NMR-Spektroskopische Untersuchungen von ...elib.suub.uni-bremen.de/diss/docs/00010860.pdf · In der NMR-Spektroskopie werden hauptsächlich eindimensionale Experimente eingesetzt

NMR-Spektroskopische Untersuchungen

von

Körperflüssigkeiten

(Kinderurin)

DISSERTATION

Zur Erlangung des Grades eines Doktors

der Naturwissenschaften

-Dr. rer. nat.-

Dem Fachbereich Biologie/Chemie der

Universität Bremen

vorgelegt von

Simone Tamoschus-Witt

Bremen

September, 2007

1. Gutachter: Prof. Dr. Dieter Leibfritz

2. Gutachter: Prof. Dr. Wolf-Dieter Stohrer

Meinen Eltern

In der Wissenschaft gleichen wir alle nur den Kindern, die am Rande des Wissens hie und da

einen Kiesel aufheben, während sich der weite Ozean des Unbekannten vor unseren Augen

erstreckt.

- Isaac Newton (1643-1727) -

Danksagung

I

Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. D. Leibfritz für die Themenstellung und die

Unterstützung und Förderung, die es mir ermöglicht haben, diese Arbeit fertig zu stellen.

Herrn Prof. Dr. Stohrer danke ich für die Bereitschaft zur Begutachtung und Diskussion

dieser Arbeit.

Bei Herrn Dipl.-Ing. Johannes Stelten und Dr. Wieland Willker bedanke ich mich für die

Unterstützung bei technischen Problemen und NMR-spektroskopischen Fragestellungen.

Frau Dipl.-Ing. Dorit Kemken danke ich für die schnelle und erfolgreiche Einarbeitung in die

HPLC.

Vielen Dank an alle Mitarbeiter der Arbeitsgruppe Prof. Dr. D. Leibfritz für die Hilfe und die

Ratschläge im Rahmen der praktischen Arbeit, sowie die fördernden und unterhaltsamen

Gespräche.

Ich danke allen Mitarbeitern und Freunden, die mir bereitwillig Proben zur Verfügung gestellt

haben.

Ein spezieller Dank gilt meinen Freunden und meiner Schwester, die mich begleitet, meine

Launen ertragen und mich immer wieder motiviert haben.

Ganz besonders danke ich meinen Eltern für ihr Verständnis und die liebevolle Unterstützung

in jeder Hinsicht.

Danke Torben, für die unendliche Geduld und Liebe.

Inhalt

II

1. Einleitung.........................................................................................................5

2. Darstellung der Methoden

2.1. Kernmagnetische Resonanzspektroskopie......................................................................7

2.1.1. Einführung.............................................................................................................7

2.1.2. Physikalische Grundlagen.....................................................................................7

2.1.3. Allgemeine Experimente.......................................................................................8

2.1.4. Anwendungsgebiete..............................................................................................9

2.1.5. Aufarbeitung von Körperflüssigkeiten für die NMR-Spektroskopie..................10

2.1.5.1. Aufarbeitung von Urin.........................................................................10

2.2. Festphasenextraktion.......................................................................................................11

2.2.1. Einführung...........................................................................................................11

2.2.2. SPE-Phasen.........................................................................................................12

2.2.3. Methodenentwicklung.........................................................................................13

2.2.4. Durchführung der Trennung................................................................................14

2.3. Hochdruckflüssigchromatographie................................................................................16

2.3.1. Einführung...........................................................................................................16

2.3.2. Methodenentwicklung.........................................................................................17

2.3.3. Durchführung der Trennung................................................................................18

2.4. Ergebnisse der Trennungen............................................................................................18

2.4.1. Festphasenextraktion...........................................................................................19

2.4.1.1. Chromabond C18..................................................................................20

2.4.1.2. Chromabond EASY..............................................................................21

2.4.2. Hochdruckflüssigchromatographie.....................................................................22

2.4.3. Zusammenfassung...............................................................................................24

3. Identifizierung unbekannter Metabolite

3.1. Anatomie und Funktion der Niere.................................................................................25

3.2. Einführung........................................................................................................................27

3.2.1. Allgemeine Durchführung...................................................................................28

3.3. Vorstellung der Metabolite.............................................................................................29

3.3.1. Aromatische Verbindungen.................................................................................30

3.3.1.1. Aromaten..............................................................................................30

Inhalt

III

3.3.1.2. Heteroaromaten....................................................................................35

3.3.1.2.1. Nukleoside.........................................................................................35

3.3.1.2.2. Pyridine..............................................................................................39

3.3.1.2.3. Indole und Imidazole.........................................................................42

3.3.2. Proteinogene Aminosäuren.................................................................................44

3.3.2.1. Unpolare, aliphatischeAminosäuren.....................................................44

3.3.2.2. Aromatische Aminosäuren...................................................................46

3.3.2.3. Polare, ungeladene Aminosäuren.........................................................48

3.3.2.4. Positiv geladene Aminosäuren.............................................................50

3.3.3. Kohlenhydrate.....................................................................................................52

3.3.3.1. Monosaccharide....................................................................................53

3.3.3.2. Disaccharide.........................................................................................57

3.3.3.3. Zuckeralkohole.....................................................................................58

3.3.4. Biogene Amine....................................................................................................60

3.3.4.1. Quartäre Ammoniumverbindungen......................................................60

3.3.4.2. Methylamine.........................................................................................62

3.3.4.3. Guanidin-Verbindungen.......................................................................63

3.3.4.4. Primäre Amine......................................................................................65

3.3.5. Carbonsäuren.......................................................................................................67

3.3.5.1. Dicarbonsäuren.....................................................................................67

3.3.5.2. Tricarbonsäuren....................................................................................70

3.3.5.3. Aminocarbonsäuren..............................................................................72

3.3.5.4. Hydroxycarbonsäuren...........................................................................73

3.3.5.5. Oxocarbonsäuren..................................................................................75

3.3.5.6. Andere Verbindungen..........................................................................76

3.4. Zusammenfassung............................................................................................................78

4. Einfluss der Ernährung auf die Zusammensetzung des Urins

4.1. Einführung........................................................................................................................80

4.2. Allgemeine Durchführung...............................................................................................81

4.3. Untersuchte Nahrungsmittel...........................................................................................81

4.3.1. Bananen...............................................................................................................82

4.3.2. Pekanüsse............................................................................................................84

4.3.3. Orangen...............................................................................................................85

Inhalt

IV

4.4. Zusammenfassung............................................................................................................89

5. Anhang............................................................................................................90

5.1. Lagerung und Vorbereitung der Urinproben...............................................................90

5.2. Durchführung der NMR-Messungen.............................................................................90

5.3. NMR-Parameter von Urin-Metaboliten (pH 5,85).......................................................91

6. Abkürzungen................................................................................................107

7. Literatur.......................................................................................................109

Einleitung

5

1. Einleitung

Die Urinuntersuchung ist eine sehr alte Methode zur Diagnose von Krankheiten. Bereits im

alten Ägypten (etwa 2500 v. Chr.) waren Polyurie und Hämaturie bekannt. Hindu-Ärzte

untersuchten den Urin mit allen fünf Sinnen und die Griechen deuteten Veränderungen des

Urins als Symptom verschiedener Krankheiten. Im 16. Jahrhundert wurde die Uroskopie zu

einem diagnostischen Universalmittel. Sie galt als wichtigste Tätigkeit des Arztes. Das

kolbenförmige Harnglas wurde zum Standessymbol der Ärzteschaft. Ende des 18.

Jahrhunderts wurden mit der chemischen Analyse präzisere Methoden für die

Urinuntersuchung entwickelt. In den vierziger Jahren des 19. Jahrhunderts kam die

mikroskopische Betrachtung des Urins hinzu. Heute sind die Untersuchungen weitestgehend

automatisiert. Der Urin dient nicht nur zur Diagnose von Krankheiten, er wird auch für

Drogentests und zur Medikamentenforschung eingesetzt. Geringe Mengen reichen aus, um im

Labor eine Vielzahl von Krankheitsparametern zu bestimmen.

Die Probleme einer solchen Untersuchung liegen in dem hohen Zeit- und Kostenaufwand. Für

die Analyse ist eine aufwendige Probenvorbereitung notwendig, bis hin zur Isolierung

einzelner Metabolite. Dadurch ist die Wahrscheinlichkeit von Substanzverlusten sehr groß.

Verschiedene Untersuchungen können auch an nativen Urinproben erfolgen. Diese Methoden

sind jedoch zumeist nicht sehr spezifisch, so dass ähnliche Substanzen die Ergebnisse

verfälschen können. Zudem erfordert die Untersuchung von Einzelsubstanzen eine

Vorauswahl der zu untersuchenden Verbindungen. Dabei können unerwartete oder

unbekannte Metabolite nicht berücksichtigt werden.

Die NMR-Spektroskopie bietet hier verschiedene Vorteile. Das Protonenspektrum einer

Urinprobe stellt sämtliche niedermolekularen, protonenhaltigen Metabolite dar. Damit liefert

es einen nahezu vollständigen Überblick über die Zusammensetzung des Urins. Die

Messungen erfordern, je nach Fragestellung, nur wenig Probenvorbereitung und können in

kurzer Zeit durchgeführt werden. Mustererkennungsverfahren ermöglichen eine zügige

Auswertung der Spektren. Mit ihrer Hilfe können mögliche Abweichungen im

Metabolitenprofil des Urins ermittelt werden. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode die

Aufklärung unbekannter Substanzen.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Urinproben gesunder Probanden mit Hilfe der

NMR-Spektroskopie untersucht. Diese Untersuchungen sind nützlich, um neue Kenntnisse

über enthaltene Metabolite und deren Konzentrationen zu gewinnen. Mit diesem Wissen

können pathologische Veränderungen erkannt und Stoffwechselstörungen identifiziert

werden.

Einleitung

6

Zu Beginn werden die Grundlagen der NMR-Spektroskopie und zweier Trennmethoden,

Festphasenextraktion (SPE) und Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC), beschrieben. Die

Festphasenextraktion wurde angewendet, um verschiedene Substanzklassen der komplexen

Urinproben zu separieren. Anschließend wurde mit Hilfe der HPLC eine Fraktion der SPE

weiter aufgetrennt. Auf diese Weise konnte die Anzahl der Signale in den NMR-Spektren

reduziert, und die Strukturaufklärung unbekannter Substanzen erleichtert werden.

In den folgenden Kapiteln werden verschiedene Metabolite vorgestellt, die in den Spektren

der Urinproben identifiziert werden konnten. Für diese Untersuchungen wurde Kinderurin

verwendet. Hier ist die Wahrscheinlichkeit, ungewöhnliche Substanzen (z. B. durch

Zigaretten- oder Kaffeekonsum hervorgerufen) zu finden, wesentlich geringer als bei

Erwachsenen. Die Identifizierung der Metabolite erfolgte über Literaturrecherche,

Datenbanken und Strukturaufklärung.

Ein weiterer Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss der Ernährung auf die

Zusammensetzung von Urin. Hierfür wurden, nach dem Verzehr verschiedener

Nahrungsmittel, in bestimmten Zeitabständen Proben genommen und vermessen. Durch

Vergleich der Protonenspektren konnten Abweichungen in den Proben erkannt werden. Die

Änderungen der Konzentrationen wurden über die Intensitäten der Signale relativ zum

Creatininsignal bestimmt.

Darstellung der Methoden

7

2. Darstellung der Methoden

2.1. Kernmagnetische Resonanzspektroskopie

2.1.1. Einführung

Den Grundstein für die Kernmagnetische Resonanzspektroskopie (NMR) legte der

Amerikaner Otto Stern im Jahr 1933. Er fand heraus, dass Protonen, genau wie Elektronen,

magnetische Eigenschaften besitzen und wurde dafür 1943 mit dem Nobelpreis für Physik

ausgezeichnet. 1939 wies Isidor Isaac Rabi den Spin von Atomkernen nach und erhielt dafür

1944 den Nobelpreis für Physik. Felix Βloch und Edward Will Purcell gelang es 1945

unabhängig voneinander, erstmals NMR-Experimente in flüssiger und fester Phase

durchzuführen. Sie wurden dafür 1952 gemeinsam mit dem Nobelpreis für Physik

ausgezeichnet. Die Einführung der gepulsten Fourier-Spektroskopie durch den Schweizer

Richard Robert Ernst (Nobelpreis für Chemie 1991) und die Entwicklung supraleitender

Magnete, sowie zweidimensionaler Techniken, machen die NMR heute zu einem der

wichtigsten Analyseverfahren in der Physik, Chemie, Biochemie und Medizin (Schlemmer,

2005).

2.1.2. Physikalische Grundlagen

Nahezu alle Atomkerne haben einen Drehimpuls (Spin) I, der von der Anzahl der Protonen

und Neutronen abhängig ist. Dieser Spin ist durch eine Proportionalitätskonstante γ

(gyromagnetische Konstante) mit einem magnetischen Moment µ verknüpft. Wird nun ein

Kern mit einem Kernspin ≠ 0 in ein äußeres, angelegtes Magnetfeld B0 gebracht, richten sich

das magnetische Moment, und damit auch der Spin, im Magnetfeld aus und präzediert

kegelförmig um die Magnetfeldachse. Bei Kernen mit einem Spin = ½ kann der Spin sich

dabei entweder parallel (energiearm) oder antiparallel (energiereich) zur Magnetfeldachse

ausrichten. Die Geschwindigkeit der Präzession wird Lamor-Frequenz ωL genannt. Sie ist von

dem Produkt aus Magnetfeld und gyromagnetischem Verhältnis abhängig.

Die Summe der im Magnetfeld auftretenden magnetischen Momente wird als Magnetisierung

bezeichnet. Sie ist eine makroskopisch messbare Größe. Die magnetischen Momente verteilen

sich gleichmäßig über den Präzessions-Kegel, wobei die Anzahl der energieärmeren, parallel

zum Feld angeordneten Spins überwiegt. Durch diese Verteilung bildet sich eine

makroskopische Magnetisierung entlang der Magnetfeldrichtung (Z-Achse) aus. Wird

senkrecht zum Magnetfeld ein Hochfrequenz-Impuls eingestrahlt, kann die Magnetisierung

entsprechend der Pulsdauer aus seiner Gleichgewichtslage gebracht werden. Dies ist

allerdings nur möglich, wenn die Anregungsfrequenz des Pulses mit der Lamor-Frequenz


8

übereinstimmt, da nur Strahlungsenergie dieser Frequenz absorbiert werden kann. Bei einem

90°-Puls beträgt die Auslenkung der Magnetisierung genau 90° zur Gleichgewichtslage. Ist

der Puls beendet, präzediert die Magnetisierung in der x-y-Ebene, also senkrecht zum

Magnetfeld. Diese Präzession erzeugt ein oszilllierendes Feld, welches in einer

Empfangsspule in y-Richtung wahrgenommen werden kann. Da jetzt nur noch das

Magnetfeld auf die Magnetisierung wirkt, kehren die Spins in den Ausgangszustand zurück

(Relaxation). Dabei wird die überschüssige Energie im gleichen Frequenzbereich wie die der

Anregung wieder abgegeben. Dieses abklingende Emissionssignal in y-Richtung wird als FID

(free induction decay) bezeichnet. Durch eine Fourier-Transformation wird der FID in ein

Spektrum der Frequenzdomäne umgewandelt.

Die Abhängigkeit der Larmorfrequenz eines Kernspins von seiner chemischen Umgebung

wird als chemische Verschiebung δ bezeichnet. Sie beschreibt die Änderung der

Resonanzfrequenz relativ zu einer Referenzsubstanz und wird unabhängig vom Magnetfeld in

ppm (parts per million) angegeben. Für 1H und 13C wird fast immer Tetramethylsilan (TMS)

als Referenz verwendet. Bei isolierten Atomkernen hängt die Resonanzfrequenz

ausschließlich vom äußeren Magnetfeld und ihrem gyromagnetischen Verhältnis ab. In realen

Molekülen wird der Kernspin durch Elektronen abgeschirmt. Die Elektronen besitzen ein

magnetisches Moment, welches dem äußeren Feld entgegengerichtet ist. Dadurch wird die

Resonanzfrequenz verkleinert. Ein Atomkern mit kleiner Verschiebung wird als abgeschirmt

(hohes Abschirmfeld) bezeichnet, ein Kern mit großer Verschiebung ist dagegen entschirmt

(tiefes Abschirmfeld).

In der hochauflösenden NMR-Spektroskopie kann eine Aufspaltung verschiedener Signale zu

Multipletts beobachtet werden. Diese Aufspaltung erfolgt durch indirekte oder skalare Spin-

Spin-Kopplung von Kernspins über kovalente Bindungen. Die Größe der Aufspaltung wird

als Kopplungskonstante J (Hz) bezeichnet und entspricht dem Frequenzabstand von zwei

Multiplettübergängen. Kopplungsmuster sind essentiell, um bestimmte Spinsysteme in einem

Molekül zu identifizieren und seine chemische Struktur aufzuklären.

2.1.3. Allgemeine Experimente

In der NMR-Spektroskopie werden hauptsächlich eindimensionale Experimente eingesetzt.

Dabei werden überwiegend die Kerne Wasserstoff (1H) und Kohlenstoff (13C), aber auch

Phosphor (31P), Stickstoff (15N) und Fluor (19F) gemessen. Um störende Signale zu

verhindern, werden deuterierte Lösemittel verwendet.


9

Ein Protonenspektrum enthält diverse Informationen, die zur Strukturaufklärung

herangezogen werden können. Die chemische Verschiebung der Signale gibt Auskunft über

einzelne Strukturfragmente, die Integrale geben die Zahl der Protonen vor und die

Multiplizitäten der Signale ermöglichen Angaben über die Zahl der benachbarten Protonen.

Kohlenstoffspektren geben durch die chemischen Verschiebungen ebenfalls Auskunft über

Strukturfragmente. Über ein DEPT-Experiment (distortionless enhancement by polarization

transfer) kann die Anzahl der direkt gebundenen Wasserstoffe am Kohlenstoff bestimmt

werden. Quartäre Kohlenstoffe geben im DEPT-Spektrum kein Signal und können durch

Vergleich mit einem einfachen Kohlenstoffspektrum ebenfalls identifiziert werden.

Daneben kommen auch verschiedene zweidimensionale Verfahren zum Einsatz, die durch

Korrelation der einzelnen Signale zusätzliche Informationen liefern und

Resonanzüberlagerungen bei größeren Molekülen oder Substanzgemischen entzerren können.

Zum einen gibt es homonukleare Experimente, welche das skalare Wasserstoff-

Kopplungsnetzwerk darstellen. Dazu gehören das COSY-Experiment (correlation

spectroscopy), welches die Kopplung zweier Wasserstoffatome im Molekül über zwei

(geminal) oder drei (vicinal) Bindungen aufzeigt, und das TOCSY (total correlation

spectroscopy), mit dem sich alle Signale eines Spinsystems in Verbindung bringen lassen.

Daneben gibt es auch noch das NOESY (nuclear Overhauser enhancement spectroscopy),

welches räumlich benachbarte Wasserstoffatome erfasst.

Zu den heteronuklearen Experimenten zählen u. a. das HSQC-Experiment (heteronuclear

single quantum coherence), das HMBC (heteronuclear multiple bond correlation) und das

HSQC-TOCSY. Im ersten Experiment werden die Heteroatome und ihre direkt gebundenen

Wasserstoffatome korreliert, mit dem zweiten lässt sich die Kopplung eines Protons zu einem

Heteroatomen und die Kopplungen zu benachbarten Protonen aufzeigen. Dadurch ist es z. B.

möglich, quaternäre Kohlenstoffe zu identifizieren. Das dritte Experiment stellt sowohl die

direkt an das Heteroatom gebundenen Wasserstoffatome als auch Protonen, die zwei oder

mehr Bindungen entfernt sind, dar.

2.1.4. Anwendungsgebiete

Ein großer Vorteil der NMR liegt darin, dass die Proben während der Messung nicht zerstört

werden. So stehen sie hinterher für weitere Analysemethoden zur Verfügung. Deshalb findet

die NMR-Spektroskopie in vielen naturwissenschaftlichen Bereichen Anwendung. In der

organischen Synthese wird sie zur Reinheits- und Produktkontrolle genutzt. Mit ihrer Hilfe


10

können Strukturen sowohl in Lösung als auch im Festkörper mit atomarer Auflösung

bestimmt werden. In der Biologie ermöglicht sie die dreidimensionale Aufklärung von

Proteinstrukturen und Enzym-Substratbindungen (Takeuchi und Wagner, 2006; Vaynberg und

Qin, 2006). Die MRT (Magnetresonanztomographie) basiert auf den Prinzipien der NMR und

ist heutzutage in der medizinischen Diagnostik unverzichtbar (Valencia und Castillo, 2006).

Ein weiteres, wichtiges Einsatzgebiet in der klinischen Chemie und Toxikologie ist die

Untersuchung von Körperflüssigkeiten (Blut, Urin, Zerebrospinalflüssigkeit, etc) auf

Abbauprodukte von Medikamenten und Drogen, Infektionen und Stoffwechselstörungen

(Hodavance et al, 2006; Coen et al, 2005). Diese Untersuchungen sind üblicherweise mit

einem geringen Aufwand an Vorbereitungs- und Messzeit verbunden und liefern einen

Überblick über alle enthaltenen Substanzen der Körperflüssigkeiten.

2.1.5. Aufarbeitung von Körperflüssigkeiten für die NMR-Spektroskopie

Körperflüssigkeiten können in verschiedene Klassen eingeteilt werden. Eine Möglichkeit ist

dabei die Einteilung in sekretorische Flüssigkeiten und Ultrafiltrate. Die sekretorischen

Flüssigkeiten enthalten Lipide und Proteine. Diese Substanzen erschweren die Auswertung

der NMR-Spektren, da sie breite Signale erzeugen, welche andere überlagern können. Es ist

deshalb sinnvoll, die Lipide vor der Messung zu extrahieren und getrennt zu vermessen.

Proteine können vor der Messung durch Ultrafiltration entfernt werden. Alternativ dazu ist es

aber auch möglich, ihre Signale mit einer geeigneten Pulssequenz wie CPMG- oder NOESY-

Pulsfolgen spektroskopisch zu unterdrücken.

Körperflüssigkeiten, die eine semipermeable Membran, wie zum Beispiel die Niere,

durchlaufen haben, werden als Ultrafiltrate bezeichnet. Sie besitzen einen sehr kleinen

Proteinanteil. Die Bestandteile sind niedermolekular und normalerweise gering konzentriert.

Durch Lyophilisation (Gefriertrocknung) ist es möglich, diese Flüssigkeiten um ein

Vielfaches aufzukonzentrieren. Die Probe wird vollständig getrocknet und der Rückstand

anschließend in kleinen Mengen deuterierten Wassers wieder aufgenommen. Auf diese Weise

wird auch das störende Wassersignal reduziert.

2.1.5.1. Aufarbeitung von Urin

Die Nieren halten das Milieu im Körper konstant, indem sie alle überflüssigen, organischen

und anorganischen Substanzen über den Urin ausscheiden. Eine Änderung im Körper,

beispielsweise durch einen Infekt oder eine Stoffwechselstörung, spiegelt sich direkt im

Ausscheidungsprofil wider. Das macht Urin zu einer sehr komplexen, diagnostisch wertvollen


11

Flüssigkeit. Außerdem ist Urin leicht und nicht invasiv zugänglich und damit gerade für

Untersuchungen bei Kleinkindern geeignet.

Bei vielen Fragestellungen reicht es aus, die Urinproben nativ, ohne Vorbereitung zu

vermessen. Das resultierende Wassersignal kann mit Hilfe geeigneter Pulssequenzen

unterdrückt werden. Bei gering konzentrierten Proben ist diese Methode jedoch nur bedingt

zu empfehlen. Je größer der Wasseranteil im Verhältnis zu den Konzentrationen der

enthaltenen Substanzen, desto schwieriger und unvollständiger wird die spektroskopische

Wasserunterdrückung. Ein weiterer Nachteil der nativen Messung ist die Tatsache, dass viele

Metabolite aufgrund ihrer geringen Konzentration kaum oder gar nicht detektierbar sind.

Zur Aufkonzentrierung dieser Substanzen kann der Urin lyophilisiert werden. Auf diese

Weise wird auch das Wassersignal reduziert. Andererseits steigen die Intensitäten der Signale

im Hochfeldbereich. Die Anzahl der Signale ist in diesem Bereich so groß, dass es zu

Überlagerungen kommt, die eine Auflösung bis zur Basislinie verhindern.

Macht die Fragestellung den Vergleich mehrerer Spektren erforderlich, ist es notwendig, den

pH-Wert konstant zu halten. Die Resonanzfrequenzen verschiedener Substanzen sind stark

pH-abhängig, schon leichte Abweichungen führen zu teilweise großen Signalverschiebungen.

Dadurch werden die Identifizierung der Signale und die Auswertung der Spektren erschwert.

In der vorliegenden Arbeit wurde der Urin stets lyophilisiert und der pH-Wert mit dem

K2HPO4/KH2PO4-Puffer auf 5,75-5,95 eingestellt.

2.2. Festphasenextraktion

2.2.1. Einführung

Die Festphasenextraktion (SPE) ist eine schnelle und effiziente Methode zur Auftrennung von

Substanzgemischen. Sie wird hauptsächlich in der klinischen Analytik zur Vorbereitung von

Blut, Urin und anderen biologischen Proben eingesetzt (Jain et al, 2006; Persson et al, 2006;

Kato et al, 2005), aber auch in der Umweltanalytik (Botitsi et al, 2006; Zorita et al, 2006)

oder Lebensmittelchemie (Mortensen et al, 2005; Tribalat et al, 2006). Mit ihrer Hilfe können

störende Probenbestandteile, wie z. B. Proteine, entfernt werden und sie ermöglicht die

Aufkonzentrierung einzelner Substanzen bzw. Substanzklassen.

Die SPE basiert wie auch die HPLC (Hochdruckflüssigchromatographie) auf

Migrationsprozessen, bei denen die Komponenten adsorbiert und eluiert werden. Allerdings

kommen hier nur starke, reversible Wechselwirkungen zum Einsatz. Die

Extraktionskartuschen (Säulen) sind mit unterschiedlichen Materialien gepackt, die ionische,

hydrophile und lipophile Wechselwirkungen mit den Proben ausbilden können. Während die


12

Probe durch die Kartusche hindurchgesaugt wird, binden die Substanzen an das Sorbens und

werden nach eventuell folgenden Waschschritten mit einem geeigneten Lösemittel wieder

eluiert. Dadurch ergeben sich zwei Möglichkeiten zur Trennung. Die gewünschte Substanz

kann entweder auf dem Sorbens zurückgehalten, und damit auch aufkonzentriert werden, oder

sie läuft durch, während störende Bestandteile adsorbieren. Gegenüber der Flüssig-Flüssig-

Extraktion (LLE) besitzt die SPE gleich mehrere Vorteile. Der Verbrauch an Lösemittel ist

gegenüber der LLE sehr niedrig. Damit sinken auch die Kosten und das Risiko von

Verunreinigungen. Gleichzeitig ist die Wiederfindungsrate größer und der zeitliche Aufwand

wesentlich geringer. Außerdem ist bei der SPE eine Automatisierung möglich, so kann sie z.

B. direkt vor eine HPLC geschaltet werden.

2.2.2. SPE-Phasen

Generell lassen sich die Materialien, mit denen die Extraktionskartuschen gepackt sind, in

verschiedene Klassen einteilen. In Umkehrphasen (RP), normale Phasen (NP),

Ionenaustauscher- und Größenausschlussphasen.

Umkehrphasen bestehen aus unpolaren Materialien und extrahieren organische Substanzen

aus polaren Lösemitteln. Die Substanzen werden über lipophile Wechselwirkungen (Van der

Waals-Kräfte) an das Sorbens gebunden und mit organischen Lösemitteln eluiert. Übliche

Materialien sind Kohlenwasserstoffketten oder andere lipophile Reste, die an Kieselgel

gebunden werden. Daneben sind auch freie Silanolgruppen vorhanden, welche bei hohen pH-

Werten dissoziieren und auf diese Weise zusätzliche ionische Wechselwirkungen einbringen.

Sie können aber auch mit Trimethylsilylgruppen enthaltenden Reagenzien, wie zum Beispiel

Trimethylchlorsilan geblockt werden (end-capping). Beispiele für RP-Materialen sind C18-

oder C8-Kartuschen, aber auch vernetzte Kopolymere wie Styrol-Divinylbenzol.

Normale Phasen isolieren polare Verbindungen über ein polares Sorbens aus unpolaren

Lösemitteln. Dabei werden hauptsächlich Dipol-Dipol-Wechselwirkungen und

Wasserstoffbrückenbindungen, aber auch π-π-Wechselwirkungen ausgebildet. Typische

Materialien sind Kieselgel-gebundene Aminopropyl- oder Cyanopropylgruppen.

Ionenaustauscher extrahieren polare Verbindungen aus polaren Lösemitteln über Coulomb-

Wechselwirkungen. Es gibt starke und schwache Ionenaustauscher, wobei die schwachen pH-

Wert abhängig sind. Typische Materialien für starke Anionenaustauscher sind quartäre

Amine, für schwache primäre oder sekundäre Amine. Sie werden eingesetzt, um azide

Verbindungen zu isolieren. Starke Kationenaustauscher enthalten Sulfonsäuregruppen,

schwache Carbonsäuregruppen. Der pH-Wert der Probe muss so eingestellt werden, dass die


13

gewünschten Substanzen in ionisierter Form vorliegen. Sie werden dann an dem Sorbens

neutralisiert und anschließend mit einem niedrigeren bzw. höheren pH-Wert eluiert.

Größenausschlussphasen trennen Proben über die Porengröße auf. Große Moleküle, z. B.

Proteine, können diese nicht durchlaufen und werden zurückgehalten. In den Poren können

Materialien integriert sein, welche zusätzliche Wechselwirkungen mit der Probe eingehen und

eine weitere Trennung ermöglichen. Daneben gibt es Mischphasen, die zwei oder mehr dieser

Funktionen vereinen (Walker und Mills, 2002).

2.2.3. Methodenentwicklung

Die allgemeine Vorgehensweise bei der Festphasenextraktion kann in vier Hauptschritte

unterteilt werden: Konditionierung des Sorbens, Auftragen der Probe, Waschen des Sorbens

und Elution der Analyte. Die Konditionierung dient der Benetzung des Sorbens und schafft

damit eine Umgebung, die zur Adsorption der Analyten geeignet ist. Sie wird auch als

Solvatisierung bezeichnet. Unpolare Sorbentien werden üblicherweise mit einem

Lösungsmittel, welches mit Wasser mischbar ist, gefolgt von der reinen Matrix konditioniert.

Bei polaren Sorbentien werden unpolare Lösemittel zur Konditionierung eingesetzt. Im

Anschluss daran erfolgt die Probenaufgabe. Hierbei sollte die Menge so gewählt werden, dass

es nicht zu einer Volumen- oder Massenüberladung kommt. Der pH-Wert der Probe sollte

dem Sorbens entsprechend gewählt und eingestellt sein. Das Waschen des Sorbens wird mit

geeigneten Lösemitteln durchgeführt. Bei wässrigen Proben wird hierzu in der Regel Wasser

eingesetzt. Dieser Schritt dient dazu, störende Verunreinigungen und Nebenbestandteile der

Probe zu entfernen. Die Elution mit einem passenden Lösemittel sollte nicht zu schnell

durchgeführt werden, damit die Wiederfindungsrate möglichst hoch ist. Hier ist eine

Durchflussrate von etwa 3ml pro Minute geeignet.

Die Entwicklung einer Trennmethode mittels SPE setzt einige Überlegungen voraus. So

sollte bekannt sein, welche funktionellen Gruppen die Analyten tragen, ob sie ionisierbar

sind, in welcher Konzentration sie in etwa vorliegen und in welchem Lösemittel sie löslich

sind. Bei der Matrix ist es von Interesse, ob es sich um eine wässrige oder eine organische

Lösung handelt, welchen pH-Wert diese Lösung besitzt und ob störende Verunreinigungen

vorliegen. Wenn diese Informationen vorliegen, kann ein geeignetes Sorbens gewählt werden.

Die Wahl der Waschlösungen und Eluenten richtet sich nach dem Sorbens und den Analyten.

Sie lassen sich nur durch Versuche optimieren. Da die Entwicklung und Optimierung einer

Trennmethode kompliziert und zeitaufwändig ist, legen viele Hersteller ihren Kartuschen

generelle Applikationsvorschriften bei. Außerdem besteht bei einigen Firmen die


14

Möglichkeit, im Internet oder in Papierform auf Applikations-Datenbanken zuzugreifen, um

geeignete Verfahren zu ermitteln.

2.2.4. Durchführung der Trennung

Die Festphasenextraktion wurde im Rahmen dieser Arbeit eingesetzt, um komplexe

Urinproben aufzutrennen und damit die Zahl der Signale in den NMR-Spektren zu reduzieren.

Zum einen sollten die Kohlenhydrate abgetrennt werden, da ihre Resonanzfrequenzen dicht

beieinander liegen und im Protonenspektrum zu Signalüberlagerungen führen. Zum anderen

sollten die aromatischen Verbindungen isoliert und aufkonzentriert werden. Sie sind nur

gering konzentriert und führen im Protonenspektrum zu Signalen mit zum Teil sehr

schwachen Intensitäten.

ppm (t1) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0

Abbildung 1: Protonenspektrum einer Urinprobe. Im aromatischen Bereich des Spektrums zwischen 6,5ppm und 9,5ppm sind die Signalintensitäten z. T. sehr schwach. Im Bereich der Kohlenhydrate zwischen 3,5ppm und 4,0ppm sind dagegen Überlagerungen vieler Signale zu beobachten.

Für die Trennung wurden verschiedene RP- und NP-Kartuschen von zwei Herstellern

getestet. Von Supelco kommen die Phasen DPA-6S und SC-Ph endcapped. DPA-6S ist eine

normale Phase, deren polares Material aus einem Polyamidharz besteht. Die SC-Ph-Phase ist

eine Umkehrphase, bestehend aus Kieselgel-gebundenen Phenylresten. Freie Silanolgruppen

wurden hier blockiert. Die übrigen Kartuschen, C8, C18, C18ec, C18hydra, CN, NH2 und

EASY kommen von Macherey-Nagel. Es handelt sich ausschließlich um Chromabond-Säulen

aus Polypropylen. C8, C18, C18ec und C18hydra sind Umkehrphasen, die sich in ihrer


15

Kettenlänge und speziellen Modifikationen unterscheiden. C8 und C18 sind Silika-gebundene

Octyl- bzw. Octadecylreste. Die freien Silanolgruppen können sekundäre ionische

Wechselwirkungen einbringen, welche bei der C8-Phase aufgrund der kürzeren Kette stärker

zum Tragen kommen. C18ec kann diese ionischen Wechselwirkungen nicht einbringen, da

keine freien Silanolgruppen zur Verfügung stehen. Dadurch ist sie unpolarer als die C18-

Phase. C18hydra besitzt eine spezielle, vom Hersteller nicht näher benannte Modifikation der

Octadecylreste, die sie gegenüber den anderen Umkehrphasen hydrophiler macht.

Daneben wurden noch die normalen Phasen CN, NH2, und EASY eingesetzt. CN besteht aus

Kieselgel-gebundenen Cyanopropylresten. Die Phase ist polar bis mittelpolar und kann über

die hohe Elektronendichte an der CN-Gruppe sekundäre Wechselwirkungen ausbilden. Die

NH2-Phase ist polar und wirkt auch als schwacher Ionenaustauscher. Sie besteht aus

Kieselgel-gebundenen Aminopropylresten. EASY besteht aus einer polaren, bifunktionell

modifizierten Polystyrol-Divinylbenzol-Phase, welche einen schwachen Ionenaustauscher

enthält.

Die Kartuschen wurden alle auf die gleiche Weise konditioniert, indem zuerst Methanol und

dann Wasser aufgetragen wurde, um die Säulen auf die wässrige Probe vorzubereiten. Die

Mengen richteten sich dabei nach den Größen der Kartuschen. Die Probe wurde bei

verschiedenen pH-Werten aufgetragen, bei pH3, pH9 und nativ. Gewaschen wurden alle

Kartuschen mit Wasser, wobei die pH-Werte 3 und 9 für die Waschlösungen übernommen

wurden. Als Eluenten wurden verschiedene Lösemittel getestet. Zum einen wurden

verschiedene Wasser/Methanol Gemische in den Verhältnissen 85:15, 60:40 und 40:60 (%;

v/v) in gegebener Reihenfolge eingesetzt. Zum anderen erfolgte die Elution durch Ethylacetat

bzw. einer Tetrahydrofuran (THF) / Methanol Mischung im Verhältnis 1:1 (v/v). Die

Volumina der einzelnen Waschlösungen und Eluenten richteten sich nach den Größen der

Kartuschen. Sie wurden den Herstellerangaben entnommen. Von den Urinproben wurden

jeweils 3mL aufgetragen. Da ausreichend Probenmaterial zur Verfügung stand, wurde auf

Vorversuche mit weniger komplexen Gemischen verzichtet.

Im Allgemeinen erfolgt die Beurteilung einer Extraktion über die Wiederfindungsrate. Diese

Beurteilung ist aber nur sinnvoll, wenn einzelne, bekannte Verbindungen isoliert werden,

deren Konzentration in der Probe bekannt ist. In diesem Fall sollten keine einzelnen

Substanzen isoliert, sondern Stoffklassen möglichst genau voneinander getrennt werden. Die

Auswertung der Methoden erfolgte deshalb mittels NMR-Spektroskopie. Es wurde ein

Protonenspektrum der Urinprobe vor der Extraktion aufgenommen und anschließend mit den

Spektren der einzelnen Fraktionen verglichen. Diese Form der Auswertung lässt keine


16

Aussagen über einzelne Substanzen zu. Im Hinblick auf die Zielsetzung ist sie jedoch

sinnvoll, da eine mögliche Reduzierung der Signalzahl sofort zu erkennen ist.

2.3. Hochdruckflüssigchromatographie

2.3.1. Einführung

Nachdem die HPLC in den siebziger Jahren entwickelt wurde, hat sie eine sprunghafte

Entwicklung durchgemacht. Aufgrund verschiedenartiger Säulenmaterialien und des

Einsatzes von Computern gehört sie heute zu den meistgenutzten Analysemethoden. Sie

findet in allen Bereichen Anwendung, in denen Proben mit geringen Konzentrationen

bearbeitet werden, wie der Biochemie, Pharmazie, Toxikologie oder der Umweltforschung.

Die HPLC kann sowohl zur qualitativen als auch zur quantitativen Analyse genutzt werden.

Mit ihrer Hilfe ist es möglich, chemisch ähnliche Verbindungen zu isolieren und

Zielverbindungen aus komplexen Gemischen zu extrahieren. Sie kann auch als

Reinigungsverfahren im präparativen Maßstab eingesetzt werden.

Der Begriff Chromatographie umfasst diverse physikalische Methoden, bei denen eine

Stofftrennung durch Verteilung zwischen einer ruhenden (stationären) Phase und einer

bewegten (mobilen) Phase erfolgt. Im Laufe der Jahre wurden verschiedene Methoden,

darunter die Gaschromatographie, die Dünnschichtchromatographie und die

Flüssigchromatographie, entwickelt. In der Hochdruckflüssigchromatographie wird die

Trennleistung durch den Einsatz von Partikeln mit sehr kleinen Korngrößen gesteigert. Die

mobile Phase wird mit Druck durch die stationäre Phase gepumpt, um den dadurch

entstehenden Strömungswiderstand zu überwinden.

Die HPLC arbeitet hauptsächlich mit Adsorptions- und Verteilungsgleichgewichten. Bei der

Adsorptionschromatographie kommt es zu reversiblen Bindungen der Analyten an die

stationäre Phase. Die Geschwindigkeit, mit der die Substanzen durch die Säule laufen, hängt

von zwei Faktoren ab. Zum einen von der Affinität der Analyten zur stationären Phase und

zum anderen von der Fähigkeit der mobilen Phase die Substanzen von den Bindungsstellen

des Sorbens zu verdrängen.

Die Verteilungschromatographie nutzt die unterschiedliche Löslichkeit der Analyten in der

mobilen und der stationären Phase. Durch die unterschiedliche Polarität der beiden Phasen

stellt sich ein Verteilungsgleichgewicht ein. Je stärker das Gleichgewicht auf der Seite des

Sorbens liegt, desto länger verbleiben die Moleküle auf der Säule.

Als Totzeit wird die Aufenthaltsdauer der Substanzen in der mobilen Phase bezeichnet. Die

Zeit, welche die Moleküle auf der stationären Phase verbleiben, nennt man


17

Nettoretentionszeit. Die Gesamt- oder Bruttoretentionszeit gibt die Dauer vom Einspritzpunkt

bis zum Signalmaximum wieder. Retentionszeiten sind von den Eigenschaften der Analyten

abhängig und machen eine Aussage über die Identität der Stoffe. Die Zahl der theoretischen

Stufen wird über die Retentionszeit und die Signalbreite berechnet und ist ein Merkmal für

die Qualität einer Trennsäule. Je größer die Zahl der theoretischen Stufen, desto komplexere

Gemische können mit der Säule getrennt werden. Hier liegt, neben der Säulenlänge, der große

Unterschied zur Festphasenextraktion. Beide Methoden basieren auf den gleichen

Trennprinzipien, aber während in der SPE nur Trennstufenzahlen bis 50 erreicht werden, sind

in der HPLC Zahlen um die 10.000 gebräuchlich. Dadurch lässt sich die deutlich

empfindlichere und selektivere Trennung mittels HPLC erklären.

Die Identifizierung der Analyten erfolgt über geeignete Detektoren, zum Beispiel UV- oder

Massenspektrometer, mittels NMR oder elektrochemisch. Quantifiziert werden die

Substanzen mit Hilfe von Standardverbindungen bekannter Konzentration. Diese werden

entweder einzeln gemessen oder direkt zur Probe gegeben. Durch Integration der

Signalflächen können anschließend die Konzentrationen ermittelt werden.

2.3.2. Methodenentwicklung

Die Entwicklung einer Trennmethode beginnt mit der Auswahl einer geeigneten stationären

Phase. Dafür sind, wie in der SPE, einige Informationen über die Probe notwendig. In der

HPLC werden vorwiegend wässrige Proben analysiert, deshalb finden hauptsächlich RP-

Materialien Verwendung. Da diese Phasen polare Laufmittel erfordern, werden überwiegend

Gemische aus Wasser und Acetonitril oder Methanol eingesetzt. Die Zusammensetzung

richtet sich nach den Eigenschaften der Probe und muss experimentell ermittelt werden.

Zusätzliches Ansäuern der mobilen Phase mit Ameisensäure kann die Trennung weiter

verbessern. Die Elution mit einem Laufmittel konstanter Zusammensetzung wird auch als

isokratische Elution bezeichnet. Bei der Chromatographie von Substanzen mit stark

unterschiedlichen chromatographischen Eigenschaften kann die Zusammensetzung des

Laufmittels auch während der Trennung verändert werden. Die so genannte Gradientenelution

reduziert die Unterschiede in den Retentionszeiten der Analyte. Auch hier kann die

Optimierung nur experimentell erfolgen. Nachdem die Methodenentwicklung abgeschlossen

ist, ist es sinnvoll, die Reproduzierbarkeit der Trennung zu testen. Dazu wird die Probe

mehrmals vermessen und anschließend die Chromatogramme miteinander verglichen.

Alternativ besteht in der HPLC die Möglichkeit, genau wie in der SPE,

Applikationsvorschriften vom Hersteller oder aus Datenbanken zu erhalten. Allerdings


18

müssen diese Vorschriften größtenteils noch optimiert werden, da die HPLC viel

empfindlicher arbeitet als die SPE.

2.3.3. Durchführung der Trennung

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die HPLC eingesetzt, um damit eine Fraktion der

Festphasenextraktion aufzutrennen. Diese Auftrennung sollte eine weitere Reduzierung der

Signale in den NMR-Spektren zur Folge haben.

Als Säule wurde die Sphinx von Macherey/Nagel ausgewählt. Dabei handelt es sich um eine

RP-Phase, die bifunktionell belegt ist. Sie bringt sowohl hydrophobe Wechselwirkungen über

C18-Ketten als auch π-π-Wechselwirkungen über kurzkettige Phenylreste ein. Durch diese

Eigenschaften zeigt sie, besonders bei aromatischen Verbindungen mit polaren Eigenschaften,

eine gute Trennung. Die Methode wurde mit Hilfe einer analytischen Säule erarbeitet, um den

Proben- und Laufmittelverbrauch gering zu halten. Aufgetragen wurde die dritte Fraktion

(Elution) der SPE, um die darin enthaltenen aromatischen Verbindungen zu isolieren. Die

Probe wurde nach der Elution getrocknet und in 1ml Wasser wieder aufgenommen. Für die

HPLC wurde sie zentrifugiert, filtriert und mit Wasser im Verhältnis 1:1000 verdünnt. Es

wurden verschiedene Laufmittel getestet, um eine ausreichende und reproduzierbare

Trennung zu erreichen. Zum einen Gemische aus Wasser und Acetonitril bzw. Methanol mit

und ohne einem Zusatz von Ameisensäure, zum anderen verschiedene Gradienten des

Wasser/Methanol Gemisches. Da die Probe lediglich fraktioniert werden sollte, war es nicht

notwendig, die Signale bis zur Basislinie zu trennen. Aromatische Verbindungen absorbieren

UV-Frequenzen bei 254nm, deshalb erfolgte die Detektion über ein integriertes UV/VIS-

Spektrometer.

Die eigentliche Auftrennung wurde mit Hilfe einer semi-präparativen Säule mit einer

Durchflussrate von 4,8ml pro Minute durchgeführt. Dadurch musste die Probe nicht verdünnt

werden und es konnten jeweils 100µl aufgetragen werden. Anhand der UV-Spektren wurden

geeignete Zeitpunkte zum Schneiden der Fraktionen gewählt. Die Fraktionen wurden bei

jedem Durchlauf gesammelt, vereint und anschließend für die NMR getrocknet und in 0,5ml

D2O aufgenommen.

2.4. Ergebnisse der Trennungen

2.4.1. Festphasenextraktion

Eine vollständige Trennung der im Urin enthaltenen Stoffklassen ist nahezu unmöglich, da

sehr viele Verbindungen enthalten sind, deren chemische Eigenschaften sich überschneiden.

So sind zum Beispiel relativ polare (durch gebundene Hydroxygruppen) oder glukuronierte


19

Aromaten vorhanden, Nukleoside tragen Ribose-Einheiten und langkettige organische Säuren

besitzen lipophile Eigenschaften. Deshalb wurde eine Trennung als ausreichend angesehen,

wenn eine deutliche Reduzierung der Signale in den NMR-Spektren vorlag. Die meisten

Phasen erreichten dieses Ziel unter den gewählten Bedingungen nicht. Möglicherweise

wurden nur Substanzen unterhalb der NMR-Nachweisgrenze (ca. 10µmol/L) adsorbiert oder

nur wenige Substanzen, die sich unter den gegebenen Konditionen nicht wieder eluieren

ließen. Nur zwei Phasen (EASY, C18) lieferten Spektren, welche sich deutlich von dem

unbehandelten Urins unterschieden.

ppm (t1) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0

Abbildung 2: Protonenspektrum einer Urinprobe. Dieses Spektrum einer unbehandelten Urinprobe wurde als Referenzspektrum für die Erfolgskontrolle der Trennungen eingesetzt.

2.4.1.1. Chromabond C18

Für die C18-Kartusche ergab die folgende Durchführung eine ausreichende Trennung. Der

Urin wurde ohne Änderung des pH-Wertes aufgetragen und die Säule anschließend mit 3ml

Wasser gewaschen. Die Elution erfolgte mit 6ml Methanol. Unter den gewählten

Bedingungen adsorbierten die Kohlenhydrate und andere hydrophile Verbindungen, wie

aliphatische Carbonsäuren oder Aminosäuren, nicht an dem Sorbens. Sie befinden sich in der

ersten Fraktion (beladen). Die zweite Fraktion (waschen) enthält wenige Substanzen in

geringen Konzentrationen, darunter auch einige aromatische Verbindungen. In der dritten

Fraktion sind kaum noch Substanzen enthalten, möglicherweise liegen hier aber auch die

Konzentrationen unter der Nachweisgrenze.


20

A

B

C

ppm (t1) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0

A

B

C

ppm (t1) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0

Abbildung 3: Protonenspektren der C18-Extraktion. Die Spektren A – C entsprechen den Fraktionen 1 – 3. Das Signal bei 4,77ppm wird durch Wasser verursacht, welches durch die Vorsättigung nicht vollständig unterdrückt werden konnte. Die Reduzierung der Signalzahl ist deutlich zu erkennen.

In Spektrum A ist die Reduzierung der Signale im Tieffeldbereich deutlich zu erkennen. Im

Hochfeldbereich werden dagegen weniger Unterschiede zum Referenzspektrum sichtbar.

Spektrum B zeigt, auch im Tieffeldbereich, wenige Signale mit geringen Intensitäten. In

Spektrum C sind nur noch wenige Signale auszumachen.

Neben anderen Substanzen sind die Kohlenhydrate nahezu vollständig in der ersten Fraktion

enthalten. Sie wurde für weitere, zweidimensionale NMR-Experimente eingesetzt, um die

Identifizierung verschiedener Kohlenhydrate zu erleichtern. Ein großer Anteil der

aromatischen Verbindungen konnte unter den gewählten Bedingungen gar nicht eluiert

werden.


21

2.4.1.2. Chromabond EASY

Die Chromabond EASY erbrachte nach folgender Vorschrift ein ausreichendes

Trennergebnis. Der pH-Wert des Urins wurde auf 3 eingestellt und die Säule nach dem

Auftragen mit 3ml Wasser (pH3) gewaschen. Die Elution erfolgte mit 6ml THF/Methanol.

Die Kohlenhydrate adsorbieren hier ebenfalls kaum an dem Sorbens, sie sind nur in den

ersten beiden Fraktionen (Beladen und Waschen) zu finden. Aromatische Substanzen werden

relativ gut adsorbiert und erst mit dem Eluenten von dem Sorbens gelöst. Die Spektren der

Fraktionen sind in Abbildung 4 dargestellt.

A

B

C

ppm (t1) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0

A

B

C

ppm (t1) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0

Abbildung 4: Protonenspektren der EASY-Extraktion. Die Spektren A – C entsprechen den Fraktionen 1 – 3. Das Signal bei 4,77ppm wird durch Wasser verursacht, welches durch die Vorsättigung nicht vollständig unterdrückt werden konnte.

In Spektrum A ist deutlich zu erkennen, dass im Tieffeldbereich keine Signale sichtbar sind.

Der Hochfeldbereich ähnelt dem des Referenzspektrums. Eventuell vorhandene Unterschiede


22

zur ersten Fraktion der C18-Extraktion sind wegen den Signalüberlagerungen nicht zu

erfassen. Spektrum B weist ebenfalls keine Signale im Tieffeldbereich auf. Der

Hochfeldbereich ähnelt der ersten Fraktion, nur sind hier die Intensitäten der Signale geringer.

In Spektrum C sind Signale im Tieffeldbereich zu sehen. Die vielen Signale im

Hochfeldbereich lassen vermuten, dass auch noch andere Stoffklassen in dieser Fraktion

enthalten sind. Die dritte Fraktion wurde für weitere NMR-Experimente eingesetzt, mit ihrer

Hilfe sollten aromatische Verbindungen identifiziert werden. Bei der Auswertung dieser

Spektren wurde deutlich, dass auch hier Substanzen auf dem Sorbens haften geblieben sind.

So sind zum Beispiel in allen Fraktionen keine Imidazole zu finden, obwohl im Urin welche

vorkommen.

2.4.2. Hochdruckflüssigchromatographie

Die in der HPLC eingesetzte Fraktion der EASY-Extraktion ist weniger komplex als die

Urinprobe, enthält jedoch immer noch verschiedene Substanzklassen. Mit Hilfe der HPLC

sollten die NMR-Spektren weiter vereinfacht werden, das Hauptziel hierbei war eine weitere

Auftrennung der aromatischen Verbindungen. Die Optimierung des Laufmittels ergab eine

Zusammensetzung aus Wasser, Methanol und 0,1% Ameisensäure mit einem Gradienten von

5% Methanol pro Minute bei einer Anfangskonzentration von 5% Methanol und einer

Endkonzentration von 100% Methanol. Mit diesem Laufmittel gelang es, das UV-Spektrum

so weit zu entzerren, dass die Signale zumindest teilweise bis zur Basislinie getrennt waren

und geeignete Zeitpunkte zum Fraktionieren gewählt werden konnten. Ein Durchlauf der

HPLC dauerte 35 Minuten, es wurde aber nur in den ersten 15 Minuten fraktioniert, da

hinterher keine UV-Signale mehr detektiert wurden. Die Spektren der Fraktionen sind in

Abbildung 5 dargestellt.


23

A

B

C

D

E

ppm (t1) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0

A

B

C

D

E

ppm (t1) 1.02.03.04.05.06.07.08.09.0

Abbildung 5: Protonenspektren der HPLC-Trennung. Die Spektren A – E entsprechen den Fraktionen 1 – 5. Das Signal bei 4,77ppm wird durch Wasser verursacht, welches durch die Vorsättigung nicht vollständig unterdrückt werden konnte.


24

Die Spektren der einzelnen Fraktionen zeigen, dass die aromatischen Verbindungen

tatsächlich aufgetrennt wurden. Sie weisen charakteristische Unterschiede im Tieffeldbereich

auf. Die in den einzelnen Fraktionen enthaltenen Verbindungen besitzen auch strukturelle

Übereinstimmungen. So sind zum Beispiel in der dritten Fraktion drei verschiedene

Nikotinamid-Derivate enthalten. In allen Spektren sind auch noch Signale von aliphatischen

Carbonsäuren zu erkennen, obwohl erwartet wurde, dass diese vollständig in der ersten

Fraktion gesammelt werden. Möglicherweise ist die Ameisensäure Ursache für diese

Erscheinung.

Schon während der Festphasenextraktion sind Substanzverluste unvermeidbar, welche durch

die HPLC noch erhöht werden. Deshalb sind die Intensitäten der Signale sehr gering. Es ist

auch sehr wahrscheinlich, dass einige Substanzen nicht mehr detektiert werden, da sie

unterhalb der Nachweisgrenze liegen.

2.4.3. Zusammenfassung

Ob eine Auftrennung des Urins mit Hilfe der Festphasenextraktion erfolgreich ist oder nicht,

hängt sehr von der Fragestellung ab. Die Phasenvielfalt in Verbindung mit den vielen

Substanzklassen im Urin, deren Eigenschaften sich zum Teil überschneiden, macht eine

Methodenentwicklung nicht einfach. Für das hier gewählte Ziel der Signalreduzierung waren

die Extraktionen auf jeden Fall ausreichend, da zumindest einzelne Fraktionen für die

Strukturaufklärung herangezogen werden konnten. Die Spektren sind zwar immer noch

komplex, weisen aber weniger Signalüberlagerungen auf. Auch die Abtrennung einzelner

Substanzklassen war erfolgreich.

Die Durchführung einer HPLC mit Urinproben ist ohne vorhergehende SPE kaum möglich,

da es leicht zu einer Überladung der HPLC-Säule kommen kann. Die Chromatographie der

gewählten Fraktion hat gute Ergebnisse gezeigt. Mit ihrer Hilfe konnte die Strukturaufklärung

vereinfacht werden. Die Spektren der Fraktionen sind sehr hilfreich bei der Identifizierung

von unbekannten Substanzen. Es gibt kaum noch Überlagerungen und die grobe Einteilung

aufgrund möglicher struktureller Übereinstimmungen erleichtert die Zuordnung unbekannter

Signalgruppen. Es ist hier auch zum ersten Mal möglich, einige Kopplungskonstanten und

Multiplizitäten zu bestimmen. Sowohl in den Spektren der unbehandelten Urinprobe als auch

in den Spektren der Festphasenextraktionen kommen dafür zu viele Überlagerungen vor.

Identifizierung unbekannter Metabolite

25

3. Identifizierung unbekannter Metabolite

Urin ist für die Medizin eine sehr interessante Körperflüssigkeit, da ihre Zusammensetzung

nahezu alle Stoffwechselwege des menschlichen Körpers widerspiegelt. Schädliche

Substanzen und überschüssige Stoffwechselprodukte im Blut werden von den Nieren

abfiltriert und mit dem Urin ausgeschieden.

3.1. Anatomie und Funktion der Niere

Die Nieren sind rötliche, bohnenförmige Organe, die unterhalb des Zwerchfells zwischen dem

Peritoneum (Bauchfell) und der rückwärtigen Abdominalwand (Bauchwand) liegen. Sie

werden teilweise vom 11. und 12. Rippenbogen geschützt. Die rechte Niere liegt etwas tiefer

als die linke, da die Leber den Platz darüber beansprucht.

Jede Niere ist etwa 12cm lang, 7cm breit und 4cm dick. Ihr Gewicht beträgt 120 bis 200g. Sie

ist von drei Gewebeschichten umgeben. Die unterste (Capsula fibrosa) besteht aus dichtem

unregelmäßigem Bindegewebe, welches sich in der Außenhülle des Ureters fortsetzt. Sie

schützt vor Verletzungen und bewahrt die äußere Form der Niere. Die mittlere Schicht

(Capsula adiposa) wird aus einer Fettgewebemasse gebildet. Sie dient ebenfalls als Schutz vor

Verletzungen und hält die Niere an ihrem Platz in der Bauchhöhle. Die oberste Schicht

(Fascia renalis) besteht wiederum aus Bindegewebe, dass die Niere an den umgebenden

Strukturen und der hinteren Abdominalwand verankert. Ein Längsschnitt durch die Niere

zeigt zwei Schichten, außen die Nierenrinde und innen das Nierenmark. Das Nierenmark wird

durch Säulen der Rindensubstanz in etwa 12 Nierenpyramiden unterteilt. Die Spitzen dieser

Pyramiden werden als Nierenpapillen bezeichnet und sind von schlauchförmigen

Nierenkelchen überzogen. Sie fangen den fertigen Harn auf und leiten ihn in den

Sammelraum des Nierenbeckens.

Abbildung 6: Querschnitt einer Niere. Quelle: Roche Lexikon Medizin; 5. Auflage (www.gesundheit.de/roche/)


26

Die harnbildenden Systeme der Niere werden als Nephrone bezeichnet. Das Nephron besteht

aus dem Nierenkörperchen, in dem der Primärharn abfiltriert wird, und dem Tubulusapparat,

in dem durch Resorptions- und Sekretionsprozesse die Umwandlung in den Endharn

stattfindet. Das Nierenkörperchen wird von einem Kapillarknäuel (Glomerulus) gebildet,

welches von einer Kapsel aus einschichtigem Epithelgewebe (Bowmansche Kapsel) umgeben

ist. Das Blut wird dem Glomerulus über die Vas afferens zugeführt. Anschließend gelangt es

über die Kapillarschlingen in die abführende Arteriole, das Vas efferens, und wird einem

zweiten Kapillarnetz zugeleitet. Die Arteriolen liegen dicht beieinander und bilden den

Gefäßpool des Nierenkörperchens. Ihm gegenüber liegt der Harnpool. An dieser Stelle geht

das äußere Blatt der Bowman-Kapsel in das Harnkanälchen über. Alle Nierenkörperchen

liegen innerhalb der Rinde. Entweder als kortikale Glomeruli in der Außenrinde oder als

juxtamedulläre Glomeruli in der Nähe der Marksubstanz.

Der an die Bowman-Kapsel anschließende Kanalabschnitt wird als proximaler Tubulus

bezeichnet. Er beginnt mit einem stark verknäulten Teil (Pars convoluta) und geht dann in

einen gestreckten Abschnitt (Pars recta) über. Dieser gestreckte Abschnitt bildet zusammen

mit einem dünnen Übergangsstück und einem dicken aufsteigenden Abschnitt die Henle-

Schleife. Diese Schleife geht in den distalen Tubulus über. Er besteht aus einem dicken

aufsteigenden Schenkel, welcher wiederum in einen gewundenen Teil übergeht. Der

gewundene Teil berührt die afferente Arteriole des zu ihm gehörenden Nierenkörperchens und

endet im Sammelröhrchen, das den Harn zur Papillenspitze leitet.

Abbildung 7: Aufbau eines Nephrons. Quelle: www.onmeda.de/lexika/anatomie/niere/


27

Jeder anatomische Abschnitt eines Nephrons hat eine bestimmte Funktion bei der

Harnbereitung. In den Nierenkörperchen wird durch Ultrafiltration des Blutplasmas der

Primärharn gebildet. Dieser Primärharn besteht aus einer proteinfreien, wässrigen Lösung

aller im Blutplasma enthaltenen Stoffe. Innerhalb von 24 Stunden werden ca. 150l

Primärharn filtriert. Durch Resorption, Sekretion und Exkretion wird der Primärharn stark

verändert während er die Tubuli durchläuft. In dem gewundenen Abschnitt des proximalen

Tubulus befindet sich eine Natriumpumpe. Die Entfernung des Natriums aus dem Primärharn

begründet ein osmotisches Druckgefälle, weswegen Wasser dem Natrium passiv folgt.

Dadurch werden etwa 80% des Wassers ins Blut rückresorbiert. Eine weitere

Harnkonzentrierung erfolgt in der Henle´schen Schleife. Hier werden noch einmal 18-19%

des Wassers resorbiert.

Harnpflichtige Substanzen gelangen durch die Primärharnbildung in den Urin,

Stoffwechselprodukte und körperfremde Stoffe werden dagegen von den Zellen der Tubuli

zur Ausscheidung an den Harn abgegeben. Umgekehrt werden einige Stoffe (Glucose,

Aminosäuren Chloride etc.) von den Tubulizellen ans Blut abgegeben. Bei diesen Stoffen

spricht man von Schwellenstoffen. Sie werden nur über den Urin ausgeschieden, wenn ihre

Konzentration im Blut einen bestimmten Schwellenwert überschreitet. Der Endharn gelangt

aus den Sammelrohren ins Nierenbecken und von dort über den Ureter in die Harnblase

(Leutert, 1994; Jecklin, 1986).

3.2. Einführung

Die Untersuchung von Urinproben ist heute ein gängiges Diagnoseverfahren, da sich

pathologische Veränderungen des Stoffwechsels unter anderem auf die Zusammensetzung des

Urins auswirken. Jede Stoffwechselstörung wirkt sich auf die Ausscheidung weniger

Substanzen aus und verursacht so charakteristische Änderungen der Zusammensetzung. Diese

Substanzen werden auch als Markermoleküle bezeichnet, da mit ihrer Hilfe eine Diagnose

gestellt werden kann. Im Allgemeinen erfolgen die Untersuchungen des Urins über

Einzelnachweise bestimmter Verbindungen, was mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand

verbunden ist. Zudem macht es eine Vorauswahl der zu untersuchenden Metabolite

erforderlich.

Die NMR-Spektroskopie bietet hier Vorteile. Neben einer schnellen und unkomplizierten

Probenvorbereitung ist die Messung, je nach Fragestellung, in kurzer Zeit durchführbar und

das resultierende Spektrum liefert einen metabolischen „Fingerabdruck“. Da sämtliche NMR-

aktiven Substanzen des Urins im Spektrum Signale liefern, kann auf diese Weise ein nahezu


28

komplettes Stoffwechselprofil dargestellt werden. Der Vergleich verschiedener Spektren

macht eventuell vorhandene Auffälligkeiten sichtbar, die auf eine veränderte

Zusammensetzung des Urins schließen lassen.

Ein NMR-Spektrum enthält eine große Datenmenge. Um die Auswertung und den Vergleich

mehrerer Spektren zu erleichtern, können Mustererkennungsverfahren eingesetzt werden. Sie

bestehen im Grunde aus drei Schritten, der Datenreduktion, der Klassifizierung und der

Visualisierung. In der NMR-Spektroskopie werden Mustererkennungsverfahren eingesetzt um

in den Spektren Muster zu erkennen, die eine Einteilung in verschiedene Gruppen

ermöglichen und, die verantwortlichen Signale zu identifizieren. Sie finden in der klinischen

Diagnostik Anwendung, da sie nach einer Lernphase dazu in der Lage sind, die Spektren von

Urinproben verschiedenen Gruppen zuzuordnen. Je nach Vorgabe können auf diese Weise

kranke Probanden von gesunden unterschieden oder Patienten verschiedenen

Krankheitsstadien zugeordnet werden. Der Einsatz von Mustererkennungsverfahren ist jedoch

nur sinnvoll, wenn die auffälligen Signale auch einer Substanz zugeordnet werden können.

Deshalb ist es von Interesse, das NMR-Spektrum von Urin möglichst vollständig aufzuklären

und die Metabolite zu identifizieren.

3.3. Allgemeine Durchführung

Die Zuordnung der Signale in den NMR-Spektren erfolgte über Literaturrecherche,

Spektrendatenbanken und Referenzmessungen. Daneben konnten einige Metabolite mit Hilfe

der Strukturaufklärung identifiziert werden. Dazu wurden verschiedene 2D-Verfahren, i. e.

HSQC, COSY und TOCSY, eingesetzt.

Die Strukturaufklärung ist in komplexen Gemischen schwieriger als bei Einzelsubstanzen, da

verschiedene Methoden nicht verwendet werden können. So kommen in den

Protonenspektren von komplexen Gemischen so viele Signalüberlagerungen vor, dass

Integrale, Multiplizitäten und Kopplungskonstanten nur selten bestimmt werden können. 13C-

und DEPT-Spektren können wegen der hohen Signaldichte ebenfalls nicht vollständig

ausgewertet werden. Es ist in vielen Fällen aufgrund der Signalüberlagerungen auch nicht

möglich, die Wasserstoff-Kopplungsnetzwerke der einzelnen Verbindungen im COSY oder

TOCSY vollständig zu verfolgen. Selbst im HSQC erschweren die Überlagerungen in einigen

Bereichen eine eindeutige Zuordnung der Signale. Das HSQC mit TOCSY-Transfer und das

HMBC zeigen dieselben Probleme. Auch hier erschweren Signalüberlagerungen die

Auswertung. Außerdem sind bei den letzten zwei Methoden sehr lange Messzeiten

notwendig, um auswertbare Spektren zu erhalten, da sie relativ unempfindlich sind.


29

Die Strukturaufklärung erfolgte hauptsächlich über die chemischen Verschiebungen der

Protonen und Kohlenstoffe. Diese geben zum Teil eindeutige Informationen über vorhandene

Strukturelemente. Mit ihrer Hilfe können, vor allem im aromatischen Bereich, zumindest die

Grundgerüste der Verbindungen ermittelt werden. Vorhandene Substituenten lassen sich zum

Teil ebenfalls über die chemischen Verschiebungen ermitteln und aliphatische Seitenketten

im COSY identifizieren.

Festphasenextraktion und HPLC verringern das Problem der Signalüberlagerungen,

verdünnen aber auch die Proben, so dass einige Substanzen nicht mehr detektiert werden

können. Die aus der HPLC resultierenden Proben waren so stark verdünnt, dass von den 2D-

Verfahren lediglich das COSY-Experiment auswertbare Spektren ergab. Dennoch

ermöglichte die Bestimmung der Kopplungskonstanten, Integrale und Multiplizitäten die

Identifizierung der Pyridin-Derivate und anderer Verbindungen. Die Korrelation der Protonen

zu den gebundenen Kohlenstoffen erfolgte in dem HSQC der unbehandelten Probe.

3.3. Vorstellung der Metabolite

In den folgenden Kapiteln werden die identifizierten Metabolite vorgestellt. Die gewählte

Einteilung der Substanzen ist variabel, da die meisten Substanzen mehrere Eigenschaften

vereinen (z. B. aromatische Carbonsäuren). Die mit den Metaboliten verbundenen

Stoffwechselstörungen sind beispielhaft und nicht vollständig. Viele Enzymdefekte sind bis

heute nicht aufgeklärt und die meisten Stoffwechselstörungen verursachen

Konzentrationsänderungen von mehreren Substanzen. So ist es zum Beispiel möglich, dass

die Konzentrationszunahme einer Verbindung mit der Konzentrationsabnahme einer anderen

Verbindung verknüpft ist. In einigen Fällen wird jedoch nur auf eine Substanz untersucht, so

dass die Zusammenhänge nicht zwingend erfasst werden.

In der Vorstellung der Verbindungen werden nicht alle Signale der einzelnen Metabolite

erwähnt. Die Beschreibung und die Darstellung der Spektren beschränken sich auf Signale,

die in den Spektren leicht und eindeutig identifiziert werden können und damit für analytische

Fragestellungen geeignet sind. Eine vollständige Aufzählung findet sich in Tabelle 1 im

Anhang 5.2..

Die Experimente wurden entsprechend Anhang 5.2. an einem 600MHz-Gerät durchgeführt.

Es wurden verschiedene, zu unterschiedlichen Zeiten genommene Urinproben eines Kindes

vermessen, um festzustellen, ob die identifizierten Metabolite ständig im Urin zu finden sind.


30

3.3.1. Aromatische Verbindungen

Die meisten aromatischen Verbindungen im Urin sind nur sehr gering konzentriert, da sie

aufgrund ihrer strukturellen Eigenschaften nicht sehr hydrophil sind.

3.3.1.1. Aromaten

Benzol-Derivate machen einen Teil der aromatischen Verbindungen aus. Durch gebundene

Hydroxyl- und Carboxylgruppen wird die Hydrophilie dieser Verbindungen gesteigert.

Dadurch ist es möglich, sie mit dem Urin auszuscheiden. Zu den Aromaten, die im Urin

identifiziert werden konnten, gehören Vanillinsäure, Homovanillinsäure, 4-

Hydroxyphenylessigsäure, 3-Hydroxyphenylessigsäure, Phenylessigsäure, 4-Kresol, 4-

Hydroxybenzamid, 4-Hydroxybenzoesäure und Hippursäure.

Vanillinsäure ist ein Abbauprodukt von Tyrosin, Catecholaminen und von Vanillin, welches

mit der Nahrung aufgenommen wird. Bei Patienten mit Leberzirrhose sind erhöhte

Konzentrationen im Urin zu finden (Liebich und Pickert, 1985).

Homovanillinsäure ist ebenfalls ein Abbauprodukt im Catecholamin-Stoffwechsel. Vermehrte

Ausscheidung im Urin wird bei verschiedenen Tumoren, wie z. B. Phäochromozytomen,

Neuroblastomen und Ganglioneuromen beobachtet (Shi et al, 1998; Gerlo und Sevens, 1994).

4-Hydroxyphenylessigsäure ist ein deaminiertes Oxidationsprodukt von 4-Tyramin und

Tyrosin. Leberzirrhose führt unter anderem zu einer vermehrten Ausscheidung von 4-

Hydroxyphenylessigsäure in den Urin (Liebich und Pickert, 1985).

3-Hydroxyphenylessigsäure, ein Metabolit von Tyrosin und Rutin, wirkt als Antioxidans im

menschlichen Organismus. Stoffwechselstörungen oder andere Krankheiten, die zu erhöhten

Konzentrationen im Urin führen, sind bis heute nicht bekannt.

Phenylessigsäure ist ein Abbauprodukt von Phenylethylamin. Ihre Struktur ähnelt denen der

Neurotransmitter Dopamin und Adrenalin, weshalb sie ebenfalls anregende Wirkung besitzt.

Die Konzentration von Phenylessigsäure im Urin ist bei depressiven Menschen signifikant

erniedrigt (Szabo et al, 2001).

4-Kresol ist ein Endprodukt des Proteinstoffwechsels durch den Abbau von Tyrosin und

Phenylalanin. Die Ausscheidung in den Urin ist abhängig von der Proteinaufnahme. Benzol

oder Toluol werden unter anderem zu 4-Kresol abgebaut, welches dadurch vermehrt mit dem

Urin ausgeschieden wird.

Über 4-Hydroxybenzamid im Urin ist nichts bekannt, es könnte über die Nahrung in den

menschlichen Stoffwechsel gelangen.


31

4-Hydroxybenzoesäure ist ein Stoffwechselprodukt von verschiedenen Substanzen, darunter

Catechine, Parabene und Polyphenole. Parabene sind in Kosmetika enthalten und werden

hauptsächlich über die Haut aufgenommen. Catechine und Polyphenole werden mit der

Nahrung aufgenommen. Als Biomarker im Urin ist 4-Hydroxybenzoesäure aufgrund der

vielen Quellen nur bedingt geeignet.

Hippursäure wird, in Folge der Entgiftungsfunktion von Leber und Niere, durch Konjugation

von Benzoesäure mit Glykokoll gebildet. Auch Toluol wird zum größten Teil zu Hippursäure

abgebaut. Niereninsuffizienz führt zu verringerter, Stoffwechselstörungen zu vermehrter

Ausscheidung mit dem Urin. Natriumbenzoat ist ein Konservierungsmittel in vielen

Lebensmitteln, welches ebenfalls zu Hippursäure abgebaut wird. Deshalb ist die

Konzentration im Urin zum Teil auch von der Ernährung abhängig (Zuppi et al, 1998).

Aufgrund ihrer geringen Konzentrationen geben Aromaten nur schwache Signale im

Protonenspektrum, die sich zum Teil nur wenig von der Basislinie abheben. Außerdem ist im

HSQC deutlich zu erkennen, dass viele Signale überlagert sind und im Protonenspektrum

deshalb nicht separiert dargestellt werden. Die chemische Verschiebung der aromatischen

Kohlenstoffe liegt, je nach Substituenten, zwischen 100ppm und 135ppm. Sie enthalten nur

wenig strukturelle Informationen. Hauptsächlich lassen sich die einzelnen Aromaten mit Hilfe

des COSY identifizieren. In vielen Fällen sind auch die Kopplungssignale der aromatischen

Protonen zu den Protonen alipahtischer Seitenketten zu beobachten, was für die

Strukturaufklärung sehr hilfreich ist. Die Resonanzfrequenzen der aliphatischen Seitenketten

liegen in dem überlagerten Bereich der Kohlenhydrate und sind für analytische Zwecke wenig

geeignet.


32

ppm (t2) 7.007.508.00

110.0

115.0

120.0

125.0

130.0

135.0

ppm (t1)

ppm (t2) 7.007.508.00

110.0

115.0

120.0

125.0

130.0

135.0

ppm (t1)

Abbildung 8: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt den Bereich, in dem die Signale der Aromaten liegen. Die meisten Signale sind intensitätsschwach und einige Signale sind überlagert.

Sowohl Vanillinsäure als auch Homovanillinsäure sind in den untersuchten Proben nur sehr

gering konzentriert. In den Protonenspektren sind die Signale beider Verbindungen durch

andere Resonanzfrequenzen überlagert. Die Vanillinsäure ist nur mit Hilfe des HSQC

identifizierbar. Auch dort zeigt sie lediglich schwache Signale. Homovanillinsäure kann

dagegen über ihre Kopplungssignale im COSY identifiziert werden. Interessant sind dabei die

Kopplungen der aromatischen Protonen zu den aliphatischen Seitenketten. Die Kopplungen

der aromatischen Protonen bei 6,89ppm und 6,73ppm zur Methylengruppe der aliphatischen

Seitenkette bei 3,47ppm sind deutlich zu erkennen. Ganz schwach ist auch eine Kopplung der

Methoxygruppe bei 3,84ppm zu dem benachbarten aromatischen Proton bei 6,89ppm

sichtbar. Die 4-Hydroxyphenylessigsäure zeigt ebenfalls deutliche Kopplungssignale der

aromatischen Protonen bei 7,14ppm und 6,84ppm zur Methylengruppe der aliphatischen

Seitenkette bei 3,46ppm. 3-Hydroxyphenylessigsäure ist weniger konzentriert, zeigt jedoch

gleichfalls Kopplungen der aromatischen Protonen bei 6,82ppm und 6,77ppm zu der

aliphatischen Methylengruppe bei 3,48ppm.


33

ppm (t2) 7.00

3.00

3.50

4.00

ppm (t1)

Homovan

4-OH-PES 3-OH-PES

ppm (t2) 7.00

3.00

3.50

4.00

ppm (t1)

Homovan

4-OH-PES 3-OH-PES

Abbildung 9: COSY einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Kopplungssignale der aromatischen Protonen zu den aliphatischen Seitenketten. Abkürzungen: 3-OH-PES – 3-Hyrdoxyphenylessigsäure, 4-OH-PES – 4-Hydroxyphenylessigsäure, Homovan - Homovanillinsäure

Die Hippursäure und die Phenylessigsäure gehören zu den aromatischen Substanzen, die im

Urin die höchsten Konzentrationen aufweisen. Sie sind auch im Protonenspektrum deutlich zu

identifizieren. Allerdings liegen zwei Signale der Phenylessigsäure bei 7,32ppm und 7,31ppm

so dicht beieinander, dass sie sich überlagern. Eine dritte Substanz, U1, die ebenfalls relativ

hoch konzentriert ist, konnte nicht eindeutig identifiziert werden.

ppm (t1) 7.007.508.00

Hip

Hip

Hip

Phe

PheU1

U1

ppm (t1) 7.007.508.00

Hip

Hip

Hip

Phe

Phe

ppm (t1) 7.007.508.00

Hip

Hip

Hip

Phe

PheU1

U1

Abbildung 10: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der konzentrierten aromatischen Verbindungen, die das Spektrum dominieren. Abkürzungen: Hip – Hippursäure, Phe – Phenylessigsäure, U1 – Unbekannte Substanz.


34

Die Aufspaltung der Signale der unbekannten Substanz im Protonenspektrum weist darauf

hin, dass es sich um eine para-substituierte Verbindung handelt. Im COSY zeigt sie

Kopplungen der aromatischen Protonen bei 7,23ppm und 7,17ppm zu einer Methylgruppe bei

2,31ppm, die nahe bei denen des 4-Kresols liegen. Die Signale der aromatischen Protonen

sind gegenüber dem 4-Kresol tieffeldverschoben, was darauf hinweist, dass in der para-

Position keine freie Hydroxygruppe gebunden ist. Daneben ist im TOCSY eine schwache

Kopplung zu 4,62ppm zu erkennen. Das lässt darauf schließen, dass es sich hier um ein

Konjugat des 4-Kresols handelt, möglicherweise ein Glucuronid. Konjugierte Verbindungen

können allein mit Hilfe der NMR-Spektroskopie nicht identifiziert werden, da in der Regel

keine Kopplungen zu den gebundenen Kohlenhydraten oder Glucuroniden beobachtet werden

(siehe 3.1.2.1. Nukleoside). Für eine genaue Identifizierung sind deshalb weitere

Untersuchungen notwendig.

4-Kresol ist nicht sehr konzentriert, die Signale sind im Protonenspektrum überlagert. Im

COSY ist es dagegen eindeutig zu identifizieren. Die Kopplungen der Signale bei 7,16ppm

und 6,84ppm zu dem Signal der Methylgruppe bei 2,26ppm sind eindeutig zu erkennen.

Daneben sind auch die Kopplungssignale der unbekannten Substanz zu sehen.

ppm (t2) 7.0007.0507.1007.1507.2007.250

2.050

2.100

2.150

2.200

2.250

2.300

2.350

2.400

2.450ppm (t1)

U1 U1

4-Kresol 4-Kresol

ppm (t2) 7.0007.0507.1007.1507.2007.250

2.050

2.100

2.150

2.200

2.250

2.300

2.350

2.400

2.450ppm (t1)

ppm (t2) 7.0007.0507.1007.1507.2007.250

2.050

2.100

2.150

2.200

2.250

2.300

2.350

2.400

2.450ppm (t1)

U1 U1

4-Kresol 4-Kresol

Abbildung 11: COSY einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Kopplungssignale der aromatischen Protonen zu den aliphatischen Seitenketten von 4-Kresol und der unbekannten Substanz U1.

4-Hydroxybenzoesäure und 4-Hydroxybenzamid besitzen sehr ähnliche Strukturen. Deshalb

liegen ihre Signale auch dicht beieinander. Da beide Verbindungen relativ gering konzentriert


35

sind und ihre Signale im Protonenspektrum dicht neben anderen liegen, ist es von Vorteil, das

COSY zur Identifizierung heranzuziehen.

ppm (t2) 6.507.00

7.50

8.00

ppm (t1)

4-OH-BA

4-OH-BS

ppm (t2) 6.507.00

7.50

8.00

ppm (t1)

ppm (t2) 6.507.00

7.50

8.00

ppm (t1)

4-OH-BA

4-OH-BS

Abbildung 12: COSY einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Kopplungssignale der aromatischen Protonen von 4-HYdroxybenzoesäure (4-OH-BS) und 4-Hydroxybenzamid (4-OH-BA).

3.3.1.2. Heteroaromaten

Der Begriff Heteroaromaten steht für aromatische Verbindungen, die ein oder mehrere

Heteroatome enthalten. Sie werden aufgrund der Art und Anzahl der Heteroatome und der

Anzahl enthaltener Kohlenstoffatome in unterschiedliche Substanzklassen eingeteilt. In den

untersuchten Urinproben konnten verschiedene Purine, Pyrimidine, Indole, Imidazole und

Pyridine identifiziert werden.

3.3.1.2.1. Nukleoside

Ribonukleinsäure (RNA) ist eine Hauptkomponente der Genexpression. Sie setzt sich aus

verschiedenen Nukleosiden zusammen, welche wiederum aus einem Ribosemolekül und einer

Nukleinbase (Purin- oder Pyrimidin-Derivat) bestehen. Neben den vier bekannten

Nukleosiden Adenosin, Cytidin, Uridin und Guanidin enthält RNA eine große Anzahl

modifizierter Verbindungen. Bei den Modifizierungen handelt es sich hauptsächlich um

Methylierungen der Basen, die im Anschluss an die RNA-Synthese erfolgen. Diese

modifizierten Nukleoside können nach Abbau der RNA nicht wieder verwendet werden.

Deshalb werden sie über die Nieren mit dem Urin ausgeschieden. Dabei gehen auch immer

nichtmodifizierte Nukleoside verloren. Bis heute sind an die hundert Nukleoside im Urin


36

bekannt (Schram, 1998; Seidel et al, 2006). Mit ihrer Hilfe können Aussagen über den RNA-

Stoffwechsel und über den Proteinstatus gemacht werden. Außerdem sind viele heute als

Tumormarker bekannt (Zheng et al, 2002; Kammerer et al, 2005; Seidel et al, 2006). Die

meisten Nukleoside und Nukleinbasen sind im Urin von gesunden Individuen jedoch so

gering konzentriert, dass sie mit Hilfe der NMR nicht detektiert werde können (Zheng et al,

2002; Hofmann et al, 2003). In den untersuchten Proben konnten Adenosin, Cytidin, Cytosin,

Dihydrouracil, Guanosin, Pseudouridine, Thymin, Xanthin, Uracil und Uridin identifiziert

werden.

Pseudouridine ist unter anderem ein Marker für das Wachstum von Lymphknotentumoren

und wird in Verbindung mit anderen Nukleosiden für die Anwesenheit verschiedener Tumore

als Marker verwendet (Kvist et al, 1990; Tu et al 1995).

Uracil und Dihydrouracil werden häufig als Indikator für die Enzymaktivität der

Dihydropyrimidin-Dehydrogenase eingesetzt. Wenn Tumore mit Uracilanaloga, wie zum

Beispiel 5-Fluoruracil, behandelt werden, müssen die Medikamente über die

Dihydropyrimidin-Dehydrogenase abgebaut werden. Ist die Enzymaktivität eingeschränkt,

werden die Medikamente angereichert und können zu Vergiftungen führen (Kuhara et al,

2001).

Nukleinbasen und Nukleoside sind im Urin nur gering konzentriert. Deshalb besitzen die

Signale in den Spektren auch nur schwache Intensitäten. Kopplungssignale der Nukleinbasen

zu den Ribosemolekülen werden weder im COSY noch im TOCSY beobachtet. Die

Ribosemoleküle der Nukleoside können jedoch mit Hilfe der α-Wasserstoffe identifiziert

werden. Diese zeigen charakteristische Resonanzfrequenzen zwischen 5,8ppm und 5,9ppm

und die dazugehörenden Kohlenstoffe zwischen 88ppm und 91ppm. Gegenüber den α-

Wasserstoffen anderer Kohlenhydrate sind diese Signale deutlich tieffeldverschoben.


37

ppm (t2) 5.705.805.906.006.106.206.30

85.0

90.0

95.0

ppm (t1)

Adenosine

Uridine

Guanosine

Cytidine

ppm (t2) 5.705.805.906.006.106.206.30

85.0

90.0

95.0

ppm (t1)

ppm (t2) 5.705.805.906.006.106.206.30

85.0

90.0

95.0

ppm (t1)

Adenosine

Uridine

Guanosine

Cytidine

Abbildung 13: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der α-Wasserstoffe, der zu den Nukleosiden gehörenden Ribosen.

Die Nukleinbasen Uracil, Uridin und Cytidin lassen sich im COSY identifizieren, da die

Wasserstoffatome der Basen miteinander koppeln. Die Signale von Uracil liegen bei 7,52ppm

und 5,78ppm. Die gebundene Ribose verschiebt die Resonanzfrequenzen der Base im Uridin

zu 7,83ppm und 5,96ppm. Die Signale des Cytidins liegen mit 7,86ppm und 6,09ppm nahe

bei denen des Uridins, was durch strukturelle Ähnlichkeiten bedingt ist. Dementsprechend

sind die Signale des Cytosins bei 7,58ppm und 6,02ppm nahe bei denen des Uracil zu finden.

Pseudouridin ist ebenfalls in diesem Bereich zu finden. Allerdings handelt es sich in diesem

Fall um eine Kopplung zwischen dem Signal der Base bei 7,64ppm und dem Signal des α-

Wasserstoffs der Ribose bei 4,68ppm. Da die Ribose in diesem Fall über ein Kohlenstoffatom

an die Base gebunden ist, ist diese Kopplung möglich.


38

ppm (t2) 4.505.005.506.006.50

7.00

7.50

8.00

8.50

ppm (t1)

Uridin

Uracil

Cytidin

PseudouridinCytosin

ppm (t2) 4.505.005.506.006.50

7.00

7.50

8.00

8.50

ppm (t1)

Uridin

Uracil

Cytidin

Pseudouridin

ppm (t2) 4.505.005.506.006.50

7.00

7.50

8.00

8.50

ppm (t1)

ppm (t2) 4.505.005.506.006.50

7.00

7.50

8.00

8.50

ppm (t1)

Uridin

Uracil

Cytidin

PseudouridinCytosin

Abbildung 14: COSY einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Kopplungssignale der Nukleinbasen Uracil, Uridin, Cytosin, Cytidin und Pseudouridin.

Die Nukleinbasen der Nukleoside Adenosin und Guanosin, sowie Thymin und Xanthin tragen

nur singuläre Protonen, die nicht mit anderen Protonen koppeln. Sie können nur mit Hilfe des

HSQC identifiziert werden, da ihre Intensität in dem Protonenspektrum so gering ist, dass

man sie nicht eindeutig als Signal identifizieren kann.

ppm (t2) 7.508.008.50

130.0

135.0

140.0

145.0

150.0

155.0

160.0ppm (t1)

Adenosin

Adenosin

Guanosin

ThyminXanthine

ppm (t2) 7.508.008.50

130.0

135.0

140.0

145.0

150.0

155.0

160.0ppm (t1)

ppm (t2) 7.508.008.50

130.0

135.0

140.0

145.0

150.0

155.0

160.0ppm (t1)

Adenosin

Adenosin

Guanosin

ThyminXanthine

Abbildung 15: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der Nukleinbasen Adenosin, Guanosin, Xanthin und Thymin. Da diese Substanzen nur gering konzentriert sind, ist auch die Intensität der Signale schwach.


39

Die Resonanzfrequenzen von Dihydrouracil liegen nicht bei denen der anderen Nukleinbasen.

Da Dihydrouracil keine aromatische Struktur besitzt, liegen seine Signale in dem

aliphatischen Bereich bei 2,65ppm und 3,43ppm und sind durch viele Überlagerungen nicht

einfach zu identifizieren.

3.3.1.2.2. Pyridine

Neben den Purin- und Pyrimidin-Nukleosiden gibt es auch Pyridin-Nukleoside, welche

allerdings nicht in RNA oder DNA eingebaut werden. Eines davon konnte in den

untersuchten Urinproben identifiziert werden. Es handelt sich hierbei um 4-Pyridon-3-

Carboxamid-1-β-D-Ribonukleosid. Dieses Nukleosid wurde zuerst im Urin von Leukämie-

Patienten gefunden (Dutta et al, 1979). Die genaue Funktion im humanen Stoffwechsel ist bis

heute nicht bekannt. Die Konzentrationen im Blut und im Urin sind bei

Nierenfunktionsstörungen erhöht. Auch bei AIDS-Patienten wurden höhere Konzentrationen

festgestellt (Slominska et al, 2006).

Auch hier ist die Ribose zur Identifizierung nicht geeignet, da sie keine Kopplung zu dem

Pyridin-Derivat zeigt und sich ihre Signale in dem überlagerten Bereich befinden. Das 4-

Pyridon-3-Carboxamid-1-β-D-Ribonukleosid ist nur gering konzentriert. Sowohl im

Protonenspektrum als auch im HSQC sind die Intensitäten der Signale sehr schwach. Für eine

eindeutige Identifizierung ist deshalb das COSY hilfreich. Dort sind die Kopplungssignale

von 8,04ppm zu 6,72ppm und zu 8,76ppm zu erkennen.


40

ppm (t2) 8.008.509.00

130.0

135.0

140.0

145.0

150.0

155.0

ppm (t1)

4P3C

4P3C

ppm (t2) 8.008.509.00

130.0

135.0

140.0

145.0

150.0

155.0

ppm (t1)

ppm (t2) 8.008.509.00

130.0

135.0

140.0

145.0

150.0

155.0

ppm (t1)

4P3C

4P3C

Abbildung 16: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale des 4-Pyridon-3-Carboxamid-1-β-D-Ribonukleosids (4P3C). Die Intensität der Signale ist sehr schwach.

Mit N-Methylnikotinsäure, N-Methylnikotinamid, N-Methyl-2-Pyridon-5-Carboxamid,

Chinolinsäure und 6-Aminonikotinamid konnten weitere Pyrididine im Urin identifiziert

werden. Dabei handelt es sich nahezu ausschließlich um Metabolite des Vitamin B3

Stoffwechsels, welches eine Komponente des Coenzyms NAD ist und von über 500 Enzymen

benötigt wird. Als Vitamin B3 werden sowohl Nikotinsäure als auch Nikotinamid bezeichnet.

N-Methylnikotinsäure ist ein Abbauprodukt der Nikotinsäure. N-Methylnikotinamid und N-

Methyl-2-Pyridon-5-Carboxamid entstehen beim Abbau von Nikotinamid. Sie alle sind

Marker im Urin für den Vitamin B3 Status und werden unter anderem bei Nierenschäden oder

verschiedenen Tumoren verstärkt ausgeschieden (Okamoto et al, 2003; Carter, 1982;

McCreanor und Bender, 1986).

Chinolinsäure entsteht beim Abbau von Tryptophan und wird zu Nikotinamid

weiterverarbeitet. Die Säure im Urin kann als Biomarker für juvenile, idiopathische,

phlogistische Myopathie herangezogen werden. Im Fall dieser entzündlichen

Muskelerkrankung ist die Konzentration der Chinolinsäure im Urin um das Zwei- bis

Dreifache erhöht (Rider et al, 2002).

Daneben gibt es noch ein Pyridin-Derivat, welches als 6-Aminonikotinamid identifiziert

wurde. 6-Aminonikotinamid wird in der Krebstherapie eingesetzt. Im Urin gesunder

Individuen wurde es bisher nicht beschrieben. Eventuell wird es über die Nahrung

aufgenommen und unverarbeitet wieder ausgeschieden.


41

N-Methylnikotinsäure und N-Methylnikotinamid sind einfach zu identifizieren. Einige ihrer

Resonanzfrequenzen liegen im Protonenspektrum gegenüber allen anderen Signalen

tieffeldverschoben bei 9,09ppm bzw. 9,26ppm. Eine quantitative Analyse ist ebenfalls

unproblematisch, da hier keine Überlagerungen zu finden sind. Auch eine Resonanzfrequenz

von N-Methyl-2-Pyridon-5-Carboxamid liegt sehr weit tieffeldverschoben bei 8,26ppm und

ist für analytische Zwecke geeignet. Chinolinsäure zeigt ebenfalls in diesem Bereich ein

Signal bei 8,62ppm, welches nicht überlagert ist. Lediglich die Resonanzfrequenz von 6-

Aminonicotinamid bei 8,53ppm ist überlagert.

ppm (t1) 8.008.509.00

N-Met-NA

N-Met-NSN-Met-NA

N-Met-NS

2P5CChS

ANA

ppm (t1) 8.008.509.00

N-Met-NA

N-Met-NSN-Met-NA

N-Met-NS

2P5C

ppm (t1) 8.008.509.00

N-Met-NA

N-Met-NSN-Met-NA

N-Met-NS

ppm (t1) 8.008.509.00

N-Met-NA

N-Met-NSN-Met-NA

N-Met-NS

2P5CChS

ANA

Abbildung 17: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt einige Signale der enthaltenen Pyridin-Derivate. Abkürzungen: N-Met-NS – N-Methylnicotinsäure, N-Met-NA – N-Methylnicotinamid, 2P5C – N-Methyl-2-Pyridon-5-Carboxamid, ChS – Chinolinsäure, ANA – 6-Aminonicotinamid.

Alle Pyridin-Derivate besitzen Resonanzfrequenzen, die im Protonenspektrum weit

tieffeldverschoben sind. Die dazugehörenden Kohlenstoffe geben ebenfalls stark

tieffeldverschobene Signale bei über 140ppm. Dadurch sind diese Derivate auch im HSQC

leicht zu identifizieren.


42

ppm (t2) 8.008.509.00

130.0

135.0

140.0

145.0

150.0

155.0

ppm (t1)

4P3C

4P3C

N-Met-NS

N-Met-NA

ChS

ANA

2P5CN-Met-NA

N-Met-NS

ppm (t2) 8.008.509.00

130.0

135.0

140.0

145.0

150.0

155.0

ppm (t1)

4P3C

4P3C

ppm (t2) 8.008.509.00

130.0

135.0

140.0

145.0

150.0

155.0

ppm (t1)

ppm (t2) 8.008.509.00

130.0

135.0

140.0

145.0

150.0

155.0

ppm (t1)

4P3C

4P3C

N-Met-NS

N-Met-NA

ChS

ANA

2P5CN-Met-NA

N-Met-NS

Abbildung 18: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt einige Signale der enthaltenen Pyridin-Derivate. Abkürzungen: N-Met-NS – N-Methylnicotinsäure, N-Met-NA – N-Methylnicotinamid, 2P5C – N-Methyl-2-Pyridon-5-Carboxamid, ChS – Chinolinsäure, ANA – 6-Aminonicotinamid, 4P3C – Pyridon-3-Carboxamid-1-β-D-Ribonukleosid.

3.3.1.2.3. Indole und Imidazole

Außerdem konnten verschiedene Indole und Imidazole identifiziert werden. Tryptophan,

Histidin und zwei Histidin-Derivate werden bei den proteinogenen Aminosäuren (Kapitel

3.3.2.) erwähnt.

Imidazolessigsäure ist ein Metabolit von Histidin und Histamin (Khandelwal et al, 1985),

welches selber ein Decarboxylierungsprodukt von Histidin und einer der bekanntesten

Mediatoren allergischer Entzündungen ist. Im Falle einer Histidinämie oder einer erhöhten

Histaminausschüttung wird Imidazolessigsäure vermehrt ausgeschieden.

Indolessigsäure und Indoxylsulfat sind Abbauprodukte der essentiellen Aminosäure

Tryptophan. Phenylketonurie führt zu einer erhöhten Ausscheidung von Indolessigsäure im

Urin. Das Hartnup-Syndrom (autosomal-rezessiv erblicher Transportdefekt für Monoamino-

Monocarboxylsäuren in Nieren und Dünndarm) führt zu einer vermehrten Ausscheidung u. a.

von Inolessigsäure und Indoxylsulfat. Hohe Konzentrationen von Indoxylsulfat im Urin

stehen auch in Beziehung mit einer schnellen Entwicklung von chronischem Nierenversagen

(Niwa et al, 1999).

5-Hydroxyindolacetat ist ein Abbauprodukt von Serotonin, einem Neurotransmitter im

Gehirn. Eine vermehrte Ausscheidung von 5-Hydroxyindolacetat ist ein Hinweis auf

neuroendokrine Tumore, von denen viele Serotonin produzieren (Zuetenhorst et al, 2004).

Der Verzehr verschiedener serotoninhaltiger Lebensmittel (z. B.: Walnüsse, Ananas, Kiwi)


43

führt ebenfalls zu einer erhöhten 5-Hydroxyindolacetat-Konzentration im Urin. Auch die

Einnahme diverser Medikamente (z. B.: Diazepam, Naproxen, Aspirin) kann die

Ausscheidung von 5-Hydroxyindolacetat verändern. Um 5-Hydroxyindolacetat im Urin als

Marker für Tumore verwenden zu können, dürfen diese Lebensmittel und Medikamente zwei

Tage vor der Urinuntersuchung nicht mehr konsumiert werden. Ansonsten kann es sowohl zu

falsch positiven als auch falsch negativen Ergebnissen kommen (Feldman et al, 1985).

Die Resonanzfrequenzen von Imidazolen sind sehr stark vom pH-Wert abhängig. Für einige

Fragestellungen sind reproduzierbare Ergebnisse wichtig. Um diese zu erhalten, ist es wichtig,

den pH-Wert der Proben genau einzustellen. Bei dem für diese Untersuchungen gewählten

pH-Wert von 5,85 liegen die Signale der Protonen weit tieffeldverschoben über 8,4ppm. Die

dazugehörenden Kohlenstoffe liegen um 135ppm. Das ermöglicht eine Unterscheidung von

Pyrimidinen und Imidazolen im HSQC-Spektrum.

Die Resonanzfrequenzen von Imidazolacetat liegen nahe bei denen der Aminosäure Histidin

und seiner Derivate. Dies ist durch strukturelle Gemeinsamkeiten begründet. Die Signale der

aliphatischen Seitenkette liegen in dem Bereich starker Überlagerungen und sind für

analytische Zwecke nicht geeignet. Die Signale des Imidazolrings liegen bei 8,53ppm und

7,2ppm.

ppm (t1) 7.508.008.50

IA

IA

ppm (t1) 7.508.008.50

IA

IA

Abbildung 19: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale des Imidazolacetats (IA). Die Intensität der Signale ist sehr schwach.


44

Indol-Derivate die in der 2. oder 3. Position substituiert sind, weisen sehr ähnliche Strukturen

auf. Dementsprechend dicht liegen ihre Resonanzfrequenzen beieinander. Die Signale von

Indoxylsulfat, Indolessigsäure und einem weiteren Indol-Derivat, Tryptophan (siehe 3.3.2.2.

aromatische Aminosäuren) überlagern sich und sind im Protonenspektrum nicht auseinander

zu halten. Im COSY-Spektrum zeigen die Signale der Indol-Derivate ein charakteristisches

Kopplungsmuster. Aber auch hier ist zu erkennen, dass die Signale sich überlagern.

Indole

ppm (t2) 6.806.907.007.107.207.307.407.50

7.30

7.40

7.50

7.60

7.70

7.80

7.90

ppm (t1)

Indole

ppm (t2) 6.806.907.007.107.207.307.407.50

7.30

7.40

7.50

7.60

7.70

7.80

7.90

ppm (t1)

Abbildung 20: COSY einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt einige Kopplungssignale der Indol-Derivate. Aufgrund der strukturellen Gemeinsamkeiten kommt es zu Überlagerungen der Signale.

3.3.2. Proteinogene Aminosäuren

Proteinogene Aminosäuren sind Bausteine der Proteine. Es handelt sich hierbei um α-

Aminosäuren. Unterschieden werden sie durch ihre Seitenketten, deren Struktur, Größe und

elektrische Ladung verschieden ist. Daneben gibt es auch viele nicht-proteinogene

Aminosäuren, die im menschlichen Organismus andere Funktionen erfüllen. Einen Teil der

proteinogenen Aminosäuren kann der menschliche Organismus nicht synthetisieren. Diese

essentiellen Aminosäuren müssen mit der Nahrung aufgenommen werden. Die Konzentration

der verschiedenen Aminosäuren im Urin ist von der Ernährung abhängig und wird durch

proteinreiche Nahrung erhöht (Fonteh et al, 2006; Brand et al, 1997).

3.3.2.1. Unpolare, aliphatische Aminosäuren

Die Seitengruppen dieser Aminosäuren sind unpolar und hydrophob. Sie kommen in

Proteinen oft gehäuft vor, da sie, aufgrund ihrer Lipophilie, zu Aggregatbildung neigen.


45

Durch diese hydrophoben Wechselwirkungen wird die Proteinstruktur stabilisiert. In den

Urinproben konnten die unpolaren Aminosäuren Glycin, N, N-Dimethylglycin, Alanin, Valin,

Leucin und Isoleucin identifiziert werden.

Glycin ist die einfachste Aminosäure. Sie wird aus Serin, Threonin oder Glyoxylat gebildet

und ist hauptsächlich Bestandteil der Skleroproteine (z. B. Kollagen). Glycin ist ein wichtiges

Zwischenprodukt der Biosynthese von Porphyrinen, Purinen, Creatin und Glutathion. Es wird

über Glyoxylsäure zu Oxalsäure oder über Serin abgebaut. Vermehrte Glycinausscheidung in

den Urin kann unter anderem durch einen erblichen Defekt im Glycintransport im proximalen

Tubulus erfolgen. Nicht-ketotische Hyperglycinämie kann durch verschiedene Enzymdefekte

verursacht werden und führt ebenfalls zu erhöhten Konzentrationen im Urin (Tada und

Hayasaka, 1987).

N, N-Dimethylglycin ist ein Derivat der Aminosäure Glycin. Es entsteht beim Abbau von

Cholin zu Glycin und ist auch ein Nebenprodukt des Homocystein-Stoffwechsels.

Dimethylglycin Dehydrogenase Mangel führt zu einer vermehrten Urinausscheidung von N,

N-Dimethylglycin (Binzak et al, 2001; Moolenaar et al, 1999).

Alanin wird durch Pyruvattransaminierung oder Spaltung der Dipeptide Carnosine und

Anserin gebildet. Es ist vor allem im Muskelgewebe konzentriert und wird dort zur

Energiegewinnung freigesetzt. Das Hartnup-Syndrom ist ein erblicher Transportdefekt für

Monoaminocarboxyl-Säuren in Nieren und Dünndarm (Bröer et al, 2005). Alanin ist eine von

mehreren Aminosäuren, die bei diesem Syndrom vermehrt mit dem Urin ausgeschieden

werden. Daneben gibt es verschiedene Enzymdefekte, z. B. Pyruvat-Dehydrogenase-Mangel,

die ebenfalls zu erhöhten Konzentrationen im Urin führen.

Valin, Leucin und Isoleucin gehören zu den essentiellen Aminosäuren. Sie werden als

verzweigtkettige Aminosäuren bezeichnet und kommen in geringen Mengen in allen

Proteinen vor. Valin ist eine Biosynthesevorstufe für Panthothensäure und unentbehrlich für

Nerven- und Muskelfunktion. Leucin ist wichtig für den Aufbau und Erhalt von

Muskelgewebe. Es unterstützt die Proteinsynthese in Muskelgewebe und Leber und hemmt

den Abbau von Muskelprotein. Isoleucin ist für den Muskelaufbau von Bedeutung, da seine

hydrophoben Eigenschaften für die Ausbildung der Sekundärstruktur hilfreich sind. Rund ein

Drittel der Muskulatur besteht aus dieser Aminosäure. Es gibt viele Stoffwechselstörungen

dieser Aminosäuren, die bekannteste wird als Ahornsirupkrankheit bezeichnet (Chuang et al,

2006; Harris et al, 2005). Diese Krankheit führt unter anderem zu einer vermehrten

Ausscheidung von Valin, Leucin und Isoleucin mit dem Urin. Auch das Hartnup-Syndrom

verursacht erhöhte Urinkonzentrationen dieser Aminosäuren (Bröer et al, 2005).


46

Diese unpolaren Aminosäuren sind in dem Protonenspektrum relativ einfach zu identifizieren.

Sie tragen aliphatische Seitenketten, deren Resonanzfrequenzen weit hochfeldverschoben

liegen. Diese Signale sind auch für analytische Zwecke geeignet, da dort nur wenige

Überlagerungen vorliegen. Eine Ausnahme bilden hier Glycin und N, N-Dimethylglycin, da

sie keine langen Seitenketten besitzen. Ihre Signale liegen bei 3,57ppm bzw. 3,72ppm und

2,91ppm. Alanin zeigt ein deutliches Dublett bei 1,47ppm und Valin zwei Dubletts bei

1,03ppm und 0,98ppm. Die beiden Dubletts von Leucin bei 0,93ppm und 0,95ppm liegen im

Protonenspektrum sehr dicht beieinander. Isoleucin ist nur sehr gering konzentriert, so dass

sein Signal bei 1,97ppm im Protonenspektrum kaum sichtbar ist.

ppm (t1) 1.001.502.00

Ala

ValLeu

Ile

ppm (t1) 1.001.502.00

Ala

ValLeu

Ile

Abbildung 21: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt einige Signale der unpolaren Aminosäuren Alanin (Ala), Valin (Val), Leucin (Leu) und Isoleucin (Ile).

3.3.2.2. Aromatische Aminosäuren

Die Seitengruppen dieser Aminosäuren sind relativ unpolar und können ebenfalls an

hydrophoben Wechselwirkungen beteiligt sein. In den Urinproben konnten die aromatischen

Aminosäuren Phenylalanin, Tyrosin und Tryptophan identifiziert werden.

Phenylalanin gehört zu den essentiellen Aminosäuren. Es ist an der Synthese von Adrenalin,

L-Dopa und anderen Hormonen beteiligt und dient als Edukt für weitere Substanzen, z. B. für

die Botenstoffe Dopamin, Serotonin oder Tyramin im Gehirn. Das Hartnup-Syndrom (Bröer

et al, 2005), Phenylketonurie und mildere Formen von Hyperphenylalaninämie verursachen

neben dem Erscheinen von Phenylbrenztraubensäure eine vermehrte Ausscheidung von

Phenylalanin im Urin (Kitagawa et al, 1975).

Tyrosin ist ein zentraler, intermediärer Metabolit für Schilddrüsenhormone, Catecholamine

und Melanine. Erhöhte Tyrosin Konzentrationen im Urin werden unter anderem durch das

Hartnup-Syndrom (Bröer et al, 2005) oder Hypertyrosinämie (Balato et al, 1986; Machino et

al, 1983) verursacht.

Tryptophan gehört zu den essentiellen Aminosäuren. Es ist Bestandteil vieler Proteine,

Vorläufer verschiedener biogener Amine wie Tryptamin, Melatonin und Serotonin und am


47

Stoffwechsel diverser B-Vitamine beteiligt. Eine vermehrte Ausscheidung von Tryptophan

über den Urin wird durch Tryptophanurie und dem Hartnup-Syndrom (Bröer et al, 2005)

verursacht.

Die aromatischen Aminosäuren sind Analoga der aromatischen Säuren Phenylessigsäure, 4-

Hydroxyphenylessigsäure und Indolessigsäure. Dementsprechend dicht liegen die Signale der

jeweiligen Verbindungen beieinander. Die aromatischen Resonanzfrequenzen des

Tryptophans sind im COSY von denen der anderen enthaltenen Indole überlagert (siehe

3.3.1.2.3. Indole und Imidazole). Die aromatischen Signale des Phenylalanins sind im HSQC

und im COSY nicht von der Phenylessigsäure zu trennen, und die des Tyrosins liegen nahe

denen der 4-Hydroxyphenylessigsäure. Lediglich die aliphatischen Seitenketten unterscheiden

sich. Die gebundene Aminogruppe schränkt die freie Drehbarkeit der danebenliegenden

Methylengruppe ein, so dass die Protonen nicht mehr chemisch äquivalent sind und zu zwei

Signalen aufspalten. Die Identifizierung erfolgt deshalb am besten über die Kopplungssignale

der aromatischen Protonen zu denen der aliphatischen Seitenketten. Dort ist der Effekt der

Aufspaltung deutlich zu erkennen.

ppm (t2) 6.806.907.007.107.207.307.407.507.60

3.00

3.50

ppm (t1)

Phenylalanin Tyrosin

Tryptophan

ppm (t2) 6.806.907.007.107.207.307.407.507.60

3.00

3.50

ppm (t1)

ppm (t2) 6.806.907.007.107.207.307.407.507.60

3.00

3.50

ppm (t1)

Phenylalanin Tyrosin

Tryptophan

Abbildung 22: COSY einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Kopplungssignale der aromatischen Aminosäuren. Die aromatischen Signale koppeln jeweils zu zwei aliphatischen Protonen, da die Protonen der Methylengruppe nicht chemisch äquivalent sind und zu zwei Signalen aufspalten. Ein Signal von Tryptophan ist durch das einer anderen Verbindung überlagert.


48

3.3.2.3. Polare, ungeladene Aminosäuren

Die Seitengruppen dieser Aminosäuren sind hydrophil. Ihre funktionellen Gruppen können

Wasserstoffbrückenbindungen ausbilden und dadurch die Wasserlöslichkeit der Proteine

steigern. In den Urinproben konnten die Aminosäuren Serin, Threonin, Asparagin, Glutamin,

Cystin und Pyroglutamat identifiziert werden.

Serin kommt in Phospholipiden von Zellmembranen vor. Die Biosynthese von Serin erfolgt

ausgehend von 3-Phosphoglycerat oder Glycin. Es kann aber auch durch Protein- oder

Phospholipidabbau freigesetzt werden. Serin spielt eine zentrale Rolle beim Zellwachstum

und wird zum Aufbau von Cholin, Cystein und Purin-Nukleotiden benötigt. Außerdem ist es

wichtig für die Entwicklung und Funktion des Gehirns.

Threonin gehört zu den essentiellen Aminosäuren. Es wird für den Harnsäure-Stoffwechsel

und das Immunsystem benötigt, ist an der Biosynthese von Vitamin B12 beteiligt und spielt

eine Rolle im Stoffwechsel von Prophyrin. Erhöhte Konzentrationen im Urin werden unter

anderem durch das Hartnup-Syndrom verursacht (Bröer et al, 2005).

Asparagin wird aus Ammoniak und Asparaginsäure gebildet. Es wirkt wachstumsfördernd,

spielt eine Rolle in der Stoffwechselüberwachung in Hirn- und Nervengewebe und stellt eine

NH2-Quelle im Intermediärstoffwechsel für die Harnstoffsynthese dar. Stoffwechselstörungen

oder andere Krankheiten, die zu veränderten Urin Konzentrationen führen, sind bisher nicht

bekannt.

Glutamin wird aus Glutaminsäure gebildet. Es ist für den Hirnstoffwechsel von Bedeutung,

wird als NH2-Donor bei Transaminierungen eingesetzt und für NH3-Bindung und -Transport

benötigt. Erhöhte Konzentrationen im Urin werden unter anderem durch das Hartnup-

Syndrom (Bröer et al, 2005) oder dem LOWE-Syndrom verursacht. Ein Glutamin-Synthetase-

Mangel (Haberle et al, 2005) führt dagegen zu einer stark reduzierten Ausscheidung von

Glutamin.

Cystin ist eine schwefelhaltige Aminosäure. Es ist das Oxidationsprodukt von zwei

Cysteinmolekülen, welche über eine Disulfidbindung verknüpft sind. Cystein wird aus

Methionin gebildet und über Aminoacrylat zu Pyruvat abgebaut. Im extrazellulären Raum

liegt nur die oxidierte Form vor. Cystin ist hauptsächlich in Haaren und Haut zu finden und

spielt eine wichtige Rolle im Immunsystem. Erhöhte Konzentrationen im Urin treten bei

Cystinurie, einer Störung des renalen Transportsystems, auf (Font-Llitjos et al, 2005).

Die zyklisierte Glutaminsäure Pyroglutamat bzw. 5-Oxoprolin steht am Anfang von

Peptidketten und entsteht als Artefact bei der Lyophylisierung. Der Enzymdefekt Glutathion-

Synthetase-Mangel (Creer et al, 1989) führt zu erhöhten Konzentrationen im Urin.


49

Die Signale der polaren Aminosäuren liegen zum Teil in dem stark überlagerten Bereich der

Kohlenhydrate, die nicht für die Identifizierung geeignet sind. Threonin, Asparagin und

Glutamin zeigen aber auch Signale, die weiter hochfeldverschoben liegen und für analytische

Zwecke geeignet sind. Threonin trägt eine Methylgruppe, deren Signal bei 1,33 liegt,

Glutamin zeigt zwei Signale zwischen 2ppm und 3ppm bei 2,45ppm und 2,14ppm, die

zusammen zur Identifizierung genutzt werden sollten, da beide überlagert sind. Die

Resonanzfrequenz der Methylengruppe des Asparagins ist zu zwei Signalen bei 2,91ppm und

2,99ppm aufgespalten, von denen eins bei 2,91ppm nicht überlagert ist. Pyroglutamat zeigt

mehrere Signale in dem Bereich zwischen 2ppm und 3ppm. Die Signale bei 2,49ppm und

2,02ppm werden von einer Methylengruppe verursacht, die zu zwei Signalen aufspaltet.

ppm (t1) 1.502.002.50

Asn

Asn

PGlu

Gln

PGlu

Gln

PGlu

Thr

ppm (t1) 1.502.002.50

Asn

Asn

PGlu

Gln

PGlu

Gln

PGlu

Thr

Abbildung 23: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt einige Signale der polaren Aminosäuren Asparagin (Asn), Glutamin (Gln), Pyrolutamat (PGlu) und Threonin (Thr).

Serin zeigt nur Signale in dem überlagerten Bereich bei 3,87ppm, 3,95ppm und 3,99ppm und

kann auch im HSQC nur schlecht identifiziert werden, da die korrespondierenden

Kohlenstoffe bei 57,47ppm und 61,42ppm auch überlagert sind. Die Resonanzfrequenzen der

Protonen von Cystin liegen ebenfalls in dem überlagerten Bereich bei 4,13ppm, 3,39ppm und

3,21ppm, aber der korrespondierende Kohlenstoff der aufgespalteten Methylengruppe liegt so

weit hochfeldverschoben bei 38,74ppm, dass es im HSQC deutlich identifiziert werden kann.


50

ppm (t2) 3.003.504.00

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

ppm (t1)

Cys2

Ser

ppm (t2) 3.003.504.00

35.0

40.0

45.0

50.0

55.0

60.0

ppm (t1)

Cys2

Ser

Abbildung 24: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die aufgespaltenen Signale vom Cystin (Cys2). Das Signal von Serin (Ser) ist nicht so leicht zu identifizieren, da es überlagert ist.

3.3.2.4. Positiv geladene Aminosäuren

Geladene Seitengruppen besitzen die größte Hydrophilie. Die Ladungen ermöglichen auch

häufig enzymatisch katalysierte Reaktionen. Die positiv geladenen Aminosäuren Histidin, 3-

Methylhistidin, 1-Methylhistidin, Carnosin und Arginin konnten in den Urinproben

identifiziert werden.

Histidin ist eine halbessentielle Aminosäure. Sie kommt im Globin des Blutfarbstoffes vor

und ist in vielen Enzymen Bestandteil des aktiven Zentrums. Eine erhöhte Histidin

Konzentration im Urin kann verschiedene Ursachen haben. Dazu gehören die durch

Enzymdefekte verursachte Histidinämie, das Hartnup Syndrom (Bröer et al, 2005) und

Histidinurie, welche durch einen Defekt im tubulären Transportsystem hervorgerufen wird

(Nyhan und Hilton, 1992).

3-Methylhistidin ist Bestandteil von Actin und Myosin. Bei der Zersetzung dieser

Muskelproteine wird es freigesetzt und mit dem Urin ausgeschieden. Deshalb gilt es als

Marker für den Katabolismus von Muskelgewebe. 3-Methylhistidin wird aber auch über die

Nahrung aufgenommen. Um genaue Aussagen zu treffen, wie viel 3-Methylhistidin endogen

freigesetzt wurde, ist es hilfreich, zusätzlich die Konzentration von 1-Methylhistidin zu

ermitteln.

1-Methylhistidin bildet mit β-Alanin das Dipeptid Anserin. Es kommt im menschlichen

Gewebe kaum vor, wird aber ebenfalls mit der Nahrung aufgenommen. Seine Konzentration

korreliert gut mit der Konzentration von 3-Methylhistidin und ermöglicht dadurch eine


51

Bestimmung des Anteils der mit der Nahrung aufgenommen wurde. (Tůma et al, 2005; Sjölin

et al, 1989)

Carnosin oder β-Alanyl-L-Histidin ist ein Dipeptid, welches verschiedene Funktionen im

menschlichen Organismus ausübt. Es wirkt als Antioxidans und als Calcium- und

Enzymregulator. Außerdem verhindert es die Glykolysierung und Quervernetzungen

zwischen Proteinen. Carnosinase-Mangel führt auch bei vegetarischer Ernährung zu einer

vermehrten Ausscheidung von Carnosin in den Urin (Cohen et al, 1989).

Arginin ist für Kinder eine essentielle Aminosäure. Erwachsene Menschen können sie über

Argininbernsteinsäure im Harnstoffzyklus synthetisieren. Arginin ist die Vorstufe für

verschiedene Verbindungen im menschlichen Organismus. Es wird zu Stickstoffmonoxid,

Creatin, Glutamat oder Prolin verarbeitet und kann zu Glukose umgewandelt werden.

Argininämie, ein Enzymdefekt, führt zu einer vermehrten Ausscheidung von Arginin

(Sakiyama et al, 1984).

Arginin zeigt Resonanzfrequenzen im Hochfeldbereich zwischen 1ppm und 2ppm. Da diese

Aminosäure nur gering konzentriert ist, hebt sich das Signal bei 1,65ppm im

Protonenspektrum kaum von der Basislinie ab, während das Signal bei 1,91ppm von anderen

überlagert ist. Die übrigen Resonanzfrequenzen liegen bei 3,24ppm und 3,78ppm und können

aufgrund der Überlagerungen auch im HSQC nur schwer zugeordnet werden.

ppm (t1) 1.502.002.50

Arg

Arg

ppm (t1) 1.502.002.50

Arg

Arg

Abbildung 25: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt zwei Signale der Aminosäure Arginin (Arg). Das Signal bei 1,91ppm ist überlagert und kann nicht identifiziert werden. Das Signal bei 1,65ppm hebt sich kaum von der Basislinie ab.


52

Histidin, 3-Methylhistidin, 1-Methylhistidin, und Carnosin lassen sich am besten über die

Resonanzfrequenzen der Imidazolringe identifizieren. Im Protonenspektrum liegen die

Signale dicht beieinander, sind aber deutlich separiert. Lediglich das Signal von 1-

Methylhistidin bei 8,52ppm ist etwas von dem Signal einer anderen Verbindung überlagert.

Die Signale von Histidin bei 8,60ppm, 3-Methylhistidin bei 8,64ppm und Carnosin bei

8,58ppm werden nicht überlagert.

ppm (t1) 8.008.509.00

His

1-Met-His

3-Met-His

Car

ppm (t1) 8.008.509.00

His

1-Met-His

3-Met-His

Car

Abbildung 26: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der Histidin-Derivate. Abkürzungen: Car – Carnosin, His – Histidin, 1-Met-His – 1-Methylhistidin, 3-Met-His – 3-Methylhistidin

3.3.3. Kohlenhydrate

Zucker und deren chemische Abkömmlinge werden als Kohlenhydrate bezeichnet. Sie sind

hochwertige Energielieferanten und Baustoffe, die im Körper schnell verwertet werden. Sie

können aber auch in polymerer Form (Glycogen) gespeichert werden. Es werden einfache

Kohlenhydrate (Monosaccharide) und zusammengesetzte Kohlenhydrate (Disaccharide

Oligosaccharide, Polysaccharide) unterschieden. Außerdem gibt es noch Zuckeralkohole und

Uronsäuren. Daneben kommen auch konjugierte Verbindungen wie Glykolipide und

proteingebundene Kohlenhydrate vor.

Das Protonenspektrum der Urinprobe weist im Bereich der Kohlenhydrate zwischen 3,5ppm

und 4,2ppm sehr viele Überlagerungen auf. Im HSQC sind die Signale ebenfalls nicht

separiert. Die korrespondierenden Kohlenstoffe geben ebenfalls dicht beieinander liegende

Signale zwischen 60ppm und 75ppm. Die Überlagerungen erschweren die Identifizierung der

Substanzen und machen eine quantitative Analyse nahezu unmöglich. Deshalb werden im

folgenden Abschnitt nur die Signale dargestellt, die für eine Analyse hilfreich sind.

Unbekannte konjugierte Verbindungen können alleine mit Hilfe der NMR nicht identifiziert

werden, da in der Regel im COSY keine Kopplung zwischen dem Kohlenhydrat und der

zugehörenden Substanz erkennbar ist (siehe 3.3.1.2.1. Nukleoside).


53

3.3.3.1. Monosaccharide

Monosaccharide sind hydrolytisch nicht weiter aufspaltbare Zucker. Sie kommen in vielen

Lebensmitteln vor und werden durch die Nahrung dem humanen Stoffwechsel zugeführt. Der

Ringschluß dieser Verbindungen führt dazu, dass jeweils zwei Isomere (alpha und beta)

vorhanden sind. Zu den Monosacchariden, die im Urin identifiziert werden konnten, gehören

Glucose, Fructose, Fucose, Galactose, Xylose und N-Acetylneuraminsäure.

Glucose ist eine Schlüsselsubstanz im Kohlenhydratstoffwechsel. Sie wird als Glycogen in

Muskel und Leber gespeichert und steht in ihrer stoffwechselaktiven Form, Glukose-6-

phosphat, der Energiegewinnung durch Glycolyse, Citratzyklus und oxidativer

Phosphorylierung oder durch den Pentosephosphatzyklus zur Verfügung. Im Urin wird

Glucose hauptsächlich zur Diagnose von Diabetes mellitus und zur Kontrolle der

Insulintherapie (Kabadi, 1992; Koch, 2004) genutzt.

Fructose kommt in Früchten, Honig und gebunden mit Glucose als Saccharose vor, kann aber

auch im Körper synthetisiert werden. Sie wird zu Glycogen umgewandelt, oder nach

Phosphorylierung in der Leber abgebaut. Im Urin ist Fructose nach Verzehr nachweisbar

(Luceri et al, 1996). Fructokinase-Mangel bedingte Fructosämie oder Fructoseintoleranz

führen zu erhöhten Konzentrationen im Urin (Froesch, 1976).

Im menschlichen Organismus kommt Fucose unter anderem in Muco- und Glykoproteinen

vor (Kornfeld und Kornfeld, 1976). Verschiedene Krebsarten führen zu erhöhten Fucose-

Konzentrationen im Urin, darunter Leber-, Magen-, Lungen- und Pankreaskrebs (Suzuki et al,

1992, Sakai et al, 1990), außerdem auch Magengeschwüre und Leberzirrhose (Sakai et al,

1990; Yamauchi et al, 1993).

Galactose ist in Gangliosiden, Cerebrosiden, Glykolipiden und Glykosaminoglykanen zu

finden und wird hauptsächlich in der Leber abgebaut. Im Urin sind vor allem im Fall einer

Galactosämie erhöhte Galactosekonzentrationen nachweisbar (Easley et al, 2003).

Die Bestimmung von Xylose im Urin erfolgt hauptsächlich bei Absorptionstests. Mit der

Nahrung aufgenommene Xylose wird im oberen Dünndarm resorbiert und etwa 25% der

aufgenommenen Menge unverändert über den Urin ausgeschieden. Im Fall eines

Malabsorptionssyndroms ist Xylose in erniedrigten Konzentrationen im Urin zu finden (Rana

et al, 2007). Die Ursachen dafür sind unterschiedlich, so verursacht z. B. Zöliakie

(glutenbedingte Erkrankung der Darmschleimhaut), virale Gastroenteritis (Entzündung von

Magen- und Darmschleimhaut) oder Ankylostomiasis (Hakenwurmkrankheit) eine

Malabsorption.


54

N-Acetyl-Neuraminsäure gehört zur Gruppe der Sialinsäuren. Neuraminsäure ist ein

Aminozucker der aus Mannosamin und Brenztraubensäure zusammengesetzt ist. Das N-

acetylierte Derivat wird als N-Acetyl-Neuraminsäure oder Sialinsäure bezeichnet.

Sialinsäuren sind Bausteine in Gangliosiden, Glykolipiden und Glykoproteinen und

hauptsächlich in Zellmembranen und Blutplasma zu finden. Im Fall einer N-

Acatylneuraminsäure-Speicherkrankheit (Sewell et al, 1996) oder einer Sialurie (Leroy et al,

2001; Weiss et al, 1989) wird N-Acetyl-Neuraminsäure vermehrt mit dem Urin

ausgeschieden.

Im Protonenspektrum der Urinprobe sind die Monosaccharide trotz der Überlagerungen

eindeutig zu identifizieren. Die Resonanzfrequenzen der anomeren Wasserstoffatome dieser

Moleküle liegen gegenüber den restlichen Protonen tieffeldverschoben. Für die α-Pyranosen

liegen sie um 5,2ppm und für die β-Pyranosen um 4,6ppm. Das Signal der Glucose bei

5,24ppm wird häufig zur internen Kalibrierung genutzt, da Glucose ein normaler Bestandteil

von Urin ist und die Resonanzfrequenzen der Monosaccharide nicht vom pH-Wert abhängig

sind.

ppm (t1) 3.504.004.505.00

ppm (t1) 4.504.604.704.804.905.005.105.20

α-Gal

α-Glu

α-Xyl

α-Fuc

β-Glu

β-Gal

β-Xylβ-Fuc

ppm (t1) 3.504.004.505.00

ppm (t1) 4.504.604.704.804.905.005.105.20

α-Gal

α-Glu

α-Xyl

α-Fuc

β-Glu

β-Gal

β-Xylβ-Fuc

Abbildung 27: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signalüberlagerungen zwischen 3,5ppm und 4,0ppm. In dem vergrößerten Bereich sind die Signale der anomeren Wasserstoffe der Monosaccharide dargestellt. Abkürzungen: Gal – Galactose, Glu – Glucose, Xyl – Xylose und Fuc – Fucose.

Im HSQC sind die korrelierten Signale der α-Wasserstoffe ebenfalls separiert. Die

Kohlenstoffe der α-Pyranosen liegen um 93ppm und der β-Pyranosen um 97ppm. Auch hier


55

fällt auf, dass die Signale dicht beieinander liegen, was auf sehr ähnliche Strukturen schließen

lässt.

ppm (t2) 4.504.604.704.804.905.005.105.205.30

90.0

95.0

100.0

105.0ppm (t1)

α-Glu

α-Gal α-Xyl

α-Fuc

β-Gluβ-Gal

β-Xyl

β-Fuc

ppm (t2) 4.504.604.704.804.905.005.105.205.30

90.0

95.0

100.0

105.0ppm (t1)

α-Glu

α-Gal α-Xyl

α-Fuc

β-Gluβ-Gal

β-Xyl

β-Fuc

Abbildung 28: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der anomeren Wasserstoffe der Monosaccharide. Abkürzungen: Gal – Galactose, Glu – Glucose, Xyl – Xylose und Fuc – Fucose.

Fructose und N-Acetyl-Neuraminsäure geben in diesem Bereich keine Signale. Bei der

Fructose befindet sich keine Hydroxylgruppe in der α-Position, sondern ein Proton. Die

Resonanzfrequenz dieser Methylengruppe ist hochfeldverschoben und, aufgrund

magnetischer Nichtäquivalenz, zu zwei Signalen aufgespaltet. Die Signale der Fructose

befinden sich im Protonenspektrum alle in dem Bereich der Kohlenhydrate und sind für eine

Analyse nicht geeignet. Im HSQC können die Signale der anomeren Wasserstoffe bei

4,02ppm und 84,34ppm bzw. 3,86ppm und 82,16ppm identifiziert werden, obwohl sie

teilweise überlagert sind. Da die korrelierten Kohlenstoffe bei über 80ppm liegen, sind sie am

unteren Rand des überlagerten Bereichs zu finden.


56

ppm (t2) 3.503.603.703.803.904.004.104.204.30

75.0

80.0

85.0

ppm (t1)

α-Fructose

β-Fructose

ppm (t2) 3.503.603.703.803.904.004.104.204.30

75.0

80.0

85.0

ppm (t1)

ppm (t2) 3.503.603.703.803.904.004.104.204.30

75.0

80.0

85.0

ppm (t1)

α-Fructose

β-Fructose

Abbildung 29: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der anomeren Wasserstoffe von Fructose.

N-Acetyl-Neuraminsäure unterscheidet sich in seiner Struktur von den übrigen Zuckern.

Trotzdem liegen die meisten Signale zwischen 3,5ppm und 4,2ppm. Ausnahmen bilden auch

hier die β-Wasserstoffe. Sie sind weit hochfeldverschoben in einem Bereich, der weniger

Signale beinhaltet. Die zwei aufgespalteten Signale der Methylengruppe liegen im

Protonenspektrum bei 2,23ppm und 1,84ppm. Der korrelierende Kohlenstoff bei 40,53ppm.

Diese Signale sind für analytische Zwecke am besten geeignet.

ppm (t1) 1.502.002.50

N-Ac-NeuN-Ac-Neu

ppm (t1) 1.502.002.50

N-Ac-NeuN-Ac-Neu

Abbildung 30: Protonenspektrum einer Urinprobe. Die Markierungen bezeichnen die aufgespalteten Signale der CH2-Guppe von der N-Acetyl-Neuraminsäure (N-Ac-Neu)


57

3.3.3.2. Disaccharide

Disaccharide bestehen aus zwei Monosacchariden, die über eine glycosidische Bindung

verknüpft sind. Die Monosaccharide können an verschiedenen Stellen miteinander verbunden

sein und unterschiedliche Stereochemie aufweisen. Dadurch ergibt sich eine Vielzahl an

möglichen Disacchariden. In der Urinprobe konnten Saccharose und Laktose identifiziert

werden.

Saccharose ist ein Disaccharid, welches sich aus Glucose und Fructose zusammensetzt. Die

Konzentration an Saccharose im Urin hängt von der Ernährung ab (Tasevska et al, 2005;

Luceri et al, 1996).

Lactose besteht aus Glucose und Galactose. Lactase-Mangel führt zu einer vermehrten

Ausscheidung von Lactose mit dem Urin.

Die Resonanzfrequenzen der Saccharose unterscheiden sich von denen der jeweiligen

Monosaccharide, da die Isomerie durch die Verknüpfung aufgehoben wird. Sie lässt sich am

einfachsten im HSQC durch das α-Wasserstoffatom der Glucose bei 5,40ppm und 93,42ppm

identifizieren. Bei der Lactose ist dagegen die Stereochemie erhalten geblieben. Die

gebundene Glucose besitzt ihre Hydroxylgruppe in der α-Position noch und begründet eine

Auftrennung in die α- und β-Form der Lactose. Dabei sind die Resonanzfrequenzen der

Galactose bei beiden Isomeren identisch. Die Signale der α-Wasserstoffe der Glucose liegen

sehr dicht bei denen der freien Glucose. Zur Identifizierung sind sie deshalb nicht so gut

geeignet. Die Resonanzfrequenz des α-Wasserstoffes der Galactose, deren Isomerie

aufgehoben ist, liegt bei 4,45ppm und 104,03ppm. Dieses Signal ist für analytische Zwecke

besser geeignet, ermöglicht aber keine Unterscheidung der beiden Anomere.


58

ppm (t2) 4.505.00

90.0

95.0

100.0

105.0

ppm (t1)

Saccharose

Lactose

ppm (t2) 4.505.00

90.0

95.0

100.0

105.0

ppm (t1)

ppm (t2) 4.505.00

90.0

95.0

100.0

105.0

ppm (t1)

Saccharose

Lactose

Abbildung 31: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der Disaccharide Saccharose und Lactose, die sich nicht in dem überlagerten Bereich der Kohlenhydrate befinden.

3.3.3.3. Zuckeralkohole

Zuckeralkohole oder mehrwertige Alkohole werden durch Reduktion der Monosaccharid-

Aldosen bzw. -Pentosen gebildet und mittels der Anzahl der Kohlenstoffatome klassifiziert.

Über die Funktion und den Stoffwechsel der meisten Zuckeralkohole ist nur wenig bekannt,

ihre Ausscheidung ist alters- und geschlechtsabhängig (Lee und Chung, 2005). In den

untersuchten Urinproben konnten die Zuckeralkohole Arabinitol, Erythrol, Erythronsäure-1,4-

Lakton, Galactitol, Mannitol, Myo-Inositol, Threitol, Sorbitol, Ribitol, Fucitol und Xylitol


Arabinitol bzw. Arabitol ist das Oxidationsprodukt von Xylulose und Bestandteil des Pentose-

Stoffwechsels. Im Fall einer systemischen Candidiasis (Pilzerkrankung) ist die Konzentration

an D-Arabinitol im Urin erhöht. Für eine eindeutige Diagnose muss das Verhältnis von D-

Arabinitol zu L-Arabinitol bestimmt werden (Sigmundsdóttir et al, 2000; Lehtonen et al,

1996). Störungen im Pentose-Stoffwechsel können ebenfalls zu einer vermehrten

Ausscheidung in den Urin führen (Verhoeven et al, 2001).

Erythritol ist als Süßstoff geeignet, da es nicht über den Darm ausgeschieden wird, sondern

über Magen und Zwölffingerdarm an die Niere, und damit an den Urin abgegeben wird

(Munro et al, 1998). Es gibt Beweise, dass Erythritol in humanen Geweben und

Körperflüssigkeiten existiert (Brusati et al, 2005), die Funktion ist aber bis heute unbekannt.

Störungen im Pentose-Stoffwechsel können zu erhöhten Konzentrationen an Erythritol im

Urin führen (Verhoeven et al, 2001).


59

Erythronsäure-1,4-Lakton wurde als normaler Bestandteil im Urin gesunder Kinder und

Erwachsener identifiziert (Thompson et al, 1975). Über die Funktion und den Stoffwechsel ist

bis heute nichts bekannt.

Galactitol bzw. Dulcitol ist ein Produkt von Galactose, welches nicht weiter metabolisiert

wird. Es ist im Fall einer Galactosämie, aufgrund eines Mangels an Galactokinase oder

Galactose-1-Phosphat-Uridyl-Transferase, in erhöhten Konzentrationen zu finden (Schwarz et

al, 1985; Ridel et al, 2005).

Mannitol ist normaler Bestandteil von Urin. Es spielt eine Rolle bei der Osmoregulation des

menschlichen Organismus. In Verbindung mit Lactulose wird Mannitol häufig für

Permeabilitätsuntersuchungen der Darmwand eingesetzt (Wring et al, 1998; Bao et al, 1996).

Außerdem findet Mannitol als Abführmittel und als Osmotherapeutikum zur

Gewebeentwässerung Verwendung.

Myo-Inositol ist ein Vorläufer des Second-Messengers Phosphatidylinositol. Es wird in vielen

menschlichen Geweben synthetisiert und zusätzlich mit der Nahrung aufgenommen. Mitunter

wird es als Wuchsstoff zum Vitamin-B2-Komplex gerechnet. Im Urin kann Myo-Inositol

alleine (Sarashina et al, 2004) oder im Verhältnis zu Chiro-Inositol als Marker für eine

Glucoseintoleranz genutzt werden (Jung et al, 2005). Threitol ist als normaler Bestandteil von

Urin bekannt (Wamelink et al, 2005). Es ist das Hauptprodukt des Xylose-Stoffwechsels, der

in der Leber stattfindet. Bei Patienten mit Leberzirrhose ist die Konzentration an Threitol im

Urin signifikant verringert (Pitkanen, 1977).

Sorbitol bzw. Glucitol wird aus Glucose gebildet und kann zu Fructose weiter metabolisiert

werden. Frauen zeigen höhere Sorbitol Konzentrationen im Urin als Männer (Lee und Chung

2005). Bei Diabetes Mellitus kann es durch den Abbau von Glucose zu einer vermehrten

Ausscheidung in den Urin kommen (Nakano et al, 2003).

Ribitol ist das Oxidationsprodukt der Ribose und wird, genau wie Arabinitol und Erythritol,

bei Störungen des Phosphopentose-Stoffwechsels vermehrt mit dem Urin ausgeschieden

(Verhoeven et al, 2001).

Fucitol ist normaler Bestandteil von Urin (Haga und Nakajima, 1989), über den Stoffwechsel

und die Funktion von Fucitol ist bis heute nichts bekannt. Xylitol wird als Zwischenprodukt

bei der Umwandlung von L-Xylose zu D-Xylose gebildet. Mit der Nahrung aufgenommenes

Xylitol wird zum Teil über den Urin ausgeschieden. Der Rest wird in der Leber über Xylulose

als Zwischenprodukt zu Glucose umgewandelt. Leberzirrhose führt zu stark erhöhten,

Hepatitis zu leicht erhöhten Xylitol Konzentrationen im Urin (Oka et al, 1976)


60

Sowohl im Protonenspektrum als auch im HSQC liegen die Signale der mehrwertigen

Alkohole alle sehr dicht beieinander in dem überlagerten Bereich. Eine quantitative Analyse

ist hier nicht möglich.

ppm (t2) 3.504.00

60.0

65.0

70.0

75.0

ppm (t1)

ppm (t2) 3.504.00

60.0

65.0

70.0

75.0

ppm (t1)

Abbildung 32: HSQC einer Urinprobe. Die Markierungen heben die Bereiche hervor, in denen die Signale der mehrwertigen Alkohole liegen. Einzelne Signale können nicht dargestellt werden. In der oberen Markierung liegen die Signale der endständigen Methylengruppen, in der unteren die Signale der Hydroxymethylengruppen.

3.3.4. Biogene Amine

Amine sind Derivate des Ammoniaks, bei dem die Wasserstoffe durch Alkyl- oder

Arylgruppen ersetzt wurden. Es gibt primäre, sekundäre und tertiäre Amine. Ein möglicher,

vierter Substituent verursacht am Stickstoff eine positive Ladung.

3.3.4.1. Quartäre Ammoniumverbindungen

Quartäre Ammoniumverbindungen sind meistens wichtige Träger von Methylgruppen, die für

Methylierungen verwendet werden. In den Urinproben konnten Betain, Carnitin und Cholin


Betain ist ein Abbauprodukt von Cholin und ein wichtiger Methylgruppen-Donor für

Transmethylierungen. Bei Diabetikern wurde eine vermehrte Ausscheidung in den Urin

beobachtet (Lever et al, 1994). Die Glukose-Konzentration im Urin wird jedoch bevorzugt zur

Diagnose und Therapiekontrolle eingesetzt.

Carnitin wird aus Lysin gebildet. Es transportiert Fettsäuren in die Mitochondrien von

Muskelzellen, wo sie zur Energiegewinnung oxidiert werden. Mit der Nahrung


61

aufgenommenes Carnitin wird zu einem großen Teil mit dem Urin ausgeschieden. Sowohl

systemischer als auch myopathischer Carnitinmangel führen zu erniedrigten Konzentrationen

im Urin (Rebouche und Paulson, 1986).

Cholin stellt die Grundsubstanz des Acetylcholins dar und erfüllt wesentliche

Intermediärfunktionen. Daneben ist es auch Baustein für Phosphatidylcholin und fungiert als

Methylgruppen-Donor. Cholin ist für den Menschen essentiell, kann aber bei Bedarf in

kleinen Mengen aus Ethanolamin synthetisiert werden. Es wird zu einem großen Teil zu

Methylaminen abgebaut. Ein geringer Anteil wird aber auch mit dem Urin ausgeschieden,

wobei die Menge ernährungsbedingt variiert.

Die Resonanzfrequenzen der drei quartären Amine liegen zwischen 2ppm und 4ppm. Die an

dem Stickstoff gebundenen Methylgruppen sind chemisch äquivalent und geben ein Singulett.

Diese Signale der drei Verbindungen liegen dicht beieinander bei 3,16ppm, 3,20ppm und

3,24ppm. Betain trägt nur ein weiteres Proton, dessen Signal bei 3,78ppm liegt und durch die

starken Überlagerungen dort nicht zur Analyse geeignet ist. Carnitin und Cholin tragen

weitere Protonen, von denen einige zusätzlich zur Identifizierung im Protonenspektrum

herangezogen werden können. Alle Signale sind von wenigen anderen überlagert.

ppm (t1) 2.503.003.504.00

Betain

Carnitin

Cholin

Carnitin

Cholin

ppm (t1) 2.503.003.504.00

Betain

Carnitin

Cholin

Carnitin

Cholin

Abbildung 33: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt einige Signale der quartären Amine.


62

3.3.4.2. Methylamine

Unter Methylaminen werden Verbindungen zusammengefasst, bei denen, ausgehend vom

Ammoniak, Wasserstoffe durch Methylgruppen substituiert sind. In den Urinproben konnten

Methylamin, Dimethylamin, Trimethylamin und Trimethylaminoxid identifiziert werden.

Methylamin ist ein Abbauprodukt von Creatinin. Deshalb führen creatininhaltige

Lebensmittel zu einer vermehrten Ausscheidung von Methylamin in den Urin.

Stoffwechselstörungen und andere Krankheiten, die zu veränderten Konzentrationen im Urin

führen sind bis heute nicht bekannt.

Dimethylamin, eine Vorstufe des Carcinogens N-Nitrosodimethylamin, wird auf

verschiedenen Wegen synthetisiert. Zum einen über die N-methylierung von Methylamin

welches ein Abbauprodukt von Sarcosine und Glycin ist. Zum anderen ist Dimethylamin ein

Abbauprodukt von N, N-Dimethylarginin, ein endogener Inhibitor der

Stickstoffmonoxidsynthese aus Arginin (Tsikas et al, 2007). Außerdem wird Dimethylamin

auch mit der Nahrung aufgenommen. Als Biomarker im Urin ist Dimethylamin nicht

geeignet, da unterschiedliche Krankheiten, z. B. Erkrankungen der Herzkranzgefäße oder der

Leber, zu einer vermehrten Ausscheidung führen (Tsikas et al, 2007).

Trimethylamin ist ein Abbauprodukt von Cholin, Carnitin und Trimethylaminoxid.

Umgekehrt wird mit der Nahrung aufgenommenes Trimethylamin zu Trimethylaminoxid

abgebaut und hauptsächlich in dieser Form mit dem Urin ausgeschieden. Trimethylaminurie,

ein Enzymdefekt, ruft bei den Betroffenen einen charakteristischen Geruch nach Fisch hervor.

Dieser Geruch wird durch vermehrt mit dem Urin ausgeschiedenes Trimethylamin verursacht

(Bain et al, 2005; Mitchell und Smith, 2001). Trimethylaminoxid wird dementsprechend im

Fall einer Trimethylaminurie weniger ausgeschieden. Erhöhte Konzentrationen im Urin

können nach dem Verzehr von Fisch beobachtet werden (Zeisel und DaCosta, 1986).

Da die am Stickstoff gebundenen Methylruppen chemisch äquivalent sind, geben sie jeweils

nur ein Singulett. Trimethylaminoxid und Dimethylamin bei 3,39ppm bzw. 2,71ppm sind

aufgrund ihrer Konzentrationen leicht zu identifizieren. Trimethylamin und Methylamin bei

2,87ppm bzw. 2,61ppm sind dagegen sehr gering konzentriert.


63

ppm (t1) 2.503.003.50

MA

DMA

TMA

TMAO

ppm (t1) 2.503.003.50

MA

DMA

TMA

TMAO

Abbildung 34: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der Methylamine. Abkürzungen: TMAO – Trimethylaminoxid, TMA – Trimethylamin, DMA – Dimethylamin, MA – Methylamin.

3.3.4.3. Guanidin-Verbindungen

In den Urinproben konnten Creatin, Phosphocreatin, Creatinin und Guanidinoacetat


Creatin, ein Zwischenprodukt des intermediären Stoffwechsels, wird in der Leber in

annähernd konstanter Menge aus Glycin, Arginin und Methionin gebildet. Creatin wird zum

großen Teil im Muskelgewebe gelagert, wo es in energiereiches Creatinphosphat

umgewandelt wird. Der Abbau erfolgt zu Creatinin. Auf einen Enzymdefekt basierende

Creatin-Mangel-Syndrome sind mit niedrigen Konzentrationen im Urin verbunden.

Mangelsyndrome, die auf eine Störung im tubulären Transport zurückzuführen sind,

verursachen dagegen erhöhte Creatin-Konzentrationen im Urin (Sykut-cegielska et al, 2004).

Phosphocreatin ist der aus Creatin gebildete Energiespeicher im Muskel.

Stoffwechselstörungen oder andere Krankheiten, die zu veränderten Konzentrationen im Urin

führen, sind bis heute nicht bekannt.

Guanidinoacetat ist ein Metabolit im Harnstoffzyklus und im Stoffwechsel der Aminosäuren

Glycin, Serin, Threonin, Arginin und Prolin. Es ist auch ein Vorläufer von Creatin und damit

essentiell für den Energie-Stoffwechsel der Muskeln. Guanidinoacetat-Methyltransferase-

Mangel bedingt eine erhöhte Konzentration im Urin (Sykut-cegielska et al, 2004),

Nierenversagen erniedrigte Konzentrationen (Shirokane et al, 1987).

Creatinin ist das Abauprodukt des Creatinphosphats und wird im Muskelgewebe gebildet. Die

Synthese und Ausscheidung des harnpflichtigen Anhydrids erfolgt relativ konstant und ist


64

abhängig von der Masse des Körpers. Aufgrund dieser konstanten Ausscheidung bei

Erwachsenen wird Creatinin häufig als interner Standard für Konzentrationsbestimmungen

anderer Metabolite im Urin herangezogen. Die sogenannte „Creatinin-Clearance“ wird zum

Nachweis einer beginnenden Niereninsuffizienz herangezogen. In diesem Fall ist die Menge

an Creatinin, die in 24Std. je kg Körpergewicht in den Urin abgegeben wird, erniedrigt. Als

Einzeluntersuchung hat die Bestimmung der Creatinin-Ausscheidung praktisch keine

Aussagekraft, da verschiedene Syndrome die Konzentration verändern. So sind zum Beispiel

Erkrankungen wie Muskeldystrophie, amyotrophische Lateralsklerose oder Dermatomyositis

mit einem Rückgang der Muskulatur verbunden und verursachen deshalb verringerte

Creatinin-Konzentrationen im Urin.

Creatinin, Creatin und Phosphocreatin sind aufgrund ihrer Konzentrationen leicht zu

identifizieren. Die Resonanzfrequenzen von Creatin und Phosphocreatin liegen sowohl bei

3,91ppm als auch bei 3,01ppm so dicht beieinander, dass sie weder im Protonenspektrum

noch im HSQC getrennt beobachtet werden können. Guanidinoacetat ist dagegen sehr gering

konzentriert und sein Signal bei 3,78ppm wird von anderen Signalen überlagert. Zur

Identifizierung ist das HSQC notwendig.

ppm (t1) 3.003.504.00

Creatin

Creatin

PhosphocreatinPhosphocreatin

Creatinin

Creatinin

Guanidinoacetat

ppm (t1) 3.003.504.00

Creatin

Creatin

PhosphocreatinPhosphocreatin

Creatinin

Creatinin

Guanidinoacetat

Abbildung 35: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der Guanidin-Verbindungen.


65

3.3.4.4. Primäre Amine

Bei primären Aminen ist nur ein Wasserstoff des Ammoniaks durch eine Alkylgruppe

substituiert. In den Urinproben konnten Ethanolamin, Phosphoethanolamin und Taurin


Ethanolamin ist die unmethylierte Vorstufe des Cholins und ein Decarboxylierungsprodukt

von Serin. Es ist ein Baustein in Plasmalogenen und in Glycerophosphatiden.

Stoffwechselstörungen oder andere Krankheiten, die veränderte Konzentrationen im Urin

verursachen, sind bisher nicht bekannt.

Phosphoethanolamin, der Phosphorsäure-Ester des Ethanolamins, ist Bestandteil der

Phosphatidylamine und Abbauprodukt des Sphingosin-1-Phosphates. Hyperphosphatasie, ein

Enzymdefekt, bedingt eine vermehrte Ausscheidung an Phosphoethanolamin mit dem Urin

(Igbal et al, 2000). Taurin ist ein Abbauprodukt von Cystin und Methionin. Es fungiert als

Neurotransmitter im Gehirn, stabilisiert Zellmembranen und wird für den Ionentransport von

Natrium, Kalium, Magnesium oder Calcium genutzt. Sulfit-Oxydase-Mangel oder Hyper-β-

Alaninämie verursachen vermehrte Taurin Ausscheidung mit dem Urin.

Die primären Amine sind nur gering konzentriert und geben Signale mit schwacher Intensität.

Ihre Resonanzfrequenzen liegen zum Teil in dem stark überlagerten Bereich der

Kohlenhydrate. Aber jede Verbindung zeigt zumindest ein Signal, welches für analytische

Zwecke verwendet werden kann. Die Signale von Taurin bei 3,29ppm und 3,43ppm, und das

Signal von Ethanolamin bei 3,14ppm, sowie von Phosphoethanolamin bei 3,25ppm sind nur

wenig überlagert. Aufgrund der schwachen Signalintensitäten ist es sinnvoll, das HSQC zur

Identifizierung heranzuziehen.


66

ppm (t1) 3.003.504.00

Taurin

Ethanolamin

P-ethanolamin

Ethanolamin

Taurin

P-ethanolamin

ppm (t1) 3.003.504.00

Taurin

Ethanolamin

P-ethanolamin

Ethanolamin

Taurin

P-ethanolamin

Abbildung 36: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der primären Amine. Abkürzung: P-Ethanolamin - Phosphoethanolamin

Im HSQC liegen die meisten Signale der identifizierten Amine relativ dicht beieinander.

Einige Resonanzfrequenzen liegen auch hier in dem stark überlagerten Bereich der

Kohlenhydrate, aber die meisten sind in einem Bereich mit weniger Überlagerungen zu

finden. Methylamin und Trimethylamin zeigen nur sehr kleine Signale gegenüber

Dimethylamin und Trimethylaminoxid. Die Signale der Methylgruppen der Amine liegen

aufgrund ihrer strukturellen Gemeinsamkeiten sehr dicht beieinander, ebenso wie

Ethanolamin und Phosphoethanolamin. Das Signal von Guanidinoacetat liegt etwas abseits

von den anderen Guanidino-Verbindungen. Die Verbindungen Creatinin, Creatin und

Phosphocreatin zeigen Signale mit starker Intensität. Auch hier ist es nicht möglich, Creatin

und Phosphocreatin zu unterscheiden.


67

ppm (t2) 1.502.002.503.003.50

30

40

50

60

ppm (t1)

QA

MA

DMA

TMA

TMAO

Cn

Cr / PCrGA

Ta

EA

PEA

ppm (t2) 1.502.002.503.003.50

30

40

50

60

ppm (t1)

ppm (t2) 1.502.002.503.003.50

30

40

50

60

ppm (t1)

QA

MA

DMA

TMA

TMAO

Cn

Cr / PCrGA

Ta

EA

PEA

Abbildung 37: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der identifizierten Amine. In diesem Bereich ist zumindest ein Signal von jeder Verbindung zu finden. Die Markierung hebt die Signale der Methylgruppen der vorhandenen quartären Amine hervor. Abkürzungen: GA – Guanidinoacetat, Cn – Creatinin, Cr – Creatin, PCr – Phosphocreatin, MA – Methylamin, DMA – Dimethylamin, TMA – Trimethylamin, TMAO – Trimethylaminoxid, PEA – Phosphoethanolamin, EA – Ethanolamin, QA – quartäre Amine.

3.3.5. Carbonsäuren

Carbonsäuren sind organische Verbindungen, die aus einer Kohlenwasserstoffkette und einer

funktionellen Gruppe, der Carboxyl-Gruppe, bestehen. Sie sind Intermediate oder

Endprodukte im Stoffwechsel der Aminosäuren, Kohlenhydrate, Fettsäuren und der biogenen

Amine.

3.3.5.1. Dicarbonsäuren

In den Urinproben konnten die Dicarbonsäuren Adipinsäure, Ameisensäure, Fumarsäure,

Glutarsäure, Suberinsäure, Maleinsäure, Malonsäure, Methylmalonsäure und

Carbamoylaspartat identifiziert werden.

Adipinsäure ist ein normaler Bestandteil von Urin. Sie entsteht bei der Fettsäureoxidation und

wird mit der Nahrung aufgenommen. Eine erhöhte Syntheserate von Glutaryl-CoA inhibiert

die Dehydrierung von Adipyl-CoA und führt zu einer vermehrten Ausscheidung von

Adipinsäure im Urin. Dieser Fall kann bei einer Glutarsäureurie Typ II auftreten.

Ameisensäure ist ein Metabolit im Intermediärstoffwechsel.

Fumarsäure entsteht im Citratzyklus durch Oxidation der Bernsteinsäure, im Harnstoffzyklus

durch Spaltung der Argininbernsteinsäure und beim Abbau von Phenylalanin, Tyrosin und


68

Asparaginsäure. Fumarase-Mangel führt zu einer vermehrten Ausscheidung in den Urin

(Deschauer et al, 2006).

Glutarsäure ist ein Abbauprodukt des Lysins und ist als Glutaryl-CoA im Fettsäure-

Stoffwechsel zu finden. Verschiedene Enzymdefekte führen zu erhöhten Konzentrationen im

Urin, darunter Glutaryl-CoA-Dehydrogenase-Mangel (Zschocke et al, 2000).

Suberinsäure ist ein Metabolit aus dem Fettsäure-Stoffwechsel. Störungen in diesem

Stoffwechsel führen zu erhöhten Konzentrationen im Urin.

Methylmalonsäure ist ein Abbauprodukt der Aminosäuren Isoleucin und Valin und als

MethylmalonylCoA im Fettsäure-Stoffwechsel zu finden. Methylmalonyl-CoA-Isomerase-

Mangel (Drennan et al, 1996) oder Vitamin B12-Mangel (Bjorke Monsen und Ueland, 2003)

führen zu einer vermehrten Ausscheidung in den Urin.

Ureidobernsteinsäure ist ein Intermediärprodukt der Pyrimidin-Biosynthese. Ein Mangel an

Ornithin-Transcarbamylase oder Argininosuccinase führt zu einer erhöhten Konzentration an

Ureidobernsteinsäure im Urin (van Kuilenburg et al, 2004).

Glutarsäure, Adipinsäure und Suberinsäure sind Carbonsäuren mit CH2-Ketten. Die Signale

dieser CH2-Ketten liegen im Hochfeldbereich. Aufgrund der ähnlichen Strukturen liegen die

α-Wasserstoffe der drei Säuren dicht beieinander bei 2,21ppm, 2,22ppm und 2,20ppm. Da die

Wasserlöslichkeit durch die Lipophilie der CH2-Ketten eingeschränkt ist, sind die Säuren nur

gering konzentriert und geben Signale mit sehr schwacher Intensität.

ppm (t1) 1.502.00

Adipinsäure

Adipinsäure

Glutarsäure

GlutarsäureSuberinsäure

SuberinsäureSuberinsäure

ppm (t1) 1.502.00

Adipinsäure

Adipinsäure

Glutarsäure

GlutarsäureSuberinsäure

SuberinsäureSuberinsäure

Abbildung 38: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der Dicarbonsäuren Adipinsäure, Glutarsäure und Suberinsäure.


69

Ameisensäure ist die kleinste Carbonsäure. Sie besteht nur aus der Carboxygruppe und einem

daran gebundenen Proton. Die Resonanzfrequenz dieses Protons ist weit tieffeldverschoben

bei 8,45ppm. Das Signal des dazugehörenden Kohlenstoffs liegt bei 172,29ppm. Fumarsäure

besitzt eine symmetrische Struktur und zeigt im Spektrum nur ein Signal bei 6,70ppm. Das

Signal des korrespondierenden Kohlenstoffs ist tieffeldverschoben bei 137,78ppm. Beide

Säuren sind nur gering konzentriert. Da sie in Bereichen mit wenigen Signalüberlagerungen

liegen, ist es trotzdem möglich, sie zu identifizieren.

8.50 6.50

Ameisensäure Fumarsäure

8.50 6.50

Ameisensäure Fumarsäure

Abbildung 39: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der Ameisensäure und der Fumarsäure. Der Bereich zwischen 6,9ppm und 8,3ppm wurde herausgeschnitten.

Das Signal der Malonsäure liegt bei 3,09ppm in dem Bereich der Kohlenhydrate. Es ist im

Protonenspektrum nicht detektierbar. Durch den korrespondierenden Kohlenstoff bei

49,05ppm kann die Malonsäure im HSQC identifiziert werden. Methylmalonsäure zeigt

ebenfalls ein Signal in dem überlagerten Bereich und ist im HSQC bei 3,23ppm und

44,08ppm zu finden. Zusätzlich gibt die Methylgruppe ein Signal bei 1,27ppm und 15,93ppm.

Die Ureidobernsteinsäure zeigt die Signale einer Methylengruppe bei 2,63ppm und 2,80ppm,

die durch sterische Hinderung aufspaltet. Deshalb korrelieren beide Signale im HSQC zu

demselben Kohlenstoffatom bei 41,34ppm. Daneben gibt sie noch ein Signal bei 4,22ppm und

57,95ppm.


70

ppm (t2) 2.503.003.50

35.0

40.0

45.0

50.0

ppm (t1)

MA

MMA

UBS

ppm (t2) 2.503.003.50

35.0

40.0

45.0

50.0

ppm (t1)

ppm (t2) 2.503.003.50

35.0

40.0

45.0

50.0

ppm (t1)

MA

MMA

UBS

Abbildung 40: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der Malonsäure (MA), Methylmalonsäure (MMA) und der Ureidobernsteinsäure (UBS).

3.3.5.2. Tricarbonsäuren

In den Urinproben konnten die Tricarbonsäuren Citronensäure, cis-Aconitsäure und trans-

Aconitsäure identifiziert werden.

Citronensäure ist eine Tricarbonsäure aus dem Citratzyklus. Nierensteine und nephrogene

Azidose führen zu einer verringerten Ausscheidung in den Urin. Aconitsäure kommt in zwei

isomeren Formen vor. Die cis-Aconitsäure ist ein wichtiges Glied des Citratzyklus. Trans-

Aconitsäure gelangt wahrscheinlich über die Nahrung und die Darmflora in den Urin.

Die Citronensäure gehört zu den Verbindungen, die in größeren Mengen im Urin vorkommen.

Die Signale der Citronensäure bei 2,58ppm und 2,73ppm werden durch zwei

Methylengruppen verursacht, deren Protonen magnetisch nicht äquivalent sind. Diese Signale

sind aufgrund ihrer Intensität im Protonenspektrum gut zu erkennen.


71

ppm (t1) 2.002.503.00

Citronensäure

ppm (t1) 2.002.503.00

Citronensäure

Abbildung 41: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der Citronensäure. Das linke Signal ist zum Teil von einer anderen Verbindung überlagert.

Die stereoisomeren Verbindungen cis- und trans-Aconitsäure zeigen trotz der ähnlichen

Strukturen unterschiedliche Signale. Während die cis-Aconitsäure ein Signal bei 6,04ppm

zeigt, liegt das der trans-Aconitsäure bei 6,67ppm. Daneben zeigen beide Verbindungen ein

weiteres Signal. Diese Signale liegen jedoch im überlagerten Bereich der Kohlenhydrate und

sind zur Identifizierung nicht geeignet.

ppm (t1) 6.006.50

trans-Aconitsäure cis-Aconitsäure

ppm (t1) 6.006.50

trans-Aconitsäure cis-Aconitsäure

Abbildung 42: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der cis-Aconitsäure und der trans-Aconitsäure.

Die Resonanzfrequenzen der Aconitsäuren sind stark pH-abhängig. Eine Änderung des pH-

Werts der Probe von 5,85 zu 7,0 verschiebt die Signale von 6,04ppm zu 5,71ppm und von

6,67ppm zu 6,58ppm. Daher muss der pH-Wert der Proben sorgfältig eingestellt werden,

wenn die Fragestellung eine Analyse der Aconitsäuren erfordert.


72

3.3.5.3. Aminocarbonsäuren

In den Urinproben konnten die Aminocarbonsäuren 2-Aminoisobuttersäure, 3-Amino-2-

Methylpropionsäure und Ureidopropionsäure identifiziert werden.

2-Aminoisobuttersäure, eine für Menschen nichtproteinogene Aminosäure ist ein Endprodukt

des Pyrimidin-Stoffwechsels. Erhöhte Urin-Konzentrationen werden im Fall einer

Ketoazidose beobachtet. 3-Amino-2-Methylpropionsäure ist ein Intermediat aus dem

Stoffwechsel der Pyrimidinbasen Thymin und Uracil und ein Abbauprodukt von Valin.

Sowohl 3-Hydroxyisobuttersäure-Dehydrogenase-Mangel als auch Methylmalonic-

Semialdehyd-Dehydrogenase-Mangel (Manning und Pollitt, 1985) führen zu erhöhten

Konzentrationen im Urin (Podebrad et al, 2000).

Ureidopropionsäure ist Bestandteil des β-Alanin-Stoffwechsels und ein Abbauprodukt von

Pyrimidinen. Ureidopropionase-Mangel führt zu einer vermehrten Ausscheidung in den Urin

(van Kuilenburg et al, 2004).

Die Aminocarbonsäuren können einfach im Protonenspektrum identifiziert werden. 2-

Aminoisobuttersäure trägt eine Methylgruppe, die ein Signal bei 1,48ppm zeigt. Die 3-

Amino-2-Methylpropionsäure trägt ebenfalls eine Methylgruppe, deren Signal bei 1,19ppm

liegt. Ureidopropionsäure trägt keine Methylgruppen, aber eine Methylengruppe, deren Signal

bei 2,39ppm zu finden ist.

ppm (t1) 1.502.002.50

UPSAIBS AMPS

ppm (t1) 1.502.002.50

UPSAIBS AMPS

Abbildung 43: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt einige Signale der Aminocarbonsäuren 3-Amino-2-Methylpropionsäure (AMPS), 2-Aminoisobuttersäure (AIBS) und Ureidopropionsäure (UPS).


73

3.3.5.4. Hydroxycarbonsäuren

In den Urinproben konnten die Hydroxycarbonsäuren 3-Hydroxy-2-Methylpropionsäure, 3-

Hydroxyisovaleriansäure, Milchsäure, Pantothensäure, Glycolsäure, Glycerinsäure,

Threonsäure, 2-Hydroxyisobuttersäure und Glucuronsäure identifiziert werden.

3-Hydroxy-2-Methylpropionsäure ist, wie 3-Amino-2-Methylpropionsäure, ein Abbauprodukt

von Valin, Thymin und Uracil. Beide Substanzen sind mit seltenen Enzymdefekten

verbunden. Sowohl 3-Hydroxyisobuttersäure-Dehydrogenase-Mangel als auch

Methylmalonic-Semialdehyd-Dehydrogenase-Mangel (Manning und Pollitt, 1985) führen zu

erhöhten Konzentrationen der beiden Verbindungen im Urin (Podebrad et al, 2000).

3-Hydroxyisovaleriansäure ist ein normaler Bestandteil von Urin. Verschiedene

Enzymdefekte, darunter Biotidinase-Mangel, 3-Methylcrotonyl-CoA-Carboxylase-Mangel

(Baumgartner et al, 2001) und 3-Methylglutaconsäure-Azidose, führen zu einer vermehrten

Ausscheidung in den Urin.

Milchsäure ist ein glykolytisches Hydrierungsprodukt der Brenztraubensäure im

Intermediärstoffwechsel. Laktoseintoleranz und Laktase-Mangel führen zu einer vermehrten

Ausscheidung in den Urin.

Pantothensäure bzw. Vitamin B3 ist ein Coenzym-A-Baustein. Die Konzentration im Urin

hängt zum Teil von der Ernährung ab.

Glykolsäure wird zu Glyoxylatsäure oxidiert und weiter zu Glycin umgesetzt. In einigen

Fällen der Hyperoxalurie Typ I wird sie vermehrt in den Urin ausgeschieden (Danpure,

2005; Dietzen et al, 1997).

Glycerinsäure ist das Oxidationsprodukt von Glycerin und spielt als Phosphoglycerat eine

wichtige Rolle im Kohlenhydratstoffwechsel. Zwei verschiedene Enzymdefekte führen zu

erhöhten Konzentrationen im Urin. Im Fall eines Glycerat-Kinase-Mangels wird

ausschließlich D-Glycerinsäure vermehrt ausgeschieden (Fontaine et al, 1989), im Fall eines

Glycerat-Dehydrogenase-Mangels (auch Hyperoxalurie Typ II) L-Glycerinsäure (Dietzen et

al, 1997).

Threonsäure ist ein Abbauprodukt der Ascorbinsäure. Ascorbinsäure kommt ebenfalls im

Urin vor, konnte jedoch mit Hilfe der NMR-Spektroskopie nicht nachgewiesen werden.

Stoffwechselstörungen oder andere Krankheiten, die zu veränderten Konzentrationen der

Threonsäure führen, sind bis heute nicht bekannt. Carbamoylaspartat ist ein

Intermediärprodukt der Pyrimidin-Biosynthese. Ein Mangel an Ornithin-Transcarbamylase

oder Argininosuccinase führt zu einer erhöhten Konzentration an Carbamoylaspartat im Urin

(van Kuilenburg et al, 2004).


74

2-Hydroxyisobuttersäure ist ein normaler Bestandteil von Urin. Außerdem ist es ein Metabolit

von Methyl-tertiär-Butyl-Ether (Amberg et al, 2000). Eine vermehrte Ausscheidung in den

Urin ist bei Isovaleriatämie zu beobachten (Shigematsu et al, 1982).

Glucuronsäure ist Bestandteil von Glukosaminoglykanen und bildet, vor allem in der Leber,

mit vielen schädlichen Substanzen wasserlösliche Glucuronide, die dann über Niere und

Leber ausgeschieden werden können.

Die Signale der Hydroxycarbonsäuren Glykolsäure, Glycerinsäure und Threonsäure liegen bei

3,97ppm, 3,86ppm und 4,32ppm bzw. 3,69ppm, 3,62ppm, 3,98ppm und 4,07ppm im Bereich

der Kohlenhydrate und sind nicht einfach zu identifizieren.

3-Hydroxy-2-Methylpropionsäure, 3-Hydroxyisovaleriansäure, Milchsäure, Pantothensäure,

und 2-Hydroxyisobuttersäure tragen jeweils mindestens eine Methylgruppe. Die Signale

dieser Methylgruppen können zur Identifzierung der Hydroxycarbonsäuren herangezogen

werden. Das Signal der Methylgruppe von 3-Hydroxy-2-Methylpropionsäure liegt bei

1,06ppm, das der Milchsäure bei 1,34ppm und das der 2-Hydroxyisobuttersäure bei 1,37ppm.

Die Methylgruppen der 3-Hydroxyisovaleriansäure sind chemisch äquivalent und geben ein

Signal bei 1,32ppm. Die Methylgruppen der Pantothensäure sind nicht chemisch äquivalent.

Ihre Signale liegen bei 0,87ppm und 0,90ppm.

ppm (t1) 1.001.50

PSHMPS

HIVSMS

HIBS

ppm (t1) 1.001.50

PSHMPS

HIVSMS

HIBS

Abbildung 44: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt einige Signale der Carbonsäuren 2-Hydroxyisobuttersäure (HIBS), Milchsäure (MS), 3-Hydroxyisovaleriansäure (HIVS), 3-Hydroxy-2-Methylpropionsäure (HMPS) und Pantothensäure (PS)

Die Glucuronsäure ähnelt in ihrer Struktur der Glucose. Wie bei der Glucose existieren zwei

Diastereomere der Glucuronsäure, die ebenfalls anomere Wasserstoffe tragen. Die Signale

dieser α-Wasserstoffe liegen dicht neben denen der Glucose bei 5,26ppm und 4,66ppm und

können zur Identifizierung genutzt werden.


75

ppm (t1) 4.505.00

α-Glucuronsäure

β-Glucuronsäure

ppm (t1) 4.505.00

α-Glucuronsäure

β-Glucuronsäure

Abbildung 45: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der anomeren Wasserstoffe der Glucuronsäure.

3.3.5.5. Oxocarbonsäuren

In den Urinproben konnten die Oxocarbonsäuren 2-Ketoglutarsäure, Brenztraubensäure,

Oxalacetat und Acetoacetat identifiziert werden.

2-Ketoglutarsäure, eine Dicarbonsäure, ist eine Schlüsselsubstanz des Citratcyklus und eine

Vorstufe von Glutaminsäure und Glutamin. Enzymdefekte, wie zum Beispiel 2-Ketoglutarat-

Dehydrogenase-Mangel (Dunckelmann et al, 2000) oder Glykogenose, führen zu einer

vermehrten Ausscheidung von 2-Ketoglutarsäure in den Urin.

Brenztraubensäure ist die einfachste Ketosäure und ein wichtiger Metabolit im

Intermediärstoffwechsel der Kohlenhydrate (Glykolyse, Citratzyklus). Durch

Sauerstoffmangel, Vitaminmangel oder Gifte verursachte Zellschädigungen führen ebenso zu

einer Pyruvat-Anreicherung im Urin, wie Pyruvat-Dehydrogenase-Mangel und andere

enzymatische Defekte.

Oxalacetat ist, wie 2-Ketoglutarat, ein zentraler Metabolit im Citratcyclus.

Stoffwechselstörungen oder andere Krankheiten, die zu veränderten Konzentrationen im Urin

führen, sind bis heute nicht bekannt. Pantothensäure bzw. Vitamin B3 ist ein Baustein des

Coenzym-A. Die Konzentration im Urin hängt zum Teil von der Ernährung ab

Acetoacetat entsteht im Intermediärstoffwechsel aus ketoplastischen Aminosäuren und im

Fettstoffwechsel. Eine Stoffwechselentgleisung bei Diabetes mellitus führt zu erhöhten

Acetoacetat-Konzentrationen im Urin (Bales et al, 1984).

Die Signale von 2-Ketoglutarsäure, Brenztraubensäure, Oxalacetat und Acetoacetat liegen

alle im Hochfeldbereich. 2-Ketoglutarsäure zeigt zwei Signale bei 2,48ppm und 3,02ppm.

Das Signal der Brenztraubensäure ist bei 2,28ppm zu finden, das des Oxalacetats bei

2,38ppm. Die beiden Signale vom Acetoacetat liegen bei 2,27ppm und 3,44ppm.


76

ppm (t1) 2.503.003.50

KGS

KGS

BS

OA

AA

AA

ppm (t1) 2.503.003.50

KGS

KGS

BS

OA

AA

AA

Abbildung 46: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale der 2-Ketoglutarsäure (KGS), Brenztraubensäure (BS), Oxalacetat (OA) und Acetoacetat (AA).

3.3.5.6. Andere Verbindungen

Unter dem Begriff „Andere Verbindungen“ werden Substanzen zusammengefasst, die sich

nur schwer in die gewählte Einteilung einordnen lassen. Dazu gehören die in den Urinproben

identifizierten Verbindungen Aceton, Acetat und Allantoin.

Aceton ist ein Keton, keine organische Säure. Es wird aus Acetoacetat gebildet. Fasten,

Hungern oder Störungen im Kohlenhydrat-Stoffwechsel fördern die Entstehung von Aceton,

welches dann vermehrt über die Atmung und mit dem Urin ausgeschieden wird (Bales et al,

1984).

Acetat, das Anion der Essigsäure, stellt als Acteyl-CoA Acetylreste für Biosynthesen im

Intermediärstoffwechsel zur Verfügung. Im Stoffwechsel der Kohlenhydrate, Amino- und

Fettsäuren ist es ein Endprodukt. AcetylCoA ist auch wichtig für die Biosynthese von

Acetylcholin. Um den pH-Wert in den Zellen konstant zu halten, wird überschüssiges, freies

Acetat mit dem Urin ausgeschieden. Auch mit der Nahrung aufgenommenes Acetat wird in

den Urin überführt.

Allantoin ist keine Carbonsäure, sondern ein Carboxamid. Es entsteht durch den Abbau von

Harnsäure durch Uricase. Der Mensch kann, im Gegenteil zu vielen Säugetieren, durch die

Uricase der Darmflora nur wenig Harnsäure in Allantoin überführen. Daneben findet

Allantoin in verschiedenen Kosmetikprodukten Verwendung.


77

Allantoin besitzt nur ein Proton, welches im Protonenspektrum detektiert werden kann. Das

Signal liegt bei 5,38ppm und der dazugehörende Kohlenstoff bei 64,2ppm. Das Signal von

Allantoin liegt neben dem überlagerten Bereich der Kohlenhydrate bei 5,38ppm und

64,20ppm und ist sowohl im Protonenspektrum als auch im HSQC einfach zu identifizieren.

ppm (t2) 4.505.005.506.00

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

ppm (t1)

Allantoin

ppm (t2) 4.505.005.506.00

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

ppm (t1)

ppm (t2) 4.505.005.506.00

50.0

55.0

60.0

65.0

70.0

75.0

ppm (t1)

Allantoin

Abbildung 47: HSQC einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt das Signal von Allantoin.

Die Signale von Aceton und Acetat liegen dagegen weit hochfeldverschoben bei 2,24ppm

bzw. 1,91ppm. Sie können im Protonenspektrum detektiert werden, obwohl die Intensität

beider Signale nur gering ist.

ppm (t1) 1.502.002.50

AcetonAcetat

ppm (t1) 1.502.002.50

AcetonAcetat

Abbildung 48: Protonenspektrum einer Urinprobe. Der Ausschnitt zeigt die Signale von Aceton und Acetat.


78

3.4. Zusammenfassung

Die hier vorgestellten Metabolite wurden auf verschiedenen Wegen identifiziert. Ein Teil der

Signalzuordnung erfolgte über Literaturrecherche. So konnte ein Großteil der proteinogenen

Aminosäuren, diverse Monosaccharide, Indole, Amine und ein Teil der organischen Säuren

mit Hilfe verschiedener Artikel identifiziert werden (Fan, 1996; Nicholson und Foxall, 1995;

Holmes et al, 1997). Die Signalzuordnung der Zuckeralkohole erfolgte ebenfalls über

Literaturrecherche (Hawkes und Lewis, 1984; Angyal und Wheen, 1980; Angyal und Le Fur,

1980). Außerdem konnten mittels Literatur die Substanzen N-Acetyl-Neuraminsäure (Gervay

und Batta, 1994), Hippursäure (Fan, 1996), Pseudouridin (Grey et al, 1971) identifiziert

werden.

Andere Signale konnten mit Hilfe der Datenbank SDBS zugeordnet werden. Über diese

Datenbank konnte ein weiterer Teil der organischen Säuren und der Amine identifiziert

werden. Die Signalzuordnung der meisten Nukleoside erfolgte ebenfalls über die Datenbank.

Hier waren jedoch zusätzliche Referenzmessungen notwendig, da die Signale dieser

Verbindungen sehr dicht beieinander liegen. Außerdem wurden die Metabolite 1-Methyl-

Nicotinamid, 1-Methylnicotinsäure, 4-Hydroxybenzamid, Fucose, Xylose, Lactose,

Saccharose, Guanidinoacetat und Allantoin mit Hilfe der Datenbank identifiziert.

Ein Großteil der aromatischen und heteroaromatischen Verbindungen und einige organische

Säuren wurden durch Strukturaufklärung identifiziert. So konnten Histidin, 1-Methylhistidin,

3-Methylhistidin und Carnosine nur mit Hilfe der Strukturaufklärung identifiziert werden, da

bei gegebenen pH-Wert keine Signalzuordnung vorliegt. Im Fall des 4-Pyridon-3-

Carboxyamid-1-beta-D-Ribonucleosid wurde die Strukturaufklärung durch anschließende

Literaturrecherche (Slominska et al, 2006) unterstützt.

Die meisten Metabolite, die in den Urinproben identifiziert wurden, können als

Markermolekül mit Stoffwechselstörungen in Verbindung gebracht werden. Viele von ihnen

können über ihre Signale in einem Protonenspektrum zugeordnet werden, andere müssen mit

Hilfe des HSQC oder COSY identifiziert werden. Mit Hilfe von NMR und

Mustererkennungsverfahren ist es möglich, die hier genannten Substanzen zur Diagnose

pathologischer Stoffwechseländerungen einzusetzen. Einige von ihnen sind nur gering

konzentriert, so dass sie unter normalen Bedingungen durch die Datenreduzierung der

Mustererkennungsverfahren nicht mehr erfasst werden. Erhöhte Konzentrationen können

jedoch detektiert werden.

Einzelne Substanzen, wie zum Beispiel Harnsäure tragen keine Protonen und geben im NMR

keine Signale. Deshalb sind sie nicht detektierbar. Andere Metabolite sind an Glucuronsäuren,


79

Ribosen oder andere Moleküle gebunden, die die Hydrophilie steigern. Diese gebundenen

Moleküle können ebenfalls nicht identifiziert werden, da eine Kopplung der Protonen über

Heteroatome nur sehr selten beobachtet wird.

Es gibt noch eine Vielzahl an Signalen, die aufgrund der Überlagerungen bisher noch nicht

identifiziert werden konnten. Hier wäre eine höhere Magnetfeldstärke oder ein

Kryoprobenkopf hilfreich. Beide Möglichkeiten verbessern die Auflösung der Spektren und

können dadurch die Überlagerungen entzerren. Weitere Festphasenextraktionen und HPLC-

Methoden können durch Reduzierung der Signalzahl ebenfalls die Identifizierung zusätzlicher

Substanzen erlauben.

Einfluss der Ernährung auf die Zusammensetzung des Urins

80

4. Einfluss der Ernährung auf die Zusammensetzung des Urins

4.1. Einführung

Die Zusammensetzung biologischer Flüssigkeiten unterliegt immer natürlichen

Schwankungen. So hängen auch die Konzentrationen der im Urin enthaltenen Metabolite von

verschiedenen physischen und psychischen Faktoren ab. Neben Stress, Bewegung, Hormonen

und anderen Einflüssen wirkt sich auch die Ernährung auf die Zusammensetzung des Urins

aus. Zum Beispiel ist Hippursäure ein Abbauprodukt der Benzoesäure (Kubota et al, 1991).

Diese findet, in Form des Natriumbenzoats, als Konservierungsmittel in Lebensmitteln

Verwendung. Deshalb wird die Hippursäure nach dem Verzehr konservierter Lebensmittel

vermehrt ausgeschieden. Für die klinische Diagnostik ist es wichtig, die Ursachen möglicher

Konzentrationsänderungen bestimmter Metabolite zu kennen. Werden andere, nicht

pathologische Einflüsse auf die Zusammensetzung des Urins vernachlässigt, kann es leicht zu

Fehldiagnosen kommen.

Der Einfluss diverser Nahrungsmittel auf die Zusammensetzung von Urin ist Inhalt

verschiedener Untersuchungen (Ito et al, 2005; Brevik et al, 2004). Hierbei werden in den

meisten Fällen HPLC und Massenspektrometrie zur Analyse verwendet. So wurden zum

Beispiel der Konsum von Schokolade und mögliche Auswirkungen auf die Zusammensetzung

des Urins untersucht (Rios et al, 2003). Dabei zeigte sich, dass die in der Schokolade

enthaltenen Polyphenole durch die Darmflora zu aromatischen Carbonsäuren abgebaut

werden. Nach dem Verzehr konnten erhöhte Konzentrationen von verschiedenen

Benzoesäure- und Phenylessigsäure-Derivaten im Urin detektiert werden. Andere

beschäftigten sich mit dem Einfluss von Weizenkleie auf die Konzentration bestimmter

Metabolite im Urin (Kern et al, 2003). Dabei zeigte sich, dass dem Konsum eine erhöhte

Ausscheidung der Ferulasäure (3-Methoxy-4-Hydroxy-Zimtsäure) und des Feroylglycins

folgte. Eine weitere Studie untersuchte die Effekte von grünem Tee auf den menschlichen

Metabolismus (Lee et al, 1995). Grüner Tee enthält verschiedene Catechine, die als

Glucuronat oder Sulfat in den menschlichen Organismus gelangen. Wenige Stunden nach

dem Konsum konnten konjugierte Formen von Epigallocatechin und Epicatechin im Urin

detektiert werden.

Die NMR-Spektroskopie wird hier überwiegend eingesetzt, um Stoffwechselprofile von

Probanden zu erstellen. Die Untersuchungen beschäftigen sich unter anderem mit ethnischen

Metabolitenprofilen, die durch unterschiedliche Ernährungsgewohnheiten verursacht werden.

Eine Studie verglich britische und schwedische Einwohner (Lenz et al, 2004) und konnte die

beiden Völker anhand der Zusammensetzung der Urinproben gut voneinander unterscheiden.


81

Die Abweichungen werden hauptsächlich durch unterschiedliche Ernährungsgewohnheiten

verursacht. Eine weitere Untersuchung beschäftigt sich mit dem Vergleich arktischer

Einwohner mit denen aus Rom (Zuppi et al, 1998). Auch hier verursachen die

verschiedenartigen Ernährungsgewohnheiten unterschiedliche Metabolitenprofile. Da

Bewohner der Arktis generell mehr Fisch und konservierte Lebensmittel zu sich nehmen, sind

bei ihnen erhöhte Konzentrationen von Trimethylaminoxid und Hippursäure im Urin zu

finden. Römer ernähren sich dagegen eher von kohlenhydratreichen Lebensmitteln. Dadurch

werden vermehrt Metabolite des Citrat-Cyclus ausgeschieden.

Für klinische Studien ist es hilfreich, die Variabilität von Urinproben möglichst gering zu

halten. Auf diese Weise wird ein Vergleich der Proben erleichtert. Das kann durch eine

Standard-Diät ermöglicht werden. Sofern alle Probanden einer Studie die gleiche Diät

erhalten, sind die Unterschiede in den Urinproben deutlich reduziert (Walsh et al, 2006; Lenz

et al, 2003).

4.2. Allgemeine Durchführung

Für die Untersuchungen wurden die Urinproben von zwei Probanden eingesetzt. Die erste

Probennahme erfolgte unmittelbar vor dem Verzehr der gewählten Nahrungsmittel.

Anschließend wurden vier weitere Proben nach 6, 12, 18 und 24 Stunden genommen. Die

Proben wurden lyophillisiert und der pH-Wert auf 5,75 – 5,95 eingestellt. Anschließend

wurden Protonenspektren der Urinproben aufgenommen und die Spektren auf das Signal der

Hippursäure bei 7,81ppm kalibriert.

Zur Bestimmung möglicher Konzentrationsänderungen wurden relative Veränderungen der

Integrale herangezogen. Creatinin diente hierbei als interner Standard. Die Bildung dieses

Metaboliten ist unmittelbar mit der vorhandenen Muskelmasse verknüpft. Deshalb kann die

Konzentration von Creatinin im Urin unter Normalbedingungen als konstant betrachtet

werden. Der Integralwert des Creatinins wurde auf 1000 gesetzt und so alle anderen Integrale

auf diesen Wert normiert. Es wurde ein Integral von 1000 gewählt, damit auch die

intensitätsschwachen Signale im Tieffeldbereich erfasst werden konnten.

4.3. Untersuchte Nahrungsmittel

Für die Untersuchungen wurden verschiedene Obstsorten ausgesucht, da sie relativ schnell

verdaut werden. Mögliche Änderungen in der Zusammensetzung des Urins sind auf diese

Weise schon nach kurzer Zeit zu erkennen. Nach dem Verzehr der eher schwer verdaulichen

Pekanüsse zeigen sich die Abweichungen deutlich später.


82

4.3.1. Bananen

Bananen sind serotoninhaltige Nahrungsmittel. Untersuchungen mittels HPLC und MS

zeigten, dass der Verzehr zu einer vermehrten Ausscheidung des Serotoninabbauprodukts 5-

Hydroxyindolessigsäure führt (Feldman et al, 1989). Die NMR-Spektren der Urinproben

konnten dieses Ergebnis bestätigen.

Serotonin (5-Hydroxytryptamin) ist ein Indolamin und fungiert im Organismus als

Neurotransmitter. Es ist auch in verschiedenen Nahrungsmitteln enthalten. Ein Verzehr dieser

Lebensmittel führt zu einer vermehrten Ausscheidung von 5-Hydroxyindolacetat, wobei der

Abbau enzymatisch erfolgt. Das Enzym Monoaminoxygenase baut Serotonin zu 5-

Hydroxyindolacetaldehyd ab. Dieser Aldehyd wird anschließend von dem Enzym

Aldehyddehydrogenase-2 weiter abgebaut zur 5-Hydroxyindolacetat.

NH

OH

NH2

NH

OH

O

NH

OH

O

OH

Monoaminoxygenase

Aldehyddehydrogenase

5-Hydroxyindolessigsäure

5-Hydroxyindolacetaldehyd

Serotonin

NH

OH

NH2

NH

OH

O

NH

OH

O

OH

Monoaminoxygenase

Aldehyddehydrogenase

5-Hydroxyindolessigsäure

5-Hydroxyindolacetaldehyd

Serotonin

Abbildung 49: Enzymatischer Abbaumechanismus von Serotonin über 5-Hydroxyindolacetaldehyd zur 5-Hydroxyindolessigsäure.

Der Abbau von Serotonin und die Ausscheidung des Abbauproduktes sind von Interesse, da

Neuroendokrine Tumore Serotonin produzieren und über die vermehrte Ausscheidung des

Abbauprodukts 5-Hydroxyindolessigsäure diagnostiziert werden. Wird die Konzentration der


83

5-Hydroxyindolessigsäure durch den Verzehr verschiedener Lebensmittel verändert, kann es

zu falschen Diagnosen kommen.

ppm (t1) 7.007.508.00

A

B

C

5-HIAA

ppm (t1) 7.007.508.00

A

B

C

ppm (t1) 7.007.508.00

A

B

C

5-HIAA

Abbildung 50: Protonenspektren von Urinproben. Spektrum A stellt die Probe vor dem Verzehr der Bananen dar, Spektrum B 6 Stunden bzw. Spektrum C 12 Stunden nach dem Verzehr der Früchte. Abkürzung: 5-HIAA – 5-Hydroxyindolessigsäure

In den Spektren der Urinproben zeigt schon die optische Auswertung nach 6 Stunden den

Anstieg der Signalintensität der 5-Hydroxyindolessigsäure bei 7,03ppm. Dieses Signal wurde

gewählt, weil hier keine Signalüberlagerungen vorliegen. Die Betrachtung der Integrale führte

zu dem gleichen Ergebnis. Vor dem Verzehr der Bananen lag der Integralwert bei 0,35, stieg

nach 6 Stunden auf 5,65 an und fiel nach 12 Stunden auf 0,22 zurück. Da Bananen relativ


84

leicht verdaulich sind, ist die Ausscheidung der 5-Hydroxyindolessigsäure schon nach kurzer

Zeit zu beobachten. Nach 12 Stunden ist das aufgenommene Serotonin anscheinend

vollständig abgebaut, da der Integralwert der 5-Hydroxyindolessigsäure bereits wieder

gesunken ist. Auch nach 24 Stunden ist kein Anstieg des Integrals mehr zu beobachten.

4.3.2. Pekanüsse

Pekanüsse sind ebenfalls serotoninhaltige Nahrungsmittel. Da sie nicht so leicht verdaulich

sind wie Bananen, erfolgt der Abbau des Serotonins und damit die Ausscheidung der 5-

Hydroxyindolessigsäure deutlich langsamer.

ppm (t1) 7.007.508.00

5-HIAA

A

B

C

ppm (t1) 7.007.508.00

5-HIAA

A

B

C

Abbildung 51: Protonenspektren von Urinproben. Spektrum A stellt die Probe vor dem Verzehr dar, Spektrum B nach 18, und Spektrum C nach 24 Stunden. Abkürzung: 5-HIAA – 5-Hydroxyindolessigsäure


85

In den Spektren der Urinproben steigt der Integralwert des Signals bei 7,03ppm von 2,56 auf

13,09 an. Allerdings erst nach 18 Stunden. Nach 24 Stunden ist die Intensität mit 13,96 immer

noch erhöht. Die Verdauung der Nüsse nimmt also mehr Zeit in Anspruch.

4.3.3. Orangen

Orangen gehören zu den polyphenolreichen Nahrungsmitteln. Sie enthalten vor allem große

Mengen an Hesperitin und Naringenin. Nach dem Verzehr von Orangen konnten mittels

HPLC und MS erhöhte Konzentrationen dieser Verbindungen im Urin detektiert werden (Ito

et al, 2005).

Hesperitin und Naringenin gehören zu den Flavanonen, die wiederum den Flavonoiden

zugeordnet werden. Flavonoide bestehen aus drei Kohlenstoffringen mit zwei aromatischen

(A und B) und einem Sauerstoff-heterocyclischen Ring (C). Anhand struktureller

Unterschiede am C-Ring werden die Flavonoide in verschiedene Gruppen (z. B. Flavanone)

eingeteilt.

O

OH

O

OH

OH

OH

O

OH

OOH

OH

A C C

BB

A

Hesperitin Naringenin

O

OH

O

OH

OH

OH

O

OH

OOH

OH

A C C

BB

A

O

OH

O

OH

OH

OH

O

OH

OOH

OHO

OH

O

OH

OH

OH

O

OH

OOH

OH

A C C

BB

A

Hesperitin Naringenin

Abbildung 52: Strukturen der Flavanone Hesperitin und Naringenin. Die Kohlenstoffringe sind mit den Buchstaben A, B und C beschriftet.

Aufgrund der drei Kohlenstoffringe besitzen Flavanone, wie alle Flavonoide, eine relativ

unpolare Struktur. Deshalb werden sie nur in sehr geringen Mengen mit dem Urin

ausgeschieden. Auch nach dem Verzehr von Orangen liegen die Konzentrationen von

Hesperitin und Naringenin im Urin unterhalb der Nachweisgrenze für die NMR-

Spektroskopie. Daher konnten sie auch in den hier vermessenen Proben nicht identifiziert

werden.

Ein Teil der aufgenommenen Flavonone wird durch die Darmflora abgebaut. Dabei wird der

C-Ring im Flavonoidgerüst gespalten (Rechner et al, 2004). Anschließend werden die


86

entstehenden Produkte unter Bildung verschiedener Benzoe- und Phenylcarbonsäuren weiter

metabolisiert (Rechner et al, 2002).

O

R

R

O

OH

OH

OHOH

OH

R

R

HOOC

+

Benzoe- und Phenylcarbonsäuren

O

R

R

O

OH

OH

O

R

R

O

OH

OH

OHOH

OH

R

R

HOOC

+

Benzoe- und Phenylcarbonsäuren

Abbildung 53: Postulierter Abbaumechanismus von Naringenin und anderen Flavanonen nach Rechner et al, 2004

Die Konzentrationen der meisten Abbauprodukte von den Flavanonen im Urin liegen auch

nach dem Verzehr von Orangen unterhalb der Nachweisgrenze. So können zum Beispiel

weder 3-(4-Hydroxyphenyl)-Propionsäure noch 3-Phenylpropionsäure in den Urinproben

detektiert werden. Beide Substanzen sind laut Rechner et al, 2004 Abbauprodukte des

Naringenins. Lediglich 4-Hydroxybenzoesäure und 4-Hydroxybenzamid zeigen erhöhte

Integrale, die auf eine vermehrte Ausscheidung schließen lassen.


87

ppm (t1) 7.007.508.00

A

B

C

4-OH-BA 4-OH-BS

ppm (t1) 7.007.508.00

A

B

C

ppm (t1) 7.007.508.00

A

B

C

4-OH-BA 4-OH-BS

Abbildung 54: Protonenspektren von Urinproben. Spektrum A stellt die Probe vor dem Verzehr der Orangen dar, Spektrum B 6 Stunden bzw. Spektrum C 12 Stunden nach dem Verzehr der Früchte. Abkürzungen: 4-OH-BS - 4-Hydroxybenzoesäure, 4-OH-BA – 4-Hydroxybenzamid.

In den Globalspektren ist keine Änderung der Signalintensitäten unmittelbar zu erkennen.

Deshalb wurden für die Auswertung die Signale bei 7,73ppm für 4-Hydroxybenzamid und

6,90ppm für 4-Hydroxybenzoesäure gewählt, da sie nicht überlagert werden. Deren Integrale

stiegen nach 6 Stunden von 3,41 auf 11,08 für 4-Hydroxybenzamid und von 6,61 auf 13,20

für 4-Hyroxybenzoesäure. Nach 12 Stunden sind die Integralwerte wieder auf 1,27 bzw. 5,29

zurückgegangen.

4-Hydroxybenzoesäure gehört zu den Abbauprodukten der Flavanone. Die vermehrte

Ausscheidung lässt sich anhand der angestiegenen Integralwerte belegen. Die Konzentration


88

im Urin ist allerdings nur wenig erhöht. Eventuell liegen die Konzentrationen der anderen

Abbauprodukte deshalb weiterhin unterhalb der Nachweisgrenze.

Die vermehrte Ausscheidung des 4-Hydroxybenzamids kann nicht durch die Metabolisierung

der Flavanone erklärt werden. Möglicherweise ist diese Substanz selber ein Bestandteil von

Orangen oder ein Abbauprodukt einer anderen Verbindung. Der Konzentrationsanstieg findet

parallel zu dem der 4-Hydroxybenzoesäure statt, was vermuten lässt, dass die beiden

Verbindungen den gleichen Ursprung haben.

4.4. Zusammenfassung

Die Messungen zeigen, dass der Einfluss von Nahrungsmitteln auf die Zusammensetzung des

Urins auch mit Hilfe der NMR aufgezeigt werden kann. Die Konzentrationsänderungen

aromatischer Substanzen sind jedoch relativ gering und nur über die Integralwerte

nachzuweisen. Verschiedene Substanzen sind gar nicht detektierbar, da ihre Konzentrationen

unterhalb der Nachweisgrenze liegen.

Die Einflüsse der Nahrung auf die Zusammensetzung des Urins sind deutlich zu erkennen.

Deshalb müssen sie bei klinischen Studien bedacht werden. Eine Standardisierung der

Ernährung bei den Probanden ist hier hilfreich. Auf diese Weise kann die Variabilität der

Urinproben reduziert und die Auswertung der Messungen erleichtert werden. Die Diagnose

von Stoffwechselstörungen wird durch den Einfluss der Ernährung ebenfalls erschwert. Auch

hier kann, je nach Fragestellung, eine Diät vor der Probennahme helfen.

Anhang

89

5. Anhang

5.1. Lagerung und Vorbereitung der Urinproben

Alle für diese Arbeit verwendeten Urinproben wurden bis zur Aufarbeitung bei -80°C

gelagert. Nach dem Auftauen wurde jeweils ein Aliquot von 10ml entnommen und

lyophillisiert. Eventuell vorhandene, unlösliche Bestandteile wurden vorher durch

zentrifugieren der Proben (3000U/min, 20°C, 5min) entfernt. Anschließend wurde die

getrocknete Probe in 1ml D2O aufgenommen und mit 80µl eines 1,5M KH2PO4 / K2HPO4-

Puffers (7:1) in D2O versetzt. Nachdem der pH-Wert der Proben mit DCl bzw. NaOD auf

5,85-5,95 eingestellt wurde, konnten die Proben gemessen werden.

5.2. Durchführung der Messungen

Die NMR-Spektroskopische Messung der Urinproben erfolgte mit der zgpr-Pulssequenz

(Bruker, 600MHz AVANCE-Gerät). Einer eindimensionalen Methode mit Vorsättigung des

Wassersignals. Die Parameter der Messungen blieben nahezu konstant. Lediglich der Offset

des Wassersignals und der 90°-Puls wurden für jede Probe optimiert.

O1: Frequenz des Wassersignals

AQ: 1,827s

D1: 3s

DE: 6µs

DS: 8

NS: 64

TD: 32k

TE: 300K

p1: 90°

pl9: 65dB

RG: 256

SWH: 10964,912Hz

Die zweidimensionalen Messungen erfolgten mit entsprechenden Pulssequenzen von Bruker.

Auch hier wurde der 90°-Puls für Protonen optimiert. Für 13C wurde ein Geräte-spezifischer

Wert übernommen.

Anhang

90

5.3. NMR-Parameter von Urin-Metaboliten (pH 5,85)

Symmetrische Gruppen mit gleichen Signalen sind nur einmal nummeriert. Substanz Struktur 1H

(ppm) 13C (ppm)

1-Methylhistidin H1 8,52

H2 7,29 H3 3,33 H4 4,04 H5 3,85

C1 136,68 C2 118,73 C3 27,31 C4 54,97 C5 34,67

2-Aminoisobuttersäure H1 1,48 C1 25,48

2-Hydroxyisobuttersäure H1 1,37 C1 27,96

2-Ketoglutarsäure H1 2,48

H2 3,02 C1 31,28 C2 36,31

3-Amino-2-Methylpropionsäure

H1a 3,03 H1b 3,10 H2 2,61 H3 1,19

C1 43,58

C2 40,28 C3 16,41

3-Hydroxy-2-Methylpropionsäure

H1a 3,69 H1b 3,53 H2 2,49 H3 1,06

C1 65,81

C2 33,41 C3 14,77

3-Hydroxyisovaleriansäure H1 2,39

H2 1,32 C1 50,14 C2 27,65

3-Methylhistidin H1 8,64

H2 7,42 H3a 3,32 H3b 3,36 H4 4,03 H5 3,85

C1 137,03 C2 119,97 C3 25,67

C4 54,05 C5 34,35

1

N

N2

CH35

3

4

NH2

OH

O

OH2

1 OH

O

O

O

NH2

1

2 OH

CH33

O

OH1

2 OH

CH33

O

1

N

N2

CH35

3

4

NH2

OH

O

OH 1

O CH32

OH

CH3

OH

OCH31

NH2

CH3

OH

OCH31

OHCH3

Anhang

91

4-Hydroxybenzamid H1 7,73

H2 6,95 C1 130,24 C2 116,22

4-Hydroxybenzoesäure H1 7,81

H2 6,90 C1 130,40 C2 116,53

4-Hydroxyphenylessigsäure H1 7,14

H2 6,84 H3 3,46

C1 131,58 C2 116,51 C3 44,26

4-Kresol H1 7,16

H2 6,99 H3 2,26

C1 120,93 C2 116,68 C3 20,91

4-Pyridon-3-Carboxamid-1-β-D-Ribonukleosid

H1 8,76 H2 8,04 H3 6,72 H4 5,64 H5 4,32 H6 4,26 H7 4,22 H8a 3,88 H8b 3,79

C1 143,71 C2 139,65 C3 121,53 C4 98,09 C5 74,82 C6 70,61 C7 86,38 C8 62,17

5-Hydroxyindolacetat H1 7,18

H2 7,23 H3 7,03 H4 6,95 H5 3,67

C1 126,26 C2 113,37 C3 112,06 C4 119,12 C5 34,69

6-Aminonicotinamid H1 8,53

H2 6,67 H3 7,80

C1 147,62 C2 102,84 C3 144,41

Acetat H1 1,91 C1 25,28

1

2

OH

NH2

O

1

2

OH

OH

O

1

2

OH

3 OH

O

1

2

OH

CH33

1

N

3

2

O

NH2

O

4

5

O

6

7

8OH

OHOH

3

1

4

2

NH

5

O

OHOH

1

3

N

2

NH2

NH2

O

CH31

OH

O

Anhang

92

Acetoacetat H1 3,44

H2 2,27 C1 53,36 C2 30,58

Aceton H1 2,24 C1 30,69

Adenosin H1 8,30

H2 8,24 H3 6,04 H4 4,76 H5 4,44 H6 4,27 H7a 3,90 H7b 3,86

C1 141,52 C2 153,55 C3 89,47 C4 74,82 C5 71,44 C6 86,92 C7 62,38

Adipinsäure H1 2,22

H2 1,53 C1 40,52 C2 29,17

Alanin H1 1,47

H2 3,77 C1 17,41 C2 51,69

Allantoin H1 5,38 C1 64,20

Ameisensäure H1 8,45 C1 172,42

Arabinitol H1a 3,84 H1b 3,65 H2 3,75 H3 3,57 H4 3,93 H5a 3,68 H5b 3,66

C1 64,18

C2 72,37 C3 71,92 C4 71,65 C5 64,42

CH32

1 OH

OO

CH31

CH3

O

N

N

2N

1

N

NH2

3

4

O

5

6

7OH

OHOH

OH 1

2 OH

O

O

O

1

NH2

CH32 OH

NH

NH

1

O

O

NH O

NH2

H1

OH

O

OH5

4

3

2

1

OH

OH

OH

OH

Anhang

93

Arginin H1 3,78

H2 1,90 H3 1,63 H4 3,21

C1 55,31 C2 30,92 C3 23,81 C4 41,63

Asparagin H1 4,04

H2a 2,99 H2b 2,91

C1 52,50 C2 36,38

Betain H1 3,78

H2 3,25 C1 68,37 C2 54,89

Brenztraubensäure H1 2,28 C1 28,66

Carbamoylaspartat H1 4,22

H2a 2,80 H2b 2,63

C1 57,95 C2 41,34

Carnitin H1 4,56

H2 3,44 H3 3,20 H4 2,45

C1 65,14 C2 70,61 C3 54,98 C4 43,89

Carnosin H1 8,58 H2 7,26 H3a 3,24 H3b 3,08 H4 4,49 H5 2,71 H6 3,24

C1 134,39 C2 117,84 C3 28,21

C4 54,39 C5 23,81 C6 36,85

Chinolinsäure H1 8,62 H2 7,62 H3 8,02

C1 150,01 C2 125,96 C3 139,54

NH

O

NH 1

NH2

NH2

4 2

3 OH

2

1

O

O

NH2

NH2

OH

OH 1N

+

CH3

O CH32

CH3

CH31

O

O

OH

OH

2 NH

NH2

O

1

OO

OH

CH33

N+

2

1

4 OH

OOHCH3CH3

1

N

NH

2

3

4NH

O OH

5

O

6NH2

3

N

2

1

OH

O

O

OH

Anhang

94

Cholin H1 4,07

H2 3,51 H3 3,16

C1 56,23 C2 68,58 C3 54,98

Cis-Aconitsäure H1 6,04

H2 3,21 C1 129,41 C2 44,99

Citronensäure H1a 2,73

H1b 2,58 C1 45,89

Creatin H1 3,91

H2 3,01 C1 54,83 C2 37,96

Creatinin H1 4,10

H2 3,06 C1 56,55 C2 31,67

Cystin H1 4,13

H2a 3,39 H2b 3,21

C1 54,36 C2 38,74

Cytidin H1 7,86 H2 6,04 H3 5,89 H4 4,33 H5 4,19 H6 4,13 H7a 3,96 H7b 3,84

C1 142,93 C2 97,47 C3 92,16 C4 76,54 C5 70,14 C6 84,19 C7 61,57

Cytosin H1 7,52

H2 5,98 C1 144,59 C2 97,47

OH

1

2N

+

CH3

CH3

CH33

OH 2 1 OH

O OOHO

OH 1N NH2

O

NH

CH32

OH 1 OH

O OOH

OH O

1

N

NO

NH2

CH32

OH

O

NH2 S S

2 1

NH2

OH

O

N

N

2

1

NH2

O

3

4

O

5

6

7OH

OHOH

N

NH

2

1

NH2

O

Anhang

95

Dihydrouracil H1 3,45

H2 2,65 C1 42,81 C2 38,89

Dimethylamin H1 2,71 C1 30,78

Erythrol H1a 3,78

H1b 3,61 H2 3,67

C1 63,74

C2 73,17

Erythronsäure-1,4-Lacton H1a 4,56 H1b 4,28 H2 4,48 H3 4,31

C1 71,24

C2 67,80 C3 71,06

Ethanolamin H1 3,14

H2 3,82 C1 42,66 C2 58,91

α-Fructose H1 3,66 H2 4,12 H3 3,98 H4 4,02 H5a 3,84 H5b 3,72

C1 63,10 C2 84,26 C3 76,94 C4 84,34 C5 62,76

β-Fructose H1 3,57 H2 4,11 H3 4,09 H4 3,86 H5a 3,77 H5b 3,64

C1 63,61 C2 76,07 C3 75,61 C4 82,16 C5 63,39

Fucitol H1a 3,68 H1b 3,66 H2 3,96 H3 3,64 H4 3,47 H5 4,09 H6 1,24

C1 64,36

C2 71,74 C3 71,19 C4 74,44 C5 67,16 C6 19,93

2

1

NH

NH

O

O

NHCH3 CH3

1

OH

2

OH 1OH

OH

O

3

1

2

O

OH OH

NH2

1

2OH

5 O

23

4

OH

OHHH

OH

H

OH H

1

HOH

5 O

23

4

1

OHHH

OH

H

OH H

OH

H

OH

OH1

2

3

4

5

CH36

OH

OH

OH

OH

Anhang

96

α-Fucose H1 5,21 H2 3,78 H3 3,88 H4 3,82 H5 4,22 H6 1,22

C1 93,37 C2 69,63 C3 71,03 C4 71,08 C5 68,89 C6 16,48

β-Fucose H1 4,54 H2 3,65 H3 3,46 H4 3,76 H5 3,83 H6 1,26

C1 97,93 C2 72,25 C3 68,46 C4 70,74 C5 73,95 C6 16,62

Fumarsäure H1 6,71 C1 137,77

Galactitol H1 3,71

H2 3,99 H3 3,69

C1 64,45 C2 71,47 C3 70,69

α-Galactose H1 5,27

H2 3,78 H3 3,91 H4 3,91 H5 4,09 H6 3,73

C1 93,35 C2 69,48 C3 70,41 C4 70,63 C5 71,64 C6 62,22

β-Galactose H1 4,58

H2 3,47 H3 3,65 H4 3,93 H5 3,69 H6 3,76

C1 97,81 C2 72,87 C3 73,72 C4 69,95 C5 75,88 C6 61,94

Gluconsäure H1 3,76 H2 3,79 H3 4,02 H4 4,11 H5a 3,81 H5b 3,63

C1 74,86 C2 73,69 C3 73,52 C4 76,62 C5 65,34

5 O

1

23

4

OH

HH

OH

H

OH

H OH

H

CH36

5 O

1

23

4

H

HH

OH

H

OH

H OH

OH

CH36

OH

O

1 OH

O

5 O

1

23

4

OH

HH

OH

H

OH

H OH

H

6OH

OH

OH

3 2

OH

1

OH

OH

OH

5 O

1

23

4

H

HH

OH

H

OH

H OH

OH

6OH

OH5

4

3

2

1 OH

O

OH

OH

OH

OH

Anhang

97

α-Glucose H1 5,24 H2 3,54 H3 3,72 H4 3,42 H5 3,86 H6a 3,77 H6b 3,84

C1 93,26 C2 72,72 C3 73,88 C4 70,81 C5 72,89 C6 61,77

β-Glucose H1 4,65

H2 3,27 H3 3,49 H4 3,40 H5 3,48 H6a 3,90 H6b 3,73

C1 97,11 C2 75,31 C3 76,79 C4 70,82 C5 70,74 C6 61,86

α-Glucuronsäure H1 5,26

H2 3,55 H3 3,71 H4 3,49 H5 4,06

C1 93,31 C2 74,34 C3 73,89 C4 73,07 C5 75,23

β-Glucuronsäure H1 4,66

H2 3,27 H3 3,51 H4 3,49 H5 3,71

C1 97,09 C2 75,31 C3 73,27 C4 76,79 C5 77,39

Glutamin H1 3,79

H2 2,14 H3 2,45

C1 55,24 C2 27,41 C3 32,08

Glutarsäure H1 2,21

H2 1,82 C1 31,94 C2 26,48

Glycerinsäure H1 4,32

H2 3,86 C1 72,03 C2 64,32

Glycin H1 3,57 C1 42,76

5 O

1

23

4

OH

HH

H

OH

OH

H OH

H

6OH

1

2

O

3

5

4

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH2

1 OH

O O

2

OH

O OH

1 OH

NH21OH

O

5 O

1

23

4

H

HH

H

OH

OH

H OH

OH

6OH

1

2

O

3

5

4

OH

OH

OH

OH

O

OH

NH2 3

2

1 OH

O O

NH2

Anhang

98

Glycolsäure H1 3,97 C1 62,37

Guanidinoacetat H1 3,78 C1 45,79

Guanosine H1 7,96

H2 5,87 H3 4,72 H4 4,40 H5 4,22 H6a 3,87 H6b 3,82

C1 139,02 C2 88,57 C3 73,26 C4 71,54 C5 86,38 C6 62,01

Hippursäure H1 7,61

H2 7,52 H3 7,81 H4 3,96

C1 133,45 C2 129,95 C3 128,29 C4 44,92

Histidin H1 8,60

H2 7,37 H3a 3,38 H3b 3,35 H4 4,06

C1 135,33 C2 118,89 C3 25,67

C4 54,96

Homovanillinsäure H1 6,89 H2 6,85 H3 6,73 H4 3,47 H5 3,84

C1 114,48 C2 115,89 C3 122,10 C4 45,02 C5 56,86

Imidazolessigsäure H1 8,53

H2 7,21 H3 3,63

C1 136,48 C2 121,75 C3 34,11

OH 1OH

O

NH2 NH

1 OH

O

NH

N

NH

N

1

N

NH2

O

2

3

O

4

5

6OH

OHOH

3

2

1

NHO4 OH

O

O

4

3

NH2

NH

1

N2

OH

3

1

2OH

OCH35

4 O

OH

1

N

NH

2

3 O

OH

Anhang

99

Indolessigsäure H1 7,67

H2 7,14 H3 7,22 H4 7,49 H5 7,22 H6 3,67

C1 119,58 C2 120,55 C3 123,56 C4 113,06 C5 124,89 C6 34,52

Indoxylsulfat H1 7,64

H2 7,15 H3 7,23 H4 7,46 H5 7,35

C1 118,41 C2 120,95 C3 123,63 C4 113,31 C5 124,22

Isoleucin H1 3,60

H2 1,90 H3 1,43 H4 1,00 H5 0.93

C1 60,27 C2 37,04 C3 25,76 C4 15,88 C5 12,35

α-Laktose H1 5,23 H2 3,94 H3 3,55 H4 3,65 H5 3,83 H6 3,96 H7 4,45 H8 3,55 H9 3,68 H10 3,94 H11 3,74 H12 3,78

C1 93,10 C2 69,67 C3 72,64 C4 79,67 C5 72,64 C6 61,23 C7 194,03 C8 72,65 C9 73,57 C10 69,67 C11 77,01 C12 62,63

β-Laktose H1 4,67 H2 3,27 H3 3,65 H4 3,65 H5 3,61 H6a 3,87 H6b 3,82 H7 4,45 H8 3,55 H9 3,68 H10 3,94 H11 3,74 H12 3,78

C1 96,54 C2 75,29 C3 75,74 C4 79,67 C5 75,61 C6 61,07

C7 194,03 C8 72,65 C9 73,57 C10 69,67 C11 77,01 C12 62,63

1

2

3

45

NH

6

OH

O

1

2

3

45

NH

O

S OH

O

O

1

O

NH2

2

3

CH34

CH35 OH

5 O

1

23

4

OH

HH

H

O

OH

H OH

H

6OH

11 O

7

89

10

H

HH

OH

H

OH

H OH

12OH

5 O

1

23

4

H

HH

H

O

OH

H OH

OH

6OH

11 O

7

89

10

H

HH

OH

H

OH

H OH

12OH

Anhang

100

Leucin H1 3,73

H2 1,71 H3 1,67 H4 0,95 H5 0,93

C1 61,72 C2 41,22 C3 26,05 C4 23,26 C5 22,18

Maleinsäure H1 6,01 C1 130,21

Malonsäure H1 3,09 C1 47,07

Mannitol H1a 3,86

H1b 3,67 H2 3,75 H3 3,79

C1 64,25

C2 71,63 C3 70,35

Methylamin H1 2,61 C1 25,93

Methylmalonsäure H1 3,18

H2 1,26 C1 52,79 C2 15,78

Milchsäure H1 4,15

H2 1,34 C1 69,63 C2 21,63

Myo-Inositol H1 4,08

H2 3,62 H3 3,54 H4 3,29

C1 73,02 C2 71,96 C3 73,01 C4 75,12

N, N-Dimethylglycin H1 3,72

H2 2,91 C1 61,05 C2 44,76

1

O

2

NH2

3CH35

CH34

OH

1

OH

O

OH

O

CH31 CH3

O O

OH 3

2

1OH

OH

OH

OH

OH

CH31

NH2

OH 1 OH

OO

CH32

CH32

1

OH

O

OH

1

2

3

4

OH

OH

OHOH

OH

OH

N1CH3 O

OHCH32

Anhang

101

N-Acetylneuraminsäure H1a 2,24 H1b 1,84 H2 4,06 H3 3,98 H4 4,03 H5 3,55 H6 3,81 H7a 3,87 H7b 3,65 H8 2,04

C1 40,53

C2 68,30 C3 52,45 C4 70,74 C5 69,38 C6 70,35 C7 63,71

C8 23,52

N-Methyl-2-Pyridon-5-Carboxamid

H1 8,26 H2 7,92 H3 6,62 H4 3,61

C1 143,56 C2 140,39 C3 119,24 C4 39,44

N-Methylnikotinamid H1 9,26

H2 8,95 H3 8,16 H4 8,86 H5 4,46

C1 146,02 C2 148,15 C3 129,31 C4 144,49 C5 49,47

N-Methylnikotinsäure H1 9,09

H2 8,83 H3 8,05 H4 8,78 H5 4,41

C1 146,83 C2 145,85 C3 128,85 C4 146,93 C5 49,46

Oxalacetat H1 2,38 C1 50,27

Pantothensäure H1 2,45

H2 3,43 H3 3,98 H4a 3,49 H4b 3,36 H5 0,90 H6 0,87

C1 37,49 C2 37,17 C3 76,85 C4 69,51

C5 21,71 C6 20,15

4

3

O

2

1

OH

OH

O

OH

NH

CH38

O

5

6

OH

OH

7

OH

1

2

N

3

CH34

O

O

NH2

3

4

2

N+

1

CH35

NH2

O

3

4

2

N+

1

CH35

OH

O

OH1 O

OHO

O

OH4 3 NH

2

1 OH

CH36

CH35

OH

O O

Anhang

102

Phenylalanin H1 7,33

H2 7,39 H3 7,30 H4a 3,24 H4b 3,15 H5 3,95

C1 128,36 C2 130,35 C3 130,04 C4 36,89

C5 57,11

Phenylessigsäure H1 7,32

H2 7,39 H3 7,31 H4 3,64

C1 128,36 C2 130,35 C3 130,41 C4 43,11

Phosphocreatin H1 3,91

H2 2,93 C1 54,78 C2 38,11

Phosphoethanolamin H1 3,25

H2 3,99 C1 41,55 C2 61,39

Pseudouridin H1 7,64

H2 4,68 H3 4,24 H4 4,14 H5 4,00 H6a 3,83 H6b 3,71

C1 142,36 C2 79,97 C3 74,67 C4 72,02 C5 84,35 C6 62,72

Pyroglutamat H1 4,16

H2 2,38 H3a 2,49 H3b 2,02

C1 59,46 C2 30,93 C3 26,50

Ribitol H1a 3,80

H1b 3,66 H2 3,82 H3 3,69

C1 63,57

C2 73,28 C3 73,24

5

O

4

NH2

3

2

1

OH

43

2

1

OH

O

OH 1N NH

P

O CH32

NH

O

OHOH

NH2

2

1O

POH

O

OH

NH

1

NH

O

O

2

3

O

4

5

6OH

OHOH

32

1

NH

O

OH

O

OH1

2

3OH

OH

OH

OH

Anhang

103

Saccharose H1 3,81

H2 3,87 H3 4,04 H4 4,20 H5 3,66 H6 5,39 H7 3,54 H8 3,74 H9 3,47 H10 3,83 H11 3,82

C1 63,58 C2 82,32 C3 75,14 C4 77,79 C5 62,17 C6 93,26 C7 72,17 C8 73,73 C9 70,45 C10 73,42 C11 61,23

Serin H1 3,87

H2a 3,99 H2b 3,95

C1 57,47 C2 61,42

Sorbitol H1a 3,73

H1b 3,62 H2 3,85 H3 3,85 H4 3,65 H5 3,77 H6a 3,83 H6b 3,65

C1 63,71

C2 74,06 C3 70,78 C4 72,83 C5 72,39 C6 64,21

Suberinsäure H1 2,21

H2 1,54 H3 1,29

C1 37,47 C2 26,34 C3 29,29

Taurin H1 3,43

H2 3,82 C1 37,21 C2 48,72

Threitol H1a 3,69

H1b 3,62 H2 3,72

C1 63,87

C2 72,96

Threonin H1 3,63

H2 4,29 H3 1,33

C1 61,41 C2 67,12 C3 20,61

4 3

2O H

1

H

OH

OH

H

5

O

OH

OH10 O

6

78

9

H

HH

H

OH

OH

H OH

11OH

1

O

NH2

2

OH OH

OH

6

5

4

3

2

1OH

OH

OH

OH

OH

OH3

2

1 OH

O

O

NH2

1

2S

O

OOH

OH2

1OH

OH

OH

1

O

2

NH2

OH

CH33

OH

Anhang

104

Threonsäure H1a 3,69

H1b 3,62 H2 4,07 H3 3,98

C1 63,58

C2 72,95 C3 73,87

Thymin H1 7,31

H2 1,82 C1 139,79 C2 12,60

Trans-Aconitsäure H1 6,67

H2 3,51 C1 132,62 C2 37,95

Trimethylamin H1 2,87 C1 45,92

Trimethylammoniumoxid H1 3,40 C1 59,77

Tryptophan H1 7,69

H2 7,19 H3 7,27 H4 7,52 H5 7,32 H6a 3,43 H6b 3,30 H7 4,04

C1 119,65 C2 119,65 C3 123,72 C4 113,09 C5 126,06 C6 27,49

C7 56,08

Tyrosin H1 7,16

H2 6,87 H3a 3,16 H3b 3,07 H4 3,95

C1 131,86 C2 116,93 C3 36,63

C4 57,20

Uracil H1 5,78

H2 7,52 C1 102,11 C2 144,62

OH1

2

3 OH

O

OH

OH

1

NH

NH

O

O

CH32

OH 2 1

O

OH O

OHO

N CH3

CH3

CH31

N+

CH3

CH3

CH31

O-

O

7

6

NH25

NH

1

4

3

2 OH

O

4

3

NH21

2OH

OH

2

1

NH

NH

O

O

Anhang

105

Ureidopropionsäure H1 3,29

H2 2,40 C1 41,23 C2 41,86

Uridin H1 5,96

H2 7,83 H3 5,91 H4 4,34 H5 4,21 H6 4,13 H7a 3,94 H7b 3,83

C1 102,94 C2 145,43 C3 92,32 C4 74,67 C5 70,29 C6 85,45 C7 61,77

Valin H1 3,62

H2 2,26 H3 1,03 H4 0,98

C1 62,72 C2 30,36 C3 19,20 C4 17,91

Vanillinsäure H1 7,41

H2 7,34 H3 6,94 H4 3,89

C1 112,31 C2 122,05 C3 116,56 C4 57,06

Xanthin H1 7,73 C1 142,31

Xylitol H1a 3,72

H1b 3,64 H2 3,80 H3 3,64 H4 3,80 H5a 3,72 H5b 3,64

C1 63,86

C2 73,13 C3 71,96 C4 73,13 C5 63,86

α-Xylose H1 5,20

H2 3,53 H3 3,64 H4 3,65 H5 3,68

C1 93,39 C2 74,39 C3 75,52 C4 72,24 C5 63,57

OH 2

1

NH NH2

OO

2

1

N

NH

O

O

3

4

O

5

6

7OH

OHOH

1

O

NH2

2

CH33

CH34

OH

2

1

3OH

OCH34

OH

O

NH

NH

NH

1

N

O

O

OH5

4

3

2

1

OH

OH

OH

OH

5 O

1

23

4

OH

HH

H

OH

OH

H OH

H

H

Anhang

106

β-Xylose H1 4,56

H2 3,24 H3 3,42 H4 3,60 H5a 3,93 H5b 3,31

C1 97,37 C2 75,26 C3 77,01 C4 72,44 C5 66,36

5 O

1

23

4

H

HH

H

OH

OH

H OH

OH

H

Abkürzungen

107

6. Abkürzungen

γ gyromagnetische Konstante SPE Festphasenextraktion

δ chemische Verschiebung RNA Ribonukleinsäure

µ magnetischer Moment THF Tetrahydrofuran

π π-Elektronen TMS Tetramethylsilan

ωL Lamor-Frequenz TOCSY total correlation spectrosc.

B0 Magnetfeld UV Ultraviolett

CoA Coenzym A v/v Volumenprozent

COSY correlation spectroscopy VIS Visible

CPMG Carr-Pucell-Meiboom-Gill

Experiment

DEPT Distortionless Enhancement by

Polarisation Transfer

DNA Desoxyribonukleinsäure

FID freier Induktionsabfall (free

induction decay)

HMBC Heteronuclear Multiple Bond

Correlation

HPLC Hochdruckflüssigchromatographie

HSQC Heteronuclear Single Quantum

Coherence

Hz Hertz

I Drehimpuls

J Kopplungskonstante

LLE Flüssig-Flüssig-Extraktion

MHz Megahertz

MRT Magnetresonanztomographie

nm Nanometer

NMR Kernmagnetische Resonanz

NOESY nuclear Overhauser enhancement

Spectroscopy

NP Normale Phase

ppm parts per million

RP Umkehrphase (reversed phase)

Literatur

108

7. Literatur

Amberg, A.; Rosner, E.; Dekant, W. Biotransformation and kinetics of excretion of ethyl

tert-butyl ether in rats and human. Toxicol. Sci. (2000); 53: 194-201

Angyal, S. J.; Le Fur, R.The 13C-NMR spectra of alditols. Carbohydrate research (1980);

84: 201-209

Angyal, S. J.; Wheen, R. G.The Composition of reducing sugars in aqueos solution:

Glyceraldehyde, Erythrose, Threose. Aust. J. Chem. (1980); 33: 1001-1011

Bain, M. A.; Fornasine, G.; Evans, A. M. Trimethylamine: Metabolic, pharmacokinetic and

safety aspects. Curr. Drug Metab. (2005); 6: 227-240

Balato, N.; Cusano, F.; Lembo, G.; Santoianni, P. Tyrosinemia type II in two cases

previously reported as Richner-Hanhart syndrome. Dermatologica (1986); 173: 66-74

Bales, J. R.; Higham, D. P.; Howe, I.; Nicholson, J. K.; Sadler, P. J. Use of high-

resolution proton nuclear magnetic resonance spectroscopy for rapid multi-component

analysis of urine. Clin. Chem. (1984); 30: 426-432

Bao, Y.; Silva, T. M. J.; Guerrant, R. L.; Lima, A. A. M.; Fox, J. W. Direct analysis of

mannitol, lactulose and glucose in urine samples by high performance anion-exchange

chromatography with pulse amperometric detection. Clinical evaluation of intestinal

permeability in human immunodeficiency virus infection. J. Chromatogr. B (1996);

685: 105-112

Baumgartner, M. R.; Almashanu, S. Suormala, T.; Obie, C.; Cole, R. N.; Packman, S.;

Baumgartner, E. R.; Valle, D. The molecular basis of human 3-methylcrotonyl-CoA

carboxylase deficiency. J. Clin. Invest. (2001); 107: 495-504

Binzak, B. A.; Wevers, R. A.; Moolenaar, S. H.; Lee, Y. M.; Hwu, W. L.; Poggi-Bach, J.;

Engelke, U. F.; Hoard, H. M.; Vockley, J. G.; Vockley, J. Clonig of

dimethylglycine dehydrogenase and a new human inborn error of metabolism,

dimethylglycine dehydrogenase deficiency. Am. J. Hum. Genet. (2001); 68: 839-847

Literatur

109

Bjorke Monsen, A. L.; Ueland, P. M. Homocysteine and methylmalonic acid in diagnosis

and risk assessment from infancy to adolescence. Am. J. Clin. Nutr. (2003); 78: 7-21

Botitsi, E.; Frosyni, C.; Tsipi, D. Determination of pharmaceuticals from different

therapeutic classes in wastewaters by liquid chromatography-electrospray ionization-

tandem mass spectrometry. Anal. Bioanal. Chem. (2007); 387: 1317-1327

Brand, H. S.; Jörning, G. G. A.; Chamuleau, R. A. F. M.; Abraham-Inpijn, L. Effect of a

protein-rich meal on urinary and salivary free amino acid concentrations in human

subjects. Clin. Chim. Acta (1997); 264: 37-47

Brevik, A.; Rasmussen, S. E.; Drevon, C. A.; Andersen, L. F. Urinary excretion of

flavonoids reflects even small changes in the dietary intake of fruits and vegetables.

Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. (2004); 13: 843-849

Bröer, S.; Cavanaugh, J. A.; Rasko, J. E. Neutral amino acid transport in epithelial cells

and its malfunction in Hartnup disorders. Biochem. Soc. Trans. (2005); 33: 233-236

Brusati, V.; Jozwik, M.; Jozwik, M.; Teng, C.; Paolini, C.; Marconi, A. M.; Battaglia, F.

C. Fetal and maternal non-glucose carbohydrates and polyols concentrations in normal

human pregnancies at term. Pediatr. Res. (2005); 58: 700-704

Carter, E. G. A. Quantitation of urinary niacin metabolites by reversed-phase liquid

chromatography. Am. J. Clin. Nutr. (1982); 36: 926-930

Chuang, D. T.; Chuang, J. L.; Wynn, R. M. Lessons from genetic disorders of branched-

chain amino acid metabolism. J. Nutr. (2006); 136: 243S-249S

Coen, M.; O´Sullivan, M.; Bubb, W. A.; Kuchel, P. W.; Sorrel, T. Proton nuclear

magnetic resonance-based metabonomics for rapid diagnosis of meningitis and

ventriculitis. Clin. Infect. Dis. (2005); 41: 1582-1590

Literatur

110

Cohen, M.; Hartlage, P. L.; Krawiecki, N.; Roesel, R. A.; Carter, A. L.; Hommes, F. A.

Serum carnosinase deficiency: A non-disabling phenotype. J. Ment. Defic. Res.

(1985); 29: 383-389

Creer, M. H.; Lau, B. W.; Jones, J. D.; Chan, K. M. Pyroglutamic academia in an adult

patient. Clin. Chem. (1989); 35: 684-686

Danpure, C. J. Molecular etiology of primary hyperoxaluria type I: new directions for

treatment. Am. J. Nephrol. (2005); 25: 303-310

Deschauer, M.; Gizatullina, Z.; Schulze, A.; Pritsch, M.; Knoppel, C.; Knape, M.; Zierz,

S.; Gellerich, F. N. Molecular and biochemical investigations in fumarase deficiency.

Mol. Genet. Metab. (2006); 88: 146-152

Dietzen, D. J.; Wilhite, T. R.; Kenagy, D. N.; Milliner, D. S.; Smith, C. H.; Landt, M.

Extraction of glyceric and glycolic acids from urine with tetrahydrofuran: utility in

detection of primary hyperoxaluria. Clin. Chem. (1997); 43: 1315-1320

Drennan, C. L.; Matthews, R. G.; Rosenblatt, D. S.; ledley, F. D.; Fenton, F. D.; Ludwig,

M. L. Molecular basis for dysfunction of some mutant forms of methylmalonyl-CoA

mutase: Deductions from the structure of methionine synthase. Proc. Natl. Acad. Sci.

U S A (1996); 93: 5550-5555

Dunckelmann, R. J.; Ebinger, F.; Schulze, A.; Wanders, R. J.; Rating, D.; Mayatepek,

E. 2-ketoglutarate dehydrogenase deficiency with intermittent 2-ketoglutaric aciduria.

Neuropediatrics (2000); 31: 35-38

Dutta, S. P.; Crain, P. F.; McCloskey, J. A.; Chheda, G. B. Isolation and characterization

of 1-beta-D-ribofuranosylpyridin-4-one-3-carboxamide from human urine. Life Sci.

(1979); 24: 1381-1388

Easley, C. J.; Jin, L. J.; Presto Elqstoen, K. B.; Jellum, E.; Landers, J. P.; Ferrance, J. P.

Capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection for laboratory

diagnosis of galactosemia. J. Chromatogr. A (2003); 1004: 29-37

Literatur

111

Fan, T. W.-M. Metabolite profiling by one- and two-dimensional NMR analysis of complex

mixtures. Prog. Nuc. Magn. Res. Spec. (1996); 28: 161-219

Feldman, J. M.; Lee, M. D.; Lee, E. Serotonin content of foods: effect on urinary excretion

of 5-hydroxyindoleacetic acid Am. J. Clin. Nutr. (1985); 42: 639-643

Fontaine, M.; Porchet, N.; Largilliere, C.; Marrakchi, S.; Lhermitte, M.; Aubert, J.-P.;

Degand, P. Biochemical contribution to diagnosis and study of a new case of D-

glyceric academia/aciduria. Clin. Chem. (1989); 35: 2148-2151

Fonteh, A. N.; Harrington, R. J.; Harrington, M. G. Quantification of free amino acids and

dipeptides using isotope dilution liquid chromatography and electrospray ionization

tandem mass spectrometry. Amino Acids (2007); 32: 203-212

Font-Llitjos, M.; Jimenez-Vidal, M.; Bisceglia, L.; Di Perna, M.; de Sanctis, L.;

Rousaud, F.; Zelante, L.; Palacin, M.; Nunes, V. New insights into cystinuria: 40

new mutations, genotype-phenotype correlation, and digenic inheritance causing

partial phenotype. J. Med. Genet. (2005); 42: 58-68

Fribolin, H. Ein- und Zweidimensionale NMR-Spektroskopie: Eine Einführung. 3. Auflage,

Weinheim: Wiley-VCH (1999)

Froesch, E. R. Disorders of fructose metabolism. Clin. Endocrinol. Metab. (1976); 5: 599-

611

Gerlo, E. A.; Sevens, C. Urinary and plasma catecholamines and urinary catecholamine

metabolites in pheochromocytoma: Diagnostic value in 19 cases. Clin. Chem. (1994);

40: 250-256

Gervay, J.; Batta, G. pH dependent C6 and C8 13C chemical shift assignment in N-Acetyl

Neuraminic acid. Tetrahedron Letters (1994); 35: 3009-3012

Literatur

112

Grey, A. A.; Smith, I. C. P.; Hruska, F. E. A model for the molecular conformation of α-

Pseudouridine from nuclear magnetic resonance data. J. Am. Chem. Soc. (1971); 93:

1765-1769

Haberle, J.; Gorg, B.; Rutsch, F.; Schmidt, E.; Toutain, A.; Benoist, J. F.; Gelot, A.; Suc,

A. L.; Hohne, W.; Schliess, F.; Haussinger, D.; Koch, H. G. Congenital glutamine

deficiency with glutamine synthetase mutations. N. Engl. J. Med. (2005); 353: 1926-

1933

Harris, R. A.; Joshi, M.; Jeoung, N. H.; Obayashi, M. Overview of the molecular and

biochemical basis of branched-chain amino acid catabolism. J. Nutr. (2005); 135:

1527S-1530S

Hawkes, G. E.; Lewis, D. 1H nuclear magnetic resonance spectra and conformations of

alsitols in deuterium oxide. J. Chem. Soc. Perkin Trnas. II (1984); 395: 2073-2078

Hodavance, M. S.; Ralston, S. L.; Pelcer, I. Beyond blood sugar: the potential of NMR-

based metabonomics for type 2 human diabetes, and the horse as a possible model.

Anal. Bioanal. Chem. (2006); 387: 533-537

Hofmann, U.; Schwab, M.; Seefried, S.; Marx, C.; Zanger, U. M.; Eichelbaum, M.;

Mürdter, T. E. Sensitive method fort the quantification of urinary pyrimidine

metabolites in healthy adults by gas chromatography-tandem mass spectrometry. J.

Chroamtogr. B (2003); 791: 371-380

Holmes, E.; Foxall, P. J. D.; Spraul, M.; Farrant, R. D.; Nicholson, J. K.; Lindon, J. C.

750MHz 1H NMR spectroscopy characterisation of the complex metabolic pattern of

urine from patients with inborn errors of metabolism: 2-Hydroxyglutaric aciduria and

maple syrup urine disease. J. Pharm. Biomed. Anal. (1997); 15: 1647-1659

Igbal, S. J.; Davies, T.; Cole, R.; Whitaker, P.; Chapman, C. Neutrophil alkaline

phosphatase (NAP) score in the diagnosis of hyperphosphatasia. Clin. Chem. (2000);

302: 49-57

Literatur

113

Ito, H.; Gonthier, M.-P.; Manach, C.; Morand, C.; Mennen, L.; Rémésy, C.; Scalbert, A.

Polyphenol levels in human urine after intake of six different polyphenol-rich

beverages. Brit. J. Nutr. (2005); 94: 500-509

Jain, D. S.; Subbaiah, G.; Sanyal, M.; Jain, V. K.; Shrivastav, P. A rapid and specific

approach for direct measurement of Pravastatin concentration in plasma by LC-MS /

MS employing solid-phase extraction. Biomed. Chromatogr. (2007); 21: 67-78

Jecklin, E. Arbeitsbuch Anatomie und Physiologie: für Krankensschwestern, Krankenpfleger

und andere Medizinalfachberufe. 4. Auflage, Stuttgart: Fischer (1986)

Jung, T. S.; Hahm, J. R.; Kim, J. J.; Kang, M. Y.; Moon, S. W.; Lee, K. W.; Kim, H. C.;

Lee, J. D.; Kim, J. H.; Kim, D. R.; Chung, S. I. Determination of urinary Myo-

/chiro-inositol ratios from Korean diabetes patients. Yonsei Med. J. (2005); 46: 532-

538

Kabadi, U. M. Urine glucose testing: Reliable backup for whole blood glucose monitoring. J.

Fam. Pract. (1992); 34: 495-497

Kammerer, B.; Frickenschmidt, A.; Müller, C. E.; Laufer, S.; Gleiter, C. H.; Liebich, H.

Mass spectrometric identification of modified urinary nucleosides used as potential

biomedical markers by LC-ITMS coupling. Anal. Bioanal. Chem. (2005); 382: 1017-

1026

Kato, K.; Silva, M. S.; Needham, L. L.; Calafat, A. M. Determination of 16 phthalate

metabolites in Urine using automated sample preparation and on-line preconcentration

/ high-performance liquid chromatography / tandem mass spectrometry. Anal. Chem.

(2005); 77: 2985-2991

Kern, S. M.; Bennet, R. N.; Mellon, F. A.; Kroon, P. A.; Garcia-Conesa, M.-T.

Absorption of hydroxycinnamates in humans after high-bran cereal consumption. J.

Agric. Food Chem. (2003); 51: 6050-6055

Literatur

114

Khandelwal, J. K.; Kline, T.; Green, J. P. Measurement of imidazoleacetic acid in urine by

gas chromatography-mass spectrometry. J. Chromatogr. (1985); 343: 249-257

Kitagawa, T.; Smith, B. A.; Brown, E. S. Gas-liquid chromatography of phenylalanine and

its metabolites in serum and urine of various hyperphenylalaninemic subjects, their

relatives, and controls. Clin. Chem. (1975); 21: 735-740

Koch, B. The role of urine glucose testing in the management of diabetes mellitus. Can. J.

Diabetes (2004); 28: 238-245

Koelbing, H. M. Die antiken Grundlagen der Harnschau. Der Urin im medizinischen Denken.

Basel: Geigy (1967)

Kornfeld, R.; Kornfeld, S. Comparative aspects of glycoprotein structure. Annu. Rev.

Biochem. (1976); 45: 217-237

Kubota, K.; Ishizaki, T. Dose-dependent pharmacokinetics of benzoic acid following oral

administration of sodium benzoate to humans. Er. J. Clin. Pharmcol. (1991); 41: 363-

368

Kuhara, T.; Phdoi, C.; Ohse, M. Simple gas chromatographic-mass spectrometric procedure

for diagnosing pyrimidine degradation defects for prevention of severe anticancer side

effects. J. Chromatogr. B (2001); 758: 61-74

Kvist, E.; Sjolin, K. E.; Iversen, J. Excretion patterns of pseudouridine and beta-

aminoisobutyric acid in patients with tumours of the upper urinary tract. Scand. J.

Urol. Nephrol. (1990); 24: 287-292

Lee, J.; Chung, B. C. Simultaneous measurement of urinary polyols using gas

chromatography/mass spectrometry. J. Chromatogr. B (2005); 831: 126-131

Lee, M.-J.; Wang, Z.-Y.; Li, H.; Chen, L.; Sun, Y.; Gobbo, S.; Balentine, D. A.; Yang, C.

S. Analysis of plasma and urinary tea polyphenols in human subjects. Cancer

Epidemiol. Biomarkers Prev. (1995); 4: 393-399

Literatur

115

Lehtonen, L.; Anttila, V.-J.; Ruutu, T.; Salonen, J.; Nikoskelainen, J.; Eerola, E.;

Ruutu, P. Diagnosis of disseminated candidiasis by measurement of urine D-

arabinitol/L-arabinitol ratio. J. Clin. Micobiol. (1996); 34: 2175-2179

Lenz, E. M.; Bright, J.; Wilson, I. D.; Hughes, A.; Morrisson, J.; Lindberg, H.; Lockton,

A. Metabonomics, dietary influences and cultural differences: A 1H NMR-based study

of urine samples obtained from healthy british and Swedish subjects. J. Pharm.

Biomed. Anal. (2004); 36: 841-849

Lenz, E. M.; Bright, J.; Wilson, I. D.; Morgan, S. R.; Nash, A. F. P. A 1H NMR-based

metabonomic study of urine and plasma samples obtained from healthy human

subjects. J. Pharm. Biomed. Anal. (2003); 33: 1103-1115

Leroy, J. G.; Seppala, R.; Huizing, M.; Dacremont, G.; De Simpel, H.; Van Coster, R.

N.; Orvisky, E.; Krasnewich, D. M.; Gahl, W. A. Dominant inheritance of sialuria,

an inborn error of feedback inhibition. Am. J. Hum. Genet. (2001); 68: 1419-1427

Leutert, G. Systematische und funktionelle Anatomie des Menschen: für medizinische

Assistenzberufe. 2. Auflage, Berlin: Ullstein-Mosby (1994)

Liebich, H. M.; Pickert, A. Gas chromatographic profiling of phenolic acids in urine of

patients with cirrhosis of the liver. J. Chromatogr. (1985); 338: 25-32

Luceri, C.; Caderni, G.; Lodovici, M.; Spagnesi, M. T.; Monserrat, C.; Lanvioni, L.;

Dolara, P. Urinary excretion of sucrose and fructose as a predictor for sucrose intake

in dietary intervention studies. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. (1996); 5: 167-

171

Machino, H.; Miki, Y.; Kawatsu, T.; Kida, K.; Matsuda, H. Successful dietary control of

tyrosinemia II. J. Am. Acad. Dermatol. (1983); 9: 533-539

Manning, N. J.; Pollitt, R. J.; Tracer studies of the interconversion of R- and S-

methylmalonic semialdehydes in man. Biochem. J. (1985); 231: 481-484

Literatur

116

McCreanor, G. M.; Bender, D. A. The metabolism of high intakes of tryptophan,

nicotinamide and nicotinic acid in the rat. Brit. J. Nutr. (1986); 56: 577-586

Mitchell, S. C.; Smith, R. L. Trimethylaminuria: The fish malodour syndrome. Drug Metab.

Dispos. (2001); 29: 517-521

Moolenaar, S. H.; Poggi-Bach, J.; Engelke, U. F.; Corstiaensen, J. M.; Heershap, A.; de

Jong, J. G.; Binzak, B. A.; Vockley, J.; Wevers, R. A. Defect in dimethylglycine

dehydrogenase, a new inborn error of metabolism: NMR spectroscopy study. Clin.

Chem. (1999); 45: 459-464

Mortensen, G. K.; Main, K. M.; Andersson, A.-M.; Leffers, H.; Skakkebæk, N. E.

Determination of phthalate monoesters in human milk, consumer milk, and infant

formula by tandem mass spectrometry (LC-MS-MS). Anal. Bioanal. Chem. (2005);

382: 1084-1092

Munro, I. C.; Bernt, W. O.; Borzelleca, J. F.; Flamm, G.; Lynch, B. S.; Kennepohl, E.;

Bär, E. A.; Modderman, J. Erythritol: An interpretive summary of biochemical,

metabolic, toxicological and clinical data. Food and Chemical Toxicology (1998); 36:

1139-1174

Nakano, I.; Tsugawa, T.; Shinohara, R.; Watanabe, F.; Fujita, T.; Nagata, M.; Kato, T.;

Himeno, Y.; Kobayashi, T.; Fujiwara, K.; Nagata, M.; Itoh, M.; Nagasaka, A.

Urinary sorbitol measurement and the effect of an aldose reductase inhibitor on its

concentration in the diabetic state. J. Diabetes Complications (2003); 17: 337-342

Nelson, D. L.; Cox, M. M. Lehninger Biochemie. 3. Auflage, Berlin Heidelberg: Springer

(2001)

Nicholson, J. K.; Foxall, P. J. D. 750MHz 1H and 1H- 13C NMR spectroscopy of human

blood plasma. Anal. Chem. (1995); 67: 793-811

Literatur

117

Niwa, T.; Aoyama, I.; Takayama, F.; Tsukushi, S.; Miyazaki, T.; Owada, A.; Shiidai, T.

Urinary indoxyl sulphate is a clinical factor that affects the progression of renal

failure. Miner. Electrolyte Metab. (1999); 25: 118-122

Nyhan, W. L.; Hilton, S. Histidinuria: defective transport of histidine. Am. J. Med. Genet.

(1992); 44: 558-561

Oka, H.; Suzuki, S.; Suzuki, H.; Oda, T. Increased urinary excretion of L-xylulose in

patients with liver cirrhosis. Clin. Chim. Acta (1976); 67: 131-136

Okamoto, H.; Ishikawa, A.; Yoshitake, Y.; Kodama, N.; Nishimuta, M.; Fukuwatari, T.;

Shibata, K. Diurnal variations in human urinary excretion of nicotinamide catabolites:

effects of stress on the metabolism of nicotinamide. Am. J. Clin. Nutr. (2003); 77: 406-

410

Oyanagi, K.; Tsuchiyama, A.; Itakura, Y.; Tamura, Y.; Nakao, T.; Fujita, S.; Shiono, H.

Clinical, biochemical and enzymatic studies in type I hyperprolinemia associated with

chromosomal abnormality. Tohoku J. Exp. Med. (1987); 151: 465-475

Persson, E.; Löfgren, L.; Hansson, G.; Abrahamsson, B.; Lennernäs, H.; Nilsson, R.

Simultaneous assessment of lipid classes and bile acids in human intestinal fluid by

solid phase extraction and HPLC methods. J.Lipid Res. (2007); 48: 242-251

Pitkanen, E. The conbersion of D-xylose into D-threitol in patients without liver disease and

in patients with portal liver cirrhosis. Clin. Chim.Acta (1977); 80: 49-54

Podebrad, F.; Heil, M.; Beck, T.; Mosandl, A.; Sewell, A. C.; Bohles, H.

Stereodifferentiation of 3-hydroxyisobutyric- and 3-aminoisobutyric acid in human

urine by enantioselective multidimensional capillary gas chromatography-mass

spectrometry. Clin. Chim. Acta. (2000); 292: 93-105

Rana, S. V.; Thapa, B. R.; Pal, R. Comparison of D-xylose hydrogen breath test with

urinary D-xylose test in indian children with celiac disease. Dig. Dis. Sci. (2007);

ahead of print.

Literatur

118

Rebouche, C. J.; Paulson, D. J. Carnitine metabolism and function in humans. Ann. Rev.

Nutr. (1986); 6: 41-66

Rechner, A. R.; Smith, M. A.; Kuhnle, G.; Gibson, G. R.; Debnam, E. S.; Srai, S. K.;

Moore, K. P.; Rice-Evans, C. A. Colonic metabolism of dietary polyphenols:

influence of structure on microbial fermentation products. Free Radic. Biol. Med.

(2004); 36: 212-225

Rechner, A. R.; Kuhnle, G.; Bremner, P.; Hubbard, G. P.; Moore, K. P.; Rice-Evans, C.

A. The metabolic fate of dietary polyphenols in humans. Free Radic. Biol. Med.

(2002); 33: 220-235

Ridel, K. R.; Leslie, N. D.; Gilbert, D. L. An update of the long-term neurological effects of

galactosemia. Pediatr. Neurol. (2005); 33: 153-161

Rider, L. G.; Schiffenbauer, A. S.; Zito, M.; Lim, K. L.; Ahmed, A.; Zemel, L. S.;

Rennebohm, R. M.; Passo, M. H.; Summers, R. M.; Hicks, J. E.; Lachenbruch, P.

A.; Heyes, M. P., Miller, F. W. Neopterin and quinolinic acid are surrogate measures

of disease activity in the juvenile idiopathic inflammatory myopathies. Clin. Chem.

(2002); 48: 1681-1688

Rios, L. Y.; Gonthier, M.-P.; Rémésy, C.; Mila, I.; Lapierre, C.; Lazarus, S. A.;

Williamson, G.; Scalbert, A. Chocolate intake increases urinary excretion of

polyphenol-derived phenolic acids in healthy human subjects. Am. J. Clin. Nutr.

(2003); 77: 912-918

Sakai, T.; Yamamoto, K.; Yokota, H.; Hakozaki-Usui, K.; Hino, F.; Kato, I. Rapid,

simple enzymatic assay of free L-fucose in serum and urine, and its use as a marker

for cancer, cirrhosis and gastric ulcers. Clin. Chem. (1990); 36; 474-476

Sakiyama, T.; Nakabayashi, H.; Shimizu, H.; Kondo, W.; Kodama, S.; Kitagawa, T. A

successful trial of enzyme replacement therapy in a case of argininemia. Tohoku J.

Exp. Med. (1984); 142: 239-248

Literatur

119

Sarashina, G.; Yamakoshi, M.; Noritake, M.; Takahashi, M.; Kure, M.; Katsura, Y.;

Shiomi, H.; Tsuboi, I.; Kawazu, S.; Yamagata, F.; Tominaga, M.; Matsuoka, T.A

study of urinary myo-inositol as a sensitive marker of glucose intolerance. Clin. Chim.

Acta (2004); 344: 181-188

Schlemmer, H.-P. Vom Magneteisenstein zum Magnetresonanztomographen. Radiologe

(2005); 45: 356-362

Schram, K. H. Urinary nucleosides. Mass spectrum. Rev. (1998); 17: 131-251

Schwarz, H. P.; Schaefer, T.; Bachmann, C. Galactose and galactitol in the urine of

children with compound heterozygosity for duarte variant and classical galactosemia

(GtD/gt) after an oral galactose load. Clin. Chem. (1985); 31: 420-422

Seidel, A.; Brunner, S.; Seidel, P.; Fritz, G. I.; Herbarth, O. Modified nucleosides: An

accurate tumour marker for clinical diagnosis of cancer, early detection and therapy

control. Br. J. Cancer (2006); 94: 1726-1733

Sewell, A. C.; Poets, C. F.; Degen, I.; Stoss, H.; Pontz, B. F. The spectrum of free

neuraminic acid storage disease in childhood: Clinical, morphological and biochemical

observations in three non-Finnish patients. Am. J. Med. Genet. (1996); 63: 203-208

Shi, R. Z.; Ho, Y. P.; Yeung, J. H.; Or, P. M.; To, K. K.; Lau, M. W.; Arumanayagam,

M. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay with monoclonal

antibody for quantification of homovanillic in human urine samples. Clin. Chem.

(1998); 44: 1674-1679

Shigematsu, Y.; Sudo, M.; Momoi, T.; Inoue, Y.; Suzuki, Y.; Kameyama, J. Changing

plasma and urinary organic acid levels in a patient with isovaleric acidemia during an

attack. Pediatr. Res. (1982); 16: 771-775

Shirokane, Y.; Utsushikawa, M.; Nakajima, M. A new enzymic determination of

guanidinoacetic acid in urine. Clin. Chem. (1987); 33: 394-397

Literatur

120

Sigmundsdóttir, G.; Christensson, B.; Björklund, L. J.; Håkansson, K.; Pehrson, C.;

Larrson, L. Urine D-arabinitol/L-arabinitol ratio in diagnosis of invasive candidiasis

in newborn infants. J. Clin. Microbiol. (2000); 38: 3039-3042

Sjölin, J.; Stjernström, H.; Henneberg, S.; Hambraeus, L.; Friman, G. Evaluation of

urinary 3-methylhistidine excretion in infection by measurements of 1-methylhistidine

and the creatinine ratios. Am. J. Clin. Nutr. (1989); 49: 62-70

Slominska, E. M.; Carrey, E. A.; Foks, H.; Orlewska, C.; Wieczerzak, E.; Sowinski, P.;

Yacoub, M. H.; Marinaki, A. M. Simmonds, H. A.; Smolenski, R. T. A novel

nucleotide found in human erythrocytes, 4-pyridone-3-carboxyamide-1-beta-D-

ribonucleoside triphosphate. J. Biol. Chem. (2006); 281: 32057-32064

Suzuki, J.; Akihiro, K.; Ikunoshin, K.; Sumihiro, H.; Tokuji, I. Assay of urinary free

fucose by fluorescence labelling and high-performance liquid chromatography. Clin.

Chem. (1992); 38: 752-755

Sykut-Cegielska, J.; Gradowska, W.; Mercimek-Mahmutoglu, S.; Stockler-Ipsiroglu, S.

Biochemical and clinical characteristics of creatine deficiency syndromes. Acta

Biochim. Pol. (2004); 51: 875-882

Szabo, A.; Billett, E.; Turner, J. Phenylethylamine, a possible link to the antidepressant

effects of exercise? Br. J. Sports Med. (2001); 35: 342-343

Tada, K.; Hayasaka, K. Non-ketotic hyperglycinaemia: Clinical and biochemical aspects.

Eur. J. Pediatr. (1987); 146: 221-227

Takeuchi, K.; Wagner, G. NMR studies of protein interactions. Curr. Opin. Struct. Biol.

(2006); 16: 109-117

Tasevska, N.; Runswick, S. A.; McTaggart, A.; Bingham, S. A. Urinary sucrose and

fructose as biomarkers for sugar consumption. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev.

(2005); 14: 1287-1294

Literatur

121

Thompson, J. A.; Markey, S. P.; Fennessey, P. V. Gas-chromatographic/mass-

spectrometric identification and quantitation of tetronic and deoxytetronic acids in

urine from normal adults and neonates. Clin. Chem. (1975); 21: 1892-1898

Tribalat, L.; Paisse, O.; Dessalces, G.; Grenier-Loustalot, M.-F. Advantages of LC-MS-

MS compared to LC-MS for the determination of nitrofuran residues in honey. Anal.

Bioanal. Chem. (2006); 386: 2161-2168

Tsikas, D.; Thum, T.; Becker, T.; Pham, V. V.; Chobanyan, K.; Mitschke, A.;

Beckmann, B.; Gutzki, F. M.; Bauersachs, J.; Stichtenoth, D. O. Accurate

quantification of dimethylamine (DMA) in human urine by gas chromatography-mass

spectrometry as pentafluorbenzamide derivative: Evaluation of the relationship

between DMA and ist precursor asymmetric dimethylarginine (ADMA) in health and

disease. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. (2007); epub ahead of

print

Tu, Z.; Xu, S.; Wu, M. Clinical value of urinary and serum pseudouridine in diagnosis and

monitoring of primary liver cancer. Chin. Med. J. (Engl.) (1995); 108: 204-208

Tůma, P.; Samcová, E.; Balínová, P. Dtermination of 3-methylhistidine and 1-

methylhistidine in untreated erine samples by capillary electrophoresis. J.

Chromatogr. B (2005); 821: 53-59

Valencia, M. P.; Castillo, M. MRI findings in posttraumatic spinal cord wallerian

degeneration. Clin. Imaging (2006); 30: 431-433

Van Kuilenburg, A. B. P.; Meinsma, R.; Beke, E.; Assmann, B.; Ribes, A.; Lorente, I.;

Busch, R.; Mayatepek, E.; Abeling, N. G.; van Cruchten, A.; Stroomer, A. E.;

van Lenthe, H.; Zoetekouw, L.; Kulik, W.; Hoffmann, G. F.; Voit, T.; Wevers, R.

A.; Rutsch, F.; van Gennip, A. H. Beta-ureidopropionase deficiency: An inborn error

of pyrimidine degradation associated with neurological abnormalities. Hum. Mol.

Genet. (2004); 13: 2793-2801

Literatur

122

Van Kuilenburg, A. B. P.; van Lenthe, HH.; Löffler, M.; van Gennip, A. H. Analysis of

pyrimidine synthesis „de novo“ intermediates in urine and dried urine filter-paper

strips with HPLC-electrospray tandem mass spectrometry. Clin. Chem. (2004); 50:

2117-2124

Vaynberg, J.; Qin, J. Weak protein-protein interactions as proped by NMR spectroscopy.

Trends Biotechnol. (2006); 24: 22-27

Verhoeven, N. M.; Huck, J. H. J.; Roos, B.; Struys, E. A.; Salomons, G. S.; Douwes, A.

C.; van der Knaap, M. S.; Jakobs, C. Transaldolase deficiency: Liver cirhosis

associated with a new inborn error in the pentose phosphate pathway. Am. J. Hum.

Genet. (2001); 68: 1086-1092

Walker, V.; Mills, G. A. Solid-phase extraction in clinical biochemistry. Ann. Clin. Biochem.

(2002); 39: 464-477

Walsh, M. C.; Brennan, L.; Malthouse, J. P. G.; Roche, H. M.; Gibney, M. J. Effect of

acute dietary standardization on the urinary, plasma, and salivary metabolomic profiles

of healthy humans. Am. J. Clin. Nutr. (2006); 84: 531-539

Wamelink, M. M. C.; Smith, D. E. C.; Jakobs, C.; Verhoeven, N. M. Analysis of polyols

in urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry: A usefull tool for

recognition of inborn errors affecting polyol metabolism. J. Inherit. Metab. Dis.

(2005); 28: 951-963

Weiss, P.; Tietze, F.; Gahl, W. A.; Seppala, R.; Ashwell, G. Identification of the metabolic

defect in sialuria. J. Biol. Chem. (1989); 264: 17635-17636

White, W. A new look at the role of Urinalysis in the history of diagnostic medicine. Clin.

Chem. (1991); 37: 119-125

Wring, S. A.; Terry, A.; Causon, R.; Jenner, W. N. The electroanalysis of mannitol, xylose

and lactulose at copper electrodes: coltammetric studies and bioanalysis in human

Literatur

123

urine by means of HPLC with electrochemical detection. J. Pharm: Biomed. Anal.

(1998); 16: 1213-1224

Yamauchi, M.; Kimura, K.; Maezawa, Y. Ohata, M.; Mizuhara, Y.; Hirakawa, J.;

Nakajima, H.; Toda, G. Urinary level of L-fucose as a marker of alcoholic liver

disease. Alcohol. Clin. Exp. Res. (1993); 17: 268-271

Zeisel, S. H.; DaCosta, K.-A. Increase in human exposure to methylamine precursors of N-

Nitrosamines after eating fish. Cancer Res. (1986); 46: 6136-6138

Zheng, Y.-F.; Xu, G.-W.; Liu, D.-Y.; Xiong, J.-H.; Zhang, P.-D.; Zhang, C.; Yang, Q.;

Lv, S. Study of nucleosides as biological marker in cancer patients analyzed by

micellar electrokinetic capillary chromatography. Electrophoresis (2002); 23: 4104-

4109

Zorita, S.; Westbom, R.; Thörneby, L.; Björklund, E.; Mathiasson, L. Development of a

combined solid-phase extraction – supercritical fluid extraction procedure for the

determination of polychlorinated biphenyls in wastewater. Anal. Sci. (2006); 22: 1455-

1459

Zschocke, J.; Quak, E.; uldber, P.; Hoffmann, G. F. Mutation analysis in glutaric aciduria

type I. J. Med. Genet. (2000); 37: 177-181

Zuetenhorst, J. M.; Korse, C. M.; Bonfrer, J. M.; Peter, E.; Lamers, C. B.; Taal, B. G.

Daily cyclic changes in the urinary excretion of 5-hydroxyindoleacetic acid in patients

with carcinoid tumors. Clin. Chem. (2004); 50: 1634-1639

Zuppi, C.; Messana, I.; Forni, F.; Ferrari, F.; Rossi, C.; Giardina, B. Influence of feeding

on metabolite excretion evidenced by urine 1H NMR spectral profiles: A comparison

between subjects living in Rome and subjects living at arctic latitudes (Svaldbard).

Clin. Chim. Acta (1998); 278: 75-79

Zuppi, C.; Messana, I.; Forni, F.; Ferrari, F.; Rossi, C.; Giardina, B. Influence of feeding

on metabolite excretion evidenced by urine 1H NMR spectral profiles: A comparison

Literatur

124

between subjects living in Rome and subjects living at arctic latitudes (Svaldbard).

Clin. Chim. Acta (1998); 278: 75-79

SDBS http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/direct_frame_top.cgi

Documents

NMR-Spektroskopische Untersuchungen von ...elib.suub.uni-bremen.de/diss/docs/00010860.pdf · In der NMR-Spektroskopie werden hauptsächlich eindimensionale Experimente eingesetzt