Untermodul 4 - 9Andrologie und KB6. Semester (Sommersemester) 2009

Die instrumentelle Samenübertragung beim Rind

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Die instrumentelle Samenübertragung beim Rind

Gliederung

• Aufbau von Bullenbesamungsstationen• Tierseuchenrechtliche und zuchthygienische Anforderungen • Spermagewinnung• Spermabeurteilung• Spermaverarbeitung• Spermakonservierung• Insemination

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Besamungsstation - eine Einrichtung, in der männliche Zuchttiere zur Gewinnung, Behandlung und Abgabe von Samen zur künstlichen Besamung gehalten werden,

- bedarf einer staatlichen Betriebserlaubnis,

- unterliegt der staatlichen Überwachung

- auf züchterischem Gebiet, - auf veterinärhygienischem Gebiet;

Träger kann sein:- Besamungsgenossenschaft- GmbH- Privatperson- eingetragener Verein- usw.

Trend: internationale kommerzielle Organisationen

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AGTK Wehrend, 2007

Aufbau von Bullenbesamungsstationen

• Stallbereich• Samenentnahmebereich• Laborbereich• Spermadepot• Verwaltungsbereich

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Aufbau von Bullenbesamungsstationen

Stallbereich

• Bullenställe mit Stand- und Boxenhaltung• Bewegungskarussell• Lagerräume für Material und Futter• Behandlungsraum

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Bereich Haltung der Zuchttiere- räumlich getrennt von anderen Bereichen

- keine offenen Luftverbindungen zu anderen Stallungen- keine anderen Tierarten- keine kreuzenden Wege auf dem Weg zum Absambereich

- räumlich getrennter Quarantänebereich

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AGTK Wehrend, 2007

Haltung von Zuchtbullen

Boxenhaltung (Boxengröße 4 x 4 m)

• Boxenbegrenzung: durch Stahlrohrgitter, deren Abstände Fluchtmöglichkeiten für das Personal bieten

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AGTK Wehrend, 2007

Haltung von Zuchtbullen

Vorschriften der Unfallverhütungsvorschrift„Tierhaltung“ von der Landwirtschaftlichen Berufsgenossenschaft (Auszug)

- über 12 Monate Nasenring- Leitstange: mindestens 1,4 Meter lang mit sicher schließbarem Anhängesystem

- wenn Bulle in Einzelbox ,muss diese über Fluchtmöglich-keiten und Personenschlupf verfügen

8 AGTK Wehrend, 2007

Aufbau von Bullenbesamungsstationen

Samenentnahmebereich

• Sprung-/Spermagewinnungsraum• Warteraum für Bullen• Wasch- und Trockenraum für Bullen

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Sprungraum

- überdacht

- Bodenbelag trittsicher

- Wandbeschichtung wasserabweisend

- ausreichend groß

- Boden und Wände leicht zu reinigen und zu desinfizieren

- rückstaugeschützter Wasserabfluss

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AGTK Wehrend, 2007

Aufbau von Bullenbesamungsstationen

Laborbereich

• Laboratorien für Spermauntersuchung, -verarbeitung und –konservierung

• Wasch- und Sterilisationslabor

• Vorbereitungsraum für künstliche Vaginen

• Containerraum

• Umkleide- und Lagerräume

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Laborbereich

- separat von der Samenentnahme (meist direkt benachbart)

- Arbeitseinheiten für Samen-untersuchung, -verdünnung, -konfektionierung

- bei Arbeiten mit flüssigem Stickstoff ausreichende Belüftung

Beispiele für die apparative Ausstattung:- Mikroskop mit Heiztisch- Zentrifuge- Wasserbad- Abfüll- und Dosierungsvorrichtungen- Heißluftsterilisator

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Bereich Spermadepot

- ausreichende Lüftung

- Unfallverhütungsvorschriften zum Umgang mit flüssigem Stickstoff

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AGTK Wehrend, 2007

Nach EU-Richtlinien zu untersuchenden Infektionen

Ursprungsbestand

Status Untersuchung auf Quarantäne

Untersuchung auf

Station

Untersuchung auf

Bestand ist amtlich

frei von:

-Brucellose

- Leukose

- Tuberkulose

-Brucellose

-Leukose

-Tuberkulose

-BHV-1-Infektion

- BVD/MD-Virus-

Infektion

-Brucellose

- BHV-1-Infektion

-BVD/MD-Virus-

Infektion

-Bovine genitale

Campylo-

bacteriose

-Trichomonaden-

seuche

-Brucellose

- Leukose

- Tuberkulose

- BHV-1-Infektion

- BVD/MD-Virus-

Infektion

- Bovine genitale

Campylo-

bacteriose

-Trichomonaden-

seuche

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In der Besamungsstation werden gehalten:

• Produktionsbullen: Bullen mit Zuchtwert im Alter von 4,5 – 8 Jahren

• Prüfbullen: Testbullen im Alter von 1,0 –1,8 Jahren mit begrenzter Produktion von Sperma für Prüfanpaarungen

• Verwahrbullen: Wartebullen im Alter von 1,8 – 4,5 Jahren in Warte- oder Verwahrhaltung bis Zuerkennung des Zuchtwertes

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Anforderung an Zuchtbullen für den Einsatz in der KB und an Deckbullen

- bei Mängelanzeige tierärztliches Fachgutachten

- Verkäufer gewährleistet die angegebene Abstammung des Bullen

- Verkäufer haftet für das Freisein von erkennbaren Mängeln und solchen Mängeln, die zum Zeitpunkt der Übergabe mit geeigneten diagnostischen Methoden erfasst werden können.

- Zum Zeitpunkt der Übergabe gewährleistet der Verkäufer das Freisein von Erkrankungen außerhalb des Geschlechtsapparates, die die Zuchtverwendung einschränken oder ausschließen.

-Physiologisch ausgebildete und nicht krankhaft veränderte Geschlechtsorgane (insbesondere Freisein von Genitalinfektionen) sind bis zu 12 Wochen nach der Übergabe durch den Verkäufer zu gewähleisten.

- Der Verkäufer haftet für eine Reaktionszeit bis zum ersten Aufsprung von maximal 10 Minuten sowie einen physiologischen Ablauf der Paarungsreflexe und die Annahme der künstlichen Vagina (Frist 12 Wochen nach Ablauf der Quarantäne.

aus: ADR-Empfehlung 8.2, 2006 16

Anforderung an Zuchtbullen für den Einsatz in der künstlichen Besamung und für Deckbullen

Befruchtungsfähigkeit (Frist: 4 Monate ab Beginn des Einsatzes):

- Erfüllung der Mindestanforderungen des Ejakulates (s. u.!)

- Beurteilungsgrundlage: drei Ejakulatuntersuchungen in einem Abstand von 3 – 5 Tagen; bei Nichterfüllung der Mindestanforderungen in mindestens einem Ejakulat – Untersuchung von zwei weiteren Ejakulaten im Abstand von nicht weniger als 14 Tagen und nicht mehr als 4 Wochen – Die Gewährfrist für die Spermaqualität beträgt 12 Wochen nach Abschluß der Quarantäne

- Sonderegelung Deckbullen (Frist: 12 Wochen nach Einstallung): Potentia coeundi: - Mangelnde Libido sexualis ist frühestens zwei Wochen nach Verbringung anzeigbar.

-- Nach einer Deckruhe von einem Tag müssen zwei Drittel der dem Bullen vorgestellten paarungsbereiten Tiere gedeckt werden.

-Potentia generandi:- Von sechs einmal gedeckten Rindern sollen vier erfolgreich befruchtet

werden.

ADR-Empfehlung 8.2, 2006 17

Methoden der Samengewinnung bei Bullen

Künstliche Vagina: Methode der Wahl

Elektroejakulation: Methode nur für Sonderfälle, in Deutschland

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Samengewinnung mittels der künstlichen Vagina

Erstmals bei Bullen durch Milowanow (SU, 1931) verwendet

Im Laufe der Jahre zahlreiche Modellmodifikationen entstanden

Sehr häufig genutzt: das dänische Modell

Sprungpartner: Zuchtbulle, fixes oder bewegliches Phantom

19Minitüb, 1998

Samengewinnung durch Elektroejakulation

• Weit verbreitetes Verfahren in Ländern mit extensiver Rinderhaltung, vor allem bei Fleischrassen• Durch Stromstöße wechselnder Stromstärke und Spannung im Bereich der Anhangdrüsen kommt es zu Kontraktion der samen- ableitenden Wege und der Samenblasendrüsen (0 auf 200 mA, 10-30 Volt, Reizdauer: 3-5 sec) • Erektion Ejakulation; auch Ejakulation ohne Erektion

20

Elmore, 1985

Minitüb, 2003

Samengewinnung durch Elektroejakulation

In der deutschen Rinderzucht • nicht zulässig bei Bullen mit Störungen der

Begattungsfähigkeit oder mit schwacher Libido sexualis

• anwendbar beispielsweise beim Verdacht, dass die schlechte Konzeption von Färsen/Kühen einer Herde (Fleischrasse) durch den Deckbullen hervorgerufen wurde

nein ja21

Parsons, 2003Walker, 1991

Künstliche Vagina

- Mantelrohr, z. B. aus Hartgummi

- Innenschlauch, z. B. aus Latex

- Samenauffangglas

- Gummiringe

- Ventil

- Gleitmittel

- Latextrichter

22Minitüb, 2003

Künstliche Vagina

Schlüsselreize:- Temperatur (zwischen 40 - 41°C)- Druck- Gleitvermögen

- Wärmeschrank (Cave: Keimvermehrung)- Wasser (Cave: spermizid)- alternativ: Luft

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Absamvorgang

- geschlechtliche Stimulation- Entwicklung von Routinen

-Präputium erfassen und Penis ablenken- Vagina anbieten

Eingangsöffnung der Vaginawird an die Penisspitze geführt

- Suchbewegungen - der Bulle stößt aktiv in die Vagina

Fehler:- Penis erfassen- Vagina überstülpen

24 Busch/Löhle/Peter, 1991

Hygienische Samengewinnung garantiert keimarmes Sperma

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Top Agrar , 1994

Spermabeurteilung – Richtwerte Ejakulat (unverdünntes Sperma)

Parameter bis 2 Jahre über 2 Jahre

Konsistenz rahmig bis milchig

Farbe elfenbeinfarben bis weiß

Massenbewegung gute Massenbewegung, lebhafte Wellen- und Schwarmbewegungen mit dunklen Verdichtungen

Vorwärtsmotilität ≥ 70 %

Veränderte Spermien < 20 %, ≤ 5 Kopf- , ≤ 10 Kopfkappenveränderungen

pH-Wert 6,4 - 7

Dichte/ml ≥ 600000

Volumen/ml ≥ 2 ≥ 4

Gesamtzahl x 109 durchschnittlich bei 6

ADR-Empfehlung 8.2, 200626

Spermakonservierung beim Rind

TRIS-Eidotter-Citronensäure-Fructose-Glycerol: für Pailletten

Verfahren T: °C Verdünner Befruchtungs-fähigkeit

Flüssigsperma +5 Na-Zitrat, TRIS-Puffer, Milch-Glycerin mit oder

Eidotter, Antibiotika

4 Tage

Flüssigsperma +15 bis+25

Caprogenhaltiger V.

+ Glucose + Antibiotika

3 Tage

TG-N2-Sperma

- 196 Na-Zitrat-Glycerin mit Fruktosezusatz, TRIS-

Verdünner,

Soja-Lecithine, Antibiotika

unbegrenzt

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Spermakonservierung beim Rind

TRIS-Eidotter-Citronensäure-Fructose-Glycerol: für Pailletten

Verfahren T: °C Verdünner Befruchtungs-fähigkeit

Flüssigsperma +5 Na-Zitrat, TRIS-Puffer, Milch-Glycerin mit oder

Eidotter, Antibiotika

4 Tage

Flüssigsperma +15 bis+25

Caprogenhaltiger V.

+ Glucose + Antibiotika

3 Tage

TG-N2-Sperma

- 196 Na-Zitrat-Glycerin mit Fruktosezusatz, TRIS-

Verdünner, Soja-Lecithine, Antibiotika

unbegrenzt

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 Frischsperma-Konservierung

• Nutzung eines kaprogensäurehaltigen Verdünners

• Besamungsdosis: 2 - 5 Mio. Spermien!

• Begasung der Inseminationsportion mit Stickstoff

• Befruchtungsfähigkeit der Samenzellen etwa 3 Tage

• Anwendung z.Z. in Gegenden mit hoher Rinder- konzentration (z.B. Nordwestdeutschland, Bayern) oder bei hohem Bedarf an Sperma eines Spitzenbullen

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Spermabeurteilung Anforderung an flüssigkonserviertes Sperma

• Gesamtzahl mindestens 3 Mio. Spermien

• mindestens 50 % Vorwärtsbeweglichkeit bis 72 Std. nach der Gewinnung bei sachgerechter Lagerung

ADR-Empfehlung 8.2.2006

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Kryokonservierung (TG-Sperma)

• Wichtigste Methode der Spermaverarbeitung beim Rind

• Eidotter ist in verschiedenen Verdünnermedien nach wie vor

sehr gebräuchlich

• Anzahl der Spermien pro Dosis: 15-25 Mio., nach Auftauen

etwa 10 Mio. lebende Spermien (Schwellenwert)

• Neuer Verdünner: auf der Basis von Soja-Lecithinen

Verdrängung des Eigelbs in den Verdünnern?

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Spermakonservierung beim Rind

TRIS-Eidotter-Citronensäure-Fructose-Glycerol: für Pailletten

Verfahren T: °C Verdünner Befruchtungs-fähigkeit

Flüssigsperma +5 Na-Zitrat, TRIS-Puffer, Milch-Glycerin mit oder

Eidotter, Antibiotika

4 Tage

Flüssigsperma +15 bis+25

Caprogenhaltiger V.

+ Glucose + Antibiotika

3 Tage

TG-N2-Sperma

- 196 Na-Zitrat-Glycerin mit Fruktosezusatz, TRIS-

Verdünner,

Soja-Lecithine, Antibiotika

unbegrenzt

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Spermabeurteilung – Anforderung an aufgetautes Tiefgefriersperma

- Auftauen unter kontrollierten Bedingungen:- 38°C im Wasserbad für 10 Sekunden

- mindestens 50 % Vorwärtsbeweglichkeit

- pro Besamungsportion mindestens 6 Mio. vorwärtsbewegliche Spermien

ADR-Empfehlung 8.2

Bedenke: - 30 – 50 % der Spermien überleben das Einfrieren und Auftauen nicht

– daher muss mehr rein als rauskommen soll- bei den überlebenden Spermien ist die Überlebenszeit verkürzt

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Neuer Verdünner für das BullenspermaBiociphos: Soja-Lecithine anstatt Eigelb

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Kommerzielle Verdünner

Eidotterhaltige Verdünner Eidotterfreie VerdünnerTriladyl (Minitüb) Biociphos Plus (IMV)

Trilutor (BIOLAB) BioXCell (IMV)

Laiciphos (IMV) AndroMed (Minitüb)

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Verschiedene Verpackungsformen für Sperma:

Ampulle, Pellet mit Auftaulösung, Minitüb, mittlere Paillette

36Top Agrar, 1994

Pailletten ( Straws)• Entwicklung aus Frankreich, die sich seit den sechziger Jahren weltweit verbreitet hat.

• Polyvinylchlorid, verschiedene Farben

• Verschiedene Größen:- große Pailletten (Makrotübs): Länge 240 mm; 5 mm, Inhalt 4 ml

- mittlere Pailletten: Länge 133 mm; 2,9 mm, Inhalt 0,5 ml- feine Pailletten: Länge 133 mm; 2 mm, Inhalt 0,25 ml- Modell Minitüb: Länge 65 mm; 3 mm, Inhalt 0,25 ml

• Vorteile der Miniaturisierung:- rationelle Lagerung- Veränderung des Verhältnisses von Oberfläche zu Inhalt

Nachteile der Miniaturisierung:- bei einigen Tieren müssen mehrere Pailletten eine

Besamungsportion ergeben (Pferd)37

Spermalagerung

- in flüssigem Stickstoff (N2)

- Temperatur -196 Grad Celsius

- Eigenschaften: - farblos- geruchlos- chemisch nicht aggressiv- schwerer als Luft- Siedepunkt: -196 °C

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Gefahr durch flüssigen Stickstoff

- N2 muss verdampfen können- Explosionsgefahr bei festem Verschluss- Erstickungsgefahr in verschlossenen Räumen

- Erfrierungen- besondere Gefahr: Augenverletzungen

Merke: - Container vor Umkippen schützen,auch im Auto

- Augen schützen (Schutzbrille tragen)

- Container nicht in schlecht belüfteten Räumen lagern (Keller, Abseiten, u .a.)

- Container müssen regelmäßig aufgefüllt werden

39

40AGTK Wehrend, 2007

Sollte nicht im Fahrgastraum transportiert werden.

41

AGTK Wehrend, 2007

Sofortmassnahmen bei Unfällen mit flüssigen Stickstoff

- Kleidung und Schuhe ausziehen, wenn N2 zwischen Kleidung und Haut

- Augen: mit Wasser spülen

- Bei Blasenbildung nicht reibenbetroffene Stellen mit Verbandsmaterial abdecken

- Räume lüften

42AGTK Wehrend, 2007

Entnahme einer Besamungsportion

Prinzip

- Nur die Portion entnehmen, die gebraucht wird- die anderen Portionen nicht schädigen- die entnommene Portion unverzüglich dem Auftauprozess zuführen

Vorgehen

- Kanister soweit anheben, dass Paillette mit Pinzette erfasst werden kann

- obere Kante der Pailletten darf Niveau der Containeröffnung nicht überragen

- Paillette kurz schwenken- Kanister absenken- Paillette ins Auftaugerät überführen

43

Geräte für das Auftauen von Tiefgefriersperma

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Minitüb, 2001

Vorbereitende Maßnahmen für die Insemination

• Auftauen der Paillete (38°C, Wasserbad)

Feine Paillette: 10 sec.

Minitüb: 20 sec.

(Motilität der Samenzellen: 50%)

• Abtrocknen der Paillette

• Einlegen der Paillette in das Besamungsgerät

• Abschneiden der Paillettenspitze

• Ansetzen der Inseminationshülle

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46Top Agrar, 1995

47Top Agrar 1995

Besamungszeitraum

• Ideale Bedingungen für eine Konzeption liegen dann vor, wenn bereits zum Zeitpunkt der Ovulation in der Eileiterampulle Spermien präsent sind.

• Die Lebensfähigkeit, vor allem die Befruchtungsfähigkeit der Spermien im Eileiter beträgt etwa 24 Stunden.

• Die Lebensdauer der Eizelle ist relativ kurz, etwa 6 - 8

Stunden. Lebende Samenzellen sollten gegen Ende der

Brunst im Eileiter befruchtungsbereit sein.

48

Der optimale Besamungszeitpunkt (I)

• Ovulation erfolgt durchschnittlich 8 - 12 Stunden nach Ende der äußeren Brunstsymptome

• Kapazitation der Spermien dauert 6 - 8 Stunden

Optimaler Besamungszeitpunkt liegt in der zweiten

Hälfte des Östrus, d.h. 12 bis 18 Stunden nach den ersten Brunstsymptomen

Morgens-Abends-Regel

(steht die Kuh morgens => Besamung abends)

Fehlerquelle: Brunstfeststellung entspricht nicht dem Brunstbeginn

49

• Samenablage in den Gebärmutterkörper

intrauterine Spermadeponierung • Samenablage in das vordere Drittel der Zervix

intrazervikale Spermadeponierung

- Samenablage in das ipsilaterale Horn

tief intracornuale Spermadeponierung

Samenablage in Genitaltrakt

- Standardmethoden

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• In den Gebärmutterkörper: bei Erstbesamung und Nachbesamung, wenn deutliche Brunsterscheinungen auftreten und wenn eine Trächtigkeit mit Sicherheit auszuschließen ist ,

• in das vordere Drittel der Zervix: bei Nachbesamung, wenn schwächere Brunstzeichen zu erkennen sind und wenn eine Trächtigkeit nicht mit Sicherheit auszuschließen ist,

• tief in das Horn: bei reduzierter Spermienzahl pro Inseminations- dosis und Besamung mit Sperma von Spitzenbullen mit niedriger Befruchtungsrate.

Samenablage in Genitaltrakt

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Samenablage im weiblichen Genitale

Im Natursprung wird der Samen unmittelbar vor dem äußeren Muttermund abgesetzt

(etwa 1-5 Mrd. Samenzellen)

Bei der Insemination wird der Samen im kranialen Teil der Zervix oder im Uteruskörper abgesetzt

(etwa 10-20 Mio. Samenzellen)

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Senger, 1997

53

Minitüb, 2001

Die Technik der Sameneinführung, die heute weltweit verwendet wird, ist die Insemination unter

rektaler Kontrolle und Fixierung der Zervix

Die Zervix wird nach kranial geschoben.Dadurch glättet sich die Schleimhaut der Vagina, die Besamungspipette kann leichter eingeführt werden.

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AGTK Wehrend, 2007

InseminationstechnikSamenablage unter rektaler Kontrolle

Aufspreizen der Schamlippen Einführen des Besamungsgerätes tief in die Vagina Einführen des Armes in den Mastdarm Richtiger Zervixgriff und Zervixpassage Fingerkontrolle der richtigen Lage der Spitze des Besamungsgerätes Insemination intrazervikal

intrauterin

intrakornual Entfernung und Kontrolle des Besamungsgerätes Rektale Massage der Gebärmutter

(eventuelle Klitorismassage)55

56

Parey/Duplan 1987

Fehlerhafte Inseminationstechnik

Wenn der Besamer die Zervix zu sich hin zieht, legt

sich die Schleimhaut der Vagina in Falten, in denen

sich das Besamungsgerät verfängt.

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AGTK Wehrend 2007

Fehlerhafte Inseminationstechnik

Wenn die Zervix zu weit kranial gefasst wird,

knickt das Orificium externum ab und kann nicht

gefunden werden.

58

AGTK Wehrend, 2007

Brunstverlauf und Reifung der Spermien bei zeitgerechter Besamung

59Top Agrar, 2003