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Molekulare Diagnostik beimMultiplen Myelom
Dr. Dirk HoseSektion Multiples Myelom
Leiter Labor für Myelomforschung4th Heidelberg Myeloma Workshop
27.04.2013
if you know your enemies and know yourself, you will not be imperiled in a hundred battles;
if you do not know your enemies but do know yourself, you will win one and lose one;
if you do not know your enemies nor yourself, you will be imperiled in every single battle.
Sun Tzu et al., 6. Jh v. Chr.
1. Einleitung: Molekulare Diagnostik
2. Interphase Fluoreszenz‐in‐situ‐Hybridisierung
3. Genexpressionsanalysen & Report (GEP‐R)
4. Molekulare Diagnostik & Therapie‐Paradigmen
Übersicht
1. Einleitung
aCGH
mRNA
GEP
DNA
iFISH
Zellen miRNA
miRNomeWGS
DNA
KM‐Aspirat
MNCMNC
Ficoll
RNADNA
WBM
NH4‐Lyse
Zellkultur (BMSCs)KM Serum
KM Ausstrich
MNCFACS
CD14
MMC
CD15
TC
MACS MMC
OC
CompoundExposition
MSC
OB
27.04.2013n = 3991
Molekulare-Diagnostik – Wie & Was?Knochenmarkpunktion beim Multiplen Myelom•60‐80 ml Knochenmark aus Beckenkamm •Knochenmarkausstriche (Diagnose MM, CR) •Aspirat für Aufreinigung
Myelomzellaufreinigung (CD138‐Sortierung) „80%“
Molekulare Diagnostik (in klinischer „Routine“)•Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) Veränderung einzelner chromosomaler Regionen
•Genexpressionsanalysen („Gene expression profiling“, GEP) Veränderung der Expression „aller“ (ca. 30.000) Gene in Myelomzellen
Molekulare Diagnostik (in klinischen Studien):•Minimale Resterkrankung (MRD) Kombi FLC/FACS/ASO‐PCR•miRNA‐Profiling Veränderung regulatorischer RNAs•array‐CHG Veränderungen der Kopienzahl
Molekulare Diagnostik (einzelne Patienten):•DNA‐Sequenzierung (WGS,WES) Punktmutationen, Kopien, TL•RNA‐Sequenzierung alle Transkripte, Fusionstranskripte
Molekulare-Diagnostik – Warum?
Prognose•iFISH (t(4;14), del17p, 1q21, [t(14;16)])•Globale Genexpressionsanalysen „GEP“ (Microarrays)
‐ Proliferation (Genexpressions‐basiert)‐ Risiko‐Score (UAMS, IFM)‐ prognostisch relevante Gene (Aurora‐kinase, IGF1R)
Klinische Konsequenz•iFISH: ‐ t(4;14) Chemotherapie + Bortezomib
‐ del17p längere Bortezomib‐Gabe (Erhaltung)•GEP: UAMS‐Niedrigrisiko und del17p TT3 (Einzelfall)•risikoadaptierte Therapie (Zukunft)•personalisierte Therapie z.B. Aurora‐Kinase (Zukunft)
Wissenschaftliche Fragestellungen•Pathogenese des Myeloms •Neue therapeutische Zielstrukturen
Plasmazellaufreinigungen in der MM5‐Studie
n = 504
in %
6,55 %
2. Interphase Fluoreszenz in situ Hybridisierung
Interphase Fluoreszenz in situ Hybridisierung
5‘
3‘
5‘
3‘
Einzelstrang DNA
DNA ‐ SondeFluoreszenz‐Farbstoff
• (Myelom‐) Zellen auf einen Objektträger spinnen
• In situ (= auf dem Objektträger):
• Denaturierung (Aufspaltung) der doppelsträngigen DNA in einzelsträngige DNA ermöglicht:
• Hybridisierung der interessierenden Region mit einer für diese spezifischen „DNA‐Sonde“, die mit einem Fluoreszenz‐Farbstoff gekoppelt ist.
• Detektion: Fluoreszenz‐Mikroskopie
t(4;14) und Bortezomib: HD4‐Studie
Sonneveld et al., JCO 2012
del17p13: schlechte Prognose z.T. durch längere Bortezomib-Gabe aufgehoben
del17p13 und Bortezomib: HD4‐Studie
Neben et al., Blood 2012
93,8 %
n = 461
iFISH in der MM5‐Studie
3. Genexpressionsanalysen (GEP)
Affymetrix
GEP‐Hochrisiko‐Scores / Proliferation & Prognose
Hose et al., Haematologica 2011
P=.03IFM‐HRkein HR
P=.001
IFM‐HRkein HR
P=.009
UAMS‐HRkein HR
P=.008UAMS‐HRkein HR
P=.002
GPIhigh
GPImedium
GPIlow
P=.002
GPIhigh
GPImedium
GPIlow
Ereignisfreies Überleben
Gesamt‐überleben
Expression therapeutischer Zielgene
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Months
Sur
viva
l Pro
babi
lity
129 105 89 69 57 47 38 29 18 11 5 1 0
39 32 20 14 9 5 3 2 1 1 1 1
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66
AURKA absentAURKA present
P=.003
Aurora-A absentAurora-A present
Ereignisfreies Überleben
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Months
Sur
viva
l Pro
babi
lity
0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 72
129 122 113 102 92 85 73 60 44 30 13 5 1 0
39 35 29 21 18 12 7 6 4 2 1 1
AURKA absentAURKA present
P=.03
Aurora-A absentAurora-A present
Gesamtüberleben
Hose et al., Blood 2009
Aurora-Kinase A
1. therapeutisches Ziel2. prognostischer Faktor
Genexpressionsanalysen in der MM5‐Studie
Stand: 11.10.2012
n = 471
83 %
Gene‐Expression Report (GEP‐R)
Meißner et al., Clin Cancer Res 2011
Beispiel
Patient: *1968
• Shaughnessy‐Score (UAMS): Hochrisiko
• Decaux‐Score (IFM): Niedrigrisiko
• GPI: mittleres Risiko
• ISS‐Stadium: 1
• Translokation t(4;14): ja
Vielzahl prognostischer Faktoren macht es im klinischen Alltag schwierig, eine zusammenfassende prognostische Einschätzung abzugeben:
Integration validierter genexpressionsbasierter und klinisch prognostischer Faktoren in einem prognostischen Score:
• UAMS‐Hochrisiko‐Score (Shaughnessy et al.)
• IFM‐Hochrisiko‐Score (Decaux et al.)
• GPI (Hose et al.)
• ISS‐Stadium
• Translokation t(4;14)
• AURKA und IGF1R
HM‐Metascore
Meißner et al., Clin Cancer Res 2011
P<0.001
low riskmedium risk high risk
19 %
61 %
89 %
Gesamtüberleben
4. Therapie‐Paradigmen
Reexposition
Keats et al., Blood 2012
ZusammenfassungPrognose:• iFISH (t(4;14), del17p, 1q21, [t(14;16)]), [aCGH]• GEP (Microarrays) [miRNA]
‐ Proliferation (Geneexpressions‐basiert)‐ Risiko‐Scores (UAMS, IFM)‐ Prognostisch relevante Gene (Aurora‐kinase A, IGF1R…)
Personalisierte Therapie – therapeutische Konsequenzen:•iFISH: ‐ t(4;14) Chemotherapie + Bortezomib
‐ del17p längere Bortezomib‐Gabe (Erhaltung)• GEP: UAMS‐Niedrigrisiko und del17p TT3 (Einzelfall)
Therapieparadigmen – therapeutische Konsequenzen:•Reexposition im 2. Rezidiv nach Primärtherapie denkbare Option
In Zukunft?• iFISH & aCGH• GEP•MRD •Sequenzierung
Vielen Dank
• Anja Seckinger
• Tobias Meißner
• Edith Daum
• Maria Dörner
• Katrin Heimlich
• Gabriele Hoock
• Ewelina Nickel
• Thorsten Oberle
• Sibylle Seyfried
• Hartmut Goldschmidt
• Thomas Hielscher
• Axel Benner
• Uta Bertsch
• Jana Schlenzka
• Barbara Hügle‐Dörr
• Véronique Pantesco
• Bernard Klein
• Michaela Brough
• Anna Jauch
iFISH • W. Huber
• J. Gehring
• J. Zimmermann
• V. Benes
• Hanno Glimm
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