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Aus der
Dermatologischen Klinik
im St.-Josef-Hospital Bochum
-Universitätsklinik-
der Ruhr-Universität-Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. Peter Altmeyer
Differentielle Expression von Mikrotubuli-assoziiertem Protein 2 in melanozytären
Naevi und malignen Melanomen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Katharina Elisabeth Radkowski
aus Tübingen
2011
Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla
Referent: PD Dr. med. T. Gambichler
Koreferent: Prof. Dr. med. C. Szliska
Tag der mündlichen Prüfung: 13.11.2012
Abstract
Radkowski, Katharina
Differentielle Expression von Mikrotubuli-assoziiertem Protein 2 in melanozytären Naevi und
malignen Melanomen
Problem: Neoplastische Melanozyten können bestimmte Merkmale von Derivaten der Neuralleiste
aufweisen. In einigen Studien konnte eine Expression von Neuron-assoziierten Markern (z.B.
Neuropeptid Substanz P, Neuronen-spezifische Enolase) in primären und metastasierten Melanomen
gezeigt werden. Es wird davon ausgegangen, dass die Melanozyten der menschlichen Haut sich ihre
Plastizität zur Differenzierung beibehalten, sodass sie im Falle einer neoplastischen Transformation die
Fähigkeit besitzen Merkmale anderer Neuralleiste-Derivate zu imitieren.Unsere Studie zielte darauf ab,
die Expression von Mikrotubuli-assoziiertem Protein 2 (MAP2) in verschiedenen Arten von
melanozytären Hautveränderungen zu untersuchen.
Methode: Paraffin-Schnitte von Gewebeproben von gutartigen Naevi (BN), dysplastischen Naevi (DN)
und primären sowie metastasierten malignen Melanomen (SSM) wurden von uns retrospektive auf ihre
Immunreaktivität für MAP2 untersucht. Die Anzahl der positiv gefärbten Melanozyten innerhalb einer
Läsion pro Gesichtsfeld wurde als Prozentsatz auf die gesamte Melanozytenzellzahl im Gesichtsfeld
bezogen.
Ergebnis: Die Stichprobe umfasste insgesamt 124 Proben, wobei die Gruppe der benignen Naevi aus 42
Präparaten bestand. Die Gruppe der dysplastischen Naevi enthielt 22 Proben, die der Melanomgruppe 45,
sowie 15 Melanommetastasen. Die vertikale Tumordicke nach Breslow lag in der Melanomstichprobe im
Median bei 0.97 mm (von 0,1 bis 4,6 mm). Insgesamt gingen die klinischen Daten von 124 Patienten in
unsere Studie mit ein. Davon waren 80 der Teilnehmer Männer und 44 Frauen. Der Altersmedian lag bei
47.7±14.1 Jahren. Die Daten der immunhistologischen Auswertung zeigten deutliche Unterschiede der
Immunreaktivität von MAP2 in den untersuchten Läsionen. Es zeigte sich, dass die Immunreaktivität
gemessen an der MAP2-Expression in den DN mit 26±8.5% und den SSM mit 26.9±10.1% signifikant
erhöht (p < 0.05) war im Vergleich zu der MAP2-Expression bei den BN, die hier bei 18.6±10.5% lag.
Desweiteren war die Expression von MAP2 gemessen bei den subkutanen Metastasen mit 19.3±7.1%
signifikant (p < 0.05) vermindert, im Vergleich zur Immunreaktivität von MAP2 der DN (26±8.5%) und
des SSMs (26.9±10.1%). Hingegen schien es bei dem direkten Vergleich der MAP2-Expression den wir
bei den BN (18.6±10.5%) und den subkutanen Melanommetastasen (19.3±7.1%) beobachten konnten,
keinen großen Unterschied zu geben (p > 0.05). In den SSM korrelierte die MAP2-Expression signifikant
mit der vertikalen Tumordicke nach Breslow (r = 0,36, p = 0,016), dem Clark Level (r = 0,4, p = 0,0078)
und dem Stadium der Erkrankung (r = 0,31, p = 0,039).
Diskussion: Wir beobachteten eine signifikant erhöhte Expression von MAP2 in DN und SSM, im
Vergleich zu BN und subkutanen Metastasen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die MAP2-Expression
offenbar vom Grad der Tumorprogression abhängt. Die moderate Korrelation zwischen der
Immunreaktivität von MAP2, der Tumordicke nach Breslow, dem Clark Level und Stadium der
Erkrankung bestätigen diese Hypothese. Es wurde beobachtet, dass MAP2 während der Entstehung und
Progression von benignen und malignen melanozytären Hautveränderungen ein differentielles
Expressionsmuster zeigt. Darüber hinaus zeigen unsere Daten, dass MAP2 ein moderater positiver
Prädiktor für die Entwicklung des SSM ist.
4
Meiner Familie
I
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung und Grundlagen ...................................................................................... - 1 -
1.1. Vorwort ............................................................................................................. - 1 -
1.2. Das Maligne Melanom ...................................................................................... - 1 -
1.2.1. Definition ................................................................................................... - 1 -
1.2.2. Epidemiologie ............................................................................................ - 2 -
1.2.3. Ätiologie und Risikofaktoren ..................................................................... - 3 -
1.2.4. Klinik ......................................................................................................... - 4 -
1.2.5. Histologische Kriterien für die Melanomdiagnose .................................... - 6 -
1.2.6. Metastasierungswege ................................................................................. - 8 -
1.2.7. Diagnose .................................................................................................... - 9 -
1.2.8. Stadieneinteilung ..................................................................................... - 11 -
1.2.9. Therapie ................................................................................................... - 13 -
1.2.10. Prognose und Nachsorge ....................................................................... - 15 -
1.3. Der melanozytäre Naevus ............................................................................... - 16 -
1.3.1. Definition ................................................................................................. - 16 -
1.3.2. Einteilung der melanozytären Naevi ........................................................ - 17 -
1.3.3. Diagnostik ................................................................................................ - 20 -
1.3.4. Therapie ................................................................................................... - 21 -
1.3.5. Prävention ................................................................................................ - 21 -
1.4. Tumormarker .................................................................................................. - 22 -
1.4.1. Definition ................................................................................................. - 22 -
1.4.2. Tumormarker des malignen Melanoms ................................................... - 22 -
1.4.2.1. S100 .................................................................................................. - 23 -
1.4.2.2. MIA ................................................................................................... - 25 -
1.4.2.3. LDH .................................................................................................. - 25 -
1.4.2.4. HMB-45 ............................................................................................ - 26 -
1.4.2.5. Melan A/MART 1 ............................................................................. - 26 -
II
1.4.2.6. Ki-67 ................................................................................................. - 27 -
1.5. Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAPs) ....................................................... - 28 -
2. Zielsetzung ............................................................................................................. - 30 -
3. Material und Methoden .......................................................................................... - 31 -
3.1. Patienten .......................................................................................................... - 31 -
3.1.1. Gewebeproben ......................................................................................... - 31 -
3.1.2. Gewebearten ............................................................................................ - 31 -
3.2. Schritte zur Vorbereitung ................................................................................ - 32 -
3.3. Immunhistochemie .......................................................................................... - 33 -
3.3.1. Prinzip der Immunhistochemischen Färbung .......................................... - 34 -
3.3.2. Avidin/Streptavidin-Biotin-Methode ....................................................... - 35 -
3.4. Durchführung der immunhistochemischen Färbungen ................................... - 36 -
3.5. Auswertung der histologischen Schnitte ......................................................... - 38 -
3.6. Die statistische Analyse .................................................................................. - 39 -
4. Ergebnisse .............................................................................................................. - 41 -
4.1. Das Patientenkollektiv .................................................................................... - 41 -
4.2. Qualitative Auswertung der Schnittpräparate nach MAP2-Färbung .............. - 42 -
4.3. Bildmaterial .................................................................................................... - 44 -
4.4. Quantitative Auswertung der MAP2-Expression ........................................... - 51 -
5. Diskussion .............................................................................................................. - 53 -
5.1. Anforderung an den Marker ........................................................................... - 53 -
5.2. Einordnung der eigenen Ergebnisse ............................................................... - 59 -
5.3. Die Rolle der Methodik .................................................................................. - 65 -
5.4. Schlussfolgerungen, Ausblick für die weitere Forschung .............................. - 67 -
6. Zusammenfassung ................................................................................................. - 70 -
7. Literaturverzeichnis ............................................................................................... - 73 -
- 1 -
1. Einleitung und Grundlagen
1.1. Vorwort
Auch zu Beginn des 21. Jahrhunderts bleibt das maligne Melanom eine potentiell
tödliche Krankheit, was zu anhaltenden Sorgen aus einer Reihe von Gründen führt.
In einer Zeit, in der die Häufigkeit vieler Tumorentitäten eher abnimmt, nimmt die
Inzidenz des malignen Melanoms weiter zu. Ein großer Teil dieser Zunahme liegt darin,
dass schon relativ junge Menschen von dieser Erkrankung betroffen sind und folglich
die Zahl der potentiell verlorenen Lebensjahre pro Tod durch Melanom höher ist, als bei
anderen soliden Tumoren (MacKie et al., 2009).
Weltweit ist das maligne Melanom der Tumor mit der am schnellsten wachsenden
Inzidenz. Kohortenstudien zeigen, dass sich dieser Trend in Zukunft für mindestens die
nächsten zwei Jahrzehnte fortsetzen wird, und aus diesem Grund eine zusätzliche
Verdoppelung der bisherigen Inzidenz zu erwarten ist. (Garbe and Leiter, 2009).
Es hat sich gezeigt, dass neoplastische Melanozyten in der Lage sind bestimmte
Merkmale von Derivaten der Neuralleiste beizubehalten. In einigen Studien konnte eine
Expression von Neuron-assoziierten Markern (z.B. Neuropeptid Substanz P, Neuronen-
spezifische Enolase) in primären und metastatischen Melanomen gezeigt werden. Es
wird davon ausgegangen, dass die Melanozyten der menschlichen Haut sich ihre
Plastizität zur Differenzierung erhalten, sodass sie im Falle einer neoplastischen
Transformation die Fähigkeit besitzen Merkmale anderer Neuralleiste-Derivate zu
imitieren. Die vorliegende Studie zielte darauf ab, die Expression von Mikrotubuli-
assoziierten Protein 2 (MAP2) in verschiedenen Arten von melanozytären
Hautveränderungen zu untersuchen und nach möglichen neuen Ansätzen in der
Diagnostik des malignen Melanoms zu suchen.
1.2. Das Maligne Melanom
1.2.1. Definition
Das Melanom ist der maligne Tumor der pigmentbildenden Zellen und der am
häufigsten tödlich verlaufende Hauttumor überhaupt. Dieser Tumor betrifft nicht nur
ältere Menschen, sondern ist einer der häufigsten Tumoren junger Erwachsener (Netter,
2009). Das maligne Melanom ist ein bösartiger Tumor, der vom melanozytären
Zellsystem ausgeht und sich ganz überwiegend an der Haut manifestiert. Auch am
Auge, an den Hirnhäuten und an Schleimhäuten verschiedener Lokalisation kann es
- 2 -
vorkommen. Meist ist das Melanom stark pigmentiert, es können aber auch
amelanotische Formen auftreten (Garbe et al., 2005; Hein et al., 2011a).
1.2.2. Epidemiologie
Das Melanom ist gerade deshalb verstärkt ins öffentliche Bewusstsein gerückt, da bei
dieser Tumorart eine drastische Erhöhung der Zuwachsraten mit einer Verdoppelung
der Erkrankungsfälle alle 10-15 Jahre messbar ist (Netter, 2009).
Eine steigende Inzidenz des kutanen Melanoms ist bei der weißen Bevölkerung in den
letzten vier Jahrzehnten beobachtet worden.
Die Häufigkeit des Auftretens ist eng verbunden mit dem Hauttyp und der
geografischen Lage. Die höchsten Inzidenzraten wurden aus Queensland, Australien,
mit 56 neuen Fällen für Männer und 43 für Frauen pro Jahr und 100.000 Einwohnern
berichtet (Leiter and Garbe, 2008). Im weltweiten Vergleich haben wir in Europa eine
mittlere Inzidenz. Die Inzidenz beträgt für Mitteleuropa 10-12 Fälle pro 100.000
Einwohner und Jahr. Die höchsten Inzidenzraten wurden aus Skandinavien berichtet,
mit etwa 15 Fällen pro 100.000 Einwohnern und Jahr, die niedrigste aus den Ländern
des Mittelmeerraums mit ca. 5-7 Fällen pro 100000 Einwohnern und Jahr (Garbe and
Blum, 2001).
In Deutschland liegt die Inzidenz des malignen Melanoms zwischen 18,3 und 20,1 pro
100.000 Einwohner und Jahr (Robert Koch-Institut, 2010). Im Jahr 2006 waren 7360
Männer und 8470 Frauen in Deutschland an einem Melanom erkrankt. Das maligne
Melanom liegt bei Männern auf Platz 8 aller Krebserkrankungen und bei Frauen auf
dem 6. Platz. Nach Hochrechnungen des Tumorregisters München (TRM) kann die
Anzahl der jährlichen Neuerkrankungen am malignen Melanom aber mit etwa jeweils
9800 Fällen höher eingestuft werden (Schmidt and Schubert-Fritschle, 2011).
Der Altersgipfel bei Erstdiagnose liegt zwischen dem 60. und 70. Lebensjahr, der
Altersmedian bei 57,7 bis 61,6 Jahren. Es sind aber auch junge Menschen von dieser
Erkrankung betroffen, was nicht außer Acht gelassen werden darf (Schmidt and
Schubert-Fritschle, 2011).
Bei Dunkelhäutigen und Asiaten ist die Inzidenz gering. Hier tritt das Melanom vor
allem an Schleimhäuten, Fußsohlen und den Handflächen auf (Garbe et al., 2005).
Die Sterblichkeitsraten von Melanomen zeigen eine Stabilisierung in den
USA, Australien und auch in europäischen Ländern (Leiter and Garbe, 2008).
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1.2.3. Ätiologie und Risikofaktoren
Die Risikofaktoren für das maligne Melanom können in solche genetischen Ursprungs
und umweltbedingte Faktoren unterteilt werden (MacKie et al., 2009).
Studien haben gezeigt, dass eine hohe Anzahl an melanozytären Naevi, sogenannten
Muttermalen, ein wesentlicher Risikofaktor für das Auftreten des sporadischen
Melanoms ist (Swerdlow et al., 1986).
Dabei spielt die Anzahl der Naevi eine Rolle. Menschen mit mehr als 100 Naevi am
gesamten Körper haben ein etwa 7-fach erhöhtes Risiko im Vergleich zu solchen, die
weniger als 10-15 Naevi aufweisen (Ramrath et al., 2011). Die Anzahl der gezählten
Naevi variiert von Land zu Land, eine hohe Anzahl ist meist mit einer größeren UV-
Exposition verbunden und kann dann als Surrogat-Marker für die UV-induzierten
Hautschäden eingesetzt werden (MacKie et al., 2009).
Bei der hellhäutigen Bevölkerung lässt sich ein Zusammenhang von Inzidenz und UV-
Belastung der Körperhaut feststellen (Wiecker et al., 2003). Ein verändertes Freizeit
und Bräunungsverhalten scheint eine Rolle bei der Entstehung des malignen Melanoms
zu spielen, so zeigen epidemiologische Studien einen Zusammenhang zwischen dem
Auftreten des malignen Melanoms und dem Bräunen der Haut im Solarium (Schmitz et
al., 1994; Ramrath et al., 2011). Nicht nur kurze intensive Einheiten von
Sonnenexpostion scheinen ein signifikantes Risiko für das Melanom darzustellen,
sondern gerade die kumulative UV-Belastung über Jahre (Elwood and Gallagher, 1998).
Das Vorkommen von atypischen Naevi, auch dysplastische Naevi genannt, ist ein
unabhängiger Risikofaktor für das maligne Melanom. Insbesondere Menschen mit
dysplastischen Nävi, die als Melanomvorstufen angesehen werden, haben ein erhöhtes
Risiko nach vermehrter Sonnenexposition maligne Melanome zu entwickeln (Garbe et
al., 1994a).
Auch eine genetische Disposition scheint bei der Krankheitsursache eine Rolle zu
spielen, so tritt das maligne Melanom familiär gehäuft auf (Pho et al., 2006).
Es konnte beispielsweise gezeigt werden, dass rund ein Drittel der Patienten aus
Familien mit malignen Melanom eine identifizierbare Keimbahnmutation in einem
bestimmten Gen (CDKN2A) aufweisen, dass eine Rolle bei dem Eintritt der Zelle in
den Zellzyklus spielt (Pho et al., 2006).
Eine Reihe von Arbeitsgruppen ist derzeit damit beschäftigt weitere mögliche, für das
maligne Melanom verantwortlichen, Gene zu identifizieren und zu erforschen (Avilés
and Lázaro, 2006).
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1.2.4. Klinik
Klinisch-histologische Subtypen kutaner maligner Melanome
Die Einteilung erfolgt nach klinischen und histologischen Kriterien. Das maligne
Melanom wird in verschiedene klinisch-histologische Subtypen unterteilt. Zu den vier
Haupttypen des malignen Melanoms zählen das superfiziell spreitende Melanom (SSM,
Häufigkeit ca.60%), das noduläre maligne Melanom (NMM, Häufigkeit ca. 20%), das
Lentigo-maligna-Melanom (LMM, Häufigkeit ca. 10%) und das akrolentiginöse
Melanom (ALM, Häufigkeit bei Kaukasiern ca. 5%). Seltene Varianten des malignen
Melanoms, wie das maligne Melanom der Schleimhäute oder andere Sonderformen,
werden in den restlich 5% erfasst (Hein et al., 2011a).
Tabelle 1: Klinisch-histologische Subtypen des kutanen malignen Melanoms (nach Garbe et al. 2005)
Melanomtyp Anteil an allen
Melanomformen in %
Medianes Alter in Jahren
Superfiziell spreitendes Melanom 57,4 51
Noduläres Melanom 21,4 56
Lentigo-maligna-Melanom 8,8 68
Akral-lentiginöses Melanom 4,0 63
Nicht klassifizierbares Melanom 3,5 54
Sonstige 4,9 54
Superfiziell spreitendes malignes Melanom (SSM)
Das SSM ist die häufigste Melanomform und kann an jeder Körperstelle und in jedem
Alter auftreten. Die Läsionen haben klassischerweise eine starke Variation in ihrer
Pigmentierung. Die Vielfalt der Pigmentierung zeigt sich in einem Vorkommen von
verschiedenen Farbtönen. Insbesondere schwarzbraune und rosa bis graue Farbtöne
geben Hinweise auf für diesen Tumor typische Regressionszonen. Prädilektionsstelle ist
der Rumpf (Hein et al., 2011a).
Vorherrschend ist hier zunächst ein horizontales Wachstumsmuster. Das SSM imponiert
makroskopisch als fleckförmige Erhabenheit mit einem Durchmesser von >6mm. Später
kommt es dann zu einem vertikalen Wachstum einhergehend mit einem erhöhten
Metastasierungsrisiko. In der Histologie finden sich in allen Hautschichten polymorphe,
zytoplasmareiche Tumorzellen, die ein pagetoides Wachstumsmuster aufweisen (Riede
et al., 2004).
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Noduläres malignes Melanom (NMM)
Das noduläre Melanom kann knotig, polypös oder gestielt in Erscheinung treten. Es
zeigt kein radiales Wachstum. Diese Melanome zeichnen sich durch ein schnelles
Wachstum aus und gehen direkt, mit Überspringen einer horizontalen Wachstumsphase,
in ein vertikales Wachstumsmuster über. Bei einem primär knotig wachsenden
Melanom zeigt sich das Melanom als ein scharf begrenzter Tumor von
unterschiedlichem Durchmesser mit einer Neigung zu Ulzerationen. Je nach
Pigmentgehalt ist es braunschwarz bis rötlich. Der Tumorknoten zeigt unter der
histologischen Betrachtung polymorphe und polychromatische epitheloide Zellen. Oft
liegt eine seitliche Begrenzung durch eine lymphozytäre Demarkierung vor (Riede et
al., 2004). Häufig werden diese Hauttumoren erst diagnostiziert, wenn es zu einer
Ulzeration gekommen ist, oder sie angefangen haben zu bluten und zu nässen (Hein et
al., 2011a).
Lentigo-maligna-Melanom (LMM)
Lentigo-maligna-Melanome treten auf sonnenexponierter Haut, wie im Bereich des
Gesichts und der oberen Extremitäten auf, insbesondere bei älteren Menschen (Situm et
al., 2010). Es handelt sich bei dieser Form hauptsächlich um eine in situ Variante des
Melanoms mit einer Proliferation von vorwiegend spindelförmigen Melanomzellen, die
in Form von Einzelzellen aber auch als Zellnester entlang der Basalzellschicht in der
chronisch lichtgeschädigten Haut vorkommen (Riede et al., 2004).
Nur bei etwa 5% der Patienten mit Lentigo maligna kommt es zu einem Fortschreiten
der Erkrankung mit der Ausbildung eines Lentigo-maligna-Melanoms, dieser Prozess
dauert in der Regel mehrere Jahre.
Histologisch erkennt man ein Lentigo-maligna-Melanom durch das Vorliegen einer
atrophischen Epidermis. Die basalen Schichten dieser atrophierten Epidermis enthalten
unterschiedlich große und spindelzellig konfiguierte Melanozyten, das Zytoplasma ist
vakuolisiert und die Zellkerne sind polymorph und hyperchromatisch. Das
Bindegewebe im Stratum papillare liegt bedingt durch die chronische Lichtschädigung
als basophilen Schollen vor, dies bezeichnet man auch als aktinische Elastose (Riede et
al., 2004).
Akral-lentiginöses Melanom (ALM)
Das ALM tritt typischerweise im Bereich der Handteller und Fußsohlen sowie an deren
Nagelorganen auf, insbesondere bei Menschen der schwarzen Bevölkerung aber auch
- 6 -
bei Asiaten (Bristow and Acland, 2008). Es kommt zu einer Melanomzellwucherung in
der Basalzellschicht der akralen Epidermis.
Das ALM wird häufig erst mit dem Auftreten von Ulzerationen erkannt, ein hoher
Prozentsatz dieser Hauttumore ist amelanotisch. Veränderungenan den Nagelplatten mit
einer begleitenden Hyperpigmentierung können Hinweise auf das Vorliegen eines ALM
sein (Hein et al., 2011a).
Lokalisation
Grundsätzlich kann man sagen, dass das maligne Melanom am gesamten Integument
auftreten kann. Allerdings konnte gezeigt werden, dass bei Frauen häufiger die
Unterschenkel betroffen sind, während es bei Männern eher am Rücken lokalisiert ist
(Randi et al., 2006). Bei Männern treten etwa 42,9% der malignen Melanome am
Stamm auf, bei Frauen dagegen nur 20,9%. Im Vergleich dazu sind die unteren
Extremitäten eher bei den Frauen betroffen (40,1%), während sie bei den Männern eher
einen kleineren Anteil ausmachen (16,6%). Dieser Trend konnte über einen Zeitraum
von bisher über 20 Jahre beobachtet werden (Schmidt and Schubert-Fritschle, 2011).
1.2.5. Histologische Kriterien für die Melanomdiagnose
Die histologische Beurteilung ist ein wesentlicher Bestandteil für die
Diagnosesicherung, sowie für die Stadieneinteilung.
Die Einordnung der Dignität sollte durch einen erfahrenen Histopathologen erfolgen,
der sein Augenmerk auf folgende Merkmale richtet (Garbe et al., 2005):
- den Melanomtyp,
- die Tumordicke in mm nach Breslow
- die Eindringtiefe nach Clark
- Ulzeration
- Regression
- Einbruch in Lymph-, Blutgefäße oder Perineuralscheiden
- Mikrosatelliten
Ein wichtiger Bestandteil des histologischen Befunds stellt die Sicherung des
Melanomtyps und die Tumordicke nach Breslow dar (Tab. 2). Sie wird definiert als der
größte vertikale Durchmesser des Tumors gemessen vom obersten Niveau des Stratum
granulosum bis zum unteren Tumorrand an (Breslow, 1970).
- 7 -
Als ein weiteres Kriterium wird die Eindringtiefe nach Clark bestimmt, siehe Tab. 3
(Clark et al., 1969).
Tabelle 3: Tumorinvasion nach Clark et al. (1969)
Nach 40 Jahren wird die Ermittlung des Clark-Level nicht mehr als integraler
Bestandteil für das Melanomstaging empfohlen, da es bei Einschluss der Mitoserate
nicht als unabhängiger Faktor gilt (Balch et al., 2009).Eine größere Zuverlässigkeit
ergibt sich aus der Messung der Tumordicke nach Breslow, da sie nicht von
individuellen Schwankungen der Hautdicke abhängig ist.
Histologische Kriterien des malignen Melanoms, wie die Tumordicke, die Mitoserate
und Ulzeration der Hautläsion, sind wichtige Merkmale zur Diagnosestellung
Prognoseeinschätzung. Vor allem hat sich die Analyse der Mitoserate als
leistungsfähiger prädiktiver Faktor erwiesen (Gimotty et al., 2007; Francken et al.,
2004; Busam, 2004).
Tabelle 2: Tumordicke des Primärtumors nach Breslow (1975)
(1975) (1975)
Stadium Tumordicke in mm
I < 0,75
II 1,76 – 1,5
III 1,51 – 4,0
IV > 4,0
Clark-Level Tumoreindringtiefe
I
Melanoma in situ, die Tumorzellen befinden sich noch ausschließlich
in der Epidermis
II
Durchbruch der Tumorzellen durch die Basalmembran bis in das
Stratum papillare
III
Tumorzellen im gesamten Stratum papillare bis zur Grenzzone des
Stratum reticulare
IV
Tumorzellen im gesamten Stratum reticulare
V
Tumorzellen im subkutanen Fettgewebe
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Bei histologisch unklarem Befund kann eine immunophänotypische Charakterisierung
unter der Verwendung von verschiedenen Proliferationsmarkern, wie beispielsweise das
S-100 Protein, HMB-45 Antigen oder Melan A Aufschluss über die Dignität des
Tumors geben (Garbe et al., 2005). Die Bestimmung dieser Marker erlaubt eine
immunologische Differenzierung des Tumors und lässt so Rückschlüsse auf die Dignität
des malignen Melanoms zu. Letztendlich erfolgt die Einordung der
immunhistochemischen Ergebnisse nur in Zusammenschau aller klinischen Befunde
(Andres et al., 2011).
1.2.6. Metastasierungswege
Eine Metastasierung des Melanoms ist verbunden mit einer infausten Prognose und
einer hohen Sterblichkeit der Betroffenen. Patienten mit Metastasen haben eine
durchschnittliche Überlebensrate von unter 1 Jahr. Ursache dafür ist oft ein Nicht-
Ansprechen auf eine Chemo- bzw. Strahlentherapie (Uong and Zon, 2010; Eager et al.,
2009). Die Metastasierungswege des malignen Melanoms sind sowohl lymphogen als
auch hämatogen. Dabei bleiben rund 2/3 der Erstmetastasierungen zunächst auf das
direkt drainierende regionäre Abflussgebiet der Lymphbahnen begrenzt. Diese
regionäre Metastasierung äußert sich durch die Bildung von sognannten Satelliten-
Metastasen. Satelliten-Metastasen beschreiben eine Absiedlung von Melanomzellen im
direkten umliegenden Gewebe des Tumors, in einem Bereich von weniger als 2 cm
direkt um den Primärtumor befinden. Als In-transit-Metastasen werden Metastasen
bezeichnet, wenn der Abstand mehr als 2 cm zwischen dem Primärtumor und dem
drainierenden Lymphknoten liegen. Das heißt vor dem Erreichen der ersten
Lymphknotenknotenstation. Außerdem können regionäre Lymphknotenmetastasen
unterschieden werden (Garbe et al., 2005; Kandamany and Mahaffey, 2009).
Grundsätzlich kann jedes Organ durch eine Fernmetastasierung betroffen sein, wobei
besonders häufig zu einer Metastasierung in Lunge, Leber, Knochen, Hirn, Herz und
Nebennieren betroffen sind (Riede et al., 2004). Zunächst dominieren jedoch
Fernmetastasen in Lunge, Lymphknoten und Haut, später kommt es dann zusätzlich zu
In-transit-Metastasen und zum Befall des ZNS (Schmidt and Schubert-Fritschle, 2011).
- 9 -
1.2.7. Diagnose
Die Kriterien zur klinischen Beurteilung melanomverdächtiger Läsionen wurden durch
Rigel und Friedman (1993) in der ABCD-Regel zusammengefasst.
A = Asymmetrie
B = Begrenzung (unregelmäßig)
C = Color (unterschiedliche Farbtöne)
D = Durchmesser > 6 mm
Weist die Pigmentveränderung mehrere dieser Kriterien auf, sollte die Läsion entfernt
werden. Die Asymmetrie spielt hier eine entscheidene Rolle (Rigel and Friedman,
1993).
Eine Erweiterung dieser Regel wurde in neueren Studien empfohlen. Hierzu zählt das
Kriterium der Erhabenheit, oder auch eine seitliche Erweiterung (Enlargement) des
Tumors (Abbasi et al., 2004). Melanomverdächtige Signale wie Juckreiz, Ulzeration
und Blutung sind zwar alarmierend, treten aber meist zu spät auf, um als
Früherkennungsparameter zu dienen (Sterry et al., 2010).
Diagnosesicherung
Zur Sicherung der Verdachtsdiagnose wird der Tumor nach der Inspektion mithilfe der
Dermatoskopie unter einer 10-40fachen Vergrößerung betrachtet. Veränderungen der
Pigmentmerkmale können so leichter erkannt und bewertet werden. Die präoperative
Diagnostik schließt eine Fotodokumentation mit ein. Eine Verlaufsbeobachtung mit der
computergestützten Dermatoskopie hat sich als wertvoll erwiesen (Kittler et al., 2000;
Goodson et al., 2010).
Bei der Beurteilung von melanozytären Veränderungen kann zur Bestimmung der
Tumordicke auch die hochauflösende Sonografie eingesetzt werden. Es konnte gezeigt
werden, dass die Tumordicke, die bei der Sonographie mit einer Frequenz von 20MHz
ermittelt wurde, mit den in der histologischen Untersuchung gemessenen Werten gut
korreliert (Machet et al., 2009).
Es folgt die klinische Untersuchung der ableitenden Lymphwege, sowie eine
Laboruntersuchung (BSG, Blutbild, LDH, alkalische Phosphatase, und Protein S100).
Häufig entscheidet erst die histologische Untersuchung zwischen gutartigen
Veränderungen (Naevi) und dem bösartigem Melanom. Eine Diagnosesicherung erfolgt
im Rahmen einer Exzisionsbiopsie. Um das klinische Stadium festzulegen, werden nach
Diagnose eines Melanoms weitere Untersuchungen erforderlich. Vor allem die
Invasionsfähigkeit des Tumors, also die vertikale Tumordicke, ist hier entscheidend.
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Ausbreitungsdiagnostik
Die Ausbreitungsdiagnostik wird durchgeführt, um das Stadium der Erkrankung zum
Zeitpunkt der Erstdiagnose zu bestimmen und zu dokumentieren. Mit der Einteilung des
Tumors in ein bestimmtes Stadium können Entscheidungen zum therapeutischen
Vorgehen getroffen werden und letztendlich Aussagen zur Prognose gemacht werden.
Eine Bestandsaufnahme vor Beginn der Therapie, bei der auch bereits bestehende
Vorerkrankungen dokumentiert werden, ist wichtig für die Abgrenzung von laufenden
malignen Prozessen. In den Leitlinien für die Therapie des malignen Melanoms wird die
genaue Vorgehensweise näher beschrieben.
Bei Melanomen mit einer Dicke von >1mm sollte eine Ausbreitungsdiagnostik erfolgen.
Hierzu gehören eine Lymphkontensonographie des regionären Abflussgebietes, eine
Röntgen-Thoraxaufnahme in zwei Ebenen, eine Sonographie des Abdomens
einschließlich des Beckens und Retroperitoneums, sowie die Biopsie des
Wächterlymphknotens zur Prognoseeinschätzung. Im Einzelfall können zusätzliche
Maßnahmen für die Staginguntersuchung nützlich sein, dazu gehören die Durchführung
einer CT, ein MRT des Schädels und die PET-Diagnostik (Garbe et al., 2005).
Wächterlymphknotenbiopsie
Ist die Tumordicke größer als 1mm wird eine histologische Untersuchung des
Wächterlymphknotens (engl. sentinel node) zum Staging empfohlen. Liegen zusätzliche
Risikofaktoren vor, die die Prognose verschlechtern, wie beispielsweise eine Ulzeration
des Tumors, oder ein invasiv wachsender Tumor mit einem Clark-Level IV-V, kann
diese Methode auch bei einer kleineren Tumordicke in Betracht gezogen werden.
Es handelt sich bei der Wächterlymphknotenbiopsie (SLND, Sentinel-Lymph-Node-
Dissektion) um eine minimalinvasive Methode zur Diagnosesicherung, um bei noch
klinisch unauffälligem Tastbefund der Lymphknoten eine lymphogene Metastasierung
auszuschließen.
Diese Methode wurde 1992 von Morton et al. entwickelt, um den Lymphknoten selektiv
darzustellen, der als erster die regionale Lymphabflussbahn des Tumors drainiert
(Morton et al., 1992). Die Methode setzt sich aus drei Schritten zusammen. Zuerst wird
in der Umgebung des Primärtumors ein radioaktiver Marker, meist 99m-Technetium, in
die Haut injiziert. Dieser reichert sich in den Lymphknoten an. Vor der Operation wird
dann entsprechend der detektierten maximalen radioaktiven Anreicherung ein Farbstoff
(Patentblau V) injiziert, der die Lymphknoten optisch markiert. Diese werden daraufhin
extipiert (Kunte et al., 2011).
- 11 -
Es konnte gezeigt werden, dass die rezidivfreie Überlebenszeit eindeutig mit dem Status
des Wächterlymphkotens korreliert (Gershenwald et al., 1999).
Wird im Wächterlymphknoten keine Mikrometastasierung festgestellt, sind keine
weiteren operativen Maßnahmen notwendig. Wenn eine Mikrometastasierung des
betroffenen Lymphknotens vorliegt, wird eine radikale Lymphadenektomie
durchgeführt (Essner et al., 1999; Cadili and Dabbs, 2010).
1.2.8. Stadieneinteilung
Die Einschätzung der Prognose ist wichtig um dem Patienten eine stadiengerechte
Therapie und Nachsorge zu gewährleisten. Entsprechend der TNM-Kriterien erfolgt
eine Einteilung des Tumors. Die wichtigsten prognostischen Kriterien beim malignen
Melanom sind die Tumordicke des primären Melanoms (pT), sowie ein mögliche
Metastasierung der Lymphknoten (N) und das Vorliegen von Fernmetastasen (M).
AJCC-Klassifikation für das maligne Melanom
Das American Joint Committee on Cancer hat 2002 eine Klassifikation zum klinischen
Staging des malignen Melanoms herausgegeben. Unter der Berücksichtigung von
verschiedenen Faktoren, wie das Auftreten von Ulzerationen, dem Invasionslevel nach
Clark, dem Vorhandensein von Metastasen wurde die Einteilung nach dem TNM-
System vorgenommen (Balch et al., 2001).
Das Klassifzierungssystem für das Melanom Staging wurde kürzlich von dem American
Joint Committee on Cancer (AJCC) neu überarbeitet und beinhaltet jetzt in der 7.
Auflage die neuesten prognostischen Daten durch die Erfassung einer deutlich größeren
Patientenpopulation (Balch et al., 2009; Nading et al., 2010).
In der endgültigen Fassung der AJCC-Klassifikation von 2009 wurden weitere Kriterien
zum Staging integriert. So spielt die Mitoserate bei der Einteilung eine Rolle, aber auch
bei der immunhistochemischen Detektion von Lymphknotenmetastasen wurden
Kriterien definiert, sodass zumindest ein Melanom-assoziierter Marker (z.B. HMB45,
Melan-A und Mart-1) enthalten sein muss bei entsprechender Zellmorphologie (Balch
et al., 2009).
Die Einteilung ist in den Tabellen 4 bis 7 zusammengefasst.
- 12 -
Tabelle 4: T-Klassifikation (AJCC 2009)
Tabelle 5: N-Klassifikation (AJCC 2009)
* Mikrometastase(n) diagnostiziert nach Schildwächter-Lymphadenektomie
** Makrometastase(n) definiert als klinisch festgestellte Lymphknoten-Metastasen, pathologisch bestätigt
Tabelle 6: M-Klassifikation (AJCC 2009)
T Tumordicke Ulzerationsstatus
Tis Melanoma in situ Keine Tumorinvasion
T1 ≤1,0mm a: ohne Ulzeration, Mitoserate < 1/mm²
b: mit Ulzeration, Mitoserate ≥ 1/mm³
T2 1,01 – 2,0mm a: ohne Ulzeration
b: mit Ulzeration
T3 2,01 – 4,0mm a: ohne Ulzeration
b: mit Ulzeration
T4 >4,0mm a: ohne Ulzeration
b: mit Ulzeration
N Anzahl metastasierter
Lymphknoten
Masse der Lymphknoten Metastasen
N0 0 entfällt
N1 1 Knoten a: Mirkometastasierung *
b: Makrometastasierung**
N2 2-3 Knoten a: Mikrometastasierung *
b: Makrometastasierung**
c: In-transit- Metastase(n)/ Satelliten-
Metastase(n) ohne metastasierte Knoten
N3 4 oder mehr Knoten oder In-
transit-Metastase(n)/
Satellitenmetastasen mit
metastasierten Knoten
M Lokalisation Serum LDH
M0 keine Fernmetastasen entfällt
M1a Fernmetastasen der Haut, der Subkutis oder
der Lymphknoten
normal
M1b Lungenmetastasen normal
M1c alle anderen viszeralen Metastasen
jede Art von Fernmetastase
normal
erhöht
- 13 -
Tabelle 7: Stadieneinteilung des malignen Melanoms nach dem AJCC 2009
1.2.9. Therapie
Die Behandlung des malignen Melanoms basiert auf den drei Säulen der operativen,
medikamentösen oder Strahlentherapie. Diese Therapieoptionen werden einzeln oder in
Kombination stadiengerecht angewandt. Individuelle Situationen führen jedoch häufig
zu einer individualisierten Therpieentscheidung, insbesondere was den Einsatz der
Metastasenchirurgie angeht. Zudem ermöglicht die Entwicklung neuer experimenteller
Medikamente wie z.B. der BRAF-Inhibitor Vemurafenib auch in der Rezidivsituation
hoffnungsvolle Therapieansätze, welche bisher jedoch nur in Studien angeboten werden
Stadium Klinisches Staging Stadium Pathologisches Staging
T N M T N M
0 Tis N0 M0 0 Tis N0 M0
IA T1a N0 M0 IA T1a N0 M0
IB T1b N0 M0 IB
T1b N0 M0
T2a N0 M0 T2a N0 M0
IIA T2b N0 M0 IIA T2b N0 M0
T3a N0 M0 T3a N0 M0
IIB T3b N0 M0 IIB T3b N0 M0
T4a N0 M0 T4a N0 M0
IIC T4b N0 M0 IIC T4b N0 M0
III jedes T N > N0 M0 IIIA T1-4a N1a M0
T1-4a N2a M0
IIIB T1-4b N1a M0
T1-4b N2a M0
T1-4a N1b M0
T1-4a N2b M0
T1-4a N2c M0
IIIC T1-4b N1b M0
T1-4b N2b M0
T1-4b N2c M0
jedes T N3 M0
IV jedes T jedes N M1 IV jedes T jedes N M1
- 14 -
können. Im Folgenden sollen die unterschiedlichen Behandlungsstrategien besprochen
werden.
Operative Therapie
Die Therapie der Wahl beim malignen Melanom ist die Exzision im Gesunden. Eine
möglichst vollständige Entfernung der pigmentierten Läsion sollte angestrebt werden,
nur so kann eine sichere Beurteilung des Präparats gewährleistet werden. Die Exzision
erfolgt in Lokalanästhesie. In Abhängigkeit vom Metastasierungsrisiko wird ein
entsprechender Sicherheitsabstand gewählt. Die operative Sanierung erfolgt bei einer
Tumordicke nach Breslow bis 2mm mit einem Sicherheitsabstand von 1cm und bei
tieferen Läsionen (> 2mm) 2cm (Marsden et al., 2010; Sober et al. 2001).
Bei einer zusätzlichen regionären Lymphknotenmetastasierung sollte die Exzision mit
Sicherheitsabstand durch eine radikale Lymphadenektomie ergänzt werden. In-transit-
und Satelliten-Metastasen (Stadium IIIB und IIIC) werden im Gesunden entfernt
(Kretschmer et al., 2004). Ab dem Stadium IV nach AJCC reicht eine vollständige
Entfernung des Primärtumors ohne Sicherheitsabstand aus. Eine besondere Rolle
kommt der Metastasenchirurgie zu, welche immerhin bei ca. 25% aller Patienten im
Stadium IV möglich ist. Eine Prognoseverbesserung konnte, bei begrenzter
Metastasenanzahl und einer vollständigen Tumorentfernung vorausgesetzt,
nachgewiesen werden (Wong et al., 1993; Petersen et al., 2007).
Tabelle 8: Empfohlene Sicherheitsabstände (nach Garbe et al. 2005)
Adjuvante Therapie
Die adjuvante medikamentöse Therapie wird ab dem Stadium III, das heißt bei
nachgewiesener Lymphknotenmetastasierung, empfohlen. Dafür gibt es gemäß der
aktuellen Studienlage die höchste Evidenz. In der adjuvanten Situation kommt die
Therapie mit Immuntherapeutika, wie dem Interferon, zum Einsatz. Eine der ersten
Substanzen die hier Bedeutung gewonnen hat ist das Interferon-alpha. In prospektiv
randomisierten Studien konnte gezeigt werden, dass es zu einem signifikanten Vorteil
Tumordicke nach Breslow Sicherheitsabstand
in situ 0,5cm
bis 2mm 1cm
>2mm 2cm
- 15 -
gemessen an der Rezidivfreiheit der Behandelten gekommen ist (Cameron et al., 2001;
Hauschild et al., 2010).
Soweit keine Kontraindikationen bestehen, wird die allgemeine Empfehlung
ausgesprochen, allen Patienten mit einem erhöhten Metastasierungsrisiko diese
Behandlung anzubieten. Auf der Internetseite der Arbeitsgemeinschaft Dermatologische
Onkologie können die aktuellen Empfehlungen zu den Leitlinien für die Therapie des
malignen Melanoms verfolgt werden (http://www.ado-homepage.de/index.php?ID=71).
Chemotherapie
Die Chemotherapie wird überwiegend aus palliativen Gründen beim fortgeschrittenen
malignen Melanom im Stadium IV durchgeführt. Es stehen hier vor allem die
Bemühungen auf die Erhaltung der Lebensqualität im Vordergrund. Zum einen soll eine
Verlängerung der Überlebenszeit erreicht werden, zum anderen die beschwerdefreie
Zeit insgesamt verlängert werden bzw. die Symptomatik der Beschwerden zu lindern.
Allgemein lässt sich aber sagen, dass die bislang verwendeten Chemotherpeutika
geringe Ansprechraten aufweisen und eine Heilung durch diese medikamentösen
Therapien nur selten erreicht werden (Garbe et al., 2005).
Strahlentherapie
Bei Primärtumoren ist die Strahlentherapie nur in Einzelfällen indiziert. Gerade dann,
wenn die operative Sanierung des Tumors nicht möglich ist, kann eine lokale
Bestrahlung in solchen Fällen als eine alternative Option in Betracht gezogen werden
(Testori et al., 2009). Etwa bei der Hälfte aller Patienten mit malignem Melanom
kommt es im Verlauf der Erkrankung zur Entwicklung von Hirnmetastasen (Morris et
al., 2004). Liegen multiple Hirnmetastasen (>3) und/oder große Filie (>3,5cm) vor wird
eine Ganzhirnbestrahlung (WBI= whole brain irradiation) durchgeführt (Rades et al.,
2010).
1.2.10. Prognose und Nachsorge
Bei frühzeitiger Erkennung und Exzision des malignen Melanoms ist es heilbar. Wenn
aber eine Metastasierung bereits eingetreten ist, ist die Prognose schlecht. Tritt das
maligne Melanom als Primärtumor auf, das heißt dass bei Erstdiagnose noch keine
Metastasierung vorliegt, beträgt die tumorspezifische 10-Jahres-Überlebensrate im
Gesamtkollektiv ca. 75-80 %. Liegen Satelliten- oder In-transit-Metastasen vor, liegt die
- 16 -
10-Jahres-Überlebensrate etwa bei 30-50%, bei Patienten mit klinisch manifesten
regionären Lymphknoten-Metastasen bei ca. 20-40% (Garbe et al., 2005).
In Studien konnten verschiedene Faktoren identifiziert werden, die sich auf das
Gesamtüberleben auswirken. Das sind zum einen die vertikale Tumordicke nach
Breslow und das Invasionslevel nach Clark, aber auch ob der Tumor Anzeichen einer
Ulzeration aufweist. Der Nachweis von Mikrometastasen, aber auch die Lokalisation
des Tumors wie auch das Geschlecht beeinflussen die Prognose (Balch et al., 2001;
Garbe et al., 2002). Zur Verbesserung der Prognose hat sich die Durchführung einer
standardisierten Nachsorge etabliert Der Umfang der Nachsorge mit den
entsprechenden Intervallen hängt vom jeweiligen Tumorstadium des Patienten bei
Erstdiagnose ab (siehe Tabelle 9). Mit den empfohlenen Nachsorgeuntersuchungen
sollen die Krankheitsverläufe der Patienten verfolgt werden können und der jeweilige
Krankheitsstatus dokumentiert werden. Neben der Überwachung und Durchführung
einer adjuvanten Therapie sollten die Patienten in diesem Rahmen auch auf
entsprechende Hilfestellungen zurückgreifen können, wie etwa einer adäquaten
psychosozialen Betreuung (Garbe et al., 2005).
Tabelle 9: Empfehlungen für die Nachsorge kutaner maligner Melanome (Intervalle in Monaten)
(aus Garbe et al. 2005)
1.3. Der melanozytäre Naevus
1.3.1. Definition
Der Begriff Naevus (Mal) umfasst verschiedene Fehlbildungen (Hamartome) der Haut
(Netter, 2009). Aus den Melanozyten der Haut können sich benigne Tumoren
entwickeln, die sich im Laufe des Lebens als sogenannte Naevi, umgangssprachlich
Muttermale, manifestieren. Die Melanozyten sind eine Zellpopulation, deren Aufgabe
Stadium
und
Tumordick
e
Körperliche
Untersuchun
g
1.–5. Jahr
Körperliche
Untersuchun
g
6.-10. Jahr
Lymphknote
n- Sonografie
1.-5. Jahr
S100-
Protei
n
1.-5.
Jahr
Bildgebende
Untersuchun
g
1.- 5. Jahr
I, ≤1mm 6 12 keine keine keine
I, IIa, IIb,
>1mm
3 6-12 6 3-6 keine
IIc, III 3 6 3-6 3-6 6
IV Individuell
- 17 -
es ist die Pigmentsynthese insbesondere an Haut, Haaren und Augen zu leisten. Sie
wandern in der 8. Schwangerschaftswoche von der Neuralleiste in die Epidermis und
die Haarfollikel aus. Ihre Herkunft ist also neuroektodermal (Riede et al., 2004).
1.3.2. Einteilung der melanozytären Naevi
Neben angeborenen (kongenitalen) Naevi werden erworbene unterschieden.
Die Einteilung erfolgt nach klinischen und histologischen Kriterien.
Erworbener melanozytärer Naevus
Erworbene melanozytäre Naevi sind die häufigsten Neubildungen bei Hellhäutigen. In
Mitteleuropa haben Erwachsene im Durchschnitt 20 bis 30 dieser gutartigen
melanozytären Tumoren mit einem Durchmesser von meist 2 mm und mehr am
gesamten Körper. Diese melanozytäre Naevi entwickeln sich schon im Kindesalter und
nehmen in ihrer Zahl bis zum Erwachsenenalter zu. Findet man bei Neugeborenen
selten Naevi, so kommt es doch im Laufe des Lebens, vor allem bis zum
Erwachsenenalter zu einer Zunahme der Häufigkeit des melanozytären Naevi (English
and Armstrong, 1994; Luther et al. 1996; Wiecker et al. 2003).
Melanozytäre Naevi können Vorstufen des malignen Melanoms sein. Etwa ein Drittel
aller Melanome ist mit melanozytären Naevi assoziiert (Bauer and Garbe, 2004).
Für die Melanomentwicklung stellt die Anzahl melanozytärer Naevi den wichtigsten
Risikofaktor dar. Ab einer Zahl von 50 Naevi ist das Melanomrisiko etwa um den
Faktor 4 bis 5, ab 100 melanozytären Naevi auf das 8- bis 10-fache erhöht (Garbe et al.
1994b).
Es besteht ein Zusammenhang zwischen der Sonnenexposition und der Häufigkeit des
Auftretens melanozytärer Naevi (Harrison et al., 1999). Naevi kommen häufig in
sonnenexponierten Arealen vor, insbesondere dann, wenn Kinder in sonnenreichen
Gegenden aufwachsen (Harrison et al., 2000). In einer Studie von Dodd et al. (2007)
konnte gezeigt werden, dass an sonnenexponierten Körperstellen eine höhere Dichte an
Naevuszellnaevi vorlag, als an solchen Stellen der Haut, die der Sonne nur zeitweise
ausgesetzt waren. Außerdem bestand ein signifikanter Zusammenhang zwischen der
Anzahl der Sonnenbrände und der Anzahl der Naevi am Körper der jeweiligen Person
(Dodd et al., 2007).
Klinisch-histologische Subtypen
Melanozytische Naevi sind Pigmenttumoren, die einer umschriebenen Vermehrung von
Pigmentzellen, den Naevuszellen aufgebaut sind und deshalb auch als Naevuszellnaevi
- 18 -
(Naevus, lat. Muttermal) bezeichnet werden. Je nach Naevustyp liegen die Naevuszellen
in den verschiedenen Etagen der Haut, in nest- oder strangförmiger Anordnung. Die
Einteilung der Entwicklungstypen erfolgt nach der Lage der Melanozyten in der
Epidermis. Melanozytäre Naevi durchlaufen verschiedene Entwicklungsstadien, die mit
unterschiedlichen klinischen und histopathologischen Merkmalen versehen sind. Es
müssen nicht alle Entwicklungsstadien bei jedem melanozytären Naevus vorkommen,
jedoch sieht man immer wieder ähnliche Entwicklungsmuster. Es sind klinische
Überlappungen zwischen allen Naevus-Typen möglich. (Riede et al., 2004)
Lentigo simplex
Bei der Lentigo simplex handelt es sich um einen braunschwarzen, scharf begrenzten
Pigmentfleck der Haut oder Schleimhaut, der meist kleiner als 5mm ist. Seine
Oberfläche ist glatt (Riede et al., 2004). Die Lentigo simplex wird als erstes Stadium bei
der Entwicklung eines melanozytären Naevus angesehen und tritt bevorzugt an
sonnenexponierten Hautpartien auf (Hauschild et al., 2005). Eine Lentigo simplex kann
in jedem Alter auftreten, manifestiert sich aber häufig schon im Kindesalter.
Histologisch zeigen sich eine füßchenförmige Verlängerung der Reteleisten mit einer
verstärkten basalen Pigmentierung, sowie eine geringgradige Vermehrung von
Melanozyten ohne Nestbildung (Kempf et al., 2007). Auch eine melanozytäre
Hyperplasie kann auftreten.
Melanozytärer Naevus vom Junktionstyp
Der junktionale Naevus ist eine regelmäßige, scharf begrenzte Makula mit einer meist
mittel- bis dunkelbraunen Pigmentierung (Hauschild et al., 2005). Histologisch weist er
eine symmetrische Architektur mit scharfer seitlicher Begrenzung auf. Vor allem an der
Spitze der Reteleisten, in der Junktionszone, sowie auch an der oberen Dermis finden
sich gleichförmige Nester monomorpher Melanozyten, sogenannter Naevuszellen
(Kempf et al., 2007).
Melanozytärer Naevus vom Compoundtyp
Der melanozytäre Naevus vom Compoundtyp ist hellbraun bis dunkelbraun pigmentiert,
im Allgemeinen aber heller als der junktionale Naevus. Die Läsion kann erhaben sein
oder als flache Papel imponieren. Neben den junktionalen Naevuszellnestern finden sich
beim Compoundtyp nest- oder strangförmige Ansammlungen von Naevuszellen auch in
der Dermis (Hauschild et al., 2005). Die Melanozyten weisen eine charakteristische
Ausreifung der Zellen zur Tiefe hin aus, das heißt die Melanozyten und ihre Kerne
- 19 -
werden zur Tiefe hin deutlich kleiner und verlieren ihre Fähigkeit zur Pigmentbildung
(Kempf et al., 2007).
Dermaler melanozytärer Naevus
Von einem dermalen Naevus spricht man, wenn sich die Läsion als erhabener, scharf
begrenzter Knoten darstellt, mit einer Farbe von hellbraun bis hautfarben. Ein wichtiges
Merkmal ist, dass die melanozytären Zellenester rein dermal vorzufinden sind, das heißt
es liegen keine epidermalen Nester von Melanozyten mehr vor. Sie liegen in
strangförmigen und aufgelockerten Anordnungen vor, den Zellen fehlt es an
Pigmentierung (Hauschild et al., 2005).
Atypischer/dysplastischer melanozytärer Nävus
Unter atypischen bzw. dysplastischen Naevi versteht man auffällig große und in ihrer
Form und Pigmentierung variierende melanozytäre Hautveränderungen, die Zeichen
einer Atypie aufweisen. Klinisch kann man sie aber noch nicht eindeutig einem
Melanom zuordnen (Friedman et al., 2009).
Diese in ihrer Form und Struktur ungewöhnlichen Naevi wurden lange unter dem
Namen „dysplastischer Naevus“ geführt, bis dieser unter Kritik geratenene Begriff von
einer Expertengruppe 1992 (NIH Consensus Development Conference, 1992) durch die
Bezeichnung „atypischer Naevus“ ersetzt wurde (Hauschild et al., 2005).
Trotzdem werden die Begriffe atypisch und dysplastisch im klinischen Alltag häufig
synonym benutzt. Die atypischen Naevi gelten als Risikofaktoren für die Entstehung
eines malignen Melanoms. Klinisch lassen sich diese Läsionen noch nicht einem
malignen Melanom zuordnen, weisen aber bei genauer Untersuchung schon Zeichen
einer Atypie auf. Atypische melanozytäre Nävi werden aufgrund klinischer,
auflichtmikroskopischer und histologischer Merkmale definiert.
Als Hauptkriterien in der Histologie gelten die basale lentiginöse
Melanozytenhyperplasie, zytologische Atypien sowie eine stromale Reaktion im oberen
Korium. Daneben wurden auch architektonische Kriterien wie eine „Schulterbildung“
herausgestellt (Ramrath et al., 2011).
Syndrom atypischer Naevi
Das „Syndrom atypischer Nävi“ (B-K-Mole-Syndrom, FAMMM-Syndrom; Melanom-
Pankreaskarzinom-Syndrom) wird in einen familiären und in einen sporadischen Typ
unterteilt. Vom „familiären Syndrom atypischer Nävi“ sind klassischerweise mehrere
Familienmitglieder betroffen, die im Alter zwischen 20 und 60 Jahren das erste maligne
- 20 -
Melanom entwickeln (Kelly et al., 1997; Rhodes 1998). Oft treten auch mehrere
Melanome am gleichen Patienten auf. Als sporadisch wird das Auftreten atypischer
melanozytärer Nävi bezeichnet, wenn maligne Melanome oder atypische Nävi zwar
gehäuft bei einer Person auftreten, die Familienangehörigen aber nicht betroffen sind.
Angeborener (kongenitaler) Naevus
Als einen kongenitalen melanozytären Naevus (KMN) bezeichnet man einen
melanozytären Naevus, der schon bei der Geburt vorhanden ist oder spätestens im
Neugeborenenalter auftritt. Dabei handelt es sich um ein Hamartom, das aus einer
umschriebenen Ansammlung von Melanozyten besteht, die von der Neuralleiste
stammen (Barnhill et al., 1995; Tannous et al., 2005).
Am häufigsten manifestieren sich KMN als über 1,5 cm im Durchmesser große, scharf
begrenzte, homogen hell- bis dunkelbraun pigmentierte Flecken oder Plaques mit glatter
Oberfläche und verstärkter Behaarung (Hypertrichose). Im Kindesalter vergrößern sie
sich proportional zum Wachstum der Haut (Rhodes et al., 1996). Die KMN können
auch in ihrer Farbausprägung variieren und zeigen dann eine unterschiedliche
Pigmentierung mit teilweise sehr dunklen Arealen (Changchien et al., 2007).
Im Gegensatz zu den erworbenen melanozytären Nävi, befinden sich die Melanozyten
bei KMN oft auch in den unteren beiden Drittel der Dermis. Typisch ist ihr Auftreten
zwischen den Kollagenfasern im oberen Stratum reticulare, in Gefäßwänden sowie im
Perineurium (Barnhill and Fleischli, 1995). Das tiefe Baumuster ist für den KMN
typisch.
1.3.3. Diagnostik
Im Regelfall können gewöhnliche melanozytäre Naevi vom Dermatologen mit
hinreichender Sicherheit diagnostiziert werden. Schwieriger ist die klinische
Abgrenzung zum malignen Melanom bei atypischen melanozytären Naevi. Die
Dermatoskopie spielt bei der Diagnostik eine entscheidende Rolle, insbesondere bei der
Unterscheidung zwischen benignen und malignen melanozytären Tumoren (Kittler et
al., 2002). Ist der klinische Befund nicht eindeutig zuzuordnen, kann die Beurteilung
melanozytärer Hautläsionen mit der computergestützten Dermatoskopie zur
Verlaufsbeobachtung hinzugenommen werden (Haenssle et al., 2006). Schon kleinste
Veränderungen in der Ausprägung der Pigmentmale können so leichter erkannt und
untersucht werden und mit speziellen digitalen Bildanalyseprogrammen bewertet
werden (Wurm et al., 2010). Die Grenzen der jeweiligen Untersuchungsmethoden
- 21 -
erfordern einen kombinierten Einsatz um die Naevi besser beurteilen zu können und
Melanome früh zu erkennen (Goodson and Grossman, 2009).
1.3.4. Therapie
Der gewöhnlich melanozytäre Naevus bedarf bei einem unauffälligen Befund keiner
Therapie. Es werden regelmäßige Kontrollen durchgeführt und dokumentiert. Das Ziel
der operativen Behandlung melanozytärer Nävi ist die histopathologischen Abgrenzung
zum malignen Melanom. Für Personen mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung
maligner Melanome werden jährliche oder halbjährliche Untersuchungen empfohlen,
um bei ihnen eine eingehenden Überwachung zu gewährleisten. Zu diesen
Risikopatienten zählen Menschen mit sehr vielen (> 100) gewöhnlichen melanozytären
Naevi, Patienten mit dem „Syndrom atypischer Naevi“ (> 50 melanozytäre Naevi und >
5 atypische melanozytäre Naevi), Patienten mit großen kongenitalen melanozytären
Naevi, Patienten mit einer positiven Familienanamnese sowie Patienten mit einer
Melanomdiagnose in der Vorgeschichte (Hauschild et al. 2005).
1.3.5. Prävention
Vor allem Kampagnen zur Primärprävention haben einen Einfluss auf den
Krankheitsverlauf. Diese zielen darauf ab einen sicheren und verantwortungsvollen
Umgang mit dem Sonnenbaden zu pflegen, im Einklang mit den gegebenen
Umweltbedingungen und dem individuellen Hauttyp (MacKie et al., 2009).
Da die Entwicklung melanozytärer Naevi vorwiegend in der Kindheit stattfindet, sollten
präventive Maßnahmen auch in dieser Zeit ansetzen. Es konnte in mehreren Studien
gezeigt werden, dass eine UV-Exposition und gerade das „Sonnenbaden“ das Risiko für
die Entwicklung von melanozytären Naevi stark erhöhen. Zu den wichtigsten
Schutzmaßnahmen zählen demzufolge eine UV-Abstinenz, das Auftragen von
Lichtschutzmitteln und das Tragen von spezieller UV-absorbierender Kleidung
(Gambichler et al., 2002; English et al., 2005).
Nur durch deutlich verstärkte Maßnahmen in der Prävention kann auf lange Sicht eine
Senkung der bis heute steigenden Inzidenz für maligne Melanome erreicht werden.
Das im Jahr 2008 eingeführte Hautkrebsscreening auf Bundesebene und seit 2009 die
Einführung eines Verbots für Jugendliche Solarien zu benutzen, sind erste Schritte in
diesem Bereich (Berking, 2011).
- 22 -
1.4. Tumormarker
1.4.1. Definition
Tumormarker sind zirkulierende Makromoleküle, deren vermehrtes Auftreten auf eine
Tumorerkrankung zurückzuführen sind deren Konzentration mit dem Wachstum des
Tumors in Zusammenhang stehen (Hein et al., 2011b).
Idealerweise sollte ein Tumormarker möglichst tumorspezifisch sein. Ein Wert oberhalb
einer bestimmten Grenze, das heißt dem obersten Grenzwert beim Gesunden, sollte ein
Tumorwachstum identifizieren. Für die Interpretation von Tumormarkern ist aber zu
beachten, dass nicht der Einzelwert an sich aussagekräftig ist, sondern der Verlauf der
Tumormarkerkonzentration. Sodass man daraus schließen kann, dass sich bei einem
Abfall des Tumormarkerspiegels der Tumor zurückbildet und andersherum eine
Fortbestehen des Tumors bzw. eine Metastasierung bei einem Anstieg vorliegt (Hein et
al., 2006).
In aller Regel eignen sich Tumormarker nicht dazu eine ungezielte Suche nach einem
Tumor zu betreiben, wie es oft im Rahmen von Screeningverfahren durchgeführt wird,
denn nur in Einzelfällen sind sie zur gezielten Tumordiagnostik brauchbar. Vielmehr
finden sie die größte Verwendung heutzutage bei Verlaufskontrollen oder der
Nachsorge von Tumorpatienten (Dörner, 2003).
1.4.2. Tumormarker des malignen Melanoms
Untersuchungen des Blutes zur Metastasensuche waren bisher nicht genau genug. Meist
konnte erst im Spätstadium der Erkrankung eine Erhöhung von eher unspezifischen
Parametern, wie der Laktatdehydrogenase (LDH) und Albumin erkannt werden.
In den letzten Jahren hat sich auf diesem Gebiet einiges getan und so ist es heutzutage
möglich mit kommerziell erhältlichen Tumormarkerassays, als Beispiel seien hier S100
und das Protein „melanoma inhibitory activity“ (MIA) genannt, im Blut des
Melanompatienten Aussagen zu dessen Erkrankung machen zu können (Juergensen et
al., 2001; Schmitz et al., 2000).
In der Vergangenheit wurde das maligne Melanom auf das Auftreten von verschiedenen
Tumormarkern untersucht. Die möglichen serologischen Tumormarker für das maligne
Melanom kann man verschiedenen Gruppen zuordnen. Zum einen gibt es die Gruppe
der Zytokine, Zytokinrezeptoren und Zelladhäsionsmoleküle (z.B. IL-6, IL-8, IL-10, s-
IL-2-R, sICAM-1, sVCAM), dann Substanzen des Melaninstoffwechsels, wie 5-S-
Cysteinyldopa, 6-Hydroxy-5-Metoxyindol-2-Carboxylsäure und Tyrosinase.
- 23 -
Desweiteren können zur Gruppe der Entzündungsparameter, Enzyme und Proteine
Substanzen, wie LDH, das C-reaktive Protein (CRP), Serummatrixmetalloproteinase-2
und das Serum-Amyloid A gezählt werden. Als letzte Gruppe schließt sich die der
melanomassoziierten Antigene an. In diese Gruppe kann man NSE, MIA und S100ß
zuordnen (Hein et al., 2011b).
Die Methode der vorliegenden Arbeit betrifft die Gruppe der Melanom-assoziierten
Antigene. Eine Rolle bei der Detektion dieser Oberflächenantigene spielt hier die
Immunhistologie.
Immunhistologie
Bei der Immunhistologie handelt es sich um eine Methode um gewebespezifische
Antigene darzustellen. Mit Hilfe von spezifischen Antikörpern werden diese Antigene
markiert und sichtbar gemacht. Auf den Tumorzellen des malignen Melanoms finden
sich wie auf allen Körperzellen verschiedene Oberflächenantigene mit immunogenen
Eigenschaften. Eine immunhistologische Charakterisierung ist dann angezeigt, wenn
man den Tumor mit der konventionellen histologischen Untersuchung nicht näher
einzuordnen vermag. Die Anzahl der korrekt diagnostizierten Melanome hat sich durch
die Nutzung monoklonaler Antikörper stark verbessert (Orchard and Wilson Jones,
1994; Gogas et al., 2009).
Für die Diagnose eines melanozytären Tumors haben sich folgende Marker als
bedeutend erwiesen.
1.4.2.1. S100
Einer der am häufigsten verwendeten Tumormarker beim malignen Melanom ist das
Protein S100. S100-Proteine sind Calcium-bindende Proteine, die mit einer
Molekülmasse von 9-12 kDa relativ klein sind und eine Vielzahl unterschiedlicher
zellulärer Prozesse beeinflussen. Es kommt auf Zellmembranen und im Zytoplasma vor
(Donato, 1986).
In Abhängigkeit von der intrazellulären Kalzium-Konzentration aktivieren diese
niedermolekularen Proteine andere Proteine mit unterschiedlicher intra- und
extrazelluläre Funktionen. Wenn Kalzium-Ionen an die S100-Proteine binden, kommt
es zu einer Konformationsänderung, dadurch wird die Bindung von verschiedenen
Zielproteinen ermöglicht (Zimmer et al., 2003).
Die S100-Proteine sind an der Zellproliferation, Signaltransduktion, Zelladhäsion und
Motilität beteiligt (Donato, 2001; Donato, 2003).
- 24 -
S100 spielt auch bei der Zelladhäsion und Motilität der Zelle eine Rolle. Die Erhaltung
der Struktur des Zytoskeletts durch verschiedene Zellstrukturen, wie etwa den
Mikrotubuli gehört zu seinen Aufgaben (Santamaria-Kisiel et al., 2006).
S100-Proteine findet man in benignen und malignen Melanozyten, Nervenzellen,
Langerhans-Zellen, gelegentlich auch in epithelialen Tumorzellen und Fettzellen
(Fernando et al., 1994).
Es gibt viele verschiedene Subtypen, die alle zur Familie der S100-Proteine gehören
und deren Lokalisation in unterschiedlichen Geweben anzutreffen sind. Allein in der
Epidermis und in Keratinozyten konnte man bislang 13 Subtypen identifizieren
(S100A2, S100A3, S100A4, S100A6-S100A12, S100A15). In Melanozyten konnte die
Expression von S100β nachgewiesen werden. Diese Form findet man auch in den
Langerhans-Zellen der Haut. (Zimmer et al., 2003).
Die Entdeckung des S100 in humanen Melanomzelllinien durch Gaynor et al. (1980)
machte den Weg frei für zahlreiche weiterführende Untersuchungen (Gaynor et al.,
1980).
Das S100-Protein wird durch den Antikörper anti-S100 erkannt, diese Eigenschaft
macht man sich in der Dermatohistologie zunutze. Auf Grund der geringen Größe der
S100-Proteine ist eine Formalinfixierung zur Darstellung im Gewebe notwendig
(Sedaghat and Notopoulos, 2008). Mit seiner hohen Sensitivität aber niedrigen
Spezifität gilt er selbst als guter Marker bei klinisch zunächst inapparenten Melanomen,
wie dem desmoplastischen und amelanotischem Melanom (Argenyi et al., 1994).
Die Bedeutung des Markers für die Diagnostik konnte in zahlreichen Studien belegt
werden. Fagnart et al. (1988) zeigte in seiner Studie, dass S100 im Serum von Patienten
mit metastasierten Melanomen nachgewiesen werden kann (Fagnart et al., 1988).
Es folgten mehrere Studien, um die S100 als Tumormarker für das maligne Melanom
weiter zu charakterisieren. In den meisten dieser Studien wurde ein signifikanter
Unterschied in der S100-Expression hinsichtlich des Tumorbefalls festgestellt (Schultz
et al., 1998; Mårtenson et al., 2001; Andrés et al., 2004).
Hinsichtlich der Prognose, Therapieplanung und Nachsorge spielt die Bestimmung
S100β im Serum eine entscheidende Rolle. Beim Melanomscreening sind jedoch nicht
die Absolutwerte des Markers für die Therapie entscheidend, sondern deren
Schwankungen im Verlauf (Sedaghat and Notopoulos, 2008).
- 25 -
1.4.2.2. MIA
MIA (Melanoma-inhibiting activity) ist ein Protein, das von Bogdahn et al. erstmals
Anfang der 1990er Jahre bei einer Melanomzelllinie nachgewiesen wurde (Bogdahn et
al., 1989). Es handelt sich hierbei um ein kleines Protein (11kD), welches von den
Zellen des Melanoms sezerniert wird (Hau et al., 2002). Zu seinen Aufgaben zählt die
Regulation der Zelladhäsion, außerdem scheint es bei der Metastasierung von
Melanomen eine entscheidende Rolle zu spielen (Bosserhoff et al., 1998).
Infolge seiner Eigenschaft als sezernierendes Protein, wurden Melanompatienten auf
den Nachweis von MIA im Serum untersucht. Die Tatsache, dass es stark von malignen
melanozytären Tumoren exprimiert wird, aber nicht in benignen melanozytären
Hautveränderungen vorkommt, hat MIA zu einem interessanten Tumormarker für das
maligne Melanom werden lassen (Bosserhoff and Buettner, 2002).
Auch die Tatsache, dass MIA unter physiologischen Bedingungen verändert sein kann,
darf nicht außer Acht gelassen werden. So werden im Normalgewebe im Knorpel MIA
gemessen, aber auch bei vorliegenden rheumatischen Erkrankungen kann es zu einer
einer Suppression der Serumwerte für MIA kommen (Vandooren et al., 2009).
Einzelwerte dürfen nicht für sich betrachtet werden, sondern Aussagen zur Erkrankung
können nur dann getroffen werden, wenn man die Tumorkinetik in ihrem Verlauf
verfolgt.
1.4.2.3. LDH
Mit der Einführung der LDH-Konzentration in die Klassifikation der Tumorstadien der
AJCC zeigt sich, dass sich mit der Bestimmung von LDH prognostische Aussagen zum
Krankheitsverlauf treffen lassen (Balch et al., 2001). LDH (Laktatdehydrogenase) ist
ein Enzym des Stoffwechsels, das Pyruvat zu Laktat (Milchsäure) reduziert und ist
Bestandteil aller Gewebe.
Erhöhte LDH-Werte findet man bei Vorgängen, die mit einem gesteigerten Zellumsatz
verbunden sind. Als Beispiele seien hier Erkrankungen wie eine Hepatitis oder ein
Myokardinfarkt genannt
Bei Tumorerkrankungen, gerade dann, wenn zusätzlich eine Metastasierung vorliegt,
kann es zum Anstieg der LDH-Werte im Serum kommen. Die neue Datenerhebeung
zum Staging des malignen Melanoms zeigt deutlich, dass ein erhöhter LDH-Wert ein
unabhängiger und hoch signifikanter Prädiktor für das Überleben von Patienten mit der
Stufe IV beim malignen Melanom ist. In multivarianten Analysen konnte gezeigt
- 26 -
werden, dass LDH zu den unabhängigen Variablen für den Faktor Überleben zählt
(Neumann et al., 2008; Bedikian et al., 2008).
Da LDH für das maligne Melanom nicht spezifisch ist, sollten bei erhöhten Werten
auch andere mögliche Differentialdiagnosen berücksichtigt werden.
1.4.2.4. HMB-45
HMB-45 (Human Melanoma Black 45) ist ein weit verbreiteter Marker, der in der
Immunhistochemie zum Nachweis von primären und metastasierenden Melanomen
eingesetzt wird (Baisden et al., 2000).
Der Antikörperklon HMB-45 färbt ein zytoplasmatisch lokalisiertes Antigen (gp100) in
Melanozyten und melanozytären Tumoren an (Schaumburg-Lever, 2005). Dieser
Antikörper reagiert mit Melanomzellen, Junktionsnaevuszellen und fetalen
Melanozyten, das heißt er reagiert mit benignen sowie malignen Melanozyten.
Ausdifferenzierte Melanozyten sind in der Regel negativ (Gown et al., 1986; Colombari
et al., 1988). Aufgrund der guten Auflösung und einer geringen Hintergrundfärbung ist
HMB-45 dafür bekannt, in Sentinel-Lymphknoten geringe falsch-positive Ergebnisse zu
haben (Baisden et al., 2000).
1.4.2.5. Melan A/MART 1
Kommen Lymphozyten in vitro mit autologen Melanomzellen und IL-2 in Kontakt,
werden diese stimuliert und es erfolgt eine Immunantwort mit der Bildung von
zytotoxischen T-Zellen. Eine Interaktion zwischen den Abwehrzellen und den
Oberflächenstrukturen der Melanomzellen führt letztendlich zu einer Lyse der
Melanomzellen. Die Bildung von diesen spezifischen zytotoxischen T-Zellen wird von
Melan A induziert. Melan A bzw. MART-1 (melanoma antigen recognized by T cells 1)
wurde 1994 entdeckt. Das Melan-A-Antigen kodierende Gen ist 18 kb lang und stammt
aus einer menschlichen Melanom-Zelllinie (Coulie et al., 1994).
Das Melanom-spezifische Antigen wird von autologen zytotoxischen Lymphozyten
erkannt. In seiner Struktur ist das Melan-A-Antigen ein Transmembranprotein mit einer
Länge von 118 Aminosäuren und wird in der Mehrzahl von Melanomen vorgefunden
(Fetsch et al., 1997). Das Protein wird in Melanozyten, melanozytären Naevi,
Melanomen aber auch in Steroidhormone produzierenden Geweben (z. B. Tumoren der
Nebennierenrinde, Leydig-Zellen, Ovarien), sowie Angiomyolipomen, bei
Lymphangioleiomyomatose und Klarzell-Tumoren der Lunge exprimiert (Busam and
Jungbluth, 1999).
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Für immunhistochemische Zwecke wird der rekombinante Klon A103 als
entsprechendes Immunogen für Melan A verwendet. A103 Antikörper erkennt ein 20
bis 22 kDa Dublett in einer Melan A mRNA-positiven Melanomzelllinie. Das Anti-
Melan-A, Klon A103, zeigt eine einheitliche zytoplasmatische Färbung in einem hohen
Prozentsatz (> 90%) von primären Melanomen (Chen et al., 1996).
Melan A ist nicht spezifisch für das Melanom, es werden sowohl benigne als auch
maligne Melanozyten markiert (Busam et al., 1998).
1.4.2.6. Ki-67
Ki-67 ist ein Proliferationsmarker der seine Verwendung in der Routinediagnostik hat.
Dieses Protein markiert sich vermehrende Zellen im Gewebe (Scholzen and Gerdes,
2000). Ki-67 wurde zuerst in Kiel entdeckt, im Rahmen einer Immunisierung von
Mäusen mit einer Lymphomzellinie (L428). Es wurden in den letzten Jahren einige
Bemühungen unternommen, um weitere Informationen zur Struktur und Regulation
dieses Proteins zu erhalten. Letztendlich ist seine genaue Funktion bis heute noch nicht
vollständig entschlüsselt (Scholzen and Gerdes, 2000). In Form von zwei
Splicevarianten, mit einer Größe von 320 kDa und 359 kDa, ist das Protein vorzufinden.
In der M-Phase wird das Protein phosphoryliert (MacCallum and Hall, 1999).
Bereits 1984 konnte Gerdes et al. nachweisen, dass Ki-67 nur in proliferierenden Zellen
vorkommt. Diese Eigenschaft macht man sich auch heute noch in der Routinediagnostik
zunutze (Gerdes et al., 1984).
Das Antigen wird in den sich teilenden Zellen exprimiert, das heißt, es wird in der G1-,
in der S-, in der G2- und in der M-Phase aufgefunden. In ruhenden Zellen (G0) gibt es
keine Expression dieses Markers. Dieser Umstand macht es zu einem guten Marker, der
die Wachstumsgeschwindigkeit einer Zellreihe, in unserem Fall des Tumors, anzeigen
kann (Scholzen and Gerdes, 2000).
Um das Protein nachzuweisen, werden unterschiedliche Antikörper verwendet. Ein
Antikörper, der hierbei am häufigsten benutzt wird, ist MIB-1 (Molecular Immunology
Borstel-1) (Scholzen and Gerdes, 2000). Dieser monoklonale Antikörper macht es
möglich Ki-67 auch in Paraffinschnitten sichtbar zu machen.
Werden Zellen mit Antikörpern gegen Ki-67 beimpft, tritt ein Proliferationsstopp dieses
Markers auf (Endl and Gerdes, 2000). Als Prognosefaktor hat sich Ki-67 bei einigen
Tumorarten etabliert, wie beispielsweise dem Prostatakarzinom (Aaltomaa et al., 1997)
und dem Mammakarzinom (Jansen et al., 1998).
- 28 -
1.5. Mikrotubuli-assoziierte Proteine (MAPs)
Mikrotubuli-assoziierte Proteine sind eine hetreogene Gruppe von Proteinen. Als
Proteine des neuronalen Zytoskeletts spielen sie insbesondere eine Rolle bei der
Motilität und dem Transport innerhalb der Zelle (Bernhardt and Matus, 1984).
MAPs sind eine Familie von Proteinen, die hauptsächlich in neuronalen Zellen
exprimiert werden und in den Dendriten der Neurone anzutreffen sind (Matus, 1988).
Diese faserigen Moleküle unterschiedlicher Länge (50-185nm) dienen, als Proteine des
neuronalen Zytoskeletts, zur Stabilisierung oder Destabilisierung der Mikrotubuli.
(Hirokawa, 1994).
Aufgebaut aus zylindrischen Polymeren, helfen sie bei dem Transport von
Zellorganellen, der Bewegung von Zilien, und dem Transport von Chromosomen
(Johnson and Jope, 1992). Mehrere Isoformen konnten in den letzten Jahren
differenziert werden. Obwohl MAPs weitegehend in neuronalen Zellen anzutreffen
sind, gibt es bestimmte Formen, wie MAP1 und MAP4 die auch in nicht-neuronalen
Zellen vorkommen (Kobayashi and Mundel, 1998; Wiche et al., 1984; Bulinski et al.,
1997). Während MAP4 ubiquitär exprimiert wird, geschieht die Expression der Isoform
MAP2 hauptsächlich in Neuronen. Die Expression von MAP7 ist auf Epithelzellen
beschränkt (Cassimeris and Spittle, 2001).
Tau gehört zu den am besten untersuchten MAP. Seine phosphorylierten Unterformen
binden vor allem in Neuronen an Tubulin und fördern damit die Polymerisation und
Stabilisierung der Mikrotubuli in den Axonen. Defekte in der Phosphorylierung von
Tau spielen eine Rolle bei Alzheimer und anderen neurodegenerativen Erkrankungen
(Busée et al., 2000).
Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2)
Einer der am besten untersuchten MAPs ist das MAP2. Es ist das häufigste
Mikrotubuli-assoziierte Protein im Gehirn und scheint ausschließlich in Zellen des
Nervensystems exprimiert zu werden (Goedert et al., 1991). Es wurden mehrere
Isoformen charakterisiert. Die drei Unterformen (MAP2A, 2B, 2C) entstammen alle
demselben Gen. Jedoch gibt es Unterschiede bei der Molakularmasse: 2A und 2B haben
ein hohes Molekulargewicht (280kDa), 2C weist ein niedriges Molekulargewicht
(70kDa) auf. MAP2A und 2B finden sich im Gehirn des Erwachsenen vor allem in den
Nervenzellen und Dendriten, aber nicht in den Axonen. MAP2C wird zunächst im
embryonalen Gehirn gebildet, und findet sich dort auch in Gliazellen und Axonen. Der
Wechsel von 2C zu 2A, 2B vollzieht sich in der zweiten postnatalen Woche, da das
- 29 -
Neuritenwachstum nachlässt und Stabilisieungsprozesse beginnen (Bernhardt and
Matus, 1984; Hirokawa, 1994; Tucker 1990).
Die MAP2 Expression wird als Marker für die neuronale Differenzierung verwendet.
Durch alternatives Spleißen der mRNA werden diese Umbauprozesse reguliert. Das
Spleißen scheint wachstumsregulierend zu sein: Während man MAP2C nur in unreifen
Neuronen findet, bestehen MAP2A und MAP2B während der gesamten Lebensdauer
der Neurone (Kalcheva et al., 1998). MAP2 wird primär in den Dendriten der
postmitotisch entdifferenzierten Neurone gefunden. Es spielt eine Rolle beim
Neuritenwachstum und der Entwicklung der Dendriten (Sánchez et al., 2000).
Sicherlich spielt hierbei die selektive Stabilisierung dendritischen Mikrotubuli eine
Rolle. Da MAP2 stark in den dendritischen Zytoskelett angereichert wird, geht man
davon aus, dass es zudem eine Rolle bei der Signaltransduktion spielt (Harada et al.,
2002). Die Intensität des Expressionmusters von MAP2 lässt Rückschlüsse auf die
Ausprägung der neuronalen Differenzierung zu (Megiorni et al., 2005).
Über eine veränderte MAP2-Expression bei einer Vielzahl von Tumoren mit
neuroendokrinen Differenzierung, wie Karzinoidtumoren, Gliome, und Merkel-Zell-
Karzinomen, wurde in verschiedenen Studien berichtet (Suzuki et al., 2002; Liu et al.,
2001; Liu et al. 2003).
Diese Ausgangssituation soll Grundlage dieser Arbeit sein.
- 30 -
2. Zielsetzung
Die Inzidenz des malignen Melanoms nimmt weiter zu. Aus diesem Grunde ist es
durchaus von Bedeutung nach Möglichkeiten zu suchen, der steigenden Patientenzahl
mit einer günstigen und effizienten Nachsorge entgegenzutreten. Um den
Krankheitsverlauf möglichst kostengünstig und mit einem geringen Zeitaufwand
verbunden zu gestalten eignet sich die Bestimmung von sogenannten Tumormarkern im
Blut. Auf der Suche nach einem spezifischen Antikörper für das maligne Melanom
wurde die Immunreaktivität des Antikörpers MAP2 untersucht. Das Hauptziel bestand
darin das Expressionsmuster von MAP2 in den verschiedenen melanozytären Läsionen
zu ermitteln und zu sehen, inwieweit MAP2 zur Differenzierung der Läsionen
verwendet werden kann.
Es gab zu diesem Zeitpunkt schon Arbeitsgruppen, die sich mit der
immunhistochemischen Charakterisierung des Antikörpers MAP2 und seine Bedeutung
für die Diagnostik des malignen Melanoms beschäftigt haben.
Die Forschergruppe von Fang et al. (2001) untersuchte die Expression von MAP2 in
Melanomen und deren Vorstufen. Hierbei konnten sie zeigen, dass MAP2 reichlich in
der Mehrzahl des melanozytären Naevi und primären Melanomen exprimiert wird, aber
nur schwach in Metastasen in vivo (Fang et al., 2001).
Soltani et al. (2005) haben gezeigt, dass MAP2 mitotische Defekte induziert, das
Wachstum von Melanomzellen hemmt und das metastatische Potential von MM
vorhersagen kann (Soltani et al., 2005).
Folgende Fragen wurden von uns untersucht:
1) Wie ist die Antigenexpression des Antikörpers MAP2?
2) Was lässt sich zum Färbeverhalten von MAP2 in melanozytären Läsionen
sagen? Liegen unterschiedliche Färbemuster innerhalb des Tumors vor? Gibt es
Unterschiede im Färbeverhalten zwischen Primärtumor, Metastasen und Naevi?
3) Besteht eine Korrelation zwischen der MAP2 Expression und der
Tumorprogression?
4) Wie ist der Stellenwert des Markers MAP2 für die Melanomdiagnostik
einzuordnen? Wie sieht die diagnostische Aussagekraft aus?
Um diesen Fragen nachzugehen führten wir eine Studie zur Untersuchung der
Proteinexpression von MAP2 in Melanomen und seinen Vorstufen durch.
- 31 -
3. Material und Methoden
3.1. Patienten
Die vorliegenden Patientendaten wurden aus der Datenbank der Dermatologischen
Klinik der Ruhr-Universität Bochum erhoben. Zunächst erfolgte das Auffinden und die
Selektion aller Melanompatienten die zwischen den Jahren 2002 und 2008 in der
Universitätsklinik der Ruhr-Universität-Bochum operiert worden waren. Als
Vergleichsgruppe sollte uns ein Patientenkollektiv von Patienten mit der Diagnose
melanozytärer Nävus dienen, dazu zählten dysplastische Naevi, Naevi vom Junktions-
und Compound-Typ und dermale Naevi.
Informationen über die Tumordicke nach Breslow und das Stadium der Erkrankung
nach dem American Joint Committee on Cancer (AJCC) wurden von den Original-
Berichten der Melanom-Patienten gesammelt (Gimotty et al., 2005).
Der Nachweis von Metastasen und die Einteilung der Patienten in die entsprechenden
Tumorstadien wurden nach den aktuellen Leitlinien durchgeführt. Hierzu gehörte neben
der klinischen körperlichen Untersuchung mit einer Inspektion des gesamten
Integuments auch die Verwendung von bildgebenden Verfahren. In Abhängigkeit vom
Stadium des Tumors und zum Ausschluss von Metastasen wurden Röntgen-Thorax-
Aufnahmen und andere apparative Verfahren, wie die Durchführung eines CTs, MRTs,
PET und einer Skelettszintigrafie zum weiteren Staging hinzugezogen.
3.1.1. Gewebeproben
Die histologischen Schnitte der hier vorliegenden Patienten stammen aus der
Gewebebank der Dermatologischen Klinik der Ruhr-Universität-Bochum und wurden
zufällig ausgewählt. Nach der Entnahme der Gewebeproben erfolgte die Fixierung in
10%igem gepufferten Formaldehyd und die anschließende Einbettung in Paraffin. Die
Bearbeitung der Schnitte führte das histologische Labor durch, die histologische
Diagnostik ein erfahrener Dermatohistopathologe und wurde durch die Begutachtung
eines zweiten bestätigt.
3.1.2. Gewebearten
Es wurden insgesamt 124 einzelne Präparate von melanozytären Hautveränderungen
immunhistologisch beurteilt, darunter 42 benigne Naevi, 22 dysplastische Naevi und 45
superfiziell spreitende Melanome, sowie 15 Melanommetastasen. Die Proben stammten
- 32 -
teilweise von Patienten mit mehreren Hautveränderungen bzw. mit vorhandenen
Metastasen. Hier wurden dann alle zur Verfügung stehenden Präparate untersucht.
3.2. Schritte zur Vorbereitung
Herstellung von Paraffinschnitten
Die Hautproben gelangen in Formalin eingelegt ins Labor. Hier werden sie je nach
Größe zugeschnitten und anschließend für ein paar Stunden in Formalin geparkt. Über
Nacht werden sie im Entwässerungsgerät zunächst in warmem Alkohol (70, 96, 100%),
dann in Xylol und anschließend in gelöstem Paraffin gebettet. Am folgenden Tag
werden die Hautproben in dem gelösten Paraffin in neue Förmchen gegossen. Die in
Paraffin eingebetteten Gewebeproben werden mit dem Mikrotom in 4 μm dicke
Schnitte geschnitten und werden anschließend auf Superfrost-Objektträger gelegt. Am
Mikrotom (Leica RM 2135) werden die 4 μm dicken Blöckchen kalt geschnitten. Es
schließt sich eine mindestens 20 minütige Aufbewahrung im Brutschrank bei einer
Hitze von 60°C an, hierbei kommt es zum Anschmelzen des Paraffins.
Entparaffinierung und Gewebevorbehandlung
Es ist wichtig, dass das Einbettungsmedium vor dem Färben vollständig entfernt ist, um
eine Hintergrundfärbung und eine damit verbundene Überdeckung der positiv gefärbten
Zellen zu vermeiden (Boenisch, 2007; Kumar and Rudbeck, 2009).
Zur Entparaffinierung werden folgende Schritte durchlaufen:
- 2 x 10 min Xylol zur Entparaffinierung
- 2 x 5 min in 99%-iges Ethanol
- 1 x 5 min in 96%-iges Ethanol
- 1 x 5 min in 70%-iges Ethanol
- 1 x 5 min in 50%-iges Ethanol,
Zur Rehydrierung werden die Präparate etwa 5 Minuten unter fließendes
Leitungswasser gehalten.
Anschließende erfolgt die Vorbereitung der Proben für die immunhistochemische
Färbung.
- 33 -
Herstellung des Antikörpers
Der Antikörper MAP2ab ist ein monoklonaler Antikörper des Isotyps IgG mit einem
Molekulargewicht von 280 kDa (doublet) (Harrison and Hyams, 1990).
Dieser Antikörper ist hochspezifisch für MAP2ab und zeigt keine Kreuzreaktion mit
MAP1, MAP5, Tubulin oder Tau. Er reagiert mit Dendriten und Zellkörpern von
Neuronen greift aber nicht in neuronale Prozesse ein. Deweiteren reagiert er auch nicht
mit der niedermolekularen Form MAPc (70 kDa). Mikrotubuli-assoziiertes Protein aus
Rinderhirn dient als Immunogen, die Gewinnung erfolgt aus Aszites der Maus.
Der Antikörper mit dem Klon AP20 wurde 1994 erstmals klassifiziert. Im humanen
MAP2-Molekül findet sich das korrespondierende Epitop in den Aminosäuren 995-
1332 (Kalcheva et al., 1994).
Hergestellt wurde der monoklonalen Antikörper Maus-MAP-2ab (Kat. Nr.: 513-6104)
von Zytomed Systems, Berlin, Deutschland bezogen über www.antikoerper-online.de.
3.3. Immunhistochemie
Bei der Immunhistochemie handelt es sich um einen Überbegriff unter den viele
Methoden subsummiert werden, die verwendet werden, um Antigene mit dem Einsatz
von spezifischen Antikörpern mittels Färbung zu visualisieren (Brandtzaeg, 1998;
Haines and West, 2005). Die Immunhistochemie wird bei der Suche nach Zell- oder
Gewebs-Antigenen benutzt. Die Technik, die hierbei zur Anwendung kommt, besteht
aus zwei Phasen: der Vorbereitung der zu untersuchenden Materialien und der sich
anschließenden Interpretation und Quantifizierung der gewonnen Ergebnisse.
Die Immunhistochemie ist ein wichtiges Instrument für die wissenschaftliche
Forschung, aber auch im klinischen Alltag hilfreich als ergänzende Methode zur
Aufklärung von Differentialdiagnosen, die durch konventionelle
Untersuchungsmethoden nicht möglich sind (Matos et al., 2010).
Von Immunzytochemie spricht man, wenn die gewünschten Untersuchungen direkt die
Zellen und die Zellbestandteile betreffen (Matos et al., 2010).
- 34 -
3.3.1. Prinzip der Immunhistochemischen Färbung
Um Gewebe- bzw. Zellantigene im mikroskopischen Bild sichtbar zu machen wendet
man immunhistochemische Färbetechniken an. Durch die Antigen-Antikörper-Reaktion
wird das Antigen im Schnittpräparat dargestellt.
Man verwendet hierfür spezifische Antikörper, die mit verschiedenen Markern versehen
sind, wie beispielsweise Fluoreszenzfarbstoffe oder Enzyme, aber auch partikuläres
Material wie Gold oder radioaktive Isotope. Die Aussagekraft der Methode hängt von
der Spezifität der verwendeten Antikörper ab und der Stabilität des verwendeten
Antigens (Seidal et al., 2001).
In der Vergangenheit wurden verschiedene Färbetechniken verwendet, die heute aber
kaum noch zur Anwendung kommen. Hierzu zählt die direkte Methode, bei der
enzymmarkierte Antikörper mit dem Gewebsantigen reagieren und anschließend mit der
Substrat-Chromogenreaktion sichtbar gemacht werden (Nakane and Pierce, 1966;
Nakane 1968).
Eine Verbesserung der Sensitivität erreichte man mit der Einführung der indirekten
Methode. Diese Methode erfolgt in zwei Schritten. Ein spezifischer Primärantikörper
wird auf das zu untersuchende Gewebe aufgebracht. Es wird ein zweiter Antikörper
(Sekundärantikörper) dazugegeben, der sich gegen den Primärantikörper richtet. Der
Sekundärantikörper ist mit einem Enzym gekoppelt und löst einen Farbumschlag aus.
Die Enzym-Substrat-Reaktion wird somit sichtbar gemacht (Haines and West, 2005;
Boenisch, 2007).
Die indirekte Methode, die auch als indirekte Immunfluoreszenz bezeichnet wird, gibt
es als Zwei- bzw. Drei-Schritt-Methode (Kumar and Rudbeck, 2009).
Ein weiteres Verfahren stellt die Peroxidase-Antiperoxidase-Methode (PAP) dar, bei
der es zur Verwendung von löslichen Enzym-Immunkomplexen kommt. Bei dieser
Methode werden in drei Stufen ein Primärantikörper, ein Brückenantikörper sowie ein
Peroxidase-Antiperoxidase-Komplex aufgetragen. Der Vorteil dieser Methode liegt in
einer erhöhten Sensitivität und einer geringeren Hintergrundanfärbung als bei den
Vorgänger-Methoden (Sternberger et al., 1970).
Heutzutage wird vor allem die Avidin/Streptavidin-Biotin-Methode bevorzugt
verwendet.
- 35 -
3.3.2. Avidin/Streptavidin-Biotin-Methode
Das Prinzip der Avidin/Streptavidin-Biotin-Methode beruht auf der starken Affinität
von Streptavadin (Streptomyces avidinii) und Avidin (Hühnereiweiß) für Biotin, einem
Glycoprotein. Streptavidin und Avidin besitzen beide vier Bindungsstellen für Biotin
(Kumar and Rudbeck, 2009; Santora et al., 2000). Es bestehen zwei Verfahren, die in
der Routine zu ihrer Anwendung kommen. Das Prinzip beruht in beiden Fällen darauf,
dass ein Primärantikörper an mehreren Peroxidasemolekülen bindet. Es werden
Komplexe aus enzymmarkierten Avidin/Streptavidin-Biotin-Komplexe mit
biotinylierten Sekundärantikörpern gebildet (ABC-Methode) oder es erfolgt eine
Kopplung von enzymmarkiertem Avidin an biotinylierte Sekundärantikörper (labelled
avidin biotin technique, LAB) (Hsu and Raine, 1981; Hsu et al., 1981a). Durch diese
Reaktion kann eine höhere Empfindlichkeit im Vergleich zu den direkten Verfahren
erzielt werden. Die beiden Methoden sollen hier kurz dargestellt werden. (Abbildung 1
und 2).
Bei der Avidin-Biotin-Komplex (ABC)-Methode bindet Avidin an einen biotinylierten
sekundären Antikörper und übernimmt so die Funktion als Bindeglied zwischen dem
gewebsgebundenen primären Antikörper und dem Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex.
Abbildung 1: Darstellung der indirekten Methode (modifiziert nach Kumar and Rudbeck, 2009).
- 36 -
Bei der Labeled-Streptavidin-Biotin (LSAB)-Methode wird in einem ähnlichen
Verfahren ein biotinylierter Sekundärantikörper benutzt. Der Primärantikörper bindet an
das gesuchte Gewebsantigen.
Abbildung 2: Darstellung der LSAB Methode (modifiziert nach Kumar and Rudbeck, 2009).
Mit der ABC- und der LSAB-Technik wird eine höhere Sensitivität im Vergleich zu den
direkten Methoden erreicht (Hsu et al., 1981b).
Die Intensität der Reaktion wird durch den Farbumschlag ausgedrückt, der
niedergeschlagene Farbstoff ist proportional zur Menge des untersuchten Antigens.
Durch eine Gegenfärbung werden Zellen, die das Antigen nicht aufweisen, im Kontrast
dargestellt.
3.4. Durchführung der immunhistochemischen Färbungen
Nach der Vorbehandlung der Schnitte durch Entparaffinierung und anschließender
Rehydrierung mit Wasser als Puffer, werden die demaskierten Proben für die Färbung
vorbereitet. Verwendet wurde das Dako REAL Detection System, Alkaline
Phosphatase/RED, Rabbit/Mouse Code Nr. K5005.
Prinzip des Verfahrens:
Das Dako REAL Detection System, Alkaline Phosphatase/RED, Rabbit/Mouse wird bei
der Durchführung von immunhistochemischen Verfahren benutzt, um die
entsprechenden Immunfärbungen darzustellen. In seinem Prinzip beruht es auf einen
indirektem Streptavidin-Biotin-Verfahren, das heißt mithilfe von markiertem
Streptavidin-Biotin kommt es zu der gewünschten Reaktion. Das in dem Kit enthaltene
- 37 -
Streptavidin wurde aus Streptomyces avidinii gewonnen, die alkalische Phosphatase aus
der Schleimhaut des Kalbsdarms isoliert.
Das vorliegende Verfahren beruht auf drei Schritten. Zunächst wird das Gewebe mit
dem verdünnten primären Kaninchen-oder Mausantikörper versehen. In einem zweiten
Schritt kommt es zur Hinzunahme eines zweiten Antikörpers, in diesem Fall dem Dako
REAL Link, Biotinylated Antibodies (AB2). Schließlich erfolgt eine Inkubation der
Gewebeproben mit der Dako REAL Streptavidin Alkaline Phosphatase (AP). Die
Farbreaktion wird unter Hinzunahme des RED Chromogen erreicht (Dako, 2006).
Reagenzien:
- monoklonalen Antikörper Maus-MAP-2ab (Kat. Nr.: 513-6104) (Zytomed,
Berlin, Deutschland), Verdünnung 1:100
- Biotinylated Secondary Antibodies (AB2): 100ml, Biotinylierte Ziege-Anti-
Maus- und Ziege-Anti-Kaninchen-Immunglobuline. Gepufferte Lösung,
Stabilität erreicht durch Protein und Natriumazid.
- Streptavidin Alkaline Phosphatase (AP), 100 ml
- Chromogen Red 1-3, 8ml, 28fach konzentriert
- AP Substrate Buffer, 250 ml
- Levamisole, 1ml, 501fach konzentriert
(aus: Dako (2006). Dako REAL Detection System, Alkaline Phosphatase/RED,
Rabbit/Mouse Code Nr. K5005. 4. Auflage)
Durchführung des Färbevorgangs:
Das immunchemische Färben der Gewebeschnitte erfolgte nach folgendem Protokoll:
1. 20 Minuten waschen in Target Retrieval Solution (Dako, Hamburg,
Deutschland)
2. Beizen des Formalin-fixierten Gewebes erforderte Sieden mit dem Dampfgarer
bei 96°C mit 10 mM Citratpuffer, pH 6.0 für 10 Minuten
3. 25 min Auskühlen
4. Antikörperhinzunahme mit monoklonalen Maus-MAP-2ab (Kat. Nr.: 513-6104)
(Zytomed, Berlin, Deutschland) in einer Verdünnung von 1:100.
5. 30 Minuten Inkubation im Dako-Autostainer-Immunfärbeautomat
6. Hinzugabe des zweiten Antikörpers, Biotinylated Secondary Antibodies (Dako)
7. Waschpufferlösung (Dako) 10x2 Minuten gewaschen
- 38 -
8. 30minütige Inkubation mit Streptavidin-Alkaline-Phosphatase
9. Gegenfärben der Präparate durch Hinzugabe von Chromogen Red
10. 10 Minuten wässern in Leitungswasser zur Farbintensivierung
11. Lufttrocknen der Präparate
Schließlich Betrachtung der Farbreaktion unter dem Mikroskop. Am Ort des vom
primären Antikörper erkannten Zielantigens sollte eine kontrastreiche rote Farbe als
Endprodukt auszumachen sein.
Durch das Mitführen von Kontrollproben mit entsprechendem Farbverhalten erfolgte
die Qualitätskontrolle. Die Prüfung der Spezifität wurde durch die Blockade des
primären Antikörpers und die Färbung der Negativ-Kontrolle wurde durch Weglassen
des primären Antikörpers erreicht.
Entwässerung der Schnitte:
Die Entwässerung der Gewebsproben schließt sich dem Färbevorgang an. Hierzu
werden folgende Schritte durchlaufen:
- 70%-iges Ethanol 2-3 min
- 96%-iges Ethanol 2-3 min
- 2x 99%-iges Ethanol 2-3 min
- 3x Xylol 2-3 min
Danach werden die Präparate in Folie eingedeckt, was zu einer längeren Haltbarkeit der
Gewebeproben führt.
3.5. Auswertung der histologischen Schnitte
Die Auszählung der immunhistochemischen gefärbten Schnitte erfolgte durch
denselben Untersucher der nach dem gleichen Schema die MAP-2 Expression von
Melanozyten in der Läsion auswertete. Die mikroskopische Auswertung (Vergrößerung
100x, bzw. 40x) erfolgte durch den Untersucher indem er drei zufällig ausgewählte
Sichtfelder im Bereich des Tumors, nach dem für MAP-2 spezifischen Färbeverhalten,
auszählte. Ein kräftiger Farbumschlag wurde als positiv bewertet, eine unspezifische,
diffuse Färbung, als negativ. Der Prozentsatz der positiv gefärbten Melanozyten pro
Feld innerhalb einer Läsion wurde als Prozentsatz bezogen auf die gesamte
Melanozyten Zellzahl innerhalb des Gesichtsfeldes ermittelt.
- 39 -
3.6. Die statistische Analyse
Die statistische Auswertung der gewonnenen Daten und deren Aufarbeitung erfolgte
unter der Verwendung des Statistik-Pakets MedCalc Software (Mariakerke, Belgien).
Um die erhaltenen Testergebnisse zu beurteilen, wurde die Verteilung der Daten mit
den D`Agostino-Pearson-Test berechnet. Die Einweg-Varianzanalyse (ANOVA)
einschließlich der Levene-Test auf Gleichheit der Varianzen und der Student-Newman-
Keuls post hoc-Test für paarweise Vergleiche wurden für die Analyse von
unabhängigen Daten verwendet.
Bevor der ANOVA-Test durchgeführt wird, wird mithilfe des Levene-Test auf
Gleichheit der Varianzen geprüft, inwieweit sich die Gruppen hinsichtlich ihrer
Differenzen unterscheiden.
Mit der Varianzanalyse (ANOVA, analysis of variance) sollen Schlüsse über die
Gesetzmäßigkeiten, die sich hinter den Daten verbergen, aufgezeigt werden. Die
Einweg-Varianzanalyse wird verwendet, um den Unterschied zwischen den
Mittelwerten, die aus mehreren Untergruppen einer Variablen ermittelt wurden, zu
testen (Woodward, 2005). Fällt der ANOVA-Test positiv aus (p< 0,05), heißt das, dass
in der untersuchten Gruppe signifikante Unterschiede bei den Mittelwerten vorliegen.
Die Daten werden dann mithilfe des Student-Newman-Keuls Test für paarweise
Vergleiche durchgeführt. Dieser post-hoc-Test gibt darüber Auskunft, bei welchen
Mittelwerten signifikante Unterschiede bestehen.
Kategoriale Daten wurden in dieser Arbeit anhand des Chi-Quadrat-Tests ausgewertet.
Mit dem Chi-Quadrat-Test werden Eigenschaften einer statistischen Grundgesamtheit
auf ihre Verteilung hin untersucht. Er dient zur Analyse von Häufigkeitsunterschieden
(Weiß, 2010). Dieses Verfahren kommt dann zur Anwendung, wenn man einen
Vergleich zwischen der beobachteten Häufigkeitsverteilung von den erhaltenen
Kategorialdaten mit der zu erwarteten Verteilung herstellen möchte. Es geht hier darum,
die Verteilung einer kleinen Stichprobe von Individuen auf eine entsprechende Anzahl
an Kategorien zu vergleichen, entsprechend der von der Nullhypothese erwarteten
Verteilung (Bortz and Lienert, 2008).
Die Korrelationsanalyse der Daten erfolgte durch Anwendung des Pearson
Korrelationskoeffizienten. Der Korrelationskoeffizient nach Pearson ist ein Maß zur
Quantifizierung eines linearen Zusammenhangs. Dieser Koeffizient wird berechnet,
indem man die Kovarianz durch die beiden Standardabweichungen dividiert. Der
- 40 -
Korrelationskoeffizient kann nur Werte zwischen -1 und +1 annehmen und ist
dimensionslos (Weiß, 2010).
Durch die Berechnung des p-Werts (p value) kann die statistische Signifikanz ermittelt
werden. Um das genaue Signifikanzniveau anzugeben, wird die Wahrscheinlichkeit
nicht als Prozentzahl, sondern als sogenannter p-Wert angegeben. Der p-Wert ist die
exakte Wahrscheinlichkeit ein Ergebnis zu bekommen, wie es in der Teststatistik
beobachtet wurde, wenn die Nullhypothese wahr ist (Woodward, 2005).
In der Statistik wird der p-Wert dazu verwendet Entscheidungen zu treffen. Die
Nullhypothese ist die Annahme, dass kein signifikanter Unterschied vorliegt.
Liegt der Wert für p unter 0,05, wird die Nullhypothese bei einem Signifikanzniveau
von 5% abgelehnt (Woodward, 2005). Die Ablehnung der Nullhypothese wird als
Nachweis für das Vorliegen eines statistischen Zusammenhangs gewertet.
Auch in der vorliegenden Arbeit wurde ein p-Wert 0,05 wurde als statistisch
signifikant angesehen.
- 41 -
4. Ergebnisse
4.1. Das Patientenkollektiv
Es wurden von uns Naevi, darunter benigne und dysplastische, sowie zwei
Melanomstichproben, zum einen der Primärtumor in unterschiedlicher Größe und zum
anderen die Melanommetastasen, auf ihre Immunreaktivität mit dem Antikörper MAP2
untersucht. Die Stichprobe umfasste insgesamt 124 Proben, wobei die Gruppe der BN
aus 42 Präparaten bestand. Die Gruppe der DN enthielt 22 Proben, die der
Melanomgruppe 45, sowie 15 Melanommetastasen. Die vertikale Tumordicke nach
Breslow lag in der Melanomstichprobe im Median bei 0.97 mm (von 0,1 bis 4,6 mm).
Insgesamt gingen die klinischen Daten von 124 Patienten in unsere Studie mit ein.
Davon waren 80 der Teilnehmer Männer und 44 Frauen. Der Altersmedian mit
Standardabweichung (engl. SD) lag bei 47.7±14.1 Jahren. Die Altersverteilung in den
einzelnen Gruppen unterschied sich nicht wesentlich.
Tabelle 10: Die Verteilung der Patienten mit benignen und malignen melanozytären Hautläsionen nach
klinischen Merkmalen
Diagnose Geschlecht (m/w) Alter (in Jahren ± SD )
Benigner Naevus (n = 42) 28/14 42.1±15
Dysplastischer Naevus
(n = 22)
18/4 39.8±11.7
Superfziell spreitendes
Melanom (n = 45)
24/21 58.3±13.1
Subkutane
Melanommetastasen
(n = 15)
10/5 50.5±16.6
Die Nachsorge der Patienten erfolgte nach den aktuellen Leitlinien der
Arbeitsgemeinschaft Dermatologische Onkologie. Neben einer eingehenden Inspektion
des gesamten Integuments erfolgten auch die entsprechenden bildgebenden
Untersuchungen, dazu zählen die Sonografie des Lymphknoten, Röntgenaufnahmen des
Thorax und gegebenenfalls die Durchführung von CT, MRT und Skelettszintigrafie je
nach Ausgangsbefund. Bei jedem Präparat wurde die Diagnose durch einen erfahrenen
Histopathologen der Dermatologie gestellt. Alle Proben der Stichprobe die in dieser
- 42 -
Arbeit vorgestellt werden, wurden außer mit dem hier untersuchten MAP2 auch
routinemäßig mit HMB-45 und anti-S100 gefärbt.
4.2. Qualitative Auswertung der Schnittpräparate nach MAP2-Färbung
Immunhistochemisches Färbeverhalten von MAP2 an melanozytäre Nävi
Benigne Naevi
Bei den benignen Naevi kam es eher zu einer moderaten Färbung des Zytoplasmas der
Hautzellen. Dies zeigte sich auch in einer geringeren mediane MAP2-Expression im
Vergleich zu den anderen untersuchten Läsionen. In diesem Fall lag sie bei 18.6±10.5%.
Dysplastischer Naevus
Von den dysplatischen Naevi wurden 22 untersucht. Die mediane MAP2-Expression bei
den dysplastischen Naevi betrug 26±8.5%. Das heißt, dass etwa 1/3 der Zellen eine
deutliche Immunreaktivität für MAP2 aufwiesen. Auch die Farbintensität der gefärbten
Zellen war intensiver.
Immunhistochemisches Färbeverhalten von MAP2 an primären malignen
Melanomen
Von den 45 primären Melanomen hatten 11 (24.4%) das Clark level II, 14 (31.1%)
hatten Clark level III, und 20 (44.4%) konnten der Gruppe Clark level IV zugeordnet
werden. Einundzwanzig (46.7%) der Patienten befanden sich nach AJCC-Stadium im
Stadium IA, sieben (15.6%) waren dem Stadium IB zuzuordnen, acht (17.8%) hatten
IIA, ein Patient (2.2%) war im Stadium IIB, vier (8.9%) hatten bereits das Stadium IIIA
erreicht, ein weiterer (2.2%) hatte IIIB und drei (7%) befanden sich im Stadium IV der
Erkrankung.
Bei den primären Melanomen zeigte sich eine positive Färbung für MAP2. Die mediane
MAP2-Expression lag bei 26.9±10.1%.Diese Läsionen zeigten im Allgemeinen eine
starke und homogene Reaktivität, wobei es in den zentralen Regionen der Läsionen zu
einer größeren Anreicherung der Immunreaktivität kam.
Immunhistochemie des monoklonalen Antikörpers MAP2 bei Melanommetastasen
Insgesamt wurden 15 Metastasen untersucht, welche hauptsächlich kutane, subkutane
oder Lymphknotenmetastasen waren. Diese Läsionen zeigten eine moderate Reaktivität.
Dies spiegelte sich in der medianen MAP2-Expression wider, die in diesem Fall bei
- 43 -
19.3±7.1% lag. Im Allgemeinen waren die Färbungen für MAP2 eher in den zentralen
Regionen der Läsion zu finden, schlossen also einen Großteil der neoplastischen Zellen
ein.
Tabelle 11: Expression von MAP2 bei Patienten mit benignen und malignen melanozytären Hautläsionen
( * Zytoplasmatische Proteinexpression in Melanozyten).
Diagnose Geschlecht
(m/w)
Alter
(in Jahren ± SD)
MAP-2*
Expression in %
mean±SD
Benigner Naevus (n = 42)
28/14 42.1±15 18.6±10.5
Dysplastischer Naevus
(n = 22)
18/4 39.8±11.7 26±8.5
Superfziell spreitendes
Melanom
(n = 45)
24/21 58.3±13.1 26.9±10.1
Subkutane
Melanommetastasen
(n = 15)
10/5 50.5±16.6 19.3±7.1
Färbeverhalten und fotografische Darstellung
Die normale Haut wurde von MAP2 nicht gefärbt. Das betraf auch die dem Tumor
direkt angrenzenden Hautzellen. Die meisten anderen Zellen der Dermis und Epidermis
waren ebenfalls negativ für MAP2. Von besonderem Interesse war die Anfärbbarkeit
von normalen und aktivierten Melanozyten, Keratinozyten, und Langerhanszellen.
Artefakte oder andere Störfaktoren, wie die Hintergrundfärbung waren nicht immer
vermeidbar. Jedoch konnten eindeutige Aussagen getroffen werden bezüglich des
Farbniederschlags bei positiv reagierenden Hautzellen. Bei der mikroskopischen
Untersuchung konnten die MAP2-positiven deutlich von MAP2-negativen Zellen, bis
auf wenige Ausnahmen, abgegrenzt werden. Bei der Betrachtung der Schnittpräparate
verschiedener Läsionen zeigten sich zum Teil deutliche Unterschiede in der Intensität
des Farbniederschlags.
- 44 -
4.3. Bildmaterial
Abbildung 4: Fotografische Darstellung von einem benignen Naevus vom Compoundtyp. Das
Tumorkonvolut ist im oberen Korium gut abgrenzbar, mittleres und tiefes Korium sind frei. Vereinzelt
Melaninablagerungen sichtbar. Vergrößerung 100x
Abbildung 3: Fotografische Darstellung von einem benignen Compound-Naevus.
Keine positive MAP2-Immunreaktivität. Vergrößerung 100x
- 45 -
Abbildung 5: Fotografische Darstellung von einem benignen Naevus vom Junktionstyp. Eher
verminderte Expression von MAP2. Die Reteleisten sind breitbasig verbreitert. In der Junktionszone
finden sich Nester von Melanozyten in unregelmäßigen Abständen. Vergrößerung 100x
- 46 -
Abbildung 6: Fotografische Darstellung von einem dysplastischen Naevus. Deutliche Expression von
MAP2. Zytologische Atypien sowie eine stromale Reaktion im oberen Korium sind erkennbar.
Vergrößerung 100x
- 47 -
Abbildung 7: Fotografische Übersichts-Darstellung von einem Superfiziell spreitenden Melanoms.
Deutliche MAP2-Expression in der Dermis. Unregelmäßige Pigmentverteilung. Vergrößerung 100x
- 48 -
Abbildung 8: Fotografische Darstellung eines superfiziell spreitenden Melanoms mit einer
unregelmäßigen Epidermishyperplasie. Melanozyten in allen Lagen der Epidermis. Breite dermale
Infiltration mit einem kräftigen lymphozytären Infiltrat an der Tumorbasis. Vergrößerung 100x
Abbildung 9: Fotografische Darstellung von einem superfiziell spreitenden Melanom (Tumordicke
nach Breslow 1.6 mm; Clark level III; T2aN0M0) Deutliche diffuse Durchsetzung des Oberflächen-
und Tiefenepithel durch MAP2-positive Tumorproliferate. Vergrößerung 100x
- 49 -
Abbildung 10: Fotografische Darstellung von einer Melanommetastase. Die Läsion zeigt eine moderate
Reaktivität gegenüber MAP2. Vergrößerung 100x
- 50 -
Abbildung 11: Der DN vom Compoundtyp (Bild 1) und das SSM (Tumordicke nach Breslow 1.6 mm;
Clark level III; T2aN0M0) (Bild 2) lassen eine stärkere MAP2-Expression erkennen als der
Compoundnaevus (Bild 3) und die subkutane Melanommetastase (Bild 4). Vergrößerung 100x.
1 2
3 4
- 51 -
4.4. Quantitative Auswertung der MAP2-Expression
Durch den Vergleich von Melanozyten, mit beziehungsweise ohne Farbniederschlag,
nach Reaktion mit farbgekoppeltem MAP2-Antikörper lassen sich Aussagen über die
Quantität der Expression machen. Die im Methodenteil beschriebenen statistischen
Tests dienen hier als Grundlage. Die Ergebnisse werden nun im Folgenden besprochen,
basierend auf dem Verhältnis von MAP2-positiven, mit einem Farbniederschlag
einhergehenden, zu MAP2-negativen Zellkörpern.
Die Boxplots dienen der graphischen Veranschaulichung der Ergebnisse. Es handelt
sich bei dem Boxplot um eine übersichtliche graphische Darstellungsform, die einige
charakteristische Lage- und Streuungsmaße zusammenfasst. Sie erleichtert durch ihre
anschauliche Art einen Eindruck über die Lage und Streuung der gewonnenen Daten
und ermöglicht einen Vergleich der Daten verschiedener Gruppen untereinander. Die
Schachtel (box) enthält den Median, als das Zentrum der Daten, sowie das untere und
obere Quantil. Von der Box ausgehend werden Minimum und Maximum der Daten
gezeichnet (Kreienbrock and Schach, 2005).
Abbildung 12: Mediane MAP-2-Expression in BN, DN sowie in SSM und subkutanen
Melanommetastasen. Deutlich verminderte (P < 0.05) Immunreaktivität von MAP2 in BN und
subkutanen Melanommetastasen im Vergleich zu den DN und dem SSM.
- 52 -
Vergleich der MAP2-Expression in den verschiedenen Läsionsgruppen
Die Daten der immunhistologischen Auswertung waren normalverteilt. Unter
Anwendung des Levene’s test für die Testung auf Gleichheit der Varianzen konnte kein
signifikanter (p > 0.05) Unterschied innerhalb der verschiedenen untersuchten Gruppen
festgestellt werden.
Die Einweg-Varianz-Analyse ANOVA, wobei hier auch der Student-Newman-Keuls
post hoc-Test für paarweise Vergleiche durchgeführt wurde, zeigte, dass die
Immunaktivität gemessen an der MAP-2 Expression in den verschiedenen Hautläsionen
variierte.
In den dysplastischen Naevi mit 26±8.5% und den superfiziell spreitenden Melanomen
mit 26.9±10.1% war die MAP-2 –Expression signifikant erhöht (p < 0.05) im
Vergleich zu der MAP-2 Expression bei den benignen Naevi, die hier bei 18.6±10.5%
lag. Dagegen zeigte sich bei den subkutanen Metastasen eine signifikante (p < 0.05)
Verminderung mit 19.3±7.1%, im Vergleich zu der Immunaktivität von MAP-2 in den
dysplastischen Naevi (26±8.5%) und dem superfiziell spreitenden Melanom
(26.9±10.1%). Hingegen schien es bei dem direkten Vergleich der MAP-2 Expression,
den wir bei den benignen Naevi (18.6±10.5%) und den subkutanen Melanommetastasen
(19.3±7.1%) beobachten konnten, keinen großen Unterschied zu geben (p > 0.05).
Vergleich der Regionen innerhalb eines Kollektivs
Die Auswertung der statistischen Daten ergab, dass die MAP-2 Expression in der
Gruppe der superfiziell spreitenden Melanome signifikant mit der vertikalen
Tumordicke nach Breslow (r = 0.36; p = 0.016) korrelierte. Zwischen der MAP-2
Expression und dem Invasionslevel nach Clark konnte ebenfalls eine positive
Korrelation nachgewiesen werden (r = 0.4; p = 0.0078). Ein weiterer positiver
Zusammenhang scheint zwischen der Immunreaktivität von MAP-2 und dem Stadium
der Erkrankung zu bestehen (r = 0.31; p = 0.039).
- 53 -
5. Diskussion
„Zu den bedrückendsten Erfahrungen dermatologischer Tätigkeit in früheren
Jahrzehnten gehörte die außerordentlich schlechte Prognose bei Patienten mit malignen
Melanomen. Diese Patienten kamen, wie wir heute wissen, mit viel zu großen
Primärtumoren viel zu spät zur Behandlung. Meistens starben solche Patienten an den
Folgen ausgedehnter Metastasierung“, so Prof. Dr. Dr. h. c. mult. Otto Braun-Falco,
vorm. Direktor der Dermatologischen Klinik und Poliklinik der Ludwig-Maximilians-
Universität München, in seinem Geleitwort für das Manual Maligne Melanome des
Tumorzentrums München (2000) (Volkenandt and Plewig, 2000).
Die Inzidenz des malignen Melanoms hat in der weißen Bevölkerung weltweit
zugenommen (Hall et al., 1999; van der Rhee et al. 1999). Obwohl dieser Tumor
weniger als 5 % der bösartigen Neoplasien der Haut umfasst, ist er jedoch
verantwortlich für fast 60% der Todesfälle, die auf eine Neubildung der Haut
zurückzuführen sind (Radović-Kovacević et al., 1997).
In seiner Entwicklung ist das maligne Melanom ein Tumor der sich oft in verschiedenen
Ausprägungen zeigen kann, der aber gerade wegen seiner Tendenz früh zu
metastasieren, schlimme Verläufe für den Patienten und seine Angehörigen bedeuten
kann. Aus diesem Grund sollten alle uns möglichen Anstrengungen weiterhin
unternommen werden, diesen bösartigen Tumor zu untersuchen und zu versuchen neue
Therapieoptionen auszuloten. Eine enge interdiziplinäre Zusammenarbeit ist somit
gefordert, um gerade in der frühen Phase pigmentierte Hautveränderungen nach ihrer
Dignität einzuordnen und entsprechend zu therapieren.
Die Notwendigkeit von effizienten Konzepten in der Früherkennung des malignen
Melanoms ist gegeben. Einen Ansatz bietet hier sicherlich die weitere Erforschung der
Tumormarker. Da viele konventionelle Behandlungsformen versagen, wird man nicht
darum herum kommen wirksame und effektive Behandlungsmethoden für das maligne
Melanom auf anderen Feldern zu suchen. Dies stellt einer der höchsten Prioritäten in
der Dermatologie insbesondere in der Krebsforschung dar (Song et al., 2010).
5.1. Anforderung an den Marker
Marker oder auch Biomarker, wie sie in der Medizin verwendet werden, sollten gewisse
Bedingungen erfüllen, um den therapeutischen Anforderungen gerecht zu werden. Sie
sollten eine hohe Spezifität und Sensitivität aufweisen.
- 54 -
Unter Sensitivität (Empfindlichkeit) eines Tests versteht man den Anteil der Patienten,
die bei vorliegender Krankheit auch im Test positiv sind. Die Spezifität gibt darüber
Auskunft, ob ein Gesunder auch im Test als gesund erkannt wird, also Test-negativ ist
Natürlich ist es wünschenswert, ein Testverfahren zu etablieren, das sowohl eine hohe
Sensitivität als auch eine hohe Spezifität aufweist. In der Regel ist dies allerdings nicht
möglich, da eine gegenläufige Abhängigkeit zwischen der Sensitivität und der Spezifität
besteht (Fletcher and Flechter, 2007).
Die Antikörper, die derzeit hauptsächlich ihre Verwendung bei der Melanomdiagnostik
finden, weisen in ihrer Spezifität und Sensitivität eben diese Einschränkungen auf.
In seiner Studie verglichen Clarkson et al. (2001) die Marker S100-Protein, HMB-45,
Melan A und Tyrosinase miteinander. Sie kamen zu dem Ergebnis, das die
Kombination von S100- Antikörper mit HMB-45 und Melan A-Antikörpern
empfehlenswert sei. Das S100-Protein hatte zwar die höchste Sensitivität, jedoch eine
im Verhältnis niedrige Spezifität. Andersherum war es bei der immunhistochemischen
Färbung mit HMB-45. Hier gab es die im Vergleich geringste Sensitivität, doch eine
höhere Spezifität. Die Werte der Antikörper gegen Melan A und Tyrosinase lagen in
etwa zwischen denen der anderen beiden Marker (Clarkson et al., 2001).
Ohsie et al. (2008) führten eine Zusammenschau der Literatur bezüglich verschiedener
Differenzierungsmarker für das maligne Melanom durch. Trotz der mittlerweile breiten
Anwendung von immunhistochemischen Markern in der Diagnostik von Melanomen,
bleibt das S-100 der empfindlichste Marker für melanozytäre Läsionen. Andere Marker,
darunter HMB-45, Melan A /MART-1 und Tyrosinase als Beispiel, zeigten zwar eine
gute Spezifität, waren aber in ihrer Sensitivität dem S-100 unterlegen. Ki-67 bleibt eine
sinnvolle Ergänzung bei der Differenzierung zwischen benignen und malignen
melanozytären Hautläsionen. Keinem der Marker, die sie hier untersucht hatten, konnte
ein prognostischer Wert für melanozytäre Hauttumoren zugesprochen werden (Ohsie et
al., 2008).
Zur Differenzierung melanozytärer Hautveränderungen wurden die Eigenschaften von
verschiedenen Antikörpern untersucht.
S100
Das S100-Protein hat sich in der Klinik als Tumormarker beim malignen Melanom bis
heute am meisten bewährt. Im Rahmen der Nachsorge, aber auch beim Therapieverlauf
kommt es zur Anwendung. Seine prognostische Wertigkeit konnte in zahlreichen
Studien ermittelt werden.
- 55 -
Das erstmals im Nervengewebe entdeckte S100-Protein gehört heutzutage schon zur
Routinediagnostik bei der Diagnose und Verlaufskontrolle des malignen Melanoms
(van Eldik et al., 1986). Die im Jahr 1995 veröffentliche Studie zur Beurteilung der
klinischen Relevanz des S100-Werts in Melanomen zeigte eine Korrelation zwischen
dem S100-Serum-Wert und dem Stadium der Erkrankung (Guo et al., 1995).
Die Messungen der Serumwerte für S100 zeigten, dass ein Anstieg mit dem
Fortschreiten der Erkrankung assoziiert war, während ein Abfall der Werte ein
Ansprechen auf die Melanombehandlung zeigte.
In einer weiteren Studie mit 643 Melnaompatienten war das Gesamtüberleben stark mit
der Serum-Konzentration für S100 assoziiert. Für Patienten mit S100-Werten über
0,6μg/l beobachteten sie eine signifikant verminderte Gesamtüberlebenszeit, im
Gegensatz zu Patienten mit S100-Werten im Normbereich (von Schoultz et al., 1996).
S100ß kann als unabhängiger prognostischer Faktor für das maligne Melanom gesehen
werden. Die Höhe der ermittelten Serumkonzentrationen für S100ß korreliert mit dem
Überleben der Patienten. Außerdem ist S100ß als Laborparameter anderen Markern
überlegen in der Detektion von Metastasen des Melanoms, insbesondere im Stadium IV
der Melanomerkrankung (Harpio and Einarsson, 2004).
Bei Patienten, die bei ihrer Krankheit bereits Fernmetastasen aufweisen, zeigen erhöhte
Serumwerte von S100 eine signifikante Korrelation mit dem Überleben (Garbe et al.,
2003; Kruijff et al., 2009).
Diese Tatsache macht man sich in der Nachsorge der Patienten zunutze. Garbe et al.
(2003) empfehlen aus diesem Grund, den S100-Wert zur Verlaufskontrolle regelmäßig
zu kontrollieren (Garbe et al., 2003).
MIA
MIA eignet sich durchaus als Marker, um den Verlauf zwischen klinischem
Erscheinungsbild der Melanomerkrankung und dem Ansprechen auf eine Therapie zu
dokumentieren (Guba et al., 2002; Hamberg et al., 2003).
In frühen Stadien der Erkrankung eignet sich MIA, wie auch S100, jedoch nicht für das
Monitoring des Krankheitsverlaufs (Acland et al., 2002; Juergensen et al., 2001).
Die Messung von MIA erfolgt durch einen quantitativen ELISA („enzyme-linked
immunosorbent assay“). Untersuchungen an Seren von Melanompatienten mit dem
Stadium I und II zeigten keine Korrelation zwischen der Höhe der MIA-Werte und der
Tumordicke (Stahlecker et al., 2000).
- 56 -
In einer Studie von Auge et al. (2005) wurden MIA und S100ß hinsichtlich ihrer
Sensitivität und Spezifität untersucht. 96 der Patienten hatten einen Primärtumor ohne
weitere Krankheitszeichen, 86 Patienten wiesen bereits Melanommetastasen auf. Hier
zeigten sich erhöhte Werte von MIA und S100 in der Metastasengruppe. Beide
Tumormarker zusammengenommen zeigten eine Sensitivität von 69,8% und einer
Spezifität von 96,8% (Auge et al., 2005).
In einer weiteren Studie wurden die vier Tumormarker L-DOPA/Tyrosin, S100B, MIA
und LDH in verschiedenen Kombinationen auf ihrer Aussagekraft an 170
Melanompatienten untersucht. Hier zeigte sich, dass alle vier Marker, bis auf LDH, im
Stadium IV am meisten erhöht waren. MIA und S100B korrelierten stark im Stadium
IV (p<0,001) miteinander und kristallisierten sich als die besten Prädiktoren für die
Überlebenszeit heraus (Garnier et al., 2007).
Verlaufskontrollen von Patienten mit malignen Melanom zeigten einen Abfall der MIA-
Werte bei denen, die auf die Behandlung des Melanoms angesprochen hatten, während
wiederum bei den Patienten mit einer Progredienz der Erkrankung ein Anstieg dieser
Werte zu verzeichnen war (Stahlecker et al., 2000; Guba et al., 2002).
Dies deutet auf möglichen Optionen der MIA-Bestimmung im Serum bei Patienten mit
malignem Melanom, um deren Krankheitsverlauf zu monitoren.
LDH
Die diagnostische Wertigkeit von LDH wird schon seit langem diskutiert. Eine erhöhte
LDH-Konzentration im Serum von Melanompatienten konnte bereits 1954
nachgewiesen werden (Hill and Levi, 1954).
LDH ist ein recht unspezifischer Marker, der eine Prognoseabschätzung erst in späteren
Erkrankungsstadien zulässt, also im Stadium III bzw. IV bei Melanompatienten. Es
konnte gezeigt werden, dass erhöhte LDH-Werte bei Patienten mit metastasierten
Melanomen mit einer verminderten Überlebenszeit verbunden war (Deichmann et al.,
1999).
Mit der Aufnahme des LDH-Konzentration in das AJCC Staging-System werden
Patienten mit Fernmetastasen und erhöhtem LDH höher gestuft (Stadium IV) (Balch et
al., 2001).
- 57 -
HMB-45
Das immunhistochemische Färben von HMB-45 wird zum Nachweis von primären
sowie metastasierenden Melanomen eingesetzt (Baisden et al., 2000).
HMB-45 hat zwar eine relativ hohe Sensitivität (70- 90%), lässt aber keine genaue
Differenzierung zwischen melanozytären und anderen Tumoren zu (Ordóñez et al.,
1988). Trotz der hohen Spezifität weist HMB-45 aber nur eine relativ geringe
Sensitivität (70-90%) auf, liefert bei Metastasen oft falsch negative Ergebnisse
(Mahmood et al., 2002).
Um diese Defizite des Antikörpers zu umgehen, macht vor allem eine Kombination mit
anderen Markern seine Stärke in der Routinediagnostik aus (Colombari et al., 1988).
Die Bedeutung von HMB-45 in der Routinediagnostik wird daher von manchen
Autoren in Frage gestellt, da dieser monoklonale Antikörper zwar nützlich für die
Identifizierung von differenzierten melanozytären Tumoren ist, aber die
Aussagemöglichkeiten für weitere Fragestellungen begrenzt sind (Mahmood et al.,
2002).
Melan A/MART 1
Melan A/MART-1 ist ein Protein, das in verschiedenen Geweben exprimiert wird.
In zahlreichen Studien wurde Melan A auf seine Sensitivität untersucht. Hofbauer et. al
zeigten in ihrer Studie, dass die Sensitivität von Melan A bei 75-100% liegt (Hofbauer
et al., 1998). In einer vergleichenden Studie konnte gezeigt werden, dass A103 als First-
Line-Antikörper bei der Diagnose des metastasierenen Melanoms eingesetzt werden
kann. A103 zeigte eine homogene Färbung in einer signifikant höheren Anzahl (72%)
von Gewebsproben des Melanoms, als es bei HMB-45 (52%) der Fall war (Jungbluth et
al., 1998).
Palmieri et al. (2003) konnten einen signifikanten Zusammenhang zwischen
Tumorstadium und der Melan A Expression aufzeigen (28-33% Melan A positive
Patienten in Stadium I-III, 61% im Stadium IV). Ein Zusammenhang hinsichtlich der
Prognose konnte nachgewiesen werden.
Mahmood et al. (2002) hingegen konnten keine signifikante Reaktivität von A103 in
histologisch inapparenten Lymphknoten erkennen. Im Gegensatz dazu traten bei vielen
der untersuchten Lymphknoten einzelne isolierte HMB-45 positive Zellen.
Die Tatsache, dass Melan A in allen HMB-45-positiven-Melanophagen von
Lymphknoten- und Hautbiopsien negativ ist, macht ihn zu einem diagnostischen
- 58 -
Hilfsmittel, insbesondere in Fällen, in denen einzelne isolierte Melanophagen
Mikrometastasen nachahmen (Mahmood et al., 2002).
Kucher et al. (2006) untersuchten, ob der Marker Melan-A die Entdeckung von
metastasierten Melanomen in Sentinellymphknoten-Biopsien verbessert. Es wurden
Lymphknoten bei vorliegendem metastasierendesm Melanom für S-100, HMB-45 und
Melan A auf deren Immunreaktivität untersucht. Sie kamen zu dem Schluss, dass
Melan A trotz seiner relativ hohen Spezifität S100 und HMB-45 als Detektionsmarker
für befallenene Lymphknoten nicht ablösen kann, es aber gleich gute Ergebnisse wie
HMB-45 alleine liefert (Kucher et al., 2006).
Ki-67
Als Proliferationsmarker bietet Ki-67 hinsichtlich seiner Eigenschaften einige Vorteile.
So können Vergleiche der Proliferationsraten verschiedener Gewebe und Tumorarten
untereinander Rückschlüsse auf der deren Dignität zulassen (Chorny et al., 2003).
Bei Untersuchungen von Melanomen der Uvea (Netzhaut) konnte ein Zusammenhang
zwischen dem Anteil der sich teilenden Zellen in der S-Phase und der Proliferationsrate
von Ki-67 ermittelt werden (Karlsson et al., 1996).
In verschiedenen Arbeiten konnte ein Zusammenhang zwischen der Anzahl Ki-67-
positiver Zellen und der Tumordicke bzw.- zellproliferation festgestellt werden (Tran et
al., 1998; Straume et al., 2000).
In einer Studie von Ladstein et al. (2010) die an kutanen Melanomen durchgeführt
wurde, zeigte sich eine erhöhte Mitoserate und Ki-67-Expression mit dem zunehmenden
Tumorstadium. Eine hohe Mitoserate konnte als Prädiktor für eine schlechtere Prognose
in der univarianten Analyse bestätigt werden. Der größte Anteil an Ki-67 positiven
entarteten Zellen zeigte sich in der multivarianten Analyse der gewonnenen Daten
(Ladstein et al., 2010). Für den Therapieverlauf und die Nachsorge von
Melanompatienten muss dieser Marker aber noch weiterer Forschungen in diesem
Bereich unterzogen werden.
Ki67 bleibt eine sinnvolle Ergänzung bei der Unterscheidung zwischen gutartigen und
bösartigen melanozytären Hautläsionen (Ohsie et al., 2008).
Im klinischen Alltag ist es oft nicht einfach mit der Routinediagnostik die
verschiedenen Vorläuferläsionen und das maligne Melanom selbst sicher voneinander
zu unterscheiden. Es ist aber durchaus von prognostischer Bedeutung eine genaue
Diagnostik für den Patienten zu gewährleisten, um möglichst früh und angemessen auf
seine Erkrankung reagieren zu können. Ein Antikörper, der eine präzise Detektion der
- 59 -
malignen Zellen ermöglicht, wäre demzufolge wünschenswert um letztendlich eine
Hilfestellung bei der Differentialdiagnose von malignen zu benignen Hautläsionen zu
ermöglichen. Wir sind also auf der Suche nach einem Antikörper, der uns dabei hilft
durch eine Erweiterung des bisherigen Erfassungsspektrums der in der
Routinediagnostik gebräuchlichen Marker vorzunehmen, um möglichst frühzeitig
therapieren zu können.
5.2. Einordnung der eigenen Ergebnisse
Melanozyten entstammen der Neuralleiste, wo auch periphere Neurone, Gliazellen und
andere neuroendokrine Zelllinien entstehen (Riede et al., 2004).
Neoplastische Melanozyten sind dafür bekannt bestimmt Differenzierungsmerkmale
anderer Derivate aus der Neuralleiste aufzuweisen. So sehen einige benigne
Naevuszellen, die in die Dermis ausgewandert sind, den Schwann-Zellen des peripheren
Nervensystems morphologisch ähnlich. Aus diesen Beobachtungen liegt es nahe, dass
die Zellen der menschlichen Haut ihre Plastizität und Fähigkeit zur Differenzierung
beibehalten können. Durch neoplastische Transformation können sie vermutlich die
Merkmale und Ausprägungen anderer Neuralleistenderivate imitieren (Reed et al.,
1999).
In dieser Arbeit beschreiben wir die Expression eines solchen Neuron-selektiven
Markers in Melanomen, das Mikrotubuli-assoziierten Protein 2 (MAP-2).
MAP2 als potentieller Marker
Der Antikörper MAP2 schien uns auf der Suche nach einem geeigneten Marker, die
gewünschten Anforderungen erfüllen zu können.
In den letzten Jahren wurde in einigen Studien untersucht, inwieweit das Mikrotubuli-
assoziierte Protein 2 (MAP2) als potentieller Prädiktor für verschiedene Fragestellungen
genutzt werden kann.
Aus diesem Grund wurde MAP2 hinsichtlich seiner immunhistochemischen
Eigenschaften von uns näher untersucht. Zu diesem Zweck wurden verschiedene
Gewebetypen, darunter benigne Naevi, dysplastische Naevi, superfiziell spreitende
Melanome und deren Metastasen, mit dem Marker gefärbt und deren immunologische
Reaktion ausgewertet.
Bei der Gruppe der mikrotubuliassoziierten Proteine (MAPs) handelt es sich um eine
heterogene Gruppe von Proteinen, deren Aufgabe es ist die Stabilität der Mikrotubuli in
- 60 -
den Axonen und Dendriten der Nervenzellen zu gewährleisten (Bernhardt and Matus,
1984).
Mikrotubuli spielen eine zentrale Rolle bei der Koordinierung unterschiedlicher
Funktionen, wie der zellulären Motilität, der Signaltransduktion und dem Transport auf
intrazellulärer Ebene. Weiterhin sind sie für die Bildung von mitotischen Spindeln
während der Zellteilung zuständig. Als wesentlicher Bestandteil des Zytoskeletts
spielen Mikrotubuli eine entscheidene Rolle in vielen zellulären Prozessen. Mikrotubuli
bestehen aus αβ- Tubulin Heterodimeren und sind in ihrer Funktion als dynamische
Polymere entscheidend für die Zellteilung, den intrazellulären Transport und die
Bewahrung der Zellform. (Hayden et al., 1990; Zhai et al., 1996). Mikrotubuli bestehen
zum einen aus Tubulin, als Hauptbestandteil, und zum anderen aus verschiedenen
Typen von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen (MAPs) (Maccioni and Cambiazo,
1995). Ein Kennzeichen der Mikrotubuli ist ihre Dynamik, die in den verschiedenen
zellulären Prozessen zu tragen kommt. So bilden sie zu Beginn der Mitose/Zellteilung
die Mitosespindeln, die für die Trennung der Chromosomen benötigt werden (McNally,
1996; Gell et al., 2010). Die Stabilität der Mikrotubuli ist entscheidend für die
Ausbildung von mitotischen Spindeln und bei der Trennung von Chromosomen. Eine
ektopische Expression von MAP2 in nicht-neuronalen Zellen, insbesondere in sich
schnell teilenden Zellen, wie es bei Krebszellen oft der Fall ist, kann zu einer Instabilität
der Mikrotubuli führen und damit verbunden kann es zu Störungen in ihrer Funktion
kommen (Wittmann et al., 2001).
Daher ist eine Instabilität der Mikrotubuli kritisch für den Ablauf der Mitose, gerade in
sich rasch teilenden Zellen, wie es bei Tumorzellen der Fall ist. So ist es naheliegend,
dass die nähere Erforschung der Mikrotubuli zu neuen Ansätzen in der Tumorforschung
geführt hat (Desai and Mitchison, 1997).
MAP2 gehört zu diesen neuronenspezifischen MAPs und wirkt bei der Stabilisierung
von Mikrotubuli und bei verschiedenen zellulären Prozessen mit (Kosik and Caceres,
1991). MAP2 wird in Neuronen exprimiert und hat eine charakteristische dendritische
und somatische subzellulären Verteilung (Harada et al., 2002).
Insgesamt 9 Isoformen von MAP2 konnten bisher identifiziert werden. Darunter
hochmolekulare Formen (280 kDa), wie MAP2a und MAP2b, die während der
gesamten Lebenszeit eines Neurons persistieren und andere Isoformen, wie die juvenile
Form MAP2c (70kD) das während der Entwicklungsphase anzutreffen ist, später im
Verlauf aber verschwindet (Garner and Matus, 1988).
- 61 -
In vielen Studien konnte bereits gezeigt werden, dass die Expression von MAP2 sich
vor allem in den Neuronen selbst abspielt und es somit seine Verwendung bei Themen
der neuronalen Differenzierung findet (Kobayashi and Mundel, 1998; Tojima et al.,
2000).
Eine Immunreaktivität von MAP2 wurde in verschiedenen Tumorentitäten beobachtet.
So zeigte sich in vielen neuroendokrinen Karzinomen und in einigen nicht-kleinzelligen
Karzinomen der Lunge eine diffuse Expression für MAP2 (Liu et al., 2001). In einigen
Merkelzell-Karzinomen konnte eine fokale MAP2 Immunreaktivität ausgemacht
werden, sodass der Gedanke aufkam MAP2 als einen Marker für Hauttumoren mit
einem neuroendokrinen Ursprung zu verwenden (Liu et al., 2003). Auch für das orale
Plattenepithelkarzinom wurde MAP2 als diagnostischer Marker vorgeschlagen (Chen et
al., 2003).
Einige der Studien haben gezeigt, dass MAP2 in der Mehrheit von Naevuszellnaevi und
in primären malignen Melanomen zu finden waren, nicht jedoch in metastasierenden
Melanomen (Fang et al., 2001; Liu et al., 2003).
In der vorliegenden Studie wurde die MAP2-Expression in melanozytären
Hautveränderungen untersucht. Es konnte eine signifikant erhöhte Expression von
MAP2 in dysplatischen Naevi und superfiziell spreitenden Melanomen beobachtet
werden, im Vergleich zu benignen Naevi und subkutanen Metastasen.
In einer Studie von Fang et al. (2001) konnte gezeigt werden, dass die MAP2
Expression in melanozytären Hautveränderungen erhöht war, insbesondere in gutartigen
Naevi und primären Melanomen, nicht aber in metastasierten Melanomen (Fang et al.,
2001). Fang et al. (2001) untersuchten 10 angeborene und erworbene melanozytäre
Naevi, 9 primär maligne Melanome und 42 Metastasen. Allerdings haben sie keine
dysplastischen Naevi in ihre Studie eingeschlossen.
Die immunhistochemische Auswertung der benignen und malignen melanozytären
Hautläsionen zeigte eine erhöhte Expression von MAP2-Protein in melanozytären
Naevi und in den Frühformen des Melanoms, sowie den invasiven Formen des
Melanoms. Allerdings fand sich nur eine heterogene Verteilung in einzelnen Foci in
Melanomen, die bereits metastasiert waren. Während die Mehrzahl der Naevi (60%)
und viele primäre Melanome (44%) stark MAP-2-positiv waren, hatte nur ein kleiner
Prozentsatz der metastasierten Melanomen (24%) einen Fokus auf MAP-2-gefärbte
Zellen. Außerdem beobachteten sie ein reziprokes Anfärbeverhalten der untersuchten
Läsionen für MAP2 und TYRP-1. Die Daten zeigen, dass insbesondere die Frühstadien
- 62 -
von neoplastischen Läsionen die Fähigkeit bewahren, neuronenspezifische Marker, wie
das MAP2 zu exprimieren. Diese Beobachtungen stimmen mit der Annahme überein,
dass beide, benigne, wie auch maligne dermale Melanozyten Marker der neuronalen
Differenzierung exprimieren können (Fang et al., 2001).
Die Daten in der vorliegenden Arbeit unterscheiden sich von den Ergebnissen, über die
Fang et al. (2001) berichtet haben. Es konnte hier keine abnehmende MAP-2-
Expression von Naevi zu Melanom-Metastasen beobachten werden. Stattdessen zeigen
die vorliegenden Ergebnisse, dass die MAP-2-Expression offenbar mit der
Tumorprogression bis zu einem gewissen Grad in den Hautläsionen steigt und
schließlich in den Metastasen des malignen Melanoms wieder abnimmt,
möglicherweise durch Entdifferenzierung. Darüber hinaus zeigte sich eine moderate
Korrelation zwischen der MAP2-Expression von melanozytären Hautveränderungen
und der Breslow Tumordicke, dem Clark Level und dem Stadium der Erkrankung.
Hieraus wurde die Hypothese abgeleitet, dass die MAP2-Expression somit mit der
Differenzierung des Tumors korreliert.
Diese Fragestellung, ob die MAP2 Expression mit der Progression des Tumors
korreliere, ging die Arbeitsgruppe von Song et al. (2010) nach. Sie führten eine Studie
durch, um die Auswirkungen einer Hemmung von MAP2 auf das biologische Verhalten
von metastasierenden Melanomen in vitro und in vivo zu untersuchen. Sie kamen zu
dem Ergebnis, dass MAP2, vermittelt durch Adenoviren, den apoptotischen Zelltod und
eine Hemmung des Zellzyklus in humanen, sowie in Maus-Melanom-Zelllinien in vitro
induzieren kann. Auch im Tierversuch in vivo an Nacktmäusen zeigte sich eine
Hemmung auf das Wachstum von Melanomen.
Außerdem stellten sie fest, dass eine intrazelluläre MAP2 Expression verschiedene
morphologische Veränderungen in den betroffenen Zellen herbeiführte, unter anderem
wurde hemmende Effekte auf die Mikrotubuli in den Melanomzellen beobachtet (Song
et al., 2010).
In einer klinischen Follow-up Studie von Soltani et al. (2005) über 5 Jahre konnte
gezeigt werden, dass bei Patienten, deren Primärtumor eine hohe MAP2-Expression
zeigten, das krankheitsfreie Überleben höher war als bei der Gruppe deren Tumoren
schwach oder gar keine MAP2 Expression aufwiesen. Das ließ die Autoren zu dem
Schluss kommen, dass die MAP2 Expression ein postiver Prädiktor für die
Aggressivität des Melanoms sein kann (Soltani et al., 2005).
- 63 -
Sie konnten zeigen, dass MAP2 in primären kutanen Melanomen vorhanden ist, in
metastasierten Melanomen aber fehlt. Aus dieser Beobachtung heraus schlussfolgerten
sie, dass eine Induktion von einem Mikrotubuli-stabilisierendem Protein in primären
Melanomen eine dynamische Instabilität der Mikrotubuli zur Folge haben könnte,
verbunden mit einer Hemmung der Zellteilung und somit einer Verhinderung bzw.
Verzögerung der Tumorprogression. Sie konnten in ihrer Studie zeigen, dass Patienten
mit primären MAP2 positiven Melanomen ein signifikant besseres metastasenfreies
Überleben hatten, als solche, deren Melanome negativ für MAP2 waren. Nach Ansicht
der Autoren würden diese Daten nahelegen, dass eine ektope Aktivierung in
Melanomen eines für die neuronale Differenzierung zuständigen Gens, in den frühen
Stadien der Tumorentwicklung die Zellteilung hemmt, und somit mit der Hemmung
bzw. Verzögerung des Auftretens von Metastasen korreliere.
Folglich war in dieser Studie die beobachtete MAP-2-Expression in superfiziell
spreitenden Melanomen eher als ein negativer prognostischer Faktor eingestuft worden
(Soltani et al., 2005).
Die Arbeitsgruppe um Hendrix et al. (2003) hat sich mit der molekularen Analyse von
Tumoren, wie dem malignen Melanom, beschäftigt. Bei der Klassifikation und für das
Verständnis der Funktionsweise der verschiedenen Tumortentitäten verwendeten sie die
Microarray Technologie. Sie erstellten in ihrer Arbeit ein molekulares Profil unter
anderem auch das des kutanen malignen Melanoms. Ein bemerkenswertes Beispiel für
die Plastizität des Melanoms wird darin deutlich, dass Melanomzellen die Fähigkeit
besitzen sich entlang mehrerer, einschließlich Endothel-und Nervenzellen, zelluläre
Signalwege auszudifferenzieren (Hendrix et al., 2003).
Diese Wechselwirkung führt zu Differenzierung von Melanomzellen entlang
verschiedener Wege, einschließlich neuronaler Bahnen (Sangüeza et al., 1998; Fang et
al., 2001; Hendrix et al., 2003).
In der Tat zeigen die Daten von Soltani et al. (2005), dass es durch neuronale
Differenzierung von primären Melanomzellen in der Dermis, wie es die MAP-2-
Expression andeutet, zu tiefgreifenden Veränderungen im Zellzyklus kommen kann
(Soltani et al., 2005).
Es ist bekannt, dass neoplastische Melanozyten, insbesondere dermale Naevus-Zellen,
in der Lage sind, sich entlang der Wege anderer von der Neuralleiste abgeleiteten
Zelltypen zu differenzieren. Melanozyten, die Formen von Neoplasien tragen, sind
dafür bekannt, gewisse Differenzierungsmerkmale anderer Neuralleistederivate
- 64 -
aufzuweisen (Fang et al., 2001). Zum Beispiel teilen desmoplastische Melanome viele
Eigenschaften von Tumoren der peripheren Nervenscheiden, wie die Expression von
neuronalen Proteinmarkern (Sangüeza et al., 1998).
Das desmoplastische Melanom (DM) ist eine seltene Variante der Spindel
Zellmelanome, das sich in der Regel in der durch Sonne geschädigter Haut von älteren
Patienten entwickelt. Für diese Veränderungen ist charakteristisch, dass sie viel später
als herkömmliche Melanome zur Metastasierung neigen (de Almeida et al., 2008).
Maligne Melanozyten sind in der Lage dem Differenzierungsweg der Schwann-Zellen
zu folgen. Gerade die terminale Differenzierung von Typ C Naevuzellen, die tief in der
Dermis zu finden sind, erinnert an eine Schwannzell-ähnliche Morphologie verbunden
mit einer Aktivierung der für Schwannzellen zuständigen Zellmarkern.
Eine Auswertung von 12 erworbenen intradermalen Naevuszellnaevi in ihrer
Ultrastruktur ergab, dass gerade die Naevuszellen der tiefen Dermis eine perineurale
Differenzierung zeigten (Yang et al., 1996; Bröcker et al., 1991).
Die Tendenz zur Metastasierung des malignen Melanoms ist bekannt. Die
Mikroumgebung des Tumors spielt bei der Tumorentstehung und Progression eine
wichtige Rolle.
Tatsächlich ist die Progression des kutanen Melanoms aus einem lokal invasiven, aber
noch nicht zur Metastasierung fähigem zu einem schnell wuchernden Metastasen-
kompetenten vertikale Wachstum beeindruckend. In einer Studie (Ruiter et al., 2002)
wurden die strukturellen und funktionalen Aspekte der Wechselwirkungen zwischen
Melanomen und dem sie umgebenden Stroma untersucht. Hier konnte gezeigt werden,
dass das Eindringen von Tumorzellen in die Lederhaut und Unterhaut bedingt ist durch
eine dynamischen Interaktion zwischen Tumorzellen und Stroma (Ruiter et al., 2002).
Diese Wechselwirkungen zwischen zellulären Strukturen und dem Stroma der Dermis
sind dazu gedacht, die Signale für eine solche Transdifferenzierung von Melanozyten
bereitzustellen (Skelton et al., 1995).
Andere Studien haben gezeigt, dass eine Expression von Markern, die normalerweise
mit Neuronen assoziiert werden, wie das Peripherin, ein Intermediärfilament, das
Neuropeptid Substanz P oder die neuronenspezifische Enolase, in primären
metastasierten Melanomen anzutreffen sind (Prieto et al., 1997; Khare et al., 1998;
Dhillon et al., 1982).
- 65 -
Diese Beobachtungen haben zu der Hypothese geführt, dass während der Progression
des Tumors, kutane Melanozyten in der Lage sind unterschiedliche
Differenzierungswege zu verfolgen (Fang et al., 2001).
Die gewonnen Erkenntnisse aus dieser Studie über die Überexpression von MAP-2 in
dysplastsichen Naevi und in superfiziell spreitenden Melanomen scheinen diese
Vermutung zu unterstützen.
5.3. Die Rolle der Methodik
Obwohl es sich bei der Immunhistochemie um eine relative einfache Technik handelt,
bestehen doch einige Besonderheiten und die gewonnenen Ergebnisse hängen von
vielen Faktoren ab.
Der Nutzen der Immunhistochemie, in seinem Beitrag histologische Gegebenheiten
aufzuklären, ist stark abhängig von den Erfahrungen der einzelnen Untersucher und
deren Interpretationen. Aus diesem Grund müssen die gewonnen Ergebnisse in ihrem
gesamten Rahmen betrachtet werden (Matos et al., 2010).
Eine kürzlich durchgeführte Übersichtsarbeit hat die verschiedenen
Fehlermöglichkeiten bei der Auswertung von immunhistochemischen Reaktionen
analysiert. Diese Fehlerquellen können unterteilt werden in Fehler, die mit der Reaktion
an sich zu tun haben, wie die Probenfixierung, die Verarbeitung des Gewebes und die
Wahl der Detektionssysteme. Und in solche Fehler, die Auswirkungen auf die
Interpretation haben, wie die Auswahl des Antikörper-Panels, die Senitivität des
gewählten Panels, die Wahl der Antikörper und schließlich die Resultate und deren
Interpretation (Yaziji and Barry, 2006).
Sicherlich spielen der Zeitpunkt der Probenentnahme und die sich anschließende
Bearbeitungszeit auch eine Rolle bei der Bewertung. Durch längere Liegezeiten der
Präparate könnten Veränderungen in der Proteinstruktur des menschlichen Gewebes
stattgefunden haben. Diese Degeneration könnte sich negativ auf die Anfärbbarkeit der
Präparate ausgewirkt haben (Shi et al., 2006; Manne et al., 1997). Diese Annahmen
sollten aber nicht als gegeben akzeptiert werden, da sich in anderen Untersuchungen die
Stabilität des Epitops MAP2 als recht ausgeprägt erwies (Trojanowski et al., 1989).
Als ein weiterer Punkt der Kritik muss die Formalinfixierung an sich näher betrachtet
werden. Gerade wegen ihrer Fähigkeit Epitope zu maskieren und durch den
Fixierungsprozess auch teilweise zu zerstören, galt sie als eine Einschränkung bei der
Untersuchung der Immunreaktivität von Proteinen (Matos et al., 2010).
- 66 -
Durch die Formalinfixierung findet eine Quervernetzung der Proteine miteinander in
den entsprechenden Zellen der Gewebe statt. Manche der antigenen Determinanten, also
der Epitope, verlieren dadurch ihre Fähigkeit vom zugehörigen Antikörper erkannt zu
werden (Werner et al., 2000).
Die Einführung der „antigen retrieval“-Methode von Shi et al. (1991) brachte erste
Erfolge für die Identifzierung von therapeutischen und diagnostischen Markern (Shi et
al., 1991).
Die Antigen-retrieval-Methode ist als integraler Bestandteil in der routinemäßigen
Krebsdiagnose kaum noch wegzudenken. Durch eine Kombination aus enzymatischem
Verdau und eine Erhitzung in der Mikrowelle werden Quervernetzungen, die zwischen
den Proteinen bestehen aufgelöst, und es kommen die demaskierten Epitope zum
Vorschein. Diese können dann zu diagnostischen Zwecken weiter auf ihre
Immunreativität hin untersucht werden (Leong and Leong, 2007). Diese Methode macht
es möglich, die ursprüngliche Immunreaktivität von den in Paraffin eingebetteten
Geweben, unter Verwendung von Zitratpuffer oder Urealösung, wieder herzustellen
(Shi et al., 2011).
Auch in dervorliegenden Arbeit wurde diese Technik bei der Bearbeitung der
Paraffinschnitte verwendet. Durch die entsprechende Erhitzung mittels Mikrowelle und
der Verwendung von Citratpuffern spielt dieser Faktor eine eher untergeordnete Rolle
auf der Suche nach möglichen Fehlerquellen.
Zur Vereinfachung wurde in dieser Studie bei fehlendem Farbniederschlag von keiner
vorhandenen MAP2-Expression ausgegangen. Die genauen Ursachen der negativen
Anfärbbarkeit der Zellen können aber aus unterschiedlichen Gründen verursacht worden
sein. Man kann nicht unterscheiden, ob eine Zellschädigung im Einzelnen vorlag, der zu
einer negativen Reaktion im Färbeverhalten geführt hat, oder ob andere Veränderungen
in den Zellen stattgefunden haben, die eine Färbung mit dem Antigen unmöglich
gemacht haben.
Bei Veränderungen des pH-Werts in dem Gewebe könnte es vielleicht zu einer anderen
Reaktion im Färbeverhalten der Zellen für MAP2 gekommen sein, oder vielleicht hat
eine Phosphorylierung von MAP2 stattgefunden, der den Verlust der Antigenität
erklären könnte (Matos et al., 2010).
Von Bedeutung ist sicherlich auch die Tatsache, dass das Auszählen der MAP2-
positiven Zellen durch die subjektive Bewertung des Doktoranden zustande kam. Zwar
wurde zuvor die Systematik des Auszählens abgestimmt, trotzdem beruhen die
- 67 -
Auswertungen der Antigenexpression auf den subjektiven Entscheidungen des
jeweiligen Betrachters. Ein Auszählen der Zellen durch ein computergestütztes System
birgt gewisse Risiken in der Umsetzung, da viele Faktoren, wie beispielsweise die
verschiedenen Farbnuancen beim Farbverhalten nur unzureichend differenziert werden.
Eine Weiterentwicklung auf diesem Gebiet könnte in Zukunft die Objektivität des
Auszählens verbessern.
Da die Überlebensdaten der Patienten aus dieser Studie nicht bekannt sind, lässt sich
zum Zusammenhang zwischen der Expression des Antikörpers und der Überlebenszeit
der betroffenen Patienten keine Aussage machen.
Mögliche Einflussfaktoren, die zu einer veränderten MAP-2 Expression führen könnten,
aufgrund der oben genannten Faktoren, wurden bei der Auswertung weitestgehend
berücksichtigt. Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass weitere Faktoren bestehen, die
auf Antikörperexpression einwirken, deren Einfluss aber nach derzeitigen
wissenschaftlichen Erkenntnissen noch nicht bekannt ist, die aber möglicherweise zu
Verzerrungen bei den Ergebnissen führen. Gerade in Zeiten des rasanten medizinischen
Fortschritts, verbunden mit einem ständigen steigenden Zuwachs an neuem Wissen,
können bisher unbekannte Einflussfaktoren hinzukommen.
5.4. Schlussfolgerungen, Ausblick für die weitere Forschung
Mechanismen der neuronalen Stammzellen bzw. Vorläuferzellen bei der
Zelldifferenzierung wurden in der Vergangenheit mehrfach untersucht. Veränderungen
in der Epigenetik, einschließlich der DNA-Methylierung und Wege der intrazellulären
Signalwege haben gezeigt, dass sie bei der neuronalen Differenzierung von Bedeutung
sind (Kohyama et al., 2008; Juliandi et al., 2010).
Obwohl MAP2 als Marker bei der neuronalen Differenzierung oft verwendet wird, ist
der Mechanismus der MAP2-Regulierung noch nicht vollständig verstanden.
Um die Mechanismen, die an der Regulation der MAP2-Genexpression beteiligt sind zu
verstehen, untersuchten Maddodi et al. (2010) die Rolle der DNA-Methylierung und die
Rolle von BRAF in Melanomen mit MAP2 Aktivität.
BRAF (v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1)-MEK3-ERK ist dafür
bekannt eine Rolle bei der neuronalen Differenzierung zu spielen. In dieser Studie
konnte gezeigt werden, dass während der Tumorprogression des Melanoms, der MAP2
Promoter hypermethyliert ist und das die MAP2 Genexpression durch die DNA-
Demethylierung aktiviert werden kann und zwar durch 5-Aza-2-deoxycytidine (5-Aza).
- 68 -
Die Daten zeigen auch, dass eine Überexpression von BRAF zur Aktivierung von
MAP2 führt (Maddodi et al., 2010).
Es konnte gezeigt werden, dass die MAP2 Expression durch die Behandlung mit einem
pharmakologischen Wirkstoff induziert werden kann (Fang et al., 2001). MAP2 als
neuronaler Marker scheint also nicht nur mit der Tumorprogression assoziiert zu sein,
sondern bietet auch neue Möglichkeiten für therapeutische Ansätze, ähnlich der
Behandlungen mit Mikrotubuli-stabilisierenden Medikamenten. Taxol soll hier als
Beispiel genannt werden (Singh et al., 2008; Lopes et al., 1997).
Eine ektope Expression von MAP2, ausgelöst durch einen Adenovirus-vermittelten
Gentransfer, führt zum Zellzyklusarrest, Mängeln bei der Ausbildung von
Mitosespindeln, zu einer Wachstumshemmung der zellulären Strukturen und
letztendlich zur Apoptose (Soltani et al., 2005).
Da MAP2 in vivo in erster Linie auf primären Melanomzellen gerade während der
frühen Tumorprogression zu agieren scheint, ist es wichtig mit menschlichen Tumoren
zu arbeiten, auch für das Verständnis der Rolle von MAP2 in der Progression von
Melanomen und um die Beurteilung der Korrelation zwischen MAP2 Expression in
primären Melanomen und deren Metastasen erfassen zu können.
Die Expression von MAP2 und die daraus resultierenden Veränderungen in der
Mikrotubuli-Organisation haben Auswirkungen auf die neuronale Differenzierung und
die Progression von melanozytären Tumoren. Eine steigende Zahl an Untersuchungen
von Agenzen, die auf die Mikrotubuli-Organisation einwirken, wird auf ihre Aktivität
hinsichtlich ihrer Krebsbekämpfung getestet. Die Funktion der MAP2 Expression sowie
die Rolle anderer Mikrotubuli-stabilisierender Faktoren müssen in ihrer Funktionsweise
verstanden werden, um so gezielt an geeigneten therapeutischen Strategien arbeiten zu
können (Bhat and Setaluri, 2007).
Die Erforschung von MAP2 wird auch in Zukunft von Interesse sein. In letzter Zeit
wurde eine Reihe von Forschungen in diesem Bereich getätigt. Auch bei anderen
Erkrankungen scheint die Expression des Markers eine Rolle zu spielen. MAP2 wurde
in Merkelzellkarzinomen der Haut gefunden (Liu et al., 2003). Auch in
Oligodendrogliomen und anderen glialen Vorläuferzellen lässt es sich nachweisen, nicht
zuletzt auch beim kleinzelligen Lungenkrebs (Blümcke et al., 2001; Tanaka and
Terasaki, 2002).
Das lässt darauf Rückschlüsse zu, dass MAP2 an der Entwicklung und der Progression
von neuroendokrinen Neubildungen beteiligt ist, die aus der Neuralleiste stammen.
- 69 -
Daher sollte MAP2 hinsichtlich seiner Funktion bei neuroendokrinen Neubildungen
Gegenstand zukünftiger Forschung sein.
Allerdings werden langfristig angelegte Follow-up Studien benötigt, mit einer größeren
Population von Melanompatienten, um weiter den Nutzen von MAP2 als
Prognosefaktor zu etablieren. Darüber hinaus könnte es hilfreich sein, das Verständnis
über die Mechanismen der Genregulation von MAP2 zu vertiefen und dieses Wissen in
der Entwicklung von neuen Therapiestrategien einfließen zu lassen (Soltani et al.,
2005).
Zur Bestätigung der vorliegenden Ergebnisse sind weitere Studien in diesem Bereich
erstrebenswert, auch mit dem Ziel den geeigneten Marker für die Tumorforschung in
der Dermatologie ein Stück näher zu kommen.
- 70 -
6. Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von MAP2a in benignen und malignen
Hautveränderungen immunhistochemisch untersucht und auch nachgewiesen. Eine gute
Vergleichbarkeit der ausgezählten Ergebnisse ließ sich dadurch ermitteln, indem der
Anteil der positiven Zellen an der Gesamtzahl der Zellen einer Läsion als Index
angegeben wurde. Durch dieses Verfahren sollte bestimmt werden, ob ein
Zusammenhang zwischen dem immunhistochemischen Nachweis des Antikörpers mit
den klinischen und histologischen Veränderungen der Hautläsionen korreliert und somit
Aussagen hinsichtlich der Differenzierung verschiedener melanozytärer Läsionen und
des Verlaufs der Melanom-Erkrankung gemacht werden können.
Eine MAP2-Expression konnte in den Präparaten von den malignen Melanomen und
auch in den benignen Vorläuferläsionen beobachtet werden. Die Immunreaktivität von
MAP2 war aber in den verschiedenen Läsionen unterschiedlich ausgeprägt.
Die Daten der immunhistologischen Auswertung zeigten deutliche Tendenzen der
Immunreaktivität von MAP2 in den untersuchten Läsionen. Es zeigte sich, dass die
Immunreaktivität, gemessen an der MAP2-Expression, in den dysplastischen Naevi mit
26±8.5% und den superfiziell spreitenden Melanomen mit 26.9±10.1% signifikant
erhöht (p < 0.05) war, im Vergleich zu der MAP2-Expression bei den benignen Naevi,
die hier bei 18.6±10.5% lag. Dagegen war die Expression von MAP2 von den
subkutanen Metastasen mit 19.3±7.1% signifikant (p < 0.05) vermindert, im Vergleich
zur Immunaktivität von MAP2 der dysplastischen Naevi (26±8.5%) und des superfiziell
spreitenden Melanoms (26.9±10.1%). Beim direkten Vergleich der MAP2 Expression
zwischen den benignen Naevi (18.6±10.5%) und den subkutanen Melanommetastasen
(19.3±7.1%) konnte kein großer Unterschied ausgemacht werden (p > 0.05).
In den SSM korrelierte die MAP2-Expression signifikant mit der vertikalen Tumordicke
nach Breslow (r = 0,36, p = 0,016), dem Clark Level (r = 0,4, p = 0,0078) und dem
Stadium der Erkrankung (r = 0,31, p = 0,039).
Es gibt also Unterschiede in der Expression von MAP2 während der Entstehung und der
Entwicklung von benignen und malignen melanozytären Hautläsionen. Man kann die
melanozytären Hautveränderungen anhand ihres Anreicherungsmusters von MAP2 in
den entsprechenden Läsionen voneinander unterscheiden. Es konnte statistisch
signifikant eine Abhängigkeit der MAP2-Expression mit dem histologischen Typ
beobachtet werden.
- 71 -
Außerdem ergab die Auswertung der statistischen Daten, dass die MAP2-Expression in
der Gruppe der superfiziell spreitenden Melanome signifikant mit der vertikalen
Tumordicke nach Breslow (r = 0.36; p = 0.016) korrelierte. Zwischen der MAP2-
Expression und dem Invasionslevel nach Clark (r = 0.4; p = 0.0078) konnte ebenfalls
eine positive Korrelation nachgewiesen werden. Ein weiterer positiver Zusammenhang
scheint zwischen der Immunreaktivität von MAP2 und dem Stadium der Erkrankung (r
= 0.31; p = 0.039) zu bestehen
Die vorliegende Arbeit konnte die Ergebnisse früherer Berichte zum Teil bestätigen, es
fanden sich aber auch abweichende Aussagen.
Fang et al. (2001) beschrieben in ihrer Arbeit eine Induktion von MAP2 in
metastasierten Melanomzellen und eine vermehrte Expression in benignen Hautläsionen
und primär malignen Melanomen. Eine fokale Expression von MAP2 konnte nur in
einigen metastasierten Melanomen gefunden werden. In den Überlebenskurven zeigte
sich, dass Patienten, deren Melanome positiv für MAP2 waren, ein signifikant besseres
metastasenfreies Überleben zeigten, als solche, deren Melanome keine Reaktion auf
MAP2 gezeigt hatten (Fang et al., 2001).
Nähere Untersuchungen zur Wirkung der MAP2–Expression auf Melanomzellen
zeigten, dass MAP2 dazu führt, Mikrotubuli zu stabilisieren, es zu einem
Zellzyklusarrest in der G2-M Phase und zu einer Wachstumshemmung in vitro und in
vivo kommt. Aus diesen Daten schließt man, dass eine Aktivierung von Mikrotubuli-
stabilisierenden Proteinen in Krebszellen diese in ihrer Proliferation hemmen können
und so eine Verzögerung wenn, nicht sogar eine Hemmung der Metastasierung erreicht
werden kann (Soltani et al., 2005).
Auch hinsichtlich der Resultate und der damit verbundenen Schlussfolgerungen
bestehen starke Unterschiede zwischen den publizierten Studien und unseren Schlüssen.
Daher ist in Zusammenschau der genannten Studien davon auszugehen, dass die
immunhistochemische Expression des Markers MAP2a bis jetzt nur von
eingeschränktem Nutzen ist, um den klinischen Verlauf und die Prognose des malignen
Melanoms zu beurteilen. Bis dahin müssen wir auf bereits etablierte Verfahren in der
Behandlung des malignen Melanoms zurückgreifen. Für eine mögliche Weiterführung
dieser Studie kann es sinnvoll sein, wenn man auch weitere Gruppen in der
entsprechenden Anzahl mit einbezieht. Eine größere Fallzahl wäre dann sicherlich
wünschenswert und könnte die Aussagen bezüglich ihrer Validität optimieren.
- 72 -
Die neuen Erkenntnisse tragen dazu bei, die Wirkungsweise von MAP2 genauer
verstehen zu lernen und bieten die Möglichkeit das gewonnene Wissen in weiteren
Studien zu vertiefen.
Wir kommen also zu dem Schluss, dass die neuronale Differenzierung von Melanozyten
von der Art der melanozytären Neubildung abhängig ist. Darüber hinaus zeigen unsere
Daten, dass MAP-2 ein moderater positiver Prädiktor für die Progression des
superfiziell spreitenden Melanoms ist.
- 73 -
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Anhang
Danksagung
Mein Dank gilt folgenden Personen:
Zuallererst meinem Mann Robert ohne dessen Unterstützung ich diese Arbeit nie
angefangen, geschweige denn zu Ende geschrieben hätte.
Meinen Söhnen für ihre Geduld.
Meiner Familie für ihre Ausdauer, ihr Mitgefühl und ihren Glauben an das Projekt.
Allen, die sich um meine Kinder gekümmert haben und dafür, dass sie mir ihre kostbare
Zeit geschenkt haben.
Weiterhin möchte ich allen danken, die mir das Verfassen dieser Arbeit überhaupt
ermöglicht haben.
Meinem Doktorvater Herrn PD Dr. med. Thilo Gambichler für die zuverlässige
Betreuung.
Frau Sabine Richter für ihr Engagement, ihre Fürsorglichkeit und ihr Können.
Frau Elisabeth Panz für ihre Bemühungen in meiner Sache.
Maria Steilmann, die mir bei der Überarbeitung zur Seite stand.
Peter Boertz, der sich trotz eigenem Prüfungsstress die Zeit genommen hat, mir bei der
Formatierung zur Hand zu gehen.
Lebenslauf
Persönliche Daten
geboren am 28. April 1983 in Tübingen
Familienstand verheiratet
Nationalität deutsch
Studium
10/2002 – 03/2005 Ruhr-Universität Bochum, Studium der Humanmedizin
04/2005 – 01/2008 Universität Duisburg-Essen, Studium der Humanmedizin
02/2008 – 09/2009 Ruhr-Universität Bochum, Studium der Humanmedizin
07/2009 Approbation als Ärztin
seit 10/2010 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf,
Weiterbildender Masterstudiengang (M.Sc.)
in Public Health
Schulausbildung
09/1989 – 12/1989 Grundschule Gerbrunn, Würzburg
01/1990 – 08/1991 Davis Elementary School, Davis, Kalifornien, USA
09/1991 – 12/1991 Grundschule Gerbrunn, Würzburg
01/1992 – 07/1993 St. Martinusschule, Grundschule der Gemeinde Nottuln
08/1993 – 06/2002 Gymnasium Nottuln, Gymnasium der Gemeinde Nottuln
Abschluss: Abitur
Berufliche Tätigkeit
02/2006 – 01/2008 Studentische Hilfskraft
Organisation des Studentenpraktikums, Mitwirken an
ärztlichen Fortbildungsveranstaltungen, Literaturrecherche
für Studien
Universitätsklinikum Essen,
Klinik für Orthopädie, Prof. Dr. med. F. Löer
Publikation
Gambichler, T., Rotterdam, S., Radkowski, K., Altmeyer, P., Kreuter, A. (2009)
Differential expression of microtubule-associated protein 2 in melanocytic skin lesions.
Am J Clin Pathol. 131 (5), 710-714
