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Aus der Poliklinik für zahnärztliche Prothetik, Alterszahnheilkunde und medizinische
Werkstoffkunde
(Direktor: Univ.- Prof. Dr. Reiner Biffar)
der Universitätsmedizin der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Thema:
"Untersuchung von Vorläuferzellen in Abhängigkeit von dekorierten, sowie nicht dekorierten
Implantatoberflächen als Wachstumsunterlage“
Inaugural - Dissertation
zur
Erlangung des akademischen
Grades
Doktor der Wissenschaften in der Medizin
(Dr. rer. med.)
der
Universitätsmedizin
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2013
vorgelegt von:
Michael, Hentschel
geb. am: 03.06.1980
in: Wolgast
II
Dekan: Prof. Dr. Reiner Biffar
1. Gutachter: Prof. Dr. Reiner Biffar
2. Gutachter: Prof. Dr. Dr. Jörg Handschel
3. Gutachter: Prof. Dr.-Ing. Wilhelm Michels
Ort, Raum: Greifswald, Hörsaal ZA0.44
Tag der Disputation: 23.04.2014
III
Für Wenke
IV
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ........................................................................................................................... 1
2 Darstellung in der Literatur ................................................................................................ 2
2.1 Biokompatibilität von Implantatmaterialien ................................................................ 2
2.2 Eigenschaften und klinische Relevanz von Implantatmaterialien ............................... 4
2.2.1 Titan ..................................................................................................................... 4
2.2.2 Calciumphosphate ................................................................................................ 7
2.2.3 Wollastonite ......................................................................................................... 8
2.3 Herstellung der Oberflächenmodifikationen von Titanimplantaten ............................ 9
2.3.1 SLA Oberflächen ................................................................................................ 10
2.3.2 Beschichten durch elektrochemisches Abscheiden ............................................ 11
2.3.3 Beschichten mit VPS .......................................................................................... 12
2.4 Messgrößen zur Bestimmung von Oberflächeneigenschaften .................................. 12
2.4.1 Arithmetischer Mittenrauhwert Ra ..................................................................... 12
2.4.2 Maximale Rauhtiefe Rmax ................................................................................. 13
2.4.3 Einteilung in Bereiche der Rauigkeit für medizinische Zwecke ........................ 13
2.5 Testung der Biokompatibilität von Implantatoberflächen ......................................... 14
2.5.1 Zell- Materialinteraktion .................................................................................... 14
2.5.2 Einflussfaktor der Implantatoberfläche .............................................................. 15
2.5.3 Unrestringierte, somatische Stammzellen (USSC) ............................................ 16
2.5.4 Osteogene Vordifferenzierung der USSCs......................................................... 17
2.5.5 Differenzierungsverlauf osteoblastärer Zellen ................................................... 17
2.5.6 Knochen ............................................................................................................. 19
2.6 Fragestellung der vorliegenden Arbeit ...................................................................... 20
3 Material und Methode ...................................................................................................... 21
3.1 Geräte ......................................................................................................................... 21
3.2 Verbrauchsmaterialien ............................................................................................... 22
3.3 Chemikalien ............................................................................................................... 23
V
3.4 Medien ....................................................................................................................... 23
3.4.1 Zellkulturmedium ............................................................................................... 23
3.4.2 DAG ................................................................................................................... 24
3.5 Verwendete Kits ........................................................................................................ 24
3.6 Probenkörper ............................................................................................................. 24
3.6.1 Bonit-Oberflächendekoration ............................................................................. 25
3.6.2 CaSi-Oberflächendekoration .............................................................................. 25
3.6.3 DUOTex-Oberfläche .......................................................................................... 25
3.6.4 Sterilisieren der Probenkörper ............................................................................ 26
3.6.5 Vorbehandeln der Probenkörper mit Nährmedium ............................................ 26
3.7 Berechnungen der Zellzahlen und Probenkörper ...................................................... 27
3.8 Oberflächentestung .................................................................................................... 28
3.8.1 AFM (Atomic-Force-Microscope) ..................................................................... 28
3.8.2 Abgabe von Ca2+ Ionen ...................................................................................... 29
3.9 Zellen ......................................................................................................................... 31
3.10 Zellbiologische Methoden ..................................................................................... 31
3.10.1 Herstellung Nährmedium ................................................................................... 31
3.10.2 Zellkultur ............................................................................................................ 31
3.10.3 Passagieren ......................................................................................................... 32
3.10.4 Kryokonservierung ............................................................................................. 33
3.10.5 Vordifferenzieren der USSC .............................................................................. 33
3.10.6 Aufbringen der Zellen auf die Prüfkörper .......................................................... 33
3.10.7 Umsetzen der Probenköper ................................................................................ 34
3.10.8 Mediumwechsel ................................................................................................. 34
3.11 Testung der Biokompatibilität ............................................................................... 35
3.11.1 Bestimmung der Zellzahlen................................................................................ 35
3.12 Morphologie Zelle und Oberfläche ........................................................................ 36
3.12.1 Rasterelektronenmikroskopie ............................................................................. 36
VI
3.13 Statistische Methoden ............................................................................................ 38
4 Ergebnisse ........................................................................................................................ 39
4.1 Oberflächentestung .................................................................................................... 39
4.1.1 Morphologie ....................................................................................................... 39
4.1.2 Strukturierung im Nanometerbereich ................................................................. 40
4.1.3 Abbau der Bonit Oberflächendekoration ........................................................... 42
4.1.4 Rauheit der Oberflächen ..................................................................................... 43
4.1.5 Ca2+Abgabe ........................................................................................................ 44
4.2 Biokompatibilität ....................................................................................................... 45
4.2.1 Zellzahlen USSC ................................................................................................ 45
4.2.2 Zellzahlen USSC auf Oberflächen mit geänderter initialer Rauigkeit ............... 52
4.2.3 Prozentuale Zellzahlen USSC nach 24 h ............................................................ 54
4.2.4 Zellzahlen USSC, 24 h und 7 Tage bezogen auf die Oberflächenrauigkeit ....... 56
4.2.5 Oberflächenkontakt und Morphologie ............................................................... 59
5 Diskussion ........................................................................................................................ 65
6 Zusammenfassung ............................................................................................................ 80
7 Anhang ............................................................................................................................. 82
7.1 Abbildungsverzeichnis .............................................................................................. 82
7.2 Literaturverzeichnis ................................................................................................... 85
7.3 Danksagung ............................................................................................................... 93
VII
Abkürzungen
°C Grad Celsius
µl Mikroliter
µm Mikrometer
µM Mikromol
AFM (Atomic-Force-Microscope)
Al2O3 Aluminiumoxid / Edelkorund
ALP alkalische Phosphatase
AO Oberfläche
Aqua dest. destilliertes Wasser
Ar Argon
B Brushit
Bonit auf Titan elektrochemisch abgeschiedene
CaP- Beschichtung
CaP Calciumphosphat
Ca10(PO4)6(OH)2 Hydroxylapatit
Ca2+ Calcium
Ca3(PO4)2 Tricalciumphosphat
Ca3[Si3O9] Wollastonit
Ca5(PO4)3Cl Chlorapatit
Ca5(PO4)3F Fluorapatit
CaHPO4 Brushit
CaP Calciumphosphat
CaSi VPS-Beschichtung auf Titan mit
Weißzement
CaTiSiO5 Beschichtetes Titan
cm2 Quadratzentimeter
CO2 Kohlenstoffdioxid
cp-Ti Kommerzielles Titan
cp-Ti-OR-Vit Scheiben aus Titan
DAG (Dexamethason-Ascorbinsäure-ß
Glycerolphosphat)
dl Deziliter
dm³ Dezimeter
VIII
DPBS phosphatgepufferte Kochsalzlösung
DUOTex doppelt geätzte Titanoberfläche
ESC embryonale Stammzelle
EZM extrazellulären Matrix
F Fluor
FCS Fetales Kälberserum
Fe Eisen
h Stunde
H Wasserstoff
H𝑃𝑂42− Monohydrogenphosphationen
H2𝑃𝑜4− Dihydrogenphosphationen
h1bis hn Höhen
H2O2 Wasserstoffperoxid
H2SO4 Schwefelsäure
HA Hydroxylapatit
HAP Hydroxylapatit
HB Härte Brinell
HCL Salzsäure
hdp hexagonal-dichteste Kugelpackung
HF Flusssäure
K Kelvin
kg Kilogramm
kGy Kilogray
KH2PO4 Kaliumdihydrogenphosphat
krz kubisch-raumzentriertes Gitter
kV kilo Volt
lm Einzelmeßstrecke
M Mol
Mg Magnesium
mg Milligramm
min Minute
ml Milliliter
mm Millimeter
mM Millimol
IX
mRNA messenger RNA
MSC Mesenchymale Stammzelle
N Stickstoff
Na Natrium
nm Nanometer
O Sauerstoff
OC Osteokalzin
OH - Hydroxidion
OP Osteopontin
P𝑂43− Orthophosphat
r Radius
Ra arithmetischer Mittenrauwert
REM Rasterelektronenmikroskop
Rm Zugefestigkeit
Rmax maximale Einzelrauhtiefe
Rp0,2 Dehngrenze
SiC Siliciumcarbid
SLA Sand-blasted, Large grit, Acid etched
(grob sandgestrahlt und, säuregeätzt)
Ti13Nb13Zr Titanlegierung
Ti-6Al-7Nb Titanlegierung
TiAl6V4 Titanlegierung
TiO2 Titandioxid / Rutil
USSC Unrestricted Somatic Stem Cell
(Nabelschnurblutstammzelle)
V1 bis Vn Volumen
VPS Vakuum-Plasma-Spritzverfahren
y Profilabweichung
Z Zellen
ZrO2 Zirkonoxid
β-TCP Tricalziumphosphat
π Kreiszahl
1
1 Einleitung
Implantate aus Titan werden bereits seit mehreren Jahrzehnten erfolgreich in der Medizin und
Zahnmedizin eingesetzt. Branemark und Kollegen (Branemark, Adell et al. 1969) zeigten,
dass intraossale Implantate aus Titan nicht vom Hart- und Weichgewebe abgestoßen, sondern
toleriert werden und einwachsen. Ihnen war es erstmals möglich eine dauerhafte, durch
Titanimplantatpfeiler getragene, prothetische Versorgung („Zahnersatz“) im Kiefer zu
verankern.
Mittlerweile sind dentale Implantate Teil der Standartindikationen. Zur Verbesserung der
Biokompatibilität werden Oberflächeneigenschaften von dentalen Implantaten, die nicht mehr
nur rein aus Titan bestehen, hinsichtlich ihrer Beschaffenheit weiterentwickelt und untersucht.
So werden beispielsweise SLA (sandblasted and acid etched) Oberflächen aus
Titanlegierungen eingesetzt (Le Guehennec, Soueidan et al. 2007) und Oberflächen von
Titanimplantaten mit Calciumphosphaten, oder Calciumsilicaten beschichtet (LeGeros 2008;
Liu, Morra et al. 2008).
Da die erfolgreiche Osseointegration eines Implantates vom Verhalten der Zellen abhängt, die
in direktem Kontakt zur Oberfläche stehen, liegt das Augenmerk der Forschung auf dem
Verhalten von osteoblastenähnlichen Zellen auf verschiedenen Werkstoffoberflächen. Ein
besonderer Fokus wird dabei auf die Oberflächenrauigkeit, bzw. die
Oberflächenstrukturierung der Materialien gelegt, denn diese beeinflussen das
Proliferationsverhalten, das Attachement, die Form und die Proteinsynthese von
osteoblastären Vorläuferzellen (Guizzardi, Galli et al. 2004; Mendonca, Mendonca et al.
2008; Schwartz, Raz et al. 2008).
Zur Prüfung der Biokompatibilität von Oberflächendekorationen lassen sich verschiedene
Zellmodelle heranziehen, in dieser Arbeit wurde mit humanen Nabelschnurblutstammzellen
(USSC) gearbeitet. Diese lassen sich zu hohen Zellzahlen heranzüchten, sind wenig
immunogen und im Gegensatz zu ESCs (embryonalen Stammzellen) ethisch unbedenklich
(Kogler, Sensken et al. 2004; Winter, Wang et al. 2009). Nach Zugabe von DAG
(Dexamethason, Ascorbinsäure, ß-Glycerolphosphat) differenzieren diese osteogen (Kogler,
Sensken et al. 2004; Langenbach, Berr et al. 2011) und werden unter anderem zum Tissue
Engineering von Knochen, in Verbindung mit Gerüsten, eingesetzt (Handschel, Naujoks et al.
2010; Langenbach, Naujoks et al. 2012).
2
Die Biokompatibilität der einzelnen Oberflächen ist auch deshalb interessant, weil
Knochenkonstrukte aus USSC und Biomaterialien, häufig mit Implantaten fixiert werden.
Das Ziel dieser Studie war es, das Wachstumsverhalten von Vorläuferzellen auf
verschiedenen Oberflächendekorationen, wie sie auch auf dentalen Implantaten zum Einsatz
kommen, zu untersuchen. Es soll anhand verschiedener Parameter bestimmt werden, wie das
Zellwachstum von der Oberflächenbeschaffenheit abhängt. Die so gewonnenen Ergebnisse
können eine Aussage über die Biokompatibilität der getesteten Oberflächendekorationen
liefern.
2 Darstellung in der Literatur
2.1 Biokompatibilität von Implantatmaterialien
In der Implantologie kommen verschiedene Typen von Materialien zum Einsatz, welche in
direktem Kontakt mit Gewebe und Zellen stehen. Diese werden im Allgemeinen als
biokompatibel bezeichnet.
Der Begriff Biokompatibilität wurde in den 1980er Jahren von D. F. Williams geprägt und
beschreibt die Fähigkeit eines Materials, mit einer passenden Wirtsantwort in einer
spezifischen Situation zu reagieren (Williams 1987).
Durch die Weiterentwicklung von Materialien, für verschiedene Einsatzorte und
Verweilzeiten im menschlichen Körper, musste die Definition von D.F. Williams erweitert
werden. Der aktuelle Wortlaut des Paradigmas, bezogen auf Langzeitimplantate besagt, dass
sich die Biokompatibilität einer langfristig implantierbaren medizinischen Vorrichtung auf die
Fähigkeit dieser bezieht, ihre beabsichtigte Funktion mit dem gewünschten Grad der
Integration im Wirt zu erfüllen, ohne unerwünschte lokale oder systemische Effekte in diesem
hervorzurufen (Williams 2008).
Eine weiterführende Einteilung der biokompatiblen Materialien lässt sich in biotolerant,
bioinert und bioaktiv treffen (Osborn and Newesly 1980). Die Eigenschaften dieser
Materialien bezogen auf die Form der Osteogenese, respektive die Reaktion des knöchernen
Lagers, sowie Materialien, werden in Tabelle 2-1 dargelegt.
3
Tabelle 2-1 Reaktion des knöchernen Lagers auf das Implantat
Biodynamik Art der Osteogenese Werkstoffe
biotolerant Distanzosteogenese
- Umkapselung des Implantates mit
einer Bindegewebsschicht
Gold; Cobalt-Chrom-
Legierungen; Edelstahl;
Zirkonium; Niobium; Tantal
Polyethylen; Polyamid;
Polyurethan;
Polymethylmethacrylat;
Polytetrafluorethylen;
bioinert Kontaktosteogenese
- Keine Bindegewebsbildung
- Knochengewebe entsteht in
unmittelbarer Umgebung des
Implantates
- Wachstumsrichtung des
Knochengewebes zur
Implantatoberfläche
reines Titan (cp-Titanium);
Titanlegierungen TiAl6V4
Aluminiumoxid;
Zirkoniumoxid
bioaktiv Verbundosteogenese
- Bildung von Knochen an der
Oberfläche des Materials
- Ionenaustausch, sowie chemische
Bindung
- Wachstumsrichtung des
Knochengewebes in Richtung
Empfängergewebe
Hydroxylapatit; Tricalcium-
und Tetracalciumphosphat;
Calciumpyrophosphat;
Fluorapatit; Brushit;
Carbonglas; Pyrocarbon
Bioglass
adaptiert aus: (Osborn and Newesely 1980; Sykaras, Iacopino et al. 2000; LeGeros 2008; Wintermantel, Shah-Derler et al. 2008)
Für die Betrachtungen der Implantatwerkstoffe in Bezug auf gewebs-, oder zellulären
Interaktion, müssen die Begriffe Osteokonduktivität, Osteoinduktivität, Osseointegration und
Resorbierbarkeit erläutert werden.
4
Als Osteoinduktion wird der Prozess bezeichnet, bei dem die Osteogenese induziert, bzw.
angeregt wird (Albrektsson and Johansson 2001). Die Osteoinduktivität eines Materials stellt
die Eigenschaft dar, ohne die Anwesenheit von osteogenen Faktoren, wie bsp. Bone
Morphogenetic Proteins, oder de novo Knochenformationen zu induzieren (LeGeros 2008).
Osteokonduktiv bedeutet zusammengefasst, dass Knochen an einer Oberfläche wächst. Eine
osteokonduktive Oberfläche ist folglich jene, die es dem Knochen gestattet in den Kanälen
oder Poren der Materialoberfläche zu wachsen (Albrektsson and Johansson 2001). Branemark
prägte 1977 den Begriff der Osseointegration. Dieser beinhaltet einen direkten, funktionellen
und strukturellen Verbund zwischen dem organisierten, lebenden Knochengewebe und der
Oberfläche eines belasteten Implantates (Branemark, Hansson et al. 1977). Abschließend
erläutert der Begriff Resorption den Prozess der Aufnahme von körpereigenen oder
körperfremden Stoffen durch lebende Zellen, oder Gewebe (http://flexikon.doccheck.com
2012). Besonders gute Eigenschaften hinsichtlich der Resorbierbarkeit in medizinischen und
dentalen Anwendungen werden Calciumphosphatkeramiken zugeschrieben (Osborn and
Newesely 1980; LeGeros 2008).
2.2 Eigenschaften und klinische Relevanz von Implantatmaterialien
2.2.1 Titan
Die Farbe von reinem Titan ist silberweiß, es ist duktil und lässt sich gut schmieden (Roos
and Maile 2004). Unterhalb von 882 °C befindet sich Titan in der hexagonal dichtesten
Kugelpackung (hdp, α-Titan) und oberhalb ist es kubisch raumzentriert (krz, β-Titan)
(Schumann and Heinrich 2004). Allgemeine physikalische Eigenschaften des reinen Titans
sind in Tabelle 2-2 aufgelistet.
Tabelle 2-2 Physikalische Eigenschaften des reinen Titan
Physikalische Größe Wert Einheit
Dichte 4,51 [kg/dm³]
Elastizitäts-Modul 115000 [MPa]
Wärmeausdehnungskoeffizient 8,3610-6 [K-1]
Wärmeleitfähigkeit 0,15 [W/(cmK)]
Rp0,2 140 [MPa]
Rm 235 [MPa]
Schmelzpunkt 1668 [°C]
adaptiert und modifiziert aus: (Roos and Maile 2004)
5
Unlegiertes Titan, welches für chirurgische Implantate verwendet wird, ist laut DIN EN ISO
5832-2 in sechs verschiedene Titan-Güten unterteilt (DIN EN ISO 5832-2 August 2012).
Diese sind Güte 1 ELI, Güte 1, Güte 2, Güte 3, Güte 4A und Güte 4B. Die chemischen
Zusammensetzungen und mechanischen Eigenschaften sind auszugsweise in Tabelle 2-3
dargestellt. Die Güte 1 ELI besitzt den höchsten Reinheitsgrad und somit die niedrigsten
Anteile an den Elementen Fe, O, N und C. Mit Zunahme dieser Elemente im Titan verändern
sich die mechanischen Eigenschaften, wie die Vickershärte und die Zug- oder Dehngrenze
(Roos and Maile 2004; Schumann and Heinrich 2004; http://www.fieke-dental.de 2011).
Tabelle 2-3 Unlegiertes Titan, für chirurgische Implantate
Bezeichnung
Güte 1 ELI Güte 1 Güte 2 Güte 3 Güte 4A Güte 4B
chem.
Zusammen-
setzung in %.
N max. 0.012 0,03 0,03 0,05 0,05 0,05
C max. 0,03 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1
H max. 0,0125 0,0125 0,0125 0,0125 0,0125 0,0125
Fe max 0,1 0,2 0,3 0,3 0,5 0,5
O max. 0,1 0,18 0,25 0,35 0,4 0,4
Ti Rest Rest Rest Rest Rest Rest
mechanische
Eigenschaften
Zugfestigkeit
min. Mpa 200* 240* 345* 450* 550* 680**
Dehngrenze
min. MPA 140* 170* 275* 380* 483* 520**
Bruchdehnung
min. % 30* 24* 20* 18* 15* 10**
*=geglühter Zustand, **= Kaltverformt
adaptiert und modifiziert aus: (DIN EN ISO 5832-2 August 2012)
Durch Zulegieren und thermische Verfahren lässt sich die (α+ β)-Legierung TiAl6V4
herstellen. Diese weist neben Korrosionsbeständigkeit und guter Biokompatibilität, günstige
mechanische Eigenschaften auf, welche auszugsweise in Tabelle 2-4 dargestellt sind.
6
Tabelle 2-4 mechanische Eigenschaften der Titanlegierung TiAl6V4
Werkstoffkurzzeichen Mechanische Kennwerte
Rp0,2 [N/mm2] Rm [N/mm2] HB
TiAL6V4 830-870 900-920 310
adaptiert aus: (DIN 17860 Januar 2010)
Legierungen aus Titan und unlegiertes Titan werden oft für medizinische und
zahnmedizinische Implantate genutzt (Le Guehennec, Soueidan et al. 2007).
Implantate aus Titan werden bereits seit mehreren Jahrzehnten erfolgreich in der Medizin und
Zahnmedizin eingesetzt. Branemark, sowie Laing stellten bereits in den Jahren 1963-1969
fest, dass Titan so gut wie keine Gewebereaktion zeigte und somit als inert bezeichnet werden
kann (Branemark and Lindstrom 1963; Branemark, Aspegren et al. 1964; Laing, Ferguson et
al. 1967; Branemark, Adell et al. 1969). Für eine zahnmedizinische Anwendung, nicht nur bei
Implantaten, sondern auch prothetischen Versorgungen, spricht eine Vielzahl von
Eigenschaften des Titans. Es ist röntgentransparent, was eine Beurteilung des Gewebes von
überkronten Pfeilerzähnen zulässt (Lindigkeit 2002). Seine Wärmeleitfähigkeit ist sehr gering,
so dass das Risiko der Sensibilität eines überkronten Pfeilerzahnes minimiert wird. Ideal für
die Implantation macht den Werkstoff Titan die in Verbindung mit Luftsauerstoff entstehende
dünne, aber beständige Schicht aus Titandioxid (Rutile). Diese Schicht verhindert, dass sich
Metallione herauslösen und in das Gewebe diffundieren. Titan und Titanlegierungen sind
aufgrund dieser Passivierungsschicht gegen eine Vielzahl von Säuren und Chloriden
beständig (Geis-Gerstorfer 2005). Elektrochemische Studien zeigen, dass der Werkstoff Titan
und Titanlegierungen verglichen mit anderen in der Medizin eingesetzten Legierungen ein
wesentlich höheres Durchbruchpotential besitzen (Wintermantel and Ha 2008).
Dennoch haben auch Titanimplantate Nachteile. Die graue Farbe des Titanimplantates,
vornehmlich im sichtbaren Oberkiefer, Frontzahn- und Prämolarenbereich, kann
beispielsweise zu Beeinträchtigungen in der Ästhetik führen. Weiterhin kann es zum
„Durchscheinen“ des Implantates durch Alveole kommen (Kohal, Weng et al. 2004), was
wiederum eine ungünstige kosmetische Situation darstellt. A. Weingart fand eine
Ansammlung von Titanpartikeln in Lymphknoten, jedoch ohne erkennbare systemische
Auswirkungen (Weingart, Steinemann et al. 1994). Nicht alle mechanische Eigenschaften des
Titans und seiner Legierungen sind auf die Gegebenheiten, welche im Knochen vorkommen
abgestimmt. Als kritisch wird hier der zu hohe E-Modul des Titans angesehen. Durch das
Missverhältnis zum Knochen kann es zu Problemen bei spannungsindizierten Knochenaufbau
und Knochenabbau kommen (Wintermantel and Ha 2008).
7
2.2.2 Calciumphosphate
Calciumphosphate befinden sich als anorganische Komponente in physiologischen
Hartgeweben, wie Zähne und Knochen. Sie bestehen aus Ortho-, Pyro- oder Polyphosphaten
(Dorozhkin and Epple 2002) in Verbindung mit Calciumionen, sowie Bestandteilen des
Wassers (H+, oder OH-). Die klassischen Zusammensetzungen der in der Medizin genutzten
Calciumphosphate enthalten in der Regel Orthophosphate. Medizinisch genutzte
Calciumphosphate sind Tricalciumphosphat (Ca3(PO4)2), Hydroxylapatit (Ca10(PO4)6(OH)2),
Brushit (CaHPO4), sowie eine Mischung aus Tricalciumphosphat und Hydroxylapatit (Tabelle
2-5).
Anwendungen von Tricalciumphosphat, zur Unterstützung der Knochenreparatur wurden
1920 von Albee (Albee 1920) publiziert. Eine erste Nutzung in der Zahnmedizin beschrieb
Nery 1978 (Nery and Lynch 1978).
Calciumphosphate besitzen Eigenschaften, die sie besonders interessant für den Einsatz als
Implantatmaterialien machen, denn strukturell sind sie den im menschlichen Körper
vorkommenden mineralischen Verbindungen im Zahnhartgewebe und Knochen ähnlich (Kay,
Young et al. 1964). Calciumphosphate sind biologisch abbaubar. Dieser Vorgang verläuft in
unterschiedlichen Geschwindigkeiten und sollte im Idealfall an die Geschwindigkeit
angepasst werden, mit welcher sich der Knochen neu bildet (Dorozhkin and Epple 2002).
Hydroxylapatit wird bei einem physiologischen Ph-Wert sehr langsam, bis gar nicht aufgelöst,
wo hingegen sich Brushit, und Tricalziumphosphat schneller auflösen (de Groot 1985;
Dorozhkin and Epple 2002; Szmukler-Moncler, Zeggel et al. 2003). Die Löslichkeit wird im
Allgemeinen mit fallendem Ph-Wert gesteigert. Dies kann durch das biochemische Milieu am
Ort der Implantation, durch beispielsweise zelluläre/enzymatische Aktivitäten hervorgerufen
werden (de Groot 1985).
8
Tabelle 2-5 ausgewählte Eigenschaften Calciumphosphat basierender, in der Medizin eingesetzter Materialien
Mineral Idealisierte
Formel
Härte
Mohs
Ca/P
Verhältnis
Dichte
[g/cm3]
Gittertyp
(B) Brushit CaHPO4 2,5 1,1 2,328 monoklin
(HA) Hydroxylapatit Ca10(PO4)6(OH)2 5 1,67 3,2 hexagonal
(β-TCP)
Tricalziumphosphat
Ca3(PO4)2 5,5 1,5 3,14 monoklin
adaptiert aus: (Osborn and Newesely 1980; de Groot 1985; Szmukler-Moncler, Zeggel et al. 2003; LeGeros 2008;
http://www.mineralienatlas.de 2012)
Ducheyne und Kollegen (Ducheyne, Hench et al. 1980) zeigten, dass in Poren, welche mit
Hydroxylapatit ausgekleidet waren, eine Stimulation des Knochenwachstums stattgefunden
hat. Auch unterstützt es in den ersten Wochen nach Insertion die Anlagerung des Knochens.
Dies führt verglichen mit nicht beschichteten Oberflächen zu einem rascheren Einheilen des
Implantates (Ducheyne, Hench et al. 1980; Soballe, Hansen et al. 1990; Aebli, Krebs et al.
2003). Beschichtungen von Implantaten mit Calciumphosphaten führen verglichen mit nicht
beschichten, nach Implantation, zu einer Erhöhung der Bindungsstärke zwischen Knochen
und Implantat (Ducheyne, Hench et al. 1980; Soballe, Hansen et al. 1990). Es wurde eine
osteokonduktive Wirkung der beschichteten Oberflächen (LeGeros 2008; Hao, Kuroda et al.
2011) nachgewiesen. Calciumphosphate gehören zu der Gruppe der bioaktiven Materialien
(Tabelle 2-1). Ihnen wird eine gute biologische Abbaubarkeit bescheinigt (LeGeros 2008;
Hao, Kuroda et al. 2011). Nachteile von Calciumphosphaten sind die Sprödigkeit, die geringe
Zugfestigkeit und ihre begrenzte strukturelle Integrität (Blokhuis and Arts 2011).
2.2.3 Wollastonite
Bei Wollastoniten handelt es sich um natürlich vorkommende Calciumsilicate (Inosilicate).
Diese Mineralien sind chemisch als Ca3[Si3O9] zusammengesetzt. Wollastonite gehören in die
Klasse „Silikate und Germanate“ und lassen sich in drei Modifikationen einteilen:
Wollastonit-1A wird im Englischen auch als Wollastonit-TC bezeichnet und besitzt einen
triklinen Aufbau. Das Wollastonit-2M hat einen monoklinen Aufbau. Pseudowollastonit ist
die dritte Modifikation (Hochtemperaturmodifikation) des Wollastonit. Diese besitzt einen
triklinen Aufbau der nur oberhalb 1120 °C stabil ist (Briehl 2008;
http://universal_lexikon.deacademic.com 2012).
9
Die Vorteile von Wollastonit ergeben sich aus seinen günstigen mechanischen Eigenschaften.
Diese sind geringe Schwindung, gute Festigkeit und eine nadelförmige Struktur (Liu, Morra
et al. 2008). Wollastonit wird beispielsweise als Füllstoff in Kunststoffen genutzt (Briehl
2008). In der Zahnmedizin werden Calciumsilicate beispielsweise erforscht, um als
Dentinersatz eingesetzt zu werden (Atmeh, Chong et al. 2012). Wollastonite dienen als
Beschichtungen auf Trägeroberflächen aus Titan. Diese werden mit Hilfe von
Plasmaspritzverfahren aufgebracht und besitzen physikalische Eigenschaften, welche
auszugsweise in Tabelle 2-6 dargestellt sind. Ebenfalls verfügen Wollastonitbeschichtungen
über eine gute Bioaktivität und osteokonduktive Eigenschaften. So lagert sich in der
Frühphase nach der Implantation mehr Knochen an, als beispielsweise auf einer reinen
Titanoberfläche. Dies ist in der Bildung einer Apatit-Schicht auf der Oberfläche begründet.
Sie wird nach der Implantation durch Oberflächenreaktion der Wollastonitbeschichtung mit
umgebenden Körperflüssigkeiten gebildet (Xue, Liu et al. 2005). Oberflächen aus Wollastonit
haben positive Auswirkungen auf das Proliferationsverhalten von osteoblatenähnlichen Zellen
(Ni, Chang et al. 2006).
2-6 physikalische Eigenschaften von plasmagespritztem Wollastonit
Physikalische Größe Wert Einheit
Dichte 2,6 [g/cm³]
Härte Vickers 2,5 [GPa]
Verbundfestigkeit (Ti6Al4 V) 42,8 [MPa]
Wärmeausdehnungskoeffizient 8,1-9,2 [10-6 °C]
adaptiert aus (Liu, Morra et al. 2008)
Nachteile bei der Verwendung von Wollastoniten (in glaskeramischen Systemen) stellen die
geringe Bruchzähigkeit und das hohe Elastizitätsmodul im Vergleich zum hoch belasteten
kortikalen Knochen dar (Kokubo, Kim et al. 2003).
2.3 Herstellung der Oberflächenmodifikationen von Titanimplantaten
Die Oberflächenmodifikationen bei dentalen Implantaten lassen sich verfahrenstechnisch grob
in die zwei Gruppen der additiven und subtraktiven Verfahren unterteilen. Beim additiven
Verfahren wird dem Werkstück (Implantatrohling) Material zugefügt und es entstehen so
Unebenheiten und Erhebungen. Beim subtraktiven Verfahren wird von der
10
Implantatoberfläche abgetragen, was zu Vertiefungen und Poren führt (Wennerberg and
Albrektsson 2009).
2.3.1 SLA Oberflächen
Eine Möglichkeit eine definierte Oberflächenrauigkeit, bzw. eine Oberflächenvergrößerung,
auf Titanimplantaten durch ein subtraktives Verfahren zu erzeugen, ist das Bestrahlen mit
Partikeln. SLA (sandblasted and acid etched) Oberflächen gehören somit in die Gruppe der
subtraktiven Herstellungsverfahren.
Das Bestrahlen mit Al2O3 (Edelkorund) ist eine Möglichkeit, um poröse oder raue
Oberflächen zu erhalten. Dabei wird das Al2O3 in unterschiedlicher Partikelgröße und mit
verschiedenem Druck auf die Titanoberfläche aufgestrahlt. Jedoch, abhängig von der Höhe
des Druckes, können in die Implantatoberfläche eingebettete Aluminiumoxidreste zurück
bleiben (Ricci, Kummer et al. 1992; Darvell, Samman et al. 1995). Weitere Partikel, die zum
Bestrahlen der Oberfläche dentaler Implantate genutzt werden, sind SiC (Aparicio, Gil et al.
2002), ZrO2 (Guizzardi, Galli et al. 2004), aber auch TiO2, bzw. Rutil und Hydroxylapatit
(Wennerberg, Albrektsson et al. 1996; Bagno and Di Bello 2004). In der Literatur lassen sich
Hinweise auf eine Zytokompatibilität von Al2O3 und TiO2 (Naji and Harmand 1991), sowie
SiC (Santavirta, Takagi et al. 1998) finden. Durch eine Ultraschall- und Säurebehandlung,
sowie die Sterilisation lassen sich nicht immer alle Partikel entfernen. Unter Umständen
können diese später an das Gewebe abgegeben werden (Buser, Schenk et al. 1991; Aparicio,
Gil et al. 2003).
Nach dem Bestrahlen mit Partikeln wird eine Säureätzung der Oberflächen vorgenommen.
Die so entstandenen Oberflächen werden im Allgemeinen als SLA (sandblasted and acid
etched) bezeichnet. Dabei wird nach dem Bestrahlen die zu behandelnde Oberfläche u.a. in
eine Mischung aus HCL und H2SO4 gegeben (Bagno and Di Bello 2004). Dadurch werden
einerseits Teile der Strahlpartikel von der Oberfläche entfernt (Diniz, Soares et al. 2002),
andererseits wird die bereits vom Strahlen vorhandene Oberflächencharakteristik verändert,
indem eine Sekundärrauigkeit durch Glättung der Spitzenrauigkeiten entsteht (Buser, Schenk
et al. 1991; Bagno and Di Bello 2004; Wennerberg and Albrektsson 2009).
11
2.3.2 Beschichten durch elektrochemisches Abscheiden
Eine etablierte Möglichkeit Oberflächen mit Calciumphosphaten zu beschichten, ist die
elektrochemische Abscheidung. Diese Oberflächenbeschichtung ist ein additives Verfahren.
Durch die Dissoziation eines Stoffes in wässriger Lösung entstehen Elektrolyte (Anionen und
Kationen). Die Ionenwanderung wird durch ein Potential gerichtet (Ionenleiter). Die negativ
geladenen Ionen wandern zur Anode und die positiv geladenen zur Kathode. An der Kathode
nehmen die Kationen Elektronen auf und werden reduziert, während an der Anode mit den
Anionen der entgegengesetzte Prozess abläuft.
Wird als Elektrolyt eine Calciumdihydrogenphosphathaltige-Lösung verwendet und der zu
beschichtende Werkstoff als Kathode geschaltet, dann lassen sich Calciumphosphate
elektrochemisch aus dem Elektrolyt auf die Werkstoffoberfläche abscheiden (Yen and Lin
2003; Peng, Kumar et al. 2006; Narayanan, Seshadri et al. 2008):
2𝐻2𝑂 + 2𝑒− ↔ 𝐻2 + 2𝑂𝐻− (1)
𝑂𝐻− + 𝐻2𝑃𝑜4− ↔ 𝐻2𝑂 + 𝐻𝑃𝑂4
2− (2)
𝐻𝑃𝑂42− + 𝑂𝐻− ↔ 𝐻2𝑂 + 𝑃𝑂4
3− (3)
𝐶𝑎2+ + 𝐻𝑃𝑂42− + 𝐻2𝑂 ↔ 2𝐻2𝑂 + 𝐶𝑎𝐻𝑃𝑂4 (4)
10𝐶𝑎2+ + 6𝑃𝑂43− + 2𝑂𝐻− ↔ 𝐶𝑎10(𝑃𝑂4)6(𝑂𝐻)2 (5).
Wasser wird bei einem Stromfluss elektrochemisch in Hydroxidionen und Wasserstoff
zersetzt (Gleichung 1). Es folgt eine Säure-Base-Reaktion und die freigesetzten
Hydroxidionen reagieren mit dem Dihydrogenphosphationen 𝐻2𝑃𝑜4−. Es entstehen
Monohydrogenphosphationen 𝐻𝑃𝑂42− (Gleichung 2). Weitere freie Hydroxydione in der
Lösung reagieren mit den Monohydrogenphosphationen und es bilden sich
Orthophosphatione 𝑃𝑂43− (Gleichung 3). Durch eine Sättigung der Lösung, durch die neu
entstandenen Ionen, kommt es zur Ausfällung der verschiedenen Calciumphosphate an der
Kathode, der Werkstoffoberfläche. Das hier in Gleichung 4 gegebene Beispiel ist eine
Reaktion zu Bruschit und in Gleichung 5 zu Hydroxylapatit.
12
2.3.3 Beschichten mit VPS
Zu den additiven Verfahren gehört das so genannte VPS-Verfahren (Vakuum-Plasma-
Spritzverfahren), welches der Gruppe des thermischen Spritzens zuzuordnen ist (Ilschner and
Singer 2004).
Der Schichtwerkstoff (meist Pulver) wird einer stark energetischen Wärmequelle zugeführt
und in dieser an- oder aufgeschmolzen. Meist handelt es sich bei der Wärmequelle um ein
Plasma (Plasmaspritzen). Es können je nach Anforderung aber auch eine Gasflamme
(Flammspritzen), oder ein Lichtbogen (Lichtbogenspritzen) genutzt werden. Der
Schichtwerkstoff wird durch einen Gasstrom in Richtung der zu beschichtenden
Implantatoberfläche beschleunigt und lagert sich dort auf. Im Vakuum oder unter Inertgasen
wird der Oxidation vorgebeugt (Ilschner and Singer 2004). Es kann sowohl im Vakuum, unter
normaler Atmosphäre und unter Wasser beschichtet werden.
In der Medizintechnik können Calciumsilikate mittels Plasmasprayverfahren auf
Titanoberflächen abgeschieden werden. Liu (Liu and Ding 2002) nutzte beispielsweise in
Puderform vorliegendes und verändertes (kugelförmiges) Wollastonit als Schichtwerkstoff
und als Substrat eine TiAl6V4 Legierung. Als Gase im Plasma dienten Ar und H2. Zum
Transport des Schichtwerkstoffes wurde ebenfalls Ar eingesetzt. Bei einem Abstand zum
Substrat von 100 mm war es nun möglich, je nach Schichtwerkstoff eine mit Kugeln und eher
glatte, oder mit Platten und eher raue Oberfläche zu erzeugen. Weitere Schichtwerkstoffe, die
in der Dentalimplantatherstellung verwendet werden, sind beispielsweise Titanpulver, oder
Hydroxylapatit (Babbush, Kent et al. 1986; de Groot, Geesink et al. 1987; Le Guehennec,
Soueidan et al. 2007).
2.4 Messgrößen zur Bestimmung von Oberflächeneigenschaften
2.4.1 Arithmetischer Mittenrauhwert Ra
In Anlehnung an die DIN 4768, ist der Mittenrauhwert Ra der arithmetische Mittelwert der
absoluten Beträge der Profilabweichungen y des Rauheitsprofils von der mittleren Linie,
welche sich innerhalb der Einzelmeßstrecke lm befindet (DIN 4768 Mai 1990). Dies ist
dargestellt in Abbildung 2-1.
13
Abbildung 2-1 Profil einer Oberfläche mit Kennwerten
Berechnen lässt sich Ra wie folgt:
𝑅𝑎 =1
𝑙𝑚 ∫ |𝑦(𝑥)|𝑑𝑥
1
0
2.4.2 Maximale Rauhtiefe Rmax
In Anlehnung an die DIN 4768, ist die maximale Rauhtiefe, als die größte der auf der
Gesamtstrecke vorkommenden Einzelrauhtiefe Rmax definiert (Abbildung 2-1).
2.4.3 Einteilung in Bereiche der Rauigkeit für medizinische Zwecke
Um in der Zahnmedizin und Medizin Oberflächenbeschaffenheiten eine Zuordnung zu geben,
wird immer wieder von rauen, sehr rauen, oder glatten Oberflächen gesprochen. Eine
Einteilung der Rauigkeiten in Bereiche ist hier von Vorteil. Diese wurden von Wennerberg
und Albrektsson beschrieben (Wennerberg and Albrektsson 2009). Ihnen zu Folge wird eine
glatte Oberflächen (Sa, respektive Ra) mit >0,5 µm und eine minimal raue mit 0,5-1µm
beschrieben. Weiterhin wird mit >1-2µm in moderat rau und >2µm in rau eingeteilt.
Wennerberg (Wennerberg and Albrektsson 2009) beschreibt Ra als die arithmetische mittlere
Abweichung eines Profils und Sa die einer Oberfläche.
14
2.5 Testung der Biokompatibilität von Implantatoberflächen
Um die Eigenschaften von neu entwickelten Oberflächen zu testen, wird in der Regel in
folgender Reihenfolge vorgegangen: 1. in vitro Testverfahren, 2. in vivo Tierversuch, 3. in
vivo klinische Studien im Menschen (Wintermantel, Shah-Derler et al. 2008). Da in dieser
Arbeit die „Biokompatibilität“ von Implantatoberflächen in vitro untersucht wurde, soll diese
Methodik folgend näher erläutert werden. Bei in vitro Testverfahren werden verschiedene
Zelllinien eingesetzt, beispielsweise adhärente Zelllinien, welche einer Primärkultur, oder
permanenten Zellkultur angehören. Primärkulturen werden aus Gewebe, oder Organen isoliert
und die Lebensdauer ist limitiert, im Gegensatz zu einer permanenten Zellkultur aus stabil
transfizierten, oder Tumorzellen, mit hoher Replikationsrate (Schmitz 2011). Durch die in
vitro Kultivierung von Zellen können so binnen kurzer Zeit Aussagen über das Verhalten
einer Oberfläche getroffen werden. Das Attachement, die Proliferation, die Morphologie und
das Überleben der Zellen in vitro geben Informationen über eine spätere Biokompatibilität in
einem komplexen Organismus. Durch die Vermehrung der Zellen unter gleichbleibenden
Bedingungen können reproduzierbare Ergebnisse gewonnen werden, eine Reihe von Zellen
lassen sich jederzeit bei einer Zellbank käuflich erwerben. Diese Versuche sind Vorversuche
zur Anwendung in einem komplexen Organismus des Tieres oder Menschen.
2.5.1 Zell- Materialinteraktion
Die Zell- Materialinteraktion ist vom ersten initialen Kontakt bis hin zur Langzeit-Zell-
Antwort ein Schritt-für-Schritt-Prozess, bei dem zelluläre und nicht zelluläre Vorgänge eine
Rolle spielen (Meyer, Buchter et al. 2005).
Meyer teilt dabei die Stadien der Osteoblasten-Titan-Oberflächeninteraktion in
Zellattachment, Zellverbreitung, Zellproliferation, Zellmigration, Matrixsynthese und
Mineralbildung ein.
Dabei kommt es zuerst zu einer Proteinadsorption, durch das Benetzten der
Implantatoberfläche mit einer Flüssigkeit, wie z.B. Blut oder Kulturmedium. Dieser Vorgang
wird durch physiochemische Eigenschaften des Materials beeinflusst (Meyer, Buchter et al.
2005). Folgend kommt es zu der Attachmentphase. Diese tritt schnell auf und beinhaltet
kurzfristige Ereignisse zwischen Zelle und Oberfläche. Dazu gehören unter anderem die
physikalisch-chemischen Verbindungen zwischen Zellen und Materialien mit ionischen oder
van der Waals-Kräften (Anselme 2000; Meyer, Buchter et al. 2005). Länger dauert die
15
anschließende Adhäsionsphase. Verschiedene biologische Moleküle, wie Proteine der
extrazellulären Matrix, Zellmembranproteine und Zytoskelett-Proteine sind involviert. Diese
interagieren und induzieren die anschließende Zell-Antwort in Bezug auf Migration und
Differenzierung (Anselme 2000; Meyer, Buchter et al. 2005).
2.5.2 Einflussfaktor der Implantatoberfläche
Die Oberflächentopografie eines dentalen Implantates kann in den Makro-, Mikro-, und
Nanometerbereich eingeteilt werden (Abbildung 2-2). Für die Testung der Biokompatibilität
im Zellmodell sind vor allem der Mikro- und Nanometerbereich interessant, denn die
Makrostruktur eins Implantates bezieht sich auf die Implantatgeometrie (Le Guehennec,
Soueidan et al. 2007).
Abbildung 2-2 Oberflächentopografie eines dentalen Implantates: a Makrostrukturierung (Implantatcorpus (5) im Knochen
verankert in Kontakt mit: (3) Periost, (4) Kompakta und (6) Spongiosa, so wie das Abutment (1) mit Kontakt zur Schleimhaut (2)) b
Mikrostrukturierung (Zellen auf der Implantatoberfläche im Mikrometerbereich); c Nanostrukturierung (Zelle in Interaktion mit
der Implantatoberfläche im Nanometerbereich), zu sehen sind das Substrat unten, die EZM (Extra Zellulare Matrix) mit
Aktinfilamenten in der Mitte und die Zelle oben. ).
Strukturierungen im Mikrometer- und Nanometerbereich einer Implantatoberfläche haben
direkte Auswirkungen auf das Verhalten von Zellen, somit auch auf eine rasche
Osseointegration. In der Literatur lassen sich Hinweise darauf finden, dass das
Wachstumsverhalten von osteoblasten ähnlichen Zellen in vitro in engem Zusammenhang mit
den Oberflächeneigenschaften steht.
16
Beeinflusst werden beispielsweise das Attachement (Guizzardi, Galli et al. 2004; Yamashita,
Machigashira et al. 2009), die Proliferation (Rosa and Beloti 2003; Osathanon, Bespinyowong
et al. 2011), die Morphologie und das Überleben der Zellen (Park, Bauer et al. 2007; Okada,
Ito et al. 2010). Weitere Parameter, die einen Einfluss auf Zellen ausüben können sind das
Material, die Ionenfreisetzung, die Topographie, die Chemie und der Ladungstransfer (Meyer,
Buchter et al. 2005).
2.5.3 Unrestringierte, somatische Stammzellen (USSC)
Ein Zellmodell, welches sich für die Testung von Oberflächen in vitro besonders gut eignet,
sind die USSCs.
USSCs sind eine adhärent wachsende Zelllinie, dass bedeutet beim Wachstum heften sich die
Zellen an die jeweilige Oberfläche an. USSCs sind multipotent, sie lassen sich in Zellen aller
drei embryonalen Keimblätter differenzieren, jedoch nicht mehr in alle Zelltypen eines
Organismus (Abbildung 2-3) (Kogler, Sensken et al. 2004).
Abbildung 2-3 Potential der homogenen Differenzierung von USSCs, in vitro, in verschiedene Zelltypen.
Interessant für diese Studie war vor allem, die osteogene Vordifferenzierung der USSCs nach
der Zugabe von DAG (Dexamethason + Ascorbinsäure + ß-Glycerophosphat) (Kogler,
Sensken et al. 2004; Langenbach, Berr et al. 2011). Weiterhin behalten USSCs bis zu einer
hohen Passage ihre multipotenten Eigenschaften. USSCs sind für Versuche mit hohen
Reproduktionszahlen geeignet. Osteogen vordifferenzierte USSCs werden bereits zum Tissue-
Engineering von Knochen, in Verbindung mit Scaffolds (Handschel, Naujoks et al. 2010;
Langenbach, Naujoks et al. 2012) eingesetzt. Darüber hinaus sind USSCs im Gegensatz zu
embryonalen Stammzellen ethisch unbedenklich (Winter, Wang et al. 2009).
17
2.5.4 Osteogene Vordifferenzierung der USSCs
Das Vordifferenzieren der USSCs bietet die Möglichkeit zu untersuchen, in wie weit die
Oberfläche der Probenkörper einen Einfluss auf knochenähnliche und undifferenzierte Zellen
ausübt.
Ein etabliertes System, um USSCs osteogen vorzudifferenzieren bietet die Zugabe von DAG
(Jaiswal, Haynesworth et al. 1997; Meyer, Wiesmann et al. 2006), welches seinen Ursprung
in den späten 70er Jahren hat. Für die Mineralisierung von Zellen in vitro wird eine
zusätzliche Phosphatquelle für die Bildung von Calciumphosphaten benötigt. 1979
beschrieben Binderman und Greene (Binderman, Greene et al. 1979), dass sie bei
mesenchymalen Stammzellen, gewonnen aus der Extremitätenknospe eines Hühnerembryos,
unter Zugabe von 3 mM Phosphat (KH2PO4), eine verbesserte Kalzifizierung beobachten
konnten. Später zeigte Tenenbaum (Tenenbaum and Heersche 1982) eine Abhängigkeit der
Mineralisierung von Osteoid in vitro, durch Zugabe von alkalischem Phosphatsubstrat „ß-
Glycerolphosphat“. Um Calcium einzulagern werden eine Kollagenmatrix, bzw.
Kollagenfibrillen benötigt. Durch die Zugabe von Ascorbinsäure wird die Hydroxylierung
von Prokollagen um das ca. fünffache gesteigert, was zu einer schnelleren Sezernierung der
Kollagen-Tripelhelix führt (Franceschi and Iyer 1992). Tenenbaum führte 1985
Vorläuferzellen Dexamethason in verschieden Konzentrationen und in unterschiedlichen
Entwicklungsstadien zu. Dies führte zu einer Stimulation der alkalischen Phosphataseaktivität
in einem frühen Entwicklungsstadium (Tenenbaum and Heersche 1985).
2.5.5 Differenzierungsverlauf osteoblastärer Zellen
Der osteoblastäre Differenzierungsverlauf umfasst im zeitlichen Ablauf, erstens die
Proliferation der Zellen, zweitens die Reifung der extrazellulären Matrix und drittens die
Mineralisation (Abbildung 2-4).
In der ersten Phase, der Proliferationsphase, ist ein hohes Niveau von Kollagen TypI mRNA,
sowie eine Expression von Zellzyklus- und Zellwachstums-Genen zu verzeichnen. Die
folgende zweite Phase, die Matrixentwicklung, wird charakterisiert durch die Induktion von
ALP (alkalischer Phosphatase). In der dritten Phase, der Mineralisation, steigt das mRNA-
Niveau für Osteopontin und Osteokalzin signifikant um das 10- bis 100- fache an (Mayer,
Scutt et al. 1992).
18
Abbildung 2-4 Beziehung zwischen Proliferation und Differenzierung, bei der osteoblastären Differenzierung; adaptiert aus (Mayer,
Scutt et al. 1992).
Kollagen Typ I kommt beispielsweise im Dentin der Zähne, in Knochen und Sehnen, sowie
Bändern vor und ist ein Bestandteil der EZM (extrazellulären Matrix). Es wird unter anderem
von Fibroblasten und Osteoblasten sezerniert. Kollagen Typ I gehört zu den fibrillären
Kollagenen, es dient der Strukturbildung und ist zugfest (Schiebler and Korf 2007;
http://flexikon.doccheck.com 2012). Die alkalische Phosphatase (ALP) spaltet
Phosphorsäuremonoester, ist aber kein rein knochenspezifisches Enzym. Sie kommt unter
anderem im Leberparenchym, sowie den Gallengangsepithelien vor
(http://flexikon.doccheck.com 2012). Die Expression von ALP tritt vor der Mineralisation der
Knochenmatrix auf und leitet diese ein (Zernik, Twarog et al. 1990). Durch Präosteoblasten,
Osteozyten sowie Osteoblasten wird Osteopontin (OP) synthetisiert, im Osteoid sezerniert
und in den Knochen eingebracht (Butler 1989). OP inhibiert die Formation von Hydroxlapatit
(Boskey, Maresca et al. 1993) und ist somit am Knochenumbau beteiligt. Auch OP ist nicht
rein knochenspezifisch, es findet sich weiterhin in den Nieren und der glatten Muskulatur.
Osteokalzin (OC) wird speziell von Osteoblasten sezerniert. Es ist das häufigste nicht
kollagene Protein im Knochen und reguliert das Wachstum der Apatitkristalle (Meyer,
Wiesmann et al. 2006).
19
2.5.6 Knochen
Knochen hat neben der Funktion als Stützgewebe auch die Aufgabe Calcium- sowie
Phosphationen zu speichern. Die Zusammensetzung des Knochens ist in Tabelle 2-7
beschrieben. Die organischen Bestandteile des Knochens werden auch als Osteoid bezeichnet.
2-7 Zusammensetzung der Knochenmatrix
Inhalt Menge in %
organische Verbindungen (bsp. Kollagen-Typ I,
Glycosaminoglycane, Osteocalcin, Osteonectin)
25
Wasser (gebunden an Apatitkristalle) 25
Mineralien (35% Calcium und 50 %Phosphat, Rest Mg, Na,
F)
50
adaptiert aus: (Witt 2006)
Prinzipiell werden Knochen in Geflecht- und Lamellenknochen unterteilt. Der
Geflechtknochen tritt, mit Ausnahme von den Alveolen der Zähne, Suturen von
Schädelplatten, sowie Ansatzstellen einiger Sehnen nur bei der Knochenneubildung auf und
stellt wegen der enthaltenen ungerichteten Kollagenfasern das weniger belastbare Modell dar.
Der Lamellenknochen verdankt seine guten Eigenschaften den gegenläufig in Spiralen
angeordneten Kollagenfasern. Seine makroskopischen Hauptmerkmale sind die Kompakta
und die Spongiosa Abbildung 2-2. Die Kompakta besitzt Porengrößen von 10 bis 50 µm
sowie 100 bis 300 nm und die Spongiosa vom 200 bis 600 µm (LeGeros 2008).
Zu den Zellen des Knochens gehören Osteoblasten, Osteozyten und Osteoklasten.
Osteoblasten, sezernieren die organischen Komponenten der Knochenmatrix. Osteozyten
entstehen aus Osteoblasten und befinden sich im verkalkten Knochen. Osteoklasten bauen den
mineralischen Knochen ab (Witt 2006).
Apatit stellt eine Sammelbezeichnung dar, in welcher die Minerale Fluorapatit Ca5(PO4)3F,
Chlorapatit Ca5(PO4)3Cl, und Hydroxylapatit Ca5(PO4)3(OH) enthalten sind. Sie stammen aus
der Gruppe der Apatit-Pyromorphite, welche durch eine frei austauschbare Konzentration von
einfach negativ geladenen Fluor-, Chlor- und Hydroxylionen gekennzeichnet ist. Weiterhin
sind sie der Mineralklasse der wasserfreien Phosphate mit fremden Anionen zuzuordnen.
Hydroylapatit kristallisiert im hexagonalen Kristallsystem (http://www.chemie.de 2012).
Neben der oben erwähnten Formel Ca5(PO4)3(OH) kann das Apatit, aus dem Zähne und
20
Knochen bestehen, auch als Hydroxyalapatit, respektive Kalziumhydroxylapatit mit der
Formel (𝐶𝑎)10(𝑃𝑂4)6(𝑂𝐻)2 dargestellt werden (Kay, Young et al. 1964). Einige
physikalische Eigenschaften des Hydroxylapatits sind in Tabelle 2-5 gezeigt. Hydroxylapatit
kommt im menschlichen Knochen zu 40% vor und ist im Dentin des Zahnes zu 70%
enthalten. Im Zahnschmelz sind bis 97% enthalten. Er ist das härteste Material im
menschlichen Körper (http://www.chemie.de 2012).
Die Apatitkristalle im Knochen sind unregelmäßig geformte Plättchen, mit variablen Längen
und Breiten, von durchschnittlich 30 bis 45 nm Dicke, welche entlang der Kollagenfibrillen
liegen (LeGeros 2008).
2.6 Fragestellung der vorliegenden Arbeit
Wie aus der Einleitung und Darstellung in der Literatur ersichtlich, gibt es eine Vielzahl von
Implantatwerkstoffen mit verschiedenen Oberflächenmodifikationen, die direkten Einfluss auf
das Verhalten von Zellen haben. Daher war es Ziel dieser Studie, das Wachstumsverhalten
von Vorläuferzellen auf verschiedenen Oberflächendekorationen, wie sie auch auf dentalen
Implantaten zum Einsatz kommen, zu untersuchen. Es soll anhand verschiedener Parameter
bestimmt werden, wie das Zellwachstum von der Oberflächenbeschaffenheit abhängt. Die so
gewonnenen Ergebnisse können eine Aussage über die Biokompatibilität der getesteten
Oberflächendekorationen liefern.
Es ergeben sich folgende Fragen:
1) Ist das Wachstumsverhalten der (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs von der
Oberflächenrauigkeit im Mikrometerbereich und einer Oberflächenstrukturierung im
Nanometerbereich abhängig?
2) Welchen Einfluss haben degradierbare Oberflächen auf das Wachstumsverhalten der
(+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs?
3) Werden die Zellform und Verbreitung der USSCs durch verschiedene
Oberflächenstrukturierungen beeinflusst?
21
3 Material und Methode
3.1 Geräte
Gerät Hersteller Sitz
Abzug nach DIN EN
14175, Vinitex Airflow
Vinitex
Laboreinrichtungen
GmbH und CO KG
Coswig, Deutschland
AFM, Dimension 3100 SPM Veeco Instruments S.A.S DOURDAN cedex, Frankreich
Brutschrank, cytoperm 2 Hereaus Langenselbold, Deutschland
Critical Point Dryer, CPD 030 BAL-TEC Balzers, Liechtenstein
Gefrierschrank, Forma -86 C
ULT Freezer
Thermo Scientific Marietta, OH, USA
Kryo-Anlage (-190 °C)
Aufbewahrungstank
ARPEGE 170
Stickstoffreservoir TP100
Air Liquide Medical
GmbH
Düsseldorf, Deutschland
Kühlschränke Liebherr Ochsenhausen, Deutschland
Laborschüttler ,HS 501 digital IKA®-Werke GmbH &
Co. KG
Staufen, Deutschland
Mikroliterpipette, Research Eppendorf Wesseling-Berzdorf,
Deutschland
Mikroskop, Leica DMIL Leica Wetzlar, Deutschland
Mikroskop, Leica DM5000B Leica Wetzlar, Deutschland
Neubauerzählkammer,
Improve
Assistent Sondheim, Deutschland
Pipette, Stripette Costar New York, USA
Pipettierhelfer, accu-jet Brand Wertheim, Deutschland
Scanning-Electron-
Microscope, S-3000N
Hitachi Tokyo, Japan
Sputter Coater, 108 auto Cressington Warford, England
Sterilbank, Hera Safe Hereaus Langenselbold, Deutschland
22
Tecan Reader, GENios TECAN Austria GmbH Gröding, Austria
Tecan Reader, infinite M200 TECAN Austria GmbH Gröding, Austria
Wärmebad Köttermann Uetze, Hänigsen, Deutschland
Zentrifuge, Multifuge 1 S-R Hereaus Osterode, Deutschland
3.2 Verbrauchsmaterialien
Material Hersteller Sitz
12 Well Cell Culture Plate Greiner Bio-One GmbH Frickenhausen, Deutschland
75 cm2 Cell Culture Flasks,
Canted Neck
Corning Incorporated NewYork, USA
Bechergläser Simax Tschechien
Cantilever, NSC14 MikroMasch Tallinn, Estonia
CELLSTAR 96 Well Cell
Culture Plate (transparent)
Greiner Bio-One GmbH Frickenhausen, Deutschland
Kryo-Röhrchen 1,0mL SI Nunc Roskilde, Dänemark
Nunc 96 MicroWell™ Plates,
Black
Nunc A/S Roskilde, Dänemark
Pipetten Stripette (5, Corning
Incorpotated 10 und 25mL)
Corning Incorpotated Corning (NY), USA
Pipettenspitzen, TipOne (0,1
10; 1-100; 101-1000 μl)
STARLAB GmbH Ahrensburg, Deutschland
Reaktionsgefäße Eppendorf Hamburg, Deutschland
Untersuchungshandschuhe Mai Med Neuenkirchen, Deutschland
Zentrifugenröhrchen Falcon
(15 und 50 ml)
Becton Dickinson
Labware
Franklin Lakes (NJ), USA
23
3.3 Chemikalien
Chemikalie Hersteller Sitz
Aceton Merck Darmstadt, Deutschland
Aceton getrocknet Merck Darmstadt, Deutschland
Dimethylsulphoxid (DMSO) SIGMA ALDRICH
COMPANY
Steinheim, Deutschland
Dulbecco`s
Phosphatgepufferte
Kochsalzlösung (DPBS)
Invitrogen Karlsruhe, Deutschland
GIBCO ultra URE Destilled
water, DNase, RNase Free
Invitrogen Karlsruhe, Deutschland
Glutardialdehyd
(25% ige Lösung in Wasser)
Mareck Schuchardt OHG Hohenbrunn, Deutschland
TRYPAN BLUE SOLUTION
(0,4%)
SIGMA ALDRICH
COMPANY
Steinheim, Deutschland
Trypsin / 1:250 Lonza Walkersville, USA
3.4 Medien
3.4.1 Zellkulturmedium
Chemikalie Hersteller Sitz
Dulbecco`s modified eagle
medium (DMEM)
Lonza Verviers, Belgien
Fetale Bovine Serum (FKS) Pan Biotech GmbH Aidenbach, Deutschland
L-Glutamin (200mM) Biochrom AG Berlin, Deutschland
Penicillin/ Streptomycin Biochrom AG Berlin, Deutschland
24
3.4.2 DAG
Chemikalie Hersteller Sitz
Ascorbinsäure Sigma Taufkirchen, Deutschland
Dexamethason Sigma Taufkirchen, Deutschland
ß-Glycerophosphat Sigma Taufkirchen, Deutschland
3.5 Verwendete Kits
Kit Hersteller Sitz
CyQUANT® Cell
Proliferation Assay Kit
- CyQUANT GR dye
Cell-lysis buffer
Invitrogen Oregon, USA
QuantiChrom™ Calcium
Assay Kit
- Calcium standart
- Reagent A
- Reagent B
BioAssay Systems Hayward, USA
3.6 Probenkörper
Die verwendeten Probenkörper wurden von der Firma DOT GmbH (Rostock, Deutschland)
zur Verfügung gestellt.
Alle verwendeten Prüfkörper bestehen aus Titan mit dem Reinheitsgrad 2 und wurden aus
Blechen gestanzt. Die Höhe betrug 2 mm und der Durchmessen 20mm (Abbildung 3-1). Die
Probenkörper wurden im Ultraschallbad gereinigt, gespült und danach getrocknet.
Anschließend wurden alle Probenkörper mit Hydroxylapatit (HA) gestrahlt. Das Strahlgut
wurde mit Hilfe von Säure entschichtet und die Probenkörper abschließend gespült und
getrocknet.
25
Abbildung 3-1 Abmessungen der Probenkörper
3.6.1 Bonit-Oberflächendekoration
Die Bonit-Oberfläche ist eine elektrochemisch abgeschiedene CaP- Beschichtung
(Patentnummer WO 0205862) und gehört somit zu den additiven Verfahren.
Als Grundlage dienten die im Absatz 3.6 erwähnten Titanscheiben. Diese wurden in einem
elektrolytischen Bad mit einer bioaktiven Calciumphosphatschicht versehen. Dabei setzte sich
die CaP-Phase der Beschichtung zum größten Teil aus Brushit (B) und zu einem kleineren
Teil, weniger als 5%, aus Hydroxylapaptit (HA) zusammen. Das Brushit stellte sich hier in
Form von Platten dar, die eine Länge von 10-20 µm (Abbildung 4-1 ) und eine Schichtdicke
von 15-20µm aufwiesen.
3.6.2 CaSi-Oberflächendekoration
Durch ein VPS-Beschichtungsverfahren mit Weißzement wurde auf die bereits bestehende
Primärtexturierung (durch Bestrahlen der Titanprobenkörper mit HA (Absatz 3.6)) eine
Sekundärtexturierung aufgebracht. Die CaSi-Oberflächendekoration ist in Abbildung 4-1
dargestellt.
3.6.3 DUOTex-Oberfläche
Der Primärtexturierung der gestanzten Titanscheiben (Absatz 3.6) wurde durch Doppelätzung
eine Sekundärtexturierung aufgebracht. Die so entstandene Oberflächendekoration ist der
Abbildung 4-1 zu entnehmen.
26
3.6.4 Sterilisieren der Probenkörper
Um einer Infektion, etwa durch Pilze oder Bakterien vorzubeugen, wurden die Probenkörper
sterilisiert. Dabei ist an die Bedingungen, die einem herkömmlichen dentalen Implantat
entsprechen, angeknüpft worden. Da die Bonit-Oberflächendekoration durch Einflüsse wie
erhöhte Temperatur und Feuchtigkeit ihre oberflächenspezifischen Eigenschaften verändert,
wurde die Sterilisation mit Gammabestrahlung durchgeführt. Die Strahlendosis entsprach 25
kGy, wobei die Probenkörper zuvor doppelt steril verpackt wurden.
3.6.5 Vorbehandeln der Probenkörper mit Nährmedium
Da es sich bei der Bonit Oberflächendekoration um eine biologisch abbaubare Oberfläche
handelte, waren in diesem Zusammenhang auch topografische Änderungen zu erwarten.
Diese sollten sich in einer Änderung der Oberflächenrauigkeiten (Ra und Rmax)
wiederspiegeln. Ebenfalls sollten sich für die für die Bonit und CaSi Oberflächendekorationen
Änderungen des Ca2+ Niveaus im Nährmedium zeigen.
Um die Resorption der Bonit-Oberflächendekoration, sowie zusätzlich eine Ca2+ Abgabe
dieser und der CaSi Oberflächendekoration zu provozieren, wurden die Probenkörper in
Standardnährmedium ohne DAG (Dexamethason-Ascorbinsäure-ß Glycerolphosphat)
inkubiert. Als Kontrolloberfläche für die Änderung der Oberflächenparameter und Ca2+
Abgabe diente die DOUTex Oberfläche. Die Probenkörper wurden in 12 er Wells überführt
und 2,1 ml Standartnährmedium ohne DAG hinzupipettiert. Die Proben wurden im
Brutschrank inkubiert und der Mediumwechsel erfolgte nach 24 h dann alle drei, respektive
vier Tage (Tabelle 3-1).
Tabelle 3-1 Zeiträume der Probenentnahme aus dem Überstand des Nährmediums und Mediumwechsel
Tag
1 4 7 8 11 14 15 18 22 25 28
Mediumwechsel x x x x x x x x
Probenentnahme
Ca2+
x x x x
Probenentnahme
AFM
x x
27
3.7 Berechnungen der Zellzahlen und Probenkörper
Das einzelne Well einer 12 er Wellplatte, in welche der Probenkörper gelegt wurde hatte
einen größeren Durchmesser als dieser selbst. Im Vorfeld wurde berechnet wie viele Zellen in
das Nährmedium gelangen durften um eine Zelldichte von ca. 5000 Zellen pro cm2 auf dem
Probenkörper zu erhalten. Zuerst wurden die Oberflächen der Probenkörper und der 12 er
Wellplatte berechnet (Gleichung 5 und 6). Um die nicht bedeckte Fläche des Wells zu
erhalten, wurde die Fläche des Probenkörpers von der des Wells abgezogen (Gleichung 8).
Die Flüssigkeitssäule über dem Probenkörper und die Höhe des Probenkörpers wurden als ℎ2
und ℎ1 bezeichnet. Im Folgenden wurde die Flüssigkeitssäule 𝑉1 berechnet, welche sich über
dem Probenkörper befand (Gleichung 9). Nun ließ sich errechnen wie viele Zellen (𝑍1 ) in
dieser Flüssigkeitssäule enthalten sein mussten, um eine gewünschte Anzahl pro 𝑐𝑚2 auf
dem Probenkörper auszusähen (Gleichung 10). Um das Volumen des Wells aufzufüllen,
wurde das Volumen (𝑉2) der unbedeckten Fläche des Wells mit der Summe der Höhen aus
(ℎ1) und (ℎ2) errechnet (Gleichung 11). Das Gesamtvolumen (𝑉𝑔𝑒𝑠.) des Nährmediums wurde
wie folgt berechnet (Gleichung 12):
𝐴𝑂 𝑃𝑟𝑜𝑏𝑒𝑛𝑘ö𝑟𝑝𝑒𝑟 = 𝜋𝑟2 (6)
𝐴𝑂 𝑊𝑒𝑙𝑙 = 𝜋𝑟2 (7)
𝐴 𝑂 𝑅𝑒𝑠𝑡𝑓𝑙ä𝑐ℎ𝑒 = 𝐴𝑂 𝑊𝑒𝑙𝑙 − 𝐴𝑂 𝑃𝑟𝑜𝑏𝑒𝑛𝑘ö𝑟𝑝𝑒𝑟 (8)
𝑉1 = ℎ2 ∙ 𝐴𝑂 𝑃𝑟𝑜𝑏𝑒𝑛𝑘ö𝑟𝑝𝑒𝑟 (9)
𝑍1 = 𝑍𝑒𝑙𝑙𝑒𝑛 𝑝𝑟𝑜 𝑐𝑚2 ∙ 𝐴𝑂 𝑃𝑟𝑜𝑏𝑒𝑛𝑘ö𝑟𝑝𝑒𝑟 (10)
𝑉2 = (ℎ1 + ℎ2) ∙ 𝐴𝑂 𝑅𝑒𝑠𝑡𝑓𝑙ä𝑐ℎ𝑒 (11)
𝑉𝑔𝑒𝑠. = 𝑉1 + 𝑉2 (12)
Über den Dreisatz konnte nun errechnet werden, wie viele Zellen sich in 𝑉𝑔𝑒𝑠. befinden
mussten, um die gewünschte Zellzahl pro 𝑐𝑚2 auf dem Probenkörper auszusähen.
Weiterhin wurde in Tabelle 3-2 eine Übersicht erstellt, welche zeigt, wie viele Probenkörper
pro Versuch benötigt wurden. Dabei sind die Versuche zur Bestimmung der Zellzahlen 3-mal
wiederholt worden. Somit setzte sich die Anzahl von 12 Probenkörpern für die jeweiligen
Versuche folgendermaßen zusammen, für jeden Versuchstag und jede Oberfläche wurden 2
Prüfkörper benötig. Der Versuch wurde jeweils 3-mal mit nicht vordifferenzierten ((-)DAG)
28
und mit vordifferenzierten ((+) DAG) USSCs wiederholt. Die Zellen stammten von einem
humanen Spender und befanden sich in derselben Passage, so dass diese untereinander
identisch sind.
Tabelle 3-2 Anzahl der Probenkörper pro Versuch
Anzahl Probenkörper pro Versuchsaufbau
Oberfläche Tag REM AFM Ca2+ Abgabe Zellzahlen Zellzahlen nach
Änderung
OF-Parameter
Bonit
0 1 1 1 - -
1 2 - - 12 12
7 2 - - 12 12
14 2 + 1* 1* 1* 12 -
28 2 + 1* 1* 1* 12 -
CaSi
0 1 1 1 - -
1 2 - - 12 -
7 2 - - 12 -
14 2 1* 1* 12 -
28 2 1* 1* 12 -
DUOTex
0 1 1 1 - -
1 2 - - 12 12
7 2 - - 12 12
14 2 + 1* 1* 1* 12 -
28 2 + 1* 1* 1* 12 - *= gleiche Probenkörper für REM/ und AFM, diese wurden 14, und 28 Tage in Nährmedium im Versuch Ca2+ Messung
inkubiert und dann entnommen
3.8 Oberflächentestung
3.8.1 AFM (Atomic-Force-Microscope)
Um eine adäquate Bestimmung der Oberflächenmorphologie vorzunehmen, wurde mit dem
AFM gearbeitet. Durch die extrem hohe Auflösung auf atomarer Ebene war es möglich,
Oberflächenstrukturen im Mikro- und Nanometerbereich zu untersuchen.
Beim AFM diente ein kleiner Hebelarm (Cantilever), an dessen Unterseite sich eine
nanoskopisch kleine Spitze befand, als zentrale Messeinheit. Wurde der Cantilever Zeile für
Zeile über die zu untersuchende Oberfläche geführt, so konnten die Biegungen oder
Auslenkungen aufgrund der Wechselwirkung zwischen Oberfläche und Spitze mit einem
29
Laserstrahl detektiert werden. Der Laser wurde auf den Cantilever geleitet und von dort zu
einer Messeinheit reflektiert, welche die Position der Spitze ermittelte. Dabei konnte das
AFM entweder im Kontaktmodus, bei welchem zwischen Spitze und Werkstoffoberfläche
ständiger Kontakt besteht, oder wie in dieser Studie dem „Tapping-Modus“ genutzt werden.
In diesem Modus wird der Cantilever in Schwingungen nahe der eigenen Resonanzfrequenz
gebracht. Zu einer Verringerung der Schwingungsamplitude kam es, wenn sich die Spitze der
Probe annäherte und sich durch Wechselwirkungskräfte (bsp. Van-der-Waals-Kräfte) mit der
Oberfläche die Schwingungsamplitude änderte.
Mit Hilfe der Software „NanoScope 6.13R1“ wurden die Oberflächenstrukturierungen der
verschieden Probenkörper analysiert. Zum Ermitteln der Oberflächenparameter Ra und Rmax
im µm Bereich wurde ein repräsentativer Bereich von 600 µm2 ausgewählt. Dieser entsprach
in etwa der Fläche die eine ausgewachsene USSC Zelle in Anspruch nimmt und sollte
Aufschluss über die Beschaffenheit des Wachstumsuntergrundes liefern. Ebenfalls konnten
laterale Abstände und Höhenunterschiede im Nanometerbereich vermessen und ausgewertet
werden.
Die Probenkörper wurden direkt nach der Gammasterilisation mit dem AFM begutachtet.
Ebenfalls wurden Probenkörper an den Tagen 14 und 28, nach der Inkubation topographisch
begutachtet. Dazu wurden diese entnommen und mit Aqua dest. gespült und getrocknet. Um
die Probenkörper nicht nur mit dem AFM, sondern auch mit dem REM begutachten zu
können, wurden diese, analog Absatz 3.12.1, leitfähig gemacht.
3.8.2 Abgabe von Ca2+ Ionen
Das Ziel dieser Untersuchung war die Bestimmung der freien Ca2+ Ionen im Überstand des
Nährmediums. Dadurch ließ sich sowohl eine Aussage über das freie Ca2+ direkt im Medium
treffen, als auch über die Beständigkeit der Beschichtung der Oberflächendekoration in
Verbindung mit dem Nährmedium. Da freie Ca2+ Ionen auch in Verbindung mit dem
Wachstumsverhalten von Zellen stehen, konnten diese Ergebnisse weiteren Aufschluss
liefern.
Zum Feststellen der Menge des Ca2+ wurde mit dem QuantiChrom™ Calcium Assay Kit
gearbeitet. Dieses basierte auf Phenolsulfonphthalein, einem Farbstoff der speziell mit Ca2+
einen stabilen blauen Farbkomplex bildete. Die Intensität der Farbe wurde bei einer
Wellenlänge von 612 nm gemessen und war somit direkt proportional zur
30
Calciumkonzentration in der Probe (http://www.bioassaysys.com). Durch den Vergleich der
Werte mit einer zuvor erstellten Standardkurve wurde so die Menge an Ca2+ ermittelt.
Standardkurve und Workingreagent:
Zum Erstellen der Standardkurve wurde eine Verdünnungsreihe vom mitgelieferten Standard
erstellt. Dazu wurde der im Kit enthaltene Calciumstandard mit destilliertem Wasser, wie in
Tabelle 3-3 aufgelistet, verdünnt. Dies geschieht in Eppendorf-Cups, welche anschließend bei
4°C gelagert wurden.
Tabelle 3-3 Verdünnung des Ca2+ Standards
Ca2+ Standard [µl] Aqua dest. [µl]
Enthaltene Menge an
Ca2+
[mg/dl]
100 0 20
80 20 16
60 40 12
40 60 8
30 70 6
20 80 4
10 90 2
0 100 0
Anschließend wurde das Workingreagent bestehend zu gleichen Teilen aus Reagent A und
Reagent B in einem Gesamtvolumen von 13 ml angesetzt. Folgend wurden im dreifachen
Ansatz je 5 µl aus den hergestellten Standards abpipettiert und in ein 96 er Well überführt. Es
wurden danach 200 µl Workingreagent hinzupipettiert und die Suspension vorsichtig
vermischt.
Entnahme und Messung der Proben:
An den Tagen, wie in Tabelle 3-1 aufgelistet, wurden 35 µl aus dem Überstand des
Nährmediums entnommen, in ein Eppendorf Cup überführt und bei – 80 °C eingefroren. Am
Tag des Versuchs wurden die Proben aus dem Tiefkühler entnommen und aufgetaut. Es
31
wurden aus jeder Probe im dreifachen Ansatz 5 µl in das 96 er Well überführt. Anschließend
sind 200 µl Workingreagent hinzupipettiert worden und die Suspension wurde vorsichtig
gemischt. Es folgte eine Inkubation von drei min. bei Raumtemperatur. Die Messung der
Absorption wurde bei einer Wellenlänge von 612 nm vorgenommen.
3.9 Zellen
Es wurden multipotente humane unrestringierte somatische Stammzellen (USSC) aus
Nabelschnurblut verwendet. Diese wurden in der José Carreras Stammzellbank des Instituts
für Transplantationsdiagnostik und Zelltherapeutika der Heinrich-Heine Universität
Düsseldorf mit dem Einverständnis der Eltern und der Ethikkommission der Heinrich Heine
Universität aus gespendetem Nabelschnurblut isoliert. Die Zellen wurden von Prof. Dr. rer.
nat. G. Kögler, dem Labor der Klinik für Mund-, Kiefer- und Plastische Gesichtschirurgie zur
Verfügung gestellt.
3.10 Zellbiologische Methoden
3.10.1 Herstellung Nährmedium
Für die Herstellung des Nährmediums wurden 350 ml Dulbecco`s modified eagle medium
(DMEM) benötigt. Dazu wurden aus der Originalflasche 150 ml abpipettiert und in einem
sterilen Gefäß gesammelt. Zu den übrigen 350 ml wurden 150 ml FCS, 5 ml Penicillin /
Streptomycin und 5 ml L-Glutamin hinzupipettiert. Die Flasche wurde anschließend
vorsichtig geschwenkt um eine gute Durchmischung zu erlangen.
3.10.2 Zellkultur
Die USSCs aus der Stammzellbank sind in Kryo-Röhrchen, in Flüssigstickstoff bei -196 °C
gelagert worden. Das Auftauen und Kultivieren wird im Folgenden beschreiben.
Als erstes wurden 10 ml Nährmedium in ein Falcontube vorgelegt. Die gefrorenen USSCs
wurden im Wasserbad auf ca. 36°C erwärmt. Danach wurden die Zellen in das vorbereitete
Falcontube überführt. Dazu wurden sie mit 5 ml des Nährmediums verdünnt und mit einer
Pipette aufgenommen. Dieses Gemisch wurde vorsichtig vermengt und wieder zu den
32
restlichen 5 ml im Falcontube hinzupipettiert. Anschließend wurde die Mischung mit einem
passenden Gegengewicht bei einer G-Zahl von 470 für sieben min. bei 4 °C zentrifugiert.
Weiterhin wurden 10 ml Nährmedium in eine 75 cm2 Zellkulturflasche gefüllt. Das
überschüssige Nährmedium wird nach dem Zentrifugieren vom Zellpallet durch abpipettieren
entfernt. Durch Ein- und Auspipettieren, mit 5 ml Nährmedium wurde das Zellpallet
aufgelöst. Anschließend wurde die 5 ml Suspension (Mischung aus Nährmedium und USSCs)
zu den 10 ml Nährlösung in die Zellkulturflasche pipettiert. Die gefüllten Zellkulturflaschen
sind geschwenkt worden, um eine gleichmäßige Verteilung der USSCs zu gewährleisten und
wurden anschließend im Brutschrank bei 37°C / 5% CO2 / 21% O2 / und 95% Luftfeuchte
gelagert.
3.10.3 Passagieren
Die USSCs wurden bei einer Konfluenz von ca. 80 % passagiert, da es sonst zu einer
Differenzierung der Zellen gekommen wäre. Das Splitten der USSCs erfolgte in einem
Verhältnis von eins zu drei.
Das Nährmedium wurde aus der Zellkulturflasche abpipettiert und anschließend mit 10 ml
DPBS gespült. Folgend werden der Zellkultur 10 ml DPBS zugegeben und diese für 5 min.
im Brutschrank inkubiert. Anschließend wurde das DPBS abpipettiert und 5ml Trypsin
hinzupipettiert, welches zuvor im Wasserbad auf 37 °C vorgewärmt wurde. Die USSCSs
wurden nun mit dem Trypsin acht min. im Brutschrank inkubiert. In dieser Zeit wurden 15 ml
des Nährmediums (im Wasserbad vorgewärmt auf 37°C) in ein Falcontube gefüllt. Die
USSCs werden dem Brutschrank acht min. später entnommen. Um die die USSCs zu lösen
wurde die Zellkulturflasche klopfenden Bewegung unterzogen. Um die Wirkung des Trypsins
aufzuheben wurden die abgelösten USSCs in das mit 15 ml Nährmedium vorbereitete
Falcontube pipettiert. Nach dem Zentrifugieren bei einer G-Zahl von 470 für sieben min. bei 4
°C, wurde das überschüssige Nährmedium abpipettiert und 45 ml der Nährlösung
hinzupipettiert. Weiterhin wurde durch Auf- und Abpipettieren des Nährmediums, das
Zellpallet aufgelöst, so dass eine Suspension aus USSCs und Nährmedium entstand. Im
Anschluss wurden je 15 ml auf drei Zellkulturflaschen verteilt. Die gefüllten
Zellkulturflaschen wurden geschwenkt um eine gleichmäßige Verteilung der USSCs zu
gewährleisten und anschließend im Brutschrank gelagert.
33
3.10.4 Kryokonservierung
Um USSCs bei -196°C in Flüssigstickstoff für längere Zeit lagerbar zu machen müssen diese
speziell behandelt werden, denn durch die Bildung von Eiskristallen wird die Zellmembran
beschädigt.
Die Zellen wurden analog Absatz 3.10.3 von der Zellkulturplatte gelöst, zentrifugiert und in
einer Konzentration von 1x106 Zellen in 900µl 40 – 50%igem FCS (in Standardnährmedium)
resuspendiert. Dann wurden 100 μl Dimethylsulfoxid (DMSO) in die Kryoröhrchen vorgelegt
und 900 μl von der Zellsuspension zupipettiert. Unmittelbar danach wurden die Zellen bei -80
°C eingefroren und am nächsten Tag in Flüssigstickstoff transferiert.
3.10.5 Vordifferenzieren der USSC
Um die USSCs osteogen vorzudifferenzieren wurde einem Volumen von 15 ml des
Standardnährmediums DAG in folgender Zusammensetzung hinzugefügt:
Stammlösung: 10-4 M Dexamethason im Medium: 10-7M
Stammlösung: 50 mM Ascorbinsäure im Medium: 50µM
Stammlösung: 1 M ß- ß-Glycerophosphat im Medium: 10mM
Nach drei Tagen Inkubation in DAG-haltigem Nährmedium wurden die USSCs auf die
Probenkörper ausgesät.
3.10.6 Aufbringen der Zellen auf die Prüfkörper
Die Probenkörper wurden mit einer Pinzette aus der Verpackung genommen und in die Wells
einer 12 er Wellplatte überführt. Sie wurden so positioniert, dass die zellaktiven
(Oberflächendekorierte) Seiten oben lagen und sich eine Well-Reihe Abstand zwischen den
Probenkörpern befand. Folgend wurden, wie im Abschnitt 3.10.3 beschrieben, die USSCs von
den Zellkulturflaschen gelöst und eine Suspension aus gelösten Zellen und Nährmedium
hergestellt, bei welcher jedoch nur mit 2 ml Nährmedium resuspendiert wurde. Anschließend
ist die Anzahl der Zellen mit Hilfe einer TRYPAN BLUE SOLUTION und der Neubauer-
34
Zählkammer bestimmt worden. Danach wurde die, für den Versuchsaufbau benötigte Menge
an Nährmedium der zugehörigen Menge an Zellen beigefügt.
Im Anschluss wurde die Zellsuspension gut, durch Auf- und Abpipettieren, gemischt und
somit homogenisiert. Im Weiteren wurden 2,1 ml der Zellsuspension in die Wellplatten mit
den Probenkörpern gefüllt. Hierbei war darauf zu achten, die Befüllung nur für 2 Wellplatten
vorzunehmen, da die Zellen in der Pipette sehr schnell absanken und bei größeren Volumina
Ungenauigkeiten entstehen konnten. Weiterhin wurde der Vorgang der Homogenisierung der
Zellsuspension nach jedem Pipettiervorgang wiederholt, was ebenfalls ein Absinken der
Zellen innerhalb des Gefäßes verhinderte. Die Wellplatten mit den Probenkörpern und der
Zellsuspension wurden danach im Brutschrank gelagert.
3.10.7 Umsetzen der Probenköper
24 Stunden nach der Aussaat der USSCS auf die Probenkörper wurde diese in neue Wells
überführt. Der Grund dafür war die kleinere Oberfläche des Probenkörpers im Vergleich zu
der 12er Wellplatte. Die ausgesäten Zellen sanken im Nährmedium ab und durch die
Oberflächendifferenz auch auf einen gewissen Anteil des 12 er Wells. Im späteren Verlauf
hätten sich Zellen vom 12 er Well an den Rand oder unter den Probenkörper heften können,
was die Messergebnisse verfälscht hätte.
Anfangs wurden 2,1 ml Nährmedium, welches vorher im Wasserbad bei auf 37 °C erwärmt
wurde, in 12 er Wells pipettiert. Anschließend wurden die Probenkörper vorsichtig mit einer
sterilen Pinzette in die mit frischem Nährmedium gefüllten Wells gelegt.
3.10.8 Mediumwechsel
Der Mediumwechsel wurde in einem drei, respektive vier tägigen Rhythmus durchgeführt.
Um beim Mediumwechsel die USSCs nicht von der Oberfläche der Prüfkörper zu spülen,
wurde auf eine 1000 er Pipette zurückgegriffen. Diese besaß eine sehr schlanke Spitze und
somit konnte in dem Spalt zwischen Probenkörper und 12 er Well gearbeitet werden. Anfangs
wurde die benötigente Menge Nährmedium berechnet und von einer 500 ml Flasche in ein 50
ml Falconröhrchen pipettiert. Diese wurden im Wasserbad bei 37 °C warm gestellt. Dann
wurde mit der Pipette eine Spitze aufgenommen und das alte Nährmedium aus dem Well,
respektive aus dem Spalt zwischen Probenkörper und 12 er Wellplatte, pipettiert. Die Spitze
wurde entsorgt und eine neue aufgenommen, mit welcher aus dem Falcon frisches
35
Nährmedium in das Well, bzw. den Spalt, pipettiert wurde. Anschließend wurden die Wells
wieder im Brutschrank gelagert.
3.11 Testung der Biokompatibilität
3.11.1 Bestimmung der Zellzahlen
Zum Bestimmen der Zellzahlen wurde mit dem „CyQUANT cell proliferation assay“
gearbeitet. Die Prüfmethode nutzte einen Fluoreszenzfarbstoff, der an die zelluläre
Nucleinsäure band. Dies führte mit aufsteigender Menge an Nucleinsäure zu einer linearen
Erhöhung der Fluoreszenz. Durch einen Vergleich der Fluoreszenzwerte mit einer
Standardkurve war es möglich die Zellzahl zu ermitteln. Nach Jones (Jones, Gray et al. 2001)
korrelieren Intensität der emittierten Fluoreszenz und die Anzahl der Zellen über einen großen
Bereich sowie Typenvielfalt.
Stammlösung:
Zur Herstellung der Stammlösung wurden unter Lichtausschluss „Cell Lysis Buffer“ und
„DNAse/RNAse freies Wasser“ in einem Verhältnis von 1 zu 20 gemischt und anschließend
150µl „CyQuant GR reagent“ zugegeben.
Standardkurve:
Es wurde eine Standardkurve erstellt. USSCs gleichen Spenders und gleicher Passage wurden
kultiviert, geerntet und ein Zellpallet aus 500000 USSCs hergestellt. Dieses wurde bei – 80 °C
gelagert.
Am Tag der Messung wurde das Pallet aufgetaut, sein Volumen mit einer Pipette bestimmt
und dies auf ein Gesamtvolumen von einem ml mit der Stammlösung aufgefüllt. Nach gutem
Vermischen wurde die Suspension unter Ausschluss von Licht sechs min. bei
Raumtemperatur gelagert. Im Folgenden wurden in eine schwarze 96 er Wellplatte
Stammlösung und Zellsuspension in dreifachem Ansatz laut Tabelle 3-4 pipettiert.
36
Tabelle 3-4 Verdünnungsreihe zum Erstellen der Standardkurve
Anzahl Zellen in 200 µl Stammlösung in µl Zellsuspension in µl
40000 120 80
30000 140 60
20000 160 40
10000 180 20
5000 190 10
2500 195 5
0 200 0
Entnahme und Messung der Proben:
Bevor die Proben ausgewertet werden konnten, wurden sie entnommen und mindestens für
einen Tag bei – 80°C gelagert. Dazu wurden die Proben an den Tagen 1,7,14 und 28 aus den
jeweiligen Versuchsdurchläufen entnommen. Sie wurden mit einer sterilen Pinzette vorsichtig
in ein Well mit DPBS gelegt, was dazu diente nicht adhärente Zellen zu beseitigen und Reste
des rotfarbenen Nährmediums, welches spätere Messergebnisse verfälschen würde zu
eliminieren. Danach wurden die Probenkörper in ein beschriftetes 12 er Well überführt und
bei – 80°C gelagert.
Am Tag der Messung sind die Probenkörper bei Raumtemperatur aufgetaut worden.
Anschließend wurde zu jedem Probenkörper 700 µl der Stammlösung hinzupipettiert. Im
Anschluss wurden die Wells für fünf min., unter Ausschluss von Licht, auf einen Rüttler
gestellt. Danach sind die Oberflächen mit der sich in den Wells befindlichen Stammlösung
gespült worden. Aus jedem 12 er Well wurden nun im dreifachen Ansatz 200µl entnommen
und zu der 96 er Well-Platte pipettiert. Im Anschluss folgte die Fluoreszenzmessung bei einer
Extinktion von 480 nm und einer Emission von 520 nm.
3.12 Morphologie Zelle und Oberfläche
3.12.1 Rasterelektronenmikroskopie
Um die Morphologie der Zellen, ihre Interaktion untereinander und mit der Oberfläche
beurteilen zu können, wurde mit dem Rasterelektronenmikroskop (REM) gearbeitet. Dies
37
hatte zum Einen den Grund, dass die Probenkörper nicht transparent waren, zum Anderen war
die Auflösung eines Lichtmikroskops durch die Wellenlänge des Lichts eingeschränkt. So
ließen sich mit dem REM theoretisch bis zu 500000-fache Vergrößerungen realisieren, wo
hingegen das Lichtmikroskop auf eine knapp 2000-fache Vergrößerung limitiert ist
(http://www.unibas.ch).
Beim REM wurde im Hochvakuum gearbeitet, Elektronen wurden aus einem Wolframdraht
gelöst, mit Hilfe eines elektromagnetischen Feldes beschleunigt und mit elektromagnetischen
Linsen gebündelt. Folgend wurde die Oberfläche mit dem Elektronenstrahl Zeile für Zeile
erfasst. Dabei traten Sekundärelektronen aus, die detektiert und in ein Bild umgewandelt
wurden.
Da es sich bei den USSCs auf den Probenkörpern um biologische Proben handelte, welche
Flüssigkeit enthielten, mussten diese für die Rasterelektronenmikroskopie vorbereitet werden.
Anderenfalls konnte es beim Aufbau des Vakuums im REM zum Zerstören der Proben
(USSCs) durch explosionsartiges Verdampfen der enthaltenen Flüssigkeit kommen. Aus
diesem Grund wurden die Proben fixiert, dehydratisiert getrocknet und letztendlich elektrisch
leitfähig gemacht.
Fixieren und Dehydratisieren:
Zuerst erfolgte eine Fixierung. Dazu wurden die Proben an den Tagen 1, 7, 14 und 28
entnommen, vorsichtig mit DPBS gespült und anschließend für 24 h in 2,5 % Glutardialdehyd
in DPBS, in einem 12 er Well inkubiert.
Folgend wurden die Proben in einer aufsteigenden Acetonreihe (60,70, 90 und 99 %) in Aqua
dest. für 40 min. dehydratisiert. Im Anschluss erfolgte eine 24 h lange Lagerung der Proben in
getrocknetem Aceton. Für beide Vorgänge wurden Bechergläser verwendet, welche mit
Alufolie abgedeckt wurden.
Punkttrocknen und Sputtern:
Nun erfolgte das kritische Punkttrocknen, bei welchem erst Aceton gegen CO2 substituiert
wurde. Wurde folgend die Temperatur im Punkttrockner oberhalb des kritischen Punktes
gehalten (kritischer Punkt CO2 = 73 bar und 31°C), konnte durch Druckverminderung eine
Trocknung der Probe erreicht werden. Dabei wurde die Phasengrenze „Gas-Flüssig „ nicht
durchlaufen, was Oberflächenspannungen und folgende Deformationen verhinderte.
38
Im Anschluss wurden die Proben durch Sputtern leitfähig gemacht. Dazu wurden die Proben
auf ein Kohleplättchen mit Metallsockel geklebt und in die Probenkammer überführt. In
dieser wurde ein Vakuum erzeugt und anschließend mit Argon geflutet. Durch das Anlegen
einer Spannung wurden Atome aus dem Target (Goldfolie) durch Beschuss mit
energiereichen Ionen (Argon) gelöst, diese gingen in die Gasphase über und lagerten sich
dann auf der Probenoberfläche ab.
Betrachten der Proben im REM:
Zuletzt wurden die Proben in das Rasterelektronenmikroskop überführt. Um die Proben zu
betrachten musste dort ein Hochvakuum geschaffen, eine Beschleunigungsspannung von 25
kV angelegt, sowie eine „working distance“ von 16,5 mm eingestellt werden.
3.13 Statistische Methoden
Die Erfassung der Messdaten erfolgte mit „Microsoft Office Excel 2007“.
Zum Untersuchen der statistischen Zusammenhänge wurden explorative Datenanalysen
durchgeführt. Für die statistischen Auswertungen wurde das Programm R 2.15.0 (R
Development Core Team 2012) verwendet. Zunächst wurde mit dem Shapiro-Wilk-Test,
sowie mit einem Q-Q-Plot geprüft, ob die Daten normalverteilt waren. Waren die zu
vergleichenden Stichproben nicht normalverteilt, wurde der Wilcoxon-Mann-Whitney-Test
verwendet, um Stichprobenunterschiede zu prüfen. Für normalverteilte Stichprobenwerte
wurde mit Hilfe des F-Tests bestimmt, ob die Voraussetzung der Varianzengleichheit
innerhalb beider Stichproben erfüllt war. War dies der Fall, wurde der t-Test für gleiche
Varianzen verwendet, um auf Stichprobengleichheit zu testen. Bei ungleichen Varianzen
wurde der t-Test für ungleiche Varianzen verwendet, um auf Stichprobengleichheit zu testen.
Es wurde durchgängig ein Signifikanzniveau von α=5% angenommen.
Um die Zusammenhänge zwischen den Zellzahlen und den Oberflächenrauigkeiten genauer
zu untersuchen, wurden nicht-lineare Regressionsanalysen durchgeführt. Dazu wurde das
Programm STATA/SE 12.0 (StataCorp 2011) genutzt.
39
4 Ergebnisse
4.1 Oberflächentestung
4.1.1 Morphologie
Um die Morphologie der Implantatoberflächen im Mikrometerbereich genauer zu beurteilen,
wurden die verschiedenen Oberflächen mit dem Rasterelektronenmikroskop (REM) und mit
dem AFM (Atomic-Force-Microscope) untersucht. Abbildung 4-1 zeigt die verschiedenen
Oberflächendekorationen nach der Gammasterilisierung.
Abbildung 4-1 Aufnahme der Oberflächendekorationen nach der Gamma-Sterilisation. Die Bilder auf der linken Seite wurden mit
dem Rasterelektronenmikroskop (Balken = 10µm) und auf der rechten Seite mit dem AFM (Atomic-Force-Microscope)
aufgenommen.
40
In der Abbildung 4-1 ist die Bonit Oberflächendekoration zu sehen. Bei der
rasterelektronenmikroskopischen Aufnahme war eine 100%ige Bedeckung der Oberfläche mit
Platten (vornämlich aus Brushit (B)) mit einer Länge 10-20 µm zu erkennen. Die
Überprüfung der Topografie mit dem AFM zeigte, dass es sich um eine
Oberflächenstrukturierung handelt, die über viele Höhen und Tiefen verfügt (primär), mit
einer kristallinen Struktur überzogen ist (sekundär) und im Allgemeinen eher rau erscheint.
Die Topografie zeigte für die CaSi Oberflächendekoration primär eine weniger raue
Oberfläche, welche durch das Strahlen mit Hydroxylapatit hohe und tiefe Gebiete besaß.
Außerdem sind feine Strukturierungen zu beobachten, die sich als Sekundärrauigkeit über die
Primärrauigkeit erstrecken.
Für die DUOTex Oberflächendekoration war deutlich die Primärrauigkeit feststellbar, welche
ebenfalls durch das Bestrahlen mit (HA) entstand. Die Sekundärrauigkeit, welche durch die
doppelte Ätzung geschaffen wurde, ließ sich ebenfalls gut erkennen.
4.1.2 Strukturierung im Nanometerbereich
Nachfolgend wurde untersucht welche Strukturierung im Nanometerbereich auf den
Oberflächen vorzufinden war. Mit Hilfe des AFM wurden die Morphologie, laterale
Abstände, sowie Höhenunterschiede bestimmt. Die Abbildung 4-2 zeigt die verschiedenen
Oberflächendekorationen im Nanometerbereich für den Startpunkt (Tag Null nach der
Sterilisation).
Die Bonit Oberflächendekoration bestand, wie bereits beschrieben, aus einer bioaktiven
Calciumphosphatschicht. Diese setzte sich zum größten Teil aus Brushit (B) und zu einem
kleineren Teil, weniger als 5%, aus Hydroxylapaptit (HA) zusammen. Eine
Oberflächenstrukturierung, welche geringe laterale Ausprägungen (Abstände) besaß, ließ sich
nicht feststellen. Die Plattenoberfläche wies eine eher glatte Struktur auf.
Für die CaSi Oberflächendekoration ließen sich laterale Abstände im Nanometerbereich
messen, welche eine regelmäßige Struktur hatten und eine eher abgerundete Form aufwiesen.
Die lateralen Abstände zwischen zwei „Bergspitzen“ lagen zwischen 113 nm und 158 nm.
Die Höhenunterschiede zwischen den Bergspitzen und Tälern betrugen ca. 40 nm.
Die DUOTex Oberfläche zeigte ebenfalls eine Strukturierung im Nanometerbereich, diese
hatte eine hügelige Form. Es konnten laterale Abstände zwischen zwei „Bergespitzen“ von 41
nm bis 57 nm und Höhenunterschiede von 5 nm (im Bereich zwischen grünen und blauen
Balken) gemessen werden.
41
Abbildung 4-2 Oberflächen aufgenommen mit AFM (im tapping-mode) in einen Bereich von 500 nm zur Bestimmung der lateralen
Abstände im Nanometerbereich. Die Abbildungen auf der linken Seite stellen das mit dem AFM aufgenommene Bild der
verschiedenen Oberflächen mit horizontaler Vermessungslinie und Messpunkten dar. Über die Vermessungslinie lässt sich das
Höhenprofil der Oberflächen erstellen. Mit Hilfe der Messpunkte können einzelne Bereiche markiert und vermessen werden. Das
Höhenprofil der Oberflächen und die Messpunkte sind auf der rechten Seite abgebildet.
42
4.1.3 Abbau der Bonit Oberflächendekoration
Die Bonit Oberflächendekoration bestand aus löslichen Calciumphosphaten, welche in vitro,
so wie in vivo abgebaut, respektive degradiert werden können. Der Abbau und die
Morphologie der Bonit Oberflächendekoration wurden mit dem REM und dem AFM
untersucht. In Abbildung 4-3 ist der Abbau der Bonit Oberflächendekoration durch die
Inkubation in Nährmedium über einen Zeitraum von 1, 14 und 28 Tagen dargestellt. Beim
Nährmedium handelte es sich um das Standartnährmedium für die USSCs, ohne den Zusatz
von DAG.
Abbildung 4-3 Aufnahme der Bonit Oberflächendekoration nach Inkubation für 1,14 und 28 Tage im Nährmedium. Die Aufnahmen
wurden mit dem (REM) Rasterelektronenmikroskop (Balken = 10 µm.), sowie dem AFM (Atomic-Force-Microscope) gemacht.
Deutlich ist zu erkennen, wie sich die Oberfläche ab- und umbaut, bzw. degradiert wird.
43
An Tag eins waren keine Veränderungen der Oberflächenstruktur zu erkennen. Sie wies rein
optisch die gleichen Eigenschaften auf, wie sie bereits in Abschnitt 4.1.1 beschrieben wurden.
Vierzehn Tage nach Inkubation im Nährmedium ließ sich eindeutig feststellen, dass sich die
kristalline Struktur aufzulösen begann. Die Primärstruktur schien glatter zu werden und
Kanten waren nicht mehr zu beobachten. 28 Tage nach Inkubation im Nährmedium ließ sich
ein Voranschreiten dieses Vorgangs beobachten. Die kristalline Struktur auf der Oberfläche
wurde weiterhin abgebaut.
4.1.4 Rauheit der Oberflächen
Um die Rauheit der Oberflächen zu beschreiben wurden die Parameter Ra und Rmax über
einen Bereich von 600 µm² bestimmt. Die Oberflächenbeschaffenheit wurde mit dem AFM
dargestellt. Die Messungen der verschiedenen Parameter der Oberflächen sind in Tabelle 4-1
abgebildet.
Tabelle 4-1 Messwerte der Oberflächenrauigkeit
Oberfläche Ra [µm] Rmax [µm]
Bonit 1,234 7,981
Bonit nach 14 Tagen in Kulturmedium 0,865 6,982
Bonit nach 28 Tagen in Kulturmedium 0,834 6,286
CaSi 0,669 4,935
CaSi nach 28 Tagen in Kulturmedium 0,663 4,575
DUOTex 0,537 4,009
DUOTex nach 28 Tagen in Kulturmedium 0,542 4,382
Alle Proben wurden gammasterilisiert und die Messung erfolgte in einem Bereich von 600 µm² mit dem AFM im „Tapping-Mode“.
Die Messungen wurden in einem Gebiet von 20 µm mal 30 µm vorgenommen, um so der
Fläche einer sich ausbreitenden Zelle gerecht zu werden. Es war ersichtlich, dass die
verschiedenen Oberflächendekorationen unterschiedliche Werte für die mittlere
Oberflächenrauigkeit (Ra) aufwiesen. So konnten die höchsten Ra Werte bei der Bonit
44
Oberflächendekoration und die geringsten bei der DUOTex Oberfläche gemessen werden.
Nach einer Inkubation im Nährmedium zeigten sich für die CaSi und DUOTex Oberfläche
keine Änderungen für den arithmetischen Mittenrauwert (Ra). Hingegen wurde bei der Bonit
Oberflächendekoration eine Abnahme des mittleren Rauwertes (Ra) nach Inkubation im
Nährmedium über 14 bzw. 28 Tage beobachtet.
4.1.5 Ca2+Abgabe
Um zu untersuchen, ob die Bonit und CaSi Oberflächendekorationen Ca2+ an die Umgebung
abgeben, wurde die Menge an freiem Ca2+ im Nährmedium bestimmt. Dazu wurde, wie im
Material und Methoden Teil beschrieben, mit dem QuantiChrom™ Calcium Assay Kit
gearbeitet. In Abbildung 4-4 sind die Werte für freie Ca2+ Ionen im Zellkulturmedium, in
welchem sich die Probenkörper befanden, dargestellt.
Abbildung 4-4 Gegenüberstellung der Ca2+ Menge aus dem Nährmedium in dem die Probenkörper (Bonit, CaSi, und DUOTex)
ohne Zellen inkubiert wurden. Gemessen wurde an den Tagen 1, 7, 14 und 28.
Zu beachten war, dass außer am Tag 1 (turnusmäßiger Wechsel des Nährmediums bei allen
Versuchen mit USSCs) die Messpunkte je 96 h nach einem Mediumwechsel lagen. In den
Versuchen zur Bestimmung der Biokompatibilität wurde das Nährmedium der USSCs,
abwechselnd in einem Zeitraum von 3 und 4 Tagen ausgetauscht. Die Messungen des Ca2+
45
ohne Zellen spiegeln die Veränderungen innerhalb dieses Zeitraums wieder. Die Bonit und
CaSi Oberflächendekoration zeigten an Tag 1 eine Freisetzung und somit Erhöhung von Ca2+
Ionen im Nährmedium, verglichen zur DUOTex Oberfläche. An Tag 7 näherte sich der Ca2+
Level im Nährmedium für alle Oberflächen an. Am Tag 14 und 28 wurde ein Abfall der Ca2+
Konzentration im Nährmedium der Bonit Oberflächendekoration, verglichen zur DUOTex
Oberfläche und CaSi Oberflächendekoration beobachtet.
4.2 Biokompatibilität
4.2.1 Zellzahlen USSC
Die Ergebnisse der Biokompatibilität beruhen auf den mittleren Zellzahlen der (+) DAG
USSCs und (-) DAG USSCs. Von diesen wurden je 5000 USSCs pro cm2 ((+) DAG USSCs
oder (-) DAG USSCs) auf den Probenkörpern ausgesät und nach 1, 7, 14 und 28 Tagen die
Zellzahlen bestimmt. Unterschiede in den Zellzahlen für die (+) DAG USSCs und (-) DAG
USSCs auf den verschieden dekorierten Oberflächen, werden nachfolgend beschrieben.
Dazu erfolgte ein Vergleich der mittleren Zellzahlen zwischen den Versuchstagen 1, 7, 14 und
28 für eine Gruppe ((+) DAG USSCs oder (-) DAG USSCs) auf gleichen Probenkörpern.
Signifikante Unterschiede in den Zellzahlen zwischen den einzelnen Tagen für identische
Gruppen ((+) DAG USSCs oder (-) DAG USSCs) auf gleichen Probenkörpern wurden
entsprechend in Abbildung 4-5 eingetragen.
46
Abbildung 4-5 Gegenüberstellung der mittleren Zellzahlen (mit Standardabweichung) auf den Probenkörpern Bonit, CaSi und
DUOTex von dreitägig mit DAG vordifferenzierten (+) und nicht vordifferenzierten USSCs (-) über einen zeitlichen Verlauf von
insgesamt 28 Tagen. Mit p < 0,05 signifikant für: *=t-Test mit gleichen Varianzen/**=t-Test mit ungleichen Varianzen/#=Mann-
Whitney-U-Test.
In Abbildung 4-5 ist zu erkennen, dass von Tag 1 zu Tag 7 unter Kulturbedingungen auf der
Bonit Oberflächendekoration keine Zunahme der mittleren Zellzahlen stattgefunden hat. Die
(+) DAG USSCs wiesen an Tag 1 eine mittlere Zellzahl von 1349 Zellen und an Tag 7 eine
mittlere Zellzahl von 1208 Zellen auf (p>0,05). Für die (-) DAG USSCs wurden an Tag 1 und
7 jeweils eine mittlere Zellzahl von 3108 und 6586 Zellen gemessen (p>0,05). Auf den
anderen Probenkörpern (CaSi und DUOTex) war für die (+) DAG USSCs und (-) DAG
USSCs eine statistisch signifikante Erhöhung der mittleren Zellzahl zu beobachten. Die
mittlere Zellzahl auf der CaSi Oberflächendekoration betrug für die (+) DAG USSCs 2071
Zellen an Tag 1 und 5341 Zellen an Tag 7 (p<0,05). Weiterhin konnte auf der CaSi
Oberflächendekoration eine Steigerung der mittleren Zellzahl von 5593 Zellen an Tag 1 auf
21132 Zellen an Tag 7 für die (-) DAG USSCs beobachtet werden (p<0,05). Auf der
DUOTex Oberfläche zeigte sich für die (+) DAG USSCs eine Erhöhung der mittleren
Zellzahl von Tag 1 zu Tag 7 um 14958 Zellen (p<0,05). Es wurde ebenfalls eine Erhöhung
der mittleren Zellzahl für die (-) DAG USSCs auf der DUOTex Oberfläche festgestellt. Diese
betrug von Tag 1 zu Tag 7 20847 Zellen (p<0,05).
47
Von Tag 7 zu Tag 14 war für die (+) DAG USSCs auf der Bonit Oberflächendekoration eine
statistisch signifikante Erhöhung der mittleren Zellzahl um 705 Zellen zu erkennen (p<0,05).
Verglichen mit den anderen Oberflächen fiel die Erhöhung aber eher gering aus. Für die (-)
DAG USSCs auf der Bonit Oberflächendekoration konnte keine signifikante Änderung der
mittleren Zellzahl nachgewiesen werden. Die mittlere Zellzahl betrug an Tag 7 6586 Zellen
und an Tag 14 7480 Zellen (p>0,05). Auf den anderen Probenkörpern (CaSi und DUOTex)
war für (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs weiterhin eine signifikante Erhöhung der
mittleren Zellzahlen zu beobachten. Die (+) DAG USSCs auf der CaSi Oberflächendekoration
zeigten eine Erhöhung der mittleren Zellzahl von 5341 Zellen an Tag 7 auf 27257 Zellen an
Tag 14 (p<0,05). Ebenfalls wurde für die (-) DAG USSCs auf der CaSi
Oberflächendekoration eine Erhöhung der mittleren Zellzahl beobachtet. Diese betrug von
Tag 7 zu Tag 14 55126 Zellen (p<0,05). Es gab eine Erhöhung der mittleren Zellzahl von
21606 Zellen an Tag 7 zu 58001 Zellen an Tag 14 für die (+) DAG USSCs auf der DUOTex
Oberfläche (p<0,05). Die Zahl der (-) DAG USSCs auf der DUOTex Oberfläche stieg
ebenfalls. Hier wurde eine Steigerung der mittleren Zellzahl von Tag 7 zu Tag 14 um 34629
Zellen festgestellt (p<0,05).
Die Ergebnisse der Proliferation von Tag 14 zu Tag 28 spiegelten, mit Ausnahme der
DUOTex Oberfläche, die von Tag 7 zu Tag 14 wieder. Auf der DUOTex Oberfläche zeigten
sich für (+) DAG USSCs keine Unterschiede in der mittleren Zellzahl. Diese betrug an Tag 14
58001 Zellen und an Tag 28 47031 Zellen (p>0,05). Ebenso wiesen die (-) DAG USSCs auf
der Bonit Oberflächendekoration mit einer mittleren Zellzahl von 7480 Zellen an Tag 14 und
11556 Zellen an Tag 28 (p>0,05) keine Zunahme auf. Mit einer mittleren Zellzahl von 1912
Zellen an Tag 14 zu 6435 Zellen an Tag 28, wurde für die (+) DAG USSCs ein Anstieg
(p<0,05) auf der Bonit Oberflächendekoration festgestellt. Ebenso war eine Erhöhung der
mittleren Zellzahl der (+) DAG USSCs auf der DUOTex Oberfläche zu beobachten. Diese
betrug von Tag 14 zu Tag 28 10970 Zellen (p<0,05).
Die mittlere Zellzahl der (-) DAG USSCs auf der DUOTex Oberfläche betrug an Tag 14
64987 Zellen und an Tag 28 65661 Zellen. Dies entspricht einer Zunahme der Zellzahlen
(p<0,05). Auf der CaSi Oberflächendekoration war für die (+) DAG USSCs und (-) DAG
USSCs eine Erhöhung der mittleren Zellzahlen von Tag 14 zu Tag 28 zu erkennen. Die
mittlere Zellzahl der (+) DAG USSCs stieg dabei um 32448 Zellen (p<0,05) und die der (-)
DAG USSCs um 23559 Zellen (p<0,05).
48
Im folgenden Abschnitt sollen die Unterschiede in den mittleren Zellzahlen zwischen (+)
DAG USSCs und (-) DAG USSCs jeweils an den Tagen 1, 7 ,14 und 28 auf gleichen
Oberflächen herausgestellt werden. Weiterhin wurde untersucht auf welcher der
verschiedenen Oberflächen die (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs die höchsten mittleren
Zellzahlen aufwiesen. Dazu wurden die mittleren Zellzahlen und dazugehörige Signifikanzen
für jeden der Versuchstage in einem Diagramm dargestellt.
Abbildung 4-6 Gegenüberstellung der Zellzahlen von dreitägig mit DAG vordifferenzierten (+) und nicht vordifferenzierten USSCs
(-) mit Standartabweichungen, nach 24 h unter Kulturbedingungen auf den Probenkörpern Bonit, CaSi, und DUOTex. Mit p<0,05
signifikant für: *= t-Test mit gleichen Varianzen/**=t-Test mit ungleichen Varianzen/#=Mann-Whitney-U-Test.
Abbildung 4-6 stellt die Zellzahlen und die dazugehörigen Signifikanzen für die USSCs 24 h
nach der Aussaat auf die verschiedenen Probenkörper dar. Zwischen den (+) DAG USSCs
und (-) DAG USSCs waren jeweils auf der DUOTex Oberfläche und der CaSi
Oberflächendekoration signifikante Unterschiede nachweisbar. Hier waren die höheren
mittleren Zellzahlen bei den nicht vordifferenzierten USSCs zu finden.
Die mittlere Zellzahl betrug 24 h nach der Aussaat auf die DUOTex Oberfläche für die (+)
DAG USSCs 6643 Zellen und die (-) DAG USSCs 9511 Zellen (p<0,05). Die CaSi
49
Oberflächendekoration zeigte nach 24 h eine mittlere Zellzahl von 2071 Zellen für die (+)
DAG USSCs und 5593 Zellen für (-) DAG USSCs (p<0,05). Es wurden keine relevanten
Unterschiede zwischen (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs auf der Bonit
Oberflächendekoration nachgewiesen. Der Unterschied von den (+) DAG USSCs zu den (-)
DAG USSCs betrug 1760 Zellen (p>0,05).
Die höchsten mittleren Zellzahlen über alle Oberflächen ließen sich für die (+) DAG und (-)
DAG USSCs auf der DUOTex Oberfläche finden. Diese betrugen für die (+) DAG USSCs
6643 Zellen und die (-) DAG USSCs 9511 Zellen (p<0,05).
Abbildung 4-7 Mittlere Zellzahlen (mit Standardabweichung) von dreitägig mit DAG vordifferenzierten (+) und nicht
vordifferenzierten USSCs (-) nach sieben Tagen unter Kulturbedingungen auf den Probenkörpern Bonit, CaSi und DUOTex. Mit
p<0,05 signifikant für: *= t-Test mit gleichen Varianzen/**=t-Test mit ungleichen Varianzen/#= Mann-Whitney-U-Test.
Sieben Tage nach der Aussaat der USSCs (Abbildung 4-7) ließen sich für die CaSi
Oberflächendekoration signifikante Unterschiede in der mittleren Zellzahl zwischen (+) DAG
USSCs und (-) DAG USSCs feststellen. Die mittlere Zellzahl betrug für die (+) DAG USSCs
5341 Zellen und für die (-) DAG USSCs 21132 Zellen (p<0,05). Damit lagen die höheren
mittleren Zellzahlen bei den nicht vordifferenzierten USSCs. Nicht signifikant waren die
Unterschiede in der mittleren Zellzahl der (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs auf der
50
Bonit Oberflächendekoration, sowie der DUOTex Oberfläche. Auf der Bonit
Oberflächendekoration wurde 7 Tage nach der Aussaat eine mittlere Zellzahl von 1208 Zellen
für die (+) DAG USSCs und 6586 Zellen für die (-) DAG USSCs festgestellt (p>0,05). Nach
7 Tagen auf der DUOTex Oberfläche wiesen die (-) DAG USSCs eine mittlere Zellzahl von
30358 Zellen und die (+) DAG USSCs 21601 Zellen auf (p>0,05).
Die höchsten mittleren Zellzahlen, vergleichend für alle Oberflächen, ließen sich für die (-)
DAG USSCs auf der CaSi Oberflächendekoration und der DUOTex Oberfläche finden. Sie
betrugen für die (-) DAG USSCs auf der CaSi Oberflächendekoration 21123 Zellen und auf
der DUOTex Oberfläche 30358 Zellen (p>0,05). Bei den (+) DAG USSCs waren die
höchsten mittleren Zellzahlen mit 21601 Zellen auf der DUOTex Oberfläche zu sehen.
Abbildung 4-8 Mittlere Zellzahlen (mit Standardabweichung) von dreitägig mit DAG vordifferenzierten (+) und nicht
vordifferenzierten USSCs (-) nach 14 Tagen unter Kulturbedingungen auf den Probenkörpern Bonit, CaSi und DUOTex. Mit p<0,05
signifikant für: *= t-Test mit gleichen Varianzen/**=t-Test mit ungleichen Varianzen/#=Mann-Whitney-U-Test.
Nachdem sich die Zellen 14 Tage auf den verschiedenen Probenkörpern befanden, wurden
erneut die mittleren Zellzahlen bestimmt (Abbildung 4-8). Für die mittleren Zellzahlen
zeigten sich im Vergleich der (-) DAG USSCs zu den (+) DAG USSCs auf der gleichen
Oberfläche für die Bonit und CaSi Oberflächendekoration signifikante Unterschiede. Es
51
wurde bei der Bonit Oberflächendekoration eine mittlere Zellzahl von 1912 Zellen für die (+)
DAG USSCs zu 7480 Zellen für die (-) DAG USSCs festgestellt (p<0,05). Auf der CaSi
Oberflächendekoration wurde für die mittlere Zellzahl der (-) DAG USSCs 76258 Zellen und
die der (+) DAG USSCs 27257 Zellen gemessen (p<0,05). Die Zellzahlen von (+) DAG
USSCs und (-) DAG USSCs auf der DUOTex-Oberfläche näherten sich weitestgehend an.
Mit einem Unterschied von 6968 Zellen in der mittleren Zellzahl war kein statistisch
signifikanter Unterschied nachweisbar (p>0,05).
Die höchsten mittleren Zellzahlen der (-) DAG Zellen über alle Probenkörper wurden auf der
CaSi Oberflächendekoration und der DUOTex Oberfläche festgestellt. Die mittleren
Zellzahlen betrugen 76258 Zellen auf der CaSi Oberflächendekoration und 64987 Zellen auf
der DUOTex Oberfläche. Einen statistisch relevanten Unterschied zwischen diesen gab es
nicht (p>0,05). Die höchste mittlere Zellzahl der (+) DAG USSCs wurde auf der DUOTex
Oberfläche nachgewiesen. Diese betrug 58001 Zellen.
Abbildung 4-9 Mittlere Zellzahlen (mit Standardabweichung) von dreitägig mit DAG vordifferenzierten (+) und nicht
vordifferenzierten USSCs (-), nach 28Tagen unter Kulturbedingungen auf den Probenkörpern Bonit, CaSi und DUOTex. Mit p<0,05
signifikant für: *= t-Test mit gleichen Varianzen/**=t-Test mit ungleichen Varianzen/#= Mann-Whitney-U-Test.
52
Nach 28 Tagen unter Kulturbedingungen auf den verschiedenen Probenkörpern waren, wie
auch an den Tagen 1, 7 und 14, unterschiedliche mittlere Zellzahlen (Abbildung 4-9)
vergleichend für (-) DAG USSCs mit (+) DAG USSCs auf der CaSi Oberflächendekoration
zu beobachten. Diese betrugen für die (+) DAG USSCs 59704 Zellen und (-) DAG USSCs
99817 Zellen (p<0,05). Die Bonit Oberflächendekoration und die DUOTex Oberfläche
wiesen für die (-) DAG USSCs zu den (+) DAG USSCs auf derselben Oberfläche keine
signifikanten Unterschiede in der mittleren Zellzahl auf. Die mittlere Zellzahl betrug auf der
Bonit Oberflächendekoration für die (+) DAG USSCs 6435 Zellen und für die (-) DAG
USSCs 11556 Zellen (p>0,05). Die DUOTex Oberfläche wies für die (+) DAG USSCs eine
mittlere Zellzahl von 47031 Zellen und für die (-) DAG USSCs 65661 Zellen auf (p>0,05).
Die höchste mittlere Zellzahl, über alle Oberflächen, für (-) DAG USSCs ließ sich mit 99817
Zellen auf der CaSi Oberflächendekoration finden. Die mittleren Zellzahlen der (+) DAG
USSCs waren am höchsten auf der CaSi Oberflächendekoration und der DUOTex Oberfläche.
Die CaSi Oberflächendekoration zeigte eine mittlere Zellzahl von 59704 Zellen und die
DUOTex Oberfläche eine mittlere Zellzahl von 47031 Zellen. Der Unterschied zwischen
diesen beiden war statistisch nicht signifikant (p>0,05).
4.2.2 Zellzahlen USSC auf Oberflächen mit geänderter initialer Rauigkeit
Die Erkenntnisse aus den Kapiteln 4.1.3, 4.1.4 und 4.2.1 zeigen, dass mit zunehmendem
Abbau der Bonit Oberflächendekoration die mittleren Zellzahlen der USSCs ansteigen.
Resultierend daraus wurde eine Gruppe dieser Oberflächen 14 Tage lang im Nährmedium
inkubiert, um den Ab- und Umbau der Bonit Oberflächendekoration zu simulieren. Folgend
wurden je 5000 USSCs pro cm2 ((+) DAG USSCs oder (-) DAG USSCs) auf den
Probenkörpern (jeweils vorbehandelt) ausgesät und nach 24 h, sowie nach 7 Tagen die
Zellzahlen bestimmt.
Unterschiede in den Zellzahlen für die (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs auf den
verschieden dekorierten Oberflächen, werden nachfolgend beschrieben. Es sollen die
Unterschiede in den mittleren Zellzahlen der (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs jeweils an
den Tagen 1 und 7 auf gleichen Oberflächen mit verschiedenen Rauigkeiten herausgestellt
werden. Auch wurde nach Unterschieden in den Zellzahlen zwischen den einzelnen Tagen für
identische Gruppen ((+) DAG USSCs oder (-) DAG USSCs) auf gleichen Probenkörpern
gesucht.
Die Ergebnisse der mittleren Zellzahl der (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs der nicht
vorbehandelten Bonit Oberflächendekorationen wurden dazu aus Kapitel 4.2.1 entnommen.
53
In Abbildung 4-10 sind die mittleren Zellzahlen (mit Standardabweichungen) vergleichend
für die Bonit Oberflächendekoration und die DUOTex Oberfläche für den ersten und den
siebenten Tag dargestellt. Die USSCs auf den vor- und nicht vorbehandelten DUOTex
Oberflächendekorationen wiesen keine statistischen Unterschiede innerhalb eines Tages für
(+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs auf. Daher wurden diese nicht mit in die Betrachtungen
einbezogen und der Übersicht halber auch auf den Eintrag von Signifikanzen in Abbildung
4-10 verzichtet.
Abbildung 4-10 Mittlere Zellzahlen (mit Standardabweichung) für dreitägige mit DAG vordifferenzierte USSC (+) und nicht mit
DAG vordifferenzierte USSC (-) nach 24 Stunden und 7 Tagen unter Kulturbedingungen auf 14-tägig mit Nährmedium
vorbehandelten und nicht vorbehandelten Bonit Oberflächendekoration und DUOTex Oberflächen. Mit: p<0,05 signifikant für: *=
t-Test mit gleichen Varianzen/**=t-Test mit ungleichen Varianzen/#=Mann-Whitney-U-Test.
In Abbildung 4-10 ist im Vergleich der (-) DAG und (+) DAG vorbehandelten USSCs 24 h
nach Aussaat zwischen der Gruppe der 14-tägig vorbehandelten und nicht vorbehandelten
Bonit Oberflächendekoration zu erkennen, dass es signifikante Differenzen in den mittleren
Zellzahlen gab. Eine Erhöhung der mittleren Zellzahl und Verbesserung des Attachments, hat
im Gegensatz zu der nicht vorbehandelten Oberflächendekoration, nur für die (+) DAG
54
USSCs auf der vorbehandelten Oberflächendekoration stattgefunden. Die mittlere Zellzahl
betrug auf nicht vorbehandelten Bonit Oberflächendekoration für die (+) DAG USSCs 1349
Zellen und für die vorbehandelte Bonit Oberflächendekoration 4661 Zellen (p<0,05). Die (-)
DAG USSCs zeigten mit 3108 Zellen auf der nicht vorbehandelten, verglichen mit 4011
Zellen auf der vorbehandelten Bonit Oberflächendekoration, keine Erhöhung der mittleren
Zellzahl (p>0,05).
Sieben Tage nach Aussaat der (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs auf die 14-tägig
vorbehandelten Oberflächendekorationen war zu erkennen, dass es wiederum einen statistisch
signifikanten Anstieg der Zellzahlen für die (+) DAG USSCs auf der vorbehandelten
Oberflächendekoration vergleichend zu der nicht vorbehandelten gegeben hatte. Die (+) DAG
USSCs wiesen auf der nicht vorbehandelten Bonit Oberflächendekoration eine mittlere
Zellzahl von 1208 Zellen auf, wohingegen diese auf der vorbehandelten Bonit
Oberflächendekoration 6408 Zellen betrug (p<0,05). Die (-) DAG USSCs wiesen keine
Veränderung der mittleren Zellzahlen zwischen den Oberflächentypen auf. Diese betrugen auf
der nicht vorbehandelten Bonit Oberflächendekoration 6586 Zellen und auf der
vorbehandelten Bonit Oberflächendekoration 10235 Zellen (p>0,05).Vergleichend für die
Zellzahlen der (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs auf den 14-tägig vorbehandelten Bonit
Oberflächendekorationen von Tag 1 zu Tag 7, war zu beobachten, dass es eine signifikante
Erhöhung der mittleren Zellzahlen gegeben hatte. Die Steigerung der mittleren Zellzahl auf
den vorbehandelten Bonit Oberflächendekorationen betrug für die (+) DAG USSCs 1747
Zellen und für die (-) DAG USSCs 6243 Zellen (p<0,05). Für die (+) DAG USSCs und (-)
DAG USSCs auf den nicht vorbehandelten Bonit Oberflächendekorationen konnte kein
statistisch signifikanter Anstieg der mittleren Zellzahl festgestellt werden. Die (+) DAG
USSCs wiesen an Tag 1 eine mittlere Zellzahl von 1349 Zellen und an Tag 7 von 1208 Zellen
auf (p>0,05). Für die (-) DAG USSCs wurde an Tag 1 eine mittlere Zellzahl von 3108 Zellen
und an Tag 7 von 6586 Zellen ermittelt (p>0,05).
4.2.3 Prozentuale Zellzahlen USSC nach 24 h
Um zu untersuchen, welche Oberfläche die besten Startbedingungen für die USSCs lieferte,
wurden die aus Abschnitt 4.2.1 und 4.2.2 ermittelten Werte für die Zellzahlen nach 24 h
verwendet. Da die Probenkörper, auf welchen sich die USSCs befanden, vor dem Ermitteln
der Zellzahlen mit DPBS gespült wurden, wurden nur die sich auf der Oberfläche
befindlichen Zellen gemessen (siehe Material Methode). Diese wurden in eine prozentuale
Beziehung zu der theoretisch möglichen Gesamtzellzahl gesetzt. Die Gesamtzellzahl stellt
55
dabei die Menge an USSCs dar, welche sich am Tag der Aussaat im Nährmedium befanden,
und auf der Probenkörperoberfläche (siehe Material und Methode) niedergegangen waren. In
Abbildung 4-11 sind die prozentual auf den Oberflächen verbliebenen USSCs nach 24 h auf
den verschiedenen Probenkörpern dargestellt.
Abbildung 4-11 Prozentual auf der Oberfläche angehaftete Zellenzahlen, nach 24 h, der mit DAG vor und nicht vordifferenzierten
USSCs unter Kulturbedingungen auf den verschiedenen Probenkörpern. Bonit (14d-v) ist die 14 Tage im Nährmedium
vorbehandelte Bonit Oberflächendekoration.
In Abbildung 4-11 ist zu erkennen, dass auf der DUOTex Oberfläche für (+) DAG USSCs
und (-) DAG USSCs prozentual die meisten USSCs ermittelt wurden. Hier wurde für die (-)
DAG USSCs festgestellt, dass im Mittel 60,6% und für die (+) DAG USSCs 42,3% der Zellen
auf der Oberfläche verblieben waren. Aus der Abbildung 4-11 geht ebenfalls hervor, dass sich
durch die Senkung der initialen Oberflächenrauigkeit der Bonit Oberflächendekoration (14-
tägig im Nährmedium inkubiert) die prozentuale Anzahl der auf der Oberfläche verbliebenen
Zellen für die (+) DAG USSCs verbessert hatte. Die (+) DAG USSCs wiesen auf der Bonit
Oberflächendekoration 8,6% verbliebene USSCs auf. Dieses fiel geringer aus, als die 29,7%
verbliebenen (+) DAG USSCs auf der vorbehandelten Bonit Oberflächendekoration (14d-v).
Von den (-) DAG USSCs blieben auf der Bonit Oberflächendekoration 19,8% haften und auf
der vorbehandelten Bonit Oberflächendekoration (14d-v) 25,5%. Auf der CaSi
Oberflächendekoration wurden für die (+) DAG USSCs festgestellt, dass 13,2% und für die (-
) DAG USSCs 35,6% der Zellen auf der Oberfläche verblieben waren.
56
4.2.4 Zellzahlen USSC, 24 h und 7 Tage bezogen auf die Oberflächenrauigkeit
Nachfolgend wurde die Abhängigkeit der Zellzahl von der Oberflächenrauigkeit Ra für (-)
DAG USSCs (dunkelgrauer Rhombus) als auch (+) DAG USSCs (hellgraues Quadrat) 24 h
nach dem Aussäen untersucht (Abbildung 4-12). Für die (-) DAG USSCs wurde mit
abnehmender Oberflächenrauigkeit ein Anstieg der mittleren Zellzahl beobachtet. Für die (+)
DAG USSCs wurde mit abnehmender Oberflächenrauigkeit ebenfalls ein Anstieg der Zellzahl
beobachtet, jedoch fällt dieser weniger streng aus.
Abbildung 4-12 Zusammenhang zwischen Oberflächenrauigkeit (Ra) und Zellzahl für (-) DAG USSCs (dunkelgraue Rhomben) und
(+) DAG USSCs (hellgraue Quadrate) 24 h nach dem Aussäen. Dargestellt sind die Mittelwerte für die Zellzahlen mit
Standardabweichung, bezogen auf die Oberflächenrauigkeit.
Der monotone Zusammenhang zwischen Ra und Zellzahl der (-) DAG USSCs wurde im
Weiteren genauer untersucht. Es wurde ein nichtlineares Regressionsmodell unter
Verwendung fraktioneller Polynome ersten Grades angepasst (Abbildung 4-13). Der
Zusammenhang zwischen Ra und Zellzahl der (-) DAG USSCs war statistisch signifikant
(p<0,001) und ergab sich als: Zellzahl=2285,6 · Ra-2+4506,6.
Der durch das Modell vorhergesagte Zusammenhang zwischen Ra und Zellzahl wurde in
Abbildung 4-13 dargestellt.
57
Abbildung 4-13 Zusammenhang zwischen Oberflächenrauigkeit (Ra) und Zellzahl bei nicht vordifferenzierten USSCs 24 h nach dem
Aussäen. Dargestellt sind die beobachteten Werte (Datenpunkte) sowie die durch das Regressionsmodell vorhergesagte mittlere
Zellzahl (durchgezogene Linie) mit dem 95% Konfidenzintervall (gestrichelte Linien).
Weiterhin wurde geprüft, ob es einen Zusammenhang zwischen den Zellzahlen an Tag 7 der
USSCs und der Oberflächenrauigkeit gab.
Abbildung 4-14 Zusammenhang zwischen Oberflächenrauigkeit (Ra) und Zellzahl 7 Tage nach dem Aussäen der (-) DAG USSCs
(dunkelgraue Rhomben) und (+) DAG USSCs (hellgraue Quadrate). Dargestellt sind die Mittelwerte für die Zellzahlen mit
Standardabweichung, bezogen auf die Oberflächenrauigkeit.
58
Dazu wurden sieben Tage nach Aussaat der (-) DAG USSCs (dunkelgrauer Rhombus) und
(+) DAG USSCs (hellgraues Quadrat) auf die Probenkörper, die Zellzahlen in Abhängigkeit
zur Oberflächenrauigkeit Ra in einem Diagramm aufgetragen (Abbildung 4-14). Die USSCs
befanden sich zu diesem Zeitpunkt in der Proliferationsphase. Auch hier war für die (-) DAG
USSCs ein monotoner Anstieg der Zellzahlen bei abnehmender Oberflächenrauigkeit zu
beobachten. Die (+) DAG USSCs wiesen mit abnehmender Oberflächenrauigkeit ebenfalls
einen monotonen Anstieg der mittleren Zellzahl auf, welcher jedoch weniger streng ausfiel.
Nachfolgend wurde der monotone Zusammenhang zwischen Ra und Zellzahl bei (-) DAG
USSCs nach 7 Tagen genauer untersucht. Es wurde ein nichtlineares Regressionsmodell unter
Verwendung fraktioneller Polynome ersten Grades angepasst (Abbildung 4-15).
Abbildung 4-15 Zusammenhang zwischen Oberflächenrauigkeit (Ra) und Zellzahl für (-) DAG USSCs 7 Tage nach dem Aussäen.
Dargestellt sind die beobachteten Werte (Datenpunkte), sowie die durch das Regressionsmodell vorhergesagte mittlere Zellzahl
(durchgezogene Linie) mit dem 95% Konfidenzintervall (gestrichelte Linien).
Der Zusammenhang zwischen Ra und Zellzahl der (-) DAG USSCs war statistisch signifikant
(p<0,001) und ergab sich als: Zellzahl= 8817,0 · Ra-2+ 13035,3.
Der durch das Modell vorhergesagte Zusammenhang zwischen Ra und Zellzahl wurde in
Abbildung 4-15 dargestellt.
59
4.2.5 Oberflächenkontakt und Morphologie
In diesem Abschnitt wurde untersucht, mit welcher Morphologie die USSCs auf ihre
Wachstumsunterlage reagieren und wie sie mit dieser interagieren. Dazu wurden die USSCs
auf der Oberfläche fixiert und mit dem REM betrachtet.
Die Ergebnisse der REM-Aufnahmen für die (+) DAG USSCs und (–) DAG USSCs auf den
verschiedenen Oberflächen, 24 h nach der Aussaat, sind in Abbildung 4-16 dargestellt. Die (-)
DAG USSCs auf der DUOTex Oberfläche und der CaSi Oberflächendekoration waren
vereinzelt zu beobachten. Sie zeigten eine abgeflachte und breite Zellform. Es waren die
ersten radiären Zellausläufer zu finden, die mit der Oberfläche interagierten. Die (-) DAG
USSCs auf der Bonit Oberflächendekoration konnten zu diesem Zeitpunkt die Form eines
Nodulie besitzen, waren vereinzelt zu beobachten, hatten jedoch keine radiären Zellausläufer.
Die (+) DAG USSCs wiesen auf der DUOTex Oberfläche und CaSi Oberflächendekoration
eine eher längliche Form auf. Die radiären Ausläufer schienen noch nicht so ausgeprägt zu
sein, interagierten aber auch hier mit der Oberfläche. Auf der Bonit Oberflächendekoration
war eine abgeflachte Zelle zu beobachten.
In Abbildung 4-17 sind (+) DAG USSCs und (–) DAG USSCs 7 Tage nach Aussaat auf die
Probenkörper dargestellt. Auf der Bonit Oberflächendekoration ließ sich für die (-) DAG
USSCs eine abgeflachte längliche Zellform beobachten. Die USSCs besaßen lange radiäre
Ausläufer, welche mit der Werkstoffoberfläche und benachbarten Zellen in Kontakt standen.
Die (+) DAG USSCs auf der Bonit Oberflächendekoration zeigten ebenfalls eine gestreckte
Zellform und radiäre Ausläufer, die mit anderen Zellen, sowie der Werkstoffoberfläche in
Verbindung standen. Auf der DUOTex Oberflächendekoration wiesen die (+) DAG USSCs,
sowie die (-) DAG USSCs eine abgeflachte, breite Zellform auf. Sie begannen die Oberfläche
weitgehend zu bedecken und vernetzten sich untereinander mit den radiären Zellausläufern.
Die (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs, welche auf der CaSi Oberflächendekoration
wuchsen, begannen die Oberfläche weiter abzudecken und hatten eine flache Zellform, sowie
radiäre Zellausläufer.
Die (+) DAG USSCs und (–) DAG USSCs, welche sich 14 Tage auf den verschiedenen
Probenkörpern befanden sind in Abbildung 4-18 dargestellt. Auf den CaSi
Oberflächendekorationen und DUOTex Oberflächen für die (-) DAG USSCs ist eindeutig zu
60
erkennen, dass sich ein Zellrasen zu bilden begann, welcher die Oberfläche der Probenkörper
nahezu gänzlich bedeckte. Es waren daher keine Rückschlüsse mehr auf die Zellform einer
Einzelzelle möglich. Die (+) DAG USSCs auf der DUOTex Oberfläche und der CaSi
Oberflächendekoration bedeckten einen Großteil der Oberfläche, waren zahlreich
untereinander mit den Zellausläufern vernetzt und hatten eine flache, sowie breite Zellform.
Die (-) DAG USSCs auf der Bonit Oberflächendekoration waren abgeflacht und lang
gezogen. Sie standen miteinander in Kontakt und begannen die Oberfläche zu bedecken. Die
Zellausläufer besaßen eine kurze Form. Die (+) DAG USSCs auf der Bonit Oberfläche wiesen
sehr lange Zellausläufer auf, die in Kontakt mit den Nachbarzellen standen. Die USSCs hatten
eine große und flache Form.
Tag 28 des Versuches für die (+) DAG USSCs und (–) DAG USSCs ist in Abbildung 4-19
dargestellt. Zu diesem Zeitpunkt hatte sich auf den CaSi Oberflächendekorationen und den
DUOTex Oberflächen ein dichter Zellrasen aus (-) DAG USSCs und (+) DAG USSCs
gebildet, welcher die Oberfläche bedeckte. Ein noch nicht ganz geschlossener Zellrasen war
für die (-) DAG USSCs und (+) DAG USSCs auf der Bonit Oberflächendekoration zu
beobachten. Über die Morphologie einer einzelnen Zelle oder deren Oberflächeninteraktion
ließen sich keine Aussagen mehr treffen.
61
Abbildung 4-16 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von 3 Tage mit DAG vordifferenzierten und nicht vordifferenzierten
USSCs. Aufgenommen wurde mit dem Rasterelektronenmikroskop: 24 h nach der Aussaat auf die Bonit und CaSi
Oberflächendekoration, sowie auf die DUOTex Oberfläche (Balken = 50 µm).
62
Abbildung 4-17 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von 3 Tage mit DAG vordifferenzierten und nicht vordifferenzierten
USSCs. Aufgenommen wurde mit dem Rasterelektronenmikroskop: 7 Tage nach der Aussaat auf die Bonit und CaSi
Oberflächendekoration, sowie auf die DUOTex Oberfläche (Balken = 50 µm).
63
Abbildung 4-18 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von 3 Tage mit DAG vordifferenzierten und nicht vordifferenzierten
USSCs. Aufgenommen wurde mit dem Rasterelektronenmikroskop: 14 Tage nach der Aussaat auf die Bonit und CaSi
Oberflächendekoration, sowie auf die DUOTex Oberfläche (Balken = 50 µm).
64
Abbildung 4-19 Rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von 3 Tage mit DAG vordifferenzierten und nicht vordifferenzierten
USSCs. Aufgenommen wurde mit dem Rasterelektronenmikroskop: 14 Tage nach der Aussaat auf die Bonit und CaSi
Oberflächendekoration, sowie auf die DUOTex Oberfläche (Balken = 50 µm).
65
5 Diskussion
Methodenkritik
Bei den verschiedenen Messverfahren zur Charakterisierung der Oberflächen und
Bestimmung der Biokompatibilität könnte es zu Messungenauigkeiten gekommen sein. Dies
betrifft das AFM, das REM, das CyQUANT cell proliferation assay und das QuantiChrom™
Calcium Assay Kit. Diese werden im Folgenden kurz vorgestellt und diskutiert.
Um die Bestimmung der Oberflächenmorphologie vorzunehmen, wurde mit dem AFM
gearbeitet. Dies stellt ein adäquates Hilfsmittel dar, um sich einen Überblick über die
dimensionalen Strukturen im Mikro- und Nanometerbereich zu verschaffen und Messwerte zu
erheben. Es wurde daher bereits mehrfach zur Bestimmung von Oberflächeneigenschaften
benutzt (Wu, Ramaswamy et al. 2009; Yamashita, Machigashira et al. 2009). Da aber nur ein
limitierter Bereich der Oberfläche abgerastert werden kann, besteht die Gefahr, dass relevante
Strukturen nicht aufgefunden werden. Einige Autoren (Rosa and Beloti 2003; Osathanon,
Bespinyowong et al. 2011) benutzen daher Profilometer, welche einen größeren Bereich
abrastern, aber nicht über die entsprechende Auflösung verfügen, um im Nanometerbereich zu
agieren.
Weiterhin wurden mit dem REM die Oberflächenstrukturen und das Wachstumsverhalten der
Zellen untersucht. Die dazu nötige Fixierung der Zellen und das anschließende Aufbereiten
des biologischen Materials, sind seit Jahren in der Forschung etabliert. Sie werden eingesetzt
um morphologische Unterschiede im Zellwachstum aufzuzeigen (Richard, Dumelie et al.
2006; Bigi, Nicoli-Aldini et al. 2007). Als problematisch muss hier das Waschen der Zellen
mit DPBS vor dem Fixieren gesehen werden. Es besteht die Gefahr, dass sich durch den
Waschvorgang Zellen lösen, die bei nachfolgenden Messverfahren nicht erfasst werden
können. Dadurch kann es zu einer verfälschten Aussage über die Verbreitung der Zellen
kommen.
Die Zellzahlen wurden mit dem „CyQUANT cell proliferation assay“ ermittelt. Dabei bindet
ein Fluoreszenzfarbstoff an die zelluläre Nukleinsäure. Dies führt zu einer Fluoreszenz, deren
Intensität mit steigender Menge an Nukleinsäure linear zunimmt. Über eine zuvor erstellte
Standardkurve lässt sich somit auf die Zellzahl schließen. Dieses Assay ist über einen großen
Bereich und eine ausgedehnte Vielfalt von Zelltypen einsetzbar (Jones, Gray et al. 2001) und
wird bereits zur Bestimmung der Zellzahlen von USSCs (Naujoks, Langenbach et al. 2011)
genutzt. Der Methodenvorteil liegt in der sehr genauen Messung aller auf der Oberfläche
66
befindlichen Zellen. Ein Nachteil ist, dass auch die Nukleinsäure von toten Zellen mit in die
Messung einfließt. Dies sollte die Ergebnisse im frühen Stadium (Tage 1-14) jedoch nicht
beeinflussen, da durch ein Spülen mit DPBS vor dem Fixieren, die toten Zellen entfernt
wurden. Eine Färbung mit 4`,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) ermöglicht
es ebenfalls, Zellkerne anzufärben und Zellzahlen zu erheben (Osathanon, Bespinyowong et
al. 2011). Diese werden dann meist per Hand in zufällig gewählten Bereichen der Oberflächen
gezählt, was hohe Ungenauigkeiten mit sich bringt. Außerdem muss auch bei diesem System
mit DPBS gespült werden, was Zellen von der Oberfläche waschen kann und das Ergebnis
zusätzlich verfälschen könnte.
Weiterhin wurde die Menge des Ca2+ mit dem QuantiChrom™ Calcium Assay Kit bestimmt.
Dieses basiert auf einem Farbstoff der speziell mit Ca2+ einen Farbkomplex bildet
(http://www.bioassaysys.com). So konnte durch den Vergleich mit einer zuvor erstellten
Standardkurve die Menge an Ca2+ im Nährmedium ermittelt werden. Dieses Assay wurde
bereits von Jung und Kollegen (Jung, Park et al. 2010) verwendet, um Rückschlüsse von
freigesetztem Ca2+ aus HAP-Beschichtungen auf das Differenzierungsverhalten von Zellen zu
ziehen. Eine Problematik in dieser Studie kann unter Umständen ein schwankender Ca2+
Level durch das genutzte FCS im selbst angesetzten Nährmedium sein.
Vergleichbarkeit von Effekten einer Oberfläche auf Zellen
Wie bereits in der Einleitung erwähnt, wird das Wachstumsverhalten von Vorläuferzellen
durch verschiedene Eigenschaften von Oberflächen beeinflusst. Dazu gehören
Oberflächenstrukturen der Mikrorauigkeit und der Nanorauigkeit. Zellen finden hier
Strukturen vor, auf welche sie sensitiv reagieren. Weiterhin können chemische Eigenschaften
einer Oberfläche, wie die Dissoziation und Resorbierbarkeit, Effekte der Abbauprodukte und
die sich neu ergebende Oberflächenmorphologie, einen Einfluss auf das Wachstumsverhalten
von Vorläuferzellen haben.
Der Vergleich der in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse mit der Literatur ist komplex, da alle
oben erwähnten Eigenschaften gemeinsam auf die Zellen Einfluss nehmen. Daher können
nicht alle Verhaltensweisen von Zellen (beispielsweise die Zellzahlen zu einem bestimmten
Zeitpunkt oder die Morphologie) einer einzelnen Eigenschaft einer Oberfläche zugeschrieben
werden. So können sich Zellen auf Oberfläche A aus Material X, die exakt die gleiche
67
Mikrorauigkeit hat wie Oberfläche B aus Material Y, völlig anders verhalten. In der Literatur
finden sich häufig Arbeiten, die sich nur auf eine Oberflächeneigenschaft beziehen.
Oft werden die Effekte von Rauigkeiten vieler Materialien untereinander verglichen, wobei
die chemischen Eigenschaften einer Oberfläche außer Acht gelassen werden. Es müssten zur
Ermittlung eines idealen Materials, viele verschiedene Materialien mit Variationen der
Struktureigenschaften verglichen werden. Werden dabei pro Material nur zwei Variablen je
Struktureigenschaft getestet, ergibt sich daraus bereits eine Vielzahl von Probengruppen.
Zieht man dann noch in Betracht, dass erzielte Ergebnisse nur für die getestete Zellart
Gültigkeit haben, weil sich andere Zellarten unterschiedlich verhalten, wird offensichtlich
warum es kaum Studien gibt, die alle Faktoren gemeinsam betrachten. So bleibt den meisten
Autoren nur die Möglichkeit, spezifische Teilergebnisse mit ähnlichen Ergebnissen aus der
Literatur zu vergleichen.
Andererseits ist es technisch schwierig gleiche Struktureigenschaften beliebig auf
verschiedenen Materialien zu erzeugen. Strukturen die durch Säureätzung auf einer
Oberfläche erzeugt werden, könnten bei einem anderen Material zu völlig anderen Strukturen
führen, oder erst gar nicht realisiert werden. Letztendlich führt dieser Umstand dazu, dass
Effekte auf Zellen nicht allein der Eigenschaft einer Strukturebene zugeschrieben werden
können. Es muss immer gefragt werden, ob eine bestimmte Struktur auf einem anderen
Material, wenn überhaupt erzeugbar, den gleichen Effekt hat, oder ob er durch beispielweise
die chemische Eigenschaft verstärkt oder determiniert wird.
Eine mögliche Diskussionsgrundlage ist die sehr hohe Anzahl an Veröffentlichungen in
denen die Effekte von Oberflächenstrukturierungen und Materialien auf Zellen untersucht
wurden. Durch den Vergleich vieler Studien miteinander lässt sich möglicherweise ein
optimales Material mit der besten Oberflächengestaltung herauskristallisieren. Auch die in
dieser Arbeit erzielten Ergebnisse lassen sich schwer untereinander vergleichen. Es wurden
drei verschiedene Oberflächenmodifikationen einer Titan-Legierung (CaSi, DUOTex und
Bonit), von denen die Bonit Oberflächendekoration über die Zeit hinweg ihre Struktur
verändert, untersucht. Dennoch sind Aussagen über den Einfluss der Strukturen von
eventuellen Effekten durch das Material nicht ganz zu bereinigen, was einen intensiven
Vergleich mit der Literatur notwendig macht
Die folgenden Diskussionsteile werden an der Fragestellungen aus der Einleitung
ausgerichtet.
68
Ist das Wachstumsverhalten der (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs von der
Oberflächenrauigkeit im Mikrometerbereich und einer Oberflächenstrukturierung im
Nanometerbereich abhängig?
Um den Zusammenhang zwischen der Oberflächenstrukturierung im Mikrometerbereich und
den Zellzahlen der USSCs erkennen zu können, wurde mit Hilfe des AFM die
Oberflächenrauigkeit Ra gemessen. Anschließend wurden (+) DAG USSCs oder (-) DAG
USSCs auf diesen Oberflächen kultiviert. Nach 1, 7, 14 und 28 Tagen wurden die Zellzahlen
ermittelt. Es erfolgte ein Vergleich der mittleren Zellzahlen zwischen den Versuchstagen 1, 7,
14 und 28 für eine Gruppe ((+) DAG USSCs oder (-) DAG USSCs) auf gleichen
Probenkörpern. Innerhalb der Versuchstage 1, 7, 14 und 28 wurden die mittleren Zellzahlen
zwischen den Gruppen ((+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs) auf gleichen Probenkörpern
verglichen. Weiterhin wurden die mittleren Zellzahlen beider Gruppen ((+) DAG USSCs und
(-) DAG USSC) auf verschiedenen Probenkörpern miteinander verglichen. Es wurde geprüft,
ob es einen Zusammenhang zwischen den Zellzahlen für (-) DAG USSCs und der
Oberflächenrauigkeit (Ra) nach 24h und 7 Tagen gab. Dazu wurde ein nichtlineares
Regressionsmodell unter Verwendung fraktioneller Polynome ersten Grades angepasst, um
den Zusammenhang zwischen Ra und der Zellzahl genauer zu beschreiben. Zusätzlich wurde
die theoretisch mögliche Gesamtzellzahl, die auf der Oberfläche niedergegangen war in
Relation zu der tatsächlich verbliebenen Zellzahl nach 24h dargestellt. Der Zusammenhang
zwischen der Oberflächenstrukturierung im Nanometerbereich und dem Einfluss derselben
auf die mittleren Zellzahlen der USSCs wurde untersucht. Dazu wurde mit Hilfe des AFM die
Oberflächenmorphologie festgehalten. So konnten topographische Merkmale, wie laterale
Abstände und Höhenunterschiede im Nanometerbereich, vermessen werden. Dies geschah für
die verschiedenen Oberflächen und Dekorationen vor der Aussaat der Zellen und wurde im
Fall der Bonit Oberflächendekoration auch für eine 14-tägig im Nährmedium vorbehandelte
Oberfläche durchgeführt.
In der Literatur lassen sich eine Vielzahl von Ergebnissen finden, die sich mit dem direkten
Zusammenhang der Beschaffenheit der Oberfläche und deren Einfluss auf das Verhalten von
Osteoblasten oder osteoblastenähnlichen Vorläuferzellen beschäftigen. Hier werden oft die
Beschaffenheit der Oberflächenstrukturierung und die daraus resultierende Rauigkeit (Ra)
betrachtet. Sowohl die Oberflächenstrukturierung, als auch die Rauigkeit haben maßgeblichen
Einfluss auf die Zellzahlen osteoblastärer Vorläuferzellen 24 h nach Kontakt mit der
69
Oberfläche. Welche Oberflächenstrukturierung und Rauigkeit den stärksten Einfluss auf
Zellen hat, wird jedoch aus den oben genannten Problemen bei der Vergleichbarkeit von
Materialien kontrovers diskutiert.
Dass osteoblastenähnliche Zellen aus der Maus, unabhängig vom Material, innerhalb von 24 h
höhere Zellzahlen auf raueren Oberflächen aufweisen, konnten Yamashita und Kollegen
(Yamashita, Machigashira et al. 2009) feststellen. Dabei steigerten Sie die Anfangsrauigkeiten
für vergleichende Aussagen der Zellzahlen um das ca. Vierfache. Untersuchungen von
Osathanon und Kollegen (Osathanon, Bespinyowong et al. 2011) zeigten höhere Zellzahlen,
nach 24 h für humane osteoblastenähnliche Zellen bei höheren Oberflächenrauigkeiten. Sie
verwendeten als Wachstumsgrundlage Glas mit Ra 0,0138+/-0,001 µm, sowie eine Ti-6Al-
7Nb Legierung welche Ra Werte bis zu 0,2435 +/-0,0690 µm aufwies. Die Ergebnisse von
Osathanon und Kollegen (Osathanon, Bespinyowong et al. 2011), sowie Yamashita und
Kollegen (Yamashita, Machigashira et al. 2009) korrelieren nicht mit den in dieser Studie
gefunden unterschiedlichen Zellzahlen der USSCs nach 24 h. Die mittlere Zellzahl war nach
24 h für (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs auf der glattesten Oberfläche, DUOTex mit
einem Ra Wert von 0,537 µm, am höchsten. Die raueste Oberfläche, Bonit
Oberflächendekoration mit einem Ra Wert von 1,234 µm, zeigte die niedrigsten Zellzahlen.
Den Ausführungen von Guizzardi und Kollegen zu Folge (Guizzardi, Galli et al. 2004), kann
eine verbesserte Zellzahl nach 24 h für die von Ihnen verwendeten Zellen in einem
bestimmten Ra-Bereich interpretiert werden. Sie zeigten in diesem Zusammenhang für die
Adhäsion von humanen Osteoblasten auf (cp-Ti-OR-Vit) Titan mit verschieden
Oberflächenrauigkeiten, dass die besten Ergebnisse bei einer Oberflächenrauigkeit Ra von
1,38µm zu finden waren. Rauigkeiten oberhalb, sowie unterhalb dieses Wertes wiesen
niedrigere Zellzahlen nach 24 h auf. Anzumerken ist, dass die Autoren dieser Studie große
Differenzen in den verwendeten Oberflächenrauigkeiten angaben. So ist der geringste Wert
mit Ra 0,56 µm und der höchste mit 9,5 µm angegeben, was die Vergleichbarkeit erschwert.
In der vorliegenden Studie wird ein bestimmter Bereich der Rauigkeit, um welchen die
Zellzahlen nach 24 h pendeln, ausgeschlossen. Es zeigte sich ein statistisch signifikanter
(p<0,001) Zusammenhang zwischen Ra und Zellzahl für (-) DAG USSCs, welcher sich als
Funktion (Zellzahl = 2285,6 · Ra-2+4506,6) ergab. Dieser impliziert, dass mit steigender
Oberflächenrauigkeit die Zellzahl (für USSCs) nach 24 h abnimmt.
70
Eine Beeinflussung der Zellzahlen in der Proliferationsphase durch die Ra Werte im
Mikrometerbereich, wird in der Literatur widersprüchlich gesehen. Die Argumentationslinien
teilen sich den Ergebnissen nach, in ein verbessertes Wachstum auf raueren Oberflächen und
gegenteilig auf glatteren Oberflächen. Interessant ist, dass es offensichtlich einen
eingegrenzten Bereich der Oberflächenrauigkeit (Ra) gibt, auf dem bestimmte Zellen
besonders gut proliferieren.
Dass osteoblastenähnliche Zellen besonders gut auf glatten Oberflächen wachsen wiesen
Schwartz und Kollegen (Schwartz, Raz et al. 2008) auf einer Ti6Al4V Legierung nach. Hier
zeigte sich nach 7 Tagen, dass auf einer maschinell bearbeiteten Oberfläche, die einen Ra
Wert von 0,2 µm aufwies, die Zellzahlen höher waren, als auf rauen, gestrahlten Oberflächen.
Diese hatten einen Ra Wert von 2,0 µm, 3,0 µm und 3,3 µm. Hier sollte beachtet werden, dass
die Autoren eine besonders große Differenz zwischen dem kleinsten Wert der Rauigkeit von
0,2 µm, zum nächsten darauf folgenden Wert mit 2,0 µm als Bemessungsgrundlage nahmen,
was wiederum eine Vergleichbarkeit erschwert. Bei der in der vorliegenden Arbeit
verwendeten Bonit Oberflächendekoration (Ra 1,234 µm) lässt sich vergleichend zu der
DUOTex Oberfläche (Ra 0,537 µm) und der CaSi Oberflächendekoration (Ra 0,669 µm) ein
Unterschied um ca. Faktor 2 in den Ra- Werten feststellen. Vergleicht man die Zellzahlen von
(+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs an Tag 7 von der DUOTex Oberfläche und CaSi
Oberflächendekoration, mit der deutlich raueren Bonit Oberflächendekoration, waren auf
dieser wesentlich geringere Zellzahlen zu finden. Auch unter den Rahmenbedingungen der
Differenz zwischen den Ra Werten scheint dieses Ergebnis unabhängig von der
Vordifferenzierung der USSCs zu sein. Diese Schlussfolgerung wird durch die Resultate von
Schwartz und Kollegen (Schwartz, Raz et al. 2008) für erhöhte Zellzahlen bei geringeren Ra
Werten gestützt. Ein weiteres Indiz dafür ist das Einsetzen einer Proliferation für (-) DAG
USSCs und (+) DAG USSCs auf den 14-tägig im Nährmedium vorbehandelten Bonit
Oberflächendekorationen, welche mit einer Absenkung der Ra Werte verbunden war.
Zellzahlen auf einer Oberfläche aus Titan, welche mit Aluminium gestrahlt und doppelt geätzt
war, sowie eine mit Calciumphosphat (CaP) beschichtete Titanoberfläche, mit eng
beieinander liegenden Ra Werten von 1,11 µm bzw. 0,84 µm verglichen Bucci-Sabattini und
Kollegen (Bucci-Sabattini, Cassinelli et al. 2010). Sie benutzen dafür Osteosarkomazellen und
humane mesenchymale Stammzellen. Es zeigte sich, dass die unterschiedlichen
Oberflächenbehandlungen keinen Einfluss auf die Zellzahlen für die Osteosarkomazellen
hatten. Im Gegensatz dazu, ermöglichte die rauere Oberfläche den humanen mesenchymalen
71
Stammzellen ein besseres Wachstum. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass es
zelltypenabhängige Reaktionen auf Oberflächenstrukturierungen gibt. Die von Bucci-
Sabattini und Kollegen (Bucci-Sabattini, Cassinelli et al. 2010) verwendeten humanen
mesenchymalen Stammzellen ähneln den hier verwendeten USSCs deutlicher als
Osteosarkomazellen. Bigi und Kollegen (Bigi, Nicoli-Aldini et al. 2007) konnten ebenfalls
zeigen, dass eine minimale Abweichung in der Oberflächenrauigkeit, respektive der Ra
Werte, ausreicht um das Wachstumsverhalten von Zellen zu beeinflussen. Die von ihnen
verwendeten mesenchymalen Stammzellen wiesen höhere Zellzahlen in der
Proliferationsphase für geätzte Ti13Nb13Zr Oberflächen (Ra 0,2869 µm), als für die ebenfalls
geätzte Ti6Al4V Oberflächen (Ra 0,2340 µm) mit einem etwas geringeren Ra Wert auf.
In der vorliegenden Studie wurde ebenfalls eine Sensitivität hinsichtlich der Zellzahlen in der
Proliferationsphase für eng beieinander liegende Ra Werte festgestellt. Die DUOTex
Oberfläche (Ra 0,537 µm) und die CaSi Oberflächendekoration (Ra 0,669 µm) liegen
ebenfalls bezüglich der Rauigkeit eng beieinander. Vergleicht man die Ra Werte dieser
Oberflächen mit den Zellzahlen an Tag 7 und 14 lässt sich feststellen, dass sich ähnliche
Oberflächenrauigkeiten nicht zwingend in ähnlichen Zellzahlen wiederspiegeln müssen. Es
gibt für (-) DAG USSCs keine statistisch signifikanten Unterschiede in der Zellzahl an diesen
Tagen auf der DUOTex Oberfläche (Ra 0,537 µm) und die CaSi Oberflächendekoration (Ra
0,669 µm). Die (+) DAG USSCs zeigen hingegen an den Tagen 7 und 14 höhere Zellzahlen
auf der glatteren DUOTex Oberfläche. Dementsprechend wird eine Sensitivität der (+) DAG
USSCs bei geringen Änderungen in den Ra Werten bestätigt, aber die höheren Zellzahlen sind
gegenteilig zu den anderen Autoren (Bigi, Nicoli-Aldini et al. 2007; Bucci-Sabattini,
Cassinelli et al. 2010) bei geringen Ra Werten zu finden. Weiterhin wird in dieser Arbeit
herausgestellt, dass es eine Anhängigkeit von der Vordifferenzierung der USSCs gibt.
Rosa und Beloti (Rosa and Beloti 2003) kultivierten humane Knochenmarkszellen auf
kommerziellem Titan mit Ra Werten zwischen 1,91 µm und 0,24 µm. Die niedrigsten
Verdopplungszeiten wies bei ihnen die raueste Oberfläche mit Ra 1,91 µm auf. Allerdings
wurden die höchsten Verdopplungszeiten nicht auf der glattesten Oberfläche generiert,
sondern auf Ra 0,69 µm. Die verwendeten Zellen empfanden diesen Bereich als ungünstig für
die Proliferation und bevorzugten Werte über oder unter diesem. Gleichzeitig schließen diese
Ergebnisse aus, dass besonders glatte Oberflächen eine bestmögliche Proliferation
begünstigen. Auch Guizzardi und Kollegen (Guizzardi, Galli et al. 2004) stellten ähnliches
fest. Sie zeigten, dass auf Titanscheiben (cpTi-OR-Vit) mit 6 verschiedenen
72
Oberflächenrauigkeiten von Ra 0,56 µm – 9,5 µm, humane Osteoblasten nach 12 Tagen in
Kultur, die höchsten Zellzahlen auf einer Oberfläche mit einem Ra von 1,32 µm aufwiesen.
Des Weiteren war erkennbar, dass die getesteten Oberflächenrauigkeiten mit besonders
niedrigen und besonders hohen Ra Werten, hinsichtlich der Zellzahlen, am schlechtesten
abschnitten. In der hier vorliegenden Studie wurden Bereiche der Oberflächenrauigkeit in
Verbindung mit (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs getestet. Dieser erstreckte sich von
0,537 µm bis 1,234 µm. Innerhalb dieses Korridors der Ra Werte wurde an Tag 7 der
Zusammenhang zwischen Ra und Zellzahl bei (-) DAG statistisch signifikant (p<0,001) als
Funktion (Zellzahl = 8817,0 · Ra-2+ 13035,3) ermittelt. Dies zeigt, dass sich eine geringer
werdende Oberflächenrauigkeit positiv auf die Zellzahlen innerhalb der Proliferationsphase
auswirkt und rauer werdende Oberflächen die Proliferation hemmen.
Oberflächenmodifikationen im Mikrometerbereich hinterlassen, ob gewollt oder nicht, auch
eine bestimmte Struktur im Nanometerbereich. Dies kann beispielsweise durch Strahlen mit
Partikeln und anschließender Ätzung mit Säure, oder durch das Bestrahlen mit Partikeln nach
dem Aufbringen einer Schicht geschehen. Park und Kollegen (Park, Bauer et al. 2007) stellten
mit Nanoröhren aus Titan den Zusammenhang von lateralen Abständen im Nanometerbereich
und dem Zellverhalten dar. Sie konnten für mesenchymale Stammzellen aus Ratten
feststellen, dass ein geringer lateraler Abstand von 15-30 nm einen positiven Effekt auf die
Adhäsion hatte. Die Messung von Park und Kollegen (Park, Bauer et al. 2007) fand allerdings
1 h nach dem Besiedeln der Oberflächen statt. Dies erschwert einen direkten Vergleich zu den
USSCs, bei welchen die Zellzahlen nach 24 h ermittelt wurden, zeigt aber ähnliche
Tendenzen. Die hier verwendete Bonit Oberflächendekoration mit den (B) Platten an der
Oberfläche weist im Nanometerbereich lateral eher große Abstände (>150 nm) auf, was einen
negativen Einfluss auf die Zellzahlen der (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs hat. Die
DUOTex, die Oberfläche mit den höchsten Zellzahlen nach 24 h für (+) DAG USSCs und (-)
DAG USSCs, weist laterale Abstände zwischen zwei „Hügeln“ von ca. 41-56 nm auf. Auf
den CaSi Oberflächen zeigte sich, dass USSCs auch laterale Abstände von ca. 113-158 nm
überwinden und hohe Zellzahlen für (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs vorliegen. In der
Studie von Park und Kollegen (Park, Bauer et al. 2007) handelte es sich jedoch um Ratten
MSCs und die hier getesteten Oberflächen unterscheiden sich zusätzlich in den Tiefen der
Kavitäten.
73
In der Literatur gibt es Studien, die einen Zusammenhang zwischen der Struktur im
Nanometerbereich und der Proliferation von Zellen herstellen. Verschiedene, mit HAP
hergestellte, Oberflächendekorationen untersuchten Okada und Kollegen (Okada, Ito et al.
2010). Die Autoren stellten einen Zusammenhang zwischen dem Platzangebot der
Nanostruktur aus HAP und dem Überleben der mesenchymalen Stammzellen aus
Rattenknochenmark her. Sie benutzten eine Oberfläche welche glatt und dicht war, sowie
solche mit Strukturen im Nanometerbereich. Diese bestanden aus submikroskopischen Fasern
(d = 150-200 nm), Nanofasern (d = 40–50 nm), aus gebündelten Nanonadeln basierend auf
kleineren Primärteilchen (d = 20–40 nm) und Nanoflaks, sowie weiten Nanoblättern mit einer
Dicke von 10 nm. Zellen die bei ihnen überlebten und proliferierten fanden sie auf der dichten
und glatten Oberfläche und auf weiten Nanoblättern. Zellen die überlebten, aber nicht
proliferierten, wurden auf den Strukturen mit relativ großen submikroskopischen Fasern und
Nanofasern gefunden. Die von Okada und Kollegen (Okada, Ito et al. 2010) verwendeten
Oberflächen, auf welcher Zellen zwar überlebten, aber nicht proliferierten, ähneln in ihrer
Struktur der in dieser Studie verwendeten Bonit Oberflächendekoration. Ebenfalls ist für die,
auf dieser Oberflächendekoration ausgesäten (-) DAG USSCs und (+) DAG USSCs eine
Zellanhaftung nach 24 h zu beobachten, aber eine statistisch signifikante Erhöhung der
Zellzahl von Tag 1 zu Tag 7 bleibt aus. Dies könnte an den großen Abständen (>150 nm) der
Brushitplatten liegen, welche die USSCs schwer überbrücken können.
Auch Park und Kollegen (Park, Bauer et al. 2007) untersuchten das Proliferationsverhalten
von mesenchymalen Stammzellen aus Ratten auf verschiedenen Strukturierungen im
Nanometerbereich. Sie stellten für die Proliferation (Proliferationsraten) fest, dass diese sich
mit zunehmenden lateralen Abständen verschlechterten. Der getestete Bereich betrug bei
ihnen 15 bis 100 nm. Ein ähnliches Verhalten konnte in dieser Arbeit für die verwendeten
USSCs beobachtet werden. Allerdings schienen die USSCs auch größere laterale Abstände
gut überbrücken zu können. Die hier getesteten Oberflächen besitzen für die DUOTex
Oberfläche 41-56 nm, die CaSi Oberflächendekoration 113-158 nm und die Bonit
Oberflächendekoration laterale Abstände > 158 nm. Vernachlässigt man hier die
unterschiedlichen Tiefen der Kavitäten und betrachtet die Zellzahlen der USSCs an Tag 7, so
bewegen sich diese für (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs im gleichen Muster, wie bei
Park und Kollegen (Park, Bauer et al. 2007) beschrieben. Eine Zunahme der lateralen
Abstände verringert somit die Zellzahlen der (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs.
74
Zusammenfassend konnte anhand der Zellzahlen, der Feststellung der Oberflächenparameter
und statistischen Auswertungen für (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs abgeleitet werden,
dass abhängig von der Oberflächenrauigkeit im Mikrometerbereich und der
Oberflächenstrukturierung im Nanometerbereich das Wachstumsverhalten beeinflusst wurde.
Welchen Einfluss haben degradierbare Oberflächen auf das Wachstumsverhalten der
(+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs?
Da aus der Literatur bekannt ist, dass sich CaP Verbindungen mit der Zeit abbauen und in
dieser Arbeit ein Abbau der Bonit Oberfläche zu erwarten war, wurde überprüft, ob durch den
Abbau die Zellzahlen in den ersten 24 h und nach 7 Tagen beeinflusst werden. Dazu wurden
die Rauhheitsparameter der Oberflächen vor und nach Inkubation im Nährmedium mit Hilfe
des AFM, sowie für die Bonit Oberflächendekoration zusätzlich mit dem REM, festgehalten.
Es wurde die initiale Oberflächenbeschaffenheit der Bonit Oberflächendekoration geändert,
indem diese 14 Tage lang im Nährmedium inkubiert wurde. Auf dieser wurden (+) DAG
USSCs oder (-) DAG USSCs ausgesät und die Zellzahlen nach 24 h und 7 Tagen ermittelt.
Diese Zellzahlen wurden mit denen, der nicht vorbehandelten Oberflächendekorationen,
sowie der Kontrolle aus Titan verglichen. Weiterhin wurde die Menge an Ca2+, abgegeben
durch Inkubation der Oberflächen im Nährmedium, festgehalten.
Das CaP Oberflächen abgebaut werden, ist in der Literatur beschrieben. Die direkte
Auswirkung auf das Verhalten von Zellen, ist jedoch bislang noch nicht zur Gänze aufgeklärt.
Auch die Auswirkungen der beim Abbau entstehenden Produkte und das resultierende
Verhalten der Zellen darauf, ist bis heute nicht ausreichend aufgearbeitet. Gao und Kollegen
(Gao, Hu et al. 2012) haben gezeigt, dass Oberflächen bestehend aus CaP unter Abgabe von
Ca2+ ihre Morphologie verändern. Diese werden unter Freisetzung von Ca2+ degradiert. Die
Menge an freiem Ca2+ und somit auch die Geschwindigkeit des Umbaus der CaP
Oberflächen, steigen bei Gao und Kollegen (Gao, Hu et al. 2012) mit dem Säuregehalt des
von ihnen verwendeten Kunstspeichels. Die Oberflächenmorphologie änderte sich dann z.B.
in eine nadelförmige Struktur. Die Autoren sind nicht weiter auf die Beziehung zwischen der
Oberflächenänderung, der Ca2+ Ausschüttung in das Nährmedium und das Zellwachstum
eingegangen. Dass in einer statischen Umgebung, wie von Gao und Kollegen (Gao, Hu et al.
2012) gezeigt, die Oberflächenstruktur von CaP Oberflächen geändert wird, konnte in dieser
Arbeit durch ein Zellkulturmedium hervorgerufen werden. Dieses veränderte nachhaltig die
75
Wachstumsunterlage für die Zellen. Die Bonit Oberflächendekoration hat sich im Laufe der
Zeit (14 Tage) strukturell zu einer eher glatteren Oberfläche mit einem geringeren Ra Wert
umgebaut. Die auf dieser umgebauten Bonit-Oberfläche ausgesäten (+) DAG USSCs zeigten
eine deutlich höhere Zellzahlen nach 24 h im Vergleich zu den USSCs auf der nicht
umgebauten Bonit Oberflächendekoration. Die von Gao und Kollegen (Gao, Hu et al. 2012)
verwendeten Osteoblasten, isoliert aus der Schädelkalotte von Ratten, zeigten auf der CaP
Oberfläche, zu Kontrollen aus Titan, nach 24 h keine verbesserten Zellzahlen. Vergleicht man
weiterhin die Bonit Oberflächendekoration mit der DUOTex Oberfläche aus der vorliegenden
Studie, welche aus Titan besteht, liegen die höchsten Zellzahlen für (+) DAG USSCs und (-)
DAG USSCs bei der DUOTex Oberfläche. Dies steht im Wiederspruch zu den Ergebnissen
von Gao (Gao, Hu et al. 2012).
Im direkten Vergleich der Zellzahlen von osteoblastenähnlichen Zellen zwischen einer
CaTiSiO5, einer HAP sowie, einer Ti6Al4V Oberfläche, stellten Wu und Kollegen (Wu,
Ramaswamy et al. 2009) fest, dass die HAP Oberfläche die Zellzahlen nach 24 h unterstützt.
Statistisch belegt ist dies allerdings nicht, so dass alle Oberflächen die gleichen Zellzahlen
nach 24 h aufweisen. Betrachtet man die Zellzahlen in Zusammenhang mit den dort
gefundenen Oberflächenrauigkeiten von 10-0,5 µm, so stehen die Ergebnisse im Gegensatz zu
den Resultaten in der hier vorliegenden Studie. Wendet man die Erkenntnisse von Wu und
Kollegen (Wu, Ramaswamy et al. 2009) jedoch auf die CaTiSiO5 und HAP Oberfläche an,
welche den gleichen Ra Wert aufweisen und unterschiedliche Mengen an Ca2+ abgeben, kann
eine Abhängigkeit der Zellzahlen (24 h) vom Material ausgeschlossen werden. Dieses
Ergebnis zeigt zum Einen, dass nicht die chemischen Eigenschaften der Bonit-Oberfläche für
die geringeren Zellzahlen verantwortlich waren. Zum Anderen, dass eine zu raue
Oberflächendekoration die Zellzahlen nach 24 h von den hier verwendeten USSCs hemmt.
Wu und Kollegen (Wu, Ramaswamy et al. 2009) zeigten Unterscheide für die Proliferation
von osteoblastenähnlichen Zellen auf einer CaTiSiO5, und HAP Beschichtung auf einer Ti-
6Al-4V Legierung. Die Autoren stellten fest, dass die Hauptursache für verschiedene
Reaktionen der Zellen in der Zusammensetzung der Oberfläche zu suchen war, und nicht auf
die Oberflächenrauigkeit zurückzuführen sind. Dies lag darin begründet, dass die von ihnen
getestete HAP und CaTiSiO5 Oberflächen die gleichen Ra Werte aufwiesen, aber ein
unterschiedliches Verhalten bei der Ionenabgabe und den Zellzahlen, innerhalb der
Proliferationsphase zeigten. Die HAP Oberfläche wies mehr Ca2+ Ionen und weniger Zellen,
die CaTiSiO5 weniger Ca2+ Ionen und mehr Zellen am 7. Tag der Untersuchung von Wu und
76
Kollegen auf (Wu, Ramaswamy et al. 2009). Lässt man die Oberflächenrauigkeit außer Acht,
ist der Ca2+ Gehalt im Nährmedium (ohne Zellen) der CaSi Oberflächendekoration und
DUOTex Oberfläche an Tag 7 annähernd gleich, und an Tag 14 und 28 im Vergleich zur
Bonit Oberflächendekoration erhöht. Der Ca2+ Gehalt im Nährmedium der Bonit
Oberflächendekoration zeigte weiterhin von Tag 7 bis Tag 28 einen Abfall, verglichen zu den
anderen. Vermutlich wurde ein Präzipitat aus CaP unter der Bindung von Ca2+ gebildet,
welches bereits in vorherigen Studien mit der Bonit Oberflächendekoration gefunden wurde
(Becker, Neumann et al. 2004). Die Bonit Oberflächendekoration zeigte von Tag 7 bis Tag 28
die niedrigsten Zellzahlen für die (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs. Es kann also
abgeleitet werden, dass die USSCs sensitiv auf die Änderung des Ca2+ Gehaltes im
Nährmedium reagieren. Die Oberflächenrauigkeiten der getesteten Oberflächen waren
unterschiedlich, so dass kein Vergleich hergestellt werden konnte.
Für CaP Beschichtungen wiesen Bigi und Kollegen (Bigi, Nicoli-Aldini et al. 2007)
kugelförmige Aggregate auf der Oberflächenstruktur nach. Bei vergrößerter Betrachtung
dieser, kam eine Lamellenstruktur zum Vorschein. Nach dem Ablösen der Oberfläche stellten
sie fest, dass es sich um elongierte, plattenähnliche Hydroxylapatitkristalle mit einer Länge
von 100 nm handelte. Die mesenchymalen Stammzellen auf diesen Oberflächen zeigten nach
14 Tagen in Kultur weniger Zellzahlen, im Vergleich zu den unbeschichteten Kontrollen aus
Ti13Nb13Zr und Ti6Al4V. Die Stagnation nach 14 Tagen auf den CaP Oberflächen, erklären
sich die Autoren mit dem Vorhandensein von Hydroxylapatit. Eine Stagnation der
Proliferation der (-) DAG USSCs konnte auch in der hier vorliegenden Arbeit festgestellt
werden. Allerdings änderte sich dies, als die (-) DAG USSCs auf der 14-tägig im
Nährmedium inkubierten, Bonit Oberflächendekoration kultiviert wurden. Hier war nun eine
Steigerung der Zellzahlen von Tag 1 zu Tag 7 zu beobachten, was eine Unabhängigkeit vom
Werkstoff suggeriert. Bigi und Kollegen (Bigi, Nicoli-Aldini et al. 2007) untersuchten nicht
die strukturelle Veränderung ihrer Oberflächen, was einen direkten Vergleich erschwert.
Abschließend kann für die verwendeten (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs
zusammengefasst werden, dass der Abbau von degradierbaren Oberflächen einen positiven
Einfluss auf das Wachstumsverhalten hatte. Dieser zeigte sich in höheren Zellzahlen,
verglichen mit nicht abgebauten Oberflächen.
77
Werden die Zellform und Verbreitung der USSCs durch verschiedene
Oberflächenstrukturierungen beeinflusst ?
Um die Zusammenhänge zwischen der Oberflächenstrukturierung und der Zellform, sowie
der Verbreitung zu untersuchen, wurden die USSCs nach 1, 7, 14 und 28 Tagen Wachstum
auf ihrer Oberfläche fixiert und mit dem Rasterelektronenmikroskop untersucht.
Dass osteoblastäre Zellen sensitiv auf die Morphologie von Oberflächen reagieren und somit
ihre Form und Verbreitung beeinflusst wird, zeigen eine Vielzahl von Publikationen.
Guizzardi und Kollegen (Guizzardi, Galli et al. 2004) testeten unter Anderem eine
Oberflächenstruktur mit tiefen, bzw. weiten Kavitäten und kugelförmigen Ausstülpungen,
was bei den verwendeten humanen Osteoblasten zu einem Herum-, aber nicht Hineinwachsen
führte. Dieser Effekt, den eine „tiefe Kavität“ auf das Verhalten einer Zelle hat, könnte
ebenfalls bei der hier verwendeten Bonit Oberflächendekoration eingetreten sein. Denn
bedingt durch die Größe der Brushit (B) Platten und die Ergebnisse der AFM-Messungen für
die Rmax lässt sich konstatieren, dass dies die Oberflächendekoration mit den tiefsten Stellen
von den in dieser Studie getesteten Oberflächen ist. Ein Indiz für zu tiefe Kavitäten könnte die
langgezogene Zellform (erkennbar bis an Tag 7) sein, die vor allem bei (-) DAG USSCs
durch lange Zellausläufer zu beobachten war. Die USSCs haben einen optimalen Platz für das
Zellwachstum identifiziert und überbrücken dabei die anderen Oberflächenanteile z.B.
„Zerklüftungen“ durch lange Zellausläufer. Ebenfalls scheint die Ausbildung eines Zellrasens,
vergleichend zu der CaSi Oberflächendekoration und DUOTex Oberfläche, erst relativ spät
einzusetzen. Ein ähnliches Verhalten beobachteten Richard und Kollegen (Richard, Dumelie
et al. 2006) für osteoblastenähnliche Zellen, die auf einer CaP beschichteten Ti6Al4V
Legierung kultiviert wurden. Die CaP Beschichtung wies dabei eine nadelige bis kugelige
Form auf, welche die Morphologie der Zellen beeinflusste. Diese hatten im Anfangsstadium,
nach 7 Tagen, ein längliches Aussehen mit langen Zellausläufern. Erst im späteren Verlauf,
ab Tag 14, wurde die Zellform polygonal und es waren mehr Zellausläufer, sowie die Bildung
eines Multilayers und einige runde Zellen zu beobachten. Die Form und die Art der
Verbreitung, korrespondieren mit dem Verhalten der hier verwendeten USSCs auf der Bonit
Oberflächendekoration. Weiterhin war in der vorliegenden Studie innerhalb der ersten 7
Tagen des Wachstums eine gestreckte, abgeflachte Zellform und lange Zellausläufer zu
beobachten. Die Vernetzung der Zellen untereinander zu einem Layer vollzieht sich erst
relativ spät, auch im Vergleich mit den anderen Oberflächendekorationen, CaSi und
DUOTex. Die von Richard und Kollegen (Richard, Dumelie et al. 2006) verwendeten Zellen
78
auf den Zellkulturplastiken (Kontrollen), wiesen im Gegensatz zu der CaP Beschichtung
bereits im Anfangsstadium eine sehr flache Morphologie, sowie eine polygonale Form mit
dünnen filopodialen Verlängerungen auf. Dies ist vergleichbar mit der Morphologie der hier
verwendeten USSCs, welche auf den DUOTex Oberflächen kultiviert wurden.
Vergleicht man die Morphologie der (-) DAG USSCs und (+) DAG USSCs auf der CaSi
Oberflächendekoration und der DUOTex Oberfläche, mit den getesteten Kontrolloberflächen
von Guizzardi und Kollegen (Guizzardi, Galli et al. 2004), dann lassen sich Analogien
feststellen. Die Autoren verwendeten eine Oberfläche, beispielsweise eine Struktur mit
scharfen Metallkanten und kleinen Löchern, auf welcher u.a. eine breite Zellform beobachtet
werden konnte. Es gibt zwar keine Löcher auf der in der vorliegenden Studie verwendeten
DUOTex Oberflächendekoration, es sind jedoch kantige Strukturen vorhanden, die ebenfalls
zu einer breiten und flachen Zellform der genutzten USSCs führten. Des Weiteren scheinen
die USSCs unter Vorsprüngen in den CaSi Oberflächendekorationen und DUOTex
Oberflächen bevorzugt zu wachsen, indem die Filopodia unter diese Strukturanteile bewegt
werden.
Diese Feststellung unterstützen die Resultate von Schwartz und Kollegen, in deren
Untersuchung reagierten die verwendeten humanen osteoblastenähnlichen Zellen sensitiv auf
die Oberflächenmorphologie (Schwartz, Raz et al. 2008). Nach 6 Tagen in Kultur wurde eine
spindelförmige bzw. längliche Morphologie mit gerichtetem Wachstum für die weniger rauen
Oberflächen (mit Mikrorillen) mit einem Ra Wert von 0,2 µm festgestellt. Ra Werte ab 2,0
µm führten hingegen zu einer polygonalen, dreieckigen, rundlichen Form, bei der
Zellausläufer in den Gruben der gestrahlten Geometrie festgestellt werden konnten. Dieses
Verhalten entspricht dem der USSCs auf der CaSi Oberflächendekoration. Auch hier wuchsen
die Filopodia der USSCs in die Kavitäten hinein. Andere Autoren konnten bei zunehmender
Oberflächenrauigkeit die Tendenz zu langgezogenen Zellausläufern beobachten, die nicht in
Kavitäten hineinwuchsen (Guizzardi, Galli et al. 2004). Diese Ergebnisse zeigen, dass
verschiedene Zelltypen unterschiedlich auf die jeweils vorliegenden Wachstumsunterlagen
reagieren. Bei den hier verwendeten (+) DAG USSCs zeigten sich ähnliche Morphologien
und ein ähnliches Wachstumsverhalten wie (-) DAG USSCs. Die (+) DAG USSCs zeigten
jedoch eine deutliche zeitliche Verzögerung.
Insgesamt konnte für die in dieser Studie verwendeten (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs
gezeigt werden, dass verschiedene Oberflächenstrukturierungen eine ähnliche Zellform und
79
Verbreitung aufweisen. Diese wurden jedoch zeitlich versetzt, also unterschiedlich schnell,
erreicht.
Ausblick
Um eine bessere Aussage über die Abhängigkeit zwischen dem Material einer
Oberflächenbeschichtung und der Zellinteraktion zu erlangen, müssten weitere Oberflächen
designt werden. Für (+) DAG USSCs konnte in dieser Studie beispielsweise der
Zusammenhang zwischen Oberflächenbeschichtung und den Kennwerten, wie Ra, nicht
ausgeschlossen werden. Optimal wären Kontrolloberflächen aus Kunststoff oder Titan, mit
der gleichen Oberflächenstrukturierung, wie die zu untersuchende Oberfläche aus einem
resorbierbaren Material (bspw. Bonit Oberflächendekoration).
Darüber hinaus sollte auf Ebene der Nanostrukturierung eine Standardisierung für die
verschiedenen Materialien realisiert werden. Es sollten laterale Abstände mit definierter
Morphologie erzeugt werden und geringer als 40 nm ausfallen. So könnten die Zellzahlen für
USSCs weiter gesteigert werden. Ein weiterer wichtiger Punkt der in die folgenden
Betrachtungen mit einbezogen werden muss, ist der im menschlichen Körper vorhande Abbau
von Abfallprodukten durch den Blutfluss. Eine Simulation dieser Zirkulation ist auch in der
Zellkultur möglich. Zu erwartende Ergebnisse wären in einem schnelleren Abbau der
Zerfallsprodukte von resorbierbaren Oberflächen zu sehen, welche sich auf das Verhalten der
darauf kultivierten Zellen auswirken könnte.
Viele Implantate sind selbstschneidend und treffen beim Einschrauben in den Kiefer auf die
harte Struktur der Kompakta. Hier wird unter Umständen die aufgebrachte
Oberflächenstruktur im Mikro- und Nanometerbereich der Materialien verändert. Es sollte
untersucht werden, in wie weit sich diese verändert und welchen Einfluss dies auf das
Wachstumsverhalten der USSCs hat.
80
6 Zusammenfassung
Ziel
Oberflächeneigenschaften im Mikro- und Nanometerbereich, die Löslichkeit, Effekte der
Abbauprodukte und die sich verändernde Oberflächenmorphologie, spielen eine bedeutende
Rolle in der Einheilung von Implantaten in den Knochen. So beeinflussen diese
Oberflächeneigenschaften maßgeblich die Zellzahlen, das Überleben, die Verbreitung und
Morphologie von Vorläuferzellen. Es war Ziel dieser Studie, das Wachstumsverhalten von
Vorläuferzellen auf verschiedenen Oberflächendekorationen, wie sie auf dentalen Implantaten
zum Einsatz kommen, zu untersuchen. Es sollte anhand verschiedener Parameter bestimmt
werden, wie das Zellwachstum von der Oberflächenbeschaffenheit abhängt. Die so
gewonnenen Ergebnisse können eine Aussage über die Biokompatibilität der getesteten
Oberflächendekorationen liefern.
Material und Methoden
Es wurden DUOTex-Oberflächen, Bonit- und Kalziumsilikat (CaSi)
Oberflächendekorationen, sowie abgebaute Bonit-Oberflächendekorationen genutzt. Darauf
wurden vor- und nicht vordifferenzierte ((+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs) humane
Nabelschnurblutstammzellen (USSC) kultiviert. Zur Bestimmung der
Oberflächentopographien im Nanometerbereich, sowie der Ra Werte, wurde mit dem AFM
(Atomic-Force-Microscope) und dem REM (Rasterelektronenmikroskop) gearbeitet. Durch
Messungen der Fluoreszenzfarbstoffbindung an die Nukleinsäure, sind die Zellzahlen nach 24
h, sowie 7, 14 und 28 Tagen bestimmt worden. Die Werte für abgegebenes Ca2+ der
Oberflächen, wurden mittels einer Farbkomplexbildung und der Messung ihrer Intensität
erhoben. Mit dem REM wurden die Morphologie und die Verbreitung der USSCs untersucht.
Ergebnisse
Die Ra Werte betrugen: DUOTex = 0,537 µm, CaSi = 0,669 µm, Bonit abgebaut = 0,865 µm,
Bonit = 1,234 µm. Die lateralen Abstände der Oberflächen im Nanometerbereich betrugen:
DUOTex = 41-57 nm, CaSi 113-158 nm, Bonit > = 160 nm. Zwischen den Tagen 1, 7, 14
81
und 28 wurden unterschiedlich starke Erhöhungen (p<0,05) der mittleren Zellzahlen für die
(+) DAG USSCs oder (-) DAG USSCs auf den verschiedenen Oberflächen beobachtet. Die
höchsten mittleren Zellzahlen für (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs an den Tagen 1, 7, 14
und 28 wurden auf den DUOTex Oberflächen, sowie CaSi Oberflächendekorationen
gefunden. Es konnten Unterschiede (p<0,05) in den mittleren Zellzahlen, vergleichend
zwischen (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs auf der jeweiligen Oberflächenart an den
Tagen 1, 7, 14 und 28 beobachtet werden. Für eine Kultivierungszeit von 24 h war der
Zusammenhang zwischen der Zellzahl und Ra für die (-) DAG USSCs statistisch signifikant
(p<0,001) und wurde durch folgende Funktion beschrieben: Zellzahl = 2285,6 · Ra-2+4506,6.
Nach sieben Tagen, in der Proliferationsphase, war der Zusammenhang zwischen der Zellzahl
der (-) DAG USSCs und Ra ebenfalls statistisch signifikant (p<0,001) und wurde durch die
Funktion: Zellzahl = 8817,0 · Ra-2+ 13035,3 beschrieben. Nach dem Abbau der Bonit-
Oberflächendekoration wurden gegenüber nicht vorbehandelten Bonit-
Oberflächendekorationen nach 24 h und 7 Tagen höhere mittlere Zellzahlen bei (+) DAG
USSCs beobachtet (p<0,05). Zusätzlich konnte ein signifikanter Anstieg der Zellzahlen
(p<0,05), verglichen von Tag 1 zu Tag 7, für (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs
nachgewiesen werden. Die Messung der Ca2+ Ionen ergab, dass die Bonit- und CaSi
Oberflächendekorationen Ca2+ in das Nährmedium abgaben. Die CaSi Oberflächendekoration
näherte sich einem Ca2+ Level, vergleichbar der DUOTex Oberfläche. Für die Bonit-
Oberflächendekoration konnte ein Rückgang des Ca2+ im Nährmedium beobachtet werden.
Die Ausbreitung, sowie Form der (+) DAG USSCs und (-) DAG USSCs waren ähnlich,
wurden aber abhängig von der Wachstumsunterlage unterschiedlich schnell erreicht.
Schlussfolgerung
Es konnte gezeigt werden, dass die USSCs sensitiv auf Beschaffenheit im Mikro- und
Nanometerbereich, sowie die Degradation von Oberflächen reagieren. Oberflächen mit
geringen Ra Werten, sowie kleinen lateralen Abständen im Nanometerbereich, haben sich
günstig auf die Zellzahlen der USSCs ausgewirkt. Durch Veränderungen von abbaubaren
Oberflächen wurden ebenfalls die Zellzahlen der USSCs deutlich erhöht. Weiterhin konnte
festgestellt werden, dass die Vordifferenzierung der USSCs Einfluss auf das
Wachstumsverhalten hatte.
82
7 Anhang
7.1 Abbildungsverzeichnis
ABBILDUNG 2-1 PROFIL EINER OBERFLÄCHE MIT KENNWERTEN ...................................................... 13
ABBILDUNG 2-2 OBERFLÄCHENTOPOGRAFIE EINES DENTALEN IMPLANTATES: A
MAKROSTRUKTURIERUNG (IMPLANTATCORPUS (5) IM KNOCHEN VERANKERT IN
KONTAKT MIT: (3) PERIOST, (4) KOMPAKTA UND (6) SPONGIOSA, SO WIE DAS ABUTMENT
(1) MIT KONTAKT ZUR SCHLEIMHAUT (2)) B MIKROSTRUKTURIERUNG (ZELLEN AUF DER
IMPLANTATOBERFLÄCHE IM MIKROMETERBEREICH); C NANOSTRUKTURIERUNG (ZELLE
IN INTERAKTION MIT DER IMPLANTATOBERFLÄCHE IM NANOMETERBEREICH), ZU SEHEN
SIND DAS SUBSTRAT UNTEN, DIE EZM (EXTRA ZELLULARE MATRIX) MIT
AKTINFILAMENTEN IN DER MITTE UND DIE ZELLE OBEN. ). ...................................................... 15
ABBILDUNG 2-3 POTENTIAL DER HOMOGENEN DIFFERENZIERUNG VON USSCS, IN VITRO, IN
VERSCHIEDENE ZELLTYPEN. .............................................................................................................. 16
ABBILDUNG 2-4 BEZIEHUNG ZWISCHEN PROLIFERATION UND DIFFERENZIERUNG, BEI DER
OSTEOBLASTÄREN DIFFERENZIERUNG; ADAPTIERT AUS (MAYER, SCUTT ET AL. 1992). ... 18
ABBILDUNG 3-1 ABMESSUNGEN DER PROBENKÖRPER ......................................................................... 25
ABBILDUNG 4-1 AUFNAHME DER OBERFLÄCHENDEKORATIONEN NACH DER GAMMA-
STERILISATION. DIE BILDER AUF DER LINKEN SEITE WURDEN MIT DEM
RASTERELEKTRONENMIKROSKOP (BALKEN = 10µM) UND AUF DER RECHTEN SEITE MIT
DEM AFM (ATOMIC-FORCE-MICROSCOPE) AUFGENOMMEN. ..................................................... 39
ABBILDUNG 4-2 OBERFLÄCHEN AUFGENOMMEN MIT AFM (IM TAPPING-MODE) IN EINEN
BEREICH VON 500 NM ZUR BESTIMMUNG DER LATERALEN ABSTÄNDE IM
NANOMETERBEREICH. DIE ABBILDUNGEN AUF DER LINKEN SEITE STELLEN DAS MIT
DEM AFM AUFGENOMMENE BILD DER VERSCHIEDENEN OBERFLÄCHEN MIT
HORIZONTALER VERMESSUNGSLINIE UND MESSPUNKTEN DAR. ÜBER DIE
VERMESSUNGSLINIE LÄSST SICH DAS HÖHENPROFIL DER OBERFLÄCHEN ERSTELLEN.
MIT HILFE DER MESSPUNKTE KÖNNEN EINZELNE BEREICHE MARKIERT UND VERMESSEN
WERDEN. DAS HÖHENPROFIL DER OBERFLÄCHEN UND DIE MESSPUNKTE SIND AUF DER
RECHTEN SEITE ABGEBILDET. ............................................................................................................ 41
ABBILDUNG 4-3 AUFNAHME DER BONIT OBERFLÄCHENDEKORATION NACH INKUBATION FÜR
1,14 UND 28 TAGE IM NÄHRMEDIUM. DIE AUFNAHMEN WURDEN MIT DEM (REM)
RASTERELEKTRONENMIKROSKOP (BALKEN = 10 µM.), SOWIE DEM AFM (ATOMIC-FORCE-
MICROSCOPE) GEMACHT. DEUTLICH IST ZU ERKENNEN, WIE SICH DIE OBERFLÄCHE AB-
UND UMBAUT, BZW. DEGRADIERT WIRD. ....................................................................................... 42
ABBILDUNG 4-4 GEGENÜBERSTELLUNG DER CA2+ MENGE AUS DEM NÄHRMEDIUM IN DEM DIE
PROBENKÖRPER (BONIT, CASI, UND DUOTEX) OHNE ZELLEN INKUBIERT WURDEN.
GEMESSEN WURDE AN DEN TAGEN 1, 7, 14 UND 28. ...................................................................... 44
83
ABBILDUNG 4-5 GEGENÜBERSTELLUNG DER MITTLEREN ZELLZAHLEN (MIT
STANDARDABWEICHUNG) AUF DEN PROBENKÖRPERN BONIT, CASI UND DUOTEX VON
DREITÄGIG MIT DAG VORDIFFERENZIERTEN (+) UND NICHT VORDIFFERENZIERTEN
USSCS (-) ÜBER EINEN ZEITLICHEN VERLAUF VON INSGESAMT 28 TAGEN. MIT P < 0,05
SIGNIFIKANT FÜR: *=T-TEST MIT GLEICHEN VARIANZEN/**=T-TEST MIT UNGLEICHEN
VARIANZEN/#=MANN-WHITNEY-U-TEST. ........................................................................................ 46
ABBILDUNG 4-6 GEGENÜBERSTELLUNG DER ZELLZAHLEN VON DREITÄGIG MIT DAG
VORDIFFERENZIERTEN (+) UND NICHT VORDIFFERENZIERTEN USSCS (-) MIT
STANDARTABWEICHUNGEN, NACH 24 H UNTER KULTURBEDINGUNGEN AUF DEN
PROBENKÖRPERN BONIT, CASI, UND DUOTEX. MIT P<0,05 SIGNIFIKANT FÜR: *= T-TEST
MIT GLEICHEN VARIANZEN/**=T-TEST MIT UNGLEICHEN VARIANZEN/#=MANN-WHITNEY-
U-TEST. ...................................................................................................................................................... 48
ABBILDUNG 4-7 MITTLERE ZELLZAHLEN (MIT STANDARDABWEICHUNG) VON DREITÄGIG MIT
DAG VORDIFFERENZIERTEN (+) UND NICHT VORDIFFERENZIERTEN USSCS (-) NACH
SIEBEN TAGEN UNTER KULTURBEDINGUNGEN AUF DEN PROBENKÖRPERN BONIT, CASI
UND DUOTEX. MIT P<0,05 SIGNIFIKANT FÜR: *= T-TEST MIT GLEICHEN VARIANZEN/**=T-
TEST MIT UNGLEICHEN VARIANZEN/#= MANN-WHITNEY-U-TEST. .......................................... 49
ABBILDUNG 4-8 MITTLERE ZELLZAHLEN (MIT STANDARDABWEICHUNG) VON DREITÄGIG MIT
DAG VORDIFFERENZIERTEN (+) UND NICHT VORDIFFERENZIERTEN USSCS (-) NACH 14
TAGEN UNTER KULTURBEDINGUNGEN AUF DEN PROBENKÖRPERN BONIT, CASI UND
DUOTEX. MIT P<0,05 SIGNIFIKANT FÜR: *= T-TEST MIT GLEICHEN VARIANZEN/**=T-TEST
MIT UNGLEICHEN VARIANZEN/#=MANN-WHITNEY-U-TEST. ...................................................... 50
ABBILDUNG 4-9 MITTLERE ZELLZAHLEN (MIT STANDARDABWEICHUNG) VON DREITÄGIG MIT
DAG VORDIFFERENZIERTEN (+) UND NICHT VORDIFFERENZIERTEN USSCS (-), NACH
28TAGEN UNTER KULTURBEDINGUNGEN AUF DEN PROBENKÖRPERN BONIT, CASI UND
DUOTEX. MIT P<0,05 SIGNIFIKANT FÜR: *= T-TEST MIT GLEICHEN VARIANZEN/**=T-TEST
MIT UNGLEICHEN VARIANZEN/#= MANN-WHITNEY-U-TEST. ..................................................... 51
ABBILDUNG 4-10 MITTLERE ZELLZAHLEN (MIT STANDARDABWEICHUNG) FÜR DREITÄGIGE
MIT DAG VORDIFFERENZIERTE USSC (+) UND NICHT MIT DAG VORDIFFERENZIERTE USSC
(-) NACH 24 STUNDEN UND 7 TAGEN UNTER KULTURBEDINGUNGEN AUF 14-TÄGIG MIT
NÄHRMEDIUM VORBEHANDELTEN UND NICHT VORBEHANDELTEN BONIT
OBERFLÄCHENDEKORATION UND DUOTEX OBERFLÄCHEN. MIT: P<0,05 SIGNIFIKANT FÜR:
*= T-TEST MIT GLEICHEN VARIANZEN/**=T-TEST MIT UNGLEICHEN VARIANZEN/#=MANN-
WHITNEY-U-TEST. .................................................................................................................................. 53
ABBILDUNG 4-11 PROZENTUAL AUF DER OBERFLÄCHE ANGEHAFTETE ZELLENZAHLEN, NACH
24 H, DER MIT DAG VOR UND NICHT VORDIFFERENZIERTEN USSCS UNTER
KULTURBEDINGUNGEN AUF DEN VERSCHIEDENEN PROBENKÖRPERN. BONIT (14D-V) IST
DIE 14 TAGE IM NÄHRMEDIUM VORBEHANDELTE BONIT OBERFLÄCHENDEKORATION... 55
ABBILDUNG 4-12 ZUSAMMENHANG ZWISCHEN OBERFLÄCHENRAUIGKEIT (RA) UND ZELLZAHL
FÜR (-) DAG USSCS (DUNKELGRAUE RHOMBEN) UND (+) DAG USSCS (HELLGRAUE
QUADRATE) 24 H NACH DEM AUSSÄEN. DARGESTELLT SIND DIE MITTELWERTE FÜR DIE
84
ZELLZAHLEN MIT STANDARDABWEICHUNG, BEZOGEN AUF DIE
OBERFLÄCHENRAUIGKEIT. ................................................................................................................. 56
ABBILDUNG 4-13 ZUSAMMENHANG ZWISCHEN OBERFLÄCHENRAUIGKEIT (RA) UND ZELLZAHL
BEI NICHT VORDIFFERENZIERTEN USSCS 24 H NACH DEM AUSSÄEN. DARGESTELLT SIND
DIE BEOBACHTETEN WERTE (DATENPUNKTE) SOWIE DIE DURCH DAS
REGRESSIONSMODELL VORHERGESAGTE MITTLERE ZELLZAHL (DURCHGEZOGENE
LINIE) MIT DEM 95% KONFIDENZINTERVALL (GESTRICHELTE LINIEN). ................................. 57
ABBILDUNG 4-14 ZUSAMMENHANG ZWISCHEN OBERFLÄCHENRAUIGKEIT (RA) UND ZELLZAHL
7 TAGE NACH DEM AUSSÄEN DER (-) DAG USSCS (DUNKELGRAUE RHOMBEN) UND (+)
DAG USSCS (HELLGRAUE QUADRATE). DARGESTELLT SIND DIE MITTELWERTE FÜR DIE
ZELLZAHLEN MIT STANDARDABWEICHUNG, BEZOGEN AUF DIE
OBERFLÄCHENRAUIGKEIT. ................................................................................................................. 57
ABBILDUNG 4-15 ZUSAMMENHANG ZWISCHEN OBERFLÄCHENRAUIGKEIT (RA) UND ZELLZAHL
FÜR (-) DAG USSCS 7 TAGE NACH DEM AUSSÄEN. DARGESTELLT SIND DIE
BEOBACHTETEN WERTE (DATENPUNKTE), SOWIE DIE DURCH DAS REGRESSIONSMODELL
VORHERGESAGTE MITTLERE ZELLZAHL (DURCHGEZOGENE LINIE) MIT DEM 95%
KONFIDENZINTERVALL (GESTRICHELTE LINIEN). ........................................................................ 58
ABBILDUNG 4-16 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPISCHE AUFNAHME VON 3 TAGE MIT DAG
VORDIFFERENZIERTEN UND NICHT VORDIFFERENZIERTEN USSCS. AUFGENOMMEN
WURDE MIT DEM RASTERELEKTRONENMIKROSKOP: 24 H NACH DER AUSSAAT AUF DIE
BONIT UND CASI OBERFLÄCHENDEKORATION, SOWIE AUF DIE DUOTEX OBERFLÄCHE
(BALKEN = 50 µM). .................................................................................................................................. 61
ABBILDUNG 4-17 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPISCHE AUFNAHME VON 3 TAGE MIT DAG
VORDIFFERENZIERTEN UND NICHT VORDIFFERENZIERTEN USSCS. AUFGENOMMEN
WURDE MIT DEM RASTERELEKTRONENMIKROSKOP: 7 TAGE NACH DER AUSSAAT AUF
DIE BONIT UND CASI OBERFLÄCHENDEKORATION, SOWIE AUF DIE DUOTEX
OBERFLÄCHE (BALKEN = 50 µM). ....................................................................................................... 62
ABBILDUNG 4-18 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPISCHE AUFNAHME VON 3 TAGE MIT DAG
VORDIFFERENZIERTEN UND NICHT VORDIFFERENZIERTEN USSCS. AUFGENOMMEN
WURDE MIT DEM RASTERELEKTRONENMIKROSKOP: 14 TAGE NACH DER AUSSAAT AUF
DIE BONIT UND CASI OBERFLÄCHENDEKORATION, SOWIE AUF DIE DUOTEX
OBERFLÄCHE (BALKEN = 50 µM). ....................................................................................................... 63
ABBILDUNG 4-19 RASTERELEKTRONENMIKROSKOPISCHE AUFNAHME VON 3 TAGE MIT DAG
VORDIFFERENZIERTEN UND NICHT VORDIFFERENZIERTEN USSCS. AUFGENOMMEN
WURDE MIT DEM RASTERELEKTRONENMIKROSKOP: 14 TAGE NACH DER AUSSAAT AUF
DIE BONIT UND CASI OBERFLÄCHENDEKORATION, SOWIE AUF DIE DUOTEX
OBERFLÄCHE (BALKEN = 50 µM). ....................................................................................................... 64
85
7.2 Literaturverzeichnis
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93
7.3 Danksagung
Mein außerordentlicher Dank gilt Herrn Prof. Dr. Reiner Biffar für die engagierte Betreuung
bei der Erstellung der Arbeit. Weiterhin möchte ich mich bei Prof. Dr. Reiner Biffar für die
Unterstützung im Promotionsverfahren bedanken.
Bei Herrn Prof. Dr. Dr. Jörg Handschel bedanke ich mich besonders für die Unterstützung
beim Entstehungsprozess dieser Arbeit, die Finanzierung einer Stelle, die Möglichkeit der
Teilnahme an Kongressen und weiteren Projekten.
Bei Herrn Prof. Dr. Dr. Norbert R. Kübler bedanke ich mich im Besonderen für die
Bereitstellung des Labors, der Reagenzien und die Nutzung des Equipments, ohne welches
der praktische Teil der Arbeit nicht durchführbar gewesen wäre.
Für die fachliche Betreuung der Arbeit seitens der HS-Osnabrück möchte ich mich im
Besonderen bei Prof. Dr.-Ing. Wilhelm Michels bedanken.
Für die Anfertigung und Überlassung der hohen Anzahl an Probenkörpern bin ich Herrn Prof.
Dr. Hans-Georg Neumann und Frau Dr. Cornelia Prinz zu besonderem Dank verpflichtet.
Für stets lösungsorientierte Gespräche, die Weitergabe von zellbiologischem Fachwissen
praktischer und theoretischer Natur, möchte ich mich bei Herrn Dr. rer. nat. Fabian
Langenbach und Frau Dr. rer. nat. Karin Berr bedanken. Weiterhin möchte ich Herrn Dr. rer.
nat. Fabian Langenbach für die Hilfestellungen und Ratschläge, welche das wissenschaftliche
Aufbereiten der gewonnenen Daten angehen, danken.
Für die Schaffung eines angenehmen Arbeitsklimas möchte ich mich bei Frau Dr. med. vet.
Pia Valeska Kersten-Thiele, Andrea Hassel und Marianne Hölbling bedanken.
Bei Frau Prof. Gesine Kögler bedanke ich für die Bereitstellung der USSCs.
Herrn Prof. Dr. Thomas Heinzel danke ich für die Möglichkeit das AFM nutzen zu können.
Seinem Team, Herrn Dr. M. Cerchez und Herrn Dipl.-Ing. (FH) Uwe Zimmermann, verdanke
ich die gelungenen Aufnahmen und Auswertungen der Oberflächen.
94
Für die fachliche Betreuung der statistischen Auswertungen möchte ich mich bei Frau Dr. rer.
nat. Birte Holtfreter bedanken.
Abschließend möchte ich mich bei meiner Frau Wenke Hentschel, M.A. bedanken. Sie hat
mir stets den Rückhalt gegeben diese Arbeit zur Vollendung zu führen. Im Besonderen bin ich
ihr sehr dankbar für das geduldige Korrekturlesen dieser Abreit.
