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Malariadiagnostik in Theorie und Praxis a hands-on experience
Assoc. Prof. HARALD NOEDL, MD, PhD
Institut für Spezifische Prophylaxe und Tropenmedizin
Kinderspitalgasse 15,
A - 1090 Vienna, AUSTRIA
Im Rahmen der Methodenseminare SS13
„Spezifische Prophylaxe und Tropenmedizin“
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M A L A R I A
Protozoenerkrankung hervorgerufen durch vier verschiedene Spezies der Gattung Plasmodium übertragen durch die Anophelesmücke:
P.falciparum, P. vivax, P. malariae, and P. ovale
• ca 215 Millionen klinische Faelle (<50 in AUT) • 0.66 Millionen Todesfaelle/Jahr (WHO, 0-2 in AUT) • Etwa 40% der Weltbevoelkerung Malaria ausgesetzt
• P. falciparum [klinisches Bild: ‘Malaria tropica’] ist verantwortlich fuer die schwersten Verlaufsformen und fast alle Todesfaelle • Die benignen Verlaufsformen der Malaria werden verursacht von P. vivax, P. ovale [‘Malaria tertiana’] , und P. malariae [‘Malaria quartana’]
• Innerhalb von etwa 5 bis 10 Jahren fuehren wiederholte Infektionen zu einer kurzlebigen Semiimmunitaet (Kinder bis 10 Jahre sind daher besonders betroffen, da sie noch keine Immunitaet entwickeln konnten)
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M A L A R I A E P I D E M I O L O G I E
1995 2010 (WHO 2011)
At Risk 3 billion 3,3 billion
Clinical Cases 300-500 million 216 millions
Deaths 1,5-2,7 million 655.000
Main Distribution 90% of cases in
Subsaharan Africa
90 % of cases in
Subsaharan Africa
Secondary India, Sri Lanka,
Afghanistan, Vietnam,
Colombia
India, Afghanistan, SE-
Asia
M A L A R I A E P I D E M I O L O G I E
P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae
M. tropica M. tertiana M. tertiana M. quartana
Präpatenz 9-10 11-13 10-14 15-16
Inkubation 7-14 12-17 (bzw. 6-
12 Monate)
15-18 18-40
Erythrozytärer
Zyklus
48 48 50 72
Fieber Quotidian, tertian,
sub-/bi-tertian
Tertian Tertian Quartan
Max.
Parasitämie/uL
2 millionen (40%) 50,000 (1%) 30,000 (0.6%) 20,000 (0.4%)
Relapse
(Hypnozoiten)
-- ++ ++ --
Dauer einer
unbehandelten
Infektion
1-2 y 1.5-5 y 1.5-5 y ? 3-50 y
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M A L A R I A E P I D E M I O L O G I E
M A L A R I A E P I D E M I O L O G I E
Neu: P. knowlesi – “die 5. Spezies”
• Morphologisch nicht von P. malariae (M. quartana) zu
unterscheiden
• Zyklus: 24h! schneller Anstieg der Parasitämie
• Verbreitung: Südostasien
(v.a. Borneo und Malaiische Halbinsel)
• Reservoir: Makaken (Macaca fascicularis - Zoonose!)
• Vektor: A. leucosphyrus
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M A L A R I A L E B E N S Z Y K L U S
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PROBLEME IN DER MALARIA-DIAGNOSTIK
• Malaria ist eine potentiell tödliche Erkrankung,
fruehzeitige Diagnose daher lebenswichtig
• In Endemiegebieten stellt jeder Erkrankte ein
Infektionsrisiko für die Gemeinschaft dar. Rechtzeitige
Erkennung von Malaria ist daher von grosser
epidemiologischer Bedeutung
• PROBLEM: Malaria ist eine Krankheit der Armen –
Malariadiagnostik und –kontrolle verlangen jedoch ein
gewisses Maß an Infrastruktur und finanzielle Mittel für
die Diagnose und Therapie des einzelnen Falles
• In reichen Ländern dagegen fehlt es nicht am Geld,
wohl aber an der Erfahrung im Umgang mit Malaria
M A L A R I A D I A G N O S T I K
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M A L A R I A D I A G N O S T I K
ÜBERBLICK: VERFÜGBARE DIGNOSTISCHE VERFAHREN
• Klinische Diagnose
• Gefärbter Blutausstrich
• Dicker Tropfen – Ausstrich
• Fluoreszenz Mikroskopie
• QBC – Kawamoto
• Molekulare Diagnostik (PCR)
• ELISA
• Antigen – Antikörper
• Immunochromatographische Tests
• HRP-2
• pLDH
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M A L A R I A M O R P H O L O G I E
P L A S M O D I U M F A L C I P A R U M
Zyklus: 48 Stunden, Erys nicht vergroessert, Maurer’s kleft
Ringe / Trophozoiten
Klein bis mittelgross, haeufig zwei Chromatine
(Doppelchromatin), randstaendige Formen (accole), oft
mehrere Parasiten in einem Erythrozyten (Doppel-,
Dreifachinfektion); spaetere entwicklungsstadien verschwinden
aus dem periphaeren Blutstrom (Sequestration)
Schizonts
Normalerweise NICHT im peripheren Blutstrom (ausser bei
schweren Verlaufsformen); 12 bis 32 Merozoiten, kompakt mit
einem einzelnen dunklen Pigment
Gametozyten
Erscheinen etwa 10 Tage nach den asexuellen Formen;
bananenfoermig; weibliche (Macrogametozyten) sind
schlanker, haben einen kleinen Kern, blaeuliches Zytoplasma,
Pigmentkoerner gehaeuft, maennliche (Microgametozyten)
sind etwas breiter undhaben ein roetliches Zytoplasma, einen
grossen Kern und verteiltes Pigment
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M A L A R I A M O R P H O L O G I E
P L A S M O D I U M V I V A X
Zyklus: 48 Stunden, Erys vergroessert, Schueffner Tuepfelung
Ringe / Trophozoiten
Klein bis relativ gross, wachsen schnell, mit deutlicher
amoeboider Aktivitaet und Pseudopodien (Amoeboide
Formen); grosse Vakuole
Schizonten
Auch im peripheren Blutstrom, 12 to 24 Merozoiten,
vergroesserte Zelle
Gametozyten
Erscheinen innerhalb von 3 Tagen, gross, rund oder oval,
koennen beinahe die gesamte, vergroesserte Zelle ausfuellen;
Macrogametozyten: blaues Zytoplasma, kleiner, kompakter
Kern; Microgametozyten: grosser diffuser Kern
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M A L A R I A M O R P H O L O G I E
P L A S M O D I U M O V A L E
Zyklus: 48 Stunden, Erys vergroessert, Schueffner
Tuepfelung, haeufig oval, ausgefranst
Ringe / Trophozoiten
Klein bis mittelgross, kompaktes Zytoplasma,
Vakuole verschwindet fruehzeitig, prominentes Pigment,
Schizonten
Auch im peripheren Blutstrom, 4 to 12 Merozoiten,
vergroesserte Zelle
Gametozyten
Aehnlich wie P. malariae (aber in vergroesserter Zelle);
Macrogametozyten: blaues Zytoplasma, kleiner, kompakter
Kern; Microgametozyten: hellblaues Zytoplasma, grosser,
diffuser Kern
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M A L A R I A M O R P H O L O G Y
P L A S M O D I U M M A L A R I A E
Zyklus: 48 Stunden, Erys vergroessert
Ringe / Trophozoiten
Klein bis mittelgross, kompaktes Zytoplasma,
Vakuole verschwindet fruehzeitig, polares Wachstum
(Bandformen), reichlich dunkles, prominentes Pigment
Schizonten
6 bis 12 Merozoiten als cluster or symmetrisch angeordnet
(bluetenfoermig), konzentriertes, oft zentrales Pigment
Gametocytes
Macrogametozyten: blaues Zytoplasma, kleiner, kompakter
Kern; Microgametozyten: hellblaues Zytoplasma, grosser,
diffuser Kern
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P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae
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M O R P H O L O G I E
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KLINISCHE DIAGNOSE
• Auch heute noch die am weitesten verbreitete
Methode der Malariadiagnose und in vielen
Gegenden die einzig verfügbare
• Diagnose anhand „typischer“ Klinik (Fieber,
Schüttelfrost, Kopfschmerz, Übelkeit,
Erbrechen...)
• Problem: Malaria hat keine „typische“ Klinik,
sie kann vielmehr praktisch jede ander
Krankheit imitieren
• Klinische Diagnose der Malaria ist daher
häufig eher ein Lotteriespiel, besonders in nicht
endemischen Gebieten, in denen es häufig an
der Erfahrung im Umgang mit Malaria fehlt
M A L A R I A D I A G N O S T I K
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MIKROSKOPISCHE DIAGNOSE
• Auch heute nach über 100 Jahren noch der Gold Standard der Malariadiagnose
• Hat in dieser Zeit wenig Veränderung gesehen
• Vorteile:
• Sensibel
• Erlaubt Speziesdiagnostik und Quantifizierung der Parasitämie
• Relativ billig (US$ 0.12 bis 0.40)
• Nachteile:
• Arbeitsintensiv und relativ zeitaufwendig (ca. 60 Minuten)
• Erfordert gut geschultes und vor allem geübtes technisches Personal
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MIKROSKOPISCHE DIAGNOSE
• DICKER TROPFEN
• Durch Haemolyse massiv angereicherte Schichtung von Erythrozyten (ca. 20-30 fach)
• Färbung mit Giemsa, Field‘s, Wright‘s Stain
• Qualität der Färbung extrem wichtig für Sensitivität
• Quantifizierung durch Zählung pro 200 Leukos
• Sensitivität: >20/uL (Expert Microscopy), >50/uL (Standard in Endemiegebieten), >500/uL in den meisten westlichen Labors
• Vorteil: Hohe Sensitivität, daher ausgezeichnet für Diagnose
• Nachteil: Deutlich schwieriger zu interpretieren als Ausstrich, schwierigere Speziesdiagnose
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MIKROSKOPISCHE DIAGNOSE
• AUSSTRICH
• Als Monolayer auf Slide aufgebracht, fixiert
• Färbung mit Giemsa, Wright‘s Stain
• Qualität der Färbung nicht so wichtig für Sensitivität
• Quantifizierung durch Zählung per 1000 – 10,000 Erys
• Vorteil: Einfach zu interpretieren, sehr gut für Speziesdiagnose
• Nachteil: NICHT GEEIGNET für Diagnose dank niedriger Sensitivität (nur ca. 1/10 des Dicken Tropfens!)
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FLUORESZENZMIKROSKOPIE
• QBC II
• Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.
• Anreicherung von Parasiten in Acridin-Orange beschichteten Kapillaren, Nachweis in Fluoreszenzmikroskop
• Nach Zentrifugieren Konzentration der gefärbten Parasiten in der oberen Ery Schicht
• KAWAMOTO TECHNIK
• AO Färbung, Umgeht das Problem des Fluorenzmikroskops mit Quarz Halogenlichtquelle
• Vorteil: Etwas einfacher zu interpretieren als Giemsa
• Nachteil: Relativ aufwendig, nicht sensibler als Giemsa Smear, ungeeignet für Endemiegebiete, schwierige Differentialdiagnose
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RDTs (Rapid Diagnostic Tests)
• Immunochromatographische Tests
• Prinzip ähnlich ELISA, monoklonaler Antikörper fängt markiertes Antigen auf Mikrozellulose-membran
• Verschiedene Formate:
• Teststreifen
• Kartenformat
• Kassettenformat
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RDTs (Rapid Diagnostic Tests)
• Zielantigene:
• Histidinreiches Protein II (HRP2) z.B. Now ICT (Binax), Paracheck (Orchid)
• Äußerst stabiles Protein (daher nicht für den Nachweis des Behandlungserfolgs geeignet)
• In P. falciparum, unabhängig von Knob-Phänotyp
• In Parasiten, infiz. Erys, Serum u. Plasma
• Lactatdehydrogenase (pLDH) Optimal (Diamed)
• Enzym aus Glycolytic Pathway
• Findet sich bei allen P. spezies
• Kurze Halbwertszeit
• Aldolase (als „Panamalaria Ag“ auf Now ICT)
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RDTs (Rapid Diagnostic Tests)
Vorteile:
• Rasche Diagnose (ca. 15 Minuten)
• Einfache Durchführung, erfordert daher nur kurze Einschulung (aber dennoch nicht für die Selbstdiagnose z.B. bei Reisenden geeignet!)
• Hohe Sensitivität (vgl. mit dickem Tropfen, im Vergleich zu unerfahrenem Personal sogar deutlich höher!)
• Erfordern praktisch keine Infrastruktur (Elektrizität, Laborgeräte etc.) und sind sehr wiederstandsfähig
Nachteile:
• Keine Speziesdiagnose (Primär Pf)
• Falsch positiv nach erfolgreicher Therapie (HRP2)
• Limitierte Aussage über Parasitendichte
• Relativ teuer (ca. US$ 0.60 bis 5.00)
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POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)
Ziel: Small-Subunit 18S rRNA u.a. (z.B. CS)
Vorteile:
• Äusserst sensitiv (ca. 5 Parasiten/uL)
• Bester Nachweis von gemischten Infektionen
• RTPCR erlaubt exakte Quantifizierung der Parasitendichte und ist relativ schnell
• Ausgezeichnetes Tool für wissenschaftliche Zwecke (z.B. als Goldstandard für RDT-Sensitivitätsstudien)
Nachteile:
• Sehr teuer
• Nicht für Routinediagnose
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ELISA
Antigen – Antikörper Nachweis
Antigennachweis:
• Hoher Durchsatz (ca 40 Samples pro Platte, 5 Platten können gleichzeitig gefahren werden 200 Resultate innerhalb von ca. 3-4 Stunden)
• Ausgezeichnet geeignet für epidemiologische Studien, nicht für Routinediagnostik
• Hohe Sensitivität (ca. 20 Parasiten/uL), für Pf sensibler als Mikroskopie, möglicher Goldstandard für Pf?
• Kommerziell nur für Pf erhältlich, daher keine Speziesdiagnose
Antikörpernachweis:
• Für epidemiologische Seroprävalenzstudien, Blutbanken, Eradikationskampanien
• Nicht für Routinediagnose
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FÜR JEDEN ZWECK DER RICHTIGE TEST
Routinediagnose in Endemiegebieten:
• Mikroskopie (Giemsa) ODER RDTs (wo Mikroskopie nicht verfügbar)
Routinediagnose bei Reisenden:
• Mikroskopie (Giemsa oder Fluoreszenz) PLUS RDTs (keine Selbstdiagnose)
Seroprävalenzstudien und Blutbanken:
• Ak-ELISA und Mikroskopie
Wissenschaftliche Zwecke:
• Mikroskopie (Giemsa) PLUS PCR oder Ag-ELISA
Auch nach über 100 Jahren hat die Mikroskopie nicht an Bedeutung für die Malariadiagnose verloren. Neue ergänzende Techniken können jedoch die Sensitivität deutlich erhöhen.