View
4
Download
0
Category
Preview:
Citation preview
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA FARMACIJO
TADEJA ŠVAJGER
MAGISTRSKA NALOGA
ENOVITI MAGISTRSKI ŠTUDIJSKI PROGRAM FARMACIJA
Ljubljana, 2015
UNIVERZA V LJUBLJANI
FAKULTETA ZA FARMACIJO
TADEJA ŠVAJGER
VPLIV SESTAVE MATRIKSA NA REZULTAT
KROMATOGRAFSKE ANALIZE HIPERICINA
INFLUENCE OF SAMPLE'S MATRIX ON
CHROMATOGRAPHIC ANALYSIS OF HYPERICIN
Ljubljana, 2015
i
Eksperimentalni del magistrske naloge sem opravljala na Katedri za farmacevtsko biologijo
Fakultete za farmacijo pod mentorstvom prof. dr. Sama Krefta, mag. farm. in somentorstvom
asist. dr. Eve Tavčar Benković, mag. farm.
»Kdor išče cilj, bo ostal prazen, ko ga bo dosegel,
kdor pa najde pot, bo cilj vedno nosil v sebi.«
N. Zaplotnik, Pot
ii
ZAHVALA
Iskrena hvala prof. dr. Samu Kreftu za sprejem mentorstva, strokovno usmerjanje in napotke
pri izdelavi magistrskega dela. Hvala za zanimiva in poučna predavanja, ki so mi vlila
dodatno motivacijo, pozitivno voljo in željo po doseganju novega znanja.
Asist. dr. Evi Tavčar Benković za sprejem somentorstva, za ves vložen čas, kritičen, a
kljubtemu pedagoški poduk ob natančnem branju magistrskega dela. Hvala za vse
sproščene, nepozabne ure preživete v laboratoriju, katere so se mi zagotovo globoko vtisnile
v spomin.
Hvala tudi vsem ostalim zaposlenim na Katedri za farmacevtsko biologijo.
Mami in očetu, za vsestransko pomoč in podporo pri študiju. Hvala za življenjske napotke,
skozi katere sta mi pokazala razsežnost, da v življenju ob močni volji in želji nič ni
nedosegljivo ali nemogoče.
Vsem bližnjim, starim staršem in vsem sorodnikom, ki so mi kakorkoli pomagali na moji
življenjski poti.
Starejši sestri Andreji, ki je kljub razdalji briljantno opravljala svoje poslanstvo – življenjske
zaupnice. Brez tebe bi mi bilo težje.
Hvala vsem študijskim prijateljem za vse nepozabne trenutke, smeh, veselje, tolažbo in vse
spodbudne besede, ki ne bodo nikdar pozabljene!
Mojemu Blažu, da me je našel, izpopolnil in osrečil. Hvala za tvojo brezpogojno ljubezen, ki
mi jo vseskozi daješ. Hvala za podporo, da počnem in sanjam to, česar brez tebe ne bi.
Izjava
Izjavljam, da sem magistrsko delo samostojno izdelala pod vodstvom mentorja prof. dr.
Sama Krefta, mag. farm. in somentorice asist. dr. Eve Tavčar Benković, mag. farm.
Predsednik komisije: izr. prof. dr. Marko Anderluh, mag. farm.
Članica komisije: izr. prof. dr. Mojca Kerec Kos, mag. farm.
Ljubljana, 2015 Tadeja Švajger
iii
KAZALO VSEBINE
POVZETEK .................................................................................................................... VIII
ABSTRACT ........................................................................................................................ X
1 UVOD ................................................................................................................................ 1
1.1 SPLOŠNO O ŠENTJANŽEVKI (Hypericum perforatum) .......................................... 1
1.2 SESTAVA .................................................................................................................... 2
1.3 UPORABA ................................................................................................................... 4
1.3.1 Uporaba v farmaciji .............................................................................................. 4
1.4 HIPERICINI ................................................................................................................. 7
1.4.1 Hipericin................................................................................................................ 7
1.5 EKSTRAKT ............................................................................................................... 11
1.5.1 Standardizacija.................................................................................................... 11
1.5.2 Delovanje ekstrakta ............................................................................................. 12
1.5.3 Topilo za ekstrakcijo ........................................................................................... 12
2 NAMEN DELA ............................................................................................................... 13
3 MATERIALI IN METODE .......................................................................................... 15
3.1 MATERIALI .............................................................................................................. 15
3.1.1 Rastlinski material............................................................................................... 15
3.1.2 Reagenti in topila ................................................................................................ 15
3.1.3 Aparature in laboratorijska oprema ................................................................... 16
3.1.4 Material za HPLC analize vzorcev ..................................................................... 17
3.1.5 Drugo .................................................................................................................. 17
3.2 METODE ................................................................................................................... 18
3.2.1 Priprava osnovnih raztopin ................................................................................. 18
3.2.2 Priprava vzorcev standarda in ekstrakta za analize ........................................... 21
3.2.3 Spektrofotometrično merjenje absorbance ......................................................... 22
3.2.4 Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC) ........................................ 23
3.2.4.1 HPLC metode za analize vzorcev ................................................................. 24
iv
4 REZULTATI IN RAZPRAVA ...................................................................................... 25
4.1 OPAŽANJA PRI PRIPRAVI VZORCEV ................................................................. 25
4.1.1 Priprava osnovne raztopine standarda ............................................................... 25
4.1.2 Priprava vzorcev standarda in ekstrakta za analize ........................................... 25
4.2 ANALIZA STANDARDA HIPERICINA ................................................................. 26
4.2.1 Dodatki soli k standardu hipericina .................................................................... 27
4.2.1.1 Dodatki različnih koncentracij mešanice soli ter posameznih komponent te
mešanice ................................................................................................................... 27
4.2.1.2 Dodatki različnih koncentracij aluminijevega sulfata .................................. 29
4.2.2 Dodatki kisline in baze k standardu hipericina ................................................... 34
4.2.3 Vpliv stekla na površino pod krivuljo standarda hipericina ............................... 35
4.3 ANALIZA EKSTRAKTA ŠENTJANŽEVKE .......................................................... 38
4.3.1 Dodatki soli k ekstraktu šentjanževke.................................................................. 38
4.3.1.1 Dodatki različnih koncentracij mešanice soli ter posameznih komponent te
mešanice ................................................................................................................... 38
4.3.1.2 Dodatki različnih koncentracij aluminijevega sulfata .................................. 39
4.3.2 Dodatki kisline in baze k ekstraktu šentjanževke ................................................ 41
4.4 PRIMERJAVA UPORABLJENIH METOD PRI HPLC ANALIZAH .................... 44
5 SKLEP ............................................................................................................................. 47
6 LITERATURA ............................................................................................................... 49
7 PRILOGA ....................................................................................................................... 54
v
KAZALO SLIK
Slika 1: Šentjanževka ............................................................................................................ 1
Slika 2: Strukturne formule značilnih spojin v šentjanževki ................................................. 3
Slika 3: Biosintezna pot hipericina in psevdohipericina iz emodina v celicah temnih žlez .. 8
Slika 4: Oštevilčena struktura hipericina in prikaz bay ter peri regije spojine .................... 9
Slika 5: Od prisotnosti dovolj močne baze odvisno ravnotežje 7,14-diketo tavtomera
hipericina (Q7,14) in njegove stabilne anionske oblike ................................................. 10
Slika 6: Posušena šentjanževka, rastlinski material za pripravo ekstrakta ........................ 15
Slika 7: Pripravljena osnovna raztopina standarda ........................................................... 18
Slika 8: Pripravljene osnovne raztopine različnih koncentracij mešanice soli, različnih
koncentracij aluminijevega sulfata, 0,5 % posameznih soli, ocetne kisline in
trietilamina ................................................................................................................... 21
Slika 9: Pripravljeni vzorci standarda za HPLC analize ................................................... 22
Slika 10: Pripravljeni vzorci ekstrakta za HPLC analize ................................................... 22
Slika 11: Aparatura za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti na Katedri za
farmacevtsko biologijo ................................................................................................. 24
Slika 12: Spremembe barv vzorcev standarda hipericina po različnih dodatkih ............... 25
Slika 13: Spremembe barv vzorcev ekstrakta šentjanževke po različnih dodatkih ............. 26
Slika 14: Kromatogram standarda hipericina po dodatkih različnih koncentracij
aluminijevega sulfata, metoda 1................................................................................... 31
Slika 15: Vpliv dolžine metode na ločevanje vrhov pri novonastali spojini ....................... 34
Slika 16: Pripravljeni vzorci standarda v svetlih/temnih vialah različnih proizvajalcev pri
testiranju stekla na vpliv AUC-ja standarda hipericina .............................................. 36
Slika 17: Predviden mehanizem pretvorbe psevdohipericina v izopsevdohipericin ........... 42
Slika 18: Kromatogram ekstrakta šentjanževke, metoda 1, absorbančni detektor ............. 43
Slika 19: Kromatogram standarda hipericina, metoda B, fluorescenčni detektor ............. 45
Slika 20: Kromatogram standarda hipericina, metoda 1, fluorescenčni detektor .............. 45
Slika 21: Kromatogram ekstrakta šentjanževke, metoda B, fluorescenčni detektor ........... 45
Slika 22: Kromatogram ekstrakta šentjanževke, metoda 1, fluorescenčni detektor ........... 46
vi
KAZALO GRAFOV
Graf 1: Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih soli na AUC, metode A .............. 27
Graf 2: Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih soli na AUC, metoda B .............. 28
Graf 3: Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih soli na AUC. Primerjava vplivov
med različnimi metodami (metode A in metoda B) ...................................................... 29
Graf 4: Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega sulfata
na AUC, metoda 1 ........................................................................................................ 29
Graf 5: Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega sulfata
na AUC, metoda B ........................................................................................................ 30
Graf 6: Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega sulfata
na AUC. Primerjava vplivov med različnimi metodami (metode A in metoda B) ....... 31
Graf 7: Celoten UV-VIS spekter po dodatkih različnih koncentracij aluminijevega sulfata k
standardu hipericina .................................................................................................... 32
Graf 8: Znižanje odziva hipericina po dodatkih različnih koncentracij aluminijeve soli ... 33
Graf 9: Prikaz AUC-ja predvidenega nastanka kompleksa po dodatkih različnih
koncentracij aluminijevega sulfata k standardu hipericina, metoda 1 ........................ 33
Graf 10: Vpliv dodatkov kisline in baze na AUC hipericina po metodah A ter metodi B ... 34
Graf 11: Vpliv stekla na AUC standarda hipericina, metoda B ......................................... 37
Graf 12: Vpliv stekla na AUC standarda hipericina, metoda 1 .......................................... 37
Graf 13: Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov različnih soli na AUC hipericina.
Primerjava vplivov med različnimi metodami (metode A in metoda B) ...................... 39
Graf 14: Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega
sulfata na AUC hipericina. Primerjava vplivov med različnimi metodami (metode A in
metoda B) ..................................................................................................................... 40
Graf 15: Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov kisline ter baze na AUC hipericina.
Primerjava vplivov med različnimi metodami (metode A in metoda B) ...................... 41
Graf 16: Primerjava UV-VIS absorpcijskih spektrov ekstrakta brez dodatka in ekstrakta po
dodatku baze ................................................................................................................. 43
vii
KAZALO PREGLEDNIC
Preglednica I: Znanstvena klasifikacija šentjanževke, Hypericum perforatum L. ............... 1
Preglednica II: Priprava nižjih koncentracij aluminijeve soli iz 0,5 % aluminijeve soli ... 20
Preglednica III: Priprava različnih koncentracij mešanice soli iz 1 % osnovne raztopine
mešanice soli ................................................................................................................ 20
Preglednica IV: Priprava vzorcev standarda/ekstrakta z različnimi dodatki .................... 21
Preglednica V: Viale različnih proizvajalcev ..................................................................... 35
Preglednica VI: Priprava vzorcev standarda v različne viale............................................ 36
viii
POVZETEK
V zadnjem času je duševno zdravje čedalje pogosteje predmet razprave v širši javnosti.
Problematika težav na tem področju postaja vse bolj aktualna, ljudje pa vse bolj posegajo po
alternativnih metodah zdravljenja in zaradi tega narašča tudi zanimanje za šentjanževko.
Izvleček šentjanževke s svojim antidepresivnim delovanjem predstavlja alternativo
sinteznim antidepresivom. Hypericum perforatum L. vsebuje široko paleto biološko aktivnih
spojin, med katerimi je tudi hipericin.
V magistrski nalogi smo se osredotočili predvsem na sestavo matriksa vzorca in vpliv, ki ga
le-ta ima na analize hipericina s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC). V ta
namen smo standardu hipericina in ekstraktu šentjanževke dodajali različne koncentracije
(0,25 %, 0,5 % in 1 %) mešanice soli, ki vsebuje natrijev klorid, magnezijev klorid, kalcijev
karbonat in aluminijev sulfat, 0,5 % posamezne komponente te mešanice, različne
koncentracije aluminijevega sulfata (0,006 %, 0,025 %, 0,1 %, 0,25 % in 0,4 %), ocetno
kislino in trietilamin. Pri analizah smo se usmerili v uporabo »metod A« in »metode B«, pri
čemer metoda B predstavlja farmakopejsko metodo za hipericin. Dodatek soli ali sprememba
pH-ja bi lahko znižala ali zvišala površino pod krivuljo hipericina, ki se v farmakopejski
metodi uporablja za kvantifikacijo suhega ekstrakta šentjanževke, in tako bi lahko dobili
napačne rezultate.
Ugotovili smo, da je do značilnega znižanja površine pod krivuljo hipericina prišlo po
dodatku aluminijevega sulfata. Vpliv aluminijeve soli na hipericin je bil večji pri uporabi
standarda kakor pri ekstraktu šentjanževke. Razlog je najverjetneje ta, da ekstrakt
šentjanževke vsebuje številne druge spojine, ki preprečujejo nastanek kompleksa hipericina
z aluminijem in zaradi tega ne pride do tako velikih sprememb površine pod krivuljo. Prav
tako so spremembe površine pod krivuljo hipericina bistveno manjše pri uporabi metode B
kot pri metodah A. Sklepamo, da do tega pride zaradi prisotnosti fosfatnih ionov v pufru
metode B, ki bi lahko interagirali z aluminijevimi ioni in s tem preprečili nastanek kompleksa
hipericina z aluminijem. Obenem ima metoda B ustreznejšo pufrno kapaciteto. Drugi
dodatki niso imeli večjega vpliva na kromatografski vrh hipericina. Do večjih sprememb po
dodatku baze pa je prišlo pri psevdohipericinu v ekstraktu šentjanževke. Po dodatku baze k
ekstraktu se je precej znižala površina pod krivuljo psevdohipericina, pri višjem
retencijskem času pa je nastal nov vrh, ki pripada izopsevdohipericinu. V preteklih
ix
diplomskih nalogah so pri raziskovanju hipericinu podobnih spojin opazili neponovljive
rezultate HPLC analiz. Zaradi suma, da lahko na analitske rezultate med drugim vpliva tudi
tip stekla vial in insertov ter predhodno spiranje le-teh z metanolom, smo to preverili in
ugotovili, da ti parametri ne vplivajo na rezultate.
Ključne besede: hipericin, HPLC, matriks, šentjanževka, tekočinska kromatografija visoke
ločljivosti.
x
ABSTRACT
Mental health is becoming an increasingly popular subject of discussion in the general
public. The difficulties in this area are becoming increasingly topical, and people are seeking
alternative methods of therapy and because of this, there is an increasing interest in the St.
John's wort. St. John's wort extract works as an antidepressant and thus represents an
alternative to synthetic antidepressants. Hypericum perforatum L. contains a wide range of
biologically active compounds, which also include hypericin.
In the thesis we are focusing mainly on the composition of the sample matrix and its impact
on the analysis of hypericin using high-performance liquid chromatography (HPLC). For
this purpose, we added various concentrations (0,25 %, 0,5 % and 1 %) of a mixture of salts
which includes sodium chloride, magnesium chloride, calcium carbonate and aluminium
sulphate, 0,5 % of the individual components of this mixture, different concentrations of
aluminum sulphate (0,006 %, 0,025 %, 0,1 %, 0,25 % and 0,4 %), acetic acid and
triethylamine to the standard of hypericin and St. John's wort extract. In the analysis we
focused on the use of »methods A« and »method B«, wherein the method B represents
pharmacopeic method for hypericin. The addition of salts or a change in pH could decreased
or increased the area under the curve of hypericin, which is used in pharmacopoeial method
for quantification of dry extract of St. John's wort, which could lead to erroneous results.
We have found that the addition of aluminum sulphate caused a significant decrease in the
area under the hypericin curve. The effect of aluminum salt on hypericin was greater when
applying the standard than with the St. John's wort extract. The reason is probably that the
extract of St. John's wort contains a number of other compounds that prevent the formation
of the hypericin complex with aluminum, and because of this, there is no significant changes
in the areas under the curve. Also, the changes of area under the hypericin curve are
significantly lower when using method B than with methods A. We conclude that this is due
to the presence of phosphate ions in the buffer of method B which may interact with the
aluminum ions, thereby preventing the formation of complex with aluminum and hypericin.
Method B also has an adequate buffering capacity. Other additives had no significant impact
on the chromatographic peak of hypericin. Major changes occurred after the addition of base
in pseudohypericin in the extract of St. John's wort. After adding a base to extract, the area
under the curve of pseudohypericin decreased significantly and at a higher retention time a
xi
new peak occured, which belongs to isopseudohypericin. When researching hypericin like
compounds in past diplomas, they observed unrepeatable results of HPLC analyses. Due to
the suspicion that the analytical results can be affected also by the type of glass vials and
inserts and pre-washing those tools with methanol, we examined it and found that these
parameters do not affect the results.
Keywords: hypericin, HPLC, matrix, St. John's wort, high-performance liquid
chromatography.
xii
SEZNAM OKRAJŠAV
Okrajšava Razlaga
AUC (angl.: area under the curve) površina pod krivuljo
CYP3A4 izoforma citokroma P450 3A4
EtOH etanol
GABA (angl.: gamma-aminobutyric acid) γ-aminobutanojska kislina
HPLC (angl.: high-performance liquid chromatography) tekočinska kromatografija
visoke ločljivosti
MeOH metanol
Ph. Eur. Evropska farmakopeja
RP-HPLC (angl.: reversed-phase reverznofazna tekočinska
high-performance liquid chromatography) kromatografija visoke ločljivosti
rpm (angl.: rotations per minute) obrati na minuto
SSRI (angl.: selective serotonin reuptake inhibitor) selektivni zaviralci ponovnega
privzema serotonina
SNRI (angl.: serotonin-noradrenaline reuptake inhibitor) zaviralci ponovnega privzema
serotonina in noradrenalina
TFA (angl.: trifluoroacetic acid) trifluoroocetna kislina
tr retencijski čas
UV ultravijolična svetloba
UZ ultrazvok
VIS vidna svetloba
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
1
Slika 1: Šentjanževka (10)
1 UVOD
1.1 SPLOŠNO O ŠENTJANŽEVKI (Hypericum perforatum)
Krčnica ali Hypericum je rod, ki je razširjen po vsem svetu in vsebuje okoli 400 vrst. V
medicinske namene največ uporabljamo vrsto Hypericum perforatum L., katera je bila in je
še vedno najbolj cenjena v fitoterapiji (1). V preglednici I je podana znanstvena klasifikacija
šentjanževke. Šentjanževka (slika 1) je trpežna, delno lesena trajnica s pokončno rastjo, ki
zraste do enega metra visoko. Cvetovi so zlato rumeni, zvezdasto oblikovani, s petimi
zelenimi čašnimi listi in petimi zlato rumenimi venčnimi listi. Cvetijo od sredine meseca
junija do avgusta. Čašni listi (čaša ali kaliks) in venčni listi (venec ali korola) vsebujejo
številne črne žlezne pike. Majhni gladki ovalni listi, ki nastopajo v nasprotnih parih vzdolž
peclja, imajo značilne številne drobne oljne žleze. Majhni jajčasti stroki vsebujejo okrogla
črna semena (2, 3, 4, 5). Ime šentjanževka izhaja iz dejstva, da je rastlina v največjem
razcvetu za šentjanževo, ko goduje sv. Janez, tj. 24. junija. Iz strtih cvetov se izloči krvavo
rdeč sok, ki naj bi po eni izmed legend predstavljal Kristusovo kri. Druga legenda pa pravi,
da je rastlina zrasla iz kapljic krvi ob obglavljenju Janeza Krstnika (4, 6). Rodovno ime
hypericum izvira iz grških besed hyper (nad) in eikon (sliko) (7). Če list pridržimo proti
svetlobi, so lepo vidne drobne oljne žleze. Dobimo občutek »preluknjanega« lista, od koder
izvira vrstno ime perforatum.
Preglednica I: Znanstvena klasifikacija šentjanževke, Hypericum perforatum L.(9)
Kraljestvo Plantae (rastline)
Deblo Magnoliophyta
(kritosemenke)
Razred Magnoliopsida
(dvokaličnice)
Red Malpighiales
Družina Hypericaceae
(krčničevke)
Rod Hypericum
(krčnica)
Vrsta H. perforatum
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
2
Ljudska imena: grilavec, ivanovka, janževka, kamenika, krčevec, krčnica, krčno zele, kri
sv. Janeza, križevec, krvavec, krvočistnik, navadna krčna zel, navadna krčnica, počist, roža
sv. Ivana, rumena naniknica, šentjanženca, šentjanževa roža (8).
1.2 SESTAVA
Šentjanževka vsebuje širok spekter različnih naravnih razredov spojin (11, 12). Čas
pobiranja šentjanževke (pred, med ali po cvetenju) je zelo pomemben z vidika fitokemije,
saj stadij razvoja rastline bistveno vpliva na sestavo učinkovin.
Naftodiantroni: 0,06–0,4 %, večinoma psevdohipericin, hipericin (1), protohipericin,
protopsevdohipericin (2) in ciklopsevdohipericin (3) (13). Njihova vsebnost variira zaradi
različnih načinov kultivacije, prisotnosti svetlobe, nadmorske višine, obdobja leta in
okoljskih dejavnikov (16, 17).
Največ naftodiantronov se nahaja v listih in cvetovih (18). Njihova koncentracija narašča od
prvega brstenja do popolnoma odprtih cvetov. Prav tako je njihova vsebnost močno odvisna
od faze razvoja, z najvišjo vsebnostjo v fazi cvetenja in drastičnim upadom v fazi zorenja
plodov, fruktifikacije (17). Šentjanževemu olju dajejo značilno rdečo barvo (2).
Zaradi njihove aromatske konjugacije so v primerjavi s fluoroglucinolnimi derivati bolj
stabilni. Izjema sta proto obliki, ki imata odprto obročno strukturo in nista stabilni pod
vplivom svetlobe, saj pride do pretvorbe protohipericina v hipericin in
protopsevdohipericina v psevdohipericin (14, 15).
Fluoroglucinolni derivati: 0,2–4,0 %, odvisno od starosti droge. Največ je hiperforina (4),
sledita mu njegova analoga adhiperforin in furanohiperforin. Večja količina hiperforina se
tvori šele po cvetenju, ko ima rastlina že plodove (13). Občutljivi so na oksidacijo, v
raztopini pa so najbolj nestabilni, kadar so izpostavljeni svetlobi in zraku (14, 15).
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
3
1 2
hipericin: R = H protohipericin: R = H
psevdohipericin: R = OH protopsevdohipericin: R = OH
3 4
ciklopsevdohipericin hiperforin
Slika 2: Strukturne formule značilnih spojin v šentjanževki. Hipericin in psevdohipericin (1),
protohipericin in protopsevdohipericin (2), ciklopsevdohipericin (3), hiperforin (4).
Flavonoidi: 2–4 %, glikozidi kvercetina (hiperozid, rutin, kvercitrin in izokvercitrin),
biflavonoidi (biapigenin, amentoflavon).
Procianidini: 6–15 %, procianidin B2, tanini s katehinskim skeletom.
Ksantoni: v sledovih.
Eterično olje: 0,1–0,25 %, največ 2-metiloktana.
Druge komponente: nasičene maščobne kisline (palmitinska, stearinska, izovalerijanska),
vitamini in njihovi analogi (karatenoidi, holin, nikotinamid, nikotinska kislina), pektin itd.
(13, 7, 19).
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
4
1.3 UPORABA
Šentjanževka je znana kot zdravilna rastlina, njena uporaba je v ljudski medicini zelo dobro
zakoreninjena. Že od nekdaj so ljudje verjeli, da odganja zle duhove, čarovnije in varuje hiše
pred strelami, zato so jo obešali nad vhode, verske slike ipd. (2). V poletne kresove so jo
metali kot zelišče za varovanje in očiščenje. Še danes pa je simbol poletnega obrata ali
solsticija (3). Stoletja se je uporabljala za zdravljenje ran in razjed, motenj presnov in zlasti
kot sredstvo s protivnetnim in diuretičnim učinkom.
Dandanes je še posebej izpostavljeno antidepresivno delovanje ekstrakta šentjanževke, le-ta
pa deluje tudi protivirusno, protimikrobno in protivnetno. V zadnjih letih se prav tako
povečuje število raziskav, v katerih hipericin prepoznavajo kot potencialni fotosenzibilizator
v fotodinamični terapiji za zdravljenje nekaterih rakavih obolenj, luskavice in možganskih
tumorjev (20, 21, 22).
1.3.1 UPORABA V FARMACIJI
Po Pravilniku o razvrstitvi zdravilnih rastlin je šentjanževka uvrščena v kategorijo Z. V to
kategorijo so razvrščene zdravilne rastline, ki so namenjene za preprečevanje in zdravljenje
bolezni in bolezenskih stanj (23).
V današnjem času se ekstrakti šentjanževke uporabljajo predvsem kot rastlinski antidepresiv
za zdravljenje blage do srednje težke depresije. Uporablja se za izboljšanje razpoloženja,
zmanjša občutek izčrpanosti, utrujenosti, brezvoljnosti, odžene potrtost in malodušje (12,
24, 18). Rastlinski pripravki šentjanževke predstavljajo alternativo sinteznim
antidepresivom, saj povzročajo manj stranskih učinkov (25).
Droga je zel šentjanževke (Hypericii herba), ki jo sestavljajo celi ali zmleti posušeni cvetovi.
Nabiramo jih v času cvetenja, saj je takrat količina naftodiantronov najvišja (19, 13, 17).
Farmakološki učinki
Šentjanževka vsebuje številne spojine, ki so dokazano biološko aktivne. Spojine, katerim se
posveča največ pozornosti, vključujejo naftodiantrona hipericin in psevdohipericin, široko
paleto flavonoidov in fluoroglucinola hiperforin ter adhiperforin. Kljub temu, da obstajajo
odprta vprašanja, je iz večine podatkov možno razbrati, da za antidepresivno delovanje ni
odgovorna zgolj ena spojina, temveč več skupin aktivnih spojin, ki delujejo sinergistično
(26, 27, 28).
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
5
Antidepresivno delovanje
Področje problematike težav v duševnem zdravju postaja vse bolj aktualno tako v evropskem
kot tudi v širšem svetovnem merilu. Duševno zdravje je v zadnjem času čedalje pogosteje
predmet razprave v širši javnosti. Duševne motnje niso nekaj oddaljenega in čudaškega,
temveč so prisotne v domala vseh strukturah družbe in imajo pomembno vlogo pri
posameznikovem splošnem počutju, telesnem zdravju in življenju nasploh. Ljudje zaradi
različnih vzrokov vse bolj posegajo po alternativnih metodah zdravljenja, zaradi česar
narašča tudi zanimanje za šentjanževko, ki s svojim antidepresivnim delovanjem predstavlja
alternativo sinteznim antidepresivom. V kliničnih poskusih so učinek antidepresivnega
delovanja ekstrakta šentjanževke primerjali s standardnimi antidepresivi kot so amitriptilin,
fluoksetin, imipramin, sertralin (29). V raziskavah so uporabili Hamiltonovo (HAMD)
lestvico za ocenjevanje depresije in ugotovili, da je izmed naštetih sinteznih antidepresivov
izvleček šentjanževke primerljiv z vsemi razen z amitriptilinom (30).
Sprva so antidepresivne učinke ekstraktov pripisovali zgolj naftodiantronom, hipericinu in
psevdohipericinu. Najnovejša dognanja trdijo, da ta učinek ni odvisen zgolj od ene same
sestavine ali skupine sestavin. Poenostavljen pogled: ena rastlina – ena aktivna spojina – en
mehanizem delovanja, je torej nepravilen (26). Do izboljšanja stanja bolezenskih znakov
pride zaradi medsebojnega delovanja različnih sestavin (18). Dandanes je znano, da ima
pomembno vlogo pri tem delovanju fluoroglucinolni derivat hiperforin in tudi številni
flavonoidi (31, 25). Prav tako pa flavonoidi, zlasti hiperozid in procianidini, povečajo
topnost hipericina v vodi, kar pomeni tudi boljšo biorazpoložljivost hipericina (26).
Učinkovine v izvlečku zavirajo ponovni privzem monoaminov (noradrenalina, serotonina,
dopamina) in aminokislinskih nevrotransmiterjev (GABA, glutamata) v predsinaptične
nevrone (15, 56).
Odmerek
Za zdravljenje blage in zmerno hude depresije oz. za zmanjšanje simptomov je pomemben
zadosten odmerek suhega izvlečka. Priporočen začetni dnevni odmerek je med 500 in
1000 mg izvlečka, v nadaljevanju pa zadoščajo odmerki med 300 in 600 mg dnevno (2).
Plazemska koncentracija se postopno zvišuje več tednov, zato so za izražen klinični učinek
potrebni dva do štirje tedni (29).
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
6
Varnost
Neželeni učinki
Uporaba ekstrakta šentjanževke v primerjavi z ostalimi antidepresivi ne izkazuje nobenega
resnega neželenega učinka. Pri nizkem odstotku ljudi se lahko pojavijo blagi stranski učinki
kot so prebavne motnje, suha usta, glavobol, povečana tesnoba, utrujenost in nemir (29).
Interakcije
Poleg učinkovitosti šentjanževke je znana tudi problematika glede interakcij spojin v
izvlečku šentjanževke. Le-te so v primerjavi z neželenimi učinki, ki so blagi in redki, vredne
večje pozornosti. Morebitne interakcije izvlečka šentjanževke tako predstavljajo omejujoč
dejavnik za njegovo uporabo.
Šentjanževka v telesu inducira nastajanje encimov iz skupine citokromov P450 (najbolj
izoformo CYP3A4, ki metabolizira veliko danes uporabljenih zdravilnih učinkovin) in
transmembranskega prenašalca glikoproteina P, ki skrbi za izločanje učinkovin iz celic.
Posledica tega je pospešen metabolizem zdravilnih učinkovin in s tem zmanjšanje njihovega
učinka. Interakcije se torej lahko pojavijo ob hkratni uporabi šentjanževke in zdravilnih
učinkovin, ki se presnavljajo z navedenimi izoformami citokromov P450 ali se prenašajo z
glikoproteinom P (32). Za indukcijo citokromov P450 in glikoproteina P je odgovoren
hiperforin, katerega količina v različnih izvlečkih se razlikuje. Poleg interakcij, ki jih
povzroča hiperforin, pa pomembno prispeva tudi k antidepresivnemu delovanju izvlečkov
šentjanževke, zato njegova vsebnost kljub vsemu ne sme biti premajhna (33).
Novejše raziskave relativizirajo nevarnost interakcij šentjanževke z ostalimi zdravili. Pri
višjih odmerkih (zdravljenje blagih do zmernih depresivnih epizod) je kontraindicirana
sočasna raba teh zdravil z imunosupresivi (ciklosporinom, takrolimusom), nekaterimi
zdravili za terapijo infekcij s HIV (amprenavirjem, indinavirjem), zdravili proti raku
(irinotekanom) in antikoagulanti kumarinskega tipa (varfarinom). Pri nižjih odmerkih
zdravil (za lajšanje blažjih simptomov) nevarnosti interakcij niso klinično pomembne (34).
V primeru jemanja pripravkov šentjanževke skupaj s selektivnimi zaviralci ponovnega
privzema serotonina (SSRI) ali zaviralci ponovnega privzema serotonina in noradrenalina
(SNRI), lahko pride do serotoninskega sindroma.
Zaradi teh interakcij naj bi pripravke iz šentjanževke svetovali za samozdravljenje blagih
oblik depresije (brezvoljnost, potrtost), če je le možno ljudem, ki ne jemljejo drugih zdravil.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
7
Navsezadnje predstavljajo pripravki iz izvlečka šentjanževke, ob upoštevanju možnosti
interakcij z drugimi zdravili in v primernem dnevnem odmerku ter primerni izbiri bolnika,
varno in učinkovito alternativo sinteznim antidepresivom v primeru blage do srednje hude
depresije (34).
Fototoksičnost (hipericizem)
Hipericizem oziroma fototoksičnost šentjanževke je znana predvsem iz veterine. Doslej so
opazovali vnetja kože in gobca pri ovcah, konjih in kravah, ki so s hrano zaužili velike
količine šentjanževke. Pri ljudeh so plazemske koncentracije hipericina med antidepresivno
terapijo s šentjanževko prenizke, da bi lahko prišlo do fototoksičnih reakcij. Do tega bi prišlo
v primeru 30–50 krat višje priporočene dnevne doze (18, 11, 29). Ob jemanju priporočenih
terapevtskih odmerkov se znaki fotosenzibilizacije (preobčutljivosti na svetlobo) naj ne bi
pojavili. V primeru, da pride do večje prekoračitve odmerka, pa bi se moral bolnik nekaj
časa izogibati ultravijoličnemu sevanju (2).
1.4 HIPERICINI
Hipericini so naravni rastlinski proizvodi, ki zaradi njihove strukture pripadajo skupini
naftodiantronov. Hipericini vključujejo spojine hipericin, psevdohipericin, protohipericin,
protopsevdohipericin in njihove derivate (izohipericin, ciklopsevdohipericin itd.), ki se
pojavljajo v precej nižjih koncentracijah. Protohipericin je predhodnik hipericina,
protopsevdohipericin pa psevdohipericina (11).
1.4.1 HIPERICIN
Hipericin (C30H16O8, 504,44 g/mol) je naravna spojina prisotna v rastlinah roda Hypericum
ali pridobljena sintezno. Kljub temu, da je bila struktura hipericina odkrita že več desetletij
nazaj, je njegova podrobna molekulska struktura še vedno predmet debate (21). Standard
hipericina je v vodi praktično netopen, njegova topnost v vodi pa se v ekstraktu poveča zaradi
prisotnosti različnih spojin (rutin, hiperozid, procianidini itd.) (13, 35).
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
8
Biosinteza
Slika 3 prikazuje biosintezo hipericina v celicah temnih žlez rastline (listi, steblo, venčni in
cvetni listi, prašniki). Različna količina temnih žlez v teh rastlinskih organih je razlog za
različno vsebnost hipericina. Največ hipericina najdemo v cvetovih, saj se največ temnih
žlez nahaja ravno v prašnikih (36).
+
Slika 3: Biosintezna pot hipericina in psevdohipericina iz emodina v celicah temnih žlez (prirejeno
po (36))
acetat + malonat
OGLJIKOVI HIDRATI
(glukoza, fruktoza, galaktoza)
glukoza-6-fosfat
glikogen
malonil
CoA
piruvična kislina
acetil CoA
emodin
emodin antron
oksidacija
protopsevdohipericin protohipericin
psevdohipericin hipericin
svetloba svetloba
temna žleza
zeleno tkivo
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
9
Struktura in značilnosti
Molekula hipericina ni planarna, saj stranske verige iz aromatskih skeletov odbijajo druga
drugo in na ta način preprečujejo, da bi molekula zavzela planarno konformacijo (16).
5
Slika 4: Oštevilčena struktura hipericina (5) in prikaz bay (pozicije 3, 4 in 10, 11) ter peri regije
(pozicije 6, 7, 8 ter 1, 13, 14) spojine
Molekula hipericina ima tako imenovani bay in peri regiji (slika 4). Ti dve regiji
predstavljata podskupini različnih kislosti. Kisla bay regija (hidroksilni skupini na pozicijah
3, 4), katere protoni so bolj kisli kakor hidroksilni protoni peri regije (pozicije 1, 6, 8, 13, ti
so bližje karbonilnim skupinam) (37, 38).
Hipericin lahko reagira z anorganskimi materiali na dva različna načina:
lahko tvori fenolate z njegovo kislo bay regijo,
ali pa vzpostavi kelatni tip koordinacijskega kompleksa na območju peri hidroksilnih
in karbonilnih skupin (38).
Pomemben faktor, ki prav tako lahko povzroči spremembe v strukturi naftodiantronov, je
pH. V kislem okolju pride do protonacije, v alkalnem pa do deprotonacije molekule
hipericina. Alkalno okolje pa povzroči hitro degradacijo psevdohipericina v raztopinah
standarda in ekstrakta (16).
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
10
Falk in sod. so raziskali deprotonacijo in protonacijo molekule hipericina ter ocenili pKa
vrednosti posameznih regij molekule hipericina. Po dodatku močne kisline (npr. vsaj 70 %
žveplove kisline) pride do mono oz. diprotonacije karbonilnih skupin (pKa = –5, –6,
C=OH+). Fenolna OH skupina bay regije je bolj kisla (pKa = 2) kot fenoli peri regije, zato
tukaj pride do monodeprotonacije, pri čemer je nastali fenolatni anion stabiliziran z vodikovo
vezjo z drugo fenolno skupino bay regije. Monodeprotonirana oblika je tako prevladujoča
oblika hipericina pri pH vrednostih med 2 in 10. Do dideprotonacije v bay in peri regiji pride
pri pH vrednostih med 11 in 13 (fenolne skupine peri regije imajo pKa ocenjeno na 11) (57).
5 (=OH+)2 5 5 bay–O– 5 bay–O–, peri–O–
Obe strukturi, tako anionska kot tudi nevtralna oblika, pa sta v obliki 7,14-diketo izomera
(slika 5, 21).
Slika 5: Od prisotnosti dovolj močne baze odvisno ravnotežje 7,14-diketo tavtomera hipericina
(Q7,14) in njegove stabilne anionske oblike (prirejeno po (21))
Molekula hipericina je nagnjena k tavtomernemu ravnotežju (keto-enol tavtomerija) (39).
Obstaja šestnajst teoretičnih tavtomerov hipericina, izmed katerih je najbolj stabilen 7,14-
diketo (Q7,14 ) tavtomer. Le-ta ima na 7. in 14. mestu pozicionirano karbonilno skupino.
Najstabilnejšemu tavtomeru Q7,14 sledita tavtomera Q1,7 in Q1,6 (40, 21).
V različnih topilih je pomembno poznati različne konformacijske, tavtomerne lastnosti, ki
so značilne za posamezna topila in tako interpretirati fotofizikalno obnašanje v vzbujenem
stanju, ki je odgovorno za biološko aktivnost spojine (21). Poznavanje strukturnih in
elektronskih lastnosti je pomembno tudi v primeru optimiziranja strategij za terapevtsko
aplikacijo (41).
pKa = 11 pKa = 2 pKa = -5, -6
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
11
Stabilnost
Raztopine standarda so stabilne pri temperaturi –20 °C v temi čez preiskovano časovno
obdobje 140 dni. Pri višjih temperaturah, ob prisotnosti svetlobe ali piridina, poteka
degradacija psevdohipericina pospešeno. Pri tem predstavlja najbolj agresivni faktor
prisotnost svetlobe. Hipericin v primerjavi s psevdohipericinom izkazuje večjo stabilnost,
do znižanja koncentracije hipericina pride le v primeru prisotnosti svetlobe. Obe spojini pa
sta bolj stabilni v ekstraktih (16). Večjo stabilnost naftodiantronov v ekstraktih si lahko
razlagamo zaradi prisotnosti različnih antioksidantov, zaradi katerih so radikalske reakcije,
ki lahko vplivajo na strukturo naftodiantronov, upočasnjene (42).
V študiji, ki je raziskovala vpliv svetlobe in pH-ja na različne strukture v metanolnih
izvlečkih šentjanževke, so Liu in sod. za naftodiantrone ugotovili sledeče:
nevtralni pH brez izpostavitve svetlobi; ni sprememb,
kisel pH brez izpostavitve svetlobi; ne pride do pretvorbe proto oblik v hipericin in
psevdohipericin, majhno znižanje AUC-ja,
nevtralni pH po izpostavitvi svetlobi; spojini z zaprto obročno strukturo (hipericin in
psevdohipericin) na začetku hitro narasteta na račun protohipericina in
protopsevdohipericina, ki imata odprto obročno strukturo,
kisel pH po izpostavitvi svetlobi; poteče pretvorba proto oblik v hipericin in
psevdohipericin, AUC hipericina in psevdohipericina pa se niža konstantno s časom
(14).
1.5 EKSTRAKT
1.5.1 STANDARDIZACIJA
Standardizacija kompleksnih mešanic rastlinskih materialov je izziv, saj so rastline
podvržene naravnim variacijam. Variacije med različnimi komercialnimi ekstrakti so
posledica različnih metod kultivacije, okoljskih faktorjev, časa cvetenja, postopka
ekstrakcije in shranjevanja (43). Od kakovosti pridobljene droge je izjemno pomembna
kakovost samega izvlečka (2). Večina produktov šentjanževke je še vedno standardiziranih
glede na vsebnost »totalnih hipericinov«, tj. vsote hipericina in psevdohipericina (44).
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
12
Ravno to predstavlja pereč problem in vzbuja skepticizem, saj številne študije dokazujejo,
da je za farmakološke učinke ekstrakta šentjanževke odgovornih več aktivnih skupin in ne
le hipericin. Vrednost totalnih hipericinov se določa po izpostavitvi vzorca svetlobi, saj tako
poteče pretvorba proto oblik hipericina in psevdohipericina. Kot že omenjeno, je znano, da
ob prisotnosti vidne svetlobe (400–750 nm) pride do pretvorbe protohipericina in
protopsevdohipericina v hipericin in psevdohipericin (25).
Kljub temu, da se zadnje čase daje poudarek antidepresivnemu učinku hiperforina,
informacije o vsebnosti hiperforina pogosto ni (45). Hiperforin se za standardizacijo
ekstraktov šentjanževke še ne uporablja rutinsko, najverjetneje zaradi njegove nestabilnosti,
zlasti ob prisotnosti svetlobe in kisika (24, 42, 7).
1.5.2 DELOVANJE EKSTRAKTA
Številne študije so pokazale, da je terapevtski učinek odvisen od načina priprave ekstrakta
in same farmacevtske oblike. Vodni ekstrakti, ki so bogati s hidrofilnimi spojinami
(flavonoidni glikozidi, tanini, fenoli), se uporabljajo pri prebavnih težavah (proti driski,
želodčnim bolečinam, menstrualnim težavam). Infuzi se uporabljajo kot obloge na slabo
celjene rane. Etanolni/metanolni vodni ekstrakti (50–80 %) v večji meri vsebujejo hipericin,
hiperforin, ksantone in flavonoide, ki imajo učinek na centralno živčni sistem ter se
uporabljajo za zdravljenje blage depresije (19).
1.5.3 TOPILO ZA EKSTRAKCIJO
Pri ekstrakcijskih mešanicah topil, ki vsebujejo več kot 50 % EtOH ali MeOH v vodi, je
vsebnost hipericina v ekstraktu neodvisna od deleža organske faze. Za razliko od hipericina
pa je vsebnost hiperforina močno odvisna od deleža organske faze (13). Optimalne količine
hipericina in psevdohipericina so bile pridobljene z 80 % MeOH pri temperaturi 80 °C
(46, 5). Najpogostejše metode ekstrakcije iz posušenih cvetov šentjanževke vključujejo
ekstrakcijo z uporabo metanola v vodni kopeli s stresanjem ali v ultrazvočni kadički (5).
V farmacevtske namene uporabljamo suhe izvlečke z razmerjem med drogo in izvlečkom
4–7:1, kot topilo pa se uporabljata metanol ali etanol (2).
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
13
2 NAMEN DELA
V magistrskem delu bomo z uporabo reverznofazne tekočinske kromatografije visoke
ločljivosti (RP-HPLC) proučevali vpliv sestave matriksa vzorca na analize standarda
hipericina in hipericina v ekstraktu šentjanževke. V ta namen bomo standardu hipericina in
ekstraktu šentjanževke dodajali različne koncentracije mešanice soli (0,25 %, 0,5 % in 1 %),
ki vsebuje natrijev klorid, magnezijev klorid, aluminijev sulfat in kalcijev karbonat, 0,5 %
posamezne komponente te mešanice, različne koncentracije aluminijevega sulfata (0,006 %,
0,025 %, 0,1 %, 0,25 % in 0,4 %), ocetno kislino in trietilamin. Zanimal nas bo vpliv teh
dodatkov na površino pod krivuljo standarda hipericina in hipericina v ekstraktu
šentjanževke. Nato bomo raziskali tudi vpliv stekla (uporaba različnih vial) na odziv
standarda hipericina.
Pri našem delu bomo uporabljali »metode A« in »metodo B«. Metoda B predstavlja
farmakopejsko metodo za hipericin in vsebuje fosfatni pufer, pH pa je uravnan na 2. Zaradi
ustreznejše pufrne kapacitete sklepamo, da bodo spremembe po različnih dodatkih k
standardu hipericina in k ekstraktu šentjanževke na AUC vrha hipericina pri tej metodi
manjše. Metoda A je bila razvita na Katedri za farmacevtsko biologijo in se sicer uporablja
pri analizi fagopirinov iz ajde, ki so strukturno zelo podobni hipericinu, vendar zanje
standard ni na razpolago in se v ta namen uporablja hipericin. Med raziskovanjem
fagopirinov so bile opažene določene naključne spremembe odziva v odvisnosti od matriksa
vzorca. V ta namen smo se odločili, da bomo metodo A uporabili tudi pri raziskovanju
hipericina, saj bi se lahko spremembe, ki so bile zaznane pri analiziranju fagopirinov,
razložile tudi na podlagi opažanj sprememb pri hipericinu.
To magistrsko delo bo nadaljnje raziskovanje že opravljene diplomske naloge Andraža
Počiča na to temo (»Vpliv matriksov vzorca na analizo standarda hipericina in ekstraktov
šentjanževke s tekočinsko kromatografijo visoke zmogljivosti«), kjer so bile zaznane
določene spremembe odziva hipericina v odvisnosti od sestave matriksa vzorca in stekla
(58). Naš namen bo rezultate te diplomske naloge raziskati dalje oziroma jih potrditi ali
ovreči.
V prvem delu magistrske naloge bomo pripravili osnovno raztopino standarda in izvedli
ekstrakcijo hipericina iz šentjanževke ter naredili osnovne raztopine dodatkov. Vzorce bomo
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
14
analizirali s pomočjo tekočinske kromatografije visoke ločljivosti. Sledila bo obdelava
dobljenih kromatogramov in primerjava kromatografskih vrhov hipericina. Morebitne
dobljene značilne spremembe bomo poskušali pojasniti tudi s pomočjo podatkov iz
literature.
Naš cilj bo torej s pomočjo reverznofazne tekočinske kromatografije visoke ločljivosti
ugotoviti vpliv posameznih dodatkov in stekla na kromatografski vrh hipericina.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
15
3 MATERIALI IN METODE
3.1 MATERIALI
3.1.1 RASTLINSKI MATERIAL
Šentjanževko (Hypericum perforatum L., slika 6) smo nabrali ob suhem, lepem vremenu v
času cvetenja na Koroškem nad krajem Vuhred (kmetija »Brdnik«, junij 2014). Sušila se je
en teden v suhem, senčnem, čistem in zračnem prostoru na podstrešju. Pri eksperimentalnem
delu – izdelavi ekstrakta, smo uporabili posušene zmlete cvetove šentjanževke, saj se v njih
nahaja najvišja količina preiskovane spojine – hipericina (17).
Slika 6: Posušena šentjanževka, rastlinski material za pripravo ekstrakta
3.1.2 REAGENTI IN TOPILA
Topila za ekstrakcijo
Metanol, p.a. (Panreac, Barcelona, Španija)
Prečiščena voda (Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani)
Topila in reagenti za mobilne faze
Voda, p.a. (J. T. Baker, Deventer, Nizozemska)
Acetonitril, p.a. (J. T. Baker, Deventer, Nizozemska)
Voda, p.a. (Panreac, Barcelona, Španija)
Acetonitril, p.a. (Panreac, Barcelona, Španija)
Trifluoroocetna kislina (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija)
Etilacetat, p.a. (Carlo Erba, Milano, Italija)
Natrijev dihidrogenfosfat (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija)
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
16
Metanol, p.a. (Carlo Erba, Milano, Italija)
Ortofosforna kislina (Fluka, Buchs, Švica)
Standard
Hipericin (PhytoLab, Vestenbergsgreuth, Nemčija)
Soli
NaCl (Carlo Erba, Milano, Italija)
MgCl26H2O (Kemika, Zagreb, Hrvaška)
Al2(SO4)318H2O (Kemika, Zagreb, Hrvaška)
CaCO3 (KEFO, Ljubljana, Slovenija)
Kislina
Ocetna kislina (Merck, Darmstadt, Nemčija)
Baza
Trietilamin (Sigma-Aldrich, Steinheim, Nemčija)
Voda
Prečiščena voda (Fakulteta za farmacijo, Univerza v Ljubljani)
Metanol
Metanol (Panreac, Barcelona, Španija)
3.1.3 APARATURE IN LABORATORIJSKA OPREMA
Homogeniziranje
Mlinček za homogenizacijo droge IKA A10 (IKA-Werke, Staufen, Nemčija)
Tehtanje
Analitska tehtnica XS205 DualRange (Mettler Toledo, Zürich, Švica)
Precizna tehtnica AX4202 (Sartorius, Goettingen, Nemčija)
Centrifugiranje
Centrifuga Centric 200R (Tehtnica, Železniki, Slovenija)
Centrifuga Centric 400R (Tehtnica, Železniki, Slovenija)
Stresanje
Stresalnik Vibromix 40 (Tehtnica, Železniki, Slovenija)
Soniciranje
Ultrazvočna kad Bandelin Sonorex Digitec (Bandelin, Berlin, Nemčija)
Rotavapiranje
Rotavapor R-200 (Büchi, Flawil, Švica)
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
17
Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti (HPLC)
Sistem UFLC XR Shimadzu 20 AD XR (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japonska):
- detektor Diode Array SPD-M20A,
- fluorescenčni detektor RF-10A XL,
- zbiralec frakcij FRC-10A.
Kolona Phenomenex Kinetex 2,6 μm C18 100 Å (1004,60 mm) S/N 528234-58,
B/N 5569-138 (Phenomenex, Torrance, CA, ZDA)
Računalniški program LC Solution Shimadzu 1,24 SP1 (Shimadzu Corporation,
Kyoto, Japonska)
Spektrofotometrično merjenje absorbance
Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, USA)
3.1.4 MATERIAL ZA HPLC ANALIZE VZORCEV
Injekcijske igle
Plastične epruvete (1,5 mL)
Temna viala z vgrajenim insertom Chromacol (pri vseh analizah)
Steklene viale različnih proizvajalcev (pri raziskovanju morebitnega vpliva stekla na
odziv standarda hipericina na detektorju, poglavje 4.2.3):
- temna viala brez inserta, Supelco SU 860033,
- temna viala brez inserta, La-Pha-Pack 11 09 0520,
- temna viala z dodanim insertom, viala Supelco SU 860033, insert Supelco SU
860066,
- temna viala z vgrajenim insertom, Chromacol 03-FIRV(A),
- prozorna viala brez inserta, Supelco SU 854165,
- prozorna viala brez inserta, Chromacol 2-SVW,
- prozorna viala brez inserta, La-Pha-Pack 11 09 0519.
3.1.5 DRUGO
Bučke, erlenmajerice, čaše, steklene palčke, plastične epruvete (15 mL, 50 mL),
čolnički, steklene pipete, žogica za pipetiranje, pincete, spatule, avtomatska pipeta
(Biohit-Proline, Helsinki, Finska), nastavki za pipeto, filtri za injekcijske brizge,
injekcijske brizge.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
18
3.2 METODE
3.2.1 PRIPRAVA OSNOVNIH RAZTOPIN
Standard hipericina
0,65 mg standarda hipericina smo raztopili v 41,6 mL MeOH (dodajali smo ga postopoma,
41,6 mL predstavlja končni dodan volumen).
Postopek priprave osnovne raztopine standarda:
Na analitski tehtnici smo na čolniček natehtali 0,65 mg standarda hipericina, ga prenesli v
50 mL plastično epruveto in mu postopoma dodajali MeOH. Med postopnim raztapljanjem
smo raztopino večkrat postavili v UZ kadičko in sonificirali ter nato centrifugirali (5 min,
4500 rpm, 24 °C). S tem smo preverjali ali je usedlina še vedno prisotna in ali je za raztopitev
le-te potreben dodatek MeOH. Končni dodan volumen MeOH je bil 41,6 mL. Plastično
epruveto smo nato ponovno za 5 minut sonificirali. Vzorec smo še zadnjič centrifugirali
(5 min, 4500 rpm, 24 °C), da bi preverili, če se je ves hipericin raztopil. Tako pripravljeno
osnovno raztopino standarda smo hranili v hladilniku v 50 mL plastični epruveti (slika 7).
Slika 7: Pripravljena osnovna raztopina standarda v 50 mL plastični epruveti
Ekstrakt šentjanževke
Ekstrakt šentjanževke smo pripravili tako, da smo iz stebel rastlinskega materiala
(poglavje 3.1.1) postrgali cvetove in jih približno 1 minuto mleli v mlinčku za
homogenizacijo droge. Nato smo 1 g zmlete droge prenesli v 15 mL plastično epruveto in
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
19
dodali 10 mL 80 % MeOH. 30 minut smo sonificirali na temperaturi 50 °C, stresali na
stresalniku 15 min, nato pa centrifugirali (5 min, 3000 rpm, 25 °C). Supernatant smo prenesli
v bučko. Topilo smo odstranili pri znižanem tlaku. Suhi preostanek je znašal 0,18 g. Ekstrakt
smo postopoma raztopili v 21,43 mL MeOH, prenesli v 50 mL plastično epruveto,
sonificirali 5 min in centrifugirali (5 min, 3000 rpm, 25 °C). Supernatant smo prenesli v 50
mL plastično epruveto in za 8 minut izpostavili ksenonski svetlobi (765 W/m2). Z
izpostavitvijo svetlobi pride do pretvorbe protohipericina v hipericin in
protopsevdohipericina v psevdohipericin. Takšen način priprave ekstrakta preprečuje, da bi
do ciklizacije na svetlobi prišlo šele po opravljenih analizah. Tako pripravljen ekstrakt smo
hranili v hladilniku.
Opomba: Mletja cvetov šentjanževke smo se poslužili z namenom, da povečamo površino
droge in s tem izboljšamo ekstrakcijo.
Ocetna kislina, 10 v/v %
V 10 mL bučko smo odpipetirali 0,5 mL ocetne kisline in 4,5 mL MeOH. Dobili smo
osnovno raztopino ocetne kisline (0,1 mL ocetne kisline/mL raztopine oz. 0,1 μL ocetne
kisline/μL raztopine). Raztopino ocetne kisline smo pripravljali sproti, tik preden smo vzorce
začeli pripravljati v viale.
Trietilamin (TEA), 10 v/v %
V 10 mL bučko smo odpipetirali 0,5 mL trietilamina in 4,5 mL MeOH. Dobili smo osnovno
raztopino TEA (0,1 mL TEA/mL raztopine oz. 0,1 μL TEA/μL raztopine). Raztopino
trietilamina smo pripravljali sproti, tik preden smo vzorce začeli pripravljati v viale.
Raztopine posameznih soli, 0,5 ut/vol %
V 50 mL plastične epruvete smo posebej natehtali 250 mg vsake od naslednjih soli: natrijev
klorid, magnezijev klorid, aluminijev sulfat in kalcijev karbonat. Dodali smo 50 mL
prečiščene vode in 10 minut sonificirali. Vsako posamezno raztopino soli smo nato
prefiltrirali skozi filter s porami 0,45 µm. Dobili smo 0,5 % raztopine posameznih soli, ki
smo jih shranjevali v 50 mL plastičnih epruvetah na sobni temperaturi v omarici. Iz 0,5 %
aluminijevega sulfata smo pripravili še nižje koncentracije te soli. Postopek priprave je
prikazan v preglednici II.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
20
Preglednica II: Priprava nižjih koncentracij aluminijevega sulfata iz 0,5 % aluminijevega sulfata
Ime vzorca V (0,5 % aluminijev sulfat) [mL] V (H2O) [mL]
0,4 % 8 2
0,25 % 5 5
0,1 % 2 8
0,025 % 0,5 9,5
0,006 % 0,125 9,875
Raztopine različnih koncentracij aluminijevega sulfata smo shranjevali v 15 mL plastičnih
epruvetah na sobni temperaturi v temnem prostoru (v omarici).
Raztopina mešanice soli, 1 ut/vol %
Pripravili smo 1 % mešanico naslednjih soli: natrijev klorid, magnezijev klorid, aluminijev
sulfat in kalcijev karbonat. 250 mg vsake soli smo posamično natehtali na čolniček in
prenesli v 100 mL bučko ter s prečiščeno vodo dopolnili do oznake. Bučko smo za 10 minut
postavili v ultrazvočno kadičko. Raztopino smo nato prefiltrirali skozi filter s porami
0,45 µm. Dobili smo 1 % raztopino mešanice soli. Iz dobljene 1 % raztopine mešanice soli
smo pripravili še 0,5 % in 0,25 % raztopino mešanice soli. Količine so navedene v
preglednici III.
Preglednica III: Priprava različnih koncentracij mešanice soli iz 1 % osnovne raztopine
mešanice soli
Ime vzorca V (1 % osnovna raztopina mešanice soli) [mL] V (H2O) [mL]
1 % mešanica soli 10 0
0,5 % mešanica soli 5 5
0,25 % mešanica soli 2,5 7,5
0 % mešanica soli (slepa) 0 10
Raztopine smo shranjevali v 15 mL plastičnih epruvetah, v temnem prostoru in na sobni
temperaturi (v omarici).
Opomba: Obstajala je možnost vpliva stekla oziroma plastike na vzorec, zato smo vse
osnovne raztopine (razen kisline in baze) shranjevali v plastičnih epruvetah (slika 8). Želeli
smo, da bi bil morebitni vpliv materiala, v katerem shranjujemo vzorce, na vse enak.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
21
Slika 8: Pripravljene osnovne raztopine različnih koncentracij mešanice soli, različnih koncentracij
aluminijevega sulfata (v 15 mL plastičnih epruvetah), 0,5 % posameznih soli (v 50 mL plastičnih
epruvetah), ocetne kisline in trietilamina (v bučkah)
3.2.2 PRIPRAVA VZORCEV STANDARDA IN EKSTRAKTA ZA ANALIZE
V 1,5 mL plastične epruvete smo pripravili po 400 µL vsakega vzorca po postopku
prikazanem v preglednici IV.
Preglednica IV: Priprava vzorcev standarda/ekstrakta z različnimi dodatki
Različni dodatki Ime vzorca V (standard
ali ekstrakt)
[µL]
V (dodatek)
[µL]
V(MeOH)
[µL]
Brez dodatka Standard ali ekstrakt 200 / 200
Dodatek vode H2O 200 20 180
Dodatek različnih
koncentracij mešanice
soli
1 % sol 200 20 180
0,5 % sol 200 20 180
0,25 % sol 200 20 180
Dodatek 0,5 %
posameznih komponent
mešanice soli
0,5 % NaCl 200 20 180
0,5 % MgCl2 200 20 180
0,5 % Al2(SO4)3 200 20 180
0,5 % CaCO3 200 20 180
Dodatek nižjih
koncentracij
aluminijeve soli
0,4 % Al2(SO4)3 200 20 180
0,25 % Al2(SO4)3 200 20 180
0,1 % Al2(SO4)3 200 20 180
0,025 % Al2(SO4)3 200 20 180
0,006 % Al2(SO4)3 200 20 180
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
22
Dodatek kisline in baze
0,5 % ocetna kislina 200 20 180
0,25 % ocetna kislina 200 10 190
1 % TEA 200 40 160
0,5 % TEA 200 20 180
Vzorce v 1,5 mL plastičnih epruvetah smo centrifugirali (5 min, 10000 rpm, 24 °C). Po
centrifugiranju smo si raztopine dobro ogledali in opažanja tudi fotografirali. Po 100 µL
vsakega vzorca smo iz 1,5 mL plastične epruvete prenesli v temne viale z vgrajenimi inserti
(slika 9 in 10) in po približno 24 urah (hranili smo jih v hladilniku) analizirali po metodah A
in metodi B (metodi sta opisani v poglavju 3.2.4). Preostalim supernatantom v plastičnih
epruvetah smo pomerili absorbanco po metodi, ki je opisana v naslednjem poglavju.
Opomba: Osnovno raztopino standarda/ekstrakta in vse osnovne raztopine soli smo pred
uporabo in pripravo vzorcev še centrifugirali (5 min, 3000 rpm, 24 °C). Odstotki ocetne
kisline (0,25 % in 0,5 %) in trietilamina (0,5 % in 1 %) predstavljajo končno koncentracijo
v raztopini.
Slika 9: Pripravljeni vzorci standarda za HPLC analize
Slika 10: Pripravljeni vzorci ekstrakta za HPLC analize
3.2.3 SPEKTROFOTOMETRIČNO MERJENJE ABSORBANCE
Spektrofotometrično merjenje absorbance smo izvajali na napravi Nanodrop ND-1000
(Fakulteta za farmacijo), UV-VIS spektrofotometru, ki omogoča zelo natančne analize
majhnih volumnov vzorcev. Uporablja tehnologijo zadrževanja vzorcev na mestu zaradi
površinske napetosti, kar odpravlja potrebo po uporabi kivet. Zaradi majhnega volumna
vzorca, ki smo ga imeli na voljo, nam je način analize brez uporabe kivet predstavljal
optimalno rešitev za merjenje absorbance vzorcev.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
23
Merili smo absorbanco vzorcev standarda in ekstrakta po celotnem UV-VIS spektru (220–
750 nm). Iz preostalih vzorcev v 1,5 mL plastičnih epruvetah (poglavje 3.2.2), smo z
avtomatsko pipeto odpipetirali po 4 µL vzorca direktno na površino za merjenje in jih
analizirali. Kot slepo raztopino smo uporabili 90 % metanol.
3.2.4 TEKOČINSKA KROMATOGRAFIJA VISOKE LOČLJIVOSTI (HPLC)
Tekočinska kromatografija visoke ločljivosti temelji na detekciji in ločevanju spojin v tekoči
fazi in predstavlja eno izmed najbolj pogosto uporabljenih analiznih tehnik. Pri
eksperimentalnem delu smo vzorce analizirali z reverznofazno tekočinsko kromatografijo
visoke ločljivosti (RP-HPLC), ki je daleč najpogostejša in obsega največji odstotek aplikacij
HPLC. Pri RP-HPLC imamo nepolarno stacionarno fazo in polarno mobilno fazo, kar vpliva
na obratni vrstni red elucije posameznih komponent kot pri normalnofazni kromatografiji
(48, 49). Polarne spojine se iz kolone izločijo prej, medtem ko se manj polarne dalj časa
zadržujejo na koloni in je posledično njihov retencijski čas daljši. Pri RP-HPLC kot mobilno
fazo uporabljamo mešanico vode in organskega topila. Najpogosteje se uporablja mešanica
acetonitrila in vode ali metanola in vode. Od razmerja mešanice topil je odvisen čas elucije
določene spojine. Retencijski čas je odvisen tudi od fizikalno-kemijskih lastnosti spojine in
je karakteristična značilnost analizirane spojine, ki ga uporabljamo za identifikacijo (47).
HPLC sistem (slika 11) sestavljajo naslednje komponente:
rezervoar za mobilno fazo,
razplinjevalec mobilne faze,
injektor (injicira vzorec na kromatografsko kolono),
črpalka (poganja mobilno fazo skozi sistem),
kromatografska kolona (poteka ločevanje komponent vzorca),
termostat,
rezervoar za odpadna topila,
detektor (zazna komponente vzorca),
in instrument za zapis signala, programska oprema za obdelavo podatkov.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
24
Slika 11: Aparatura za tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti na Katedri za farmacevtsko
biologijo
3.2.4.1 HPLC metode za analize vzorcev
»Metode A«
Vsem metodam A so bili skupni naslednji parametri:
pretok 2 mL/min, volumen injiciranja 5 μL, temperatura kolone 40 °C,
detekcija na UV-VIS detektorju pri 590 nm, na fluorescenčnem detektorju pri
ekscitacijski valovni dolžini 330 nm in emisijski valovni dolžini 590 nm.
Topilo A: voda, 2 % acetonitrila, 0,1 % TFA.
Topilo B: acetonitril, 2 % vode, 0,1 % TFA.
Metoda 1: izokratska elucija, mobilna faza A/B (3/7), čas trajanja analize 6 min.
Metoda 2: izokratska elucija, mobilna faza A/B (2/3), čas trajanja analize 15 min.
Metoda 3: izokratska elucija, mobilna faza A/B (1/1), čas trajanja analize 30 min.
»Metoda B« (metoda po Ph. Eur. 8.0, glej prilogo)
Parametri metode B:
pretok 1 mL/min, volumen injiciranja 20 μL, temperatura kolone 40 °C,
detekcija na UV-VIS detektorju pri 590 nm, na fluorescenčnem detektorju pri
ekscitacijski valovni dolžini 330 nm in emisijski valovni dolžini 590 nm.
Metoda B: izokratska elucija, mobilna faza etilacetat/raztopina natrijevega dihidrogenfosfata
(15,6 g/L)/metanol (39/41/160), pH = 2 (uravnan s fosforno kislino), čas trajanja analize 15
min.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
25
4 REZULTATI IN RAZPRAVA
4.1 OPAŽANJA PRI PRIPRAVI VZORCEV
4.1.1 PRIPRAVA OSNOVNE RAZTOPINE STANDARDA
Med pripravo osnovne raztopine standarda hipericina smo MeOH dodajali postopoma,
dokler se standard hipericina ni popolnoma raztopil (opisano v poglavju 3.2.1). Volumen
porabljenega MeOH je bil 41,6 mL na 0,65 mg standarda hipericina (15,6 µg/mL), kar se
ujema s podatki iz literature, kjer je navedeno, da se v čistem MeOH raztopi maksimalno
37,17 µg/mL. Glede na informacije, ki jih posreduje članek, bi bilo morda smiselno standard
hipericina raztopiti v mešanici MeOH in piridina (99:1), saj piridin precej poveča topnost
hipericina. Topnost hipericina se v tem primeru poveča na 320,91 µg/mL, vendar v primeru
dodatka piridina pride do pospešene degradacije psevdohipericina (50).
4.1.2 PRIPRAVA VZORCEV STANDARDA IN EKSTRAKTA ZA ANALIZE
Vzorce za HPLC analize smo pripravljali v 1,5 mL plastične epruvete, ki smo jih
centrifugirali (5 min, 10000 rpm, 24 °C) in nato prenesli del v viale ter s tem preprečili
morebitni nanos delcev na HPLC kolono in druge težave oziroma napačne rezultate, ki bi
lahko bili posledica tega.
Med pripravo vzorcev standarda v 1,5 mL plastične epruvete smo opazili, da so nekatere
raztopine spremenile barvo (iz rožnate v modrikasto, slika 12). Ta sprememba se je zgodila
pri vseh koncentracijah mešanice soli in pri vseh koncentracijah aluminijevega sulfata. Iz
tega lahko sklepamo, da je bil za spremembo barve odgovoren dodatek aluminijevega
sulfata.
Slika 12: Spremembe barv vzorcev standarda hipericina po različnih dodatkih
mešanice soli posamezne soli
(NaCl, MgCl2, CaCO3)
različne koncentracije aluminijevega
sulfata kislina baza
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
26
Pri pripravi vzorcev ekstrakta v plastične epruvete pa se je opazna sprememba barve zgodila
po dodatku baze (iz svetlejše rdeče v temnejšo rdečerjavo, slika 13).
Slika 13: Spremembe barv vzorcev ekstrakta šentjanževke po različnih dodatkih
4.2 ANALIZA STANDARDA HIPERICINA
Na Katedri za farmacevtsko biologijo so tekom raziskovanja fagopirinov iz ajde opažali, da
med HPLC analizami na vidnost fagopirinov na detektorju vplivajo različni dejavniki. Ker
za fagopirine ni ustreznega referenčnega standarda, so pojav pričeli raziskovati na fagopirinu
podobni spojini, hipericinu, in sicer v sklopu diplomske naloge Andraža Počiča. Pojav smo
nadalje raziskovali v tej magistrski nalogi. Ugotavljali smo, ali matriks, v katerem se nahaja
hipericin, vpliva na vidnost hipericina na detektorju, zato smo k standardu hipericina dodali
različne koncentracije mešanice soli, 0,5 % posamezne komponente mešanice soli, različne
koncentracije aluminijevega sulfata, ocetno kislino in trietilamin. Vzorce smo analizirali z
različno dolgimi metodami (metode A, poglavje 3.2.4), da bi videli, ali dolžina metode vpliva
na odziv hipericina na detektorju. Prav tako smo pri analizah uporabili farmakopejsko
metodo (metoda B, poglavje 3.2.4).
V vseh vzorcih je bila enaka koncentracija standarda hipericina, vendar so bili odzivi na
detektorju ponekod različni. Posneli smo kromatograme standarda hipericina z različnimi
dodatki in želeli ugotoviti, ali ima matriks, v katerem se nahaja hipericin v vzorcih, vpliv na
njegovo površino pod krivuljo.
mešanice soli posamezne soli
(NaCl, MgCl2, CaCO3)
različne koncentracije aluminijevega
sulfata kislina baza
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
27
4.2.1 DODATKI SOLI K STANDARDU HIPERICINA
Zanimal nas je vpliv dodatka različnih soli na kromatogram oziroma na kromatografski vrh
hipericina. V temne viale z vgrajenim insertom smo k standardu hipericina dodali različne
koncentracije mešanice soli (0,25 %, 0,5 %, 1 %), 0,5 % posamezne komponente te mešanice
soli in nižje koncentracije aluminijevega sulfata (postopek priprave vzorcev je opisan pod
poglavjem 3.2.2) ter analizirali po metodah A in metodi B.
4.2.1.1 Dodatki različnih koncentracij mešanice soli ter posameznih komponent te
mešanice
Graf 1 prikazuje vpliv dodatkov različnih koncentracij mešanice soli (0,25 %, 0,5 %, 1 %)
in 0,5 % posameznih komponent te mešanice na odziv hipericina po metodi 1, 2 in 3. Iz
grafa 1 lahko vidimo, da večina dodatkov ne vpliva značilno na AUC standarda hipericina,
razen dodatka aluminijevega sulfata. Po dodatku te soli se je odziv pri vseh metodah znižal
skoraj za 90 % glede na standard brez dodatka. Sklepamo, da je zaradi dodatka aluminijeve
soli hipericin tvoril kompleks oz. se je spremenila njegova struktura. Kompleks oz.
spremenjena struktura imata lahko različno specifično fluorescenco in posledično se je znižal
odziv pri retencijskem času osnovne oblike hipericina, nastala pa je nova spojina, ki ima
krajši retencijski čas. Ostali dodatki niso presegli 10 % spremembe AUC-ja glede na
standard brez dodatka. Zaradi vpliva, ki ga ima dodatek aluminijevega sulfata na odziv
hipericina, smo se odločili pripraviti in raziskati še nižje koncentracije te soli.
Graf 1: Standard hipericina in vpliv različnih koncentracij mešanice soli in 0,5 % posamezne
komponente te mešanice na AUC standarda po metodah A (metoda 1, 2 in 3)
0
2.000.000
4.000.000
6.000.000
8.000.000
10.000.000
12.000.000
brez
dodatka
H2O 0,25% sol 0,5% sol 1% sol 0,5% NaCl 0,5%
MgCl2
0,5%
CaCO3
0,5%
Al2(SO4)3
AU
C
Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih soli, metoda 1, 2 in 3,
fluorescenčni detektor
6 min 15 min 30 min
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
28
Pri vseh treh metodah (metoda 1, metoda 2, metoda 3) so vplivi na površine pod krivuljo
standarda hipericina zelo podobni. Iz tega sklepamo, da dolžina oz. trajanje metode nima
večjega vpliva na odziv standarda hipericina po dodatkih različnih soli. Najbolj optimalna
izmed metod A bi torej lahko bila metoda 1, ki je najkrajša in imamo z njo posledično
najmanjšo porabo mobilne faze in s tem najnižje stroške.
Rezultate, ki smo jih dobili pri farmakopejski metodi (metoda B), prikazuje graf 2. Vpliv
aluminijevega sulfata na odziv hipericina na detektorju je pri tej metodi manjši. Odziv se v
tem primeru zniža za okoli 50 % v primerjavi s standardom brez dodatka, kar je precej manj
kot pri metodah 1, 2 in 3. Dodatki ostalih soli k standardu hipericina tudi tukaj nimajo
občutnega vpliva na njegovo površino pod krivuljo.
Graf 2: Standard hipericina in vpliv različnih koncentracij mešanice soli in 0,5 % posamezne
komponente te mešanice na AUC standarda po metodi B
Na grafu 3 je prikazana primerjava vplivov med metodami A in metodo B. Mobilna faza, ki
jo uporabljamo pri metodi B je pufer in vsebuje fosfatne ione, ki bi lahko interagirali z
aluminijevimi ioni in s tem preprečili nastanek kompleksa med hipericinom in aluminijevimi
ioni. Pri metodi A v mobilni fazi ni pufra, zato je več hipericina kompleksiralo aluminijeve
ione, kar se na kromatogramu odraža kot večje znižanje AUC-ja hipericina.
0
200.000
400.000
600.000
800.000
1.000.000
1.200.000
1.400.000
0
100.000
200.000
300.000
400.000
500.000
600.000
700.000
800.000
900.000
AU
C (
flu
ore
scen
čni
det
ekto
r)
AU
C (
abso
rban
čni
det
ekto
r)
Standard hipericina in vpliv različnih dodatkov soli, metoda B
absorbančni detektor
fluorescenčni detektor
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
29
Graf 3: Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih soli na njegov AUC. Primerjava vplivov med
različnimi metodami (metode A in metoda B). Na levi (primarni) navpični osi je podan odziv za
metode A, na desni (sekundarni) navpični osi pa je podan odziv za metodo B.
V naslednjem koraku smo se zaradi značilnega vpliva aluminijevega sulfata na
kromatografski vrh hipericina odločili pripraviti in analizirati nižje koncentracije te soli.
4.2.1.2 Dodatki različnih koncentracij aluminijevega sulfata
Dodatek aluminijevega sulfata k standardu hipericina je izmed vseh dodanih soli povzročil
najbolj značilno spremembo odziva hipericina na detektorju. Želeli smo podrobneje raziskati
vpliv aluminijevega sulfata, zato smo k standardu dodali nižje koncentracije te soli. V temne
viale z insertom smo k standardu hipericina dodali 0,006 %, 0,025 %, 0,1 %, 0,25 %, 0,4 %
in 0,5 % aluminijevega sulfata (poglavje 3.2.2). Vzorce smo analizirali po metodah A in
metodi B.
Graf 4: Standard hipericina in vpliv različnih koncentracij aluminijevega sulfata na površino pod
krivuljo, metoda 1
0
200.000
400.000
600.000
800.000
1.000.000
1.200.000
1.400.000
0
2.000.000
4.000.000
6.000.000
8.000.000
10.000.000
12.000.000
AU
C (
met
od
a B
)
AU
C (
met
od
e A
)
Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih soli, metode A in metoda B,
fluorescenčni detektor
metoda 1 metoda 2 metoda 3 metoda B
0
2.000.000
4.000.000
6.000.000
8.000.000
10.000.000
12.000.000
0
10.000
20.000
30.000
40.000
50.000
60.000
70.000
brez
dodatka
0,006% 0,025% 0,1% 0,25% 0,4% 0,5%
AU
C (
flu
ore
scen
čni
det
ekto
r)
AU
C (
abso
rban
čni
det
ekto
r)
Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega
sulfata, metoda 1
absorbančni detektor
fluorescenčni detektor
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
30
Graf 4 prikazuje kako dodatki različnih koncentracij aluminijevega sulfata vplivajo na
površino pod krivuljo standarda hipericina po metodi 1. Razberemo lahko, da je najmanjši
vpliv na odziv pri najnižji koncentraciji aluminijeve soli (0,006 %), kar smo pričakovali
(znižanje za okrog 60 % glede na standard brez dodatka). Pri ostalih dodatkih pa lahko iz
grafa razberemo, da se odzivi pri vseh znižajo za približno 90 % glede na standard brez
dodatka. Iz tega lahko sklepamo, da že dodatek 0,1 % aluminijevega sulfata povzroči
kvantitativno pretvorbo hipericina, zaradi česar so odzivi pri vseh nadaljnjih dodanih
koncentracijah podobni. Ko reakcija enkrat poteče do konca, vsak nadaljnji dodatek ne
vpliva več bistveno na površino pod krivuljo hipericina.
Tudi pri metodi 2 in 3 je situacija podobna. Najmanjše znižanje povzroči dodatek 0,006 %
aluminijeve soli (okrog 60 % glede na standard brez dodatka), ostali dodatki pa ravno tako
kot pri metodi 1 znižajo odziv na detektorju za okrog 90 %. Iz tega lahko sklepamo, da
dolžina metode ne vpliva na površino pod krivuljo standarda hipericina. Prav tako
predvidevamo, da je prišlo do pretvorbe hipericina v kompleks z aluminijem.
Pri metodi B (graf 5) največje znižanje povzroči 0,025 % aluminijeva sol (90 % glede na
standard brez dodatka), najmanjše pa 0,5 % aluminijeva sol (50 % glede na standard brez
dodatka). Pri metodi B so znižanja odzivov pri ostalih dodatkih aluminijevih soli manjša kot
pri metodah A.
Graf 5: Vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega sulfata na AUC standarda hipericina,
metoda B
0
200.000
400.000
600.000
800.000
1.000.000
1.200.000
1.400.000
0
100.000
200.000
300.000
400.000
500.000
600.000
700.000
800.000
900.000
brez
dodatka
0,006% 0,025% 0,1% 0,25% 0,4% 0,5%
AU
C (
flu
ore
scen
čni
det
ekto
r)
AU
C (
abso
rban
čni
det
ekto
r)
Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega
sulfata, metoda B
absorbančni detektor fluorescenčni detektor
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
31
Graf 6: Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega sulfata na njegov
AUC. Primerjava vplivov med različnimi metodami (metode A in metoda B). Na levi (primarni)
navpični osi je podan odziv za metode A, na desni (sekundarni) navpični osi pa je podan odziv za
metodo B.
Opazili smo, da je bil pri analiziranju izredno pomemben tudi čas, kako dolgo smo pustili
vzorec z dodatkom aluminijeve soli stati. Pri prehitro injiciranem vzorcu pretvorba še ni
potekla do konca, kar se je odražalo na kromatografskem vrhu hipericina, katerega AUC se
do takrat še ni znižal. Vzorec namreč potrebuje nekaj časa, da se stabilizira, oziroma da
pretvorba poteče do konca. Pri metodah 1, 2 in 3, smo na kromatogramu po dodatku
aluminijeve soli zasledili nov kromatografski vrh, za katerega sklepamo, da pripada
novonastali spojini – kompleksu hipericina z aluminijem. Hipericin lahko tvori kelatne
koordinacijske komplekse z aluminijem, ki vključujejo peri hidroksi in okso skupine
(pozicije 1, 6, 8, 13 in 7, 14) (38).
Slika 14: Kromatogram standarda hipericina po dodatkih različnih koncentracij aluminijevega
sulfata, metoda 1
0
200.000
400.000
600.000
800.000
1.000.000
1.200.000
1.400.000
0
2.000.000
4.000.000
6.000.000
8.000.000
10.000.000
12.000.000
brez
dodatka
0,006% 0,025% 0,1% 0,25% 0,4% 0,5%
AU
C (
met
od
a B
)
AU
C (
met
od
e A
)
Standard hipericina in vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega
sulfata, metode A in metoda B, fluorescenčni detektor
metoda 1 metoda 2 metoda 3 metoda B
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
110000
120000
130000
140000
150000
uV
hipericin
kompleks hipericina z aluminijem
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
32
Na sliki 14 je na desni strani kromatograma prikazan kromatografski vrh hipericina. Na levi
strani pa je nastal nov kromatografski vrh, ki najverjetneje pripada kompleksu hipericina z
aluminijem. Pri kromatografskem vrhu hipericina od določene koncentracije aluminijevega
sulfata naprej pričakujemo enak odziv, saj je količina aluminijeve soli dovolj velika za
kvantitativno pretvorbo hipericina. Kvantitativno pretvorbo hipericina pri nas povzroči
dodatek 0,1 % aluminijevega sulfata. V primeru nastanka nove spojine je vpliv različnih
koncentracij aluminijevih soli v skladu s količino nastale spojine (pri metodah A). Pri najvišji
dodani koncentraciji aluminijevega sulfata k standardu hipericina je nastala najvišja
koncentracija nove spojine itd. (graf 9), vendar tudi tukaj opazimo, da graf ne narašča
konstantno strmo, temveč pri določenih koncentracijah prihaja do fenomena nasičenja.
V skladu s temi rezultati lahko interpretiramo batokromne premike, ki smo jih opazili, ko
smo posneli absorbance po celotnem UV-VIS spektru (graf 7). Batokromni efekt bi tako
lahko bil posledica tvorbe peri kompleksa hipericina z aluminijem. Iz spektrov lahko ravno
tako razložimo spremembo barve, ki smo jo opazili pri pripravi vzorcev standarda (poglavje
4.1.2). Barva vzorcev, ki smo jim dodali aluminijevo sol, se je namreč iz rožnate obarvala v
modrikasto, kar pomeni, da se je absorbirana svetloba pomaknila k rdečemu delu spektra
(rdeči premik) oz. k višjim valovnim dolžinam, kar je razvidno tudi iz dobljenega UV-VIS
spektra. Hipericin je obarvan in ob prisotnosti aluminija tvori kompleks, aluminij v
kompleksu pa vpliva na porazdelitev elektronske gostote v konjugiranem sistemu hipericina,
kar ima za posledico premik absorpcijskega maksimuma in spremembo njegove intenzitete.
Graf 7: Celoten UV-VIS spekter po dodatkih različnih koncentracij aluminijevega sulfata k
standardu hipericina
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Ab
sorb
anca
Valovna dolžina [nm]brez dodatka H2O 0,006% 0,025%0,1% 0,25% 0,4% 0,5%
standard brez
dodatkadodatki različnih
koncentracij
aluminijevega sulfata
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
33
Iz spektrov lahko razberemo, da pride po dodatku aluminijeve soli k standardu hipericina do
pomika absorbanc k daljšim valovnim dolžinam (batokromni efekt) in do znižanja intenzitete
absorbanc (hipokromni efekt).
Graf 8: Prikaz znižanja odziva hipericina po dodatkih različnih koncentracij aluminijevega sulfata
in odziv novonastalega kromatografskega vrha pri retencijskem času 0,7 min
Graf 9: Prikaz AUC-ja (absorbančni detektor) in AUC-ja (fluorescenčni detektor) predvidenega
nastanka kompleksa po dodatkih različnih koncentracij aluminijeve soli k standardu hipericina
Prav tako je potrebno omeniti, da se pri metodi 2 in 3 kromatografski vrh, ki se pojavi ob
dodatku aluminija, začne ločevati v dva vrhova. Sklepamo lahko, da je dolžina metode v tem
primeru pomemben faktor. Hipotetično je možno, da potekata v vzorcih dve reakciji.
Hyp + Al ↔ Hyp-Al
Hyp-Al + Al ↔ Hyp-Al-Al
0
100.000
200.000
300.000
400.000
500.000
0
1.000.000
2.000.000
3.000.000
4.000.000
5.000.000
0,006% 0,025% 0,1% 0,25% 0,4% 0,5%
AU
C (
ko
mp
leksa
)
AU
C (
hip
eric
ina)
Nastanek kompleksa in spremenjen odziv hipericina po dodatkih različnih
koncentracij aluminijevega sulfata, metoda 1, fluorescenčni detektor
hipericin kompleks
0
100.000
200.000
300.000
400.000
500.000
0
5.000
10.000
15.000
20.000
25.000
30.000
0,006% 0,025% 0,1% 0,25% 0,4% 0,5%
AU
C (
flu
ore
scen
čni
det
ekto
r)
AU
C (
abso
rban
čni
det
ekto
r)
Nastanek kompleksa po dodatkih različnih koncentracij aluminijevega
sulfata, metoda 1
absorbančni detektor fluorescenčni detektor
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
34
Slika 15: Vpliv dolžine metode na ločevanje vrhov pri novonastali spojini (6 min – levo, 15 min – na
sredini, 30 min – desno)
Hipericin lahko tvori kompleks z enim ali z dvema aluminijevima ionoma, pri daljši metodi
pa se pričneta kromatografska vrhova teh kompleksov ločevati.
4.2.2 DODATKI KISLINE IN BAZE K STANDARDU HIPERICINA
Zaradi naključnih opažanj preteklih diplomskih nalog pri raziskovanju fagopirinov iz ajde
in nadalje še pri raziskovanju hipericina, smo z naslednjim poskusom želeli preveriti, kakšen
je vpliv dodatka kisline in baze na vidnost hipericina na detektorju. K standardu hipericina
smo dodali ocetno kislino, da je bila njena končna koncentracija 0,25 % in 0,5 % ter
trietilamin, katerega končna koncentracija je bila 0,5 % in 1 % (poglavje 3.2.2).
Koncentraciji smo izbrali na podlagi verjetnosti, da se takšna koncentracija tudi realno pojavi
v vzorcu (iz rastline, stekla ipd.). Analizirali smo po metodah A in metodi B.
Graf 10: Vpliv dodatkov kisline in baze na AUC hipericina po metodah A in metodi B. Na levi
(primarni) navpični osi je podan odziv za metode A, na desni (sekundarni) navpični osi pa je podan
odziv za metodo B.
Glede na rezultate, ki smo jih dobili po dodatkih kisline in baze lahko zaključimo, da večjega
vpliva na AUC hipericina ni. Pri metodah 1, 2 in 3 so vse spremembe znotraj 7 % glede na
standard brez dodatka, kar pa ni toliko, da bi lahko govorili o bistvenih spremembah, ki bi
0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 min
0
5000
10000
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
uV
0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85 0.90 0.95 1.00 1.05 1.10 1.15 min
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
17500
20000
22500
25000
27500
30000
32500
35000
37500
uV
0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 min
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
17500
20000
22500
uV
1.120.0001.140.000
1.160.000
1.180.0001.200.0001.220.000
1.240.000
1.260.0001.280.000
9.000.000
9.500.000
10.000.000
10.500.000
11.000.000
11.500.000
brez dodatka 0,25% ocetna
kislina
0,5% ocetna
kislina
0,5% TEA 1% TEA
AU
C (
met
od
a B
)
AU
C (
met
od
e A
)
Standard hipericina in vpliv dodatkov kisline ter baze, metode A in metoda
B, fluorescenčni detektor
metoda 1 metoda 2 metoda 3 metoda B
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
35
bile posledice teh dodatkov. Pri metodah A je dodatek ocetne kisline povzročil majhno
znižanje odziva hipericina na detektorju, medtem ko je dodatek trietilamina v splošnem
povzročil majhno zvišanje odziva na detektorju. Pri opazovanju kromatogramov smo
opazili, da je po dodatku baze prišlo do spremembe oblike kromatografskega vrha hipericina
(znižanje vrha na levi strani in zvišanje na desni strani), kar pa nima večjega vpliva na
površino pod krivuljo.
Pri metodi B so vsi dodatki znižali površino pod krivuljo hipericina, vendar so tudi tukaj vse
spremembe znotraj 10 % glede na standard brez dodatka. Zatorej ne moremo sklepati na
značilen vpliv ocetne kisline in trietilamina na kromatografski vrh standarda hipericina. Prav
tako je mogoče, da sta tako kislina kot baza prešibki, da bi povzročili vpliv na absorbanco
hipericina in bi bilo to možno pričakovati pri močnejših kislinah in bazah, katerih pa v
naravnih ekstraktih ni pričakovati. Prav tako pa je količina injicirane kisline in baze izredno
nizka, obe mobilni fazi pa vsebujeta tudi kisli komponenti.
4.2.3 VPLIV STEKLA NA POVRŠINO POD KRIVULJO STANDARDA
HIPERICINA
V naslednjem koraku nas je zanimal vpliv stekla različnih vial na odziv hipericina na
detektorju. Preizkusili smo viale različnih proizvajalcev, ki smo jih imeli na voljo v
laboratoriju (preglednica V). Viale so se razlikovale po barvi stekla, vsebnosti inserta in ali
smo jih predhodno sprali z metanolom ali ne.
Preglednica V: Viale različnih proizvajalcev
Viala Proizvajalec, model Tip stekla
Temna viala brez inserta Supelco SU 860033 Hidrolitično steklo, tip 1
Temna viala brez inserta La-Pha-Pack 11 09 0520 Hidrolitično steklo, tip 1
Temna viala z dodanim insertom Viala: Supelco SU 860033
Insert: Supelco SU 860066
Hidrolitično steklo, tip 1
Temna viala z vgrajenim
insertom
Chromacol 03-FIRV(A) Hidrolitično steklo, tip 1
Svetla viala brez inserta Supelco SU 854165 Hidrolitično steklo, tip 1
Svetla viala brez inserta Chromacol 2-SVW Hidrolitično steklo, tip 1
Svetla viala brez inserta La-Pha-Pack 11 09 0519 Hidrolitično steklo, tip 1
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
36
Preglednica VI: Priprava vzorcev standarda v različne viale
Viala V (standarda) [μL] V(MeOH) [μL]
Temna viala brez inserta, Supelco 200 200
Temna viala brez inserta, La-Pha-Pack 200 200
Temna viala z dodanim insertom, Supelco 100 100
Temna viala z vgrajenim insertom, Chromacol 100 100
Svetla viala brez inserta, Supelco 200 200
Svetla viala brez inserta, Chromacol 200 200
Svetla viala brez inserta, La-Pha-Pack 200 200
Analizo vpliva stekla na odziv hipericina smo izvedli v dveh serijah. Ene serije vial nismo
sprali z metanolom, drugo serijo pa smo z metanolom napolnili do vrha in pustili stati 2 uri.
Nato smo viale do suhega posušili. Pripravili smo vzorce s standardom hipericina, ki smo
mu dodali metanol (preglednica VI, slika 16).
V vse viale (razen v viali z vgrajenim in dodanim insertom) smo z injekcijo odmerili 200 μL
osnovne raztopine standarda ter 200 μL MeOH. Viali z vgrajenim in dodanim insertom imata
manjši volumen, zato smo v ti dve viali pripravili po 100 μL osnovne raztopine standarda in
dodali 100 μL MeOH.
Slika 16: Pripravljeni vzorci standarda v svetlih/temnih vialah različnih proizvajalcev pri testiranju
stekla na vpliv AUC standarda hipericina
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
37
Graf 11: Vpliv stekla na površino pod krivuljo hipericina, metoda B. Vzorci so v vialah stali 6 ur
pred injiciranjem.
Graf 11 prikazuje vpliv različnih vial na kromatografski vrh hipericina, na njegovo površino
pod krivuljo po metodi B. Med različnimi vialami je največja razlika AUC-ja znotraj 5 %
(med temno vialo z dodanim insertom Supelco in prozorno vialo Chromacol). Iz navedenega
izhaja, da vpliv različnih vial na kromatografski vrh hipericina ni pomemben. Če primerjamo
rezultate serije različnih vial, ki jih predhodno nismo sprali z MeOH, s serijo vial, ki smo jih
predhodno sprali z MeOH, so vse spremembe manjše od 2 %.
Graf 12: Vpliv stekla na površino pod krivuljo hipericina, metoda 1. Vzorci so v vialah stali 26 ur
pred injiciranjem.
Vpliv stekla na AUC hipericina po metodi 1 predstavlja graf 12. Največja razlika AUC-ja
med posameznimi vialami je okrog 6 % (med temno vialo z dodanim insertom Supelco in
prozorno vialo Chromacol).
1.140.000
1.160.000
1.180.000
1.200.000
1.220.000
1.240.000
1.260.000
1.280.000
prozorna La-
Pha-Pack
prozorna
Chromacol
prozorna
Supelco
temna La-
Pha-Pack
temna
Supelco
temna z
vgrajenim
insertom
Chromacol
temna z
dodanim
insertom
Supelco
AU
CVpliv stekla na AUC standarda hipericina, metoda B, fluorescenčni detektor
brez spiranja spiranje z MeOH
10.000.000
10.200.000
10.400.000
10.600.000
10.800.000
11.000.000
11.200.000
11.400.000
prozorna La-
Pha-Pack
prozorna
Chromacol
prozorna
Supelco
temna La-
Pha-Pack
temna
Supelco
temna z
vgrajenim
insertom
Chromacol
temna z
dodanim
insertom
Supelco
AU
C
Vpliv stekla na AUC standarda hipericina, metoda 1, fluorescenčni detektor
brez spiranja spiranje z MeOH
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
38
Iz tega lahko sklepamo, da je vpliv stekla na AUC pri vseh metodah zelo podoben. Kot pri
metodi B tudi pri metodi 1 predhodno spiranje vial z MeOH ne povzroči občutnih sprememb
na površino pod krivuljo hipericina (vse spremembe so znotraj 2 %).
Različne viale vseh proizvajalcev so izdelane iz hidrolitičnega stekla tip 1, ki ima visoko
hidrolitično odpornost. To lahko pojasni, da do večjih sprememb med vialami ni prišlo.
Majhna odstopanja so lahko posledice eksperimentalnih napak, vezave hipericina na
površino stekla, manj verjetno pa odpuščanja ionov (npr. aluminijevih), ki bi tvorili
komplekse s hipericinom.
4.3 ANALIZA EKSTRAKTA ŠENTJANŽEVKE
Ekstrakt, ki smo ga pripravili iz šentjanževke (poglavje 3.2.1), smo analizirali po metodah A
in metodi B. Tako kot pri analizi standarda, nas je tudi pri analizi ekstrakta šentjanževke
zanimal vpliv matriksa vzorca na kromatogram oziroma na kromatografski vrh hipericina. S
tem namenom smo tudi k ekstraktu dodali različne koncentracije mešanice soli, posamezne
komponente mešanice soli, različne koncentracije aluminijevega sulfata, kislino in bazo.
Želeli smo izvedeti, kakšen je vpliv posameznih dodatkov na kromatografski vrh hipericina
v ekstraktu šentjanževke in ali so vplivi različnih dodatkov pri ekstraktu drugačni v
primerjavi s spremembami pri standardu.
4.3.1 DODATKI SOLI K EKSTRAKTU ŠENTJANŽEVKE
V temne viale z vgrajenim insertom smo k ekstraktu šentjanževke dodali različne
koncentracije mešanice soli (0,25 %, 0,5 %, 1 %), 0,5 % posamezne komponente te mešanice
soli in nižje koncentracije aluminijevega sulfata ter analizirali po metodah A in metodi B.
4.3.1.1 Dodatki različnih koncentracij mešanice soli ter posameznih komponent te
mešanice
Graf 13 prikazuje vpliv dodatkov različnih soli na kromatografski vrh hipericina. Vidimo,
da je trend pri metodah A zelo podoben. Pri vseh dodatkih se je odziv nekoliko znižal. Tako
pri standardu kakor tudi pri ekstraktu, opazimo največjo spremembo pri dodatku
aluminijevega sulfata. Tukaj se je odziv po dodatku 0,5 % aluminijevega sulfata znižal za
okrog 10 % v primerjavi z ekstraktom brez dodatka, kar je precej manj kot pri standardu,
kjer se je odziv znižal za 90 %.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
39
Razlog je verjetno v tem, da je v ekstraktu poleg hipericina prisotnih še mnogo drugih spojin,
ki bi lahko imele vpliv na takšen rezultat. Te spojine lahko namreč delujejo kot nekakšen
»pufer«, ki veže aluminijeve ione in s tem preprečuje značilne spremembe odziva.
Pri metodi B je bil vpliv aluminijeve soli na kromatografski vrh hipericina manjši. Pri tej
metodi se odziv zniža za približno 4 % glede na ekstrakt brez dodatka. Farmakopejska
metoda se je tudi pri raziskovanju hipericina v ekstraktu šentjanževke izkazala kot
ustreznejša.
Graf 13: Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov različnih soli na AUC hipericina. Primerjava
vplivov med različnimi metodami (metode A in metoda B). Na levi (primarni) navpični osi je podan
odziv za metode A, na desni (sekundarni) navpični osi pa je podan odziv za metodo B.
4.3.1.2 Dodatki različnih koncentracij aluminijevega sulfata
Največjo spremembo pri odzivu hipericina tudi pri ekstraktu povzroči dodatek
aluminijevega sulfata, zato smo tudi k ekstraktu dodali še nižje koncentracije te soli. V temne
viale z insertom smo k ekstraktu šentjanževke dodali 0,006 %, 0,025 %, 0,1 %, 0,25 %,
0,4 % in 0,5 % aluminijevo sol (poglavje 3.2.2). Vzorce smo analizirali po metodah A in
metodi B.
1.200.000
1.250.000
1.300.000
1.350.000
1.400.000
1.450.000
1.500.000
1.550.000
10.000.000
10.500.000
11.000.000
11.500.000
12.000.000
12.500.000
13.000.000
AU
C (
met
od
a B
)
AU
C (
met
od
e A
)
Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov različnih soli, metode A in metoda
B, fluorescenčni detektor
metoda 1 metoda 2 metoda 3 metoda B
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
40
Graf 14: Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov različnih koncentracij aluminijevega sulfata na
AUC hipericina. Primerjava vplivov med različnimi metodami (metode A in metoda B). Na levi
(primarni) navpični osi je podan odziv za metode A, na desni (sekundarni) navpični osi pa je podan
odziv za metodo B.
Iz grafa 14 lahko vidimo, da so vplivi oziroma trend različnih aluminijevih dodatkov na
kromatografski vrh hipericina v ekstraktu pri različnih metodah podobni. Pri vseh dodatkih
pride do znižanja odziva hipericina. Obstajajo pa majhne razlike med posameznimi
metodami. Z daljšanjem metode se vpliv dodatka aluminijeve soli na kromatografski vrh
hipericina nekoliko zmanjša. Največja sprememba odziva se tako odraža po dodatku 0,5 %
aluminijeve soli k ekstraktu šentjanževke pri metodi 1 (okrog 10 % v primerjavi z ekstraktom
brez dodatka). Sledi metoda 2 (znižanje odziva za okrog 8 % glede na ekstrakt brez dodatka)
in nato metoda 3 (znižanje odziva za približno 7 % v primerjavi z ekstraktom brez dodatka).
Še manjše znižanje odziva (za okrog 4 % glede na ekstrakt brez dodatka) povzroči dodatek
aluminijeve soli k ekstraktu pri metodi B. Razlog za takšno spremembo smo omenili že pri
analizah standarda hipericina in sicer pufer pri metodi B vsebuje fosfatne ione, ki bi lahko
interagirali z aluminijevimi ioni in s tem preprečili tvorbo kompleksa med aluminijem in
hipericinom. Tako kot pri standardu je tudi pri ekstraktu farmakopejska metoda tista, pri
kateri je prišlo do najnižjih sprememb po dodatkih aluminijevega sulfata. Glede na
odstotkovne spremembe AUC-jev pri standardu, ki smo mu dodali različne koncentracije
aluminijeve soli, opazimo, da spremembe pri ekstraktu niso tako velike. Razlog je lahko ta,
da so v ekstraktu prisotne razne snovi, ki preprečujejo vezavo aluminija na hipericin. Zaradi
tega dodatek aluminijeve soli nima tolikšnega vpliva na spremembo vrednosti AUC-ja
hipericina v ekstraktu.
1.200.000
1.250.000
1.300.000
1.350.000
1.400.000
1.450.000
1.500.000
1.550.000
10.000.000
10.500.000
11.000.000
11.500.000
12.000.000
12.500.000
13.000.000
brez
dodatka
0,006% 0,025% 0,1% 0,25% 0,4% 0,5%
AU
C (
met
od
a B
)
AU
C (
met
od
e A
)
Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov različnih koncentracij
aluminijevega sulfata, metode A in metoda B, fluorescenčni detektor
metoda 1 metoda 2 metoda 3 metoda B
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
41
Za razliko od standarda hipericina je vrh, ki domnevno pripada kompleksu aluminija s
hipericinom, prisoten že na kromatogramu ekstrakta brez dodatka. Iz tega lahko sklepamo,
da je takšen kompleks prisoten že v naravi, v rastlini.
4.3.2 DODATKI KISLINE IN BAZE K EKSTRAKTU ŠENTJANŽEVKE
Z naslednjim poskusom smo želeli preveriti vpliv pH-ja (dodatek kisline in baze) na AUC
hipericina v ekstraktu šentjanževke. V temne viale z vgrajenim insertom smo pripravili
vzorce, kot je opisano v poglavju 3.2.2. Analizirali smo po metodah A in metodi B.
Graf 15: Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov kisline ter baze na AUC hipericina. Primerjava
vplivov med različnimi metodami (metode A in metoda B). Na levi (primarni) navpični osi je podan
odziv za metode A, na desni (sekundarni) navpični osi pa je podan odziv za metodo B.
Glede na dobljene rezultate, ki jih predstavlja graf 15 lahko sklepamo, da dodatek kisline in
baze k ekstraktu šentjanževke nima večjega vpliva na AUC hipericina (vse spremembe so
manjše od 6 % glede na ekstrakt brez dodatka). Hipericin je v vodno-alkoholnih raztopinah
stabilen tako pri nizkih kot tudi pri visokih pH-jih (53).
V primerjavi s standardom pa so spremembe pri ekstraktu tudi po dodatku kisline in baze
manjše. Takšni rezultati so lahko prav tako posledica dejstva, da so v ekstraktu poleg
hipericina prisotne še druge spojine, ki kot pufer preprečujejo velike spremembe AUC-jev
oziroma povečajo stabilnost hipericina.
Pri metodah A je pri kromatografskem vrhu hipericina po dodatku baze prišlo do manjše
spremembe izgleda vrha (rahlo znižanje na desni strani vrha in zvišanje na levi strani),
vendar to ni imelo večjega vpliva na skupno površino pod krivuljo.
1.200.000
1.250.000
1.300.000
1.350.000
1.400.000
1.450.000
1.500.000
1.550.000
10.000.000
10.500.000
11.000.000
11.500.000
12.000.000
12.500.000
13.000.000
brez dodatka 0,25% ocetna
kislina
0,5% ocetna
kislina
0,5% TEA 1% TEA
AU
C (
met
od
a B
)
AU
C (
met
od
e A
)
Ekstrakt šentjanževke in vpliv dodatkov kisline ter baze, metode A in metoda
B, fluorescenčni detektor
metoda 1 metoda 2 metoda 3 metoda B
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
42
Pri opazovanju kromatogramov smo opazili, da je po dodatku baze prišlo do občutnih
sprememb pri psevdohipericinu. Psevdohipericin je na dodatek baze veliko bolj občutljiv
kot hipericin. Na sliki 17 je prikazan predviden mehanizem pretvorbe psevdohipericina v
alkalnem mediju, kjer pride do ireverzibilne degradacije, ki vodi do nastanka nove spojine
– izopsevdohipericina (51, 52). Kadar je pH nižji od 4, je psevdohipericin stabilen in ne pride
do tvorbe izopsevdohipericina. Če je pH višji od 10, je pretvorba psevdohipericina v
izopsevdohipericin hitra in popolna. Do vzpostavitve ravnotežja med spojinama v vodno-
alkoholnih raztopinah pa pride pri pH vrednostih med 4 in 10 (53).
Slika 17: Predviden mehanizem pretvorbe psevdohipericina v izopsevdohipericin (prirejeno po (52))
Izopsevdohipericin je ciklični eter, izomer psevdohipericina. Retencijski čas in UV-VIS
spekter izopsevdohipericina sta odvisna od pH-ja. Retencijski čas izopsevdohipericina je
višji od tr psevdohipericina, kar prikazuje slika 18 (54).
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
43
Slika 18: Kromatogram ekstrakta šentjanževke, metoda 1, absorbančni detektor. Roza barva
ponazarja spremembe AUC-jev po dodatku baze. Vidimo, da se vrh psevdohipericina precej zniža,
desno od njega (višji tr) pa se pojavi nov vrh, ki po naših predvidevanjih predstavlja
izopsevdohipericin.
V UV-VIS spektru (graf 16) je po dodatku baze prišlo do zmanjšanja intenzitete
absorpcijskega maksimuma – hipokromnega efekta. Prav tako se je pri višjih valovnih
dolžinah intenziteta nekoliko povišala. Večjo spremembo spektra opazimo tudi pri valovni
dolžini okrog 400 nm. Vse te spremembe v UV-VIS spektru so lahko odgovorne za opaženo
spremembo barve vzorcev ekstrakta po dodatku baze (poglavje 4.1.2), kjer so se vzorci po
dodatku baze obarvali v temnejšo rjavordečo barvo.
Graf 16: Primerjava UV-VIS absorpcijskih spektrov ekstrakta brez dodatka in ekstrakta po dodatku
baze. Del spektra pod 400 nm najverjetneje predstavlja šum, ki je verjetno posledica prekoračene
zmogljivosti spektrofotometra.
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min
0
2500
5000
7500
10000
12500
15000
17500
20000
22500
25000
27500
30000
32500
35000
uV
0
1
2
3
4
5
6
0 100 200 300 400 500 600 700 800
Ab
sorb
anca
Valovna dolžina [nm]
brez dodatka H2O 0,5% TEA 1% TEA
ekstrakt brez
dodatka
psevdohipericin
izopsevdohipericin
dodatek
baze
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
44
Po dodatku baze pride namreč do nastanka fenolatnega aniona, kar pa vpliva na porazdelitev
elektronske gostote. Posledica tega bi lahko bila sprememba barve in absorpcijskega
maksimuma.
4.4 PRIMERJAVA UPORABLJENIH METOD PRI HPLC ANALIZAH
Pri eksperimentalnem delu smo HPLC analize opravljali z različnimi uporabljenimi
metodami, ki so opisane v poglavju 3.2.4.
Pri primerjavi različno dolgih metod A smo opazili, da je retencijski čas hipericina najkrajši
pri metodi 1, ki vsebuje največji delež organskega topila. Čas, ki je potreben za elucijo
določene spojine iz kolone, je v veliki meri odvisen od razmerja med komponentama v
mobilni fazi. Spojina tvori interakcije s stacionarno fazo na osnovi lipofilnosti, hkrati pa so
najverjetneje prisotni še drugi parametri, ki vplivajo na zadrževanje spojine na koloni:
sterični vpliv, vpliv gibljivosti (vezi okoli katerih se molekula vrti in tako zavzema različne
konformacije) in vodikove vezi. Ločevanje komponent se odvija na osnovi porazdeljevanja
spojine med mobilno in stacionarno fazo. Manj polarne molekule se v večji meri
porazdeljujejo na stacionarno fazo, zato je njihov retencijski čas daljši, bolj polarne molekule
pa se iz kolone izločijo prej. Strukturne lastnosti predstavljajo pomembno vlogo pri
zadrževanju analizirane spojine. Takšno obnašanje hipericina si lahko razlagamo tako, da
večji kot je delež vode v mobilni fazi, bolj je ta polarna, manjša je afiniteta nepolarne spojine
do polarne mobilne faze in spojina se pozneje izloči iz kolone. Ko pa se poveča delež
acetonitrila, se zmanjša retencijski čas spojine, saj »močno« topilo na nekakšen način
tekmuje s stacionarno fazo.
Farmakopejska metoda (metoda B, slika 19 in 21) se je pri našem eksperimentalnem delu s
hipericinom pokazala kot boljša izbira, saj ima kratek čas analize, obenem pa večjo simetrijo
vrhov (manjši »tailing«), kar je povezano z ločljivostjo in možnostjo kvantifikacije – v
našem primeru je to izredno pomembno, saj vsebuje ekstrakt zelo pester spekter različnih
spojin. Prav tako pufer pri metodi B vsebuje fosfatne ione, ki bi lahko interagirali z
aluminijevimi ioni in tako preprečili tvorbo kompleksa med aluminijevimi ioni in
hipericinom ter s tem znižanje površine pod krivuljo hipericina.
Pri metodah A (slika 20 in 22) pa je zaradi nesimetričnih vrhov zaradi »tailinga« otežena
kvantifikacija. Prav tako je pri teh metodah večji vpliv matriksa na odziv na detektorju.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
45
Metoda A zatorej ne predstavlja optimalne metode za raziskovanje hipericina, vendar se
nenazadnje v prvotnem namenu uporablja pri raziskovanju fagopirinov, za katere pa se je
izkazala kot zelo primerna.
Slika 19: Kromatogram standarda hipericina pri metodi B, fluorescenčni detektor
Slika 20: Kromatogram standarda hipericina pri metodi 1, fluorescenčni detektor
Slika 21: Kromatogram ekstrakta šentjanževke pri metodi B, fluorescenčni detektor
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
110000
uV
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
550000
uV
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
uV
hipericin
hipericin
kompleks hipericina
z aluminijem
hipericin
psevdohipericin
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
46
Slika 22: Kromatogram ekstrakta šentjanževke pri metodi 1, fluorescenčni detektor
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
uV
hipericin
psevdohipericin
izopsevdohipericin
kompleks
hipericina z
aluminijem
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
47
5 SKLEP
V magistrskem delu smo raziskali vpliv matriksa vzorca na rezultat HPLC analize. K
standardu hipericina in ekstraktu šentjanževke smo dodali različne koncentracije mešanice
soli (natrijev klorid, magnezijev klorid, kalcijev karbonat in aluminijev sulfat), 0,5 %
posamezne komponente te mešanice, različne koncentracije aluminijevega sulfata, ocetno
kislino in trietilamin. Preverili smo tudi vpliv stekla različnih vial na odziv hipericina na
detektorju. Pri pripravljanju vzorcev smo pri določenih dodatkih zaznali spremembo barve.
Pri standardu hipericina je spremembo barve iz rožnate v modrikasto povzročil dodatek
aluminijevega sulfata, pri ekstraktu šentjanževke pa je dodatek trietilamina spremenil barvo
iz svetlejše rdeče v temnejšo rdečerjavo.
Tekom magistrskega dela smo ugotovili, da najbolj značilno spremembo površine pod
krivuljo hipericina povzroči dodatek aluminijevega sulfata. Tako smo si razložili tudi
spremembo barve raztopine standarda hipericina po dodatku te soli. Posneli smo celoten
UV-VIS spekter in tudi tam opazili, da je po dodatku te soli prišlo do premika absorpcijskega
vrha hipericina. Natrijev klorid, magnezijev klorid, kalcijev karbonat, ocetna kislina in
trietilamin nimajo bistvenega vpliva na površino pod krivuljo hipericina. Sprememba
površine pod krivuljo hipericina je bila pri vseh dodatkih večja pri uporabi standarda
hipericina kakor pri ekstraktu šentjanževke. Sklepamo, da kompleksen ekstrakt šentjanževke
vsebuje spojine, ki preprečujejo nastanek kompleksa aluminijevih ionov s hipericinom in
zaradi tega ne pride do takšne spremembe površine pod krivuljo kromatografskega vrha
hipericina. Pri opazovanju kromatogramov smo opazili, da je po dodatku baze prišlo do
občutnih sprememb pri psevdohipericinu. V alkalnem mediju pride do ireverzibilne
degradacije psevdohipericina, ki vodi do nastanka nove spojine – izopsevdohipericina, le-ta
ima višji tr kot psevdohipericin. Ugotovili smo, da tip stekla, iz katerega je viala, ter
predhodno spiranje vial z MeOH, ne vpliva na odziv hipericina na detektorju.
Ugotovili smo, da je pri uporabi metod A opaziti večji vpliv matriksa na odziv hipericina na
detektorju. Razlog je najverjetneje ta, da pufer pri metodi B vsebuje fosfatne ione, ki bi lahko
interagirali z aluminijevimi ioni in s tem preprečili tvorbo kompleksa med hipericinom in
aluminijevimi ioni ter s tem preprečili znižanje AUC-ja. Kromatografski vrhovi pri
metodah A so nesimetrični in zaradi tega je otežena tudi kvantifikacija. Farmakopejska
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
48
metoda (metoda B) ima boljšo simetrijo vrhov (manjši »tailing«) in s tem tudi boljšo možnost
kvantifikacije.
Rezultati, ki smo jih pridobili tekom analiz v magistrski nalogi, niso potrdili sprememb, ki
so bile opažene pri raziskovanju hipericinu podobnih spojin (fagopirinov iz ajde) in so bile
v kasnejši diplomski nalogi Andraža Počiča na temo hipericina potrjene. Te sklepe smo z
našim magistrskim delom ovrgli.
Zaključili smo, da je za analizo hipericina najprimernejša farmakopejska metoda. Sklepamo,
da k temu pripomore prisotnost fosfatnega pufra in ustrezna pufrna kapaciteta te metode, ki
dobro nasprotuje spremembam pH-ja. K manjšemu vplivu dodatkov na kromatografski vrh
hipericina prispevajo tudi spojine, ki so poleg hipericina prisotne v kompleksnem izvlečku
šentjanževke. Pri analiziranju manj kompleksnih raztopin, kot je standardna raztopina
hipericina, pa je pozornost potrebno nameniti prisotnosti aluminijevih soli, ki lahko vplivajo
na analitski rezultat. V prihodnosti bi lahko preizkusili, kako je pojav odvisen od tipa
aluminijeve soli.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
49
6 LITERATURA
1. Gîtea D, Şipoş M, Mircea T, Paşca B: The analysis of alcoholic extracts of
Hypericum species by UV/VIS spectrophotometry. Tom. XWII/1, 2010; pp. 111–5.
2. Kreft S, Kočevar Glavač N, Stojilkovski K, Mlinarič A, Injac R, Novak A, Doljak B,
Štrukelj B, Slanc Može P, Umek A, Lunder M, Kristl J, Janeš D, Berlec A, Sabotič
J, Glavač I: Sodobna fitoterapija: z dokazi podprta uporaba zdravilnih rastlin,
Slovensko farmacevtsko društvo, Ljubljana, 2013: 50–5.
3. Reader's Digest: Velika knjiga o zeliščih, Mladinska knjiga Založba, d. d., Ljubljana,
2014: 107.
4. Grünwald J, Jänicke C: Zelena lekarna, Mladinska knjiga Založba, d. d., Ljubljana,
2007: 359–60.
5. Rao V, Veeresham G: An overview on Hypericum perforatum Linn. Natural Product
Radiance, 2005; 4(5): 368–81.
6. Gupta R. K, Möller H.-J: St. John's Wort, An option for the primary care treatment
of depressive patients? European Archives of Psychiatry and clinical Neuroscience,
2003; 253: 140–8.
7. Barnes J, Anderson L, Phillipson J.D: St John's wort (Hypericum perforatum L.): a
review of its chemistry, pharmacology and clinical properties. Journal of Pharmacy
and Pharmacology, 2001; 53: 583–600.
8. Willfort R: Zdravilne rastline in njih uporaba, Založba obzorja Maribor, Maribor,
1988: 303–4.
9. http://en.wikipedia.org/wiki/Hypericum_perforatum (dostop november 2014).
10. http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Hypericum_perforatum_i01.jpg (dostop
november 2014).
11. Ernst E (urednik): Hypericum, The genus Hypericum, Taylor&Francis, London, New
York, 2003: 77–8.
12. Piovan A, Filippini R, Borsarini A, Caniato R: Letter to the Editor. Rapid
Communications in Mass Spectrometry, 2004; 18: 131–2.
13. EMEA, Committee on herbal medicinal products (HMPC), Assessment report on
Hypericum perforatum L., herba, 2009.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
50
14. Liu F, Pan C, Drumm P, Ang C: Liquid chromatography-mass spectrometry studies
of St. John's wort methanol extraction: active constituents and their transformation.
Journal of Pharmaceutical and Biomedicinal Analysis, 2005; 37: 303–12.
15. Cossuta D, Vatai T, Báthori M, Hohmann J, Keve T, Simándi B: Extraction of
hyperforin and hypericin from St. John's wort (Hypericum perforatum L.) with
different solvents. Journal of Food Process Engineering, 2011; 1–14.
16. Karioti A, Bilia A. R: Hypericins as Potential Leads for New Therapeutics.
International Journal of Molecular Sciences, 2010; 11: 562–94.
17. Xenophontos M, Stavropoulos E, Avramakis E, Navakoudis E, Dörnemann D,
Kotzabasis K: Influence of the Developmental Stage on the (Proto)Hypericin and
(Proto)Pseudohypericin Levels of Hypericum Plants from Crete. Planta Med, 2007;
73: 1309–15.
18. Galle-Toplak K: Zdravilne rastline na Slovenskem, Založba Mladinska knjiga,
Ljubljana, 2002: 132–3.
19. Anyżewska M, Kowalczuk A, Łozak A, Jabłczyńska R, Fijałek Z: Determination of
total hypericins in St. John's wort and herbal medicinal products. Acta Poloniae
Pharmaceutica-Drug Research, 2010; 67(6): 586–93.
20. Darmanyan A, S. Jenks W, Eloy D, Jardon P: Quenching of Excited Triplet State
Hypericin with Energy Acceptors and Donors and Acceptors of Electrons. The
Journal of Physical Chemistry B, 1999; 103: 3323–31.
21. Skalkos D, Tatsis E, P. Gerothanassis I, Trogranis A: Towards a consensus
structure of hypericin in solution: direct evidence for a single tautomer and different
ionization states in protic and nonprotic solvents by the use of variable temperature
gradient 1H NMR. Tetrahedron, 2002; 58: 4925–9.
22. Berlanda J, Kiesslich T, Engelhardt V, Krammer B, Plaetzer K: Comparative in
vitro study on the characteristics of different photosensitizers employed in PDT.
Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology, 2010; 100: 173–80.
23. Pravilnik o razvrstitvi zdravilnih rastlin, 2008, Uradni list RS št. 103/2008, 30. 10.
2008, str. 13637.
24. De los Reyes G, Koda R: Determining hyperforin and hypericin content in eight
brands of St. John's wort. American Journal of Health-System Pharmacy, 2002; 59:
545–7.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
51
25. Rückert U, Likussar W, Michelitsch A: Simuntaneous Determination of Total
Hypericin and Hyperforin in St. John's Wort Extracts by HPLC with
Electrochemical Detection. Phytochemical Analysis, 2007; 18: 204–8.
26. Butterweck V, Schmidt M: St. John's wort: Role of active compounds for its
mechanism of action and efficacy. Wiener Medizinische Wochenschrift, 2007;
157/13–14: 356–61.
27. Kennedy D. O, Wightman E. L: Herbal Extracts and Phytochemicals: Plant
Secondary Metabolites and the Enhancement of Human Brain Function. Advances
in Nutrition, 2011; 2: 32–50.
28. Li W, Fitzloff J. F: High performance liquid chromatographic analysis of St. John's
Wort with photodiode array detection. Journal of Chromatography B, 2001; 765:
99–105.
29. Lawvere S, Mahoney M. C: St. John's Wort. American Family Physician, 2005;
72(11): 2249–54.
30. Tracy T. S, Kingston R. L (urednika): Herbal products: toxicology and clinical
pharmacology, Humana Press, New Yersey, 2007: 71–95.
31. Tolonen A, Hohtola A, Jalonen J: Fast High-performance Liquid Chromatographic
Analysis of Naphthodianthrones and Phloroglucinols from Hypericum perforatum
Extracts. Phytochemical Analysis, 2003; 14: 306–9.
32. Izzo AA, Ernst E: Interactions between herbal medicines and prescribed drugs: a
systematis review. Drugs, 2001; 61: 2163–75.
33. Madabushi R, Frank B, Drewelow B, Derendorf H, Butterweck V: Hyperforin in St.
John's wort drug interactions. European Journal of Clinical Pharmacology, 2006; 62:
225–33.
34. Kreft S: Varni in učinkoviti: nova spoznanja o izvlečkih šentjanževke (Hypericum
perforatum). Farmacevtski vestnik, 2014; 65: 349–53.
35. Jürgenliemk G, Nahrstedt A: Dissolution, solubility and cooperativity of phenolic
compounds from Hypericum perforatum L. in aqueous systems. Pharmazie, 2003;
58: 200–3.
36. Zobayed S. M. A, Afreen F, Goto E, Kozai T: Plant-Environment Interactions:
Accumulation of Hypericin in Dark Glands of Hypericum perforatum. Annals of
Botany, 2006; 98: 793–804.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
52
37. Obermüller R. A, Schütz G. J, Gruber H. J, Falk H: Concerning Regioselective
Photochemical Intermolecular Proton Transfer from Hypericin. Monatshefte für
Chemie, 1999; 130: 275–81.
38. Falk H, Mayr E: Concerning bay Salt and peri Chelate Formation of
Hydroxyphenanthroperylene Quinones (Fringelites). Monatshefte für Chemie, 1997;
128: 353–60.
39. Amer A. M, Falk H, Tran H. T. N: The Dissociation and Tautomerization Equilibria
of Hypericin: Alkyl Protected Hydroxyl Derivates. Monatshefte für Chemie, 1998;
129: 1237–44.
40. Dax T. G, Falk H, Kapinus E. I: A Structural Proof for the Hypericin 1, 6-Dioxo
Tautomer. Monatshefte für Chemie, 1999; 130: 827–31.
41. Mylrajan M, Hildebrandt P, Mazur Y: Vibrational spectroscopy of hypericin, its
sodium salt and pyridinium complex. Journal of Molecular Structure, 1997; 407: 5–
10.
42. Baugh S. F: Simultaneous Determination of Protopseudohypericin, Pseudohypericin,
Protohypericin, and Hypericin Without Light Exposure. Journal of AOAC
International, 2005; 88(6): 1607–12.
43. Gemal Jensen A, Cornett C, Gudiksen L, Honoré Hansen S: Characterisation of
Extracts of Hypericum perforatum L. using an On-line HPLC System with
UV/Visible and Fluorescence Detection Prior to and after Photochemical Conversion
of the Effluent. Phytochemical Analysis, 2000; 11: 387–94.
44. Zotou A, Loukou Z: Determination of Hypericin and Pseudohypericin in Extracts
from Hypericum Perforatum L. and Pharmaceutical Preparations by Liquid
Chromatography-Fluorescence Detection. Chromatographia, 2001; 54(3/4): 218–24.
45. Gemal Jensen A, Honoré Hansen S: Separation of hypericins and hyperforins in
extracts of Hypericum perforatum L. using non-aqueous capillary electrophoresis
with reversed electro-osmotic flow. Journal of Pharmaceutical and Biomedical
Analysis, 2002; 27: 167–76.
46. Wagner H, Bladt S: Pharmaceutical quality of hypericum extracts. Journal of
Geriatric Psychiatry and Neurology, 1994; 7(1): 65–8.
47. Žorž M: HPLC, Samozaložba, Ljubljana, 1991: 5.
48. Žakelj S: Dejavniki, ki vplivajo na HPLC-ločbo in parametri s katerimi jo opišemo.
Instrumentalne analizne metode v farmaciji, predavanja, 2012.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
53
49. Skoog D. A, Holler F. J, Crouch S. R: Principles of instrumental analysis, 2007: 316–
32
50. Wirz A, Meier B, Sticher O: Solubility of hypericin in methanol and methanol-
pyridine. Pharmazie, 2002; 57(8):543–5.
51. Fourneron J.-D, Herbette G, Caloprisco E: Pseudohypericin and hypericin in St.
John's wort extracts. Breakdown of pseudohypericin. Comptes Rendus de l'Académie
des Sciences Paris, 1999; 2: 127–31.
52. Hecka A, Maunit B, Aubriet F, Muller J.-F: Study of active naphtodianthrone St
John's Wort compounds by electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron
resonance and multi-stage mass spectrometry in sustained off-resonance irridiation
collision-induced dissociation and infrared multiphoton dissociation modes. Rapid
Communications in Mass Spectrometry, 2009; 23: 885–98.
53. Naït-Si Y, Fourneron J.-D: Chemical and Chromatographic Behavior of
Pseudohypericin and Isopseudohypericin, and the Occurrence of Isopseudohypericin
in Saint John's Wort (Hypericum perforatum) Extracts. Monatshefte für Chemie,
2005; 136: 159–68.
54. Fourneron J.-D, Naït-Si Y, Rosas R, Faure R, Viant P: Identification of
isopseudohypericin, a new phenanthroperylene quinone obtained by the alkaline
treatment of pseudohypericin. Tetrahedron Letters, 2003; 44: 6285–8.
55. Evropska farmakopeja 8.0, 2014. St. John's Wort dry extract, quantified (Hyperici
herbae extractum siccum quantificatum). European Pharmacopoeia 8.0, 2014; 1393.
56. Lekarniška zbornica Slovenije: Uporaba zdravil rastlinskega izvora pri duševnih
motnjah, Lekarniška zbornica Slovenije, Ljubljana, 2004: 18.
57. Leonhartsberger J. G, Falk H: The Protonation and deprotonation Equilibria of
Hypericin Revisited. Monatshefte für Chemie, 2002; 133: 167–72.
58. Počič A: Vpliv matriksov vzorca na analizo standarda hipericina in ekstraktov
šentjanževke s tekočinsko kromatografijo visoke zmogljivosti. Diplomsko delo.
Ljubljana, 2013.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
54
7 PRILOGA
FARMAKOPEJSKA METODA (55), kvantifikacija suhega ekstrakta šentjanževke
(Ph. Eur. 8.0, Hyperici herbae extractum siccum quantificatum).
Postopek za določanje vsebnosti celokupnih hipericinov se izvaja s tekočinsko
kromatografijo (LC).
Priprava ekstrakta: ekstrakt se pripravi z uporabo etanola ali metanola (50–80 V/V %).
Testna raztopina: 70,0 mg ekstrakta raztopimo v 25,0 mL metanola R, nato obdelujemo v
ultrazvočni kadički in centrifugiramo. Raztopino izpostavimo svetlobi ksenonski luči z
močjo 765 W/m2 za osem minut.
Referenčna raztopina: količino suhega ekstrakta šentjanževke HRS, ki ustreza 0,15 mg
hipericinom, raztopimo v 25,0 mL metanola R. Nato postavimo na ultrazvok in
centrifugiramo ter za osem minut izpostavimo svetlobi ksenonske luči z močjo 765 W/m2.
Kolona:
l = 0,15 m, Ø = 4,6 mm,
stacionarna faza: oktadecil silikagel za kromatografijo R (5 μm),
temperatura: 40 °C.
Mobilna faza: 39 volumskih enot etil acetata R, 41 volumskih enot 15,6 g/L raztopine
natrijevega dihidrogenfosfata R, pH se uravna s pomočjo fosforne kisline R na 2 in 160
volumskih enot metanola R.
Pretok: 1,0 mL/min.
Detekcija: spektrofotometer, valovna dolžina 590 nm.
Injiciranje: 20 μL.
Čas ločbe: 15 min.
Identifikacija vrhov: za identifikacijo vrhov hipericina in psevdohipericina primerjamo
kromatogram suhega ekstrakta šentjanževke HRS ter kromatogram referenčne raztopine.
Tadeja Švajger Vpliv sestave matriksa na rezultat kromatografske analize hipericina
55
Ustreznost sistema: referenčna raztopina:
dobljen kromatogram je podoben kromatogramu suhega ekstrakta šentjanževka
HRS,
resolucija je minimalno 2 med kromatografskima vrhovoma psevdohipericina in
hipericina.
Po sledeči formuli izračunaj odstotek celokupnih hipericinov, izraženih kot hipericin:
(A1+A2) x m2 x p
A1: površina pod krivuljo psevdohipericina, kromatogram testne raztopine;
A2: površina pod krivuljo hipericina, kromatogram testne raztopine;
A3: površina pod krivuljo hipericina, kromatogram referenčne raztopine;
m1: masa ekstrakta (g) za pripravo testne raztopine;
m2: masa suhega ekstrakta šentjanževke HRS (g) za pripravo referenčne raztopine;
p: odstotek vsebnosti hipericina v suhem ekstraktu šentjanževke HRS.
A3 x m1
Recommended