460

Gr6ge und Gesamtladung aufgrund eines weiteren Kriteriums, n/imlich der spezifischen Bindungseigenschaften des Carboxylen- des, aufgetrennt werden.

Da alle Serin-Proteasen trotz unterschiedlicher Spaltungsspe- zifitfit einen essentiellen Serinrest-195 besitzen, lfigt sich die gleiche Modifikations-Reaktion im Prinzip auf weitere Enzyme mit neuen Bindungseigenschaften anwenden.

Literatur

1. Fahrney DE, Gold AM (1963) J Am Chem Soc 85:997 2. Ako H, Ryan CA, Foster RF (1972) Biochem Biophys Res

Comm 46:1639 3. Ritter K (1981) Diplomarbeit, Univ Heidelberg 4. Yokosawa H, Ishii S (1976) Biochem Biophys Res Comm

72 : 1443

B 52

Fresenius Z Anal Chem (1982) 311:460- 461 - �9 Springer-Verlag 1982

Affinitiits-Chromatographie von Plasminogen an Lysin-Sepharose und Concanavalin A- Sepharose

E. K6ttgen, H. A. Fabricius, S. Schmitt, W. M6ssner und W. Gerok Medizinische UniversitMsklinik Freiburg, Hugstetterstr. 55, D-7800 Freiburg, Bundesrepublik Deutschland

Affinity Chromatography of Plasminogen on Lysine-Sepharose and Concanavalin A-Sepharose

Plasminogen als inaktive Vorstufe der Serinprotease Plasmin ist seit langem als Glykoprotein bekannt. Schon eine partielle Deglykosylierung scheint die Enzymaktivitfit zu beeinflussen. Nach neuen Untersuchungen k6nnen ein Plasminogen I (Pg 1) mit N-glykosidisch gebundenem Kohlenhydratrest von einem Plasminogen II (Pg II) mit O-glykosidischer Kohlenhydrat-Bin- dung unterschieden werden [1]. Diese molekularen Varianten be- sitzen unterschiedliche Affinit/it zu Fibrin und zu Antiplasmin [2].

Wir beschreiben hier ein neues Verfahren zur Trennung von Pg I u n d Pg II und zeigen erste Befunde fiber das variable Vorliegen der molekularen Varianten im Plasma von Patienten verschiedener Krankheitsgruppen.

Material und Methoden. Die Affinitfits-Chromatographie von Plasma an Lysin-Sepharose (Pharmacia, Freiburg, FRG) erfolg- te nach Deutsch u. a. [3]. Nach Elution des nicht Lysin-bindenden Proteinanteils erfolgt die spezifische Elution mit einem e-Amino- capronsS.ure (EAC)-Gradienten. Die Affinidits-Chromatogra- phie an Concanavalin A-Sepharose (Con A S.) erfolgte nach [4], wobei der Lectin-gebundene Proteinanteil mit 0.5 M Methylman- nosid eluiert wurde. Die Plasminogen-Aktivit~itsbestimmung erfolgte nach Streptokinase-Aktivierung in einem fluorimetrisch- kinetischen Test mit dem Substrat D-valine-leucine-5-amido- isophthalic acid dimethylester (Protopath, Dade, Mfinchen, FRG). Parallel wurde die Plasminogen-Konzentration mit der radialen Immundiffusion ermittelt.

Ergebnisse und Diskussion. Plasminogen kann an Lysin-Sepha- rose mittels eines EAC-Gradienten in zwei molekulare Varian- ten mit unterschiedlicher Lysin-Affinit/it getrennt werden (Abb. 1 A). Bei Rechromatographie dieser Plasminogen-Fraktio- nen wird jedoch deutlich, dab mit diesem relativ zeitaufwendigen Verfahren Pg I und Pg II nicht vollstfindig zu differenzieren sind.

Da Pg I in seinem N-glykosidisch gebundenen Kohlenhydrat- rest Mannose besitzt, nicht dagegen Pg II (NANA, Gal, Gal- NAc), ist zu erwarten, dab das vorwiegend Mannose-spezifische Lectin Con A nur Pg I binder. Tatsfichlich ist Plasminogen nach Trennung an Con A S. in zwei molekulare Varianten mit und ohne Con A-Affinitfit zu trennen. Wird die Plasminogen-Frak- tion ohne Con A-Affinitfit an Lysin Seph. rechromatographiert, so wird sie im EAC-Gradienten entsprechend Pg II eluiert (Abb. 1B). Die primfir Con A-bindungsf~ihige Proteinfraktion enthfilt dagegen ausschlieglich Pg I (Abb. 1 C).

Ebenso k6nnen die Plasminogen-Fraktionen nach Lysin- Seph. an Con A-Seph. rechromatographiert werden. Auch jetzt

wird Pg I vom tr/igergebundenen Lectin fixiert, nicht dagegen das Mannose-freie Pg II.

Mehrfachanalysen einer Plasmaprobe zeigen bei Chromato- graphie an Con A Seph. eine sehr gute Reproduzierbarkeit und eine Ausbeute von fiber 85 %. Mit Hilfe der schon frfiher von uns beschriebenen Minisfiulen-Chromatographie [4] ist die Trennung der Plasminogen-Varianten auch in gr68eren Analysenserien m6glich.

Wir prfiften in ersten orientierenden Untersuchungen den relativen Anteil der Plasminogen-Varianten bei Gesunden und

~Abs.280nm ,...

'- A

0,10

5 - 0.05 ..'

0 , " ' ; . , , I F 0 25 ... 0 20 40 60 80ml o

�9 i /l"

/ 008

Abb. 1A--C. AffinitMs-Chromatographie von Plasminogen aus Humanplasma an Lysin-Sepharose. A Nativ-Plasma. Nach Elu- tion des nicht-Lysin-bindenden Proteinanteils mit 0.1 M Phos- phat, pH 8.0 wird Plasminogen im e-Aminocaprons~ure (EAC)- Gradienten in zwei molekularen Varianten eluiert (Pg I und Pg II). Humanplasma kann an ConA Seph. in eine Fraktion ohne und eine mit Con A-Affinitfit getrennt werden. Bei Rechro- matographie der Proteinfraktion ohne Con A-Affinit/it an Lysin- Seph. ist nur Pg II nachweisbar (B), dagegen reprfisentiert das Con A-bindungsfahige Plasminogen nur Pg I (C). CTA Plasmin- Aktivitfit

(.D

10

0.010 E

(D

-0,008

-0,006

-0,004

-0,002

-0,000

461

Literatur

100- I

%

75-

1. Hayes ML, Castellino FJ (1979) J Biol Chem 254: 8777- 8780 2. Lijnen HR, Van Hoff B, Collen D (1981) Eur J Biochem

120:149-150 3. Deutsch D, Mertz ET (1970) Science 170: 1095-1096 4. K6ttgen E, Lindinger G, Reutter W (1977) Clin Chim Acta

80: 221 -- 224

B53

Fresenius Z Anal Chem (1982) 311 : 461 - 462 - �9 Springer-Verlag 1982

Some New Applications of Analytical Capillary Isotachophoresis: Part I

E. Anhalt, R. V. Battersby, B. Btissenschfitt, G. Bulge, C. J. Holloway*, J. Ltistorff, V. Pingoud, E. Schuppe, and F. Tegtmeier

Abteilung ftir Klinische Biochemie, Zentrum Biochemie, Medizinische Hochschule Hannover, Karl-Wiechert-Allee 9, D-3000 Hannover, Federal Republic of Germany

Neue Anwendungen der analytischen Capillar-Isotachophorese: Teil I

Analytical capillary isotachophoresis is a separation method which has proved suitable for species as small as alkali metal ions and as large as immunoglobulins. This technique is the newest of the high-performance electrophoretic procedures. The theory applying to such separations has been reviewed in some detail by Everaerts and coworkers [1]. More recently, Holloway and Trautschold [2] have provided an extensive outline of the principles involved, particularly in separations in capillaries. In spite of the fact that isotachophoresis is well established in informed circles, there is a widespread ignorance concerning the principles and possibilities afforded by the method, which not infrequently leads to questions of competence in refereeing of publications on this subject for the scientific literature. We have already reviewed the applications of isotachophoresis to the separation and analysis of nucleotides [3], amino acids and peptides [4] and in enzymology [5] and clinical science [6]. The aim of this, and the following two articles, is to introduce some newly developed applications of isotachophoresis from our group.

Operating Conditions

The equipment employed for the present work was the LKB 2127 Tachophor, fitted with PTFE capillaries of length 23 or 61 cm. The following electrolyte systems were used for the work described in this and the following two articles:

System A: leading ion - chloride; terminating ion - he- xanoate; counter ion - /~-alanine.

System B: leading ion - chloride; terminating ion - /~- alanine; counter ion - tris(hydroxymethyl)- aminomethane.

System C: leading ion - chloride; terminating ion - 6- aminohexanoate (pH adjusted to 10.8 by the ad- dition of barium hydroxide); counter ion - 2- amino-2-methylpropane- 1,3-diol.

* Author to whom correspondence and reprint requests should be addressed

System D: leading ion - potassium; terminating ion - alanine; counter ion - acetate.

All leading electrolytes contained 0.25 ~ of hydroxypropyl- methylcellulose to reduce effects of electroendosmosis. A more detailed account of suitable experimental conditions has been given in our previous reviews [3-5] .

Design and Performance of a Sample Application Valve for Capillary Isotachophoretic Equipment

One of the drawbacks of commercially-produced capillary isotachophoretic equipment is the manner in which the sample is introduced, namely by means of a microsyringe, injecting the sample through a septum, approximately at the boundary between leading and terminating electrolytes. Apart from pos- sible inaccuracy associated with this procedure, there are often problems arising from interaction of sample with the metal of the syringe needle, e.g. oxalate [7]. As an alternative, we have

uv c

50.

25-

Patienten verschiedener Krankheitsgruppen. W~ihrend gesunde Kontrollpersonen einen Pg I-Anteil yon 4 2 - 48 % haben, kann dieser vor allem bei onkologischen Patienten-Gruppen zwischen 3 0 - 70 % einnehmen.

Da Plasminogen nicht nur f/Jr die Fibrinolyse, sondern auch bei immunologischen Prozessen sowie beim Tumorwachstum Bedeutung besitzt, k6nnen sich hieraus m6glicherweise neue pathobiochemische Aspekte ableiten lassen.

I I t t I r t J I t J l i t l I

2 4 6 8 10 12 HRS 16

Fig. 1. The kinetics of deiodination of 3,5-diiodotyrosine (A) to tyrosine (C), with intermediate 3-iodotyrosine (B), under acid hydrolytic conditions as described in the text. The insert is an isotachopherogram of a mixture of approximately 1 nmole each of the three substances, with traces derived from the UV signal at 254nm, and the thermodetector (T)