Inaktivierung des Picornavirus durch Anwendung derActivTek RCI-Technologie

EinleitungDer Virenstamm Picornaviridae, der auch Hepatitis-A beinhaltet, wird charakterisiert als Viren, die nicht umhüllt sind und einzelsträngige, lineare RNA Genome mit positiver Polarität besitzen. Diese gelten als besonders resistent gegen physikalische und chemische Inaktivierung (1). Von Hepatitis-A ist bekannt, dass diese sich vorrangig durch kontaminiertes Trinkwasser und Nahrungsmittel verbreitet. Während eines Ausbruches kann HAV verschiedenste Oberflächen kontaminieren und dort infektiös bleiben. Aufgrund der großen Resistenz sind die üblichen Desinfektionsprozesse bei diesem Virus meist wirkungslos. Strenge Desinfektionsmaßnahmen für betroffene Bereiche in Verbindung mit ebenfalls strengen Hygienevorschriften für die Angestellten werden empfohlen um Ausbrüche von HAV in der Lebensmittelindustrie vorzubeugen.

Das Ziel dieser Studie ist es, die völlige Inaktivierung von HAV zu untersuchen. Dazu wird ein eng verwandtes Enterovirus als Ersatz verwendet, das wir dann der RCI-Zelle von ActivTek aussetzen. Das RCI System ist ein fortschrittliches Oxidationsverfahren, das eine UV-Inaktivierung mit hydroxischen Radikalen kombiniert, so dass es zwischen diesen beiden Inaktivierungsmethoden zu Synergie-Effekten kommt. Die Wirksamkeit dieser Technologie soll geprüft werden durch das Anlegen von getrockneten Kulturen auf Edelstahlträgern. Gleichzeitig wurden Kontrollproben herausgenommen, bevor die Objektträger der RCI-Zelle für verschiedene Zeitspannen ausgesetzt wurden. Nicht behandelte Kontrollproben wurden ebenfalls bewertet, um die Reduzierung des infektiösen Virusbefalls in kontrollierter Umgebung innerhalb einer Spanne von 24 Stunden zu vergleichen. Die Wirksamkeit wurde bestimmt durch die Messung der Verringerung des Virusbefalls. Dazu verwendeten wir Endpunkt-Titration auf Stoffkulturen für behandelte Kulturen im Vergleich zu unbehandelten, positiven Kontrollproben.

Materialien und MethodenViren und Zellen. BEV-2 (ATCC VR-754, Manassas, VA) wurde in Madin Darby Bovine Kidney (MDBK, ATCC CCL-22) Zellen vermehrt. Die MDBK Zellen wurden im Minimalmedium (Eagle) vermehrt mit 2mM L-Glutamin und 2mM Earle’s BBS mit einem angepassten Gehalt von 1,5g/L Natriumbicarbonat, 0,1mM nicht-essentiellen Aminosäuren und 1,0mM Natriumpersulfat mit 7% fötalem Rinderserum, ergänzt durch Antibiotika (2,5mg/L Amphotericin B, 0,67g/L Streptomycin und 0,3g/L Penicillin). Die MDBK Zellen wurden dann mit BEV-2 infiziert ohne den Zusatz von 10% fötalem Rinderserum. Der Grad des Befalls wurde auf Stoffkulturen zugänglich gemacht und wie von Reed und Muench nach TCID50 Methode berechnet.

Virus Inaktivierung. Edelstahlobjektträger vom Typ 302 (McMaster Carr, Atlanta, GA) (2x10cm², Dicke 0,8mm) wurden bei 121°C 15 Minuten lang mit dem Autoklav-Verfahren sterilisiert. In einer Biosicherheitsglas-II-Kammer wurden 100µl BEV-2 auf jeden Träger

verbracht und mit der Spitze einer Pipette verteilt, damit die gesamte Oberfläche bedeckt war. Danach trocknete die Probe ungefähr 20 Minuten lang. Dann wurden die beimpften Träger in einem sterilen Transportbehälter in die Testkabine transportiert. Die Proben wurden in der Testkabine platziert und für 24 Stunden der Behandlung durch die RCI-Zelle ausgesetzt. Als Kontrollproben wurden weitere Testkulturen wie oben beschrieben angelegt und für 24 Stunden in eine Testkabine verbracht ohne der Behandlung durch die RCI-Zelle ausgesetzt zuwerden. Jeweils ein beimpfter Träger wurde vorab aus beiden Testkabinen entfernt um einen Maßstab als Kontrollprobe zu haben. Die RCI-Zelle wurde eingeschaltet und aus beiden Testkabinen wurden nach 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden Proben entnommen. Diese Proben wurden, wie unten beschrieben, auf die Wiedergewinnung der Viren vorbereitet.

Wiedergewinnung der Viren. BEV-2 wurde von der Edelstahloberfläche entfernt, indem der Objektträger in eine sterile 50ml konische Ampulle mit 5ml Infektionsmedium getaucht wurde. Die Röhrchen wurden dann für 1 Minute verwirbelt um den Virus vom Objektträger zu lösen. Die Proben wurden mit einer TCID50 Endpunkt-Titration behandelt indem zusammenfließende MDBK Kavitäten in einem 96-Kavitäten Format zugefügt wurden. Die Platten wurden bei 37°C, 5% CO² für 48 Stunden inkubiert. Für jede Kavität wurde der für BEV-2 typische zytopathische Effekt bestimmt und der Virusbefall wurde als TCID50/ml notiert.

ErgebnisseDie durchschnittliche Menge von BEV-2, die in allen Experimenten von der Edelstahloberfläche gewonnen werden konnte, lag bei 6,00 log¹º TCID50/ml. Nach der Behandlung durch eine RCI-Zelle betrug die durchschnittliche log-Reduzierung von infektiösem BEV-2 Virus 3,87 und 4,87 log¹º TCID50/ml nach 2 und 4 Stunden. Kein infektiöses BEV-2 konnte wieder gewonnen werden nach einer 8, 12 oder 24-stündigen Behandlung durch die RCI-Zelle. Dagegen wurden infektiöse BEV-2 von allen Vergleichs-objektträgern gewonnen, die für 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden in einer Testkabine ohne Behandlung durch die RCI-Zelle aufbewahrt wurden.

Abbildung 1: Infektiöse BEV-2 Viren wieder gewonnen und berechnet in TCID50/ml in MDBK Zellen nach Behandlung mit RCI-Zelle (gelbe Balken) und ohne Behandlung durch RCI-Zelle (blaue Balken) nach 2, 4, 8, 12 und 24 Stunden

Quellenverzeichnis1. Hollinger, F.B., and S.U. Emerson. 2003. Hepatitis A, p. 799-840. In D.M. Knipe and

P.M. Howley (ed.), Fields Virology, Fourth ed, vol. l. Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia

2. Reed, L.J., and H. Muench. 1932. A simple method for estimating 50% endpoints. Am J Hyg 27:493-497