1

Erschienen in: Karlheinz Sonntag (Hg.) „Viren und andere Mikroben: Heil oder Plage? Zum 100. Todestag von Robert Koch“, S. 99 – 135. Universitätsverlag WINTER Heidelberg (2011). “Mikroskope und Mikroben“ Christoph Cremer Kirchoff-Institut für Physik und Institut für Pharmazie und Molekulare Biotechnologie/BioQuant, Universität Heidelberg Überall lauern Mikroorganismen, manchmal auch „Mikroben“ genannt, die Gesundheit und Leben von Menschen, Tieren und Pflanzen bedrohen. Es handelt sich dabei um mikroskopisch kleine Lebewesen, die als einzelne Individuen mit bloßem Auge nicht zu erkennen sind. Beispiele sind Bakterien, die für die Menschheitsgeißeln Pest, Cholera oder Syphilis verantwortlich sind. Zu den „Mikroben“ werden oft auch als ebenfalls submikroskopisch kleine Krankheitserreger die Viren gezählt, z.B. als Verursacher von Grippe, Gelbfieber, Pocken, AIDS, oder bestimmten Formen von Krebserkrankungen. Warum sind diese „Feinde der Menschheit“ jahrtausendelang unentdeckt geblieben? Zwar wussten die Ärzte schon lange, dass bestimmte Krankheiten unter geeigneten Umweltbedingungen auftraten. Man wusste auch um den Zusammenhang zwischen dem Auftreten bestimmter Tiere, z.B. Ratten, und todbringenden Krankheiten wie der Pest. Aber das waren Korrelationen, keine direkten Beobachtungen. Warum hat in vielen Jahrhunderten medizinischer und wissenschaftlicher Tätigkeit kein einziger Arzt oder Naturforscher einzelne Mikroben sehen können? Heute wissen wir: Sie sind zu klein: Die typische Größe eines Bakteriums liegt im Mikrometerbereich (1 µm = 1/1000 mm). Die kleinste mit bloßem Auge sichtbare Struktureinzelheit („optische Auflösung“ genannt) ist hingegen um die 100 Mikrometer, also rund 100x größer als ein einzelnes Bakterium. Dies bedeutet, dass diese einfach nicht sichtbar waren. Noch mehr gilt dies von den Viren. Mit typischen Abmessungen von 0.05 Mikrometer bis 0.1 Mikrometer sind sie rund tausendmal kleiner als die kleinste mit bloßem Auge sichtbare Struktureinzelheit. Mikroben wie Bakterien und Viren sind also viel zu klein, um ohne Instrumente sichtbar zu sein. Dies liegt an der Organisation unseres Sehvermögens: Ein Objekt wird nach den Gesetzen der Optik durch die Augenlinse auf der Retina abgebildet. Damit zwei Punkte eines Gegenstandes getrennt voneinander wahrgenommen werden können, müssen sie unterschiedliche Sehzellen treffen. Daraus ergibt sich eine kleinste sichtbare Struktureinzelheit oder die oben genannte Auflösung von ca. 100 µm oder 0.1 mm.

2

Daher war die Menschheit den aufgrund ihrer Mikrogrößen unsichtbaren Mikroben fast hilflos ausgeliefert: Ein gnadenloser Feind mit Tarnkappe hat leichtes Spiel. Um sich gegen Mikroben wirksam wehren zu können, ist es notwendig, ihnen diese Tarnkappe zu entreißen. Dann kann man sehen, wo sie sich aufhalten, wie sie sich vermehren, welche Wirkungen bestimmte Abwehrmaßnahmen haben usw. Die Fundamentalmethode hierzu wurde in optischen Systemen gefunden. Im einfachsten Fall bestehen sie aus einer einzigen Linse, wie sie jeder als Lupen kennt. Sie erlauben es, vergrößerte Abbildungen kleiner Objekte zu gewinnen. Damit wird der Abstand der einzelnen Bildpunkte auf der Retina größer, verschiedene Sehzellen werden getroffen; der kleinste Abstand von zwei Punkten des Gegenstandes, der auf der Retina verschiedene Sehzellen aktiviert, bestimmt die so erreichbare Auflösung. Optische Systeme zur Vergrößerung des Bildes von Gegenständen gab es bereits seit Jahrtausenden; so sollen schon altorientalische Könige und römische Kaiser über geschliffene Edelsteine als Lupen verfügt haben, mit deren Hilfe sie Kleingeschriebenes besser lesen konnten. Aber auch die Glastechnik und die Herstellung der zur Halterung erforderlichen Mechanik waren seit drei Jahrtausenden so weit fortgeschritten, dass der Bau von stark vergrößernden Linsensystemen, Mikroskopen, technisch möglich gewesen wäre. Doch hatte daran offenbar niemand ein Interesse, mit fatalen Folgen für die Gesundheitsgeschichte der Menschheit. Dies änderte sich erst vor ein paar hundert Jahren, mit dem Bau erster stark vergrößernder optischer Systeme Ende des 16. und Beginn des 17. Jahrhunderts. Wohl nicht zufällig geschah diese Erfindung in Italien und in den Niederlanden, wo die Textilindustrie blühte; Mikroskope erlaubten erstmals eine eingehende Analyse der Qualität von Wolle und Tuch, einer Grundlage des damaligen „Wohlstands der Nationen“. Das erste allgemein verbreitete Werk über die Mikroskopie veröffentlichte jedoch 1665 ein englischer Physiker. Robert Hooke, der Sekretär der Royal Society in den Jahren 1677-1682, beschrieb in seiner „Micrographia or some physiological descriptions of minute bodies, made by magnifying glasses with observations and inquiries thereupon" Beobachtungen, darunter mikroskopische Untersuchungen über das Gewebe der Pflanzen. Dort entdeckte er kleine Struktureinheiten, „cells“, von „cellulae“. In der damaligen Weltwissenschaftssprache, dem mittelalterlichen Latein, bezeichnete „cellula“ ein leeres Kämmerchen. Die fundamentale Bedeutung dieser „Kämmerchen“ blieb jedoch noch für weitere rund 170 Jahre im Dunkeln. Die frühen Mikroskopiker des 17. Jahrhunderts beobachteten nicht nur Wolle, Tuch, Kork, kleine Lebewesen in Wassertropfen oder Spermien. Der zusammen mit Robert Hooke berühmteste von ihnen, der Niederländer Antonie van Leeuwenhoek (1632 – 1723) war der erste, der mithilfe seines einfachen, nur aus einer einzigen - sehr kurzbrennweitigen und daher stark vergrößernden - Linse bestehenden Mikroskops einzelne Bakterien nicht nur für sich beobachtete, sondern dieses Wissen auch mitteilte (Abb. 1). Die von Leeuwenhoek erzielte optische Auflösung, also die kleinste noch erkennbare Struktureinzelheit, gemessen als der kleinste noch erkennbare Abstand von zwei Objektpunkten, lag bereits bei wenigen Mikrometer. Das reichte, um unter günstigen Bedingungen einzelne Zellen und sogar einzelne Bakterien sehen zu können.

3

Abb. 1. Links: Leeuwenhoeks Mikroskop. Das "Mikroskop" Leeuwenhoeks besteht aus einer bikonvexen Linse, die zwischen zwei Metallplätchen fixiert ist. Das biologische Objekt wird auf der Spitze einer Nadel befestigt und kann mit Hilfe einiger Schrauben in den Fokus der Linse gebracht werden. Der Beobachter führt die der Nadelspitze abgewandte Seite der Linse unmittelbar vor sein Auge. (1) Das gebrauchsfertige Instrument von hinten; (2) und (3) zeigen Details der mechanischen Teile zum Justieren des Objekts; (4) zeigt einen schematischen Längsschnitt. Aus [1]. Rechts: Zeichnungen von Bakterien aus dem Zahnbelag Leeuwenhoeks. (Quelle: Wikipedia). Wegen ihrer Bedeutung für die Naturwissenschaften, die Technik und die Medizin wird die Mikroskopie allgemein als eine der wichtigsten Entdeckungen in der Geschichte der Menschheit angesehen. Antonie van Leeuwenhoek hat sie zwar nicht erfunden, aber zu einer ersten Vollkommenheit geführt. Leider hat er das Geheimnis seiner damaligen „Supermikroskope“ mit ins Grab genommen; aber auch abgesehen davon bestand kein großes Interesse von Seiten der Fachleute, sich mit den von Leeuwenhoek gefundenen Kuriosa und ihren Konsequenzen für die Bekämpfung von Infektionskrankeiten auseinanderzusetzen. Warum sollte man das auch tun? Dazu hätte man erst einmal wissen müssen, dass so winzige Gebilde irgendeine Bedeutung für den Menschen haben. Ihr Vorkommen im Zahnbelag war dafür noch kein Beweis. Hinzu kam, dass die Mikroskope dieser Zeit vielfältigste technische Probleme hatten, die scharfe, klare Beobachtungen der Mikrowelt außerordentlich erschwerten. Bakterien wurden erst wieder im 19. Jahrhundert systematisch beobachtet, als mehrlinsige, robuste und „bedienungsfreundliche“ Mikroskopsysteme mit besserer Beleuchtung und guten Korrekturen von Linsenfehlern gebaut werden konnten. Abb. 2 zeigt ein Mikroskop des Jenaer Botanik-Professors Matthias Schleiden; es stammte aus einer optischen Werkstätte in Paris, damals wie heute eine der Zentren europäischer Wissenschaft.

4

Abb. 2. Beispiel für ein Hochleistungsmikroskop von Matthias Schleiden. Links: Skizze eines zusammengesetztes Mikroskops der Pariser Firma Oberhäuser aus einer Publikation von Schleiden (1855); zitiert nach [1]. Rechts: Abbildung eines Oberhäusermikroskops (1849/50) aus der Mikroskopsammlung der University of California Berkeley (Photo C.Cremer). Die nutzbare optische Auflösung solcher Mikroskope betrug ca. 1µm oder 1/1000 Millimeter. Dies war zwar noch nicht wesentlich besser als das was Leeuwenhoek 170 Jahre früher schon erreicht hatte. Aber ein Vergleich der beiden Mikroskope (Abb. 1 und 2) zeigt große Unterschiede in der praktischen Brauchbarkeit: Statt einer winzigen einzelnen Linse, die man sich ganz nahe ans Auge halten musste, benutzte Schleiden ein mehrlinsiges System, mit dessen Hilfe man das Objekt stark vergrößert bequem durch ein Okular betrachten konnte; statt einem auf einer Spitze notdürftig befestigten Objekt mit einer „wackeligen“ Haltemechanik (wenn auch in den besseren Modellen Leeuwenhoeks aus Silber gefertigt) zum freihändigen Halten gab es bei Schleiden ein robustes Stativ aus Stahl, das solide auf einem Tisch stand und in dem das Objekt und sein Abstand zur Frontlinse des Mikroskops präzise und stabil eingestellt werden konnte; statt das Objekt mit einem einlinsgen „Minimikroskop“ irgendwie ins Tageslicht zu halten und zu hoffen, dass die Beleuchtungsstärke und –Richtung ausreichend und passend war, gab es bei Schleiden ein Lichtsammelsystem, um das Objekt optimal beleuchten zu können, entweder von unten im Durchlicht, oder von oben im Auflicht. Die mechanische Stabilität wurde durch einen mit Blei gefüllten Sockel unterstützt (bei heutigen „Supermikroskopen“ dienen dazu tonnenschwere Steintische). Um eine präzise Scharfeinstellung zu erreichen, wurde ein Federmechanismus verwendet. Ein

5

plankonkaver Beleuchtungsspiegel ermöglichte eine Durchlichtbeleuchtung des Objekts von unten; eine Sammellinse ermöglichte eine Auflichtbeleuchtung von oben. Die Präparate befanden sich bei diesem Mikroskop auf Objektträgern aus Glas, die mit Stahlfedern auf dem Objekttisch angeklemmt wurden, ganz wie bei heutigen konventionellen Systemen. Damit gehörten solche Mikroskope wohl zum Besten, was in der ersten Hälfte des 19. Jahrhunderts an hochauflösender Optik zu haben war. Dank dieser und anderer „wissenschaftlichen Kleinigkeitskrämerei“ (wie Schleiden selbst es ironisch nannte), insbesondere auch der Entwicklung von Fixierungs- und Färbemethoden, war es nun mit derartigen Mikroskopsystemen in der ersten Hälfte des 19. Jahrhunderts möglich geworden, biologische Mikrostrukturen und sogar Bakterien unter Bedingungen zu beobachten, die systematisch angelegte Forschungen ermöglichten. Eine der ersten epochalen Entdeckungen, die auch für unser Thema von größter Bedeutung sind, war die auf solchen Mikroskopbeobachtungen basierende Begründung der Zelltheorie durch Schleiden und Schwann (Abb. 3).

Abb. 3: Links: Mikroskop-Abbildung von pflanzlichem Zellgewebe aus Schleiden (1838);Rechts: Mikroskopabbildung von tierischem Zellgewebe aus Schwann (1839). Aus [1] Schwann und Schleiden waren nicht die ersten, die in Geweben von Lebewesen solche merkwürdigen Mikrogebilde mit distinkten Struktureigenschaften beobachten konnten. Im Gegensatz zu den Beobachtungen von Leeuwenhoek und Hooke verband Schleiden seine Beobachtungen von „cellulae“ jedoch mit einer Interpretation, die den Beginn der modernen Biologie, Medizin, Hygiene und Mikrobiologie markiert. In seiner epochalen Arbeit von 1838 (Abb. 4) postulierte Schleiden: „Jede nur etwas höher ausgebildete Pflanze ist aber ein Aggregat von völlig individualisierten, in sich abgeschlossenen Einzelwesen.“ Diese Formulierungen erinnern an eine von Goethe bereits drei Jahrzehnte früher niedergeschriebene Vision: „Jedes Lebendige ist kein Einzelnes, sondern eine Mehrheit; selbst insofern es uns als Individuum erscheint, bleibt es doch eine Versammlung von lebendigen selbständigen Wesen, die der Idee, der Anlage nach gleich sind“ . Schleiden war Jurist wie Goethe, Professor an der jahrzehntelang unter Goethes Oberaufsicht stehenden Universität Jena und Direktor des von Goethe dort

6

stark geförderten botanischen Gartens. Die Vermutung liegt nahe, dass der Botaniker Schleiden auch dessen 1817 publizierte Schriften zur Morphologie der Pflanzen kannte, die diese bereits 1807 formulierte Idee zur Grundstruktur des Lebendigen enthält. Nun wird die Zelle zur zentralen Idee des Lebens. Was jedoch bei Goethe ein ganz allgemeines, ursprünglich von makroskopisch sichtbaren Blättern ausgehendes Konzept war, das wurde bei Schleiden und Schwann zu einem mikroskopischen Ausgangspunkt der Lebenswissenschaften. Einige Jahre später (1854/1855) zog der Arzt Rudolf Virchow die für die weitere Entwicklung von Biologie und Medizin entscheidende Konsequenz „omnis cellula e cellula“, jede Zelle stammt von einer anderen Zelle ab: „Der menschliche Körper setzt sich, wie alle organischen Körper, aus feinen Elementen zusammen, von denen jedes in letzter Instanz auf eine einzige Zelle und ihr Wirkungsgebiet zurückgeführt werden kann.“ Folglich können Krankheiten vielfach auf Änderungen von Zellen zurückgeführt werden, auch auf solche, bei denen ’Mikroben’ beteiligt sind. So gibt es von Virchow eine Veröffentlichung (1885) mit dem Titel „Der Kampf von Zellen und Bakterien“; auf einem Kongress nannte er die Kenntnis der Bakterien, verglichen mit der Kenntnis der Zellen, „ein anderes, nicht geringeres, vielleicht sogar wichtigeres Produkt der wissenschaftlichen Bemühungen unserer Zeiten“ (zitiert nach H. Schipperges, Rudolf Virchow [2003]). Es kommt also auf beides an, eine bessere Kenntnis der Zellen und der Mikroben, sowie ihrer Wechselwirkungen.

Abb. 4. Titelseite aus Schleidens Arbeit von 1838 zur Begründung der Zelltheorie Aus [1].

7

Eine wesentliche Voraussetzung für die Weiterentwicklung der Mikroskopie und damit der verbesserten Beobachtung auch von „Mikroben“ war die Herstellung von hochwertigen optischen Gläsern mit ganz bestimmten Eigenschaften. Nur so konnten die vielfachen Abbildungsfehler von Mikroskopen vermindert werden, die die Nutzung dieser Methoden in der biologischen und medizinischen Forschung Jahrhunderte lang behindert hatten. Hierauf beruhte ganz wesentlich die Entwicklung der leistungsfähigsten Mikroskope des 19. Jahrhunderts, die die Grundlage für die rasche Entwicklung der Mikrobiologie als Wissenschaft möglich machten. Auch in diese Entwicklung sind der Jenaer Professor Matthias Schleiden und Johann Wolfgang von Goethe als der für die Universität Jena zuständige „Staatsminister für Wissenschaft und Kunst“ eingebunden. Untersuchungen zur Farbenlehre veranlassten Goethe um 1825 zur Gründung einer Glashütte für Präzisionsoptik in Jena, wobei er als Sponsorin Maria Pawlowna (1786 – 1859), die Gemahlin von Großherzog Carl Friedrich (1783 – 1853) und Schwester der Zaren Alexander I. und Nikolaus I. gewinnen konnte. Über staatliche Mittel und großzügiges Sponsoring hinaus sind jedoch auch geeignete Köpfe notwendig. Auch hier hatte Goethe eine gute Hand; als Direktor seiner Glashütte ernannte er seinen „Farbenassistenten“ Friedrich Körner und berief ihn zum Dozenten an der Universität Jena. Dort hatte Körner einen tüchtigen Studenten mit Namen Carl Zeiss, der aus einer wahrhaft interdisziplinären Familie mit vielen Juristen und Theologen aber auch mit tüchtigen Handwerkern stammte. Dieser gründete mit Unterstützung von Matthias Schleiden in Jena eine kleine Optikwerkstätte und fing an, Mikroskope zu fertigen. Dabei spielte die Verbindung zum wissenschaftlichen Apparatebau von Anfang an eine wesentliche Rolle. Diese wurden damals nach empirischen Regeln gebaut. Jeder Physiker weiß, dass bei einer erfolgreichen Instrumentenentwicklung zur praktischen Erfahrung die Theorie hinzukommen muss. (Man stelle sich vor, der Large Hadron Collider im CERN oder das Hubble-Teleskop sollten durch „Pröbeln“ entwickelt werden, undenkbar). Carl Zeiss war der erste, der die Bedeutung der Theorie auch für den Bau von Hochleistungsmikroskopen erkannte. Daher engagierte er 1866 den Jenaer Physiker und späteren Direktor der dortigen Universitäts-Sternwarte Ernst Abbe (1840 – 1905). Das Ziel war, auf der Basis quantitativer numerischer Rechnungen (heute würde man das „Optik-Simulationen“ nennen) die Entwicklung neuer, außerordentlich leistungsfähiger Mikroskopsysteme zu ermöglichen. Die Idee war gut: Aber zunächst rechnete Abbe viele Jahre lang ohne Erfolg; unter heutigen Industriebedingungen oder universitären Exzellenzförderungen wäre er wohl kläglich gescheitert. Doch Abbe und Zeiss hielten durch, und um 1880 waren die von Zeiss gebauten Mikroskope die besten der Welt.

8

Abb. 5. Links: Ernst Abbe (1840 –1905), Professor der Physik an der Universität Jena; Partner von Carl Zeiss, später Alleininhaber der Firma; Begründer der Carl Zeiss Stiftung, der Eigentümerin der Carl Zeiss AG und der Schott AG (Quelle: Wikipedia). Neue Mikroskope von Zeiss und anderen führenden Optikherstellern ermöglichten die Begründung der modernen Mikrobiologie. Einer der wichtigsten ’Helfer der Menschheit’ auf diesem Gebiet war Robert Koch (1843 – 1910): Die neuen Mikroskope mit ganz wesentlich verbesserter Mechanik, Beleuchtung, Fehlerkorrektur und Auflösung erlaubten erstmals die detaillierte Analyse vieler bakterieller Krankheitserreger, wie Milzbrand, Tuberkulose, Cholera, Pest. Mit diesem Wissen wurden Diagnostik, Hygiene und Therapie auf völlig neue Grundlagen gestellt; nunmehr wurde ein effektiver Kampf gegen diese Geißeln der Menschheit möglich: Die Tarnkappe war weg. Koch war sich der Bedeutung der Optik für seine Forschungen voll bewusst. In einem Brief an die Geschäftsleitung von Carl Zeiss aus dem Jahre 1904 schreibt der Geheime Medizinalrat: „Sehr geehrter Herr, Ich erinnere mich noch sehr gut der Zeit, als ich zum ersten Male ein Öl[immersions]system in die Hand bekam… und mich von den gewaltigen Fortschritten überzeugte, die der optischen Werkstätte von Carl Zeiss unter Professor Abbe‘s genialem Beirat gelungen war…Oft habe ich später mit Bewunderung der Zeiß‘schen optischen Werkstätte gedacht… Mit größter Hochachtung, ergebenst Robert Koch“ Diese von Zeiss gefertigten Mikroskopsysteme hatten eine brauchbare optische Auflösung um die 0.2 µm. Damit konnten Koch und seine Kollegen nun Formunterschiede zwischen einzelnen Bakterien gut voneinander unterscheiden, hinzu kam die Anfärbbarkeit dieser Mikroben mit geeigneten Farbstoffen. Diese Techniken trugen ganz wesentlich bei zur Diagnostik vieler von Mikroben verursachten Krankheiten. Für seine Pionierleistungen wurde Koch im Jahre 1905 mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet.

9

So gut die neuen Hochleistungsmikroskope auch waren, sie hatten ein gravierendes Problem: Struktureinzelheiten von Mikroben und ihrer oft todbringenden Wechselwirkungen mit den Zellen des Körpers konnten nur erkannt werden, wenn diese größer waren als ungefähr 0,2 µm, also größer als 0,2/1000 mm. Unterhalb dieser Auflösungsgrenze war das Bild so verschwommen wie eine Zeitung aus großer Entfernung für das bloße Auge. Allen Verbesserungsversuchen zum Trotz konnte diese Grenze der „konventionellen“ Lichtmikroskopie nicht überwunden werden. Auch die besten Mikroskope von Zeiss, Leitz und anderen erlaubten keine Erkennung von Struktureinzelheiten in den Bakterien (Abb. 6); bei vielen Infektionskrankheiten war es noch schlimmer, da konnte man die Existenz von Erregern nur indirekt nachweisen. Aufgrund solcher Indizien wusste man, dass diese noch viel kleiner sein mussten als Bakterien; heute wissen wir, dass es sich dabei um Viren handelt.

Abb.6. Lichtmikroskopisches Bild von Bakterien bei der ‚konventionellen’ Bestauflösung Aus [2]. Ernst Abbe hat sich intensiv mit diesem erstaunlichen und beunruhigenden Phänomen befasst und die Lösung gefunden. Offenbar handelte es sich hier nicht mehr um ein technisches Problem, sondern um eine fundamentale Grenze der mit Optik möglichen Naturerkenntnis. Im Jahre 1873 fasste er seine Erkenntnisse in einer der berühmtesten Arbeiten der Physik zusammen. Diese enthielt so viele mathematische Formeln wie die Farbenlehre Goethes, nämlich keine einzige; dennoch war der physikalische Gehalt so brisant, dass er seitdem in jeder Physik-Grundvorlesung zur Sprache kommt. Abbe postulierte [3], „…dass….die Unterscheidungsgrenze [beim Mikroskop]…doch niemals über [den Betrag] der halben Wellenlänge des blauen Lichts um ein Nennenswertes hinausgehen wird“

10

Eine „halbe Wellenlänge des blauen Lichts“, das sind ungefähr 0,2 µm (0,2/1000 mm) oder 200 nm in der Sprache der heutigen Physik der Nanowelt (1 nm = 1 tausendstel Mikrometer = 1 Millionstel Millimeter). Allgemein gilt nach Abbe, dass der kleinste Abstand d zwischen zwei punktförmigen Objekteinzelheiten, der in irgendeinem – existierenden oder möglichen - Mikroskop noch unterschieden (aufgelöst) werden kann, wesentlich von der Wellenlänge λ des zur Abbildung verwendeten Lichts bestimmt wird (Abb. 7 rechts) Der Faktor nsinα (α ist der sog. halbe Aperturwinkel) kann aus mathematischen Gründen nicht größer werden als der Brechnungsindex n, eine optische Materialgröße, die typischerweise um maximal 1,5 liegt; typische Werte für nsinα sind be i Hochleistungsmikroskopen 1,2 bis 1,4. Damit wäre die mit irgendeinem Mikroskop mögliche Auflösung auf etwa 1/3 bis 1/2 der Wellenlänge im Vakuum beschränkt; bei den üblicherweise zur Beobachtung verwendeten Lichtwellenlängen ist dies aus praktischen Gründen etwa 0,2 µm.

Abb. 7. Links: Das Abbe Denkmal vor der Universität Jena. Auf der Kugel befindet sich die berühmte Formel für die Grenzen der optischen Auflösung (rechts vergrößert). Photo C.Cremer Ein berühmter Zeitgenosse von Abbe in England, Lord Rayleigh, kam 1896 zu einer fast identischen Formel [4]. Im Gegensatz zu Abbe gingen seine Überlegungen aber von der Annahme aus, dass sich die Objektpunkte wie selbstleuchtende Körper verhalten, so wie es Sterne tun. Im Gegensatz hierzu hatte Abbe angenommen, dass das Objekt das Licht in einer strukturabhängigen Weise ablenkt. Da die von dem Abbe gefundene Grenze für die lichtoptische Grenze der Naturerkenntnis aber als so fundamental angesehen wurde, entspann sich eine Auseinandersetzung über die physikalischen Grundlagen der beiden Aussagen. Gab es zwischen der um 20 Jahre verspäteten Erkenntnis des Engländers Rayleigh und der des Deutschen Abbe einen in der Physik begründeten wichtigen Unterschied? Wenn nicht, dann gebührte der Ruhm allein Abbe. Diese auch mit nationaler Leidenschaft über mehrere Jahrzehnte sich hinziehenden Diskussionen fanden um 1930 ein Ende mit der

11

sogenannten Äquivalenz-Theorie, also mit der Feststellung, dass keine essentiellen physikalischen Unterschiede zwischen Abbe und Rayleigh bestehen. Dies hatte zur Folge, dass rund ein halbes Jahrhundert lang niemand mehr daran zweifelte, dass der einzige Weg zu einer Erhöhung der Auflösung darin bestand, die Wellenlänge kürzer zu machen als 0,4 µm, also kürzer als mit sichtbarem Licht möglich. Bereits Rayleigh schlug die Verwendung von ultraviolettem Licht vor, und dies wurde auch realisiert; allerdings wird Glas im ultravioletten Bereich bei Verkürzung der Wellenlänge schnell undurchsichtig, sodass die Auflösungsverbesserungen auf diesem Wege relativ gering waren. Als wesentlich viel versprechender erwiesen sich hier zwei noch zu Lebzeiten von Abbe und Rayleigh am Ende des 19. Jahrhunderts gemachte fundamentale Neuerungen der Physik, die Entdeckung des Elektrons und die technische Möglichkeit, Hochvakua zu erzeugen. In den Zwanzigerjahren des letzten Jahrhunderts kam dann die Entdeckung der Welleneigenschaften von Materie hinzu: Für Elektronen ergeben sich hieraus sehr kleine Wellenlängen, die Bruchteile eines Nanometer betrugen. Nach der Abbe-Formel (Abb. 7 rechts) eröffnete dies die Möglichkeit der Konstruktion von Elektronenmikroskopen, mit denen heute in den Materialwissenschaften optische Auflösungen bis in den atomaren Bereich möglich geworden sind, und bis zu molekularen Dimensionen (wenige nm) bei Biostrukturen. Dank diesen auf energiereicher Strahlung basierenden Ultrastrukturanalysemethoden konnten viele Geheimnisse der Nanowelt aufgedeckt werden. Jetzt konnten sogar einzelne Viren sichtbar gemacht werden, die sich aufgrund ihrer Kleinheit der lichtmikroskopischen Analyse entzogen hatten. Dennoch blieb eine Verbesserung der lichtoptischen Auflösung, also eine Verkleinerung des detektierbaren minimalen Abstandes zweier punktförmiger Objekte unter Verwendung von sichtbarem Licht, von größtem Interesse. Dafür gibt es eine große Zahl praktischer Gründe. So sind Beobachtungen von Bakterien und Viren mit Elektronenmikroskopen sehr aufwendig und zeitraubend. In der Mikrobiologie kommt es aber oft darauf an, Krankheitserreger routinemäßig und schnell nachzuweisen; auch in der Forschung wäre es ein großer Vorteil, z.B. die Anheftung von Viren an Zellmembranen und ihre Beeinflussung durch Arzneimittel einfach und schnell auf der Ebene der einzelnen „Mikroben“ analysieren zu können. Ein weiteres Problem der Elektronenmikroskopie und anderer Ultrastrukturverfahren ist die mit den kleinen Wellenlängen verbundene energiereiche Strahlung; diese ist so groß, dass Beobachtungen lebender Zellen – von Ausnahmefällen abgesehen – nicht möglich ist. Sichtbares Licht hingegen wird von Zellen und Mikroben sehr viel besser ertragen. Bereits Abbe hielt es für grundsätzlich möglich, dass eines Tages neue Methoden gefunden würden, die eine lichtoptische Abbildung weit jenseits der von ihm formulierten Erkenntnisgrenze möglich machen könnten. In der oben zitierten Arbeit [3] zur Grenze der Auflösung schrieb er schon 1873, die Grenze von etwa einer halben Wellenlänge sei nur gültig, „… so lange nicht Momente geltend gemacht werden, die ganz außerhalb der Tragweite der aufgestellten Theorie liegen…” Fundamentale neue Entdeckungen in Physik, Optoelektronik, Informationstechnologie und Molekularbiologie ermöglichen heute die Überwindung der „Abbe/Rayleigh Grenze“ der lichtoptischen Naturerkenntnis: In der Physik ist dies insbesondere die Entwicklung von Lasern im sichtbaren Spektralbereich sowie von hochsensitiven Lichtdetektoren; die digitale Bildverarbeitung auf der Basis leistungsfähiger kleiner Computer; und die immer besseren Einsichten in die optische Physik von organischen Molekülen und anderen ’Nanoeinheiten’; in den Lebenswissenschaften sind für die „superauflösende“ Lichtmikroskopie oder „Nanoskopie“ wesentlich geworden die molekulare Zellbiologie, die Entdeckung der

12

DNA Struktur, des genetischen Codes sowie Techniken, die molekülspezifische optische Markierungen erlauben.

Auf der Grundlage dieser neuen, von Abbe und Rayleigh nicht vorhersehbaren Entwicklungen sind in den letzten beiden Jahrzehnten eine Reihe von Methoden entwickelt worden, die bislang für absolut gehaltene Grenze der optischen Auflösung in der Lichtmikroskopie in dramatischer Weise zu überwinden, genauer gesagt zu umgehen. Seit kurzem werden diese „Nanoskopie“-Methoden auch für die Erforschung von „Mikroben“ nutzbar gemacht. Als Beispiel für eine solche ‚nanoskopische’ Überwindung der konventionellen Grenze der optischen Auflösung soll hier das Verfahren der „ Lokalisations Mikroskopie“ oder „Spektralen Präzisionsdistanzmikroskopie“ (SPDM) näher beschrieben werden. Ihre Anfänge reichen bis in die 1990iger Jahre zurück, als sie erstmals konzipiert und in „Proof-of-Principle“ Experimenten realisiert wurde [5-8]. Lokalisationsmikroskopische Methoden haben es ermöglicht, zelluläre Nanostrukturen, Bakterien und sogar Viren mit sichtbarem Licht und bei Raumtemperatur zu analysieren und damit Perspektiven eröffnet, wesentliche Fragen der molekularen Biophysik, Zellbiologie und molekularmedizinischen Forschung mit wichtigen biologischen, systembiologischen und medizinischen Anwendungen angehen zu können. Der Ausgangspunkt der Überlegungen zur Überwindung der Auflösungsgrenze der konventionellen Lichtmikroskopie (ca. 0,2 µm) sind die Überlegungen von Lord Rayleigh: Wie schon erwähnt, ging dieser von der Annahme aus, dass der zu untersuchende Gegenstand aus vielen sehr kleinen ‚punktförmigen’ selbstleuchtenden Objekten besteht. In der Astronomie ist das beim Licht von Sternen der Fall; in der Biologie ist eine Selbstleuchtern entsprechende Lichtemission möglich, wenn in der zu untersuchenden Biostruktur dort befindliche Moleküle durch das Beleuchtungslicht zur Fluoreszenz angeregt werden können: Das heißt dass sie Licht einer anderen Wellenlänge aussenden als derjenigen des Beleuchtungslichtes. Jeder kennt zum Beispiel das Phänomen, dass bestimmte Materialien, die mit ultraviolettem Licht bestrahlt werden, dann grün oder gelb aufleuchten. Auch chemische Reaktionen können zu einer ähnlichen Lichtaussendung führen. Aufgrund der Wellennatur der Lichtausbreitung wird ein punktförmiges Objekt aber sogar mit einem Hochleistungsobjektiv nicht als Punkt abgebildet, sondern es erscheint als kleines Scheibchen mit einem Durchmesser von etwa einer halben Wellenlänge mal dem Vergrößerungsfaktor M des Mikroskops (Abb. 8) Solange im Gesichtsfeld nur einziges punktförmiges Objekt leuchtet (Abb. 8 oben), kann seine Lage im Bild eindeutig festgestellt werden, sofern die Helligkeit des leuchtenden Scheibchens groß genug ist. Dazu braucht man nur die Position seines Gipfels zu bestimmen; aus dieser Position kann man dann Lage des punktförmigen Objekts in der Biostruktur berechnen. Rayleigh selbst hat bereits im Jahre 1895 darauf hingewiesen.

13

Abb. 8. Grenzen der Auflösung in der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie. Oben: Das von einem ‚punktförmigen’ Objekt (z.B. Molekül) erzeugte Beugungsbild (x,y Koordinaten der Bildebene, senkrechte Koordinate: Intensität (Farbkodiert, dunkel rot = Intensität 1). Aus [9].

Normalerweise besteht ein Gegenstand aber aus sehr vielen einzelnen leuchtenden ‚Punkten’. Zum Beispiel können viele organische Moleküle durch chemische Prozesse oder durch Lichtanregung zur Aussendung von ’Fluoreszenzphotonen’ angeregt werden. Solange der Abstand d zwischen den Objektpunkten so groß ist, dass die von ihnen gebildeten Beugungsscheibchen sich nicht überlappen (Abb. 8 oben), solange kann die Lage jedes Beugungsscheibchens und damit die Lage der zugehörigen Moleküle im Gegenstand getrennt von den anderen bestimmt werden: Alle Objektpunkte zusammen ergeben ein maximal aufgelöstes Bild des Gegenstandes, d.h. die Information über die räumlichen Beziehungen der Objektpunkte zueinander. Was geschieht aber, wenn die Objektpunkte einander so nahe kommen, dass die vom abbildenden Mikroskopsystem gebildeten Beugungsscheibchen einander zu überlagern beginnen ? Rayleigh argumentierte, dass zwei solche selbstleuchtenden Objektpunkte nur dann noch voneinander unterschieden und damit ihre Positionen bestimmt werden können, wenn die Maxima (Gipfel) der beiden Beugungsscheibchen noch getrennt voneinander bestimmt werden können. Aus geometrischen Gründen (zwischen den beiden ‚Gipfeln’ muss eine Senke vorhanden sein) ist dies dann gegeben, wenn das Maximum des zweiten Beugungsscheibchens in das Minimum des ersten fällt (Abb. 8 unten). Daraus ergibt sich eine kleinste noch trennbare („auflösbare“) Distanz von ca. einer halben Wellenlänge, also etwa dem Durchmesser eines einzelnen Beugungsscheibchens.

14

Da die Größe der Beugungsscheibchen aber nicht wesentlich kleiner gemacht werden kann als etwa eine halbe Wellenlänge, also ca. 0,2 µm, erschien die hierdurch gegebene Grenze der optischen Auflösung mit sichtbarem Licht aus den Grundeigenschaften des Lichts zu folgen und damit unüberwindbar. Alle diese Überlegungen beruhen auf der Annahme, dass sich die beiden Beugungsscheibchen überlagern. In der konventionellen Lichtmikroskopie tun sie das auch. Was aber wäre, wenn es irgendwie gelänge, die Positionen von jedem Beugungsscheibchen unabhängig vom anderen zu messen ? In der Lokalisationsmikroskopie/SPDM kann dieses Problem auf verschiedene Weise gelöst werden.

Abb. 9: Prinzip der Lokalisationsmikroskopie. a) Drei im Abstand von jeweils 50 nm liegende ‚punktförmige’ Objekte derselben spektralen Signatur (z.B. derselben Farbe); b) Das von ihnen erzeugte Beugungsbild; c) Intensitätsverteilung durch das Zentrum von b); d) Drei im Abstand von jeweils 50 nm liegende Objekte mit verschiedenen

spektralen Signaturen B, G, R (z.B. Blau, Gelb, Rot); e) optisch isolierte Beugungsbilder von B,G,R; g) Intensitätsverteilung durch das Zentrum der einzelnen optisch isolierten Beugungsbilder von B, G, R. Nähere Erläuterung im Text. Aus [9, 17], nach [6].

Die Abb. 9 zeigt schematisch das Prinzip der Lokalisationsmikroskopie. Man stelle sich zunächst drei ‚punktförmige’, mit derselben spektralen Signatur selbstleuchtende Punkte (z.B. Moleküle mit derselben Fluoreszenzfarbe) vor, die voneinander einen Abstand von nur 50 Nanometer (0,050 µm) haben, also viermal kleiner als die konventionelle Grenze der optischen Auflösung von ca. 200

15

Nanometer = 0,2 µm (oben links, a). Von jedem dieser Moleküle wird aufgrund der Wellennatur des Lichts durch die Mikroskopoptik (bei gleichmäßiger Beleuchtung des Objekts) ein Beugungsscheibchen mit einem Durchmesser von etwa 200 nm x M (M Vergrößerungsfaktor) erzeugt; bei derselben spektralen Signatur überlagern diese sich in der Bildebene (oben Zentrum, b). Ein Intensitätsquerschnitt durch die Mitte dieses ‚Beugungsbildes’ (oben rechts, c, nach Division durch M) gibt eine Helligkeitskurve, die sich aus der Überlagerung der drei von den drei Molekülen gebildeten einzelnen Beugungsscheibchen ergibt; diese ist fast identisch mit der durch ein einziges Molekül erzeugten. Es ist also hier nicht mehr möglich festzustellen, wo die drei Moleküle im Bildfeld genau lokalisiert sind, und welchen Abstand sie voneinander haben. Hat jedes der eng benachbarten Moleküle jedoch eine verschiedene

„spektrale Signatur“ B,G,R – sie leuchten z.B. mit verschiedenen Farben Blau, Gelb, Rot - (b), so wird eine Orts- und Abstandsbestimmung der einzelnen Moleküle möglich: In (e) oben ist das Beugungsscheibchen gezeigt, das durch das in (d) links gelegene Molekül mit der spektralen Signatur B entsteht; dabei wurde angenommen, dass die Emissionen der beiden Moleküle mit Markierung G,R nicht zu dem Beugungsscheibchen von B beitragen, für den in diesem Falle verwendeten Detektor also „dunkel“ sind. Es ist offensichtlich, dass sich der Mittelpunkt dieser Beugungsverteilung mit einem Lokalisierungsfehler bestimmen lässt, der wesentlich kleiner ist als der Durchmesser der Beugungsverteilung. Diese Überlegungen lassen sich nun für die „optisch isolierten“ Beugungsbilder der beiden anderen Moleküle mit den spektralen Signaturen G und R wiederholen: In (e) Mitte wird das von G erzeugte Beugungsscheibchen gezeigt; in diesem Falle wurde angenommen, dass es „optisch isoliert“ von B und R abgebildet wurde. In (e) Unten wird das von R erzeugte Beugungsscheibchen gezeigt; in diesem Falle wurde angenommen, dass es „optisch isoliert“ von den beiden anderen (B und G) registriert wurde. Da nun die Einzelpositionen der drei Objekte B,G,R (z.B. drei Moleküle mit den spektralen Signaturen B,G,R) in der Objektebene auf einfache Weise berechnet werden können (Division durch den Vergrößerungsfaktor M des Mikroskopsystems), lassen sich daraus z.B. die Lagekoordinaten/Abstände in der Objektebene nach dem Pythagoras berechnen, selbst wenn diese erheblich kleiner sind als die konventionelle Auflösungsgrenze der Lichtmikroskopie. Dies aber bedeutet, dass mit diesem Verfahren Objekteinzelheiten ‚aufgelöst’ (d.h. voneinander unterschieden) werden können, die wesentlich kleiner sind als die konventionelle Grenze der lichtoptischen Auflösung. Da dieses lokalisationsmikroskopische Verfahren auf Präzisionsdistanzmessungen von Objekten geeigneter spektraler Signatur beruht, wurde es von uns als Spektrale Präzisions Distanz Mikroskopie(SPDM) bezeichnet [6].

In den obigen Überlegungen zur Überwindung der konventionellen Auflösungsgrenze wurde unter dem Begriff ‚spektrale Signatur’ jede Objekteigenschaft verstanden, die es erlaubt, die für die Lokalisationsmikroskopie erforderliche optische Isolation der Beugungsscheibchen durchzuführen. Dies kann zum Beispiel mithilfe von verschiedenen Fluoreszenzemissionsspektren (‚Spektralfarben’) realisiert werden. In einer Zusammenarbeit mit dem Chaim Sheba Medical Center/Israel konnten wir bereits vor mehr als zehn Jahren die grundsätzliche experimentelle Realisierbarkeit und biomedizinische Anwendbarkeit der Lokalisationsmikroskopiemethode/SPDM zeigen [7]. Distanzen in Zellkernen von Leukämiepatienten konnten bis zu einem Abstand von ca. 30 nm, also ~ 1/16 der verwendeten Anregungswellenlänge

16

vermessen werden. Die optische Auflösung war somit um den Faktor 200/30 ~ 7 besser, als dies selbst mit den besten Mikroskopen von Abbe und Koch möglich gewesen wäre. Mit dem hier beschriebenen SPDM Verfahren können im Prinzip molekular aufgelöste Abbildungen von Nanostrukturen gewonnen werden, sofern die wesentliche Grundbedingung, die ’optische Isolation’, erfüllt werden kann: Dies bedeutet, dass der Abstand zwischen zwei Molekülen derselben

Allerdings ist die Anzahl der in einem Beugungsscheibchen befindlichen Moleküle, die aufgrund von Farbunterschieden im Fluoreszenzemissionsspektrum gleichzeitig getrennt von einander detektiert werden können, relativ gering (derzeit < 10). Eine große Anzahl von spektralen Signaturen ist jedoch in vielen Fällen erforderlich, um genaue Informationen über die Gestalt von Biostrukturen, z.B. in Bakterien, oder von Viren zu erhalten. Über die bisher genannten spektralen Signaturen („Farben“) hinaus gibt es jedoch noch weitere Möglichkeiten, auch eng benachbarte Moleküle voneinander lichtoptisch zu unterscheiden.

spektralen Signatur mindestens so groß sein muss wie der Durchmesser D des Beugungsscheibchens dividiert durch den Vergrößerungsfaktor M des Mikroskopsystems.

Dieses zunächst unüberwindlich scheinende Problem konnte in den letzten Jahren gelöst werden; nun ist es möglich, in einer einzigen Zelle bis zu vielen tausend spektralen Signaturen für die Lokalisationsmikroskopie nutzbar zu machen. Die Grundidee solcher Ansätze ist es, die zeitliche Dimension konsequent auszunutzen: Beispielsweise könnte man die Beugungsscheibchen von ganz eng zusammen liegenden, nur in einer einzigen Farbe leuchtenden Moleküle auch dann voneinander trennen, wenn diese Moleküle ihre Leuchtkraft zeitlich verändern würden, wie das bei Leuchttürmen geschieht, oder in der Astronomie bei Supernova-Ausbrüchen. Diese unterscheiden sich nicht nur in der Farbe ihrer Lichtemission; sondern sie können während einer bestimmten Zeitspanne leuchten, also sich in einem Hell-Zustand befinden; außerhalb dieser Zeiten leuchten sie nicht, sie sind in einem Dunkel-Zustand. Nicht nur Farben können also als eine spektrale Signatur herangezogen werden, sondern auch Hell-Zustände und Dunkelzustände. Aus solchen Hell-und Dunkelzuständen verschiedener Farbstoffmolekülen kann dann ein hochaufgelöstes Bild aufgebaut werden, gemäß einer schon vor 200 Jahren von einem Jenaer Naturforscher ausgesprochenen Leitidee: „Nunmehr behaupten wir, wenn es auch einigermaßen sonderbar klingen mag, daß das Auge keine Form sehe, indem Hell, Dunkel und Farbe zusammen allein dasjenige ausmachen, was den Gegenstand vom Gegenstand, die Teile des Gegenstandes voneinander fürs Auge unterscheidet. Und so erbauen wir aus diesen dreien die sichtbare Welt.“ (J.W. Goethe, Entwurf einer Farbenlehre, 1808). Bei der Anwendung dieser Idee in der heutigen Lokalisationsmikroskopie muss man dafür sorgen, dass der Abstand von zwei Molekülen einer bestimmten Farbe im Hell-Zustand so groß ist, dass sich die beiden Beugungsscheibchen derselben Farbe während der Aufnahmezeit im Detektionssystem (z.B. einer CCD Kamera) nicht überlappen. In den letzten Jahren wurden derartige auf dem SPDM Grundkonzept der Lokalisationsmikroskopie beruhende Ideen von verschiedenen Gruppen (u.a. an der Harvard University, der Universität Heidelberg, dem Howard Hughes Medical Institute, der Maine University, dem Max-Planck-Institut Göttingen) experimentell realisiert, wobei unterschiedliche Markierungs- und Aufnahmemethoden zum selben

17

Ziel führten [8-20]: Einer optischen Superauflösung, die um ein Vielfaches besser war als die von Abbe und Rayleigh postulierten Grenzen. Auf der Grundlage der langjährigen Erfahrungen in der Entwicklung superauflösender lichtmikroskopischer Methoden konnten wir in unserer Arbeitsgruppe am Heidelberger Kirchhoff-Institut für Physik zeigen, dass die oben skizzierte Lokalisationsmikroskopie/SPDM auf der Grundlage der Induktion einmaliger„Lichtblitze“ unter bestimmten ’photophysikalischen’ Bedingungen auch für viele „ganz gewöhnliche“ Farbstoffmoleküle realisiert werden kann [15 – 20]. Solche Moleküle verhalten sich also in Punkto Lichtemission analog zu ihren makrokosmisch großen „Schwestern“, den Supernova-Sternen: Sie leuchten für kurze Zeit so stark auf, dass ihre Position aufgrund des Lichtblitzes festgestellt und in eine Positionskarte eingetragen werden kann. Dann endet diese Lichtaussendung plötzlich, und sie verschwinden im Dunkeln. Tritt in ganz kleiner Entfernung von der Position der ersten „Supernova“ ein weiterer Lichtblitz auf, so wird dessen Position einer zweiten Supernova (in der Lokalisationsmikroskopie einem zweiten Molekül) zugeschrieben. Abb. 10 zeigt eines der in unserer Arbeitsgruppe am Kirchhoff-Institut für Physik auf der Grundlage des SPDM Konzepts gebauten „Nanoskope“. Der Aufbau hat mit ’klassischen’ Mikroskopen wie dem in Abb. 2 gezeigten viele Gemeinsamkeiten: Auch hier ist ein massives Stativ zur Erhöhung der mechanischen Stabilität essentiell. Der durch das Okular blickende Beobachter ist hier jedoch durch eine hochempfindliche CCD-Kamera ersetzt (ähnlich wie bei modernen Fotoapparaten), mit der die Lichtblitze von einzelnen Molekülen detektiert werden können; statt des Sonnenlichts dienen Laser zur Beleuchtung des Präparats. Hinzu kommt ein weiteres, ganz wesentliches Element, leistungsstarke Computer zur Speicherung und Auswertung der von der CCD-Kamera registrierten Bilder: Um eine ‚superaufgelöste’ Abbildung zu erhalten, werden typischerweise Informationen aus mehreren tausend Einzelbildern benötigt.

Abb. 10: Ansicht eines der am Kirchhoff-Institut für Physik entwickelten „Lokalisationsmikroskope“ [15 – 18] (Photo C.Cremer)

18

Derzeit wird in unserer Arbeitsgruppe am Heidelberger Kirchhoff-Institut mit SPDM eine lichtoptische Auflösung (2D) zellulärer Nanostrukturen von etwa 10 – 20 nm (0.010 – 0.020 µm) realisiert. Die Bestauflösung bei solchen zellulären Strukturen entspricht etwa 1/50 der eingesetzten Laserwellenlänge, oder dem Durchmesser eines einzelnen größeren Proteins, oder 1/1000 Durchmesser eines Zellkerns. Ein Beispiel wird in Abb. 11 gezeigt: Während bei konventioneller Fluoreszenzmikroskopie (optische Auflösung ~ 200 nm = 0,2 µm) sich eine eher gleichmäßige „Färbung“ des Zellkerns ergab, wurden bei Verwendung von Lokalisationsmikroskopie (SPDM) in diesem ‚optischen Schnitt’ rund 120.000 einzelne Proteine lokalisiert [18]. So gewonnene Molekülverteilungen können nun mit Mitteln der theoretischen Polymerphysik quantitativ analysiert und mit numerischen Modellvorstellungen verglichen werden [20]. In Abb.12links werden einzelne Moleküle der Verpackung der DNA im Kern einer menschlichen Zelle sichtbar gemacht. Einzelne Moleküle im Abstand von nur 17 nm (= 0.017 µm = 0.000 017 mm) sind noch deutlich voneinander getrennt. In Abb. 12rechts wurde dasselbe Verfahren auf Moleküle der Zellmembran angewandt, mit ähnlichen Ergebnissen. Gegenwärtig können wir derartige Bilder mit fast molekularer Auflösung von ganzen Zellen in etwa einer Minute gewinnen, was auch erste SPDM -Aufnahmen von lebenden Zellen erlaubt hat. Kameras mit höherer Aufnahmefrequenz sollten eine Reduktion der für mehrere tausend Einzelbilder benötigten Gesamtaufnahmezeiten auf wenige Sekunden ermöglichen; neue, derzeit mit Kollegen aus der Informatik in Entwicklung befindliche Computerprogramme werden die Auswertungszeit bis zum fertigen Nanoskopie-Bild auf ähnlich kurze Zeiten reduzieren. Durch Kombination von SPDM mit einem weiteren in unserer Arbeitsgruppe entwickelten Nanoskopieverfahren, der Spatially Modulated Illumination (SMI) Mikroskopie ist es uns kürzlich gelungen, eine dreidimensionale (3D) Auflösung zellulärer Nanostrukturen von ca. 40 – 50 Nanometer zu verwirklichen [16].

19

Abb 11. Lokalisationsmikroskopie (SPDM) des Kerns einer Knochenmarks-Krebszelle. Links: Bei konventioneller hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie ist es nicht möglich, Einzelheiten der Verteilung der beiden fluoreszenzmarkierten Molekültypen zu erkennen. Rechts: Mit SPDM im Zweifarbenmodus konnten in dem gezeigten “optischen Schnitt” (Kernschicht von ca. 600 nm Dicke) etwa 70,000 einzelne ‚Histon’moleküle (rot) und etwa 50,000 individuelle Proteine zur Regulation der Genomstruktur (grün) in einem Gesichtsfeld von ca. 470 µm2

lokalisiert werden. Aus [18].

Abb.12. Links: Lokalisationsmikroskopie (SPDM) von individuellen Histonmolekülen in einem menschlichen Zellkern (Detail). Rechts: SPDM

von individuellen Proteinmolekülen in einer menschlichen Zellmembran (Detail). Die für die Anregung verwendete Wellenlänge war 488 nm. Einzelne Moleküle mit demselben Absorptions/Emissionsspektrum (’Farbe’) konnten auch in einem Abstand um die 10 nm noch klar voneinander getrennt werden. Dabei wurden Standardfluoreszenmarker (Farbstoffe) verwendet. Aus [16,17].

In einer Zusammenarbeit mit Prof. V. Sourjik (Zentrum für Molekularbiologie der Universität Heidelberg/ZMBH) haben wir begonnen, Nanostrukturen von Bakterien zu untersuchen (Abb. 13). Im Gegensatz zur Elektronenmikroskopie ist das sogar in lebenden Zellen möglich. Unser gegenwärtiger Bestwert bei der lokalisationsmikroskopischen Analyse von Biostrukturen liegt bei etwa 5 nm, entsprechend etwa 1/100 der verwendeten Wellenlänge. Verglichen mit der „konventionellen“ Auflösungsgrenze ist das eine Verbesserung um einen Faktor 40.

20

Abb. 13. Oben: Lichtmikroskopisches Bild eines Bakterium bei der ‚konventionellen’ Bestauflösung; Unten: Lokalisationsmikroskopie (SPDM) der Verteilung von einzelnen Molekülen eines bestimmten Typs dem oben abgebildeten Bakterium. Aus [2] Nanoskope und Mikroben Für unser Thema „Mikroskope und Mikroben“ bedeuten die neuen Entwicklungen der superauflösenden Mikroskopie (Nanoskopie), dass nunmehr die Wechselwirkung von Bakterien und Viren mit einzelnen Zellen auf der makromolekularen Ebene auch mit sichtbarem Licht beobachtet werden kann. So untersuchen wir derzeit in Zusammenarbeit mit verschiedenen virologischen Instituten zelluläre Nanostrukturen, die sich durch Infektion mit verschiedenen Viren ergeben. In einem dieser Projekte geht es um die Wechselwirkung von Influenza-Viren (verantwortlich für verschiedene Formen von Grippe-Infektionen) und der Zellmembran: Die Anheftung von Viren an die Zellmembran ist eine Voraussetzung für ihr Eindringen in die Zelle; ein besseres Verständnis solcher Anheftungsprozesse kann zur Entwicklung wirksamerer Arzneimittel beitragen. Bislang werden solche Anheftungsvorgänge hauptsächlich mit elektronenmikroskopischen Methoden untersucht. Diese sind in punkto Auflösung (also Erkennung von Struktureinzelheiten) selbst der hier dargestellten Lokalisationsmikroskopie immer noch überlegen (wenn auch zur Zeit nur noch um einen Faktor 2 - 3 und nicht mehr um einen Faktor 100). Es ist jedoch sehr schwierig, in so hoch aufgelösten Elektronenmikroskopischen Bildern Viren zu finden, die sich gerade an die Zellmembran anheften, also gewissermaßen den Virus „in flagranti“ zu erwischen. Bei der Lokalisationsmikroskopie ist das sehr viel einfacher. Eine solche Inspektion kann im Prinzip in wenigen Minuten durchgeführt werden. Wenn man einigermaßen sicher sein darf, Viren im Moment der Anheftung identifiziert zu haben, dann lohnt es sich viel mehr, auf diese Stelle die mühseligen Prozeduren der höchstauflösenden Elektronenmikroskopie anzuwenden. In einem anderen Projekt geht es darum, die Auswirkungen einer Vireninfektion auf die Genexpression zu untersuchen, also die vireninduzierte Bildung von bestimmten Proteinarten. Das ist zum Beispiel von Interesse in der Immunologie. Aber ist es möglich, mit den oben beschriebenen superauflösenden Lichtmikroskopieverfahren einzelne Viren direkt „scharf“ abzubilden? Zu Zeiten Robert Koch’s war es unmöglich, diese winzig kleinen Feinde der Menschheit ins Visier zu bekommen. Man musste sich mit indirekten Indizien zufrieden geben, bis die seit den 1930iger Jahren entwickelte Elektronenmikroskopie diese Lücke schloss;

21

mit diesen Methoden konnte man einzelne Viren selbst dann noch scharf darstellen, wenn sie nur einen Durchmesser von 20 nm (0.020 µm = 0.000 020 mm) hatten. Mit Lichtmikroskopie unter Verwendung von sichtbarem Licht so etwas zu erreichen, schien angesichts der vielfach schlechteren optischen Auflösung von 200 nm aussichtslos. Wenn solche Viren geeignet gefärbt vereinzelt auf einen Objektträger gebracht werden konnten, dann konnte man unscharfe Schemen wahrnehmen, aber nichts Genaues. In einer Zusammenarbeit mit dem Institut für Biologie der Universität Stuttgart haben wir begonnen, die Lokalisationsmikroskopie/SPDM auf die Strukturanalyse von Tabakmosaik-Viren anzuwenden. Tabakmosaik-Viren sind zylinderförmige Pflanzenviren mit einer typischen Länge von 300 nm und einem Durchmesser von 18 nm (0.018 µm) und einer Proteinhülle um die Nukleinsäure des Virus. Zum einen sind sie für die Erforschung von Virusverursachten Pflanzenkrankheiten interessant; ein signifikanter Teil der Welternte geht auf ihr Konto. Zum anderen werden solche für den Menschen unschädlichen Pflanzenviren aufgrund ihrer leichten Gewinnbarkeit, perfekten Symmetrie und einheitlichen Gestalt als vielversprechende elementare Bausteine für verschiedene Anwendungen in der Nanotechnologie angesehen, zum Beispiel für die Herstellung von Batterien, oder für verbesserte Sensoren. Solche Anwendungen setzen jedoch eine präzise Kontrolle der Verteilung der Viren auf den benutzten Oberflächen voraus. Mit elektronenmikroskopischen Verfahren ist dies zwar möglich, aber sehr aufwändig. Abb. 14links zeigt solche auf einer Oberfläche aufgebrachte Tabakmosaikviren nach Färbung der Hüllproteine mit einem fluoreszierenden Farbstoff bei bestmöglicher konventioneller Auflösung (200 nm = 0,2 µm). Eine Reihe von „Flecken“ sind sichtbar, aber genauere Strukturen sind nicht erkennbar, eine Identifizierung ist nicht möglich. Die Anwendung der Lokalisationsmikroskopie auf dieselbe Stelle des Präparats (Abb. 14rechts) zeigt hingegen deutlich einzelne stäbchenförmige Objekte. Wie die genauere Analyse zeigte (Manuskript in Vorbereitung), stimmen die lokalisationsmikroskopisch ermittelten Strukturdaten fast haargenau mit denjenigen der Elektronenmikroskopie überein, mit einer Abweichung von ca. 2 nm (0.002 µm).

Abb. 14. Lokalisationsmikroskopie von Viren (Tabakmosaikviren)

22

Links: Konventionelle lichtmikroskopische Bestauflösung. Rechts: Lokalisationsmikroskopie. Die einzelnen‚’Pünktchen’ geben den Ort einzelner Virusmoleküle an. S. Pres, M. Gunkel, R. Kaufmann, F, Geiger, S. Degenhard, C. Wege, C. Cremer, Super-resolution imaging of viruses by Spectral Precision Distance Microscopy (SPDM), Manuskript in Vorbereitung. Perspektiven Das Anwendungsspektrum der oben skizzierten superauflösenden Lokalisationsmikroskopie-Verfahren reicht derzeit von menschlichen und tierischen Zellen (Zellkern, Zytoplasma, Zellmembran, Zell-Zell-Interaktionen) und Pflanzenzellen bis zur superaufgelösten Abbildung einzelner Bakterien und Viren, also Objekten, deren Struktur bis vor kurzem nur der Elektronenmikroskopie zugänglich war. Einige bereits begonnene Anwendungen in der Mikrobiologie wurden oben erwähnt. Im Folgenden sollen einige weitere – derzeit noch spekulative, aber von der optischen Seite erstmals realisierbare - Möglichkeiten dieser und verwandter Methoden der lichtoptischen Nanoskopie in der Analyse von Bakterien und Viren genannt werden. Bakterien:

Ein weiteres potentielles Anwendungsbeispiel sind die Proteinfabriken der Bakterien, die Ribosomen; das sind ‚Biomolekulare Maschinen’ [21], auf deren Störung die Wirkung vieler Antibiotika beruht. Nanoskopietechniken könnten dazu beitragen, die Wirkung solcher Antibiotika auf ihre Zielstrukturen auf der Ebene einzelner Bakterien zu verfolgen. Zum Beispiel könnten Antibiotikabedingte Änderungen der gebildeten Protein-„Stückzahlen“ direkt mit einer bislang nicht möglichen Präzision gemessen werden; oder es könnten sogar Antibiotikabedingte Strukturänderungen in den Bakterienribosomen (und zum Vergleich in den Ribosomen der menschlichen Wirtszellen) nanoskopisch bestimmt werden. Hierfür würde eine Auflösung im Bereich von 1 nm (0.001 µm) benötigt. Lokalisationsmikroskopische Verfahren, die dies ermöglichen, sind gegenwärtig in Entwicklung. Bereits jetzt aber konnten wir mit einer anderen in unserer Arbeitsgruppe etablierten superauflösenden Lichtmikroskopiemethode, der sog. Strukturierten Beleuchtung, den Durchmesser

Nanoskopietechniken mit molekularer Auflösung erlauben es, die Verteilung einzelner spezifischer Molekültypen in einzelnen Bakterien zu analysieren. Da solche Verteilungen vom Bakterientyp abhängen, sollte es möglich sein, Nanoskopietechniken für eine schnelle Diagnostik der in irgendeiner kleinen Probe befindlichen Bakterienstämme zu entwickeln, selbst wenn eine solche Probe (z.B. ein Abdruck von einer Oberfläche von der Größe einer Nadelspitze) eine Vielzahl von Bakterientypen enthält. Bei geeigneten Präparationsverfahren verbunden mit der Entwicklung schneller Computerprogramme für die Auswertung könnte die Diagnostik von der Probenentnahme bis zur Identifizierung in wenigen Minuten abgeschlossen werden. Mikroskopiegestützte Ansätze zu einer solchen Diagnostik gibt es heute schon, aber lokalisationsmikroskopische Nanoskopieverfahren würden wegen ihrer molekularen Auflösung diese Möglichkeiten stark erweitern können. Eine der vielen Anwendungsgebiete einer solchen raschen Diagnostik bieten sich beim Aufspüren von multiresistenten Keimen im Krankenhaus an. Das Anlegen von Bakterienkulturen, die Wartezeit auf die Ergebnisse würde entfallen, die damit verbundene antibakterielle Therapie könnte sofort begonnen werden.

23

von Biomolekularen Maschinen der DNA Verdopplung („Replikation“) mit einem statistischen Fehler von 1 nm bestimmen, und so die durch die Anlagerung einzelner Moleküle induzierten Größenänderungen (wenige Nanometer) messen. Nanoskopietechniken könnten auch wichtige Informationen über die räumliche Faltung der in einem langen DNA Strang kodierten Erbinformation des Bakteriums und seiner Beeinflussung durch Umwelteinflüsse erlauben. Dies wäre nicht nur theoretisch für die „Fundamental Biophysics“ von Interesse: Gelänge es, auf der Basis solcher Strukturinformationen z.B. die für die Vermehrung der Bakterien notwendige Verdopplung ihres Genoms zu stören, dann könnte dies zur Entwicklung verbesserter Antibiotika führen, die das Wachstum der Bakterien auf der Ebene ihrer DNA Faltung behindern.. Viren:

Vielfältige Anwendungsperspektiven nanoskopischer Methoden ergeben sich auch bei Viren. Sie könnten die bestehenden molekularbiologischen und elektronenmikroskopischen Methoden wirksam ergänzen, z.B. bei der Analyse der Bildung viraler Strukturen, der Aufnahme und des Transports von Viren in der Zelle, oder der Integration bestimmter Viren in die Erbsubstanz der Wirtszelle und deren Folgen für die Nanostruktur des Genoms. Dies wiederum könnte in Verbindung mit dem übrigen Methodenspektrum der Virologie, ergänzt auch durch die neuen viel versprechenden Möglichkeiten der theoretischen Biophysik und Computersimulation solcher Vorgänge, hilfreich sein bei der Entwicklung antiviraler Arzneimittel. In einer der ersten Tagungen des Jubiläumsjahres 625 der Universität Heidelberg im November 2010 wurden solche Perspektiven thematisiert [21].

Danksagung Bei der Entwicklung der oben skizzierten laseroptischen Entwicklungen am Kirchhoff-Institut für Physik haben zahlreiche Diplomanden, Doktoranden, wissenschaftliche Mitarbeiter, sowie weitere Kooperationspartner mitgewirkt, denen hier sehr herzlich gedankt sei (siehe www.kip.uni-heidelberg.de). Insbesondere danke ich Herrn Dr. Paul Lemmer (Abb. 6,12,13); Dipl.-Phys. Rainer Kaufmann (Abb. 8,9,12); Dipl.-Phys. Manuel Gunkel (Abb. 11,14) und cand.phys. Sebastian Pres (Abb. 14), sowie Herrn Prof. V. Sourjik (Abb. 13) und Frau Priv.-Doz. Dr. Cristina Wege (Abb. 14). Die Forschungen wurden unterstützt vom Land Baden-Württemberg, der DFG, dem BMBF und der EU. Literatur: [1] Cremer, T. (1985) Von der Zellenlehre zur Chromosomentheorie. Springer Verlag, Heidelberg New York. [2] Lemmer, P. (2009) Lichtmikroskopische Untersuchungen konventionell markierter Präparate weit unterhalb der Beugungsgrenze. Dissertation Fakultät für Physik, Heidelberg. [3] Abbe E. (1873): Beiträge zur Theorie des Mikroskops und ihrer mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv f. mikroskopische Anatomie 9: 411 – 468.

24

[4] Rayleigh, L. (1896) On the theory of optical images, with special reference to the microscope. Philosophical Magazine 42. 167-195 [5] Bornfleth H et al. (1998) High precision distance measurements and volume-conserving segmentation of objects near and below the resolution limit in three-dimensional confocal fluorescence microscopy. J. Microscopy 189: 118-136. [6] Cremer C et al.(1999) Principles of Spectral Precision Distance confocal microscopy for the analysis of molecular nuclear structure. In: Handbook of Computer Vision and Applications (ed. B. Jähne, H. Haußecker, P. Geißler), Ch. 41., Vol. 3, Academic Press San Diego, New York: 839-857. [7] Esa A et al. (2000) Three-dimensional spectral precision distance microscopy of chromatin nanostructures after triple-colour DNA labelling: a study of the BCR region on chromosome 22 and the Philadelphia chromosome. Journal of Microscopy 199:96–105.

[8] Heilemann M et al. (2002) High-resolution colocalization of single dye molecules by fluorescence lifetime imaging microscopy. Anal. Chem 74:3511–3517.

[9] Cremer C. (2011) Lokalisationsmikroskopie - Lichtmikroskopie unterhalb des Abbe-Limits. Physik in Unserer Zeit 42: 21 – 29. [10] Lidke KA et al. (2005) Superresolution by localization of quantum dots using blinking statistics. Opt. Express 13: 7052–7062.

[11] Betzig E. et al. (2006): Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution. Science 313:1642–1645.

[12] Hess S et al. (2006) Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy. Biophysical Journal 91:4258.

[13] Egner, A et al. (2007) Fluorescence nanoscopy in whole cells by asynchronous localization of photoswitching emitters. Biophysical Journal 93:3285.

[14] Rust M et al. (2006) Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).Nature Methods 3: 793–795.

[15] Reymann J et al. (2008):High-precision structural analysis of subnuclear complexes in fixed and live cells via spatially modulated illumination (SMI) microscopy. Chromosome Research 16:367–382.

[16] Lemmer P et al. (2008) SPDM – Light Microscopy with Single Molecule Resolution at the Nanoscale. Applied Physics B 93: 1-12. [17] Kaufmann R et al. (2009) SPDM – Single Molecule Superresolution of Cellular Nanostructures. Proc. SPIE 7185

:71850J-1 – 71850J-19.

[18] Gunkel M et al. (2009) Dual color localization microscopy of cellular nanostructures. Biotechnology J. 4: 927 – 938. [19] Cremer C. et al. (2010) Far field fluorescence microscopy of cellular structures @ molecular resolution, In: Nanoscopy and Multidimensional Optical Fluorescence Microscopy (A. Diaspro, Edit.), Taylor & Francis. [20] Bohn, M. et al (2010) Localization microscopy reveals expression dependent parameters of chromatin nanostructure. Biophys. J. 99: 1358 – 1367. [21] Structure, Dynamics and Modulation: 3rd International Conference on Viral Membrane Proteins, Nov. 5-7,2010, Heidelberg.

25

Korrespondenzadresse:

Prof. Dr. Christoph Cremer

Kirchhoff-Institut für Physik

Universität Heidelberg

Im Neuenheimer Feld 227

D-69120 Heidelberg

e-mail: cremer@kip.uni-heidelberg.de; cremer@bmm.uni-heidelberg.de