Molekularbiologie;ZusammenfassungVonBeelerPatrickStoffumfangderPrüfung
‐ TheoriezudenExperimentendesPraktikums‐ KenntnisderverwendetenMethoden
DurchgeführteExperimente
‐ HefeidentifikationmittelsISTPCRundRestriktionsanalyse(RFLP)‐ SequenzierungdermitochondrialenDNAvonKanninchen(KlassischeDNA
Sequenzierung)‐ KlonierungderSODvonE.coliundExpressioninE.coli‐ FleischartenanalysevonWurstwarenmittelsRealtimePCR,2:Strategien‐ GruppenarbeitAndereKlonierungsstrategien(EukaryotischeSysteme)
1. HefeidentfikationmittelsITSPCRundRestriktionsanalyseRFLPRestriktionsfragmentlängenpolymorphismus,abgekürztRFLP(sprich:"Riflip",vonengl.:
RestrictionFragmentLengthPolymorphism,auchPLP:PCR‐Längen‐Polymorphismus)bezeichnet
UnterschiedevonDNA‐SequenzenhomologerChromosomen,welchealsverschiedene
Restriktionsfragmentmuster(z.B.beiderGelelektrophorese)sichtbarwerden.
DieLängeeinesRestriktionsfragmentswirddurchMutationbeeinflusst,beidereine
ErkennungssequenzfüreinRestriktionsenzymentstehtoderverlorengeht.
Beispiel:EineSequenzenthältbeiPerson1eineSchnittstellefüreinRestriktionsenzym,inder
SequenzbeiPerson2kommtdiesenichtvor.WerdennundieseSequenzenmiteinem
Restriktionsenzymgeschnitten,entstehenbeiPerson1zweiFragmenteundbeiPerson2ein
Fragment.WerdennundieLängenderSequenzenverglichen,kanneinRFLPfestgestelltwerden,
dieFragmentesindunterschiedlichlang,derLocusistpolymorph.
RFLPsdienenu.a.alsgenetischeMarkerbeiderGenkartierung,dasieumsowahrscheinlicher
zusammenvererbtwerden,jenähersiezusammenliegen.Siewerdendarüberhinausauchzur
SuchenachQuantitativeTraitLoci,alsoChromosomenabschnittenmitEinflussaufdie
AusprägungeinesquantitativenMerkmals,sowieinSouthernBlotsgenutzt.
EinespeziellereAnwendungistdieT‐RFLP(TerminaleRFLP).DabeiwerdendieZielgeneinder
PCR(PolymeraseChainReaction)miteinem(oderbeiden)fluoreszenzmarkiertenPrimer
amplifiziert.DieAmplifikationsproduktewerdenmiteinemRestriktionsenzymverdautund
durcheinenautomatisiertenSequenzeranalysiert.Dieserdetektiertnurdiefluoreszierenden
Fragemente(alsodieterminalen).AnwendungzumBeispielzurBestimmungderDiversitätin
einerProbeoderDiversitätsvergleicheentlangeinesGradienten.
Die18S‐,5,8Sund28S‐rRNAGeneeinerTranskriptionseinheitwerdenaufDNA‐Ebenedurchzweisogenannteinternaltranscribedspacer(ITS)getrenntundgemeinsamvoneinemexternaltranscribedspacer(ETS)angeführt(sieheSchemazeichnung).MituntergibtesauchamRepeat‐EndenocheinenETS.AufeinanderfolgendeTranskriptionseinheitenwerdendurchnontranscribedspacer(NTS)getrennt.PCRamBeispielderITSRegionvonHefen
1. IsolierungchromosomaleDNAvoneinerHefe2. AmplifikationderITS‐Regionausgehendderchr.DNAmittelsPCR3. Agaroseelektrophorese:‐ AuftrennungderPCRProdukte‐ BestimmungderGrössederPCRBandeninbp4. RestriktionsverdauderPCRProduktemitTaqI,ErkennungssequenzTCGA5. Agarosegelelektrophorese:AuftrennungderFragmenteBestimmungderGrösseder
FragmenteinbpLagederInternalTranscribedSpacer(ITS)‐RegionbeiHefen18SrDNA‐‐ITS1—5.8SrDNA—ITS2—26SrDNAITS‐RegionenhabenbeidenverschiedenenHefeneineunterschiedlicheGrösse(Mutationen)EsistegalwelcheHefeesist,amplifiziertwerdenalle,weilallediegleicheRegionhaben.
2. SequenzierungdermitochondrialenDNAvonKanninchen(KlassischeDNA
Sequenzierung)HierbezieheichmichaufdieDidesoxyMethode
DidesoxymethodenachSanger
DieDidesoxymethodenachSangerwirdauchKettenabbruchSynthesegenanntundstellteine
enzymatischeMethodedar.SiewurdevonSangerundCoulsonum1975entwickeltundbereits
1977mitdererstenvollständigenSequenzierungeinesGenoms(BakteriophageφX174[2])
vorgestellt.[3]SangererhieltfürseineArbeitenzurDNA‐SequenzierungzusammenmitGilbert
1980denNobelpreisfürChemie.
PrinzipderDNA‐SequenzierungnachderDidesoxy‐Methode.dNTPistdieallgemeineAbkürzungfüreinNukleosidtriphosphatundkannfürdATP,dCTP,dGTPoderdTTPstehen.ddNTPssinddieentsprechendenDidesoxy‐VariantenderdNTPs.DerEinbaueinesddNTPsführtzumAbbruchderPolymerisationsreaktion.DieblauenPunkteam5'‐EndedesPrimersstellteineMarkierungdar(z.B.einefluoreszierendeGruppe),mittelsderdieSyntheseproduktespäterimGelsichtbargemachtwerdenkönnen.AlternativlassensichauchradioaktivmarkierteNukleosidtriphosphatezurPolymerisationsreaktioneinsetzen.
AusgehendvoneinemkurzenAbschnittbekannterSequenz(Primer)wirddurchdasEnzym
DNA‐PolymeraseeinerderbeidenkomplementärenDNA‐Strängeverlängert.Zunächstwirddie
DNA‐DoppelhelixdurchErwärmungdenaturiert,woraufhinEinzelsträngefürdasweitere
VorgehenzurVerfügungstehen.InviersonstgleichenAnsätzen(allebeinhaltendievier
Nukleotide)wirdjeeinedervierBasenzumTeilalsDidesoxynukleosidtriphosphat(ddNTP)
zugegeben.DieseKettenabbruch‐ddNTPsbesitzenkeine3'‐Hydroxygruppe:Werdensieinden
neusynthetisiertenStrangeingebaut,isteineVerlängerungderDNAdurchdieDNA‐Polymerase
nichtmehrmöglich,dadieOH‐Gruppeam3'‐C‐AtomfürdieVerknüpfungmitder
PhosphatgruppedesnächstenNukleotidsfehlt.InderFolgeentstehenDNA‐Fragmente
unterschiedlicherLänge,dieinjedemAnsatzstetsmitdemgleichenddNTPenden.Entwederist
derPrimeroderessinddieddNTPsradioaktivmarkiert.NachderSequenzier‐Reaktionwerden
diemarkiertenAbbruchprodukteausjedemAnsatzmittelsPolyacrylamid‐Gelelektrophorese
derLängenachaufgetrennt.DurchVergleichdervierAnsätzekannmandieSequenz,nachder
EntwicklungdesradioaktivenGelsaufeinemfotografischenFilm,ablesen.Diedementsprechend
komplementäreSequenzistdieSequenzderverwendeteneinsträngigenDNA‐Matrize.Als
Sequenzier‐ReaktionkommtheutzutageeineVariationderPolymerase‐Kettenreaktion(PCR)
zumEinsatz.AndersalsbeiderPCRwirdnureinPrimereingesetzt,sodassdieDNAnurlinear
amplifiziertwird.
SeitAnfangderneunzigerJahrewerdenvorallemmitFluoreszenz‐FarbstoffenmarkierteDidesoxynukleosidtriphosphateeingesetzt.JedesdervierddNTPswirdmiteinemunterschiedlichenFarbstoffgekoppelt.DieseModifikationerlaubtes,allevierddNTPsineinemReaktionsgefäßzuzugeben,eineAufspaltungingetrennteAnsätzeundderUmgangmitRadioisotopenentfällt.DieentstehendenKettenabbruchproduktewerdenmittelsKapillarelektrophoreseaufgetrenntundmitHilfeeinesLaserszurFluoreszenzangeregt.DieddNTPsamEndejedesDNA‐FragmenteszeigendadurchFluoreszenzunterschiedlicherFarbeundkönnensovoneinemDetektorerkanntwerden.DasChromatogramm(dieAbfolgederFarbsignale,dieamDetektorerscheinen)gibtdirektdieSequenzderBasendessequenziertenDNA‐Strangeswieder.
3. KlonierungderSODvonE.coliinE.coli
3.1 DieGrundlagendesKlonierensKlonierungensindeineeinfacheAngelegenheit.ManverdautVektorundDNA‐Fragment,reinigtsie,ligiertsiemiteinanderundtransformiertdiewildeMischung,diedabeientsteht,inBakterien.AnschliessendmussmannurnochunterdenBakterieneinesmitdemgewünschtenKlonselektierenundfertigistdieKlonierung.DieSchwierigkeitenimDetail:DerVektor:MeistentscheidetmansichzuBeginnseinerArbeitenfüreinenKlonierungsvektorundbleibtbeidiesem.ManbenutztauchimmerwiederdiegleichenSchnittstellen.ObwohlmanfürdieeinzelneLigationnurwenigVektorbenötigt(25‐50ng),solltemandeswegenimmergleichgrössereMengen(1‐5mikrog)präparieren,d.h.ordentlichverdauenundgegebenenfallsdesphosphorylieren,aufreinigunen,aufeineKonzentrationvon25ng/mikroleinstellenundwegfrieren.VerdautmandenVektormitzweiRestriktionsenzymen,setztmaneinkleinesStückPolylinkerfrei,dasbeideranschliessendenLigationstört,weilsokleineDNAFragmenteweitbesserindenVektorliegiertwerdenalsdasFragment,dassmaneigentlichhineinbekommenmöchte.IstdasPolylinkerstückenkürzerals10bis15Basen,wirdmanesbeiderEthanolfällunglos,isteslänger,solltemandasVektorfragmentübereine
GelelektrophoresevomPolylinkerfragmenttrennenunddenVektorausdemGelaufreinigen.WennmandenVektormitnureinemRestriktionsenzymschneidet,entstehenzweikompatibleEnden,diewiedermiteinanderliegierenkönnen.ManhatdamitdenFeindindereigenenVektor‐DNAundderAnteilanWunschklonenistmeistminimal.MankanndiesesProblemverringernindemmandieVektor‐DNAdesphoshoryliert.UmgangssprachlichsprichtmanauchCIPen.DasPrinzip:NachdemRestriktionsverdaubleibenanden5`‐EndenderDNA‐FragmentenPhosphatresetezurück,diefürdieLigationbenötigtwerden.EntferntmandiesemiteinerPhosphatase,kannkeineSelbstligationdesVektorsmehrstattfinden.DasFragment,dasmanhieinbefördernmöchte,besitztdagegennochbeidePhosphatresteundkanndaherseinerseitsimmernochmitderVektor‐DNAligieren,zumindestmiteinemderbeidenStränge.DasDNAFragment:DerschwierigsteSchrittistmeist,geeigneteRestriktionssschnittstellenfürdieKlonierungzufinden.IstdiesesProblemgelöst,verdautmandieDNA,trenntdieFragmenteübereinAgarosegelundisoliertdasgewünschteDNA‐FragmentausdemGel.DasFragmentwirdanschliessendineineVektor‐DNAligiert,diemitdengleichenRestriktionsenzymengeschnittenwurde.MitunterwillmaneinenganzbestimmtenVektorfürdieKlonierungverwenden,dochstelltsichheraus,dasserkeinepassendenSchnittstellenbesitzt.Bevormananfängt,sichverzweifeltdieHaarezuraufen,solltemanvorsichtshalberkurzprüfen,obsichnichtwenigstenseinpaarSchnittstellenfinden,diekompatibleÜberhängeproduzieren.
3.2 KlonierenvonPCR‐ProduktenEinebesondereHerausforderungstelltdieKlonierungvonPCR‐Produktendar.DerklassischeWeg,beschriebenvonScharfetal.1986,bestehtdarin,anden5`‐EndenderbeidenverwendetenPrimerjeweilseineRestriktionssschnittstelleunterzubringen.NachderReinigungwirddasPCR‐ProduktgeschnittenundineinenpassendenVektorkloniert.DieSchwierigkeitbestehtdarin,dasseinigeRestriktionsenzymeandenEndeneinesFragmentsnurschlechtscheniden.DamandenErfolgeinersolchenOperationnursehrschlechtüberprüfenkann,ähneltderVorgangeinwenigeinemGlücksspiel.EinweitereNachteilderMethodebestehtdarin,dassmannichtimmerzweiPrimermitRestriktionsschnittstellenzurHandhat.FindigeGeisterarbeitendeshalbschonseiteinigerZeitaneinersimplerenundallgemeineranwendbarenMethode.EineklassischeLösungbestehtdarin,dasPCRFragmentineinenglatt,z.B.mitEcoRVgeschnittenenVektorzuklonieren.AmplifiziertmanPfuoderPwo,funktioniertdasauchganzgut,verwendetman,wiesomeistens,dieTaq‐Polymerase,istdieAusbeutenurmittelmässig,weildiesedieNeigunghat,andas3`‐EndedersynthetisirtenDNAeinezusätzlicheBaseanzuhängen.IstdieBaseam5`‐EndedesPrimerseinT,istdieChance,einglattesEndezuerhalten,nochamgrössten.UmbeiderKlonierungdenAnteilanKlonenmitInsertzuerhöhen,bietensicheingieganzpfiffigeMethodenan.HierwirdaufdieMehtodederTA‐Klonierungeingegangen!EinAnsatzbasiertaufderEntdeckung,dassdieTaq‐PolymerasekeineFragmentemitglattenEndenproduziert,sonderneinenmeistunspezifischenÜberhangvoneinerBaseschafft.DieseBaseistinderMehrzahlderFälleeinAdenosin,allerdingsnichtimmer.EineBaseÜberhangistnichtviel,aberbesseralsnichts.DurchdieKonstruktioneinesVekorsmitThymidinüberhanglassensichPCR‐FragmenteleichterklonierenalsinVektorenmitglattenEnden.DieMethodewirdalsTA‐Klonierungbezeichnetundnatürlichgibt’sdafürKITSmitfertigenT‐Vektor,z.B.beiInvitrogen.MankanndenVektoraberauchselbstherstellen,indemmanglattgeschnittenenVektormitTaq‐PolymeraseunddTTPimpassendenPufferfür2hbei70°Cinkubiertundanschliessendreinigt.
3.3 PlamidealsVektorenPlasmidesindzirkuläredoppelsträngigeDNA‐Moleküle,diesichunabhägigvombakteriellenGenominBakterienvermehrenkönnen.DieMinimalausstattungeinesPlasmidsbestehtauseinemReplikationnsstart(originofreplication,ori),einemSelektionsgen(meisteinAntibiotikaresistenzgen)undeinerKlonierungsstelle(cloningsite),umfremdeDNAinsPlasmideinschleussenzukönnen.DarüberhinauskannnocheineMengeandererSequenzendrinstecken,beispielsweisezweiterSelektionsmarkerodereinPromoterzwecksExpressiondeseingeschleustenGens.Plasmidvektorensindüblicherweise2.5bis5kblang,jenachdem,wassiesoanEigenschaftenbesitzen.WeildieGrösseeinesPlamidsimPrinzipnichtbeschränktist,kannmanjedeMengeDNAinsiehineinklonieren,dasmachtsiezuwunderbarenWerkzeugeninderMolekularbiologie.InderPraxiserweisensichPlamsideallerdingsdochalsrechtbeschränkt,manverwendetsiedahermeistfürdieKlonierungvonFragmentenvon0bis5kbLänge.AuchlängereFragmentekönneninPlasmideeingeschleustwerden,dochwirddieKlonierungüblicherweiseumsoschwieriger,jelängerdasFragmentist.DerReplikationsursprungentscheidetüberdieZahlderPlasmidkopien,dieeinBakteriumenthält.Sindeswenigeralszwanzig,bezeichnetmanesalslow‐copyPlasmid,währendrichtigehighcopyPlasmideinmehrerenhundertKopienjeBakteriumvorliegenkönnen.Üblicherweiseverwendetmanhigh‐copyPlasmide,weildieAusbeutebeiPlasmidpräparationenhöherist,dochkanndiegrosseKopienzahlmanchmalhinderlichsein.DieKlonierungsstelleenthältSchnittstellen,dieinderRegelnureinmalimVektorvorkommen.Dieserlaubt,denVektorfürdieKlonierungzuschneiden,ohneintausendkleineStückchenzuzerlegen.TheoretischreichteineeinzigesolcheSchnittstelleaus,aberumdieVektorenmöglichstvielseitigzumachen,enthaltendiemeistengängigenPlasmidvektorenzehnbiszwanzigdavon,mansprichtdannvoneinermultiplecloningsiteMCS.DieKlonierungsstellekannineinemGenliegen,dasinaktiviertwird,wenneinDNA‐FragmentindenVektorkloniertwird.DieserlaubteineeinfachereSelektiondergewünschtenKlonenachderKlonierung‐einesehrnützlicheEigenschaft,wennmanbedenkt,dasshäufignureinkleinerTeilderKolonien,diemannacheinerKlonierungaufderAgarplattevorfindet,auchdengewünschtenKlonenthält.AmhäufigstenwirddieBlau‐weissSelektionverwendetdieaufeinerUnterbrechungdeslacZ‐Gensberuht.LacZkodiertfürdasneueN‐terminalealpha‐Fragmentderbeta‐Galactosidase,dassalleinekeineBeta‐Galactosidase‐Aktivitätbesitzt.BringtmanesaberzusammenmitdemebenfallsinaktivenC‐terminalenomega‐Fragment,wirddieseAktivitätaufwundersameWeisewiederhersgestellt,einVorgang,deralsalpha‐Komplementationbezeichnetwird.DurchInsertationweisssonstblau.
3.4 Ablauf:SOD:Klonierung,ExpressioninE.coli
1. KenntnisüberdasProtein.SODinCytoplasma?Periplasma?Sekretion?
Glycosielierung?,S‐SBrücken?KorrekteFaltung?Hydrophobizität?2. DNA‐Sequenz,MuSOD,XO3951,Genbank3. DNA‐Isolation,chr.DNAE.coli4. AuswahlKlonierungsvektorfürE.coliPCRTZ/NT‐TOPO(Invitrogen)5. AuswahlDesignPCRPrimer6. Ligation:Vektor+PCR‐Produkt7. TransformationinE.coli:TOP10F+AnzuchtE.coli8. Plasmidisolierung+KontrolleOrierntierung9. TransformationinExpressionsstamm10. InduktionIPTG
11. Reingung+AnalysepolyHIS+SDSPage+WesternBlot
4. TheoriePCR
DiePolymeraseKettenreaktion(englischPolymeraseChainReaction,PCR)isteineMethode,
umdieErbsubstanzDNAinvitrozuvervielfältigen.DazuwirdeinEnzymverwendet,dieDNA‐
Polymerase.DerBegriff"Kettenreaktion"beschreibtindiesemZusammenhangdieTatsache,
dassdieProduktevorherigerZyklenalsAusgangsstoffefürdennächstenZyklusdienenund
somiteineexponentielleVervielfältigungermöglichen.
DiePCRwirdinbiologischenundmedizinischenLaboratorienfüreineVielzahlverschiedenerAufgabenverwendet,zumBeispielfürdieErkennungvonErbkrankheitenundVirusinfektionen,fürdasErstellenundÜberprüfengenetischerFingerabdrücke,fürdasKlonierenvonGenenundfürAbstammungsgutachten.DiePCRzähltzudenwichtigstenMethodendermodernenMolekularbiologieundvielewissenschaftlicheFortschritteaufdiesemGebiet(z.B.imRahmendesHumangenomprojekts)wärenohnedieseMethodenichtdenkbargewesen.
PCRinderPraxis
PCRwirdeingesetzt,umeinenkurzen,genaudefiniertenTeileinesDNA‐Strangszu
vervielfältigen.DabeikannessichumeinGenoderauchnurumeinenTeileinesGenshandeln
oderauchumnicht‐kodierendeDNA‐Sequenzen.ImGegensatzzulebendenOrganismenkann
derPCR‐ProzessnurrelativkurzeDNA‐Abschnittekopieren.BeieinerStandard‐PCRkönnen
diesbiszuetwa3.000Basenpaare(3kbp)langeDNA‐Fragmentesein.MitHilfebestimmter
Polymerasen‐Gemische,weitererAdditiveinderPCRundoptimalenBedingungenkönnensogar
FragmentemiteinerLängevonüber20–40kbpvervielfältigtwerden,wasimmernochsehrviel
kürzeristalsdiechromosomaleDNAeinereukaryotischenZelle.DasmenschlicheGenom
enthältbeispielsweiseetwadreiMilliardenBasenpaare.
InihrenmomentanenAnwendungsgebietenbenötigtPCRmehreregrundlegendeKomponenten.
Diesesind:
DieOriginal‐DNA,diedenzuvervielfältigendenAbschnittenthält
ZweiPrimer,umaufdenbeidenEinzelsträngenderDNAjeweilsdenStartpunktderDNA‐
Synthesefestzulegen,wodurchderzuvervielfältigendeBereichvonbeidenSeiten
begrenztwird.
DNA‐Polymerase,diebeihohenTemperaturennichtzerstörtwird,umdenfestgelegten
Abschnittzureplizieren(kopieren)(z.B.Taq‐Polymerase)
Desoxynukleosidtriphosphate,dieBausteinefürdenvonderDNA‐Polymerasesynthetisierten
DNA‐Strang
Mg2+‐Ionen,fürdieFunktionderPolymeraseessentiell
Pufferlösungen,dieeinefürdieDNA‐PolymerasegeeignetechemischeUmgebung
sicherstellen
DiePolymerase‐KettenreaktionfindetineinemsogenanntenThermocyclerstatt.DieseMaschine
erhitztundkühltdieinihrbefindlichenReaktionsgefäßepräziseaufdieTemperatur,diefürden
jeweiligenSchrittbenötigtwird.UmVerdunstungzuverhindern,wirdeindichtschließendes
ReaktionsgefäßodereineÖlschichtaufdemReaktionsgemischverwendet.Etwaige
KondensatbildungimDeckeldesGefäßeswirddurcheinenbeheizbarenGerätedeckel(über100
°C)verhindert.
SolldiePCRvorallemalsquantitativerNachweisdienen,empfiehltsichdiesog.RealTimePCR.
DieVerwendungeinerPyrophosphatasekannunterUmständendieEffektivitätderPCRsteigern.DasEnzymkatalysiertdieHydrolysedesvondenNukleotidtriphosphatenabgespaltenenPyrophosphatszuOrthophosphat.PyrophosphatkannalsInhibitorbeiderPCRwirken.
Beispiel
PCR‐Reaktionsgefäße.PCR‐Plattefür96AnsätzemitGummiabdeckung
AlsallgemeinesBeispielseihierdie„Rezeptur“füreinePCR‐Reaktionwiedergegeben(viele
BeispielefürdieverschiedenstenReaktionenfindensichansonsteninderwissenschaftlichen
LiteraturinallenmöglichenVariationen):
1,0µlDNA‐Lösung(100ng/µl)
2,0µlproPrimer(i.d.R.zwei)(10µM)
1,0µlPfu‐,Taq‐oderanderethermostabilePolymerase(1–5U/µl)Pwo,TbrTfi
1,0µl10mMDesoxy‐Nukleotide(dATP,dGTP,dCTP,dTTP),„dNTP“
5,0µl10‐fachkonzentriertePolymerase‐Pufferlösung
38,0µlH2O
50,0µlGesamtvolumenEin200‐µl‐Reaktionsgefäßmitden50µlGemischwirdindenThermocyclergestellt.AlsReaktionsgefäßkönnennebeneinzelnen200‐µl‐Reaktionsgefäßenauchachtzusammenhängende200‐µl‐ReaktionsgefäßeoderPCR‐Plattenfürbiszu96Ansätzeverwendetwerden.DiePlattenwerdenentwedermiteinerGummiabdeckungodereinerselbstklebendenKlarsichtfolieverschlossen.
TheoretischerAblauf
DerPCR‐ProzessbestehtauseinerAnzahlvon12–50Zyklen,dieineinemThermocycler
durchgeführtwerden.DiefolgendenAngabensindalsRichtwertegedacht.MeistmusseinePCR
aufdiespezifischeReaktionhinoptimiertwerden.JederZyklusbestehtausdreiSchritten(siehe
Abbildungunterhalb):
Denaturierung(Melting,Schmelzen):ZunächstwirddiedoppelsträngigeDNAauf94–96°C
erhitzt,umdieSträngezutrennen.DieWasserstoffbrückenbindungen,diediebeiden
DNA‐Strängezusammenhalten,werdenaufgebrochen.ImerstenZykluswirddieDNAoft
fürlängereZeiterhitzt(Initialisierung),umsicherzustellen,dasssichsowohldie
Ausgangs‐DNAalsauchdiePrimervollständigvoneinandergetrennthabenundnur
nochEinzelsträngevorliegen.Manche(sogenanntehotstart‐)Polymerasenmüssen
durcheinenochlängereanfänglicheErhitzungs‐Phase(biszu15Minuten)aktiviert
werden.
Primerhybridisierung(primerannealing):DieTemperaturwirdca.30Sekundenlangaufeiner
Temperaturgehalten,dieeinespezifischeAnlagerungderPrimerandieDNAerlaubt.
DiegenaueTemperaturwirdhierbeidurchdieLängeunddieSequenzderPrimer
bestimmt(bzw.derpassendenNukleotideimPrimer,wenndurchdiesenMutationen
eingeführtwerdensollen=site‐directedMutagenesis).WirddieTemperaturzuniedrig
gewählt,könnensichdiePrimerunterUmständenauchannicht‐100‐%‐
komplementärenSequenzenanlagernundsozuunspezifischenProdukten
(„Geisterbanden“)führen.WirddieTemperaturzuhochgewählt,istdiethermische
BewegungderPrimeru.U.sogroß,dasssiesichnichtrichtiganheftenkönnen,sodass
eszugarkeinerodernurineffizienterProduktbildungkommt.DieTemperatur,welche
diebeidenobengenanntenEffekteweitgehendausschließt,liegtnormalerweise2–3°C
unterdemSchmelzpunktderPrimersequenzen;diesentsprichtmeisteinerTemperatur
von55–65°C.Elongation(Polymerisation,Verlängerung,Amplifikation):SchließlichfülltdieDNA‐PolymerasediefehlendenSträngemitfreienNukleotidenauf.Siebeginntam3'‐EndedesangelagertenPrimersundfolgtdanndemDNA‐Strang.DerPrimerwirdnichtwiederabgelöst,erbildetdenAnfangdesneuenEinzelstrangs.DieTemperaturhängtvomArbeitsoptimumderverwendetenDNA‐Polymeraseab(68–72°C).DieserSchrittdauertetwa30Sekundenje500Basenpaare,variiertaberinAbhängigkeitvonderverwendetenDNA‐Polymerase.ÜblicheThermocyclerkühlendieReaktionsansätzenachVollendungallerZyklenauf4–8°C,sodasseinePCRamAbendangesetztwerdenkannunddieProbenamMorgendaraufweiterverarbeitetwerdenkönnen.
SchematischeDarstellungdesPCR‐Zyklus.(1)Schmelzen(Denaturierung)beica.96°C.(2)Anlagerung(Primerhybridisierung)beica.68°C.(3)Verlängerung(Elongation)beica.72°C(P=Polymerase).ExponentiellesAnwachsendesKurzenProduktes(vonPrimerneingeschlossenerBereich).
ImerstenZyklusentstehenproDNA‐Ausgangsdoppelstrang2DNA‐Stränge,welcheimBereich
derZielsequenzdoppelsträngigsind.NachdemSchmelzenamAnfangdeszweitenZyklusstehen
dadurchdiebeidenursprünglichenDNA‐Einzelsträngeundzweiam3’‐Endeüberlange
EinzelsträngezurVerfügung.Diesistdamitzuerklären,dasslediglicheinStartpunkt(Primer),
nichtabereinEndpunktexaktfestgelegtist.DerAbbruchderStrangsyntheseerfolgtdabei
spätestensdurchdieStrangtrennungimfolgendenDenaturierungsschritt.ImzweitenZyklus
stehendieeingesetzteDNAsowiediegeradegebildetenDNA‐SträngezurVerfügung.An
ErsterererfolgtderselbeProzesswieimerstenZyklus.AndieneugebildetenDNA‐
Einzelstränge,welchean3’bereitsdortendenwosiesollen,lagernsichnunPrimerinder5’‐
Regionan.DienungebildetenSträngehabenkeinen5’‐Überhang,dadiePolymeraseaufdem
TemplateinRichtungdes3’‐Endesliest.AmEndedeszweitenZyklusstehendamiterstmals
ProduktedergewünschtenLängezurVerfügung.IndenfolgendenZyklenvermehrensichdie
gewünschtenProdukteexponentiell(dasieselbstalsMatrizefürweitereStrangsynthesen
dienen),währenddieungewünschtenlangenProdukte(sieheProduktedeserstenZyklus)nur
linearansteigen(nureingesetzteDNAdientalsMatrize).DiesistdertheoretischeIdealfall,in
derPraxisfallenzudemingeringemMaßeauchkürzereFragmentealsdiegewünschteZiel‐DNA
an.DiesekurzenFragmentehäufensichvorallemindenspätenZyklenan,wodurchmeistnur
etwa30Zyklendurchlaufenwerden,uminsgesamtvorwiegendDNAdergewünschtenLänge
undSequenzzuerhalten.
DasPCR‐ProduktkanndurchAgarose‐GelelektrophoreseanhandseinerGrößeidentifiziertwerden.(DieAgarose‐GelelektrophoreseisteinVerfahren,beiderDNAineinAgarose‐GeleingebrachtwirdundanschließendeineSpannungangelegtwird.DannbewegensichdiekürzerenDNA‐SträngeschnelleralsdielängerenaufdenPluspolzu.)DieLängedesPCR‐ProduktskanndurcheinenVergleichmiteinerDNA‐Leiter,dieDNA‐FragmentebekannterGrößeenthältundparallelzurProbeimGelmitläuft,bestimmtwerden.
4.1 RealtimequantitativePCR
DieRealTimequantitativePCR(RTQPCR,auchRealTimeDetectionPCR,kurzRTDPCR)ist
eineVervielfältigungsmethodefürNukleinsäuren,dieaufdemPrinzipderherkömmlichen
Polymerase‐Kettenreaktion(PCR)beruht,undzusätzlichdieQuantifizierungdergewonnenen
DNAermöglicht.DieQuantifizierungwirdmitHilfevonFluoreszenz‐Messungendurchgeführt,
diewährendeinesPCR‐Zykluserfasstwerden(daherderName„RealTime“).DieFluoreszenz
nimmtproportionalmitderMengederPCR‐Produktezu.AmEndeeinesLaufs(deraus
mehrerenZyklenbesteht)wirdanhandvonerhaltenenFluoreszenzsignalendieQuantifizierung
inderexponentiellenPhasederPCRvorgenommen.NurinderexponentiellenPhasederPCR
(diewenigeZyklenineinemLaufdauert)istdiekorrekteQuantifizierungmöglich,dawährend
dieserPhasedieoptimalenReaktionsbedingungenherrschen.DieseMethodeunterscheidetsich
somitvonanderenquantitativenPCR‐Methoden(qPCR),dieerstnachAblaufderPCReine
quantitativeAuswertung(z.B.KompetitivePCR),meistunterEinbeziehungeiner
gelelektrophoretischenAuftrennungderPCR‐Fragmente,vornehmen.
DieReal‐Time‐quantitative‐PCRkannauchfürandereZweckeverwendetwerden,z.B.zur
UnterscheidungzwischenhomozygotenundheterozygotenZellen.
FürdieReal‐Time‐PCRwirdoftdieAbkürzungRT‐PCRverwendet,wasaberauchzuVerwechslungenführenkann,daauchdieReverse‐Transkriptase‐Polymerasekettenreaktionsoabgekürztwird.
Methoden
InterkalierendeFarbstoffe
DieeinfachsteMöglichkeitderQuantifizierungderPCR‐ProdukteistdieNutzungvonDNA‐
Farbstoffen(z.B.EthidiumbromidoderSYBR®GreenI).
DieseFluoreszenzfarbstoffelagernsichindieDNAein(interkalieren)bzw.bindenandie
doppelsträngigeDNA,wodurchdieFluoreszenzdieserFarbstoffeansteigt.DieZunahmeder
Target‐DNAkorreliertdahermitderZunahmederFluoreszenzvonZykluszuZyklus.Die
MessungfindetamEndederElongationinjedemZyklusstatt.
EinNachteildiesesVerfahrensistdiegeringeSpezifität,dazwischenverschiedenenPCR‐
Produktennichtunterschiedenwerdenkann.AußerdemkönnenkeineMultiplex‐Messungen
durchgeführtwerden.
DenerstenNachteilkannmanausgleichen,indemmannachabgelaufenerPCReine
Schmelzkurvenanalysedurchführt,anhanddererdieFragmentlänge(n)unddadurchdie
Spezifitätbestimmtwerdenkann.
BeieinerSchmelzkurvenanalysewirddieDNAaufgeschmolzen,indemdieTemperaturlangsam
kontinuierlicherhöhtwird(50°C‐>95°C).BeieinerfürdasFragmentspezifischen
SchmelztemperaturdenaturiertderDoppelstrangzuzweieinzelsträngigenMolekülen.Dabei
wirdderFluoreszenzfarbstoff(z.B.SYBR®GreenI)freigesetzt,undeswirdeine
Fluoreszenzabnahmeregistriert.DadiedoppelsträngigeDNAvonspezifischenPCR‐Produkten
einenhöherenSchmelzpunkthatalsunspezifischentstehendePrimerdimere,isteine
Unterscheidungmöglich.DieHöhedesPeaksderSchmelzkurvegibtannäherndAuskunftüber
dieMengedesgebildetenFragments.
FRETSonden
EineandereMöglichkeitist,denFluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)auszunutzen.
EinDonor‐Fluorochrom(Reporter‐imZusammenhangmitTaqManSonden),dasdurcheine
Lichtquelleangeregtwird,gibteinenTeilseinerEnergieaneininausreichenderNähe
befindlichesAkzeptor‐Fluorochrom(bzw.einen„dunklen“Quencher‐imZusammenhangmit
TaqManSonden)ab.NimmtderAbstandzwischenAkzeptorundDonorzu,sonimmtFRETund
somitdasFluoreszenzsignaldesAkzeptorsab,währenddasdesDonorszunimmt.Diese
Methodeistsehraufwendigundteuer,bietetaberdieVorteilederhohenSpezifitätdesAssays.
LightCycler®Sonden(auchHybridisierungsSonden)
DieeinfachsteMöglichkeitderNutzungdesFRETzurQuantifizierungvonNukleinsäurenbestehtinderVerwendungvonLightCycler®‐Sonden.Zweiverschiedene,jeweilsmiteinemFRET‐Donorbzw.FRET‐Akzeptor(hierReporter)markierteOligonukleotide,dienebeneinanderandieZiel‐SequenzbindenunddamitdieFluorochromeineinefürdenFRETausreichendeNähebringen,könnenalsSondenfürdieQuantifizierungderPCR‐Produkteeingesetztwerden.DieMessungfindetamEndederAnnealing‐PhaseinjedemZyklusstatt.AuchhierkannsicheineSchmelzkurvenanalyseanschließen.
QuantifizierungvonNucleinsäurenmitHilfederReal‐time‐PCRundLightCycler®‐Sonden.(1)EinsatzvonLightCycler®‐Sonden,diemit2verschiedenenFRET‐Fluorophorenmarkiertwurden.(2)WährendeinesPCR‐ZyklushybridisierendieSondenmitdemkomplementärenDNA‐StrangundermöglichensomiteineFluoreszenzdesAkzeptors.(3)DieAkzeptor‐Fluoreszenz(hierderReporter)steigtproportionalmitderKonzentrationkomplementärerDNA.
TaqMan®Sonden(auchHydrolyseSonden)
EineweiterehäufiggenutzteMöglichkeitdesFRETbestehtinderAnwendungeinerSonde,dieanihremeinenEndemitdemQuencher,anihremanderenEndemiteinemReporter‐Fluoreszenzfarbstoff(z.B.TAMRAundFAM)markiertwird(Double‐Dye‐Oligos,TaqMan®‐Sonde).WenndieTaq‐Polymerase,diezusätzlichzurPolymeraseaktivitäteine5'‐3'‐Exonuclease‐Aktivitätbesitzt,dieSondewährendderSynthesedesGegenstrangesam5'‐Endeabbaut,entfernensichdadurchQuencherundFluorophorvoneinander,undeinesteigendeReporter‐Fluoreszenzkanngemessenwerden.DieMessungfindetamEndederElongationinjedemZyklusstatt.
QuantifizierungvonNucleinsäurenmitHilfederReal‐time‐PCRundTaqMan®‐Sonden.(1)DieFluoreszenzdesReporter‐FluorophorswirdbeiintaktenTaqMan®‐SondendurcheinenQuencherdurchstrahlungsfreieEnergieübertragung(FRET)unterdrückt.(2)WährendeinesPCR‐ZyklushybridisiertdieSondemitdemkomplementärenDNA‐Strang,dieReporter‐Fluoreszenzbleibtzunächstunterdrückt.(3)DieTaq‐PolymerasebautaufGrundihrer5'‐3'‐Exonucleaseaktivitätdas5'‐EndederSondewährendderPCR‐Zyklenab.DieFluoreszenzdesReporterswirdnunnichtmehrdurchdenQuenchergelöschtundkanngemessenwerden.
Quantifizierung
VerschiedeneRechenmodellewerdenfürdieQuantifizierungherangezogen,wobeimeistensein
Referenz‐Gen(z.B.GAPDH,Actin,Tubulin)mitgemessenwird,umeinenrelativenMenge‐
Vergleichdurchzuführen(relativeQuantifizierung).Andere,weitauskompliziertereMethoden
solleneineabsoluteQuantifizierungermöglichen,beiderdiegenaueAnzahlderinderProbe
vorhandenenTemplatesbestimmtwerdenkann.
CTWertoderauchCpWert
IndererstenPhasederAmplifikationeinerPCRistdieTemplatemengebegrenztunddie
Wahrscheinlichkeit,dasssichTemplate,PrimerundPolymerasetreffen,suboptimal,währendin
derdrittenPhasederAmplifikationdieMengederProdukte(DNA,Pyrophosphat,
Monophosphatnucleotide)derartansteigt,dasseszurHemmungdurchdiesekommt,häufiger
Produktfragmentemiteinanderhybridisieren,dieSubstratelangsamverbrauchtwerdenund
letztlichdiePolymerasenundNucleotidedurchdieHitzelangsamzerstörtwerden.Ein
exponentiellerunddaherquantifizierbarerAnstiegfindetsichnurinderPhasedazwischen.
ExponentiellbleibteinePCRbei12bis400Ausgangskopienfürca.30Zyklen,bei200bis3200
für25Zyklenundbeianfänglich3200bis51200fürhöchstens20Zyklen.UmimmeramAnfang
derexponentiellenPhasemessenzukönnen,wirdhäufigderCT‐Wert(ThresholdCycle=
"Schwellenwert‐Zyklus")bzw.derCp‐Wert(CrossingPoint)verwendet,derdenZyklus
beschreibt,andemdieFluoreszenzerstmaligsignifikantüberdieHintergrund‐Fluoreszenz
ansteigt.
Effizienz
DieEffizienzkannaufverschiedeneArtenberechnetwerden,diesichinihremErgebnisleicht
unterscheiden.DieeinfachsteArtistfolgende:
DieEffizienzEkannmitHilfederSteigungmeinerStandardkurveberechnetwerden:[1]
E=10−1/m
EineSteigungmvon−3,32würdesomiteineEffizienzvon100%bedeuten,d.h.eine
VerdopplungderAmplifikateproZyklus.‐3.58eineEffizienzvon90%.
AbsoluteQuantifizierung
EineabsoluteQuantifizierungistaufwändigunddieErgebnissefragwürdig,daherwirddieseArt
derQuantifizierungseltendurchgeführt.Somussu.a.dieEffizienzderreversenTranskription,
diezwischen5und95%liegenkann,bestimmtwerden,z.B.durchVerwendungsynthetisierter
RNAbekannterMenge.
RelativeQuantifizierung
HierfürwirdeineinterneKontrollebenötigt.EineinterneKontrollekanneinGen‐Transkriptsein,dessenSignalverwendetwird,umVariationeninderAusgangsmengedereingesetztenRNAauszugleichen.DieswirdalsNormierungbezeichnet.WeildieGesamtanalyseaufdiesemSignalberuht,istdieWahlderinternenKontrolleeinwichtigerAspektdesExperiments.DieidealeinterneKontrolleistleichtzudetektieren,undderenExpressionsolltenichtwährenddesZellzyklus,zwischenZelltypenoderalsAntwortaufdieexperimentelleBehandlung(z.B.Stress,Medikamente,Krankheit)variieren.
BerechnungmitHilfeeinerStandardKurve
Esbestehteinelineare,umgekehrtproportionaleBeziehungzwischendemLogarithmusder
eingesetztenMengeunddemCT.IstdieAusgangsmengebekannt,kanneineStandardkurve
durchAuftragendesLogarithmusderAusgangsmengegegendenCTkonstruiertwerden.Durch
dieGeradengleichungx=(CT−b)/mkannanderStandardkurvefürjedeunbekannteProbeder
LogarithmusderKopienzahlbestimmtwerden.AlleProbenwerdennormiert,indemdie
errechneteKopienzahldesTargetgensdurchdieKopienzahlderinternenReferenzgeteiltwird:
GEN(normiert)=KopienzahlTarget/KopienzahlReferenz
DieunterschiedlicheExpressionzweierProbenrelativzueinanderlässtsichalsQuotient
darstellenundergibteinen‐facheExpression:GEN(normalisiert)(GruppeA)/
GEN(normalisiert)(GruppeB)=n‐FacheExpressionGruppeAzuGruppeB
BerechnungnachderdeltadeltaCTMethode
DieunterschiedlicheExpressionwirdalsn‐facheExpressionmitHilfedesdelta‐delta‐CT‐Wertes
angegeben.WichtigbeidiesemVerfahrenisteinegleicheEffizienzderbeidenbeteiligtenPCR‐
Reaktionen.DieCT‐Wertewerdenhierbeieinfachvoneinanderabgezogen(delta‐CT),diebeiden
delta‐CT‐WertedereinzelnenGruppen(z.B.krank/gesund,mit/ohneMedikament)
voneinanderabgezogen(delta‐delta‐CT‐Wert)undindieGleichungn‐FacheExpression(Gruppe
AzuGruppeB)=2‐delta‐delta‐CTeingesetzt.
NeueQuantifizierungsalgorithmen
UmdieGenauigkeitderrelativenQuantifizierungzuverbessern,sindverschiedene,teilsaufder
delta‐delta‐CT‐MethodebasierendeAnsätzeentwickeltworden.
1.ErweiterungderFormelderdelta‐delta‐CT‐MethodeumdieEffizienzdesjeweiligenPCR‐
Ansatzes,diezuvorineinemProbelaufübereineStandardkurvebestimmtwerdenmuss.
2.MittelsRegressionsanalysenFitderReal‐time‐PCR‐DatensätzeaneineexponentielleFunktion
bzw.inlinearisierterFormaneineGeradengleichung.DerSchnittpunktdieserFunktionenmit
dery‐AchsegibtdannAufschlussüberdieursprünglichimAnsatzvorhandeneDNA‐Menge
(relativeAngabeimVergleichzueinerReferenzprobe).
3.FitderReal‐time‐PCR‐Datenaneinedrei‐odermehrparametrigesigmoideFunktion.Auch
hierwirddierelativeDNA‐Mengeübery(0)bestimmt.
Vorteiledieserneuen,überwiegendnochnichtmarktreifenMethodenliegenindergenaueren
AnalyseundgeringerenVarianzderPCR‐Ergebnisse.BeieinigenMethodenwirddieEffizienzin
jedemeinzelnenProbenansatzberücksichtigtundermöglichtsoeine„singletube“Analyse.
ReproduzierundVergleichbarkeitderErgebnisse
EinExperimentistgarnichtswert,wennmanesnichtwiederholenkann.HierfüristesabsolutnotwendigdieVersuchsbedingungenkonstantzuhalten.DabeiisthiernichtnurdieKonsistenzderAssay‐Qualität(Primer,Sonden,Polymerase,Pufferetc.)zuberücksichtigen,auchdieGerätemüssendenAnforderungengenügen.BeispielsweiseistbeiBlock‐Systemen(96‐oder384‐Wells)diesogenannteHomogenitätdasgroßeKriterium.DieAssaysmüsseninjedemWelldesBlocksundzudemaufBlöckenbaugleicherGerätegleichgutlaufen.WeiterhindarfsichimzeitlichenVerlaufdieseHomogenitätnichtverändern.Umsicherzustellen,obmanmitdemGerätimLaborsichereExperimentedurchführenkann,solltemaninregelmäßigenAbständenentsprechendeKontrollendurchführen(einigeModelleneigenextremzumAltern!).DabeiwirdeinAssayinvielenReplikatenüberdengesamtenBlockverteiltanalysiert.Ganzklar:dasErgebnissollteimIdealfallüberallgleichsein.JetztsolltedemExperimentatorbewusstsein,inwieweitAbweichungenauchrelevanteAuswirkungenhabenkönnen.DieseAbweichungenlassensichübrigensnichtmittelsteurerWiederholungenausgleichen,dadieserebensokonstantwiederholtwerdenwürde.
4.2 PrimerauswahlEinerseitslässtsichüberdiePrimeramwenigstensagen,weilsiespeziellfürdiegewünschteAmplifikationmassgeschneidertwerden,andererseitsentscheidensieammeistenüberdasGelingenderAmplifikation.SounvorhersehbarihrVerhaltenist,gibtesdocheinigeRegeln,diedieWahrscheinlichkeitdesFunktionierensdeutlicherhöhen.AlsDaumenregelgilt:
‐ PCRPrimerhabennormelerweiseeineLängevon18‐30BasenundbesitzeneinenAnteilvon40%bis60%GuanidinundCytosinG+C.PrimerfürdieAmplifikationextralangerProduktesollten25bis35Basenlangsein.DerPrimersolltenichtmehralsviergleicheBasenmiteinanderenthalten,z:b.AAAA,umFehlhybridisierungenundLeserasterverschiebungenzuvermeiden.DieSchmelztemeperatursollte55‐80°Cbetragen,umausreichendhoheAnnealingtemperaturenzuerlauben.
‐ Am3`‐EndesollteneinbiszweiGoderCsitzen,umeinebessereBindungundElongationzuerhalten,andererseitswirdempfohlen,höchstensdreiGoderCans3`‐Endezupaltzieren,weilsonstfehlhybridisierendePrimerstabilisiertwerden,dadurchsteigtdieGefahrvonunspezifischenAmplifikationsprodukten.
‐ DieSequenzsolltemöglichstspezifischseinfürdasgewünschteAmplifikationsprodukt,sodassdiePrimernuranderrichtigenStellehybridisieren.JemehrverwandteSequenzeninderverwendetenTemplate‐DNAexistieren,destohöheristdieWahrscheinlichkeitfürunterwünschteAmplifikationsprodukte.JekomplexerdieTemplate‐DNA,destogrösserwirddieWahrscheinlichkeit,Artefaktezuamplifizieren.ManbegegnetdemProblemambestenüberdieMöglichkeithoheAnnealingtemperaturen55bis65°C‐soferndiePrimersequenzdashergibt.MitsteigenderTemperatursinktallerdingsdieAnnealingwahrscheinlichkeitunddamitdieAubeute.
‐ DiePrimersolltekeineinternenSekundärstrukturenwieHaarnadelnhairpinsbilden,weildiesedieWahrscheinlichkeitdesHybridisierensmitderTemplate‐DNAreduzieren.
‐ DiePrimerdürfennichtmiteinanderhybridisierenundsollteneienmöglichstgeringeKomplementaritätanihren3`‐Endenbeitzen‐dereinePrimerkannsonstalsTemplatefürdenanderendienen.AufdieseWeiseentstehenstattdesgewüschtenAmpölifikationsproduktesvorallemdiegefürchtetenPrimerdimere.DieMengeannutzbaremPrimerwirddadurchdastischreduziertunddieAmplfikationseffizienzsinktinsBodenlose.
5. DieElektroporation
ElektroporationisteineMethode,Zellmembranenpermeabelzumachen,umsoDNAin
prokaryotischeZellen(Transformation)odereukaryotischeZellen(Transfektion)einzuschleusen
.DieElektroporationwirdhäufiginderMolekularbiologieverwendet.ImBereichder
Lebensmittel‐undBioverfahrenstechnikkanndieElektroporationzurBesserungvon
MassentransportprozessenoderzurInaktivierungvonMikroorganismeneingesetztwerden.
Prinzip
DurcheinelektrischesFeld,dasinderRegeldurcheinenschnellentladendenKondensator
erzeugtwird,werdeninderbehandeltenZellmembranmikroskopischkleineLöchererzeugt,die
sichinnerhalbvonMillisekundenwiederschließen.DieserEffektderElektroporationwurdevon
Zimmermann1974sowieNeumann1972beschrieben.DiePoreninduktionbedingteinen
VerlustderSemipermeabilitätderZellmembranunddieFreisetzungintrazellulärer
Bestandteile.FügtmandemUmgebungsmediumvorheraberfreieDNAhinzu,kanndiesevon
denZellenaufgenommenwerden.
ElektroporationistfaktischmitallenZelltypenmöglich;dieTransformationsratebeidieser
Methodeistextremhoch.
ElektroporationkannauchzurAbtötungvonMikroorganismenverwendetwerden.Obein
industriellerEinsatzdieserMethodezurSterilisierungdiverserSubstanzen(z.B.Wasser)
möglichist,wirdnochdiskutiert.
Verfahren
SchematischeDarstellungeinesElektroporatorsmitKüvette.
KüvettenfürdieElektroporationmitElektrodenausAluminium.
ZurElektroporationbenutztmaneinenElektroporator–einGerät,dasdaselektrischeFeld
erzeugt.DerElektroporatorhateinenPlatzfüreineKüvette,indiemandieZellsuspension
pipettiert.DieKüvetteverfügtüberzweiElektrodenausAluminium.
Normalerweisebenötigtman50MikrolitereinerZellsuspension.VorderElektroporationmischt
manmaximal1MikroliterderPlasmidlösungmitdenZellenein.DieSpannungwirdam
Elektroporatoreingestellt,dieKüvettehineingestecktunddieElektroporationdurchgeführt.Der
VorgangdauerteinigeSekunden.
DieErfolgsratederElektroporationhängtstarkvonderReinheitderPlasmidlösungab;
insbesonderemussdieLösungvonSalzenfreisein.EineunreineLösungkannbeider
ElektroporationzueinerkleinenExplosionführen,wobeidieZellengetötetwerden.Des
WeiterenmüssendieElektrodenderKüvetteganztrockensein.
ImBereichderLebensmittelverarbeitungkommenkontinuierlicharbeitendeSystemezum
Einsatz.DaszubehandelndeGutwirddurcheinenReaktionsraumgefördert,indemanhand
einerodermehrererElektrodenpaareeingepulsteselektrischesFelderzeugtwird.Die
WiederholungsratederImpulsewirdandenProduktstromangepasst.Diebenötigteelektrische
FeldstärkeliegtüblicherweiseineinemBereichvon1kV/cmfürpflanzlicheodertierische
Zellenbzw.10bis40kV/cmfürMikroorganismen.
4.3ReverseTranskriptase‐Polymerase‐Kettenreaktion
DieReverseTranskriptasePolymeraseKettenreaktion(RTPCR)istdieKombinationaus
zweiMethodenderMolekularbiologie–dieNutzungderReversenTranskriptaseunddie
Polymerase‐Kettenreaktion–umdieGenexpressionvonspezifischenGeneninZellen,Geweben
oderBlutserumnachzuweisen.VerwendetwirddieRT‐PCRinForschungundDiagnostik.
DieTechnik
UmdieTranskriptioneinesGenesnachzuweisen,mussdieabgeleseneRNAuntersuchtwerden.
BeiderAmplifikationvonDNAdurchPolymerase‐Kettenreaktion(PCR)werdenspezifische
DNA‐Polymerasenverwendet,dieDNA‐abhängigsind,d.h.siesindnichtinderLage,RNAzu
amplifizieren.DaherwirdzuersteineReverseTranskriptase(RT)eingesetzt,eineRNA‐
abhängigeDNA‐Polymerase,mitderenHilfeRNAincDNAumgeschriebenwerdenkann.Die
cDNAkannimAnschlussalsAusgangsmaterialineinerPCRverwendetwerden,umspezifische
Sequenzenausdieserzuamplifizieren.
DieProduktederRT‐PCRlassensichanschließendklonierenund/oderelektrophoretischin
einemAgarosegelauftrennen.VerschiedengroßeDNA‐Fragmentewandernunterschiedlich
schnellimGel.DurcheinenFluoreszenzfarbstoff(meistEthidiumbromid)könnendieFragmente
imUV‐Lichtsichtbargemachtunddokumentiertwerden.
DieheuteeingesetztenReversenTranskriptasensindveränderteEnzymvariantenaus
unterschiedlichenRetroviren,wieder„MoloneyMurineLeukemiaVirus“(M‐MLVRT)oder
„AvianMyeloblastosisVirus“(AMVRT).DieverschiedenenVariantendesEnzymssindjenach
Herstellerderartmodifiziertworden,dasssiehöhereSpezifitätoderbessereErträgegenerieren
können,beispielsweisewirddieimEnzymintrinsischvorkommendeRNaseH‐Aktivität
deletiert.
WieandereDNA‐PolymerasenbenötigtaucheineReverseTranskriptaseeinkurzesDNA‐Stück,
einensogenanntenPrimer,zurInitiationderDNA‐Synthese.Oftmalswirdhiereinsogenannter
Oligo‐d(T)‐Primerverwendet,alsomehrereThymin‐Basen,welchekomplementärzumPoly(A)‐
Schwanzam3'‐EndedermRNAsind.ErstimzweitenSchrittderRT‐PCRwerdendannGen‐
spezifischePrimereingesetzt.BeieinermodifiziertenVariante,die"OneStepRTPCR",werden
stattdessendirektGen‐spezifischePrimerverwendetundbeideReaktionenwerden
hintereinanderimselbenGefäßausgeführt.EineweitereVariantederRT‐PCRistdieRACEPCR.
DieAbkürzungRT‐PCRbezeichnetgelegentlichauchdieRealtimequantitativePCR,waszu
Verwechslungenführenkann.DiesesolltemitRTQ‐PCRabgekürztwerden.
DasErgebnis
DaeinecDNAzurursprünglichenmRNAkomplementärist,kannausdieseranhanddesgenetischenCodesauchdieAminosäurensequenzeinesProteinsabgeleitetwerden,fürwelchesdiesemRNAkodiert.DaeinemRNAinEukaryotennachihrerTranskriptionbereitsmodifiziertundgespleißtwurde,istsieimGegensatzzumGenauchIntron‐frei.DarüberhinausermöglichtdiesecDNAauchInformationendarüberzuerhalten,obdasdazugehörigeGeninverschiedenenIsoformenexprimiertwird,d.h.diemRNAalternativgespleißtwird.ÜberRT‐PCRlässtsichalsogezieltGenexpressionnachweisen.GenutztwirddieRT‐PCRauchbeiderDiagnosevonRNA‐VirenimBlutserum,wieHIVundinjüngererZeithäufigauchimZusammenhangmitInfluenzaA/H5N1.
6. ProteinexpressionSchematischerAblauf
1. DNA‐Sequenzsuchen; Genbank2. mRNASequenzbestimmen; Intron‐ExonStrukturauflösenundRNASequenz
notierenodercdsistschonohneIntronsExons3. ProteinsequenzundCodonUsage; passtdieCodonUsagezumeinem
Expressionssystem?Glykosilierung?4. ExpressionssystemundVektor; WelcheTags?WelcheSelektion?WieKlonieren?N‐
oder‐CTerminal?Fusion?5. Genbesorgen; mRNAisolierenundRTPCRodersynthetischherstellenlassen6. TransformationinE.coli; VermehrungderKonstrukteundAufreinigung7. Transformation/TransfektioninExpressionsstamm8. SmallscaleExpressionAufreinigungKontrolle9. LargescaleExpression
7. RekombinantesProtein(Kompakt)
RekombinanthergestellteProteinesindEiweiße,diemitHilfevongentechnischveränderten
(Mikro‐)Organismenhergestelltwerden.SeitdemBeginnderEntwicklungderGentechnik
wurdeeineVielzahlbakteriellerOrganismen,PilzenoderSäugetierzellenfürdieHerstellungvon
Fremdproteinen,insbesonderevonpharmazeutischenProteinen,etwavonInsulinoder
Impfstoffengenutzt.BevorzugteSystemefüreinederartigeProduktionsinddasDarmbakterium
Escherichiacoli,verschiedeneHefeartenundSäugetierzellen–dabeimeistensHamsterzellen.
EinfürdiegentechnischeProduktionvonProteinengenutztesSystemsollteverschiedene
Voraussetzungenerfüllen:EssollteinderLagesein,schnellingroßenFermenternmöglichst
kostengünstigzuwachsen.EssolltediegewünschtenSubstanzeneffizientproduzieren,wenn
möglich,insMediumausschleusen(sezernieren).EssollteinsbesonderefürdieProduktionvon
PharmazeutikahohenSicherheitsanforderungengenügenunddieProteineineiner
authentischen,möglichst„menschlichen“Formproduzieren.
AmeinfachstenwirddieInformationfürdasProteinineinenVektorkloniert,einPlasmid,das
dannindenWirtsorganismus,transformiertodertransfiziertwird.
ImFolgendenwerdendiegrundlegendenVorgehensweisenderProteinüberexpressionanhand
desBeispiels„Insulin“beschrieben:
lonierungundTransformation
Promotor‐BereicheinestypischenÜberexpressionsvektors
UmeinBakteriumdazuzubewegen,dasmenschlicheProteinInsulinherzustellen,mussman
ihmdieBauanleitungdafürzurVerfügungstellen.Diesgeschieht,indemmandasInsulin‐Genin
dieBakterienzelleeinschleust.MitdemGenalleinkanndieZelleabernichtsanfangen.Deshalb
bringtmandasInsulin‐GenvorherineinenVektor,derallewichtigenInformationenenthält,
damitdasGenabgelesenwerdenkann.ErwirdvondenBakterienerkannt,vermehrtundbei
einerZellteilungandieTochterzellenweitergegeben.ImArtikelKlonierungistbeschrieben,wie
einsolcherVektormitGen‐Inserthergestelltwird.
DerVektorenthältnebendemInsulin‐GeneinenPromotor(imBildrot),welcheralsStartpunkt
fürdieAblesungdesGens(Transkription)fungiert.MeististderPromotorinduzierbar;erwird
alsoerstdannaktiv,wenneinebestimmteSubstanzzugegebenwird.Diesermöglichtdie
ProduktiondesProteinszubestimmtenZeitpunktenoderabeinerbestimmtenZelldichtesowie
dieProduktionvonProteinen,diefürdieBakterieneigentlichtoxischsind.
TransformationundSelektion
AmAnfangoderamEndedesInsulin‐Genbefindetsicheinsogenanntertag(engl.für
"Markierung").DiesertagdientderspäterenIsolierungundReinigungdesProteins.Tags
bestehenauskleinenPeptidenoderbestimmtenProteinen,diemitdemeigentlichenProtein
fusioniertsind.NachderAufreinigungkanndertagabgespaltenoder–wennesdieFunktion
nichtbeeinträchtigt–amexprimiertenProteinbelassenwerden.
DerVektormitInsulin‐GenwirdinE.coli‐Bakterienzelleneingebracht(Transformation).EinAntibiotikum‐ResistenzgenaufdemVektorsorgtdafür,dassnurdieZellenimAntibiotikum‐haltigenNährmediumwachsen,diedenVektorauchwirklichaufgenommenhaben(Selektion).
EineKoloniewirdbenutzt,umeinegrößereMengeNährmediumanzuimpfen.Auchdieses
MediumenthältAntibiotikum.DieresistentenZellenvermehrensichimNährmediumbei37°C
durchZweiteilung.SobaldeinebestimmteBakterienzahlproMilliliterMedium(OD~0.9)
erreichtist,wirdIPTG(Isopropyl‐β‐D‐thiogalactopyranosid)zugegeben.DieserStoffdientals
Induktor(sieheauch:Lactose‐Operon):DasInsulin‐Genwirddaraufhinabgelesen
(Transkription),dasProteinwirdhergestellt(Translation).
NachdemdieZelleneinigeStundenlangZeitfürdieProteinsynthesehattenundInsulinim
Zellinnerenangereicherthaben,werdendieBakterien"geerntet".Dazuüberführtmandas
NährmediuminZentrifugationsgefäßeundzentrifugiertbeigeringerDrehzahl.DieZellensetzen
sichdabeiamBodendesRöhrchensabundbildeneinenKlumpen(Pellet).DasNährmedium
kannabgegossenwerden.
VonderKoloniezumLysat
DasichdasüberexprimierteInsulinnochindenBakterienzellenbefindet,müssendieseerst
aufgeschlossenwerden(Zellaufschluss).EineweitverbreiteteMethodeistdieUltraschall‐
Behandlung,diedieZellmembranenbeschädigtunddazuführt,dassdieBakteriensichauflösen.
DaindiesemGemischnunauchProteinasenvorhandensind,dienormalerweiseinabgetrennten
BereichenderZellenarbeitenunddefekteProteineabbauen,istesentscheidend,dass
Proteinase‐Hemmstoffe(Proteinase‐Inhibitoren)zugegebenwerden.DieseHemmstoffe
blockierendieproteinabbauendeWirkungderProteinasen.AndernfallswürdedasInsulin
angegriffenundbeschädigtwerden.
ZurEntfernungvonZelltrümmern,nichtaufgeschlossenenZellenundgrößerenZellorganellen
alsPelletwirdderAufschlusserneutzentrifugiert.DasklareLysatkannnundem
entscheidendenReinigungsschrittunterzogenwerden:derAffinitätschromatographie.
ImeigentlichenSchrittderGewinnungdesüberexprimiertenInsulinsspieltderAffinitäts‐Tag
einewichtigeRolle.DiesesAnhängselbestehtauskleinenPeptiden(häufigHexa‐Histidin:His‐
Tag)odereinemProtein(Maltose‐bindendesProtein(MBP),Glutathionyl‐S‐Transferase(GST))
undfungiertanschaulichalseineÖse,anderdasInsulinausderLösungherausgefischtwerden
kann.OhnedieseReinigungshilfewäreessehraufwändig,dasZielproteinausderVielzahl
unterschiedlicherProteineinderZellaufschlusslösungherauszufiltern.
PraktischbenutztmanfürdieAbtrennungdesgewünschtenProteinseineSäule,alsoeineRöhre,
diemiteinerGelmatrixgefülltist.AndieseMatrixsindMolekülegebunden,diespezifischwie
einSchlüsselindasSchloss,alsodenReinigungs‐Tag,passen(Ni2+‐NTAfürHis‐tag;Maltosefür
MBP;GlutathionfürGST).LässtmannundasZelllysatdurchdieSäulefließen,sobindetder
Affinitäts‐TagmitsamtdemInsulinandieMatrix,währendalleanderenProteineunbeeinflusst
amSäulenendewiederzumVorscheinkommen.UmdennochanhaftendeProteinezuentfernen,
spültmandieSäulemiteinerWaschlösung.DerfestenBindungdesTagstutdaskeinen
Abbruch.
UmdasgebundeneInsulinnunwiedervonderSäuleabzulösen(Elution),bedientmansicheinesTricks:manlässteinenElutionspufferdurchdieSäulelaufen,derdenBindungspartnerdesAffinitäts‐TagsinsehrhoherKonzentrationenthält.Dadurchwirderreicht,dassderAffinitäts‐TagbevorzugteinenderfreiinLösungvorkommendenBindungspartnerwählt,undsichsomitvonderSäulenmatrixlöst.
DieAffinitätschromatografieisteinchromatografischesTrennverfahrenzurIsolationeines
AnalytenauseinerLösungverschiedenerStoffe.Voraussetzungist,dasseingeeigneterLigand
(Bindungspartner)zudeminteressierendenAnalyten(Protein)zurVerfügungsteht.Sieisteine
derleistungsfähigstenTrennmethoden.DieverwendetenSäulensindjedochrelativkostspielig,
sodassdasVerfahrennurinbesonderenFällenbeziehungsweiseimkleinenMaßstab
(Labormaßstab)zumEinsatzkommt.
DieTrennungerfolgtmeistinSäulen,kannaberauchimBatchverfahrenvorgenommenwerden.
DerReinigungseffektdieserMethodebasiertentwederaufderspezifischenErkennungeines
ProteinsdurcheinenAntikörperoderbeiEnzymenaufAusnutzungderspezifischenAffinität
einesEnzymszueinemInhibitor,SubstratoderCofaktor.
DiestationärePhase(ofteinGel,z.B.ausquervernetzterAgarose(HandelsnameSepharose®)
wirdmiteinemgeeignetenLiganden(z.B.Antikörper)gekoppelt,derspezifischdenzu
reinigendenAnalytenbindet.HierbeiistinderPraxisdaraufzuachten,dassdieAffinitätgegen
denAnalytennichtzuhochist,dadieElutiondadurcherschwertwird.Umgekehrtkannzur
präparativenReinigungvonAntikörpern(Immunglobulinen)aucheinestationärePhasemit
einemProtein(meistProteinA,GoderL)verwendetwerden,dasbestimmte
Immunglobulinklassenbindet.
Durchführung
DasGemischwirdaufdieSäuleaufgegebenunddieinteressierendeSubstanzwirddurchdie
Ligandengebunden.AlleanderenStoffeverlassendieSäuleschnellwieder,dasiemitdem
Ligandennichtstarkwechselwirken.NacheinemWaschschritt,umunspezifischgebundene
Verunreinigungenzuentfernen,wirdderamLigandengebundeneAnalytdurchVeränderung
derBedingungen(Pufferzusammensetzung)dazugebracht,ebenfallsdieSäulezuverlassen
(Elution).AlsElutionsmittelwirdofteinsaurerPufferodereinLösungsmittel/Wasser‐Gemisch
verwendet.AlternativkönnenauchkompetitivzumZielproteinagierendeSubstanzenoderein
ÜberschussanfreienLigandenzugesetztwerden.DasEluatenthältdengereinigtenund
angereichertenAnalyten.
Beispiele
BeispielefürLigandenzurProteinaufreinigung:
Ligand Zielprotein
Antigen,
ProteinA,ProteinGoderProteinLAntikörper
Substrat,Kofaktor Enzym
Ligand Rezeptor
Lectin Glykoprotein
Nukleinsäure NukleinsäurebindendesProtein
Streptavidin,AvidinBiotin,
ProteinmitStreptavidin‐peptid
Metallionenchelat
wieNi2+‐NTAProteinmitPoly‐histidin‐peptid
FertigesFusionsproteinalsBeispielAngabenvonSilvanoThefusionproteinincludesanenhancedGFP(eGFP)becausethisvarianthasagreatermolarextinctioncoefficientthanthewild‐typeandtherebyabettersensitivityduring
theflorescencemeasurement.Theexcitationofthisvariantis488nmandtheemission512nm[KTI‐Project,ThomaR.].TheeGFPisoccupiedwithaHis8‐tagforrelievedpurificationofthefusionproteinwithNi‐NTA(nickel‐nitrilotriaceticacid)affinitychromatography.BetweenthehERG(1‐870)andtheeGFPaTEV(tobaccoeachvirus)proteasecleavagesitewasinsertedwiththeproteinsequenceENLYFQG.Thus,theGFPpartcanberemovedafterthepurificationandthebarehERG(1‐870)proteinwithjustashortforeignaminoacidsequencecanbeanalysed.ThisforeignsequenceattheC‐terminusisGGGRSENLYFQ.TheschemeofthisfusionproteinisshowninFigure3.
Fig.3:Schemeofthefusionprotein.ThemainpartsofitarethehERG(1‐870)sequenceandtheenhancedgreenfluorescentprotein(eGFP).ForrelievedpurificationaHis8‐tagisaddedaswellasaTEVproteasecleavagesitetoseparatethefusionprotein.NandCstandsforN‐terminusandC‐terminus.
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5.5 The Cloning Strategy
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