makrolide in die Lunge

und deren Kompartimente (Publikation 2 – 4)

5. Bestimmung des dualen Einflusses der Rifampicin-Komedikation auf die globale

Pharmakokinetik und lokale Verteilung der Antibiotika (Publikation 2 – 4)

2 Methoden

9

2 Methoden

Tierexperimentelle Studien

Nach Beantragung und Genehmigung durch die zuständigen Behörden (Landesamt für

Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei) sind die tierexperimentellen Studien

auf dem Gestüt Lewitz, Paul Schockemöhle Pferdehaltung GmbH, Neustadt-Glewe an

gesunden jungen Fohlen (Oldenburger-Rasse) durchgeführt worden. Die Tiere wurden

artgerecht gehalten und von erfahrenen Tierärzten betreut.

An diesen Tieren (18 männlich, 21 weiblich, Körpergewicht 97-167 kg, Alter 6-11 Wochen)

wurden drei pharmakokinetische Arzneimittelinteraktionsstudien mit Makroliden

(Tulathromycin, Clarithromycin) und Rifampicin nach akuter und chronischer Gabe

durchgeführt:

1. Concentration of the macrolide antibiotic tulathromycin in broncho-alveolar cells is

influenced by comedication of rifampicin in foals (LVL M-V/TSD/7221.3-2.1-021/04;

Publikation 2)

2. Chronic effects of rifampicin on the pulmonary steady-state pharmacokinetics of

clarithromycin in healthy foals (LADDF MV/TSD/7221.3-1.1.-066/08; Publikation 3)

3. Pulmonary pharmacokinetics of rifampicin and clarithromycin and acute drug/drug

interactions between both drugs in healthy foals (LADDF MV/TSD/7221.3-1.1.-

066/08; Publikation 4)

Im Anschluss an die Applikation der Arzneimittel laut Studienprotokoll erfolgten

Blutabnahmen zur pharmakokinetischen Analyse über einen Zeitraum von 48 h

(Clarithromycin-Studien) bzw. 192 h (Tulathromycin-Studie). Das nach Zentrifugation

gewonnene Plasma wurde bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert. Ferner wurde

in allen drei Studien 12 h nach letzter Arzneimittelgabe eine BAL zur Gewinnung der ELF

und BALC von erfahrenen Tierärzten durchgeführt. Hierzu wurden die Tiere zunächst

mittels Xylazininjektion sediert und anschließend mit einer Kombination aus Ketamin und

Diazepam in Narkose gelegt. Zur Durchführung der BAL und der Biopsie wurde ein flexibles

Endoskop genutzt. Die Lavage erfolgte durch viermaliges Spülen mit jeweils 100 ml warmer

isotoner Salzlösung.

Zur Expressionsbestimmung wurden die BALC und BEC für die ersten 24 h bei 4 °C in

RNAlater (RNAlater™ RNA Stabilization Reagent, Qiagen, Hilden, Deutschland) gelagert.

Die weitere Lagerung bis zur Isolation der RNA erfolgte bei -80 °C.

2 Methoden

10

Konzentrationsbestimmung der Markolide in den biologischen Matrices

Zur Bestimmung der Antibiotikakonzentrationen sowie der Konzentrationen der

Hauptmetabolite 14-Hydroxyclarithromycin und 25-O-Desacetylrifampicin in den

biologischen Matrices wurden sensitive LC-MS/MS-Methoden etabliert (Publikation 1 und

[28]). Die Abweichungen von Präzision und Richtigkeit dieser Methoden lagen in den von

der FDA geforderten Grenzen von 15% (20% beim lower limit of quantification, LLOQ).

Die Konzentrationen von Cholesterol und dessen Metabolit 4β-Hydroxycholesterol wurden

mittels einer validierten GC-MS-Methode bestimmt und zur Errechnung der Ratio 4β-

Hydroxycholesterol/Gesamtcholesterol als Surrogat für die metabolische Aktivität von

hepatischem Cytochrom P450 3A4 (CYP3A4) genutzt.

Zur Berechnung der intrazellulären Konzentration der Arzneimittel (und Metabolite) in den

BALC wurde nach Jacks et al. ein Zellvolumen von 1,2 µl/106 alveolare Makrophagen

angenommen [29]. Die Konzentration in der ELF wurde unter Nutzung der

Harnstoffverdünnungsmethode nach Rennard et al. errechnet [30].

Genexpressionsuntersuchungen

Die Bestimmung des mRNA-Expressionslevels der Transportproteine ABCB1, ABCC2,

OATP1A2, OATP2B1 und OATP1B4, dem equinen Analogon zu den humanen

Transportern OATP1B1 und OATP1B3, sowie des nukleären Rezeptors PXR wurde

anfänglich semiquantitativ (Publikation 2) und in der späteren Studie quantitativ mittels real

time RT-PCR (Publikation 3) durchgeführt. Für letztere Methode wurden speziell für Pferde

entworfene Primer und Sonden und zur Quantifizierung die ΔΔCt-Methode genutzt [31].

In vitro-Affinität der Makrolide zu Transportproteinen

Zur Bestimmung der in vitro-Affinität der Makrolide zu den Effluxtransportern ABCB1 und

ABCC2 führten wir TRANSWELL Permeabilitäts-Untersuchungen and Madin Darby canine

kidney II (MDCKII)-Zellen durch. Weiterhin verwendeten wir für diese Untersuchungen auch

in der Arbeitsgruppe hergestellte in-side-out Vesikel von ABCC2 überexprimierenden 2008

Zellen (Publikation 2). Stabil transfizierte human embryonic kidney (HEK) 293 Zellen

wurden nach deren Etablierung und Validierung in unserer Arbeitsgruppe [32;33] zur

Analyse der in vitro-Affinität zu Aufnahmetransportern der OATP-Familie (OATP1A2,

OATP2B1, OATP1B1, OATP1B3) genutzt (Publikation 4). Hierzu wurden zum einen

Kompetitionsassays mit bekannten radioaktiv markierten Substraten der

Transporterproteine (OATP1A2 und OATP2B1: Estron-3-sulfat, OATP1B1 und 1B3: BSP)

durchgeführt. Zum anderen wurde die Affinität von Clarithromycin in direkten

Aufnahmeversuchen an den transfizierten Zellen getestet (Publikation 4).

2 Methoden

11

Biometrische Verfahren

Die pharmakokinetischen Daten wurden mit etablierten Standardmethoden analysiert. Für

alle Parameter wurden Mittelwert ± Standardabweichung (M±SD) angegeben. Zur

Auswertung der in vitro-Experimente an Zellen und Vesikeln wurde das Programm Prism

5.01 genutzt (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Intraindividuelle Unterschiede

wurden mit dem nicht parametrischen Wilcoxon-Test beurteilt, zur Evaluierung von

Unterschieden zwischen zwei Gruppen wurde der nicht parametrische Mann-Whitney-Test

genutzt, während Korrelationen nach Spearman berechnet wurden. Das Signifikanzniveau

für alle Tests lag bei p<0,05.

3 Ergebnisse

12

3 Ergebnisse

Die neu entwickelte und validierte analytische Methode zur Quantifizierung von

Clarithromycin, Rifampicin und deren Hauptmetaboliten erwies sich als hinreichend selektiv

und sensitiv zur Bestimmung der Antibiotikakonzentrationen in den zu untersuchenden

biologischen Matrices. Die Methode stellte die experimentelle Grundlage zur

pharmakokinetischen Analyse der klinischen Studien dar (Publikation 1). Zur Bestimmung

der Konzentrationen von Tulathromycin in biologischen Proben konnte auf eine bereits

validierte analytische Methode zurückgegriffen werden [28].

Im Rahmen der durchgeführten klinischen Studien an gesunden Fohlen konnten folgende

neuartige Erkenntnisse gewonnen werden:

1. In den BALC wird die mRNA von PXR, ABCB1, ABCC2 und OATP2B1 exprimiert,

während in den BEC zusätzlich die mRNA von OATP1A2 und OATP1B4, dem equinen

Analogon zum menschlichen OATP1B1 und OATP1B3, exprimiert wird. Die chronische

Therapie mit Rifampicin in Kombination mit Clarithromycin führte nicht zur erwarteten

Induktion von ABCB1 und ABCC2 in BEC und BALC; in BALC kam es sogar zur

Verminderung der Expression von PXR und ABCC2 wobei jedoch die enge Korrelation

zwischen PXR- und ABCC2-Expression erhalten bleibt (Abb. 2). Die OATP1A2-

Expression wird in BEC herunterreguliert während die von OATP2B1 signifikant

induziert wird. Hinweise für eine Induktion von ABCB1 und ABCC2 in BALC aus der

Pilotstudie mit Tulathromycin mit gepooltem Material haben sich bei Vermessung aller

individuellen Proben mittels real-time RT-PCR nicht bestätigt (Publikation 2,3).

2. Tulathromycin zeigte keine Affinität zu ABCB1 und ABCC2 in transfizierten MDCKII-

Zellen (Publikation 2) während sich Clarithromycin in transfizierten HEK-Zellen als

Inhibitor von OATP1B3 > OATP1B1 > OATP1A2 > OATP2B1 erwies (Publikation 4). Im

Hinblick auf deren Expression im pulmonalen Gewebe (OATP1A2 in BEC und

OATP2B1 in BEC und BALC) könnte dieser Befund pharmakokinetisch für

Clarithromycin im Hinblick auf die Transporter OATP1A2 und OATP2B1 relevant sein.

Clarithromycin wies jedoch keine Substrateigenschaften dieser Aufnahmetransporter in

vitro auf (Publikation 4).

3 Ergebnisse

13

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.00.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

AB

CC

2 m

RN

A /

18S

rR

NA

r2 = 0.664

p < 0.001

PXR mRNA / 18S rRNA

Abb. 2: Korrelation der Genexpression von ABCC2 zu PXR in den BALC in acht gesunden Fohlen

sowohl nach Monotherapie (○) mit Clarithromycin (7,5 mg/kg KG, 7 d) als auch nach

Kombinationstherapie () mit Rifampicin (10 mg/kg KG, 11 d).

3. Beide in den tierexperimentellen Studien untersuchten Makrolide kumulierten in

Monotherapie in pulmonalen Kompartimenten: Tulathromycin in der ELF bis zum 33-

fachen sowie in den BALC bis zum 4-fachen und Clarithromycin bis zum 54-fachen in

der ELF sowie in den BALC bis zum 1510-fachen der jeweiligen

Plasmakonzentrationen. Die Konzentrationsgradienten zwischen BALC und ELF lagen

zwischen 0,83 – 14,6 für Tulathromycin und zwischen 4 – 67 für Clarithromycin. In allen

Kompartimenten wurde die minimale Hemmkonzentration (MIC) (Tulathromycin: >64

ng/ml, Clarithromycin: 120 ng/ml [34;35]) um das Mehrfache überschritten (Publikation

2-4).

4. Durch die akute und die chronische Komedikation von Rifampicin sanken die

Clarithromycinspiegel sowohl nach akuter als auch nach chronischer Komedikation im

pulmonalen Kompartiment auf ähnliche Werte, in der ELF zwischen 0,12 und

16,63 µg/ml sowie in den BALC auf Werte von 1,84 bis 74,6 µg/ml. Die Ratios

BALC/Plasma12h von Clarithromycin veränderten sich hingegen kaum weder nach

chronischer (838±449 vs. 757±478) noch nach akuter Komedikation (650±486 vs.

560±298) und unterschieden sich nicht von der jeweiligen Monotherapie. Im Gegensatz

dazu kam es in beiden Studien zur Verdopplung der Ratio ELF/Plasma12h (akute

Komedikation: 65,5±33,3 vs. 32,7±20,3, p<0,05; chronische Komedikation: 62,0±48,6

vs. 36,1±14,8, p<0,05) (Abb. 4) (Publikation 3,4).

Auch für Tulathromycin zeigte sich eine deutliche Verminderung der pulmonalen

3 Ergebnisse

14

Akkumulation mit Abnahme der Konzentration in den BALC um beinahe 50%

(Publikation 2).

5. Die Plasmaspiegel des nicht-metabolisierten Tulathromycin wurden durch Komedikation

von Rifampicin kaum beeinflusst. Auch die single-dose Komedikation von Rifampicin

beeinflusste die Pharmakokinetik von Tulathromycin nicht wesentlich (Publikation 2).

Die chronische Therapie mit Rifampicin führte zur drastischen Abnahme der

Plasmakonzentrationen von Clarithromycin (AUC-Abnahme um >90%) bei gleichzeitig

nur mäßiger, der Abnahme der Muttersubstanz nicht entsprechender Zunahme der

Plasmaspiegel des oxidativen Hauptmetaboliten 14-Hydroxyclarithromycin (Abb. 3).

Gleichzeitig kam es zur Induktion PXR-regulierter Gene im zentralen Kompartiment.

Dies konnte aus dem signifikanten Anstieg des Plasmakonzentrationsverhältnisses

zwischen 4β-Hydroxycholesterol und Gesamtcholesterol, einem Surrogat für die

hepatische CYP3A4-Aktivität, abgeleitet werden (Publikation 3).

In Übereinstimmung dazu war die Verminderung der relativen Bioverfügbarkeit von

Clarithromycin nach kurzzeitiger Komedikation von Rifampicin (2,5 Tage) ähnlich stark

ausgeprägt wie nach chronischer Gabe (Abb. 3), obwohl sich die Plasmaspiegel von 14-

Hydroxyclarithromycin wiederum nur geringfügig erhöhten und die Erhöhung der 4β-

Hydroxycholesterol/Gesamtcholesterol-Ratio als Indikator der hepatischen CYP3A4-

Aktivität völlig ausblieb (Publikation 4).

-RIF +RIF0

40

80

120

p = 0.017

ELF / Plasma

Konzentr

ationsverh

ältnis

A B

-RIF +RIF0

40

80

120

160

p = 0.036

ELF / Plasma

-RIF +RIF0

40

80

120

p = 0.017

ELF / Plasma

Konzentr

ationsverh

ältnis

A B

-RIF +RIF0

40

80

120

160

p = 0.036

ELF / Plasma

Abb. 3: Verhältnis der Clarithromycinkonzentration in ELF zu Plasma12h nach Monotherapie (- RIF)

und nach akuter (A) bzw. chronischer (B) Komedikation mit Rifampicin (10 mg/kg KG;

+ RIF) in 18 Fohlen der Oldenburger-Rasse (chronische Studie: Clarithromycin 7,5 mg/kg

KG, 13 d; akute Studie: Clarithromycin 7,5 mg/kg KG, 2,5 d)

3 Ergebnisse

15

chronische Studie akute Studie

0 6 12 18 240

200

400

600

800

1000

RIF

RIF

Cla

rith

rom

ycin

(n

g/m

l)

0 6 12 18 240

50

100

150

200

250

14

-Hyd

roxycla

rith

rom

ycin

(n

g/m

l)

Zeit (h)

0 6 12 18 240

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 240

50

100

150

200

250

Zeit (h)

chronische Studie akute Studie

0 6 12 18 240

200

400

600

800

1000

RIF

RIF

Cla

rith

rom

ycin

(n

g/m

l)

0 6 12 18 240

50

100

150

200

250

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-Hyd

roxycla

rith

rom

ycin

(n

g/m

l)

Zeit (h)

0 6 12 18 240

200

400

600

800

1000

0 6 12 18 240

50

100

150

200

250

Zeit (h)

Abb. 4: Plasmakonzentrations-Zeit-Kurven in 18 Fohlen der Oldenburger-Rasse (chronische

Studie: 4 weibliche, 5 männliche Tiere, Alter 41-61 d, Gewicht 115-159 kg, akute Studie: 6

weibliche, 3 männliche Tiere, Alter 42-70 d, Gewicht 102 – 167 kg) für Clarithromycin und

dessen Hauptmetaboliten 14-Hydroxyclarithromycin nach Monotherapie (- RIF) bzw.

Kombinationstherapie mit Rifampicin (+ RIF, 10 mg/kg KG) von Clarithromycin (7,5 mg/kg

KG) nach chronischer Therapie (11 d) bzw. nach Akuttherapie für die Dauer von 2,5 d.

4 Diskussion

16

4 Diskussion

Für eine Reihe von Arzneistoffen ist die Beteiligung von Transportproteinen bei ihrer

Absorption und Elimination bereits gut beschrieben [17;36;37]. Es gibt Hinweise, dass auch

bei der pulmonalen Akkumulation Transportproteine eine Rolle spielen könnten [4;9]. Ein

Beispiel ist die klinisch notwendige Kombinationstherapie von Clarithromycin und

Rifampicin bei Atemwegsinfektionen von Zuchtfohlen. Transportproteine könnten hierbei

sowohl einen Einfluss auf die globale als auch auf die lokale Pharmakokinetik am Wirkort

der Antibiotika haben. Letzteres ist bisher nur unzureichend untersucht.

Um diesen Einfluss näher zu charakterisieren, führten wir zunächst Genexpressions-

untersuchungen an jungen Fohlen durch. Dabei konnten wir in Übereinstimmung mit van

der Deen et al. die mRNA von ABCB1 in den BEC und BALC nachweisen [9]. Entgegen der

widersprüchlichen Datenlage in Bezug auf die Expression von ABCC2 wiesen wir dessen

mRNA in beiden Zellarten nach. Gleichzeitig konnten wir erstmalig die mRNA-Expression

von OATP1A2, OATP2B1 und OATP1B4, dem equinen Analogon zum menschlichen

OATP1B1 und OATP1B3, in den unterschiedlichen Zellen der Lunge nachweisen. Somit

konnten wir das Wissen über die Transporterexpression in der Lunge deutlich erweitern.

Abbildung 5 zeigt die Transporterexpression in den BEC und BALC unter Berücksichtigung

unserer Forschungsbefunde.

Noch ist die genaue Lokalisation der Aufnahmetransporter in den BEC nicht bekannt,

dennoch ist es sehr wahrscheinlich, dass die pulmonalen Arzneistoffkonzentrationen durch

ein komplexes Zusammenspiel von Aufnahme- und Auswärtstransport erreicht werden. So

könnten die Aufnahmetransporter bei basolateraler Lokalisation Substanzen aus dem Blut

in die BEC aufnehmen, von wo aus diese durch die Vertreter der ABC-Familie in die ELF

gepumpt würden. Aus der ELF würden die Stoffe über Aufnahmetransporter in ihren

eigentlichen Wirkort, die BALC, aufgenommen werden, um gleichzeitig durch die ebenfalls

exprimierten Auswärtstransporter wieder hinaus in die ELF gepumpt zu werden.

4 Diskussion

17

BMInterstitium

Basalzelle

ABCG2

ABCC3

ABCC1ABCC2,4,5*

ABCC1 *

ABCB1

ABCC1

OCTN1

Alveolarmakrophage

BronchialepithelzellePEPT1*

ABCB1

ABCC2* ABCC7ELF

OCT1,2 *

PEPT2

OATP2B1‡

ABCC2‡

OATP2B1‡

OATP1A2‡

Abb. 5: Expression und Lokalisation von Transportproteinen in den Lungenzellen - modifiziert nach

van der Deen et al. 2005 und Bosquillon 2010 [4;9]; BM, Basalmembran; ELF,

Epithelialflüssigkeit; ABC, ATP-binding cassette; OATP, organic anion transporting

polypeptide; OCT, organic cation transporter; OCTN, organic cation/carnitine transporter;

PEPT, peptide transporter; *widersprüchliche Datenlage zur Expression und subzellulären

Lokalisation; ††

subzelluläre Lokalisation noch unbekannt

Neben der Expression dieser Transportproteine in der equinen Lunge sollte auch deren

funktionelle Relevanz beurteilt werden. Hierzu führten wir Untersuchungen mit den

Arzneistoffen Tulathromycin und Clarithromycin und dem etablierten Modulator Rifampicin

durch und analysierten die Verteilung der Makrolidantibiotika in die Lunge. Rifampicin wirkte

dabei nach chronischer Gabe als Induktor und nach akuter Gabe als Inhibitor auf die

Transportproteine (Publikation 2-4).

In den steady-state Studien mit Tulathromycin und Clarithromycin wiesen beide Makrolide

nach Monotherapie eine starke Akkumulation in den pulmonalen Kompartimenten ELF und

BALC auf (Publikation 2,3). Die beobachtete Akkumulation von Clarithromycin stimmt dabei

mit früheren Untersuchungen überein [6;8]. Die präsentierten Ergebnisse für Tulathromycin

sind neuartig, da hier bisher nur Konzentrationen in Lungengeweben von Schweinen und

Kühen bekannt waren. Die gefundene Anreicherung lag jedoch in ähnlichen

Größenordnungen [38;39].

4 Diskussion

18

Nach chronischer Komedikation mit Rifampicin sanken die Konzentrationen in den

pulmonalen Kompartimenten für Tulathromycin um circa 50% und für Clarithromycin um

beinahe 90%. Die MIC90-Werte für R. equi wurden dennoch nicht unterschritten, so dass

der Therapieerfolg nicht direkt gefährdet war (Publikation 2,3). Die Ergebnisse der

gleichzeitig durchgeführten Analysen zur Regulation der Genexpression im pulmonalen

Kompartiment waren überraschend, da sich die erwartete Induktion von ABCB1 und

ABCC2 in den BEC und BALC durch Komedikation mit Rifampicin nicht einstellte [40;41].

Eine zu geringe Rifampicinkonzentration in der ELF und den BALC können wir als Ursache

ausschließen. Die gefundenen Konzentrationen lagen zwischen 6 – 10 µM und somit in

dem Bereich der zur transkriptionalen Regulation über PXR ausreichend ist [40;42]. Auch

das Fehlen von PXR kann nicht ursächlich an der ausbleibenden Genexpressionsänderung

sein, denn sowohl in den BEC als auch in den BALC konnten wir die mRNA von PXR

nachweisen (Publikation 3). Eine weitere mögliche Ursache ist die Beteiligung anderer

nukleärer Rezeptoren [43;44]. Auch können gewebespezifische Regulationsmechanismen

durch beispielsweise epigenetische Einflüsse als Ursache der ausbleibenden Regulation

nicht ausgeschlossen werden [45].

Bei der weiteren Betrachtung der pulmonalen Kinetik fällt auf, dass die Akkumulation in den

BALC in direkter Abhängigkeit von der Plasmapharmakokinetik des Makrolids steht. Die

Ratios BALC/Plasma12h vor und nach Rifampicin-Komedikation unterscheiden sich in

beiden Studien nicht signifikant voneinander. Die deutliche Abnahme der Akkumulation

innerhalb der BALC ist somit auf die Reduktion der oralen Absorption und somit der

Bioverfügbarkeit von Clarithromycin um über 90% (AUC0-12h 0,35±0,31 vs.

5,54±4,42 µg×h/ml; p<0,05) durch die Behandlung mit Rifampicin über zwei Wochen

zurückzuführen. Die Plasmaspiegel des ABCB1- und CYP3A4-Substrates sanken dabei

deutlich auf Werte unterhalb der MIC90 für R. equi. Dies lässt sich nicht allein mit

gesteigertem ABCB1-Effluxtransport erklären. Der Anteil des ABCB1-bedingten Verlustes

an der Bioverfügbarkeit nach oraler Absorption für etablierte ABCB1-Substrate liegt im

Bereich von 20-25% und damit deutlich unterhalb des hier beobachteten Verlustes [46-49].

Im Gegensatz zu den ABCB1-Substraten Digoxin und Fexofenadin wird Clarithromycin

jedoch intensiv metabolisiert. Die nach chronischer Rifampicin-Komedikation gleichzeitig

beobachteten gesteigerten 4β-Hydroxycholesterol/Gesamtcholesterol-Ratios zeigten einen

gesteigerten hepatischen CYP3A4-Metabolismus an. Diesen Schluss lässt auch der

gestiegene Anteil des Metaboliten an der Gesamtexposition zu. An der drastisch

gesunkenen Gesamtexposition (1,08 ± 0,75 vs. 7,12 ± 5,44 µg×h/ml, p<0,05) wird jedoch

deutlich, dass der gesteigerte Metabolismus nicht allein für die geringere Bioverfügbarkeit

von Clarithromycin verantwortlich sein kann. Diese Ergebnisse legen die Vermutung nahe,

4 Diskussion

19

dass die verminderte orale Bioverfügbarkeit Resultat eines durch Rifampicin gehemmten

Aufnahmemechanismus sein könnte.

Zur genaueren Klärung einer Beteiligung intestinaler Aufnahmemechanismen führten wir

eine zweite klinische Studie mit Clarithromycin an Fohlen durch. Rifampicin wurde hierbei

nur kurzzeitig gegeben und wirkte so als Inhibitor von zahlreichen Transportproteinen.

Während die Plasmakonzentrations-Zeit-Kurven nach alleiniger Kurzzeitgabe von

Clarithromycin denen nach chronischer Gabe ähnelten, nahm auch die AUC von

Clarithromycin nach akuter Komedikation mit Rifampicin ähnlich stark ab. Im Unterschied

zur chronischen Studie lag der Verlust der Bioverfügbarkeit jedoch bei „nur“ circa 70%.

Während bei der chronischen Komedikation nachweislich auch die Induktion des

hepatischen Metabolismus eine Rolle spielte (Anstieg des 4β-

Hydroxycholesterol/Gesamtcholesterol-Ratio von 0,68±0,34 auf 1,05±0,4; p=0,004), sollte

dies bei kurzzeitiger Rifampicingabe umgangen werden. Die unveränderten 4β-

Hydroxycholesterol/Gesamtcholesterol-Ratios bestätigen dies. Dennoch muss

einschränkend hinzugefügt werden, dass dieser Surrogatparameter nur die Veränderung

des hepatischen, nicht aber die des intestinalen CYP3A4-Metabolismus beschreibt. Eine

Induktion auf Ebene der Enterozyten erscheint unter Berücksichtigung der oralen Gabe von

Rifampicin aber durchaus als wahrscheinlich. Denn auch nach kurzzeitiger Rifampicin-

Komedikation stieg der Anteil des Metaboliten von 21 auf 52% und lag damit in der gleichen

Größenordnung wie auch nach chronischer Komedikation. Den Bioverfügbarkeitsverlust der

Muttersubstanz kann dies dennoch nicht erklären.

Eine mögliche Ursache für die Minderung der oralen Absorption nach akuter und

chronischer Gabe von Rifampicin ist die Beteiligung von Aufnahmetransportern an der

globalen Kinetik von Clarithromycin. Ein weiteres plausibles Argument hierfür stellt die

Tatsache dar, dass die akute Interaktion zwischen Clarithromycin und Rifampicin nicht zu

beobachten ist, wenn beide Substanzen zeitlich versetzt appliziert werden [50]. So wurde

zum Beispiel für Fexofenadin, einem ABCB1- und OATP1A2-Substrat, ein Verlust an

Bioverfügbarkeit von circa 45% nachgewiesen [51;52]. Eine Erklärung dafür ist die

Hemmung des genannten Aufnahmetransporters. Eine derartige Interaktion auf Ebene

intestinaler Aufnahmetransporter der OATP-Familie wäre auch für die Makrolide denkbar,

da Rifampicin einen potenten Hemmstoff dieser Carrier darstellt. Aufgrund der bereits

beschriebenen Inhibition von OATPs durch Makrolide lag die Vermutung nahe, dass

Clarithromycin ebenfalls über diese intestinalen Aufnahmetransporter aufgenommen wird

(Publikation 3 und [15]). OATP1A2 und OATP2B1 werden im Darm exprimiert und kämen

somit als mögliche Aufnahmetransporter für Clarithromycin in Frage [53].

4 Diskussion

20

Zur Eingrenzung der am Makrolidtransport beteiligten Membranproteine führten wir in vitro-

Untersuchungen an geeigneten Zellmodellen bzw. Vesikeln und Membranfraktionen durch.

Hierbei stellte sich Tulathromycin nicht als Substrat der in den BEC und BALC exprimierten

Transporter ABCB1 und ABCC2 dar. Die beiden Auswärtstransporter sind somit nicht an

der Akkumulation Tulathromycins in der ELF beteiligt. Frühere Untersuchungen haben

einen Einfluss von ABCC7 auf die Akkumulation von Azithromycin und Roxithromycin in

fetale Trachealzelllinien gezeigt [11]. Die strukturellen Ähnlichkeiten zwischen den

Makroliden legen die Vermutung nahe, dass auch bei der Akkumulation von Tulathromycin

dieser Transporter eine Rolle spielen könnte.

Für Clarithromycin wurde die Affinität zu Vertretern der OATP-Familie an

überexprimierenden Zelllinien analysiert. Clarithromycin zeigte in den Kompetitionsassays

eine Affinität zu den untersuchten OATPs mit IC50-Werten zwischen 9,5 und 384 µM. Diese

Konzentrationen werden in vivo sowohl intestinal (Dosis/250ml) als auch im Lungengewebe

erreicht [6]. Gleichzeitig lagen diese Werte in den Konzentrationsbereichen, in denen auch

Seithel et al. bereits eine Inhibition der Transporter beobachtet haben [15]. Eine

pharmakokinetisch relevante Interaktion ist also durchaus denkbar. Dennoch trugen weder

OATP1A2, OATP2B1 noch OATP1B1 oder 1B3 zur Akkumulation von Clarithromycin in den

transfizierten Zellen bei. Ein derartiges Verhalten eines inhibitorisch wirksamen

Arzneistoffes, der selbst nicht transportiert wird, ist nicht häufig. Gleichwohl konnten Kindla

et al. vor kurzem einen allosterischen Inhibitionsmechanismus für nichtsteroidale

Antiphlogistika zeigen [54]. Während sowohl Diclofenac, Ibuprofen als auch Lumaricoxib die

Aufnahme von BSP über OATP1B1 und OATP1B3 hemmten, konnte nur für Diclofenac ein

Transport über OATP1B3 nachgewiesen werden. Für Clarithromycin wäre ebenso eine

allosterische Inhibition möglich. Somit kommen die OATPs nicht als intestinale

Aufnahmetransporter für Clarithromycin in Frage. Des Weiteren wären diese Carrier auch

keine Erklärung für den Übertritt der Substanz aus dem Blut in die ELF und die BALC.

Eine andere Erklärung für die in beiden Clarithromycin-Studien beobachteten starken

Verluste an Bioverfügbarkeit könnten im Darm basolateral exprimierte Effluxtransporter der

ABCC-Familie (MRPs) sein, die sowohl den Metaboliten als auch Clarithromycin als

Muttersubstanz transportieren. Es finden sich Hinweise in der Literatur, dass Vertreter der

ABCC-Familie am intestinalen Transport von Xenobiotika beteiligt sind [55]. Da diese

Transportproteine durch Rifampicin modulierbar sind, ist ihre Beteiligung an der Absorption

und den Veränderungen durch Rifampicin Komedikation gut denkbar [56].

Die bereits gut etablierte und auch in dieser Arbeit nachweislich replizierte Akkumulation

von Clarithromycin innerhalb der BALC kann durch so genanntes base trapping erfolgen, in

dem die schwach basischen Makrolide (pKA-Wert um 8,8) in den Lysosomen (pH-Wert um 3

[57]) der BALC protoniert vorliegen und somit für eine Rückdiffusion aus den BALC in die

4 Diskussion

21

ELF ungeeignet sind. Auch bei physiologischem pH-Wert von 7,4 im Blut liegt

Clarithromycin bereits zu mehr als 97% protoniert vor und ist als kationische

makrozyklische Verbindung schwer membrangängig. Die passive Diffusion dieses

makrozyklischen, geladenen Moleküls durch Membranen der Blutkapillaren in die ELF ist

daher aus physikochemischer Sicht unwahrscheinlich und suggeriert die Beteiligung von

Transportproteinen. Die These wird weiter durch den Befund gestärkt, dass die

Konzentration in den BALC in direkter Abhängigkeit zur Plasmakonzentration stand, die in

der ELF gefundenen Konzentrationen sich relativ zum Plasma gesehen jedoch

verdoppelten.

Weitere mögliche Kandidaten für den Transport von Makroliden sind Vertreter der organic

anion transporter (OAT-), organic cation transporter (OCT-) oder organic cation/carnitine

transporter (OCTN-) Familie. Bisher existieren keine publizierten in vitro-Untersuchungen,

die auf eine Beteiligung dieser Transporter schließen lassen. Es finden sich jedoch

Hinweise in der Literatur, dass neben der möglichen Beteiligung von OATPs auch die

Vertreter der OCTs als Transportproteine für Clarithromycin in Frage kommen [58], ebenso

sind OCTNs denkbar. Eine Beteiligung ist möglich, da Vertreter dieser Transporter sowohl

im Darm [59] als auch in der Lunge [4] exprimiert sind. Für eine Beteiligung von OCTs oder

OCTNs spricht weiterhin, dass Makrolide als schwach basische Verbindungen in

physiologischem pH-Wert Eigenschaften klassischer Substrate dieser Transporter [60]

aufweisen, da sie hauptsächlich als protonierte organische Verbindungen vorliegen. Dies

muss jedoch in weiteren Untersuchungen bestätigt werden.

Die Kombinationstherapie aus Makroliden und Rifampicin zur Elimination des pathogenen

R. equi ist ein gutes Beispiel einer klinisch indizierten, aber aus pharmakokinetischen

Gesichtspunkten fragwürdigen Arzneimittelkombination. Trotz einer enormen

Absorptionsminderung von Clarithromycin durch die Komedikation mit Rifampicin kumuliert

Clarithromycin in der ELF und den BALC in therapeutisch ausreichend hohen

Konzentrationen. Die vorliegende Arbeit konnte unter Berücksichtigung der globalen und

lokalen Pharmakokinetik am Wirkort nachweisen, dass es bei der untersuchten

Kombination zu Interaktionen auf Ebene intestinaler Transportmechanismen kommt.

Die detaillierte Aufklärung der beteiligten Transportproteine konnte allerdings nicht erbracht

werden und bietet Ansatzpunkte für zukünftige Forschungsarbeiten.

5 Zusammenfassung

22

5 Zusammenfassung

Der klinische Erfolg einer Arzneimitteltherapie wird maßgeblich von den

pharmakokinetischen Eigenschaften eines Arzneistoffes bestimmt. Dabei spielt neben der

Absorption, dem Metabolismus und der Elimination auch der Transport und somit die

Verteilung des Arzneistoffes in die Zielkompartimente eine entscheidende Rolle. Dass

intestinal exprimierte Transportproteine einen entscheidenden Einfluss auf die Absorption

eines Arzneistoffes nach oraler Gabe ausüben, ist bereits gut dokumentiert. Die Beteiligung

dieser membranalen Proteine bei der Verteilung von Xenobiotika in die jeweiligen

Wirkkompartimente ist jedoch weniger umfassend untersucht. Ein Beispiel hierfür ist die

pulmonale Penetration eines oral verabreichten Arzneistoffes. Hier gibt es erste Hinweise,

die auf eine Beteiligung von Transportproteinen an der Akkumulation von beispielsweise

Makrolidantibiotika in der Lunge schließen lassen.

Daher war das Ziel der vorliegenden Dissertation, die Expression von für den

Arzneimitteltransport wichtigen Proteinen in unterschiedlichen Kompartimenten der Lunge

und gleichzeitig den Einfluss dieser auf die Verteilung von Arzneistoffen in die pulmonale

Epithelialflüssigkeit und die bronchoalveolären Lavagezellen zu untersuchen. Die klinisch

indizierte Kombinationstherapie eines Makrolides mit Rifampicin zur Eradikation von

Rhodococcus equi in Fohlen bietet eine geeignete Grundlage dafür.

Zur Auswertung pharmakokinetischer Untersuchungen von Clarithromycin und Rifampicin

entwickelten und validierten wir eine Flüssigchromatographie-Tandemmassenspektrometrie

(LC-MS/MS)-Methode. Diese Methode ermöglichte die Quantifizierung von Clarithromycin,

14-Hydroxyclarithromycin, Rifampicin und dessen Hauptmetaboliten 25-O-

Desacetylrifampicin sowohl in den Plasma-, Lavage- und Zellproben der tierexperimentellen

Studien nach Gabe therapeutischer Dosen als auch in den Zelllysaten der in vitro-

Untersuchungen (Publikation 1).

In den ersten beiden tierexperimentellen Interaktionsstudien an gesunden Fohlen sollte der

Einfluss einer chronischen Komedikation von Rifampicin, einem Induktor der

Genexpression der Transporter ABCB1 und ABCC2, auf die Verteilung der Makrolide

Tulathromycin bzw. Clarithromycin in die pulmonale Epithelialflüssigkeit und die

bronchoalveolären Lavagezellen untersucht werden. Hierbei stellten wir nach

Rifampicingabe eine deutliche Abnahme der Akkumulation beider Makrolide in den

pulmonalen Kompartimenten fest. Die mittels sensitiver TaqMan®-Methoden durchgeführten

Genexpressionsuntersuchungen ergaben den unerwarteten Befund einer fehlenden

Induktion der mRNA von ABCB1 und ABCC2 durch Rifampicin. Für Clarithromycin ist

bekannt, dass es ein Substrat von ABCB1 und ABCC2 ist. Gleichzeitig konnten in vitro-

5 Zusammenfassung

23

Transportstudien an ABCB1- und ABCC2-überexprimierenden Zellmodellen sowie Vesikeln

von ABCC2-transfizierten Zellen zeigen, dass Tulathromycin keine Affinität zu den

genannten Transportproteinen besitzt (Publikation 2). Somit konnten die pulmonalen

Auswärtstransporter nicht ursächlich sein für den Verlust an Makrolidkonzentration an ihrem

Wirkort. Gleichzeitig beobachteten wir eine signifikante Reduktion der oralen

Bioverfügbarkeit von Clarithromycin um mehr als 90% wohingegen die Bioverfügbarkeit von

Tulathromycin nur um 25% sank. Dieser drastische Verlust an Bioverfügbarkeit von

Clarithromycin konnte weder allein mit einem gesteigerten intestinalen Efflux noch durch

den gesteigerten hepatischen Metabolismus des CYP3A4-Substrates erklärt werden.

Vielmehr wiesen die Ergebnisse auf eine Beteiligung anderer intestinaler

Aufnahmemechanismen hin (Publikation 3).

Die daraufhin durchgeführte tierexperimentelle Studie zur Untersuchung der Interaktion von

Clarithromycin und Rifampicin nach kurzzeitiger Kombination erbrachte eine ähnliche

Reduktion der Akkumulation des Makrolids in der Epithelialflüssigkeit und den

bronchoalveolären Lavagezellen. Die orale Absorption war ebenfalls drastisch vermindert,

jedoch um „nur“ 70% reduziert. Der Bioverfügbarkeitsverlust war somit deutlich geringer

ausgeprägt als bei der chronischen Interaktionsstudie beider Arzneistoffe. Den Unterschied

von etwa 20% in der Veränderung der oralen Absorption von Clarithromycin konnten wir mit

der nach akuter Komedikation ausbleibenden Induktion von ABCB1, ABCC2 und dem

Biotransformationsenzym CYP3A4 begründen (Publikation 4).

Auffallend, und die These der Beteiligung von Transportproteinen an der oralen Absorption

sowie der pulmonalen Distribution stützend, waren die gestiegenen Verhältnisse der

Konzentration von Clarithromycin in der Epithelialflüssigkeit verglichen zum Plasma. Sowohl

nach chronischer als auch nach akuter Komedikation beobachteten wir eine Verdopplung

dieses Verhältnisses.

Die zur weiteren Aufklärung der möglicherweise beteiligten Aufnahmetransporter

durchgeführten Transportuntersuchungen zeigten einen inhibitorischen Einfluss von

Clarithromycin auf Vertreter der organic anion transporting polypeptide (OATP-) Familie

(OATP1B > OATP1B1 > OATP1A2 > OATP2B1). In den folgenden direkten

Akkumulationsversuchen stellte sich Clarithromycin jedoch nicht als Substrat der genannten

Transportproteine dar (Publikation 4).

Zusammenfassend konnte die vorliegende Dissertation verdeutlichen, dass die klinisch

indizierte Kombinationstherapie aus Makroliden und Rifampicin zur Elimination des

pathogenen R. equi mit einer drastischen Absorptionsminderung von Clarithromycin

verbunden ist und dass auch die Akkumulation im Wirkkompartiment, den

bronchoalveolären Lavagezellen, deutlich beeinträchtigt ist. Dennoch werden in der

5 Zusammenfassung

24

pulmonalen Epithelialflüssigkeit und den bronchoalveolären Lavagezellen therapeutisch

ausreichend hohe Konzentrationen erreicht. Wir konnten im Vergleich der akuten und der

chronischen Interaktion der Antibiotika die Beteiligung von intestinalen

Transportmechanismen, die durch Rifampicin modulierbar sind, nachweisen. Die detaillierte

Aufklärung der beteiligten Transportproteine bietet Ansatzpunkte für zukünftige

Forschungsarbeiten.

6 Literaturverzeichnis

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7 Publikationen

32

7 Publikationen

7.1 LC-MS/MS method for the simultaneous determination of clarithromycin,

rifampicin and their main metabolites in horse plasma, epithelial lining fluid and

broncho-alveolar cells (Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis

2011; 55(1):194-201).

7.2 Concentration of the macrolide antibiotic tulathromycin in broncho-alveolar

cells is influenced by comedication of rifampicin in foals (Naunyn

Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology 2010;381(2):161-9)

7.3 Oral absorption of clarithromycin is nearly abolished by chronic comedication

of rifampicin in foals (Drug Metabolism and Disposition, accepted for

publication June 20th, 2011; doi:10.1124/dmd.111.039206)

7.4 Clarithromycin is absorbed by an intestinal uptake mechanism which is

sensitive to major inhibition by Rifampicin – results of a short-time drug

interaction study in foals (Drug Metabolism and Disposition, under review)

J Pharm Biomed Anal. 2011;55(1):194-201 7.1 Publikationen

33

7.1 LC-MS/MS method for the simultaneous determination of clarithromycin,

rifampicin and their main metabolites in horse plasma, epithelial lining

fluid and broncho-alveolar cells (Journal of Pharmaceutical and

Biomedical Analysis 2011; 55(1):194-201).

Eigene Leistung:

Material und Methoden

o Planung und Entwicklung der analytischen Methode zur quantitativen

Bestimmung der Analyten in den biologischen Matrices bei Fohlen

o Validierung der analytischen Methode und fortlaufende Qualitätssicherung

o Vermessung der in der klinischen Studie gewonnenen Proben mit der neu

entwickelten Methode

Ergebnisse

o biometrische Auswertung dieser Ergebnisse (inkl. Qualitätsdaten)

o Interpretation der Validierungsdaten

Abfassung des Manuskriptes

Stefan Oswald:

Anleitung bei der Planung, Durchführung, Auswertung und Validierung der

analytischen Messungen

Anleitung zur Interpretation der Validierungsdaten

Mitarbeit bei der Planung und Korrektur des Manuskriptes

Monica Venner:

Mitarbeit bei der Abfassung und Korrektur des Manuskriptes

Werner Siegmund:

Planung und Überwachung aller Experimente sowie inhaltliche Begleitung und

Korrektur bei der Erstellung des Manuskriptes

Unterschrift des Betreuers

7.1 Publikationen J Pharm Biomed Anal. 2011;55(1):194-201

34


35


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41

7.2 Publikationen Naunyn-Schmied Arch Pharmacol. 2010; 381:161-169

42

7.2 Concentration of the macrolide antibiotic tulathromycin in broncho-

alveolar cells is influenced by comedication of rifampicin in foals

(Naunyn Schmiedeberg’s Archives of Pharmacology 2010;381(2):161-9)

Eigene Leistung:


o Transportuntersuchungen an isolierten Membranvesikeln

o Mitarbeit bei der Probenverarbeitung in der klinischen Studie

Ergebnisse

o Auswertung der Experimente zu den Transportuntersuchungen an isolierten

Membranvesikeln

o Auswertung der Genexpressionsanalysen

o alle pharmakokinetischen und biometrischen Auswertungen aus der

klinischen Studie

o Interpretation sämtlicher Ergebnisse sowohl aus den

Transportuntersuchungen an Zellen und Membranvesikeln wie auch der

Genexpressionsanalysen und pharmakokinetischen Daten sowie den

statistischen Auswertungen


Monica Venner:

Mitarbeit bei der Planung und Durchführung der tierexperimentellen Studie


Nina Höhensteiger:

Durchführung tierärztlicher Leistungen: Applikation der Arzneimittel, Narkose,

Blutabnahmen, Bronchoskopie mit bronchoalveolärer Lavage

Birthe Schock:

Durchführung tierärztlicher Leistungen: Applikation der Arzneimittel, Narkose,

Blutabnahmen, Bronchoskopie mit bronchoalveolärer Lavage

Alexa Bornhorst:

Durchführung der Genexpressionsanalysen

Naunyn-Schmied Arch Pharmacol. 2010; 381:161-169 7.2 Publikationen

43

Markus Grube:

Mitarbeit bei der Gestaltung und Abfassung des Manuskriptes

Ulrike Adam:

Durchführung und Auswertung der Transportversuche an ABCB1 bzw. ABCC2

überexprimierenden MDCKII-Zellen

Eberhard Scheuch:

Durchführung aller analytischen Arbeiten

Werner Weitschies:


Dieter Rosskopf:


Heyo K. Kroemer:

Mitarbeit bei der Korrektur des Manuskriptes

Werner Siegmund:

Planung und Überwachung der Experimente, Anleitung zur Interpretation der

Ergebnisse und Mitarbeit bei der Abfassung des Manuskriptes



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DMD, accepted for publication, June 20th, 2011 7.3 Publikationen

53

7.3 Oral absorption of clarithromycin is nearly abolished by chronic

comedication of rifampicin in foals (Drug Metabolism and Disposition,

accepted for publication June 20th, 2011; doi:10.1124/dmd.111.039206)

Eigene Leistung:


o tierexperimentelle Studie: Planung und Durchführung aller Arbeiten in der

klinischen Studie, die keine tierärztliche Approbation erfordern. Im

Speziellen: Erstellung der Studiendokumente, Verarbeitung der Blutproben

zur Bestimmung der Pharmakokinetik, Verarbeitung der in der Studie

gewonnenen pulmonalen Proben, inkl. der bei der bronchoalveolären Lavage

gewonnenen Spülflüssigkeit, Aufteilung in Lavageflüssigkeit und

bronchoalveoläre Zellen sowie die Zellzahlbestimmung.

o Arzneimittelanalytik: Durchführung aller Arzneimittelanalysen zu den

Antibiotika in den biologischen Matrices aus den tierexperimentellen

Untersuchungen, inkl. Probenaufbereitung

o Genexpressionsuntersuchungen in den Alveolarmakrophagen und

Bronchialepithelzellen mittels TaqMan®-Technologie

o alle biometrischen Analysen

Ergebnisse

o Auswertung der pharmakokinetischen Daten der klinischen Studie

o Auswertung der Konzentrationsbestimmung der Sterole

o Auswertung der Genexpressionsanalysen

o Auswertung sämtlicher biometrischer Analysen

o Interpretation sämtlicher Ergebnisse der Genexpressionsanalysen,

Arzneimittelanalysen und den resultierenden pharmakokinetischen Daten,

der Sterolmessungen sowie der statistischen Auswertungen


Wiebke Block:

Durchführung tierärztlicher Arbeiten bei den Fohlen: Applikation der Arzneimittel,

Narkose, Blutabnahmen, Bronchoskopie mit bronchoalveolärer Lavage und

Bronchialbiopsie

Stefan Oswald:

7.3 Publikationen DMD, accepted for publication, June 20th, 2011

54

Anleitung und Überwachung der Durchführung und Auswertung analytischer

Arbeiten zur Bestimmung der Antibiotikakonzentrationen in den biologischen Proben

aus der tierexperimentellen Studie

Mitarbeit bei der Abfassung des Manuskriptes

Johanna Freyer:

Mithilfe bei der Durchführung der Genexpressionsanalysen

Markus Grube:

Mitarbeit bei der Planung der Experimente sowie bei der Abfassung des

Manuskriptes

Heyo K. Kroemer:


Marc Lämmer:

Mithilfe bei der Durchführung der tierärztlichen Arbeiten bei Fohlen

Dieter Lütjohann:

Durchführung der Konzentrationsbestimmung der Sterole

Monica Venner:

Mitarbeit bei der Planung und Überwachung der tierärztlichen Arbeiten sowie bei der

Planung und Korrektur des Manuskriptes

Werner Siegmund:

Planung der Experimente, Anleitung zur Interpretation der Daten sowie Mitarbeit bei

der Abfassung des Manuskriptes



55

Reprinted with permission of the American Society for Pharmacology and Experimental

Therapeutics. All rights reserved.

ORAL ABSORPTION OF CLARITHROMYCIN IS NEARLY ABOLISHED BY CHRONIC

COMEDICATION OF RIFAMPICIN IN FOALS

Jette Peters, Wiebke Block, Stefan Oswald, Johanna Freyer, Markus Grube, Heyo K.

Kroemer, Marc Lämmer, Dieter Lütjohann, Monica Venner, Werner Siegmund

Form the Department of Clinical Pharmacology (JP, SO, JF, WS) and Department of

General Pharmacology (MG, HKK), University of Greifswald; the Department of Clinical

Chemistry and Clinical Pharmacology, University of Bonn, (DL); the Veterinary Clinic (MV),

Trift 4, 38162 Destedt, and the Lewitz Stud, Lewitzhof 1, 19306 Neustadt-Glewe, Germany

(WB, ML)

Abstract

The delivery of clarithromycin (CRL) to its site of action in bronchial/alveolar epithelial cells

(EC), bronchial epithelial lining fluid (ELF) and bronchoalveolar lavage cells (BALC) may be

influenced by CYP3A4 and the drug transporters ABCB1, ABCC2 and OATPs which can be

modulated and/or upregulated via the nuclear pregnane X receptor (PXR) by rifampicin

(RIF). Therefore, we evaluated disposition and pulmonary distribution of CLR (7.5 mg/kg

b.i.d., 21 days) and expression of ABCB1, ABCC2, OATP1A2 and OATP2B1 in EC and

BALC before and after comedication of RIF (10 mg/kg b.i.d., 11 days) in 9 healthy foals (41-

61 days, 115-159 kg) in which the genetic homology of drug transporters is close to their

human analogs. After RIF comedication, relative bioavailability of CLR decreased by more

than 90%. Concentrations in plasma (29.8±26.3 ng/ml vs. 462±368 ng/ml), ELF (0.69±0.66

µg/ml vs. 9.49±6.12 µg/ml) and BALC (10.2±10.2 µg/ml vs. 264±375 µg/ml, all p<0.05) were

lowered drastically whereas levels of the metabolite 14-hydroxyclarithromycin (14OH-CLR)

were not elevated despite higher 4β-OH-cholesterol/cholesterol plasma concentration ratio,

a surrogate for CYP3A4 induction. In presence of CLR, ABCC2 and PXR mRNA content

were significantly and coordinately (r2=0.664, p<0.001) reduced in BALC after RIF. In EC,

mRNA expression of OATP1A2 increased but of OATP2B1 decreased (both p<0.05).

RIF interrupts oral absorption and decreases CRL plasma levels below the minimal

inhibitory concentration for eradication of Rhodococcus equi. Evidence exists for RIF to

influence the cellular uptake of CLR in bronchial cells and the PXR expression in BALC in

presence of high CLR concentrations.


56

Introduction

Efficacy of drugs is dependent on the availability of active concentrations at the site(s) of the

desired pharmacodynamic effect. In the case of infectious lung diseases, for instance, the

minimum inhibition concentrations (MIC) for antimicrobial agents must be exceeded in the

environment of the respective bacteria; i.e. in the bronchial and alveolar epithelial cells

(EC), in the bronchial epithelial lining fluid (ELF) and in bronchoalveolar lavage cells (BALC)

of which about 80% are alveolar macrophages. Thus, the frequently prescribed macrolide

antibiotics penetrate into these pulmonary spaces to reach drug levels many times above

the concurrent plasma concentrations at steady-state (BALCELFplasma) (Conte, Jr. et

al., 1995). The mechanisms by which macrolides accumulate in pulmonary cells are poorly

understood. So far, trapping of the basic compounds in acidic compartment of alveolar

macrophages (i.e. lysosomes, endosomes) is the only plausible rationale. However,

BALC/plasma gradients of 50-100 : 1 and steeper and accumulation in the

alveolar/bronchial ELF are not solely explainable by base trapping. There is ample evidence

that unidirectional penetration of drugs from the blood throughout the vascular and the

alveolar/bronchial epithelium into the alveolar/bronchial ELF and from there into the BALC is

achieved by the coordinate interplay of multidrug transporters. To the current knowledge,

the cell membranes along the pulmonary penetration route are equipped with uptake

carriers of the organic anion transporting polypeptide (OATP), organic cation transporter

(OCT) and peptide transporter (PEPT) families and with efflux carriers of the ATP-binding

cassette (ABC) family which are also expressed along the intestinal/hepatic absorption

route of the drugs (Bosquillon, 2010; Chan et al., 2004).

To evaluate whether and how multidrug transport proteins influence absorption and

pulmonary distribution of macrolides, we initiated a multiple-dose drug interaction study with

clarithromycin (CLR) and rifampicin (RIF) in healthy foals. CLR is a substrate of cytochrome

P450 (CYP) 3A4, ABCB1 (P-glycoprotein) and probably of ABCC2 (multidrug resistance

associated protein 2) and of OATPs (Garver et al., 2008; Seithel et al., 2007; Suzuki et al.,

2003; Lan et al., 2009; Munic et al., 2010). The efflux carriers ABCB1 and ABCC2 and

several OATPs are modulated in the presence of RIF (Geick et al., 2001; Vavricka et al.,

2002) After chronic treatment, however, RIF can up-regulate gene expression of intestinal

and hepatic CYP3A4, ABCB1, ABCC2 and OAP1A2 via the nuclear pregnane X receptor

(PXR) pathway (Lau et al., 2006; Tirona, 2011; Vavricka et al., 2002; Zong and Pollack,

2003). We have recently shown, that RIF may also regulate pulmonary ABCB1 and ABCC2

of healthy foals (Venner et al., 2010). Therefore, the overall changes in absorption and

pulmonary distribution of CRL may be caused by competitive effects in presence of RIF and

by the chronic effects as caused by PXR-type transporter induction.


57

We have chosen foals for our mechanistic drug interaction study because of the clinical

challenge in horse-breeding to eradicate Rhodococcus equi which resists innate

macrophage defense in adult horses but causes severe caseous, necrotisizing lung

infection in the foals with high mortality rate of up to 80% (Hillidge, 1987). Combined

antimicrobial therapy with macrolides and RIF has become the most effective treatment

protocol to increase the survival rate from 20% to nearly 90% (Hillidge, 1987). In a

retrospective study it was shown that the combination of RIF with CLR is superior to

combinations with erythromycin or azithromycin (Giguère et al., 2004). Secondly, we have

chosen the animal model because bronchoscopy and bronchoalveolar lavage are accepted

diagnostic techniques in foals for sampling of biomaterial. Finally, the sequence homology

of the equine drug transporters is distinctly closer to the human analogs (ABCB1, 92%;

ABCC2, 82%; OATP1A2, 85%; OATP2B1 89% on protein basis) than, for instance, the

homology of the transporter of rats which are often used to predict the situations in human

beings (Abcb1a, 86%; Abcb1b, 79%; Abcc2, 77%; Oatp1a5, 72%; Oatp2b1, 76% on protein

basis, www.ncbi.nih.gov, www.ebi.ac.uk) (Hagenbuch and Meier, 2004).

Material and methods

Study protocol

Animals: The drug interaction study was performed after approval by the State Authority of

Mecklenburg/Vorpommern (reference code: LALLF M-V/TSD/7221.3-1.1-066/08). Nine

foals (4 females, 5 males, age 41-61 days, body weight 115-159 kg) of warm-blooded

horses of the Oldenburger trait were included after confirmation of good health by physical

examinations including sonography of the lung and routine clinical-chemical and

hematological screenings. The animals were kept at natural light rhythm on paddocks

together with their mares and had free access to equine milk, hay, oats and tap water. All

clinical examinations were done in individual stables which were covered with straw. Prior to

the study, the foals did not receive any other medication.

Study design: The drug interaction study was performed under steady-state condition within

a study period of 21 days. Initially, the foals were treated orally with 7.5 mg/kg CLR (Abbott,

Wiesbaden, Germany) twice daily for 6 days. A last dose was given in the morning of the 7th

study day. On treatment days 9-19, the animals received 7.5 mg/kg CLR and 10 mg/kg RIF

(Gruenenthal GmbH, Aachen, Germany) twice daily. Administration of CLR was continued

until the morning of the 21st day while RIF was not given on the 20th day or in the morning of

the 21st day to avoid competitive interferences with the pharmacokinetics of CLR after last

administration. RIF tablets suspended in 30 ml water and the commercial CLR suspension

were sprinkled in the mouth using a syringe to be completely swallowed by the foals.


58

To evaluate pharmacokinetics of CLR on treatment days 7 and 21, venous blood was

collected via an indwelling jugular vein cannula (Vygon, Aachen, Germany) before and 0.33,

0.66, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6, 8, 12, 16, 24, 36 and 48 h after administration. Plasma was

separated by centrifugation at 2.000 x g for 10 min and stored at least at -80°C until further

analysis.

To measure drug distribution in the ELF and BALC, a bronchoalveolar lavage (BAL) was

performed 12 h after the last administrations of CLR of each study period as described

recently (Venner et al., 2010). In brief, after anesthesia with ketamine (Serumwerke,

Bernburg, Germany) and diazepam (ct-Arzneimittel, Berlin, Germany), a flexible fiberscope

(Karl Storz, Tuttlingen, Germany) was advanced through the nose into the trachea to take

two biopsy specimen from the bronchial epithelium behind the carina. Then, the endoscope

was advanced and wedged in a second-generation bronchus. The lavage was performed by

repeated instillation of 100 ml phosphate buffered saline (pH 7.4, temperature about 37 °C).

The first aspirate was discarded to remove the excess of epithelial cells. Three additional

aliquots were combined, filtered through a layer of gauze (Lohmann and Rauscher,

Neuwied, Germany) and centrifuged at 400 g for 10 min. The BALC pellet consisted of 77-

84.5% alveolar macrophages, 11.5-18.5% lymphocytes and 2.5-8.5% mast cells as

confirmed by May-Gruenwald staining. For mRNA analysis of ABCB1, ABCC2 and PXR,

the biopsy specimens and aliquots of 5 106 BALC were incubated overnight with RNAlater

buffer (4 °C) (Qiagen, Hilden, Germany) before freezing. For drug analysis, aliquots of

BALC and of the supernatant were shock frozen using dry ice and stored at -80°C until

further use.

Quantitative assays for clarithromycin and 4-β-hydroxycholesterol

CLR and 14-hydroxyclarithromycin (14OH-CLR) were quantified in plasma, lavage fluid and

BALC using a validated LC-MS/MS method as recently described (Oswald et al., 2011a).

The limit of quantification for all matrices was 2.5 ng/ml. The within-day accuracy of the

assay ranged from -11.8 to 9.3% of the nominal concentrations and precision was 1.6 to

11.2% of means (coefficient of variation). Between-day accuracy was -11.7 to 8.6% of the

nominal concentrations and precision was 3.7 to 10.0% of the respective mean control

values. CLR and 14OH-CLR concentrations in ELF were assessed by normalizing to the

concentration ratio of urea in plasma over bronchoalveolar fluid and in BALC to a mean

macrophage cell volume of 1.2 µl/106 cells in foals (Jacks et al., 2001; Rennard et al.,

1986). Urea was quantified using the kit LT-UR 0010 (Labortechnick Eberhard Lehmann,

Berlin, Germany).

Plasma concentrations of 4-β-hydroxycholesterol (4β-OH-C) were assayed using GC-MS

for a isotope dilution method with [26.26.26.27.27.27-2H6] 4β-OH-C as an internal standard

as described previously (Tomalik-Scharte et al., 2009). The lower limit of quantification was


59

3.0 ng/ml for plasma. Between-day and within-day precision was 2.1 and 2.7%,

respectively, of the mean values and between-day and within-day accuracy was between

2.9 and 3.3% of the nominal values.

Quantitative mRNA expression of drug transporters and PXR

The bronchial biopsy specimens and BALC were homogenized using a dismembrator

(Braun, Melsungen, Germany), total RNA was prepared applying the NucleoSpin® RNAII Kit

(Macherey-Nagel, Dueren, Germany) and reverse transcription of 100 ng RNA was

performed using the SuperScript®VILO™ cDNA Kit (Invitrogen, Karlsruhe, Germany)

according to the protocols of the manufacturers. The quantitative real-time RT-PCR analysis

for ABCB1, ABCC2 and PCR was conducted using primers assembled for equine mRNA

(PrimerDesign, Southampton, United Kingdom). The sequences were as follows,

ABCB1_SE 5`-AGGATGTTCTGTTGGTATTCTCA-3`; ABCB1_AS 5`-

GACACTTTGGCTTTGGCATAG-3`; ABCC2_SE 5`-ACTTCAATG-CCACCAACTATCC-3`;

ABCC2_AS 5`-CACCTTGTGCTAATCCCAGAG-3`; PXR_SE 5`-

CGATTGTCCAAAGTTGATAATTTACG-3` and PXR_AS 5`-CGGAGCCATTAG-

GAATAGTAGAAT-3`. Sequences for the probes for ABCB1, ABCC2 and PXR were 5`-

(FAM)-CAAATGAACTGACCTGCCCCACTGCC, 5`-(FAM)-

CCATAGACGCCAACTCTCAAGTCCCTCT and 5`-(FAM)-

CTCTCTGCCAACCATCTCCATAGCCT, respectively. For mRNA quantification of

OATP1A2 and OATP2B1, we used equine primers according to the instruction of the

manufacturer (Applied Biosystems, Foster City, USA). The RT-PCR was performed using

the TaqMan® method with human 18s rRNA (Applied Biosystems, Foster City, USA) as

reference due to the high homology between the equine and human gene. Each experiment

was conducted in duplicates. Gene expression was quantified using the ΔΔct method.

Biometrical evaluation

Maximum (Cmax) and minimum (Cmin) plasma concentrations and the time of Cmax (tmax) at

steady-state were taken from the plasma concentration-time curves. The area under the

plasma concentration-time curve (AUC0-12h) was calculated using the trapezoidal rule and

the average plasma concentration (Cav) was derived (AUC/dosing interval). Terminal

elimination half-life (t1/2) was estimated by log-linear regression analysis. For group result,

arithmetic means±standard deviations (mean±SD) are given. Differences between two

groups were evaluated using the nonparametric Wilcoxon test and correlations were

assessed using Spearman´s rank test, both with p<0.05 as level of significance.


60

Results

CLR was slowly absorbed during the chronic oral treatment to generate average plasma

concentrations between 133 ng/ml and 1300 ng/ml at steady-state (Figure and Table 1).

The plasma exposure (AUC0-12h) of the metabolite 14OH-CLR amounted to 33±9% of the

CLR exposure (metabolic ratio). CLR accumulated along the pulmonary distribution route to

reach more than 30-fold higher levels in the ELF and 700-fold higher concentrations in

BALC than in plasma at trough 12 hours after administration. 14OH-CLR underwent similar

accumulation even though to a lower extent (ELF, about 5-fold; BALC, about 44-fold; Table

2). Please note in Table 1, that the concentrations for CLR and 14OH-CLR in plasma are

given in ng/ml and in ELF and BALC in µg/ml. CLR was eliminated in foals at steady-state

with terminal half-lives between 4.7 and 7.3 hours.

After comedication of RIF for 11 days, relative bioavailability of CLR decreased by more

than 90%; accordingly, the average plasma concentrations (Cav) were significantly reduced

and fell even below the minimum inhibition concentration (MIC) for Rodoccocus equi (Jacks

et al., 2003). The elimination rate was not significantly influenced. The drastic decrease of

CLR bioavailability did not result in a proportional increase of metabolite exposure, although

relative 14OH-CLR exposure increased more than 7-fold compared to the situation before

RIF comedication (metabolic ratio: 2.56±0.97 versus 0.33±0.09, p<0.05). Lower

bioavailability of CLR after RIF was also associated with parallel lowering of CLR and

14OH-CLR in ELF and BALC by more than 90% and 60%, respectively, as compared to the

levels reached by CLR mono-therapy. Remarkably, CLR penetrated significantly better into

the ELF after RIF comedication as confirmed by the increase of the ELF/plasma

concentration ratio (Figure 2). RIF treatment was also associated with induction of systemic

metabolic activity. The 4β-OH-C/cholesterol plasma concentration ratio significantly

increased from 0.68±0.34 to 1.05±0.40 (p=0.004) (Figure 3). However, the pulmonary

mRNA expression of the efflux transporters ABCB1 and ABCC2 and of the nuclear PXR

receptor was not significantly up-regulated by RIF; the bronchoalveolar mRNA content of

ABCC2 and PXR was even significantly reduced (Figure 4). Nevertheless, we found a

significant correlation between the decrease in PXRmRNA and the decrease in

ABCC2mRNA expression in BALC (Figure 5). OATP1A2mRNA and OATP2B1mRNA were

expressed in EC. In BALC, only OATP2B1 was markedly expressed. RIF comedication

significantly decreased the mRNA content of OATP1A2 in EC but increased that of

OATP2B1 (Figure 6). Content of both OATPmRNAs was not significantly correlated to the

content of PXRmRNA


61

Discussion

By this drug interaction study it was clearly shown, that chronic comedication of RIF leads to

a dramatic lowering of the average steady-state plasma concentrations of CLR by more

than 90% and in turn to a similarly limited distribution into the bronchial ELF and BALC. RIF

comedication was not associated with up-regulation of the pulmonary efflux transporters

ABCB1 and ABCC2. Nevertheless, the distribution of CLR into the ELF in absolute

measures was decreased while it was nearly twofold increased relative to the (lowered)

plasma levels after RIF. Interestingly, RIF comedication was associated with decreased

OATP1A2mRNA but increased OATP2B1mRNA expression levels in EC.

The dramatic decrease of the steady-state levels is doubtlessly the consequence of nearly

complete abolition of CLR bioavailability because the plasma half-lives remained

unchanged after comedication of RIF. In healthy foals, bioavailability of CLR after oral

administration is incomplete (60%) as caused at least in part by presystemic “first pass”

metabolism by which the active 14OH-CLR is generated (Womble et al., 2006). The results

of in-vitro studies using human liver microsomes and recombinant CYPs suggested that

CYP3A4 plays a major role in the overall metabolic clearance of CLR (Suzuki et al., 2003).

Another reason for deficit bioavailability could be intestinal efflux transport. Macrolides are

substrates of ABCB1 as confirmed by competitions assays using Caco2, MDCK and

ABCB1-overexpressing MES-SA/Dx5 (ATCC, CRL-1976) human uterine sarcoma cells.

From these in-vitro studies, the overall impression can be derived, that CLR has moderate

affinity to ABCB1 (Munic et al., 2010; Pachot et al., 2003; Hughes and Crowe, 2010). There

is also evidence for macrolides to be substrates of ABCC2 as shown for azithromycin by

pharmacokinetic studies in Abcc2-deficient rats and in a drug interaction study with

probenecid, an inhibitor of ABCC2 (Sugie et al., 2004). Therefore, the drastic lowering of the

average CLR plasma concentrations by more than 90% may have resulted from induction of

hepatic and intestinal CYP3A4 and intestinal ABCB1, and probably ABCC2.

RIF is a prototype ligand for the nuclear PXR receptor that regulates many drug

metabolizing enzymes and multidrug transport proteins in the small intestine and the liver

(Handschin and Meyer, 2003; Glaeser, 2011; Oswald et al., 2011b; Tirona, 2011). Induction

of hepatic CYP3A4 in our study was confirmed by significant increase of the 4ß-

hydroxycholesterol/cholesterol plasma concentration ratio, an accepted endogenous

metrics for hepatic CYP3A4 activity in-vivo (Yang and Rodrigues, 2010). Nevertheless, the

plasma levels of 14OH-CLR increased only to a limited extent and did not agree with the

large loss in CLR bioavailability. Therefore, induction of intestinal efflux transport seems to

be the major reason for lower bioavailability which is also supported by the results of clinical

studies in man. According to the summary of product characteristics (SMPC) of the

manufacturers for CLR, strong enzyme inducers of the CYP450 system may accelerate the


62

metabolism of CLR and, by this, decrease the plasma levels of the parent drug in human

patients by about 30-40% and increase the concentrations of the microbiologically active

14OH-CLR by the same extent (e.g. Klacid®, Abbott, Wiesbaden, Germany). In contrary to

the product information, the results of two clinical studies in patients with pulmonary

Mycobacterium avium complex infections showed a somewhat different feature. In all

patients, the trough plasma concentrations of CLR were markedly lower when administered

together with RIF (<20% of the levels after monotherapy); the 14OH-CLR levels, however,

were not different (Wallace, Jr. et al., 1995; Taki et al., 2007). Interestingly, the decrease of

CLR exposure could be avoided if RIF and CLR were administered at different times, i.e.,

CLR seems to be absorbed by a mechanism which is susceptible to direct competition with

RIF (Taki et al., 2007) but this mechanism has not been identified yet.

Therefore, we are encouraged to provide an alternative hypothesis to which inhibition of a

so far unknown intestinal uptake transporter in the presence of RIF may have caused lower

bioavailability of CLR; instead of or additionally to the absorption deficit as caused by RIF-

type induction of ABCB1. Candidates might by members of the OATP-family which are

known to be modulated by RIF in-vitro (Vavricka et al., 2002). Firstly, CLR is a potent

inhibitor of the taurocholate uptake in rat Oatp1a5-transfected MDCK cells, the nearest

analog to human OATP1A2. Both rat Oatp2b1 and human OATP2B1 were not inhibited by

clarithromycin (Garver et al., 2008; Lan et al., 2009). Secondly, oral bioavailability of CLR in

rats was reduced by 45% in the presence of RIF. Thirdly, RIF had no effect on body

clearance of CLR and did most likely not cause induction of metabolic enzymes and/or

transporters after the short-time comedication in this study (120-180 min) (Garver et al.,

2008). Therefore, a member of the OATP-family might be involved in intestinal absorption of

CLR although there is little evidence that rat Oatp1a5/human OATP1A2 or

rat Oatp2b1/human OATP2B1 really are the candidates (Lan et al., 2009). Hence,

alternative intestinal absorption pathways must exist which are susceptible to inhibition by

RIF. Anyway, in assuming competition of RIF with an intestinal uptake transporter for CLR,

it must be considered that RIF also modulates ABCB1 and ABCC2 (Zong and Pollack,

2003; Lau et al., 2006) which are also expressed in the horse intestine (Tyden et al., 2009).

Thus, the net effect resulting from modulation of intestinal OATP(s) and/or induction of

ABCB1/ABCC2 must have overshadowed in extent the modulating effects of RIF on the

ABCB1/ABCC2-mediated efflux of CLR.

Whatsoever mechanism has influenced the “first-pass” route of CLR, the average steady-

state plasma concentrations in our foals dropped down to levels below the MIC (90%) of

0.12 µg/ml for Rhodoccocus equi (Jacks et al., 2003). Although manifold decreased, the

concentrations in the ELF and BALC were still above the desired MIC. Nevertheless, there

are many doubts from a pharmacokinetic point of view that combination therapy of CLR with


63

RIF might really be superior to other eradication protocols as suggested by the results of a

retrospective clinical study in foals (Giguère et al., 2004). Absence of major drug

interactions as shown in our recent pharmacokinetic study with tulathromycin and RIF

should be confirmed before launching a combination treatment in clinical practice (Venner

et al., 2010).

A second major finding in our study was the more intensive distribution of CLR into the

bronchial ELF despite markedly lower plasma concentrations after RIF comedication. We

have hypothesized that finding in advance because, as discussed above, CLR is a

substrate of ABCB1 (and probably of ABCC2) and RIF is a strong inducer of both. Both

ABCB1 and ABCC2 are expressed in the apical membrane of the EC and in the cell

membrane of BALC and both may mediate active efflux of their substrates into the ELF and

the environment of macrophages, respectively (Bosquillon, 2010; Seral et al., 2003a; Seral

et al., 2003b). According to our recent preliminary data, mRNA expression of ABCB1 and

ABCC2 (semi-quantitative RT-PCR in pooled samples) can be up-regulated by RIF in foals

(Venner et al., 2010). We also found, that the trough BALC concentrations of RIF after

administration of 10 mg/kg given twice daily (6.0±1.3 µmol/l, N=9, Oldenburger trait,

unpublished own result) are in the same order of magnitude as the in-vitro concentrations

necessary to activate the nuclear PXR and to increase CYP3A4, ABCB1 and ABCC2

activity (2-10 µM) (Geick et al., 2001; Kast et al., 2002). In fact, our results did not suit our

working hypothesis; ABCB1 expression remained unchanged and ABCC2 was even

significantly down-regulated by RIF comedication. However, we must consider some

methodological limitations because quantitative PCR was performed 48 h after RIF last

administration. We cannot exclude that mRNA levels returned to their pre-treatment levels

while expression of the transporter protein in the cell membrane was still high, causing an

increase in CLR accumulation in the ELF.

Pulmonary penetration of drugs is extremely complex, not well understood and not only

mediated by efflux transporters. In man, the uptake carriers PEPT2 and OCTN2 are

expressed in the apical membrane of the EC. In alveolar macrophages, OCTN1 and

OATP2B1 are expressed. In the lung, mRNA transcripts were also identified for OCT3,

OCTN1, OATP1A2 and OATP2B1 (Bosquillon, 2010; Endter et al., 2009; Moreau et al.,

2011). OATP1A2 and 2B1 are highly conserved in Equus caballus (mRNA homology

compared to human genes: OATB1A2 88%, OATP2B1 84%, ww.ncbi.nih.gov,

www.ebi.ac.uk). To our data in foals, OATP1A2 is expressed in EC and OATP2B1 in EC

and BALC; the exact cellular localization is unknown so far.

It is rather speculative to find a conclusive rationale for higher ELF/plasma ratios of CLR

after RIF comedication because of the complexity of parallel processes. In our study, equine

OATP2B1 in EC was regulated by RIF. Others also found OATP1A2 to be induced by RIF


64

via a PXR response element (Meyer zu Schwabedissen et al., 2008). On the other hand,

OATPs are inhibited in the presence of RIF (Vavricka et al., 2002). If the pulmonary OATPs

are localized to the basolateral site of EC, higher ELF/plasma ratios are explained by

upregulation of OATP2B1 by chronic RIF comedication. In case of apical localization of the

uptake carriers, the pharmacokinetic phenomenon in presence of RIF (downregulation and

or inhibition) is in line with delayed CLA reuptake from the bronchial ELF back to EC during

systemic elimination of the drug. Therefore, information on the pulmonary localization of

OATPs and quantitative data on affinity of CLA and RIF to the uptake transporters and their

regulatory elements is needed before the results of the drug interaction study can be

rationally discussed.

A third interesting and, to our knowledge, new finding in our study was the coordinate down-

regulation of ABCC2mRNA expression in significant correlation to the PXRmRNA content

(r=0.815) in the BALC after comedication of RIF; a tendency for lower PXRmRNA levels

was also observed in EC. Please notice, that the down-regulation of PXR occurred in the

presence of high cellular CLR concentrations (about 350 mM !). PXR-activating

concentrations of RIF in presence of high CLR concentrations obviously inhibit mRNA

expression of PXR whereas the interaction between PXR with other nuclear receptors and

transcriptional factors that regulate the ABCC2 target gene seemed not to be disrupted by

RIF/CLR as shown for ketoconazole and CYP3A4 (Lim et al., 2009). Future research is

required to elucidate the mechanism behind our finding in BALC of foals.

Conclusions: Chronic comedication of RIF in foals leads to an unexpectedly strong

decrease of the bioavailability of CLR. By this undesired drug interaction, the plasma levels

fall below the MIC for eradication of Rhodococcus equi. Evidence exists for RIF to influence

the cellular uptake of CLR in bronchial cells and the PXR expression in BALC in presence

of high CLR concentrations.


65

Acknowledgements

The authors thank Gitta Schumacher, Sabine Bade and Danilo Wegner for excellent

technical assistance.


66

Authorship Contributions

Participated in research design: Peters, Grube, Kroemer, Venner and Siegmund.

Conducted experiments: Peters, Block, Freyer, Lämmer and Venner.

Contributed new reagents or analytic tools: Oswald and Lütjohann.

Performed data analysis: Peters, Block and Oswald.

Wrote or contributed to the writing of the manuscript: Peters, Oswald, Grube, Kroemer,

Venner and Siegmund.


67

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70

Legends for Figures

Figure 1: Plasma-concentration time curves of clarithromycin (above) and 14-

hydroxyclarithromycin (below) after chronic treatment with 7.5 mg/kg twice

daily before (-RIF) and after (+RIF) comedication of rifampicin (10 mg/kg b.i.d.,

11 days) in 9 healthy foals.

Figure 2: Accumulation of clarithromycin in bronchial epithelial lining fluid (ELF) and

bronchoalveolar lavage cells (BALC) after chronic treatment with 7.5 mg/kg

twice daily before (-RIF) and after (+RIF) comedication of rifampicin

(10.0 mg/kg b.i.d., 11 days). The cell/plasma ratios are given for 8 healthy foals

(the plasma level was in one animal <LOQ).

Figure 3: 4β-OH-cholesterol/cholesterol plasma concentration ratios before (-RIF) and

after (+RIF) treatment with rifampicin (10.0 mg/kg b.i.d., 11 days) in 9 healthy

foals.

Figure 4: Expression of ABCB1mRNA, ABCC2mRNA and PXRmRNA (relative to

18SrRNA) in bronchoepithelial cells (upper figures) and bronchoalveolar

lavage cells (lower figures) before (-RIF) and after (+RIF) treatment with

rifampicin (10.0 mg/kg b.i.d., 11 days) in 9 healthy foals.

Figure 5: Correlation between the mRNA content of PXR and ABCC2 bronchoepithelial

cells (left) and brochoalveolar lavage cells (right) in 9 healthy foals.

Figure 6: Expression of OATP1A2mRNA and OATP2B1mRNA (relative to 18SrRNA) in

bronchoepithelial cells (EC) and bronchoalveolar lavage cells (BALC) before (-

RIF) and after (+RIF) treatment with rifampicin (10.0 mg/kg b.i.d., 11 days) in 9

healthy foals.


71

Figure 1

0 6 12 18 240

200

400

600

800

1000

RIF

RIF

cla

rith

rom

ycin

(n

g/m

l)

0 6 12 18 240

50

100

150

200

250

14

OH

-cla

rith

rom

ycin

(n

g/m

l)

time (h)


72

Figure 2

-RIF +RIF0

40

80

120

160

p = 0.036

ELF / plasma

concentr

ation r

atio

-RIF +RIF0

400

800

1200

1600

2000

p = 1.000

BALC / plasma

-RIF +RIF0

20

40

60

80

p = 0.110

BALC / ELF

Figure 3

-RIF +RIF

0.0

0.4

0.8

1.2

1.6

2.0

p = 0.004

4O

H-c

hole

ste

rol / chole

ste

rol


73

Figure 4

-RIF +RIF0

2

4

6

8

p = 0.260

ABCB1

18S

rR

NA

ratio

-RIF +RIF0

1

2

3

4

5

p = 0.889

18S

rR

NA

ratio

-RIF +RIF0

1

2

3

4

5

p = 0.441

ABCC2

-RIF +RIF0

1

2

3

4

p = 0.025

-RIF +RIF

0

10

20

30

p = 0.086

PXR

-RIF +RIF0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

p = 0.025

Figure 5

0 5 10 15 20 250

1

2

3

4

5

AB

CC

2 m

RN

A /

18S

rR

NA

r2 = 0.194

p = 0.067

PXR mRNA / 18S rRNA

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.50.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

r2 = 0.664

p < 0.001

PXR mRNA / 18S rRNA


74

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ble

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3 ±

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75

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75

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± 4

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5 (

Wilc

oxo

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st)

7.4 Publikationen DMD, under review

76

7.4 Clarithromycin is absorbed by an intestinal uptake mechanism which is

sensitive to major inhibition by Rifampicin – results of a short-time drug

interaction study in foals (Drug Metabolism and Disposition, under

review)

Eigene Leistung:


o tierexperimentelle Studie: Planung und Durchführung aller Arbeiten in der

klinischen Studie, die keine tierärztliche Approbation erfordern. Im

Speziellen: Erstellung der Studiendokumente, Verarbeitung der Blutproben

zur Bestimmung der Pharmakokinetik, Verarbeitung der in der Studie

gewonnenen pulmonalen Proben, inkl. der bei der bronchoalveolären Lavage

gewonnenen Spülflüssigkeit, Aufteilung in Lavageflüssigkeit und

bronchoalveoläre Zellen sowie die Zellzahlbestimmung.

o Arzneimittelanalytik: Durchführung aller Arzneimittelanalysen in den

biologischen Matrices aus den tierexperimentellen Untersuchungen, inkl.

Probenaufbereitung, ebenso Probenaufbereitung und Vermessung aller

Proben aus den in vitro Transportuntersuchungen im Zellmodell

o Planung und Durchführung sämtlicher Transportuntersuchungen zu

Clarithromycin mittels Kompetitionsassays und Direkttransportversuchen an

transfizierten HEK-Zellen

o alle biometrischen Analysen

Ergebnisse:

o Auswertung aller pharmakokinetischer Daten der klinischen Studie

o Auswertung der Konzentrationsbestimmung der Sterole

o Auswertung der Transportexperimente an transfizierten Zellen

o Auswertung sämtlicher biometrischer Analysen

o Interpretation sämtlicher Ergebnisse der Transportversuche an transfizierten

HEK-Zellen, der Arzneimittelanalysen und den resultierenden

pharmakokinetischen Daten, Interpretation der Sterolmessungen sowie der

statistischen Auswertungen


Karen Eggers:

Mitarbeit bei der Durchführung tierärztlicher Leistungen: Applikation der Arzneimittel,

Narkose, Blutabnahmen, Bronchoskopie mit bronchoalveolärer Lavage

DMD, under review 7.4 Publikationen

77

Stefan Oswald:

Anleitung und Überwachung der Durchführung und Auswertung analytischer

Arbeiten zur Bestimmung der Antibiotikakonzentrationen in den biologischen Proben

aus der tierexperimentellen Studie

Mitarbeit bei der Abfassung des Manuskriptes

Wiebke Block:



Dieter Lütjohann:

Durchführung der Konzentrationsbestimmung der Sterole

Marc Lämmer:



Monica Venner:

Mitarbeit bei der Planung und Überwachung der tierärztlichen Arbeiten sowie bei der

Planung und Korrektur des Manuskriptes

Werner Siegmund:

Planung der Experimente, Anleitung bei der Interpretation der Daten und Mitarbeit

bei der Abfassung des Manuskriptes



78

Clarithromycin is absorbed by an intestinal uptake mechanism which is

sensitive to major inhibition by rifampicin – results of a short-time drug

interaction study in foals

Jette Peters, Karen Eggers, Stefan Oswald, Wiebke Block, Dieter Lütjohann, Marc Lämmer,

Monica Venner, Werner Siegmund

From the Department of Clinical Pharmacology, University of Greifswald (JP, SO, WS), the

Lewitz Stud, Lewitzhof 1, 19306 Neustadt-Glewe, Germany (KE, WB, ML, MV) and the

Department of Clinical Chemistry and Clinical Pharmacology, University of Bonn, Germany

(DL)

Abstract

Pulmonary penetration of clarithromycin (CLR) in epithelial lining fluid (ELF) and broncho-

alveolar lavage cells (BALC) can be influenced by CYP3A4, ABCB1 and to our hypothesis

by a member of the OATP-family for which rifampicin (RIF) is inhibiting in single doses but

inducing after long-term co-medication. To assess the partial inhibitory effect, we measured

absorption and pulmonary distribution of CLR after short-term (2.5 days) co-medication of

RIF after which up-regulation is still not expected. The drug interaction study was performed

with five doses (12h interval) of CLR (7.5 mg/kg) and RIF (10 mg/kg) in nine healthy foals;

horse transporters are very similar in protein sequence and transcriptional regulation to the

human analogues. RIF equally distributed into ELF but reached half the plasma levels in

BALC. The de-acetylated metabolite accumulated 1.4-6-fold in ELF and 8-60-fold in BALC.

CLR did not significantly influence distribution of RIF. CLR and 14-hydroxy-clarithromycin

(14OH-CLR), accumulated approximately 20-40-fold and 1.5-4.5-fold in ELF as well as 300-

1,800-fold and 25-90-fold in BALC, respectively. By RIF, plasma levels of CLR dropped

down by more than 70% without changing 14OH-CLR formation, half-lives of CLR and

14OH-CLR and the 4-ß-hydroxycholesterol/cholesterol ratio, a surrogate for CYP3A4

induction. CLR was an inhibitor of OATP1B3 (IC50=9.50±3.50µM), OATP1B1

(IC50=46.0±2.27µM), OATP1A2 (IC50=92.6±1.49µM) and OATP2B1 (IC50=384±5.30µM) but

not a substrate for these transporters in transfected HEK cells. In conclusion, despite no

significant inducing effects, RIF lowers plasma levels of CLR below the MIC90 of pathogenic

bacteria most likely by inhibition of an unknown intestinal uptake transporter.


79

Introduction

The invasion of orally administered drugs to the sites of pharmacodynamic action, e.g. in

the lung, can be influenced by the activity of drug metabolizing enzymes and transport

proteins in the intestinal wall, the liver and in pulmonary compartments such as the

broncho-epithelial cells (BEC), the epithelial lining fluid (ELF) and luminal cells that can be

sampled by broncho-alveolar lavage (broncho-alveolar-lavage cells, BALC) (Giacomini et

al., 2010; van der Deen et al., 2005). Major factors known to change the function of these

enzymes and transporters are genetic polymorphisms, drug interactions and diseases.

Thus, we have recently evaluated oral absorption and pulmonary distribution of

clarithromycin (CLR) at steady-state before and after long-term co-medication of rifampicin

(RIF) in foals because CLR is a substrate for cytochrome P450 (CYP) 3A4 and for the efflux

transporters ABCB1 (and likely for ABCC2) which are expressed in enterocytes,

hepatocytes, BEC and BALC and which can be induced by chronic treatment with the

pregnane-X receptor (PXR) ligand RIF (Peters et al., 2011; Urquhart et al., 2007).

Pharmacokinetic studies in foals are suitable to predict transporter variability in human

beings because of their body size enabling non-invasive experimental procedures (e.g.

broncho-alveolar lavage, BAL) and because protein sequence of drug transporters in

horses exhibits high homology to the respective human proteins (www.ncbi.nih.gov,

www.ebi.ac.uk). CLR and RIF are components of treatment protocols for eradication of

Rhodococcus equi which causes severe necrotisizing pneumonia with high mortality rate in

foals (Giguère et al., 2004). While information about CLR pharmakokinetics and pulmonary

distribution exists to a certain extend only little is known about RIF pharmakokinetics and its

distribution into pulmonary compartments.

Astonishingly for a well established clinical drug combination, we recognized in our long-

term study, that the plasma levels of CLR fall by more than 90 % even below the minimum

inhibitory concentration required to inhibit the growth of 90% (MIC90%) of Rhodococcus equi

(Jacks et al., 2003). The distribution of CLR into the ELF in absolute measures was

decreased while, interestingly, it was nearly two-fold increased relative to the (lowered)

plasma levels after RIF. A further interesting finding was, that RIF comedication resulted in

decreased OATP1A2 mRNA but increased OATP2B1 mRNA expression levels in BEC,

whereas the expected up-regulation of the pulmonary efflux transporters ABCB1 and

ABCC2 in BEC and BALC did not occur. However, it was unknown whether CLR is a

substrate for OATPs and whether RIF reaches pulmonary compartments in concentrations

known to induce PXR-regulated transporter gene expression in-vitro (Meyer zu

Schwabedissen et al., 2008; Kast et al., 2002; Geick et al., 2001). Furthermore, we could

not clarify whether the nearly abolished CLR absorption resulted entirely from induction of

intestinal efflux via ABCB1/ABCC2 or whether a so far unknown intestinal uptake


80

transporter susceptible to inhibition by RIF was involved, most likely a member of the

OATP-family for which RIF is a strong inhibitor (Vavricka et al., 2002).

To get deeper insights into the mechanisms behind our major findings with CLR after long-

term treatment with RIF, further research was needed, i.e. to measure the exposure of RIF

in lung compartments, to evaluate affinity of CLR to OATPs and to quantify that portion of

the absorption deficit that is most likely caused by inhibition of an intestinal uptake

transporter for CLR. Therefore, we initiated a cross-over drug interaction study with CLR

and RIF at steady-state following short-term repeated dosing by which expression of drug

metabolizing enzymes and drug transporters is not expected to be up-regulated in a

significant manner. Furthermore, we evaluated in vitro whether CLR is a substrate and/or an

inhibitor of OATP1A2, 2B1, 1B1 and 1B3 which are expressed along the oro-hepatic uptake

route of CLR into lung compartments.

Material and methods

Animal experimental study

Animals: The pharmacokinetic CLR-RIF interaction study was performed in healthy warm-

blooded foals (N=9, 6 females, 3 males, age 6-10 weeks, body weight 102-167 kg) of the

Oldenburger trait after approval of the State Authority of Mecklenburg-Vorpommern,

Germany. Good health of the animals was confirmed by physical examination including

sonography of the lung and routine clinical-chemical and hematological screenings. The

animals were housed at natural light rhythm and free access to equine milk, standard

pellets, hay, oats and tap water. All clinical examinations were performed in individual

stables covered with straw. The foals did not receive any other medication for at least 4

weeks prior to the study.

Study protocol: The drug interaction study was performed controlled, three-period, cross-

over with wash-out phases of 11 days between the study periods. In the study periods, the

foals received 5 times either 10 mg/kg RIF (Rifampicin, Gruenenthal GmbH, Aachen,

Germany), 7.5 mg/kg CLR (Klacid, Abbott, Wiesbaden, Germany) or 10 mg/kg RIF in

combination with 7.5 mg/kg CLR in intervals of 12 hours according to the randomization list.

For administration, RIF tablets suspended in 30 ml of water and the commercially available

CLR suspension were sprinkled in the mouth using a syringe to ensure complete

swallowing by the foals. Pharmacokinetics was measured after last administration of the

respective study medication in the morning of the 3rd treatment day. Venous blood was

collected via an indwelling jugular vein catheter before and 0.33, 0.66, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 6,

8 and 12 hours after administration; and after 16, 24, 36 and 48 hours to calculated

elimination half-lives correctly. Plasma was separated by centrifugation at 2.000 x g for

10 min and stored at least at -80°C until further analysis. 12 h after administration, a BAL


81

was performed as described recently to measure drug distribution in the ELF and BALC

(Peters et al., 2011). The BALC pellet consisted of 42-82.5% alveolar macrophages, 16.5-

57.0% lymphocytes, 0-1.5% mast cells and 0-2.5% neutrophil granulocytes as confirmed by

May-Gruenwald staining.

Assays for drugs, major metabolites and 4β-hydroxycholesterol

CLR, 14-hydroxy-clarithromycin (14OH-CLR), RIF and 25-O-desacetylrifampicin (DAc-RIF)

in plasma, lavage fluid and BALC were quantified by LC-MS/MS as recently described

(Oswald et al., 2011). The lower limit of quantification (LLOQ) for all matrices was 2.5 ng/ml.

Within-day accuracy ranged for all analytes between -6.1 and 13.7% of the nominal

concentrations and within-day precision was 1.6 to 12.6% of means (coefficient of

variation). Between-day accuracy was -3.6 to 9.1 % of the nominal concentrations and

precision was 3.4 to 13.3% of mean controls. Drug concentrations in ELF were assessed by

normalizing to the concentration of urea in lavage fluid over the concentrations in plasma

and in BALC to a mean macrophage cell volume of 1.2 µl/106 cells in foals (Jacks et al.,

2001; Rennard et al., 1986). Plasma concentrations of 4-β-hydroxycholesterol (4βOH-C)

were assayed using GC-MS for an isotope dilution method with [26.26.26.27.27.27-2H6]

4βOH-C as an internal standard as described previously (Tomalik-Scharte et al., 2009).

The LLOQ was 3.0 ng/ml for plasma. Between-day and within-day precision was 2.1 and

2.7%, respectively, of the mean values and between-day and within-day accuracy was

between 2.9 and 3.3% of the nominal values.

Biometrical evaluation

Maximum (Cmax) and minimum (Cmin) plasma concentrations and the time of Cmax (tmax) at

steady-state were taken from the plasma concentration-time curves. The area under the

plasma concentration-time curve (AUC0-12h) was calculated using the trapezoidal rule and

the average plasma concentration (Cav) was derived (AUC/dosing interval). Terminal

elimination half-life (t1/2) was estimated by log-linear regression analysis of the terminal

slope. Arithmetic means ± standard deviations (mean±SD) are given. Differences between

two groups were evaluated using the nonparametric Wilcoxon and Mann-Withney test as

appropriate.

Cellular uptake by HEK-OATPs

Chemicals: CLR, estrone-3-sulphate (E3S) and bromosulfophthalein (BSP) were obtained

from Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Germany). [3H]-BSP (14 Ci/mmol) was purchased from

Hartmann Analytic (Braunschweig, Germany) and [3H]-E3S (50 Ci/mmol) was acquired from

Biotrend (Cologne, Germany).

Competitions assays with CLR: HEK-OATP1A2, 1B1, 1B3, 2B1 and the respective vector-

transfected control cells (HEK-VC) were established as previously described (Leonhardt et

al., 2010; Mandery et al., 2010). For competition assays, the cells were seeded in 24-well


82

plates (BD Biosciences, Heidelberg, Germany) in full growth medium (minimal essential

medium supplemented with 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine and 2 mM

nonessential amino acids; PAA, Coelbe, Germany) for three days at an initial density of

200,000 cells per well. Before starting the experiments, the cells were washed with

phosphate buffered saline (PBS, temperature 37°C). [3H]-BSP and [3H]-E3S were dissolved

in incubation buffer and unlabeled substrates were added to reach final concentrations of

0.05 µM and 1.0 µM BSP for OATP1B1 and OATP1B3, respectively, and of 1.0 µM E3S for

OATP1A2 and OATP2B1. After incubation at 37°C for 5 min in the presence or absence of

CLR, the cells were washed three times with ice-cold PBS and lysed with 0.5% Triton-X-100

and 0.5% sodium deoxycholate. Aliquots were mixed with 2 ml of scintillation cocktail

(Rotiszint eco plus, Carl Roth, Karlsruhe, Germany) and the intracellular accumulation of

radioactivity was measured using a scintillation beta counter (type 1409; LKB-Wallac,

Turku, Finland). During the incubation time of 5 min, the cellular influx of BSP and E3S was

still in the linear range (data are not shown).

Uptake assays with CLR: To measure time-dependence of CLR-uptake, HEK-OATP1A2

and 2B1 were incubated with 0.1 mM CLR and HEK-OATP1B1 and 1B3 with 0.01 mM CLR

for 60 min. Afterwards, the cellular uptake of CLR in OATP1A2 and 2B1 (3.9-500 µM) and in

OATP1B1 and 1B3 (1.9-250 µM) was measured after incubation for 1 min. Within 1 min, the

uptake was still in the linear range. After adding 0.2% sodium dodecyl sulfate, CLR was

quantified in cell lysates using LC-MS/MS as described before (Oswald et al., 2011). Protein

concentrations were determined using the BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific

Inc. Rockford, USA) according to the manufacturer’s instructions. All experiments were

performed in triplicates.

In all experiments, the substrate uptake in OATP-transfected cells was corrected by the

vector control uptake. In competition assays, 50% inhibitory concentration (IC50) was

calculated by fitting the data to a sigmoidal dose-response regression curve using Prism 5

(GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Means±SD are given.

Results

Pharmacokinetic interaction between CLR and RIF

RIF was slowly absorbed from the gastrointestinal tract and reached maximum plasma

concentrations between 7.93 and 19.5 µg/ml after administration of the last maintenance

dose (Figure 1). The parent drug was eliminated with half-lives between 9.48 and

19.8 hours. Formation of the de-acetylated metabolite DAc-RIF accounted to <1 % of the

plasma exposure of total RIF. RIF equally distributed into the ELF but reached only half the

plasma levels in BALC. In contrast, the more polar metabolite achieved concentration

gradients of 1.3-6 in ELF and approximately 8-60 in BALC relative to plasma (Table 1,


83

Figure 2). Co-medication of CLR did not significantly influence any pharmacokinetic

characteristics and pulmonary distribution of RIF except formation of the de-acetylated

metabolite which was numerically decreased in presence of CLR.

CLR after short-term administration was faster absorbed than RIF; tmax occurred

approximately one hour earlier. Plasma exposure, accumulation in pulmonary

compartments, formation of 14OH-CLR and elimination rates for CLR and the metabolite

were quite similar to the data obtained in our recent long-time study which was performed

with the same staff and in identical experimental environment (Peters et al., 2011). By co-

medication of RIF, the plasma concentrations dropped down by more than 70 % without

change of 14OH-CLR formation and without influencing half-lives of CLR and 14OH-CLR

(Table 2, Figure 3). Relative to the lowered plasma levels, the accumulation of CLR in ELF

was significantly increased and, consequently, the BALC/ELF-ratio decreased (Figure 4).

The 4βOH-C/cholesterol ratio was not significantly different in the treatment groups (CLR,

1.7±1.0; RIF, 1.8±0.8; CLR with RIF, 1.6±0.6).

Affinity of CLR to HEK-OATP1A2, 2B1, 1B1, 1B3

In competition assays with the model substrates BSP and E3S, respectively, CLR was a

strong inhibitor of the liver specific uptake transporters OATP1B3 (IC50=9.50±3.50 µM) and

OATP1B1 (IC50=46.0±2.27 µM). OATP1A2 (IC50=92.6±1.49 µM) and OATP2B1

(IC50=384±5.30 µM) were inhibited with markedly lower potency (Figure 5). The uptake of

CLR in all OATP-transfected cells was not significantly different from the uptake in vector

control cells (data not shown).

Discussion

As a primary objective of our drug-interaction study, we provide for the first time data on

penetration of RIF and of its major de-acetylated metabolite into pulmonary compartments

of foals under steady-state condition; the half-life of RIF was approximately 15 hours and

distribution was evaluated 60 hours after first administration of the all in all 5 RIF doses (10

mg/kg, 12 h dosage interval), i.e. after about 4-times the half-life. At distribution equilibrium,

RIF permeated unrestricted into ELF but reached approximately 40-80% lower levels in

BALC. Interestingly, the de-acetylated, more polar metabolite accumulated 1.4-6-fold in ELF

and 8-60-fold in BALC (Figure 4) thus accounting for approximately 2% of total drug

exposure in ELF but 25% in BALC. Therefore, a significant part of the antimicrobial effect of

RIF in BALC must be attributed to DAc-RIF which is as active as the parent compound

(Acocella, 1978). However, the concentrations of RIF in plasma (considering 20% unbound

fraction), (Kohn et al., 1993) and in all pulmonary compartments at steady state were in

excess of the MIC90 for equine pathogens as ß-hemolytic streptococci (<0.5 µg/ml),


84

Staphylococcus spp. (1 µg/ml), Pasteurella spp. (1 µg/ml) and Rhodococcus equi (<0.5

µg/ml) (Jacks et al., 2003). Furthermore, the concentrations of RIF in plasma (13.1±4.45

µM) and in the lung compartments (ELF 10.3±4.98 µM; BALC 5.97±1.26 µM) were also in

the magnitude for which transcriptional regulation via the nuclear PXR-receptor pathway

was shown in-vitro for CYP3A4 (2-20 µM, (Luo et al., 2002)) and for the multidrug

transporters ABCB1 (5-10 µM, (Geick et al., 2001)), ABCC2 (>1 µM, (Kast et al., 2002)) and

OATP1A2 (1 µM, (Meyer zu Schwabedissen et al., 2008)) which are expressed in BEC and

BALC of foals (Peters et al., 2011). Our steady-state data are more reliable to predict

pharmacodynamic effects of RIF in the therapeutic in-vivo situation than the data of Ziglam

et al. from a single dose study with arbitrary sampling at times points of non-equilibrium.

They found in ELF of patients approximately one third but in BALC 16-fold the

concentrations in plasma ~2-5 hours after a single 600 mg dose (microbiological assay)

(Ziglam et al., 2002).

Contrary to our expectation, pharmacokinetics of RIF was not influenced by co-medication

of CLR although RIF is a substrate of the liver specific uptake transporters OATP1B1 and

1B3 (Vavricka et al., 2002) which can be inhibited by CLR at concentrations that most likely

occur in portal venous blood after oral administration of therapeutic doses (our study data

and (Seithel et al., 2007)).

A second finding of our short-time study was the extreme loss of CLR bioavailability by

more than 70% in the presence of RIF and, in parallel, the lower penetration in ELF and

BALC by approximately 65% and 80%, respectively (Table 2). The average plasma

concentrations of CLR which were in absence of RIF (~0.40 µg/ml) already quite near to the

MIC90 for ß-hemolytic streptococci (<0.06 µg/ml), Staphylococcus spp. (0.25 µg/ml),

Pasteurella spp. (1 µg/ml) and Rhodococcus equi (0.12 µg/ml), dropped down to inactive

levels in presence of RIF (~0.10 µg/ml) (Jacks et al., 2003). In contrast to our hypothesis,

these results were rather similar to the data of our long-term CLR-RIF interaction study

(initial loading with 7.5 mg/kg CLR b.i.d. for 7 days followed by 7.5 mg/kg CLR plus 10

mg/kg RIF b.i.d. for 11 days) (Peters et al., 2011). It must be mentioned, that there were

some important aspects in our short-term study relevant for discussing the rationale behind

the major RIF-CLR drug interaction. Firstly, the 4ßOH-C/cholesterol ratio, an endogenous

marker for CYP3A4 induction, was not elevated after short-term co-medication of RIF (5

doses). Secondly, we found a lower magnitude of the absorption deficit (~70 % vs. >90 %).

Thirdly, the plasma exposure (AUC0-12h) of 14OH-CLR in absence and presence of RIF

were not markedly different in both studies (short-term: without RIF 1.09±0.64 µg×h/ml vs.

with RIF 0.99±0.66 µg×h/ml, n.s.; long-term: without RIF 1.58±1.03 µg×h/ml vs. with RIF

0.72±0.44 µg×h/ml, p<0.05). Please consider that the half-life for 14OH-CLR was


85

unchanged after short-term co-medication of RIF (7.28±1.35 h 6.60±1.76 h, n.s.) but

significantly lowered after long-term treatment (8.11±1.61 h 5.10 ± 0.88 h, p<0.05).

In our long-term study, absorption of CLR was nearly abolished most likely by the net effect

resulting from PXR-type induction of ABCB1 and ABCC2 and inhibition of a so far unknown

transporter which is susceptible for strong inhibition by RIF (Peters et al., 2011). In this

context must be mentioned for horses, that ABCB1 and ABCC2 (and ABCC1 and BCRP)

are highly expressed along the intestine in similar pattern as in man and rodents, that there

is a high transporter protein homology between these species and that the protein

expression is regulated at a transcriptional level (Tyden et al., 2009; Tyden et al., 2010).

The short-term study was initiated to achieve steady-state condition for RIF and CLR

without significant up-regulation of CYP3A4, ABCB1 and ABCC2 which are involved in

disposition of CLR (Munic et al., 2010; Suzuki et al., 2003). We concluded from the pattern

of changes in our two studies, that administration of 5 RIF doses in our short-term study did

not or only marginally induce gene transcription. In man, induction of CYP3A4 by RIF leads

to a significant increase of the 4ßOH-C/cholesterol ratio after one week; the maximum (4-

fold) elevation is reached after 14 days (Diczfalusy et al., 2009; Kanebratt et al., 2008). The

same pattern of induction was observed in our previous study in foals after chronic

administration of RIF for 11 days (Peters et al., 2011). The induction dissipates within 2

weeks following termination of RIF treatment (Niemi et al., 2003). A two-day treatment is

unlikely to produce any significant response in CYP3A4 expression even there is a

considerable induction (>10-fold) (Yang and Rodrigues, 2010). Therefore, it is very unlikely

that the increased proportion of 14OH-CLR exposure (AUC0-12h) relative to the AUC of total

CLR (0.52±0.13 vs. 0.21±0.06, p<0.01) is caused by induction of CYP3A4 hydroxylation of

CLR (Suzuki et al., 2003) and, in turn, that induction of presystemic “first-pass” metabolism

of CLR is the major reason for >70 % lowering of bioavailability (please notice the

discussion below on alternative reasons). Because the concentrations necessary to

regulate CYP3A4, ABCB1 and ABCC2 in-vitro were quite similar and in the range of the

systemic levels achieved at steady-state (see discussion above), but duration of RIF

concentration was not long enough, intestinal efflux via ABCB1 and ABCC2 was most likely

also not significantly up-regulated in our short-time study. Therefore, the loss of

bioavailability must have been entirely or in its major portion resulted from inhibition of

intestinal uptake mechanisms for CLR.

To quantify the absorption deficit following inhibition of the intestinal uptake transport in our

long-time drug interaction study, the overall net effect must be detracted by the deficit that

can be maximally achieved with strong inducers (e.g. RIF, St. John’s wort) on absorption of

probe drugs for ABCB1 (e.g. digoxin, talinolol) which are not a substrate of a RIF-sensitive

uptake transporter. Effectively, the maximum decrease did not exceed 20-25% from


86

baseline after therapeutic standard doses of RIF and St. John’s wort in man (Glaeser et al.,

2007; Johne et al., 1999). Only in case of fexofenadine, the absorption deficit (~45%) was

markedly stronger considering that fexofenadine is also a substrate of intestinal OATP2B1

and OATP1A2 which are modulated by RIF (Glaeser et al., 2007; Imanaga et al., 2011). For

fexofenadine, the absorption deficit as caused by OATP-uptake inhibition must account for

at least 20% assuming that not more than 20-25% can be explained by strong efflux

induction. Translating this conception to the results of our two RIF-CLR interaction studies,

we conclude that up to approximately 70 % of the CLR absorption deficit is caused by

inhibition of intestinal uptake which is in case of chronic dosing additionally minimized by 20

to 25 % following induction of intestinal efflux.

Potential intestinal uptake carriers for CLR might be members of the OATP-family because

CLR inhibits the uptake of taurocholate in OATP-transfected MDCK cells and because its

oral absorption in rats can be markedly reduced by co-medication of RIF (Garver et al.,

2008; Lan et al., 2009). In our in-vitro studies using transfected HEK-cells, CLR was also an

inhibitor with potency for OATP1B > OATP1B1 > OATP1A2 > OATP2B1 similar to previous

results of Seithel et al. (Seithel et al., 2007). However, CLR was not a substrate for

OATP1A2, 1B1, 1B3 and 2B1 as clearly shown in our in-vitro study.

Interestingly, we and others found that plasma exposure with 14OH-CLR (AUC, trough

levels) is nearly not influenced by RIF, neither after short-time nor after long-term co-

medication although CLR absorption was dramatically reduced (Peters et al., 2011; Taki et

al., 2007; Wallace, Jr. et al., 1995); the lower AUC0-12h in our chronic study is explained by

shortening the half-life of 14OH-CLR following induction of its terminal metabolism (Ferrero

et al., 1990). It might be, that the proximal intestine is the major site of CLR hydroxylation in

horses, where CYP3A-metabolic activity is highly expressed (Tyden et al., 2004). If

intestinal metabolism is not influenced or even induced by RIF, than the uptake carrier for

CLR must be located along the “first-pass” route beyond the place of intestinal

biotransformation, i.e. in the basolateral membrane of enterocytes. Possible candidates

might be ABCC1 and ABCC3 as these transporters are expressed within the basolateral

membrane of the enterocytes, acting there as efflux transporters that are also inhibited by

rifampicin (Giacomini et al., 2010; Oswald et al., 2006). In addition there exists evidence

that basolateral transporters have an impact on the absorption of orally administered drugs

(Torii et al., 2002). In conclusion, to discover intestinal uptake carriers for macrolides,

further research directed to efflux transporters in the basolateral membrane of enterocytes

is needed.


87

Acknowledgements

The authors thank Gitta Schumacher, Sabine Bade and Danilo Wegner for excellent

technical assistance.


88

Authorship Contributions

Participated in research design: Peters, Venner and Siegmund.

Conducted experiments: Peters, Eggers, Block, Lämmer

Contributed new reagents or analytic tools: Oswald and Lütjohann

Performed data analysis: Peters, Eggers and Oswald.

Wrote or contributed to the writing of the manuscript: Peters, Oswald, Venner and

Siegmund.


89

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92

Footnotes

Financial support: The clinical part of the study was generously supported by the

Paul-Schockmoehle Lewitz Stud, Neustadt-Glewe, Germany. The analytical part

and the molecular and cell biological part were supported by grant of the German

Federal Ministry for Education and Research [03IP612, InnoProfile].

Conflict of interest: The authors declare that they have no conflict of interest.


93

Legends for Figures

Figure 1: Plasma-concentration time curves of rifampicin and 25-O-desacetylrifampicin

after last administration of 10 mg/kg rifampicin alone and after co-medication

with 7.5 mg/kg clarithromycin in nine healthy foals.

Figure 2: Penetration of rifampicin (upper figures) and 25-O-desacetylrifampicin (lower

figures) in bronchial epithelial lining fluid (ELF) and broncho-alveolar lavage

cells (BALC) after last administration of 10 mg/kg rifampicin alone (-CLR) and

after comedication of 7.5 mg/kg clarithromycin (+CLR).

Figure 3: Plasma-concentration time curves of clarithromycin and 14-hydroxy-

clarithromycin (14OH-clarithromycin) after last administration of 7.5 mg/kg

clarithromycin alone and after co-medication with 10 mg/kg rifampicin in nine

healthy foals.

Figure 4: Accumulation of clarithromycin (upper figures) and 14-hydroxy-clarithromycin

(lower figures) in bronchial epithelial lining fluid (ELF) and broncho-alveolar

lavage cells (BALC) after last administration of 7.5 mg/kg clarithromycin alone

(-RIF) and after comedication of 10 mg/kg rifampicin (+RIF).

Figure 5: Competition of clarithromycin with the uptake of estrone-3-sulphate (E3S,

1.0 µM) in HEK cells transfected with OATP1A2 and OATP2B1 (upper figures)

and with bromosulfophthalein (BSP) in cells transfected with OATP1B1

(0.05 µM) and OATP1B3 (0.1 µM), respectively (lower figures). Means±S.D.

are given for three experiments each performed in triplicate.


94

Figure 1

0 6 12 18 24 30 36 42 480.00

0.05

0.10

0.15

25-O

-desa

ce

tylrifa

mp

icin

(µ

g/m

l)

time (h)

0 6 12 18 24 30 36 42 480

5

10

15

20

25

CLR

CLR

rifa

mpic

in (

µg/m

l)


95

Figure 2

-CLR +CLR0

2

4

6

8

p = 0.953

ELF / plasma

concentr

ation r

atio

-CLR +CLR0

20

40

60

80

p = 0.594

BALC / plasma

-CLR +CLR0

5

10

15

20

25

p = 0.678

BALC / ELF

-CLR +CLR0.0

0.5

1.0

1.5

p = 0.767

ELF / plasmaconcentr

ation r

atio

-CLR +CLR0.0

0.5

1.0

1.5

p = 0.214

BALC / plasma

-CLR +CLR0.0

0.5

1.0

1.5

p = 0.038

BALC / ELF


96

Figure 3

0 6 12 18 240.00

0.25

0.50

0.75

1.00

RIF

RIF

cla

rith

rom

ycin

(µ

g/m

l)

0 6 12 18 240.00

0.05

0.10

0.15

0.20

14

OH

-cla

rith

rom

ycin

(µ

g/m

l)

time (h)


97

Figure 4

-RIF +RIF0

1

2

3

4

5

p = 0.069

ELF / plasma

concentr

ation r

atio

-RIF +RIF0

40

80

120

p = 0.017

ELF / plasma

concentr

ation r

atio

-RIF +RIF0

1

2

3

4

5

p = 0.069

ELF / plasma

concentr

ation r

atio

-RIF +RIF0

40

80

120

p = 0.017

ELF / plasma

concentr

ation r

atio

-RIF +RIF0

25

50

75

100

p = 0.093

BALC / plasma

-RIF +RIF0

400

800

1200

1600

2000

p = 0.889

BALC / plasma

-RIF +RIF0

25

50

75

100

p = 0.093

BALC / plasma

-RIF +RIF0

400

800

1200

1600

2000

p = 0.889

BALC / plasma

-RIF +RIF0

20

40

60

p = 0.401

BALC / ELF

-RIF +RIF0

20

40

60

p = 0.012

BALC / ELF

-RIF +RIF0

20

40

60

p = 0.401

BALC / ELF

-RIF +RIF0

20

40

60

p = 0.012

BALC / ELF


98

Figure 5

0

25

50

75

100

125

1 10 100 1000

clarithromycin (µM)

BS

P u

pta

ke

(%

)

0

25

50

75

100

125

1 10 100 1000

E3S

upta

ke (%

)

0

25

50

75

100

125

1 10 100 1000

0

25

50

75

100

125

1 10 100 1000


IC50= 9.5 ± 3.5 µM

IC50= 92.58 ± 1.49 µM IC50= 384 ± 5.3 µM

IC50= 46.0 ± 2.27 µM

0

25

50

75

100

125

1 10 100 1000


BS

P u

pta

ke

(%

)

0

25

50

75

100

125

1 10 100 1000

E3S

upta

ke (%

)

0

25

50

75

100

125

1 10 100 1000

0

25

50

75

100

125

1 10 100 1000


IC50= 9.5 ± 3.5 µM

IC50= 92.58 ± 1.49 µM IC50= 384 ± 5.3 µM

IC50= 46.0 ± 2.27 µM


99

Ta

ble

1:

Ph

arm

acokin

etic c

hara

cte

ristics a

nd

dis

trib

utio

n o

f rifa

mp

icin

in

pulm

ona

ry e

pith

elia

l lin

ing

flu

id (

EL

F)

and

bro

nch

o-

alv

eo

lar

lava

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6

101

Eidesstattliche Erklärung Hiermit erkläre ich, dass diese Arbeit bisher von mir weder an der Mathematisch-

Naturwissenschaftlichen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald noch einer

anderen wissenschaftlichen Einrichtung zum Zwecke der Promotion eingereicht wurde.

Ferner erkläre ich, dass ich diese Arbeit selbständig verfasst und keine anderen als die

darin angegebenen Hilfsmittel und Hilfen benutzt und keine Textabschnitte eines Dritten

ohne Kennzeichnung übernommen habe.

Datum Unterschrift

102

Lebenslauf

Jette Peters

geboren am 20.11.1982 in Demmin

wohnhaft im Max-Hagen-Weg 13A, 17491 Greifswald

08/1993 – 07/1999 Besuch des Christophorus Gymnasium Rostock

09/1999 – 06/2000 Besuch des Vankleek Hill Collegiate High Institute, Vankleek

Hill, Canada

08/2000 – 06/2002 Besuch des Christophorus Gymnasium Rostock, Abitur

10/2002 – 10/2006 Studium der Pharmazie an der Ernst-Moritz-Arndt-Universität

Greifswald

08/2004 1. Staatsexamen

10/2006 2. Staatsexamen

11/2006 – 04/2007 1. Praktisches Halbjahr bei der Bayer Schering Pharma AG,

Berlin, Bereich: Regulatory affairs

05/2007 – 10/2007 2. Praktisches Halbjahr in der Witzleben Apotheke, Berlin

11/2007 Approbation als Apothekerin

seit 12/2007 Wissenschaftliche Mitarbeiterin am Institut für Pharmakologie

der Ernst-Moritz-Arndt Universität Greifswald, Abteilung

Klinische Pharmakologie und Anfertigung der vorliegenden

Arbeit unter Betreuung von Prof. Dr. Werner Siegmund

103

Danksagung

Die vorliegende Dissertationsarbeit wurde in der Abteilung für Klinische Pharmakologie der

Universität Greifswald unter der Leitung von Prof. Dr. Werner Siegmund angefertigt. An

dieser Stelle möchte ich mich sehr herzlich für die immer gewährte Unterstützung, die

stetige Motivation und die vielen konstruktiven Diskussionen bedanken, die maßgeblich

zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben.

• Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Werner Siegmund für die Überlassung

dieses äußerst interessanten und fruchtbaren Themas, die Bereitstellung der exzellenten

technischen und materiellen Rahmenbedingungen, die unermüdlichen Diskussionen und

Anregungen sowie die zielführenden Hilfestellungen bei Erstellung der Publikationen.

• Frau Dr. Karen Saljé und Herrn Dr. Stefan Oswald möchte ich im Speziellen danken. Ihre

allgegenwärtige Unterstützung, Hilfe bei der Planung und Auswertung von Experimenten,

Durchführung von Analysen, die konstruktiven Diskussionen und ihre Freundschaft haben

mich wesentlich bei der Erstellung dieser Arbeit unterstützt.

• Herrn Dr. Markus Keiser danke ich für die gründliche Einarbeitung in das Arbeiten in der

Zellkultur und die immer - auch zu frühesten Morgenstunden - bereit gestellte Hilfe bei der

Durchführung meiner Versuche.

• Herrn Danilo Wegner danke ich für die Ruhe und Ausdauer mit der er mir auch zum

wiederholten Male die Funktionen bestimmter Programme erklärte, Berechnungen

durchführte und für die beinahe philosophischen Kurzdiskussionen am Arbeitsplatz.

• Frau Gitta Schumacher danke ich für die unzähligen vorbereiteten Proben für die

analytischen Messungen und allen Mitarbeitern des GLP-Labors für die offenen Ohren für

alle kleinen und größeren Problemchen während der vergangenen Jahre.

• Bei allen Mitarbeitern des Institutes für Klinische Pharmakologie möchte ich mich für die

produktive Arbeitsatmosphäre, aber auch die fröhlichen sportlich-musikalischen

„Abteilungs-Events“ bedanken.

• Frau Anja Moll danke ich für die in den zurückliegenden Jahren gewährte Unterstützung

und Ihre freundschaftliche Verbundenheit.

• Den Mitarbeitern des Gestüts Lewitz, allen voran Frau Dr. Venner, Herrn Dr. Lämmer

sowie Frau Dr. Wiebke Block und Frau Karen Eggers danke ich für die gemeinsame

Durchführung der tierexperimentellen Studien zu allen Tages- und Nachtzeiten, den

unermüdlichen Einsatz und den Spaß den wir dabei zusammen hatten.

104

• Herrn Dr. Markus Grube aus der Abteilung für Allgemeine Pharmakologie danke ich für

die vielen ausdauernd beantworteten Fragen und ideenreichen Diskussionen, die wir

geführt haben.

• Herrn Dr. Dieter Lütjohann von der Abteilung für Klinische Pharmakologie der Universität

Bonn gilt mein Dank für die Bestimmung der Serum-Sterole der tierexperimentellen

Studien.

• Darüber hinaus möchte ich mich bei meinem Verlobten und meinen Eltern bedanken,

dass sie immer für mich da waren. Sie haben mich stets unterstützt und unermüdlich

aufgemuntert, bei allen Schwierigkeiten das Ziel nicht aus den Augen zu verlieren.

Documents

Zur Bedeutung von Arzneistofftransportern für die Therapie ... · Clarithromycin und Erythromycin nachweisen [15]. Es ist daher möglich, dass die Makrolide Es ist daher möglich,