This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.
Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.
432 K.-D. SCHWENKE
Durch die Aktivitätsabnahme während des Wachs
tums unterscheidet sich das erfaßte Enzym ebenfalls
von der Pyruvat-Decarboxylase des Multienzym-
Komplexes [E.C. 1.2.4.1], deren Aktivität während
des Wachstums konstant bleibt15 oder sogar etwas
ansteigt16. Eine ähnliche Aktivitäts-Abnahme wäh
rend des Wachstums wurde auch beim Pyruvatoxy-
dase- [E.C. 1.2.2.2] und phosphorklastischen System
von E. coli gefunden 15.
Die Beziehungen der Pyruvat-Decarboxylase zur
C-Quelle im Wachstumsmedium lassen sich mit einer
Induktion des Enzyms durch abbaubare Hexosen
bzw. eines ihrer Abbauprodukte erklären. Diese In
duktion erfolgt aber erst, wenn die Bakterien das
Ende ihrer log-Phase erreichen.
15 M. 0. O s t e r u . L. P. H a g e r , Bacteriol. Proc. 1964, 101.
16 U. H e n n in g , C. H e r z u . K. S z o l y v a y , Z. Vererbungsl. 95,
236 [1964],
Über Proteine aus Tumor- und Normalgewebe
7. Zur elektrophoretischen Charakterisierung basischer Proteine in cytoplasmatischen
Säureextrakten aus Rattenhepatom und normaler Rattenleber*
K.-D. S c h w e n k e
Institut für Ernährung der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin,Potsdam-Rehbrücke
(Z. Naturforschg. 24 b, 432— 435 [1969] ; eingegangen am 26. August 1968)
Ungepufferte Lösungen von KC1/KOH eignen sich für die elektrophoretische Trennung säureextrahierter, cytoplasmatisdier Organproteine. M it Hilfe der freien Elektrophorese im System 0,05-m. KC1/K0H wurde der isoelektrische Punkt einer basischen Leberproteinfraktion (h-Protein) bei pH 8,3 —8,4 bestimmt. Diese Fraktion ist in den Extrakten aus Hepatom Berlin und DAENA- Hepatom nur schwach vertreten oder fehlt ganz.
Mit Hilfe der Stärkegel-Elektrophorese in 0,01-ra. HCl wurden die säurelöslichen Cytoplasmaproteine aus Rattenleber und 2 Hepatomen in 5 —6 scharfe Zonen getrennt.
Elektronenphoretische Methoden wurden wieder
holt zu vergleichenden Untersuchungen von Organ
proteinen aus Tumor- und Normalgeweben heran
gezogen 1~i . Dabei konnten charakteristische Unter
schiede besonders bei den basischen Cytoplasmapro
teinen, die durch Säureextraktion angereichert wur
den, festgestellt werden °. Die Verwendung konven
tioneller Puffersysteme zur freien Elektrophorese
der säureextrahierten Proteine ergab zwar eine rela
tiv gute Trennung der Hauptfraktionen, führte aber
zur Ausfällung eines hohen Proteinanteils.
In der vorliegenden Arbeit wird über eine ver
besserte Auftrennung säureextrahierter, cytoplasma-
tischer Proteine aus normaler Rattenleber und zwei
Hepatomen und die Charakterisierung der basischen
Hauptfraktion mit Hilfe der Elektrophorese in un-
gepulferten Elektrolytlösungen berichtet.
1 S. So r o f u. P. P. C o h e n , Cancer Res. 11, 376 [1951].2 S. S o r o f , P. P. C o h e n . E. C. M il l e r u. J. A. M il l e r ,
Cancer Res. 11, 383 [1951].3 K . D. S c h w e n k e , Z. Krebsforsch. 68, 112 [1966].4 K. D. S ch w en ke , R. P la ss u . M . K u ja w a , Z. Krebsforsch.
68. 234 [1966],
Experimenteller Teil
Als Ausgangsmaterial verwendeten wir neben normaler Rattenleber die Tumoren Hepatom Berlin und DAENA 7330, zwei ursprünglich im Institut für Krebsforschung der DAW zu Berlin, Berlin-Buch, aus Buttergelb bzw. Diäthylnitrosamin erzeugte transplantable
Rattenlebercarcinome. Die Aufarbeitung der Gewebe und ihre Fraktionierung wurde nach dem bereits be
schriebenen3’5, jedoch leicht modifizierten Verfahren durchgeführt. Die Gewinnung des hochtourigen Über
standes erfolgte durch 1-stdg. Zentrifugation bei 120 000 g und 0° in der präparativen Ultrazentrifuge
VAC 60 (Fa. Janetzki, Engelsdorf b. Leipzig**), die Säureextraktion mit 0,25-n. H2S04 (Endkonzentration).
Nach Dialyse gegen Wasser und 0,01-n. Essigsäure wurde der Säureextrakt im Rotationsverdampfer bei + 25° eingeengt und gefriergetrocknet. Ausbeute (pro 100 g gewaschenes Gewebe): Leber 400 — 500 mg, Hepatom Berlin 600 — 700 mg, DAENA 500 — 600 mg.
5 K . D. S c h w e n k e u . M. K u ja w a , Z. Naturforschg. 2 2 b, 961 [1967].
* 6. Mitt. s. 1. c. 5.** Für die Möglichkeit zur Benutzung der Ultrazentrifuge
möchte ich Herrn Dr. habil. H. K o b l it z , Institut für Faserstoff-Forschung der DAW zu Berlin in Teltow-Seehof, verbindlichst danken.
PROTEINE AUS TUMOR- UND NORMALGEWEBE 433
Die freie Elektrophorese wurde unter den an anderer Stelle3 beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Dazu wurden 60 mg Säureextrakt in 2 ml 0,01-rc. HCl bzw. bei Trennung im alkalischen Milieu in 0,05-rc. KC1/KOH, pH 9,2, gelöst, gegen die zur Elektrophorese verwendete jeweilige Elektrolytlösung dialysiert und gegebenenfalls klar zentrifugiert. Die Eiweißkonzentration bei der Elektrophorese betrug 0,5 Prozent. Für die Elektrophorese wurden folgende Lösungen verwandt: ungepufferte Salzsäure, pH 1,8 —2,2; 0,02 bis0,05-m. NaCl (bzw. KCl)/HCl, pH 2,2-4,7, und0,05-m. KC1/KOH, pH 7,2-10, nach B a r n e t t und Mitarbeiter 6.
Zur Stärkegelelektrophorese in 0,01-n. HCl nach J o h n s und Mitarbb. 7 verwendeten wir eine vom Institut für Biochemie und Lebensmittelchemie der Technischen Universität Dresden entwickelte, horizontale Mikroelektrophorese-Kammer.
Ergebnisse
Aus Vorversuchen hatte sich vollständige Löslich
keit der Säureextrakte bei pH-Werten < 5 und >8 ,6
und einer Ionenstärke von 0,05 in den verwendeten
ungepufferten Elektrolytlösungen ergeben. Die Lös-
lichkeits-pH-Kurven weisen beim Übergang vom al
kalischen zum sauren Bereich einen ersten Löslich
keitsabfall bei pH 8,6 — 8,3 und einen zweiten, stär
keren Abfall der Löslichkeit bei pH 6,1 — 6,2 auf.
Bei pH-Werten < 5 und >8 ,6 werden also bei der
elektrophoretischen Trennung sämtliche Proteine des
Säureextraktes erfaßt, während außerhalb dieser pH-
Bereiche gewisse Proteine durch Ausfällung dem
elektrophoretischen Nachweis verlorengehen. Freie
Elektrophorese in ungepufferter Salzsäure (pH
1,7 —2,3) lieferte eine Trennung in 2 schnell wan
dernde Hauptkomponenten und 1 — 2 Nebenkompo
nenten und — wie zu erwarten — starke Asymme
trien zwischen den auf- und absteigenden Fronten.
NaCl- oder KCl-Zusatz (bis 0,05-m.) führte zu einer
1 a
1 b
lc
i 6
Abb. 1 Freie Elektrophorese im System 0,05-m. KC1/KOH, pH 9,2, (5 und £ = Puffergradienten, h und i = basische Pro
teine, a = saure Proteine (Globuline, Albumin). a) Säureextrakt Leber, 60 Min., aufsteigend, b) Säureextrakt Hepatom Berlin, 60 Min., aufsteigend, c) Säureextrakt DAENA-Tumor, 50 Min., aufsteigend, d) postribosomaler Uberstand, DAENA-
Tumor, 71 Min., absteigend.
Abb. 2. Freie Elektrophorese eines Leberextraktes, System 0,05-m. KC1/KOH, pH 8,1, absteigend, 50 Min., e = Puffer
gradient, h und i = basische Proteine.
6 C. B. Barnett u. H. B. Bu ll , Arch. Biochem. Biophysics89, 167 [I960],
t t te h i
E. W. Johns , D. M. P. P h illip s , P. Simson u . J. A. v.
B u t le r , Biochem. J. 77, 631 [I960].
434 K.-D. SCHWENKE
mit dem pH und der Ionenstärke zunehmenden An
gleichung beider Fronten und zu einer geringen Ver
besserung der Trennung. Eine bessere Auftrennung
wurde im alkalischen Bereich erzielt. Hier lassen sich
auch charakteristische Unterschiede zwischen den Ex
trakten aus Normalgewebe und Hepatomen nachwei-
sen. Die früher 3’ 4 an den salzextrahierten Gewebe
proteinen gemachte Beobachtung der Verminderung
von Proteinen der h-Fraktionen im Tumorextrakt
wird bestätigt (Abbn. 1 a — c). Infolge der Anreiche
rung der basischen Proteine durch Säureextraktion
des Gewebeextraktes wird der Unterschied zwischen
Tumor- und Normalgewebe aber viel deutlicher.
Tab. 1 zeigt elektrophoretische Beweglichkeit und
u [%]
pH 8,1 Leber h + 2,6 ± 0,1
i + 5,6 ± 0,4
80 ± 6 20 ± 6
pH 9,2 Leber h - 2,2 i 0,06 i + 0,6 ± 0,1
21 ± 44 ± 2
pH 9,2 Hepatom Berlin h - 2,3 ± 0,1
i + 0,6 ± 0,1
3 ± 3 3 ± 2
pH 9,2 DA EN A 7330 h - 2,1 ± 0,2
i + 0,6 ± 0,1
3 ± 3 3 ± 2
Tab. 1. Elektrophoretische Beweglichkeit u (x 103 V 1 sec 1 cm2) und prozentualer Anteil basischer Proteine im Säure-
/ x21/ 5 / — , ' 71— 1
System: 0,05-m. KC1/K0H.
für n
prozentualen Anteil dieser basischen Proteine. Bei
pH 8,1 wandert die basische Hauptfraktion (h) des
Leberextraktes kathodisch (Abb. 2, Tab. 1). Anodisch
wandernde Fraktionen lassen sich nicht nachweisen.
Diese wurden offenbar bei der Dialyse quantitativ
ausgefällt bzw. befinden sich teilweise aggregiert im
e- (Puffer) Gradienten. Aus der Veränderung der elek
trophoretischen Beweglichkeit der basischen Protein-
hauptfraktion ließ sich ihr isoelektrischer Punkt zu
pH 8,3 — 8,4 bestimmen. Eine exaktere Bestimmung
kann erst nach einer Isolierung des Proteins erfol
gen. Dieser Wert stimmt mit dem von K e t t e r e r
und Mitarbb.8 für das isolierte, Azofarbstoff-bin
dende Rattenleberprotein (h-Fraktion) gefundenen
Wert überein. Er steht auch in Übereinstimmung mit
dem Löslichkeitsverhalten und den Titrationskurven
der Säureextrakte.
Neben der h-Fraktion läßt sich in geringem Maße
(2 — 5% des Gesamtextraktes) eine stärker basische,
8 B. K e t t e r e r , P. R o s s-Ma n s e l l u . J . K . W h it e h e a d , Biochem. J. 103, 316 [1967],
bei pH 9,2 kathodisch wandernde Proteinfraktion
(i) durch Extrapolation des Puffergradienten nach
weisen (Abb. 1), die bei pH 8,1 vor der h-Fraktion
erscheint (Abb. 2). Die basischen Proteinfraktionen
des Säureextraktes und des postribosomalen Über
standes vor der Säureextraktion stimmen in ihrem
elektrophoretischen Verhalten überein. Abb. 1 d zeigt
eine ausgeprägte Lücke an der Stelle des h-Proteins
auch bei dem postribosomen DAENA-Überstand.
Die Stärkegel-Elektrophorese in ungepufferter
HCl lieferte eine scharfe Trennung der Säureextrakte
in 5 — 6 Proteinzonen. Die Elektropherogramme der
Hepotomextrakte mit oft diffusen Bandenmustern
weisen dabei eine Lücke an der Stelle der 2. Pro
teinzone auf (Abb. 3).
( - )
( + )
Abb. 3. Schematische Wiedergabe von Elektropherogrammen im Stärkegel, System 0,01-rc. HCl, Laufzeit 120 Min., Auftragstelle, a) Leberextrakt, b) Extrakt Hepatom Berlin,
c) Extrakt DAENA-Tumor.
Diskussion
Die freie Elektrophorese in ungepufferter Lösung
niedriger Ionenstärke (/< = 0,05, pH 8,6 —9,2) er
gibt trotz schlechterer Auftrennung einzelner Pro
teinfraktionen eine weitaus bessere Trennung zwi
schen sauren und basischen Proteinen des Säure
extraktes als die Elektrophorese in konventionellen
Pufferlösungen (z. B. Veronal/Acetat, /t = 0,1, pH
8,6). Die Unterschiede zwischen den in Veronal-
Acetat-Puffer5 erhaltenen und den Elektrophorese
kurven der vorliegenden Arbeit erklären sich nicht
nur durch die veränderten Aufarbeitungsbedingun
gen. Die auffälligen Diskrepanzen zwischen den
Hepatomkurven sind vielmehr auf die Ausfällung
eines hohen Anteils der Hauptfraktionen durch das
Puffersystem zurückzuführen, wodurch sich die Kon
zentrationen der einzelnen Proteine angleichen. Die
PROTEINE AUS TUMOR- UND NORMALGEWEBE 435
Elektrophoresekurven in ungepuffertem Medium ge
ben dagegen die wahren Konzentrationsverhältnisse
im Säureextrakt wieder. Das gleiche elektrophoreti
sche Verhalten der basischen Hauptproteinfraktion
vor und nach der Säureextraktion deutet auf die In
taktheit des säureextrahierten Proteins hin. Danach
könnte die Säureextraktion allgemeinen auch in die
Isolierung basischer Cytoplasmaproteine einbezogen
werden, wobei gleichzeitig störende proteolytische
Aktivitäten zerstört würden. Auf die Schädigung
einiger Proteine durch die Säurebehandlung weist
die Neigung einer sauren Proteinfraktion zur irrever
siblen Denaturierung im schwach sauren Gebiet (pH
5 — 6) hin. Durch das entstehende Gel wurden auch
basische Proteine ausgefällt. Es wäre denkbar, daß
diese Denaturierung durch eine Wechselwirkung zwi-
9 H . B. B u l l u. K. B r e e s e , Arch. Biochem. Biophysics 120, 309 [1967].
10 C h . H e id e l b e r g e r , J. cellular comparat. Physiol. 64, 129[1964],
sehen Proteinen und den Fettsäurekomponenten von
Lipoproteiden des Säureextraktes, entsprechend den
von B u l l und Mitarbb. gemachten Beobachtungen 9,
erfolgt.
Die Abnahme der basischen, Cancerogene binden
den h-Proteine des Normalgewebes im Tumor wurde
bereits an anderer Stelle diskutiert2-5,10. Da sie
wachstumshemmende Eigenschaften besitzen 11, könn
ten sie als „Repressoren“ ein schrankenloses Wachs
tum im Normalgewebe verhindern. Ihr isoelektri
scher Punkt und ihre Aminosäuren-Zusammen-
setzung12 zeigen, daß es sich hierbei nicht um
Histone handelt.
Für gewissenhafte technische Mitarbeit habe ich FrauH. B e y e r und für die Transplantation der Tumoren Frau H. G e r l a c h zu danken.
11 J. J. F r e e d u. S. S o r o f , Biochem. biophysic. Res. Com-mun. 22, 1 [1966].
12 K. D. S c h w e n k e , unveröffentlicht.