Anne Langenbach: “Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischen Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen”

Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischen

Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen

Masterarbeit von Anne Langenbach

Medizinische Biotechnologie

Eingereicht am 17.01.2012 an der

Medizinischen Fakultät der Universität Rostock

Gutachter: Prof. Joachim Rychly

Zweitgutachter: Dr. Petra Müller

Inhaltsverzeichnis

1

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung .................................................................................................... 4

1.1 Mesenchymale Stammzellen .................................................................... 4

1.1.1 Allgemeiner Überblick ....................................................................... 4

1.1.2 Vorkommen ..................................................................................... 5

1.1.3 Charakterisierung ............................................................................. 6

1.1.4 Therapeutischer Einsatz ..................................................................... 7

1.2 Zytoskelett ............................................................................................. 8

1.3 Aktin ..................................................................................................... 9

1.4 Vinculin ............................................................................................... 11

1.5 Fokaladhäsion und Integrine .................................................................. 11

1.6 Mechanotransduktion ........................................................................... 13

1.7 Inhibitoren ........................................................................................... 14

1.7.1 Latrunculin A .................................................................................. 14

1.7.2 Jasplakinolid .................................................................................. 15

1.7.3 Cytochalasin D .............................................................................. 15

2 Zielstellung ................................................................................................ 16

3 Material und Methoden .............................................................................. 17

3.1 Chemikalien ........................................................................................ 17

3.2 Verbrauchsmaterialien .......................................................................... 18

3.3 Geräte ................................................................................................ 18

3.4 Software ............................................................................................. 18

3.5 Antikörper ........................................................................................... 19

3.6 Kits ..................................................................................................... 19

Inhaltsverzeichnis

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3.7 Zellen ................................................................................................. 19

3.8 Medien für die Zellkultur ....................................................................... 20

3.9 Zellbiologische Methoden ..................................................................... 20

3.9.1 Isolation von hMSZ ......................................................................... 20

3.9.2 Zellen einfrieren und auftauen .......................................................... 21

3.9.3 Mediumwechsel ............................................................................. 21

3.9.4 Zellpassagen ................................................................................. 21

3.9.5 Zellaussaat .................................................................................... 22

3.9.6 Verwendung der Inhibitoren ............................................................ 22

3.9.7 Lichtmikroskopie ............................................................................. 23

3.9.8 Kolorimetrische Assays .................................................................... 23

3.9.9 Immunfluoreszenzfärbung ................................................................ 25

3.9.10 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie ........................................... 25

3.10 Proteinbiochemische Methoden ........................................................... 26

3.10.1 Zelllyse und Probenvorbereitung .................................................... 26

3.10.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ........................... 27

3.10.3 Western Blot und Immundetektion .................................................. 28

3.11 Bio-Plex-Assay ................................................................................... 29

3.12 Mechanische Stimulation .................................................................... 30

3.12.1 Aussaat ...................................................................................... 30

3.12.2 Vorbereitung der Mikrobeads ....................................................... 30

3.12.3 Mechanischer Reiz ...................................................................... 30

3.13 Statistik und Auswertung .................................................................... 31

4 Ergebnisse ................................................................................................. 32

4.1 Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie ............................................ 32

4.2 Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett von hMSZ ......................... 34

Inhaltsverzeichnis

3

4.3 Einfluss der Inhibitoren auf die Stoffwechselaktivität und die Proliferation von

hMSZ 36

4.4 Einfluss der Inhibitoren auf Signalproteine ............................................... 39

5 Diskussion ................................................................................................. 46

6 Zusammenfassung ...................................................................................... 51

7 Literatur ..................................................................................................... 52

8 Abkürzungsverzeichnis ............................................................................... 59

9 Tabellenverzeichnis .................................................................................... 60

10 Abbildungsverzeichnis ............................................................................. 61

12 Erklärung ............................................................................................... 62

1.1 Mesenchymale Stammzellen 1 Einleitung

4

1 Einleitung

1.1 Mesenchymale Stammzellen

1.1.1 Allgemeiner Überblick

Mesenchymale Stammzellen, die auch als multipotente mesenchymale Stromazellen

(MSZ) bezeichnet werden (Horwitz et al., 2005), zählen zu den adulten Stammzellen.

Sie spielen im menschlichen Organismus eine wichtige Rolle bei

Regenerationsprozessen und haben die Aufgabe, Zellen, die durch Alterung, Trauma

oder Krankheit zu Grunde gehen, im Gewebeverband, ersetzen (Caplan und

Goldberg, 1999; Caplan, 2009). Adulte Stammzellen sind undifferenzierte Zellen, die

durch klonale Expansion zur ständigen Selbsterneuerung fähig sind (Pittenger et al.,

1999). Unter Einfluss von spezifischen Stimulatoren, wie beispielsweise spezieller

Wachstumsfaktoren, differenzieren sie in spezialisierte Zellen aus (Bianco und Robey

2001). MSZ differenzieren abhängig von der Art der Stimulation in unterschiedliche

Richtungen. So sind sie in der Lage Osteoblasten, Chondrozyten oder Adipozyten zu

bilden (Pittenger et al., 1999). Entgegen früherer Annahmen ist das

Differenzierungspotential von MSZ jedoch nicht auf Zelllinien des Mesoderms

beschränkt. Es konnte gezeigt werden, dass MSZ in vitro unter anderem zu Zellen mit

neuronalen (Sanchez-Ramos et al., 2000), hepatischen (Weng et al., 2003) und

myokardialen Charakteristika (Toma et al., 2002) differenziert werden können. Durch

diese Erkenntnisse hat sich das Spektrum der möglichen medizinischen

Anwendungsbereiche enorm vergrößert. Obwohl die Richtung der Differenzierung in

vitro beeinflusst werden kann, erhält man lediglich gemischte Zellkulturen, welche in

ihren biochemischen und biomechanischen Eigenschaften nicht vollständig dem

Zielgewebe entsprechen (Tuan, 2006).


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1.1.2 Vorkommen

MSZ kommen neben den hämatopoetischen Stammzellen (HSZ), einer zweiten

Population von adulten Stammzellen, überwiegend im Knochenmark vor (Friedenstein

et al., 1974; Da Silva Meirelles et al., 2008). Dort machen sie 0,001 bis 0,01 % aller

kernhaltigen Zellen aus (Pittenger et al., 1999). Lokalisiert sind die MSZ innerhalb des

Knochenmarks in sogenannten Stammzellnischen. Darunter versteht man eine

Mikroumgebung innerhalb eines Organismus, welche die MSZ umgibt und

Voraussetzung für ihre Existenz ist (Watt und Hogan, 2000; Fuchs et al., 2004).

Gebildet wird die Stammzellnische aus einer Vielfalt komplexer Signale. Zu diesen

zählen lösliche, intrinsische Faktoren, die von den MSZ selbst sezerniert werden, Zell-

Zell-Kontakte und Signale der extrazellulären Matrix (EZM), die sowohl chemischer als

auch mechanischer Natur sein können (Scadden, 2006; Discher et al., 2009; Guilak

et al., 2009). Auf diese Weise bewirkt sie den Ausgleich zwischen Selbsterneuerungs-

und Differenzierungspotential der MSZ und somit die Aufrechterhaltung der

Funktionalität und des Phänotyps.

Zusätzlich konnten MSZ aus einer Vielzahl anderer Gewebe isoliert werden, wie zum

Beispiel dem Fettgewebe (Zuk et al., 2002), der Skelettmuskulatur (Williams et al.,

1999), der Lunge (Fan et al., 2005), der Leber (Campagnoli et al., 2001), der

Kopfhaut (Shih et al., 2005), der Plazenta (In’t Anker et al., 2004) und aus diversen

fetalen Geweben (In’t Anker et al., 2003). Auch wurden MSZ im peripheren Blut

(Kuznetsov et al., 2001), im Nabelschnurblut (Sarugaser et al., 2005) und im

Fruchtwasser (De Coppi et al., 2007) nachgewiesen. Alle diese MSZ weisen

untereinander trotz unterschiedlicher Herkunft große phänotypische Ähnlichkeit auf.

Auf Grund der spindelförmigen Morphologie ähnelt ihr Erscheinungstyp dem der

Fibroblasten.

Das gebräuchlichste Verfahren zur Isolation von MSZ stellt die

Dichtegradientenzentrifugation von Knochenmarkaspiraten dar (Pittenger et al., 1999).

Auf Grund ihrer Eigenschaft auf Plastikoberflächen zu adhärieren, können sie nach

Aufbringen auf Kulturschalen von nicht adhärenten HSZs getrennt werden (Le Blanc

und Pittenger, 2005).


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1.1.3 Charakterisierung

Die direkte Identifizierung und Charakterisierung von Zellen als MSZ gestaltet sich

schwierig. Das liegt daran, dass sie mitunter in sehr geringer Anzahl vorkommen und

es außerdem keinen spezifischen Oberflächenmarker gibt, mit welchem MSZ eindeutig

identifiziert werden können. Aus diesem Grund werden sie durch ihre spindelförmige

Morphologie und Adhäsionsvermögen auf Plastikoberflächen charakterisiert. Weiterhin

sind sie durch ihr enormes Vermögen zur klonalen Expansion in vitro (Gregory et al.,

2005), die Fähigkeit der Differenzierung in osteogene, adipogene und chondrogene

Richtung und einer Kombination verschiedener Oberflächenmarker charakterisiert.

Trotz der Heterogenität unter MSZ verschiedener Herkunft und Funktion weisen die

meisten von ihnen eine Reihe von Oberflächenproteinen wie CD29, CD44, CD73,

CD105, CD106, CD166, stro-1, und HLA- ABC auf. Die Oberflächenmarker CD34,

CD14 und CD45 werden dagegen von keiner MSZ exprimiert. Häufig werden

Kombinationen aus diesen Positiv- und Negativmarkern genutzt, um MSZ zu

identifizieren und zu isolieren (Kolf et al., 2007).

Zusammenfassend hat die International Society for Cellular Therapy (ISCT) folgende

Minimalkriterien zur Definition von MSZ aufgestellt (Dominici et al., 2006).

• MSZ adhärieren unter standardisierten Kulturbedingungen auf Plastikoberflächen

• MSZ sind positiv für die Expression der Oberflächenmarker CD105, CD73 und CD90 und negativ für die Expression der Oberflächenmarker CD45, CD34, CD14 oder CD11b, CD79 oder CD19 und HLA-DR.

• MSZ besitzen osteogenes, adipogenes und chondrogenes Differenzierungspotential in vitro.


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1.1.4 Therapeutischer Einsatz

Auf Grund ihrer spezifischen Eigenschaften, wie dem extensiven Proliferationspotential

und der Fähigkeit in verschiedene Zelltypen zu differenzieren, sind MSZ ein

vielversprechendes Werkzeug in der regenerativen Medizin. MSZ sind vergleichsweise

einfach aus unterschiedlichen Geweben zu isolieren und in vitro bis zur 500fachen

Menge zu expandieren (Gregory et al., 2005). Diese Zellen können anschließend

genutzt werden, um die Regeneration von beschädigtem Gewebe zu fördern (Caplan,

2009). Zur Geweberegeneration tragen zum einen Differenzierungsprozesse und

daraus resultierende Ersatzzellen und zum anderen die Sekretion trophischer Faktoren

bei (Caplan und Dennis, 2006). Diese trophischen Faktoren sind von MSZ sezernierte

lösliche Moleküle, wie Wachstumsfaktoren, Zytokine und Adhäsionsmoleküle, die

entscheidenden Einfluss auf die Regeneration des umliegenden, verletzten Gewebes

haben (Caplan, 2009).

Es konnte gezeigt werden, dass systemisch applizierte MSZ fähig sind in Gewebe und

Organe einzuwandern und sich in diesen über lange Zeiträume stabil anzusiedeln

(Devine und Hoffman, 2000). Auch wurde im Tiermodel beobachtet, dass MSZ auf

diese Weise direkt in verletztes Gewebe von Knochenbrüchen oder Herzinfarkten

migrieren können (Shake et al., 2002). Es bieten sich außerdem viele Möglichkeiten

im Bereich des Tissue Engineering. Es können beispielsweise Gewebekonstrukte

hergestellt werden, in denen in vitro expandierte MSZ enthalten sind. Diese können

dann in einen Patienten eingesetzt werden (Wakitani et al., 1994; Young et al.,

1998).

Da MSZ auch eine immunsuppressive Wirkung haben, besteht die Möglichkeit sie

während der Transplantation von HSZ einzusetzen, um die Gefahr von

Abstoßungsreaktionen zu reduzieren. Außerdem ist es möglich sich diese

immunsuppressiven Eigenschaften bei der Therapie der Graft-versus-Host-Reaktion zu

Nutze zu machen (Le Blanc et al., 2003). Die Kombination aus

Differenzierungspotential und immunsuppressiven Effekten machen MSZ zu idealen

Kandidaten für Zelltransplantationstherapien.

1.2 Zytoskelett 1 Einleitung

8

Ein weiterer Einsatzbereich für die medizinische Verwendung von MSZ ist die

Gentherapie. Genetisch modifizierte MSZ, in welche z. B. therapeutische Gene

transduziert wurden, bieten ein enormes therapeutisches Potential (Prockop et al.,

2003; Niyibizi et al., 2004).

1.2 Zytoskelett

Das Zytoskelett ist ein intrazelluläres Filamentsystem, bestehend aus zahlreichen Faser-

und Regulationsproteinen. Es ist maßgeblich für die Form einer Zelle verantwortlich und

nimmt außerdem Schlüsselpositionen in Bewegungs- und Transportprozessen, sowie in

Zellteilung und Differenzierung ein (Disanza et al., 2005; Lauffenburger und Horwitz,

1996; Welch und Mullins, 2002).

Es besteht hauptsächlich aus drei Fasertypen, den Aktinfilamenten, den Mikrotubuli und

den Intermediärfilamenten. Bei allen dreien handelt es sich um Polymere, die sich in

Netzwerken organisieren. Da sie ständigen Auf- und Abbauprozessen unterlegen sind,

bilden sie dynamische, anpassungsfähige Strukturen aus. Solche Umstrukturierungen

finden meist als Reaktion auf äußere Krafteinwirkungen statt. Die Unterschiede

zwischen den drei Fasertypen liegen in der Polarität, der Steifigkeit, der

Zusammensetzungsdynamik und dem Vorhandensein von Motorproteinen.

Mikrotubuli sind die steifsten der drei Filamenttypen. Sie bilden komplexe, zylindrische

Strukturen, die sich aus α- und β-Tubulin-Heterodimeren zusammensetzen (Bieling et al.,

2007). Aktinfilamente sind flexible, hoch dynamische Mikrofilamente von geringerer

Steifigkeit als Mikrotubuli (dos Remedios et al., 2003). Aktinfilamente sind genau wie

Mikrotubuli polarisierte Polymere, da sie aus asymmetrischen Monomeren

zusammengesetzt sind. Beide Filamenttypen haben spezielle Motorproteine, die unter

ATP-Hydrolyse der Bewegungserzeugung dienen. Sowohl Aktin als auch Mikrotubuli

können durch Polymerisierung bzw. Depolymerisierung Kräfte generieren, die zur

Veränderung der Zellform führen.

Intermediärfilamente weisen die geringste Steifigkeit auf. Ihre Hauptaufgabe besteht

darin das Zytoskelett gegenüber mechanischen Belastungen zu stabilisieren, wobei sie

1.3 Aktin 1 Einleitung

9

Zugkräften effektiver standhalten als Druckbelastung. Im Gegensatz zu Mikrotubuli und

Aktinfilamenten sind die Intermediärfilamente nicht polarisiert, binden keine

Motorproteine und leisten keinen direkten Beitrag zu Bewegungsprozessen (Wiche,

1998).

Neben den Polymeren, die die Netzwerkarchitektur des Zytoskeletts bilden, gibt es

noch eine Vielzahl regulatorischer Proteine, die an diese andocken und diese

kontrollieren. Solche Regulatorproteine werden in verschiedene Klassen unterteilt. Es

gibt sogenannte Nukleationspromotoren, durch welche die Filamentbildung initialisiert

wird. Durch Polymerasen wird das Wachstum der Filamente beschleunigt.

Cappingproteine dagegen führen zum Abbruch des Filamentwachstums. Zusätzlich

gibt es depolymerisierende und abbauende Faktoren. Stabilisiert wird die

Filamentstruktur durch quervernetzende Faktoren und andere Stabilisierungsproteine

(Fletcher und Mullins, 2010).

1.3 Aktin

Die ATPase Aktin ist ein universales Protein, das in allen bekannten Organismen

vorkommt. Es ist eines der am häufigsten in eukaryotischen Zellen vertretenen Proteine

(Dominguez, 2009). Aktin ist ein funktionell vielfältiges Protein. Es ist beteiligt an

zahlreichen Prozessen, unter anderem im Zusammenhang mit Zellmotilität, Zellteilung,

Transportvorgängen, Signaltransduktion und Zellmorphologie. Lokalisiert ist Aktin

sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma. Erstmals wurde Aktin 1859 von Kühne,

einem Physiologen aus Heidelberg, in Muskelzellen von Säugetieren identifiziert

(Kühne, 1859). In den folgenden Jahren wurden viele weitere Isoformen und

Homologe in verschiedensten Zellen, Geweben und letztlich auch in Prokaryoten

identifiziert und charakterisiert. Diese Tatsache lässt auf große funktionelle Vielfalt

dieses Proteins schließen.

Aktin kommt in zwei unterschiedlichen Formen vor: globulär und filamentös. Fibriläres

Aktin (F-Aktin) wird unter physiologischen Bedingungen in einer reversiblen

Polymerisationsreaktion aus globulären Aktinmonomeren (G-Aktin) gebildet (Pantaloni

et al., 2001). Bei G-Aktin handelt es sich um ein Protein, das aus einer einzelnen

1.3 Aktin 1 Einleitung

10

Peptidkette, bestehend aus 275 Aminosäureresten, aufgebaut ist. Es ist ein kleines,

kompakt gefaltetes Protein mit einer Molekülmasse von 43 kDa. G-Aktin besteht aus

zwei etwa gleich großen Hauptdomänen, die sich wiederum in jeweils zwei

Subdomänen unterteilen. Insgesamt setzt sich die Molekülstruktur also aus vier

verschiedenen Domänen zusammen (Schüler, 2001; Aguda et al., 2005). Zwischen

den beiden Hauptdomänen befindet sich eine Spalte. Diese enthält eine Bindungstasche

für kleine Moleküle, wie z. B. Adenosintriphosphat oder Phalloidin. Insgesamt sind heute

mehr als 150 Proteine bekannt, die eine spezifische Bindungsstelle für Aktin besitzen

(dos Remedios et al., 2003). Auf Grund von Interaktionen mit dieser Vielzahl an

unterschiedlichen Liganden ist es möglich, dass ein kleines, kompakt gefaltetes Protein

wie G-Aktin in so vielen physiologischen Prozessen beteiligt ist. Die Bindung eines

Liganden resultiert in einer Änderung der Konformation im Aktinmolekül. Da die

Aktinisoformen in den diversen Geweben unterschiedliche Affinitäten zu gleichen

Liganden aufweisen, können gleiche Liganden abhängig vom Gewebe verschiedene

Reaktionen hervorrufen. Das ist ein Punkt, der die funktionelle Vielfältigkeit von Aktin

erklären kann. Zusätzlich können Aktinmoleküle einer Reihe von posttranslationalen

Modifikationen wie Phosphorylierung, Acetylierung oder Ubiquitinierung unterzogen

werden. Da Aktinmonomere asymmetrisch geformte Proteine sind, besitzen auch

Aktinfilamente strukturelle und kinetische Polarität, d. h. beide Enden weisen

unterschiedliche biochemische Eigenschaften auf. Es gibt ein schnell wachsendes (+)-

Ende und ein langsam wachsendes (-)-Ende (Welch und Mullins, 2002). Ein effektives

Filamentwachstum findet nur am (+)-Ende statt. Ein Faktor, der dieses polarisierte

Wachstum bedingt ist Profilin, ein reichlich vorhandenes Protein, welches

Aktinmonomere bindet und somit deren Assoziation mit dem (-)-Ende verhindert.

Voraussetzung für das Filamentwachstum sind folglich freie (+)-Enden. Diese können

auf drei unterschiedliche Arten generiert werden. Die ersten beiden sind entweder das

Abspalten sogenannter Cappingmoleküle oder das Aufbrechen bereits vorhandener

Filamente. Die dritte Möglichkeit ist die De novo Synthese von F-Aktin aus monomerem

Aktin. Die spontane Polymerisation von G-Aktin zu Filamenten ist allerdings eine sehr

langsame Reaktion, die zusätzlich durch G-Aktin bindende Proteine inhibiert wird.

Damit die Polymerisation überhaupt ablaufen kann, werden sogenannte

1.4 Vinculin 1 Einleitung

11

Nukleationskerne, die aus Dimeren oder Trimeren von G-Aktin bestehen, benötigt. Da

die Bildung solcher Kerne eine thermodynamisch ungünstige Reaktion darstellt, müssen

diese durch Nukleationsfaktoren wie dem Arp2/3-Komplex und dessen Aktivatoren

initialisiert und stabilisiert werden (Disanza et al., 2005). Als Reaktion auf äußere und

innere Einflüsse unterliegt das räumlich und zeitlich eng regulierte Aktinzytoskelett

ständigen Auf-, Ab- und Umbauprozessen. Infolgedessen ist es sehr anpassungsfähig

und besitzt eine hohe Variabilität.

1.4 Vinculin

Vinculin ist ein hochkonserviertes Strukturprotein des Zytoskeletts, das in nahezu allen

tierischen Zellen vorkommt. Als wichtiger struktureller Bestandteil von Zell-Zell- und Zell-

Matrix-Verbindungen bindet Vinculin zytoplasmatische Proteinkomplexe, welche

Mikrofilamente in der Zellmembran verankern (Ziegler et al., 2006). Aufgebaut ist es

aus 1066 Aminosäureresten und besitzt ein Molekulargewicht von 117 kDa. Das

Vinculinmolekül besteht aus einer globulären Kopf- und einer Schwanzdomäne. Beide

Domänen besitzen Bindungsstellen für andere Proteine. So binden an der Kopfdomäne

z. B. Talin und α-Aktinin und an der Schwanzdomäne finden sich Bindungsstellen für

Paxillin, diverse Lipide und F-Aktin (Goldmann und Ingber, 2002). Kopf- und

Schwanzdomäne sind in der Lage einander zu binden und auf diese Weise

Bindungsstellen für verschiedene Liganden zu blockieren. Die Talinbindungsstelle spielt

eine besondere Rolle bei der Aktivierung der Integrine und der Zusammensetzung der

Fokalkontakte, indem sie für die Verknüpfung der β-Integrine mit dem Aktinzytoskelett

zuständig ist (Critchley, 2000; Johnson und Craig, 1994).

1.5 Fokaladhäsion und Integrine

Die zelluläre Adhäsion hat grundlegende Bedeutung für vielzellige Organismen. Sie

sorgt durch mechanische Verknüpfung von Zellen untereinander und mit der EZM für

den Zusammenhalt von Geweben und verleiht diesen so Stabilität und Zugfestigkeit.

Die Vermittlung der Adhäsion erfolgt über spezialisierte Bereiche der Zellmembran, die

1.5 Fokaladhäsion und Integrine 1 Einleitung

12

Fokalkontakte, welche das Zytoskelett über Transmembranproteine mit extrazellulären

Strukturen verbinden.

Fokalkontakte wurden Anfang der 70er Jahre erstmals von Abercrombie in

Fibroblasten entdeckt und als adhäsive Membranbereiche mit Kontakt zum

umliegenden Substrat beschrieben (Abercrombie und Dunn, 1975). Es handelt sich um

multimolekulare Verankerungsstrukturen, die aus mehr als 100 verschiedenen Proteinen

zusammengesetzt sind. Durch diese ist das Aktinzytoskelett mechanisch an die EZM

gekoppelt. Zentraler Bestandteil der Fokaladhäsionen sind Integrine, EZM-bindende

Oberflächenrezeptoren, die in Clustern organisiert und über Adapterproteine wie z. B.

Vinculin und Talin intrazellulär mit den Aktinfilamenten verbunden sind (Horwitz et al.,

1986).

Somit besitzen Integrine als Oberflächenrezeptoren zentrale Funktion bei der Adhäsion

und den damit verbundenen Prozessen. Bei den Integrinrezeptoren handelt es sich um

heterodimere Transmembranproteine, die aus zwei nichtkovalent gebundenen

Untereinheiten, der α- und der β-Kette, bestehen. Zurzeit sind 18 verschiedene α- und

acht β-Ketten bekannt, die durch Dimerisierung 22 unterschiedliche αβ-Heterodimere

bilden können, die zur Integrinfamilie zusammengefasst werden. Jedes der Integrine

bindet an spezifische Liganden. Diese können zum einen Proteine der EZM wie z. B.

Kollagen, Fibrinogen, Fibronektin oder Laminin oder zum anderen

Oberflächenrezeptoren benachbarter Zellen sein. Integrine induzieren nach der

Bindung eines extrazellulären Liganden Signalkaskaden im Zellinneren. Auf Grund der

Integrine, einer Vielzahl assoziierter Kinasen und anderen Signalproteinen sind

Fokalkontakte nicht nur passive, mechanische Verbindungsstrukturen, sondern auch

intensiv an intrazellulären Signaltransduktionswegen beteiligt. Die Art der

Signalweiterleitung ist bidirektional, d. h. sie kann sowohl von außen nach innen

(Outside-In), als auch von innen nach außen (Inside-Out) erfolgen. Auf Grund der

Rezeptoreigenschaften der Fokalkontakte ist es einer Zelle möglich Parameter aus ihrer

Umgebung, wie die Beschaffenheit der Matrix oder den Adhäsionsstatus, zu messen

und ihr Verhalten den Gegebenheiten anzupassen. So können beispielsweise

Differenzierung, Migration, Bewegung, aber auch andere Signal- oder

1.6 Mechanotransduktion 1 Einleitung

13

Stoffwechselwege an die äußeren Bedingungen angepasst werden. Im Vergleich dazu

reagiert die Zelle bei der Inside-Out-Signalweiterleitung auf intrazelluläre Signale, was

in den meisten Fällen zu Konformationsänderungen in extrazellulären Domänen führt

und somit in einer veränderten Affinität zu Liganden resultiert.

1.6 Mechanotransduktion

Integrine sind Rezeptoren, die mechanische Reize in die Zelle übertragen. Dieser

Prozess der Mechanotransduktion beinhaltet die Umwandlung äußerer physikalischer

Kräfte in intrazelluläre biochemische Signale, die dann zu einer adäquaten Zellantwort

führen. Es wird angenommen, dass ein Mechanismus der Mechanotransduktion auf

Konformationsänderungen der Proteine des fokalen Adhäsionskomplexes durch

Zugkräfte beruht. In diesem Zuge werden Bindungsstellen freigelegt, an welche

Liganden binden können, wodurch es dann zur Auslösung intrazellulärer

Signalkaskaden kommt (del Rio et al., 2009). Mechanische Interaktionen von Zellen

mit der umliegenden Matrix sind bidirektional und haben große Bedeutung für die

Regulation vieler zellulärer Prozesse. Die Integrine als transmembrane Rezeptoren sind

für die Mechanorezeption und –transduktion besonders gut geeignet, da sie das

Aktinzytoskelett über assoziierte Proteine direkt an die EZM koppeln. Zugkräfte, die auf

die EZM wirken, können folglich über Integrine auf das Zytoskelett übertragen und in

biochemische Signale umgewandelt werden. Die Zellen sind ihrerseits ebenfalls in der

Lage Kräfte auf umliegende Matrixproteine auszuüben und deren Umorganisierung zu

bewirken (Guilak et al., 2009). Die Elastizität des umliegenden Substrates, welche auf

die Richtung der Differenzierung Einfluss hat, kann von MSZs wahrgenommen werden

(Engler et al., 2006; Winer et al., 2009). Die Zellen reagieren mit einer Veränderung

ihrer Zellform. Das hat wiederum starke Veränderungen der Organisation des

Aktinzytoskeletts zur Folge (Zajac und Discher, 2008). Es konnte bereits gezeigt

werden, dass Zugkräfte an Integrinrezeptoren von Osteoblasten zu einer Anhäufung

von Proteinen der fokalen Adhäsionskomplexe in der unmittelbaren Umgebung des

gereizten Integrins führen. Außerdem kommt es zur Aktivierung der fokalen

Adhäsionskinase (FAK). Dies bewirkt dann weiterhin die Aktivierung von MAP-Kinasen

1.7 Inhibitoren 1 Einleitung

14

z. B. der extrazellulär regulierten Kinasen (ERK) 1 und 2 (Rychly et al., 1998; Schmidt

et al., 1998; Pommerenke et al., 2002).

1.7 Inhibitoren

Das Aktinzytoskelett ist in eine Vielzahl zellulärer Prozesse involviert. Es sind einige

Substanzen bekannt, die diese Prozesse beeinflussen, indem sie die intrazelluläre

Organisation der Aktinfilamente (F-Aktin) verändern und das Aktinzytoskelett damit

häufig zerstören. Solche Substanzen kommen in der zellbiologischen Forschung oft

zum Einsatz. Die destruktiven Wirkmechanismen solcher Substanzen sind sehr

unterschiedlich. So wird z.B. durch Cytochalasine die Elongation von F-Aktin verhindert

(Brown und Spudich, 1979). Latrunculine binden G-Aktin (Coué et al., 1987).

Jasplakinolide führen dagegen durch übersteigerte Polymerisation von F-Aktinen zur

Verfestigung des Zytoskeletts (Yarmola et al., 2000).

1.7.1 Latrunculin A

Latrunculin A ist ein marines Toxin, das von verschiedenen, im Roten Meer

vorkommenden Schwammarten, z. B. Latrunculia magnifica, gebildet wird. Chemisch

handelt es sich um ein bioaktives, makrozyklisches 2-Thiazolidinon mit der

Summenformel C22H31NO5S und einem Molekulargewicht von 421,6 Dalton.

Latrunculin A ist in der Lage G-Aktin mit moderater Affinität zu binden (Andavan und

Lemmens-Gruber, 2010). Diese Bindung erfolgt im stöchiometrischen Verhältnis 1:1

und führt zur Ausbildung stabiler Komplexe aus G-Aktin und Latrunculin A (Spector et

al., 1989). Auf diese Weise inhibiert Latrunculin A die Polymerisierung von G-Aktin zu

F-Aktin sowohl in vitro (Morton et al., 2000; Coué et al., 1987), als auch in vivo

(Spector et al., 1983). Infolge dessen wird die Organisation intrazellulärer

Mikrofilamente blockiert und das Zytoskelett innerhalb kurzer Zeit zerstört.

Latrunculin A beeinträchtigt folglich physiologische Prozesse, die durch Mikrofilamente

reguliert werden. Zu diesen zählen Prozesse der frühen Embryonalentwicklung, der

Fertilisation und der Phagozytose von Immunkomplexen (Ayscough et al., 1997).

1.7 Inhibitoren 1 Einleitung

15

1.7.2 Jasplakinolid

Auch bei Jasplakinolid handelt es sich um ein marines Toxin. Es ist ein aus dem

Meerschwamm Jaspis johnstoni stammendes makrozyklisches Peptid mit einem

Molekulargewicht von 709,7 Dalton und der Summenformel C36H45BrN4O6.

Jasplakinolid besetzt am Aktinmolekül die gleiche Bindungsstelle wie Phalloidin. Es

fördert die Polymerisierung von F-Aktin und führt zur Verfestigung des Zytoskeletts,

indem es durch sogenannte unkontrollierte Nukleation neue Polymerisationsstellen

induziert. Es kommt anstelle von Filamenten zur Bildung von großen Aktinaggregaten

(Scott et al., 1988). Durch diese Stabilisierung können Aktinstressfasern nicht mehr

umgebaut werden, wodurch die Integrität des Zytoskeletts gestört wird (Posey und

Bierer, 1999).

1.7.3 Cytochalasin D

Cytochalasin D ist ein Mykotoxin, das von verschiedenen Pilzen wie z.  B. Zygosporium

mansonii oder Helminththosporium dematiodideum gebildet wird. Auch Cytochalasin

D ist ein makrozyklisches Peptid. Es hat die Summenformel C30H37NO8 und ein

Molekulargewicht von 507,6 Dalton. Cytochalasin D inhibiert die Polymerisation von

Aktin in vitro, indem es mit sehr hoher Affinität an die schnell wachsenden Enden

(‚barbed ends’) von Aktinfilamenten bindet und so die Addition weiterer Monomere

verhindert (Casella et al., 1981; Goddette und Frieden, 1986). Die Bildung und die

Verteilung der Mikrofilamente im Zytoplasma werden folglich durch Cytochalasin D

inhibiert. Außerdem besitzt Cytochalasin D eine antibiotische bzw. antitumorigene

Wirkung und führt zur Erhöhung des intrazellulären Kalziumlevels.

2 Zielstellung

16

2 Zielstellung

Mit dieser Arbeit wird das Ziel verfolgt die Rolle des Aktinzytoskeletts für die

Übertragung mechanischer Kräfte im Zusammenhang mit der funktionellen Steuerung

von mesenchymalen Stammzellen näher zu analysieren. Zu diesem Zweck werden

Integrinrezeptoren mit Hilfe von Magnetpartikeln mechanisch stimuliert. Zusätzlich soll

das Aktinzytoskelett unter dem Einfluss der mechanischen Kräfte mit

depolymerisierenden und polymersierenden Substanzen beeinflusst werden. Die

Beurteilung der Effekte einer solchen Behandlung auf die Signaltransduktion wird über

die Bestimmung der Aktivierung der Signalmoleküle ERK und AKT erfolgen.

3.1 Chemikalien 3 Material und Methoden

17

3 Material und Methoden

3.1 Chemikalien

Die im Folgenden aufgelisteten Chemikalien wurden verwendet.

• Acrylamid (40 %) (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)

• Ammoniumperoxodisulfat (Merck, Darmstadt)

• Antibiotische-antimykotische Lösung (AB/AM) (Invitrogen, Karlsruhe)

• Coomassie-Lösung (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)

• Cryo-SFM (Promocell, Heidelberg)

• Cytochalasin D (CytoD) (Calbiochem, Merck, Darmstadt)

• Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (Invitrogen, Karlsruhe)

• Essigsäure (J.T. Baker, Phillipsburg NJ)

• Fetales Kälberserum (PAN-Biotech, Aidenbach)

• Fluoroshield (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)

• Glycin (Carl Roth, Karlruhe)

• Isopropanol (J.T. Baker, Phillipsburg NJ)

• Jasplakinolide (Jasp) (Calbiochem, Merck, Darmstadt)

• Kristall-Violett (Fluka, Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)

• Ladepuffer (Laemmli, 1970)

• Latrunculin A (LatA) (Calbiochem, Merck, Darmstadt)

• Methanol (Carl Roth, Karlruhe)

• Milchpulver (Carl Roth, Karlruhe)

• Natriumclorid (Carl Roth, Karlruhe)

• Paraformaldehyd (PFA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)

• Phalloidin, Fluorescein Isothiocyanat (FITC) markiert (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)

• Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) (Invitrogen, Karlsruhe)

• Sodium Dodecyl Sulfat (SDS) (Serva, Heidelberg)

• Tetramethylethylendiamin (TEMED) (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)

• Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) (Carl Roth, Karlruhe)

• Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)

• Trypsin/EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)

• Tween20 (GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien)

3.2 Verbrauchsmaterialien 3 Material und Methoden

18

3.2 Verbrauchsmaterialien

Die im Folgenden aufgelisteten Verbrauchsmaterialien wurden verwendet.

• Costar® 96-Well EIA/RIA Stripwell™ Plate (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)

• Criterion Stain Free Gel (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)

• Deckgläser (Menzel GmbH, Braunschweig)

• Dynabeads® M-280 Schaf anti-Maus IgG (Dynal, Hamburg)

• Filterpapier (Whatman, GE Healthcare, Buckinghamshire, Großbritannien)

• Low Protein Binding Tubes (Sarstedt, Nümbrecht)

• Mikrotiterplatten (Greiner Bio-One, Frickenhausen)

• Objektträger (Engelbrecht GmbH, Edermünder)

• Pastikwaren (Greiner Bio-One, Frickenhausen)

• PVDF-Membranen (Roche, Basel)

• Zellkulturflaschen (Greiner Bio-One, Frickenhausen)

3.3 Geräte

Die im Folgenden aufgelisteten Geräte wurden benutzt.

• Anlage zur Erzeugung eines inhomogenen Magnetfeldes für die mechanische Stimulation

• Anthos Reader (Anthos, Krefeld)

• Axiovert 40 C (Zeiss, Jena)

• CASY® Cell Counter (OLS, Bremen)

• Leica TCS SP2 (Leica, Heidelberg)

• Molecular Imager Gel Doc XR System (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)

• Qubit® 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Karlsruhe)

3.4 Software

Die im Folgenden aufgelistete Software wurde verwendet.

• AxioVision (Zeiss, Jena)

• Image Lab (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)

• LAS AF Lite (Leica, Heidelberg)

3.5 Antikörper 3 Material und Methoden

19

• Leica Confocal Software (Leica, Heidelberg)

• Microsoft Excel 2010 (Microsoft, Redmond, USA)

• Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)

• The GIMP (The GIMP Team)

3.5 Antikörper

Die im Folgenden aufgelisteten Antikörper wurden verwendet.

• β1-Integrin Maus-Antikörper (Beckman Coulter, Fullerton, CA)

• Kaninchen anti-Maus IgG-Cy3 (Dianova, Hamburg)

• p44/42 MAPK (ERK 1/2) Kaninchen-Antikörper, polyklonal (Cell Signaling, Boston, MA)

• Schwein anti-Maus IgG/HRP, polyklonal (Dako, Hamburg)

• Schwein anti-Kaninchen IgG/HRP, polyklonal (Dako, Hamburg)

• Vinculin Maus-Antikörper, monoklonal, Clone hVIN-1 (Sigma-Aldrich, St. Louis, Mo)

3.6 Kits

Die im Folgenden aufgelisteten Kits wurden verwendet.

• Bio-PlexTM cell lysis Kit (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)

• Bio-PlexTM Phospho-AKT (S473) Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)

• CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI, USA)

• Qubit® Protein Assay Kit (Invitrogen, Karlsruhe)

• SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce, Rockford, USA)

3.7 Zellen

Alle zellbiologischen Untersuchungen wurden mit humanen mesenchymalen

Stammzellen aus dem Knochenmark (hMSZ) durchgeführt. Als Quelle dienten zum

einen Zellen aus dem Knochenmark von Patienten, die während einer medianen

Sternotomie entnommen wurden, zum anderen kommerzielle hMSZ (Lonza, Basel).

3.8 Medien für die Zellkultur 3 Material und Methoden

20

3.8 Medien für die Zellkultur

Als Expansionsmedium wurde Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) verwendet,

welchem vor dem Gebrauch fetales Kälberserum (FKS) bis zu einer Endkonzentration

von 10 % bzw. 0,5 % und antibiotische-antimykotische Lösung (AB/AM) bis zu einer

Endkonzentration von 1 % steril hinzugegeben wurde.

Als Medium zur Kryokonservierung der hMSZ wurde Cryo-SFM verwendet.

3.9 Zellbiologische Methoden

Die Isolierung und Kultivierung der Zellen wurden unter sterilen Bedingungen unter

einer Sicherheitswerkbank durchgeführt. Alle Inkubationsschritte erfolgten unter

standardisierten Bedingungen bei 37 °C, 5 % CO2 und 95 % Luftfeuchtigkeit in einem

Brutschrank.

3.9.1 Isolation von hMSZ

Die hMSZ wurden aus Knochenmark gewonnen, das Patienten während einer

medianen Sternotomie entnommen wurde (Klinik für Herzchirurgie, Universität

Rostock). Dieses Knochenmark (ca. 6 ml) wurde zur Antikoagulation 1:2 mit PBS/EDTA

verdünnt, sodass das Gesamtvolumen 12 ml betrug. Zur Isolation der mononukleären

Zellen wurde eine Dichtegradientenzentrifugation durchgeführt. Dafür wurden in ein

Falconröhrchen 12 ml Pancoll vorgelegt. Pancoll enthält Ficoll 400, ein stark

verzweigtes Zuckerpolymer aus Saccharose und Epichlorhydrin.

Das vorgelegte Pancoll wurde mit dem verdünnten Knochenmark überschichtet und für

30 min bei 1 800 rpm und Raumtemperatur in einem Swingout-Rotor zentrifugiert.

Nach der Zentrifugation wurde der dabei entstandene, weiße Lymphozytenring

abgenommen und in Hank's Buffered Salt Solution (HBSS) gewaschen. Die Zellen

wurden anschließend in 5 ml DMEM aufgenommen und in T 25 Kulturflaschen

kultiviert. Nach 24 h wurden die nicht-adhärenten Zellen durch Spülen des Zellrasens

3.9 Zellbiologische Methoden 3 Material und Methoden

21

mit HBSS entfernt. Die weitere Kultivierung erfolgte, bis die Zellen zu 80 % konfluent

waren. Danach wurden sie entweder gesplittet oder für weitere Versuche ausgesät.

3.9.2 Zellen einfrieren und auftauen

Damit hMSZ eingefroren werden konnten, wurden diese zuvor mit Hilfe von

Trypsin/EDTA vom Boden der Kulturflasche abgelöst und bei 1 200 rpm für 5 min

sedimentiert. Das entstandene Zellpellet wurde in DMSO-haltigem Medium, Cryo-SFM,

resuspendiert und anschließend in Kryoröhrchen überführt. Bis zur weiteren

Verwendung wurden die Zellen in der Gasphase flüssigen Stickstoffs gelagert.

Um kryokonservierte Zellen erneut in Kultur zu nehmen, wurden diese in DMEM

aufgenommen. Um das zytotoxische DMSO zu entfernen, wurde die Zellsuspension

pelletiert und der Überstand dekantiert. Das Zellpellet wurde in frischem DMEM

resuspendiert und auf Zellkulturflaschen verteilt. Die Kultivierung erfolgte unter

standardisierten Bedingungen im Brutschrank. Nach einem Tag wurden die nicht

adhärenten Zellen entfernt, indem das Medium gewechselt und die Kultivierung

fortgesetzt wurde.

3.9.3 Mediumwechsel

Der Verbrauch von Nährstoffen im Medium ist unter anderem abhängig von der

Stoffwechselaktivität und der Anzahl der Zellen - er geht einher mit einem Absinken des

pH-Wertes. Dieser äußert sich in einem Farbumschlag des Mediums. Um ein

konstantes Milieu und gleiche Bedingungen für die Zellen zu gewährleisten, wurde das

Medium alle zwei bis drei Tage gewechselt.

3.9.4 Zellpassagen

Im Laufe der Kultivierung bildeten die Zellen einen konfluenten Zellrasen aus. Durch die

Konfluenz kommt es einerseits zur Kontakthemmung, wodurch die weitere

Zellproliferation inhibiert wird, andererseits besteht die Gefahr, dass sich der Zellrasen

vom Flaschenboden ablöst, wodurch Zellen verloren gehen. Um nach Erreichen der


22

Konfluenz die weitere Zellvermehrung zu gewährleisten, wurden die Zellen gesplittet.

Hierfür wurden die Zellen nach zweimaligem Waschen mit PBS durch Inkubation mit

Trypsin/EDTA vom Flaschenboden abgelöst und in DMEM resuspendiert.

Anschließend wurde die Zellsuspension in neue Kulturflaschen überführt und die

Kultivierung entsprechend fortgesetzt.

3.9.5 Zellaussaat

Für die folgenden Versuche war die Aussaat definierter Zellzahlen notwendig. Hierfür

wurden die konfluenten Zellen mittels Trypsin/EDTA vom Boden der Kulturflaschen

abgelöst und in Medium resuspendiert. Anschließend wurden die Zellen bei 1 200 rpm

für 5 min pelletiert und in einer definierten Menge Medium aufgenommen. Die

Bestimmung der Zellzahl wurde mit Hilfe des CASY® Cell Counter vorgenommen. Die

für die folgenden Versuche jeweils benötigten Zellkonzentrationen wurden durch

Verdünnung der Zellsuspension mit Medium eingestellt. Die Zellsuspension wurde dann

in die jeweiligen Kulturgefäße mit einer Dichte von 6 000 Zellen pro cm² ausgesät und

für mindestens 24 h inkubiert.

3.9.6 Verwendung der Inhibitoren

Die Inhibitoren Cytochalasin D, Jasplakinolide und Latrunculin A sollten in

Konzentrationen eingesetzt werden, welche die Funktionen des Aktinzytoskeletts

hemmen, aber die Zellvitalität nicht beeinträchtigen. Da jede der drei Substanzen in

DMSO gelöst vorlag, wurde DMSO-haltiges DMEM mit einer Endkonzentration von

0,1 % für alle Experimente als Vehikelkontrolle mitgeführt. Auf diese Weise wurde

sichergestellt, dass beobachtete Effekte allein auf die Inhibitoren und nicht auf ihr

Lösungsmittel zurückzuführen sind. Um herauszufinden, welche

Inhibitorkonzentrationen für die weiteren Experimente geeignet waren, wurden die

Zellen zunächst unter verschiedenen Konzentrationen kultiviert. Zu diesem Zweck

wurde das Zellkulturmedium mit unterschiedlichen Mengen der inhibitorischen

Substanzen versetzt und die Zellen darin suspendiert. Nach 30-minütiger


23

Vorinkubation der Zellen in Suspension, wurden diese in die für die jeweiligen

Versuche benötigten Kulturgefäße ausgesät.

3.9.7 Lichtmikroskopie

Bei der lichtmikroskopischen Betrachtung der Zellen handelt es sich um einen

morphologischen Assay zur Beurteilung der Zellform, der Adhäsion und der Vitalität.

Zu diesem Zweck wurden 20 000 Zellen pro cm² in Petrischalen (d=3,5 cm) ausgesät

und unter verschiedenen Inhibitorkonzentrationen für 24 h inkubiert. Dann wurden die

Zellen im Kulturmedium im Durchlicht lichtmikroskopisch betrachtet und morphologisch

beurteilt. Auffälligkeiten bezüglich Zellform und Zellzahl wurden dokumentiert.

3.9.8 Kolorimetrische Assays

Die kolorimetrischen Assays unter dem Einfluss der Inhibitoren wurden in

Mikrotiterplatten im 96-Well-Format jeweils als Triplettansatz durchgeführt. Dafür

wurden in jedes Well 7 000 Zellen ausgesät und diese dann für 24 h inkubiert.

MTS-Test

Um Rückschlüsse auf die metabolische Aktivität der Zellen unter verschiedenen

Konzentrationen der Inhibitoren zu ziehen, wurde der MTS-Test (Cory et al., 1991)

durchgeführt. Dafür wurde der CellTiter 96® AQueous Non-Radioactive Cell Proliferation

Assay verwendet. Hierbei handelt sich um einen kolorimetrischen Test, der auf der

Aktivität zellulärer Dehydrogenasen basiert, die in metabolisch aktiven Zellen

vorliegen. Der Test enthält 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-

sulfophenyl)-2H-tetrazolium (MTS), ein gelbes, wasserlösliches Tetrazoliumsalz. Dieses

wird durch enzymatische Reduktion in ein oranges Formazan umgewandelt. Dieses

Formazan liegt dann gelöst im Kulturmedium vor und kann durch

Absorptionsmessungen bei einer Wellenlänge von 490 nm quantifiziert werden. Die

Menge des gemessenen Formazans ist proportional zur Stoffwechselaktivität aller

lebenden Zellen in der Kultur.


24

Nach der 24-stündigen Inkubation wurde das Medium aus allen Wells entfernt. In

jedes Well wurden dann jeweils 100 µl frisches DMEM und 20 µl MTS-Reagenz

gegeben. Drei weitere Kontroll-Wells wurden ausschließlich mit DMEM/MTS-Gemisch

gefüllt, um als Leerwert mitgeführt zu werden. Nach einstündiger Inkubation der Zellen

mit dem MTS-Reagenz wurden je 100 µl des Überstandes für die Absorptionsmessung

in eine neue Miktrotiterplatte überführt. Die photometrische Bestimmung der Absorption

wurde mit dem Anthos-Reader bei einer Wellenlänge von 490 nm durchgeführt.

Kristallviolett-Test

Der Kristallviolett-Test wurde im direkten Anschluss an den MTS-Test auf derselben

Mikrotiterplatte durchgeführt. Um die Ergebnisse des MTS-Tests auf die Zellzahl zu

relativieren, wurde der Kristallviolett-Test zur Bestimmung der Anzahl der Zellen

durchgeführt. Hierbei handelt es sich ebenfalls um einen kolorimetrischen Assay, bei

dem über Kristallviolett die DNA angefärbt wird. Durch Solubilisation des Zellrasens ist

es dann möglich, den aufgenommenen Farbstoffs photometrisch zu quantifizieren. Die

gemessene Absorption bei 570 nm ist proportional zur Menge aller adhärenten Zellen

der Kultur.

Alle Wells inklusive der drei Leerwerte wurden zu Beginn zweimal mit PBS gespült.

Anschließend wurden die Zellen für 10 min bei Raumtemperatur mit Isopropanol fixiert

und dann dreimal mit Tween/PBS (0,05 %) gewaschen und permeabilisiert. Zur

Färbung wurden die Zellen dann mit Kristallviolett (0,1 %) bedeckt und für 20 min auf

dem Schüttler inkubiert, damit der Farbstoff optimal in den Zellinnenraum penetrieren

konnte. Im Anschluss wurden die Zellen mehrmals mit destilliertem Wasser gespült, bis

das Kristallviolett vollständig aus dem Überstand entfernt war. Der gefärbte Zellrasen

wurde dann durch Zugabe von Essigsäure (33 %) für 15 min unter Schütteln

solubilisiert. Danach wurden je 70 µl des Überstandes für die Absorptionsmessung in

neue Wells transferiert. Die photometrische Bestimmung der Absorption wurde mit dem

Anthos-Reader bei einer Wellenlänge von 570 nm durchgeführt.


25

3.9.9 Immunfluoreszenzfärbung

Die Immunfluoreszenzfärbung wurde genutzt, um die Art und das Ausmaß des

Zytoskelettumbaus bei hMSZ durch verschiedene Konzentrationen der Substanzen

Cytochalasin D, Latrunculin A und Jasplakinolid zu charakterisieren. Dafür wurden die

Zellen zum einen mit FITC markiertem Phalloidin (1:100) gegen F-Aktin und zum

anderen mit Anti-Vinculin-Antikörpern (1:100) und Cy3-konjugierten

Sekundärantikörpern (1:200) angefärbt.

Die Aussaat der Zellen für die Immunfärbung erfolgte auf Deckgläsern mit einem

Durchmesser von 12 mm. Auf jedes Deckglas wurden ca. 20 000 Zellen ausgesät, die

dann für 24 h inkubiert wurden, damit die Zellen adhärieren konnten. Nach Ende der

Inkubationszeit wurde das Medium abgenommen und die Zellen vorsichtig mit PBS

gewaschen. Zur anschließenden Fixierung wurden die Zellen mit Paraformaldehyd

(PFA) (4 %) überschichtet und für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem

Waschen des Zellrasens mit PBS wurden die Zellen für 10 min mit Triton X-100 (0,1 %)

permeabilisiert, damit die folgenden Antikörper an die entsprechenden intrazellulären

Strukturen binden können. Die Inkubation mit den unterschiedlichen Antikörpern

erfolgte nacheinander für jeweils 30 min, bei Raumtemperatur, im Dunkeln. Um nicht

gebundene Antikörper zu entfernen, wurden die Deckgläser nach jedem

Inkubationsschritt mehrfach mit PBS gespült. Vor dem Einbetten der Präparate wurden

diese abschließend mit destilliertem Wasser gespült, um Kristallisationen zu vermeiden.

Zum Einbetten wurde Fluoroshield, ein kommerzielles, aushärtendes Einbettmedium,

verwendet. Die fertigen Präparate wurden lichtgeschützt bei 4 °C gelagert.

3.9.10 Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie

Die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie (LSM) wurde zur Auswertung der

Immunfluoreszenzfärbungen genutzt. Sie ermöglicht die Aufnahme hochauflösender

Bilder durch punktweises Abrastern von Präparaten mit einem fokussierten Laserstrahl.

Die Fluoreszenz, die durch das Laserlicht hervorgerufen wird, kann entsprechend

punktweise detektiert werden. Informationen über das gesamte Präparat erhält man,

3.10 Proteinbiochemische Methoden 3 Material und Methoden

26

indem der Laserstrahl über die Probe bewegt wird und die emittierte Fluoreszenz vom

jeweiligen Probenort pixelweise detektiert wird. Das konfokale LSM unterscheidet sich

maßgeblich vom gewöhnlichen Lichtmikroskop durch eine konfokale Blende. Diese

befindet sich in der Zwischenbildebene. Am Detektor trifft also nur das Licht auf,

welches diese Blende passiert hat. Der Grad der Konfokalität variiert folglich mit dem

Blendendurchmesser. Je kleiner dieser ist, desto mehr Signale unter- und oberhalb der

Fokusebene werden ausgeblendet. Das konfokale LSM ermöglicht auf diese Weise die

Aufnahme dünner optischer Schnitte aus einem Präparat. Durch digitale Überlagerung

mehrerer solcher Schnitte können sogar dreidimensionale Bilder rekonstruiert werden.

Für Aufnahmen im Rahmen dieser Arbeit wurde das Leica TCS SP2 benutzt, welches

unter anderem einen Argon-Ionen-Laser und einen Helium-Neon-Laser besitzt. Der

Argon-Ionen-Laser emittiert Licht der Wellenlänge 488 nm und wurde zur Anregung

von FITC (λex 495 nm; λem 520 nm), welches an Phalloiden gekoppelt war,

verwendet. Die Cy3-gekoppelten Antikörper (λex 550 nm; λem 570 nm) wurden mit

Licht der Wellenlänge 543 nm durch den Helium-Neon-Laser angeregt. Die

Auswertung der Daten erfolgte mit der Leica Confocal Software und LAS AF Lite.

3.10 Proteinbiochemische Methoden

3.10.1 Zelllyse und Probenvorbereitung

Die Lyse der adhärenten Zellen erfolgte 30 min nach der mechanischen Stimulation.

Sie wurde mit dem Bio-PlexTM Cell Lysis Kit nach Angaben des Herstellers durchgeführt.

Die Zelllysate wurden für mindestens 24 h bei -20 °C gelagert.

Für die Bestimmung der Proteinmenge wurden die Lysate aufgetaut und bei 4 °C und

4 500 x g für 20 min herunterzentrifugiert. Die Überstände wurden in neue Röhrchen

überführt. Die Proteinbestimmung wurde mit dem Qubit® Protein Assay Kit nach

Herstellerprotokoll durchgeführt. Die extrahierten Proteine wurden in Proteinladepuffer

nach Laemmli (1970) aufgenommen. Der Proteinladepuffer enthielt ein


27

Reduktionsmittel. Um die Proteine vollständig zu denaturieren wurden sie für 5 min auf

95 °C erhitzt.

3.10.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die SDS-PAGE wurde zunächst genutzt um die Gleichmäßigkeit des Proteinauftrags mit

Hilfe der Coomassie-Färbung zu bestätigen. Zu diesem Zweck wurden gleiche

Proteinmengen auf ein 10 %iges Polyacrylamid-Gel aufgetragen. Die Auftrennung der

Proteine nach ihrem Molekulargewicht wurde in einer vertikalen Proteingelkammer, die

mit Laufpuffer gefüllt war, bei 180 V durchgeführt. Nach Beenden der Elektrophorese

wurde das Gel aus der Kammer entfernt und für mehrere Stunden mit Coomassie

gefärbt. Die Entfärbung des Gels erfolgte über Nacht. Anhand der Intensität und

Komplexität der Banden konnte der Probenauftrag beurteilt werden.

Um die Proteine weiter im Western Blot zu verwenden, wurde eine weitere SDS-PAGE

durchgeführt. Hierfür wurde das Criterion Precast Gel System verwendet.

Tabelle 1 Zusammensetzung des Sammelgelpuffers (pH 6,8)

Tris 0,5M 6,06  g SDS 138  mM 0,4  g H2O 100  ml

Tabelle 2 Zusammensetzung des Trenngelpuffers

Tris 1,5  M 36,33  g SDS 10 Mm 0,8  g H2O 200  ml

Tabelle 3 Zusammensetzung des Trenngels

H2O 10,9  ml Acrylamid (40  %) 5,5  ml Trenngelpuffer 5,5  ml TEMED 20  µl APS (10  %) 300  µl

Tabelle 4 Zusammensetzung des Sammelgels

H2O 10,2  ml Acrylamid (40  %) 2  ml Sammelgelpuffer 4,2  ml


28

TEMED 20  µl APS (10  %) 200  µl

Tabelle 5 Zusammensetzung des Laufpuffers

H2O 5  l Tris 45,45  g Glycin 211,5  g SDS 15  g

3.10.3 Western Blot und Immundetektion

Der Western Blot wurde als Tank-Blot-Verfahren durchgeführt. Nach der Elektrophorese

wurden die ungefärbten Gele in Transferpuffer bei 370 mA für 1 h auf Membranen aus

Polyvinylidenfluorid (PVDF) transferiert. Im Anschluss wurden die noch freien

Proteinbindungsstellen der Membran mit Proteinen abgesättigt, indem die Membran für

1 h in 5 %iger Blockierungsmilch inkubiert wurde. Die PVDF-Membranen wurden über

Nacht bei 4 °C mit dem Primärantikörper inkubiert. Dieser war im Verhältnis 1:1000

in Blockierungsmilch verdünnt. Danach wurden ungebundene Antikörper durch drei

zehnminütige Waschschritte in Waschpuffer entfernt. Die Inkubation mit dem

Peroxidase gekoppeltem Sekundärantikörper erfolgte für 1 h bei Raumtemperatur.

Dieser lag in einer Verdünnung 1:10 000 in Blockierungsmilch vor. Ungebundene

Antikörper wurden wieder in mehreren Waschschritten entfernt. Danach erfolgte die

Detektion mittels Chemilumineszenz mit dem SuperSignal West Femto Maximum

Sensitivity Substrate. Hierzu wurde die Membran mit der nach Protokoll hergestellten

Detektionslösung in einer lichtdurchlässigen Folie inkubiert. Die Aufnahme des

Chemilumineszenzsignals erfolgte mit dem Molecular Imager Gel Doc XR System. Die

densitometrische Auswertung wurde mit Quantity One® 1-D Analysis und Image Lab™

vorgenommen.

Tabelle 6 Zusammensetzung des Transferpuffers

Transferpuffer H2O 4  l Tris (25  mM) 9  g Glycin (190  mM) 43,5  g Methanol (10  %) 300  ml

3.11 Bio-Plex-Assay 3 Material und Methoden

29

Tabelle 7 Zusammensetzung des Waschpuffers

Waschpuffer (10fach) H2O 4  l NaCl 350  g Tris 48,4  g Tween20 20  ml mit H2O auf 5  l auffüllen mit HCl (37  %) auf pH  7,4 einstellen

3.11 Bio-Plex-Assay

Das Bio-Plex-Verfahren ist eine von der Firma Bio-Rad Laboratories etablierte Methode.

Sie dient der Detektion von Proteinexpressionen und Phosphorylierungen in Zelllysaten

und wird im Format von 96-Well-Mikrotiterplatten durchgeführt. Das Bio-Plex-Verfahren

basiert auf Beads, die in verschiedenen Spektralfarben fluoreszieren. Diese Beads sind

mit Antikörpern gegen verschiedene Zielproteine gekoppelt. Jedem Protein ist hierbei

eine bestimmte Fluoreszenz zugeordnet. Auf diese Weise ist es möglich, verschiedene

Proteine in derselben Probe gleichzeitig differenziert nachzuweisen. Des Weiteren

erfolgt die Detektion über die Bindung eines biotinylierten Sekundärantikörpers, der

gegen ein anderes Epitop des Zielproteins gerichtet ist. An diesen sekundären

Antikörper bindet ein fluoreszierender Streptavidin-Reporter. Der entstandene Komplex

aus Beads, Zielprotein, Antikörpern und Reporter kann mit dem Bio-Plex Array Reader

detektiert werden. Das geschieht über zwei Laser, einen roten und einen grünen. Der

rote Laser ist für die Identifizierung der Proteine über die Farbe der Beads zuständig

und der grüne misst über die Intensität des Reporter Signals die Menge des

gebundenen Zielproteins.

Für diesen Versuch wurde der Bio-PlexTM Phospho-AKT (S473) Assay verwendet. Zuerst

wurden die Beads in die Wells der Multititerplatte gegeben und gewaschen. Im

zweiten Schritt wurden die Zelllysate, die mit dem Bio-PlexTM Cell Lysis Kit vorbereitet

wurden, zu den Beads gegeben und über Nacht inkubiert. Am nächsten Tag wurde

die Platte gewaschen, die Biotin-gekoppelten Sekundärantikörper zu den Proben

gegeben und der Ansatz für 30 min inkubiert. Nach erneutem Waschen der Platte

wurde der fluoreszierende Streptavidin-Reporter hinzugefügt und für 10 min inkubiert.

3.12 Mechanische Stimulation 3 Material und Methoden

30

Abschließend wurde die Assay-Platte noch gespült und die Proben in Assay-Puffer

resuspendiert, um dann mit dem Bio-Plex Array Reader gemessen zu werden.

3.12 Mechanische Stimulation

3.12.1 Aussaat

Die mechanische Stimulation der hMSZ wurde in Mikrotiterplatten im 96-Well-Format

(Costar® 96-Well EIA/RIA Stripwell™ Plate) durchgeführt. Pro Well wurden zwischen

7 000 und 9 000 Zellen ausgesät. Die Zellen wurden 24 h vor mechanischer

Stimulation in serumreduziertem Medium bei 0,5 % FKS kultiviert.

3.12.2 Vorbereitung der Mikrobeads

Um die Integrinrezeptoren mechanisch zu reizen, wurden paramagnetische

Mikrobeads mit Antikörpern gegen die β1-Untereinheit der Integrine beschichtet. Die

Beads haben eine Größe von 2,8 µm und sind mit Schaf anti-Maus Antikörpern

beschichtet. Diese Beads wurden dann mit 1 µg Maus anti-β1-Integrin Antikörpern

schüttelnd für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurden die Beads mit PBS

gewaschen und in DMEM resuspendiert. Die präparierten Beads wurden dann auf die

ausgesäten Zellen gegeben und für 30 min inkubiert. 5 bis 10 Mikrobeads binden

durchschnittlich an β1-Integrin-Untereinheiten an der apikalen Seite einer Zelle.

3.12.3 Mechanischer Reiz

Zur Ausübung der mechanischen Stimulation wurde eine spezielle magnetische Anlage

verwendet. Diese Anlage besteht aus Spulen mit einem Eisenkern und zwei

unterschiedlich geformten Polen, zwischen denen das inhomogene Magnetfeld erzeugt

wird. Der Abstand beider Pole voneinander beträgt 1 cm. Die durchschnittliche Stärke

des erzeugten Magnetfeldes liegt bei 0,015 T (Pommerenke et al., 1996).

3.13 Statistik und Auswertung 3 Material und Methoden

31

Die Kulturwells wurden einzeln zwischen den beiden Polen positioniert. Die Zugkräfte

wurden über die an die Rezeptoren gekoppelten Mikrobeads auf die Zellen ausgeübt.

Sie wirkten in horizontaler Ebene, das heißt parallel zur apikalen Seite der Zellen. Die

Kräfte, die auf einen einzelnen Bead wirken, betragen 2 x 10-10 N. Dadurch, dass jede

Zelle mit einer unterschiedlichen Anzahl Beads, die unterschiedlich lokalisiert waren,

beladen war, variierte die ausgeübte mechanische Belastung von Zelle zu Zelle. Bei

dem für 15 min applizierten Reiz handelte es sich um eine zyklische, mechanische

Belastung mit der Frequenz von 1 Hz. Zum Vergleich wurden Zellen jeweils nur mit

Mikrobeads beladen oder dem Magnetfeld ausgesetzt.

3.13 Statistik und Auswertung

Jeder experimentelle Ansatz wurde insgesamt dreimal, jeweils mit Zellen

unterschiedlicher Präparationen, durchgeführt. Die Auswertung der Messwerte erfolgte

mit Microsoft Excel 2010. Von allen Messwerten für die Absorption wurde der

Leerwert subtrahiert. Um eine Aussage über die spezifische metabolische Aktivität der

Zellen treffen zu können, musste der Quotient aus den Werten des MTS- und des

Kristallviolett-Tests gebildet werden. Anschließend wurden die arithmetischen

Mittelwerte gebildet und die Standardabweichungen bestimmt. Die Ergebnisse wurden

dann auf die entsprechenden Kontrollwerte normiert. Zur weiteren Analyse wurde der

ungepaarte t-Test durchgeführt. Als minimales Signifikanzniveau wurde eine

Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 festgelegt. Für Tendenzen wurde eine

Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,1 angenommen.

Die Auswertung der densitometrischen Daten aus der Western Blot-Analyse und der

Messwerte des Bio-Plex-Assays erfolgte mit Microsoft Excel 2010. Für die Analyse

wurde der ungepaarte t-Test durchgeführt. Als minimales Signifikanzniveau wurde eine

Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 festgelegt. Für Tendenzen wurde eine

Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,1 angenommen. Es wurden der arithmetische

Mittelwert sowie die Standardabweichung angegeben. Wobei die Mittelwerte zuvor

auf die entsprechenden Kontrollen normiert wurden.

4.1 Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie 4 Ergebnisse

32

4 Ergebnisse

4.1 Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie

Um den Einfluss der Substanzen Cytochalasin D, Jasplakinolid und Latrunculin A auf

strukturelle und funktionelle Zellparameter untersuchen zu können, mussten zuvor

geeignete Konzentrationen für deren Einsatz bestimmt werden. Es sollten

Konzentrationen verwendet werden, welche die Zellen in ihrer Vitalität nicht

beeinträchtigen. Zu diesem Zweck wurden hMSZ jeweils mit unterschiedlichen

Konzentrationen der Inhibitoren für 24 h inkubiert, um anschließend lichtmikroskopisch

auf morphologische Veränderungen untersucht zu werden.

Die Kontrollzellen in Abbildung 1A zeigen den für hMSZ typischen, Fibroblast

ähnlichen Erscheinungstyp. Die Zellen sind schlank, langgestreckt und weisen keine

Fortsätze auf. Ein sehr ähnliches morphologisches Erscheinungsbild haben die Zellen,

die als Vehikelkontrolle unter Zusatz von 0,1 % DMSO kultiviert wurden

(Abbildung 1B). Diese Zellen sind ebenfalls spindelförmig, schlank und überwiegend

bipolar. Sie weisen kaum morphologische Unterschiede zu den Kontrollzellen auf.

HMSZ, die mit 0,5 µM Cytochalasin D kultiviert wurden (Abbildung 1C), sind in ihrer

Zellform stark verändert. Die Zellen sind nicht mehr länglich sondern rundlich, einige

weisen kleine, kurze Fortsätze auf. Ein Teil der Zellen ist bereits abgekugelt. Zellen die

mit Jasplakinolid der Konzentration 0,01 µM (Abbildung 1D) kultiviert wurden, zeigen

dagegen nur geringfügige morphologische Veränderungen. Sie sind länglich, ähnlich

wie die Kontrollzellen. Im Vergleich sind sie jedoch etwas bereiter und weisen häufig

Verzweigungen auf. Zellen, die für 24 h mit 0,1 µM Jasplakinolid behandelt wurden,

waren größtenteils abgerundet (Abbildung 1E). Nach 24 h Inkubation mit 0,01 µM

Latrunculin A weisen die Zellen keine wesentlichen Veränderungen in ihrer

Morphologie gegenüber den Kontrollzellen auf (Abbildung 1F). Beim Zehnfachen

dieser Konzentration von Latrunculin A sind die Zellen breiter und zeigen einige

Verzweigungen (Abbildung 1G). Ein Teil der Zellen ist bei dieser Konzentration bereits

4.1 Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie 4 Ergebnisse

33

abgerundet. Abbildung 1H zeigt, dass die meisten Zellen bei einer Konzentration von

0,5 µM Latrunculin A abgerundet sind. Nur vereinzelt sind noch stark verzweigte hMSZ

zu sehen.

Kont

rolle

A: EM B: DMSO

Cyto

D

C: 0,5 µM

Jasp

D: 0,01 µM E: 0,1 µM

LatA

F: 0,01 µM G: 0,1 µM H: 0,5 µM

Abbildung 1 Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie von hMSZ

Lichtmikroskopische Aufnahmen von hMSZ nach 24 h Inkubation mit Cytochalasin D (CytoD) (C), Jasplakinolid

(Jasp) (D, E) und Latrunculin A (LatA) (F, G und H), Kontrolle (EM): ohne Inhibitoren (A), Vehikelkontrolle (DMSO):

ohne Inhibitoren, mit DMSO (B)

4.2 Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett von hMSZ 4 Ergebnisse

34

4.2 Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett von hMSZ

Um Aussagen über den Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett treffen zu

können, wurden die Zellen mit Phalloidin-FITC für F-Aktin und einem Antikörper gegen

Vinculin angefärbt und unter dem Konfokalmikroskop analysiert. Abbildung 2 zeigt die

konfokalmikroskopischen Aufnahmen von hMSZ, die für 24  h mit den inhibitoischen

Substanzen Cytochalasin D, Jasplakinolid und Latrunculin A kultiviert wurden.

Bei den Kontrollzellen sind die Aktinfilamente gleichmäßig im Zytoplasma verteilt

(Abbildung 2A bis 2C), sie zeigen ein intaktes, charakteristisches Aktinzytokelett. Die

Aktinfilamente sind gleichmäßig im Zytoplasma verteilt. Die feinen Fasern sind linear

und verlaufen in gleichgerichteten Bündeln entlang der Zellen. Die Aktinfilamentbündel

enden an Vinculinen. Dort sind Aktin und Vinculin kolokalisiert. Die Vinculine sind

gleichmäßig in der Zelle verteilt.

Die Zellen der Vehikelkontrolle (Abbildung 2D bis 2F) zeigen ebenfalls ein typisches

Aktinzytoskelett, in welchem die Aktinbündel weitgehend parallel entlang der Zelle

verlaufen. An den Enden der Aktinbündel sind die Vinculine lokalisiert, diese sind

auffallend lang und überwiegend randständig gelegen.

Nach 24 h Inkubation mit 0,5 µM Cytochalasin D (Abbildung 2G bis 22I) ist das

Aktinzytoskelett weitgehend zerstört. F-Aktin ist fragmentiert und gleichmäßig im

gesamten Zytoplasma verteilt, filamentöse Strukturen sind nur noch vereinzelt zu

erkennen. An den Enden der unzerstörten Aktinfilamente ist auch in diesem Fall

Vinculin lokalisiert. Der Großteil der Vinculine ist jedoch nicht mit Aktin gekoppelt und

ist diffus im gesamten Zytoplasma verteilt. Randständige Vinculine zeigen überwiegend

kurze, längliche, feine Strukturen, während die übrigen fragmentiert und ohne klare

Struktur sind.

4.2 Einfluss der Inhibitoren auf das Aktinzytoskelett von hMSZ 4 Ergebnisse

35

EM

A

B C

DM

SO

D E F

Cyto

D 0

,5 µ

M G H I

Jasp

0,0

1 µM

J K L

LatA

0,0

1 µM

M N O

LatA

0,1

µM

P Q R

Abbildung 2 Einfluss der Inhibitoren auf das Zytoskelett von hMSZ

Konfokale fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von hMSZ nach Inkubation mit 0,5  µM Cytochalasin  D (G, H und

I), 0,01  µM Jasplakinolid (J, K und L) und 0,01  µM (M, N und O) bzw. 0,1  µM Latrunculin  A (P, Q und R), Kontrolle

(A, B und C): ohne Inhibitoren; Vehikelkontrolle (D, E und F): ohne Inhibitoren, mit DMSO; F-Aktin (grün) und

Vinculin (rot).

4.3 Einfluss der Inhibitoren auf die Stoffwechselaktivität und die Proliferation von hMSZ 4 Ergebnisse

36

In Zellen, die mit 0,01 µM Jasplakinolid (Abbildung 2J bis 2L) inkubiert wurden, sind

die Aktinfilamente verdickt und ungleichmäßig im Zytoplasma verteilt. Die F-Aktin-

Aggregate sind um den Zellkern herum lokalisiert, von dort aus verlaufen sie

strahlenförmig, in stärkeren Bündeln zu den kleinen Fortsätzen, die sich am Zellrand

ausgebildet haben. Dort enden die Aktinbündel in Vinculinen, welche hauptsächlich

randständig lokalisiert sind und in den Fortsätzen gehäuft vorliegen.

Die Abbildungen 2M bis 2R zeigen Zellen, die mit Latrunculin A kultiviert wurden. Bei

einer Konzentration von 0,01 µM Latrunculin A (Abbildung 2M bis 2O) sind die F-

Aktinfilamente leicht gewellt und wirken teilweise verklebt. Die Vinculine, die mit den

Aktinfilamentenden kolokalisiert sind, befinden sich größtenteils am Rand der Zelle. Bei

einer Konzentration von 0,1 µM Latrunculin A (Abbildung 2P bis 2R) sind die

Aktinfilamente stärker gewellt und unregelmäßig im Zytoplasma verteilt, sodass dass

Aktinzytoskelett vereinzelt Löcher zum Zellrand hin aufweist, die Vinculine sind hier

vermehrt im Zentrum der Zelle lokalisiert.

4.3 Einfluss der Inhibitoren auf die Stoffwechselaktivität und die

Proliferation von hMSZ

Um die Stoffwechselaktivität und das Proliferationsvermögen der hMSZ unter dem

Einfluss der drei unterschiedlichen Inhibitoren bestimmen zu können, wurden die Zellen

nach 24-stündiger Inkubation mittels MTS-Test basierend auf zellulären

Dehydrogenaseaktivitäten kolorimetrisch analysiert. Der Kristallviolett-Test diente als

weiterer kolorimetrischer Test zur Bestimmung des Proliferationsvermögens bzw. der

Zahl der lebenden Zellen. Der Farbstoff Kristallviolett färbt die DNS adhärenter Zellen

an.

Die Resultate beider Assays sind in Abbildung 3 dargestellt. Die Werte der

Kontrollzellen sind jeweils auf 100 Prozent gesetzt und dienen als Referenzwerte, alle

anderen Messwerte sind auf diese Referenzwerte normiert.

Die Ergebnisse der Analyse der metabolischen Aktivität, die nach Inkubation mit den

Inhibitoren erhalten wurden, sind in Abbildung 3A dargestellt. Die Absorptionswerte


37

die unter Einfluss von DMSO erhalten wurden, dienen als Vehikelkontrolle und

unterscheiden sich nicht signifikant vom Referenzwert. Die Analysenwerte der Zellen,

die unter 0,5 µM Cytochalasin D, 0,01 µM bzw. 0,1 µM Latrunculin A und 0,01 µM

Jasplakinolid erhalten wurden, zeigen keine signifikanten Unterschiede zu denen der

Kontrollzellen. Zellen, die mit 1,0 µm Latrunculin A und 0,1 µM Jasplakinolid inkubiert

wurden, weisen um 50 Prozent signifikant reduzierte Stoffwechselaktivitäten auf. Beim

Wert für 1,0 µM Jasplakinolid ist keine Standardabweichung angegeben, da es sich

um eine Einzelmessung handelt. Dieser Wert ist deshalb eher als Trend zu betrachten.

Abbildung 3B zeigt die Resultate der Analyse des Proliferationsvermögens. Die

Messwerte der Vehikelkontrolle unterscheiden sich unwesentlich vom Kontrollwert. Die

Analysewerte der Zellen, die unter 0,5 µM Cytocalasin D, 0,01 µM bzw. 0,1 µM

Latrunculin A und 0,01 µM Jasplakinolid erhalten wurden, zeigen ebenfalls keine

signifikanten Unterschiede zu denen der Kontrollzellen. Bei einer Konzentration von

1,0 µM Latrunculin A ist die Proliferation signifikant um mehr als die Hälfte verringert.

Die Verwendung von 0,1 µM Jasplakinolid zeigt ein signifikantes Absinken der

Proliferation gegenüber der Vehikelkontrolle auf um 20 Prozent. Beim Wert für 1,0 µM

Latrunculin A ist keine Standardabweichung angegeben, da es sich um eine

Einzelmessung handelt. Dieser Wert ist deshalb eher als Trend zu betrachten.

Um eine Aussage über die Intensität der Stoffwechselaktivität pro Zelle treffen zu

können, wurde der Quotient aus den Absorbtionswerten des MTS- und des

Kristallviolett-Tests gebildet. Das Ergebnis ist in Abbildung 3C dargestellt. Der Wert der

Kontrolle ist auch hier auf 100 Prozent gesetzt worden, wobei die übrigen Werte auf

diesen normiert sind. Keiner der Werte zeigt einen signifikanten Unterschied zur

Kontrolle, was darauf schließen lässt, dass die Zellen durch die Inhibitoren eine

verminderte Proliferation aufweisen. Die Stoffwechselaktivität der einzelnen Zelle unter

den Inhibitoren bleibt dagegen weitgehend unbeeinflusst.


38

Abbildung 3 Einfluss der Inhibitoren auf die metabolische Aktivität und die Proliferation von hMSZ A: MTS-Test (metabolische Aktivität) und B: Kristallviolett-Test (Proliferation) nach 24 h Inkubation mit unterschiedlichen

Konzentrationen der Inhibitoren Cytochalasin D (CytoD), Jasplakinolid (Jasp) und Latrunculin A (LatA), Kontrolle: ohne Inhibitoren

(EM) bzw. mit DMSO; C: Quotient MTS/KV (metabolische Aktivität pro Zelle); Alle Werte wurden auf die Kontrolle normiert,

dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung, eckige Klammern zeigen signifikante Unterschiede (**p ≤ 0,05; n=3).

0

100

200

EM DMSO 0,5 µM 0,01 µM 0,1 µm 1 µM 0,01 µM 0,1 µM 1 µM

rel.

Abs

orpt

ion

bei 4

90 n

m in

%

Kontrolle CytoD LatA Jasp

A

** **

0

100

200


rel.

Abs

orpt

ion

bei 5

70 n

m in

%


B

** **

0

100

200

300


rel.

met

. Akt

ivitä

t pro

Zel

le in

%


C

4.4 Einfluss der Inhibitoren auf Signalproteine 4 Ergebnisse

39

4.4 Einfluss der Inhibitoren auf Signalproteine

Um den Einfluss der Inhibitoren Cytochalasin D, Jasplakinolid und Latrunculin A auf die

Aktivierung der Signalproteine ERK und AKT in Zellen nach mechanischer Stimulation

der β1-Integrin-Untereinheit zu untersuchen, wurde das Western Blot Verfahren bzw.

der Bio-Plex Assay durchgeführt. Alle Zelllysate wurden zum einen auf die Expression

von ERK1/2 und Phospho-ERK1/2 und zum anderen auf die Expression von AKT und

Phospho-AKT untersucht.

Um auszuschließen, dass DMSO, als Lösungsmittel der Inhibitoren, einen Einfluss auf

die Aktivierung der Signalproteine ERK und AKT ausübt, wurden Zellen, die in reinem

EM mechanisch stimuliert wurden, mit Zellen, die in DMSO-haltigem Erhaltungsmedium

mechanisch stimuliert wurden, miteinander verglichen (Abbildung 4). Die Western Blot

Analyse von Phospho-ERK1/2 (Abbildung 4A) zeigt deutlich intensivere Banden

sowohl bei mechanisch stimulierten Kontrollzellen in Erhaltungsmedium als auch bei

denen der Vehikelkontrolle mit DMSO. Clustern der Integrinrezeptoren durch

Inkubation mit den Beads induzierte bereits eine Aktivierung von ERK1/2 im Vergleich

zu Kontrollzellen. Die Aktivierung ist aber geringer als nach mechanischer Belastung

der Integrine durch Zugkräfte. Die densitometrische Auswertung der Western Blot

Analyse (Abbildung 4B) konnte diese Aussagen durch objekte Messswerte bestätigen

und signifikante Unterschiede zwischen Clustern der Rezeptoren und mechanischer

Belastung nachweisen. In beiden Fällen war der Effekt gegenüber den Kontrollzellen

signifikant erhöht.

Die Werte der Vehikelkontrolle zeigen keine signifikanten Unterschiede zu den

entsprechenden Werten der Kontrollzellen in reinem EM. Die Ergebnisse der Bio-Plex

Analyse für die Phosphorylierung von AKT (Abbildung 4C) zeigen ein ähnliches Bild.

Die geclusterten und die mechanisch stimulierten Zellen zeigen beide eine signifikant

erhöhte Signalintensität im Vergleich zur Kontrolle. Die Intensitäten der entsprechenden

Proben, die in reinem EM und unter DMSO erhalten wurden, zeigen keine

signifikanten Unterschiede zueinander. Auf Grund dieser Ergebnisse werden alle


40

Werte der folgenden Untersuchungen mit den Inhibitoren auf die Resultate bezogen,

die unter Behandlung mit DMSO erhalten wurden.

Um herauszufinden, welchen Einfluss die Inhibitoren auf die Phosphorylierung von ERK

und AKT nach mechanischer Stimulation haben, wurde Zellen 24 h vor und auch

während der mechanischen Stimulation mit den entsprechenden Inhibitoren inkubiert.

Nach Behandlung mit 0,5 µM Cytochalasin D ist im Western Blot (Abbildung 5A) die

Aktivierung von ERK sowohl durch Clustern der Integrine als auch nach mechanischer

Stimulation deutlich zu sehen. Dieses Ergebnis wird durch die densitometrische

Auswertung (Abbildung 5B) bestätigt.

Im Falle von AKT (Abbildung 5C) konnte ebenfalls eine Aktivierung nach Clustern der

Integrine gezeigt werden. Für mechanisch stimulierte Zellen dagegen war diese

Aktivierung unter dem Einfluss von Cytochalasin D gehemmt.


41

Abbildung 4 Einfluss mechanischer Stimulation auf die Phosphorylierung von ERK und AKT in hMSZ A: Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2, die dargestellten Blots sind repräsentative Beispiele aus neun

unabhängigen Experimenten. B: Densitometrische Auswertung der Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2.

C: Quantitative Analyse (Bio-Plex) der Phosphorylierung von AKT. Kontrolle: ohne Inhibitoren (EM) bzw. mit DMSO;

K: unbehandelte Kontrolle, Cl: mit Beads geclustert, MF: Magnetfeld, Reiz: mechanische Stimulation. (B, C) Dargestellt sind

Mittelwert und Standardabweichung, alle Werte wurden auf die Kontrolle in EM normiert, eckige Klammern zeigen signifikante

Unterschiede (* p ≤ 0,1; **p ≤ 0,05; n=9).

0

300

600

900

1200

1500

1800

2100

K Cl MF Reiz

Inte

nsitä

t in

%

B

EM

DMSO 0,1 %

**

** **

phERK

0

100

200

300

400

500

600

K Cl MF Reiz

Inte

nsitä

t in

%

C

EM

DMSO 0,1 %

**

**

phAKT

A


42

Abbildung 5 Einfluss mechanischer Stimulation auf die Phosphorylierung von ERK und AKT in hMSZ nach Inkubation mit Cytochalasin D

A: Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2, die dargestellten Blots sind repräsentative Beispiele aus drei


C: Bio-Plex Analyse der Phosphorylierung von AKT. K: unbehandelte Kontrolle, Cl: mit Beads geclustert, MF: Magnetfeld, Reiz:

mechanische Stimulation. (B, C) Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung, alle Werte wurden auf die Kontrolle in EM

normiert, eckige Klammern zeigen signifikante Unterschiede (* p ≤ 0,1; **p ≤ 0,05; n=3).

0

100

200

300

400

500

600

700

K Cl MF Reiz

Inte

nsitä

t in

%

B

DMSO 0,1 %

CytoD 0,5 µM

*

* phERK

0

100

200

300

400

500

600

700

K Cl MF Reiz

Inte

nsitä

t in

%

C

DMSO 0,1 %

CytoD 0,5 µM **

*

phAKT

A


43

Die Analyse der Zellen, die mit 0,01 µM Jasplakinolid behandelt wurden, zeigen im

Western Blot eine verstärkte Phosphorylierung von ERK nach Clustern und mechanische

Stimulation (Abbildung 6A). Durch die densitometrische Analyse wird dieses Ergebnis

bestätigt (Abbildung 6B). Für Phospho-AKT konnte ein ähnliches Ergebnis gezeigt

werden(Abbildung 6C). In Anwesenheit von Jasplakinolid bleibt die Aktivierung von

AKT durch mechanische Reize am β1-Integrin unverändert.

Die Resultate der mechanischen Stimulation unter dem Einfluss von 0,1 µM

Latrunculin  A zeigen im Western Blot, dass die Aktivierung von ERK unter Einfluss des

mechanischen Reizes durch Latrunculin  A komplett gehemmt wird. Weder durch

Clustern noch durch mechanisches Ziehen an Integrinen wird Phospho-ERK exprimiert

(Abbildung 7A). Die densitometrische Auswertung bestätigt das Ergebnis und zeigt,

dass die Expression von Phospho-ERK bei mechanischer Reizung unter dem Einfluss

von Latruculin A gehemmt ist (Abbildung 7B). Unter dem Einfluss von Latrunculin  A ist

die Aktivierung von AKT infolge eines mechanischen Integrinreizes völlig blockiert

(Abbildung 7C). Es ist im Vergleich zu den unbehandelten Zellen kein Anstieg der

Signalintensität für geclusterte und mechanisch stimulierte Zellen mit Latrunculin  A zu

sehen.


44

Abbildung 6 Einfluss mechanischer Stimulation auf die Phosphorylierung von ERK und AKT in hMSZ nach Inkubation mit Jasplakinolid A: Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2, die dargestellten Blots sind repräsentative Beispiele aus drei


C: Quantitative Analyse (Bio-Plex) der Phosphorylierung von AKT. K: unbehandelte Kontrolle, Cl: mit Beads geclustert,

MF: Magnetfeld, Reiz: mechanische Stimulation. (B, C) Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung, alle Werte wurden

auf die Kontrolle in EM normiert, eckige Klammern zeigen signifikante Unterschiede (* p ≤ 0,1; **p ≤ 0,05; n=3).

0

100

200

300

400

500

600

700

800

K Cl MF Reiz

Inte

nsitä

t in

%

B

DMSO 0,1 %

Jasp 0,01 µM

**

phERK

0

100

200

300

400

500

600

700

K Cl MF Reiz

Inte

nsitä

t in

%

C

DMSO 0,1 %

Jasp 0,01 µM *

*

phAKT

A


45

Abbildung 7 Einfluss mechanischer Stimulation auf die Phosphorylierung von ERK und AKT in hMSZ nach Inkubation mit Latrunculin A

A: Western Blot Analyse der Phosphorylierung von ERK1/2, die dargestellten Blots sind repräsentative Beispiele aus drei


C: Quantitative Analyse (Bio-Plex) der Phosphorylierung von AKT. K: unbehandelte Kontrolle, Cl: mit Beads geclustert,

MF: Magnetfeld, Reiz: mechanische Stimulation. (B, C) Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichung, alle Werte wurden

auf die Kontrolle in EM normiert, eckige Klammern zeigen signifikante Unterschiede (* p ≤ 0,1; **p ≤ 0,05; n=3).

0

100

200

300

400

500

600

700

K Cl MF Reiz

Inte

nsitä

t in

%

B

DMSO

LatA 0,1 µM

*

**

phERK

0

100

200

300

400

500

600

700

K Cl MF Reiz

Inte

nsitä

t in

%

C

DMSO 0,1 %

LatA 0,1 µM **

**

phAKT

A

5 Diskussion

46

5 Diskussion

Ziel der Untersuchungen war es die Beteiligung des Aktinzytoskeletts bei mechanischer

Belastung und daraus resultierenden Signaltransduktionswegen zu beurteilen. Zu

diesem Zweck wurde das Aktinzytoskelett im Zuge der mechanischen Belastung mit

inhibitorischen Substanzen behandelt, welche gezielt Polymerisierungs- oder

Depolymerisierungsprozesse durch unterschiedliche Mechanismen beeinflussen.

Dafür wurden zu Beginn die spezifischen Effekte der Inhibitoren auf die Morphologie

und das Aktinzytoskelett untersucht. Cytochalasin D als destabilisierende und

depolymerisierende Substanz bewirkte die vollständige Zerstörung des

Aktinzytoskeletts in unseren Untersuchungen. Intakte Aktinfilamente sind gemeinsam mit

Integrinen für eine optimale Zelladhäsion notwendig. Angesichts dieser Tatsache ist

davon auszugehen, dass auf Grund der Zerstörung der Aktinfasern durch

Cytochalasin D die Adhäsionsstärke der Zellen zum Substrat abnimmt und sich die

Zellen folglich leicht vom Untergrund ablösen könnten. Wie wir nachweisen konnten,

veränderte sich nach Gabe von Cytochalasin D die Form der Zellen grundlegend, die

Zellen sind rundlich. Bestätigt werden solche morphologischen Veränderungen auch

durch andere Studien. Neuhuber et al. (2004) konnte zeigen, dass MSZ unter Zugabe

von Cytochalasin D eine Neuronen ähnliche Morphologie ausbilden. Auch wurde

beschrieben, dass sich die Zellform von Osteoblasten und Fibroblasten nach

Behandlung mit Cytochalasin D abrundet und dabei die Höhe der Zellen zunimmt

(Charras und Horton, 2002; Ujihara et al., 2008). Zellfunktionen wie z. B.

Adhäsionsstärke, Differenzierung und Proliferation stehen in engem Zusammenhang

mit der Zellform (Chen et al., 1997; Roskelley et al., 1994). Das lässt darauf

schließen, dass Cytochalasin D durch seine morphologischen Effekte möglicherweise

verschiedene zelluläre Prozesse beeinflussen kann. So beschrieben beispielsweise

McBeath et al. (2004) einen Zusammenhang zwischen Zellform und

Differenzierungsrichtung. Durch die Form der Zelle wirken über das Zytoskelett

mechanische Kräfte auf die Zelle. Diese mechanische Spannung ist umso größer, je

5 Diskussion

47

ausgebreiteter eine Zelle ist. Durch diese Spannung nimmt die Aktivierung von Rho-

Kinasen zu und diese fördern wiederum die Osteogenese. Im Gegenzug kommt es bei

runden Zellen durch die geringere mechanische Spannung über das Zytoskelett zur

Inaktivierung von Rho-Kinasen, wodurch dann die adipogene Differenzierung gefördert

wird. Ergänzend zu unseren Untersuchungen wäre es sinnvoll nachzuprüfen, ob eine

Behandlung mit Cytochalasin D hMSZ dazu begünstigt in Adipozyten zu

differenzieren.

Jasplakinolid ist ein effektiver Induktor der Aktinpolymerisierung und führt zur

Verfestigung des Aktinzytoskeletts. Auf diese Weise verhindert es Umbauprozesse und

stört die Integrität des Aktinzytoskeletts (Bubb et al. 2000). In unseren Untersuchungen

wiesen hMSZ, die mit Jasplakinolid behandelt wurden, dickere Aktinbündel auf. Auch

in Studien mit Nierenepithelzellen (Knecht et al., 2010; Du et al., 2010; Sumida et al.,

2011) und Brustkrebszellen (Lynch et al., 2005) konnte die Bildung verdickter

Aktinbündel nach Gabe von Jasplakinolid beobachtet werden.

Latrunculin A ist eine depolymerisierende Substanz, die spezifisch G-Aktin bindet und

so dessen Polymerisierung zu F-Aktin verhindert. Auf diese Weise werden

Umbauprozesse unterdrückt und das Aktinzytoskelett destabilisiert (Coué et al., 1987).

Unsere Ergebnisse zeigen, dass in Zellen, die mit Latrunculin A behandelt wurden, das

Aktinzytoskelett unorganisiert erscheint, ohne klare Struktur und mit vereinzelten

Löchern. Die morphologischen Veränderungen waren moderat. Die Zellen waren in

ihrer Form verbreitert und teilweise verzweigt.

Im nächsten Schritt der Untersuchungen wurde den Zellen mechanischer Zugstress

appliziert. Zur Ausübung dieser mechanischen Belastung wurde eine Technik

verwendet, die sich von anderen geläufigen Techniken unterscheidet. Mit Hilfe von

paramagnetischen, antikörpergekoppelten Beads und einem Magnetfeld wurden

gezielt zyklische Zugkräfte auf β1-Untereinheiten der Integrine ausübt. β1-Integrine

dimerisieren mit verschiedenen α-Integrin-Untereinheiten und bilden so heterodimere

Adhäsionsrezeptoren (Hynes, 2002). In vorangegangenen Studien konnte

elektronenmikroskopisch gezeigt werden, dass das magnetische Ziehen an den Beads

5 Diskussion

48

lokal eine kleine Distorsion der Zellmembran bewirkt (Kasten et al., 2010). Nicht nur

der zyklische Zugstress sondern auch die Inkubation der Zellen mit den Beads stellt

eine mechanische Belastung für die Zellen dar. Unsere Arbeit konnte frühere Befunde

bestätigen, dass sowohl das Clustern als auch das zyklische Ziehen effektive

Induktoren der Aktivierung von ERK und AKT sind (Kasten et al., 2010). Es ist

beschrieben worden, dass die mechanische Stimulation der Integrine zur Aktivierung

der FAK führt (Hagen Pommerenke et al., 2002). Diese bedingt dann die Rekrutierung

der Phosphoinositid-3-Kinasen (PI-3-K) zum fokalen Adhäsionskomplex und dessen

Aktivierung (Legate et al., 2009). Im weiteren Verlauf der Signalkaskade kommt es

dann zur Aktivierung von AKT und ERK. Aktiviertes AKT spielt eine Schlüsselrolle in der

Regulierung vieler biologischer Prozesse wie z. B. des Überleben, der Proliferation, der

Differenzierung, der Proteinbiosynthese, der Zellzyklusprogression oder der

Angiogenese (Cantley, 2002; Jiang und Liu, 2008; Brazil et al., 2004). Aktiviertes

ERK hat über die Regulation der Expression verschiedener Gene ebenfalls Einfluss auf

zelluläre Funktionen wie z. B. Proliferation, Differenzierung und Reaktionen auf Stress

(Johnson und Lapadat, 2002).

Die Zerstörung des Zytoskeletts durch Cytochalasin D hatte keinen Einfluss auf die

Aktivierung von ERK und AKT nach mechanischer Belastung. Bestätigt wird ein solches

Ergebnis auch durch andere Studien. So blieb die durch Dehnungsstress induzierte

Aktivierung von ERK in Mesangiumzellen und auch in Kardiomyozyten nach Gabe von

Cytochalasin D erhalten (Ingram et al., 2000; Kustermans et al., 2008). Diese

Ergebnisse sind überraschend und unerwartet, da Cytochalasin D Aktinfilamente

zerstört, indem es die schnellwachsenden Enden von Aktinfilamenten blockiert. Keith

Burridge & Chrzanowska-Wodnicka (1996) beschrieben, dass dieser Prozess die

direkte Integrin vermittelte Phosphorylierung von fokalen Adhäsionsproteinen und der

fokalen Adhäsionskinase inhibiert. Durch Cytosalasin D wird ebenfalls die Verbindung

von Tyrosinkinasen zum Zytoskelett blockiert (Schmidt et al., 1998). Entgegen diesen

Ausführungen in der Literatur konnten andere Studien zeigen, dass die Zerstörung des

Aktinzytoskeletts mittels Cytochalasin D eine Aktivierung von ERK nicht verhindert. So

beobachteten Aplin und Juliano (1999) in Fibroblasten, dass die Integrin vermittelte

5 Diskussion

49

Phosphorylierung der FAK bei geringen Konzentrationen von Cytochalasin D (0,1 bis

1 µM) weitgehend unbeeinflusst blieb und ERK infolge von EGF-Stimulation aktiviert

wurde. Bei höheren Konzentrationen von Cytochalasin D (1 bis 2 µM) waren die

Aktivität der fokalen Adhäsionskinase und die Aktivierung von ERK jedoch nicht mehr

nachweisbar. Möglicherweise blieb auch in dieser Arbeit die Integrin vermittelte

Aktivierung der fokalen Adhäsionskinase auf Grund der geringen Konzentration von

Cytochalasin D erhalten. Um diese Vermutung der Konzentrationsabhängigkeit

bezüglich der ERK und somit auch der AKT Aktivierung zu bestätigen, sollte die

mechanische Stimulation unter erhöhten Konzentrationen von Cytochalasin D

wiederholt werden. Obwohl die meisten Integrinrezeptoren FAK abhängige

Signaltransduktionswege aktivieren, gibt es einige wie z. B. α1β1- und α5β3-Integrine,

die zusätzlich über die Rekrutierung von Fyn Shc-abhängige Signalwege aktivieren. Im

weiteren Verlauf dieser Signalkaskade kommt es auch hier zur Aktivierung von ERK

(Wary et al., 1998; Wary et al., 1996). Barberis et al. (2000) fanden heraus, dass

die Zerstörung des Zytoskeletts durch Cytochalasin D auf der einen Seite zwar die

Aktivierung von FAK blockiert, auf der anderen Seite jedoch keine Inhibierung von Shc

abhängigen Signalwegen oder der ERK-Aktivierung zur Folge hatte. Möglicherweise ist

die Aktivierung von ERK nach mechanischer Belastung von Integrinen auf Shc

abhängige Signaltransduktionswege zurückzuführen. Um das herauszufinden sollte die

mechanische Stimulation unter Verwendung von spezifischen Inhibitoren dieses

Signalweges wiederholt werden. Inwieweit die Aktivierung von AKT durch

Cytochalasin D beeinflusst wird, ist in der Literatur bisher nur wenig beschrieben

worden. Bei Ischämie- und Reperfusionsexperimenten mit Endothelzellen demonstrierten

van der Heijden et al. (2008), dass die Aktivierung von AKT auch unter Einfluss von

Cytochalasin D erhalten blieb. Um die zugrundeliegenden Mechanismen genauer

beschreiben zu können, sind weitere Untersuchungen notwendig. Möglicherweise

handelt es sich auch hier um konzentrationsabhängige Effekte oder alternative

Signalwege.

5 Diskussion

50

Die Stabilisierung des Aktinzytoskeletts durch Jasplakinolid in unseren Versuchen hatte

keinen Einfluss auf die Aktivierung von AKT und ERK und blieb nach mechanischer

Stimulation unbeeinflusst. Durch dieses Ergebnis kommen wir zu dem Schluss, dass ein

dynamisches Aktinzytoskelett offensichtlich für eine effektive Aktivierung von AKT und

ERK nicht benötigt wird. Über den Einfluss von Jasplakinolid auf die Signaltransduktion

und auf die FAK ist in der Literatur bisher sehr wenig bekannt.

Den deutlichsten Effekt auf die Aktivierung von ERK und Akt hatte in unseren Versuchen

die Behandlung der Zellen mit Latrunculin A. Die Aktivierung von AKT und ERK infolge

des Integrinreizes wurde komplett gehemmt. Bei Latrunculin A handelt es sich wie bei

Cytochalasin D um eine Substanz, die Aktinfilamente depolymerisiert. Der

Wirkmechanismus ist hier jedoch ein anderer. Aplin und Juliano (1999) zeigten in

Fibroblasten, dass eine Behandlung mit Latrunculin A (1 µg/ml) die EGF abhängige

Aktivierung von ERK1/2 zu 40 % reduziert. Dieser Beobachtung korrelierte stark mit

dem Verlust der FAK-Aktivierung. Da die FAK nicht nur für die Phosphorylierung von

ERK sondern auch von AKT verantwortlich ist, kann auch die Blockade der AKT-

Aktivierung durch Latrunculin A mit einer Hemmung FAK-Aktivität erklärt werden.

6 Zusammenfassung

51

6 Zusammenfassung

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Rolle des Aktinzytoskeletts für die Übertragung

mechanischer Kräfte im Zusammenhang mit der funktionellen Steuerung von

mesenchymalen Stammzellen untersucht.

Für die Beeinflussung des Aktinzytoskeletts wurden depolymerisierenden und

polymersierenden Substanzen eingestzt.

Die Signalproteine ERK und AKT wurden durch mechanische Stimulation der Integrine

aktiviert.

Es konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung des Aktinzytoskeletts mit

Latrunculin A zu einer deutlichen Hemmung der Aktivierung der Singnalproteine AKT

und ERK führt.

Dagegen hatten die Zerstörung des Aktinzytoskeletts durch Cytochalasin D, sowie die

Stabilisierung von Aktinfilamenten durch Jasplakinolid keinen Einfluss auf die

Aktivierung von ERK und AKT nach mechanischer Belastung.

7 Literatur

52

7 Literatur

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8 Abkürzungsverzeichnis

59

8 Abkürzungsverzeichnis

APS Ammoniumperoxodisulfat

Cy3 Cyanin3

CytoD Cytochalasin D

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

ERK extrazellulär regulierte Kinase

EZM Extrazelluläre Matrix

F-Aktin fibriläres Aktin

FITC Fluoresceinisothiocyanat

FKS fetales Kälberserum

G-Aktin globuläres Aktin

HBSS Hank's Buffered Salt Solution

hMSZ humane mesenchymale Stammzelle

HSZ hämatopoetische Stammzelle

Jasp Jasplakinolid

LatA Latrunculin A

LSM Laser-Scanning-Mikroskopie

MSZ mesenchymale Stammzelle

PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung

PFA Paraformaldehyd

PVDF Polyvinylidenfluorid

SDS Sodium Dodecyl Sulfat

TEMED Tetramethylethylendiamin

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

9 Tabellenverzeichnis

60

9 Tabellenverzeichnis

• Tabelle 1 Zusammensetzung des Sammelgelpuffers (pH 6,8) ..................................... 27

• Tabelle 2 Zusammensetzung des Trenngelpuffers ..................................................... 27

• Tabelle 3 Zusammensetzung des Trenngels ............................................................. 27

• Tabelle 4 Zusammensetzung des Sammelgels ......................................................... 27

• Tabelle 5 Zusammensetzung des Laufpuffers ........................................................... 28

• Tabelle 6 Zusammensetzung des Transferpuffers ...................................................... 28

• Tabelle 7 Zusammensetzung des Waschpuffers ....................................................... 29

10 Abbildungsverzeichnis

61

10 Abbildungsverzeichnis

• Abbildung 1 Einfluss der Inhibitoren auf die Morphologie von hMSZ ........................... 33

• Abbildung 2 Einfluss der Inhibitoren auf das Zytoskelett von hMSZ .............................. 35

• Abbildung 3 Einfluss der Inhibitoren auf die metabolische Aktivität und die Proliferation von

hMSZ .............................................................................................................. 38

• Abbildung 4 Einfluss mechanischer Stimulation auf die Phosphorylierung von ERK und AKT

in hMSZ .......................................................................................................... 41


in hMSZ nach Inkubation mit Cytochalasin  D ........................................................... 42


in hMSZ nach Inkubation mit Jasplakinolid .............................................................. 44


in hMSZ nach Inkubation mit Latrunculin  A .............................................................. 45

11 Erklärung

62

11 Erklärung

Ich versichere hiermit, dass ich die vorliegende Arbeit mit dem Thema: „Die Rolle des

Zytoskeletts bei mechanischer Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen“

selbstständig verfasst und keine anderen Hilfsmittel als die angegebenen benutzt habe.

Die Stellen, die anderen Werken dem Wortlaut oder dem Sinn nach entnommen sind,

habe ich in jedem einzelnen Fall durch Angabe der Quelle kenntlich gemacht.

Ich erkläre hiermit weiterhin, dass ich meine wissenschaftlichen Arbeiten nach den

Prinzipien der guten wissenschaftlichen Praxis gemäß der gültigen „Regeln zur

Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis und zur Vermeidung wissenschaftlichen

Fehlverhaltens“ an der Universität Rostock angefertigt habe.

Rostock, 17.01.2012

Unterschrift:

Health & Medicine

Anne Langenbach: “Die Rolle des Zytoskeletts bei der mechanischen Belastung von humanen mesenchymalen Stammzellen”