Die Nahrung 23, 7, 1979, 701-706

Zentralinstitut fur Ernahrung in Potsdam-Rehbriicke (Direktor: Prof. Dr. H. HAENEL), Forschungszentrum fur Moiekularbiologie und Medizin, Akademie der Wissenschaften der DDR

Zur Ruckstandsbestimmung des Fungizides Benz~idazolcarbamidsauremethylester und seiner Metabolite 2-Aminobenzimidazol und Benzimidazol' R. ENGST und W. SCHNAAK

Es wird eine Methode zur Extraktion und Bestimmung von Benzimidazolcarbamidsauremethylester (MBC) neben seinen Metaboliten 2-Aminobenzimidazol und Benzimidazol beschrieben. Die Bestimmung erfolgt dunnschicht- und papierchromatographisch durch visuellen Fleckenvergleich. Zur Detektion des MBC wird eine empfindliche biologische Methode eingesetzt. Der Nachweis der Metabolite erfolgt chemisch. Die kleinsten noch bestimmbaren Ruckstandsmengen betragen fur MBC = 0,Ol ppm und fur die Meta- bolite etwa 0,2 ppm bei einer durchschnittlichen Wiederaufindung (recovery) von 70-85 %.

Systemische Verbindungen haben sich schon seit langem als Insektizide bewahrt. Im Gegensatz zu den klassischen Kontaktpraparaten, die weitgehend durch Oberflachen- belage wirken, besitzen systemische Wirkstoffe die Fahigkeit, in das Innere der Pflanze einzudringen. Sie werden mit dem Saftstrom in alle Pflanzenteile befordert und gewahr- leisten einen Schutz vor Schaderregern, der auch Pflanzenteile einschlieDt, die erst nach der Behandlung ausgebildet werden. Aus der Sicht des Pflanzenschutzes ist dieser syste- mische Effekt positiv zu bewerten. Er ermoglicht bei sparsamem Einsatz der Mittel einen relativ lang anhaltenden Schutz. Zur Bekampfung von Pilzkrankheiten bei landwirtschaft- lichen Kulturen werden neuerdings in zunehmendem Ma& auch systemisch wirkende Fungizide eingesetzt.

Fur die lebensmittelhygienisch-toxikologische Beurteilung der Behandlungsruckstande an den Erntegiitern ergeben sich bei Anwendung systemischer Fungizide einige Aspekte, die im Interesse des Verbraucherschutzes verstarkt zu beachten sind. 1. Der in das Innere der Pflanze eingedrungene Anteil lafit sich nicht mehr durch ein-

faches Abwaschen entfernen. 2. Infolge der hohen Stabilitat sind systemische Wirkstoffe auch im Innern der Pflanze

oftmals relativ persistent. 3. Die metabolischen Prozesse im Innern der Pflanze fuhren beim Abbau der Wirkstoffe

haufig zu toxikologisch bedeutsamen Zwischenprodukten. Dabei sind Reaktionen mit Pflanzeninhaltsstoffen besonders zu beachten, zumal sich die gebildeten Produkte (z. B. Konjugate, Adsorbate) der Analyse entziehen konnen.

Innerhalb der Gruppe der systemischen Fungizide spielt der Methylester der Benz- imidazolcarbamidsaure (MBC) eine besondere Rolle. Er ist ubrigens als fungizidwirksame

Herrn Prof. Dr. U. FmIMUTH anlaBlich der Vollendung seines 65. Lebensjahres freundlichst zugeeignet.

702 ENGST,/SCHNAAK

Komponente einiger anderer Praparate wie Benomyl und Thiophanat-methyl erkannt worden [ I , 21 und wird in umfangreichem MaSe auch direkt als Fungizid eingesetzt.

Uber den Abbau des MBC in Pflanzen bestehen nur unklare Vorstellungen, insbesondere im Hinblick auf den Abbau des Benzimidazol-Ringsystems. Eingeleitet wird der Abbau durch die Hydrolyse der Carbamidestergruppe. Diese Reaktion fuhrt zu den Metaboliten 2-Aminobenzimidazol (2-AB) und Benzimidazol. ROUCHAUT u. a. [3] geben als weitere Produkte des Abbaus in Melonenpflanzen o-Aminobenzonitril und Anilin an.

Abb. 1 . Bildung und Abbau von MBC in Pflanzen

2-Aminobenzimidazol gilt neben MBC als potentieller Ruckstandsbildner und sollte deshalb in die Toleranzregelung fur Carbendazimpraparate als ,,terminal residue" mit einbezogen werden.

Zur Ruckstandsbestimmung des MBC wurden verschiedene Methoden (Gaschromato- graphie, Hochdruck-Fliissig-Chromatographie, Spektrophotometrie, Fluorimetrie, Diinn- schichtchromatographie) eingesetzt. Dabei haben sich diinnschichtchromatographische Verfahren mit biologischer Detektion der fungitoxischen Substanz wegen ihrer Einfach- heit bei hoher Empfindlichkeit besonders bewahrt. uber die Moglichkeiten der getrennten Bestimmung des Wirkstoffes und der Metabolite in biologischen Materialien sind dem- gegeniiber nur wenige Angaben vorhanden. Eine ausfiihrliche Darstellung der Analytik von Benzimidazol-Fungiziden hat GORBACH [4] gegeben. Ziel unserer Arbeiten war die Auffindung eines Verfahrens zur Aufarbeitung pflanzlicher Materialien und zur anschlie- Denden getrennten Bestimmung des MBC neben seinen Metaboliten, die aus den envahnten Griinden notwendig erscheint.

'

Experimenteller Teil

Im Ergebnis unserer Untersuchungen zur Analytik der Benzimidazol-Fungizide wurde folgende Arbeits- weise fur optimal befunden.

Riickstandsbestimmung 703

Extraktion von MBC, 2-AB und Benzimidazol

20 g des zerkleinerten pflanzlichen Materials werden rnit etwa 150 ml Methanol und kleinen Stiickchen Trockeneis versetzt, bis eine Temperatur von etwa -20 "C erreicht ist. Man homogenisiert mit dem Ziel, die zellulare Struktur aufzuschlieBen (z. B. Ultra-Turrax). Anschlieknd wird die Methanol-Phase iiber eine Glasfilternutsche von den Feststoffen abgetrennt. Nach wiederholter Extraktion mit 100 ml Methanol wird zur Losung der gebundenen Anteile MBC und 2-AB 12 h in einer SoxHLET-Apparatur extrahiert. Zuletzt werden die vereinigten Extrakte bei etwa 40 "C im Vakuumrotationsverdampfer bis auf ein Restvolumen von etwa 2 ml eingedampft.

Reinigung des Extraktes

Man versetzt den wie vorstehend erhaltenen Riickstand mit 30 ml Chloroform und schiittelt, bis alle Reste gelost bzw. suspendiert sind. Die Chloroformphase wird dreimal rnit je 50 ml 1 N Salzsaure extra- hiert. Emulsionen lassen sich gegebenenfalls durch Zentrifugieren beseitigen. MBC, 2-AB sowie eventuell vorhandenes Benzimidazol gehen als Kationen in die waBrige Phase iiber, die Chloroformphase wird ver- worfen. Die walrige Phase wird rnit 5 N Natronlauge und in der Nahe des Neutralpunktes rnit 0,l N Lauge bis pH 8 versetzt. Zur weiteren Verringerung der Loslichkeit des 2-AB in der waBrigen Phase wird aukrdem festes Natriumchlorid bis zur Siittigung zugegeben. Anschlieknd erfolgt die Extraktion der Benzimidazole dreimal rnit einer Mischung aus je 100 ml Methylenchlorid und 100 ml Aceton. Da Aceton oftmals geringe Mengen Saure enthalt, empfiehlt es sich, den pH-Wert nach jeder Extraktion zu kontrollieren und ggf. neu einzustellen. Der Methylenchlorid/Aceton-Extrakt (600 ml) wird durch ein trockenes Papier filtriert und im Vakuum bei 40 "C zur Trockne eingedampft. Der Riickstand wird rnit einer Mischung aus 1 ml Chloro- form und 1 ml Benzol aufgelost und an einer Aluminiumoxid-SBul$ chromatographiert. Man gibt 50 ml eines Gemisches von Benzol und Chloroform = 1 + 1 iiber die Saule und verwirft dieses Eluat I.

Danach erfolgt die Elution des MBC sowie des Benzimidazols rnit 35 ml Benzol + Methanol = 9 + 1 (Eluat 11).

2-AB wird zuletzt mit 30 ml Benzol + Methanol + Eisessig = 7 + 2,5 + 0,5 eluiert (Eluat 111). Die Eluate I1 und I11 werden jeweils im Vakuum bei 40 "C zur Trockne eingedampft und die Riickstande

mit genau 1 mi des zur Elution benutzten Losungsmittelgemisches aufgelost. Chromatographkche Bestimmung

Zur Diinnschichtchromatographie werden Platten der G r o k 20 x 20 cm rnit Kieselgel G (Merck), Schicht- dicke = 0,5 mm, benutzt. Es konnen Extraktmengen bis maximal 50 p1 aufgetragen werden. Fur die ein- zelnen Benzimidazol-Derivate werden, um optimale Trennungen zu erzielen, verschiedene FlieBmittel- Systeme empfohlen (Tab. 1). Die Auswertung erfolgt durch visuellen Fleckenvergleich anhand einer Ver- gleichsreihe der Reinsubstanzen (0,l bis 2 pg pro Fleck).

Tabelle 1 FlieDmittelsysteme und Rf-Werte zur Dunnschichtchromatographie der Benzimidazol-Derivate an Kieselgel

FlieDmittelsystem Rf-Werte

MBC 2-AB Benzimidazol

bithylacetat (fir MBC) 0,4 0,05 O J

Benzol + Chloroform + Methanol = 3 + 3 + 2 (fur 2-AB) 0,9 0,4 0,75

Benzol + bithylacetat + Methanol = 6 + 3 + 1 (fur Benzimidazol) 097 0,15 0,4

30 g mit Methanol gewaschenes und bei 100 "C aktiviertes Aluminiumoxid nach BROCKMANN werden rnit Benzol + Chloroform = 1 + 1 angeriihrt und in ein Chromatographie-Rohr (innerer Durchmesser = 1,s cm) gefiillt. Der Losungsmitteliiberstand wird bis zur HBhe der Adsorptionsmittelschicht abge- lassen.

46 Nahrung, 23. Jhg., Hefi 7

704 ENGSTISCHNAAK

Zur Bestimmung des 2-AB ist neben der Diinnschichtchromatographie die Papierchromatographie zu empfehlen. Sie ermoglicht eine verbesserte Abtrennung des Metaboliten von pflanzeneigenen Storstoffen. Die Chromatographie erfolgt zweckmaDig absteigend an der Papiersorte 2043 b (SCHLEICHER und SCHULL) mit dem Losungsmittelgemisch n-Butanol + Eisessig + Wasser = 4 + 1 + 5. Der Rf-Wert des 2-AB betragt unter diesen Bedingungen etwa 0,8.

1. Chlor-Tolidin-Reaktion (nur fur DC) Die Detektion der Substanzflecke auf den Chromatogrammen wird wie folgt durchgefiihrt :

Die trockenen Chromatogramme werden zunbhst 5 min in einer Chlor-Atmosphire (aus KMnO, und Salzsaure entwickelt) behandelt und danach zur Entferung des iiberschiissigen Chlors 5 min im Luft- strom gelagert. AnschlieDend wird sofort rnit Tolidin-Reagen~~ bespriiht. MBC, 2-AB und Benzimidazol erscheinen als blau-violette Flecke auf weiBem Untergrund. Die Nachweisgrenze betragt etwa 0,l pg pro Fleck.

Die trockenen Chromatogramme werden zunbhst etwa 5 min in eine Eisessig-Atmosphare und an- schlieknd - wie unter 1. angegeben - in eine Chlor-AtmosphPre gebracht. 2-AB ergibt orange-farbene Flecke auf weikm Untergrund. Nachweisgrenze: etwa 0,l pg pro Fleck fur PC und DC. Auf dem Papier- chromatogramm erreicht die Farbintensitit 30 min nach der Chlorbehandlung ein Maximum. MBC und Benzimidazol reagieren nicht mit einer sichtbaren Reaktion.

Die starke fungizide Wirkung des MBC wird zum Nachweis auf dem Chromatogramm ausgenutzt. Die Chromatogramme werden rnit ‘einer sporenhaltigen NahrlGsung bespriiht und anschlieknd bebriitet. MBC ergibt nach etwa 30 h weiDe Hemmflecke auf dem durch Wachstum des Schimmelpilzes verfkbten Chromatogramm (Abb. 2). Die Nachweisempfindlichkeit betriigt 0,Ol pg MBC pro Fleck. Die aus- fiihrliche Arbeitsvorschrift ist bereits an anderer Stelle beschrieben [5]. 2-AB und Benzimidazol reagieren nicht mit einer sichtbaren Reaktion.

2. Nachweis rnit Eisessig und Chlor

3. Biodetektion rnit Aspergillus niger

Bemerkungen zur Methode

Die Anwendbarkeit des Verfahrens wurde durch Anfertigung von 10 Beleganalysen (7 Proben Getreidepflanzen und 3 Apfelproben) uberpriift. Danach werden zugegebene Mengen MBC, 2-AB und Benzimidazol wie folgt wiedergefunden:

MBC (0,Ol-0,l ~ p m ) ~ = 85 f 10% 2-AB (0,2-1,5 ppm)’ = 81 & 15% Benzimidazol(0,S- 1,5 ppm)6 = 70 k 10 %.

32 mg o-Tolidin werden in 6 ml Eisessig gelost. Man fiillt mit Wasser auf 100 ml auf und fiigt 0,2 g Kalium- jodid hinzu. DC mit biologischer Detektion PC mit Eisessig-Chlor-Nachweis DC mit Chlor-Tolidin-Nachweis

Riickstandsbestimmung 705

Die Fehlerbreite wird vor allem durch die visuelle Auswertung der Chromatogramme mitbedingt. Das Verfahren liefert klare, farblose Extrakte, die nur noch in geringem Umfang (Abhangigkeit von der Art des Pflanzenmaterials) Pflanzeninhaltsstoffe enthalten. Die quantitative Bestimmung kann deshalb auch nach einer anderen Methode erfolgen, z. B. gaschromatographisch nach Derivatisierung mit Trifluoracetanhydrid [6]. Urn die Storung durch Extraktivstoffe weitgehend auszuschalten, erfolgte die Auswahl der Nachweis- reaktionen nicht nur nach der Empfindlichkeit, sondern besonders auch nach der Spe- zifitat. Die Biodetektion mit Aspergillus niger zeigt nur fungitoxische Substanzen an und ist somit bei zusatzlicher Hinzuziehung des Rf-Wertes fur die Identifiiierung des MBC relativ spezifisch.

Hinmweisen ist auf mogliche geringe Blindwerte in unbehandeltem Material. So ergaben einige Extrakte unbehandelter xpfel Hemmflecke auf den Chromatogrammen, die einen MBC-Gehalt von etwa 0,005 ppm vortiiuschten. Als mogliche Ursache hierfur sind pflan- zeneigene fungitoxische Substanzen (MBC-ahnliche Phytoalexine?) in Betracht zu ziehen. Aussagen uber Ruckstande unter 0,Ol ppm sollten deshalb nur getroffen werden, wenn unbehandelte Kontrollproben vergleichsweise mit untersucht mrden.

Die Reaktion mit Eisessig und Chlor ist weitgehend spezifisch f i r 2-AB, wahrend Chlor- Tolidin alle Verbindungen anzeigt, die sich in Chloramine uberfuhren lassen. Dies betrifft eine groDe Zahl N-haltiger Verbindungen. Auf dem Chromatogramm erscheinen deshalb zumeist neben den Benzimidazolderivaten verschiedene durch Pflanzeninhaltsstoffe ver- ursachte Farbflecke. Zur sicheren Identifiierung von Benzimidazol sollten deshalb mehrere Chromatogramme mit unterschiedlichen FlieDmittelsystemen angefertigt werden.

SWnlllarY

R. ENGST and W. SCHNAAK: On the determination of residues of the fungicide benzimidazole carbamic acid methyl ester and its metabolites 2-aminobenzimidazole and benzimidazole.

The authors describe a method for extracting and determining benzimidazole carbamic acid methyl ester (MBC) in the presence of its metabolites 2-aminobenzimidazole and benzimidazole. The determination is performed thin-layer and paper chromatographically using visual spot comparison. A sensitive biological method is employed for the detection of MBC. The metabolites are assayed by chemical procedures. The smallest amounts of residues that the authors could detect were: 0.01 p.p.m. of MBC and approximately 0.2 p.p.m. of the metabolites, the recovery rate ranging from 70-85 %.

Literatur

[I] SIMS, J. J., H. MEE und D. C. E R W ~ , Phytopathology 59, 1775 (1969). [2] VONK, J. W., und A. K. SUPESTEIJN, Pestic. Sci. 2, 160 (1971).

706 ENGST/SCHNAAK

[3] ROUCHAUT, J. P., J. R. DECALLONE und J. A. MEYER, Phytopathology 64, 1513 (1974). [4] GORBACH, S., Review on the Residue Analysis of the Systemic Fungicides Benomyl, Carbendazim,

Thiophanate, Thiophanate methyl and Thiabendazole. Bericht der R.A.-Kommission der IUPAC, 1977.

[5] ENGST, R., und W. SCHNAAK, Pharmaz. Zhalle 106, 382 (1967). (61 ROUCHAUT, J. P., und J. R. DECALLONNE, J. Agric. Food Chem. 22,259 (1974).

Prof. Dr. R. ENGST und Dip1.-Chem. W. SCHNAAK, Zentralinstitut fur Ernahrung, DDR-1505 Bergholz- Rehbriicke. Arthur-Scheunert-Allee 114- 116

Eingegangen 22. 1. 1979