Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef ... · rakteristika der Pathophysiologie und vor allem der Immunologie können aber modelliert und diese Modelle zur Hypothesengenerierung

Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin

im St. Josef-Hospital Bochum

- Universitätsklinik -

der Ruhr-Universität Bochum

Direktor: Prof. Dr. med. E. Hamelmann

Entwicklung eines Mausmodells des Asthma bronchiale

durch verlängerte Allergen-Exposition

Inaugural-Dissertation

zur

Erlangung des Doktorgrades der Medizin

einer

Hohen Medizinischen Fakultät

der Ruhr-Universität Bochum

vorgelegt von

Anke Stroet

aus Neuenkirchen

2013

Dekan: Prof. Dr. med. K. Überla

Referent: Prof. Dr. med. E. Hamelmann

Korreferent: Prof. Dr. med. T. Bauer

Tag der mündlichen Prüfung: 21.01.2014

Test

Abstract Stroet, Anke ENTWICKLUNG EINES MAUSMODELLS DES ASTHMA BRONCHIALE DURCH VERLÄNGERTE ALLERGEN-EXPOSITION Problem:

Die zur Chronifizierung des menschlichen Asthma bronchiale beitragenden Mechanismen und das Zusam-

menspiel struktureller, funktioneller und immunologischer Veränderungen sind noch wenig verstanden. Tier-

modelle für das allergische Asthma bedienen sich verschiedener Schemata von Allergen-Expositionen, um die

wichtigsten Merkmale der Erkrankung nachzubilden. Prolongierte Antigen-Expositionen über die Atemwege

werden gewählt, um dem menschlichen Phänotyp möglichst nahe zu kommen. Im Rahmen dieser Arbeit wer-

den strukturelle und funktionelle Atemwegsveränderungen nach Beendigung einer solchen prolongierten

Exposition untersucht, um Faktoren zu beleuchten, die bei der Entwicklung dauerhafter Lungenfunkti-

onsveränderungen mitwirken.

Methode:

In einem Mausmodell wird durch systemische Sensibilisierung (intraperitoneal, i.p.) gefolgt von Atemwegsex-

position (intranasal, i.n.) eine allergische Atemwegsentzündung und Hyperreaktivität induziert. Hierzu werden

die Mäuse über einen Zeitraum von entweder zwei („kurzes Schema“) oder acht („langes Schema“) Wochen

mit dem Modellallergen Ovalbumin (OVA) über die Atemwege exponiert (OVA-OVA-Gruppen). Kontrollgrup-

pen werden mit Pufferlösung schein-sensibilisiert und intranasal mit OVA (PBS-OVA-Gruppen) oder Puffer-

lösung exponiert (PBS-PBS-Gruppe). Nach Expositionsende werden Lungenfunktion, Atemwegsentzündung,

Becherzellhyperplasie und subepitheliale Fibrose zu definierten Zeitpunkten untersucht.

Ergebnis:

Die lang exponierte OVA-OVA-Gruppe zeigt Atemwegshyperreagibilität nach Methacholin (MCh)-Provokation

für einen Zeitraum von zwei Wochen und eine veränderte Baseline-Lungenfunktion als Zeichen eines erhöh-

ten Atemwegswiderstands für einen Zeitraum von sechs Wochen nach Expositionsende. Die OVA-OVA-Grup-

pe nach kurzer Exposition weist diese Veränderungen nur 48 Stunden nach letzter Exposition auf. Die Induk-

tion einer peribronchialen Fibrose gelingt nur im langen Schema. Diese Fibrose findet sich nach Auftreten der

Lungenfunktionsänderungen und überdauert diese. Die lange Allergen-Exposition führt zu längerem Anhalten

und stärkerer Ausprägung der Atemwegsentzündung und Becherzellhyperplasie. Durch eine rein lokale Anti-

gen-Exposition lässt sich funktionell nur nach verlängerter Expositionsphase eine schwächere und bis zur

ersten Woche vorhaltende Atemwegshyperreagibilität induzieren, jedoch keine Veränderungen der basalen

Lungenfunktion. Bei PBS-OVA-Exposition gelingt es im kurzen Schema, gering ausgeprägte, bis zum 3. Tag

nach letzter Exposition andauernde entzündliche Veränderungen und Becherzellhyperplasie herbeizuführen,

während die verlängerte PBS-OVA-Exposition diese bis in die vierte Woche erzeugen kann. Bindegewebige

Umbauvorgänge hervorzurufen gelingt mit dem kurzen PBS-OVA-Schema nicht; nach langer, rein lokaler An-

tigen-Exposition tritt eine ähnliche fibrotische Veränderung wie mit systemischer Sensibilisierung auf.

Diskussion:

Die systemische Sensibilisierung hat großen Einfluss auf die Induzierbarkeit funktioneller Veränderungen.

Robuste asthma-typische morphologische Veränderungen sind stark abhängig von der Dauer der Exposition.

Anhaltende funktionelle und morphologische Veränderungen entwickeln sich nach kurzer Exposition nicht.

Nach verlängerter Allergen-Exposition zeigen sich dauerhafte Lungenfunktionsänderungen zeitlich unabhän-

gig vom Auftreten der peribronchialen Fibrose. Ein engerer zeitlicher Zusammenhang besteht zur andauern-

den und verstärkten Atemwegsentzündung und Becherzellhyperplasie. Die Veränderungen bei langer Aller-

gen-Exposition unterscheiden sich auch bezüglich immunologischer Mechanismen von denen bei kurzer

Exposition: nach gemeinsamer initialer IL-13-Antwort zeigt sich nur im langen Schema eine akzentuierte IL-5-

und TGF-ß-Reaktion. Für ein murines Modell des chronischen Asthma bronchiale ist die systemische Sensi-

bilisierung unabdingbar, durch verlängerte Exposition werden morphologische, funktionelle und immunolo-

gische Veränderungen ausgelöst, die Züge des menschlichen Remodelings abbilden.

Test

1

Inhaltsverzeichnis

Seite

1. Einleitung 7

1.1 Asthma bronchiale beim Menschen 8

1.1.1 Definition des Asthma bronchiale 8

1.1.2 Epidemiologie 8

1.1.3 Klinische Symptomatik 9

1.1.4 Formen des humanen Asthma bronchiale 10

1.1.5 Pathohistologie 11

1.1.6 Phänotypisierung des menschlichen Asthma bronchiale und

immunologische und entzündliche Antwortmuster 13

1.2 Tiermodelle des Asthma bronchiale 14

2. Zielsetzung der Arbeit 21

3. Material und Methoden 23

3.1 Versuchstiere 23

3.2 Versuchsprotokoll 23

3.3 Lungenfunktionsmessungen:

Nicht-invasive Bestimmung der basalen Lungenfunktion und

der Reagibilität der Atemwege auf Methacholin 26

3.4 Präparation der Lungen 27

3.5 Histologie der Lungen 28

3.5.1 Gewebsanfärbung 28

3.5.2 Morphometrische Analyse der Lungenhistologie 30

3.6 Statistische und analytische Auswertung 33

4. Ergebnisse 34

4.1 Ergebnisse der morphometrischen Analysen 34

4.1.1 Quantifizierung der Entzündungsreaktion 34

4.1.1.1 Schweregrad der Entzündung 34

4.1.1.2 Inzidenz der Entzündung 38

4.1.2 Untersuchung der Becherzellen 40

4.1.2.1 Quantifizierung der Becherzellhyperplasie 40

2

4.1.2.2 Inzidenz der Becherzellhyperplasie 43

4.1.2.3 Gesamtzahlen der Becherzellen 44

4.1.3 Quantifizierung der Bindegewebsreaktion 45

4.2 Ergebnisse der funktionellen Analysen 49

4.2.1 Unspezifische Atemwegshyperreaktivität, gemessen als

maximaler Penh in Ganzkörper-Bodyplethysmographie

unter Methacholin-Provokation 52

4.2.2 Basale Lungenfunktion ohne Provokation

(Baseline-Penh-Werte) 55

5. Diskussion 58

5.1 Gegenüberstellung der histologischen Befunde des kurzen

und verlängerten Allergen-Expositionsschemas der syste-

misch und bzw. ausschließlich lokal behandelten Gruppen 58

5.2 Gegenüberstellung der funktionellen Befunde des kurzen

und verlängerten Allergen-Expositionsschemas der sys-

temisch bzw. ausschließlich lokal behandelten Gruppen 62

5.3 Mögliche Zusammenhänge zwischen morphologischen und

funktionellen Veränderungen der systemisch und lokal

behandelten Gruppen 64

5.4 Effekt der systemischen Ovalbumin-Sensibilisierung 68

6. Zusammenfassung 70

7. Literaturverzeichnis 73

Danksagung

Curriculum vitae

3

Verzeichnis der Abkürzungen

ABPAS Alcian Blue periodic acid Schiff

BAL bronchoalveoläre Lavage

CD1, CD4 cluster of differentiation -1, -4 usw.

FACS Durchflusszytometrie (fluorescence activated cell sorting)

IL-5, -13 Interleukin 5, Interleukin 13 usw.

i.n. intranasal

iNK T invariant natural killer T cells

IFN-γ Interferon-Gamma

i.p. intraperitoneal

MCh Methacholin

mm Millimeter

OVA Ovalbumin

PBS phosphate-buffered saline; Pufferlösung

Penh enhanced pause; dimensionsloser Wert der Atemfunktion

s.o. siehe oben

TGF-ß transforming growth factor beta

Th1, Th2 T-Helfer-Zelle Typ 1, T-Helfer-Zelle Typ 2

vs. versus

µm Mikrometer

4

Verzeichnis der Tabellen

Seite

Tab. 1: Semiquantitative Beurteilung der Entzündungsreaktion

(Mittelwert ± Standardfehler) 34

Tab. 2: Inzidenz der Entzündung


Tab. 3: Anteil muzinhaltiger Zellen in Bezug auf die Gesamtzahl

der Epithelzellen


Tab. 4: Inzidenz der Becherzellhyperplasie


Tab. 5: Peribronchiale Kollagenablagerung


Tab. 6: Maximale Penh-Werte unter Methacholin-Provokation


Tab. 7: Penh-Werte der basalen Lungenfunktion


5

Verzeichnis der Abbildungen

Seite

Abb.1: Histologischer Vergleich des Bronchusquerschnitts

eines Gesunden mit dem eines von Asthma

betroffenen Menschen 12

Abb.2: Schematische Darstellung charakteristischer

Veränderungen im Sinne des Remodelings 13

Abb. 3: Ovalbumin (OVA) - Expositionsschema 16

Abb. 4: Verlängertes Ovalbumin (OVA) - Expositionsschema 18

Abb. 5: Versuchsprotokolle für das kurze (a) und lange (b)

Allergen-Expositionsschema 25

Abb. 6: Aufbau des Einzelkammer-Ganzkörperplethysmographen 26

Abb. 7: Ausprägung der Entzündung

anhand semiquantitativem System 35

Abb. 8: Ausprägung der Entzündung

anhand semiquantitativem System mit PBS-OVA 36

Abb. 9: Fotografien der Gruppen des kurzen Schemas,

HE-Färbung, 20fache Vergrößerung 37

Abb. 10: Fotografien der Gruppen des langen Schemas,

HE-Färbung, 20fache Vergrößerung 37

Abb. 11: Inzidenz der Entzündung 39

Abb. 12: Messung der Becherzellhyperplasie 41


Alzianblau-PAS-Färbung, 40fache Vergrößerung 42


Alzianblau-PAS-Färbung, 40fache Vergrößerung 42

Abb. 15: Inzidenz der Becherzellhyperplasie 44

Abb. 16: Becherzellzahl/mm Basalmembran 45

Abb. 17: Quantifizierung der Bindegewebsvermehrung 46

Abb. 18: Quantifizierung der Bindegewebsvermehrung

mit PBS-OVA 48

6

Seite


Masson-Goldner-Färbung, zehnfache Vergrößerung 48


Masson-Goldner-Färbung, zehnfache Vergrößerung 49

Abb. 21: Penh-Verlauf unter steigenden Methacholin-Dosen 50

Abb. 22: Penh-Verlauf unter steigenden Methacholin-Dosen

mit PBS-OVA 51

Abb. 23: Zeitlicher Verlauf des maximalen Penh unter Provokation 52

Abb. 24: Zeitlicher Verlauf des maximalen Penh unter Provokation

mit PBS-OVA 54

Abb. 25: Zeitlicher Verlauf des Baseline-Penh 55

Abb. 26: Zeitlicher Verlauf des Baseline-Penh mit PBS-OVA 57

7

1. Einleitung

Die zahlreichen Bemühungen in der Asthmaforschung haben in den letzten

Jahren das Wissen über die Pathogenese der Erkrankung vertieft. Neben

den Einsichten in die Rolle bestimmter Moleküle und Botenstoffe bei der

Krankheitsentwicklung auf Proteinebene wachsen zugleich die molekularge-

netischen Erkenntnisse über Genloci, die mit dem Auftreten von Asthma as-

soziiert sind und für bestimmte Kandidatenmoleküle der Immunregulation

kodieren (Agrawal and Shao 2010; Halwani, et al. 2011; Li, et al. 2010). Die

Komplexität dieser Erkenntnisse ist nahezu unüberschaubar.

Studien am Menschen sind aus ethischen Gründen weitgehend beschränkt

auf klinische Studien und in-vitro- oder ex-vivo-Experimente. Die Etablierung

von Tiermodellen für Untersuchungen zu pathophysiologischen Zusammen-

hängen in vivo und für Interventionsuntersuchungen ist somit unablässig.

Letztere erlauben eine Reihe weiterer Möglichkeiten funktioneller wie mor-

phologischer Untersuchungen und die Beobachtung der dynamischen Pro-

zesse der zellulären und humoralen Entzündungsreaktion, der Reaktion des

exokrinen Systems, der Atemwegsphysiologie und der Interaktionen dieser

Veränderungen untereinander.

Im Allgemeinen bleibt zu bedenken, dass Tiermodelle nicht das Vollbild des

menschlichen Asthma bronchiale in allen Aspekten wiedergeben können.

Dies gilt insbesondere für Mausmodelle, da die Maus natürlicherweise kein

allergisches Asthma entwickelt und sich die Physiologie der Atemwege zwi-

schen Menschen und Nagetieren deutlich unterscheidet. Bestimmte Cha-

rakteristika der Pathophysiologie und vor allem der Immunologie können

aber modelliert und diese Modelle zur Hypothesengenerierung auch in Inter-

ventionsstudien genutzt werden.

Die Maus ist in der Asthmaforschung als In-vivo-Modell etabliert (zum Bei-

spiel (Inman, et al. 1999; Kung, et al. 1994; Leigh, et al. 2002)) und besitzt

den Vorteil der Verfügbarkeit genetisch charakterisierter Inzuchtstämme und

der Anwendungsmöglichkeiten immunologischer Werkzeuge und der Gen-

deletionstechnologie (Montoliu and Whitelaw 2011).

Weiterer Vorzug der Maus sind die vergleichsweise geringen Kosten.

8

1.1 Asthma bronchiale beim Menschen

1.1.1 Definition des Asthma bronchiale

Eine allgemeingültige Definition ist noch immer umstritten, Einigkeit besteht

bei fehlender eindeutiger Ätiologie über die maßgeblichen Charakteristika der

Erkrankung. Das Asthma bronchiale ist eine Erkrankung der Atemwege, die

chronische Entzündungsvorgänge beinhaltet und durch eine bronchiale Hy-

perreagibilität und eine variable Atemwegsobstruktion charakterisiert ist

(Hargreave and Nair 2009).

1.1.2 Epidemiologie

Weltweit leiden über 300 Millionen Menschen unter Asthma (ISAAC-

Steering-Committee 1998; Masoli, et al. 2004; World-Health-Organization

2011), in Deutschland sind es derzeit ca. 5 % der Erwachsenen und bis zu

10 % der Kinder (Grüber, et al. 2002). Die Prävalenz des Asthma bronchiale

hat in den vergangenen Jahrzehnten in vielen Ländern zugenommen, wobei

dieser Anstieg bei Kindern und Jugendlichen ausgeprägter ist (ISAAC-

Steering-Committee 1998).

In industrialisierten Ländern sind zum Teil mehr als zehn Prozent der Kinder

betroffen (Grüber, et al. 2002; ISAAC-Steering-Committee 1998); das

Asthma bronchiale stellt so die häufigste chronische Erkrankung im Kindes-

alter dar, ist aber auch bei älteren Patienten eine häufige Ursache von Atem-

beschwerden (Bundesärztekammer (BÄK), et al. 2011). In Osteuropa und

den so genannten Schwellen- und Entwicklungsländern ist die Häufigkeit des

Asthmas deutlich geringer (Bousquet, et al. 2003).

Die Zahl der Todesfälle durch diese Erkrankung weltweit wird auf 250.000

pro Jahr geschätzt (Masoli, et al. 2004).

Mit einem Gesamtbetrag von 2,6 Milliarden Euro pro Jahr (Nowak, et al.

1996) kommt dem Asthma bronchiale eine enorme volkswirtschaftliche

Bedeutung zu. Die aktuellen Expositionsstrategien des Asthmas ermöglichen

eine weitgehende Beschwerdefreiheit unter Therapie in den meisten Fällen

(Bundesärztekammer (BÄK), et al. 2011), verhindern jedoch nicht dessen

Chronifizierung bzw. können keine Heilung der Erkrankung herbeiführen

(Bisgaard 2002; Martinez 2009; O'Byrne, et al. 2005; Sears, et al. 2003).

9

Um dieses Ziel zu erreichen, sind die pathogenetischen Mechanismen, die

zur Chronifizierung beitragen, noch immer nicht ausreichend verstanden, hier

ist insbesondere die Kenntnis über die Bedeutung chronischer Strukturver-

änderungen für die Lungenfunktion von Interesse (siehe Abschnitt 1.1.4).

1.1.3 Klinische Symptomatik

Die anfallsweise auftretende, spontan oder unter Therapie vollständig rever-

sible Atemnot mit exspiratorischem Stridor bzw. Giemen ist Leitsymptom des

Asthma bronchiale (Sitzmann 2002). Typisch für die Erkrankung sind

rezidivierende Episoden von Atemnot, Engegefühl der Brust und Husten mit

Auswurf bei limitiertem Atemfluss, ebenso aber die Phasen vollständiger

oder weitgehender Remission. Die bronchiale Hyperreagibilität ist bei Asth-

matikern regelmäßig vorhanden.

Diskreteres Zeichen des Asthmas kann ein quälender Hustenreiz als Dauer-

husten oder insbesondere nach Belastung oder Kontakt mit anderen Auslö-

sern sein; diese klinische Symptomatik weist auf die beim Asthma beste-

hende bronchiale Hyperreagibilität hin.

Unbehandelt ist bei zunehmender Krankheitsdauer mit einer Fixierung der

Atemwegsobstruktion bei anhaltenden, nicht mehr oder nur partiell reversib-

len Beschwerden zu rechnen. Je nach Schwere der Erkrankung können un-

behandelte Patienten zu Einschränkungen zahlreicher Aktivitäten gezwungen

sein, die besonders im Kindesalter die psychosoziale Entwicklung beein-

trächtigen können.

Jedoch ist der Effekt der antientzündlichen Dauertherapie auf den Langzeit-

verlauf und die Verhinderung chronischer Umbauvorgänge und eines schwe-

ren klinischen Verlaufes noch unklar; ein positiver Einfluss auf den Langzeit-

verlauf konnte bisher nicht belegt werden (Bisgaard 2002; Martinez 2009;

O'Byrne, et al. 2005; Sears, et al. 2003).

Die adäquate Therapie des Asthmas ermöglicht den Betroffenen jedoch ein

Leben mit meist guter Symptomkontrolle und vergleichbarer Lebenserwar-

tung zu der eines gesunden Menschen.

10

1.1.4 Formen des humanen Asthma bronchiale

Während im Erwachsenenalter und bei Kindern ab dem Schulalter das

Asthma bronchiale eine klinisch klar definierte und durch Lungenfunktions-

messungen gut charakterisierbare Erkrankung darstellt, ist dieses im Säug-

lings- und Kleinkindalter nicht so eindeutig. Hier wird die Diagnose wegen

des Mangels an Untersuchungsmöglichkeiten mittels Lungenfunktion (bei

fehlender Kooperationsfähigkeit) überwiegend mit Hilfe der Anamnese und

der klinischen Symptomatik gestellt (Sitzmann 2002).

Es muss das frühkindliche Asthma von anderen Entitäten wie nicht-allergi-

schen, infektgetriggerten rezidivierenden obstruktiven Bronchitiden des

Kleinkindalters und anderen Grunderkrankungen (gastroösophagealer

Reflux, Atemwegsstenosen, bronchopulmonale Dysplasie etc.) (Buhl, et al.

2006; Masoli, et al. 2004) abgegrenzt werden.

Häufig besteht beim Asthma bronchiale eine allergische Diathese.

Man unterscheidet daher nach dem Vorliegen einer allergischen Diathese ein

allergisches Asthma vom nicht-allergischen oder intrinsischen Asthma.

Im Kindesalter überwiegt die allergische Form (90% der Fälle), während im

Erwachsenenalter Mischformen vorherrschen (Bundesärztekammer (BÄK),

et al. 2011; Matricardi, et al. 2008).

Beim allergischen Asthma bronchiale finden sich verschiedenste Umweltal-

lergene als Trigger eines Anfalls; diese können zum Beispiel Pollen, Haus-

staubmilben, Pilze oder Tierproteine sein und bei Personen mit atopischer

Diathese eine Rolle spielen. Allergisierende Stoffe in der Arbeitswelt sind bei

der Beurteilung des Asthma bronchiale als Berufskrankheit zu berücksichti-

gen. Aber auch unspezifische Triggerfaktoren wie Tabakrauch, Ozon, Stress,

körperliche Anstrengung, lösen häufig Asthmabeschwerden aus.

Der rein intrinsischen Form dienen oft Infektionen der oberen Atemwege als

Auslöser; das Mitauftreten von Sinusitiden oder nasaler Polyposis kann hin-

weisend sein. Triggernd für diese Form können weiterhin Acetylsalicylsäure

oder andere nicht-steroidale Antirheumatika/ Antiphlogistika sein.

Termini wie saisonales vs. perenniales, Anstrengungs- („exercise”), Analge-

tika-assoziiertes, nokturnales oder Husten- („Cough variant“) Asthma be-

zeichnen keine eigenständigen Formen, sondern dienen der besonderen

11

Hervorhebung bestimmter Aspekte (Brannan and Turton 2010; Pender and

Pollack 1990).

1.1.5 Pathohistologie

Der regelrechte Aufbau eines Bronchus (Abb.1 oben, nach (Riede and

Costabel 2004)) zeigt von innen nach außen folgende Bestandteile:

Das Lumen wird begrenzt vom einschichtigen Bronchialepithel, das Schleim

produzierende Becherzellen enthalten kann. Das Epithel wird durch die

Basalmembran von den subepithelialen bronchialen Schleimhautstrukturen

abgegrenzt. Es findet sich eine bindegewebige Matrix, in die eine Schicht aus

glatter Muskulatur sowie die ebenfalls Mukus produzierenden peribronchialen

Drüsen eingebettet sind.

Histologisch zeigt der Querschnitt eines Bronchus beim Asthmapatienten

(Abb.1 unten) zahlreiche Veränderungen:

Die Lichtung wird von hyperviskösem Schleim verengt. Im Bronchialepithel

fällt eine Hyperplasie der Becherzellen auf; diese produzieren ein veränder-

tes, verstärkt Glykoproteine enthaltendes, daher verdicktes Sekret, das in die

Bronchuslichtung abgegeben wird. Intraepithelial finden sich häufig eosino-

phile Infiltrationen. Die Schleimhaut wirkt insgesamt ödematös verquollen

(Riede and Costabel 2004).

Die Basalmembran erscheint verdickt (Tagaya and Tamaoki 2007).

Im peribronchialen Gewebe findet sich eine deutliche Infiltration durch

Entzündungszellen, insbesondere eosinophile Granulozyten und Lymphozy-

ten. Die peribronchiale Entzündungsreaktion wird durch die Ausschüttung

zahlreicher Mediatoren und Zytokine weiter unterhalten.

Die glatte Muskulatur ist hypertrophiert (Munakata 2006).

Zu dem im Lumen vorhandenen Sekret tragen die hyperplastischen peri-

bronchialen Drüsen einen großen Teil bei, auch ihr Syntheseprodukt ist hy-

perviskös. Die Hyper- und Dyskrinie ist daher wichtiges Merkmal der Erkran-

kung (Riede and Costabel 2004).

12

Abb.1: Histologischer Vergleich des Bronchusquerschnitts eines Gesunden mit dem eines von Asthma betroffenen Menschen (nach (Riede and Costabel 2004))

Die peribronchiale Matrix selbst zeigt Umbauvorgänge im Sinne einer Ver-

mehrung der bindegewebigen Anteile, einer Fibrosierung (Roche, et al.

1989), die gemeinsam mit oben genannten Veränderungen

(Becherzellhyperplasie, Drüsenhyperplasie, Verdickung der Basalmembran,

Muskelhypertrophie) sowie der Akkumulation verschiedener Immunzellen

und Hypervaskularisation mit dem Begriff „Remodeling“ (Abb.2) belegt wer-

den (Bento and Hershenson 1998).

13

Abb.2: Schematische Darstellung charakteristischer Veränderungen im Sinne des Remodelings (aus (Kumar and Foster 2002))

Die Veränderungen im Sinne des Remodelings beim Menschen scheinen

schon früh im Erkrankungsverlauf aufzutreten: Untersuchungen an Kindern

verschiedenen Alters konnten zeigen, dass diese Vorgänge noch nicht bei

asthmatischen Kleinkindern, wohl aber bei Schulkindern und Erwachsenen

vorhanden sind und eine eosinophile Entzündung und die Verdickung der

Basalmembran wahrscheinlich in der Vorschulphase eintreten, so dass die

präventive medikamentöse Intervention in diesem Lebensalter als sinnvoll

erachtet wurde (Saglani, et al. 2007). Diese Schlussfolgerungen bedürfen

jedoch weiterer Untermauerung, da ein Zusammenhang mit funktionellen

Veränderungen hierdurch bisher nicht beantwortet ist.

1.1.6 Phänotypisierung des menschlichen Asthma bronchiale und

immunologische und entzündliche Antwortmuster

Die Einteilung des Asthma bronchiale in verschiedene Phänotypen wird an-

hand unterschiedlicher Entzündungsmuster durchgeführt. Beim Erwachse-

nen unterscheidet man daher einen eosinophilen, einen neutrophilen, einen

gemischt-granulozytären und einen paucigranulozytären Entzündungstyp je

nach vorherrschendem Zelltyp. Diese Differenzierung erhält klinische Rele-

vanz, weil unterschiedliches Ansprechen auf therapeutische Maßnahmen

damit vergesellschaftet zu sein scheint (Gibson 2009).

14

Insgesamt herrscht Konsens darüber, dass auf immunologischer Ebene eine

Th2-Zytokin-dominierte T-Zellantwort beim Asthma bronchiale prädominiert.

Hierzu zählen IL-4, IL-5 und IL-13, wobei die genaue Rolle und Verbindun-

gen der Moleküle zum Teil umstritten sind (Finkelman, et al. 2010; Koyasu

and Moro 2011; Lloyd and Hessel 2010; McGuirk, et al. 2010).

Ebenso gehört TGF-ß zu den vermehrt im Rahmen der entzündlichen Reak-

tion freigesetzen Zytokinen (Halwani, et al. 2011; Venge 2010); gerade die-

sem Zytokin wird eine zentrale Rolle für das Remodeling beim Asthma bron-

chiale zugeschrieben (Halwani, et al. 2011; Makinde, et al. 2007; Venge

2010).

Diese prolongierte und deviierte Zytokin-Antwort birgt eine mögliche Verbin-

dung zu Prozessen des Remodelings, da über eine Kaskade von Entzün-

dungsmediatoren und Proteasen eine vermehrte Fibroblastenaktivierung

bewirkt werden kann, die die Entwicklung fibrotischer Veränderungen anstößt

(Halwani, et al. 2011; Venge 2010; Westergren-Thorsson, et al. 2010).

Eine weitere Zellart rückt in der letzten Zeit in den Mittelpunkt des Interesses:

die invarianten natürlichen Killer-T-Zellen (invariant natural killer T cells (iNK

T cells)), die für das Aufrechterhalten der Atemwegshyperreagibilität mit ver-

antwortlich gemacht werden (Pichavant, et al. 2009).

Des Weiteren werden weitere Zellarten und Zytokine außerhalb der TH2 /

TH1-Dichotomie zunehmend als relevant für die Regulation von Entzün-

dungsvorgängen beim Asthma bronchiale entdeckt wie TH17-Zellen oder IL-

25 (Kaiko and Foster 2011; Koyasu and Moro 2011; Souwer, et al. 2010).

1.2 Tiermodelle des Asthma bronchiale

Zu den Tierspezies, die natürlicherweise ein Asthma bronchiale ausbilden,

gehören zum Beispiel Katzen und Pferde (Corcoran, et al. 1995; Jost, et al.

2007; Neuhaus, et al. 2010).

Aus mehreren Gründen haben sich in verschiedensten medizinischen For-

schungsbereichen jedoch Nager wie Mäuse, Meerschweinchen oder Ratten

als günstigere Versuchstiere erwiesen, dies gilt insbesondere für die Unter-

suchung immunologisch vermittelter Erkrankungen:

Diese Kleintiere verursachen vergleichsweise geringe Haltungskosten, auch

bei einer größeren Anzahl von Versuchstieren. Insbesondere die Maus be-

15

sitzt darüber hinaus den Vorteil der Verfügbarkeit genetisch charakterisierter

Inzuchtstämme und der Anwendungsmöglichkeiten immunologischer Werk-

zeuge und der Gendeletionstechnologie (Montoliu and Whitelaw 2011).

Daher erscheint es sinnvoll, für bestimmte Fragestellungen der Grundlagen-

forschung, insbesondere immunologischer Art, sich eines Mausmodells zu

bedienen.

Die Anwendung eines Mausmodells ist eben aufgrund dieser Bedingungen

auch für das Asthma bronchiale eine praktikable Möglichkeit, da immunologi-

sche Werkzeuge wie Antikörper vorhanden sind.

Zu bedenken bleiben die Grenzen von Tiermodellen: schon aufgrund der

Spezies-Unterschiede muss eine Übertragbarkeit von tierexperimentellen

Ergebnissen auf die menschliche Erkrankung stets genau geprüft werden, es

wird kaum gelingen, in einem Tiermodell eine menschliche Erkrankung in

toto abzubilden, sondern eher, bestimmte Züge der Erkrankung nachzuah-

men.

Selbst innerhalb einer Spezies wie der Maus bestehen Rassenunterschiede

(Shinagawa and Kojima 2003), wie in vergleichenden Untersuchungen von

Asthma-Modellen zwischen C57/BL6- und BALB/c-Mausstämmen mit diffe-

rierenden zellulären und Zytokin-Entzündungsphänomenen gezeigt werden

konnte (Gueders, et al. 2009; Zhang, et al. 1997).

Hier wird auch dargestellt, dass sich die BALB/c-Mäuse für ein Asthma-Mo-

dell besonders eignen, da die Asthma-Antwort in diesem Stamm mit stärker

ausgeprägter Atemwegshyperreagibilität, größerer Mastzellaktivität und hö-

heren Zytokinspiegeln für IL-4, IL-5 und IL-13 einhergeht, so dass aus immu-

nologischer Betrachtung mehr Parallelen zum allergischen Asthma des Men-

schen bestehen.

Da die Maus jedoch nicht zu den Spezies gehört, die ein natürliches Asthma

bronchiale entwickeln, hat sich in der Entwicklung von Mausmodellen eine

systemische Sensibilisierung etabliert, um eine asthmatische Atemwegs-

reaktion mit nachweisbarer Atemwegshyperreagibilität zu erzielen. Man be-

dient sich dieser mit einem gewählten Antigen (Allergen), in den meisten Mo-

dellen ist dies Ovalbumin (OVA). Die systemische Sensibilisierung erfolgt

intraperitoneal unter Zuhilfenahme eines Adjuvanz (in der Regel Aluminium-

Hydroxid), welches die Immunantwort auf das Allergen potenziert. Auf die

16

erste kurze Phase der systemischen Sensibilisierung folgen (zumeist meh-

rere) konsekutive lokale Expositionen über die Atemwege (meist in Form ei-

ner nasalen Exposition).

Als Read-Out-Parameter der Atemwegshyperreagibilität dienen nicht-inva-

sive oder invasive Methoden der Lungenfunktionsmessung an den Mäusen;

zur Erfassung der bronchialen Entzündungs- und immunologischen Reaktion

können bronchioalveoläre Lavage und / oder Histologie an getöteten Tieren

durchgeführt werden.

Mausmodelle der allergischen Sensibilisierung mit kurzen Allergen-Expositi-

onsprotokollen beleuchteten so in der Vergangenheit bereits verschiedene

Mechanismen der akuten Entzündungsantwort, beispielsweise der Eosino-

philie, und funktioneller Veränderungen wie der vorübergehenden Atem-

wegshyperreagibilität (AHR) (Kumar and Foster 2002).

Beispielhaft für die frühen Modelle allergischer Atemwegsexposition zeigt

Abb. 3 das Expositionsschema, das in mehreren Arbeitsgruppen Verwen-

dung fand (u.a. (Inman, et al. 1999; Zhang, et al. 1997)).

Abb. 3 Ovalbumin (OVA) - Expositionsschema (systemisch = intraperitoneal, IP und lokal = intranasal, IN) (aus (Inman, et al. 1999))

BALB/c-Mäusen wird an zwei Zeitpunkten (Tag 1 und 11) intraperitoneal

Ovalbumin verabreicht, zudem erfolgt dreimalig die intranasale Exposition

von Ovalbumin, so dass die Expositionsphase nach 20 Tagen abgeschlos-

sen ist.

Es wurde gezeigt, dass für die erwünschte systemische und lokale Immun-

antwort die Kombination aus intraperitonealer Sensibilisierung und intrana-

saler Exposition in diesem Schema von 20 Tagen Dauer erforderlich ist

(Zhang, et al. 1997).

Mithilfe eines solchen Modells mit einer Expositionssphase von 20 Tagen

konnte belegt werden, dass eine relevante Vermehrung der eosinophilen

Colony-forming-units (CFUs) im Knochenmark und somit eine Verschiebung

17

des Musters der Immunreaktion erzeugt wird (Inman, et al. 1999), parallel zu

Veränderungen bei Asthma-Patienten (Wood, et al. 1998).

In den Untersuchungen der BAL-Flüssigkeit zeigte sich passend dazu auch

lokal eine Vermehrung der zellulären Entzündungsantwort mit insbesondere

Vermehrung des Anteils eosinophiler Zellen. Diese Veränderungen waren

jedoch letztmalig bei den Messungen 48 Stunden nach letzter Exposition

nachweisbar.

Die funktionelle Veränderung im Sinne einer Erzeugung von Atemwegshy-

perreagibilität in diesem Modell konnte ebenfalls ausschließlich an den Zeit-

punkten 24 und 48 Stunden in den behandelten Gruppen dargestellt werden,

jedoch nicht darüber hinaus anhaltend, so dass die letzten Messungen je-

weils an Tag 7 nach letzter Exposition erfolgten.

Im Gegensatz zur vorliegenden Arbeit (Koerner-Rettberg, et al. 2008) wurde

eine invasive Messung des Atemwegswiderstands unter Narkotisierung der

Versuchstiere durchgeführt, „Follow-up-Untersuchungen“ fanden daher je-

weils mit anderen Tieren statt.

Weitere Charakteristika, insbesondere histologischer Art, die mögliche Re-

modeling-Vorgänge untersuchen, wurden hier nicht dargestellt.

Eine Untersuchung, die dieses Modell 20-tägiger Expositionsdauer nutzte,

belegt, dass eine Vermehrung der peribronchialen glatten Muskulatur gelingt,

jedoch, dass keine Vermehrung der extrazellulären Matrix stattfindet und

eine Becherzellhyperplasie nur bis 2 Wochen nach letzter Exposition anhal-

tend ist (Leigh, et al. 2002).

Diese kurzfristigen Modelle induzieren also nicht die charakteristischen Ver-

änderungen des chronischen Asthmas wie das Remodeling der Wandstruk-

tur der Atemwege mit subepithelialer Fibrose oder persistierende Lungen-

funktionsveränderungen über die Phase der Allergen-Exposition hinaus, und

erlauben daher keine Aussagen zu den Aspekten der Chronifizierung des

Asthmas, was ein gewichtiger Nachteil dieser Modelle ist.

Diese zuletzt beschriebenen Charakteristika konnten in Tiermodellen mit

verlängerter Expositionsphase abgebildet werden (Cho, et al. 2004; Corbel,

et al. 2003; Henderson, et al. 2002; Jain, et al. 2002; Leigh, et al. 2002;

Locke, et al. 2007; McMillan and Lloyd 2004; Shinagawa and Kojima 2003;

18

Temelkovski, et al. 1998; Wegmann, et al. 2005). Die verwendeten Protokolle

sind dennoch sehr unterschiedlich, und die Untersuchungen kamen zu unter-

schiedlichen Ergebnissen.

Abb. 4 zeigt eines der verwendeten Schemata verlängerter Allergen-Exposi-

tion mit einer Elongation des in Abb. 3 gezeigten kurzen Schemas um wei-

tere 5 Zyklen intranasaler Ovalbumin-Exposition (Leigh, et al. 2002).

Abb. 4 Verlängertes Ovalbumin (OVA) - Expositionsschema (systemisch = intraperitoneal, IP und lokal = intranasal, IN) (aus (Leigh, et al. 2002))

Eine andere Gruppe (McMillan and Lloyd 2004) nutzte schon in der kurzen

Phase ein leicht modifiziertes Schema, insbesondere jedoch wurde die chro-

nische Exposition deutlich kürzer definiert (je nach Gruppenzuordnung bis

Tag 35 oder 55 mit 3 Mal pro Woche erfolgender Aerosolexposition).

Nur wenige dieser Studien mit einem verlängerten Expositionsschema unter-

suchten die Persistenz der hervorgerufenen Veränderungen über den letzten

Allergenkontakt hinaus.

So entstanden zum Teil widersprüchliche Ergebnisse, insbesondere bezüg-

lich der Dauerhaftigkeit der reduzierten Lungenfunktion (Leigh, et al. 2002;

McMillan and Lloyd 2004; Wegmann, et al. 2005):

Eine anhaltende Atemwegshyperreaktivität unter Methacholin-Provokation

nach Beendigung der Exposition bis zu acht Wochen konnte von einer

Gruppe dargestellt werden, hier wurde eine invasive Messmethode ange-

wendet, die verlängerte Exposition wurde – wie oben dargestellt – bis Tag 90

fortgeführt (Leigh, et al. 2002).

Eine andere Arbeit zeigte, dass die Atemwegshyperreaktivität nach Expositi-

onsende nur kurzlebig ist (McMillan and Lloyd 2004), hier war jedoch im Ver-

gleich die Atemwegsexposition deutlich kürzer, während sie sich unter fort-

geführter intranasaler Antigen-Exposition als anhaltend, ja sogar progredient

auswies (Corbel, et al. 2003; Wegmann, et al. 2005).

Wie geschildert finden jedoch unterschiedliche Messarten der Lungenfunk-

tion Anwendung (invasive Messung an narkotisierten Tieren (Leigh, et al.

19

2002; Temelkovski, et al. 1998) versus nicht-invasive Bodyplethysmographie

an spontan atmenden Tieren (Jain, et al. 2002; McMillan and Lloyd 2004), so

dass ein Vergleich der Ergebnisse vorsichtig unternommen werden sollte.

Hinsichtlich der basalen Lungenfunktion vor Methacholin-Provokation (bei

nicht-invasiver Messung durch den baseline-Penh-Wert repräsentiert, s. Teil

2 Methoden) bestehen bisher wenige Daten, vorliegende Arbeiten zeigen

eine Erhöhung dieses baseline-Penh-Wertes im Sinne einer vermehrten

Atemarbeit als kurzlebige Spätantwort (innerhalb von Stunden) nach Aller-

gen-Exposition (Cieslewicz, et al. 1999).

Auch bei Betrachtung der basalen Lungenfunktion unter fortgeführter intra-

nasaler Antigen-Exposition konnte eine Veränderung festgestellt werden, die

jedoch nach Ende der Exposition nicht weiter besteht (Wegmann, et al.

2005).

Für die morphologischen Analysen nutzen die dargestellten Arbeiten (Leigh,

et al. 2002; Leigh, et al. 2004bb; McMillan and Lloyd 2004) gemeinsam eine

Hämatoxylin-Eosin-Färbung zur Darstellung der zellulären Entzündungsreak-

tion, eine PAS (periodic acid Schiff’s-Reaktion) - Färbung für die Quantifizie-

rung Muzin-produzierender Zellen und einen antikörper-vermittelten immun-

histochemischen Ansatz zur Darstellung glattmuskulärer Strukturen.

Auf verschiedene Weisen fand die Anfärbung der extrazellulären bindegewe-

bigen Matrix statt (Masson’s trichrome, Martius scarlet blue, picrosirius red).

Dies belegt die weniger etablierte Untersuchung dieser Remodeling-Eigen-

schaft.

In allen Bereichen (Entzündung, Becherzellhyperplasie, Hypertrophie der

glatten Muskulatur, peribronchiale Fibrose) zeigten sich differierende Ergeb-

nisse:

Während die Entzündung im chronischen Modell bei (Leigh, et al. 2002) nur

sehr kurzlebig und schwach ausgeprägt war, zeigte die Arbeitsgruppe von

(McMillan and Lloyd 2004) eine anhaltende, sehr ausgeprägte Entzündung

mit einer Verschiebung des Zellbildes hin zu einem Mischbild aus Eosino-

philen und mononukleärer Zellen.

In der Fortführung der Experimente (Leigh, et al. 2004bb) wurden anti-CD4-

und anti-CD8-Antikörper eingesetzt, worunter sich die Entzündungsreaktion

20

weitgehend unterdrücken ließ und keine nennenswerte Atemwegshyperrea-

gibilität entstand.

Das bei (Leigh, et al. 2002) verwendete Modell ließ hinsichtlich der

Becherzellhyperplasie und der Hypertrophie der glatten Muskulatur keine

Unterschiede zwischen langer und kurzer Allergen-Exposition erkennen,

beide Merkmale traten früh auf und hielten lange ohne signifikante Abnahme

an.

In der chronischen Phase bei (McMillan and Lloyd 2004) hingegen zeigte

sich eine signifikante Wiederabnahme der zunächst deutlich vorhandenen

Becherzellhyperplasie, hinsichtlich der Muskelhypertrophie sogar ein weiterer

Anstieg.

Das Auftreten peribronchialer Fibrose gelang in beiden Gruppen nur nach

langfristiger Exposition (cave: unterschiedliche Definition von langfristig, s.

o.), jedoch bei (Leigh, et al. 2002) ca. vier Wochen nach Beendigung der

Exposition auf gleich bleibendem Niveau bis Woche 8, bei (McMillan and

Lloyd 2004) mit einem deutlich früheren Auftreten der peribronchialen Fib-

rose im Vergleich zur anderen Arbeit mit einem weiteren Anstieg nach Been-

digung der Sensibilisierung.

All diese Unterschiede zeigen die Schwierigkeit, in bisherigen Asthma-

Mausmodellen belastbare reproduzierbare chronische Asthma-Phänotypen

zu erzielen, und belegen die Notwendigkeit der sehr differenzierten Wahl des

Allergen-Expositionsschemas für die Untersuchung pathophysiologischer

Aspekte des chronischen Asthmas.

21

2. Zielsetzung der Arbeit

Durch Mausmodelle der allergischen Sensibilisierung und Exposition mit

kurzzeitig appliziertem Allergen war es möglich, Mechanismen der akuten

entzündlichen und akuten funktionellen Antwort der Atemwege auf diesen

Reiz abzubilden.

Dennoch fehlten wesentliche charakteristische Merkmale in diesen Modellen,

die den chronischen Prozessen des menschlichen allergischen Asthma

bronchiale eigen sind und in ihrer Gesamtheit mit dem Begriff des Remode-

lings belegt werden (Umbauvorgänge der Atemwegswandstrukturen im

Sinne von subepithelialer Fibrose, Hypertrophie glattmuskulärer Strukturen,

Becherzellhyperplasie). Ein weiteres Defizit von Mausmodellen mit kurzzeiti-

ger Allergen-Exposition ist das Fehlen dauerhafter funktioneller Veränderun-

gen zeitlich über die Präsenz des Allergens hinausreichend.

In jüngeren Modellen verlängerter Antigen-Exposition gelingt dies mehr und

mehr, jedoch mit bisher noch differierenden Ergebnissen bei letztlich auch

deutlich differierenden Expositionsschemata.

Insbesondere wenig untersucht ist noch immer das Fortdauern erzeugter

pathologischer funktioneller, struktureller und immunologischer Veränderun-

gen nach Beendigung der induzierenden Allergen-Exposition.

Ziel dieser Arbeit ist die Etablierung eines chronischen Asthma-Mausmodells

mit Induktion eines dem menschlichen chronischen allergischen Asthma

möglichst nahe kommenden Phänotyps.

Es sollen folgende Frage beantwortet werden:

1) Welche Rolle spielt die systemische Sensibilisierung bei der Induktion

asthmatypischer funktioneller und struktureller Lungenveränderun-

gen?

2) Ist sie durch eine Verlängerung der topischen Allergen-Exposition

ersetzbar?

3) Beeinflusst die Länge der Expositionsphase und die Anwendung sys-

temischer Sensibilisierung strukturelle und funktionelle pulmonale

Veränderungen in gleichem Maße?

22

4) Wie ist der zeitliche Zusammenhang zwischen funktionellen und

strukturellen Lungenveränderungen, insbesondere auch nach Beendi-

gung der Allergen-Exposition?

5) Lassen sich immunlogische Mechanismen als Bedingung für andau-

ernde funktionelle oder strukturelle pulmonale Veränderungen identifi-

zieren?

23

3. Material und Methoden

Der vorliegenden Arbeit liegen tierexperimentelle Untersuchungen an der

Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital, Klinikum der

Ruhr-Universität Bochum, zugrunde, die zwischen Januar 2003 und Januar

2005 durchgeführt wurden.

Der Versuchsaufbau verfolgt das Ziel, ein Maus-Modell chronischer

Atemwegsentzündung mit Atemwegshyperreaktivität und folgendem Remo-

deling zu etablieren, das strukturelle wie funktionelle Charakteristika des

menschlichen Asthma bronchiale abbildet.

Es wird ein Modell einer langfristigen Allergen-Exposition über die Atemwege

der Versuchstiere genutzt und dieses einem Modell kurzfristiger Allergen-

Exposition über die Atemwege gegenübergestellt, um den Einfluss der Expo-

sitionsdauer auf die Atemwegsphysiologie und die histologischen Verände-

rungen zu untersuchen.

Des Weiteren wird der Einfluss der systemischen Allergensensibilisierung auf

die Ausbildung der Atemwegsentzündung und des Remodelings in einem

zusätzlichen Ansatz mit und ohne systemische Sensibilisierung betrachtet.

Es werden parallel die induzierten morphologischen Veränderungen an den

Atemwegen und die resultierenden funktionellen Veränderungen untersucht,

um Anhaltspunkte für einen möglichen Zusammenhang zu gewinnen.

3.1 Versuchstiere

Weibliche BALB/c-Mäuse, frei von mausspezifischen Pathogenen, werden

von der Charles River Deutschland GmbH (Sulzfeld) bezogen.

Die Mäuse werden auf einer ovalbuminfreien Diät gehalten. Alle in dieser

Studie verwendeten Versuchstiere befinden sich unter einem vom Regie-

rungspräsidium Arnsberg genehmigten Protokoll.

3.2 Versuchsprotokoll

Sechs bis acht Wochen alte Mäuse werden an Tag 1 und 7 durch eine intra-

peritoneale Injektion von 20 µg OVA (Grad V; Sigma-Aldrich GmbH, Taufkir-

chen), emulgiert in 2,25 mg Aluminiumhydroxid (AlumImuject; Pierce Chemi-

24

cal Co., Rockford, Illinois, USA) mit einem Gesamtvolumen von 100 µl sys-

temisch sensibilisiert. Anschließend werden sie über die Atemwege mit 40 µl

sterilem einprozentigem OVA in PBS in wöchentlichen Intervallen, beginnend

an Tag 14, intranasal exponiert (OVA-OVA-Expositionsgruppe). Für dieses

Vorgehen werden die Mäuse einer leichten Anästhesie mit 0,26 mg Xylazin-

hydrochlorid (Bayer Vital, Leverkusen) und 1,3 mg Ketaminhydrochlorid

(CuraMED Pharma GmbH, Karlsruhe) ausgesetzt.

Eine zweite Versuchsgruppe wird unter den gleichen Voraussetzungen be-

handelt, die intraperitoneale Injektion erfolgt hier jedoch mit in Aluminium-

hydroxid emulgiertem sterilem PBS, während die intranasale Atemwegs-Ex-

position identisch durchgeführt wird (PBS-OVA-Expositionsgruppe).

Die Mäuse der Kontrollgruppe werden der gleichen Prozedur mit intraperito-

nealer PBS-Aluminiumhydroxid-Injektion und intranasaler Exposition von

sterilem PBS unterzogen (PBS-PBS-Expositionsgruppe).

Zwei verschiedene Versuchsprotokolle werden angewendet: eines mit einer

kurzen Periode der Allergen-Exposition über die Atemwege über zwei Wo-

chen an den Tagen 14 und 21 und ein anderes mit einer prolongierten Phase

der lokalen Allergen-Exposition über acht Wochen einmal wöchentlich, begin-

nend an Tag 14 und endend mit der letzten Exposition an Tag 63 (siehe Stu-

diendesign in Abb. 5).

Unter Anleitung und in Zusammenarbeit mit der wissenschaftlichen

Mitarbeiterin und der medizinisch-technischen Assistentin wurden

Sensibilisierung und Exposition der Tiere durch die Promovendin

durchgeführt.

So ergeben sich insgesamt sechs Versuchsgruppen:

- OVA-OVA-Gruppe, verlängertes Expositionsprotokoll

- PBS-OVA-Gruppe, verlängertes Expositionsprotokoll

- PBS-PBS-Gruppe (Kontrolle), verlängertes Expositionsprotokoll

- OVA-OVA-Gruppe, kurzes Expositionsprotokoll

- PBS-OVA-Gruppe, kurzes Expositionsprotokoll

- PBS-PBS-Gruppe (Kontrolle), kurzes Expositionsprotokoll.

25

a) Kurzes Allergen-Expositionsschema

verschiedene Untersuchungszeitpunkte

Tag 1 Tag 7 Tag 14 Tag 21 nach letzter Exposition

intra- intra- intra- intra- funktionelle und morphometrische Analysen

peritoneal peritoneal nasal nasal

b) Langes Allergen-Expositionsschema

versch. Untersuchungszeitpunkte

Tag 1 Tag 7 Tag 14 Tag 21 Tag 28 Tag 35 Tag 42 Tag 49 Tag 56 Tag 63 nach letzter Exposition

intra- intra- intra- intra- intra- intra- intra- intra- intra- intra- funktionelle und morpho-

perit. perit. nasal nasal nasal nasal nasal nasal nasal nasal metrische Analysen

Abb. 5: Versuchsprotokolle für das kurze (a) und lange (b) Allergen-Expositionsschema. Zu den angegebenen Zeitpunkten erfolgt die intraperitoneale oder intranasale Exposition entsprechend der Zugehörigkeit zu einer der Versuchgruppen mit Ovalbumin oder PBS.

48 Stunden nach letzter Atemwegs-Exposition werden die basale Lungen-

funktion und die unspezifische Atemwegsreagibilität unter Methacholin-Pro-

vokation mit Hilfe der nicht-invasiven barometrischen Ganzkörperplethysmo-

grafie gemessen.

72 Stunden nach letzter Exposition werden Mäuse aus jeder Versuchsgruppe

mittels Genickbruch getötet zur Untersuchung der Lungenhistologie und

weiterer Messungen (der FACS-Analyse pulmonaler mononukleärer Zellen

und ihrer Zytokinproduktion und der Bestimmung der zellulären Zusammen-

setzung und der Zytokine in der bronchoalveolären Lavage-Flüssigkeit sowie

OVA-spezifischer Antikörper im Serum, nicht Teil dieser Arbeit).

Die basale Lungenfunktion und die unspezifische Atemwegsreagibilität auf

Methacholin werden an den verbleibenden Versuchstieren in wöchentlichem

Abstand für einen Zeitraum bis acht Wochen nach letzter Allergen-Exposition

untersucht unter Nutzung serieller barometrischer Ganzkörperplethysmo-

grafie, um das Abklingen oder die Persistenz der beobachteten funktionellen

Veränderungen nach Ende der Allergen-Exposition zu beurteilen.

Dabei werden die Messungen der basalen Lungenfunktion aus inhaltlichen

und methodischen Gründen (zu erwartende diskretere Unterschiede bei der

basalen Lungenfunktion als bei der Methacholin-Provokation) an einer größe-

ren Gruppe von Tieren als die Messung der Atemwegshyperreaktivität

durchgeführt.

26

Zusätzlich zum Zeitpunkt drei Tage nach letzter Exposition (s.o.), werden vier

und acht Wochen nach letzter Atemwegsexposition Tiere aus allen beschrie-

benen Versuchsgruppen für die oben genannten histologischen und immu-

nologischen Untersuchungen herausgenommen und getötet.

3.3 Lungenfunktionsmessungen:

Nicht-invasive Bestimmung der basalen Lungenfunktion und der

Reagibilität der Atemwege auf Methacholin

Die basale Lungenfunktion und die Reagibilität der Atemwege auf anstei-

gende Methacholin-Konzentrationen werden mit Hilfe eines Einzelkammer-

Ganzkörperplethysmografen (Buxco Electronics Inc., Troy, New York, USA)

gemessen. In diesem System wird eine unbetäubte und spontan atmende

Maus in der Hauptkammer des Plethysmografen platziert und die Druckun-

terschiede zwischen dieser und einer Referenzkammer aufgezeichnet (Abb.

6, aus (Hamelmann, et al. 1997)).

Abb. 6: Aufbau des Einzelkammer-Ganzkörperplethysmographen (aus (Hamelmann, et al. 1997))

Das Drucksignal in der Box wird durch Volumen- und daraus resultierende

Druckveränderungen während des Atemzyklus des Tieres verursacht. Ein

Low-pass-Filter in der Wand der Hauptkammer gestattet den Temperatur-

ausgleich. Aus diesen Box-Drucksignalen können die Phasen des Atemzyk-

lus, die Tidalvolumina sowie die „enhanced pause“ (Penh) berechnet werden.

Penh ist ein dimensionsloser Wert, der eine Funktion des Verhältnisses der

maximalen exspiratorischen zu den maximalen inspiratorischen Box-Druck-

signalen und eine Funktion des zeitlichen Ablaufs der Exspiration repräsen-

tiert. Er korreliert eng mit dem pulmonalen Widerstand, gemessen durch

27

Zweikammer-Plethysmografie bei beatmeten BALB/c-Mäusen nach Allergen-

Exposition der Atemwege (Hamelmann, et al. 1997).

Penh wird als Maß der basalen Lungenfunktion und der unspezifischen

Reaktivität der Atemwege auf Methacholin benutzt. Für die Evaluierung der

Reaktivität auf Methacholin werden die Versuchstiere in den Plethysmogra-

fen gesetzt, Basalwerte (sog. Baseline-Penh) werden aufgezeichnet. Darauf-

hin werden die Mäuse vernebeltem PBS für die Dauer von drei Minuten aus-

gesetzt, um eine unspezifische Reaktivität auf bereits physikalische Reize

festzustellen. Die Tiere werden dann mit steigenden Dosen vernebelten Me-

thacholins in PBS (6,25 mg/ml, 12,5 mg/ml, 25 mg/ml und 50 mg/ml Metha-

cholin) über drei Minuten provoziert bei jeder Methacholin-Konzentration mit

anschließender vierminütiger Pause zum Auswaschen des Methacholin-Ne-

bels aus dem Vernebelungssystem. Den Penh-Werten für jede Methacholin-

Konzentration wird eine Zeitspanne von drei Minuten zugrunde gelegt, indem

die dreiminütige Zeitspanne mit höchster Reaktivität innerhalb der sieben

Minuten (höchsten Penh-Werten) mittels der Auswertungssoftware berechnet

und aus allen in dieser Zeitspanne gemessenen Penh-Werten (alle 30 Se-

kunden) ein Durchschnitt gebildet wird. Hierdurch werden Spitzen in der

Atemwegshyperreaktivitätsmessung geglättet, die allein auf Einzelwertmes-

sungen beruhen würden und anfällig für Bewegungs- oder Unruheartefakte

sind, und so die Werte für die maximale Atemwegshyperreagibilität robuster.

Die funktionellen Messungen wurden durch eine wissenschaftliche Mitarbei-

terin, die medizinisch-technische Assistentin, sowie in Zusammenarbeit mit

einer dieser Personen durch die Promovendin durchgeführt.

3.4 Präparation der Lungen

Für die histologischen Untersuchungen wird die Trachea der getöteten

Mäuse mit einer 20-gauge-Nadel kanüliert und die Lungen werden zweifach

mit jeweils 1ml sterilem PBS gespült und diese Lavage-Flüssigkeit zur Be-

stimmung der Zellzusammensetzung und der Zytokine genutzt (nicht Teil

dieser Arbeit).

Es wird dann der rechte Herzventrikel punktiert, die Lungengefäße werden

hierüber mit 10ml vierprozentigem Paraformaldehyd ausgespült, um das Blut

aus dem Lungenkreislauf herauszuwaschen und die Lungen bestmöglich zu

28

konservieren. Die Lungen werden anschließend aus der Thoraxhöhle

herausgelöst und in vierprozentigem Formalin für mindestens 24 Stunden vor

Einbettung der Gewebsblöcke in Paraffin fixiert.

Die Tötung, BAL und Lungenentnahme erfolgten durch die wissenschaftliche

Mitarbeiterin und die medizinisch-technische Assistentin. Die weitere Lun-

gengewebspräparation erfolgte nach Anleitung selbständig durch die Promo-

vendin.

3.5 Histologie der Lungen

3.5.1 Gewebsanfärbung

5µm dicke Transversalschnitte werden von den in Paraffin eingebetteten

Lungen angefertigt und mit Hämatoxylin und Eosin (HE) für die Beurteilung

der entzündlichen Infiltrate, mit Alzian-Blau-Perjodsäure-Schiff (ABPAS) für

die Feststellung des Vorhandenseins von Muzin in den Becherzellen und mit

Massons Trichrom (Masson-Goldner-Färbung) zur Bestimmung der Menge

der subepithelialen Kollagenablagerung gefärbt (alle Färbungen von Merck,

Darmstadt).

Hämatoxylin-Eosin-Färbung

Die HE-Färbungen werden automatisiert mit einem Routinefärbeautomaten

(Thermo Scientific Shandon Varistain® Gemini ES, Thermo Scientific,

Dreieich) im Institut für Pathologie der Ruhr-Universität Bochum angefertigt.

Alzianblau-PAS-Färbung

Färbeprotokoll:

- Xylol

- absteigende Alkoholreihe bis 70%

- aqua dest. 5 min

- Essigsäure 3% 3 min

- Alzianblau-Lösung 30 min

- aqua dest. 2 min

- Periodsäure 1,0% 10 min

- aqua dest. 3 * 2 min

- Schiff’s Reagenz (Abzug) 20 min (15-30 min)

29

- SO2-Wasser (Abzug) 2 * 2 min

- fließendes Leitungswasser 15 min

- Hämalaun nach Mayer 4 min

- fließendes Leitungswasser 15 min

- aufsteigende Alkoholreihe

- (Xylol)

- Eindeckmittel

Alzianblau-Lösung: 1g Alzianblau 8GX in 100ml 3% Essigsäure lösen, pH auf

2,5 einstellen, vor Gebrauch filtrieren

SO2-Wasser: 10ml 1N HCl + 10ml 10% Kaliumdisulfit ad 200ml Leitungswas-

ser muss frisch angesetzt werden

Masson-Goldner-Färbung

Färbeprotokoll:

- Xylol 45 min

- absteigende Alkoholreihe (96% - 90% - 80% - 70%) jeweils 10-15 min

oder (100% - 95% - 70% - 50%) = ca. 1 Stunde

Diese Zeiten beziehen sich auf eine Isopropanolreihe, bei Ethanol

verkürzen sich die Zeiten auf ca. 5 min

- bis zur Weiterverarbeitung in aqua dest. lagern

1. Eisen-Hämatoxylin nach Weigert (a) 5 min

2. Abspülen in Leitungswasser kurz

(3. Differenzieren)

4. Bläuen in Leitungswasser 15 min

5. Masson-Gemisch (b) 7 min

6. Abspülen in 1%iger Essigsäure 1mal eintauchen

7. Phosphomolybdän-Orange G-Lösung (c) 3 min

8. Abspülen in 1%iger Essigsäure 1mal eintauchen

9. Lichtgrün 0,1% (d) 1 min

10. Abspülen in 1%iger Essigsäure 5 min

11. aufsteigende Alkoholreihe (70% - 80% - 96%) jeweils ca. 10 Sekun-

den

12. trocknen lassen

13. eindecken

30

(a) Lösung A und B 1+1 zusammengeben, Gemisch nicht länger als 8 Tage

lagern bzw. benutzen

(b) Stammlösung A: 1g Säurefuchsin in 100ml aqua dest. kochen, 1ml

Eisessig zugeben und filtrieren

Stammlösung B: 1g Ponceau de Xylidine in 100ml aqua dest. kochen,

1ml Eisessig zugeben und filtrieren

Azophloxin-Lösung: 0,5g Azophloxin, 100ml aqua dest., 0,2ml Eisessig

Masson-Lösung: 1 Teil Stammlösung A und 2 Teile Stammlösung B

Masson-Gemisch (Färbelösung): 50ml Masson-Lösung + 10ml

Azophloxin-Lösung mischen

(c) Phosphormolybdänsäure-Orange G-Lösung: 3g Phosphormolybdän-

säure, 2g Orange G, 100ml aqua dest.

(d) Lichtgrün-Lösung: Stammlösung = 2% Lichtgrün in 2%iger Essigsäure

Gebrauchslösung = Stammlösung 1:10 in aqua dest.

verdünnen

3.5.2 Morphometrische Analyse der Lungenhistologie

Die morphometrische Analyse der Lungenschnitte von vier bis sechs Mäusen

pro Expositionsgruppe aus vier unabhängigen Versuchsreihen wird unter für

den Untersucher geblindeten Bedingungen durchgeführt. Die Nutzung des

Zeiss Axioplan-2-imaging-Mikroskops, der AxioCamHR-Kamera und der

AxioVision-Release 4.3-Software (alle Carl Zeiss GmbH, Hallbergmoos) dient

der Erhebung der Daten bezüglich der Entzündung und der Becherzellhy-

perplasie.

Für die Messung der extrazellulären Kollagenablagerung wird das Zeiss

Axiovert-200M-Mikroskop, die AxioCamHRc-Kamera und die AxioVision40-

Software, Version 4.1.1.0 (alle Carl Zeiss GmbH, Hallbergmoos), sowie eine

Bildanalysesoftware (analySIS Docu-Software, Version 3.2, Soft Imaging

System GmbH, Münster) am Department of Respiratory Medicine des Impe-

rial College London verwendet, die eine Quantifizierung der Grünfärbung in

den Lungenschnitten ermöglicht.

Beide Mikroskopanlagen werden mit einem Referenzmessungsobjektträger

kalibriert.

31

Die Planung der morphometrischen Analyse der Lungenhistologie, die Be-

funderhebung per digitalisiertem Mikroskop und die Auswertung wurden selb-

ständig durch die Promovendin erarbeitet und durchgeführt.

Die folgenden Protokolle werden zur Quantifizierung der histologischen Be-

funde benutzt:

Atemwegsentzündung

Das Ausmaß der allergischen Entzündungsreaktion der Atemwege wird

durch die Anwendung eines semiquantitativen Punktesystems quantifiziert. In

diesem Punktesystem werden für die peribronchiale Region von sechs bis

acht verschiedenen mittelgroßen Bronchien (Durchmesser 80 bis 150µm) je

Präparat wie folgt Punkte vergeben:

0: keine Infiltration durch Entzündungszellen um den Bronchus

1: vereinzelte Entzündungszellen sichtbar

2: milde zelluläre Infiltration mit einzelnen kleinen Zellclustern

3: deutliche zelluläre Infiltration mit ausgeprägten, dichten Zellansammlun-

gen

4: deutliche zelluläre Infiltration entlang der gesamten Zirkumferenz des

Bronchus

Die ersten sechs bis acht Atemwege passenden mittleren Größen werden

zur Beurteilung herangezogen. Ein Punktwert wird für jeden begutachteten

Atemweg des Präparats bei zwanzigfacher Vergrößerung vergeben, das Er-

gebnis als ihr Mittelwert ± Standardfehler beschrieben.

Ebenso werden die Anzahl mittelgroßer Atemwege mit jeglicher zellulärer

Infiltration und die Gesamtzahl aller Atemwege des gleichen Durchmessers

(80 bis 150 µm) pro Präparat bei zehnfacher Vergrößerung gezählt und als

„incidence score“, dem Anteil betroffener Atemwege in Prozent an der Ge-

samtzahl der Atemwege ± Standardfehler, ausgedrückt.

Becherzellhyperplasie

Die ersten sechs bis acht verschiedenen mittelgroßen Bronchien (Durchmes-

ser 80 bis 150 µm) werden aus jedem Lungenschnitt analysiert. Für die

Quantifizierung des Umfangs der Mukussekretion in den Atemwegen werden

32

die Anzahl PAS-positiver Zellen und die Gesamtzahl der Epithelzellen in den

einzelnen Bronchien bei vierzigfacher Vergrößerung gezählt und als Anteil

PAS-positiver Zellen in Prozent an der Gesamtzahl der Epithelzellen ± Stan-

dardfehler beschrieben.

Zusätzlich wird die Zahl mittelgroßer Bronchien mit jeglichem PAS-positiven

Befund in den Epithelzellen bei zehnfacher Vergrößerung in jedem Präparat

beurteilt und als Anteil betroffener Bronchien in Prozent unter allen mittelgro-

ßen Bronchien (Durchmesser 80 bis 150 µm) des Schnitts ± Standardfehler

(„incidence score“), parallel zur Entzündungsquantifizierung, angegeben.

Die Gesamtzahl der Becherzellen wird außerdem gezählt und als Zellzahl

pro mm Länge der Basalmembran ± Standardfehler beschrieben.

Bronchovaskuläre Kollagendeposition

Zur Quantifizierung der bronchovaskulären Kollagenablagerung werden in

einer zehnfachen Vergrößerung digitale Fotos von sechs bis acht mittelgro-

ßen Bronchien (Durchmesser 80 bis 150 µm) und der ihnen anliegenden

Gefäße jedes nach Massons Trichrom gefärbten Präparats der Versuchs-

gruppen mit n= 4 bis 6 Mäusen unter identischen Belichtungsbedingungen

und Kameraeinstellungen angefertigt.

Eine Auswertung erfolgt unter Nutzung des AnalySIS-Programms mittels ei-

ner für alle Präparate identischen Phasenanalyse, in der die vorherrschen-

den Phasen – grün (Bindegewebe), rötlich (Zellanteile) und leer (Hohlräume)

– definiert waren.

Die verschiedenen Flächen werden als prozentualer Anteil der Gesamtfläche

ausgedrückt.

Die grün angefärbte und somit die Kollagenmatrix reflektierende Umgebung

jeder bronchovaskulären Einheit wird bezogen auf die gesamte von Matrix

besetzte Fläche des Ausschnitts und als Quotient des Anteils grüner Färbung

pro Gesamtmatrix („grün/(100-leer)“) dargestellt. Die Ergebnisse werden als

durchschnittliche Fläche ± Standardfehler der im Schnitt beurteilten Atem-

wege ausgedrückt und als Indikator für die peribronchiale und perivaskuläre

Fibrose genutzt.

33

3.6 Statistische und analytische Auswertung

Alle betrachteten Atemwege werden fotografisch dokumentiert. Die semi-

quantitativen Daten werden beschreibend tabellarisch festgehalten und sta-

tistisch analysiert.

Sämtliche quantitativen Messergebnisse werden in ein Programm zur statis-

tischen Analyse übertragen (GraphPad Prism version 4.00 for Windows,

GraphPad Software, San Diego, California, USA).

Die folgenden statistischen Berechnungen werden durchgeführt:

Für den geplanten Vergleich von mehr als zwei Versuchsgruppen wird der

Kruskal-Wallis-Test mit Dunns Post-hoc-Test verwendet.

Die Gruppengröße beträgt vier bis sechs Mäuse für die morphometrischen,

acht bis 78 Versuchstiere für die funktionellen Analysen, aus vier unabhängi-

gen Experimenten.

Der Wert für die Signifikanz wird in den morphometrischen Analysen auf

p<0,05 festgesetzt.

Bei der Auswertung der funktionellen Analysen (Baseline- und maximale

Penh-Daten) wird das Signifikanzniveau auf p<0,01 festgelegt. Das strengere

Signifikanzniveau der funktionellen Analysen wurde gewählt, um die zentrale

Frage des Vorliegens von funktionellen und damit Asthma-typischen

Veränderungen im Asthma-Mausmodell besonders gut gegen einen Fehler

der 1. Art abzusichern.

Die Ergebnisse werden für alle Messungen als Mittelwert ± Standardfehler

ausgedrückt.

Alle statistischen Analysen erfolgten selbständig durch die Promovendin.

Die Auswertung der PBS-OVA-Gruppen ist ausschließlich Bestandteil dieser

Arbeit und bisher nicht anderweitig publiziert.

34

4. Ergebnisse

4.1 Ergebnisse der morphometrischen Analysen

4.1.1 Quantifizierung der Entzündungsreaktion

4.1.1.1 Schweregrad der Entzündung

Die Quantifizierung der entzündlichen Reaktion der Atemwege mit Hilfe des

semiquantitativen Punktesystems zeigt eine signifikant ausgeprägte Entzün-

dung bei allen systemisch sensibilisierten und nachfolgend lokal OVA-be-

handelten Gruppen, unabhängig von der Länge der Exposition, zu allen Zeit-

punkten (Abb. 15 a-c, Abb. 16 a-c).

Der Verlauf der Entzündung von Tag 3 bis Woche 8 weist in beiden Proto-

kollen (kurze vs. lange Allergen-Exposition) eine abnehmende Tendenz auf.

Im kurzen Schema fällt der Entzündungsschweregrad von initial 2,68 ± 0,14

bis auf 1,13 ± 0,14 ab, im langen Schema von 3,44 ± 0,10 auf 1,6 ± 0,15

(Tab. 1). Diese Entzündungswerte liegen im langen Schema im Niveau höher

und belegen eine intensivere Ausprägung der Entzündung nach langfristiger

Exposition, die jedoch nur zum Zeitpunkt von vier Wochen nach Ende der

Exposition signifikant ist.

Der individuelle Punktwert der einzelnen Atemwege variiert leicht innerhalb

der Lunge eines Versuchstieres. Anhand der unter Punkt 3.1.1.2 genannten

Inzidenzwerte der Atemwegsentzündung ist die Homogenität der induzierten

Entzündungsreaktion ablesbar.

Tab. 1: Semiquantitative Beurteilung der Entzündungsreaktion (Mittelwert ± Standardfehler)

Kurzes Schema Punktwert der

Entzündung [0-4]

Langes Schema Punktwert der

Entzündung [0-4]

PBS-PBS, 3 Tage

nach letzter Exposition

0,15 ± 0,08 PBS-PBS, 3 Tage


0,13 ± 0,06

PBS-OVA, 3 Tage


2,10 ± 0,13 PBS-OVA, 3 Tage


2,56 ± 0,10

OVA-OVA, 3 Tage


2,68 ± 0,14 OVA-OVA, 3 Tage


2,69 ± 0,12

PBS-PBS, 4 Wochen


0,11 ± 0,05 PBS-PBS, 4 Wochen


0,25 ± 0,08

PBS-OVA, 4 Wochen 0,29 ± 0,09 PBS-OVA, 4 Wochen 1,13 ± 0,15

35

nach letzter Exposition nach letzter Exposition

OVA-OVA, 4 Wochen


1,50 ± 0,16 OVA-OVA, 4 Wochen


8,08 ± 4,05

PBS-PBS, 8 Wochen




0,15 ± 0,07

PBS-OVA, 8 Wochen


0,35 ± 0,11 PBS-OVA, 8 Wochen


0,56 ± 0,13

OVA-OVA, 8 Wochen




1,60 ± 0,15

Semiquantitative Beurteilung der Entzündung

0

1

2

3

4

Tag 3 Woche 4 Woche 8 Tag 3 Woche 4 Woche 8

kurzes langes Allergen-Expositionsschema

PBS i.p.-PBS i.n.

OVA i.p.-OVA i.n.***

***

***

***

***

++

***

En

tzü

nd

un

gs

pu

nk

twe

rt

Abb. 7: Ausprägung der Entzündung anhand semiquantitativem System. Dargestellt: Mittelwert mit Standardfehler; *** p<0,001: OVA-OVA vs. Kontrollgruppe desselben Schemas/ Zeitpunkts; ++ p<0,01: lang vs. kurz. n=6 pro Gruppe.

Die sowohl intraperitoneal als auch intranasal mit PBS behandelten Mäuse

beider Schemata (Kontrollgruppe) entwickeln kaum Anzeichen einer

Atemwegsentzündung (Tab. 1, Abb. 7, Abb. 9 g-i, Abb. 10 g-i).

Die Gruppen der Versuchstiere ausschließlicher intranasaler Ovalbumin-Ex-

position (PBS-OVA-Gruppen) entwickeln ebenso eine gegenüber den Kon-

trollgruppen (PBS-PBS) signifikante Atemwegsentzündung, jedoch eine ge-

ringer ausgeprägte Entzündung als die systemisch und intranasal mit OVA

behandelten Gruppen, wie Maximalwerte von 2,10 ± 0,13 im kurzen und 2,56

± 0,10 im langen Expositionsschema in diesen Gruppen belegen (Tab. 1,

Abb. 9 d-f, Abb. 10 d-f). Auch hier zeigt die Entzündung im Verlauf der Zeit

von acht Wochen eine kontinuierlich abnehmende Tendenz.

36

Auffällig ist das raschere Abklingen der Entzündungswerte in den PBS-OVA-

Gruppen: Ab Woche 4 lässt sich im kurzen, in Woche 8 auch im langen

Schema kein Unterschied mehr zur Kontrollgruppe nachweisen, hingegen ist

in beiden Schemata ab der vierten Woche ein signifikanter Unterschied zu

den entsprechenden OVA-OVA-Gruppen ablesbar. Langes und kurzes

Schema unterscheiden sich daher signifikant in Woche 4 (Abb. 8).

Semiquantitative Beurteilung der Entzündung

0

1

2

3

4



PBS i.p.-PBS i.n.

OVA i.p.-OVA i.n.

PBS i.p.-OVA i.n.

***

###

#

***###

**

+

###

En

tzü

nd

un

gs

pu

nk

twe

rt

Abb. 8: Ausprägung der Entzündung anhand semiquantitativem System mit PBS-OVA. Dargestellt: Mittelwert mit Standardfehler; ** p<0,01, *** p<0,001: PBS-OVA vs. Kontroll-gruppe desselben Schemas/ Zeitpunkts; # p< 0,05, ### p<0,001: OVA-OVA vs. PBS-OVA; + p<0,05: lang vs. kurz. n=6 pro Gruppe.

Die Induktion einer entzündlichen Reaktion der Atemwege gelingt durch

lange als auch kurze Allergen-Exposition sowohl mit als auch ohne systemi-

sche Sensibilisierung.

Sie erreicht ihren Maximalwert in allen Fällen bereits an Tag 3, der Abfall ist

in den Gruppen ausschließlicher intranasaler Exposition schneller als in den

OVA-OVA-Gruppen und im kurzen Expositionsschema deutlicher als im lan-

gen.

37

Tag 3 Woche 4 Woche 8

OVA-OVA,

kurz

a

b

c

PBS-OVA,

kurz

d

e

f

PBS-PBS,

kurz

g

h

i

Abb. 9: Fotografien der Gruppen des kurzen Schemas, HE-Färbung, 20fache Vergrößerung.


OVA-OVA,

lang

a

b

c

PBS-OVA,

lang

d

e

f

PBS-PBS,

lang

g

h

i

Abb. 10: Fotografien der Gruppen des langen Schemas, HE-Färbung, 20fache Vergrößerung.

38

4.1.1.2 Inzidenz der Entzündung

Als ein Parameter der Homogenität der induzierten Atemwegsentzündung

wird die Inzidenz der entzündlich veränderten Bronchien unter allen darge-

stellten Bronchien bestimmt.

Im kurzen wie im langen Allergen-Expositionsschema induziert die

intraperitoneale und intranasale Exposition mit Ovalbumin (OVA-OVA-

Gruppe) eine peribronchiale Entzündungsreaktion mit homogenem Vertei-

lungsmuster, da an Tag 3 93% (kurzes Schema) respektive 100% (langes

Schema) der Bronchien von Entzündungsinfiltraten betroffen sind (Tab. 2).

Ein signifikanter Unterschied in der Anzahl betroffener Bronchien der OVA-

OVA-Gruppen zur entsprechenden Kontrollgruppe (PBS-PBS-Gruppe) des-

selben Schemas und Zeitpunkts der Untersuchung nach letzter Exposition

lässt sich im kurzen Schema nur direkt nach letzter Exposition (Tag 3) nach-

weisen, während im langen Schema sowohl an Tag 3 wie auch nach vier

Wochen ein signifikanter Unterschied der Inzidenz der Entzündung zur Kon-

trollgruppe besteht (Abb. 11).

Tab. 2: Inzidenz der Entzündung (Mittelwert ± Standardfehler)

Kurzes Schema Inzidenz [%] Langes Schema Inzidenz [%]

PBS-PBS, 3 Tage


7,56 ± 1,68 PBS-PBS, 3 Tage


13,75 ± 6,31

PBS-OVA, 3 Tage


92,44 ± 3,49 PBS-OVA, 3 Tage


100 ± 0,00

OVA-OVA, 3 Tage


93,15 ± 3,05 OVA-OVA, 3 Tage


100 ± 0,00

PBS-PBS, 4 Wochen




24,11 ± 9,14

PBS-OVA, 4 Wochen


23,90 ± 12,59 PBS-OVA, 4 Wochen


64,40 ± 7,76

OVA-OVA, 4 Wochen


76,13 ± 11,66 OVA-OVA, 4 Wochen


97,93 ± 1,33

PBS-PBS, 8 Wochen




14,51 ± 4,50

PBS-OVA, 8 Wochen




35,11 ± 7,97

OVA-OVA, 8 Wochen




72,45 ± 5,70

39

Inzidenz der Entzündung

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0



PBS i.p.-PBS i.n.

OVA i.p.-OVA i.n.

PBS i.p.-OVA i.n.* * *** **

An

teil

be

tro

ffe

ne

r A

tem

we

ge

mit

En

tzü

nd

un

g

Abb. 11: Inzidenz der Entzündung. Dargestellt: Mittelwert mit Standardfehler; * p<0,05, ** p<0,01: OVA-OVA bzw. PBS-OVA vs. Kontrollgruppe desselben Schemas/ Zeitpunkts. n=6 pro Gruppe.

Auch in der Gruppe ausschließlich intranasaler Ovalbumin-Exposition (PBS-

OVA-Gruppe) gelingt das Hervorrufen entzündlicher Prozesse in der Umge-

bung der Bronchien der Versuchstiere (siehe Schweregrad-Analyse unter

Punkt 3.1.1.1). Im kurzen und im langen Versuchsprotokoll führt diese Expo-

sitionsform zum homogenen Befall aller sichtbaren Bronchien vergleichbar

mit dem in der OVA-OVA-Gruppe am dritten Tag nach letzter Atemwegsex-

position (Tab. 2, Abb. 11).

Dieser Effekt klingt in der nicht systemisch sensibilisierten Gruppe des lan-

gen Schemas schneller ab als in der entsprechenden OVA-OVA-Gruppe und

ist bereits in Woche 4 nicht mehr signifikant.

In keiner der OVA-behandelten Gruppen ist ein signifikanter Unterschied zur

Kontrollgruppe noch nach acht Wochen zu beobachten. In den Kontrollgrup-

pen liegt die Inzidenz von entzündeten Bronchien in allen Fällen unter 24,11

± 9,14 Prozent (Tab. 2), mit einem maximalen Schweregradscore von 1 bei

den betroffenen Bronchien.

Insgesamt belegen diese Inzidenzwerte eine homogene Verteilung der

Atemwegsentzündung direkt nach Ende der Sensibilisierung mit dann unter-

schiedlich schnellem Abklingen je nach Expositionsschema (kurz/ lang, PBS-

OVA/ OVA-OVA).

Wichtig zu erwähnen ist, dass in keiner der Expositions- oder Kontrollgrup-

pen eine parenchymale Entzündung nachgewiesen werden kann.

40

4.1.2 Untersuchung der Becherzellen

4.1.2.1 Quantifizierung der Becherzellhyperplasie

Es erfolgt die Auszählung der hyperplastischen Becherzellen bezogen auf

die Anzahl der Becherzellen insgesamt:

Die Kontrollgruppen zeigen keine PAS-Positivität unabhängig vom Zeitpunkt

der Untersuchung und vom Expositionsschema (Abb. 12, Abb. 13 g-i, Abb.

14 g-i).

Die OVA-OVA-Gruppen zeigen im kurzen und langen Schema an Tag 3 eine

deutliche, danach zurückgehende Becherzellhyperplasie (Tab. 3, Abb. 13 a-

c, Abb. 14 a-c). Bis in die vierte Woche bleibt ein signifikanter Unterschied

zur entsprechenden Kontrollgruppe erhalten.

Tab. 3: Anteil muzinhaltiger Zellen in Bezug auf die Gesamtzahl der Epithelzellen (Mittelwert ± Standardfehler)

Kurzes Schema Anteil PAS-

positiver Zellen

Langes Schema Anteil PAS-

positiver Zellen

PBS-PBS, 3 Tage


0,00 ± 0,00 PBS-PBS, 3 Tage


0,00 ± 0,00

PBS-OVA, 3 Tage


0,16 ± 0,03 PBS-OVA, 3 Tage


0,47 ± 0,06

OVA-OVA, 3 Tage


0,43 ± 0,05 OVA-OVA, 3 Tage


0,63 ± 0,06

PBS-PBS, 4 Wochen




0,00 ± 0,00

PBS-OVA, 4 Wochen




0,15 ± 0,04

OVA-OVA, 4 Wochen




0,35 ± 0,05

PBS-PBS, 8 Wochen




0,00 ± 0,00

PBS-OVA, 8 Wochen




0,01 ± 0,01

OVA-OVA, 8 Wochen




0,03 ± 0,01

Im kurzen Schema liegen die Werte der OVA-OVA-Gruppen an Tag 3 und in

Woche 4 signifikant über den Werten der entsprechenden PBS-OVA-Grup-

pen, diesen Gruppenunterschied gibt es im langen Schema nicht.

41

In den OVA-OVA-Gruppen liegt kein Unterschied bezüglich des Expositions-

schemas vor (kurz vs. lang).

Die Gruppen ausschließlicher intranasaler Exposition (PBS-OVA-Gruppen)

entwickeln nur im langen Sensibilisierungsschema eine Becherzellhyperpla-

sie, die dem Ausmaß der in den OVA-OVA-Gruppen vorhandenen Verände-

rung gleichkommt (Tab. 3, Abb. 14 d-f). So findet sich im langen Schema

ebenfalls ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe bis in die vierte

Woche, allerdings mit ebenso fallender Tendenz.

An Tag 3 findet sich auch im kurzen Schema ein signifikanter Unterschied

der PBS-OVA-Gruppe zur Kontrollgruppe, allerdings mit 0,16 ± 0,03 auf nied-

rigerem Niveau und nicht mehr vorhanden ab Woche 4 (Abb. 13 d-f).

Der Unterschied zwischen den Allergen-Expositionsschemata (kurz vs. lang)

ist in den PBS-OVA-Gruppen am dritten Tag signifikant.

Eine Hyperplasie der Becherzellen findet nur in Gruppen mit Ovalbumin-Ex-

position statt. Sie erreicht in allen Fällen ihr Maximum an Tag 3 nach letzter

Exposition und findet sich in den OVA-OVA-Gruppen in ausgeprägterer Form

als in den PBS-OVA-Gruppen. Das lange Sensibilisierungsschema führt zu

einer Verstärkung des Effekts, insbesondere in der Gruppe ausschließlicher

intranasaler Exposition, in der so eine längere Persistenz der Hyperplasie

erreicht wird, die in den OVA-OVA-Gruppen im kurzen wie im langen

Schema gegeben ist.

Das Phänomen der Becherzellhyperplasie ist auf einen Zeitraum bis zu vier

Wochen nach letzter Exposition begrenzt.

Messung der Becherzellhyperplasie

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7



PBS i.p.-PBS i.n.

OVA i.p.-OVA i.n.

PBS i.p.-OVA i.n.

***

+++

****

+

***

***

##

***

+

*

An

teil

PA

S-p

os

itiv

er

Ze

lle

n

an

Ep

ith

elz

ell

en

Abb. 12: Messung der Becherzellhyperplasie. Dargestellt: Mittelwert mit Standardfehler; * p<0,05, *** p<0,001: OVA-OVA bzw. PBS-OVA vs. Kontrollgruppe; + p<0,05, +++ p<0,001: OVA-OVA vs. PBS-OVA; ## p<0,01: lang vs. kurz (desselben Schemas/Zeitpunkts). n=6 pro Gruppe.

42


OVA-OVA,

kurz

a

b

c

PBS-OVA,

kurz

d

e

f

PBS-PBS,

kurz

g

h

i

Abb. 13: Fotografien der Gruppen des kurzen Schemas, Alzianblau-PAS-Färbung, 40fache Vergrößerung.


OVA-OVA,

lang

a

b

c

PBS-OVA,

lang

d

e

f

PBS-PBS,

lang

g

h

i

Abb. 14: Fotografien der Gruppen des langen Schemas, Alzianblau-PAS-Färbung, 40fache Vergrößerung.

43

4.1.2.2 Inzidenz der Becherzellhyperplasie

Die durch die PAS-Reaktion in Form magentafarbener bis violetter Zellanfär-

bung nachgewiesene Hyperplasie der Becherzellen findet sich nahezu aus-

schließlich in Gruppen, die einer Exposition mit Ovalbumin unterzogen wer-

den (siehe auch Quantifizierung der Becherzellhyperplasie unter Punkt

3.1.2.1).

Die Bestimmung der Inzidenz der Becherzellhyperplasie stützt diese Befunde

mit einer nahezu ebenso homogenen Verteilung der Becherzellhyperplasie

wie die der peribronchialen Entzündungsantwort. Die Kontrollgruppen (PBS-

PBS-Gruppen) weisen dieses Merkmal zu keinem Zeitpunkt auf (Tab. 4).

Tab. 4: Inzidenz der Becherzellhyperplasie (Mittelwert ± Standardfehler)

Kurzes Schema Inzidenz der

Becherzell-

hyperplasie [%]

Langes Schema Inzidenz der

Becherzell-

hyperplasie [%]

PBS-PBS, 3 Tage


0,61 ± 0,61 PBS-PBS, 3 Tage


0,00 ± 0,00

PBS-OVA, 3 Tage


32,85 ± 8,09 PBS-OVA, 3 Tage


62,15 ± 2,59

OVA-OVA, 3 Tage


70,79 ± 7,02 OVA-OVA, 3 Tage


74,06 ± 5,87

PBS-PBS, 4 Wochen




0,00 ± 0,00

PBS-OVA, 4 Wochen




23,36 ± 5,67

OVA-OVA, 4 Wochen




49,53 ± 0,68

PBS-PBS, 8 Wochen




0,38 ± 0,38

PBS-OVA, 8 Wochen




2,33 ± 1,53

OVA-OVA, 8 Wochen




12,00 ± 6,18

Die der intraperitonealen und intranasalen Ovalbumin-Exposition unterzo-

genen Versuchstiere (OVA-OVA-Gruppen) entwickeln in beiden Schemata

schon zum dritten Tag das Merkmal der Becherzellhyperplasie (Tab. 4, Abb.

15). Ein Abklingen dieses Phänomens ist zu sehen, im kurzen Sensibilisie-

44

rungsschema ist ab der vierten Woche kein signifikanter Unterschied zur

Kontrollgruppe mehr vorhanden, im langen ist dies in der achten Woche nicht

mehr zu beobachten.

Die Gruppe ausschließlicher intranasaler Allergen-Exposition (PBS-OVA-

Gruppe) weist im langen Expositionsschema am dritten Tag eine signifikante

Becherzellhyperplasie auf (Tab. 4, Abb. 15). Im kurzen Schema liegt die Inzi-

denz an Tag 3 bei 32,85 ± 8,09 Prozent und damit nicht signifikant über der

Kontrollgruppe.

Das rasche Abklingen geschieht in beiden PBS-OVA-Gruppen, es finden sich

keine signifikanten Unterschiede zur Kontrollgruppe nach dem dritten Tag.

Signifikante Unterschiede zwischen den Expositionsschemata (kurz vs. lang)

oder den behandelten Gruppen (OVA-OVA vs. PBS-OVA) bestehen nicht.

Inzidenz der Becherzellhyperplasie

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8



PBS i.p.-PBS i.n.

OVA i.p.-OVA i.n.

PBS i.p.-OVA i.n.

****

**

**

An

teil

de

r b

etr

off

en

en

Ate

mw

eg

e

mit

PA

S-p

os

itiv

en

Ep

ith

elz

ell

en

Abb. 15: Inzidenz der Becherzellhyperplasie. Dargestellt: Mittelwert mit Standardfehler; ** p<0,01: OVA-OVA bzw. PBS-OVA vs. Kontrollgruppe desselben Schemas/ Zeitpunkts. n=6 pro Gruppe.

4.1.2.3 Gesamtzahlen der Becherzellen

Die Gesamtanzahl der Becherzellen verändert sich unspezifisch.

Im kurzen Schema finden sich signifikante Unterschiede der OVA-OVA-

Gruppe zur Kontrollgruppe und zur PBS-OVA-Gruppe in der achten Woche.

Das lange Schema weist zu verschiedenen Zeitpunkten und in verschiede-

nen Versuchsgruppen signifikante Unterschiede zum kurzen Schema auf,

insgesamt liegen die Zahlen des langen Schemas im Niveau leicht höher

(Abb. 16). Eine mögliche Erklärung könnte das im langen Schema höhere

Alter der Tiere darstellen, eindeutige Schlüsse lassen sich aus diesen Befun-

den nicht ziehen.

45

Gesamtbecherzellzahlen

0

50

100

150

200

250



PBS i.p.-PBS i.n.

OVA i.p.-OVA i.n.

PBS i.p.-OVA i.n. *

++

# ######

###

#B

ec

he

rze

llza

hl

pro

mm

Ba

sa

lme

mb

ran

Abb. 16: Becherzellzahl/mm Basalmembran. Dargestellt: Mittelwert mit Standardfehler; * p<0,05: OVA-OVA vs. Kontrollgruppe; ++ p<0,01: OVA-OVA vs. PBS-OVA (desselben Schemas/ Zeitpunkts); # p<0,05, ### p<0,001: lang vs. kurz. n=6 pro Gruppe.

4.1.3 Quantifizierung der Bindegewebsreaktion

Maßgebliche Eigenschaft des Remodelings der Atemwegswandstrukturen ist

die Vermehrung des kollagenen Bindegewebes in der subepithelialen Region

der Bronchien. Die Messung der peribronchialen Kollagenablagerung ist

deshalb als Parameter [%] gewählt worden.

Tab. 5: Peribronchiale Kollagenablagerung (Mittelwert ± Standardfehler)

Kurzes Schema Kollagenanteil an

Gesamtmatrix [%]

Langes Schema Kollagenanteil an

Gesamtmatrix [%]

PBS-PBS, 3 Tage


4,61 ± 0,22 PBS-PBS, 3 Tage


3,70 ± 0,29

PBS-OVA, 3 Tage


2,98 ± 0,32 PBS-OVA, 3 Tage


1,93 ± 0,36

OVA-OVA, 3 Tage


3,78 ± 0,25 OVA-OVA, 3 Tage


3,60 ± 0,32

PBS-PBS, 4 Wochen




4,49 ± 0,30

PBS-OVA, 4 Wochen




5,66 ± 0,41

OVA-OVA, 4 Wochen




8,08 ± 0,66

PBS-PBS, 8 Wochen




4,72 ± 0,29

PBS-OVA, 8 Wochen




9,02 ± 0,33

OVA-OVA, 8 Wochen




7,42 ± 0,53

46

Peribronchiale Kollagendeposition

0.000

0.025

0.050

0.075

0.100



PBS i.p.-PBS i.n.

OVA i.p.-OVA i.n. **

+++ *

+++

+++

An

teil

grü

ne

r F

ärb

un

g

an

de

r G

es

am

tma

trix

Abb. 17: Quantifizierung der Bindegewebsvermehrung. Dargestellt: Mittelwert mit Standard-fehler; * p<0,05, ** p<0,01: OVA-OVA vs. Kontrollgruppe desselben Schemas/ Zeitpunkts; +++ p<0,001: lang vs. kurz. n= 4-6 pro Gruppe.

Die OVA-OVA-Gruppen des kurzen Schemas zeigen relativ konstante Werte

(Tab. 5), die sich nicht signifikant von den entsprechenden Kontrollgruppen

unterscheiden (Abb. 17). Morphologisch kann von keiner relevanten Fibrose

gesprochen werden (Abb. 19 a-c vs. g-i).

Der Kollagenanteil der beurteilten peribronchialen Regionen des langen

Schemas liegt am dritten Tag in einem ähnlichen Bereich, steigt aber in der

vierten Woche signifikant gegenüber der Kontrollgruppe an und hält dieses

erhöhte Niveau in der achten Woche.

Es findet sich daher ein signifikanter Unterschied zwischen dem kurzen und

dem langen Expositionsschema zu den Zeitpunkten vier und acht Wochen

nach letzter intranasaler Exposition.

Der Prozess der Bindegewebsvermehrung findet nach Tag 3 in einem Zeit-

raum bis zur vierten Woche statt und ist über einen Zeitraum von acht Wo-

chen konstant. Er lässt sich nur mit Hilfe des langen Sensibilisierungssche-

mas in den OVA-OVA-Gruppen erreichen (Abb. 20 a-c).

In den Kontrollgruppen (PBS-PBS-Gruppen) besteht ein am ehesten arte-

faktbedingter signifikanter Unterschied zwischen dem kurzen und langen

Sensibilisierungsschema in Woche 8 durch einen vergleichsweise niedrigen

Wert im kurzen Schema (Tab. 5). Der im langen Schema der Kontrollgruppe

gemessene Kollagenanteil von 4,72 ± 1,92 Prozent ist im Kontext der ande-

ren Messwerte nicht als relevant erhöht zu betrachten, zumal ein signifikanter

Unterschied zu diesem Zeitpunkt zu beiden behandelten Gruppen besteht.

47

Das Verhalten bezüglich des Remodelings verhält sich in den PBS-OVA-

Gruppen ähnlich den OVA-OVA-Gruppen.

Im kurzen Schema findet sich ein signifikanter Unterschied zur Kontroll-

gruppe in der achten Woche, der mehr durch einen niedrigen Wert der PBS-

PBS-Gruppe (s. o.) denn durch eine Erhöhung in der PBS-OVA-Gruppe her-

zurühren scheint (s. auch Tab. 5).

Ein sehr niedriger Wert der PBS-OVA-Gruppen besteht an Tag 3 im langen

Schema, wodurch ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe sowie zur

entsprechenden OVA-OVA-Gruppe erzeugt wird.

Dennoch sind die Veränderungen zur Woche 4 sehr prägnant und dauern

konstant bis in die achte Woche an. Zu diesen Zeitpunkten unterscheidet

sich die PBS-OVA-Gruppe aus der langen Sensibilisierungsphase signifikant

von der aus der kurzen (Abb. 18). Der Unterschied zur entsprechenden Kon-

trolle ist erst in der achten Woche signifikant.

Durch die ausschließliche intranasale Allergen-Exposition können also ähnli-

che Veränderungen wie durch die intraperitoneale Sensibilisierung mit intra-

nasaler Exposition erreicht werden, offenbar dauert die Entwicklung dieser

Eigenschaft des Remodelings unter diesen Bedingungen länger, gelangt

aber in der Zeit bis zur achten Woche auf das gleiche Niveau.

Signifikante Unterschiede zur OVA-OVA-Gruppe bestehen zu den Zeitpunk-

ten von vier und acht Wochen nicht.

Die dargestellten zum Teil doch fluktuierenden Ergebnisse in diesem Teil der

Untersuchung deuten darauf hin, dass hier vermutlich zur Sicherung der Er-

gebnisse weitere Versuchsreihen mit größerer Tierzahl notwendig wären, so

dass zumindest für diesen Teil der Untersuchung die Interpretation der Er-

gebnisse erschwert ist.

48

Peribronchiale Kollagendeposition

0.000

0.025

0.050

0.075

0.100



PBS i.p.-PBS i.n.

OVA i.p.-OVA i.n.

PBS i.p.-OVA i.n.

***

***

#

++

***

+++

An

teil

grü

ne

r F

ärb

un

g

an

de

r G

es

am

tma

trix

Abb. 18: Quantifizierung der Bindegewebsvermehrung mit PBS-OVA. Dargestellt: Mittelwert mit Standardfehler; *** p<0,001: PBS-OVA vs. Kontrollgruppe desselben Schemas/ Zeitpunkts; # p<0,05: OVA-OVA vs. PBS-OVA; ++ p<0,01, +++ p<0,001: lang vs. kurz. n=4-6 pro Gruppe.


OVA-OVA,

kurz

a

b

c

PBS-OVA,

kurz

d

e

f

PBS-PBS,

kurz

g

h

i

Abb. 19: Fotografien der Gruppen des kurzen Schemas, Masson-Goldner-Färbung, zehnfache Vergrößerung.

49


OVA-OVA,

lang

a

b

c

PBS-OVA,

lang

d

e

f

PBS-PBS,

lang

g

h

i

Abb. 20: Fotografien der Gruppen des langen Schemas, Masson-Goldner-Färbung, zehnfache Vergrößerung.

Die Vermehrung peribronchialen Bindegewebes lässt sich nur mittels des

langen Allergen-Expositionsschemas erreichen. Es tritt mit einer Latenzzeit

von vier Wochen in der OVA-OVA-Gruppe auf, stellt also eher eine Langzeit-

veränderung denn eine kurzfristige Erscheinung dar.

Bei fehlender systemischer Sensibilisierung tritt diese Veränderung signifi-

kant gegenüber der Kontrollgruppe nach acht Wochen, gegenüber der PBS-

OVA-Gruppe des kurzen Schemas in der vierten Woche auf, gelingt also,

vielleicht etwas weniger robust als in der OVA-OVA-behandelten Gruppe des

langen Schemas.

4.2 Ergebnisse der funktionellen Analysen

An dieser Stelle wird zunächst exemplarisch die Messung der Baseline-Lun-

genfunktion und der Atemwegshyperreaktivität auf Methacholin-Provokation

für den Untersuchungszeitpunkt 48 Stunden nach letzter intranasaler Aller-

50

gen-Exposition dargestellt. Für alle weiteren Untersuchungszeitpunkte der

funktionellen Analysen (Woche 1 bis 8) erfolgen die Messungen in derselben

Weise, so dass sich für alle Versuchsgruppen zu allen Untersuchungszeit-

punkten entsprechende Kurvenverläufe mit Darstellung des Baseline- und

des maximalen Penh-Wertes ergeben.

Letztere Ergebnisse sind im Folgenden kumuliert dargestellt.

Die Methacholin-Provokation mit steigender Dosierung stellt einen

bronchokonstriktorischen Reiz dar, auf den die mit Ovalbumin behandelten

Mäuse des kurzen und langen Schemas signifikant stärker mit einer Erhö-

hung des Penh, respektive einer Erhöhung des Atemwegswiderstands, rea-

gieren als die Versuchstiere der Kontrollgruppen (Abb. 21 und 22).

Messung des Atemwegshyperreaktivitätbei steigender Methacholinkonzentration

48 Stunden nach letzterAllergen-Exposition

baseline PBS 6,25 12,5 25 50

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9OVA-OVA, kurz

PBS-PBS, kurz

OVA-OVA, lang

PBS-PBS, lang

*** ** *** *** *** ***### ### ### ### ### ###

Methacholinkonzentration [mg/ml PBS]

Pen

h

Abb. 21: Penh-Verlauf unter steigenden Methacholin-Dosen. Dargestellt: Mittelwert mit Standardfehler; ** p<0,01, *** p<0,001: OVA-OVA, lang vs. Kontrollgruppe; ### p<0,001: OVA-OVA, kurz vs. Kontrollgruppe. n=8-78 pro Gruppe.

Im Regelfall findet sich der Maximalwert bei der höchsten Methacholin-Kon-

zentration, der Kurvenverlauf wird jedoch flacher.

Im Niveau liegt die lang behandelte OVA-OVA-Gruppe über der kurz sen-

sibilisierten, dieses ist jedoch nicht signifikant, zwischen den Kontrollgruppen

besteht kein signifikanter Unterschied.

Die Gruppen ausschließlich intranasal behandelter Mäuse (PBS-OVA-Grup-

pen) zeigen im kurzen wie im langen Schema eine ähnliche Kurvenform wie

51

die OVA-OVA-Gruppen und die Kontrollgruppen. Sie liegen zwischen diesen,

wobei die Gruppe des kurzen Schemas näher an den beiden Kurven der

Kontrollgruppen liegt als die des langen Schemas. Während in der Gruppe

des kurzen Schemas ein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe nur

ohne Methacholin-Provokation nachzuweisen ist, findet sich in der lang OVA-

exponierten Gruppe ein signifikanter Unterschied bei allen Methacholin-Kon-

zentrationen für diesen Untersuchungszeitpunkt (Abb. 22).

Messung des Atemwegshyperreaktivitätbei steigender Methacholinkonzentration

48 Stunden nach letzterAllergen-Exposition

baseline PBS 6,25 12,5 25 50

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9OVA-OVA, kurz

PBS-PBS, kurz

OVA-OVA, lang

PBS-PBS, lang

PBS-OVA, kurz

PBS-OVA, lang

## ** *** *** ***

Methacholinkonzentration [mg/ml PBS]

Pen

h

Abb. 22: Penh-Verlauf unter steigenden Methacholin-Dosen mit PBS-OVA. Dargestellt: Mittelwert mit Standardfehler; ** p<0,01, *** p<0,001: PBS-OVA, lang vs. Kontrollgruppe; ## p<0,01: PBS-OVA, kurz vs. Kontrollgruppe. n=8-78 pro Gruppe.

Unter Provokationsbedingungen 48 Stunden nach letzter Exposition zeigen

die OVA-OVA-Gruppen eine ausgeprägtere Atemwegshyperreagibilität als

die ausschließlich intranasal behandelten Tiere. Die PBS-OVA-Gruppe zeigt

ausschließlich nach dem langen Sensibilisierungsschema eine Atemwegshy-

perreagibilität unter Provokation. Die Kontrollgruppen weisen keine Atem-

wegshyperreagibilität auf.

Der oben beschriebene flacher werdende Verlauf geht in der PBS-OVA-

Gruppe des langen Expositionsschemas sogar in eine leicht abfallende

Kurve über. Die Beobachtung der Versuchstiere mit sehr starker Atemwegs-

obstruktion zeigt, dass die Penh-Messung bei diesen Tieren durch die extrem

52

veränderte Atmung nicht mehr zuverlässig möglich ist, da zu wenige mess-

bare Atemexkursionen noch aufgezeichnet werden können.

4.2.1 Unspezifische Atemwegshyperreaktivität, gemessen als maxima-

ler Penh in Ganzkörper-Bodyplethysmographie unter Metha-

cholin-Provokation

Es wird untersucht, wie sich die Atemwegshyperreaktivität im Zeitverlauf

nach Ende der Allergen-Exposition verhält. Der maximale Penh-Wert (abge-

leitet aus den oben beispielhaft dargestellten Messungen für den jeweils ent-

sprechenden Zeitpunkt), der die erzeugte Atemwegshyperreaktivität reprä-

sentiert, ist bis zur achten Woche nach letzter Exposition aufgezeigt (Abb.

23).

Der zu Beginn über den beiden Kurven der Kontrollgruppen liegende maxi-

male Penh-Wert der OVA-OVA-Gruppen beider Expositionsschemata fällt

über die Zeit ab und nähert sich damit den Werten der Kontrollgruppen an.

Zeitlicher Verlauf der Atemwegshyperreagibilitätunter Methacholinprovokation

48h 1 2 3 4 5 6 7 82.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0OVA-OVA, kurz

PBS-PBS, kurz

OVA-OVA, lang

PBS-PBS, lang

***

***

******###

**

Zeit in Wochen

maxim

ale

r P

en

h

Abb. 23: Zeitlicher Verlauf des maximalen Penh unter Provokation. Dargestellt: Mittelwert mit Standardfehler; ** p<0,01, *** p<0,001: OVA-OVA vs. Kontrollgruppe desselben Schemas; ### p<0,001: lang vs. kurz. n=8-78 pro Gruppe.

Im kurzen Expositionsschema ist der Unterschied der OVA-OVA-Gruppe zur

Kontrollgruppe nur 48 Stunden nach letzter Sensibilisierung signifikant.

53

Die lang behandelte OVA-OVA-Gruppe weist bis in die zweite Woche (und

erneut zum Messzeitpunkt nach vier Wochen) signifikant höhere maximale

Penh-Werte als die entsprechende Kontrolle auf.

Im Niveau liegen die Werte der OVA-OVA-Gruppe im langen Schema über

denen des kurzen Schemas (Tab. 6), signifikant ist diese Gruppendifferenz

jedoch nur am Messzeitpunkt nach 2 Wochen.

Tab. 6: Maximale Penh-Werte unter Methacholin-Provokation (Mittelwert ± Standardfehler)

Kurzes Schema Max. Penh Langes Schema Max. Penh

PBS-PBS 48 h 4,20 ± 0,14 PBS-PBS 48 h 3,95 ± 0,20

1 Woche 3,75 ± 0,16 1 Woche 3,86 ± 0,20

2 Wochen 3,72 ± 0,20 2 Wochen 4,25 ± 0,25

3 Wochen 4,40 ± 0,35 3 Wochen 4,06 ± 0,21

4 Wochen 4,24 ± 0,24 4 Wochen 3,85 ± 0,22

5 Wochen 3,21 ± 0,20 5 Wochen 3,97 ± 0,55

6 Wochen 3,20 ± 0,11 6 Wochen 3,43 ± 0,28

7 Wochen 3,61 ± 0,26 7 Wochen 3,50 ± 0,40

8 Wochen 3,62 ± 0,19 8 Wochen 4,41 ± 0,42

PBS-OVA 48 h 4,22 ± 0,15 PBS-OVA 48 h 5,28 ± 0,26

1 Woche 4,35 ± 0,23 1 Woche 5,19 ± 0,24

2 Wochen 4,11 ± 0,20 2 Wochen 5,18 ± 0,41

3 Wochen 3,59 ± 0,20 3 Wochen 4,55 ± 0,25

4 Wochen 3,83 ± 0,22 4 Wochen 4,88 ± 0,46

5 Wochen 3,42 ± 0,21 5 Wochen 3,98 ± 0,19

6 Wochen 2,94 ± 0,23 6 Wochen 3,75 ± 0,27

7 Wochen 3,53 ± 0,21 7 Wochen 3,58 ± 0,19

8 Wochen 3,38 ± 0,19 8 Wochen 3,78 ± 0,18

OVA-OVA 48 h 6,98 ± 0,35 OVA-OVA 48 h 7,30 ± 0,44

1 Woche 5,65 ± 0,59 1 Woche 6,63 ± 0,35

2 Wochen 4,87 ± 0,38 2 Wochen 6,37 ± 0,28

3 Wochen 4,81 ± 0,52 3 Wochen 5,09 ± 0,32

4 Wochen 4,29 ± 0,22 4 Wochen 4,66 ± 0,32

5 Wochen 3,68 ± 0,40 5 Wochen 4,15 ± 0,17

6 Wochen 3,90 ± 0,27 6 Wochen 4,02 ± 0,29

7 Wochen 4,09 ± 0,59 7 Wochen 4,75 ± 0,28

8 Wochen 3,97 ± 0,28 8 Wochen 4,48 ± 0,29

Die erzeugte Atemwegshyperreagibilität ist im langen OVA-OVA-Schema

ausgeprägter und persistierender als im kurzen Schema.

54

Die Kontrollgruppen untereinander unterscheiden sich nicht signifikant.

Die Lungenfunktion unter Methacholin-Provokation verändert sich bei den

ausschließlich intranasal behandelten Tieren weniger ausgeprägt:

Während im kurzen Schema keine signifikanten Unterschiede zur Kontroll-

gruppe entstehen, ist nach ausschließlich intranasaler, langer Allergen-Expo-

sition eine signifikante Änderung des maximalen Penh bis in die erste Woche

nach Ende der Exposition nachweisbar, jedoch ist zu beachten, dass für

beide PBS-OVA-Gruppen nach 48 Stunden auch ein signifikanter Unter-

schied zur entsprechenden OVA-OVA-Gruppe besteht (Abb. 24).

Zeitlicher Verlauf der Atemwegshyperreagibilitätunter Methacholinprovokation

48h 1 2 3 4 5 6 7 82.5

3.0

3.5

4.0

4.5

5.0

5.5

6.0

6.5

7.0

7.5

8.0OVA-OVA, kurz

PBS-OVA, kurz

PBS-PBS, kurz

OVA-OVA, lang

PBS-OVA, lang

PBS-PBS, lang

***

###

**

###

Zeit in Wochen

maxim

ale

r P

en

h

Abb. 24: Zeitlicher Verlauf des maximalen Penh unter Provokation mit PBS-OVA. Darge-stellt: Mittelwert mit Standardfehler; ** p<0,01, *** p<0,001: PBS-OVA, lang vs. Kontroll-gruppe; ### p<0,001: OVA-OVA vs. PBS-OVA. n=8-78 pro Gruppe.

Zwar liegen die Werte der lang behandelten PBS-OVA-Tiere tendenziell, zu-

mindest zu Beginn der Untersuchungen, über denen der Tiere des kurzen

Schemas (Tab. 6), jedoch zeigt sich kein signifikanter Gruppenunterschied.

Die ausschließlich intranasale Allergen-Exposition erweist sich als wenig ef-

fektiv zum Hervorrufen einer Atemwegshyperreagibilität: Nach kurzer Expo-

sition kann diese nicht nachgewiesen werden, nach langer Exposition nur

innerhalb der ersten 48 Stunden, und dies signifikant weniger ausgeprägt als

im kurzen und langen Schema der OVA-OVA-Exposition.

55

4.2.2 Basale Lungenfunktion ohne Provokation (Baseline-Penh-Werte)

Zusätzlich zur Messung des maximalen Penh unter Methacholin-Provokation

werden die Baseline-Penh-Werte ohne Provokation über einen Zeitraum von

acht Wochen nach letzter Allergen-Exposition gemessen.

In der OVA-OVA-Gruppe der kurz behandelten Versuchstiere findet sich ge-

genüber der Kontrollgruppe nur 48 Stunden nach letzter Exposition ein signi-

fikanter Unterschied der Baseline-Penh-Werte, während die Werte der lang

OVA-ausgesetzten Versuchstiere sich bis in die sechste Woche von der

Kontrollgruppe (mit einer Unterbrechung in Woche 5) und von der OVA-OVA-

Gruppe des kurzen Schemas unterscheiden (Tab. 7, Abb. 25).

Die Kurven der Kontrollgruppen unterscheiden sich nicht signifikant.

Zeitlicher Verlauf der basalen Lungenfunktion(ohne Provokation)

48h 1 2 3 4 5 6 7 8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5 OVA-OVA, kurz

PBS-PBS, kurz

OVA-OVA, lang

PBS-PBS, lang

***

***###

***###

**###

**###

***##

**##

###

Zeit in Wochen

Baselin

e-P

en

h

Abb. 25: Zeitlicher Verlauf des Baseline-Penh. Dargestellt: Mittelwert mit Standardfehler; ** p<0,01, *** p<0,001: OVA-OVA vs. Kontrollgruppe des gleichen Schemas; ## p<0,01, ### p<0,001: lang vs. kurz. n=12-78 pro Gruppe.

56

Tab. 7: Penh-Werte der basalen Lungenfunktion (Mittelwert ± Standardfehler)

Kurzes Schema Baseline-Penh-

Werte

Langes Schema Baseline-Penh-

Werte

PBS-PBS 48 h 1,16 ± 0,02 PBS-PBS 48 h 1,12 ± 0,01

1 Woche 1,12 ± 0,03 1 Woche 1,13 ± 0,02

2 Wochen 1,12 ± 0,03 2 Wochen 1,20 ± 0,02

3 Wochen 1,20 ± 0,05 3 Wochen 1,20 ± 0,02

4 Wochen 1,15 ± 0,03 4 Wochen 1,16 ± 0,02

5 Wochen 1,03 ± 0,04 5 Wochen 1,16 ± 0,05

6 Wochen 1,05 ± 0,03 6 Wochen 1,09 ± 0,03

7 Wochen 1,08 ± 0,06 7 Wochen 1,11 ± 0,06

8 Wochen 1,11 ± 0,03 8 Wochen 1,09 ± 0,13

PBS-OVA 48 h 1,22 ± 0,02 PBS-OVA 48 h 1,15 ± 0,02

1 Woche 1,08 ± 0,03 1 Woche 1,21 ± 0,02

2 Wochen 1,21 ± 0,03 2 Wochen 1,20 ± 0,02

3 Wochen 1,12 ± 0,05 3 Wochen 1,20 ± 0,03

4 Wochen 1,15 ± 0,03 4 Wochen 1,27 ± 0,03

5 Wochen 1,00 ± 0,03 5 Wochen 1,20 ± 0,07

6 Wochen 1,06 ± 0,02 6 Wochen 1,12 ± 0,04

7 Wochen 1,13 ± 0,04 7 Wochen 1,13 ± 0,08

8 Wochen 1,07 ± 0,03 8 Wochen 1,14 ± 0,12

OVA-OVA 48 h 1,27 ± 0,02 OVA-OVA 48 h 1,38 ± 0,02

1 Woche 1,15 ± 0,02 1 Woche 1,31 ± 0,03

2 Wochen 1,16 ± 0,03 2 Wochen 1,30 ± 0,03

3 Wochen 1,10 ± 0,03 3 Wochen 1,30 ± 0,03

4 Wochen 1,16 ± 0,04 4 Wochen 1,30 ± 0,03

5 Wochen 1,02 ± 0,02 5 Wochen 1,27 ± 0,07

6 Wochen 1,03 ± 0,04 6 Wochen 1,23 ± 0,03

7 Wochen 1,14 ± 0,03 7 Wochen 1,20 ± 0,07

8 Wochen 1,14 ± 0,03 8 Wochen 1,15 ± 0,09

Die Erhöhung der Baseline-Penh-Werte in der intraperitoneal und intranasal

im langen Schema behandelten Versuchsgruppe stellt eine über einen

Untersuchungszeitraum bis sechs Wochen andauernde Veränderung dar, die

diese Gruppe vom kurzen OVA-OVA-Schema unterscheidet. Durch die lange

Allergen-Exposition haben sich auf funktioneller Ebene längerfristige Ände-

rungen vollzogen.

In den PBS-OVA-Gruppen beider Expositionsschemata sind starke Schwan-

kungen der Baseline-Penh-Werte sichtbar (Tab. 7).

57

Signifikante Unterschiede finden sich zwischen der OVA-OVA-Gruppe des

langen Schemas zur entsprechenden PBS-OVA-Gruppe bis in die dritte Wo-

che. Im Übrigen zeigt sich zusammenfassend kein dauerhafter Effekt der

verlängerten intranasalen Allergen-Exposition hinsichtlich der Baseline-Penh-

Werte, die vereinzelten signifikanten Unterschiede zwischen langem und

kurzen PBS-OVA-Schema und zur Kontrollgruppe lassen sich eher auf Aus-

reißer nach oben oder unten (Abb. 26) zurückführen.

Zeitlicher Verlauf der basalen Lungenfunktion(ohne Provokation)

48h 1 2 3 4 5 6 7 8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

OVA-OVA, lang

PBS-PBS, lang

PBS-OVA, kurz

PBS-OVA, lang**++

###

##+++ ## ## ++

Zeit in Wochen

Baselin

e-P

en

h

Abb. 26: Zeitlicher Verlauf des Baseline-Penh mit PBS-OVA. Dargestellt: Mittelwert mit Standardfehler; ** p<0,01: PBS-OVA vs. Kontrollgruppe, lang; ## p<0,01, ### p<0,001: OVA-OVA vs. PBS-OVA, lang. ++ p<0,01, +++ p<0,001: PBS-OVA: kurz vs. lang. n=12-78 pro Gruppe.

Ähnlich den Ergebnissen der maximalen Penh-Werte nach Methacholin-Pro-

vokation führt die ausschließlich intranasale Allergen-Exposition - auch bei

verlängerter Expositionsphase - hinsichtlich der Baseline-Penh-Werte nicht

zu funktionellen Veränderungen, obwohl es mit verlängerter ausschließlich

i.n. Exposition zum Teil gelungen war, morphologische Veränderungen her-

beizuführen, die den Veränderungen beim Asthma bronchiale ähnelten (s.o.).

58

5. Diskussion

Die pathogenetischen Mechanismen, die an der Chronifizierung des Asthma

bronchiale beteiligt sind, sind noch wenig verstanden. Die zuletzt etablierten

Mausmodelle mit systemischer Allergen-Sensibilisierung und anschließender

längerfristiger Allergen-Exposition führen nicht nur zu einer Beeinträchtigung

der Lungenfunktion (ähnlich wie in den kürzeren Expositions-Schemata),

sondern auch zu Veränderungen, die das Remodeling der Atemwege wider-

spiegeln, einem typischen Charakteristikum chronischen Asthmas. Nur we-

nige dieser Studien untersuchten die Dauerhaftigkeit der Veränderungen

nach der Beendigung der Exposition, die Ergebnisse waren widersprüchlich

(Leigh, et al. 2002; McMillan and Lloyd 2004; Wegmann, et al. 2005). Unter

Benutzung eines Mausmodells mit systemischer Sensibilisierung werden nun

in dieser Arbeit die Konsequenzen einer kurzen und einer langen Allergen-

Exposition über acht Folgewochen unter Beobachtung der Lungenfunktion,

der Atemwegsentzündung und Charakteristika des Atemwegsremodelings

wie Becherzellhyperplasie und subepithelialer Fibrose verglichen. Durch

diese Beobachtungen kann eine Aussage zum weiteren spontanen Verlauf

der Veränderungen gemacht werden.

Darüber hinaus wird hier versucht, auf die systemische Sensibilisierung vor

der lokalen Antigen-Exposition zu verzichten, um dem „natürlichen“ Entste-

hungsweg des menschlichen Asthma bronchiale näher zu kommen.

5.1 Gegenüberstellung der histologischen Befunde des kurzen und

verlängerten Allergen-Expositionsschemas der systemisch und

bzw. ausschließlich lokal behandelten Gruppen

Die verschiedenen histologischen Untersuchungen weisen Unterschiede je

nach Dauer der durchgeführten Allergen-Exposition und je nach Durchfüh-

rung einer systemischen Sensibilisierung auf.

Während die Mäuse der Kontrollgruppen (PBS-PBS-Gruppen) keine mor-

phologischen Veränderungen in den drei untersuchten Bereichen (Entzün-

dung, Becherzellhyperplasie, peribronchiale Fibrose) zeigen, finden sich so-

59

wohl in den systemisch sensibilisierten und lokal Allergen-exponierten als

auch in den ausschließlich lokal exponierten Versuchstieren unterschiedliche

Anzeichen für die erfolgreiche Induktion asthmaähnlicher morphologischer

Veränderungen.

Im Gegensatz zu den i.p. und i.n. Ovalbumin ausgesetzten Versuchsgruppen

des kurzen Schemas, in denen lediglich eine peribronchiale Entzündungsre-

aktion sowie eine Becherzellhyperplasie von kürzerer Dauer und geringerer

Ausprägung stattfinden, lassen sich in den i.p. und i.n. behandelten Gruppen

des langen Schemas zusätzlich Charakteristika darstellen, die längerfristige

Veränderungen auf der Ebene der Bindegewebsvermehrung im Sinne eines

Remodelings belegen.

Die histologischen, funktionellen und immunologischen Mechanismen der

allergischen Atemwegsentzündung wurden bereits früher mit der Hilfe von

Mausmodellen des Asthma bronchiale untersucht. Auch in diesen Studien

wurde eine i.n. Antigen-Exposition an die systemische Sensibilisierung ange-

schlossen.

Den bereits etablierten Mausmodellen mit dem Versuch der Nachahmung

der Charakteristika des menschlichen Asthma bronchiale, die zunächst kurze

Allergen-Exposition benutzten, gelang morphologisch nur die Darstellung von

Entzündung und Becherzellhyperplasie (Inman, et al. 1999; Kung, et al.

1994; Temelkovski, et al. 1998) sowie zusammenfassend dargestellt in

(Kumar and Foster 2002).

Mit kurzen Expositionsschemata gelang nicht die Induktion weiterer Charak-

teristika des Remodelings des humanen Asthma bronchiale wie der peri-

bronchialen Fibrose, der Verdickung der retikulären Basalmembran oder der

Vermehrung der peribronchialen glatten Muskulatur. Damit fehlen diesen

Tiermodellen charakteristische Merkmale, wie sie beim chronischen Asthma

gesehen werden.

Jüngere Modelle mit langfristiger Allergen-Exposition zeigen jedoch durchaus

typische histologische Merkmale des Remodelings inklusive einer Induktion

von Bindegewebsvermehrung (Henderson, et al. 2006; Muz, et al. 2006;

Plant, et al. 2012) und vergleichen eine kurzfristige versus chronische Aller-

60

gen-Exposition zum Teil direkt, wobei sich das Versagen eines kurzen

Schemas bezüglich der Induktion struktureller Asthma-Veränderungen be-

stätigte (Plant, et al. 2012). Ebenso werden funktionelle Veränderungen be-

schrieben (McMillan and Lloyd 2004; Wong and Zhao 2008).

Bisher gibt es wenige veröffentlichte Daten zur Klärung der Frage der Per-

sistenz der induzierten morphologischen, funktionellen und immunologischen

Veränderungen nach Beendigung der Allergen-Expositionsphase mit differie-

renden Resultaten (Henderson, et al. 2006; Leigh, et al. 2002; McMillan and

Lloyd 2004; Wegmann, et al. 2005).

In dieser Arbeit wird ein Mausmodell verwendet, bei dem der systemischen

Sensibilisierung eine lokale Atemwegsexposition mit demselben Antigen an-

geschlossen wird. Letztere Allergen-Exposition wird in zwei verschiedenen

zeitlichen Schemata durchgeführt, einem kurzen zweiwöchigen Schema mit

zwei Expositionen und einem langen mit acht wöchentlichen Expositionen.

In der Gegenüberstellung der hier verwendeten Schemata zeigt sich das

oben geschilderte Phänomen ähnlich wie in den zahlenmäßig begrenzt vor-

handenen anderen veröffentlichten Arbeiten zu verlängerten Allergen-Expo-

sition: Nur die Versuchstiere des langen Expositionsprotokolls entwickeln

eine retikuläre und subepitheliale Bindegewebsvermehrung. Die Darstellung

des für das chronische Asthma bronchiale beim Menschen typischen Remo-

delings ist also den verlängerten Allergen-Expositionsschemata vorbehalten

und in diesem Punkt den früher etablierten und noch weit genutzten Model-

len überlegen hinsichtlich der Nähe zum menschlichen Asthma-Phänotyp.

Ein Grund für das Auftreten der chronischen das Remodeling widerspiegeln-

den Veränderung in den langen Schemata kann in der im Gegensatz zum

kurzen Sensibilisierungsprotokoll ebenfalls deutlicher persistierenden peri-

bronchialen Entzündung liegen, die bei den kurzfristig sensibilisierten Tieren

schneller in ihrer Ausprägung wieder abnimmt. Die Persistenz oder Ausprä-

gung der Atemwegsentzündung kann zum Beispiel zur verstärkten – und

verlängerten – Freisetzung bestimmter Zytokine führen, die eine

Fibroblastenaktivierung initiieren können (Koerner-Rettberg, et al. 2008;

Kumar, et al. 2003; Leigh, et al. 2004a). In einem Projektteil, der nicht Teil

dieser Arbeit war, wurden im langen Expositionsschema eine innerhalb der

TH2-Zytokine IL-5-dominierte prolongierte Zytokin-Antwort nachgewiesen,

61

unter Abschwächung der im kurzen Expositionsschema dominierenden kurz-

fristigen IL-13 Antwort (Koerner-Rettberg, et al. 2008). Zeitlich parallel zum

Auftreten der Fibrose (d.h. im langen Expositionsprotokoll mit zeitlicher La-

tenz und dann über Wochen auftretend) ist auch eine robuste Antwort des

pro-fibrotisch wirksamen TGF-ß in der BAL nachweisbar (Koerner-Rettberg,

et al. 2008); diese zeitliche Latenz lässt vermuten, dass die TGF-ß-mediierte

Fibrose im Rahmen eines Reparaturvorgangs der Entzündung auftritt.

Die Kinetik der Entzündung ist hiermit vereinbar: Entzündliche Veränderun-

gen sind in der Versuchsgruppe des langen Protokolls bis in die achte Wo-

che nachweisbar, in der kurz behandelten Gruppe ist sie schnell rückläufig.

Die peribronchiale Fibrose als zentraler Aspekt des Remodelings ist bei den

Versuchstieren der kurzen Allergen-Exposition zu keinem Zeitpunkt zu se-

hen, während sie in den verlängert mit Ovalbumin behandelten Mäusen ab

Woche 4 signifikant vorhanden ist und bis zur achten Woche sogar noch an-

steigt.

Bei eingehenderer Betrachtung der Art der Entzündungsreaktion fallen zu-

sätzliche Unterschiede zwischen den zeitlich verschiedenen Sensibilisie-

rungsschemata auf. Dies wurde im Rahmen weiterer Untersuchungen der

Arbeitsgruppe dargestellt (Koerner-Rettberg, et al. 2008):

Während im kurzen Sensibilisierungsschema ein eher eosinophil geprägtes

Zellbild imponiert, zeigen die Befunde der längerfristig sensibilisierten Ver-

suchstiere ein Mischbild aus lymphozytären, weniger eosinophilen Zellen.

Die verstärkte Entzündungsreaktion mit Lymphozytose geht auch mit einer

veränderten Zytokinfreisetzung einher (verstärkte und verlängerte IL-5-, ver-

ringerte IL-13-Reaktion; zum Teil Th1-Antwort mit IFN-γ-Synthese); es ist

daher zu folgern, dass die Quelle des IL-5 im langen Expositionsschema

nicht die eosinophilen Zellen sind.

Die Becherzellhyperplasie als ein weiteres Charakteristikum des Remode-

lings ist in den Gruppen des kurzen Schemas an Tag 3 ebenso deutlich wie

in den Gruppen des langen Schemas, allerdings ist bei den länger sensibili-

sierten Versuchstieren in der vierten Woche noch eine ausgeprägtere Be-

cherzellhyperplasie sichtbar. Bis zur achten Woche ist dieses Phänomen in

keiner der Versuchsgruppen mehr darstellbar, so dass es sich bei der Be-

62

cherzellhyperplasie offensichtlich um eine reversible Veränderung handelt,

die mit der Beendigung der Allergen-Exposition langsam wieder abklingt.

Dies stellt einen Unterschied zu den Befunden der bindegewebigen Verände-

rungen des Remodelings an der Basalmembran dar, die im langen Sensibili-

sierungsschema zumindest über die beobachteten 8 Wochen nicht in ihrer

Ausprägung zurückzugehen scheinen.

Die mit der peribronchialen Fibrose einhergehende Verdickung der Atem-

wegswandstrukturen und damit verbundene potentielle Verminderung der

Atemwegselastizität können ein Bindeglied zu den funktionellen Verände-

rungen mit Beeinträchtigung des Atemflusses und Erhöhung des Atemwegs-

widerstands darstellen, was jedoch in Anbetracht der beobachteten zeitlichen

Zusammenhänge zwischen Lungenfunktionsveränderungen und morphologi-

schen Veränderungen differenzierter betrachtet werden muss.

5.2 Gegenüberstellung der funktionellen Befunde des kurzen und ver-

längerten Allergen-Expositionsschemas der systemisch und bzw.

ausschließlich lokal behandelten Gruppen

Mit Hilfe serieller nicht-invasiver Messungen der Lungenfunktion können in

den OVA-OVA-behandelten Versuchsgruppen Erhöhungen des maximalen

Penh-Wertes – respektive des Atemwegswiderstands – unter Methacholin-

Provokation nachgewiesen werden, die in den Kontrollgruppen nicht vorhan-

den sind.

In der Gruppe des kurzen Allergen-Expositionsschemas zeigt sich diese

Penh-Erhöhung nur bei der ersten Messung nach 48 Stunden.

Demgegenüber findet sich in der OVA-OVA-Gruppe des langen Schemas

eine dauerhaftere Änderung der basalen Lungenfunktion als Maß für einen

erhöhten Atemwegswiderstand bei Messung ohne Methacholin-Provokation

mit signifikanter Erhöhung der Penh-Werte über einen Untersuchungszeit-

raum von sechs Wochen.

Die Beeinträchtigung der Lungenfunktion mit dauerhafter Einschränkung der

bronchialen Ventilation wird für eine der bedrohlichsten Folgen des schweren

Asthma bronchiale gehalten. Daher erscheint es von großer Bedeutung, Me-

63

chanismen zu identifizieren, die an der Entwicklung einer chronisch beein-

trächtigten Lungenfunktion beteiligt sind.

Im vorliegenden Modell ist die Atemwegshyperreagibilität nach Beendigung

der Exposition – wie schon zuvor beobachtet (McMillan and Lloyd 2004) –

nur kurzlebig. Kürzlich wurde gezeigt, dass die Atemwegshyperreagibilität

anhaltend, ja sogar fortschreitend war, so lange längere Allergen-Expositio-

nen weitergeführt wurden (Corbel, et al. 2003; Wegmann, et al. 2005). Den-

noch, eine anhaltende Atemwegshyperreagibilität während einer achtwöchi-

gen Beobachtungsphase nach Ende prolongierter Allergen-Exposition wurde

nur in einem Modell dokumentiert, in dem der pulmonale Widerstand bei an-

ästhesierten und beatmeten Mäusen unter intravenöser Methacholin-Provo-

kation untersucht wurde (Leigh, et al. 2002).

Die Atemwegshyperreagibilität scheint also, wie in der Mehrzahl der veröf-

fentlichten Daten, eine Erscheinung zu sein, die vom Vorhandensein eines

Allergenkontaktes abhängt und nach Beseitigung desselben nicht anhaltend

ist.

In dieser Arbeit beobachten wir in den Protokollen mit systemischer Sensibi-

lisierung zusätzlich zur Atemwegshyperreagibilität Anstiege der Baseline-

Penh-Werte in Abwesenheit von Methacholin-Provokationen, die bereits früh

sowohl nach kurzer wie auch nach langer Ovalbumin-Exposition auftreten.

Diese Anstiege bilden sich bei den Versuchstieren des kurzen Schemas

rasch zurück, während sie nach langem Expositionsschema über sechs Wo-

chen anhalten. Solche Anstiege des Baseline-Penh, die eine erhöhte res-

piratorische Anstrengung widerspiegeln, wurden zuvor als kurzlebige, asth-

matische Spätantworten bei Mäusen beschrieben, die innerhalb von Stunden

nach der Exposition auftraten (Cieslewicz, et al. 1999). Unter Messung des

mittleren exspiratorischen Luftstroms in nicht-methacholin-provozierten Mäu-

sen wurde eine Veränderung der Baseline-Lungenfunktion unter andauern-

der (Wegmann, et al. 2005), nicht aber nach Beendigung der Exposition –

wie in der vorliegenden Untersuchung – gezeigt.

Damit kann mit diesem Protokoll an Mäusen eine asthmatypische langan-

haltende Lungenfunktionsveränderung induziert werden, und – im Mausmo-

dell – eine wesentliche Bedingung hierfür herausgearbeitet werden, nämlich

64

die Kombination aus systemischer Sensibilisierung und (langfristiger) Aller-

gen-Exposition, ggf. über den Mechanismus einer Mindest-Schwere der

bronchialen Entzündung. Dieses deckt sich mit dem Wissen, dass beim

menschlichen Asthma eine rezidivierende Allergen-Exposition für die Aus-

prägung des klinischen Bildes und der pathophysiologischen Veränderungen

wichtig ist, und liefert so ein Mausmodell, welches diese Charakteristika op-

timiert abbildet und sich daher für weiterführende Interventionsuntersuchun-

gen, zum Beispiel durch immunologische Vorbehandlung der Mäuse, eignet.

5.3 Mögliche Zusammenhänge zwischen morphologischen und

funktionellen Veränderungen der systemisch und lokal behandel-

ten Gruppen

Anstiege der Kollagenablagerung in den Atemwegswänden wurden bisher

als ein wahrscheinlicher zur chronischen Lungenfunktionsminderung beitra-

gender Faktor betrachtet. Diese Annahme resultiert aus dem gleichsinnigen

Auftreten von Atemwegsremodeling und Atemwegshyperreagibilität mit indu-

zierbarer Obstruktion beim Asthma bronchiale und der Beobachtung, dass

gerade schwere Asthmaverläufe mit chronischer Lungenfunktionseinbuße

eine signifikante Fibrose aufweisen (Bento and Hershenson 1998; Kaminska,

et al. 2009; Vignola, et al. 2003). Die Überlegung eines Zusammenhangs

zwischen Remodeling und funktionellen Veränderungen wird im Mausmodell

gestützt durch den Bericht eines murinen chronischen Asthmamodells, in

dem die Depletion von T-Zellen (definiert als CD4+/ CD8+ T-Zellen) die

Atemwegshyperreagibilität nicht aufhob (Leigh, et al. 2004b). Die Autoren

nahmen an, dass die Atemwegshyperreagibilität bei chronischer Allergen-

Exposition eher eine Folge des Remodelings mit Verengung der Atemwege

denn eine Folge der zellulären Entzündungsantwort sei.

Neuere Untersuchungen beziehen eine andere Zellart als maßgeblich für das

Aufrechterhalten der Atemwegshyperreagibilität mit ein, die invarianten na-

türlichen Killer-T-Zellen (invariant natural killer T cells (iNK T cells))

(Matsuda, et al. 2010; Pichavant, et al. 2009), wobei es hier noch zum Teil

widersprüchliche Ergebnisse gibt, die eine Rolle dieses Zelltyps eher in der

akuten, denn in der chronischen Modellerkrankung sehen (Koh, et al. 2010).

65

Unter Blockade typischer Th2-assoziierter Zytokine (IL-4, IL-25) konnte in

einem Mausmodell gezeigt werden, dass Entzündung und Remodeling unter-

drückt werden (Siegle, et al. 2011).

Auch humane in-vitro Daten stützen die Hypothese der Allergen-spezifischen

Th2- (geringer auch Th1-) Antwort, die durch IL-10 produzierende T-Zellen

anti-inflammatorisch beeinflusst werden kann (Faith, et al. 2012).

Zelluläre Entzündungsmechanismen bleiben also weiterhin in der Diskussion

hinsichtlich einer Beeinflussung der bronchialen Hyperreagibilität und dauer-

hafter Lungenfunktionsminderung.

In der hier vorgelegten Arbeit fällt bei der Untersuchung der zeitlichen Zu-

sammenhänge zwischen den Veränderungen der Lungenfunktion und der

Kollagenablagerung auf, dass sowohl die Atemwegshyperreagibilität als auch

die reduzierte Baseline-Lungenfunktion bereits vor der Manifestation der

peribronchialen Fibrose nachzuweisen sind und sich dann trotz des Weiter-

bestehens der Fibrose rückbilden. Dies weist darauf hin, dass die beobach-

teten längerfristigen Lungenfunktionsveränderungen weder vom Vorhanden-

sein der peribronchialen Fibrose abhängen, noch letztere zwingend in Ver-

änderungen der Lungenfunktion mündet.

Dadurch wirft sich die Frage auf, ob die subepitheliale Fibrose der Atem-

wegswände irrelevant in Bezug auf die Lungenfunktionseinschränkung ist,

oder ob diese Fibrose sogar möglicherweise einen protektiven Mechanismus

beim Asthma darstellt, der mehr einen Beitrag zur Atemwegsstabilität als zur

Atemflusslimitierung leistet.

Das beobachtete Remodeling ist sicher keine Bedingung für das Auftreten

einer Atemwegshyperreagibilität, jedoch könnte es eine Voraussetzung für

späte oder persistierende, mitunter diskretere funktionelle Veränderungen

sein.

Die klinische Bedeutung der subepithelialen Fibrose beim menschlichen

Asthma ist noch nicht klar, ebenso wenig die möglichen medikamentösen

Strategien zur Verhinderung der Entwicklung der subepithelialen Fibrose

zum Beispiel durch antientzündliche Therapien.

Untersuchungen am Menschen belegen, dass Remodeling-Vorgänge noch

nicht bei betroffenen jungen Kleinkindern, wohl aber im weiteren Verlauf des

66

Kleinkindalters und bei Schulkindern und Erwachsenen vorhanden sind, und

eine Verdickung der Basalmembran – die ein ähnliches, jedoch nicht gleich-

zusetzendes Phänomen des Remodelings wie die peribronchiale Fibrose

darstellt – wahrscheinlich in der Vorschulphase eintreten (Saglani, et al.

2007).

In diesem Zusammenhang ist auch die differenziertere Betrachtung der Ent-

zündungstypen des menschlichen Asthma bronchiale – ob im Kindes- oder

im Erwachsenenalter – relevant. Die frühen Remodeling-Veränderungen

zeigten sich bei Kindern mit eher eosinophilem Entzündungstyp (Saglani, et

al. 2005; Saglani, et al. 2007). Beim Erwachsenen werden eosinophile,

neutrophile, gemischt-granulozytäre und paucigranulozytäre Entzündungs-

muster unterschieden, gerade bei der Betrachtung möglicher therapeutischer

Konsequenzen wird diese Einteilung als wichtig dargestellt, da sie mit unter-

schiedlichem Ansprechen zum Beispiel auf Kortikosteroide assoziiert ist

(Gibson 2009).

Beim hier dargestellten Asthma-Mausmodell fällt in den Untersuchungen

hinsichtlich der zellulären Entzündung auf, dass die kurzfristige Antigen-Ex-

position eher zu einer eosinophil-geprägten Entzündungsreaktion führt, wäh-

rend die verlängerte Exposition eine Verschiebung zu einem lymphozytär-

geprägten Zellbild mit moderater Eosinophilie bewirkt, mit entsprechend diffe-

rierenden Zytokinantworten (Koerner-Rettberg, et al. 2008). Im vorliegenden

Mausmodell ist somit eher das lymphozytäre und weniger eosinophile Ent-

zündungsmuster mit Vorgängen des Remodelings vergesellschaftet. Eine

signifikante neutrophile Entzündung, wie sie insbesondere bei Formen des

menschlichen schweren Asthmas im Erwachsenenalter beschrieben ist, ließ

sich in diesem Modell nicht induzieren, und war nicht Grundlage des Remo-

delings. Das vorgestellte Mausmodell bietet somit die Möglichkeit zum Mo-

dellieren distinkter Asthma-Phänotypen.

Dies kann helfen, mögliche verursachende Mechanismen, die für chronische

Funktions- und Strukturveränderungen des Asthmas verantwortlich sind, auf-

zudecken. Des Weiteren kann dieses Mausmodell chronischer asthmaähnli-

cher Atemwegsentzündung für weitere Interventionsstudien genutzt werden.

So ist dieses Mausmodell in modifizierter Form bereits zur Untersuchung

eines positiven Einflusses von inhalativ angewendeten Stallmist-Extrakten

67

auf die bronchiale Hyperreagibilität und Atemwegsentzündung weiter genutzt

worden (Peters, et al. 2006).

Das aktuelle Mausmodell chronischen Asthmas ist eine Bereicherung, ver-

schiedene menschliche Asthma-Phänotypen abbilden zu können und je nach

Fragestellung (wie akut entzündlicher Phase oder chronisch mit Remodeling

einhergehender Phase) eines der Expositionsschemata gezielt anzuwenden.

Mindestens machen diese Untersuchungen aber deutlich, dass die vorhan-

denen bzw. publizierten Asthma-Mausmodelle sorgfältig unterschieden wer-

den müssen, da leichte Veränderungen der Protokolle signifikante Unter-

schiede in induziertem Entzündungsphänotyp und der Ausprägung struktu-

reller Veränderungen bedingen können.

Sicher ist eine direkte Übertragung von experimentellen Befunden auf den

Menschen nicht möglich, murine experimentelle Versuchsansätze wie der

vorliegende können aber dazu beitragen, im Rahmen von experimentellen

Interventionen Rolle und Beeinflussbarkeit der subepithelialen Fibrose und

verschiedener Entzündungstypen zu charakterisieren.

Die Becherzellhyperplasie – ein weiterer Bestandteil des Atemwegsremode-

lings – entwickelt sich bereits während der i.n. Exposition und mag so eine

Rolle bei den frühen Lungenfunktionsveränderungen spielen. Die Atem-

wegshyperreagibilität bildet sich jedoch bereits zurück, während die Becher-

zellhyperplasie noch immer vorhanden ist. Dies suggeriert, dass die Über-

produktion von Schleim nicht notwendigerweise in einer Atemwegshyperrea-

gibilität resultiert, jedoch zeitlich am ehesten mit den baseline Penh-Verände-

rungen, d.h. dem Maß der Atemanstrengung korreliert.

Die fehlende zeitliche Korrelation der Atemwegshyperreagibilität ist auch aus

anderen Untersuchungen plausibel, da bekannt ist, dass die Atemwegshy-

perreabilität auf einer kurzfristigen Aktivierung von Mastzellen und der Akti-

vierung von invarianten natürlichen Killer-T-Zellen mit humoraler Antwort be-

ruht (Siddiqui, et al. 2008).

Interessanterweise halten Becherzellhyperplasie und die Veränderungen der

Baseline-Lungenfunktion in etwa gleich lange an und bilden sich in etwa der

gleichen Zeit zwischen vier und acht Wochen nach dem langen Sensibilisie-

68

rungsschema zurück, was eine möglicherweise vorliegende Verbindung bei-

der Veränderungen andeuten könnte.

5.4 Effekt der systemischen Ovalbumin-Sensibilisierung

Es wurde dargestellt, dass eine rein lokale i.n. Allergen-Exposition ohne vor-

hergehende intraperitoneale Sensibilisierung morphologische Veränderun-

gen herbeiführen kann, es jedoch im kurzen wie im verlängerten Expositi-

onsprotokoll kaum gelingt, vergleichbare funktionelle Veränderungen zu in-

duzieren. Dies gilt sowohl für die bronchiale Hyperreagibilität als auch für die

basale Lungenfunktion im Sinne einer Veränderung des Atemwegswider-

stands.

Hinsichtlich der morphologischen Charakteristika ist zu beachten, dass die

Vorgänge der Entzündung und Becherzellhyperplasie in beiden zeitlichen

Schemata sowohl von geringerer Ausprägung sowie verringerter zeitlicher

Persistenz sind und sich eine peribronchiale Fibrose im langen Schema mit

einer verlängerten zeitlichen Latenz im Vergleich zur systemisch vorbehan-

delten Gruppe ausbildet. Insbesondere in diesem letzten Teil der morpholo-

gischen Untersuchung erweist sich das rein lokale Expositionsschema auch

als weniger stabil in seinen Ergebnissen.

Neben fehlenden funktionellen Veränderungen als maßgeblichem Endpunkt

muriner Asthma-Modelle offenbart sich in der weniger stabilen Ausprägung

morphologischer Charakteristika eine weitere Schwäche des Versuchsansat-

zes ohne systemische Sensibilisierung.

Die systemische Vorbehandlung mit dem Antigen ist ein artifizieller Vorgang,

der sich nicht beim menschlichen Asthma findet. Die Tatsache, dass er im

Mausmodell jedoch notwendig zur Erzielung längerfristiger asthmaähnlicher

Veränderungen ist, scheint zunächst die Anwendbarkeit des Mausmodells für

die Forschung zu Asthma bronchiale einzuschränken.

Die Ursache wird in dem nicht natürlicherweise bei der Maus vorkommenden

Asthma bronchiale liegen. Offensichtlich wird ohne systemisch induzierte

Allergisierung keine ausreichende immunologische Reaktion auf das Antigen

OVA in der Maus induziert.

69

Nicht veröffentlichte Daten aus unserer Arbeitsgruppe zeigen, dass die IL-13-

und IL-5-Antwort ohne systemische OVA-Sensibilisierung gering ausfiel, was

ein Hinweis darauf sein könnte, dass eine T-zellulär vermittelte Immunant-

wort wichtig für die Induktion der asthmatypischen Veränderungen ist

(Agrawal and Shao 2010; Kaiko and Foster 2011; Leigh, et al. 2004a; Lloyd

and Hessel 2010; Siegle, et al. 2011). Allerdings wird IL-13 auch von ande-

ren Zellen als T-Zellen in der Lunge sezerniert.

Es gibt andere Tierspezies, die auch natürlicherweise ein Asthma bronchiale

ausbilden (zum Beispiel Katzen, Pferde), jedoch eignen sich diese aus meh-

reren Gründen nicht gut zur Grundlagenforschung an immunologischen Me-

chanismen des Asthma bronchiale.

Wie zuvor geschildert (siehe Einleitung) bietet die Anwendung eines Maus-

modells aufgrund verschiedener Aspekte eine praktikable Möglichkeit hierzu,

da immunologische Werkzeuge wie Antikörper vorhanden sind und die Hal-

tung der Versuchstiere wenig aufwändig ist.

Daher erscheint es sinnvoll, für bestimmte Fragestellungen der Grundlagen-

forschung, insbesondere immunologischer Art, sich des Asthma-Mausmo-

dells zu bedienen, was auch weiterhin geschieht (Peters, et al. 2006), zuletzt

auch unter Anwendung medikamentöser Therapieansätze (Cowden, et al.

2010) sowie unter der Hypothese einer Toleranzentwicklung durch pränatale

Allergen-Exposition mit konsekutiver Ausbildung regulatorischer T-Zellen

(Gerhold, et al. 2012).

70

6. Zusammenfassung

Die genauen Mechanismen der Chronifizierung beim menschlichen Asthma

bronchiale sind noch immer ungeklärt. Wie in anderen Bereichen haben sich

Tiermodelle als sinnvoll erwiesen, um Hypothesen zu pathophysiologischen

Krankheitsaspekten zu generieren und zu überprüfen.

Hierzu eignen sich aufgrund von Vorteilen der Verfügbarkeit immunologi-

scher Werkzeuge und praktikablen Tierhaltung Mausmodelle, obwohl die

Maus natürlicherweise kein Asthma bronchiale entwickelt. Um asthmatypi-

sche Veränderungen in der Maus herbeizuführen ist eine systemische Aller-

gen-Sensibilisierung der Tiere notwendig.

In früheren Modellen konnten mittels kurzfristiger Allergen-Exposition nach

systemischer Sensibilisierung kurz vorhaltende asthmatypische entzündliche

Veränderungen, Becherzellhyperplasie und Lungenfunktionseinschränkun-

gen herbeigeführt werden. Jüngere Modelle versuchen, mit prolongierter Al-

lergen-Exposition weitere Eigenschaften, insbesondere länger anhaltende

und für ein chronisches Asthma charakteristische Veränderungen in Funktion

und Morphologie im Sinne des Remodelings zu induzieren. Neben einem

definierten Entzündungssphänotyp und Becherzellhyperplasie zählen hierzu

die Verdickung der Basalmembran, die Vermehrung glattmuskulärer Struktu-

ren und die peribronchiale Fibrose.

Das Überdauern struktureller, funktioneller und immunologischer Verände-

rungen nach Beendigung der Allergen-Exposition wurde hierbei jedoch nur in

wenigen Studien mit widersprüchlichen Ergebnissen untersucht.

Im vorliegenden Modell werden daher zur Induktion asthma-ähnlicher Verän-

derungen ein kurzes und ein verlängertes Ovalbumin-Expositionsschema

verwendet. Darüber hinaus wird versucht, auf eine systemische Sensibilisie-

rung zu verzichten, um der „natürlichen“ Genese des menschlichen Asthma

bronchiale näherzukommen.

Eine Nachbeobachtung erfolgt über acht Wochen nach Beendigung der Al-

lergen-Exposition.

Nach systemischer Sensibilisierung und langer intranasaler Allergen-Exposi-

tion zeigen sich prolongiert funktionelle Veränderungen mit Atemwegshyper-

71

reagibilität über zwei Wochen und reduzierter Baseline-Lungenfunktion über

sechs Wochen nach Expositionsende, die nach kurzer Allergen-Exposition

nur über 48 Stunden nachweisbar sind.

Morphologisch gelingt es, Entzündung, Becherzellhyperplasie und peribron-

chiale Fibrose mit den verschiedenen Expositionsprotokollen unterschiedlich

stark und überdauernd auszulösen.

Eine peribronchiale Fibrose lässt sich nur mittels langdauernder Allergen-Ex-

position induzieren. Diese erscheint nach Auftreten der Lungenfunktionsän-

derungen, überdauert diese aber. Darüber hinaus führt die lange Exposition

zu einem längeren und ausgeprägteren Anhalten der Atemwegsentzündung

und Becherzellhyperplasie bis in die achte bzw. vierte Woche im Vergleich

zum kurzen Schema.

Die morphologischen Charakteristika der Entzündung und in geringerem

Maße auch der Becherzellhyperplasie zeigen sich der Länge der Allergen-

Exposition gegenüber also robuster als die peribronchiale Fibrose.

Eine mögliche Erklärung kann in einer unterschiedlichen Zytokinantwort lie-

gen: Eine lange Allergen-Exposition geht anders als eine kurze Exposition

mit einer ausgeprägten und prolongierten Expression des pro-fibrotisch wir-

kenden TGF-ß einher; eine prolongierte IL-5-Antwort dominiert hier gegen-

über einer kurzfristigen IL-13-Antwort bei kurzer Exposition.

Durch die ausschließlich intranasale Allergen-Exposition gelingt es im kurzen

Schema, gering ausgeprägte, kurz andauernde entzündliche Veränderungen

und Becherzellhyperplasie herbeizuführen, während das lange Expositions-

schema diese bis in die vierte Woche erzeugen kann. Peribronchiale Fibrose

entsteht, vergleichbar zu den systemisch sensibilisierten Tieren, nur nach

verlängerter Allergen-Exposition. Außerdem lassen sich zwar eine kurzle-

bige, abgeschwächte und nur nach langer Exposition auftretende Atem-

wegshyperreagibilität induzieren, jedoch keine Veränderungen der basalen

Lungenfunktion.

Die systemische Sensibilisierung scheint somit einen besonders starken Ein-

fluss auf die Induzierbarkeit funktioneller Veränderungen zu haben.

Auf Mediator-Ebene zeigt sich, dass rein lokale Antigen-Exposition nur

marginale Zytokin-Antworten induzieren. Daher kann vermutet werden, dass

eine robuste T-zellulär vermittelte Immunreaktion unabdingbar für die Induk-

72

tion vollständiger, auch funktionell nachweisbarer asthmatypischer Verände-

rungen ist.

Nach systemischer Sensibilisierung und lokaler Exposition nach prolongier-

tem Protokoll scheinen sich dauerhafte Lungenfunktionsänderungen unab-

hängig von der andauernden peribronchialen Fibrose zu entwickeln und wie-

der zurückzugehen. In dem zweiten Versuchsansatz, der verlängerten, aber

ausschließlich lokalen Antigen-Exposition, zeigt sich die Bindegewebsver-

mehrung recht ähnlich, ohne dass es gelingt, längerfristige Funktionsein-

schränkungen nachzuweisen. Zeitlich und mechanistisch scheinen funktio-

nelle Veränderungen so enger mit der Atemwegsentzündung und der Be-

cherzellhyperplasie in Verbindung zu stehen.

Die Unterschiede der Dauer, aber auch des Typs der Atemwegsentzündung

zwischen dem kurzen und langen Expositionsschema sind ein Hinweis auf

unterschiedliche lokale Entzündungsvorgänge und übergeordnete Immun-

mechanismen, die ebenfalls Inhalt von Untersuchungen der Arbeitsgruppe

waren: Eine Verschiebung vom eosinophilen Entzündungsmuster zu einem

lymphozytären, weniger eosinophilen Zellbild in der bronchioalveolären La-

vage, und eine prolongierte IL-5- und TGF-ß1-Freisetzung konnten nach-

gewiesen werden. Es deuten sich somit in der Anwendung zeitlich verschie-

dener Expositionsschemata Parallelen zu den menschlichen Entzündungs-

phänotypen des allergischen Asthma bronchiale an.

Diese Untersuchung belegt daher, dass die Art der in tierexperimentellen

Untersuchungen zum Asthma bronchiale genutzten Allergen-Expositions-

schemata von großer Relevanz für die Übertragbarkeit auf pathophysiologi-

sche Zusammenhänge beim Menschen ist. Die genaue Kenntnis der

induzierbaren Phänotypen und deren Voraussetzungen ist eine Bedingung

für die zukünftige Nutzung solcher Tiermodelle für interventionelle Studien.

.

73

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Danksagung

Herrn Prof. Dr. med. E. Hamelmann danke ich für die Betreuung der Arbeit

und seine fachliche wie wissenschaftlich-methodische Unterstützung.

Frau Dr. med. C. Koerner-Rettberg danke ich für die kontinuierliche

praktische Betreuung dieser Arbeit und ihre ausdauernde Nachbetreuung bei

der Durchsicht der Arbeit.

Herrn PD Dr. med. J. Schwarze danke ich für die initiale Betreuung der Arbeit

und die Möglichkeit der Sammlung erster Erfahrungen in der Laborarbeit in

seiner damaligen Londoner Arbeitsgruppe.

Frau S. Doths danke ich für ihre Unterstützung bei der

Versuchsdurchführung und für die Betreuung der Versuchstiere.

Herrn Dr. rer. nat. T. Holland-Letz danke ich für Rat und Hilfe bezüglich der

Biometrie und statistischen Auswertung.

Meiner Familie, meinem Verlobten Herrn Dr. med. S. Salmen und meinen

Freunden, insbesondere meinem langjährigen Freund Herrn B. Evelt danke

ich für die stetige Motivation, Vorschlägen der Korrektur und ausdauernde

Unterstützung bei und neben der Arbeit.

Curriculum vitae

Name, Vorname: Stroet, Anke

Geburtsdatum/-ort: 09. Juni 1982 in Neuenkirchen

Beruflicher Werdegang:

Position: Seit: Bis: Institution:

Assistenzärztin (Facharztausbildung)

2007 heute Abteilung für Neurologie Direktor Professor Dr. med. Ralf Gold St. Josef-Hospital Ruhr-Universität Bochum Gudrunstr. 56 44791 Bochum

Erfahrung in klinischen Studien:

Sub-Investigator in mehreren Phase-III-Studien, einer Phase-II-Studie und mehreren Beobachtungsstudien auf dem Gebiet der Multiplen Sklerose Zertifikate:

Datum:

GCP-Kurs EDSS-Zertifikat Pharmakovigilanz-Schulung

01. Juli 2009 10. Juli 2009 19. Januar 2012

Besonderheiten und Auszeichnungen: Jahr:

Winckler-Preis der Stadt Rheine für besondere schulische Leistungen Stipendiatin der Studienstiftung des deutschen Volkes

2001 2001 bis 2007

Publikationen:

- Koerner-Rettberg C, Doths S, Stroet A, Schwarze J. Reduced Lung Function in a Chronic Asthma Model Is Associated with Prolonged Inflammation, but In-dependent of Peribronchial Fibrosis. PLoS One 2008 Feb 6;3(2):e1575.

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- Meyer C, Ansorge N, Siglienti I, Salmen S, Stroet A, Nückel H, Dührsen U, Ritter PR, Schmidt WE, Gold R, Chan A. Mitoxantron-assoziierte akute Leukä-mie bei Multipler Sklerose - Fallbericht und praktisches Vorgehen bei unklaren Zytopenien. Nervenarzt 2010 Dec; 81(12):1483-9.

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Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef ... · rakteristika der Pathophysiologie und vor allem der Immunologie können aber modelliert und diese Modelle zur Hypothesengenerierung