Einführung in die NMR-Spektroskopie

NMR-Spektroskopie

8.10. – 10.10.2012

NMR-Spektroskopie

• NMR = Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy oder Kernspinresonanzspektroskopie

• Kernspins im Magnetfeld• Spektroskopie: Absorption von Lichtquanten, deren

Frequenz (umgekehrte Wellenlänge) der Energiedifferenz zwischen zwei Zuständen entsprechen

E = h·(h = Planck‘sches Wirkungsquantum, h = 6,63 ·10-34 J·s )

Prinzip der NMR-Spektroskopie

• Die meisten Atomkerne haben einen intrinsischen Drehimpuls (Kernspin).

• Die Größe des Kernspins kann nur bestimmte Werte halb- oder ganzzahlige Werte haben. Dies ist durch die Spinquantenzahl I charakterisiert (I = 0, 1/2, 1, 3/2, 2…).

• Die Spinquantenzahl ist charakteristisch für ein Isotop.

• Der Spin (bewegte Ladung) ist bei Atomkernen mit einem magnetischen Moment verknüpft.

I

I

| | ( 1)I I I

Die Magnetquantenzahl mZ

Quantenmechanik:Ein Spin der Spinquantenzahl I kann im Magnetfeld (2I+1) stabile

Orientierungen einnehmen (stationäre Zustände) die durch die Magnetquantenzahl mZ charakterisiert sind: mZ= -I, -I+1,-I+2…I

+ 1/2

mZ

- 1/2

I

I = 1/2

= 54,7°

- 1

+ 1mZ

I

I = 1

0

= 45°

Spin-1/2-Kerne

• Kerne der Spinquantenzahl I= ½, sind besonders gut geeignet für die NMR-Spektroskopie

• Beispiele: 1H, 13C, 15N und 31P• Diese Kernspins können im äußeren

Magnetfeld 2 Zustände einnehmen, die als (parallel zum äußeren Magnetfeld) und (antiparallel zum äußeren Magnetfeld) bezeichnet werden.

• Quantenmechanik: Die exakte räumliche Ausrichtung eines Kernspins kann nicht ermittelt werden (Heisenberg)

Prinzip der NMR-Spektroskopie

• Im Magnetfeld haben die Zustände und unterschiedliche Energien• Die Energiedifferenz E zwischen zwei Zuständen ist proportional zum

Magnetfeld am Kernort• Außerdem hängt die Energiedifferenz von der Art des Kerns ab.• Das gyromagnetische Verhältnis gibt an, wie groß die

Energiedifferenz zwischen den beiden Eigenzuständen des Kernspins in einem gegebenen Magnetfeld ist.

B

E

E = ·h·B0/2

Ausgewählte Isotope und ihre KernspinsIsotop Kernspin Häufigkeit [%] γ [107 rad T-1s-1]

1H 1/2 99.985 26.75192H 1 0.015 4.106610B 3 19.6 2.874611B 3/2 80.4 8.584313C 1/2 1.11 6.7314N 1 99.6 7.215N 1/2 0.37 -2.7117O 5/2 0.04 -3.6319F 1/2 100 25.1827Al 5/2 100 6.97631P 1/2 100 10.873Ge 9/2 7.8 -0.935779Br 3/2 50.7 6.702

NB: 12C und 16O, die häufigsten Isotope dieser Elemente, haben einen Kernspin I = 0 und geben damit kein NMR-Signal

NMR-Spektroskopie

• Besetzungsunterschied zwischen und : Boltzmann-Verteilung:

• Bei 300K und einem Feld von 18,8 T (800 MHz Protonenfrequenz): N = 0,99987·N

• Auf 10000 Spins im -Zustand kommen 10001,3 Spins im -Zustand

• NMR-Spektroskopie ist eine relativ unempfindliche Methode!

0exp expN BEN kT kT

NMR-Spektroskopie

• Spektroskopie: Durch Einstrahlung von Lichtquanten geeigneter Energie lässt sich ein System vom energiearmen in den energiereichen Zustand überführen.

• Dabei werden Lichtquanten absorbiert.• Aus der Wellenlänge des absorbierten Lichtes kann auf die

Energiedifferenz zwischen den Zuständen geschlossen werden (→ Erkenntnisgewinn!):E = h· = ·h · B0/2

= · B0/2• Die Frequenz hängt vom äußeren Magnetfeld ab (rf-

Wellenbereich, bei 9,4 T ist die Resonanzfrequenz für Protonen 400 MHz, die höchste Frequenz ist 1GHz)

• Welche Erkenntnis wollen wir denn aus dem NMR-Spektrum gewinnen?

Chemische Verschiebung

E1

1

23

E2 E3

Unterschiedliche

Resonanzfrequenzen für

unterschiedliche Kerne

Im Molekül sind Atomkerne von Elektronenhüllen umgeben, die

das äußere Magnetfeld teilweise abschirmen. Diese Abschirmung hängt von der chemischen Umgebung ab.

→ Das Magnetfeld am Kernort gibt Auskunft über die

chemische Umgebung eines Atomkerns.

→ chemische Verschiebung

Die chemische Verschiebung ist proportional zum angelegten Magnetfeld

4.7 T

9.4 T

Die chemische Verschiebung wird in ppm angegeben

Referenzierung:

• Die chemische Verschiebung einer Referenzsubstanz wird willkürlich auf 0 ppm gesetzt (für Protonen und 13C Tetramethylsilan, TMS, für 15N flüssiges NH3)

• Damit ist unabhängig vom Magnetfeld

6[ ] 10 ref

ref

ppm

Puls-FT-NMR-Spektroskopie

Das Vektormodell (vereinfacht)

• z-Magnetisierung als Summe der einzelnen magnetischen Momente

• Im Gleichgewichtszustand ist die makroskopische Magnetisierung parallel zum angelegten Magnetfeld

0exp( / ) exp( / 2 )n

E kT hB kTn

Boltzmann Verteilung: bei 14.1 T: n/n 5·10-5

Vektormodell: magnetisches Moment

0exp( / ) exp( / 2 )n

E kT hB kTn

Boltzmann Verteilung: bei 14.1 T: n/n 5·10-5

Präzession im Magnetfeld

0M B

dLM r Fdt

I

0 0 sindIM I B I B edt

→ Das magnetische Moment eines Kernspins führt zu einem Drehmoment M

(Änderung des Drehimpulses mit der Zeit) senkrecht zum Drehimpuls I des

Kernspins.

→ Der Drehimpuls ändert seine Richtung, aber nicht seinen Betrag

→ Kreisbewegung (Präzession) um die Richtung des angelegten Magnetfeldes

→ Präzession mit der Larmorfrequenz des Kernspins

Wie kann der Magnetisierungsvektor von der Richtung des äußeren Magnetfeldes weggedreht

werden?

Indem man das Magnetfeld kurzzeitig ausschaltet und ein Magnetfeld senkrecht dazu anlegt, um das der Magnetisierungsvektor dann präzediert.

Der Rotationswinkel ist dann proportional zur Zeit, die das Magnetfeld angelegt wurde, und zur Stärke des Magnetfeldes.

Exkurs: Oszillierendes Magnetfeld

Ein oszillierendes Magnetfeld kann als Summe zweier in entgegengesetzter Richtung rotierender Magnetfelder betrachtet werden.

Rotierendes Koordinatensystem

Wenn ein Radiofrequenzfeld, das mit der Larmor-Frequenz eines Kernspins oszilliert, spürt dieser rotierende Kernspin ein konstantes Magnetfeld, das senkrecht zum äußeren Magnetfeld ist.

Kreisbewegung (freie Präzession um die z-Achse)

• Die Kernspinmagnetisierung präzediert im rotierenden Koordinatensystem mit der Kreisfrequenz um die Richtung des äußeren Magnetfeldes.

• Mit der Larmorfrequenz L und der Rotationsfrequenz des Koordinatensystems 0

cos sin

cos sin

tx x y

ty y x

M M t M t

M M t M t

0[ / ]L rad s

Rf-Pulse

• Durch das Einstrahlen kurzer, intensiver Radiofrequenzpulse der Intensität B1 nahe der Larmorfrequenz lässt sich der makroskopische Magnetisierungsvektor um die Einstrahlrichtung rotieren.

• Vorteil: RF-Pulse lassen sich mit jeder beliebigen Phase und für definierte Zeiten einstrahlen

• Das äußere Magnetfeld muss dazu nicht abgeschaltet werden.

Wirkung von Radiofrequenzpulsen

→ Durch Einstrahlen von rf-Feldern mit definierter Frequenz und Phase kann man den Magnetisierungsvektor nach Belieben manipulieren („Spin-Choreographie“)

Transversale Magnetisierung

• - und -Zustand sind nun gleichbesetzt. Dafür zeigen Kernspins nun Phasenkohärenz (bevorzugte Ausrichtung in der xy-Ebene)

• Die transversale Magnetisierung präzediert (rotiert) in der xy-Ebene, und zwar jede Komponente mit ihrer Larmorfrequenz .

• Rotierende Magnetisierungsvektoren induzieren einen Wechselstrom in einer rf-Spule und kann somit detektiert werden.

Fazit

• Transversale Magnetisierung präzediert mit der Larmorfrequenz der Kernspins

• Der Magnetisierungsvektor kann mit Hilfe von rf-Pulsen von der Richtung des äußeren Magnetfeldes weg rotiert werden.

• Wird der rf-Puls im rotierenden Koordinatensystem in Richtung des Magnetisierungsvektors eingestrahlt, so hat das rf-Feld keinen Einfluss („spin lock“).

Free Induction Decay FID

• Präzedierende Magnetisierung erzeugt in einer rf-Spule ein zeitabhängiges Signal, das freier Induktionszerfall oder FID genannt wird.

• Dieses Signal entspricht einer gedämpften Schwingung mit mehreren Frequenzkomponenten (Akkord, der auf dem Klavier angeschlagen oder auf der Gitarre gezupft wird, Paukenschlag, Erdbebenstoß).

• Das Signal klingt ab, weil– Die Spins mitunter aus dem Takt geraten („transversale

Relaxation“)– Der Gleichgewichtszustand (Überschuß an -Spins ohne

Phasenkohärenz) wieder erreicht wird („longitudinale Relaxation“)

• Analyse der Frequenzkomponenten (Fourier-Transformation) ergibt das Spektrum.

NMR-“Spektroskopie“

E1

1

23

E2 E3

Unterschiedliche Resonanzfrequenzen

für unterschiedliche Kerne

Fourier-Transformations-NMR / rf-Pulse

t

+

+

1

23

0

S( ) s(t) exp( i t2 )dt

x

z

yx

z

y

rf-Puls

x

z

y

Fourier-Transformation

• Der freie Induktionszerfall (freeinduction decay, FID) kann dargestellt werden als die Summe aus frequenzabhängigen Komponenten, und deren einhüllender Funktion

• Die Oszillationsfrequenz k bestimmt die Lage des k-ten Signals, die Einhüllende fk(t) die Linienform

• Die Fourier-Transformation ist umkehrbar

Jean-Baptiste Fourier, 1768-1830( ) ( ) exp( 2 )k k

k

s t f t i t

Fourier-Transformation

Fourier-Paare

k = 50 Hz

k = 250 Hz

k = 1000 Hz

FT

Fourier-Paare: konstante Amplitude( ) exp( 2 )s t i t ( ) ( )S

k = 100 Hz

k = 1000 Hz

( ) exp( )f t t

= 1000 Hz

Fourier-Paare: Exponenzieller Abfall

2 22( )kF

= 100 Hz

Fourier-Paare: Exponenzieller Abfall

( ) exp( )exp( 2 )s t t i t 22

2( )S

Fourier-Paare: Rechtecksfunktionsin(2 )( )

2kF

1, 0

( )0,

if tf t

if t

= 1 ms

= 2 ms

Fourier-Paare: Rechtecksfunktion

exp( 2 ), 0( )

0,i t if t

s tif t

= 5 ms

sin(2 ( ) )( )2 ( )

S

Fazit FT-NMR

• Je länger der FID, umso schmaler das Signal• Die Oszillationsfrequenz bestimmt die Lage des

Signals• Die Linienform hängt von der Form des FID ab• Die Form des FID hängt unter anderem von der

Lebensdauer des Kernspinzustandes ab.

FT-NMR- wozu?

• Große Zeitersparnis: Statt alle Wellenlängen einzeln durchzufahren (Dauer: Minuten) wird mit einem einzigen kurzen Puls das gesamte Spektrum angeregt (Dauer: wenige Sekunden)

• Vor allem die NMR-Spektroskopie von Kernen mit geringem gyromagnetischem Verhältnis und geringer natürlicher Häufigkeit wird dadurch ermöglicht (13C NMR-Spektroskopie in natürlicher Häufigkeit).

• Wir erinnern uns: Das Signal-zu-Rausch-Verhältnis S/N ist proportional zum Quadrat der Anzahl der aufgenommenen scans (das heißt, wenn wir in zwei Minuten 100 scans statt eines scans aufnehmen können, steigern wir die Empfindlichkeit um den Faktor 10)

Richard R. Ernst,

Nobelpreis 1991

Das gepulste NMR-Experiment

Frage: Wie lange dauert es, bis wir den nächsten FID aufnehmen können?

Relaxation

Zwei Arten der Kernspinrelaxation:• T1: longitudinale Relaxation (Spin-Gitter-Relaxation)

beschreibt die Zeit, bis die Magnetisierung wieder den Glechgewichtszustad erreicht hat (und der Magnetisierungsvektor entlang der z-Richtung ausgerichtet ist).

• T2: transversale Relaxation (Spin-Spin-Relaxation)beschreibt die Zeitkonstante, mit der der die spinsirreversibel (?!?) dephasieren (die Spins haben ihre Phaseninformation verloren, unter Umständen ist der Gleichgewichtszustand aber noch nicht wieder erreicht).

a=100Hz

Homogene Linienverbreiterung: kurze Lebensdauer des Spinzustandes

exp(-at) 1/(1+(2/a)2

a=1kHz

Inhomogene Linenverbreiterung:Jeder Kernspin hat eine etwas andere

Larmorfrequenz

Rekapitulation: Präzession

+

+

1

23

x

y

Unterschiedliche Larmorfrequenzen→ unterschiedliche Präzessionsfrequenzen

x

z

yx

z

y

rf-Puls

x

z

y

Inhomogene Linenverbreiterung:Jeder Kernspin hat eine etwas andere

Larmorfrequenz

Inhomogene Linienverbreiterungen lassen sich refokussieren – homogene nicht

Inhomogen! Homogen!

x

y

Spinecho

Homogene/Inhomogene Linienbreiten -Lochbrennen

rf

Einstrahlung einer rf-Frequenz sättigt alle Übergänge dieser Frequenz

Inhomogene Linienverbreiterung: Lochbrennen

Homogene Linienverbreiterung: Das gesamte Signal wird gesättigt

Fazit

• Transversale Relaxation führt zu homogener Linienverbreiterung

• Wenn die Phaseninformation verloren ist, kann sie nicht mehr zurückgewonnen werden.

• Inhomogene Linienverbreiterungen können durch einen 180°-Puls refokussiert werden (Spinecho).

NMR von Proteinen

• Sekundäre chemische Verschiebungen• Kernsorten in Proteinen• Labelling• Multidimensionale NMR-Spektroskopie:Prinzip• COSY, NOESY, Transfer, TOCSY

NH (Amidprotonen)

H,N-HSQC von Kanamycin-

Kinase (Protein mit 264 Aminosäuren).Jedes Signal entspricht der

Amidgruppe einer Aminosäure.

(aufgenommen bei 21.1T, oder 900

MHz Protonenfrequenz)

© Dr. Matthias Stoldt

2D-NMR-Spektroskopie

2D-NMR

• Präparation: Die Magnetisierung wird angeregt (in die xy-Ebene gebracht)

• Evolution: Die Magnetisierung präzediert in der xy-Ebene, jede Komponente enthält am Ende der Evolution eine Phase, die proportional zur Evolutionszeit und der Larmorfrequenz ist.

• Mischen: Durch geeignete Radiofrequenzpulse kann Magnetisierung zwischen verschiedenen Kernspins übertragen werden. Dazu können J-Kopplungen oder die räumliche Nachbarschaft ausgenutzt werden. Der Transfer ist homo-oder heteronuklear möglich.

• Detektion: Der FID wird aufgenommen.

2D-NMR-Spektroskopie

Dieser Vorgang wird wiederholt, und mit linear

zunehmenden t1-Evolutionszeiten

durchgeführt.

2D-NMR-Spektroskopie

Fourier-Transformation in t2 ergibt eine Serie von Spektren. Jedes Signal ist entlang t1 amplitudenmoduliert.

→ Projektion auf t1 ergibt…

2D-NMR-Spektroskopie

…ein Signal, das in t1ebenfalls mit einer charakteristischen Frequenz oszilliert.Dieses Signal lässt sich selbstverständlich auch in t1 fourier-transformieren.

2D-Spektrum

Darstellung als Höhenlinien

Informationsgehalt von 2D-Spektren

• Wenn während des Mischens „Magnetisierung“ von einer Spinart auf die andere übertragen wurde, erscheint im Spektrum ein Kreuzkorrelationssignal („Crosspeak“), das in beiden Dimensionen unterschiedliche Frequenzen hat.

• Die beiden Kernspins, die diese Larmorfrequenzen haben, stehen also in irgendeiner Beziehung zueinander.

• Z.B. J-Kopplung, aber auch räumliche Nähe (je nach Art der Mischsequenz)

2D NMR-Spektren

• Es gibt ein großes Arsenal an verschiedenen 2D-NMR-Experimenten, die sich in der Art der Präparation und der Art des Magnetisierungstransfers unterscheiden.

2D NMR-Spektren

• Homonuklear: Der Magnetisierungstransfer erfolgt zwischen Kernspins der gleichen Sorte (meist Protonen)

• Heteronuklear: Der Magnetisierungstransfer erfolgt zwischen verschiedenen Kernspins (1H/13C oder 1H/15N)

• Verschiedene Transfermechanismen für die Mischsequenz: – Durch Bindungen (Information über die chemische Struktur)– Durch den Raum (Information über die räumliche Struktur in

Proteinen)

Homonukleare 2D-NMR-Experimente

• COSY (COrrelation SpectroscopY): Nutzt J-Kopplungen aus, Kreuzkorrelationssignale zwischen Protonenspins, die über 3 Bindungen miteinander verbunden sind.

• TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY): Magnetisierungstransfer zwischen allen Kernspins, die über J-Kopplungen miteinander verbunden sind

• NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY): Transfer durch den Raum über dipolare Kopplungen (Abstandsinformation)

J-Kopplungen homonuklear: COSY

Frage: Welche Spinsystemeliegen in diesem Substanzgemisch vor?

TOCSY: TOtal Correlation SpectroscopY

• Alle miteinander gekoppelten Protonen ergeben Kreuzkorrelationssignale

• Jede Aminosäure gibt einen miteinander korrelierten Signalsatz

TOCSY

Frage: Welche Spinsystemeliegen in diesem Substanzgemisch vor?Und: Welches Spektrum sagt mehr über die Moleküle aus: das COSY oder das TOCSY?

Einfachstes 2D-Spektrum: H,H COSY (COrrelation SpectroscopY)

Zwischen Kernspins, die miteinander koppeln, gibt es Kreuzkorrelationssignale.

1H von 1-13C-Glucose

H1H1

J(H,C) = 179 Hz

© Dr. Rudolf Hartmann

J(H,C) = 167 Hz

H,H-COSY von 1-13C-Glucose

H1

H1H2

H3

H4

H5

H6

© Dr. Rudolf Hartmann

H1

H1

H2

H3

H4 H5

2xH6

TOCSY von Valin

Abstandsinformation

• J-Kopplungen geben Auskunft über chemische Struktur und sind daher für die chemische Analyse organischer Moleküle sehr wertvoll

• Die chemische Struktur von Proteinen sollte allerdings bekannt sein, bevor es mit NMR-Spektroskopie untersucht wird.

• Wie bekommt man Abstandsinformation?• Wir erinnern uns: Atomkerne sind kleine

Magnetnadeln, die als solche auch ein Magnetfeld um sich herum aufbauen.

• Frage: Was spüren Nachbarkernspins von diesem Magnetfeld?

Dipolare Kopplungen

B0

Dipolare Kopplungen

B0

Fazit Dipolkopplungen

• Das Magnetfeld, das ein Kernspin von seinem Nachbarn spürt, hängt von drei Dingen ab– Dem Kernspinzustand des Nachbarn (mZ)– der Entfernung r der beiden Spins– der relativen Orientierung des Abstandsvektors zum äußeren

Magnetfeld (charakterisiert durch den Winkel , zwischen r und dem äußeren Magnetfeld)

21 23 3cos 1Z

AB

D mr B0

rAB

Wie macht sich die Dipolkopplung im NMR-Spektrum bemerkbar?

• In Flüssig-NMR-Spektren: zunächst gar nicht.• Wir erinnern uns: NMR-Spektroskopie ist eine langsame

Methode und misst oft nur zeitliche Mittelwerte• Der Mittelwert der dipolaren Kopplung über alle Orientierungen

ist 0• Für Moleküle mit einem Molekulargewicht < 30 kDa in wässriger

Lösung sind dipolare Kopplungen durch die schnelle Reorientierung ausgemittelt (keine Aufspaltung)

• Bei größeren Proteinen: Linienverbreiterung (deshalb auch Größenlimitierung), wenn die Ausmittelung zu langsam erfolgt.

• Festkörper-NMR-Spektroskopie: Wenn die Moleküle statisch im Magnetfeld liegen, sind Dipolkopplungen sichtbar!

Kreuzrelaxation, NOE2 2 2

1 6 2 2

320 1

I I S c

I c

Wr

Normale Relaxation in den Grundzustand (→keine Crosspeaks)

2 2 2

0 26 2

110 1

I S c

I S c

Wr

Nullquantenkreuzrelaxation (große Moleküle )

2 2 2

2 26 2

35 1

I S c

I S c

Wr

Doppelquantenkreuzrelaxation (kleine Moleküle )

→ Dipolar gekoppelte (räumlich benachbarte)

Kernspins können durch den Raum Magnetisierung

miteinander austauschen

2D NOESY-Spektroskopie

→ Kreuzrelaxation während der longitudinalen Mischzeit führt zu Crosspeaks im 2D-Spektrum

→ Treten Crosspeaks auf, so wissen wir, dass diese Kernspins räumlich benachbart sind

(Abstandsinformation).

Abstände zwischen Protonen

Ausschnitt aus einem 2D NOESY; zeigtKreuzsignale zwischen Amidprotonenund aliphatischen Protonen

Kreuzsignale:- zuordnen- kalibrieren- quantifizieren

NOE ~ rAB-6

rAB

2D-NOESY- schematisch

Welches Proton ist zu wem räumlich benachbart?

→ Abstände sind wertvolle Strukturinformationen.→Kennt man genügend

Abstände, lässt sich daraus die gesamte Molekülstruktur

rekonstruieren

Fazit 2D-NMR

• Zweidimensionale NMR-Spektroskopie bietet ein Arsenal an Möglichkeiten, Informationen über Konnektivitäten (J-Kopplungen) oder räumliche Nähe (Kopplungen durch den Raum) in einem Molekül zu bekommen.

• Die Methoden lassen sich noch erweitern:– Heteronuklearer Transfer (von H auf N oder C)– Dreidimensionale NMR-Spektroskopie: Das Spektrum ist ein Würfel,

in dem jeder Punkt im Raum eine gewisse Signalintensität hat.

Protein-Flüssig-NMR-Spektroskopie

P

nicht auf Proteine beschränkt:

- Nukleinsäuren (RNA, DNA)- Polysaccharide- Membransysteme- Molekülkomplexe- ganze Zellen („in cell NMR“)

Aufbau Puls-FT-NMR-Spektrometer

-> in Jülich während Praktikum P

• Was verstehen wir unter 3D Proteinstruktur?• Warum experimentelle Bestimmung der Proteinstruktur?

• Wie funktioniert das mit Flüssig-NMR-Spektroskopie?

• Ligandenbindung und NMR-Spektroskopie

Was verstehen wir unter 3D Proteinstruktur?

• Kartesische (Raum)Koordinaten aller Atome zusammen mit der Kenntnis der kovalenten (chemischen) Struktur

oder• Torsionswinkel zusammen

mit der Kenntnis der kovalenten Struktur

Eigentlich Konformation!Verschiedene Betrachtungsebenen:- Primärstruktur (Aminosäuresequenz, kovalente (chemische) Struktur- Sekundärstruktur (Konformation des Proteinrückgrates- Tertiärstruktur (gesamte Struktur, Faltung)- Quartärstruktur (Oligomere, Komplexe, supramolekulare Strukturen)

P

Warum experimentelle Bestimmung der Proteinstruktur?

• Proteinstruktur bestimmt Funktion des Proteins (Enzyme, Ionenkanäle, Rezeptoren, Strukturproteine, Regulationsproteine etc.; Proteinfehlfaltungen -> Krankheiten)

• Vertieftes Verständnis nur mit/durch die 3D Struktur

Wie funktioniert das mit Flüssig-NMR-Spektroskopie?

Strukturvalidierung und -interpretation

Strukturrechnung

Sammeln von Struktureinschränkungen (NOE-Zuordnung, 3J, sekundäre chem. Versch.)

Präparation der Protein-NMR-Probe

Aufnahme der NMR-Spektren

Sequenzspezifische Resonanzzuordnung (Proteinrückgrat)

Resonanzzuordnung der Seitenketten

Protein-NMR-Probe

• Konzentration: ca. 1 mM• Reinheit > 95%• ab ca. 50 Aminosäurereste -> Isotopenanreicherung mit

13C und 15N: warum?• monodisperse Probe (keine Aggregation, keine

verschiedenen Zustände)• langzeitstabil

Protein-NMR-Probe

Transformation

Protein-NMR-Probe

Protein-NMR-Probe

• Zellaufschluß• Proteinreinigung (chromatographische Methoden)• Konzentrierung der Proteinprobe (Ultrafiltration)• Vorcharakterisierung der Probe (Reinheit: SDS-PAGE,

lichtspektroskopische Methoden, Lichtstreuung usw.)

• 13C/15N-Isotopenanreicherung: spezielle, künstliche Wachstumsmedien für Bakterienkulturen -> Minimalmedium, z.B. M9 (Kohlenstoffquelle z.B. 13C-Glukose, Stickstoffquelle 15N-Ammoniumsalze)

Protein-NMR-Probe

Alternative Expressionssysteme:

- Hefe- oder Insektenzellkulturen (posttranslationaleModifikationen eukaryotischer Proteine) -> sehr teuer

- Zellfreie Expression (Zellextrakte mit allen wichtigen Komponenten)

Aufnahme NMR-Spektren

methyl

aliphatic

Hbackbone HN

aromatic

side-chain HN

1D Protonenspektrum („Lieblingskern“: höchste Empfindlichkeit)

P

Ausweg: 2D Protonen-Spektren

2D 1H-1H-TOCSY (28 Aminosäurereste-Peptid, Zink-Finger)

Ausweg: 2D Protonen-Spektren

2D 1H-1H-COSY (128-aa Protein, Lysozym)

Ausweg: 2D Protonen-Spektren

2D 1H-1H-NOESY (85 aa, HPr)

Ausweg: Heteronukleare NMRAusweg: Höherdimensionale NMR

Ausweg: Heteronukleare NMR1H-15N-Korrelations-Spektrum (HSQC)

(1H) [ppm]

(15

N) [

ppm

]

P

Ausweg: Heteronukleare NMR1H-15N-Korrelations-Spektrum (HSQC)

(1H) [ppm]

(15

N) [

ppm

]=1/(4*1JHN)

4=1/1JHN=1/90-95Hz=10-11 ms

Ausweg: Heteronukleare NMRAusweg: Höherdimensionale NMR-> 3D Zuordnungsexperimente

Ausweg: Höherdimensionale NMR-> 3D Zuordnungsexperimente

3D Zuordnungsexperimente

3D HNCACB

13C

15N1HN

3D Zuordnungsexperimente

3D HNCACB

C(i)

C(i-1)

C(i)

C(i-1)

P

3D Zuordnungsexperimente

3D Zuordnungsexperimente

2D (1H-15N)-HSQC zugeordnet!

P

3D Zuordnungsexperimente

Struktureinschränkende Parameter(experimentell aus NMR-Spektren!!)

• Torsionswinkel-Einschränkungen aus 3J-Kopplungskonstanten

• Torsionswinkel-Einschränkungen () aus chemischen Verschiebungen des Rückgrates

• Definition von Wasserstoffbrückenbindungen aus 1H/2H-Austauschexperimenten („H/D-Austausch) oder aus hJ-Kopplungskonstanten

• 1H-1H-Abstände aus NOE-Korrelationen

Struktureinschränkende Parameter

• Torsionswinkel-Einschränkungen aus 3J-Kopplungs-konstanten -> Karplus-Beziehung

Beispiel: Torsionswinkel φ des Proteinrückgrates aus3JHN-Hα

C)60cos(B)60(cosA)(J 2

Struktureinschränkende Parameter

• Torsionswinkel-Einschränkungen aus 3J-Kopplungs-konstanten -> Karplus-Beziehung

Struktureinschränkende Parameter• Torsionswinkel-Einschränkungen () aus chemischen

Verschiebungen des Rückgrates: C, C, C‘, H u.a.-> sekundäre chemische Verschiebung (chemischer-Verschiebungs-Index, CSI)

P

Struktureinschränkende Parameter• Definition von Wasserstoffbrückenbindungen aus 1H/2H-Austausch-

experimenten („H/D-Austausch) oder aus hJ-Kopplungskonstanten

P

Struktureinschränkende Parameter• Definition von Wasserstoffbrückenbindungen aus 1H/2H-Austausch-

experimenten („H/D-Austausch) oder aus hJ-Kopplungskonstanten

2hJHN-C‘=0,5 Hz

Struktureinschränkende Parameter• 1H-1H-Abstände aus NOE-Korrelationen (Kreuzrelaxation)

2 2 2

1 6 2 2

320 1

I I S c

I c

Wr

Normale Relaxation in den Grundzustand (→keine Crosspeaks)

2 2 2

0 26 2

110 1

I S c

I S c

Wr

Nullquantenkreuzrelaxation (große Moleküle )

2 2 2

2 26 2

35 1

I S c

I S c

Wr

Doppelquantenkreuzrelaxation (kleine Moleküle )

→ Dipolar gekoppelte (räumlich benachbarte) Kernspins können durch den Raum Magnetisierung

miteinander austauschen

Kern (nuclear)-Overhauser-Effekt (enhancement)

Struktureinschränkende Parameter• 1H-1H-Abstände aus NOE-Korrelationen (Kreuzrelaxation)

Kreuzsignale:- zuordnen- kalibrieren- quantifizieren

rAB < 5Å

Struktureinschränkende Parameter• 1H-1H-Abstände aus NOE-Korrelationen (Kreuzrelaxation)

3D (1H-1H-15N)-NOESY-HSQC

2D (1H-15N)-HSQC

INOE ~ r-6

1H [ppm]

Struktureinschränkende Parameter• NOEs und Sekundärstruktur-Elemente: -Helix

P

Struktureinschränkende Parameter• NOEs und Sekundärstruktur-Elemente: -Helix

P

Struktureinschränkende Parameter• NOEs und Sekundärstruktur-Elemente: -Faltblatt parallel

P

Struktureinschränkende Parameter• NOEs und Sekundärstruktur-Elemente: -Faltblatt antiparallel

P

Struktureinschränkende Parameter• Sekundärstruktur-Elemente zusammen gefaßt

Strukturberechnung• Möglichst alle gemessenen NOEs zuordnen

1H [ppm]

HN

HNOE

Strukturberechnung

HN V275

1H [ppm]

Strukturberechnung1H

[ppm]

HA V275

HB V275

HG2 V275HG1 V275

1H [ppm]

Strukturberechnung

HN V275

HA V275

HB V275

HG2 V275HG1 V275

HN F274

HD F274

HA F274

HBs F274

HN F295

HA F295

HN A294

HB A294

HA P292

HN V276

P292F295

A294

V276

F274

1H [ppm]

Strukturberechnung• Möglichst alle gemessenen NOEs zuordnen

StrukturberechnungDie potenzielle Energie einer Modell-Struktur: Molekülmechanik / Kraftfeld

StrukturberechnungDie potenzielle Energie einer Modell-Struktur: Molekülmechanik / Kraftfeld

Strukturberechnung

Die potenzielle Energie einer Modell-Struktur plus zusätzliches Potential (Energie) für NOE-Abstandseinschränkungen

StrukturberechnungMolekulardynamik-Simulation

Lösen der Newtonschen Bewegungsgleichungen für alleAtome i im Potentialfeld U

Kinetische Energie folgt einem Temperaturprotokoll

Koordinaten des Protein-Modells ändern sich mit t

Ziel: Minimierung der potenziellen Energie

P

StrukturberechnungMolekulardynamik-Simulation

Movie!

StrukturberechnungStrukturschar

r.m.s. Abweichung zur mittleren Struktur:

Proteinrückgrataller Schweratome

r.m.s. Abweichung zur mittleren Struktur:

Proteinrückgrataller Schweratome

0.037 nm0.070 nm0.037 nm0.070 nm

r.m.s. Abweichung zur mittleren Struktur:

Proteinrückgrataller Schweratome

0.037 nm0.070 nm

cAMP-freie CNBD

Konformerenschar (15 Strukturen)

cAMP-freie CNBD

Konformerenschar (15 Strukturen)

NC

P

StrukturberechnungValidierung

- Anzahl und Stärke von Verletzungen (Nichteinhalten) der experimentellen Einscränkungen

- Ramachandran-Plot (erlaubte -Bereiche)- Allgemeine Geometrie der Struktur, van-der-Waals-

Zusammenstöße- Machen lokale Interaktionen Sinn? (polare WW -> H-

Brückenbind., Salzbrücken; unplolare WW -> hydrophober Kern)

- Beantwortet die Struktur biologische Fragen?

P

Bindungsstudien mit NMR

LPLP 'onk

offk

.

.

..

..

.koff groß

koff klein

Bindungsstudien mit NMR

1H chemische Verschiebung [ppm]

15N

che

mis

che

Vers

chie

bung

[ppm

]

CNBDcAMP-frei

NMR-Titrationsexperiment von CNBD mit cAMP

CNBD+ 250 µM cAMP

Bindungsstudien mit NMR

cAMP-freie CNBDcAMP-freie CNBD cAMP-gebundene CNBDcAMP-gebundene CNBD

-> starker Binder (hohe Affinität): zwei komplette Strukturen lösen!

Bindungsstudien mit NMR-> schwächere Binder (geringere Affinität): Mapping des Bindeepitops sehr schnell möglich!Titrationsexperimente mit 15N-Protein und unmarkiertem Ligand (natürliche Isotopenhäufigkeit)

NMR-Struktur(GABAA-Rezeptor

assoziierte Protein

GABARAP)

Interaktions-Partner (Trp)

Interaktions-analyse

Zeitskalen

From M.H. Levitt, „Spin Dynamics“

Alle Zustandsänderungen, die schneller als die

spektrale Zeitskala sind, führen dazu, dass im

Spektrum ein Mittelwert beobachtet wird (z.B. Entkopplung, dipolare

Kopplungen, Austausch von Protonen)

Alle Zustandsänderungen, die langsamer als die

spektrale Zeitskala sind, führen dazu, dass im Spektrum

zwei getrennte Signale beobachtet

werden.

Wechselwirkungen

• Zeeman-Wechselwirkung HZ: Wechselwirkung mit dem äußeren Magnetfeld

• Chemische Verschiebung HCS: Modulation des äußeren Magnetfeldes durch die Elektronenhülle

• Magnetfelder benachbarter Kernspins, die im Magnetfeld unterschiedliche stationäre Zustände einnehmen können:– Durch den Raum (Dipolkopplungen) HD

– Über Bindungen vermittelt (indirekte, oder J–Kopplungen) HJ

NMR –Wechselwirkungen sind orientierungsabhängig

• NMR Wechselwirkungen hängen von der Orientierung im Magnetfeld ab

• Sie werden durch einen orientierungsabhängigen Tensor repräsentiertB0k

rk

11 21 31

12 22 32

13 23 33

ˆA A A

A A A AA A A

0ˆI A B

Beispiel chemische Verschiebung

0

0

0 0

00

CSx xx xy xz xzCSy yx yy yz yzCSz zx zy zz zz

B BB BB B B

0ˆCSB B

Tensoren

• Tensoren repräsentieren Vektortransformationen (Drehungen, Streckungen)• Tensoren beschreiben die Wechselwirkungen zweier vektorieller Größen in

Abhängigkeit der Orientierung• Die Spur eines Tensors (A11+ A22+ A33) ist orientierungsunabhängig• Für drei Orientierungen beschreibt der Tensor eine Streckung ohne

Drehung. • In diesem Fall liegt der Tensor in Diagonalenform vor

• Axx, Ayy und Azz sind die drei Tensorhauptwerte• Ein Tensor wird durch drei Tensorhauptwerte sowie

drei Winkel, die ihn im Raum orientieren, vollständigcharakterisiert.

0 00 00 0

xx

yy

zz

AA A

Ax y

z

Tensoren

• Jeder Tensor ist durch drei Hauptwerte Axx, Ayy und Azz sowie drei Winkel, die ihn relativ zum Bezugskoordinatensystem orientieren, charakterisiert.

• Alternativ zu den drei Werten Axx, Ayy und Azz lassen sich auch drei andere charakterisitsche Größen angeben, die die Form des Tensors anschaulicher wieder geben und folgendermaßen von den drei Tensorhauptwerten abhängen:

• Der isotrope Wert Aiso= 1/3(Axx+Ayy+Azz)

Konvention |Azz-Aiso| ≥ |Axx-Aiso| ≥ |Ayy-Aiso|

• Die Anisotropie A = Azz - Aiso

• Die Asymmetrie = (Ayy - Axx)/A

Azz

AyyAxx

Die chemische Verschiebung hängt von der Orientierung des Moleküls im Magnetfeld ab (CSA = Chemical Shift Anisotropy)

Pulverspektrum (Summe über alle Orientierungen) CSA Tensor ist ein Maß für die Elektronenverteilung

Chemische Verschiebungs-Anisotropie

32

1

1 (3cos 1)3

obs iso k kkk

zz

yy

xx

0 0.5 1

0 0.5 1

>0

xx

yy

zz

yy

yy yy yy

yy xx

zz xx

xx

xx zzzz

zz xx zz

Chemische Verschiebungs-Anisotropie

Dipolare Kopplungen

B0

Dipolare Kopplungen

B0

Dipolare Kopplungen

21 23~ (1 3cos )DH

r

„Pulverspektrum eines isolierten Spinpaares

Dipolare Kopplungen

21 23~ (1 3cos )DH

r

B0

r

Reduktion der Linienbreiten (I): Orientierte ProbenAlle Moleküle werden gleichausgerichtet (Einkristall, Lipiddoppelschicht, auf Glasplatten aufgetragen) Chemische Verschiebungund Dipolkopplung gebenAufschluss auf Orientierungdes Tensors (und damit auchdes Moleküls)

Linienverschmälerung(I): Orientierung

Einkristall in verschiedenen Orientierungen (31P-Spektrum)Naito, A.; Sastry, D. L.; McDowell, C. A. Chem. Phys. Lett. 1985, 115, 19.

Orientierte ProbenPISEMA : 2D Correlationspekrum (dipolare NH-Kopplung) (Abstand bekannt) mit 15N Verschiebung korelliert (CSA tensor bekannt) Orientierungen aller AMidgruppen. Powder Spectrum

NH

Dip

olar

Cou

plin

g

15N Chemical Shift

M. Bak, J.T. Rasmussen, N.Nielsen, J. Magn. Reson. 2000, 147, 296-330.

Homonuclear Decoupling

t1

DECCP

CP

1H

15N

t2

Orientierte Lipiddoppelschichten

Opella, S.J., Marassi F.M.., Chem. Rev. 2004, 104, 3587-3606.

PISEMA Spektren Orienter Helices

Circular patterns(PISA Wheels) depend on the tiltangle of the helixaxis

Opella, S.J., Marassi F.M.., Chem. Rev. 2004, 104, 3587-3606.

30°

NH

dip

olar

cou

plin

g (k

Hz)

250 150 50250 150 50

=0° 60°

90°

15N Chemical Shift (ppm)

PISA Wheels of Membrane Proteins

Opella, S.J., Marassi F.M.., Chem. Rev. 2004, 104, 3587-3606.

Residue-type labeling of amino acids facilitates sequential assignments

Ile Val

Ala Leu

full

simulated

Imitation der Brown’schen Molekularbewegung durch schnelle Rotation um den magischen Winkel

54.7°

32

1

1 (3cos 1)3

obs iso k kkk

21 23~ (1 3cos )DH

r

1arccos 54.73

Reduktion der Linienbreiten: Magic Angle Spinning

Magic-Angle Spinning (MAS)

• >: isotropes Signal (wie in Lösung)

• Inhomogene Linienbreiten (z.B. CSA):Rotationsseitenbanden im Abstand ±n·rot von der isotropen chemischen Verschiebung

• Homogene Verbreiterungen (Netzwerk dipolar gekoppelter Kerne):Keine vollständige Elimination der Linienverbreiterungen; Spindiffusionseffekte

Rotationsseitenbanden: Warum?

+

+

1

23

x

y

Unterschiedliche Resonanzfrequenzen → unterschiedliche Präzessionsfrequenzen

x

z

yx

z

y

rf-Puls

x

z

y

Anisotrope Verschiebungen-Der statische Fall

Verschiedene Orientierungen

x

y

t

t

MAS

x

y

Rotationsechos

2 kHz

4 kHz

Rotationsechos und Rotationsseitenbanden

trot

1rot

rot

t

t

FT

Rotationsechos und die zugehörigen Seitenbanden

2 kHz

4 kHz

Rotationsechos (Glycin, simuliert)

Magic Angle Spinning – Zwischenbilanz

• Magic-Angle-Spinning eliminiert anisotrope Linienverbreiterungen

• Ist die Rotationsfrequenz kleiner als die Anisotropie, so treten Rotationsseitenbanden im Abstand ± nrot auf.

• Dies gilt exakt nur für inhomogene Linienverbreiterungen (Chemische Verschiebungsanisotropie, Dipolkopplungen zwischen isolierten Spinpaaren).

• Homogene Linienverbreiterungen (homonukleare Dipolkopplungen in einem Netzwerk stark gekoppelter Spins) lassen sich durch Magic-Angle-Spinning nicht vollständig eliminieren.

Inhomogene Linienverbreiterung

→ jedes Molekül hat eine definierte Resonanzfrequenz

a=100Hz

Homogene Linienverbreiterung: kurze Lebensdauer des Spinzustandes

exp(-at) 1/(1+(2/a)2

a=1kHz

Inhomogene Linienverbreiterungen lassen sich refokussieren – homogene nicht

Inhomogen! Homogen!

x

y

Homogene/Inhomogene Linienbreiten -Lochbrennen

rf

Einstrahlung einer rf-Frequenz sättigt alle Übergänge dieser Frequenz

Inhomogene Linienverbreiterung: Lochbrennen

Homogene Linienverbreiterung: Das gesamte Signal wird gesättigt

1 23~DH

r

Netzwerk homonuklearer dipolar gekoppelter Spins

• „Flip-flop“-Übergänge (Nullquantenübergänge)

• Je stärker die dipolare Kopplung (je größer das gyromagnetische Verhältnis und je höher die Dichte an Kernspins), desto wahrscheinlicher ist so ein Übergang.

• Im 3D-Netzwerk wird Magnetisierung sehr schnell ausgetauscht und durch die gesamte Probe weitergereicht.

→ Spindiffusion.

• Vor allem Protonen (hohes gyromagnetisches Verhältnis, hohe Dichte).

t

Dipolkopplungen-isoliertes Spinpaar

x

y

t

Dipolkopplungen - Netzwerk

y

x

Protonen in der Festkörper-NMR-Spektroskopie

800 MHz, Rotationsfrequenz: 20 kHz

HNNH

+H3N

CO2-

+

H2H

H21

H12

NH

Aromaten+ NH3

HH

DQ(SPC5)

Konsequenzen

• Hochauflösende Festkörper-NMR-Spektroskopie von Protonen ist oft nicht realisierbar

• Stattdessen: 13C und 15N Isotopenmarkierung• Heteronukleare Kopplung zum Protonennetzwerk macht

auch 13C- und 15N-Linienbreiten homogen • Protonenentkopplung

– Einstrahlung von rf-Strahlung auf dem 1H-Kanal während der Evolutions-und Detektionsperioden

– Dadurch wechseln die Protonen so häufig ihren Spinzustand, dass benachbarte 13C- und 15N Kerne nur noch einen gemittelten Duchschnittsuzstand sehen.

Protonen in der Festkörper-NMR-Spektroskopie

800 MHz, Rotationsfrequenz: 20 kHz

HNNH

+H3N

CO2-

+

H2H

H21

H12

NH

Aromaten+ NH3

HH

DQ(SPC5)C

C

C

CC

CO

13C-Spektrum mit high-power Protonenentkopplung

Isotopenmarkierung

• Kurze Peptide, Festphasensynthese: Vollständig markierte Aminosäuren oder spezifisch isotopenmarkierte Aminosäuren können beliebig und sequenzspezifisch eingeführt werden.

Abstandsmessung zwischen einzelnen Spins möglich

• Rekombinant exprimierte Proteine:

Minimalmedium aus isotopenmarkierten Nährstoffen; markierte Isotope werden statistisch eingebaut.*

*Geib, K. H.; Bonhoeffer, K. F., Z Phys Chem. A 1936, 175, 459-468.

Festkörper-NMR:Experimente

E. HahnJ.S. Waugh

A. Pines

1H

X

1H

X

,RF

S,RF

90

Kreuzpolarisation (Cross Polarisation CP)

• Signalverstärkung

• Umgehen der oft langen T1-Relaxation für Heterokerne

• Selektion bestimmter Spinpaare

• Spinlock der 1H-Magnetisierung

• Durch gleichzeitiges Einstrahlen eines rf-Feldes auf dem X-Kanal wird der Polarisationstransfer auf X begünstigt, wenn I,RF = S,RF

CP MAS 1 1 , 1,2I S Rk k

CP MAS

I-S/R=-2 -1 1 2

Magnetisierungstransfer ist möglich, wenn:

1H

X

,RF

S,RF

90

Hartmann-Hahn-Bedingung

Mixing time [ms]

0

100

200

300

400

500

600

700

0 1 2 3 4 5 6

1.5 2.5 3.5 Distance inÅ

I-S=MASSignal buildup

Abstandsmessung ist möglich

1H

X

Cross-Polarization 2D

t1

t2

I

S

CP

CP

Entkopplung

I

S

HETCOR-Spektren:Korrelation zwischen dipolar gekoppelten Kernen

Selektiver Transfer auf CO oder Cmöglich: Specific-CP

Baldus, M.; Petkova, A. T.; Herzfeld, J.; Griffin, R. G. Mol. Phys. 1998, 95, 1197-1207.

N/C transfer: intraresidue N/C correlation

N/CO transfer: interresidue N/C correlation

CP für heteronuklearen Transfer

2D Spektren

Tripeptid AGG (Ala-Gly-Gly)

Imitation der Brown’schen Molekularbewegung durch schnelle Rotation um den magischen Winkel

54.7°

32

1

1 (3cos 1)3

obs iso k kkk

21 23~ (1 3cos )DH

r

1arccos 54.73

Wiedereinkopplung (Recoupling)

Dipolar Recoupling

Homonuklear:

Rotational resonancerotary resonanceHORRORRFDRC-Sequences (SPC5, POST-C7 ect)R-sequences (R18, R14)

Heteronuklear:

REDOR

Double-quantum Hamiltonian:

HDQ =deff (I1+I2+ + I1-I2-)

Zero-quantum Hamiltonian:

HZQ = deff (I1+I2- + I1-I2+)

Idee: Wird die periodische Modulation der

Dipolkopplung mit einer zweiten periodischen

Modulation überlagert, so wird die Ausmittelung

aufgehoben.

Heteronukleare Wiedereinkopplung

2 180°-Pulse pro Rotorperiode

t

Dipolkopplungen-isoliertes Spinpaar

x

y

t

REDOR Recoupling

y

x

REDOR Signal:dephasiert aufgrund der Dipolkopplung

Abstandsmessung15N

13C13C

REDOR Abstandsmessung

1

2

R

R

RR Bedingung

Rotational Resonance (RR)

13C

13CR.G. Griffin

Symmetrie-basierte Pulssequenzen

C-Sequenzen R-SequenzenM. H. Levitt

Homonuclear Dipolar Recoupling: Longitudinal Mixing

exc t1 Recoupling t2

Diagonal peaks: I(1,1) = I(2,2) = cos2(defftmix)

Cross-peaks: I(1,2) = I(2,1) = ±sin2(defftmix)

k l

k

l

Doppelquantenspektroskopie

t1DQ excitation t2

01

-1

1 2 rec

p11 + p22 = -rec

p1 = ±2p2 = -11 = {0°,90°,180°,270°}4

2 = {0°}4 {90°}4 {180°}4 {270°}4

rec= {0°,180°}2 {90°,270°}2 {180°,0°}2 {270°,90°}2

DQ reconversion

Ohne t1-Evolutionszeit: Doppelquantenfilter (siehe Praktikum)

-2

2

Doppelquantenspektroskopie

t1DQ excitation t2

1 2 rec

DQ reconversion

1 2

1+2

3

1+3

2+3 Keine Diagonalsignale.

Cross-Relaxation (Spin Diffusion)

exc t1 t2mix

Spin-Diffusion: Austausch von Magnetisierung zwischen dipolar gekoppelten Kernen

Protonen

Heterokerne: keine Protonenentkopplung während des Mischens

Fazit

• Im Festkörper sind chemische Verschiebung und dipolareKopplungen zwischen den Kernspins abhängig von der Orientierung des Moleküls im Magnetfeld.

• MAS eliminiert die anisotrope Linienverbreiterung.

• Die Ausmittelung durch MAS kann durch rotor-synchronisierte rf-Felder ausgeschaltet werden.

• Wechselwirkungen können so kurzzeitig ein- und ausgeschaltet werden. → Großes Arsenal an Möglichkeiten.

Festkörper-NMR-Spektroskopie von Biomolekülen Wozu?

• Röntgenkristallographie setzt kristalline Proben voraus

• Flüssig-NMR setzt lösliche Proben voraus

• Proteine in ihrer natürlichen Umgebung sind oft weder löslich nochkristallin. (Membranproteine, Protzeinaggregate, molekulareKomplexe mit großer Masse)

MAS NMR von extensiv isotopenmarkiertenProteinen

Heise, H.; Hoyer, W.; Becker, S.; Andronesi, O. C.; Riedel, D.; Baldus, M., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 15871-15876.

Erster Schritt: sequenzielle ZuordnungBeispiel: 140 Proteinfibrille aus einem Protein mit 140-Aminosäuren (-Synuclein)

Luca, S.; Heise, H.; Baldus, M. Acc. Chem. Res. 2003, 36, 858-865.

2D Homonukleare 13C Korrelationsspektroskopie

CO C C

Doppelquantenkorrelation

Homonuklear: SD, DQ-mixingIntraresidue transfer-> spin systems

160

60

20

180

40

CO C C

Einquantenkorrelation

Tripeptid: Ala-Gly-Gly

Die Zukunft: Sensitivity, sensitivity, sensitivity

• Größter Nachteil der NMR-Spektroskopie: die geringe Empfindlichkeit

Boltzmann:

• N/N ~ exp(-E/kT)

• 600 MHz, RT: auf 500000 -spins kommen 500001 spins im -Zustand.

DNP

• Dynamic Nuclear Polarization (historischer Name, nicht wirklich aussagekräftig): Magnetisierung wird von Elektronen auf Kernspins übertragen

• Der Original-Overhauser-Effekt beruht auf dem Magnetisierungstransfer von Elektronen auf Kernspins durch Kreuzrelaxation (Elektronen-Kern-NOESY)

• Overhauser-Effekt: Doppelquanten-Kreuzrelaxation• Solid-Effekt: Verbotene Übergänge werden angeregt• Cross-Effekt/Thermal mixing: Dreispinprozess