This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

432 K.-D. SCHWENKE

Durch die Aktivitätsabnahme während des Wachs­

tums unterscheidet sich das erfaßte Enzym ebenfalls

von der Pyruvat-Decarboxylase des Multienzym-

Komplexes [E.C. 1.2.4.1], deren Aktivität während

des Wachstums konstant bleibt15 oder sogar etwas

ansteigt16. Eine ähnliche Aktivitäts-Abnahme wäh­

rend des Wachstums wurde auch beim Pyruvatoxy-

dase- [E.C. 1.2.2.2] und phosphorklastischen System

von E. coli gefunden 15.

Die Beziehungen der Pyruvat-Decarboxylase zur

C-Quelle im Wachstumsmedium lassen sich mit einer

Induktion des Enzyms durch abbaubare Hexosen

bzw. eines ihrer Abbauprodukte erklären. Diese In ­

duktion erfolgt aber erst, wenn die Bakterien das

Ende ihrer log-Phase erreichen.

15 M. 0. O s t e r u . L. P. H a g e r , Bacteriol. Proc. 1964, 101.

16 U. H e n n in g , C. H e r z u . K. S z o l y v a y , Z. Vererbungsl. 95,

236 [1964],

Über Proteine aus Tumor- und Normalgewebe

7. Zur elektrophoretischen Charakterisierung basischer Proteine in cytoplasmatischen

Säureextrakten aus Rattenhepatom und normaler Rattenleber*

K.-D. S c h w e n k e

Institut für Ernährung der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Berlin,Potsdam-Rehbrücke

(Z. Naturforschg. 24 b, 432— 435 [1969] ; eingegangen am 26. August 1968)

Ungepufferte Lösungen von KC1/KOH eignen sich für die elektrophoretische Trennung säure­extrahierter, cytoplasmatisdier Organproteine. M it Hilfe der freien Elektrophorese im System 0,05-m. KC1/K0H wurde der isoelektrische Punkt einer basischen Leberproteinfraktion (h-Protein) bei pH 8,3 —8,4 bestimmt. Diese Fraktion ist in den Extrakten aus Hepatom Berlin und DAENA- Hepatom nur schwach vertreten oder fehlt ganz.

Mit Hilfe der Stärkegel-Elektrophorese in 0,01-ra. HCl wurden die säurelöslichen Cytoplasma­proteine aus Rattenleber und 2 Hepatomen in 5 —6 scharfe Zonen getrennt.

Elektronenphoretische Methoden wurden wieder­

holt zu vergleichenden Untersuchungen von Organ­

proteinen aus Tumor- und Normalgeweben heran­

gezogen 1~i . Dabei konnten charakteristische Unter­

schiede besonders bei den basischen Cytoplasmapro­

teinen, die durch Säureextraktion angereichert wur­

den, festgestellt werden °. Die Verwendung konven­

tioneller Puffersysteme zur freien Elektrophorese

der säureextrahierten Proteine ergab zwar eine rela­

tiv gute Trennung der Hauptfraktionen, führte aber

zur Ausfällung eines hohen Proteinanteils.

In der vorliegenden Arbeit wird über eine ver­

besserte Auftrennung säureextrahierter, cytoplasma-

tischer Proteine aus normaler Rattenleber und zwei

Hepatomen und die Charakterisierung der basischen

Hauptfraktion mit Hilfe der Elektrophorese in un-

gepulferten Elektrolytlösungen berichtet.

1 S. So r o f u. P. P. C o h e n , Cancer Res. 11, 376 [1951].2 S. S o r o f , P. P. C o h e n . E. C. M il l e r u. J. A. M il l e r ,

Cancer Res. 11, 383 [1951].3 K . D. S c h w e n k e , Z. Krebsforsch. 68, 112 [1966].4 K. D. S ch w en ke , R. P la ss u . M . K u ja w a , Z. Krebsforsch.

68. 234 [1966],

Experimenteller Teil

Als Ausgangsmaterial verwendeten wir neben nor­maler Rattenleber die Tumoren Hepatom Berlin und DAENA 7330, zwei ursprünglich im Institut für Krebs­forschung der DAW zu Berlin, Berlin-Buch, aus Butter­gelb bzw. Diäthylnitrosamin erzeugte transplantable

Rattenlebercarcinome. Die Aufarbeitung der Gewebe und ihre Fraktionierung wurde nach dem bereits be­

schriebenen3’5, jedoch leicht modifizierten Verfahren durchgeführt. Die Gewinnung des hochtourigen Über­

standes erfolgte durch 1-stdg. Zentrifugation bei 120 000 g und 0° in der präparativen Ultrazentrifuge

VAC 60 (Fa. Janetzki, Engelsdorf b. Leipzig**), die Säureextraktion mit 0,25-n. H2S04 (Endkonzentration).

Nach Dialyse gegen Wasser und 0,01-n. Essigsäure wurde der Säureextrakt im Rotationsverdampfer bei + 25° eingeengt und gefriergetrocknet. Ausbeute (pro 100 g gewaschenes Gewebe): Leber 400 — 500 mg, Hepatom Berlin 600 — 700 mg, DAENA 500 — 600 mg.

5 K . D. S c h w e n k e u . M. K u ja w a , Z. Naturforschg. 2 2 b, 961 [1967].

* 6. Mitt. s. 1. c. 5.** Für die Möglichkeit zur Benutzung der Ultrazentrifuge

möchte ich Herrn Dr. habil. H. K o b l it z , Institut für Faser­stoff-Forschung der DAW zu Berlin in Teltow-Seehof, ver­bindlichst danken.

PROTEINE AUS TUMOR- UND NORMALGEWEBE 433

Die freie Elektrophorese wurde unter den an ande­rer Stelle3 beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Dazu wurden 60 mg Säureextrakt in 2 ml 0,01-rc. HCl bzw. bei Trennung im alkalischen Milieu in 0,05-rc. KC1/KOH, pH 9,2, gelöst, gegen die zur Elektropho­rese verwendete jeweilige Elektrolytlösung dialysiert und gegebenenfalls klar zentrifugiert. Die Eiweißkon­zentration bei der Elektrophorese betrug 0,5 Prozent. Für die Elektrophorese wurden folgende Lösungen ver­wandt: ungepufferte Salzsäure, pH 1,8 —2,2; 0,02 bis0,05-m. NaCl (bzw. KCl)/HCl, pH 2,2-4,7, und0,05-m. KC1/KOH, pH 7,2-10, nach B a r n e t t und Mitarbeiter 6.

Zur Stärkegelelektrophorese in 0,01-n. HCl nach J o h n s und Mitarbb. 7 verwendeten wir eine vom Insti­tut für Biochemie und Lebensmittelchemie der Techni­schen Universität Dresden entwickelte, horizontale Mikroelektrophorese-Kammer.

Ergebnisse

Aus Vorversuchen hatte sich vollständige Löslich­

keit der Säureextrakte bei pH-Werten < 5 und >8 ,6

und einer Ionenstärke von 0,05 in den verwendeten

ungepufferten Elektrolytlösungen ergeben. Die Lös-

lichkeits-pH-Kurven weisen beim Übergang vom al­

kalischen zum sauren Bereich einen ersten Löslich­

keitsabfall bei pH 8,6 — 8,3 und einen zweiten, stär­

keren Abfall der Löslichkeit bei pH 6,1 — 6,2 auf.

Bei pH-Werten < 5 und >8 ,6 werden also bei der

elektrophoretischen Trennung sämtliche Proteine des

Säureextraktes erfaßt, während außerhalb dieser pH-

Bereiche gewisse Proteine durch Ausfällung dem

elektrophoretischen Nachweis verlorengehen. Freie

Elektrophorese in ungepufferter Salzsäure (pH

1,7 —2,3) lieferte eine Trennung in 2 schnell wan­

dernde Hauptkomponenten und 1 — 2 Nebenkompo­

nenten und — wie zu erwarten — starke Asymme­

trien zwischen den auf- und absteigenden Fronten.

NaCl- oder KCl-Zusatz (bis 0,05-m.) führte zu einer

1 a

1 b

lc

i 6

Abb. 1 Freie Elektrophorese im System 0,05-m. KC1/KOH, pH 9,2, (5 und £ = Puffergradienten, h und i = basische Pro­

teine, a = saure Proteine (Globuline, Albumin). a) Säure­extrakt Leber, 60 Min., aufsteigend, b) Säureextrakt Hepatom Berlin, 60 Min., aufsteigend, c) Säureextrakt DAENA-Tumor, 50 Min., aufsteigend, d) postribosomaler Uberstand, DAENA-

Tumor, 71 Min., absteigend.

Abb. 2. Freie Elektrophorese eines Leberextraktes, System 0,05-m. KC1/KOH, pH 8,1, absteigend, 50 Min., e = Puffer­

gradient, h und i = basische Proteine.

6 C. B. Barnett u. H. B. Bu ll , Arch. Biochem. Biophysics89, 167 [I960],

t t te h i

E. W. Johns , D. M. P. P h illip s , P. Simson u . J. A. v.

B u t le r , Biochem. J. 77, 631 [I960].

434 K.-D. SCHWENKE

mit dem pH und der Ionenstärke zunehmenden An­

gleichung beider Fronten und zu einer geringen Ver­

besserung der Trennung. Eine bessere Auftrennung

wurde im alkalischen Bereich erzielt. Hier lassen sich

auch charakteristische Unterschiede zwischen den Ex­

trakten aus Normalgewebe und Hepatomen nachwei-

sen. Die früher 3’ 4 an den salzextrahierten Gewebe­

proteinen gemachte Beobachtung der Verminderung

von Proteinen der h-Fraktionen im Tumorextrakt

wird bestätigt (Abbn. 1 a — c). Infolge der Anreiche­

rung der basischen Proteine durch Säureextraktion

des Gewebeextraktes wird der Unterschied zwischen

Tumor- und Normalgewebe aber viel deutlicher.

Tab. 1 zeigt elektrophoretische Beweglichkeit und

u [%]

pH 8,1 Leber h + 2,6 ± 0,1

i + 5,6 ± 0,4

80 ± 6 20 ± 6

pH 9,2 Leber h - 2,2 i 0,06 i + 0,6 ± 0,1

21 ± 44 ± 2

pH 9,2 Hepatom Berlin h - 2,3 ± 0,1

i + 0,6 ± 0,1

3 ± 3 3 ± 2

pH 9,2 DA EN A 7330 h - 2,1 ± 0,2

i + 0,6 ± 0,1

3 ± 3 3 ± 2

Tab. 1. Elektrophoretische Beweglichkeit u (x 103 V 1 sec 1 cm2) und prozentualer Anteil basischer Proteine im Säure-

/ x21/ 5 / — , ' 71— 1

System: 0,05-m. KC1/K0H.

für n

prozentualen Anteil dieser basischen Proteine. Bei

pH 8,1 wandert die basische Hauptfraktion (h) des

Leberextraktes kathodisch (Abb. 2, Tab. 1). Anodisch

wandernde Fraktionen lassen sich nicht nachweisen.

Diese wurden offenbar bei der Dialyse quantitativ

ausgefällt bzw. befinden sich teilweise aggregiert im

e- (Puffer) Gradienten. Aus der Veränderung der elek­

trophoretischen Beweglichkeit der basischen Protein-

hauptfraktion ließ sich ihr isoelektrischer Punkt zu

pH 8,3 — 8,4 bestimmen. Eine exaktere Bestimmung

kann erst nach einer Isolierung des Proteins erfol­

gen. Dieser Wert stimmt mit dem von K e t t e r e r

und Mitarbb.8 für das isolierte, Azofarbstoff-bin­

dende Rattenleberprotein (h-Fraktion) gefundenen

Wert überein. Er steht auch in Übereinstimmung mit

dem Löslichkeitsverhalten und den Titrationskurven

der Säureextrakte.

Neben der h-Fraktion läßt sich in geringem Maße

(2 — 5% des Gesamtextraktes) eine stärker basische,

8 B. K e t t e r e r , P. R o s s-Ma n s e l l u . J . K . W h it e h e a d , Bio­chem. J. 103, 316 [1967],

bei pH 9,2 kathodisch wandernde Proteinfraktion

(i) durch Extrapolation des Puffergradienten nach­

weisen (Abb. 1), die bei pH 8,1 vor der h-Fraktion

erscheint (Abb. 2). Die basischen Proteinfraktionen

des Säureextraktes und des postribosomalen Über­

standes vor der Säureextraktion stimmen in ihrem

elektrophoretischen Verhalten überein. Abb. 1 d zeigt

eine ausgeprägte Lücke an der Stelle des h-Proteins

auch bei dem postribosomen DAENA-Überstand.

Die Stärkegel-Elektrophorese in ungepufferter

HCl lieferte eine scharfe Trennung der Säureextrakte

in 5 — 6 Proteinzonen. Die Elektropherogramme der

Hepotomextrakte mit oft diffusen Bandenmustern

weisen dabei eine Lücke an der Stelle der 2. Pro­

teinzone auf (Abb. 3).

( - )

( + )

Abb. 3. Schematische Wiedergabe von Elektropherogrammen im Stärkegel, System 0,01-rc. HCl, Laufzeit 120 Min., Auf­tragstelle, a) Leberextrakt, b) Extrakt Hepatom Berlin,

c) Extrakt DAENA-Tumor.

Diskussion

Die freie Elektrophorese in ungepufferter Lösung

niedriger Ionenstärke (/< = 0,05, pH 8,6 —9,2) er­

gibt trotz schlechterer Auftrennung einzelner Pro­

teinfraktionen eine weitaus bessere Trennung zwi­

schen sauren und basischen Proteinen des Säure­

extraktes als die Elektrophorese in konventionellen

Pufferlösungen (z. B. Veronal/Acetat, /t = 0,1, pH

8,6). Die Unterschiede zwischen den in Veronal-

Acetat-Puffer5 erhaltenen und den Elektrophorese­

kurven der vorliegenden Arbeit erklären sich nicht

nur durch die veränderten Aufarbeitungsbedingun­

gen. Die auffälligen Diskrepanzen zwischen den

Hepatomkurven sind vielmehr auf die Ausfällung

eines hohen Anteils der Hauptfraktionen durch das

Puffersystem zurückzuführen, wodurch sich die Kon­

zentrationen der einzelnen Proteine angleichen. Die

PROTEINE AUS TUMOR- UND NORMALGEWEBE 435

Elektrophoresekurven in ungepuffertem Medium ge­

ben dagegen die wahren Konzentrationsverhältnisse

im Säureextrakt wieder. Das gleiche elektrophoreti­

sche Verhalten der basischen Hauptproteinfraktion

vor und nach der Säureextraktion deutet auf die In ­

taktheit des säureextrahierten Proteins hin. Danach

könnte die Säureextraktion allgemeinen auch in die

Isolierung basischer Cytoplasmaproteine einbezogen

werden, wobei gleichzeitig störende proteolytische

Aktivitäten zerstört würden. Auf die Schädigung

einiger Proteine durch die Säurebehandlung weist

die Neigung einer sauren Proteinfraktion zur irrever­

siblen Denaturierung im schwach sauren Gebiet (pH

5 — 6) hin. Durch das entstehende Gel wurden auch

basische Proteine ausgefällt. Es wäre denkbar, daß

diese Denaturierung durch eine Wechselwirkung zwi-

9 H . B. B u l l u. K. B r e e s e , Arch. Biochem. Biophysics 120, 309 [1967].

10 C h . H e id e l b e r g e r , J. cellular comparat. Physiol. 64, 129[1964],

sehen Proteinen und den Fettsäurekomponenten von

Lipoproteiden des Säureextraktes, entsprechend den

von B u l l und Mitarbb. gemachten Beobachtungen 9,

erfolgt.

Die Abnahme der basischen, Cancerogene binden­

den h-Proteine des Normalgewebes im Tumor wurde

bereits an anderer Stelle diskutiert2-5,10. Da sie

wachstumshemmende Eigenschaften besitzen 11, könn­

ten sie als „Repressoren“ ein schrankenloses Wachs­

tum im Normalgewebe verhindern. Ihr isoelektri­

scher Punkt und ihre Aminosäuren-Zusammen-

setzung12 zeigen, daß es sich hierbei nicht um

Histone handelt.

Für gewissenhafte technische Mitarbeit habe ich FrauH. B e y e r und für die Transplantation der Tumoren Frau H. G e r l a c h zu danken.

11 J. J. F r e e d u. S. S o r o f , Biochem. biophysic. Res. Com-mun. 22, 1 [1966].

12 K. D. S c h w e n k e , unveröffentlicht.