5. Infrarotspektroskopie - IRmab.blt.kit.edu/vorlesungsdaten/ScaleupTechBio//Bioanalytik_Vorlesung_05.pdf · Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen Instrumentelle

Michael Wörner – Fakultät für Chemieingenieurwesen

Instrumentelle Bioanalytik

05.12.2011

Instrumentelle Bioanalytik5. Infrarotspektroskopie - IR

5.1 Physikalische Grundlagen5.2 IR-Spektroskopie (bio)organischer Moleküle5.3 IR-Spektrometer und Probenvorbereitung5.4 Proteinanalytik mit FT-IR

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05.12.2011

5. IR-Spektroskopie

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5.1 Physikalische GrundlagenEinteilung Infrarot-Spektroskopie (IR)

Anregung von Molekülschwingungen und Molekülrotationen

nahes IR, Nahinfrarot (NIR): 780nm (12800 cm-1) bis 2,5 μm (4000 cm-1)mittleres IR (MIR, auch nur IR) 2,5 bis 25 μm (4000 bis 400 cm-1) ⇒ organische Molekülefernes IR (FIR) 25 bis 1000 μm (400 bis 10 cm-1)

Klassische Mechanik:Molekül besteht aus Atomen in Form von Punktmassen; Atome durch elastische Feder(n) verbunden, Schwingung um den Gleichgewichtsabstand.

Hooke‘sche Gesetz

k: Federkonstante (mechanisches Modell)Kraftkonstante: Maß für die Bindungsstärke im Molekül

Harmonischer Oszillator für ein zweiatomiges Molekül: potentielle Energie der Schwingung ist eine Funktion des Kernabstandes

oscπ μν= ⋅ = ⋅V(r) k x x2 2 2 212

2

= − ⋅ ΔK k r

V: potentielle Energiex: Auslenkungνosc: Schwingungsfrequenz des Oszillators μ::reduzierte Masse

μ ⋅=

+m mm m

1 2

1 2

5. IR-Spektroskopie

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5.1 Physikalische Grundlagen

osc πν

μ=

k12

osckν

π μ⎛ ⎞ ⎛ ⎞= ⋅ ⋅ + = +⎜ ⎟ ⎜ ⎟⎝ ⎠ ⎝ ⎠

VIBhE h n n1 1

2 2 2

Quantenmechanisches Modell: diskrete Energie-/SchwingungszuständeEnergie bzw. Strahlungsabsorption ist gequantelt:

Schwingungsfrequenz ist umso höher, je größer die Kraftkonstante ist, je stärker die Bindung zwischen den Atomen ist. Wichtig für die Spektreninterpretation!

=n 0,1, 2, .....

Übergang von n = 0 nach n = 1: GrundschwingungÜbergang von n = 0 nach n = 2: erste Oberschwingung

⇒ Schwingungsfrequenz eines zweiatomigen Moleküls (nach dem mechanischen Modell)

Wahrscheinlichkeit der Übergänge und damit die Intensität der Übergänge nimmt mit zunehmender Größe des Quantensprungs ab.

Anregung einer Schwingung: Molekül geht unter Absorption eines Lichtquants in einenhöheren Schwingungszustand über, Resonanzbedingung:

oscν+Δ = = ⋅VIB n nE E E h1 -

EVIB: Schwingungsenergien: Schwingungsquantenzahl,



5. IR-Spektroskopie

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5.1 Physikalische Grundlagen

Potentialkurve des harmonischen Oszillators mit diskreten Schwingungsniveaus

HMZ-7-35

AuswahlregelnInfrarotes Licht wird nur dann absorbiert, wenn das Dipolmoment des Moleküls mit dem elektrischen Feldvektor in Wechselwirkung tritt.⇒ Änderung des Dipolmoments während der Schwingungsüberganges erforderlich.⇒ In einem Molekül mit Symmetriezentrum sind alle Schwingungen, die symmetrisch zum

Symmetriezentrum erfolgen, IR-inaktiv (d.h. verboten)(Bio-)OC: die meisten funktionellen Gruppen besitzen kein Symmetriezentrum!Intensität der Absorptionsbande hängt von der mit der Schwingung verbundenen Betragsänderung des Dipolmomentes ab, sowie von der Anzahl der Bindungen, die für die Adsorption verantwortlich sind.

Anregung von Schwingungsniveaus

Potentialkurve des anharmonischen Oszillators

E0: Nullpunktsenergie ED: Dissoziationsenergie



5. IR-Spektroskopie

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5.2 IR-Spektroskopie (bio)organischer MoleküleInfrarotspektren können in zwei Bereiche unterteilt werden:

Wellenzahlen 4000cm-1 - 1500 cm-1 (2,5-6,6 μm): Valenzschwingungsbereichin diesem Bereich können einzelne funktionelle Gruppenanhand ihrer Valenzschwingungen identifiziert werden ⇒ funktionelle Gruppen

Wellenzahlen 1500cm-1 - 400 cm-1 (6,6-25,0 μm): “fingerprint”-RegionDeformationsschwingungen einzelner funktioneller Gruppen, Kombinationsschwingungen und die Gerüstschwingungen größerer Moleküle⇒ Identifizierung einzelner funktioneller Gruppen in diesem Bereich ist schwierig

⇒ Gerüstschwingungen der großen Moleküle sind jedoch charakteristisch⇒ Identifizierung von Molekülen

IR-Spektrum von Butyl-phenyl-ether (als Film)



5. IR-Spektroskopie

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5.2 IR organischer Moleküle Funktionelle Gruppe Wellenzahl

[cm-1]Intensität

C-H (Alkane) 2850-29701340-1470

starkstark

C-H (Alkene, C=C-H) 3010-3095675-995

mittelstark

C-H (Alkine, C≡C-H) 3300 stark

C-H (Aromaten) 3010-3100690-900

mittelstark

O-H (mit H-Brücken) 3200-3600 unterschiedlich

N-H (Amine, Amide) 3300-3500 mittel

C=C (Alkene) 1610-1680 unterschiedlich

C=C (Aromaten) 1500-1600 unterschiedlich

C≡C (Alkine) 2100-2260 unterschiedlich

C-N (Amine, Amide) 1180-1360 stark

C≡N (Nitrile) 2210-2280 stark

C-O (Alkohole, Ether, Säuren, Ester)

1050-1300 stark

C=O (Aldehyde, Ketone, Säuren, Ester)

1690-1760 stark

NO2 (Nitrogruppe) 1500-15701300-1370

starkstark

IR-Banden funktioneller Gruppenorganischer Moleküle

Charakteristische Absorptionsbereiche

HMZ-7-42

IR-Spektrum von Aceton



5. IR-Spektroskopie

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5.3 IR-Spektrometer und Probenvorbereitung

Messung in der GasphaseGasküvette mit IR-durchlässigen NaCl-Fenstern. Weglänge meist 10 cm (bei OV selten, da meist relativ niedrigen Dampfdruck).Messung als FlüssigkeitEin Tropfen wird zwischen zwei flache NaCl-Platten (transparent zwischen 4000 und 667 cm-1) gepresstStörend sind Wassergehalte über 2 %, da sie die Oberfläche der NaCl-Platten beschädigen.Messung in LösungVerbindung wird in CCl4 oder CHCl3 gelöst (etwa 1 bis 5% Lösung) und in einer Natriumchlorid-Zelle gemessenMessung im festen ZustandSuspension in Öl: Festsubstanz mit einem Tropfen Paraffinöl in einem Mörser fein zerreiben; Paste wird zwischen zwei NaCl-platten gepresst.KBr-Pressling: Festsubstanz mit 10- bis 100-facher Menge an KBrvermischen und mittels einer hydraulischen Presse unter Vakuum komprimieren (ergibt Einkristall-ähnliche Tablette). Wird bei Feststoffen meist angewendet, da KBr keine zusätzlichen IR-Banden erzeugt

Fenstermaterialien für die IR-Spektroskopie

Absorptionsbereiche verschiedener Lösemittel im IR-Bereich (blau markiert)



5. IR-Spektroskopie

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zerlegbare Infrarotzelle für flüssige Proben(für sehr kleine Schichtdicken)


⇒ Differenzspektrum (rechnerisch)Problem: Valenzschwingungsbereich „zugedeckt“⇒ sehr kleine Schichtdicken (jedoch: Absorption sehr klein ⇒ gesättigte Lösungen)

Wasser als Lösungsmittel?

ca. 3500 ca. 3300 ca. 1660 cm-1

Problem: Konzentration beträgt 55 mol L-1



5. IR-Spektroskopie

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Klassische (scanning) IR-SpektrometerMeistens: Zweistrahlprinzip (Vergleichsstrahl für den optischen Nullabgleich) Beugungsgitter oder Prisma zur spektralen Zerlegung der resultierenden Strahlung und Detektion. Signale des Detektors werden in Abhängigkeit der Wellenzahl als Transmission (Durchlässigkeit) aufgezeichnet. Spektrendauer etwa 10 Minuten.

SHC-6e-445




5. IR-Spektroskopie

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5.3 IR-Spektrometer und ProbenvorbereitungFT-IR-SpektrometerWeiterentwicklung; heutige Standardgeräte.Simultane Erfassung aller Frequenzen des IR-Spektrums im Detektor.Umwandlung der polyfrequenten IR-Strahlung der Lichtquelle mittels Interferometer in ein zeitabhängiges Interferogramm (Umwandlung der Frequenzdomäne in die Zeitdomäne). Nach Durchgang der so „aufbereiteten“ Strahlung durch die Probe wird das Interferogramm durch Fourier-Transformation in ein Spektrum (in die Frequenzdomäne) rückübersetzt

FTIR mit Michelson-Interferometer

Fourier-Transform IR-Spektrometer



5. IR-Spektroskopie

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Vergleich von Interferogrammen mitoptischen Spektren

Michelson-Interferometer

5.3 IR-Spektrometer und ProbenvorbereitungFT-IR-Spektrometer



5. IR-Spektroskopie

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- kürzere Messzeiten (ca. 1s)- höheres Signal-Rausch-Verhältnis

Durchsatz- oder Jacquinot-VorteilDurch Wegfall des bei der dispersiven Spektroskopie nötigen Spaltes, welcher die Auflösung bestimmt, erreicht eine größere Lichtmenge den Detektor (gesamte Energie der IR-Quelle wird permanent durch die Probe geschickt).⇒ Lichtausbeute wird etwa um den Faktor 200 verbessert ⇒ besseres Signal-Rausch-Verhältnis

Multiplex- oder Fellgett-VorteilSpektrum wird nicht kontinuierlich in Abhängigkeit von der Wellenlänge gemessen, sondern alle Wellenlängen gleichzeitig als Momentaufnahme über den gesamten definierten Spektralbereich (Frequenzbereich). Dadurch erhöht sich das Signal-Rausch-Verhältnis um (bei N Spektralelementen).

Connes-Vorteil (Linearitäts-Vorteil, Wellenzahlkalibrierung)Durch die Verwendung eines HeNe-Lasers als Referenz ergibt sich eine wesentlich höhere Genauigkeit der Frequenz- oder Wellenlängen-Achse im IR-Spektrum als bei der dispersiven Spektroskopie. Eine Frequenzgenauigkeit von 0,001 cm-1 ist erreichbar.

fast scanning-FT-Spektrometer: Aufnahmezeiten von Bruchteilen einer Sekunde ⇒ Studien dynamischer Prozesse.

Vorteile der FT-IR-Spektroskopie



5. IR-Spektroskopie

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5.3 IR-Spektrometer

zum DetektorDiamant

Probe

Eindringtiefe dP

α

IR-Strahl

α wird so gewählt, dass Totalreflektion stattfindet(IRE, internal reflection element)

FTIR-ATR

Attenuated Total Reflectance(abgeschwächte Totalreflektion)beruht auf evaneszenten Welleneffekten

Golden Gate Probenhalter

IR-Spektroskopien an Feststoffoberflächen und Polymerfilmen

[http://www.specac.com]



5. IR-Spektroskopie

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Das Mobile-IR Gerät ist für folgende Einsatzbereiche konzipiert: im Gefahren- und Umweltschutz, bei Gefahrgutunfällen, bei Katastropheneinsätzen, bei der Spurensicherung an einem Tatort sowie bei forensischen Untersuchungen.

Mobile-IR, tragbares FT-IR

Materialidentifizierung direkt am Ort des Geschehens!

5.3 IR-Spektrometer



5. IR-Spektroskopie

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TeleSpec

IR Spectrum Simulation

3D Structure Prediction

Rapid prediction of the IR spectrum starting from a molecular structure. In addition, it is also possible to operate in reverse mode, to predict the 3D structure of the molecule from its IR spectrum.

[http://www2.ccc.uni-erlangen.de/services/telespec/]

Spektrenauswertung

IR Database and IR Spectra Simulation on the WorldWideWeb

FTIR Spectra Libraries in all digital formatsOrganic Inorganic Chemicals, Polymers, Pharmaceuticals, Pesticides, Dyes, Pigments, Coatings, Art Materials, Forensic, Hazardous, Drugs, Suspect Powders, Kidney Stones, Lubricants and more…

[http://www.ir-spectra.com/]

NIST Chemistry WebBook.url

IR Spectra. Infrared spectra Library FTIR. FT-IR Database.url



5. IR-Spektroskopie

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5.4 Proteinanalytik mit FT-IR (FT-IR Proteomics)

Results of a Fourier self-deconvolution analysis on the Amide I band for bovine pancreatic trypsin inhibitor. The assignments of the variouspeaks to the different elements of secondary structure are shown.

Anwendungen:Bestimmung der SekundärstrukturDetektion von KonformationsänderungenProtein-Dynamik (Temperatur-induzierte Änderungen) Konzentrationsbestimmung (< 0,03 mg/ml) Proteinaggregation, -präzipitation und -kristallisationEnzymkinetik



5. IR-Spektroskopie

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Entfaltung der RNase A bei Erwärmung. RNase A-Lösung (10 μg/μl) wurde von 25 bis 75°C in Zwei-Grad-Schritten erhitzt und zu jeder Temperatur ein IR-Spektrum aufgenommen (a). Die Veränderung in der Amid-I-Bande zeigt die Entfaltung des parallelen ß-Faltblatt-Anteils. Noch deutlicher wird die spektrale Änderung in den zugehörigen Differenzspektren (Spektren von (a) minus RNase-Spektrum bei 25°C) in (b). Die Entfaltung und Rückfaltung der RNase in Abhängigkeit von der Temperatur ist in (c) gezeigt. Bruker CONFOCHECK unter Verwendung der BioATRII-Einheit

Untersuchung der Protein-Konformation mit FT-IR

Bruker Optik GmbH,

reaktionsmodulierte Differenztechnik Entstehung, Verschwinden und Verschiebung von Banden wird einer Störung (Licht, Redox, photochemisch, thermisch) korreliert

Differenz-spektrum

FT-IR Proteomics



5. IR-Spektroskopie

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Spezielles FT-IR-System zur infrarotspektroskopischen Analyse von Proteinen in Wasser. Es basiert auf einem für die Biopharmazeutika optimierten Spektrometersystem, das über eine anwenderfreundliche Software gesteuert wird. Durch den Einsatz eines empfindlichen Detektors wird eine sehr kurze Messzeit (ca. 30 Sekunden/Probe) erreicht.

CONFOCHECK

CONFOCHECK IR-System für die Proteinanalyse - Bruker Optics.url

http://www.brukeroptics.com/confocheck.html?&L=1

Die AquaSpec Transmissionszelle ist eine im Durchfluss befüllbare Küvette zur Vermessung von Proteinen in Wasser

Die Bio-ATR II ist eine im Bereich 0 - 95°C temperierbareMikro-ATR-Einheit für die Untersuchung von Proteinen in Wasser.

FT-IR Proteomics



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