Malariadiagnostik in Theorie und Praxis - · PDF file• Vektor: A. leucosphyrus. 4 M A L A R I A L E B E N ... • Malaria ist eine potentiell tödliche Erkrankung, fruehzeitige Diagnose

1

Malariadiagnostik in Theorie und Praxis a hands-on experience

Assoc. Prof. HARALD NOEDL, MD, PhD

Institut für Spezifische Prophylaxe und Tropenmedizin

Kinderspitalgasse 15,

A - 1090 Vienna, AUSTRIA

[email protected]

Im Rahmen der Methodenseminare SS13

„Spezifische Prophylaxe und Tropenmedizin“

2

M A L A R I A

Protozoenerkrankung hervorgerufen durch vier verschiedene Spezies der Gattung Plasmodium übertragen durch die Anophelesmücke:

P.falciparum, P. vivax, P. malariae, and P. ovale

• ca 215 Millionen klinische Faelle (<50 in AUT) • 0.66 Millionen Todesfaelle/Jahr (WHO, 0-2 in AUT) • Etwa 40% der Weltbevoelkerung Malaria ausgesetzt

• P. falciparum [klinisches Bild: ‘Malaria tropica’] ist verantwortlich fuer die schwersten Verlaufsformen und fast alle Todesfaelle • Die benignen Verlaufsformen der Malaria werden verursacht von P. vivax, P. ovale [‘Malaria tertiana’] , und P. malariae [‘Malaria quartana’]

• Innerhalb von etwa 5 bis 10 Jahren fuehren wiederholte Infektionen zu einer kurzlebigen Semiimmunitaet (Kinder bis 10 Jahre sind daher besonders betroffen, da sie noch keine Immunitaet entwickeln konnten)

2

M A L A R I A E P I D E M I O L O G I E

1995 2010 (WHO 2011)

At Risk 3 billion 3,3 billion

Clinical Cases 300-500 million 216 millions

Deaths 1,5-2,7 million 655.000

Main Distribution 90% of cases in

Subsaharan Africa

90 % of cases in

Subsaharan Africa

Secondary India, Sri Lanka,

Afghanistan, Vietnam,

Colombia

India, Afghanistan, SE-

Asia


P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae

M. tropica M. tertiana M. tertiana M. quartana

Präpatenz 9-10 11-13 10-14 15-16

Inkubation 7-14 12-17 (bzw. 6-

12 Monate)

15-18 18-40

Erythrozytärer

Zyklus

48 48 50 72

Fieber Quotidian, tertian,

sub-/bi-tertian

Tertian Tertian Quartan

Max.

Parasitämie/uL

2 millionen (40%) 50,000 (1%) 30,000 (0.6%) 20,000 (0.4%)

Relapse

(Hypnozoiten)

-- ++ ++ --

Dauer einer

unbehandelten

Infektion

1-2 y 1.5-5 y 1.5-5 y ? 3-50 y

3



Neu: P. knowlesi – “die 5. Spezies”

• Morphologisch nicht von P. malariae (M. quartana) zu

unterscheiden

• Zyklus: 24h! schneller Anstieg der Parasitämie

• Verbreitung: Südostasien

(v.a. Borneo und Malaiische Halbinsel)

• Reservoir: Makaken (Macaca fascicularis - Zoonose!)

• Vektor: A. leucosphyrus

4

M A L A R I A L E B E N S Z Y K L U S

8

PROBLEME IN DER MALARIA-DIAGNOSTIK

• Malaria ist eine potentiell tödliche Erkrankung,

fruehzeitige Diagnose daher lebenswichtig

• In Endemiegebieten stellt jeder Erkrankte ein

Infektionsrisiko für die Gemeinschaft dar. Rechtzeitige

Erkennung von Malaria ist daher von grosser

epidemiologischer Bedeutung

• PROBLEM: Malaria ist eine Krankheit der Armen –

Malariadiagnostik und –kontrolle verlangen jedoch ein

gewisses Maß an Infrastruktur und finanzielle Mittel für

die Diagnose und Therapie des einzelnen Falles

• In reichen Ländern dagegen fehlt es nicht am Geld,

wohl aber an der Erfahrung im Umgang mit Malaria

M A L A R I A D I A G N O S T I K

5

9


ÜBERBLICK: VERFÜGBARE DIGNOSTISCHE VERFAHREN

• Klinische Diagnose

• Gefärbter Blutausstrich

• Dicker Tropfen – Ausstrich

• Fluoreszenz Mikroskopie

• QBC – Kawamoto

• Molekulare Diagnostik (PCR)

• ELISA

• Antigen – Antikörper

• Immunochromatographische Tests

• HRP-2

• pLDH

10

M A L A R I A M O R P H O L O G I E

P L A S M O D I U M F A L C I P A R U M

Zyklus: 48 Stunden, Erys nicht vergroessert, Maurer’s kleft

Ringe / Trophozoiten

Klein bis mittelgross, haeufig zwei Chromatine

(Doppelchromatin), randstaendige Formen (accole), oft

mehrere Parasiten in einem Erythrozyten (Doppel-,

Dreifachinfektion); spaetere entwicklungsstadien verschwinden

aus dem periphaeren Blutstrom (Sequestration)

Schizonts

Normalerweise NICHT im peripheren Blutstrom (ausser bei

schweren Verlaufsformen); 12 bis 32 Merozoiten, kompakt mit

einem einzelnen dunklen Pigment

Gametozyten

Erscheinen etwa 10 Tage nach den asexuellen Formen;

bananenfoermig; weibliche (Macrogametozyten) sind

schlanker, haben einen kleinen Kern, blaeuliches Zytoplasma,

Pigmentkoerner gehaeuft, maennliche (Microgametozyten)

sind etwas breiter undhaben ein roetliches Zytoplasma, einen

grossen Kern und verteiltes Pigment

6

11


P L A S M O D I U M V I V A X

Zyklus: 48 Stunden, Erys vergroessert, Schueffner Tuepfelung


Klein bis relativ gross, wachsen schnell, mit deutlicher

amoeboider Aktivitaet und Pseudopodien (Amoeboide

Formen); grosse Vakuole

Schizonten

Auch im peripheren Blutstrom, 12 to 24 Merozoiten,

vergroesserte Zelle

Gametozyten

Erscheinen innerhalb von 3 Tagen, gross, rund oder oval,

koennen beinahe die gesamte, vergroesserte Zelle ausfuellen;

Macrogametozyten: blaues Zytoplasma, kleiner, kompakter

Kern; Microgametozyten: grosser diffuser Kern

12 12


P L A S M O D I U M O V A L E

Zyklus: 48 Stunden, Erys vergroessert, Schueffner

Tuepfelung, haeufig oval, ausgefranst


Klein bis mittelgross, kompaktes Zytoplasma,

Vakuole verschwindet fruehzeitig, prominentes Pigment,

Schizonten

Auch im peripheren Blutstrom, 4 to 12 Merozoiten,

vergroesserte Zelle

Gametozyten

Aehnlich wie P. malariae (aber in vergroesserter Zelle);


Kern; Microgametozyten: hellblaues Zytoplasma, grosser,

diffuser Kern

7

13 13

M A L A R I A M O R P H O L O G Y

P L A S M O D I U M M A L A R I A E

Zyklus: 48 Stunden, Erys vergroessert


Klein bis mittelgross, kompaktes Zytoplasma,

Vakuole verschwindet fruehzeitig, polares Wachstum

(Bandformen), reichlich dunkles, prominentes Pigment

Schizonten

6 bis 12 Merozoiten als cluster or symmetrisch angeordnet

(bluetenfoermig), konzentriertes, oft zentrales Pigment

Gametocytes


Kern; Microgametozyten: hellblaues Zytoplasma, grosser,

diffuser Kern

14

P. falciparum P. vivax P. ovale P. malariae

8

15

M O R P H O L O G I E

16

KLINISCHE DIAGNOSE

• Auch heute noch die am weitesten verbreitete

Methode der Malariadiagnose und in vielen

Gegenden die einzig verfügbare

• Diagnose anhand „typischer“ Klinik (Fieber,

Schüttelfrost, Kopfschmerz, Übelkeit,

Erbrechen...)

• Problem: Malaria hat keine „typische“ Klinik,

sie kann vielmehr praktisch jede ander

Krankheit imitieren

• Klinische Diagnose der Malaria ist daher

häufig eher ein Lotteriespiel, besonders in nicht

endemischen Gebieten, in denen es häufig an

der Erfahrung im Umgang mit Malaria fehlt


9

17

MIKROSKOPISCHE DIAGNOSE

• Auch heute nach über 100 Jahren noch der Gold Standard der Malariadiagnose

• Hat in dieser Zeit wenig Veränderung gesehen

• Vorteile:

• Sensibel

• Erlaubt Speziesdiagnostik und Quantifizierung der Parasitämie

• Relativ billig (US$ 0.12 bis 0.40)

• Nachteile:

• Arbeitsintensiv und relativ zeitaufwendig (ca. 60 Minuten)

• Erfordert gut geschultes und vor allem geübtes technisches Personal

18


• DICKER TROPFEN

• Durch Haemolyse massiv angereicherte Schichtung von Erythrozyten (ca. 20-30 fach)

• Färbung mit Giemsa, Field‘s, Wright‘s Stain

• Qualität der Färbung extrem wichtig für Sensitivität

• Quantifizierung durch Zählung pro 200 Leukos

• Sensitivität: >20/uL (Expert Microscopy), >50/uL (Standard in Endemiegebieten), >500/uL in den meisten westlichen Labors

• Vorteil: Hohe Sensitivität, daher ausgezeichnet für Diagnose

• Nachteil: Deutlich schwieriger zu interpretieren als Ausstrich, schwierigere Speziesdiagnose

10

19


• AUSSTRICH

• Als Monolayer auf Slide aufgebracht, fixiert

• Färbung mit Giemsa, Wright‘s Stain

• Qualität der Färbung nicht so wichtig für Sensitivität

• Quantifizierung durch Zählung per 1000 – 10,000 Erys

• Vorteil: Einfach zu interpretieren, sehr gut für Speziesdiagnose

• Nachteil: NICHT GEEIGNET für Diagnose dank niedriger Sensitivität (nur ca. 1/10 des Dicken Tropfens!)

20

FLUORESZENZMIKROSKOPIE

• QBC II

• Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.

• Anreicherung von Parasiten in Acridin-Orange beschichteten Kapillaren, Nachweis in Fluoreszenzmikroskop

• Nach Zentrifugieren Konzentration der gefärbten Parasiten in der oberen Ery Schicht

• KAWAMOTO TECHNIK

• AO Färbung, Umgeht das Problem des Fluorenzmikroskops mit Quarz Halogenlichtquelle

• Vorteil: Etwas einfacher zu interpretieren als Giemsa

• Nachteil: Relativ aufwendig, nicht sensibler als Giemsa Smear, ungeeignet für Endemiegebiete, schwierige Differentialdiagnose

11

21

RDTs (Rapid Diagnostic Tests)

• Immunochromatographische Tests

• Prinzip ähnlich ELISA, monoklonaler Antikörper fängt markiertes Antigen auf Mikrozellulose-membran

• Verschiedene Formate:

• Teststreifen

• Kartenformat

• Kassettenformat

22


• Zielantigene:

• Histidinreiches Protein II (HRP2) z.B. Now ICT (Binax), Paracheck (Orchid)

• Äußerst stabiles Protein (daher nicht für den Nachweis des Behandlungserfolgs geeignet)

• In P. falciparum, unabhängig von Knob-Phänotyp

• In Parasiten, infiz. Erys, Serum u. Plasma

• Lactatdehydrogenase (pLDH) Optimal (Diamed)

• Enzym aus Glycolytic Pathway

• Findet sich bei allen P. spezies

• Kurze Halbwertszeit

• Aldolase (als „Panamalaria Ag“ auf Now ICT)

12

23


Vorteile:

• Rasche Diagnose (ca. 15 Minuten)

• Einfache Durchführung, erfordert daher nur kurze Einschulung (aber dennoch nicht für die Selbstdiagnose z.B. bei Reisenden geeignet!)

• Hohe Sensitivität (vgl. mit dickem Tropfen, im Vergleich zu unerfahrenem Personal sogar deutlich höher!)

• Erfordern praktisch keine Infrastruktur (Elektrizität, Laborgeräte etc.) und sind sehr wiederstandsfähig

Nachteile:

• Keine Speziesdiagnose (Primär Pf)

• Falsch positiv nach erfolgreicher Therapie (HRP2)

• Limitierte Aussage über Parasitendichte

• Relativ teuer (ca. US$ 0.60 bis 5.00)

24

POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR)

Ziel: Small-Subunit 18S rRNA u.a. (z.B. CS)

Vorteile:

• Äusserst sensitiv (ca. 5 Parasiten/uL)

• Bester Nachweis von gemischten Infektionen

• RTPCR erlaubt exakte Quantifizierung der Parasitendichte und ist relativ schnell

• Ausgezeichnetes Tool für wissenschaftliche Zwecke (z.B. als Goldstandard für RDT-Sensitivitätsstudien)

Nachteile:

• Sehr teuer

• Nicht für Routinediagnose

13

25

ELISA

Antigen – Antikörper Nachweis

Antigennachweis:

• Hoher Durchsatz (ca 40 Samples pro Platte, 5 Platten können gleichzeitig gefahren werden 200 Resultate innerhalb von ca. 3-4 Stunden)

• Ausgezeichnet geeignet für epidemiologische Studien, nicht für Routinediagnostik

• Hohe Sensitivität (ca. 20 Parasiten/uL), für Pf sensibler als Mikroskopie, möglicher Goldstandard für Pf?

• Kommerziell nur für Pf erhältlich, daher keine Speziesdiagnose

Antikörpernachweis:

• Für epidemiologische Seroprävalenzstudien, Blutbanken, Eradikationskampanien

• Nicht für Routinediagnose

26

FÜR JEDEN ZWECK DER RICHTIGE TEST

Routinediagnose in Endemiegebieten:

• Mikroskopie (Giemsa) ODER RDTs (wo Mikroskopie nicht verfügbar)

Routinediagnose bei Reisenden:

• Mikroskopie (Giemsa oder Fluoreszenz) PLUS RDTs (keine Selbstdiagnose)

Seroprävalenzstudien und Blutbanken:

• Ak-ELISA und Mikroskopie

Wissenschaftliche Zwecke:

• Mikroskopie (Giemsa) PLUS PCR oder Ag-ELISA

Auch nach über 100 Jahren hat die Mikroskopie nicht an Bedeutung für die Malariadiagnose verloren. Neue ergänzende Techniken können jedoch die Sensitivität deutlich erhöhen.

Documents

Malariadiagnostik in Theorie und Praxis - · PDF file• Vektor: A. leucosphyrus. 4 M A L A R I A L E B E N ... • Malaria ist eine potentiell tödliche Erkrankung, fruehzeitige Diagnose