Proteomsignatur mittels MS-Serumprofiling
zur Detektion der Early-onset Präeklampsie
Von der Medizinischen Fakultät
der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen
zur Erlangung des akademischen Grades
einer Doktorin der Medizin
genehmigte Dissertation
vorgelegt
von
Franka Nadine Seidenspinner
aus Rostock
Berichter: Herr Universitätsprofessor
Dr. med. Werner Rath
Herr Universitätsprofessor
Dr. med. Thorsten Orlikowsky
Tag der mündlichen Prüfung: 23. Januar 2012
Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar.
Gewidmet
Meiner Familie
1
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung 4
1.1. Präeklampsie 4
1.1.1. Klassifizierung hypertensiver Erkrankungen in der Schwangerschaft 4
1.1.2. Epidemiologie 5
1.1.3. Definition und Symptomatik 6
1.1.4. Risikofaktoren und Diagnostik 7
1.1.5. Ätiologie und Pathogenese 8
1.1.6. Therapie und Prognose 11
1.2. Massenspektrometrische Proteinanalytik 13
1.2.1. MALDI-ToF-MS 13
2 Zielsetzung 15
3 Material und Methoden 16
3.1. Material 16
3.1.1. Probengewinnung 16
3.1.2. Chemikalien 17
3.1.3. Geräte und Zubehör 18
3.1.4. Software 19
3.2. Methoden 20
3.2.1. Proteinseparation mittels magnetischer Beads 20
3.2.2. Proteinseparation mittels fraktionierter Fällung 21
3.2.3. Massenspektrometrie 22
3.2.4. SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese 24
3.2.5. Proteinidentifizierung 25
3.2.6. Nephelometrie 26
3.2.7. Software-unterstützte Quantifizierungsmethode 27
3.2.8. Statistische Poweranalyse 29
2
4 Ergebnisse 30
4.1. Charakterisierung von Präeklampsie-und Kontrollpatientinnen 30
4.2. Anwendung der Massenspektrometrie zur differentiellen Analytik
von Präeklampsie- und Kontrollpatientinnen 32
4.2.1. Monoparametrische Analyse 34
4.2.2. Multiparametrische Analyse 41
4.2.3. Verifizierung der Ergebnisse mittels SDS-PAGE 46
4.3. Identifizierung von Serumproteinen 48
4.4. Nephelometrische Analyse von Transthyretin 51
4.5. Statistische Poweranalyse 52
5 Diskussion 53
5.1. Diskussion der Methodik und Fehleranalyse 53
5.2. Bedeutung von Transthyretin 55
5.3. Massenspektrometrie in der klinischen Forschung 56
5.4. Klinische Relevanz dieser Arbeit und Ausblick 57
6 Zusammenfassung 59
7 Literaturverzeichnis 60
8 Anhang
8.1. Abbildungsverzeichnis I
8.2. Tabellenverzeichnis II
8.3. Publikationen und Kongressteilnahmen III
8.4. Danksagung IV
3
Abkürzungsverzeichnis
CAN Acetonitril
ACE Angiotensin Converting Enzym
ACOG American Congress of Obstetricians and Gynecologists
AWMF Arbeitsgesellschaft der wissenschaftlichen medizinischen
Fachgesellschaften
BMI Body-Mass-Index
CHCA Alpha-cyano-4hydroxy-zimtsäure
CTG Cardiotokogramm
Da Dalton
DHB 2,5 Dihydroxybenzoesäure
H Stunde
KO Kontrolle
MALDI Matrix-assistierte Laser Desorption/ Ionisation
MBS Magnetischer Bead Separator
M Messreihe
Mr Relative molekulare Masse
MS Massenspektrometrie
MS/ MS Tandem-Massenspektrometrie
n-OGP n-Octyl-ß-D-Glucopyranoside
PAGE Polyacrylamid Gel-Elektrophorese
PE Präeklampsie
Ppm parts per minute
RDS Respiratory Distress Syndrom-Prophylaxe
RWTH Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule
SA Standardabweichung
SDS Natriumdodecylsulfat (sodium dodecylsulfate)
SELDI Surface Enhanced Laser Desorption Ionization
SIH Schwangerschaftsinduzierte Hypertension
SS Schwangerschaft
SSW Schwangerschaftswoche
TFA Trifluoressigsäure
TIC Total Ion Count
ToF Time-of-Flight (Massenanalysator)
Tris 2-Amino-2(hydroxymethyl)-propan-1,3-diol
1 Einleitung
4
1 Einleitung
1.1. Präeklampsie
1.1.1. Klassifizierung hypertensiver Erkrankungen in der Schwangerschaft
Der Begriff „Hypertensive Schwangerschaftserkrankungen“ umfasst all jene
Erkrankungen in der Schwangerschaft, deren gemeinsames Merkmal ein arterieller
Hypertonus ist. Je nach zeitlichem Auftreten des arteriellen Hypertonus und der
zusätzlichen Symptomatik unterscheidet man die Gestationshypertonie, die
Präeklampsie, welche auch als Gestose bezeichnet wird, und die Propfgestose.
Besonders schwere Verlaufsformen der Präeklampsie mit lebensbedrohlichen
Komplikationen stellen die Eklampsie und das HELLP-Syndrom dar. Die folgende
Einteilung für „hypertensive Erkrankungen in Schwangerschaft und Wochenbett“
orientiert sich an den Leitlinien der Arbeitsgemeinschaft Schwangerschaftshochdruck/
Gestose der Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe e.V. (DGGG)
[AWMF-Leitlinie 2009] und an den Definitionen der Internationalen Gesellschaft für
Hypertensive Erkrankungen in der Schwangerschaft (ISSHP) [Brown et al. 2001].
Tabelle 1: Klassifizierung hypertensiver Erkrankungen in der Schwangerschaft [Rath,
Gembruch, Schmidt, 2010]
Gestationshypertonie De novo Hypertension mit Blutdruckwerten von ≥ 140/90 mmHg ohne
Proteinurie nach vollendeter 20. SSW bei zuvor normotensiven Werten
und normalen Blutdruckwerten 12 Wochen nach der Geburt.
Präeklampsie De novo Hypertension mit Blutdruckwerten von ≥ 140/90 mmHg und
Proteinurie >300 mg/24h nach der vollendeten 20. SSW.
Propfpräeklampsie
(Propfgestose)
Chronische Hypertonie und Gestationsproteinurie oder chronische
Hypertonie und vor der 20. SSW bestehende Proteinurie mit nach der 20.
SSW zusätzlicher Entwicklung eines plötzlichen Anstieges der
Proteinurie oder eines plötzlichen Anstieges des Blutdruckes oder
Auftreten eines klinischen oder laborchemischen Merkmales einer
schweren Präeklampsie (Definition siehe Seite 6).
1 Einleitung
5
Eklampsie Komplikation einer Präeklampsie mit Entwicklung tonisch-klonischer
Krämpfe, die keiner anderen Ursache zuzuordnen sind.
HELLP-Syndrom Schwere Verlaufsform einer Präeklampsie mit Hämolyse (hemolysis),
pathologisch erhöhten Leberenzyme (elevated liver enzyme levels) sowie
erniedrigter Thrombozytenzahl < 100G/l (low platelet counts).
1.1.2. Epidemiologie
Die Präeklampsie zählt zu den hypertensiven Schwangerschaftserkrankungen. Ihre
Inzidenz liegt bei ca. 5 bis 7% [Report of the National High Blood Pressure Education
program 2008]. Jährlich sind etwa 8,4 Millionen Frauen betroffen [Chappell et al.
2008].
Die Präeklampsie steht in den Industrieländern an zweiter Stelle der mütterlichen
Todesursachen. Nicht zu vernachlässigen ist außerdem ihr Anteil an der perinatalen
Mortalität mit etwa 20 bis 25% [Report of the National High Blood Pressure Education
program 2008]. So verstirbt eines von 100 Kindern an den Folgen einer Präeklampsie
der Mutter [Habli & Sibai 2008]. Eine besonders schwere Verlaufsform der
Präeklampsie und Eklampsie stellt das HELLP-Syndrom dar. Es tritt in 4 bis 12% aller
Präeklampsien sowie Eklampsien auf und kann Komplikationen verschiedener
Organsysteme bis hin zum Multiorganversagen verursachen. Die mütterliche Letalität
beim HELLP-Syndrom liegt weltweit zwischen 3 und 3,5% [Rath et al. 1992]. Vor der
Geburt sind ca. 70% der Fälle betroffen, postnatal hingegen lediglich 30% [Dreyfus et
al. 1992].
Die Mehrheit aller Präeklampsien kommt bei Erstgebärenden vor. So sind 5,8% aller
Primiparae, jedoch nur 0,4% aller Multiparae von dieser Form der hypertensiven
Schwangerschaftserkrankung betroffen [Bancher-Todesca et al. 1998].
Desweiteren scheint das Auftreten einer Präeklampsie abhängig von der ethnischen
Herkunft zu sein. Demnach sind Frauen ethnischer Gruppen (Afrika, Amerika,
Philippinen) stärker gefährdet. Studien zufolge konnte in den Vereinigten Staaten von
Amerika ein Anstieg der Inzidenz der Präeklampsie über die letzten Jahre beobachtet
werden, was nicht zuletzt in engem Zusammenhang mit der steigenden Rate an
1 Einleitung
6
chronisch hypertensiven Erkrankungen, Diabetes sowie Adipositas steht [Berg et al.
2009; Wallis et al, 2008].
Auch scheint der sozialökonomische Hintergrund eine Rolle zu spielen. So sind
Schwangere von niedrigem sozialen Status stärker gefährdet [Silva et al. 2008]. Auch
tritt die Präeklampsie bis zu 30mal häufiger in Entwicklungs- als in Industrieländern auf
[Duley 2009].
1.1.3. Definition und Symptomatik
Die Präeklampsie wird definiert als de novo Hypertension und Proteinurie nach der
vollendeten 20. SSW. Die unteren Grenzwerte für den Blutdruck betragen systolisch
140 mmHg und diastolisch 90 mmHg. Der Grenzwert für Eiweiß im Urin liegt bei 300
mg/Tag oder unter Verwendung eines Urin-Teststreifens bei +2 (Dipstick) [Davey &
MacGillivray 1988]. Nach Brown [Brown et al. 2000] kann auch bei Fehlen einer
Proteinurie die Diagnose Präeklampsie gestellt werden, wenn erstmals nach der 20.
SSW alternativ eine fetale Wachstumsrestriktion auftritt, es zu einer Beteiligung der
Leber kommt oder aber Nierenfunktionsstörungen, neurologische Probleme oder
hämatologische Störungen vorliegen. Häufig treten Ödeme auf. Neben den drei
Leitsymptomen Bluthochdruck, Proteinurie und Ödemen klagen die Patientinnen
oftmals über Oberbauchschmerzen, Schwindel, Kopfschmerzen, Benommenheit,
Sehstörungen (vor allem Augenflimmern) sowie Übelkeit und Erbrechen.
Eine Präeklampsie wird als schwere Präeklampsie bezeichnet, wenn zusätzlich
mindestens eines der folgenden Kriterien erfüllt ist [Brown et al. 2001; ACOG Practice
Bulletin No. 33 2002]:
Nierenfunktionseinschränkung (Kreatinin ≥ 0,9 g/l oder Oligurie < 500 ml/24 h)
Leberbeteiligung (Transaminasenanstieg, schwere Oberbauchschmerzen)
Lungenödem oder Zyanose
hämatologische Störungen (Thrombozytopenie, Hämolyse)
neurologische Symptome (schwere Kopfschmerzen, Sehstörungen)
fetale Wachstumsrestriktion
Blutdruck ≥ 170/110 mmHg
1 Einleitung
7
Proteinurie ≥ 5 g/24 h.
Je nach zeitlichem Auftreten der Leitsymptome unterscheidet man eine frühe Form (<
34. +0 SSW) sowie eine späte Form (> 34. +0 SSW) der Präeklampsie, welche auch als
early-onset- und late-onset-Präeklampsie bezeichnet werden [Dadelszen et al. 2003].
Vor allem die frühe Form der Präeklampsie kann schwere Komplikationen für Mutter
und Kind zur Folge haben [Churchill & Duley 2003].
1.1.4. Risikofaktoren und Diagnostik
Derzeit existiert noch kein aussagekräftiger Test, der die frühe und sichere Diagnose
einer Präeklampsie ermöglicht [Conde-Agudelo et al. 2004]. Es kann allerdings eine
Risikoabschätzung anhand der Anamnese erfolgen. Im Falle einer positiven Eigen- oder
Familienanamnese, bei bestehendem Diabetes mellitus Typ I, chronischer Hypertonie,
Erstparität oder einem Lebensalter von über 40 Jahren ist das relative Risiko für eine
Präeklampsie deutlich erhöht [Dekker & Sibai 2001]. Auch bei vorbestehender
Nierenerkrankung [Murakami et al. 2000] oder der Autoimmunerkrankung Lupus
erythematodes mit Nierenbeteiligung [Julkunen 1998] kommt es zu einer
Risikosteigerung. Weiterhin gilt: Je früher die Präeklampsie auftritt, desto höher ist die
Gefahr für ein Wiederauftreten in einer folgenden Schwangerschaft. Bei einer
Manifestation vor der 28. SSW liegt das Wiederholungsrisiko bei über 60% [Steinhard
& Klockenbusch 1999]. Abzugrenzen von diesen generellen Faktoren sind
schwangerschaftsbedingte Risikofaktoren. So erhöht sich laut einer Studie von Dekker
und Sibai das Risiko für die Entwicklung einer Präeklampsie bei Vorliegen einer
Mehrlingsschwangerschaft oder Gestationsdiabetes. Ebenso kann eine Blasenmole oder
eine Hydrops fetalis für die Entstehung einer Präeklampsie verantwortlich sein [Dekker
& Sibai 2001]. Auch ein, in der Dopplersonographie über die 24. vollendete SSW
hinaus, persistierendes bilaterales Notching der Aa. uterinae kann auf die Entwicklung
einer Präeklampsie hindeuten. Dabei versteht man unter einem Notch eine Veränderung
in der Flusskurve der A. uterina in Form einer postsystolischen Inzisur mit
vermindertem enddiastolischem Fluss beziehungsweise erhöhtem Widerstand. Bei
1 Einleitung
8
deutlichen Notches und/oder stark reduziertem diastolischem Blutstrom tritt in über
60% der Fälle eine Präeklampsie auf [Yu et al. 2005].
Neben Erhebung der Anamnese und dopplersonographischer Untersuchung im zweiten
Trimenon sind die regelmäßige Blutdruck- sowie Gewichtskontrolle von entscheidender
Bedeutung. Um einen Bluthochdruck differentialdiagnostisch in der Schwangerschaft
weiter abzuklären, sollte eine 24-Stunden-Blutdruckmessung erfolgen, welche ebenso
der Überprüfung des Erfolges therapeutischer Maßnahmen dient [Shennan et al. 1993].
Eine deutliche Gewichtszunahme von > 1 kg pro Woche ist Ausdruck sich rasch
entwickelnder Ödeme und gilt im 3. Trimenon als prognostisch ungünstiges Zeichen.
Als weitere Maßnahme zur Früherkennung einer Präeklampsie kommt die
Labordiagnostik zum Einsatz. Im Vordergrund steht hierbei die Bestimmung des
Gesamtproteins im 24-Stunden-Sammelurin. Diese Untersuchung sollte bei allen
Patientinnen mit de novo Hypertension in der Schwangerschaft erfolgen [Gangaram et
al. 2005]. Des Weiteren sollte neben der Untersuchung von Blutbild und Gerinnung die
Bestimmung von Harnsäure, Kreatinin sowie Leberwerten erfolgen. Charakteristisch für
die Entwicklung eines HELLP-Syndroms ist ein Abfall der Thrombozytenzahl (<
100.000/µl), ein Anstieg der Leberenzyme sowie pathologisch veränderte
Hämolyseparameter mit einem Abfall des Haptoglobin-Wertes unter den Normbereich.
Ferner kann eine augenärztliche Untersuchung helfen, die bei schwerer Präeklampsie
auftretenden retinalen Einblutungen oder ein Papillenödem frühzeitig zu erkennen.
Die Leitsymptome Hypertonie und Proteinurie dienen als wichtigster Anhalt bei der
Diagnose einer Präeklampsie, doch können sie ebenso fehlen. So liegt bei der
Maximalvariante der Präeklampsie, dem HELLP-Syndrom, in etwa 5 bis 15% der Fälle
keine signifikante Proteinurie und in bis zu 20% der Fälle keine Hypertonie vor. Bei
15% lassen sich weder Proteinurie noch Hypertonie nachweisen [Rath 1994].
1.1.5. Ätiologie und Pathogenese
Die Pathogenese der Präeklampsie ist noch weitestgehend unklar, doch scheint eine
Störung bei der Trophoblasteninvasion vorzuliegen, was eine plazentare
Minderperfusion zur Folge hat. In einer normalen Schwangerschaft läuft die
Plazentation in zwei Phasen ab. Zunächst infiltriert der Trophoblast die mütterliche
1 Einleitung
9
Dezidua und das benachbarte Myometrium bis zum Ende des ersten Trimenons. Nach
einer anschließenden vierwöchigen Ruhephase beginnt eine zweite Invasionsphase. Die
Spiralarterien werden durch die kindlichen Zellen eröffnet und die Endothelschicht bis
in das innere Myometriumdrittel ersetzt. Es kommt zur Dilatation der tieferen Radial-
und oberflächlichen Spiralarterien, um den Blutfluss an den erhöhten Bedarf des Fetus
anzupassen.
Abbildung 1: a) Uteroplazentares Gefäßsystem mit physiologischer Dilatation der Spiralarterien.
b) Pathologisches uteroplazentares Gefäßsystem mit teilweise fehlender Dilatation der Spiralarterien bei
Präeklampsie (aus „Sonographische Diagnostik in Gynäkologie und Geburtshilfe“, Band 2, Hrsg.: E.
Merz).
Als Grundlage für die Entstehung einer Präeklampsie wird eine Störung in der
Frühphase der Plazentation angenommen. Durch noch unbekannte Mechanismen
kommt es zu einer mangelnden Invasion des Trophoblasten in die mütterliche Dezidua
und das Myometrium mit unzureichendem Umbau mütterlicher myometraler
Spiralarterien. Hieraus resultiert eine Minderperfusion der Plazenta mit nachfolgenden
nekrotischen und apoptotischen Prozessen im plazentaren Gewebe [Reister et al. 2001;
Kadryrov et al. 2006]. Im Folgenden werden von der ischämischen Plazenta
Zellfragmente sowie Proteine freigesetzt, welche in den mütterlichen Kreislauf
gelangen. So konnte eine erhöhte Konzentration von Trophoblastzellen und zellfreier
fetaler DNA im maternalen Plasma nachgewiesen werden [Holzgreve et al. 1998; Lo et
al. 1999]. Letztlich kommt es zu einer Aktivierung des mütterlichen Immunsystems
sowie zu einer Endothelzellaktivierung mit der Folge der bekannten Symptomatik einer
Präeklampsie [Redman & Sargent 2003].
1 Einleitung
10
Serumfaktoren bei der Präeklampsie
TNF-alpha
Verschiedene Studien zeigten, dass TNF-alpha im Serum schwangerer Frauen mit
Präeklampsie [Visser et al. 1994; Vince et al. 1995] oder HELLP-Syndrom
[Kupferminc et al. 1994] erhöht ist. TNF-alpha ist neben Interleukin-1ß in der Lage,
Endothelzellen in vitro zu stimulieren und so die Bildung der Adhäsionsmoleküle
VCAM-1, ICAM-1, E-Selektin sowie P-Selektin anzuregen [Mantovani et al. 1992;
Introna et al. 1993]. Doch konnte gezeigt werden, dass diese Zytokine die Aktivierung
der Endothelzellen nicht erklären und ihre Bestimmung weniger sinnvoll für den
Nachweis einer Präeklampsie ist [Heyl et al. 1999]. Eindeutig hingegen scheint zu sein,
dass die durch Plazentazellen dysregulierte Zytokin-Expression eine wesentliche Rolle
bei der Entstehung „toxischer“ Faktoren spielt und so die Symptomatik einer
Präeklampsie provoziert [Rusterholz et al. 2007].
sFlt1, VEGF, PIGF, sENg
Bei der löslichen fms-like Tyrosinkinase (sFlt1) handelt es sich um ein anti-
angiogenetisches Protein, welches in der Lage ist, die Proteine vascular endothelial
growth factor (VEGF) und placental growth factor (PIGF) zu binden. Bei Patientinnen
mit Präeklampsie konnte ein Anstieg der Konzentration von zirkulierendem sFlt1 fünf
Wochen vor Beginn der Symptomatik beobachtet werden, begleitet von einem Abfall
der Konzentration an frei zirkulierendem VEGF und PIGF [Levine et al. 2004]. Des
Weiteren zeigte sich neben dem Anstieg von sFlt1 eine Erhöhung der Konzentration
von löslichem Endoglin, ein weiteres anti-angiogenetischen Protein, welches ebenfalls
zur Pathogenese der Präeklampsie beizutragen scheint [Levine et al. 2006].
Letztendlich wird deutlich, dass die Präeklampsie ein multifaktoriell bedingtes
Krankheitsbild darstellt, dessen Ursache noch nicht eindeutig geklärt ist [Chen et al.
2010]. Fakt ist, dass die Plazenta die Grundlage der Präeklampsie bildet [Redman &
Sargent 2003]. Denn hierbei handelt es sich um eine schwangerschaftsspezifische
Erkrankung, welche auch ohne Fet bei Vorliegen einer Blasenmole auftreten kann
[Dekker & Sibai 2001] und deren Symptome durch Entbindung, das heißt durch die
Entfernung der Plazenta, verschwinden.
1 Einleitung
11
1.1.6. Therapie und Prognose
Die Einleitung einer medikamentösen Therapie sollte erst bei anhaltenden
Blutdruckwerten von > 170 mmHg systolisch und/oder > 110 mmHg diastolisch
erfolgen, bei vorbestehendem Hochdruck oder anderer Propfkonstellation bereits ab
Werten von > 160/100 mmHg [Redman 1976; Sibai 1996; Leveno & Cunningham
1999; Report of the National High Blood Pressure Education program 2000]. Dies hat
zum Ziel, maternalen zerebro- sowie kardiovaskulären Komplikationen vorzubeugen,
wobei die Prävention zerebraler Blutungen im Vordergrund steht. Insbesondere bei
Patientinnen mit schwerer de novo Hypertension, mit noch nicht an die hohen
Blutdruckwerte adaptiertem zerebralem Gefäßsystem, kann es zu Störungen der
zerebrovaskulären Autoregulation mit nachfolgender Hyperperfusion kommen
[Strandgaard & Paulson 1990], woraus ein erhöhtes Risiko für zerebrale Blutung
resultiert.
Antihypertensivum der Wahl ist in der Schwangerschaft Alpha-Methyldopa. Alternativ
kann eingeschränkt auch Nifedipin, Metoprolol oder Dihydralazin verabreicht werden.
Nicht geeignet hingegen sind aufgrund einer embryo-/ fetotoxischer Wirkung unter
anderem Diuretika, ACE-Hemmer und Angiotensin-II-Rezeptorblocker [AWMF-
Leitlinien 2007]. Trotz Fehlens randomisierter Studien besteht heute eine generelle
Übereinstimmung hinsichtlich der Notwendigkeit einer antihypertensiven Therapie für
die Mutter in der Schwangerschaft bei Blutdruckwerten von > 170/110 mmHg [Brown
et al. 2001; Duley et al. 2006]. Im Gegensatz dazu zeigten Studien, dass eine
medikamentöse Therapie bei milder bis mittelschwerer Hypertonie lediglich von
geringem mütterlichem Nutzen ist [Abalos et al. 2007], jedoch die Rate
wachstumsrestriktierter Kinder mit vermindertem Geburtsgewicht ansteigt [Von
Dadelszen et al. 2000; Magee & Duley 2003].
Hinsichtlich der antikonvulsiven Therapie ist bei Patientinnen mit Präeklampsie das
Mittel der ersten Wahl zur Prophylaxe einer Eklampsie Magnesiumsulfat, welches das
Risiko einer Eklampsie um mehr als die Hälfte senkt [Duley et al. 2006]. Auch bei
manifester Eklampsie stellt Magnesiumsulfat das Mittel der Wahl dar. Weiterhin konnte
eine Überlegenheit dieses Medikamentes gegenüber anderen Antikonvulsiva wie
Phenytoin oder Diazepam hinsichtlich der Prävention erneuter eklamptischer Anfälle
und neonataler Ereignisse gezeigt werden [The Eclampsia Trial Collaborative Group
1995].
1 Einleitung
12
Letztendlich stellt die einzige kausale Therapie der Präeklampsie die Entbindung dar
[Schoonjans 1995]. Ein „Hinauszögern“ der Schwangerschaft dient in erster Linie der
Vermeidung einer Frühgeburt. Der Zeitpunkt der Entbindung ist im Wesentlichen vom
Gestationsalter abhängig und in der Regel nach der vollendeten 37. SSW indiziert
[Brown et al. 2000; Sibai 2003]. Bei schwerer Präeklampsie sollte die Entbindung ab
der vollendeten 34. SSW möglichst zeitnah erfolgen [ACOG Practice Bulletin No. 33
2002]. Dies gilt insbesondere bei Vorliegen schwerer Komplikationen wie fetaler
Wachstumsrestriktion (< 5. Perzentil) und pathologischem Dopplerbefund [Alfirevic &
Neilson 1995; Westergaard et al. 2001]. Bei drohender Frühgeburt (SSW 24+0 bis
33+6) ist die einmalige Verabreichung von zweimal 12 mg Betamethason intramuskulär
im Abstand von 24 Stunden zur Förderung der kindlichen Lungenreife indiziert
[Crowley 2000]. Nach Möglichkeit sollte die Entbindung nach Abschluss der RDS-
Prophylaxe erfolgen, wobei die Dringlichkeit der Schwangerschaftsbeendigung
abgewogen werden muss [Report of the National High Blood Pressure Education
program 2000]. Die Entscheidung bezüglich des Geburtsmodus ist in Abhängigkeit vom
Schweregrad und Verlauf der Erkrankung sowie von den Erfolgsaussichten auf eine
vaginale Entbindung zu stellen [Rath 2005].
Tritt eine Präeklampsie bereits vor Erreichen der 24. SSW auf, ist mit einer gesteigerten
maternalen Morbidität sowie Mortalität zu rechnen [Sibai 1990; Gaugler-Senden et al.
2006]. Die Entscheidung über die Fortführung einer Schwangerschaft ist individuell zu
treffen, wobei die Vermeidung mütterlicher Komplikationen im Vordergrund steht. In
der Vergangenheit haben verschiedene Studien gezeigt, dass für Patientinnen mit bereits
in früheren Schwangerschaften aufgetretener Präeklampsie ein erhöhtes
Wiederholungsrisiko besteht [Dukler et al. 2001, Sibai et al. 1991]. Es zeigte sich, dass
die frühe Gabe von Acetylsalicylsäure in der Schwangerschaft das Risiko für eine
Präeklampsie und die perinatale Mortalität senken kann [Coomarasamy et al. 2003;
Bujold et al. 2009].
Auch besteht für das höhere Lebensalter die Gefahr der Entwicklung von
Langzeitfolgen. So ist das Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen im höheren
Lebensalter im Vergleich zu einer unkompliziert verlaufenden Schwangerschaft
gesteigert. Weiterhin zeigte sich für Kinder erkrankter Mütter ein gesteigertes Risiko,
im Erwachsenenalter an Diabetes mellitus oder Bluthochdruck zu erkranken [Wilson et
al. 2003].
1 Einleitung
13
1.2. Massenspektrometrische Proteinanalytik
1.2.1. MALDI-ToF-MS
Der Begriff Massenspektrometrie (MS) bezeichnet ein Verfahren zur Bestimmung der
Molekülmassen freier Ionen im Hochvakuum und ist ein wichtiges Verfahren zur
Charakterisierung von Proteinen. Das Grundprinzip besteht in der Ionisierung der
Bestandteile einer Probe und Auftrennung dieser nach ihren molekularen Massen. Das
erste moderne Massenspektrometer ist der von F. W. Aston im Jahre 1919 gebaute
Massenspektrograph. Ziel von Aston war es, mit Hilfe dieses Gerätes die Massen
verschiedener Isotope bestimmen und unterscheiden zu können.
Ein modernes Massenspektrometer ist aus einer Ionenquelle, einem Massenanalysator
und einem Detektor aufgebaut. Eine Möglichkeit der Ionisierung von Proteinmolekülen
ist die Matrix-assistierte Laser Desorption/Ionisation (MALDI). Die Probe wird dabei
mit einer Matrixsubstanz vermischt und der Analyt so auf die Probe präpariert. Die
Matrix erfüllt hierbei mehrere Funktionen: Zum einen absorbiert sie den Hauptteil der
Energie aus dem Laserimpuls und schützt die Probe so vor photolytischer Zersetzung,
zum anderen überträgt sie die für die Desorption notwendige Energie auf die
Probenmoleküle, welche dadurch in einen gasförmigen Zustand übergehen. Des
Weiteren kommt es zum Protonentransfer zwischen Matrix und Analyt, wodurch dieser
schließlich positiv geladen wird. Schließlich bewirkt die Matrix eine Reduktion der
Wechselwirkungen der Probenmoleküle untereinander sowie mit der Metalloberfläche
des Probenträgers, wodurch die Desorption erleichtert wird [Kienbaum et al. 2009]. Die
Entscheidung für eine entsprechende Matrix ergibt sich aus der Einstrahlwellenlänge
des Lasers und den Präparationsbedingungen für die Analytmoleküle.
Die Freisetzung der ionisierten Matrix- sowie Proteinmoleküle erfolgt explosionsartig
während des Prozesses der Ionisierung. Bei einem Flugzeit-Massenspektrometer, dem
sogenannten Time-of-Flight-Massenspektrometer (ToF-MS) erfahren sie anschließend
eine starke elektrostatische Beschleunigung, ehe sie in einer feldfreien Flugröhre
(Analysator) in Richtung Detektor wandern, wobei die Ionen hinsichtlich ihres
Verhältnisses von Masse zu Ladung getrennt werden. Beim Flugzeit-
Massenspektrometer verfügen alle Ionen bei Eintritt in den Analysator über die gleiche
Energie und die Geschwindigkeit der einzelnen Ionen hängt letztlich von ihrer
jeweiligen Masse und Ladung ab, mathematisch ausgedrückt von dem Quotienten aus
Masse und Ladung (m/z). Folglich sind leichte Ionen schneller als schwere und
1 Einleitung
14
erreichen den Detektor früher. Unter Berücksichtigung der Ladung werden
zweifachgeladene Ionen stärker beschleunigt als einfachgeladene Ionen und erreichen
demzufolge den Detektor in der Hälfte, der sonst von dem Molekül benötigten Zeit. Die
sich ergebenden Zeitdifferenzen werden exakt gemessen und ermöglichen so eine
Berechnung der entsprechenden molekularen Massen [Bantscheff & Glocker 2001]. Das
Ergebnis kommt in Form eines Spektrums zur Darstellung. In diesem sind die einzelnen
Proteine als Ionensignale abgebildet, welche jeweils einen definierten m/z- Wert
aufweisen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Arbeitsablaufs eines Massenspektrometer.
2 Zielsetzung
15
2 Zielsetzung
Ziel dieser Arbeit ist es, mit Hilfe der Massenspektrometrie proteomische
Biomarkersignaturen im Serum schwangerer Frauen zu identifizieren, anhand derer es
möglich ist, ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung einer Präeklampsie frühzeitig zu
erkennen. Im wesentlichen Kontext dieser Arbeit steht die Frage danach, ob im
Vergleich zu einer normalen Schwangerschaft, bei der Präeklampsie ein auffälliges
Proteinprofil im Blutserum nachweisbar ist. Diese Studie dient damit der Vorbereitung
auf die Identifzierung prognostischer Marker der Präeklampsie. Derzeit existiert noch
kein aussagekräftiger Test zur sicheren Früherkennung der Erkrankung [Conde-Agudelo
et al. 2004]. Eine spezifische Protein-Signatur könnte helfen, die Präeklampsie noch vor
Auftreten der klinischen Symptomatik und der damit verbundenen Komplikationen zu
demaskieren, und folglich die Möglichkeit schaffen, zeitnah entsprechende
therapeutische Maßnahmen einzuleiten. Die Vielzahl biochemischer Prozesse, welche
zur Entstehung einer Präeklampsie beitragen, erschwert die Diagnose dieses komplexen
Krankheitsbildes mittels eines einzelnen Markers [Cone-Agudelo et al. 2004]. Eine
entsprechende Proteomsignatur würde folglich ein entscheidendes diagnostisches Mittel
darstellen, wodurch sich letztlich fetale sowie maternale Morbidität und Mortalität
senken ließen. Darüber hinaus ließen sich so Frauen für präventive Studien rekrutieren.
3 Material und Methoden
16
3 Material und Methoden
Diese Studie wurde an der Universitätsfrauenklinik Aachen konzipiert. Insgesamt
wurden 24 schwangere Frauen untersucht, die sich zwischen Oktober 2006 und
Dezember 2009 in stationärer Behandlung der Universitätsfrauenklinik befanden. Alle
Experimente wurden im Proteom-Zentrum Rostock durchgeführt. Die erhobenen Daten
wurden in der hausinternen Datenbank (Proteobase) gespeichert.
3.1. Material
3.1.1. Probengewinnung
Zu Beginn der Studie erfolgte deren Prüfung durch die Ethikkommission der RWTH
Aachen (EK 138/06). Jede, an der Studie teilnehmende Patientin hatte nach einem
ausführlichen Aufklärungsgespräch ihr schriftliches Einverständnis erteilt.
In dem Zeitraum von Oktober 2006 bis Dezember 2008 wurde Blut nach dem unten
angegebenem Protokoll abgenommen. Es wurden Probandinnen mit unkompliziertem
Schwangerschaftsverlauf nach dem matched-pairs-Prinzip ausgesucht: Jeder gesunden
Kontroll-Probe (KO) wurde jeweils eine Präeklampsie-Probe (PE) zugeordnet, wobei
darauf geachtet wurde, dass Gestationsalter, maternales Alter sowie der präpartale
Body-Mass-Index (BMI) einander weitestgehend entsprachen. Auch
Rauchgewohnheiten sowie die Gabe von Betamethason (RDS-Prophylaxe) wurden
berücksichtigt.
Die Präeklampsie wurde durch folgende Kriterien definiert:
1. Arterieller Bluthochdruck mit Werten von > 140/90 mmHg zu zwei oder
mehreren Zeitpunkten bzw. in der 24-Stunden-Blutdruckmessung während der
Schwangerschaft bei gleichzeitig normotensiven Werten vor Eintritt der
Schwangerschaft
2. Proteinurie > 300 mg im 24-Stunden-Sammelurin oder in der Urin-
Teststreifenanalyse (Urin-Dipsticks) ein Nachweis von mindestens 2+
Diese Kriterien beziehen sich auf die Definition der Internationalen Gesellschaft zum
Studium für Hypertension in der Schwangerschaft und den Bericht des US National
3 Material und Methoden
17
High Blood Pressure Education program [Report of the National High Blood Pressure
Education program 2000; Brown et al. 2000]. Bei den PE-Proben handelt es sich
ausschließlich um early-onset-Präeklampsien mit Beginn der Symptomatik vor der 34.
+ 0 SSW ohne bekannte Wachstumsrestriktion des Kindes [Dadelszen et al. 2003, Villar
et al. 2006]. Das Gestationsalter wurde anhand des ersten Tages der letzten Periode
ermittelt und durch eine Ultraschalluntersuchung zwischen der 10. und 14. SSW
bestätigt. Das Perzentil für das Geburtsgewicht des Neugeborenen wurde mit Hilfe der
Wachstumsskalen für Neugeborene der Bundesrepublik Deutschland von 1996
bestimmt [Voigt et al. 1996]. Neben fetaler Wachstumsrestriktion galten als weitere
Ausschlusskriterien Infektionen, Diabetes mellitus, Gestationsdiabetes sowie das
Vorliegen eines HELLP-Syndroms.
Zum Zeitpunkt der Blutentnahme erfolgte die Dokumentation von Blutdruck,
Proteinurie sowie Gestationsalter. Keine der Patientinnen wies zu dieser Zeit
Wehentätigkeit auf. Die Blutentnahme erfolgte bei Aufnahme der Patientin nach 10
minütiger Ruhephase im Liegen, pränatal aus der rechten oder linken Kubitalvene unter
Verwendung weißer Serummonovetten (Serum Z/9 ml, Monovette). Nach 15- bis 30-
minütiger Inkubation wurden die Proben bei 2000g und Raumtemperatur für 15
Minuten zentrifugiert. Die Sedimentation der zellulären Blutbestandteile ermöglichte
die Aspiration des Serums, welches schließlich in Eppendorf Tubes zu je 100 µl
aliquotiert und bei –80 °C eingelagert wurde. Alles in allem erfolgte die Bearbeitung
der Proben nach einem standardisierten Protokoll und umfasste von der Blutentnahme
bis zur endgültigen Lagerung maximal 60 Minuten.
3.1.2. Chemikalien
Chemikalien Firma Produktnr.
1,5 Diaminoaphthalene 97% Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D D212000-256
2,5 Dihydroxybenzösäure (DHB) Laser Biolabs, Sophia-Antipolis
Cedex, F
M103
4-Hydroxy-3methoxy-zimtsäure
(Ferulasäure)
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D W518301
3 Material und Methoden
18
Acetonitril Merck, Darmstadt, D 990
Alpha-cyano-4hydroxy-
zimtsäure
Bruker Daltonik, Bremen, D 201344
Bromophenol Blau Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D B- 0126
Broad Range Marker Kit New England BioLabs Inc.,
Frankfurt am Main, D
P7702S
Coomassi-Brillant-Blau G-250 Serva, Heidelberg, D 17524.02
Ethanol, LiChrosolv Merck, Darmstadt, D 1.117.271.00
0
Glycerol Serva, Heidelberg, D 26710
Isopropanol J. T. Baker, Deventer, NL 8067
n-Octyl ß-D-glucopyranoside Sigma-Aldrich, Taufkirchen, D O9882
Profiling Kit 100 MB-HIC8 Bruker Daltonik, Bremen, D 219041
Peptide Kalibrant Standard Bruker Daltonik, Bremen, D 206195
Protein Kalibrant Standard I Bruker Daltonik, Bremen, D 206355
Protein Kalibrant Standard II Bruker Daltonik, Bremen, D 207234
SDS Serva, Heidelberg, D 20765
SDS-Polyacrylamid Gel 10% T Invitrogen, Carlsbad, CA, USA NPO341BOX
SDS Polyacrylamid Gel 12% T Invitrogen, Carlsbad, CA, USA NPO301BOX
Trifluoroacetic acid (TFA) Fluka, Buchs, CH 91699
Tris HCl Roth, Karlsruhe, D 5429.2
Trypsin Promega, Madison, WI, USA V5111
3.1.3. Geräte und Zubehör
Hardware Firma
AnchorChip 600/384 target plate Bruker Daltonik, Bremen, D
Dade Behring Nephelometer II Dade Behring, Marburg, D
Eppendorf Tubes Eppendorf AG, Hamburg, D
Magnetischer Bead Separator Dynal AS, Oslo, N
MTP 384 target plate ground steel TF Bruker Daltonik, Bremen, D
3 Material und Methoden
19
Mini spin, Zentrifuge Eppendorf AG, Hamburg, D
Novex Mini-Cell Vertical Elektrophorese
System
Invitrogen, Carlsbad, CA, USA
ReflexIII MALDI-ToF-Massenspektrometer Bruker Daltonik, Bremen, D
Serummonovette Serum Z/9 ml Monovette Sarstedt, D
Speed Vac SPD 111V Eppendorf AG, Hamburg, D
Ultraschallbad Transsonic T460 Hettich, Tuttlingen, D
Umax Mirage II Scanner Biostep GmbH, Jahnsdorf, D
Vortex-Genie 2 Scientific Industries Inc., New York,
USA
3.1.4. Software
Software Firma
Bruker Daltonics FlexAnalysis, Version 2.4 Bruker Daltonik, Bremen, D
BioTools, Version 3.0 Bruker Daltonik, Bremen, D
ClinProTools 2.2 Bruker Daltonik, Bremen, D
in-Haus Datenbank SWALL (Swiss-Prot release
56.8, TrEMBL release 39.8)
Matrix Science, London, UK
Mascot search engine Version 2.2.03 Matrix Science, London, UK
MedCalc statistical software, Version 9.4.2.0 MedCalc Software bvba,
Mariakerke, B
Origin software, Version 6.1G OriginLabCorporation,
Northampton, MA, USA
Phoretix 2D Advance, Version 6.01 Nonlinear Dynamics Ltd.,
Newcastle upon Tyne, UK
3 Material und Methoden
20
3.2. Methoden
Alle experimentellen Schritte wurden in kontinuierlich klimatisierten Räumlichkeiten
durchgeführt, in denen stets die selben Bedingungen vorlagen (Raumtemperatur 21 +/-
0,5 °C, Luftfeuchtigkeit 40 +/-1%). Für die einzelnen Reaktionsschritte wurden generell
nur hochreine Chemikalien verwendet.
3.2.1. Proteinseparation mittels magnetischer Beads
Bevor mit den Messungen begonnen wurde, erfolgte zunächst die Aufarbeitung der
einzelnen Serumproben mit Hilfe des Profiling Kits 100 MB-HIC8 der Firma Bruker
Daltonik. Das war erforderlich, um Proteine wie beispielsweise Albumin oder auch
Salze aus den Serumproben zu entfernen. Diese lagen im Serum in einem hohen
Quantum vor und machten eine Auswertung der Spektren infolge einer Vielzahl von
Signalen, welche sich gegenseitig störten und überlagerten, unmöglich.
Das Profiling Kit 100 MB-HIC8 enthielt alle, für die Fraktionierung nötigen Lösungen.
Nach Durchführung der entsprechender Trenn- und Waschschritte erhielt man eine
durch die verwendete Bead-Oberfläche definierte Fraktion der Proteine im organischen
Lösungsmittelgemisch. Die Fraktionierung mit Hilfe des Profiling Kits 100 MB-HIC8
basiert auf dem Umkehrphase-Prinzip (reversed phase interaction). Das bedeutet, dass
eine unpolare stationäre Phase sowie eine polare mobile Phase vorliegen, wodurch
polare Stoffe leicht und lipophile Stoffe schwer eluiert werden. Die Bearbeitung der
Proben erfolgte nach einem standardisierten Protokoll (Product Information: Profiling
Kit MB-HIC8, Bruker Daltonik) und gestaltete sich wie folgt: Zu Beginn der
Fraktionierung wurden die magnetischen Beads leicht geschüttelt, um eine möglichst
homogene Suspension zu erhalten. Im Anschluss wurden jeweils 5 µl Serumprobe mit 5
µl der MB-HIC8 beads und 10 µl Bindungspuffer in einem 1 ml Eppendorf Tube
inkubiert und durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren gut vermischt. Nach einer
weiteren Minute Inkubation wurden die Beads mit Hilfe eines magnetischen Bead
Separators (MBS), einem Gestell mit einseitigem Magneten, vom Überstand getrennt,
so dass dieser abpipettiert und verworfen werden konnte. Als Nächstes wurden 100 µl
Waschpuffer hinzugefügt, das Reaktionsgefäß erneut im MBS platziert und 20-mal
vorsichtig vor- und zurückgedreht. Der Überstand wurde wiederum abpipettiert und
verworfen. Dieser Schritt wurde zweimal wiederholt und diente der Auswaschung
solcher Proteine, die nicht durch die Beads gebunden worden waren. Im letzten Schritt
3 Material und Methoden
21
wurden schließlich alle über die Beads gebundenen Proteine von deren Oberfläche
mittels eines Elutionspuffers, bestehend aus 50% Acetonitril (ACN) und Reinstwasser,
gelöst. Nach etwa einer Minute wurde das Tube erneut für 30 Sekunden im MBS
platziert, wodurch sich die Beads an einer Seite des Tubes sammelten. Anschließend
konnte der Überstand abpipettiert und in ein frisches Reaktionsgefäß überführt werden.
Das gewonnene Eluat stand nun für die Messung zur Verfügung.
In der folgenden Abbildung sind die einzelnen Arbeitsschritte der Aufarbeitung der
Serumproben mittels des Profiling Kits 100 MB-HIC8 nochmals vereinfacht dargestellt.
Abbildung 3: Schematische Darstellung der einzelnen Arbeitsschritte bei Aufarbeitung der Serumproben
mittels magnetischer Beads.
3.2.2. Proteinseparation mittels fraktionierter Fällung
Das Fällen von Proteinen ist eine weitverbreitete Möglichkeit der Trennung von
Proteinen von einer Lösung. Dies kann zur Aufreinigung oder Aufkonzentrierung von
Proteinen genutzt werden sowie zur Entfernung von Proteinen aus einer Lösung.
In dieser Studie wurden die Serum-Proben nach einem Standardverfahren fraktioniert
gefällt [Cohn et al. 1944]. Zunächst wurden jeweils 10 µl Serumprobe mit eisgekühlten
7 µl Ethanol (-20 °C; 40% Ethanol, vol/vol) versetzt und für 10 Minuten auf Eis gelegt.
Im Anschluss erfolgte die Zentrifugation bei 13.000 g und 4 °C. Das dadurch
gewonnene Proteinpellet entsprach der Fraktion I. In einem zweiten Schritt wurden die
in dem Überstand (17 µl) gelösten Proteine durch Zugabe von 3 µl Ethanol (50%
3 Material und Methoden
22
Ethanol, vol/vol.) ausgefällt. Es erfolgte erneut die Inkubation für 10 Minuten bei -20
°C sowie die anschließende Zentrifugation bei 13.000 g und 4 °C. Das so entstandene
Proteinpellet entsprach nun der Fraktion II. Bevor allerdings die Messung des Pellets
erfolgen konnte, musste dieses erneut in 10 µl einer Suspension, bestehend aus 50%
Acetonitril (ACN), 0,3% Trifluoressigsäure (TFA) und 5 mM n-OGP gelöst und mit
einem Vortexer für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 400 Runden pro Minute
geschüttelt werden.
3.2.3. Massenspektrometrie
Targetpräparation
Im Anschluss an die Probenfraktionierung mittels des Profiling Kits 100 MB-HIC8
wurden zunächst 0,5 µl des Eluats auf einen Probenträger, das sogenannte Target (MTP
384 target plate ground steel T F, Bruker Daltonik), präpariert. Anschließend wurden,
ohne den Spot zu berühren, 0,5 µl einer Matrixlösung hinzupipettiert. Als Matrix diente
eine gesättigte Ferulasäure-Lösung (4-Hydroxy-3methoxy-zimtsäure), gelöst in 33%
ACN und 0,1% TFA. Für die Aufbereitung von 4-Hydroxy-3methoxy-zimtsäure, wurde
zunächst ein 1,5-ml-Eppendorf-Gefäß bis zur Hälfte mit vorgefertigter Ferulasäure der
Firma Sigma-Aldrich (Taufkirchen, D) gefüllt. Anschließend wurde 1 ml einer Lösung,
bestehend aus 33% ACN und 0,1% TFA, hinzugegeben. Diese Suspension wurde im
nächsten Schritt für wenige Sekunden gevortext und für fünf Minuten ins Ultraschallbad
gestellt, bis eine gesättigte Lösung entstand. Im Anschluss erfolgte für eine Minute die
Zentrifugation bei 13.000 g und Raumtemperatur. Danach wurde die Suspension für ca.
15 Minuten inkubiert, um anschließend erneut für drei Minuten zentrifugiert zu werden.
Nach diesen letzten Schritten konnte der Überstand des Eppendorf-Gefäßes abpippetiert
werden und stand als Matrix für die Messung der Serumproben mit dem MALDI-ToF-
Massenspektrometer zur Verfügung.
Nach der Präparation von Probe und Matrix auf das Target musste einige Minuten
gewartet werden, bis die einzelnen Spots getrocknet waren. Erst dann konnte das Target
in das Gerät gefahren werden. Für jede Probe wurde jeweils ein Spot pro Messung
3 Material und Methoden
23
präpariert. Insgesamt wurden vier Messungen (M1-4) durchgeführt, für welche letztlich
96 Spots präpariert wurden.
Alternativ zur Probenfraktionierung mittels magnetischer Beads wurden alle
Serumproben auch fraktioniert gefällt. Bevor jedoch die Targetpräparation erfolgen
konnte, wurden nicht gelöste Rückstände abzentrifugiert. Anschließend wurden 0,5 µl
der fertigen Proteinlösung auf das Target (MTP 384 target plate ground steel TF,
Bruker Daltonik) präpariert und nachfolgend 1,5 µl gesättigte Ferulasäure, gelöst in
50% ACN und 0,1% wässriger TFA (33/67, vol/vol) hinzupipettiert. Auch in diesem
Fall wurde darauf geachtet, dass die Pipettenspitze den Spot nicht berührte. Nachdem
Proteinlösung und Matrix getrocknet waren, konnte das Target in das Gerät gefahren
werden. Die Messung wurde als Messung 5 (M5) bezeichnet.
Reflex III MALDI-ToF-Massenspektrometer
Die Messung der Proben erfolgte mit einem Reflex III MALDI-ToF-
Massenspektrometer der Firma Bruker Daltonik, ausgestattet mit einer SCOUT
Ionenquelle mit delayed extraction im linear positiv ion mode bei einer
Beschleunigungsspannung von 20 kV. Die Spektren wurden in einem niedrigen
Massenbereich (4-25 kDa) sowie in einem hohen Massenbereich (20-250 kDa)
aufgenommen. Die Laserintensität betrug ca. 80%, wobei im Schnitt 900 Schüsse
aufsummiert wurden. Die Spektren wurden mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen
Standard-Protein-Kalibranten der Firma Bruker Daltonik extern nachkalibriert.
Es wurden zwei unabhängige Messdurchgänge vorgenommen, wobei sich jeder
Messdurchgang aus zwei Einzelmessreihen (M) zusammensetzte. M1 und M2
resultierten aus einer ersten, M3 und M4 aus einer zweiten Probenfraktionierung mit
dem Profiling Kit 100 MB-HIC8. Für jede Messung und jede Probe wurde jeweils ein
Spot pipettiert, wobei die Spots für M1 und M2 beziehungsweise die Spots für M3 und
M4 aus jeweils einem Eluatansatz stammen. M5 ergab sich aus der Bearbeitung der
Proben durch fraktionierte Fällung. Insgesamt wurden für die 24 Proben 120 Spots in
fünf Messungen präpariert. Alle fünf Messungen wurden unabhängig voneinander
analysiert.
3 Material und Methoden
24
Abbildung 4: Reflex III MALDI-ToF-Massenspektrometer der Firma Bruker Daltonik (Bremen, D),
Standort: Proteom-Zentrum Rostock.
3.2.4. SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese
Nachdem die Serumproben fraktioniert gefällt wurden, erfolgte die Auftrennung der
verbliebenen Proteine nach ihrem Molekulargewicht mit Hilfe der SDS-Polyacrylamid
Gelelektrophorese.
Bei der SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese, auch kurz als SDS-PAGE bezeichnet,
handelt es sich um ein Verfahren zur Auftrennung von Molekülen in einem elektrischen
Feld. Die SDS-Page findet vor allem in der Analytik von Proteinen Anwendung. Bei
Sodiumdodecylsulfat (SDS) handelt es sich um ein anionisches Detergens, welches in
der Lage ist, die Proteine zu denaturieren. Diese zerfallen durch die Zugabe von SDS in
ihre Tertiär- sowie Sekundärstruktur, teilweise sogar Primärstruktur. Um auch die
Disulfidbrücken zu spalten, können optional reduzierende Thiole (zum Beispiel
Mercaptoethanol) hinzugegeben werden. Zur Auftrennung der Proteine dient schließlich
ein Gel aus Polyacrylamid, welches in geeignete Elektrolyte eingelegt ist. Es wird eine
elektrische Spannung angelegt, wodurch die Wanderung der negativ geladenen Proteine
in Richtung Pluspol (Anode) erfolgt. Kleine Proteine wandern nun relativ leicht durch
die Maschen des Gels, während große Proteine eher zurückgehalten werden.
Letztendlich ist die Wanderungsgeschwindigkeit abhängig von der Größe der SDS-
Proteinkomplexe sowie von der Porengröße des gewählten Gels. Am Ende des
3 Material und Methoden
25
Vorganges sind alle Proteine nach ihrer Größe sortiert und können durch eine
entsprechende Färbung visualisiert werden.
Zunächst wurde das Proteinpellet der Fraktion II nach fraktionierter Fällung in 300 µL
SDS Probenpuffer (2% SDS, 65 mM Tris/HCl (pH 6.8), 5% Glycerol und Bromophenol
Blau) bei Raumtemperatur gelöst. Die SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese
orientierte sich an einem standardisierten Protokoll [Kienbaum et al. 2009] und ist im
Folgenden kurz beschrieben. Es wurden 2 verschiedene Gele der Firma Invitrogen
verwendet: ein SDS-Polyacrylamid Gel 10% T für die Analyse der Proteine des hohen
Massenbereiches (20-250 kDa) sowie ein weiteres Gel 12% T für die Proteine des
niedrigen Massenbereiches (4-25 kDa). Unter Zugabe des Laemmli-Puffers (25 mM
tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS) liefen die Gele über eine Stunde bei 200 V in einem
Novex Mini-Cell Vertical Elektrophorese System (Invitrogen). Anschließend erfolgte
die Fixierung und Anfärbung der Banden mit Coomassie-Brillant-Blau G-250. Zur
Entfärbung diente eine Lösung aus 10% Ethanol, 2% Phosphorsäure und Reinstwasser.
Als molekularer Massenkalibrant diente ein Broad Range Marker Kit der Firma New
England BioLabs Inc. Zum Schluss wurden die Gele mit Hilfe eines Umax Mirage II
Scanners eingescannt und als TIFF-Datei elektronisch gespeichert.
3.2.5. Proteinidentifizierung
MS Peptide mass fingerprinting
Beim Peptide mass fingerprinting handelt es sich um ein analytisches Verfahren zur
Proteinidentifizierung. Zu diesem Zweck wird das unbekannte Protein mit
beispielsweise Trypsin verdaut, wodurch eine Vielzahl kleinerer Peptide entstehen,
deren Massen dann wiederum massenspektrometrisch bestimmt werden können. Mit
Hilfe einer geeigneten Software kann anschließend durch Vergleich der einzelnen
Peptidmassen mit bekannten Protein-Sequenzen das entsprechende Protein identifiziert
werden.
3 Material und Methoden
26
Bei der Auswertung der MS Spektren mit Hilfe der Software ClinProt tools 2.2 zeigte
sich das differentiellste Ionensignal bei m/z 13.715. Das diesem Ionensignal
zugrundeliegende Protein ließ sich auch nach fraktionierter Fällung der Serumproben
mittels SDS-PAGE visuell darstellen. Für die weitere Analyse wurde der entsprechende
Spot bei 13.000 Da ausgestochen und mit Trypsin (Promega) verdaut. Im Anschluss
wurden 0,8 µl Probe unter Verwendung von 1,6 µl Alpha-cyano-4hydroxy-zimtsäure
(CHCA) als Matrix auf ein AnchorChip 600/384 Target (Bruker Daltonik) präpariert.
Zur Erstellung der Matrixlösung CHCA wurde zunächst eine kleine Menge CHCA der
Firma Bruker Daltonik mit einer Spatelspitze in ein 1,5 ml Eppendorf-Gefäß gegeben.
Anschließend wurde 1 ml einer Lösung, bestehend aus 33% ACN und 0,1% TFA, zur
Verbindung hinzugegeben, die Suspension für wenige Sekunden gevortext und
nachfolgend für fünf Minuten ins Ultraschallbad gesetzt, bis eine gesättigte Lösung
entstand. Im nächsten Schritt erfolgte die Zentrifugation bei 13.000 g und
Raumtemperatur für eine Minute. Im Anschluss wurde die Suspension für 15 Minuten
inkubiert und erneut für drei Minuten zentrifugiert. Nach diesen letzten Schritten konnte
der Überstand des Eppendorf-Gefäßes abpippetiert werden und stand als Matrix zur
Verfügung. Die Messung erfolgte mit einem Reflex III MALDI-ToF-
Massenspektrometer der Firma Bruker Daltonik im positiven Ionen-Modus bei einer
Beschleunigungsspannung von 20 kV.
Um die Spektren extern nachzukalibrieren wurde ein Standard-Peptid-Kalibrant der
Firma Bruker Daltonik verwendet. Die interne Kalibration erfolgte mit Hilfe einzelner
Peptidionensignale, welche sich aus dem Verdau mit Trypsin ergaben. Sowohl die
Software FlexAnalysis 2.4 als auch BioTools 3.0 (Bruker Daltonik) halfen bei der
weiteren Bearbeitung und Analyse der Spektren. Die Datenbanksuche erfolgte gegen
die in-Haus Datenbank SWALL, welche wiederum mit den Programmen Swiss-Prot
und TrEMBL sowie der Software Mascot (Matrix Science, London, UK) arbeitete.
3.2.6. Nephelometrie
Die Nephelometrie ist ein optisches Analyseverfahren, mit dem sich die Konzentration
feinverteilter, kolloidaler Teilchen in Flüssigkeiten oder Gasen quantitativ bestimmen
lässt. Ein Nephelometer besteht aus einer Lichtquelle und einem Fotosensor, welcher im
3 Material und Methoden
27
rechten Winkel zum Lichtstrahl angeordnet ist. Die Partikeldichte ergibt sich aus der
Menge des von den einzelnen Partikeln reflektierten Lichtes. Die Konzentration von
Transthyretin einer jeden Serumprobe wurde nephelometrisch mit Hilfe des Dade
Behring Nephelometers II bestimmt. Dabei wurde nach dem Protokoll des Herstellers
verfahren. Der Referenzbereich für Transthyretin wurde mit 0,2–0,4 mg/ ml angegeben.
Für die nephelometrische Messung wurden jeweils 250 µl Serumprobe verarbeitet.
3.2.7. Software-unterstützte Quantifizierungsmethode
Für die verschiedenen Methoden kamen mehrere unabhängige Auswertestrategien zur
Anwendung.
Die Auswertung der MS-Spektren erfolgte mit Hilfe der Software ClinProtTools 2.2 der
Firma Bruker Daltonik. Diese Software bietet die Möglichkeit, potentielle Biomarker in
komplexen Proteingemischen zu identifizieren und so entsprechende Screeningtests für
die verschiedensten Krankheitsbilder zu entwickeln.
Die Softwareeinstellungen wurden zu Beginn der Auswertung festgelegt und für alle
Messungen beibehalten. Für die Auswertung wurden die insgesamt 24 Spektren einer
Messung in 2 Klassen hochgeladen. Klasse eins beinhaltete 11 PE-Spektren, Klasse
zwei 13 Kontroll-Spektren. Die Peakauswahl, das sogenannte peak picking, erfolgte
anhand des Summenspektrums der jeweiligen Gruppe. Die Einstellungsparameter
lauteten: signal to noise threshold 5,00; relative threshold base peak 0,00%, kein Limit
der Peakanzahl. Die Berechnung der Peaks erfolgte anhand ihrer jeweiligen Fläche
oder auch area. Zur Steigerung der Qualität der Spektren wurden diese mit Hilfe der
Software FlexAnalysis 2.4 der Firma Bruker Daltonik nachbearbeitet. Die Glättung der
Spektren erfolgte nach dem Savitsky–Golay Algorithmus, ein mathematisches
Verfahren für das Glätten von Zeitreihen, bei dem jeder Wert der Serie durch einen
neuen Wert ersetzt wird [Savitzky & Golay 1964]. Die Einstellungsparameter lauteten:
width 2,00 m/z; cycles 3.
Weiterhin wurden folgende Einstellungsparameter für die Software ClinProtTools 2.2
unter dem Punkt spectra preparation festgelegt: Die Baseline Substraction erfolgte im
„Top Hat Baseline Mode“ und „Null Spectra Exclusion“ war aktiviert. Die
Normalisierung der Spektren erfolgte anhand ihrer total ion count, kurz TIC.
3 Material und Methoden
28
Beim Hochladen der Spektren wurden diese von der Software automatisch
nachkalibriert. Dabei dienten solche Massen als Referenzmassen, die letztlich in 30%
aller Spektren vertreten waren. Üblicherweise standen mindestens 50% der Peaks für
die Kalibrierung der Spektren zur Verfügung. Die maximale Abweichung von
Referenzmasse zu Peakmasse war begrenzt auf 1500 ppm. Folglich wurden von der
Analyse solche Spektren ausgeschlossen, deren Peakmassen zu stark von den
Referenzmassen abwichen oder zu wenig Massen aufwiesen, anhand derer eine
Nachkalibration hätte erfolgen können.
Zur Ermittlung der statistischen Signifikanz der einzelnen Peaks der MS-Spektren
wurden diese mit Hilfe verschiedener mathematischer Testverfahren analysiert.
Zunächst sollte der p-Wert des Anderson-Darling Testes des jeweiligen Peaks betrachtet
werden. Dieser entscheidet, ob eine Normalverteilung der Werte vorliegt oder nicht.
Fällt der Anderson-Darling Test größer als 0,05 aus, so liegt eine Normalverteilung vor
und es wird im nächsten Schritt der Studentsche T-Test, kurz T-Test betrachtet. In
dieser Studie liegen lediglich zwei Populationen vor. Folglich arbeitet die Software in
diesem Fall bei der Auswertung mit dem T-Test. Der ANOVA-Test würde im Falle des
Vorliegens von mehr als zwei Populationen Anwendung finden. Eine statistische
Signifikanz liegt dann vor, wenn der p-Wert des T-Testes kleiner 0,05 ist. Liegt der
Wert des Anderson-Darling Testes allerdings unter 0,05, so muss bei Vorliegen von
zwei Populationen der Wilcoxon-Test in Betracht gezogen werden. Bestehen mehr als
zwei Populationen erfolgt die statistische Auswertung mit Hilfe des Kruskal-Wallis-
Testes. Ein statistisch signifikanter Peak liegt vor, wenn der p-Wert des Wilcoxon-
Testes kleiner ist als 0,05.
Weiterhin stand für die Auswertung der Messungen die Software Origin (OriginLab
Corporation) zur Verfügung. Mit Hilfe dieses Analyse- und Darstellungsprogrammes
konnten Box-Whisker-Plots grafisch erstellt und ausgewertet werden.
Die eindimensionalen Gele wurden nach Fixierung und Färbung visuell am Leuchttisch
ausgewertet. Zur Beurteilung der Dichte der einzelnen Banden wurde eine
densitometrische Bildanalyse durchgeführt. Hierfür wurde die Software Phoretix 2D
Advanced (Nonlinear Dynamics Ltd., Newcastle upon Tyne, UK) genutzt.
3 Material und Methoden
29
3.2.8. Statistische Poweranalyse
Zur Ermittlung der für diese Arbeit minimal erforderlichen Probengröße wurde eine
statistische Poweranalyse durchgeführt [Schoonjans et al. 1995; Obuchowski & Zhou
2002]. Diese erfolgt üblicherweise vor Beginn einer Studie. Sie soll Aufschluss darüber
geben, wie groß die Stichprobe pro Gruppe zu sein hat, um valide Ergebnisse zu
erhalten. Die Poweranalyse fand mit Hilfe des statistischen Softwareprogramms
MedCalc (MedCalc Software bvba) statt.
Für den Alpha-Fehler wurde ein Wert von 0,05, für den Beta-Fehler ein Wert von 0,2
festgelegt. Der Beta-Fehler wird damit viermal so groß wie der Alpha-Fehler gewählt.
Der Alpha-Fehler, auch als Fehler 1. Art bezeichnet, besagt, dass die Nullhypothese
verworfen wird, obgleich diese richtig gewesen wäre. Hingegen beschreibt der Beta-
Fehler, oder auch Fehler 2. Art, die Beibehaltung der Nullhypothese, auch wenn
eigentlich die Alternativhypothese richtig gewesen wäre. Die Nullhypothese besagt,
dass kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen besteht. Die sogenannte
Power eines Testes ist definiert als 1-ß und stellt die Teststärke dar. Sie ist umso größer,
je größer der Probenumfang und je kleiner der Beta-Fehler ist. Eine festgelegte Power
von 80% besagt letztlich, dass die ermittelte Fallzahl mit einer Wahrscheinlichkeit von
80% zu einem signifikanten Ergebnis führt. Folglich verbleibt ein Restrisiko von 20%,
dass ein tatsächlich vorhandener Unterschied zwischen zwei Gruppen nicht erkannt
wird. Die Poweranalyse sagt nichts über das tatsächliche Ergebnis der Studie aus,
sondern dient lediglich der Studienplanung.
4 Ergebnisse
30
4 Ergebnisse
4.1. Charakterisierung von Präeklampsie-und Kontrollpatientinnen
Es wurde das Serum von insgesamt 24 schwangeren Frauen untersucht, die sich
zwischen Oktober 2006 und Dezember 2008 in stationärer Behandlung der
Universitätsfrauenklinik Aachen befanden. In diesem Zeitraum wurden 41 hypertensive
Schwangerschaftserkrankungen erfasst, darunter 28 Präeklampsien, 6 Propf-
Präeklampsien und 7 reine Gestationshypertonien. Bei 11 Frauen lag eine manifeste
Präeklampsie vor, mit Entwicklung der Symptomatik zwischen der 23. und 33.
Schwangerschaftswoche. Dem gegenüber standen 13 Probandinnen mit
unkompliziertem Schwangerschaftsverlauf, ebenfalls erfasst zwischen der 23. und 33.
Schwangerschaftswoche ohne klinische oder laborchemische Zeichen einer
Präeklampsie. Im Mittel lag das Alter der Frauen beider Gruppen bei 31 Jahren. Der
Unterschied im präpartalen BMI war gering (PE: 25,8; KO: 26,1). Bei zwei
Präeklampsie-Patientinnen bestand präpartal eine Hypothyreose, alle anderen 22
Patientinnen waren hinsichtlich internistischer Erkrankungen unauffällig.
Bei 10 der 11 PE-Patientinnen wurde die Schwangerschaft per primärer Sektio beendet,
nur in einem Fall wurde eine sekundäre Sektio nach Geburtsstillstand durchgeführt.
Von den Kontrollpatientinnen entbanden drei Frauen spontan, sechs Patientinnen per
primärer Sektio und drei Patientinnen per sekundärer Sektio. Eine Patientin wurde
vaginal operativ entbunden.
Das Geburtsgewicht der Kinder der PE-Gruppe lag im Durchschnitt bei 1278 g mit
einer Standardabweichung von 360 g. Das Geburtsgewicht der Kinder der
Kontrollgruppe lag bei 3256 g mit einer Standardabweichung von 475 g. Es wird
deutlich, dass das Gewicht von Kindern kranker Mütter bei der Geburt wesentlich
niedriger ausfiel, als das Gewicht von Kindern gesunder Mütter. Dies ist zum einen auf
eine, eventuell bei einer Präeklampsie vorliegende fetale Wachstumsrestriktion
zurückzuführen, zum anderen jedoch auch auf die, im Durchschnitt zeitlich früher
durchgeführte Entbindung (PE: 30. SSW, KO: 38. SSW). Der Z-Score lag für die
Präeklampsie-Gruppe durchschnittlich bei < -1,10. Für die Kontroll-Gruppe hingegen
betrug die Standardabweichung des Geburtsgewichtes von der 50. Perzentile etwa -0,25.
Eine Übersicht über das gesamte Patientenkollektiv bietet Tabelle 2.
4 Ergebnisse
31
Tabelle 2: Charakterisierung der Schwangeren.
Patientin Altera) BMI vor
SS
SSWa) Mittlerer
Blutdrucka,b)
Proteinurie a,c,d)
Entbindung in
SSW e)
Geburtsgewicht Z-Score f))
[a] [kg/m2] [w+d] [mmHg] [mg/l] [w+d] [g] [SD]
1 23 34 31+6 148/101 6760 32.+0 1325 -1,52
2 26 31 27+6 160/97 652 28.+3 830 -1,43
3 29 29 32+4 155/95 +3d 32.+5 1345 -1,47 4 30 42 31+5 143/84 451 31.+6 1395 -0,85
5 24 43 32+0 153/83 9140 32.+3 1460 -1,18
6 38 26 30+4 162/97 3382 31.+1 1730 0,1 7 32 34 29+2 142/84 555 32.+2 1465 -1,17
8 26 34 32+4 145/88 2293 33.+1 1690 -1,22
9 46 30 25+4 183/105 2342 26.+2 760 -1,00 10 33 25 23+6 144/93 384 25.+5 680 -1,02
11 34 29 32+0 176/113 2684 32.+2 1380 -1,38
12 31 42 30+4 122/74 180 38.+5 2800 -1,33
13 28 44 33+6 128/74 96 39.+0 3850 0,86
14 21 27 31+5 111/65 49 39.+0 3700 0,50 15 33 31 30+3 111/65 79 38.+6 3710 0,85
16 38 24 28+0 98/52 +1d 38.+0 3340 -0,04 17 28 25 24+0 95/60 0d 41.+0 3995 0,81
18 30 35 28+3 111/56 0d 36.+1 2630 -0,80
19 26 23 28+2 130/70 0d 37.+6 2915 -0,65 20 39 25 28+0 120/70 0d 37.+3 2860 -0,78
21 40 28 32+2 120/75 0d 38.+2 2590 -1,83
22 28 33 31+3 134/72 0d 38.+4 3335 -0,05
23 27 28 30+5 120/46 0d 41.+4 3485 -0,34 24 35 22 30+0 103/60 0d 38.+6 3120 -0,56
a) Zu Beginn der Hospitalisierung (Zeitpunkt der Blutentnahme).
b) Systolischer/diastolischer Blutdruck; Präeklampsie wurde definiert als Bluthochdruck mit Werten
systolisch > 140 mmHg und diastolisch > 90 mmHg, wobei betroffene Frauen bis zur 20. SSW
normotensiv waren.
c) Immunturbidimetrische Untersuchung (Tina-quant albumin, Roche Diagnostics, Mannheim,
Germany); Proteinurie wurde definiert als Ausscheidung > 300 mg/ 24 h.
d) Dipstick Untersuchung; signifikante Proteinurie wurde definiert als > +1.
e) Gestationswoche zum Zeitpunkt der Entbindung.
f) Z-Score: Standardabweichung des Geburtsgewichtes von der 50. Perzentile.
4 Ergebnisse
32
4.2. Anwendung der Massenspektrometrie zur differentiellen
Analytik von Präeklampsie- und Kontrollpatientinnen
Hoher Massenbereich
Bevor die Messung der Serumproben mit dem MALDI-ToF Massenspektrometer
erfolgen konnte, wurden diese mittels magnetischer Beads aufgearbeitet sowie
fraktioniert gefällt. Im hohen Massenbereich zeigten sich Ionensignale zwischen m/z
25.000 und 200.000. Die prominentesten Signale fanden sich bei m/z 66.447, 33.282
und 28.050. Diesen wurde jeweils das einfach sowie doppelt geladene Ionensignal von
humanem Serumalbumin (Mr 66.447) und das einfach geladene Ionensignal von
Apolipoprotein A-I (Mr 28.079) zugeordnet.
Die Ergebnisse der massenspektrometrischen Messung für den hohen Massenbereich
korrelierten weitestgehend mit den Ergebnissen der SDS-PAGE Analyse der fraktioniert
gefällten Serumproben. Bei der SDS-PAGE Analyse konnten Proteinbanden zwischen
25 und 220 kDa beobachtet werden. Der Vergleich der Gele vor (Bahn 1) und nach
(Bahn 2) fraktionierter Fällung zeigte, dass durch die fraktionierte Fällung nahezu alle
Proteine in dem Massenbereich oberhalb von 220 kDa, aber nur zum Teil in dem
Massenbereich zwischen 150 kDa und 97 kDa entfernt wurden. Das Bandenmuster nach
Fällung korrelierte mit den MS-Spektren.
a) b)
Abbildung 5: a) Überblick der Ionensignale einer PE-Probe nach fraktionierter Fällung. Massenbereich
m/z 20.000-220.000. Als Matrix diente Ferulasäure. b) zeigt die SDS-PAGE Analyse (10% T, Coomassie
Blau Färbung) selbiger PE-Probe vor (Bahn 1) und nach (Bahn 2) fraktionierter Fällung.
4 Ergebnisse
33
Die kräftige Bande bei apparentem Molekulargewicht von 55 kDa konnte als humanes
Serumalbumin (m/z 66.437), die Bande bei apparentem Molekulargewicht von 26 kDa
als Apolipoprotein A-I (m/z 28.079) identifiziert werden. Hierzu wurden die in diesen
Banden befindlichen Proteine ausgestochen, mittels Trypsin verdaut und anschließend
mittels Peptide mass fingerprinting identifiziert.
Ionensignale über m/z 70.000 erschienen in den Spektren als sehr kleine Signale von
geringer Intensität. Dies ist vermutlich auf die niedrige Empfindlichkeit der Mehrkanal-
Detektorplatte zurückzuführen. Die Analyse des hohen Massenbereiches zeigte letztlich
keine signifikanten Unterschiede in den Spektren zwischen den Kontroll- und den
Präeklampsieproben und ließen kein Proteinsignal oder gar Cluster erkennen, anhand
dessen eine Trennung der beiden Gruppen möglich gewesen wäre. Der hohe
Massenbereich wurde für die weitere Auswertung folglich nicht weiter berücksichtigt.
Niedriger Massenbereich
Die Auswertung der MS-Spektren konzentrierte sich ausschließlich auf den niedrigen
Massenbereich zwischen m/z 4500 und 25.000. Für die ersten vier Messungen (M1-4)
erfolgte die Proteinseparation der Serumproben mit Hilfe des Profiling Kits 100 MB-
HIC8. Die Mehrheit der Ionensignale zeigte sich im Bereich unter m/z 20.000. Im
Gegensatz dazu fanden sich in der SDS-PAGE-Analyse unter Verwendung von
10%igen Gelen nur schwache Signale für diesen Massenbereich. Die Ursache hierfür
liegt vermutlich in der geringeren Anfärbbarkeit „kleiner“ Proteine, also Proteine mit
einer geringen molekularen Masse. Hingegen lassen sich Proteine mit einer hohen
molekularen Masse leicht mit Coomassie-Brillant-Blau anfärben und sind demzufolge
deutlich als Banden in den Gelen zu erkennen.
4 Ergebnisse
34
Abbildung 6: Darstellung MS-Einzelspektren einer Kontroll (KO)- sowie einer Präeklampsie (PE)-Probe
für den niedrigen Massenbereich von m/z 4.000-25.000 nach Aufarbeitung der Proben mittels des
Profiling Kits 100 MB-HIC8 der Firma Bruker Daltonik.
4.2.1. Monoparametrische Analyse
Nach Aufnahme der 24 Einzelspektren, davon 11 Präeklampsie- und 13 Kontroll-
Spektren, zusammengefasst als Messreihe 1, erfolgte ihre Auswertung mit Hilfe der
Computersoftware ClinProTools 2.2. Im Durchschnitt wurden pro Spektrum ca. 85
Ionensignale detektiert, wovon jedoch nicht alle als statistisch signifikant für die
Gruppendifferenzierung anzusehen waren. Die statistische Relevanz der einzelnen
Signale wurde mit Hilfe verschiedener mathematischer Testverfahren, derer sich die
Software bedient, ermittelt. Eine Übersicht über die Signale bietet die sogenannte Peak-
Statistik-Tabelle, welche aus der Gesamtheit aller Spektren erstellt wurde. Einen
Auszug dieser Tabelle für Messreihe 1 bietet Tabelle 3.
4 Ergebnisse
35
Tabelle 3: Auszug der Peak-Statistik-Tabelle für Messreihe 1 mit den ersten 10 von
insgesamt 80 detektierten Ionensignalen, geordnet nach statistischer Relevanz.
Index Mass Dave PTTA PWKW PAD Ave1 Ave2 StdDev1 StdDev2 CV1 CV2
59 13890,99 113,98 0,019 0,000415 0,0273 70,57 184,55 29,16 81,29 41,32 44,05
20 6858,13 86,36 0,037 0,00288 0,00142 77,24 163,6 25,47 71,79 32,97 43,88
57 13714,96 533,22 0,0383 0,00536 0,00167 280,93 814,14 136,72 470,66 48,67 57,81
58 13833,57 121,19 0,0496 0,0114 0,00843 121,17 242,37 49,68 116,04 41 47,88
21 6917,44 20,54 0,0496 0,0114 0,0912 38,01 58,55 11,77 17,76 30,96 30,33
22 6945,45 14,29 0,12 0,17 0,00524 15,81 30,1 6,27 16,35 39,63 54,32
56 13564,06 3,97 0,12 0,00989 8,57E-06 3,75 7,72 1,27 4,72 33,92 61,12
3 4532,53 6,38 0,216 0,203 0,155 22,78 16,4 7,42 4,8 32,58 29,28
53 12408,32 1,39 0,216 0,406 0,0286 3,33 4,71 0,84 1,84 25,26 39,08
39 8885,61 443,73 0,298 0,203 0,345 1803,66 1359,94 452,78 544,19 25,1 40,02
Index Signalreihenfolge im Summenspektrum
Mass Massenzahl in Da
DAve Differenz zwischen durchschnittlich maximaler und minimaler Peakfläche aller Klassen
PTTA P-Wert Student T-Test (Vorliegen von zwei Klassen) oder ANOVA-Test (Vorliegen von mehr
als zwei Klassen)
PWKW P-Wert Wilcoxon-Test oder Kruskal-Wallis-Test
PAD P-Wert Anderson-Darling Test
Ave1 Durchschnittliche Peakfläche Klasse 1 (Präeklampsie-Gruppe)
Ave2 Durchschnittliche Peakfläche Klasse 2 (Kontroll-Gruppe)
StdDev1 Standardabweichung der durchschnittlichen Peakfläche von Klasse 1
StdDev2 Standardabweichung der durchschnittlichen Peakfläche von Klasse 2
CV1 Variationskoeffizient von Klasse 1
CV2 Variationskoeffizient von Klasse 2
Letztlich konnten für Messreihe 1 aus 80 detektierten Ionensignalen pro Spektrum 5
Signale identifiziert werden, die nach statistischer Analyse durch die Software
signifikant erschienen: (1) m/z 13.891, (2) m/z 6858, (3) m/z 13.715, (4) m/z 13.834, (5)
m/z 6917. Doch stellte sich die Frage, ob jene Signale auch tatsächlich für die
Auswertung relevant waren. Die genauere Betrachtung zeigt, dass es sich bei den
Signalen (2) und (5) um die jeweils doppelt geladenen Ionen der Signale (3) und (4)
und handelte. Des Weiteren erwies sich das Ionensignal (1) m/z 13.891 als
wahrscheinliches Matrixaddukt von m/z 13.715, was bedeutet, dass es sich hierbei um
kein eigenständiges Signal handelte. Folglich entfiel dieses Signal aus der weiteren
Analyse und es standen letztlich noch vier Ionensignale für die Auswertung zur
Verfügung: (2) m/z 6858, (3) m/z 13.715, (4) m/z 13.834 und (5) m/z 6917.
4 Ergebnisse
36
Abbildung 7: Darstellung der Summenspektren für beide Gruppen: Präeklampsie (rot) und Kontrolle
(grün) im niedrigen Massenbereich von m/z 4.000-25.000.
Für alle vier Signale wurden im nächsten Schritt Box-Whisker-Plots erstellt, welche die
Verteilung der entsprechenden Flächen unter den Ionensignalen für insgesamt 24
Spektren in den einzelnen Gruppen aufzeigen (siehe Abbildung 8).
P = 0,00112 p = 8,89389E-4
4 Ergebnisse
37
P = 0,00335 p = 0,00182
Abbildung 8: Box-Whisker-Plots mit Darstellung der Verteilung der Flächen für die Ionensignale a)
13.715, b) 6858, c) 6917 und d) 13.834 für die PE-Gruppe (rot, n =11) und die KO-Gruppe (grün, n = 13).
Die Box entspricht dem Bereich, in dem die mittleren 50% der Daten liegen. Sie wird durch das obere
75%ige und das untere 25%ige Quantil begrenzt. Die Horizontale inmitten der Box entspricht dem
Median. Durch die Whisker werden die außerhalb der Box liegenden Werte dargestellt. Sie geben das 5.
und 95. Perzentil an. Das Kreuz beschreibt das 1. und 99. Perzentil.
Die Berechnung der in Abbildung 8 dargestellten Box-Whisker-Plots erfolgte mit Hilfe
der prozentualen Anteile der einzelnen Flächen. Dazu wurde die Summe aller Flächen
eines Ionensignals aus 24 Spektren als 100% gesetzt und danach der prozentuale Anteil
einer jeden Fläche eines jeden Spektrums bestimmt.
Bei allen Box-Whisker-Plots lag der p-Wert jeweils unter 0,05. Das bedeutet, dass auf
der 0,05-Ebene, die Mittelwerte beider Gruppen sich bedeutend unterschieden. Dies traf
für alle vier Signale zu, allerdings überschnitten sich für Signal m/z 13.834, im
Vergleich zu den übrigen, die Bereiche, in denen die mittleren 50% der Daten lagen.
Aus diesem Grund wurde das Signal von der weiteren Analyse ausgeschlossen.
Mit Hilfe der verbliebenen drei Signale wurden im Folgenden drei Kombinationen
erstellt, anhand derer eine mögliche Trennung der beiden Gruppen im
Koordinatensystem aufgezeigt werden sollte. Die Kombinationen setzten sich wie folgt
zusammen: Kombination (K1) aus m/z 6858 und m/z 13.715, Kombination (K2) aus
m/z 6858 und m/z 6917, Kombination (K3) aus m/z 13.715 und m/z 6917. Die
Reihenfolge der erstellten Kombinationen richtete sich nach der Folge der einzelnen
Signale in der Peak-Statistik-Tabelle. So wurde für Kombination (K1) das erstbeste mit
dem zweitbesten, für Kombination (K2) das erstbeste mit dem drittbesten und für
Kombination (K3) das zweitbeste mit dem drittbesten Signal kombiniert. Anschließend
erfolgte die räumliche Darstellung der ersten Kombination für die 24 Spektren der
ersten Messung (M1) im Koordinatensystem (siehe Abbildung 9). Die Box-Whisker-
4 Ergebnisse
38
Plots hatten bereits eine erste Tendenz hinsichtlich der Verteilung der Massen für die
beiden Gruppen gezeigt. So wies die KO-Gruppe im Durchschnitt stets höhere
Flächenwerte als die PE-Gruppe auf. Zur klaren Differenzierung der beiden Gruppen
wurden nun Grenzen definiert.
Abbildung 9: Räumliche Darstellung der 24 Einzelspektren für Messung 1 im Koordinatensystem,
aufgetragen nach m/z 6858 und m/z 13.715 (Kombination 1) mit Darstellung der selbst definierten
Grenzen sowie Grauzone (graue Schattierung).
Die Grenzwerte wurden aus den Box-Whisker-Plots der jeweiligen Gruppe berechnet.
So wurden alle Spektren, die unterhalb des 0,75-Quantils (P75) für m/z 13.715 und m/z
6858 der PE-Gruppe lagen, als „Präeklampsie“ eingestuft, alle Spektren oberhalb des
0,25-Quantils (P25) für Signal m/z 13.715 und Signal m/z 6858 der KO-Gruppe wurden
als „Kontrolle“ bewertet. Die Ergebnisse dieser ersten Kombination sind in der
folgenden Tabelle zusammengefasst.
4 Ergebnisse
39
Tabelle 4: Ergebnisse für die erste Kombination der ersten Messung bei einer
monoparametrischen Analyse (RP: richtig positiv, RN: richtig negativ, nz: nicht
zugeordnet, FN: falsch negativ).
Kombination 1
Probe Zuordnung Probe Zuordnung
PE_1 RP CN_2 RN
PE_29 FN CN_18 RN
PE_48 RP CN_26 nz
PE_64 RP CN_68 RN
PE_69 nz CN_102 nz
PE_77 RP CN_109 RN
PE_90 nz CN_113 nz
PE_91 RP CN_155 RN
PE_118 RP CN_171 RN
PE_128 RP CN_195 RN
PE_219 RP CN_198 RN
CN_226 nz
CN_227 RN
Insgesamt konnten durch die erste Kombination (K1) 8 von 11 PE-Proben richtig
positiv (RP) zugeordnet werden. Eine PE-Probe wurde als Kontrolle eingestuft (FN)
und 9 von 13 KO-Proben als richtig negativ erkannt. Keine Probe wurde als falsch
positiv (FP) eingestuft. In 6 von 24 Fällen, darunter 2 PE- und 4 Kontroll-Proben,
konnte keine Aussage hinsichtlich der Gruppenzugehörigkeit getroffen werden. Offen
blieb die Frage, ob es möglich wäre, diese ausstehenden 6 Proben mit Hilfe der übrigen
zwei Kombinationen einer entsprechenden Gruppe zuzuordnen. So wurden als Nächstes
in der zweiten Kombination nur die bisher nicht zugeordneten Spektren betrachtet. Die
Grenzen für oberes (0,75-Quantil) und unteres (0,25-Quantil) Quantil wurden
beibehalten, nun allerdings für die Signale m/z 6858 und m/z 6917 festgelegt. Es zeigte
sich, dass lediglich eine weitere PE-Probe über dieser Kombination richtig positiv
zugeordnet werden konnte. Selbiges Verfahren, angewendet auf die dritte Kombination,
ergab hingegen keine weitere Zuordnung zu einer der beiden Gruppen. Letztendlich
verblieben 5 Proben, die nach diesem Verfahren nicht zuzuordnen waren.
Für Messreihe 1 konnte, nach Durchlaufen aller drei Kombinationen, eine Spezifität von
69%, ein positiver Vorhersage-Wert von 100% und ein negativer Vorhersage-Wert von
90% erreicht werden. Des Weiteren zeigte sich im Verlauf der Analyse eine Steigerung
der Sensitivität von ursprünglich 73% auf 82%.
Insgesamt konnten diese Ergebnisse als zufriedenstellend betrachtet werden, jedoch
verblieb nach dieser Auswertungsstrategie stets eine Grauzone zwischen dem oberen
4 Ergebnisse
40
Quantil der PE-Gruppe und dem unteren Quantil der KO-Gruppe (siehe Abbildung 9).
In diesem Fall konnte keine eindeutige Aussage bezüglich der Gruppenzugehörigkeit
getroffen werden, was letztlich als noch unbefriedigend zu bewerten war. Um diese
Grauzone zu eliminieren, wurden zwei Lösungsansätze konstruiert. Der erste Fall
besagte: Alles unterhalb des oberen Quantils für m/z 13.715 und m/z 6858, sei eindeutig
eine „Präeklampsie“, alles oberhalb dieses Quantils eindeutig „Kontrolle“. Der zweite
Fall hingegen lautete: Alles oberhalb des unteren Quantils für m/z 13.715 und m/z 6858
sei eindeutig eine „Kontrolle“, alles unterhalb dieses Quantils eindeutig eine
Präeklampsie. Je nachdem welcher Fall nun zur Anwendung kam, zeigte sich entweder
eine hohe Spezifität für Fall 1 beziehungsweise bei Anwendung von Fall 2 eine
entsprechend hohe Sensitivität. Die Ergebnisse dieses Ansatzes sind in folgender
Tabelle zusammengefasst.
Tabelle 5: Übersicht der Ergebnisse des 2. Ansatzes einer monoparametrischen Analyse
für alle vier Messreihen.
Messung Fall Richtig
positiv
Falsch
positiv
Richtig
negativ
Falsch
negativ
Sensitivität
[%][%]
Spezifität
[%[%]
Positiver
Vorhersage-
wert [%]
Negativer
Vorhersage-
wert [%]
1 1 5 0 13 6 45,45 100,00 100,00 68,42
2 10 4 9 1 90,91 69,23 71,43 90,00
2 1 6 3 10 5 54,55 76,92 66,67 66,67
2 11 6 7 0 100,00 53,85 64,71 100,00
3 1 4 1 12 7 36,36 92,31 80,00 63,16
2 10 3 10 1 90,91 76,92 76,92 90,91
4 1 3 1 12 8 27,27 92,31 75,00 60,00
2 10 3 10 1 90,91 76,92 76,92 90,91
Auch für diesen Ansatz fielen die Ergebnisse nur unzureichend zufriedenstellend aus.
Waren sie doch zu sehr von der willkürlichen Wahl zwischen dem ersten und dem
zweiten Fall abhängig.
Da dieser erste Versuch einer Klassifizierung anhand von nur einer Kombination
lediglich zweier Parameter pro Koordinatensystem erfolgte, wurde der Ansatz als
„monoparametrische Analyse“ bezeichnet.
4 Ergebnisse
41
4.2.2. Multiparametrische Analyse
Die am besten zwischen den beiden Gruppen differenzierenden Ionensignale wurden,
wie bereits bei der monoparametrischen Analyse beschrieben, bei m/z 13.715, m/z
13.834 und m/z 13.891 gemessen. Bei allen Ionensignalen handelte es sich jeweils um
einfach geladene Ionen, die mit Hilfe der Software ClinProTools 2.2 ermittelt wurden.
Es erfolgte die Berechnung des p-Wertes durch verschiedene statistische Tests (siehe
Kapitel 3.2.7), wodurch für Messreihe 1 eine Unterscheidung zwischen differentiellem
und weniger differentiellem Signal möglich war. Allein anhand dieser drei Signale
konnte allerdings, wie bereits in Kapitel 4.2.1. beschrieben, nicht in allen Fällen eine
eindeutige Zuordnung der einzelnen Proben zu einer der beiden Gruppen erfolgen.
Nachfolgend wurden für die weitere Analyse neben den drei am besten
differenzierenden Signalen die drei intensivsten Signale mit herangezogen, also ein
multiparametrischer Ansatz verfolgt.
Abbildung 10: Darstellung der insgesamt 24 Einzelspektren der ersten Messung im sogenannten stack
view (rot: Präeklampsie-Spektren; grün: Kontroll-Spektren).
Die intensivsten Signale zeigten sich in allen Spektren, unabhängig von der
Gruppenzugehörigkeit bei m/z 9390, m/z 9103 und m/z 8886.
4 Ergebnisse
42
Tabelle 6: Übersicht der Ionensignale für die multiparametrische Analyse.
m/z Ladung PTTA PWKW PAD peak area / std dev a) Rang b,c)
1 13891 1+ 0.019 0.000415 0.0273 70.57 / 29.16 1
2 6945 2+ 0.12 0.17 0.00524 15.81 / 6.27 6
3 13834 1+ 0.0496 0.0114 0.00843 121.17 / 49.68 4
4 6917 2+ 0.0496 0.0114 0.0912 38.01 / 11.77 5
5 13715 1+ 0.0383 0.00536 0.00167 280.93 / 136.72 3
6 6858 2+ 0.037 0.00288 0.00142 77.24 / 25.47 2
7 9390 1+ 0.885 1 0.174 3109.2 / 899.53 1
8 9103 1+ 0.65 0.621 0.265 1660.76 / 458.3 3
9 8886 1+ 0.298 0.203 0.345 1803.66 452.78 2
a) Werte aus Messung 1, erster Messdurchgang (MS1)
b) 1-6: die differentiellsten Ionensignale bezogen auf die Peak Statistik (PTTA: p-Wert des "Student
T-Test" (2 Klassen) oder "ANOVA-Test" (> 2 Klassen); PWKW: p-Wert des "Wilcoxon Test" (2
Klassen) oder "Kruskal-Wallis-Test" (> 2 Klassen); PAD: p-Wert des "Anderson-Darling Test").
c) 7-9: die intensivsten Ionensignale bezogen auf die durchschnittliche Peakfläche.
Die drei am besten zwischen den beiden Gruppen differenzierenden Signalen sowie die
drei intensivsten Ionensignale ermöglichten die Formulierung von Regeln, anhand derer
eine Zuordnung zu einer der beiden Gruppen möglich war. Die Daten der ersten
Messreihe (M1) dienten dabei als „Trainings-Set“, um so eine geeignete
Auswertungsstrategie zu entwickeln. Mit Hilfe der 6 Ionensignale wurden insgesamt
fünf Zweierkombinationen erstellt: (1) m/z 13.715 und m/z 13.834, (2) m/z 13.891 und
m/z 8886, (3) m/z 13.715 und m/z 8886, (4) m/z 13.715 und m/z 9103 sowie (5) m/z
13.834 und m/z 9390. Anschließend wurde für jedes Spektrum aus M1 der Quotient aus
den Flächen dieser Ionensignal-Paare berechnet und für die jeweilige Gruppe als Box-
Whisker-Plot dargestellt (siehe Abbildung 11). Es zeigten sich in allen Fällen
signifikante p-Werte (p-Wert < 0,05). Das bedeutet, dass beide Gruppen sich in ihren
Mittelwerten auf dem Signifikanzniveau von 5% signifikant voneinander unterschieden.
Es wurden Grenzen, sogenannte Schwellenwerte, definiert, anhand derer eine
Zuordnung zu einer der beiden Gruppen erfolgen sollte. Die jeweiligen Grenzen, in den
Grafiken als gestrichelte Horizontale dargestellt, lagen oberhalb des 0,75-Quantils der
PE-Gruppe und unterhalb des 0,25-Quantils der Kontroll-Gruppe.
4 Ergebnisse
43
Abbildung 11: Darstellung Box-Whisker-Plots für die erstellten fünf Regeln, welche mit Hilfe der drei
differentiellsten und der drei intensivsten Ionensignale der ersten Messung (M1) formuliert wurden. Die
Proteinseparation für M1 erfolgte mittels des Profiling Kits 100 MB-HIC8 der Firma Bruker Daltonik.
Im nächsten Schritt wurden alle 5 Regeln auf die einzelnen Spektren von M1
unabhängig voneinander angewendet. Wurden bei der Festlegung der Grenzwerte noch
alle 24 Spektren berücksichtigt, sollte nun jedes Spektrum und sein Verhältnis zu den
einzelnen Schwellenwerten für sich betrachtet werden. Wurde der Schwellenwert der
jeweiligen Regel für ein individuelles Spektrum (also einer individuellen Proben)
überschritten, so wurde der Punktwert „0“ vergeben. War dies nicht der Fall und der
4 Ergebnisse
44
Quotient blieb unter dem berechneten Schwellenwert, wurde eine „1“ vermerkt. So
konnte insgesamt nach Anwendung aller fünf Regeln ein kulmulativer Punktwert
zwischen „0“ und „5“ erreicht werden. Betrug der kulmulative Punktwert einer Probe
nach Durchlaufen aller fünf Regeln „2“ oder weniger, erfolgte die Zuordnung dieses
Spektrums zur Gruppe der „Kontrollen“, andernfalls wurde die Probe als
„Präeklampsie“ eingestuft. Nach diesem Verfahren konnten alle Spektren der Messreihe
1, das heißt alle 24 Proben, ihrer jeweiligen Gruppe richtig zugeordnet werden. Die
Sensitivität und Spezifität betrug demnach 100%, ebenso wie der positive und der
negative Vorhersagewert. Die Falsch-positiv- sowie die Falsch-negativ-Rate betrug
jeweils 0%.
Im nächsten Schritt wurden die Regeln nun auf die Daten aus Messreihe 2 des ersten
Messdurchganges angewendet. Diese Messung erfolgte einige Tage nach der ersten,
ohne frische Ansätze für Eluate und Matrix. Hiernach ergaben sich eine Spezifität von
62% sowie eine Falsch-positiv-Rate von 38%, was bei letztlich 24 Proben als sehr
unbefriedigend anzusehen war und diesen Ansatz einer massenspektrometrie-basierten
Analyse wieder in Frage stellte.
Um nun zu eruieren, ob diese schlechte statistische Signifikanz der 2. Messreihe auf das
Verfahren zurückzuführen war oder auf eine eventuelle Schädigung der fraktionierten
Proben während der Zeit der Lagerung, wurde ein zweiter Messdurchgang durchgeführt.
Hierfür wurden alle Serumproben frisch aliquotiert und abermals mit Hilfe von
magnetischen Beads unter Verwendung des Profiling Kits 100 MB-HIC8 fraktioniert.
Der zweite Messdurchgang bestand ebenfalls aus zwei einzelnen Messreihen, genannt
Messreihe 3 und 4. Auch in diesem Fall wurde jede Serumprobe erneut zweimal im
Abstand einiger Tage mit dem MALDI-ToF-Massenspektrometer gemessen. Das
multiparametrische Auswerteverfahren, erneut angewendet auf die Daten von Messreihe
3, zeigte nun abermals hohe Werte für Sensitivität (91%) und Spezifität (85%). Die
Falsch-Positiv-Rate betrug 15%, die Falsch-negativ-Rate nur 9%. Der positive
Vorhersage-Wert lag bei 83%, der negative Vorhersage-Wert bei 92%. Die erneute
Messung der Eluate nach einigen Tagen (Messreihe 4) zeigte abermals einen Abfall der
Spezifität auf 69% und einen Anstieg der Rate falsch-positiver Ereignisse auf 31%.
Zusammenfassend sind die Ergebnisse für alle 4 Messreihen in Tabelle 7 dargestellt.
4 Ergebnisse
45
Tabelle 7: Übersicht der Ergebnisse einer multiparametrischen Analyse für Messreihe
1-4.
Messung Richtig
positiv
Falsch
positiv
Richtig
negativ
Falsch
negativ
Sensitivität Spezifität Falsch
positiv
Rate
Falsch
negativ
Rate
Positiver
Vorhersage-
Wert
Negativer
Vorhersage-
Wert
M1 a) 11 0 13 0 1,00 1,00 0,00 0,00 1,00 1,00
M2 a) 10 5 8 1 0,91 0,62 0,38 0,09 0,67 0,89
M3 b) 10 2 11 1 0,91 0,85 0,15 0,09 0,83 0,92
M4 b,c) 10 4 9 1 0,91 0,69 0,31 0,09 0,71 0,90
a) Erste Aufarbeitung der Serumproben mittels magnetischer Beads.
b) Zweite Aufarbeitung der Serumproben mittels magnetischer Beads.
c) Die Spektren der Patientinnen 12, 14, 21 und 23 waren von schlechter Qualität und wurden direkt
als falsch positiv eingestuft.
Zusammenfassend ist eine Übersicht zur Auswertung in folgender Abbildung gegeben.
Abbildung 12: Übersicht Auswertung
Monoparamterische Analyse mit
3 statistisch signifikanten Signalen
3 Kombinationen
Keine objektive Klassifizierung möglich durch
Grauzonenbildung
Multiparametrische Analyse mit
3 statistisch signifikanten und 3
intensiven Signalen
5 Kombinationen
Objektive Klassifizierung möglich
4 Ergebnisse
46
4.2.3. Verifizierung der Ergebnisse mittels SDS-PAGE
Als Nächstes wurde geprüft, ob diese Auswertungsstrategie einer multiparametrischen
Analyse auch auf andere Methoden der Probenaufarbeitung anwendbar ist oder lediglich
für die Proteinseparation mittels magnetischer Beads, basierend auf dem Reverse-Phase-
Prinzip, gilt. Zu diesem Zweck wurden alle 24 Serumproben einer sogenannten
fraktionierten Fällung zugeführt und Proteine der Fraktion II einer jeden Probe ebenfalls
mit einem MALDI-ToF-Massenspektrometer gemessen. Diese Messung aller Proben
wurde als Messreihe 5 (M5) bezeichnet.
Abbildung 13: Darstellung der Einzelspektren einer KO-Probe sowie einer PE-Probe nach fraktionierter
Fällung. Massenbereich m/z 4000-25.000.
Die Spektren dieser Messreihe unterschieden sich nur leicht von denen aus Messreihe 1.
So zeigten sich auch in diesem Fall die intensivsten Ionensignale bei m/z 9390, m/z
9103 sowie m/z 8886 und die differentiellsten Signale bei m/z 13.715, m/z 13.834
sowie m/z 13.891. Allerdings fielen Unterschiede hinsichtlich der Höhe der Intensitäten
und der Größe der jeweiligen Flächen der Signale auf. Es ergaben sich folglich nach der
Erstellung der Box-Whisker-Plots neue Quotientenwerte mit abermals signifikanten p-
Werten (p-Wert < 0,05). Es wurden nun neue Cut-off-Werte definiert, welche
wiederum, zwischen dem 0,75-Quantil der Präeklampsie-Gruppe und dem 0,25-Quantil
der Kontroll-Gruppe lagen. Es gab jedoch eine Ausnahme. Bei dem Ionensignal-Paar
m/z 13.834 und 9390 befand sich der Grenzwert über dem 0,25-Quantil der Kontroll-
Gruppe. Um mit den früheren Messreihen vergleichen zu können, wurde aber das
Verfahren hier trotz dieses Umstandes nicht geändert.
4 Ergebnisse
47
Diese Methodik einer multifaktoriellen Analyse, angewendet auf die Daten von
Messreihe 5, führte zu einer Sensitivität von 91% sowie einer Spezifität von 92%.
Darüber hinaus zeigte sich ein positiver Vorhersage-Wert von 91% sowie eine negativer
Vorhersage-Wert von 92%. Zusammenfassend sind die Ergebnisse der Messung 5 in
Tabelle 8 dargestellt.
Tabelle 8: Ergebnisse einer multiparametrischen Analyse für Messung 5 nach
Proteinseparation mittels fraktionierter Fällung.
Messung Richtig
positiv
Falsch
positiv
Richtig
negativ
Falsch
negativ
Sensitivität Spezifität Falsch
positiv
Rate
Falsch
negativ
Rate
Positiver
Vorhersage-
Wert
Negativer
Vorhersage-
Wert
M5 10 1 12 1 0,91 0,92 0,08 0,09 0,91 0,92
4 Ergebnisse
48
4.3. Identifizierung von Serumproteinen
SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese
Neben der massenspektrometrischen Untersuchung der Serumproben erfolgte die
Analyse ausgewählter Proben mittels SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese. Von
besonderem Interesse war dabei der Massenbereich unter 20 kDa, da sich dieser bereits
in den vorangegangenen MALDI-ToF-MS Messungen als sehr signalreich
herausgestellt hatte. In Abbildung 13 ist der Massenbereich von 6,5 bis 20 kDa für
jeweils zwei Präeklampsie- und Kontroll-Proben dargestellt. Es zeigten sich sowohl bei
den Präeklampsie- als auch bei den Kontroll-Proben insgesamt sechs Proteinbanden in
dem angegebenen Massenbereich vor (Bahn 1) und nach (Bahn 2) fraktionierter
Fällung.
5 7 23 15
1 2 1 2 1 2 1 220
14
6.5
Retinol binding protein 4Apolipoprotein A-II
TransthyretinApolipoprotein C-III
kDa
PE KO
Abbildung 14: SDS-PAGE-Analyse der Patientenproben 5 und 7 (Präeklampsie-Proben) und 23 und 15
(Kontroll-Proben) vor (Bahn 1) und nach (Bahn 2) fraktionierter Fällung. Verwendet wurde ein 12%iges
Gel. Der Massenbereich umfasste 6,5-20 kDa. Die Färbung der Proteinbanden erfolgte mit Coomassie-
Brillant-Blau G-250. Die massenspektrometrisch identifizierten Proteine sind links abgebildet, die
Lokalisation der Markerproteine ist rechts dargestellt.
Die vier intensivsten Proteinbanden wurden nach in-Gel Verdau mit Trypsin
massenspektrometrisch mittels Peptide mass fingerprinting identifiziert. Die Bande bei
20 kDa enthielt als Hauptkomponente Retinol–bindendes-Protein 4 (Mr 20.943). In der
direkt darunter folgenden Bande fand sich Apolipoprotein A-II (Mr 17.160) und knapp
unterhalb von 6,5 kDa Apolipoprotein C-III (Mr 8765). Die Bande im Bereich von 14
4 Ergebnisse
49
kDa beinhaltete Transthyretin (Mr 13.761). Insgesamt zeigten sich für alle Proteine gute
Signifikanzwerte für das Identifizierungsergebnis, so dass die identifizierten Proteine
als Hauptkomponente in den entsprechenden Banden angenommen werden konnten.
Abbildung 15: Spektrum Peptide mass fingerprinting von Transthyretin (* Hintergrundsignale wie
Trypsin, Matrix, Coomassie-Färbung, Keratin etc.). Transthyretin wurde mit einem Score
(Signifikanzwert) von 226 (Signifikanzgrenze) mit 14 von 26 gesuchten Signalen (RMS 29 ppm) und
einer Sequenzabdeckung von 77% identifiziert.
Densitometrische Gelbandenanalyse
Bereits bei visueller Betrachtung der Gele fiel im Vergleich zur Kontroll-Gruppe eine
scheinbar geringere Intensität der Transthyretin-Banden in der Präeklampsie-Gruppe
auf. Die densitometrische Untersuchung der Proteinbanden ergab, dass die Banden, die
Transthyretin enthielten, eine durchgehend schwächere Intensität in den Präeklampsie-
Proben als in den Kontroll-Proben aufwiesen. Zur Normalisierung wurden die
Intensitäten der einzelnen Banden in Relation zur Intensität von Apolipoprotein A-I der
gleichen Probe gesetzt. Apolipoprotein A-I fand sich in der Bande bei 26 kDa. Im
4 Ergebnisse
50
Gegensatz zu den Kontrollen erreichten die Präeklampsie-Proben keinen Wert über 0,1.
Für die Kontroll-Proben 23 und 15 wurde ein Wert von 0,137 beziehungsweise 0,118
gemessen. Im Vergleich dazu fielen in der Präeklampsie-Gruppe die Werte mit 0,057
für Patientin 5 und 0,089 für Patientin 7 deutlich niedriger aus.
4 Ergebnisse
51
4.4. Nephelometrische Analyse von Transthyretin
Zur Untermauerung der Hypothese, die Transthyretin-Konzentration falle im Serum von
Frauen mit Präeklampsie niedriger aus als im Serum gesunder Schwangerer, wurden
frische, bisher unbehandelte Serumproben nephelometrisch untersucht. Es zeigte sich,
dass die Konzentration dieses Proteins in der Präeklampsie-Gruppe mit durchschnittlich
0.16 mg/mL (Wertebereich 0,13-0,20 mg/ml; n = 11; SA: 0,03 mg/mL) niedriger war
als bei der Kontroll-Gruppe mit 0,19 mg/ml (Wertebereich 0,14-0,22 mg/ml; n = 13;
SA: 0,02 mg/ml) mit signifikantem Ergebnis (Studentischer T-Test, p=0,03).
Abbildung 16: Box-Whisker-Plots mit Gegenüberstellung der Serumkonzentration von Transthyretin für
die Präeklampsie (PE)- und Kontroll (KO)-Gruppe.
Transthyretin, auch als Thyroxin-bindendes Präalbumin (TBP) bezeichnet, stellt ein
Serum-Transportprotein dar, welches vorrangig in der Leber sowie im Plexus
choroideus des Gehirns synthetisiert wird und am Transport der Schilddrüsenhormone
beteiligt ist. Des Weiteren zählt Transthyretin zu den negativen Akutphaseproteinen,
was bedeutet, dass im Falle eines Traumas, bei Entzündungen oder aber Operationen
Transthyretin in der Leber sowie im Blut herrunterreguliert wird [Dickson et al. 1982].
Außerdem bindet es das sogenannte Retinol-bindende-Protein, möglicherweise um so
einem Verlust dessen über die glomeruläre Filtration der Nieren vorzubeugen [Raz &
Goodman 1969].
4 Ergebnisse
52
4.5. Statistische Poweranalyse
Die statistische Poweranalyse dient der Ermittlung der notwendigen Fallzahl einer
Studie.
Unter Verwendung der Daten aus Messreihe 1 wurde anhand der fünf erstellten Regeln
(siehe Abbildung 11, Kapitel 4.2.2.), je nach überprüften Parameter eine
Stichprobenmenge von n = 6 bis n = 10 Probanden für beide Gruppen berechnet.
Folglich wird die Gruppengröße aus Messreihe 1 als ausreichend für weitere Analysen
angenommen. Eine Übersicht über die Poweranalyse für Messung 1 bietet folgende
Tabelle.
Tabelle 9: Übersicht über die Poweranalyse für Messreihe 1.
5 Diskussion
53
5 Diskussion
Zur Identifizierung einer spezifischen Proteinsignatur für das Krankheitsbild der
Präeklampsie wurden Serumproben von insgesamt 24 schwangeren Frauen
massenspektrometrisch untersucht. Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe der
Massenspektrometrie proteomische Biomarkersignaturen im Serum schwangerer Frauen
zu identifizieren, anhand derer es möglich ist, ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung
einer Präeklampsie frühzeitig zu erkennen.
Letztlich konnte ein spezifisches Proteinmuster dargestellt werden, anhand dessen eine
Differenzierung von Präeklampsie und Kontrolle vorgenommen werden konnte. Das
differentiellste Signal konnte als Transthyretin identifiziert werden. Doch muss die
Methodik der Massenspektrometrie in Bezug auf diese Arbeit auch kritisch betrachtet
werden.
5.1. Diskussion der Methodik und Fehleranalyse
Hinsichtlich der Probenhandhabung müssen der zeitliche Aufwand sowie die
praktischen Fertigkeiten des bearbeitenden Laboranten berücksichtigt werden. Für die
Fraktionierung von vier Serumproben mittels magnetischer Beads wurden im
Durchschnitt 45 Minuten benötigt, für die Proteinseparation mittels fraktionierter
Fällung ist mit einem Zeitaufwand von ca. 40 Minuten je Serumprobe zu rechnen. Für
die Probenpräparation sowie die eigentliche Messung sollten nochmals, abhängig von
der Menge der zu präparierenden Proben, mindestens eine Stunde eingeplant werden.
Insgesamt kann mit einem zeitlichen Aufwand von etwa einem Arbeitstag gerechnet
werden hinsichtlich Probentransfer, Präparation sowie Messung. Auch ist hierbei die
Verfügbarkeit eines entsprechenden Massenspektrometers zu berücksichtigen.
Desweiteren ist eine rasche Weiterverarbeitung der Serumproben nach Entnahme von
entscheidender Bedeutung, so dass eine Schädigung der Probe vermieden wird.
Wie Versuche zeigten, ist eine Präfraktionierung der Serumproben erforderlich, da es
sonst aufgrund der Vielzahl von Proteinen zu einer Signalüberlagerung kommt und
damit eine sinnvolle Auswertung der MS-Spektren nicht möglich ist. Doch ist nicht
auszuschließen, dass durch die Proteinseparation mittels magnetischer Beads des
Profilings-Kits MB HIC8 wesentliche differentielle Proteine verloren gehen.
5 Diskussion
54
Die Probenaufarbeitung sowie die anschließende Matrixpräparation sollten weiterhin
stets mit frischen Ansätzen für Eluat und Matrix erfolgen, da es sonst, wie in dieser
Arbeit (Messreihe 2 und Messreihe 4) gezeigt, zu Messfehlern kommt, die dann
wiederum Ausdruck in Form falsch positiver oder falsch negativer Ergebnisse finden.
Die Aufarbeitung der Serumproben mittels magnetischer Beads ist einfach und auch
ohne spezielle Laborkenntnisse zu bewerkstelligen. Für die fraktionierte Fällung der
Proben ist ein gewisses Maß an Laborerfahrung unabdingbar. Auch in diesem Fall sollte
nach dem Auftauen eingelagert Serumproben auf eine rasche Weiterverarbeitung
geachtet werden, da es bei Zeitverzug ansonsten zu einer Schädigung der Proben
kommen kann.
Wie im Ergebnisteil beschrieben, eignet sich bei der Auswertung der gemessenen
Spektren eine monoparametrische Analyse nicht, da sich je nach Fallanwendung eine
entsprechend hohe Sensitivität bzw. Spezifität zeigt. Es sollte folglich stets der, in dieser
Studie herausgearbeitete, multiparametrische Ansatz zur Bestimmung des Risikos der
Entwicklung einer späteren Präeklampsie herangezogen werden. Hierbei sollte
allerdings die frei gewählte Definition der Schwellenwerte bedacht werden, welche erst
in weiteren Studien durch eine Erhöhung der Fallzahl an Gültigkeit gewinnen kann und
damit den Ansatz einer multiparametrischen Analyse etabliert.
Weiterhin entscheidend für die langfristige klinische Anwendbarkeit dieses Verfahrens
ist der Einsatz qualitativ hochwertiger Probenmaterialen aus gut charakterisiertem
Serum-, Gewebe- und Datenbanken sowie das Einhalten standardisierter
Arbeitsprotokolle.
Nicht zuletzt müssen die Verfügbarkeit eines entsprechend geeigneten
Massenspektrometers und damit verbundene Kosten bedacht werden, wobei diese
Problematik bei erfolgreicher Entwicklung eines Sreening-Testes aktiv angegangen
werden kann.
5 Diskussion
55
5.2. Bedeutung von Transthyretin
Transthyretin (TTR) wurde historisch als Präalbumin beschrieben, da es in der
Serumelektrophorese vor der Albumin-Bande zu finden ist. Seine genaue Funktion ist
bisweilen nicht geklärt, jedoch wird ihm eine Rolle in der Verteilung der
Schilddrüsenhormone zugesprochen.
Kürzlich konnte die Arbeitsgruppe um Gharesi-Fard zeigen, dass die plazentare
Konzentration von Transthyretin bei Frauen mit Präeklampsie höher ausfiel als bei
gesunden Frauen. Auch in diesem Fall wurde ein Zusammenhang mit der Pathogenese
der Präeklampsie gemutmaßt [Gharesi-Fard et al. 2010].
Transthyretin wird bei Frauen in der Schwangerschaft auch von den plazentaren
Trophoblastzellen sezerniert, wo es extrazellulär T4 bindet und so zu einer gesteigerten
Internalisierung des Transthyretin-T4-Komplexes führt. Dies scheint eine wichtige
Rolle für den Transport maternaler Schilddrüsenhormone in den fetalen Kreislauf zu
spielen und ist folglich von entscheidender Bedeutung für die fetale Entwicklung, was
letztlich eine fetale Wachstumsrestriktion zur Folge haben kann [Landers et al. 2009].
Diese wird wiederum häufig im Zusammenhang mit einer Präeklampsie beschrieben
[Zupan-Simunek 2010].
Auch in der Amnionflüssigkeit schwangerer Frauen fanden sich Veränderungen
hinsichtlich der Konzentration von Transthyretin. So wies Vascotto et al. in einer Studie
von 2007 eine bereits im zweiten Trimenon signifikant erhöhte Konzentration von
Transthyretin-Monomeren in der Amnionflüssigkeit schwangerer Frauen nach, welche
später eine Präeklampsie entwickelten. Normalerweise liegt Transthyretin als
Homotetramer vor. Bei den Monomeren handelte es sich um die oxidierte Form des
Transthyretins. Es wurde vermutet, dass letztlich der erhöhte oxidative Stress bei einer
Präeklampsie für die erhöhte Monomer-Konzentration in der Amnionflüssigkeit
verantwortlich ist und folglich Transthyretin als künftiger Marker einer Präeklampsie
vielversprechend sein könnte [Vascotto et al. 2007].
Letztendlich ist die Bedeutung von Transthyretin in der Schwangerschaft und dessen
Zusammenhang mit der Entstehung einer Präeklampsie nicht ausreichend geklärt.
5 Diskussion
56
5.3. Massenspektrometrie in der klinischen Forschung
Die Massenspektrometrie hat sich in den letzten Jahren immer mehr im medizinischen
Alltag etabliert, sei es im Bereich der Forschung oder hinsichtlich verschiedener
Screeningtests. So wird zum Beispiel der Guthrie-Test zum Nachweis einer
pathologischen Phenylalaninerhöhung im Blut im Rahmen des Neugeborenenscreenings
zunehmend durch die Tandemmassenspektrometrie abgelöst, wodurch auch andere
Störungen des Aminosäurestoffwechsels diagnostiziert werden können. Mit dieser
Methode werden letztlich nicht mehr nur einzelne Stoffwechselprodukte, die
sogenannten Metaboliten, und damit einzelne Stoffwechselstörungen gesucht, sondern
es werden vielmehr ganze Gruppen biochemischer Moleküle in einem Analysegang
identifiziert und quantifiziert [Hoffmann & Lindner 2002]. Auch zur Diagnostik einer
Homozystinurie und anderer Hypermethioninämien erwies sich die Tandem-
Massenspektrometrie als geeignet [Chace et al. 1996].
Als diagnostischer Screeningtest und auf der Suche nach krankheitsspezifischen
Biomarkern wurden massenspektrometrische Verfahren unter anderem auch bei der
Endometriose, dem Ovarial- und dem Prostatakarzinom eingesetzt [Wölfler et al. 2009;
Petricoin et al. 2002a; Petricoin et al. 2002b].
Das wissenschaftliche Interesse an prädiktiven Markern für hypertensive
Schwangerschaftserkrankungen ist in den letzten Jahren deutlich gestiegen. So
demonstriert bereits 2005 eine Arbeit von Koy et al., dass die genauere Betrachtung des
Proteoms entscheidend zur Erkennung diagnostischer Marker beitragen kann. Es konnte
gezeigt werden, dass es möglich ist, mit Hilfe der Kryodetektor-Massenspektrometrie
Patientinnen mit HELLP-Syndrom in der Schwangerschaft schnell und verlässlich zu
identifizieren [Koy et al. 2005). In der Folge wurden in diesem charakteristischen
Proteinmuster sechs Proteine massenspektrometrische identifiziert, die einen
signifikanten Unterschied in ihrer Expression beim Vergleich gesunder sowie
pathologisch veränderter Plasmaproben aufwiesen. Als prädiktiver Marker für das
HELLP Syndrom erschien vor allem Serum Amyloid A geeignet [Heitner et al. 2006].
Letztendlich wird deutlich, dass die Methodik der Massenspektrometrie mehr und mehr
Einzug in den medizinischen Alltag findet und ein breites Feld an diagnostischen
Möglichkeiten bietet. Nicht zuletzt könnten weitere Rückschlüsse auf
pathophysiologische Vorgänge hinsichtlich der Entstehung einer Präeklampsie gezogen
werden.
5 Diskussion
57
5.4. Klinische Relevanz dieser Arbeit und Ausblick
Die Ergebnisse dieser Arbeit konnten zeigen, dass eine Differenzierung von
Patientinnen mit Präeklampsie und gesunden Schwangeren mit Hilfe einer spezifischen
Proteinsignatur möglich ist. Doch sind dieser Methodik hinsichtlich ihrer klinischen
Anwendbarkeit Grenzen gesetzt.
Neben Zeitaufwand und Probenhandhabung sollten ebenso die Kosten für Material und
Gerätetechnik dieses Verfahrens bedacht werden, welche im klinischen Alltag
berücksichtigt werden müssen. Doch dürften diese Punkte bei erfolgreicher
Entwicklung eines Screeningtestes für die Präeklampsie in den Hintergrund rücken.
Weiterhin kann die, bei den Patientinnen mit Präeklampsie ermittelte höhere
Transthyretin-Serumkonzentration weitere Hinweise auf die Pathophysiologie dieses
schwangerschaftsinduzierten Krankheitsbildes liefern und so weitere Erkenntnisse
hinsichtlich diagnostischer sowie therapeutischer Möglichkeiten aufzeigen. Bezogen auf
die Arbeit von Landers et al. von 2009 könnte bei Möglichkeit einer plazentaren
Substitution von Transthyretin einer fetalen Wachstumsrestriktion bei Frauen mit
Präeklampsie entgegengewirkt werden.
Zusammenfassend mag dieses Verfahren nicht unmittelbar Anwendung im klinischen
Alltag finden, nicht zuletzt da aufgrund einer zu geringen Fallzahl die Aussagekraft
dieser Daten begrenzt ist. Jedoch birgt die Methodik großes Potential und könnte bei der
Vorhersage der Präeklampsie an Bedeutung gewinnen. In diesem Zusammenhang ist es
wichtig, die hier erhobenen Daten an einer größeren Zahl an Schwangeren
reproduzieren zu lassen.
Weitere zu klärende Fragen sind außerdem: Wie groß ist der Einfluss der vor den
Messungen erforderlichen Proteinseparation auf die Messdaten und ist das Verfahren
auch auf andere Arten der Probenfraktionierung anwendbar? Außerdem von Interesse
ist die Frage nach der Möglichkeit, anhand dieser Methode besonders schwere
Verlaufsformen der Präeklampsie, wie das HELLP-Syndrom vor dessen klinischer
Manifestation zu identifizieren. Letztendlich dürfte sich in Hinblick auf eine valide
Aussage, die Bedeutung dieser Arbeit für andere hypertensive
Schwangerschaftserkrankungen, wie die Gestationshypertonie und die
Propfpräeklampsie nur durch eine multizentrische Studie klären lassen. Eine Folgearbeit
dieser Studie befasste sich bereits eingehender mit dem prädiktiven Potential der hier
ermittelten Proteomsignatur für das Krankheitsbild der „early-onset- Präeklampsie“. Es
5 Diskussion
58
konnte gezeigt werden, dass das MALDI-ToF-MS Serum-Profiling ein robustes
Verfahren zur Klassifikation von Präeklampsie- und Kontroll-Proben ist [Pecks et al.
2010].
Das Fazit dieser Studie ist, dass die Erforschung des Proteoms eine Vielzahl
diagnostischer Möglichkeiten bietet, wobei die Massenspektrometrie ein entscheidendes
Mittel zur Erkennung krankheitsspezifischer Proteincluster darstellt. Das MS-Spektrum
einer Serumprobe ist charakteristisch für die Proteinzusammensetzung einer Probe und
erlaubt somit Rückschlüsse auf das Vorliegen eines entsprechenden Krankheitsbildes.
Dabei dienen neben Blutserum ebenso Blutplasma, Urin, Abstriche sowie verschiedene
Gewebeproben als Untersuchungsmaterial, was wiederum die vielseitige
Anwendbarkeit der Massenspektrometrie demonstriert. Auch lassen sich nicht zuletzt
pathophysiologische Vorgänge erfassen, die bislang nicht bekannt waren.
.
6 Zusammenfassung
59
6 Zusammenfassung
Die Präeklampsie bezeichnet eine hypertensive Erkrankung in der Schwangerschaft,
welche sich normalerweise nach der vollendeten 20. SSW entwickelt [Heilmann et al.
2007]. Sie zählt zu den Hauptursachen für mütterliche sowie kindliche Morbidität und
Mortalität [Lyell et al. 2003]. Die Behandlung dieses Krankheitsbildes, dessen
charakteristische Leitsymptome Proteinurie (> 300 mg/24h), Hypertonie (neu
aufgetreten nach vollendeter 20. SSW) sowie Ödeme sind, liegt derzeit einzig und allein
in der Entbindung des Kindes [Obuchowski & Zhou 2002].
Derzeit existiert noch kein aussagekräftiger Test zur sicheren Früherkennung einer
Präeklampsie [Rath & Fischer 2009]. Eine frühe Erkennung des Risikos für die
Entwicklung einer Präeklampsie könnte eine optimale Betreuung in der
Schwangerschaft sowie die frühzeitige Einleitung entsprechender Maßnahmen bei
auftretenden Komplikationen gewährleisten. Unter diesem Gesichtspunkt wurde für
diese Studie das Serum von 24 schwangeren Frauen massenspektrometrisch untersucht.
Es konnte eine für die Präeklampsie typische Proteomsignatur, bestehend aus sechs
Proteinionensignalen, identifiziert werden, mit Hilfe derer ein multiparametrischer
Auswertungsansatz konstruiert wurde. Dieser erlaubte eine Unterscheidung zwischen
„Präeklampsie“ und „gesunde Schwangere“ nach massenspektrometrischer
Untersuchung individueller Serumproben. Doch sind dieser Methodik hinsichtlich ihrer
klinischen Anwendbarkeit bezüglich Zeitaufwand, Probenhandhabung sowie
Verfügbarkeit eines geeigneten Massenspektrometers Grenzen gesetzt.
Das am stärksten differentielle Ionensignal bei m/z 13.715 konnte als Transthyretin-
zugehörig identifiziert werden. Eine nephelometrische Untersuchung der Serumproben
zeigte, dass Patientinnen mit Präeklampsie eine durchschnittlich niedrigere
Konzentration an Transthyretin im Blut aufweisen als gesunde Schwangere. Dies
könnte weitere Rückschlüsse auf die bislang noch unklare Pathogenese der
Präeklampsie liefern sowie Erkenntnisse hinsichtlich diagnostischer und therapeutischer
Maßnahmen aufzeigen.
Zusammenfassend unterstützen die Ergebnisse dieser Arbeit die Auffassung von der
Präeklampsie als heterogenes Krankheitsbild und zeigen, dass mit Hilfe der
Massenspektrometrie die Identifikation einer für die Präeklampsie typische
Proteomsignatur mittels eines multiparametrischen Auswertungsansatzes möglich ist.
7 Literaturverzeichnis
60
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8 Anhang
I
8 Anhang
8.1. Abbildungsverzeichnis
Abb. 1 Uteroplazentares Gefäßsystem 9
Abb. 2 Arbeitsablauf eines Massenspektrometers 14
Abb. 3 Fraktionierung der Serumproben mittels magnetischer Beads 21
Abb. 4 Reflex III MALDI-ToF-Massenspektrometer 24
Abb. 5 Spektrum einer PE-Probe nach fraktionierter Fällung 32
Abb. 6 Darstellung der Einzelspektren zweier Serumproben 34
Abb. 7 Darstellung der Summenspektren beider Gruppen 36
Abb. 8 Flächenverteilung einzelner Ionensignale (Box-Whisker-Plots) 36
Abb. 9 Räumliche Darstellung Einzelspektren im Koordinatensystem 38
Abb. 10 Einzelspektren der ersten Messung im stack view 41
Abb. 11 Box-Whisker-Plots für die selbst definierten Regeln 43
Abb. 12 Übersicht Auswertung 45
Abb. 13 Darstellung Einzelspektren nach fraktionierter Fällung 46
Abb. 14 SDS-PAGE-Analyse einzelner Serumproben 48
Abb. 15 Spektrum Peptide mass fingerprinting von Transthyretin 49
Abb. 16 Gegenüberstellung der Serumkonzentrationen von Transthyretin 51
8 Anhang
II
8.2. Tabellenverzeichnis
Tab. 1 Klassifizierung hypertensiver Erkrankungen in der SS 4
Tab. 2 Charakterisierung der Schwangeren 31
Tab. 3 Auszug der Peak-Statistik-Tabelle für Messung 1 35
Tab. 4 Ergebnisse für die erste Kombination für Messung 1 bei einer
monoparametrischen Analyse, 1. Ansatz 39
Tab. 5 Ergebnisse einer monoparametrischen Analyse, 2. Ansatz 40
Tab. 6 Übersicht Ionensignale einer multiparametrischen Analyse 42
Tab. 7 Ergebnisse einer multiparametrischen Analyse für Messung 1-4 45
Tab. 8 Ergebnisse einer multiparametrischen Analyse für Messung 5 47
Tab. 9 Übersicht Poweranalyse für Messung 1 52
8 Anhang
III
8.3. Publikationen und Kongressteilnahmen
Pecks U, Seidenspinner F, Röwer C, Coy C, Reimer T, Rath W, Glocker MO.
Multifactorial Analysis of Affinity-Mass Spectrometry Data from Serum Protein
Samples: A Strategy to Distinguish Patients with Preeclampsia from Matching Control
Individuals. J Am Soc Mass Spectrom 2010;21(10):1699-711.
Poster, 43. Tagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie, Halle (D),
2010.
Poster, 58. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe,
München (D), 2010.
8 Anhang
IV
8.4. Danksagung
Hiermit möchte ich mich ganz herzlich bei Prof. Dr. med. W. Rath für die Vergabe des
Promotionsthemas sowie die freundliche Unterstützung bedanken.
Ein besonderer Dank gilt Dr. med. U. Pecks für die intensive und verlässliche
Betreuung dieser Arbeit sowie die Ermöglichung der Publikation. Ebenso danken
möchte ich Herrn Prof. Dr. rer. nat. M. O. Glocker. Vielen Dank für die Unterstützung
während der gesamten Arbeit und die vielen wertvollen Anregungen bei der
Entwicklung der Methodik sowie Auswertungsstrategie. Danke für die intensive
Betreuung während der Durchführung und Auswertung der Experimente sowie bei der
Fertigstellung der Promotion. Danke auch für die Möglichkeit der Vorstellung dieser
Arbeit auf der 43. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Massenspektrometrie.
Ebenso ganz herzlich bedanken, möchte ich mich bei Frau C. Röwer und Herrn T.
Eickner sowie Frau A. Pause und Herrn T. Hartwig, die mir hilfreich zur Seite standen,
mich unterstützten, geduldig meine zahlreichen Fragen beantworteten sowie wertvolle
Anregungen gaben.
Insbesondere danke ich weiterhin Frau M. Sieb für die Einarbeitung und die wertvollen
Hilfestellungen bei der Durchführung und Dokumentation der Experimente. Ich danke
Herrn M. Kreutzer für die Unterstützung bei der Auswertung und Darstellung der
elektronischen Daten. Weiterhin danke ich Frau C. Koy für ihre freundliche
Unterstützung besonders in der Anfangsphase.
Ein besonders lieber Dank gilt meinen Eltern sowie meiner Oma Inge, die mir stets
ermutigend zur Seite standen, mich unterstützten und mir den nötigen Rückhalt gaben.
Ohne sie wäre diese Arbeit nicht möglich gewesen. Danke.
Erklärung § 5 Abs. 1 zur Datenaufbewahrung
Hiermit erkläre ich, dass die dieser Dissertation zu Grunde liegenden Originaldaten bei
mir, Franka Nadine Seidenspinner, Eintrachtstraße 1, 52068 Aachen hinterlegt sind.
Lebenslauf
Persönliche Daten
Geburtsdatum 28.09.1982
Geburtsort Rostock
Staatsangehörigkeit Deutsch
Familienstand Ledig
Arbeit
Seit dem 01.05.2010 Assistenzärztin für Gynäkologie/ Geburtshilfe
Medizinisches Zentrum StädteRegion Aachen GmbH
Studium
15.12.2009 Abschluss des Studiums der Humanmedizin, RWTH
Aachen
18.01.2009 - 31.05.2009 Doktorarbeit am Proteom-Zentrum Rostock
“A Mass Spectrometry-based Multifactorial Analysis
Strategy to Distinguish Patients with Preeclampsia from
Matching Control Individuals”
18.02. 2008 - 18.01.2009 Praktisches Jahr
19. 03.2005 Abschluss der Ärztlichen Vorprüfung
01.10. 2002 Aufnahme des Studiums der Humanmedizin
Praktisches Jahr
01.10.2008 - 18.01.2009 Spital Männedorf (Schweiz), Chirurgische Klinik
09.06.2008 - 28.09.2008 St.-Antonius-Hospital Eschweiler, Klinik für Innere
Medizin
18.02.2008 - 02.06.2008 Universitätsklinikum Aachen, Frauenklinik für
Gynäkologie und Geburtshilfe
Famulaturen
10.09.2007 - 30.09.2007 Anästhesie
Krankenhaus Düren gem. GmbH
01.08.2007 - 02.09.2007 Allgemeinmedizin
Dr. Seidenspinner, Rostock
12.03.2007 - 28.03.2007 Gynäkologie
Universitätsfrauenklinik, Aachen
01.09.2006 - 30.09.2006 Gynäkologie
Universitätsfrauenklinik und Poliklinik, Rostock
02.03.2006 - 19.03.2006 Innere Medizin
Medizinisches Zentrum Kreis Aachen, Würselen
01.09.2005 - 03.10.2005 Allgemeine Chirurgie
Universitätsklinik, Rostock
Schullaufbahn
1993 - 2002 Gymnasium Stefan-Jantzen, Rostock- Lichtenhagen
1989 - 1993 Rudolf- Tarnow- Grundschule, Rostock- Lichtenhagen
Sprachen
Englisch: fließend in Wort und Schrift
Französisch: Grundkenntnisse
Freizeit
Sport (Volleyball, Fitness), lesen, Musik