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Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2013
© 2013 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-150-9
Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17
35392 Gießen 0641/24466 [email protected] www.dvg.de
Institut für Pharmakologie,Toxikologie und Pharmazie
Tierärztliche Hochschule Hannover
und das Zentrum für Systemische Neurowissenschaften Hannover
Untersuchungen zur
antiepileptogenen und antikonvulsiven Wirkung des
NKCC1-Inhibitors Bumetanid
THESE
Zur Erlangung des Grades eines
DOCTOR OF PHILOSOPHY (PhD)
im Fachgebiet
Pharmakologie
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Manuel C. W. Töpfer
München
Hannover 2013
Supervisor: Prof. Dr. W. Löscher
Betreuungsgruppe: Prof. Dr. W. Löscher
Prof. Dr. A. Das
PD Dr. J. Ahrens
1. Gutachten: Prof. Dr. W. Löscher
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Prof. Dr. A. Das
Klinik für Pädiatrische Nieren-, Leber-, und
Stoffwechselerkrankungen
Medizinische Hochschule Hannover
PD Dr. J. Ahrens
Klinik für Anästhesiologie und Intensivmedizin,
Medizinische Hochschule Hannover
2. Gutachten: Prof. Dr. R. Köhling
Oskar-Langendorff Institut für Physiologie
Universität Rostock
Förderung durch ein Promotionsstipendium der Akademie für Tiergesundheit e.V.
Diese Arbeit ist ein Teilprojekt der DFG-Forschergruppe Neurodegeneration und –
regeneration bei ZNS-Erkrankungen des Hundes (Forschergruppe 1103).
Datum der mündlichen Prüfung: 12.04.2013
Für meine Familie
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG .................................................................................... 1
2 KENNTNISSTAND ............................................................................. 4
Epilepsie ....................................................................................................... 4 2.1
2.1.1 Definition und Bedeutung .................................................................... 4
2.1.2 Klassifizierung von Epilepsien ............................................................. 4
2.1.3 Temporallappenepilepsie .................................................................... 5
2.1.4 Der Begriff Epileptogenese .................................................................. 6
Tiermodelle für Epilepsie ............................................................................ 7 2.2
2.2.1 Das Kindling-Modell ............................................................................ 8
2.2.2 Das Pilokarpin-Modell ....................................................................... 10
2.2.3 Der Pentylentetrazol-Krampftest ....................................................... 11
Inhibition von Kation-Chlorid-Kotransportern als neue Möglichkeit zur 2.3
Epilepsiebehandlung ................................................................................. 13
2.3.1 Der Einfluss von Kation-Chlorid-Kotransportern auf die Wirkung des
Neurotransmitters GABA .................................................................. 13
2.3.2 Der NKCC1-Inhibitor Bumetanid ....................................................... 16
2.3.3 Bumetanid-Derivate ........................................................................... 18
2.3.4 Piperonylbutoxid ................................................................................ 21
2.3.5 Studien zu Alterationen von Kation-Chlorid-Kotransportern und
Wirkungen von Bumetanid am Menschen und in Anfallsmodellen ... 22
Phenobarbital ............................................................................................. 28 2.4
3 ZIELSETZUNG UND ARBEITSHYPOTHESEN ........................................ 29
4 MATERIAL UND METHODEN ............................................................ 32
Tiere ............................................................................................................ 32 4.1
Untersuchungen zu antiepileptogenen und antikonvulsiven Wirkungen 4.2
von Bumetanid und antikonvulsiven Wirkungen von BUM5 im Kindling-
Modell ......................................................................................................... 34
4.2.1 Implantation von Elektroden und Führungsrohren ............................. 34
4.2.2 Kindling-Protokoll .............................................................................. 37
4.2.3 Untersuchungen zur antiepileptogenen Wirksamkeit von Bumetanid im
Kindling-Modell ................................................................................. 41
4.2.4 Untersuchungen zur antikonvulsiven Wirksamkeit von Bumetanid im
Kindling-Modell ................................................................................. 43
4.2.5 Bestimmung von Bumetanid im Plasma und im Gehirngewebe nach
intravenöser und intrazerebroventrikulärer Applikation ..................... 51
4.2.6 Durchführung der Verhaltenstests ..................................................... 52
4.2.7 Perfusion/histologische Aufarbeitung der Gehirne ............................ 53
4.2.8 Lokalisationsbestimmung der Kindlingelektrode und der
Führungsrohre .................................................................................. 54
Untersuchungen zur Wirkung von Bumetanid und BUM5 nach einem 4.3
pilokarpin-induzierten SE im PTZ-Krampftest ......................................... 55
4.3.1 Induktion eines SE mittels Pilokarpin ................................................ 55
4.3.2 Durchführung des Pentylentetrazol-Krampftests ............................... 56
Statistische Berechnungen ....................................................................... 59 4.4
5 ERGEBNISSE ................................................................................ 60
Lokalisation der Elektroden und Führungsrohre .................................... 60 5.1
Untersuchungen zur antiepileptogenen Wirksamkeit von Bumetanid im 5.2
Kindling-Modell .......................................................................................... 62
5.2.1 Untersuchung der antiepileptogenen Wirksamkeit von Bumetanid
unter einer Vorbehandlung mit PBO ................................................. 62
5.2.2 Einfluss der Behandlung auf die Urinproduktion und den
Elektrolythaushalt ............................................................................. 65
Untersuchungen zu antikonvulsiven Wirkungen von Bumetanid im 5.3
Kindling-Modell .......................................................................................... 68
5.3.1 Untersuchungen zu einer i.v.-Applikation von Bumetanid ................. 68
5.3.2 Untersuchungen zu einer kombinierten Applikation von Bumetanid und
PBO .................................................................................................. 69
5.3.3 Gehirn- und Plasmakonzentration nach Applikation von PBO und
Bumetanid ........................................................................................ 71
5.3.4 Untersuchungen unter i.c.v.-Applikation von Bumetanid ................... 73
5.3.5 Gehirn- und Plasmakonzentration nach i.c.v.-Applikation von
Bumetanid ........................................................................................ 76
Untersuchungen zu einer intravenösen Applikation von Bumetanid, 5.4
BUM5 und Phenobarbital bei voll gekindelten Ratten ............................ 77
5.4.1 Dosisfindung von Phenobarbital ........................................................ 77
5.4.2 Bumetanid und BUM5 +/- Phenobarbital ........................................... 79
5.4.3 Vergleich der Wirkungen von Bumetanid und BUM5 im Kindling-
Modell ............................................................................................... 85
5.4.4 Ergebnisse von Verhaltensversuchen aus Untersuchungen zu
antikonvulsiven Wirkungen von Bumetanid und BUM5 im Kindling-
Modell ............................................................................................... 86
Untersuchungen zur Wirkung von Bumetanid und BUM5 nach einem 5.5
pilokarpin-induzierten SE im PTZ-Krampftest bei der Maus .................. 86
5.5.1 Einfluss von Bumetanid auf die PTZ-Krampfschwelle 24 Stunden nach
SE ..................................................................................................... 90
5.5.2 Einfluss von Bumetanid auf die PTZ-Krampfschwelle 48 Stunden nach
SE ..................................................................................................... 92
5.5.3 Einfluss von Bumetanid auf die PTZ-Krampfschwelle 1 Woche nach
SE ..................................................................................................... 93
5.5.4 Einfluss von BUM5 auf die PTZ-Krampfschwelle 24 h nach SE ........ 95
5.5.5 Vergleich der Wirkungen von Bumetanid und BUM5 nach SE-
Induktion im PTZ-Krampftest ............................................................ 96
6 DISKUSSION ................................................................................. 98
Untersuchung zur antiepileptogenen Wirksamkeit von Bumetanid unter 6.1
einer Vorbehandlung mit PBO im Kindling-Modell ................................. 99
Untersuchungen der antikonvulsiven Wirksamkeit von Bumetanid und 6.2
BUM5 im Kindling-Modell ........................................................................ 104
Untersuchungen zur Wirkung von Bumetanid und BUM5 nach SE-6.3
Induktion im PTZ-Krampftest .................................................................. 110
Schlussbetrachtung ................................................................................ 114 6.4
7 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................... 116
8 SUMMARY .................................................................................. 119
9 LITERATURVERZEICHNIS .............................................................. 121
10 ANHANG .................................................................................... 137
Geräte und Verbrauchsmaterialen ......................................................... 137 10.1
Sonstige Ergebnisse aus den Kindling-Studien ................................... 142 10.2
10.2.1 Untersuchungen zur intrazerebroventrikulären Applikation von
Bumetanid ...................................................................................... 142
10.2.2 Untersuchungen zur intravenösen Applikation von Bumetanid und
BUM5 +/- Phenobarbital ................................................................. 152
11 PUBLIKATIONEN .......................................................................... 180
12 EIDESSTATTLICHE ERKLÄRUNG .................................................... 182
13 DANKSAGUNG ............................................................................ 184
Abkürzungen
Abb. Abbildung
ADD Nachentladungsdauer (afterdischarge duration)
ADT Nachentladungsschwelle (afterdischarge threshold)
AED Antiepileptikum (antiepileptic drug)
ANOVA Analysis of variance (Varianzanalyse)
Aqua dest. destilliertes Wasser
BE Basenüberschuss (base excess)
BLA basolaterale Amygdala
BUM Bumetanid
bzw. beziehungsweise
ca. zirka
°C Grad Celsius
cADD kumulative Nachentladungsdauer
(cumulative afterdischarge duration)
Cl- Chlorid
cSD kumulative Anfallsdauer
(cumulative seizure duration)
d.h. das heißt
EEG Elektroenzephalogramm
et al. und andere (et alii, et aliae, et alia)
g Gramm
GABA ʏ-Aminobuttersäure
ggf. gegebenenfalls
GST Schwelle zum Erreichen eines generalisierten
Anfalls (generalized seizure threshold)
h Stunde/Stunden
HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(high pressure liquid chromatography)
i.d.R. in der Regel
i.c.v. intrazerebroventrikulär
i.p. intraperitoneal
i.v. intravenös
ILEA Internationale Liga gegen Epilepsie
(International League against Epilepsy)
kg Kilogramm
KCC2 Kalium-Chlorid-Kotransporter 2
M molar
mg Milligramm
ml Mililiter
min Minute/Minuten
mod. modifiziert
NaCl Natriumchlorid
ng Nanogramm
NKCC1 Natrium-Kalium-Chlorid-Kotransporter 1
NKCC2 Natrium-Kalium-Chlorid-Kotransporter 2
PB Phenobarbital
post-ADT post-Kindling-Nachentladungsschwelle
(d.h. nach der Kindling-Prozedur)
post-GST post-Kindling-Nachentladungsschwelle zum
Erreichen eines generalisierten Anfalls (d.h. nach
der Kindling-Prozedur)
PTZ Pentylentetrazol
SD Anfallsdauer (seizure duration)
SE Status epilepticus
Sek. Sekunde/Sekunden
SEM Standardfehler (standard error of the mean)
SS Anfallsschwere (seizure severity)
Tab. Tabelle
TLE Temporallappenepilepsie
u.a. unter anderem
usw. und so weiter
u.U. unter Umständen
vgl. vergleiche
vs. versus
μA Mikroampere
μg Mikrogramm
μl Mikroliter
μM mikromolar
z.B. zum Beispiel
z.T. zum Teil
Einleitung
1
1 Einleitung
Epilepsien mit spontan und wiederholt auftretenden epileptischen Anfällen gehören
zu den häufigsten Erkrankungen des Gehirns bei Mensch und Tier, vor allem Hunden
und Katzen. In der Tiermedizin sind sie die einzige chronische Hirnerkrankung, die
medikamentös behandelt wird und oft sogar lebenslang therapiert werden muss
(LÖSCHER 2003). In der Humanmedizin stellen Epilepsien nach Schlaganfällen die
zweithäufigste neurologische Erkrankung dar (BROWNE und HOLMES 2001). Die
Prävalenz von Epilepsien wird bei Hunden von 0,5 auf bis zu 7% angenommen
(CHANDLER 2006; VOLK und LODERSTEDT 2011). Beim Menschen treten
Epilepsien mit einer Prävalenz von 0,5 bis 1% auf (ENGEL et al. 2003). So sind
Schätzungen zufolge etwa 50 Millionen Menschen weltweit von Epilepsien betroffen
(DUNCAN et al. 2006). Oft entwickeln sich Epilepsien mit einer Latenz von Monaten
bis Jahren nach initialen Hirninsulten, wie Hirnverletzungen (z.B. nach Unfällen),
Infektionen, Hirntumoren oder auch nach einem Status epilepticus (PITKÄNEN und
LUKASIUK 2011). Während dieser Zeit laufen im Gehirn Prozesse ab, die unter dem
Begriff Epileptogenese subsumiert werden. Diese Prozesse sind durch eine
Entwicklung neuronaler Hyperexzitabilität und häufig struktureller (degenerativer und
regenerativer) Hirnveränderungen charakterisiert (SCHARFMAN 2007). Für die
Tiermedizin konnte erst kürzlich gezeigt werden, dass Hunde (und auch Katzen)
nach Schädel-Hirn-Traumata ein vielfach erhöhtes Risiko haben Epilepsien zu
entwickeln, als Tiere mit Traumata ohne Beteiligung des Kopfes (STEINMETZ et al.
in press). Mit den derzeit wenigen für die Tiermedizin verfügbaren Antiepileptika ist
es zwar möglich, bei Patienten epileptische Anfälle symptomatisch zu unterdrücken,
jedoch kann damit keine Heilung erreicht werden (POTSCHKA et al. 2009). Darüber
hinaus konnte in zahlreichen Untersuchungen in Nagermodellen für Epilepsie, als
auch am Menschen gezeigt werden, dass antikonvulsive Pharmaka nicht in der Lage
sind, die Epileptogenese prophylaktisch zu beeinflussen (TEMKIN 2001; LÖSCHER
2002; STEFAN et al. 2006).
In der Tiermedizin gilt für den Hund, dass unter Therapie etwa ein Drittel aller
behandelten Patienten mit Epilepsie anfallsfrei wird, ein Drittel sich verbessert
(Reduktion der Anfallsfrequenz und -schwere) und ein Drittel unbeeinflusst bleibt
oder sich sogar verschlechtert (LÖSCHER 2003). In der Konsequenz werden Hunde
Einleitung
2
(und auch Katzen) mit unkontrollierbaren frequenten Anfällen häufig euthanasiert
(POTSCHKA et al. 2009).
Die genannten Umstände lassen deutlich werden, dass in der Humanmedizin als
auch in der Tiermedizin ein dringender Bedarf besteht, neue therapeutische
Strategien zu entwickeln, die die Epileptogenese nach Hirninsulten verhindern oder
wenigstens soweit modulieren können, dass ein milderer Verlauf dieser
schwerwiegenden Erkrankung erreicht werden kann. Ein interessanter Ansatz zur
Entwicklung einer antiepileptogenen Behandlungsstrategie nach einem Hirninsult
ergibt sich aus zahlreichen Befunden die gezeigt haben, dass es während der
Epileptogenese zu Veränderungen ausgereifter Neurone in Richtung neonataler
Eigenschaften kommt (ARONICA et al. 2001; COHEN et al. 2002; BEN-ARI und
HOLMES 2005). Dabei konnte z.B. in hippokampalen Neuronen in epileptogenem
Gewebe festgestellt werden, dass diese Neurone erregende statt hemmende
Reaktionen auf den eigentlich inhibitorischen Neurotransmitter ʏ-Amino-Buttersäure
(GABA) zeigen, wie es sonst nur neonatal der Fall ist. Man geht davon aus, dass für
diese plötzlich veränderte Wirkung von GABA eine erhöhte intrazelluläre neuronale
Chloridkonzentration verantwortlich ist, die zu einer Umkehr des GABA-gekoppelten
Chloridkanals führt, sodass nach Aktivierung durch GABA Chlorid entlang des
Konzentrationsgradienten plötzlich aus der Nervenzelle statt in die Nervenzelle
strömt (KÖHLING 2002; STALEY 2004). Als verantwortlich dafür wird eine
veränderte Expression von Chlorid-Kotransportern gesehen. Dabei wird der Natrium-
Kalium-Chlorid-Kotransporter-1 (NKCC1), welcher Chlorid in die Zelle transportiert
hochreguliert, wohingegen der Kalium-Chlorid-Kotransporter-2 (KCC2), welcher
Chlorid aus der Zelle transportiert, runterreguliert wird (STALEY 2004).
DZHALA et al. (2005) konnte in einem Modell für neonatale Anfälle zeigen, dass mit
dem derzeit als Diuretikum eingesetzten Medikament und NKCC1-Inhibitor
Bumetanid antikonvulsive Effekte erzielt werden können. Dieser Sachverhalt lässt
vermuten, dass zum einen NKCC1 bei der Entstehung von Anfällen mit
verantwortlich ist und zum anderen Bumetanid therapeutisch zur Behandlung von
Epilepsien eingesetzt werden könnte. Derzeit existieren sowohl in den USA als auch
in Europa Programme, in denen eine Kombination aus Bumetanid und dem GABA-
Einleitung
3
Agonisten Phenobarbital zur Behandlung von neonatalen Krampfanfällen des
Menschen klinisch getestet wird (FDA IND No. 101690:
http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00830531; EU FP7 NEMO: http://www.nemo-
europe.com/). Es konnte gezeigt werden, dass NKCC1 nicht nur im neonatalen
Zustand sondern auch im Hirngewebe von Epilepsiepatienten hochreguliert ist
(ARONICA et al. 2001; COHEN et al. 2002; BEN-ARI und HOLMES 2005). Ferner
konnte in Tiermodellen für Epileptogenese ebenfalls eine Hochregulation von NKCC1
nachgewiesen werden (OKABE et al. 2002; OKABE et al. 2003; LI et al. 2008;
BRANDT et al. 2010a). Dies liefert Hinweise, dass Bumetanid über eine Blockade
von NKCC1 antiepileptogene Effekte ausüben könnte. Aus diesem Grund wurde in
einer Studie von BRANDT et al. (2010) das antiepileptogene Potential von
Bumetanid bei Ratten überprüft. Obwohl Bumetanid in vivo beim Nager nur schlecht
gehirngängig ist, was in dieser Studie ein großes Hindernis darstellte, konnte hier
gezeigt werden, dass in Verbindung mit Phenobarbital krankheitsmodifizierende
Effekte erzielt werden können (BRANDT et al. 2010a).
Basierend auf diesen Ergebnissen war das Ziel der vorliegenden Ph.D.-Arbeit, in
verschiedenen Nagermodellen für Epilepsie das antiepileptogene und antikonvulsive
Potential von Bumetanid näher zu charakterisieren. Neben Bumetanid selbst wurde
auch das neu synthetisierte Derivat, der N,N-Dimethylaminoethylester BUM5
verwendet, welches weniger diuretisch wirksam ist und eine bessere
Gehirngängigkeit als Bumetanid aufweist (TÖLLNER et al., eingereicht). Bumetanid
wurde zudem in einer Studie zur Antiepileptogenese als auch in einer Studie zur
antikonvulsiven Wirkung mit dem Monooxigenase-Inhibitor Piperonylbutoxid (PBO)
kombiniert, um dadurch eine Verlängerung der bei der Ratte nur kurzen
Halbwertszeit (HWZ) zu erreichen. Ferner wurden Bumetanid und BUM5 im Zuge der
Untersuchungen auf antikonvulsive Wirkung zum Teil (z.T.) mit dem Antiepileptikum
(AED) Phenobarbital kombiniert, um die antikonvulsive Wirkung dieser GABA-
potenzierenden Substanz zu verstärken. Das Ziel der Arbeit war, eine neue
therapeutische Option für einen möglichen klinischen Einsatz zur Prävention von
Epilepsien zu erhalten.
Kenntnisstand
4
2 Kenntnisstand
Epilepsie 2.1
2.1.1 Definition und Bedeutung
Die Bezeichnung ,,Epilepsie‘‘ hat ihren Ursprung in dem altgriechischen Wort
,,epilepsis‘‘ (der Anfall, der Überfall). Epilepsien werden gemäß der internationalen
Liga gegen Epilepsie (International League against Epilepsy, ILAE) als ,,eine Störung
des Gehirns, die durch eine dauerhafte Neigung zur Entwicklung epileptischer
Anfälle, sowie durch die neurobiologischen, kognitiven, psychologischen und
sozialen Konsequenzen dieses Zustandes charakterisiert ist‘‘ bezeichnet. Unter
einem epileptischen Anfall versteht man ein ,,vorübergehendes Auftreten von
krankhaften Befunden und/oder Symptomen einer pathologisch exzessiven oder
synchronen neuronalen Aktivität im Gehirn‘‘ (FISHER et al. 2005).
In der Tiermedizin wird für Hunde eine Prävalenz von 0,5-5,7% und für Katzen 0,5%
angenommen (LÖSCHER und MELDRUM 1984; CHANDLER 2006). Neuere
Untersuchungen gehen für den Hund sogar von einer Prävalenz von bis zu 7% aus
(VOLK und LODERSTEDT 2011). In der Humanmedizin schätzt man, dass ungefähr
0,5-1% der Weltbevölkerung von Epilepsien betroffen sind (ENGEL et al. 2003). In
den Industrieländern beträgt die Inzidenz für Epilepsien etwa 50 Neuerkrankungen
pro 100.000 Einwohner. Für die Entwicklungsländer wird von einer höheren Inzidenz
ausgegangen (SANDER 2003).
2.1.2 Klassifizierung von Epilepsien
Während epileptischer Anfälle kommt es zu abnormen hochsynchronen und hoch-
frequenten zeitlich begrenzten Entladungen von verschieden großen Neuronen-
gruppen in unterschiedlichen Regionen des Gehirns. Die klinische Symptomatik
reicht dabei von mitunter nur wenige Sekunden dauernden ,,Aussetzern‘‘ (Absencen)
bis hin zu klassischen Krampfanfällen (ELGER 2008). In der Tiermedizin besteht die
klinische Symptomatik aus fokalen Anfällen, die oft nicht erkannt werden, bis hin zu
einem konvulsiven Status epilepticus (SE) mit Serien generalisierter tonisch-
klonischer Anfälle, die zum Tod des Tieres führen können (LÖSCHER 2003). Eine
Einteilung von Epilepsien kann aufgrund ihrer Ätiologie erfolgen. So werden bei
Kenntnisstand
5
Mensch und Tier idiopathische, symptomatische und kryptogene Epilepsien
unterschieden (QUESNEL 2000; LÖSCHER 2003; BERENDT 2004; SHORVON
2011).
Grundsätzlich sind ungefähr 30% aller Epilepsien symptomatisch. Diese Epilepsien
werden als Folge einer bekannten oder vermuteten Erkrankung des
Zentralnervensystems angesehen (ENGEL 2001). Weitere 30% werden als
symptomatisch vermutet oder als kryptogen bezeichnet, wobei keine identifizierbare
Ursache gefunden werden kann. Dem gegenüber stehen idiopathische Epilepsien,
bei denen man davon ausgeht, dass sie unter anderem (u.a.) genetisch bedingt sind
(ENGEL 2006). Bezüglich der Klassifikation von Anfällen werden verschiedene
Gruppen unterschieden: Fokale (lokalisationsbezogene) Anfälle entstehen in
definierten Regionen des Gehirns. Gehen fokale Anfälle mit Bewusstseinsstörungen
einher, werden diese als komplex-fokale oder komplex-partielle Anfälle bezeichnet.
Erfolgt eine Ausbreitung über den primären Fokus in beide Hirnhemisphären, so
spricht man von einer sekundären Generalisierung. Dahingegen erfassen primär
generalisierte Anfälle von Anfang an die Hirnrinde beider Großhirnhemisphären
(ELGER 2008). Im Gegensatz zur Humanmedizin wird in der Tiermedizin in der
Regel lediglich zwischen fokalen und generalisierten Anfällen unterschieden
(LÖSCHER 2003).
2.1.3 Temporallappenepilepsie
Die Mehrzahl komplex-fokaler Anfälle des Menschen hat ihren Ursprung im
Temporallappen und dort vor allem (v.a.) im Hippokampus, in der Amygdala und im
parahippokampalen Kortex (CHANG und LOWENSTEIN 2003). Die
Temporallappenepilepsie (TLE) repräsentiert die häufigste Epilepsieform im
Erwachsenenalter. Sie ist außerdem gekennzeichnet durch das höchste Auftreten
therapieresistenter Fälle (ENGEL 1996). Man geht davon aus, dass der Entwicklung
einer TLE zumeist eine initiale Schädigung vorausgeht, die zu strukturellen
Veränderungen im Gehirn der Betroffenen führt (ENGLANDER et al. 2003). Initiale
Schädigungen können dabei Schädel-Hirn-Traumata, Schlaganfall, Tumore,
Fieberkrämpfe oder auch ein SE sein (PITKÄNEN und LUKASIUK 2009). Nach einer
Latenzzeit von etwa zwei Jahren können diese Insulte zum Auftreten des ersten
Kenntnisstand
6
spontanen epileptischen Anfalls führen (ENGLANDER et al. 2003), wobei frühere
Untersuchungen von einer durchschnittlichen Latenzzeit von sogar siebeneinhalb
Jahren berichteten (FRENCH et al. 1993). Zusätzlich zu den Anfällen leiden viele
TLE-Patienten an Begleiterkrankungen wie Depressionen, Angst- oder Lern- und
Gedächtnisstörungen, die vermutlich auf strukturelle und funktionelle Veränderungen
im Temporallappen zurückgeführt werden können (MARCANGELO und OVSIEW
2007).
2.1.4 Der Begriff Epileptogenese
Verschiedene Hirninsulte, wie Schädel-Hirn-Traumata, zerebrale Blutungen,
Schlaganfall oder ein SE können sowohl beim Menschen aber auch beim Tier und in
Tiermodellen zur Entwicklung von Epilepsien, vor allem TLE führen (PITKÄNEN und
LUKASIUK 2009; STEINMETZ et al. in press). Die Mechanismen, die diesem
Prozess zugrunde liegen und unter dem Begriff Epileptogenese subsumiert werden,
sind bisher nur lückenhaft verstanden. Es gibt jedoch zahlreiche Hinweise, dass
verschiedene Phänomene, wie Entzündungsgeschehen, Neurodegeneration,
Störungen der Blut-Hirn-Schranke, Veränderungen in Expression und Funktionen
verschiedener Rezeptoren und Ionenkanäle und die Entwicklung einer neuronalen
Hyperexzitabilität bei der Epileptogenese eine herausragende Rolle spielen
(DICHTER 2009; PITKÄNEN und LUKASIUK 2009; TIMOFEEV et al. 2010). Generell
ist es mit den derzeit verfügbaren Antiepileptika zwar möglich, bei Patienten
antikonvulsive Wirkungen zu erzielen, das heißt (d.h.) epileptische Anfälle zu
unterdrücken, jedoch wird dabei nicht in die Epileptogenese eingegriffen (LÖSCHER
und BRANDT 2010). Würde es gelingen, die Mechanismen besser zu verstehen,
wäre es möglich, aus diesem Verständnis heraus neue Strategien zu entwickeln, um
die Betroffenen nach erlittenen Hirninsulten präventiv antiepileptogen behandeln zu
können, um die Epileptogenese entweder ganz zu unterbinden oder wenigstens so
weit modifizieren zu können, dass ein milderer Verlauf der Erkrankung erreicht
werden kann (DICHTER 2009; JACOBS et al. 2009).
Kenntnisstand
7
Abbildung 2.1: Schematische Darstellung des Ablaufs des Epileptogenese, modifiziert nach
LÖSCHER et al. 2008.
Tiermodelle für Epilepsie 2.2
Ethische Gründe verbieten die Entwicklung von Medikamenten am Menschen. In der
Konsequenz ist in der präklinischen Forschung der Einsatz von Versuchstieren als
unabdingbares Mittel zur Verbesserung der für die Patienten teilweise dramatisch
schlechten therapeutischen Situation nicht wegzudenken. Gegenstand der
präklinischen Forschung ist in diesem Zusammenhang, am Tiermodell Substanzen
auf ihr antikonvulsives bzw. antiepileptogenes Potential hin zu untersuchen. Hierzu
benötigt man Modelle deren Krankheitsausprägung im Wesentlichen derjenigen der
Patienten entspricht. Viele Charakteristika der TLE beim Menschen können durch
chronische Epilepsiemodelle, v.a. durch das Kindling-Modell und durch SE-Modelle
simuliert werden, die dem menschlichen Krankheitsgeschehen sehr nahe kommen
(MORIMOTO et al. 2004). Einschränkend ist jedoch anzumerken, dass jedes Modell
Kenntnisstand
8
neben Vorteilen auch diverse Nachteile mit sich bringt, sodass es kein ideales
Epilepsiemodell gibt, das allen Anforderungen genügen kann. Dieser Umstand macht
es sinnvoll, verschiedene Modelle ergänzend zu nutzen, um sowohl falsch-positive
als auch falsch-negative Ergebnisse zu vermeiden (LÖSCHER und BRANDT 2010).
In dieser Arbeit wurden zwei verschiedene Epilepsiemodelle für verschiedene
Fragestellungen verwendet: Das Kindling-Modell wurde bei Ratten zur Untersuchung
der antiepileptogenen Wirkung von Bumetanid als auch zur Untersuchung der
antikonvulsiven Wirkung von Bumetanid und BUM5 verwendet. Das Pilokarpin-
Modell und der Pentylentetrazol (PTZ)-Krampftest, ein Anfallsmodell, wurden bei
Mäusen zur Untersuchung der Wirkung von Bumetanid und BUM5 verwendet. Diese
Modelle sollen im Folgenden detailliert dargestellt werden.
2.2.1 Das Kindling-Modell
Dieses Epilepsiemodell wurde 1969 erstmals von GODDARD et al. an Ratten
beschrieben. Hierbei handelt es sich um ein Modell, bei dem mittels schwacher
wiederholter elektrischer Stimuli anfangs subkonvulsive bis partielle Anfälle ausgelöst
werden. Die Stimulationen erfolgen über eine Elektrode, die zuvor in das limbische
System implantiert wurde und zugleich als Ableitelektrode dient. In der Folge
entwickeln die Tiere Anfälle, die mit der Anzahl der Stimulationen an Intensität und
Dauer zunehmen, sodass die Tiere im Verlauf der Kindling-Prozedur komplex-
partielle Anfälle entwickeln, die sekundär generalisieren. Als Zielstruktur für die
Kindling-Elektrode können neben der basolateralen Amygdala (BLA) auch andere
Regionen des limbischen Systems, wie Hippokampus, piriformer oder perirhinaler
Kortex ausgewählt werden (MCINTYRE et al. 1999; COULTER et al. 2002;
MORIMOTO et al. 2004). Der Begriff Kindling (englisch: to kindle = entflammen)
findet sowohl für die Beschreibung des Fortschreitens der Epileptogenese als auch
für den daraus resultierenden Zustand, nämlich der gesteigerten Anfallsbereitschaft
Verwendung. Diesem Zustand liegt der Mechanismus zugrunde, dass die Sensitivität
des Gehirns für den elektrischen Stimulus soweit ansteigt, bis diese Sensitivität einen
permanenten Status erreicht hat. Ab diesem Punkt werden die Tiere als ,,voll
gekindelt‘‘ betrachtet (MCNAMARA 1994; MORIMOTO et al. 2004).
Kenntnisstand
9
Eine Einteilung der im Kindling-Modell auftretenden Anfälle wird anhand der Skala
von RACINE (1972a) vorgenommen. Dabei werden fünf Krampfstadien (1-5)
unterschieden. Stadien 1-3 repräsentieren fokale Krampfstadien, während es sich bei
Stadien 4-5 um generalisierte Krampfaktivität handelt. Parallel zu Veränderungen der
Krampfaktivität kommt es auch zu Veränderungen des Entladungsmusters im
Elektroenzephalogramm (EEG). So nimmt mit Zunahme der Schwere der
Krampfaktivität auch die Dauer und Amplitude der EEG-Entladung kontinuierlich zu
(RACINE 1972a). Darüber hinaus sinkt parallel dazu im Verlauf der Kindling-
Prozedur die Stromstärke, die zur Auslösung einer Nachentladung im EEG nötig ist
(RACINE 1972b). Die oben genannten Veränderungen können bei gekindelten
Tieren für Monate oder gar Jahre bestehen bleiben (GODDARD et al. 1969). Es
konnte nachgewiesen werden, dass sich im Kindling-Modell strukturelle
Gehirnveränderungen vollziehen, die auch teilweise in Gehirn-Resektionsgewebe
von Menschen mit komplex-fokaler Epilepsie nachgewiesen werden können. Dies
beinhaltet u.a. das Aussprießen von Moosfasern oder das Auftreten einer
progressiven Neurodegeneration, wobei man davon ausgeht, dass diese
Phänomene teilweise mitverantwortlich für die Zunahme der Erregungsbereitschaft
sind (SUTULA 1990). Zusätzlich konnte neben diversen anderen Merkmalen gezeigt
werden, dass es durch das Amygdala-Kindling im Gehirn auch zu
neurophysiologischen Alterationen, wie z.B. der Expression von Chlorid-
Kotransportern kommt (OKABE et al. 2002; 2003), was im Zusammenhang mit der
vorliegenden Dissertation eine wichtige Rolle spielt.
Das Kindling-Modell findet weltweit Verwendung, da es die Möglichkeit bietet,
schrittweise das Fortschreiten neurobiologischer Veränderungen, die zur
Epileptogenese beitragen, zu untersuchen (STABLES et al. 2003). In der
vorliegenden Arbeit wurde das Kindling-Modell bei Ratten zum einen zur
Untersuchung des antiepileptogenen Potentials des NKCC1-Inhibitors Bumetanid als
auch zur Evaluierung seiner antikonvulsiven Wirkungen und die des Derivats BUM5
verwendet. Die folgende Abbildung veranschaulicht schematisch die verschiedenen
Vorgehensweisen und Möglichkeiten von Substanzuntersuchungen im Kindling-
Modell.
Kenntnisstand
10
Abbildung 2.2: Schematische Darstellung von Versuchsprotokollen zur Untersuchung von
substanz-assoziierten Effekten im Kindling-Modell (mod. nach LÖSCHER und BRANDT 2010).
In der vorliegenden Arbeit wurden zwei der obigen Protokolle verwendet:
(1) Substanz wurde täglich vor der Stimulation in der Aufkindling-Phase (während der
Epileptogenese) verabreicht. Bei einer antiepileptogenen Wirkung verlängert sich die
Dauer der Aufkindling-Phase.
(3) Substanz wurde voll gekindelten Tieren zur Testung auf antikonvulsive Wirkung
verabreicht. Bei antikonvulsiver Wirkung vermindert sich die Schwere der Anfälle
und/oder die Schwelle zur Auslösung eines generalisierten Anfalls (Stufe 4 und 5)
erhöht sich.
2.2.2 Das Pilokarpin-Modell
Das Pilokarpin-Modell wurde 1983 von TURSKI et al. zuerst bei der Ratte etabliert
und von dieser Gruppe kurze Zeit später auch erstmalig bei der Maus eingesetzt
(TURSKI et al. 1983; TURSKI et al. 1984). Das Alkaloid Pilokarpin ist ein Agonist des
Acetylcholinrezeptors, welcher den M1(Muscarin)-Rezeptorsubtyp aktiviert
(HAMILTON et al. 1997). Es konnte gezeigt werden, dass der M1-Rezeptorsubtyp
maßgeblich für die Entwicklung des Anfallsgeschehens verantwortlich ist, indem M1-
Rezeptor-knock-out-Mäuse auch nach der Applikation hoher Dosen von Pilokarpin,
Kenntnisstand
11
im Gegensatz zu Wildtyp-Mäusen, keine Anfälle entwickelten (HAMILTON et al.
1997). Grundsätzlich führt Pilokarpin zuerst zu einem Absinken der extrazellulären
Glutamat- und GABA-Konzentration im Hippokampus. Jedoch kommt es während
pilokarpin-induzierter Anfälle, neben denen von Dopamin, wieder zu einem
signifikanten Anstieg dieser Konzentrationen. Aus diesem Grund geht man davon
aus, dass diese induzierten Anfälle über NMDA-Rezeptoren aufrechterhalten werden
(NAGAO et al. 1996; SMOLDERS et al. 1997). Pilokarpin kann entweder fraktioniert
oder als Bolus appliziert werden (TURSKI et al. 1983, GLIEN et al. 2001), womit in
kurzer Zeit ein SE erzeugt werden kann. Bei Ratten wird vor Beginn der Pilokarpin-
Applikation oft Lithium appliziert, wodurch sich die prokonvulsive Wirkung von
Pilokarpin erhöht und infolgedessen durch eine geringere erforderliche Menge an
Pilokarpin, die Mortalitätsrate gesenkt wird (JOPE et al. 1986; CLIFFORD et al. 1987;
TURSKI et al. 1989). Für Mäuse konnte dieser Effekt unter einer Vorbehandlung mit
Lithium jedoch nicht nachgewiesen werden (GRÖTICKE et al. 2007). Weitergehende
Untersuchungen ergaben ebenfalls keine Unterschiede durch die Lithium-
Vorbehandlung hinsichtlich histopathologischer Veränderungen oder etwaiger
Verhaltensalterationen (MÜLLER et al. 2009), sodass in der vorliegenden Arbeit die
SE-Induktion bei Mäusen ohne vorherige Gabe von Lithium erfolgt ist. Der SE wurde
bei allen Tieren nach 90 min durch das Benzodiazepin Diazepam beendet. Nachdem
die Tiere einen SE durchlaufen haben, geht man davon aus, dass sich im Gehirn
Veränderungen vollziehen, die sich analog zur Epileptogenese beim Menschen
verhalten, sodass in der chronischen Phase in diesem Modell, nach einer Latenzzeit
von im Mittel einer Woche nach SE, spontan wiederkehrende Anfälle auftreten.
Weitere Charakteristika, die der menschlichen TLE entsprechen, sind neben
Verhaltens-, Lern- und Gedächtnisstörungen auch ein Neuronenverlust und die
Ausbildung einer hippokampalen Sklerose. Der Vorteil dieses Modells wird
letztendlich darin gesehen, dass es das Krankheitsbild der TLE beim Menschen in
wesentlichen Teilen wiederspiegelt (SHARMA et al. 2007; CURIA et al. 2008).
2.2.3 Der Pentylentetrazol-Krampftest
Mit diesem Test können Substanzen auf prokonvulsive oder antikonvulsive
Wirkungen hin untersucht werden, sodass dieser Test auch bei Sicherheitsprüfungen
von neuartigen Medikamenten verwendet wird und somit bei Entwicklungsprozessen
Kenntnisstand
12
in der pharmazeutischen Industrie weltweite Verbreitung findet (LÖSCHER 2009).
PTZ (auch Pentetrazol bzw. Metrazol genannt), ist ein GABA-Antagonist und wirkt
über die Bindung an der Picrotoxin-Bindungsstelle im Chlorid-Kanal des GABAA-
Rezeptors prokonvulsiv. Mit PTZ können Substanzen mit prokonvulsiver oder
antikonvulsiver Wirkung über die Veränderung der Krampfempfänglichkeit identifiziert
werden (MACDONALD und BARKER 1977; PACHECO et al. 1981;
RAMANJANEYULU und TICKU 1984; LÖSCHER und SCHMIDT 1988). So ist dieses
Modell besonders prädiktiv für Medikamente mit GABA-potenzierenden
Eigenschaften (LÖSCHER 2009, 2011). PTZ wurde früher in der Humanmedizin
aufgrund seiner Wirkungen auf den Hirnstamm als Atem- und Kreislaufstimulanz
genutzt und darüber hinaus, vor der Einführung der elektrokonvulsiven Therapie bei
depressiven Patienten eingesetzt (FINK 1972, 1984; HERRMANN und COPER
1987). Nach Vorbehandlung mit der entsprechenden Substanz wird eine intravenöse
PTZ-Infusion vorgenommen. Diese Infusion läuft mit einer konstanten Flussrate und
führt zum Auftreten von Krampfanfällen.
Abbildung 2.3: Modellaufbau des PTZ-Krampftest (LÖSCHER 2009).
Die für die beobachtete Anfallsaktivität erforderliche Dosis von PTZ (in mg/kg) wird
berechnet aus der Zeit, die bis zum Erreichen dieses Zustandes nötig ist, dem
Körpergewicht der Tiere, der Infusionsgeschwindigkeit und der PTZ-Konzentration in
der Lösung (LÖSCHER et al. 2009). Antikonvulsive Substanzen verzögern das
Auftreten von epileptischen Anfällen, wohingegen prokonvulsive Substanzen deren
Auftreten während des Tests beschleunigen. Darüber hinaus können dabei
unterschiedliche Krampfstadien als verschiedene Endpunkte bestimmt werden
Kenntnisstand
13
(LÖSCHER und SCHMIDT 1988; LÖSCHER et al. 1991). In der vorliegenden Arbeit
wurde dieser Test zu verschiedenen Zeitpunkten vor und nach einem pilokarpin-
induzierten SE an Mäusen durchgeführt. Das Ziel der Kombination dieser beiden
Modelle bestand darin, nach einem SE den Einfluss von Bumetanid und BUM5 auf
die Krampfschwelle während der Epileptogenese zu untersuchen.
Inhibition von Kation-Chlorid-Kotransportern als neue Möglichkeit zur 2.3
Epilepsiebehandlung
Seit einiger Zeit sind Kation-Chlorid-Kotransporter, die eine wichtige Rolle für den
Chlorid-Haushalt u.a. von Nervenzellen spielen, als mögliche Angriffspunkte zur
Epilepsiebehandlung zunehmend in den Fokus der Wissenschaft gerückt (BLAESSE
et al. 2009). Der Hintergrund dazu soll in den folgenden Abschnitten eingehend
dargestellt werden.
2.3.1 Der Einfluss von Kation-Chlorid-Kotransportern auf die Wirkung des
Neurotransmitters GABA
Der elektrochemische Gradient von Chlorid an der neuronalen Membran wird durch
Kation-Chlorid-Kotransporter reguliert (BLAESSE et al. 2009). Diese Transporter sind
sekundär aktiv und führen entweder zu einer Ausschleusung von Chlorid aus der
Zelle (Kalium-Chlorid-Kotransporter, KCC) oder zu einer Einschleusung von Chlorid
in die Zelle (Natrium-Kalium-Chlorid-Kotransporter, NKCC). Maßgebend ist dabei die
Funktion der Natrium-Kalium-ATPase, welche kontinuierlich einen Gradienten
zwischen dem intrazellulären und dem extrazellulärem Milieu erzeugt. Im
Säugerorganismus existieren verschiedene Isoformen von KCCs, wovon KCC2 die
Ausschleusung von Chlorid in hippokampalen und neokortikalen Neuronen generiert.
Bezüglich der Isoformen von NKCC sind hierbei zwei Varianten von Interesse:
NKCC1 wird ubiquitär im Körper exprimiert und ist sowohl in peripheren und
zentralen Neuronen als auch in Gliazellen vorhanden (HÜBNER et al. 2001;
KANAKA et al. 2001). NKCC2 wiederum wird vor allem in der Niere exprimiert
(GAMBA et al. 1994).
Im gesunden adulten Gehirn herrscht physiologisch folgende Situation: NKCC1 ist
runterreguliert, während KCC2 hochreguliert ist. Infolgedessen befindet sich
Kenntnisstand
14
intrazellulär eine niedrige Chloridkonzentration und extrazellulär eine hohe
Chloridkonzentration (BLAESSE et al. 2009). Anders verhält sich die Situation im
unreifen Gehirn: Hier ist NKCC1 hochreguliert, was zu einer Akkumulation von
Chlorid in hippokampalen Neuronen führt (BEN-ARI et al. 2012). Dieser Zustand
besteht von der späten Embryonalentwicklung bis kurze Zeit nach der Geburt bei
Menschen und Nagern gleichermaßen (WANG et al. 2002; DZHALA et al. 2005).
Parallel dazu ist KCC2, der Chlorid aus der Zelle transportiert, runterreguliert und
wird später im Zuge der Ausreifung des Nervensystems wieder hochreguliert
(RIVERA et al. 1999; LI et al. 2002). Beide Expressionszustände dieser Transporter
nehmen unterschiedlichen Einfluss auf die Wirkung von GABA. Grundsätzlich
repräsentiert GABA den wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im adulten
Gehirn. Der zugrundeliegende Mechanismus besteht in einer Öffnung des GABAA-
gekoppelten Chlorid-Kanals, durch die Bindung von GABA am GABAA-Rezeptor.
Infolgedessen strömt Chlorid entlang des Konzentrationsgradienten von extrazellulär
nach intrazellulär. Das Resultat ist eine Hyperpolarisation der Zellmembran und somit
eine Inhibition der Nervenzelle (BEN-ARI et al. 2012). Anders verhält es sich
während der Embryonalentwicklung bzw. im unreifen Gehirn: So konnte in
Gehirnschnitten noch unreifer Neurone gezeigt werden, dass durch eine
intrazelluläre Anhäufung von Chlorid GABA depolarisierend wirkt (BEN-ARI et al.
1989). Verantwortlich dafür sind eine Hochregulation von NKCC1 und eine
gleichzeitig verminderte Expression von KCC2. Dies hat eine erhöhte intrazelluläre
Chloridkonzentration zur Folge, wodurch hier nach Aktivierung des Kanals durch
GABA Chlorid aus der Zelle statt in die Zelle strömt (BEN-ARI und HOLMES 2005;
KAHLE und STALEY 2008). Dieser Zustand scheint essentiell für die neuronale
Entwicklung zu sein (WANG und KRIEGSTEIN 2009). So haben Untersuchungen an
Ratten gezeigt, dass Neurone bevor es zur Ausbildung von glutamatergen Synapsen
kommt, in der späten Embryonalentwicklung und sogar noch in den ersten Wochen
nach Geburt GABAA-Rezeptoren ausbilden, um GABAerge Signale zu empfangen
(OWENS et al. 1999; BEN-ARI 2006). Zusätzlich ist auch bekannt, dass während der
ontogenetischen Entwicklung eine GABA-vermittelte Depolarisation zur Ausbildung
exzitatorischer Synapsen in der Hirnrinde beiträgt (WANG und KRIEGSTEIN 2009).
Die genannten Umstände spielen zudem eine Rolle bei der Behandlung von
neonatalen Krampfanfällen. Grundsätzlich treten Krampfanfälle beim Menschen
Kenntnisstand
15
besonders gehäuft im neonatalen Zustand auf (ANNEGERS et al. 1995). Während
dieser Zeit auftretende Anfälle sind gefürchtet und können lebenslange
Konsequenzen nach sich ziehen, indem es später oft zur Entwicklung einer
chronischen Epilepsie oder körperlichen und geistigen Behinderungen kommt
(RAKHADE und JENSEN 2009). Ein in der Klinik sehr bekanntes Problem bei der
Behandlung von neonatalen Krampfanfällen ist, dass diese Anfälle mit klinisch
gebräuchlichen AEDs wie Phenobarbital oder Benzodiazepinen nur schlecht
kontrolliert werden können (PAINTER et al. 1999; RENNIE und BOYLAN 2007;
BONIFACIO et al. 2011). Diese Substanzen wirken bei Erwachsenen über den
GABAA-Rezeptor inhibitorisch (ROGAWSKI und LÖSCHER 2004), sind jedoch bei
Neonaten aufgrund der genannten Expressionszustände der Kation-Chlorid-
Kotransporter wirkungslos oder können epileptische Anfälle sogar verstärken
(KAHLE und STALEY 2008).
Zahlreiche Untersuchungen haben gezeigt, dass sich ausgereifte Neurone in Teilen
des Hippokampus nach Hirninsulten, also während der Epileptogenese, dahingehend
verändern, dass sie plötzlich neonatale Charakteristika aufweisen, die sich deutlich
von den Eigenschaften gesunder adulter Neurone unterscheiden (ARONICA et al.
2001; COHEN et al. 2002; KÖHLING 2002; STALEY 2004; BEN-ARI und HOLMES
2005). So gibt es zunehmend Hinweise, dass nach Hirninsulten NKCC1 ebenfalls
hochreguliert ist, während KCC2 runterreguliert ist. In der Konsequenz führt dies, wie
im neonatalen Zustand, zu einer erhöhten neuronalen Chlorid-Konzentration und
dadurch zu einer Strömungsumkehr des GABA-gekoppelten Chlorid-Kanals, sodass
der Kanal nach Aktivierung durch GABA Chlorid aus der Zelle statt in die Zelle
transportiert. Die Folge ist, dass dadurch die neuronale Membran depolarisiert und
sich auf diese Weise die Wirkung von GABA von inhibitorisch zu exzitatorisch
(GABA-switch) verändert. Dies mündet letztendlich in der Ausbildung einer
neuronalen Hyperexzitabilität und könnte so die für die Epileptogenese typische
Übererregbarkeit von Neuronen teilweise erklären (KÖHLING 2002; PAYNE et al.
2003; BEN-ARI und HOLMES 2005; GALANOPOULOU 2008; BLAESSE et al.
2009). Man geht davon aus, dass dieser ,,Rückgriff‘‘ auf neonatale Funktionsweisen
als Reparaturmechanismus zu verstehen ist, indem das Gehirn während der
Epileptogenese quasi das ‚,Programm‘‘ der Ontogenese zu wiederholen versucht.
Kenntnisstand
16
Jedoch scheint sich dieser ablaufende Prozess als kontraproduktiv zu erweisen und
verschlimmert vielmehr die Situation im Gehirn (KÖHLING 2002, BEN-ARI und
HOLMES 2005).
Erst seit ein paar Jahren sind Inhibitoren von Kation-Chlorid-Kotransportern, wie die
Diuretika Furosemid und vor allem Bumetanid als potentielle AEDs zunehmend in
den Fokus der Wissenschaft gerückt (LÖSCHER et al. 2012). Darüber hinaus
werden derartige Substanzen auch zur möglichen Behandlung anderer
Erkrankungen, wie traumatisch oder ischämisch bedingten Hirnschwellungen
(KINTNER et al. 2007; KAHLE et al. 2008; WALCOTT et al. 2012), chronischem
Schmerz (PRICE et al. 2005) und Autismus (LEMONNIER und BEN-ARI 2010)
diskutiert.
2.3.2 Der NKCC1-Inhibitor Bumetanid
Das Diuretikum Bumetanid wurde 1971 erstmals beschrieben (FEIT 1971).
Markantes Merkmal dieser Substanz ist, dass es hinsichtlich seiner Pharmakokinetik
und seiner diuretischen Wirkungen große spezies-spezifische Unterschiede aufweist.
So wird Bumetanid bei adulten Ratten mit einer Plasma-HWZ von 10 min extrem
schnell metabolisiert, wohingegen diese bei Mensch und Hund ungefähr 1-2 Stunden
beträgt. Dies hat zur Folge, dass sich die benötigten Dosen zur Herbeiführung
diuretischer Effekte deutlich voneinander unterscheiden. So kann eine vermehrte
Diurese bei Nagern erst bei parenteralen Dosen von über 4 mg/kg erzielt werden,
während dies beim Hund schon bei 0,25 mg/kg (OSTERGAARD et al. 1972) und
beim Menschen sogar bereits bei 0.005 bis 0,10 mg/kg beobachtet werden kann
(WARD und HEEL 1984; BRATER 1992).
Bumetanid als auch Furosemid repräsentieren zwei weit verbreitete Diuretika. Ihr
Wirkmechanismus beruht auf einer Inhibition von Chlorid-Kotransportern (PAYNE et
al. 2003), was durch eine Bindung an das Transportprotein an der extrazellulären
Domäne zustande kommt (FORBUSH und PALFREY 1983; PAYNE und FORBUSH
1995). Während Furosemid NKCCs und KCCs etwa zu gleichen Teilen hemmt,
besitzt Bumetanid eine ungefähr 500-fach höhere Affinität für NKCCs. So liegt
dessen Hemmkonzentration für KCCs bei 25-50 μM, wohingegen sie für NKCCs
Kenntnisstand
17
schon bei ca. 0,1 μM liegt. So weiß man, dass Konzentrationen von 2-10 μM in vitro
selektiv auf NKCCs wirken (PAYNE et al. 2003). Bumetanid liegt bei physiologischem
pH-Wert zum größten Teil ionisiert vor und weist eine sehr hohe Plasmaprotein-
Bindung auf. Dies führt dazu, dass es nur geringfügig in Organe und vor allem kaum
ins Gehirn übertritt. Dahingegen kommt es zu einer deutlichen, seiner Wirkung
entsprechenden Akkumulation in der Niere. Die geringe Organverteilung kann
vermutlich auf passive Diffusion ins Gewebe zurückgeführt werden (COHEN et al.
1976; JAVAHERI et al. 1993; BRANDT et al. 2010a; LI et al. 2011). Die wiederum
vorhandene Akkumulation in der Niere scheint wohl an einem aktiven Transport
durch organische Anionen-Transporter zu liegen (HASANNEJAD et al. 2004;
KOBAYASHI et al. 2005). Die folgende Abbildung beschreibt die Strukturformel von
Bumetanid.
Abbildung 2.4: Strukturformel von Bumetanid (Prof. Dr. T. Erker).
(1) Säure-Gruppe, verantwortlich für die schlechte Gehirngängigkeit, da bei physiologischem
pH-Wert ionisiert (FEIT 1990; BRANDT et al. 2010a).
(2) N-Butyl-Amino-Gruppe, notwendig für die starke diuretische Wirkung (KOLIS et al. 1976).
In der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Löscher konnte kürzlich in einer Studie zur
Antiepileptogenese im Pilokarpin-Modell für TLE bei der Ratte gezeigt werden, dass
Kenntnisstand
18
es möglich ist, bei adulten Ratten mit einer Kombination aus Bumetanid und
Phenobarbital, krankheitsmodifizierende Effekte zu erzielen. Die eher moderaten
Effekte und die Kenntnis, dass Bumetanid nur sehr schlecht die Blut-Hirn-Schranke
überwindet und von Nagern sehr schnell metabolisiert wird (BUSCH et al. 1979;
BRANDT et al. 2010a) führten zu dem Entschluss, in Kooperation mit der
Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Thomas Erker (Medizinische Chemie, Universität Wien)
und Herrn Dr. Peter Feit (entwickelte Bumetanid bei Leo Pharma, Ballerup,
Dänemark), Derivate von Bumetanid zu entwickeln. Diese sollten sich als
gehirngängiger und stabiler im Nager-Organismus als die Ursprungssubstanz
erweisen. Zudem wurde bei der Entwicklung angestrebt, Derivate mit einer
verminderten diuretischen Wirkung zu erhalten, da die massive diuretische Wirkung
von Bumetanid für einen chronischen Einsatz bei Epilepsie den limitierenden Faktor
darstellt (LÖSCHER et al. 2012). So wurden parallel zur Durchführung dieser Ph.D.-
Arbeit mehrere Derivate entwickelt, auf die im folgenden Kapitel kurz näher
eingegangen werden soll. Die Synthese der Derivate erfolgte hierfür in der
Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Erker an der Universität Wien.
2.3.3 Bumetanid-Derivate
Bei der Synthese von Bumetanid-Derivaten wurden drei Strategien verfolgt: Eine
Strategie war, die Säuregruppe von Bumetanid mithilfe lipophiler Ester zu maskieren
und damit eine Ionisation zu vermeiden, um so die Gehirnpenetration von Bumetanid
zu erhöhen (TÖLLNER et al., eingereicht). Im Gehirn werden die Ester wieder
abgespalten und in die Ursprungssubstanz zurückverwandelt (FREY und LÖSCHER
1980; LÖSCHER et al. 1983; LÖSCHER 1985). Mit einer derartigen Esterifizierung
kann zudem die Verweildauer im Gehirn erhöht werden, aufgrund der Tatsache, dass
Bumetanid dort wiederum ionisiert vorliegt (BRANDT et al. 2010b). Zunächst wurde
auf einen Methylester von Bumetanid, welcher von Leo Pharma (Ballerup,
Dänemark) zur Verfügung gestellt wurde, zurückgegriffen. Dieses Derivat (BUM6)
konnte später in Wien hergestellt werden. Darauf aufbauend wurde ein komplexeres
Ester-Derivat, der Pivaloyloxymethylester (BUM1) entwickelt. Dieser Ester wurde bei
dem Antibiotikum Ampicillin verwendet, um dessen orale Bioverfügbarkeit zu erhöhen
(DAEHNE et al. 1970). Der N,N-Dimethylaminoethylester (BUM5) wurde analog zu
Penethamat, einem veresterten Benzylpenicillin-Derivat entwickelt, von dem bekannt
Kenntnisstand
19
ist, dass durch diese Abwandlung die Verteilung im Gewebe erhöht werden kann
(BLEEKER und MAAS 1958). Weitere neu synthetisierte Ester waren der N,N-
Dimethylaminoester (BUM2) und der Ethylester (BUM3). Die zweite Strategie, die bei
der Entwicklung neuer Derivate verfolgt wurde, war die Synthese lipophiler
Substanzen, um die Gehirngängigkeit zu erhöhen. Dabei entstanden ein Alkohol
(BUM7) und ein Aldehyd (BUM8). Derartige Substanzen sollen nach Überwindung
der Blut-Hirn-Schranke durch Oxidation der Carboxylgruppe wieder zur
Ausgangssubstanz und in dem Fall wieder zu Bumetanid zurückverwandelt werden
(CHOI et al. 2002). Darüber hinaus wurde ein Bisulfit-Addukt des Aldehyds (BUM9)
synthetisiert. Die dritte Strategie in der Entwicklung neuer Derivate bestand in der
Synthese des Amids N,N-Dimethylaminoethylamid (BUM10), mit der Erwartung, dass
diese Substanz nach Penetration ins Gehirn ebenfalls zu Bumetanid metabolisiert
wird (TESTA und MAYER 2003). Im Zuge dieser Dissertation wurde als
vielversprechenste Substanz das Derivat BUM5 verwendet, sodass dessen
Herstellung und Eigenschaften kurz näher beschrieben werden soll: Zur Synthese
von BUM5 wurde das Derivat BUM6 benötigt, welches aus Bumetanid und SOCl2 (in
Methanol) hergestellt worden war. BUM5 (Dimethylaminoethyl-3-Aminosulfonyl-5-
Butylamino-4-Phenooxybenzoat-Hydrochlorid) wurde darauf aus der Reaktion von
BUM6 mit N,N-Dimethylaminoethanol, unter Zusatz einer katalytischen Menge von
Natrium gewonnen. Mittels einer weiteren Behandlung mit in Diethylether gelöster
Salzsäure wurde zudem dessen Wasserlöslichkeit durch Bildung des Hydrochlorids
erhöht. In dieser Ph.D.-Arbeit wurde BUM5 deshalb verwendet, da es beim Nager, im
Vergleich zu Bumetanid, eine bessere Gehirngängigkeit bei einer gleichzeitig deutlich
verminderten diuretischen Wirkung besitzt (TÖLLNER et al., eingereicht). Die
folgenden Abbildungen zeigen die Strukturformeln der entwickelten Bumetanid-
Derivate.
Kenntnisstand
20
Abbildung 2.5: Strukturformel von Bumetanid, BUM5, BUM1, BUM6, BUM7 und BUM8 im
Vergleich (Prof. Dr. T. Erker).
Kenntnisstand
21
Abbildung 2.6: Strukturformel von BUM9 und BUM10 (Prof. Dr. T. Erker).
2.3.4 Piperonylbutoxid
Neben der Entwicklung von Derivaten bestand eine weitere Strategie darin, das
Problem der in Kapitel 2.3.2 beschriebenen sehr kurzen HWZ von Bumetanid durch
Verwendung von Piperonylbutoxid (PBO) zu überwinden. Diese Substanz wurde
erstmals 1947 beschrieben (DOVE 1947). Hierbei handelt es sich um einen potenten
Inhibitor des Cytochrom P450-Systems bzw. um einen mikrosomalen Monooxigenase-
Inhibitor, welcher für den Metabolismus verschiedener Substanzen eine
entscheidende Rolle spielt (FRANKLIN 1976). Da es über das Cytochrom P 450 –
System auch den oxidativen Metabolismus von Insekten hemmt, ist es seit
Jahrzehnten Bestandteil von pyrethroid-basierten Insektiziden (CASIDA et al. 1966;
MATTHEWS et al. 1970; BYARD und NEEDHAM 2006), wobei es jedoch eine nur
relativ geringe Toxizität auf Säugetiere und Menschen ausübt (CONNEY et al. 1972).
Es ist zudem bekannt, dass es nur eine extrem niedrige Neurotoxizität bei Mäusen
aufweist (ATER et al. 1984). HALLADAY et al. (1978) berichteten, dass es möglich
ist, mit PBO die Oxidation der N-Butyl-Seitenkette von Bumetanid zu hemmen und so
die HWZ bei der Ratte zu erhöhen. So konnte mit einer zweimaligen Vorbehandlung
mit PBO zum einen die HWZ von Bumetanid verdoppelt und zum anderen erreicht
werden, dass Bumetanid vermehrt unverändert ausgeschieden wurde und
infolgedessen die diuretische Wirkung deutlich erhöht war. Dieser Sachverhalt
konnte in Untersuchungen der Arbeitsgruppe von Prof. Löscher bestätigt werden
Kenntnisstand
22
(unveröffentlichte Daten). Aufgrund dieser höchst vielversprechenden Ergebnislage,
wurde in der vorliegenden Arbeit eine Kombination von PBO und Bumetanid in einer
Antiepileptogenese-Studie im Kindling-Modell bei Ratten überprüft.
Abbildung 2.7: Strukturformel von Piperonylbutoxid, PubChem Compound (2012).
2.3.5 Studien zu Alterationen von Kation-Chlorid-Kotransportern und
Wirkungen von Bumetanid am Menschen und in Anfallsmodellen
Ergebnisse aus Untersuchungen zu Alterationen von Kation-Chlorid-Kotransportern
an Gehirnresektionsgewebe von therapieresistenten Epilepsiepatienten führten zu
Überlegungen, inwieweit über eine Beeinflussung dieser Veränderungen
antikonvulsive und antiepileptogene Effekte erzielt werden könnten. Es existiert eine
Vielzahl von Untersuchungen zu Veränderungen in der Expression von Kation-
Chlorid-Kotransportern im epileptischen Zustand. Darüber hinaus gibt es zahlreiche
Untersuchungen zur Anwendung von Bumetanid, vor allem im Tiermodell aber auch
vereinzelt am Menschen. Dieses Kapitel soll auf den folgenden Seiten einen
Überblick über die bisherige Ergebnislage von in vitro und in vivo Studien und die
klinische Anwendung von Bumetanid vermitteln.
Kenntnisstand
23
2.3.5.1 Studien zu Veränderungen von Kation-Chlorid-Kotransportern am
Menschen
Es existieren mehrere Untersuchungen an Gehirnresektionsgewebe von
pharmakoresistenten TLE-Patienten, in denen Alterationen von Kation-Chlorid-
Kotransportern und Veränderungen in der Wirkung von GABA nachgewiesen werden
konnten. So berichtete COHEN et al. (2002) über depolarisierende Wirkungen von
GABA in Gehirnschnitten des Subikulums. Ähnliche Studien ergaben ebenfalls in
Schnitten des Subikulums, dass neben einer depolarisierenden Wirkung von GABA,
eine Hochregulation von NKCC1 und eine verminderte Expression von KCC2 aufritt
(PALMA et al. 2006). Auch in weiteren Studien konnte eine Hochregulation von
NKCC1 im Gehirngewebe von pharmakoresistenten Patienten bestätigt werden
(ARONICA et al. 2007; SEN et al. 2007). Diese Ergebnisse am Menschen führten zu
zahlreichen Folgeuntersuchungen in vitro und in vivo am Tiermodell.
2.3.5.2 Studien zu neonatalen und nicht-neonatalen Anfällen in vitro
DZHALA et al. (2005) berichtete über antikonvulsive Effekte durch eine
Bumetanidbehandlung in Hippokampalschnitten neonataler Ratten. Weiter konnte
gezeigt werden, dass eine Kombination mit dem GABA-Mimetikum Phenobarbital
effektiver war, als eine Behandlung mit Bumetanid allein (DZHALA et al. 2008). In
weiteren Studien an Hippokampalschnitten von neonatalen Mäusen konnte jedoch
gezeigt werden, dass je nach Modell antikonvulsive oder prokonvulsive Effekte durch
Bumetanid beobachtet werden können (KILB et al. 2007). In mehreren Studien mit
Gehirnschnitten adulter Nager konnten in verschiedenen Epilepsiemodellen keine
antikonvulsiven Wirkungen nachgewiesen werden (DZHALA et al. 2005;
MARGINEANU und KLITGAARD 2006; WAHAB et al. 2011).
2.3.5.3 Studien zu chronischer Epilepsie in vitro
Hierbei konnte gezeigt werden, dass es mit Bumetanid möglich ist, drei Wochen nach
einem pilokarpin-induzierten SE in Gehirnschnitten von Ratten epileptische
Entladungen zu unterdrücken (BRAGIN et al. 2009). Darüber hinaus konnten auch
an Gehirnresektionsgewebe von pharmakoresistenten TLE-Patienten mittels
Kenntnisstand
24
Bumetanid spontane interiktale Entladungen geblockt werden (HUBERFELD et al.
2007).
2.3.5.4 Studien zu antikonvulsiven Wirkungen bei neonatalen Anfällen in vivo
DZHALA et al. (2005) konnte an neonatalen Ratten zeigen, dass es durch Bumetanid
möglich ist, kainat-induzierte Anfälle zu unterdrücken. In einer weiteren Studie an drei
unterschiedlichen Altersgruppen neonataler bzw. juveniler Ratten wurde der Einfluss
von Bumetanid auf die Ausbildung PTZ-induzierter Anfälle untersucht. Dabei zeigte
sich, dass unter einer Vorbehandlung mit Bumetanid in der Gruppe mit 12 Tage alten
Ratten leichte antikonvulsive Effekte hinsichtlich des Auftretens generalisierter
tonisch-klonischer Anfälle beobachtet werden konnten, während derlei Effekte
sowohl bei jüngeren (7 Tage) als auch bei älteren Tieren (21 Tage) ausblieben.
Dabei wurde vermutet, dass diesem nur schwach antikonvulsivem Effekt eine zu
diesem Zeitpunkt schon fortgeschrittene Ausreifung der Neurone im Hirnstamm
zugrunde liegen könnte, einer Region, in der generalisierte tonische Anfälle
entstehen (MARES 2009). MAZARATI et al. (2009) berichtete zudem, dass es bei 11
Tage alten Ratten möglich war, mit Bumetanid u.a. eine Verkürzung von Anfällen im
EEG zu erreichen. In einer anderen Studie bei flurothyl-induzierten Anfällen bei
neonatalen Ratten konnte unter einer Vorbehandlung mit Bumetanid allerdings keine
antikonvulsive Wirkung nachgewiesen werden (MINLEBAEV und KHAZIPOV 2011).
Die folgende Abbildung beschreibt die Arbeit von DZHALA et al. (2005) und
verdeutlicht den antikonvulsiven Wirkungsmechanismus von Bumetanid.
Kenntnisstand
25
Abbildung 2.8: Darstellung der Arbeit von DZHALA et al., mod. nach FUKUDA (2005).
a.) Anfallsaktivität durch eine Hochregulation von NKCC1 und eine infolgedessen
exzitatorische Wirkung von GABA.
b.) Anfallsunterdrückung durch Bumetanid über eine Blockade von NKCC1 und eine
infolgedessen inhibitorische Wirkung von GABA.
2.3.5.5 Studien zu antikonvulsiven Wirkungen bei nicht-neonatalen Anfällen in
vivo
Es existiert eine Studie, in der berichtet wird, dass bei urethan-anästhesierten Ratten
kainat-induzierte Anfälle im EEG mithilfe einer zweimaligen Applikation von
Bumetanid unterdrückt werden konnten (SCHWARTZKROIN et al. 1998). Eine
weitere Untersuchung an pentobarbital-anästhesierten Makaken ergab, dass es
sowohl bei chemisch als auch bei elektrisch induzierten Anfällen ebenfalls möglich
war, im EEG beobachte epileptische Entladungen zu unterdrücken (HOCHMAN und
HAGLUND 2009).
b.) Anfallsunterdrückunga.) Anfallsaktivität
Kenntnisstand
26
2.3.5.6 Untersuchungen zu Alterationen von Kation-Chlorid-Kotransportern
während der Epileptogenese
Untersuchungen zu Alterationen von Kation-Chlorid-Kotransportern können während
der Epileptogenese am Menschen nicht durchgeführt werden. Aus diesem Grund
wurde an Tiermodellen für Epileptogenese untersucht, ob auch während der
Entwicklung von Epilepsien Alterationen von Kation-Chlorid-Kotransportern
beobachtet werden können. Eine Studie im Pilokarpin-Modell für TLE an Ratten
berichtete, dass nach SE-Induktion eine verminderte KCC2-Expression und eine
daraus resultierende Veränderung in der Wirkung von GABA beobachtet werden
konnte. So wurde für den Gyrus dentatus nachgewiesen, dass ein und zwei Wochen
nach SE jeweils KCC2 signifikant runterreguliert war, wohingegen dies bei chronisch
epileptischen Tieren nicht mehr beobachtet werden konnte (PATHAK et al. 2007).
Für das Pilokarpin-Modell konnte zudem gezeigt werden, dass es nach SE sowohl
bei Mäusen in der CA1-Region des Hippokampus als auch bei Ratten im Subikulum
und Gyrus dentatus zu einer Hochregulation von NKCC1 kommt (LI et al. 2008;
BRANDT et al. 2010a). Es konnte jedoch festgestellt werden, dass bei Mäusen 2
Wochen nach SE bereits wieder eine Abnahme von NKCC1 stattfindet (LI et al.
2008). Ebenfalls konnte bei Ratten gezeigt werden, dass 2-3 Wochen nach SE eine
signifikante Hochregulation von NKCC1 im entorhinalen Kortex nicht mehr
vorzufinden war (BRAGIN et al. 2009). Weiterhin konnte für das Amygdala-Kindling-
Modell in Ratten, nachdem sie in einem Aufkindling-Prozess dreimal Anfälle der
Stufe 5 entwickelt hatten, eine signifikante Hochregulation von NKCC1 im piriformen
Kortex nachgewiesen werden (OKABE et al. 2002). Ein zur Zeit grundsätzliches
Problem im Hinblick auf den Nachweis von Veränderungen von NKCC1 ist jedoch,
dass bis jetzt keine gut funktionierenden spezifischen Antikörper existieren, was
weitere spezifische Untersuchungen erschwert (BLAESSE et al. 2009).
2.3.5.7 Studien zu antiepileptogenen Wirkungen von Bumetanid in vivo
Es konnte für Wistar-Ratten gezeigt werden, dass die Latenzzeit im Pilokarpin-Modell
zur Ausbildung einer Epilepsie nach einem 120 minütigen SE ungefähr eine Woche
beträgt (GOFFIN et al. 2007). Während eines solchen Zeitraums, also während der
Epileptogenese, könnte ein veränderter hippokampaler Chlorid-Haushalt für eine
Kenntnisstand
27
veränderte Wirkung von GABA eine Rolle spielen (LÖSCHER et al. 2012). So wurde
in einer Studie überprüft, ob es mit Bumetanid allein oder in Kombination mit dem
GABA-Mimetikum Phenobarbital möglich ist, nach SE-Induktion mittels Pilokarpin
antiepileptogene Effekte zu erzielen. Jedoch ergab sich, dass mit Bumetanid (trotz
Dauerinfusion) allein keine antiepileptogenen Effekte erzielt werden konnten, jedoch
in Kombination mit Phenobarbital nach SE auftretende Verhaltensveränderungen
abgemildert werden konnten. Die nur sehr geringe HWZ als auch die schlechte
Gehirngängigkeit von Bumetanid vermag möglicherweise diese nur moderaten
Effekte erklären (BRANDT et al. 2010a). In einer anderen Studie zur Epileptogenese,
in einem modifizierten Kindling-Modell (Rapid-Kindling) konnte jedoch an neonatalen
Ratten (11 Tage alt) mit einer intraperitonealen (i.p.) Vorbehandlung mit Bumetanid
ein antiepileptogener Effekt beobachtet werden, indem das Auftreten generalisierter
Anfälle verzögert und deren Anzahl vermindert war (MAZARATI et al. 2009). Die
Untersuchungen aus den Kapiteln 2.3.5.6 und 2.3.5.7 gaben im Hinblick auf die
Planung dieser Ph.D.-Arbeit den Hinweis, dass sowohl das Pilokarpin-Modell als
auch das Kindling-Modell grundsätzlich geeignet sein könnten, Bumetanid auf
antiepileptogene Eigenschaften zu untersuchen.
2.3.5.8 Klinische Anwendung bei Epilepsie
Ausgehend von den Studien von DZHALA et al. (2005, 2008) wird Bumetanid
zunehmend als mögliche Option zur Behandlung von neonatalen Krampfanfällen des
Menschen diskutiert (KAHLE und STALEY 2008; MERLIN 2011). Jedoch wurde
bisher nur über einen einzigen Patienten mit neonatalen Anfällen berichtet, der mit
Bumetanid behandelt worden war. Hierbei wurde von einer abgemilderten
Krampfaktivität berichtet (KAHLE et al. 2009). Weiter konnte erst kürzlich in einer
Pilotstudie gezeigt werden, dass es mit Bumetanid möglich ist, bei erwachsenen
TLE-Patienten die Anfallsfrequenz zu verringern (EFTEKHARI et al. 2012).
Mittlerweile wurden zudem in Europa und in den USA klinische Studien auf den Weg
gebracht, in denen der Nutzen von Bumetanid in einer Kombination mit
Phenobarbital zur Behandlung von neonatalen Anfällen evaluiert werden soll (FDA
IND No. 101690: http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00830531; EU FP7 NEMO:
http://www.nemo-europe.com/).
Kenntnisstand
28
Phenobarbital 2.4
Auf diese Substanz soll kurz näher eingegangen werden, da sie im Verlauf der
vorliegenden Arbeit in Kindling-Studien bei Ratten verwendet wurde. Phenobarbital
gehört zu Gruppe der Barbiturate und wurde 1911 von dem Deutschen Emil Fischer
bei der Firma BAYER synthetisiert. Seine antikonvulsive Wirkung wurde 1912 von
Alfred Hauptmann entdeckt (HAUPTMANN 1912). Phenobarbital ist eines der am
häufigsten eingesetzten AEDs in der Welt und findet vor allem in den
Entwicklungsländern die weiteste Verbreitung (BRODIE und FRENCH 2000). In der
Tiermedizin hat Phenobarbital ebenfalls eine sehr große Bedeutung und gilt derzeit
als das Mittel der Wahl zur Behandlung von Epilepsien bei Hund und Katze (VOLK
und LODERSTEDT 2011). Sein antikonvulsiver Wirkmechanismus, wie auch der
anderer Barbiturate, besteht in einer verstärkten GABAergen Inhibition,
hervorgerufen durch eine allosterische Interaktion mit postsynaptischen GABAA-
Rezeptoren (MACDONALD et al. 1989; ROGAWSKI und PORTER 1990). Dadurch
kommt es über eine Zunahme der mittleren Kanalöffnungszeit zu einer erhöhten
Aktivierung von GABAA-Rezeptoren (TWYMAN et al. 1989). Der dadurch erhöhte
Chlorid-Einstrom führt zu einer Hyperpolarisation der postsynaptischen Membran,
wodurch eine epileptische Aktivität unterbunden wird. Zusätzlich besteht eine weitere
Eigenschaft von Barbituraten darin, GABAA-Rezeptoren bei Abwesenheit von GABA
direkt zu aktivieren, was die sedativen Effekte dieser Substanzen zu erklären vermag
(RHO et al. 1996). Phenobarbital wird über die Leber verstoffwechselt (ANDERSON
2002) und zu 25% unverändert über die Niere ausgeschieden (BERNUS et al. 1994).
Eingesetzt wurde Phenobarbital in dieser Arbeit aufgrund der Tatsache, dass durch
eine Kombination mit Bumetanid und dieser GABA-potenzierenden Substanz sowohl
antikonvulsive als auch krankheitsmodifizierende Effekte erzielt werden können
(DZHALA et al. 2008; BRANDT et al. 2010a).
Zielsetzung und Arbeitshypothesen
29
3 Zielsetzung und Arbeitshypothesen
Bisher existiert keine Möglichkeit, die Entstehung von Epilepsien nach Hirninsulten
prophylaktisch zu beeinflussen. Diese Tatsache ist umso prekärer, da die
Risikogruppe für die Entwicklung von Epilepsien klar definiert werden kann
(LÖSCHER und BRANDT 2010). Dieser Umstand macht es dringend erforderlich,
neue therapeutische Strategien zu entwickeln, mit denen im Idealfall die
Epileptogenese ganz unterbunden werden oder zumindest ein milderer Verlauf
dieser schwerwiegenden neurologischen Erkrankung erreicht werden kann. Man geht
davon aus, dass neben zahlreichen anderen pathologischen Veränderungen
Alterationen u.a. in der Funktion von Rezeptoren und Ionenkanälen bei der
Epileptogenese eine wichtige Rolle spielen (DICHTER 2009; PITKÄNEN und
LUKASIUK 2009; LÖSCHER und BRANDT 2010; TIMOFEEV et al. 2010). So wurde
gezeigt, dass sich während der Epileptogenese GABA von hyperpolarisierend zu
depolarisierend verändert, was auf einer veränderten Expression von Kation-Chlorid-
Kotransportern beruht (COHEN et al. 2002; PATHAK et al. 2007). In diesem
Zusammenhang wurde in der vorliegenden Arbeit der Effekt einer
pharmakologischen Manipulation des NKCC1-Transporters untersucht. Als
pharmakologischer Modulator wurde der derzeit als Diuretikum zugelassene,
selektive NKCC-Inhibitor Bumetanid ausgewählt. Ein Problem bei der Anwendung
von Bumetanid ist jedoch, dass diese Substanz per se nur schlecht gehirngängig ist
und beim Nager eine nur sehr kurze HWZ besitzt (BUSCH et al. 1979; BRANDT et
al. 2010a). Aus diesem Grund bestand das Ziel dieser Arbeit darin, diese Hindernisse
durch verschiedene Strategien zu überwinden. Diese bestanden in der Verwendung
des N,N-Dimethylaminoethylesters BUM5, in der fokalen Applikation von Bumetanid
in das Gehirn und in der Kombination von Bumetanid mit PBO. Die Strategie
Bumetanid mit PBO zu kombinieren wurde angewendet, da gezeigt werden konnte,
dass in Kombination mit PBO die HWZ von Bumetanid bei Ratten verdoppelt werden
kann (HALLADAY et al. 1978). So wurde die antiepileptogene Wirkung dieser
Kombination in einer Aufkindling-Studie an Ratten evaluiert, da bekannt ist, dass es
im Kindling-Modell zu einer Hochregulation von NKCC1 kommt (OKABE et al. 2002;
OKABE et al. 2003). Nach der Aufkindling-Phase wurde diese Kombination im
nächsten Schritt auf antikonvulsive Wirkung untersucht. Zusätzlich wurde in einer
Zielsetzung und Arbeitshypothesen
30
proof-of-principle-Studie Bumetanid fokal (intrazerebroventrikulär = i.c.v.) appliziert,
um unter Umgehung der Blut-Hirn-Schranke zu überprüfen, ob Bumetanid nach einer
direkten Einbringung in das Zielorgan im Kindling-Modell antikonvulsive Effekte
ausüben kann. Das Derivat BUM5 wurde mit dem Ziel synthetisiert, in den
verwendeten Epilepsiemodellen die Gehirngängigkeit und Verweildauer von
Bumetanid im Gehirn zu erhöhen. Parallel zur Anfertigung dieser Ph.D.-Arbeit konnte
in Studien zur Kinetik im Nager gezeigt werden, dass BUM5 gegenüber Bumetanid
eine bessere Gehirngängigkeit bei einer gleichzeitig verminderten diuretischen
Wirkung besitzt (TÖLLNER et al., eingereicht). Zur Überprüfung der Funktionalität
wurde die antikonvulsive Wirkung von BUM5 im Kindling-Modell bei Ratten evaluiert.
Darüber hinaus wurden im Zuge dieser Studie sowohl BUM5 als auch Bumetanid mit
dem GABA-Agonisten Phenobarbital kombiniert, da bekannt ist, dass durch diese
Kombination die Wirkung von Phenobarbital potenziert werden kann (DZHALA et al.
2008; BRANDT et al. 2010a). Zusätzlich wurde der Einfluss von Bumetanid und
BUM5 auf die PTZ-Krampfschwelle nach einem pilokarpin-induzierten SE bei
Mäusen untersucht, da auch für das Pilokarpin-Modell eine Hochregulation von
NKCC1 nachgewiesen werden konnte (LI et al. 2008). Letztendlich wurden im
Rahmen dieser Ph.D.-Arbeit mehrere Strategien verfolgt, um über eine Erhöhung der
Gehirnkonzentration von Bumetanid sowohl antiepileptogene als auch antikonvulsive
Effekte durch Bumetanid in verschiedenen Nagermodellen für Epilepsie zu erzielen.
Basierend auf bestehenden Erkenntnissen wurden folgende Arbeitshypothesen
aufgestellt:
1. Durch eine kombinierte Vorbehandlung aus Bumetanid und dem
Monooxigenase-Inhibitor PBO kann die HWZ von Bumetanid derart
verlängert werden, dass antiepileptogene Effekte im Kindling-Modell für
TLE bei der Ratte erzielt werden können.
2. Die fokale Applikation von Bumetanid bewirkt unter Umgehung der Blut-
Hirnschranke, dass sich genügend intaktes Bumetanid im Gehirn befindet,
um antikonvulsive Effekte im Kindling-Modell für TLE bei der Ratte
auszuüben.
Zielsetzung und Arbeitshypothesen
31
3. Durch eine kombinierte Vorbehandlung mit Bumetanid bzw. BUM5 und
dem GABA-Agonisten Phenobarbital können antikonvulsive Effekte von
Phenobarbital im Kindling-Modell für TLE bei der Ratte potenziert werden.
4. Bumetanid bzw. BUM5 wirkt nach einem pilokarpin-induzierten SE im PTZ-
Krampftest bei der Maus antikonvulsiv.
Die im Rahmen dieser Ph.D.-Arbeit gewonnenen Erkenntnisse sollen dazu beitragen,
durch Bumetanid eine neue therapeutische Option zur Behandlung und Prävention
von Epilepsien sowohl für die Tier- als auch für die Humanmedizin zu erhalten.
Material und Methoden
32
4 Material und Methoden
Hinweis: Im Anhang befindet sich, sofern im Text nicht erwähnt, eine Auflistung der
verwendeten Geräte, Substanzen und Verbrauchsmaterialien, einschließlich der
zugehörigen Bezugsquellen. Die Herstellungsprotokolle verwendeter Lösungen und
das Färbeprotokoll befinden sich ebenfalls im Anhang.
In der vorliegenden Studie wurde mit verschiedenen Epilepsiemodellen und
unterschiedlichen Tierspezies gearbeitet. In einem Projekt wurde das Kindling-Modell
bei der Ratte verwendet. Hierbei wurde Bumetanid zum einen auf antiepileptogene
Wirkungen und zum anderen sowohl Bumetanid als auch BUM5 auf antikonvulsive
Wirkungen untersucht. Das zweite Projekt beinhaltete Untersuchungen zu
antikonvulsiven Wirkungen von Bumetanid und BUM5 nach einem pilokarpin-
induzierten SE im PTZ-Krampftest bei der Maus.
Tiere 4.1
Für die SE-Induktion und anschließende Durchführung der PTZ-Krampftests wurden
weibliche adulte NMRI-Mäuse des Versuchstierzüchters Charles River, Sulzfeld,
verwendet. Die Mäuse waren bei Anlieferung 4 Wochen alt und hatten ein
Ankunftsgewicht von 20-22 g. Die Haltung erfolgte in Zehnergruppen in
Makrolonkäfigen des Typs III. Die Versuche erfolgten frühestens eine Woche nach
Ankunft, um den Tieren eine ausreichende Adaptionszeit zu ermöglichen. Nach SE-
Induktion erhielten die Tiere bis zu zwei Tage je zweimal täglich eine subkutane
Injektion einer 0,9%igen Natriumchlorid (NaCl)-Lösung (1 ml täglich). Zusätzlich
wurden die Tiere solange per Hand mit handelsüblichem Baby-Brei versorgt, bis sie
eine normale Nahrungsaufnahme zeigten.
Für die Kindling-Studien wurden weibliche adulte Wistar-Unilever-Ratten des
Versuchstierzüchters Harlan, Horst, Niederlande, verwendet. Die Ratten waren bei
Anlieferung 10-11 Wochen alt und hatten ein Ankunftsgewicht von 200-220 g. Die
Tiere wurden in Makrolonkäfigen mit einer Einstreu aus Weichholzgranulat gehalten.
Vor der Operation wurden die Tiere in Gruppen von bis zu 5 Tieren in Typ IV Käfigen,
nach der Operation einzeln in Typ III Käfigen gehalten. Nach ihrer Ankunft erhielten
Material und Methoden
33
die Ratten eine mindestens einwöchige Adaptionsphase bevor mit den Operationen
begonnen wurde. Zwei Tage vor und bis fünf Tage nach der Operation erfolgten eine
systemische Antibiose der Tiere, sowie eine tägliche Kontrolle der Wundheilung.
Zwischen der Operation und dem Beginn der Versuchsphase wurde eine mindestens
zweiwöchige Erholungsphase eingehalten, die der Regeneration der Tiere diente.
Der Grund für die Verwendung von weiblichen Tieren lag sowohl bei Mäusen als
auch bei Ratten darin begründet, dass alle im Institut etablierten Versuchsprotokolle
auf weiblichen Tieren aufbauten, sodass bei einer etwaigen Verwendung männlicher
Tiere nicht abzuschätzen war, ob die Protokolle bei diesen Tieren funktionieren
würden. Ein weiterer Grund besteht in der Tatsache, dass weibliche Ratten
niedrigere Körpergewichte als männliche Tiere aufweisen, wodurch in den hier
durchgeführten Studien geringere Mengen des aufwendig herzustellenden
Bumetanid-Derivats BUM5 benötigt wurden.
Die Haltung der Tiere erfolgte getrennt nach Spezies. In den Ställen betrugen die
Umgebungstemperatur 23-24 °C und die Luftfeuchtigkeit ca. 30-50%. Der Hell-
Dunkel-Zyklus im Stall dauerte 12 Stunden, wobei die Hellphase von 6-18 Uhr
andauerte. Die Ernährung der Tiere bestand aus einer Standardnagerdiät und
Leitungswasser, welches beides ad libitum angeboten wurde. Das Futter wurde
einmal wöchentlich aufgefüllt, Wasser zweimal wöchentlich erneuert. Ratten wurden
einmal wöchentlich, Mäuse zweimal wöchentlich in saubere Käfige mit frischer
Einstreu umgesetzt. Das Umsetzen erfolgte in ausreichendem zeitlichem Abstand zu
den Versuchen, um eine Beeinflussung der Tiere vor den Experimenten zu
vermeiden. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Tierversuche wurden durch
das Niedersächsische Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit
(LAVES), Dezernat 33 unter dem Aktenzeichen 33.9-42502-04-09/1769 am
01.12.2009 genehmigt.
Material und Methoden
34
Untersuchungen zu antiepileptogenen und antikonvulsiven Wirkungen 4.2
von Bumetanid und antikonvulsiven Wirkungen von BUM5 im Kindling-
Modell
4.2.1 Implantation von Elektroden und Führungsrohren
Die stereotaktische Implantation der Kindlingelektrode in die rechte basolaterale
Amygdala (BLA) erfolgte frühestens eine Woche nach Ankunft der Tiere. Die Tiere
wurden mit Chloralhydrat (360 mg/kg; gelöst in 0,9%iger NaCl-Lösung;
Injektionsvolumen: 10 ml/kg i.p.) anästhesiert. Vor und während der Operation wurde
die Narkosetiefe anhand des Zwischenzehenreflexes überprüft und bei Bedarf eine
Nachinjektion mit einem Drittel der Initialdosis von Chloralhydrat vorgenommen. Die
Entfernung der Kopfbehaarung im Operationsbereich erfolgte mittels einer Schere.
Um den Schädel zu fixieren wurden die Tiere mithilfe zweier Ohrstifte in den
Gehörgängen und einer Oberkieferhalterung (incisor bar) in einem Stereotakten
eingespannt. Zur Bestimmung der Koordinaten für die Trepanation des
Schädeldachs und die Implantation der Kindlingelektrode wurde der stereotaktische
Atlas nach PAXINOS und WATSON (2007) verwendet. Der incisor bar des
Stereotakten wurde auf -3,3 mm eingestellt, damit Bregma (rostraler Kreuzungspunkt
der Schädelknochennähte) und Lambda (kaudaler Kreuzungspunkt) entsprechend
der Darstellung im Atlas auf gleicher Höhe lagen. Diese Einstellung erfolgte unter
Berücksichtigung des Rattenstamms, des Geschlechts und des Alters der Tiere. Die
Kopfhaut des Operationsbereiches wurde mit 70%igem Ethanol desinfiziert und mit
Tetracain (2%, Einwirkzeit 5 min) anästhesiert. Daraufhin erfolgte in rostrokaudaler
Richtung eine etwa 2 cm lange Inzision der Kopfhaut. Hierauf wurden die Faszien
und das Periost mit Bupivacain (0,2%, Einwirkzeit 5 min) anästhesiert. Nach
vorsichtiger Entfernung der Faszien und des Periosts wurde die Schädeloberfläche
zwecks Desinfektion und deutlicherer Darstellung der Knochennähte mit 35%iger
Wasserstoffperoxidlösung betupft. Im weiteren Verlauf der Operation wurde der
Wundbereich regelmäßig mit einer wässrigen Lösung von Ethacrinlactat betupft, um
einer etwaigen Wundinfektion weiter vorzubeugen.
Nach Feststellung der Koordinaten von Bregma, die mittels einer am Stereotakten
befestigten Nadel bestimmt worden waren, erfolgte die Berechnung und Markierung
Material und Methoden
35
des über der BLA liegenden Trepanationspunktes auf der Schädeldecke. Darauf
wurde an dieser Stelle die Schädeldecke mit einem Dentalbohrer durchbohrt. Einem
Teil der Tiere wurden zuvor, zwecks zusätzlicher Implantation zweier Führungsrohre
in die ersten beiden Hirnventrikel (für eine intrazerebroventrikuläre Applikation), zwei
weitere Punkte auf der Schädeldecke berechnet, markiert und anschließend
ebenfalls eingebohrt. Ungefähr auf der Höhe des Bohrpunktes der Kindlingelektrode
wurde auf der linke Schädelhälfte ein weiteres Loch gebohrt, wobei eine hier
eingedrehte Schraube, die mit einem teflonbeschichteten Draht, welcher wiederum
mit einer Messingbuchse verbunden war, als Erde diente. Zur weiteren Befestigung
wurden rostral der Kindlingelektrode zwei und kaudal ein weiteres Loch gebohrt und
die entsprechende Zahl an Schrauben eingedreht. Im nächsten Schritt wurde
Bregma mit der Kindlingelektrode, die am Stereotakten angebracht worden war,
angefahren und die so erhaltenen Koordinaten zur Berechnung des
Versenkungspunktes in die BLA berechnet. Die Koordinaten der Kindlingelektrode
lauteten unter Berücksichtigung des Rattenstamms, des Geschlechts und des Alters
der Tiere, für weibliche adulte Wistar-Ratten rostrokaudal -2,2, lateral -4,8 und ventral
-8,5 relativ zu Bregma. Nachdem die Elektrode nach Inzision der Dura mater in die
BLA abgesenkt worden war, wurde eine dünne Schicht eines kaltpolymerisierenden
und mit einem Antibiotikum (Marbofloxacin) versetzten Kunststoffes (Dentalzement)
auf die Schädeldecke, die Fixationsschrauben und die Kindlingelektrode
aufgetragen. In der Tiergruppe, die zusätzlich mit Führungsrohren implantiert wurde,
geschah dies zunächst unter Aussparung von Bregma und der Bohrlöcher für die
Führungsrohre. Hier wurde Bregma mithilfe eines am Stereotakten befestigten
Führungsrohrs erneut angefahren und dadurch die zugehörigen Koordinaten zur
Implantation der Rohre in die seitlichen Hirnventrikel berechnet. Die Koordinaten
hierfür lauteten rostrokaudal -0,8, lateral -1,5 (rechts), +1,5 (links) und ventral -3,5
relativ zu Bregma. Zuerst wurde das rechte Führungsrohr versenkt und sogleich mit
oben genanntem Dentalzement in seiner Position fixiert. Analog dazu wurde mit dem
linken Führungsrohr verfahren. Die Führungsrohre wurden selbst angefertigt,
bestanden aus rostfreiem Edelstahldraht und hatten eine Länge von 17 mm und
einen Innendurchmesser von 0,52 mm. Bei der Kindlingelektrode handelte es sich
um eine bipolare Elektrode die ebenfalls selbst angefertigt wurde. Sie bestand aus
zwei teflonbeschichteten Drähten (Dicke je 0,2 mm) aus rostfreiem Stahl die
Material und Methoden
36
umeinander gewunden wurden. Je ein Ende der Drähte wurde an einer
Messingbuchse festgelötet und diente zusammen mit der Buchse der Erde als
Steckkontakt für das Verbindungskabel zum Reizgenerator. Unter Einbeziehung der
Fixationsschrauben wurde mit dem Dentalzement eine dauerhafte Befestigung der
Kindlingelektrode und der Erde als Stecker und der Führungsrohre auf dem
Schädeldach gewährleistet und damit ein stabiler mehrschichtiger Aufbau modelliert.
Bei den Tieren mit Führungsrohren wurden diese zudem mithilfe von
Kunststoffstrohhalmen ummantelt, um einem Verlust der Mandrins vorzubeugen.
Nach Aushärtung des Dentalzements wurden die Wundränder um den Aufsatz
herum adaptiert und mit resorbierbarem Nahtmaterial durch Einzelhefte
verschlossen. Bei den mit Führungsrohren implantierten Tieren wurden in die Rohre
stählerne Mandrins eingeschoben, die ebenfalls eine Länge von 17 mm aufwiesen.
Nach der Operation wurden die Tiere in saubere und mit Zellstoff ausgekleidete
Käfige verbracht. Die Tiere erhielten acht Tage lang eine Antibiose, beginnend zwei
Tage vor der Operation (Marbofloxacin ca. 3 mg/kg, 0,1 ml/Tier zweimal täglich s.c.).
Nach dem Eingriff hatten die Tiere eine mindestens zweiwöchige Erholungsphase,
bevor mit der Kindling-Prozedur begonnen wurde.
Abbildung 4.1: Aufsicht eines Rattenschädel mit Kennzeichnung von Knochennähten (Lambda
und Bregma), Kindlingelektrode, Führungrohren, Halteschrauben und Erde. Mod. nach
PAXINOS und WATSON (2007).
Material und Methoden
37
Abbildung 4.2: Lokalisation der Führungsrohre. Koronarschnitt des Rattengehirns. Mod. nach
PAXINOS und WATSON (2007).
Abbildung 4.3: Lokalisation der Kindlingelektrode in der rechten BLA (grau). Koronarschnitt
des Rattengehirns. Mod. nach PAXINOS und WATSON (2007).
4.2.2 Kindling-Protokoll
Für die elektrische Stimulation wurden monophasische Rechteckimpulse mit einer
Dauer von 1 ms und 50 Hz Frequenz für die Dauer einer Sekunde verwendet.
Material und Methoden
38
4.2.2.1 Anfallsparameter
Um die motorischen und elektroenzephalographischen Anfallsaktivitäten während der
Stimulation zu bestimmen wurden folgende Parameter beurteilt:
Die Nachentladungsschwelle (afterdischarge threshold, ADT) stellt die minimale
Stromstärke in Mikroampere dar, die nötig ist, um bei dem Tier eine Nachentladung
auszulösen. Diese muss mindestens drei Sekunden andauern und die zugehörige
Amplitude im EEG mindestens doppelt so hoch wie die Grundlinie im Ruhe-EEG
sein. Entsprechend zur Nachentladungsschwelle wird die Schwelle, die zum
Erreichen eines generalisierten Anfalls notwendig ist, als generalized seizure
threshold (GST) bezeichnet. Die Beurteilung der Schwere der beobachteten Anfälle
(SS, seizure severity) erfolgte in Anlehnung an die Einteilung von RACINE (1972).
Die Stadien 1-3 entsprechen fokalen Anfällen, während es sich bei den Stadien 4
und 5 um generalisierte Anfälle handelt. Sofern im EEG eine Nachentladung von
mindestens drei Sekunden Länge auftrat, das Tier jedoch keine körperliche
Krampfaktivität zeigte, wurde dies mit einer ,,0‘‘ vermerkt.
Anfallsstärke Anfallscharakteristika (klinische Symptomatik)
Stadium 1 Immobilität, schwacher Fazialklonus (z.B. Schließen eines oder
beider Augen, stereotypes Schnüffeln, Zittern der Tasthaare)
Stadium 2 Schwere Fazialklonien in Form klonischer Kaubewegungen, ,,Kopf
nicken‘‘
Stadium 3 Unilateraler Vorderextremitätenklonus
Stadium 4 Aufrichten (Vorderextremitäten heben vom Boden ab) und
bilateraler Vorderextremitätenklonus
Stadium 5 Aufrichten des Tieres mit Verlust der Stellreflexe, nach hinten oder
zur Seite überfallen, generalisierte klonische Krämpfe
Stadium (5) Siehe 5 ohne Überfallen (Tier drückt Kopf auf den Boden oder
befindet sich in Seitenlage)
Tabelle 4.1: Einteilung der Anfallsstadien modifiziert nach RACINE (1972).
Material und Methoden
39
Die SD (seizure duration) beschreibt die Anfallsdauer, d.h. die vom Experimentator
messbare Zeit vom Beginn der Stimulation bis zum Ende der sichtbaren motorischen
Krampfaktivität. Dabei unterscheidet man die SD1, die Zeitspanne bis zum Ende der
motorischen Krampfaktivität, von der SD2, die zusätzlich zur motorischen
Krampfaktivität die Zeitspanne bis zur Normalisierung des Verhaltens des Tieres
beinhaltet. Die ADD (afterdischarge duration) beschreibt die Nachentladungsdauer,
d.h. die Zeit, in der nach einer Stimulation im EEG eine Spikeperiode von mindestens
drei Sekunden Dauer, 1 Hz Frequenz und einer doppelten Amplitude zur Grundlinie
auftritt. Kurze Pausen bis zu einer Dauer von drei Sekunden können dabei beinhaltet
sein. Unterschieden werden die ADD1, welche die Zeitspanne vom Zeitpunkt der
Stimulation bis zum Ende der ersten Spikeperiode darstellt. Sofern im Anschluss
daran eine Spikeperiode mit veränderter Amplitude und Spikemuster anschließt, so
wird die Gesamtdauer vom Beginn der Stimulation bis zum Ende der Nachentladung
als ADD2 bezeichnet. Dieser Sachverhalt tritt selten auf, sodass die ADD1 meist der
ADD2 entspricht.
Abbildung 4.4: Schematische Darstellung der gemessenen Parameter im EEG (Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie).
Für die Kindling-Prozedur wurden die Ratten einzeln in eine mit Zellstoff ausgelegte
Glasbox (Höhe: 40 cm, Länge: 80 cm, Breite: 40 cm) gesetzt und über die
Steckerbuchse auf ihrem Kopf über ein zweipoliges ummanteltes Kabel mit einem
Stimulator verbunden. Die Zwischenschaltung einer Switchbox erlaubte über die
Material und Methoden
40
implantierte Kindlingelektrode die Stimulation und Ableitung des EEG. Dieses wurde
mittels eines Thermoschreibers auf Endlosmilimeterpapier aufgezeichnet.
4.2.2.2 Bestimmung der Nachentladungsschwelle vor der Kindling-Prozedur
Nach der postoperativen Erholungsphase wurde bei jedem Tier einmalig nachmittags
die initiale ADT bestimmt. Nach FREEMAN und JARVIS (1981) wurden die Tiere im
Abstand von je einer Minute mit in 20%-Stufen aufsteigenden Stromstärken
stimuliert, bis im EEG eine Nachentladungsdauer von mindestens drei Sekunden
Länge und doppelter Amplitude zur Grundlinie sichtbar war. Angefangen bei 30 μA
betrugen die folgenden Stromstärken 36, 42, 50, 60, 75, 90, 110, 130, 160, 200, 240,
280, 330, 400, 480, 590, 710, 840 und 1000 μA.
4.2.2.3 Aufkindel-Prozess
Am Tag nach Bestimmung der initialen ADT wurde mit der Aufkindel-Prozedur
begonnen. Dazu wurden die Tiere einmal täglich zur gleichen Tageszeit mit einer
Stromstärke, die eine 20%-Stufe über dem Wert der initialen ADT lag, stimuliert.
Dabei zeigen die Tiere mit zunehmender Anzahl der Stimulationen Anfälle, die an
Schwere und Dauer immer weiter zunehmen. Sobald ein Tier zum ersten Mal das
Krampfstadium 5 erreicht hatte, wurde es als voll gekindelt bezeichnet. Die Tiere
wurden jedoch weiter stimuliert, bis sie an zehn Stimulationstagen das
Krampfstadium 5 erreicht hatten. Für die Bewertung der Kindling-Entwicklung wurde
die Anzahl der Stimulationstage zusammengezählt, die notwendig waren, bis ein Tier
zum ersten Mal das Stadium 5 erreicht hatte. Darüber hinaus wurde die kumulative
Anfallsdauer (cumulative seizure duration, cSD) bewertet. Bei diesem Parameter wird
die Dauer der motorischen Anfallsaktivität aller Anfälle, von der Bestimmung der
initialen ADT (wird miteinberechnet) bis zum ersten Anfall eines je nach
Fragestellung festgelegten Stadiums (wird nicht miteinberechnet) aufaddiert. Hierbei
wird ebenfalls eine cSD1 von einer cSD2 unterschieden. Die kumulative
Nachentladungsdauer (cumulative afterdischarge duration, cADD) beinhaltet
dementsprechend die aufaddierte Zeit der aufgezeichneten Anfälle im EEG. Auch
wird eine Einteilung in cADD1 und cADD2 vorgenommen.
Material und Methoden
41
4.2.2.4 Bestimmung der Nachentladungsschwelle nach der Kindling-Prozedur
Drei bis fünf Tage nach der letzten Aufkindling-Stimulation wurde bei jedem Tier die
post ADT (post-Kindling-Nachentladungsschwelle), analog zum Schema der
Bestimmung der initialen ADT bestimmt. Danach erfolgte zweimal wöchentlich immer
zur gleichen Tageszeit die Bestimmung der ADT mit mindestens zwei Tagen Pause
zwischen den Stimulationen bis die Werte individuell stabil waren. Dabei wurde mit
der Stimulation bei drei bzw. fünf 20%-Stufen unter dem Wert der letzten ADT
begonnen, bis das jeweilige Tier mit einem generalisierten Anfall (ab Stufe 4) reagiert
hat. Die unterschiedliche Anzahl an Prozentstufen ergab sich aus dem Umstand,
dass im Lauf der Arbeit eine Gruppe voll gekindelter Ratten aus einer anderen Studie
übernommen werden konnte. Bei dieser Gruppe waren zuvor die
Schwellenbestimmungen immer drei 20%-Stufen unter der vorherigen ADT
vorgenommen wurden, was nach Übernahme dieser Gruppe für die weiteren
Versuche so beibehalten wurde. Grundsätzlich wurde bei den
Schwellenbestimmungen unterhalb der vorherigen ADT begonnen, um durch eine
Substanzbehandlung eventuell auftretende prokonvulsive Effekte frühzeitig
bestimmen zu können. Zeigte das jeweilige Tier an mindestens drei
aufeinanderfolgenden Stimulationstagen ADT-Werte mit einer maximalen
Abweichung von einer 20%-Stufe, so wurde dieses Tier als stabil bezeichnet und mit
einer Versuchsphase begonnen. Wenn nicht anders beschrieben, zeigten die Tiere
bei der ADT motorisch einen generalisierten Anfall.
4.2.3 Untersuchungen zur antiepileptogenen Wirksamkeit von Bumetanid im
Kindling-Modell
In dieser Studie wurden Ratten während der Aufkindlingphase täglich mit Bumetanid
und dem Monooxigenase-Inhibitor Piperonylbutoxid (PBO) vorbehandelt, bevor mit
der Stimulation begonnen wurde. HALLADAY et al. berichteten schon 1978 über eine
Verlängerung der Halbwertszeit von Bumetanid unter der Verwendung von PBO. Der
Mechanismus beruht darauf, dass PBO die Oxidation der N-Butyl-Seitenkette
verhindert und so die funktionelle Gruppe bei der Ratte länger diuretisch wirken kann.
Die Hypothese dieser Studie war, dass es unter kombinierter Vorbehandlung mit
diesen Substanzen zu einer verzögerten Kindling-Entwicklung kommt und somit ein
antiepileptogener Effekt beobachtet werden kann. Vor Beginn dieser Studie wurde
Material und Methoden
42
bei den Tieren nach der postoperativen Erholungsphase die initiale ADT bestimmt.
Die anschließende Zuordnung der Tiere in eine Versuchsgruppe und eine
Kontrollgruppe (wurde mit Vehikel von PBO und Bumetanid behandelt) erfolgte
randomisiert und verblindet. Es wurde darauf geachtet die Tiere mit niedrigen und
hohen initialen ADTs gleichmäßig auf die beiden Gruppen zu verteilen. Tags darauf
wurde mit der Aufkindling-Prozedur begonnen, wobei jedes Tier fortan individuell mit
einer 20%-Stufe über der individuellen ADT stimuliert wurde. Die Tiere wurden
mindestens eine halbe Stunde vor Beginn des Versuchs in den Versuchsraum
gebracht und gewogen. Mit Beginn des eigentlichen Versuchs wurde den Tieren
PBO (150 mg/kg, in 3 ml/kg Mazola®-Keimöl) intraperitoneal (i.p.) gespritzt. Nach 20
min wurde diese Applikation wiederholt. Dreißig Minuten nach der ersten PBO-
Applikation wurde den Tieren Bumetanid (10 mg/kg in 5 ml/kg HP-β-Cyclodextrin,
Kleptose®) i.v. über die Schwanzvene appliziert. Darauf wurde das jeweilige Tier
sofort in einen Makrolonkäfig (Typ II mit Deckel) gesetzt. Der Käfig war zuvor mit
einem vorab gewogenen Filterpapier ausgelegt worden, um die diuretische Wirkung
überwachen zu können. Dazu wurde das Filterpapier 15 min und 30 min nach der
Bumetanid-Applikation aus dem Käfig genommen und auf einer Feinwaage
gewogen. Bei Minute 30 nach Bumetanid-Applikation wurde zudem mit der ADT-
Bestimmung begonnen. An dem Stimulationstag, an dem das jeweilige Tier seinen
zehnten Stufe-5-Anfall entwickelt hatte und somit als voll gekindelt betrachtet wurde,
wurde 10 min nach Beginn der Stimulation eine retrobulbäre Blutentnahme zur
Bestimmung klinischer Parameter vorgenommen und die Versuchsphase für dieses
Tier beendet. Für die Blutentnahme wurde den Tieren mit einer Einwirkzeit von 5 min
Tetracain (2%) zur Anästhesie in die Augen getropft und anschließend mit einer
gekürzten und stumpfen heparinisierten Hämatokritkapillare, die in den medialen
Augenwinkel eingeführt wurde, der retrobulbäre Venenplexus punktiert. Dieser
Vorgang fand in einem anderen Raum als dem Versuchsraum statt. Das Blut
(ungefähr 0,5 - 1 ml) wurde in ein Serumröhrchen aufgefangen und anschließend
unverzüglich in die Klinik für Kleintiere (Prof. Dr. Andrea Tipold) der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover transportiert, wo es zeitnah weiterverarbeitet und
ausgewertet wurde (Rapid Lab 1260, Siemens, Deutschland). Die folgende
Abbildung soll das angewendete Versuchsdesign während der täglichen
Stimulationen im Aufkindling-Prozess veranschaulichen.
Material und Methoden
43
Abbildung 4.5: Schematische Darstellung des Versuchsdesigns.
Die in dieser Studie verwendeten Tiere waren zuvor zusätzlich mit Führungsrohren
implantiert worden, da diese Gruppe ursprünglich für Untersuchungen zur
antikonvulsiven Wirksamkeit von Bumetanid unter einer i.c.v.-Applikation verwendet
werden sollte. Ein Teil dieser Tiere konnte jedoch nach Abschluss dieser Studie noch
für diese Zwecke eingesetzt werden, wovon wiederum ein Teil im Verlauf der Arbeit
zur Bestimmung von Bumetanid im Gehirn und Plasma dekapitiert wurde.
4.2.4 Untersuchungen zur antikonvulsiven Wirksamkeit von Bumetanid im
Kindling-Modell
Grundsätzlich wurden die Tiere bei Studien zu antikonvulsiven Wirkungen von
Bumetanid mindestens eine halbe Stunde vor Beginn des Versuchs in den
Versuchsraum gebracht und zusammen in Makrolonkäfige des Typs III ohne Deckel
gesetzt. Die Applikationen der verwendeten Substanzen erfolgte dabei i.p. und i.v.
über die Schwanzvene. Eine Minute vor Beginn einer intravenösen Applikation wurde
das jeweilige Tier aus dem Käfig genommen und dessen Schwanz, zwecks
Durchblutungsförderung der Venen, in einen mit warmem Wasser gefüllten
Erlenmeyerkolben getaucht. Darauf wurde eine Venenverweilkanüle in die rechte
Material und Methoden
44
oder linke Schwanzvene eingeführt und mit einer aufgesetzten Spritze die jeweilige
Substanz injiziert. Nach Beendigung der Applikation wurde das Tier wieder in den
Käfig zurückgesetzt. Zu verschiedenen Zeitpunkten nach den Applikationen wurden
Verhaltensuntersuchungen durchgeführt (siehe dazu Kap. 4.2.6) bevor mit der ADT-
Bestimmung begonnen wurde. Dafür wurde das Tier in eine Glasbox gesetzt, über
die Kindling-Elektrode mit dem Stimulator verbunden und eine Minute später mit der
Stimulation begonnen. Dreißig Minuten nach Stimulationsbeginn wurde ein
Verhaltenstest angeschlossen. Grundsätzlich wurde an einem Tag lediglich eine
Stimulation vorgenommen und am nächsten Stimulationstag eine Vorkontrolle mit
Vehikel vorgenommen. Sofern die Nachentladungsschwelle nur eine 20%-Stufe von
dem Wert der vorherig bestimmten Schwelle abwich, wurde am folgenden
Stimulationstag (mindestens zwei Tage später) die Substanz(-en) appliziert.
Mindestens zwei Tage nach der Substanzapplikation erfolgte eine Nachkontrolle bei
der analog zur Vorkontrolle eine Vehikel-Applikation vorgenommen wurde. Am
darauffolgenden Stimulationstag wurde wiederum nur stimuliert, bevor mit einem
weiteren Versuchszyklus begonnen wurde. Die folgende Abbildung stellt schematisch
den grundsätzlichen Versuchsablauf der erfolgten Untersuchungen dar.
Material und Methoden
45
Abbildung 4.6: Schematische Darstellung des Versuchsablaufs bei Untersuchungen zur
antikonvulsiven Wirksamkeit. Der obere Abschnitt verdeutlicht das Schema eines kompletten
Versuchszyklus. Der untere Abschnitt beschreibt den Ablauf eines Behandlungstages.
4.2.4.1 Untersuchungen zur antikonvulsiven Wirksamkeit von Bumetanid und
PBO
Anknüpfend an die Untersuchungen zur antiepileptogenen Wirkung von Bumetanid
wurde hierbei zur Überprüfung einer antikonvulsiven Wirkung das gleiche
Versuchsdesign verwendet (siehe Kap. 4.2.3). Ziel war auch hier durch die
Applikation von PBO die HWZ von Bumetanid zu erhöhen, um dadurch
antikonvulsive Effekte von Bumetanid induzieren zu können. Ein Teil der Tiere wurde
unter Behandlung mit diesem Versuchsdesign zur Messung von Bumentanid im
Gehirn und im Plasma dekapitiert. Zusätzlich wurde eine weitere Gruppe von Tieren
analog diesem Versuchsschema behandelt. Hierbei handelte es sich jedoch um
ungekindelte Spraque-Dawley Ratten, die einer anderen Studie entstammten. Nach
Applikation der Substanzen wurden diese Tiere ebenfalls zwecks Messung der
Bumetanid-Konzentration dekapitiert (zum Ablauf siehe Kap. 4.2.5).
Material und Methoden
46
4.2.4.2 Untersuchungen der antikonvulsiven Wirkung einer intrazerebro-
ventrikulären Applikation von Bumetanid
Hierbei wurde bei voll gekindelten Tieren Bumetanid via Mikroinjektion
intrazerebroventrikulär (i.c.v.) in die beiden Seitenventrikel appliziert. In einem ersten
Schritt wurde von Bumetanid mit 0,1 molarer (M) Natronlauge (NaOH) eine 25
mMolare (mM) Lösung angefertigt. Diese Lösung diente als stock solution und wurde
für den Versuch mit artifiziellem Liquor (aCSF) auf eine gewünschte Konzentration
als working solution (pH 7,4) verdünnt. Ursprünglich sollten die Konzentrationen 100,
250 und 400 μMolar (μM) betragen, jedoch wurde aufgrund eines
Verdünnungsfehlers, der erst später aufgefallen war, eine zehnfach niedrigere
Konzentration verwendet. So betrugen die in den Versuchen verwendeten
Konzentrationen 10 μM, 25 μM und 40 μM. Eine Konzentration von 400 μM wurde
noch nachträglich angesetzt und die Lösung in einem späteren Versuch injiziert. Vor
Beginn der Versuchsreihe wurde die Bumetanid-Lösung, entsprechend dem
Zeitfenster von der frischen Anfertigung bis zur Applikation, auf ihre Stabilität
überprüft. Die Tiere wurden mindestens 30 min vor Versuchsbeginn in den
Versuchsraum gebracht und in Makrolonkäfige des Typs III ohne Deckel gesetzt,
sodass es ihnen möglich war, sich während der Applikation frei im Käfig zu bewegen
und aufzurichten. Jedes Mikroinjektionssystem bestand aus einer stählernen
Injektionskanüle (1 mm länger als das Führungsrohr, um das Dach der Hirnventrikel
zu durchstoßen), die über einen Polyethylenschlauch verbunden wurde, welcher
wiederum über ein 1 cm langes Stück Tygon-Schlauch mit einer
Mikroinjektionsspritze (5 μl) aus Borsilikat verbunden war. Nach Entfernung der
Mandrins aus den Führungsrohren wurden die Injektionskanülen eingeschoben und
zunächst eine Minute abgewartet, bevor mit der Applikation begonnen wurde. Darauf
wurden beidseits jeweils 2 μl in 0,5 μl-Schritten über einen Zeitraum von zwei
Minuten appliziert. Das injizierte Volumen wurde dabei sowohl anhand des
Vorwärtsflusses eines im Schlauch befindlichen Markerfarbstoffes (Thionin), welcher
durch Luftblasen und destilliertes Wasser von der eigentlichen Substanz getrennt
war, als auch mit der Skalierung an der Spritze abgeglichen. Nach Ende der
Mikroinjektion wurden die Kanülen für eine weitere Minute in den Führungsrohren
belassen. Während der gesamten Prozedur konnten sich die Tiere im Käfig frei
bewegen und wurden hinsichtlich eventuell auftretender Verhaltensänderungen, wie
Material und Methoden
47
Abwehrreaktion oder Fluchtverhalten, beobachtet. Nach Entfernung der
Injektionskanülen wurden die Mandrins wieder eingeschoben und die Tiere wieder in
die Käfige zurückgesetzt, bevor 5 min vor Stimulationsbeginn Verhaltensversuche
angeschlossen wurden. Anschließend wurde das Tier gewogen, für die Kindling-
Prozedur in die Glasbox gesetzt und über die Kindling-Elektrode mit dem Stimulator
verbunden, bevor 30 oder 60 min nach Ende der Mikroinjektion mit der Stimulation
begonnen wurde. Zusammenfassend ergaben sich in dieser Studie folgende
Versuchsdurchläufe:
Dosis von
Bumetanid bei Applikation von beidseits je
2 μl i.c.v.
Zeitpunkt der Applikation
vor Beginn der ADT-
Bestimmung in min
14,6 ng (bei Konzentration von 10 μM) 30
36,4 ng (bei Konzentration von 25 μM) 30
58,3 ng (bei Konzentration von 40 μM) 30
58,3 ng (bei Konzentration von 40 μM) 60
583 ng (bei Konzentration von 400 μM) 30
Tabelle 4.2: Versuchsdurchläufe unter i.c.v.-Applikation von Bumetanid.
Grundsätzlich wurde hier an einem Tag eine ADT-Bestimmung ohne Injektion
vorgenommen und am nächsten Stimulationstag (mindestens zwei Tage später) eine
Vorkontrolle mit einer Mikroinjektion des Vehikels vorgenommen. Sofern die
Nachentladungsschwelle nur eine 20%-Stufe von dem Wert der vorherig bestimmten
Schwelle abwich, wurde am folgenden Stimulationstag eine Mikroinjektion mit
Bumetanid vorgenommen. Mindestens zwei Tage nach der Substanzapplikation
erfolgte eine Nachkontrolle, bei der wiederum analog zur Vorkontrolle Vehikel
appliziert wurde. Am darauffolgenden Stimulationstag wurde wiederum nur stimuliert
bevor mit einem weiteren Versuchszyklus begonnen wurde. Die folgende Abbildung
soll schematisch den Versuchsablauf veranschaulichen.
Material und Methoden
48
In dem Versuchsdurchlauf mit einer Dosis von 583 ng Bumetanid wurden Tiere
verwendet, die aus der Studie zur antiepileptogenen Wirksamkeit von Bumetanid
stammten. Die restlichen Durchläufe wurden an Tieren vorgenommen, die
ausschließlich für den Zweck der Studie operiert und voll gekindelt worden waren.
Ein Teil dieser Gruppe wurde nach Mikroinjektion zur Bestimmung des Bumetanid-
Spiegels im Plasma und Gehirngewebe 30 bzw. 60 min nach Applikation dekapitiert
(zur Weiterverarbeitung der Proben siehe Kap. 4.2.5).
4.2.4.3 Untersuchung zu antikonvulsiven Wirkungen einer kombinierten
intravenösen Applikation von Bumetanid und BUM5 +/- Phenobarbital
Hierbei wurde die antikonvulsive Wirkung sowohl von Bumetanid als auch die seines
Derivats BUM5 evaluiert. Beide Substanzen wurden zusätzlich mit Phenobarbital
kombiniert, um zu untersuchen, ob durch diese Kombination die antikonvulsive
Wirkung von Phenobarbital verstärkt werden kann. Bumetanid wurde in HP-β-
Cyclodextrin, Kleptose® gelöst (10 mg/kg in 5 ml/kg). Dabei wurde der pH-Wert mit
0,1 M NaOH auf 7,3-7,4 eingestellt. BUM5 wurde ebenfalls in HP-β-Cyclodextrin
gelöst. Aufgrund eines im Vergleich zu Bumetanid abweichenden Mol-Gewichts,
wurden von BUM5, sofern nicht anders erwähnt, 13 mg/kg in 3 ml/kg gelöst (zur
Verringerung der absoluten applizierten Menge konnte aufgrund der besseren
Löslichkeit von BUM5 das Volumen des Lösungsmittels reduziert werden). Der pH-
Wert der Lösung wurde mit 0,1 M NaOH auf etwa 7 eingestellt (der pH-Wert musste
hierbei etwas niedriger gewählt werden, da die Gefahr bestand, dass BUM5 ab
einem Wert von 7,1 ausfiel). Phenobarbital wurde in Aqua dest. gelöst (sofern nicht
anders erwähnt 10 mg/kg in 1 ml/kg). Hierzu wurde bei der Einwaage aufgrund des
Reinheitsgrades der Substanz ein Umrechnungsfaktor von 1,09 berücksichtigt.
In einem ersten Schritt wurde überprüft, ob Bumetanid bei einmaliger Gabe eine
antikonvulsive Wirkung an voll gekindelten Tieren ausüben kann. Hierzu wurde den
Tieren Bumetanid 10 min vor Beginn der Stimulation i.v. verabreicht. Zehn Minuten
nach Stimulationsbeginn wurde an diesen Tieren eine retrobulbäre Blutentnahme zur
Plasmagewinnung vorgenommen (Zum Ablauf der Gewinnung der Blutprobe und der
Weiterverarbeitung siehe Kap. 4.2.5).
Material und Methoden
49
In einem weiteren Schritt wurde überprüft, ob Bumetanid bei einer zweimaligen
Applikation im Kindling-Modell antikonvulsiv wirkt. Dazu wurde Bumetanid 60 und 30
min vor Stimulationsbeginn verabreicht. Analog zu diesem Versuchsdesign wurde in
einem weiteren Versuchszyklus die Wirkung von BUM5 untersucht.
Zusammenfassend ergaben sich in dieser Studie folgende Versuchsdurchläufe:
Dosis von
Bumetanid in mg/kg i.v.
Zeitpunkt der Applikation vor Beginn
der ADT-Bestimmung in min
10 10
10 30 und 60
Dosis von
BUM5 in mg/kg i.v.
Zeitpunkt der Applikation vor Beginn
der ADT-Bestimmung in min
13 30 und 60
Tabelle 4.3: Versuchsdurchläufe unter einer Vorbehandlung mit Bumetanid bzw. BUM5.
Im nächsten Schritt wurde überprüft, inwieweit Bumetanid bzw. BUM5 in der Lage ist,
die antikonvulsiven Wirkungen von Phenobarbital zu verstärken. Zu diesem Zweck
wurden verschiedene Dosierungen von Phenobarbital evaluiert (5, 8, 10 und 20
mg/kg in 1 ml/kg Aqua dest.). Das Ziel bestand darin die Dosis von Phenobarbital so
zu wählen, mit der allein keine antikonvulsive Wirkung im Kindling-Modell beobachtet
werden kann. Zusammenfassend ergaben sich hierbei folgende Versuchsdurchläufe:
Dosis von
Phenobarbital in mg/kg i.v.
Zeitpunkt der Applikation vor Beginn
der ADT-Bestimmung in min
5 30
8 30
10 30
20 30
Tabelle 4.4: Versuchsdurchläufe unter einer Vorbehandlung mit Phenobarbital.
Material und Methoden
50
Nach Evaluierung einer für dieses Versuchsvorhaben geeigneten Dosis von
Phenobarbital wurde diese Substanz mit Bumetanid bzw. mit BUM5 kombiniert und
die antikonvulsive Wirkung dieser Kombination mithilfe verschiedener
Versuchsdesigns überprüft. Die folgenden Tabellen veranschaulichen in diesem
Zusammenhang alle durchgeführten Versuchsdurchläufe:
Dosis von Bumetanid und
Phenobarbital in mg/kg i.v.
Zeitpunkt der Applikation vor Beginn
der ADT-Bestimmung in min
10 und 10 30
10 und 10 60 (Bumetanid)
30 (Bumetanid+Phenobarbital)
Tabelle 4.5: Versuchsdurchläufe unter einer Vorbehandlung mit Bumetanid und Phenobarbital.
Dosis von BUM5 und Phenobarbital
in mg/kg i.v.
Zeitpunkt der Applikation vor Beginn
der ADT-Bestimmung in min
13 und 10 60 (BUM5)
30 (BUM5+Phenobarbital)
13 und 10 60 (BUM5)
30 (Phenobarbital)
15 (BUM5)
1,3 und 10 60 (BUM5)
30 (BUM5+Phenobarbital)
Tabelle 4.6: Versuchsdurchläufe unter einer Vorbehandlung mit BUM5 und Phenobarbital.
Anmerkung: Zu den Tierchargen, die im Rahmen dieses Projekts verwendet wurden,
konnte aus einem Lehrprojekt des Instituts eine weitere Charge voll gekindelten Tiere
miteinbezogen werden (mit ,,Bsc-11 Nummer‘‘ gekennzeichnet). Diesen Tieren war
zuvor eigenhändig eine Kindlingelektrode implantiert worden. Verwendet wurden
diese Tiere für die Versuche zur Findung einer geeigneten Dosis von Phenobarbital
Material und Methoden
51
(bei 5, 8 und 10 mg/kg) und bei einmaliger Applikation von Bumetanid und
Phenobarbital. Für die restlichen hier aufgeführten Versuchsdurchläufe wurden Tiere
verwendet die ausschließlich für diese Studien aufgekindelt worden waren.
4.2.5 Bestimmung von Bumetanid im Plasma und im Gehirngewebe nach
intravenöser und intrazerebroventrikulärer Applikation
Zur Bestimmung von Bumetanid im Plasma wurde mittels einer retrobulbären
Blutentnahme ca. 0,5 ml Blut in ein Eppendorf-Gefäß aufgefangen das zuvor zur
Hemmung der Blutgerinnung mit 10 μl einer EDTA-Lösung (Titriplex III, Merck)
vorbefüllt worden war. Die Probe wurde vorsichtig geschwenkt und die festen
Bestandteile aus dem Blut für drei Minuten bei 12.000 Umdrehungen (Eppendorf-
Centrifuge 5415 D) abzentrifugiert. Der entstandene Überstand wurde abpipettiert
und bis zur quantitativen Bestimmung von Bumetanid bei -30°C gelagert. Im
nächsten Schritt wurden 50 μl der aufgetauten Plasmaprobe zur Enteiweißung mit
150 μl Methanol vermischt und eine Minute auf einen Schüttler gestellt (Eppendorf-
Mixer 5432). Darauf wurde 5 min bei 14.000 Umdrehungen zentrifugiert und der
entstandene Überstand erneut eingefroren. Für die Messung mittels
Hochdruckflüssigkeitschromatographie (high pressure liquid chromatography, HPLC)
wurden die Proben 10 min vor Beginn der Analyse aufgetaut. Bei der HPLC handelt
es sich um ein Flüssigkeitschromatographie-Verfahren über das Substanzen durch
sogenannte Standards sowohl identifiziert als auch quantifiziert werden können.
Zuvor wurde ein Bumetanid-Standard mit einer bekannten Konzentration erstellt. Das
Prinzip dieser Methode besteht darin, dass Bumetanid im Plasma bzw.
Gehirngewebe in einer bestimmten Stärke mit der stationären Phase der Trennsäule
wechselwirkt. Abhängig von der Stärke dieser Wechselwirkung erscheint Bumetanid
nach einer Retentionszeit von 9,1 min und bei Plasmaproben 9,9 min bei
Gehirnproben am Ende der Trennsäule, wo es mit einem UV-Detektor (210 nm)
verglichen und in einem digitalisierten Chromatogramm dargestellt wird. Die
Peakfläche des Chromatogramms der gemessenen Probe wurde mit der Peakfläche
des Bumetanid-Standard-Chromatogramms verglichen, woraus mithilfe einer
mathematischen Formel die Konzentration von Bumetanid im Plasma bzw.
Gehirngewebe der Probe errechnet werden konnte. Zur Bestimmung von Bumetanid
im Gehirn wurden die Tiere dekapitiert. Nach Entnahme des Gehirns wurde der
Material und Methoden
52
Hippokampus, die Amygdala und der piriforme Kortex vom Restgehirn separiert und
bis zur weiteren Untersuchung eingefroren. Zur Analyse wurde zunächst ca. 50 mg
Hirngewebe in 1 ml Aqua dest. homogenisiert und anschließend für 20 min bei
10.000 Umdrehungen/min zentrifugiert. Der entstandene Überstand wurde über eine
Festphasen-Extraktion mittels einer Chromabond HR-X Säule aufgereinigt.
Bumetanid wurde durch Methanol (3x 1 ml) aus der Säule gelöst und das
entstandene Extrakt mit Stickstoff bei 50°C eingedampft. Der Rückstand wurde in
100 μl aCSF gelöst und die Probe anschließend zusammen mit der Mobilen Phase
(Phosphatpuffer: Acetonitril im Verhältnis 72:28) in die Trennsäule mit der stationären
Phase gepumpt. Die aufgetauten Plasmaproben wurden ebenfalls mit der Mobilen
Phase in die Trennsäule gepumpt (Mobile Phase hier: Phosphatpuffer: Acetonitril im
Verhältnis 70:30). Die Retentionszeiten im Chromatogramm betrugen für Bumetanid
10 min und für den internen Standard 14 min. Die Nachweisgrenze für Bumetanid
betrug im Hirngewebe 100 ng/g (entspricht einer Konzentration von 0,28 μM) und im
Plasma ungefähr 50 ng/ml.
4.2.6 Durchführung der Verhaltenstests
Fünf Minuten vor Beginn der Stimulationen wurde das jeweilige Tier für eine Minute
in ein leeres Kunststoffbecken (Open-Field) gesetzt. Während sich das Tier frei in
dem Becken bewegen konnte, wurde dabei sein Verhalten hinsichtlich
Hypolokomotion, Hyperlokomotion und Ataxie hin untersucht und die Beobachtung in
einem Scoring-System notiert (,,0‘‘ = nicht vorhanden, ,,1‘‘ = verdächtig, ,,2‘‘ =
vorhanden, ,,3‘‘ = intensiv). Darauf wurde das Tier aus dem Open-Field genommen
und direkt im Anschluss auf ein laufendes Rotarod gesetzt. Dieses Verfahren wurde
als Neurotoxizitätstest eingeführt, wobei man davon ausgeht, dass Tiere mit einer
verminderten motorischer Koordinationsfähigkeit und neurologischen Defiziten nicht
oder nur schlecht auf einem drehenden Stab balancieren können (DUNHAM und
MIYA 1957). So wurde hier notiert, ob sich das Tier für die Dauer von einer Minute
durchgängig auf dem Rotarod (12 Umdrehungen pro Minute) halten konnte, wofür
ihm drei Versuche gewährt wurden. Hatte das Tier dies geschafft, wurde dies mit
einem + vermerkt, andernfalls war ein - vorgesehen (mindestens einen Tag vor dem
ersten Versuchstag fand hierfür ein hinreichendes Vortraining ohne
Substanzapplikation statt). Diese Verhaltenstests wurden in den Kindling-Studien zur
Material und Methoden
53
antiepileptogenen Wirksamkeit von Bumetanid und zur antikonvulsiven Wirksamkeit
von Bumetanid und BUM5 grundsätzlich in gleicher Art und Weise durchgeführt.
Lediglich in den Untersuchungen zur antikonvulsiven Wirksamkeit von Bumetanid
bzw. BUM5 wurde zusätzlich 30 min nach Stimulationsbeginn ein einminütiger Test
auf dem Rotarod angeschlossen.
4.2.7 Perfusion/histologische Aufarbeitung der Gehirne
Nach Abschluss einer Versuchsreihe wurden die Gehirne der Tiere zur
histologischen Auswertung über den Sitz der Kindlingelektrode und der
Führungsrohre entnommen. Zuerst wurden die Tiere in eine tiefe Chloralhydrat-
Narkose versetzt (720 mg in 20 ml 0,9%ige NaCl-Lösung; 4 ml pro Tier i.p.). Nach
Verlust des Zwischenzehenreflexes bzw. deutlicher Senkung von Herzfrequenz und
Atmung wurden die Tiere in Rückenlage verbracht und mit Kanülen auf einer
Korkunterlage fixiert. Darauf wurde mit einer Schere Bauch- und Brusthöhle eröffnet
und das dabei abgesetzte Brustbein nebst anhängigen Haut- und Muskellappen mit
einer weiteren Kanüle weit nach kranial auf der Korkplatte fixiert. Das somit gut
sichtbare und leicht zugängliche Herz wurde aus dem Herzbeutel vorgelagert, eine
Knopfkanüle durch die Spitze der linken Herzkammer in die Aorta eingeführt und mit
einer Bulldog-Klemme in Position gehalten. Darauf wurde mit einer Schere die rechte
Vorkammer vorsichtig eröffnet. Über einen Schlauch mit dem die Knopfkanüle
verbunden war, erfolgte mittels einer Pumpe eine Vorspülung mit ungefähr 80 ml
einer 0,01 M phosphatgepufferten Lösung destillierten Wassers, bis das Tier
weitestgehend entblutet war. Gleichzeitig wurde an der zuvor eröffneten rechten
Vorkammer das ausfließende Blut und Perfusat kontinuierlich abgesaugt. Als
nächster Schritt wurde ebenfalls mittels einer Pumpe, unter Vermeidung von
etwaigen Luftblasen im Schlauchsystem, 300 ml einer 4%igen (0,1 M phosphat-
gepufferten) Paraformaldehyd-Fixationslösung in den Kreislauf des Tieres eingespült.
Das über die rechte Vorkammer entweichende Perfusat wurde dabei ebenfalls
mithilfe eines Schlauchs kontinuierlich abgesaugt. Nach Beendigung der Perfusion
wurde der Elektrodenaufbau mit einer Knochenzange von der Schädeldecke entfernt
und nach Absetzen des Kopfes und Eröffnung der Schädelhöhle das Gehirn
vorsichtig entnommen. Die Gehirne wurden darauf unverzüglich, zunächst für etwa
24 Stunden in einer (0,1 M phosphatgepufferten) 10%igen Zuckerlösung und darauf
Material und Methoden
54
bis zum Schneiden in einer (0,1 M phosphatgepufferten) 30%igen Zuckerlösung im
Kühlschrank (5°C) gelagert.
4.2.8 Lokalisationsbestimmung der Kindlingelektrode und der Führungsrohre
Mit einem Mikrotom wurde von jedem Gehirn 52 μm dicke Schnitte im Bereich der
Seitenventrikel (sofern dem Tier zuvor Führungsrohre implantiert worden waren) und
im Bereich der BLA angefertigt. Die Schnitte wurden in einer 0,1 M
phosphatgepufferten Lösung aufgefangen und dabei in zwei Serien aufgeteilt. Somit
entsprach der Abstand zwischen zwei Schnitten einer Serie 104 μm. Eine Serie
wurde darauf mit Thionin gefärbt und die andere als Reserve aufbewahrt. Die
Schnitte wurden unter Verwendung einer Chromgelatine-Lösung mit einem Pinsel auf
Objektträger aufgezogen. Nach der Trocknung der Schnitte über Nacht bei
Raumtemperatur wurde eine Nisslfärbung der Schnitte mit Thionin vorgenommen.
Thionin hat die Eigenschaft, dass es in Zellen selektiv die Stapel des
endoplasmatischen Retikulums (Nisslschollen) anfärbt und dadurch Neurone, die im
Vergleich zu Gliazellen deutlich mehr Nisslschollen aufweisen, stärker angefärbt
werden. Dies hat zur Folge, dass dadurch die verschiedenen Hirnareale gut
voneinander abgesetzt dargestellt werden, was eine einfache Orientierung beim
Betrachten des Schnittes ermöglicht. Nach der Färbung wurden die Schnitte
unverzüglich mit Eindeckmedium und einem Deckgläschen eingedeckt.
In der histologischen Auswertung wurde die gefärbte Schnittserie unter einem
Durchlichtmikroskop bei 25-, 100- und 200facher Vergrößerung untersucht und
zunächst, sofern vorhanden, die Stichkanäle der Führungsrohre gesucht. Zudem
wurde bei allen Tieren der tiefste Punkt des Stichkanals der Kindlingelektrode
gesucht. Anschließend wurden die Koordinaten beider Lokalisationen relativ zu
Bregma anhand eindeutig sichtbarer anatomischer Strukturen und mithilfe des
stereotaktischen Atlas nach PAXINOS und WATSON (2007) errechnet.
Material und Methoden
55
Untersuchungen zur Wirkung von Bumetanid und BUM5 nach einem 4.3
pilokarpin-induzierten SE im PTZ-Krampftest
4.3.1 Induktion eines SE mittels Pilokarpin
Nach der Ankunft der Tiere (weibliche NMRI Mäuse, Gewicht bei Ankunft 22-22 g)
wurde vor Beginn der SE-Induktion eine mindestens einwöchige Adaptionszeit
eingehalten. Die anschließenden Versuche fanden grundsätzlich nur vormittags statt.
Mindestens eine Stunde vor Beginn der ersten Pilokarpin-Injektion wurden die Tiere
in den Versuchsraum gestellt, gewogen und mit einem Filzstift auf der
Schwanzoberseite markiert. Darauf wurden die Tiere einzeln in Makrolonkäfige des
Typs II gesetzt. Das Applikationsvolumen der im Versuch verwendeten Substanzen
betrug 10 ml/kg. Eine halbe Stunde vor Beginn der ersten Pilokarpin-Injektion
erhielten die Tiere eine einmalige i.p.-Injektion von Methylskopolamin (1 mg/kg, 5 mg
in 50 ml Aqua dest. gelöst), um die peripheren Wirkungen von Pilokarpin zu
antagonisieren. Zur Induktion eines SE wurde der Acetylcholin-Antagonist Pilokarpin
verwendet. Die i.p.-Applikation von Pilokarpin (10 mg/kg, pro 10 mg in 1 ml Aqua ad
injectabilia gelöst) erfolgte fraktioniert in 20 minütigen Intervallen bis zum Auftreten
eines sich selbst erhaltenden SE. Dieser Zustand ist gekennzeichnet durch
anhaltende limbische oder generalisierte Krampfaktivität. Pro Tier wurde höchstens
zehnmal Pilokarpin injiziert. Nach Ablauf eines SE von 90 min wurde zu dessen
Abbruch einmalig Diazepam (10 mg/kg) i.p. appliziert. Diazepam wurde als
Injektionslösung (5 mg/ml) in Fertigampullen (Faustan®) bezogen und in einem
Verhältnis von 1:5 mit einer Stammlösung (6,56 ml unvergällter Ethanol mit NaCl auf
50 ml aufgefüllt) vermischt. Zur Kreislaufstabilisierung erhielten die Tiere zudem
subkutan 0,5 ml einer 0,9%igen NaCl-Lösung. Diese Behandlung wurde bis 48
Stunden nach dem Versuch zweimal täglich wiederholt. Des Weiteren wurden den
Tieren solange handelsüblicher Baby-Brei (Milupa®) angeboten, bis sie wieder ein
normales Futteraufnahmeverhalten aufwiesen. Den Tieren der Kontrollgruppen
wurde im Versuch anstatt Pilokarpin solange eine 0,9%ige NaCl-Lösung verabreicht,
bis ungefähr die Hälfte der anderen Tiere einen SE entwickelt hatte. Sofern ein Tier,
trotz zehnmaliger Pilokarpin-Applikation während des Versuchs keinen SE entwickelt
hatte, wurde es für die anschließenden Versuche nicht mehr weiterverwendet.
Material und Methoden
56
4.3.2 Durchführung des Pentylentetrazol-Krampftests
Im Rahmen dieser Studie wurde das Anfallsverhalten verschiedener
Versuchsgruppen unter einer PTZ-Infusion untersucht. Hierbei wurden zum einen
nicht-epileptische Tiere (Kontrolltiere ohne SE) und zum anderen Tiere, die 24 h, 48
h und eine Woche zuvor einen pilokarpin-induzierten SE durchlaufen hatten, mit
Bumetanid vorbehandelt, bevor ein PTZ-Krampftest vorgenommen wurde. In einem
weiteren Versuchsdurchlauf wurde an nicht-epileptischen Tieren (Kontrolltieren ohne
SE) und an Tieren 24 h nach SE das Anfallsverhalten unter einer Vorbehandlung mit
dem Bumetanid-Derivat BUM5 untersucht. Die folgende Abbildung verdeutlicht
schematisch das in dieser Studie verwendete Versuchsdesign:
Abbildung 4.7: Schematische Darstellung des Versuchsdesigns.
Aufgrund der Mortalität der Tiere während des Krampftests wurden die
Versuchsdurchläufe mit mehreren Tiergruppen wiederholt. Folgende Tabelle zeigt die
in dieser Studie mit Bumetanid bzw. BUM5 behandelte Tiergruppen. Der Begriff +SE
bezeichnet Tiere die vor dem Krampftest einen SE durchlaufen hatten, wohingegen -
SE die nicht-epileptischen Kontrolltiere bezeichnet.
Material und Methoden
57
Bumetanid Vehikel BUM5
Zeitpunkt
PTZ-Test
+ SE - SE + SE - SE + SE - SE
24 h x x x x x x
48 h x x x x - -
1 Woche x x x x - -
Tabelle 4.7: Darstellung der in dieser Studie untersuchten Tiergruppen.
Alle Krampftests fanden grundsätzlich vormittags statt. Mindestens eine Stunde vor
Beginn der Versuche wurden die Tiere in den Versuchsraum verbracht. Für die
Injektion wurden die Tiere gewogen, darauf in einen Fixationskäfig verbracht und
eine i.v.-Applikation der Substanzen über die laterale Schwanzvene vorgenommen.
Hierzu wurde eine stumpfe Injektionskanüle (Terumo, 26G), welche mit einem
ungefähr 15 mm langen transparenten Polyethylenschlauch verbunden war, auf eine
mit Substanz befüllte 1 ml-Spritze aufgesetzt. Das Ende des Schlauches wurde mit
einer Injektionskanüle (Terumo, 27G) verbunden, welche in die Schwanzvene
eingeführt wurde. Das Applikationsvolumen aller dabei verwendeten Substanzen
betrug 10 ml/kg.
Bumetanid (10 mg/kg) wurde dabei in einer Menge von 5 mg in 1,9 ml NaOH (0,1 M)
und 3,1 ml Aqua dest. gelöst. Aufgrund eines mitunter auftretenden
Abwehrverhaltens der Tiere bei Applikation der alkalischen Bumetanid-Lösung,
wurde bei der Suche nach einer geeigneten Alternative HP-β-Cyclodextrin
(Kleptose®) als Lösungsmittel für BUM5 ausgewählt. BUM5 (13 mg/kg, entspricht 10
mg/kg Bumetanid) wurde in einer Menge von 6,5 mg in 3 ml HP-β-Cyclodextrin unter
Rühren vorgelöst und mit NaOH (0,1 M) auf ca. pH 7,1 eingestellt (lag der pH-Wert
darüber bestand die Gefahr einer Ausfällung). Anschließend wurde mit HP-β-
Cyclodextrin auf 5 ml aufgefüllt. Zuvor war BUM5 in Ethanol und Solutol gelöst und
appliziert worden. Aufgrund der beobachteten antikonvulsiven Wirkung von Ethanol
und Solutol während des PTZ-Krampftests konnten die damit behandelten Tiere
jedoch nicht in die anschließende Auswertung miteinbezogen werden.
Material und Methoden
58
Die in dieser Studie verwendeten Lösungsmittel wurden zudem den Kontrollgruppen
als Vehikel appliziert. Je eine Gruppe mit SE wurde mit Vehikel behandelt, während
je eine Gruppe ohne SE einem zuvor durchlaufenen SE mit Vehikel vorbehandelt
wurde. Nach erfolgter i.v.-Applikation wurden die Tiere unverzüglich aus dem
Fixationskäfig befreit und wieder in ihre Gruppenkäfige gesetzt. Nach Ablauf der
Vorbehandlungszeit von 20 min (Bumetanid) bzw. 30 min (BUM5) wurden die Tiere
erneut in den Fixationskäfig verbracht. Darauf wurde in die Schwanzvene eine
Kanüle (Terumo 27 G) eingeführt, die über einen Polyethylenschlauch mit einer
Spritze (10 ml) verbunden war, welche wiederum mit PTZ befüllt in eine
Infusionspumpe (Harvard Apparatus) eingespannt war. PTZ war zuvor in einer
Konzentration von 1% in Aqua dest. gelöst worden. Nachdem der korrekte Sitz der
Kanüle durch ausstreichen des Blutes in den Schlauch überprüft worden war, wurde
die Kanüle mit einem schmalen Streifen Klebeband (Tesa-Krepp®) am Schwanz
fixiert. Hierauf wurde das Tier aus dem Käfig in eine transparente Kunststoffschüssel
gesetzt (Durchmesser: 30 cm, Höhe: 20 cm), jedoch weiterhin am Schwanz
festgehalten. Nach dem Umsetzen wurde unverzüglich die Infusion
(Infusionsgeschwindigkeit 300 μl/min) gestartet und gleichzeitig von einer Hilfsperson
eine Stoppuhr gestartet. Während der beobachteten Krampfaktivität wurden sechs
verschiedene Krampfstadien erfasst und von der Hilfsperson die entsprechende Zeit
in Sekunden notiert. Die Krampfstadien umfassten:
1. Erster Myoclonus (first myoclonic twitch)
2. Zweiter Myoclonus (further myoclonic twitch)
3. Clonus ohne Verlust der Stellreflexe (clonic seizure without loss of righting
reflexes)
4. Clonus mit Verlust der Stellreflexe (clonic seizure with loss of righting reflexes)
5. Vorderbeintonus (Forelimb tonus)
6. Hinterbeintonus (Hindlimb tonus)
Sobald das Stadium des Hinterbeintonus erreicht wurde, wurde die Infusion
gestoppt, andernfalls wurde die Infusionsdauer auf maximal 120 Sekunden begrenzt.
Material und Methoden
59
Die Berechnung der verbrauchten Menge an PTZ wurde mithilfe des Programms
Excel (Microsoft) durchgeführt, indem die Infusionsgeschwindigkeit, das Gewicht der
Tiere und die gemessenen Zeitpunkte zueinander in Relation gesetzt wurden. Die so
erhaltenen Werte wurden für die statistische Auswertung weiterverwendet.
Statistische Berechnungen 4.4
Alle statistischen Berechnungen wurden mit dem Programm GraphPad Prism® 5.0
(La Jolla, CA, USA) für Windows durchgeführt. Die Daten wurden als Mittelwert ±
dem Standardfehler (SEM; Standard Error of the Mean) angegeben. Alle
statistischen Tests wurden zweiseitig durchgeführt. Das Signifikanzniveau wurde auf
p<0,05 festgelegt. In den Studien im Kindling-Modell wurde bei parametrischen
Werten eine einfaktorielle Varianzanalyse für wiederholte Messungen (One-Way-
ANOVA for repeated measures) bzw. eine zweifaktorielle Varianzanalyse (Two-Way-
ANOVA) durchgeführt. Als Post-hoc Test wurde Dunnett’s Test für multiple
Vergleiche (for multiple comparison) verwendet. Für nicht-parametrische Daten
wurde entsprechend der Friedman-Test durchgeführt. Als Post-hoc Test wurde
hierbei der Dunn’s Test verwendet. In den Studien im PTZ-Test nach pilokarpin-
induziertem SE wurde ebenfalls eine einfaktorielle Varianzanalyse (One-Way-
ANOVA) angewendet. Als Post-hoc Test wurde der Dunnett’s Test für multiple
Vergleiche (for multiple comparison) oder ein Student’s t-Test durchgeführt.
Ergebnisse
60
5 Ergebnisse
Lokalisation der Elektroden und Führungsrohre 5.1
Insgesamt wurden für die Kindling-Studien 37 Ratten mit Kindlingelektroden und
davon 23 Tiere zusätzlich mit Führungsrohren in die Gehirnventrikel implantiert.
Zusätzlich konnten aus einer anderen Studie weitere 8 Tiere hinzugefügt werden, die
bereits zuvor elektrodenimplantiert und voll gekindelt worden waren. Für die
histologische Auswertung der Elektroden- und Führungsrohrlokalisation konnten
nach Abschluss der Versuche aus verschiedenen Gründen nicht alle Tiere
miteinbezogen werden. Einer der Gründe bestand darin, dass einige Tiere zur
Bestimmung der Gehirnkonzentration von Bumetanid dekapitiert wurden und somit
das Gehirn zur weiteren Auswertung nicht mehr zur Verfügung stand. Weitere
Gründe waren vorzeitige Verluste des Elektrodenaufbaus oder eine zum Teil deutlich
fortgeschrittene Schädigung der Gehirnbereiche um die Elektrode, sodass in diesen
Fällen die exakte Lokalisation der Elektrode zuweilen entweder gar nicht oder
allenfalls nur abgeschätzt werden konnte. Zusätzlich wurden 11 Tiere für
weiterführende Studien, die über den Rahmen der Anfertigung dieser Ph.D.-Arbeit
hinausgingen weiterverwendet und dementsprechend nicht in die Auswertung
miteinbezogen. Insgesamt konnte bei 14 Tieren der Sitz der Elektrode korrekt
überprüft und bei allen für richtig befunden werden. Die folgenden Abbildungen
beschreiben den Sitz der Elektroden der untersuchten Gehirne. Zudem konnte bei
insgesamt 10 Tieren der Sitz der Führungsrohre in den Hirnventrikeln validiert
werden. Diese befanden sich rostrokaudal zwischen +0,36 bis -0,72 mm relativ zu
Bregma.
Ergebnisse
61
Abbildung 5.1: Zur Darstellung der Lokalisation der Kindling-Elektrode wurden Ausschnitte der
basolateralen Amygdala (BLA) gewählt. Koronarschnitt des Rattengehirns, mod. nach
PAXINOS und WATSON (2007).
Abbildung 5.2: Darstellung der Lokalisation der Kindling-Elektrode bei den 14 auswertbaren
Tieren. Ausschnitte mod. nach PAXINOS und WATSON (2007).
Ergebnisse
62
Untersuchungen zur antiepileptogenen Wirksamkeit von Bumetanid im 5.2
Kindling-Modell
5.2.1 Untersuchung der antiepileptogenen Wirksamkeit von Bumetanid unter
einer Vorbehandlung mit PBO
Basierend auf der Arbeit von BRANDT et al. (2010a), in der gezeigt werden konnte,
dass mit Bumetanid in einem Modell zur Untersuchung von Antiepileptogenese
krankheits-modifizierende Effekte erzielt werden können, sollte mit einer Folgestudie
an diese Ergebnisse angeknüpft werden. Zusätzlich erfolgte eine Ko-Administration
von PBO, mit dem Ziel über eine Verlängerung der HWZ von Bumetanid dessen
Gehirnkonzentration zu erhöhen. Sowohl die Substanzgruppe als auch die
Kontrollgruppe bestand jeweils aus 4 Tieren. Ursprünglich waren mehr Tiere für die
Studie geplant, jedoch traten in der postoperativen Erholungsphase bei zwei Tieren
Verluste des Elektrodenaufbaus auf, sodass diese Tiere euthanasiert wurden und für
die Studie nicht mehr zur Verfügung standen. Zudem musste ein weiteres Tier (aus
der Kontrollgruppe) kurze Zeit nach Beginn der Untersuchung aufgrund eines
Verlustes des Elektrodenaufbaus aus der Studie genommen werden, sodass dieses
Tier nur teilweise in die Auswertung miteinbezogen werden konnte. In den folgenden
Abbildungen ist die Kindling-Entwicklung beider Gruppen dargestellt. Mehrere
Wochen nach Abschluss der Studie wurde bei der Perfusion der Tiere festgestellt,
dass das während der Aufkindling-Phase applizierte Öl bei keinem der Tiere
resorbiert worden war. So konnten sowohl bei den Tieren der Kontrollgruppe als
auch bei der behandelten Gruppe großen Mengen Öl in der Bauchhöhle vorgefunden
werden.
Ergebnisse
63
Vergleich der Kindling-Entwicklung
0
1
2
3
4
5
Kontrollgruppe
PBO+Bumetanid
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14Stimulationstag
An
falls
sch
wer
e
0
1
2
3
4
5
Kontrollgruppe
PBO+Bumetanid
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Stimulationstag
Anf
alls
schw
ere
Abbildung 5.3: Oben: Verlauf der Kindling-Entwicklung der PBO+Bumetanid-Gruppe (n=4) im
Vergleich zur Kontrollgruppe (n=4; ab Tag 5 n=3) bis zum 14. Stimulationstag, anhand der
Anfallsschwere eingeteilt. Unten: Verlauf der Kindling-Entwicklung beider Gruppen bis zum
ersten Stufe 5 Anfall, anhand der Anfallsschwere eingeteilt.
Ergebnisse
64
Kontrollg
ruppe
PBO+Bum
etan
id0
5
10
15
An
zah
l der
Sti
mu
lati
on
en
Abbildung 5.4: Anzahl der Stimulationen bis die Tiere zum ersten Mal das Stadium 5 erreicht
hatten. Gruppen sind hier zusammengefasst (Mittelwerte ± SEM).
Hierbei wurde festgestellt, dass der Aufkindling-Prozess bis zum Erreichen des
ersten Stufe 5 Anfalls für die PBO+Bumetanid-Gruppe (Ø 7,3 Tage) gegenüber der
Kontrollgruppe (Ø 9,3 Tage) nicht verzögert, sondern verkürzt war. Unter
Berücksichtigung der Anfallsschwere und der Anzahl der Stimulationstage ergab ein
Two-Way-ANOVA-Test zwar einen hoch signifikanten Unterschied zwischen den
beiden Gruppen (***p<0,001), jedoch konnten mittels eines post-hoc-Tests keine
signifikanten Unterschiede an den einzelnen Versuchstagen ermittelt werden, was
wohl auf die nur geringe Tierzahl zurückgeführt werden kann. Des Weiteren wurde
sowohl die kumulative Anfallsdauer (cSD = zusammengefasste Dauer der
motorischen Anfallsaktivität nach Bestimmung der initialen ADT bis zum Erreichen
eines bestimmten Anfallstyps, dessen Dauer hier nicht dazugezählt wird) als auch die
kumulative Nachentladungsdauer (cADD = die aufaddierte Zeit der
Nachentladungsdauer im EEG dieser Anfälle) bis zum Erreichen der Anfallsstadien 4
und 5 bestimmt. Die cADD1 und die cADD2 waren dabei identisch. Das Stadium 2
und 3 wurde in beiden Gruppen (gleichermaßen) häufig übersprungen, sodass
hierfür keine cSD und cADD berechnet wurden. Es konnte festgestellt werden, dass
für alle gemessenen Parameter augenscheinlich ein Trend hin zu einem pro-
epileptogenen Effekt durch Bumetanid vorlag.
Ergebnisse
65
cSD bis zum Stadium 4
Kontrollg
ruppe
PBO+Bum
etan
id
0
50
100
150
200
(S
ek.)
cADD bis zum Stadium 4
Kontrollg
ruppe
PBO+Bum
etan
id
0
50
100
150
200
(Sek
.)
cSD bis zum Stadium 5
Kontrollg
ruppe
PBO+Bum
etan
id
0
50
100
150
200
(S
ek.)
cADD bis zum Stadium 5
Kontrollg
ruppe
PBO+Bum
etan
id
0
50
100
150
200
(Sek
.)
Abbildung 5.5: Graphische Darstellung der kumulativen Anfallsdauer (cSD) und der
kumulativen Nachentladungsdauer (cADD) beider Versuchsgruppen bis zum Erreichen des
Stadiums 4 und 5 (Mittelwerte ± SEM in Sek. =Sekunden).
5.2.2 Einfluss der Behandlung auf die Urinproduktion und den
Elektrolythaushalt
Während der Behandlungsphase wurde zwischen Substanzapplikation und Beginn
der Stimulation zu zwei Zeitpunkten die Urinproduktion gemessen, um die diuretische
Wirkung von Bumetanid als Marker für das Vorhandensein der intakten Substanz im
Plasma verwenden zu können. Dabei hat sich gezeigt, dass die behandelte Gruppe
über die gesamte Versuchsdauer (bis jedes Tier an 10 Stimulationstagen einen Anfall
der Stufe 5 entwickelt hatte) eine gegenüber der Kontrollgruppe ohne Bumetanid
hoch signifikant erhöhte Urinproduktion zeigte (***p<0,001).
Ergebnisse
66
Urinproduktion nach 15 min
0 5 10 15 20 25
1
2
3
4
5
6
Tag
Uri
ngew
icht
(g)
Urinproduktion nach 30 min
0 5 10 15 20 250
2
4
6
8
10
Tag
Uri
ngew
icht
(g)
Kontrolle Bumetanid
***
***
Abbildung 5.6: Vergleich der Urinproduktion beider Gruppen 15 min und 30 min nach
Bumetanid-Applikation in Gramm (g) (Mittelwerte ± SEM; Student’s t-test;***p<0,001).
Bei jedem Tier wurde bei Abschluss der Behandlungsphase (d.h. nachdem es zum
zehnten Mal das Krampfstadium 5 erreicht hatte) eine Blutprobe genommen, um das
Plasma auf verschiedene klinische Parameter zu untersuchen. Die folgende Tabelle
beinhaltet die hierbei gemessenen Werte. Dabei ist auffällig, dass bei der mit PBO
und Bumetanid behandelten Gruppe der pH-Wert, pCO2, BE und Bikarbonat
(Student’s t-test; p=0,0733) zur Kontrollgruppe erhöht waren, während die Werte des
pO2 (Student’s t-test; *p<0,05), von Chlorid (Student’s t-test; p=0,0522) und Kalium im
Vergleich zur Kontrollgruppe erniedrigt waren. Zum Vergleich werden die
gemessenen Parameter einer naiven Tiergruppe die nicht im Versuch war aufgeführt.
Ergebnisse
67
Parameter naiv
n=3
Kontrollgruppe
aus der Studie
n=3
PBO+Bumetanid
n=4
pH 7,43 ± 0,01 7,43 ± 0,03 7,48 ± 0,02 (↑)
pCO2
(mmHg) 38,27 ± 1,95 36,27 ± 0,90 39,68 ± 1,27 (↑)
pO2
(mmHg) 57,53 ± 3,26 50,60 ± 2,96 40,60 ± 1,28 (↓)
Bikarbonat
(mmol/l) 24,87 ± 0,62 23,77 ± 1,25 28,63 ± 1,59 (↑)
BE
(mmol/l) 0,77 ± 0,41 -0,03 ± 1,66 4,73 ± 1,62 (↑)
Natrium
(mmol/l) 142,70 ± 0,32 144,30 ± 1,36 146,40 ± 1,35
Kalium
(mmmol/l) 5,83 ± 0,19 5,20 ± 0,10 5,05 ± 0,32 (↓)
Kalzium
(mmol/l) 1,30 ± 0,02 1,30 ± 0,01 1,28 ± 0,02
Chlorid
(mmol/l) 105,30 ± 0,33 106,00 ± 1,53 100,00 ± 1,68 (↓)
Anorg.
Phosphat
(mmol/l)
1,55 ± 0,09 0,83 ± 0,09 1,29 ± 0,10
Tabelle 5.1: Darstellung der gemessenen klinischen Blut-Parameter. Bei der Spalte ,,naiv‘‘ handelt es sich um Tiere die nicht aus dieser Studie stammten. Es ergaben sich (bis auf den
Wert von PO2) keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontroll- und der
PBO+Bumetanid-Gruppe auf dem p<0,05-Niveau, aber Trends, die mit Pfeilen markiert sind.
Grundsätzlich konnte mit diesem hier angewendeten Versuchsdesign ein eher pro-
epileptogener Effekt durch Bumetanid beobachtet werden. Hierbei bestand die
Überlegung, dass NKCC1 im Kindling-Prozess unter Umständen noch gar nicht
ausreichend hochreguliert sein könnte, infolgedessen Bumetanid in diesem Modell
Ergebnisse
68
unter Umständen (u.U.) daher gar nicht antiepileptogen wirken kann. Aus diesem
Grund wurden in den Folgestudien ausschließlich voll gekindelte Tiere verwendet
und daran Untersuchungen zu antikonvulsiven Wirkungen vorgenommen.
Untersuchungen zu antikonvulsiven Wirkungen von Bumetanid im 5.3
Kindling-Modell
In diesem Kapitel werden zu den Mittelwerten für ADT je nach Datenlage im
Einzelfall zusätzlich die SS und die Mittelwerte für SD1, SD2, ADD1 und ADD2
aufgeführt. Als Maß für antikonvulsive Effekte wurde eine signifikante Erhöhung der
ADT, als auch signifikante Erniedrigungen von SD1, SD2, ADD1, ADD2 und der SS
im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle angesehen.
5.3.1 Untersuchungen zu einer i.v.-Applikation von Bumetanid
Bumetanid (10 mg/kg in 5 ml/kg HP-β-Cyclodextrin) wurde hier, entsprechend der
kurzen HWZ von ungefähr 10 min bei der Ratte (BUSCH et al. 1979), 10 min vor
Bestimmung der ADT i.v. appliziert. Die Ergebnisse von zwei durchgeführten
Versuchsdurchläufen wurden hierbei zusammengefasst und sind im Folgenden als
Mittelwerte aufgeführt. Im ersten Durchlauf befanden sich 5 Tiere, wohingegen im
zweiten Durchlauf 4 Tiere verwendet wurden. Die Tiere waren mit Führungsrohren
implantiert, da ursprünglich geplant war, sie zuerst in den Studien zur Wirkung einer
i.c.v.-Applikation von Bumetanid zu verwenden. Zur Evaluierung der Plasmawerte
von Bumetanid wurde bei jedem Tier 15 min nach Beginn der Stimulation eine
retrobulbäre Blutentnahme vorgenommen und mittels HPLC-Verfahren der
entsprechende Wert ermittelt.
Plasmawerte aus zwei Versuchsdurchläufen
Die gemessenen Plasmawerte von Bumetanid betrugen im 1. Durchlauf (n=5) 1,20
μg/ml (± 0,53) und im 2. Durchlauf (n=4) 1,22 μg/ml (± 0,15). Hinsichtlich der ADT
und der SS konnte kein signifikanter antikonvulsiver Effekt gegenüber der Vor- und
Nachkontrolle und Applikation der entsprechenden Vehikel nachgewiesen werden
(siehe Abb. 5.7).
Ergebnisse
69
ADT
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
�ASS
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
1
2
3
4
5
Kra
mp
fsta
diu
m
Abbildung 5.7: Mittelwerte aus zwei Versuchsdurchläufen unter einer i.v.-Vorbehandlung von
Bumetanid (10 mg/kg i.v.) im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle für die ADT (in μA ± SEM)
und die SS (nach Stadien dargestellt).
5.3.2 Untersuchungen zu einer kombinierten Applikation von Bumetanid und
PBO
Es bestand die Annahme, dass bei voll gekindelten Ratten NKCC1 stärker exprimiert
sein könnte als während des Kindling-Prozesses, wodurch Bumetanid eine bessere
Möglichkeit hätte, NKCC1 effektiv zu blocken. Aus diesem Grund wurde analog zur
Untersuchung auf antiepileptogene Wirkung auch hier mittels des Cytochrom P450–
Inhibitors PBO versucht, die Halbwertszeit von Bumetanid zu erhöhen, um bis zur
Stimulation vermehrt intaktes Bumetanid im Kreislauf zu erhalten. Dazu wurde PBO
(150 mg/kg in 3 ml/kg Keimöl) 20 und 10 min vor Bumetanid i.p. appliziert und
Bumetanid (10 mg/kg in 5 ml/kg HP-β-Cyclodextrin) i.v. über die Schwanzvene 30
min vor Beginn der Stimulation verabreicht. Zusätzlich wurde 15 und 30 min nach
Applikation von Bumetanid die Urinproduktion gemessen, um die Diurese als Marker
für das Vorhandensein der intakten Substanz im Körper überwachen zu können. Bei
der ADT-Bestimmung konnten für keinen gemessenen Parameter signifikante
antikonvulsive Effekte beobachtet werden (Abb. 5.8). 15 min nach Beginn der ADT-
Bestimmung, zu einem Zeitpunkt an dem bereits die SD2-Phase für die Tiere
beendet war, wurde eine retrobulbäre Blutentnahme vorgenommen. Die
Ergebnisse
70
gemessenen Plasmawerte der Tiere (n=5) betrugen 0,37 μg/ml (±0,05). Im Mittel
konnte eine deutlich sichtbare Zunahme der Urinproduktion im Vergleich zur Vor- und
Nachkontrolle beobachtet werden. Jedoch zeigte 1 Tier bei einem Plasmawert von
0,41 μg/ml innerhalb der Dauer der Messungen keine Urinproduktion, wodurch bei
der statistischen Auswertung keine Signifikanz zur Vor -und Nachkontrolle festgestellt
werden konnte (Abb. 5.9).
ADT
Vorkontro
lle
PBO + B
UM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
�A
SS
Vorkontro
lle
PBO+BUM
Nachko
ntrolle
1
2
3
4
5
Kra
mp
fsta
diu
m
Abbildung 5.8: Mittelwerte unter einer Vorbehandlung von 2x PBO (150 mg/kg) i.p. und
Bumetanid (10 mg/kg) i.v. (± SEM; n=5) im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle für die ADT (in
μA) und SS (nach Stadien dargestellt).
Urinproduktion
VorkontrollePBO+BumetanidNachkontrolle
1
2
3
4
5
6
2010 30 40min
Uri
ng
ewic
ht
(g)
Abbildung 5.9: Urinproduktion 15 und 30 min nach Applikation 2x PBO (150 mg/kg) i.p. und
Bumetanid (10 mg/kg) i.v. (n=5); Mittelwerte ± SEM (nicht signifikant, Erläuterung siehe Text).
Ergebnisse
71
Tier μg/ml
Bum 55 0,30
Bum 56 0,32
Bum 57 0,41
Bum 59 0,53
Bum 61 0,27
Tabelle 5.2: Plasmawerte von Bumetanid 45 min nach intravenöser Applikation von 10 mg/kg
i.v. (in Kombination mit 2x PBO, 150 mg/kg i.p.).
5.3.3 Gehirn- und Plasmakonzentration nach Applikation von PBO und
Bumetanid
Zum Abschluss dieser Studie wurden unter einer Behandlung mit zweimal PBO (150
mg/kg in 3 ml/kg Keimöl) i.p. und einmal Bumetanid (10 mg/kg in 5 ml/kg HP-β-
Cyclodextrin) i.v. die entsprechenden Gehirn- und Plasmaspiegel evaluiert. Dazu
wurden die Tiere 30 min nach Applikation dekapitiert und hierbei die Gehirne und
Blutproben entnommen (hier also schon zu dem Zeitpunkt, bei dem vorherig mit der
Stimulation begonnen wurde, siehe Kap. 5.3.2), um abschätzen zu können, wie viel
Substanz sich in die entsprechenden Regionen verteilen konnte. Hierbei konnten
neben zwei eigenen Tieren, vier weitere voll gekindelte Wistar-Ratten aus einer
anderen Studie verwendet werden (mit ,,SBB-Nummer‘‘ und ,,Bsc-Nummer‘‘
gekennzeichnet). Zusätzlich zu den unten aufgeführten Gruppen wurde zum
Vergleich ein unbehandeltes und ungekindeltes Tier als Null-Kontrolle dekapitiert und
dabei Blut gewonnen. Erwartungsgemäß konnte dabei kein Bumetanid
nachgewiesen werden (hier nicht aufgeführt). Bei den behandelten Tieren konnte nur
einmal im Restgehirn und in allen Proben der Amygdala und dem piriformen Kortex
kein Bumetanid nachgewiesen werden.
Ergebnisse
72
Tier Plasma-
Konzentration
(μg/ml)
Hippokampus
(μg/g)
Amygdala u.
piriformer
Kortex (μg/g)
Restgehirn
(μg/g)
Bum 56 1,19 0,105 n.n. n.n.
Bum 61 1,45 0,120 n.n 0,076
Bsc-10-12 1,57 0,045 n.n 0,075
SBB 101 1,28 0,096 n.n. 0,045
SBB 106 1,60 0,096 n.n. 0,090
SBB 112 1,29 0,101 n.n. 0,070
Tabelle 5.3: Bumetanid-Konzentration im Plasma, Hippokampus, Restgehirn und Amygdala
und piriformen Kortex 30 min nach Applikation von PBO und Bumetanid (n.n. = nicht
nachweisbar).
Bei einem Vergleich der Plasma-Konzentration 30 min und 45 min nach Applikation
von Bumetanid hat sich gezeigt, dass die Konzentration 45 min nach Applikation
hoch signifikant erniedrigt war (***p<0,001). Dabei wurden die Daten aus diesem
Versuch mit den Daten aus Kapitel 5.3.2 verglichen (Abb. 5.10).
30 m
in
45 m
in0.0
0.5
1.0
1.5
2.0***
�g/m
l
Abbildung 5.10: Vergleich der Plasma-Konzentration von Bumetanid 30 min und 45 min nach
Applikation von 2 x PBO (150 mg/kg) i.p. und Bumetanid (10 mg/kg) i.v.; Student’s t-test;
***p<0,0001 (30 min: n=6; 60 min: n=5; Mittelwerte ± SEM).
Ergebnisse
73
Die hier gemachte Beobachtung, dass unter einer Vorbehandlung mit PBO durch
Bumetanid keine antikonvulsiven Effekte im Kindling-Modell beobachtet werden
können, führte zu der Vermutung, dass trotz PBO keine ausreichend wirksame
Menge von Bumetanid das Gehirn erreichen konnte. Aus diesem Grund wurde in
einer Folgestudie überprüft, inwieweit Bumetanid bei einer i.c.v.-Applikation
antikonvulsiv wirken kann.
5.3.4 Untersuchungen unter i.c.v.-Applikation von Bumetanid
In dieser Studie war die Überlegung, wenn Bumetanid durch eine i.c.v.-Applikation
ohne Umwege sofort in den Liquor gebracht wird, ein antikonvulsiver Effekt im
Kindling-Modell erzielt werden könnte. Bumetanid wurde hierzu in verschiedenen
Konzentrationen in aCSF gelöst. Der pH-Wert der Lösung betrug stets ca. 7,4-7,45.
Die Applikation erfolgte mittels simultaner Mikroinjektion in die beiden
Gehirnventrikel. Im Lauf der Studie wurden aufsteigende Bumetanid-Konzentrationen
(10 μM, 25 μM, 40 μM und 400 μM) der applizierten Lösung verwendet.
Entsprechend der injizierten Menge der Lösung von insgesamt 4 μl ergaben sich
daraus Dosierungen von 14,6 ng, 36,4 ng, 58,3 ng und 583 ng Bumetanid. Die
Vorbehandlungszeiten bis zum Beginn der Stimulation betrugen 30 min bzw. bei der
Dosis von 58,3 ng Bumetanid zusätzlich 60 min. Bis auf die Applikation einer Dosis
von 583 ng handelte es sich um immer dieselbe Tiergruppe, welche ausschließlich
für den Zweck dieser Studie operiert und voll gekindelt worden war. Zur Überprüfung
der Wirksamkeit einer Dosis von 583 ng Bumetanid wurden Tiere aus der Studie zur
antiepileptogenen Wirksamkeit von Bumetanid verwendet. Die folgenden
Abbildungen geben einen Überblick über die Ergebnisse für die ADT und die SS. Alle
anderen hier gemessenen Parameter befinden sich im Anhang.
Ergebnisse
74
ADT-Werte
14,6 ng30 min Vorbehandlungszeit
Vorkontro
lleBum
Nachko
ntrolle
0
50
100
n = 4
�A36,4 ng
30 min Vorbehandlungszeit
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
50
100
n = 8
�A58,3 ng
30 min Vorbehandlungszeit
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
50
100
n = 5
�A
58,3 ng60 min Vorbehandlungszeit
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
50
100
n = 5
�A
583 ng30 min Vorbehandlungzeit
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
50
100*
n = 5
�A
Abbildung 5.11: ADT-Werte (in μA± SEM) bei einer Dosis von 14,6 ng, 36,4 ng, 58,3 ng und
583 ng Bumetanid i.c.v., einer Vorbehandlungszeit von 30 min und einer zusätzlichen
Vorbehandlungszeit von 60 min bei einer Dosis von 58,3 ng Bumetanid. One-Way-ANOVA for
repeated measures; Post hoc: Dunnett’s multiple comparison test; *p<0,05.
Ergebnisse
75
SS-Werte
14,6 ng30 min Vorbehandlungszeit
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
1
2
3
4
5
Kra
mp
fsta
diu
m36,4 ng
30 min Vorbehandlungszeit
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
1
2
3
4
5
Kra
mp
fsta
diu
m
58,3 ng30 min Vorbehandlungzeit
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
1
2
3
4
5
Kra
mp
fsta
diu
m
58,3 ng60 min Vorbehandlungszeit
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
1
2
3
4
5K
ram
pfs
tad
ium
583 ng30 min Vorbehandlungzeit
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
1
2
3
4
Kra
mp
fsta
diu
m
Abbildung 5.12: Darstellung der SS (nach Krampfstadien) im Vergleich zur Vor- und
Nachkontrolle bei einer Dosis von 14,6 ng, 36,4 ng, 58,3 ng und 583 ng Bumetanid i.c.v., einer
Vorbehandlungszeit von 30 min und einer zusätzlichen Vorbehandlungszeit von 60 min bei
einer Dosis von 58,3 ng Bumetanid.
Ergebnisse
76
Im Verlauf dieser Studie konnte für keine Dosierung eine antikonvulsive Wirkung
hinsichtlich der ADT festgestellt werden. Nur bei Applikation von 58,3 ng Bumetanid
konnte bei einer Vorbehandlungszeit von 30 min eine hoch signifikante Erniedrigung
der ADD2 zur Nachkontrolle (**p<0,01) beobachtet werden (in Abbildung 5.11 nicht
dargestellt). Bei Applikation von 583 ng Bumetanid konnte hinsichtlich der ADT ein
signifikant prokonvulsiver Effekt (*p<0,05) zur Nachkontrolle beobachtet werden. Bei
der Bestimmung der ADT zeigte ein Tier motorisch lediglich einen fokalen Anfall. Bei
diesem Tier wurde die Stimulation fortgesetzt bis eine GST ausgelöst wurde (in
Abbildung 5.11 nicht dargestellt). Da auch bei einer Dosierung von 583 ng
Bumetanid keine antikonvulsiven Effekte beobachtet werden konnten, wurde an
dieser Stelle die Studie zur intrazerebroventrikulären Applikation beendet.
Abschließend wurden bei mehreren Tieren die Gehirn- und Plasmakonzentrationen
nach i.c.v.-Applikation von Bumetanid gemessen.
5.3.5 Gehirn- und Plasmakonzentration nach i.c.v.-Applikation von Bumetanid
Zum Abschluss der Studie wurden die entsprechenden Gehirn- und
Plasmakonzentrationen nach i.c.v.-Applikation von 583 ng Bumetanid evaluiert, um
abschätzen zu können, wie viel Substanz sich in den entsprechenden Regionen
verteilen konnte. Hierzu wurden Tiere dekapitiert, die auch schon zuvor in der Studie
zur i.c.v.-Applikation von Bumetanid verwendet worden waren. Zusätzlich zu diesen
Tieren, wurde zum Vergleich ein unbehandeltes und ungekindeltes Tier als Null-
Kontrolle dekapitiert und dabei Blut gewonnen (hier nicht aufgeführt). Bei allen
untersuchten Tieren konnte nach i.c.v.-Applikation kein Bumetanid im Plasma
nachgewiesen werden.
Tier Hippokampus (μg/g) Amygdala u. piriformer
Kortex (μg/g) Restgehirn (μg/g)
Bum 49 0,090 n.n. 0,020
Bum 57 0,076 n.n. 0,020
Bum 59 0,070 n.n. 0,040
Tabelle 5.4: Bumetanid-Konzentration im Hippokampus, Restgehirn und Amygdala und
piriformen Kortex 30 min nach i.c.v.-Applikation von 583 ng Bumetanid (n.n. = nicht
nachweisbar).
Ergebnisse
77
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen zwar, dass Bumetanid im Hippokampus und im
Restgehirn in einer niedrigen Konzentration nachgewiesen werden konnte, jedoch
war kein Bumetanid in der Amygdala und im piriformen Kortex nachweisbar. Weiter
stellte sich nach den bisherigen Resultaten an dieser Stelle die Frage, ob Bumetanid
im Kindling-Modell alleine überhaupt wirken kann oder es vielleicht eher die
inhibitorische Wirkung der GABA-potenzierenden Substanz Phenobarbital, ähnlich
wie bei BRANDT et al. (2010a), verstärkt? Aus diesem Grund wurden im Kindling-
Modell weitere Untersuchungen zu einer Kombination mit Phenobarbital
angeschlossen.
Untersuchungen zu einer intravenösen Applikation von Bumetanid, BUM5 5.4
und Phenobarbital bei voll gekindelten Ratten
In den nächsten Schritten sollte in einer Folgestudie an die Beobachtungen von
BRANDT et al. (2010a) angeknüpft werden, in der berichtet wurde, dass bei einer
Kombination von Bumetanid und Phenobarbital im Pilokarpin-Modell der Ratte
krankheitsmodifizierende Effekte beobachtet werden konnten. Aus diesem Grund
wurde eine Kombination aus Bumetanid bzw. seinem Derivat BUM5 und
Phenobarbital im Kindling-Modell auf antikonvulsive Wirkungen untersucht.
Zusätzlich wurde mittels verschiedener Behandlungsprotokolle weiter untersucht, ob
durch Bumetanid oder BUM5 allein antikonvulsive Wirkungen erzielt werden können.
Zur Evaluierung einer Substanzkombination aus Bumetanid bzw. BUM5 und
Phenobarbital wurden Vorversuche zu einer geeigneten Dosierung dieses GABA-
Mimetikums durchgeführt.
5.4.1 Dosisfindung von Phenobarbital
Das Ziel war hierbei eine Dosis von Phenobarbital zu finden, die alleine keinen
antikonvulsiven Einfluss auf die Anfallsschwellen im Kindling-Modell ausüben konnte.
Phenobarbital wurde hierfür in Vorversuchen in einer Dosis von 5, 8, 10 und 20
mg/kg und einer 30 minütigen Vorbehandlungszeit i.v. appliziert. Die Versuche mit 5
und 8 mg/kg Phenobarbital wurden an voll gekindelten Ratten durchgeführt, die aus
einer anderen Studie übernommen werden konnten. Bei der Überprüfung der
Wirkung von 10 mg/kg zeigte ein Tier bei der ADT motorisch lediglich einen fokalen
Anfall. Bei diesem Tier wurde die Stimulation fortgesetzt bis eine GST ausgelöst
Ergebnisse
78
wurde (in Abbildung 5.13 nicht dargestellt). Die Dosierung von 10 mg/kg konnte
sowohl an dieser Gruppe überprüft werden als auch an einer neuen Tiergruppe, die
direkt zum Zweck dieser Studie voll gekindelt worden war (Gruppen wurden zur
Darstellung zusammengefasst). An dieser Gruppe wurde ebenfalls eine Applikation
von 20 mg/kg Phenobarbital vorgenommen. Im Folgenden werden die ADT-Werte
der untersuchten Dosierungen dargestellt. Hier nicht aufgeführte Parameter befinden
sich im Anhang.
Abbildung 5.13: Mittelwerte im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle für die ADT (in μA SEM)
bei i.v. Applikation von 5, 8, 10 und 20 mg/kg Phenobarbital, 30 min vor ADT-Bestimmung.
Ergebnisse
79
Die Ergebnisse dieser Vorversuche führten zu dem Entschluss, 10 mg/kg
Phenobarbital als geeignete Dosis auszuwählen, um zu evaluieren inwieweit durch
Kombination mit Bumetanid die antikonvulsive Wirkung von Phenobarbital im
Kindling-Modell potenziert werden kann. Bei 10 mg/kg Phenobarbital konnten keine
antikonvulsiven Effekte beobachtet werden, während bei 20 mg/kg zwar keine
signifikanten antikonvulsiven Effekte aufgetreten waren, jedoch festgestellt werden
konnte, dass zumindest hinsichtlich der SS bereits ein Trend hin zu einer
antikonvulsiven Wirkung erkennbar war (Friedman-Test: p=0,0694). Die Vermutung
liegt dabei nahe, dass mit einer Vergrößerung der Tierzahl bei 20 mg/kg
Phenobarbital deutliche antikonvulsive Effekte hervorgerufen werden können. Ein
Tier zeigte bei der ADT motorisch lediglich einen fokalen Anfall. Dieses Tier wurde
bis zum Erreichen einer GST weiter stimuliert (in Abbildung 5.14 nicht dargestellt).
Die folgende Abbildung zeigt die SS. Weitere Parameter befinden sich im Anhang.
SS
Vorkontro
lle PB
Nachko
ntrolle
1
2
3
4
5
Kra
mp
fsta
diu
m
n = 4 Abbildung 5.14: Werte der SS der ADT bei 20 mg/kg Phenobarbital i.v. im Vergleich zu Vor- und
Nachkontrolle nach Stadien dargestellt.
5.4.2 Bumetanid und BUM5 +/- Phenobarbital
In einer ersten Studie wurde eine gleichzeitige intravenöse Applikation von
Bumetanid und Phenobarbital vorgenommen und 30 min später mit der ADT-
Bestimmung begonnen. Die hierbei verwendeten Tiere waren z.T. schon für die
Vorversuche zur Dosisfindung von Phenobarbital verwendet worden und
Ergebnisse
80
entstammten ursprünglich aus einer anderen Studie des Instituts für Pharmakologie.
Die Substanzen wurden nach folgendem Behandlungsprotokoll verabreicht:
� Bumetanid (10 mg/kg in 5 ml/kg HP-β-Cyclodextrin i.v.) + Phenobarbital
(10 mg/kg in 1 ml/kg Aqua dest. i.v.) 30 min vor ADT-Bestimmung
Der Versuch wurde an einzelnen Tieren z.T. zweimal durchgeführt. Für die Tiere die
zweimal im Versuch waren, wurden hierfür die Mittelwerte der beiden Durchläufe in
die Auswertung einbezogen. Hierbei konnten z.T. signifikante antikonvulsive Effekte
beobachtet werden. Es reagierten alle Tiere (n=5) mit einer Erhöhung der
individuellen ADT. Hinsichtlich der Mittelwerte der ADT ergaben sich dadurch sowohl
zur Vor- als auch zur Nachkontrolle hoch signifikante antikonvulsive Effekte
(**p<0,01; ***p<0,001). Für die SS konnte ein signifikant antikonvulsiver Effekt zur
Nachkontrolle beobachtet werden (*p<0,05). Für alle weiteren Parameter konnten
keine signifikanten antikonvulsiven Wirkungen gemessen werden. Hier nicht
dargestellte Parameter befinden sich im Anhang. Die folgende Abbildung stellt die
Daten für die ADT und SS dar.
ADT
Vorkontro
lle
BUM+PB
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100 *** **
n = 5
�A
SS
Vorkontro
lle
BUM+PB
Nachko
ntrolle
1
2
3
4
5*
Kra
mpf
stad
ium
Abbildung 5.15: Mittelwerte der ADT (in μA ± SEM). One-Way-ANOVA for repeated measures;
post hoc: Dunett’s test for multiple comparison; **p<0,01, ***p<0,001. SS nach Stadien
eingeteilt; Friedman test; **p=0,0085; Post hoc: Dunn’s test; *p<0,05.
Ergebnisse
81
In den nächsten Schritten wurde überprüft, inwieweit eine zweimalige Vorbehandlung
mit Bumetanid bzw. BUM5 sowohl mit als auch ohne eine zusätzliche Applikation von
Phenobarbital eine antikonvulsive Wirkung ausübt. Hierzu wurde eine Tiergruppe
verwendet, die ausschließlich zum Zweck dieser Studie voll gekindelt worden war.
Die Substanzen wurden nach folgenden Behandlungsprotokollen verabreicht:
� Bumetanid (10 mg/kg in 5 ml/kg HP-β-Cyclodextrin i.v.) 60 und 30 min vor
ADT-Bestimmung +/- Phenobarbital (10 mg/kg in 1 ml/kg Aqua dest. i.v.)
30 min vor ADT-Bestimmung
� BUM5 (13 mg/kg in 3 ml/kg HP-β-Cyclodextrin i.v.) 60 und 30 min vor
ADT-Bestimmung +/- Phenobarbital (10 mg/kg in 1 ml/kg Aqua dest. i.v.)
30 min vor ADT-Bestimmung
Hierbei konnte weder durch eine zweimalige Applikation von Bumetanid noch durch
BUM5 eine antikonvulsive Wirkung beobachtet werden. Die folgende Abbildung zeigt
die Werte der ADT bei einer Behandlung mit Bumetanid bzw. BUM5. Zusätzlich
wurde zum Vergleich die ADT bei einer Behandlung mit Phenobarbital allein
hinzugefügt. Weitere gemessene Parameter befinden sich im Anhang.
Ergebnisse
82
Bumetanid
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
n = 6
�ABUM5
Vorkontro
lle
BUM5
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
n = 6
�A
Phenobarbital
Vorkontro
lle PB
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
n = 11
�A
Abbildung 5.16: Mittelwerte der ADT (in μA ± SEM) bei i.v.-Applikation von Bumetanid (10
mg/kg), BUM5 (13 mg/kg) und Phenobarbital (10 mg/kg) allein.
Bei einer Kombination von Bumetanid bzw. BUM5 mit Phenobarbital, mit einer Dosis,
bei der Phenobarbital alleine keine Wirkung gezeigt hatte, konnten jedoch in beiden
Behandlungsgruppen zum Teil hoch signifikante antikonvulsive Effekte gemessen
werden. So konnte sowohl unter Bumetanid- als auch unter BUM5-Behandlung
jeweils ein hoch signifikanter Anstieg der ADT im Vergleich zur Vor- und
Nachkontrolle beobachtet werden. Vereinzelt hatten Tiere in beiden Gruppen jeweils
bei der ADT motorisch lediglich mit einem fokalen Anfall reagiert. Bei diesen Tieren
wurde die Stimulation fortgesetzt bis eine GST ausgelöst wurde (in Abbildung 5.17
nicht dargestellt).
Ergebnisse
83
ADT SS
Bumetanid + Phenobarbital
Vorkontro
lle
BUM+PB
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100 ** **
n = 10
�A
Bumetanid + Phenobarbital
Vorkontro
lle
BUM+PB
Nachko
ntrolle
1
2
3
4
5
Kra
mpf
stad
ium
BUM5 + Phenobarbital
Vorkontro
lle
BUM5+PB
Nachko
ntrolle
0
50
100
150 * **
n= 10
�A
BUM5 + Phenobarbital
Vorkontro
lle
BUM5+PB
Nachko
ntrolle
1
2
3
4
5
Kra
mpf
stad
ium
Abbildung 5.17: Mittelwerte der ADT (in μA ± SEM) bei Kombination mit Bumetanid und
Phenobarbital (je 10 mg/kg i.v.) und BUM5 mit Phenobarbital (13 mg/kg und 10 mg/kg i.v.). One-
Way-ANOVA for repeated measures; Post hoc: Dunnett’s test for multiple comparison; *p<0,05,
**p<0,01. SS nach Stadien eingeteilt;
Zusätzlich war die SD1 (seizure duration 1, Anfallsdauer 1) und die ADD2
(afterdischarge duration 2, Nachentladungsdauer 2) bei der mit BUM5 behandelten
Gruppe zum Teil hoch signifikant zur Vor- und Nachkontrolle erniedrigt. Aus diesem
Grund sollen in der folgenden Abbildung diese Parameter vergleichend zur
Bumetanid-Gruppe dargestellt werden. Weitere gemessene Parameter befinden sich
im Anhang.
Ergebnisse
84
SD1 ADD2
Bumetanid + Phenobarbital
Vorkontro
lle
BUM+PB
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
n = 10
Sek
unde
n
Bumetanid + Phenobarbital
Vorkontro
lle
BUM+PB
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek
unde
n
BUM5 + Phenobarbital
Vorkontro
lle
BUM5+PB
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100** **
n = 10
Sek
unde
n
BUM5 + Phenobarbital
Vorkontro
lle
BUM5+PB
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
** *S
ekun
den
Abbildung 5.18: Mittelwerte der SD1 und ADD2 (in Sekunden ± SEM) bei Kombination mit
Bumetanid und Phenobarbital (je 10 mg/kg i.v.) und BUM5 mit Phenobarbital (13 mg/kg und 10
mg/kg i.v.). One-Way-ANOVA for repeated measures; Post hoc: Dunett’s test for multiple
comparison; *p<0,05, **p<0,01.
In zwei weiteren Versuchsdurchläufen wurden an dieser Tiergruppe die
Eigenschaften von BUM5 im Kindling-Modell weiter untersucht. Im ersten Durchlauf
wurde eine um eine Zehnerpotenz niedrigere Dosierung von BUM5 (1,3 mg/kg in 3
ml/kg HP-β-Cyclodextrin i.v.) gewählt, um an einer kleinen Tiergruppe abzuschätzen,
inwieweit eine niedrige Dosierung in Kombination mit Phenobarbital antikonvulsive
Effekte im Kindling-Modell ausübt. In einem zweiten Durchlauf wurde die
ursprüngliche Dosierung von BUM5 gewählt, jedoch die Vorbehandlungszeit vor
ADT-Bestimmung verändert. Die Substanzen wurden in den beiden Durchläufen
nach folgenden Behandlungsprotokollen verabreicht:
Ergebnisse
85
� BUM5 (1,3 mg/kg in 3 ml/kg HP-β-Cyclodextrin i.v.) 60 und 30 min vor
ADT-Bestimmung (Protokoll 1)
� BUM5 (13 mg/kg in 3 ml/kg HP-β-Cyclodextrin i.v.) 60 und 15 min vor
ADT-Bestimmung + Phenobarbital (10 mg/kg in 1 ml/kg Aqua dest. i.v.)
30 min vor ADT-Bestimmung (Protokoll 2)
Hierbei konnten in beiden Durchläufen, vermutlich aufgrund der geringen Tierzahl,
keine antikonvulsiven Effekte beobachtet werden. In der folgenden Abbildung wird
aus diesem Grund nur die jeweilige ADT im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle
dargestellt. An dieser Stelle nicht aufgeführte Parameter befinden sich im Anhang.
ADT (Protokoll 1)
Vorkontro
lle
BUM5+PB
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
n = 3
�A
ADT (Protokoll 2)
Vorkontro
lle
BUM5+PB
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
n = 4
�A
Abbildung 5.19: Mittelwerte der ADT (in μA ± SEM) beider Versuchsdurchläufe im Vergleich zu
Vor- und Nachkontrolle.
5.4.3 Vergleich der Wirkungen von Bumetanid und BUM5 im Kindling-Modell
Im Zuge dieser Studie konnte im Rahmen der durchgeführten Behandlungsprotokolle
ein markanter Unterschied hinsichtlich der phenobarbital-potenzierenden Wirkung
von Bumetanid und BUM5 festgestellt werden. So führte die Kombination mit
Phenobarbital zwar bei beiden Substanzen zu einer statistisch signifikanten
Erhöhung der ADT (*p<0,05; **p<0,01) bezogen auf die Vor- und Nachkontrolle,
jedoch wies BUM5 dabei eine höhere Effektivität auf (siehe Abb. 5.17). So führte die
Ergebnisse
86
zweimalige Applikation von BUM5, einmal ohne und einmal mit Phenobarbital mit
einer dreißigminütigen Vorlaufzeit zur ADT-Bestimmung im Vergleich zur Vor- und
Nachkontrolle zu einer Erhöhung der ADT um 43-58%. Demgegenüber führte der
gleiche Versuchsablauf unter Behandlung mit Bumetanid ebenfalls zu einer
Erhöhung der ADT um jedoch nur 28-30% im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle.
Darüber hinaus konnte festgestellt werden, dass mit BUM5 zusätzlich die SD1 und
ADD2 signifikant (*p<0,05; **p<0,01) verkürzt werden konnte (siehe Abb. 5.18).
5.4.4 Ergebnisse von Verhaltensversuchen aus Untersuchungen zu
antikonvulsiven Wirkungen von Bumetanid und BUM5 im Kindling-
Modell
Im Zuge dieser Versuchsreihe wurden bei jedem Versuchsdurchlauf
Verhaltensversuche durchgeführt, um etwaige auftretende Nebeneffekte der
vorgenommenen Behandlungen überwachen zu können. Dazu wurde im Open field
für eine Minute auf Ataxie, Hypolokomotion und Hyperlokomotion untersucht und in
einem Scoring-System bewertet. Zusätzlich wurde das Verhalten auf dem Rotarod
(12 Umdrehungen pro Minute) überprüft und dabei bewertet, ob sich die Tiere für den
Zeitraum von einer Minute auf der rotierenden Lauffläche halten konnten, ohne von
hier herabzufallen. Während der Versuchsdurchläufe kam es bei keinem der
untersuchten Parameter zu Auffälligkeiten, sodass in dieser Dissertation auf eine
Darstellung dieser Ergebnisse verzichtet werden soll.
Untersuchungen zur Wirkung von Bumetanid und BUM5 nach einem 5.5
pilokarpin-induzierten SE im PTZ-Krampftest bei der Maus
Das Ziel dieser Studie war, in einer anderen Tierspezies und in einem anderen
Epilepsie-Modell als dem Kindling-Modell zu untersuchen, ob zu verschiedenen
Zeitpunkten nach SE durch eine Behandlung mit Bumetanid bzw. BUM5
antikonvulsive Effekte über Veränderungen hinsichtlich der PTZ-Krampfschwelle am
Mausmodell erzielt werden können. Der Grund bestand in der Vermutung, dass in
diesem Modell NKCC1 im Vergleich zum Kindling-Modell höher exprimiert sein
könnte, wodurch Bumetanid besser wirken könnte, da gezeigt werden konnte, dass
es nach SE-Induktion mit Pilokarpin als Hirninsult zu einer Hochregulation von
NKCC1 kommt (LI et al. 2008). Insgesamt wurden im Lauf dieser Studie 267 adulte
Ergebnisse
87
NMRI-Mäuse verwendet. Davon wurde an 191 Tieren eine SE-Induktion mit
Pilokarpin vorgenommen und 76 Tiere wurden als Kontrolltiere (Sham-SE-Induktion)
im Versuch mitgeführt. Die folgende Tabelle gibt einen Überblick über das Ergebnis
der SE-Induktion mittels Pilokarpin.
Anzahl der
Mäuse mit
SE-Induktion
mit
Pilokarpin
(n)
Anzahl
Pilokarpin-
Applikationen
bis SE
(je 100 mg/kg)
(Ø)
Tod bei SE-
Induktion
(n)
Tod nach SE-
Induktion
(vor PTZ-
Krampftest)
(n)
Tiere ohne
SE-
Entwicklung
(n)
Kontrolltiere
mit Sham-SE-
Induktion
(n)
191 5 70 5 1 76
Tabelle 5.5: Überblick über die verwendete Tierzahl und das Ergebnis der SE-Induktion mittels
Pilokarpin.
Nach der SE-Induktion konnten für den PTZ-Krampftest neben den 76 Kontrolltieren
113 Tiere zu verschiedenen Zeitpunkten nach erfolgter SE Induktion verwendet
werden. Davon wurden 17 Tiere aufgrund aufgetretener Probleme hinsichtlich des
temporär verwendeten Lösungsmittels von BUM5 nicht in die spätere Auswertung
des Krampftests miteinbezogen (siehe dazu Kap. 4.3). In den folgenden Tabellen
wurde eine Einteilung hinsichtlich der im PTZ-Krampftest bestimmten Krampfstadien
vorgenommen. In der Spalte alle Krampfstadien bestimmt sind die Tiere aufgeführt,
bei denen alle Endpunkte gemessen und in die Statistik einbezogen werden konnten.
In der Spalte Krampfstadien teilweise bestimmt wurden diejenigen Tiere eingeteilt,
bei denen sich nach Erreichen des mindestens ersten Endpunktes entweder die
Infusionsnadel aus der Schwanzvene gelöst hatte oder die Infusion aufgrund einer
ausgeprägten Krampfaktivität plötzlich paravenös gelaufen war, dabei aber die
vorher aufgetretenen Krampfstadien in die statistische Auswertung mit einbezogen
werden konnten. Bei Auftreten derartiger Situationen wurden die entsprechenden
Tiere, sofern nicht schon bei der Infusion verstorben, sofort euthanasiert. Die Spalte
Tod nach PTZ-Infusion beinhaltet die Tiere bei denen alle Krampfstadien bestimmt
werden konnten und diese noch während der Infusion oder bis zu 5 min nach
Beendigung der Infusion verstorben waren. Die Tiere bei denen eine
Substanzapplikation über die Schwanzvene nicht möglich war oder diese vor Beginn
Ergebnisse
88
des Krampftests einen Anfall hatten oder die Infusion vor Auftreten des ersten
Endpunktes paravenös gelaufen war, wurden in der Spalte Anzahl Tiere gesamt mit
berücksichtigt. Zur Darstellung der verwendeten Versuchsgruppen wurde eine
Haupteinteilung in zwei Tabellen vorgenommen. Die erste Tabelle beinhaltet alle
Kontrolltiere mit einer Sham-SE-Induktion. Bei der Bezeichnung Vehikel (von BUM
bzw. von BUM5; 24 h bzw. 48 h bzw. 1 Woche) handelt es sich um Tiere, die zu
verschiedenen Zeitpunkten (h = Stunden) nach Sham-SE-Induktion vor Beginn des
PTZ-Krampftests das Lösungsmittel von Bumetanid oder BUM5 erhalten hatten.
Diese Gruppen wurden, sofern nicht anders angegeben, für die statistische
Berechnung und Darstellung der Ergebnisse zusammengefasst. Die Bezeichnung
BUM bzw. BUM5 (24 h bzw. 48 h bzw. 1 Woche) bezeichnet die Tiere, die zu
verschiedenen Zeitpunkten nach der Sham-SE-Induktion Bumetanid oder BUM5 vor
Beginn des PTZ-Krampftests erhalten hatten.
PTZ-Krampftest
nach Sham-SE
(=Kontrolle)
Anzahl
Tiere
gesamt
(n)
alle
Krampfstadien
bestimmt
(n)
Krampfstadien
teilweise
bestimmt
(n)
Tod nach
PTZ-Infusion
(n)
Vehikel
(von BUM; 24 h) 6 4 1 4
Vehikel
(von BUM; 48 h) 13 12 1 9
Vehikel
(von BUM; 1 Woche) 5 3 1 3
Vehikel
(von BUM5; 24 h) 9 4 5 3
BUM (24 h) 7 3 2 3
BUM (48 h) 8 4 2 3
BUM (1 Woche) 6 5 - 3
BUM5 (24 h) 11 6 5 6
Tabelle 5.6: Übersicht über die im PTZ-Krampftest nach Sham-SE-Induktion verwendeten
Versuchsgruppen hinsichtlich der Bestimmung der Krampfstadien und der Mortalität.
Ergebnisse
89
Die zweite Tabelle beinhaltet alle Tiere, die vor dem Krampftest eine SE-Induktion
durchlaufen hatten. Die einzelnen Bezeichnungen dieser Tiergruppen verhalten sich
analog zu den Gruppen der ersten Tabelle.
PTZ-Krampftest
nach SE
Anzahl
Tiere
gesamt
(n)
alle
Krampfstadien
bestimmt
(n)
Krampfstadien
teilweise
bestimmt
(n)
Tod nach
PTZ-Infusion
(n)
Vehikel
(von BUM; 24 h) 8 3 4 2
Vehikel
(von BUM; 48 h) 18 13 2 10
Vehikel
(von BUM; 1 Woche) 14 9 2 4
Vehikel
(von BUM5; 24 h) 11 5 3 4
BUM (24 h) 8 4 3 5
BUM (48 h) 17 9 5 7
BUM (1 Woche) 13 10 1 4
BUM5 (24 h) 16 8 6 4
Tabelle 5.7: Übersicht über die im PTZ-Krampftest nach SE-Induktion verwendeten
Versuchsgruppen hinsichtlich der Bestimmung der Krampfstadien und der Mortalität.
Bumetanid (10 mg/kg in alkalischem Vehikel i.p.) wurde 20 min vor Beginn des Tests,
BUM5 (13 mg/kg in HP-β-Cyclodextrin i.p.) wurde 30 min vor Beginn des Tests
appliziert. Während des Tests wurden sechs verschiedene Endpunkte in der
Krampfaktivität gemessen und ausgewertet. Grundsätzlich konnte festgestellt
werden, dass die PTZ-Krampfschwelle bei Sham-SE-Mäusen (Kontrolltieren) weder
durch Bumetanid noch durch BUM5 verändert wurde. Jedoch konnte bei
epileptischen Mäusen ein unerwarteter Anstieg der Krampfschwelle beobachtet
werden, der sich jedoch 1 Woche nach SE-Induktion wieder auf dem Niveau der
Kontrolltiere befand. Unerwartet war dieser Anstieg deshalb, da bei Ratten gezeigt
werden konnte, dass nach einem pilokarpin-induzierten SE die PTZ-Krampfschwelle
Ergebnisse
90
absinkt (RATTKA et al. 2011). Weiter konnte festgestellt werden, dass BUM5 den
beobachteten Anstieg der Krampfschwelle teilweise antagonisieren konnte. Im
Folgenden werden alle während der Krampfaktivität gemessenen Endpunkte
dargestellt, um einen detaillierten Überblick über die erzielten Resultate zu
ermöglichen.
5.5.1 Einfluss von Bumetanid auf die PTZ-Krampfschwelle 24 Stunden nach
SE
In dieser Studie konnte 24 h nach einem pilokarpin-induzierten SE in allen
gemessenen Endpunkten eine unerwartete und teilweise hoch signifikante Erhöhung
(*p<0,05;**p<0,01;***p<0,001) der PTZ-Krampfschwelle beobachtet werden.
Bumetanid schien dabei augenscheinlich teilweise in der Lage zu sein, den Anstieg
der Krampfschwelle antagonisieren zu können (Student’s t-test bei Clonic seizure
without loss of righting reflexes p=0,6504 und Clonic seizure with loss of righting
reflexes p=0,6255). Weiter konnte in Bezug auf die nicht-epileptischen Kontrolltiere
kein Einfluss von Bumetanid auf die Krampfschwelle beobachtet werden.
Aufgrund des unerwarteten Anstiegs der Krampfschwelle 24 h nach SE wurden im
Oskar-Langendorff Institut für Physiologie der Universität Rostock (Arbeitsgruppe
Prof. Dr. Rüdiger Köhling) Untersuchungen mittels der perforated patch clamp-
Methode an Mäusen durchgeführt, um diese Veränderungen näher
elektrophysiologisch charakterisieren zu können. Leider ergaben sich dabei
zahlreiche methodische ex vivo Probleme, sodass im Zuge dieses
Forschungsvorhabens leider keine verwertbaren Ergebnisse produziert werden
konnten.
Ergebnisse
91
First myoclonic twitch
K (n=21
)
K+BUM (n
=16)
SE (n=7
)
SE+BUM (n=7)
0
50
100
150
200
250
*
PTZ
[mg/
kg]
Further myoclonic twitch
K (n=21
)
K+BUM (n
=16)
SE (n=7
)
SE+BUM (n=7)
0
50
100
150
200
250
*
*
PTZ
[mg/
kg]
Clonic seizure without loss of righting reflexes
K (n=2
0)
K+BUM (n
=16)
SE (n=6
)
SE+BUM (n
=7)
0
50
100
150
200
250
**
PTZ
[mg/
kg]
Clonic seizure with loss of righting relexes
K (n=2
0)
K+BUM (n
=16)
SE (n=6
)
SE+BUM (n
=7)
0
50
100
150
200
250
***
PTZ
[mg/
kg]
Forelimb tonus
K (n=18
)
K+BUM (n
=11)
SE (n=3
)
SE+BUM (n=7)
0
50
100
150
200
250*
***
PTZ
[mg/
kg]
Hindlimb tonus
K (n=16
)
K+BUM (n
=10)
SE (n=3
)
SE+BUM (n=4)
0
50
100
150
200
250 ****
PTZ
[mg/
kg]
Abbildung 5.20: Endpunkte während der Krampfaktivität unter Bumetanid-bzw.
Vehikelbehandlung bei naiven Kontrolltieren ohne SE und 24 h nach einem pilokarpin-
induzierten SE in benötigter Menge an PTZ dargestellt (± SEM). One-Way-ANOVA; Post hoc:
Dunnett’s test for multiple comparison: *p<0,05,**p<0,01,***p<0,001; K = kein SE + Vehikel;
K+BUM = kein SE + Bumetanid; SE = SE + Vehikel; SE+BUM = SE + Bumetanid;
Ergebnisse
92
5.5.2 Einfluss von Bumetanid auf die PTZ-Krampfschwelle 48 Stunden nach
SE
In der Gruppe ohne Bumetanid-Behandlung konnte 48 h nach einem pilokarpin-
induzierten SE nur noch in einem Endpunkt (Clonic seizure with loss of righting
reflexes) eine signifikante Erhöhung der PTZ-Krampfschwelle festgestellt werden
(*p<0,05). Bumetanid schien zudem augenscheinlich den Anstieg der
Krampfschwelle nach SE teilweise antagonisieren zu können (Student’s t-test bei
Clonic seizure without loss of righting reflexes p=0,1908 und bei Clonic seizure with
loss of righting reflexes p=0,1044).
First myoclonic twitch
K (n=2
1)
K+BUM (n
=16)
SE (n=1
5)
SE+BUM (n
=14)
0
50
100
150
PTZ
[mg/
kg]
Further myoclonic twitch
K (n=2
1)
K+BUM (n
=16)
SE (n=1
5)
SE+BUM (n
=13)
0
50
100
150
PTZ
[mg/
kg]
Clonic seizure without loss of righting reflexes
K (n=2
0)
K+BUM (n
=16)
SE (n=1
5)
SE+BUM (n
=13)
0
50
100
150
PTZ
[mg/
kg]
Clonic seizure with loss of righting reflexes
K (n=2
0)
K+BUM (n
=16)
SE (n=1
5)
SE+BUM (n
=12)
0
50
100
150*
PTZ
[mg/
kg]
Abbildung 5.21: Die ersten 4 Endpunkte während der Krampfaktivität unter Bumetanid-bzw.
Vehikelbehandlung bei naiven Kontrolltieren ohne SE und 48 h nach einem pilokarpin-
induzierten SE in benötigter Menge an PTZ dargestellt (± SEM). One-Way-ANOVA hier nicht
signifikant (p=0,0671); Post hoc: Dunnett’s test for multiple comparison: K vs. SE: *p<0,05; K =
kein SE + Vehikel; K+BUM = kein SE + Bumetanid; SE = SE + Vehikel; SE+BUM = SE +
Bumetanid;
Ergebnisse
93
Forelimb tonus
K (n=1
8)
K+BUM (n
=11)
SE (n=1
3)
SE+BUM (n
=10)
0
50
100
150
PTZ
[m
g/kg
]Hindlimb tonus
K (n=1
6)
K+BUM (n
=10)
SE (n=1
3)
SE+BUM (n
=9)
0
50
100
150
PTZ
[m
g/kg
]
Abbildung 5.22: Die letzten beiden Endpunkte während der Krampfaktivität unter Bumetanid-
bzw. Vehikelbehandlung bei naiven Kontrolltieren ohne SE und 48 h nach einem pilokarpin-
induzierten SE in benötigter Menge an PTZ dargestellt (± SEM). One-Way-ANOVA hier nicht
signifikant (p=0,0671); Post hoc: Dunnett’s test for multiple comparison: K vs. SE: *p<0,05; K =
kein SE + Vehikel; K+BUM = kein SE + Bumetanid; SE = SE + Vehikel; SE+BUM = SE +
Bumetanid;
5.5.3 Einfluss von Bumetanid auf die PTZ-Krampfschwelle 1 Woche nach SE
Hierbei konnte festgestellt werden, dass 1 Woche nach einem pilokarpin-induzierten
SE die Krampfschwellen für die letzten beiden Endpunkte (Forelimb tonus und
Hindlimb tonus) in der Bumetanid-Gruppe signifikant (*p<0,05) und in der SE-Gruppe
sogar hochsignifikant (**p<0,01) erniedrigt waren. Bumetanid konnte dabei keinen
Einfluss auf die Krampfschwelle ausüben.
Ergebnisse
94
First myoclonic twitch
K (n=21
)
K+BUM (n=16
)
SE (n=11
)
SE+BUM (n=11
)0
50
100
150P
TZ [
mg/
kg]
Further myoclonic twitch
K (n=21
)
K+BUM (n=16
)
SE (n=11
)
SE+BUM (n=11
)0
50
100
150
PTZ
[m
g/kg
]
Clonic seizure without loss of rigthing reflexes
K (n=20
)
K+BUM (n=16
)
SE (n=10
)
SE+BUM (n=11
)0
50
100
150
PTZ
[mg/
kg]
Clonic seizure with loss of rigthing reflexes
K (n=20
)
K+BUM (n=16
)
SE (n=10
)
SE+BUM (n=11
)0
50
100
150
PTZ
[mg/
kg]
Forelimb tonus
K (n=18
)
K+BUM (n=11
)
SE (n=9)
SE+BUM (n=10
)0
50
100
150
**
*
PTZ
[mg/
kg]
Hindlimb tonus
K (n=16
)
K+BUM (n=10
)
SE (n=9)
SE+BUM (n=10
)0
50
100
150 ***
PTZ
[mg/
kg]
Abbildung 5.23: Endpunkte während der Krampfaktivität unter Bumetanid-bzw.
Vehikelbehandlung bei naiven Kontrolltieren ohne SE und 1 Woche nach einem pilokarpin-
induzierten SE in benötigter Menge an PTZ dargestellt (± SEM). One-Way-ANOVA; Post hoc:
Dunnett’s test for multiple comparison: *p<0,05, **p<0,01; K = kein SE + Vehikel; K+BUM = kein
SE + Bumetanid; SE = SE + Vehikel; SE+BUM = SE + Bumetanid;
Ergebnisse
95
5.5.4 Einfluss von BUM5 auf die PTZ-Krampfschwelle 24 h nach SE
In dieser Studie konnte 24 h nach einem pilokarpin-induzierten SE beobachtet
werden, dass es bei den letzten Endpunkten (Forelimb tonus und Hindlimb tonus),
ähnlich zu den Daten aus der Studie zum Einfluss von Bumetanid 24 h nach SE,
sowohl bei den mit Vehikel als auch mit BUM5 behandelten SE-Tieren zu einer hoch
signifikanten bzw. signifikanten Erhöhung (*p<0,05; ***p<0,001) der Krampfschwelle
gekommen war. BUM5 war dabei nicht in der Lage bei naiven Kontrolltieren einen
Einfluss auf die Krampfschwelle auszuüben. 24 h nach SE schien BUM5 den Anstieg
der Krampfschwelle bei den Endpunkten Forelimb tonus (Student’s t-test p=0,0762)
und Hindlimb tonus (Student’s t-test p=0,0600) antagonisieren zu können. In den
folgenden Abbildungen wurden nur die Kontrolltiere (=K) mit einbezogen, die mit dem
Vehikel von BUM5 behandelt worden waren.
First myoclonic twitch
K (n=9)
K+BUM5 (n=11
)
SE (n=8
)
SE+BUM5 (n=14
)0
20
40
60
80
100
PTZ
[m
g/kg
]
Further myoclonic twitch
K (n=9)
K+BUM5 (n=11
)
SE (n=8
)
SE+BUM5 (n=14
)0
20
40
60
80
100
PTZ
[m
g/kg
]
Clonic seizure without loss of righting reflexes
K (n=9)
K+BUM5 (n=11
)
SE (n=8
)
SE+BUM5 (n=14
)0
50
100
150
PTZ
[m
g/kg
]
Clonic seizure with loss of righting reflexes
K (n=9)
K+BUM5 (n=11
)
SE (n=8
)
SE+BUM5 (n=13
)0
50
100
150
PTZ
[m
g/kg
]
Abbildung 5.24: Die ersten 4 Endpunkte während der Krampfaktivität unter BUM5- bzw.
Vehikelbehandlung bei naiven Kontrolltieren ohne SE und 24 h nach einem pilokarpin-
induzierten SE in benötigter Menge an PTZ dargestellt (± SEM); K = kein SE + Vehikel; K+BUM5
= kein SE + BUM5; SE = SE + Vehikel; SE+BUM5 = SE + BUM5;
Ergebnisse
96
Forelimb tonus
K (n=4
)
K+BUM5 (
n=6)
SE (n=6
)
SE+BUM
5 (n=8
)0
50
100
150
200 ****
PT
Z [
mg
/kg
]Hindlimb tonus
K (n=4
)
K+BUM5 (
n=6)
SE (n=5
)
SE+BUM5 (
n=7)
0
50
100
150
200 ****
PT
Z [
mg
/kg
]
Abbildung 5.25: Die letzten beiden Endpunkte während der Krampfaktivität unter BUM5- bzw.
Vehikelbehandlung bei naiven Kontrolltieren ohne SE und 24 h nach SE in benötigter Menge an
PTZ dargestellt (± SEM). One-Way-ANOVA; Post hoc: Dunnett’s test for multiple comparison:
*p<0,05, ***p<0,001; K = kein SE + Vehikel; K+BUM5 = kein SE + BUM5; SE = SE + Vehikel;
SE+BUM5 = SE + BUM5;
5.5.5 Vergleich der Wirkungen von Bumetanid und BUM5 nach SE-Induktion
im PTZ-Krampftest
Da eine Vorbehandlung mit BUM5 vor Bestimmung der PTZ-Schwelle nur zum
Zeitpunkt 24 h nach SE erfolgt ist, können Bumetanid und BUM5 nur für diesen
Zeitpunkt verglichen werden. Hierbei zeigte sich, dass BUM5 gegenüber Bumetanid
den Anstieg der PTZ-Krampfschwelle der letzten beiden Endpunkte antagonisieren
konnte. So konnte beobachtet werden, dass die Krampfschwelle nach SE durch
BUM5, im Vergleich zu Bumetanid, bei den Endpunkten Forelimb tonus und Hindlimb
tonus signifikant gesunken war. Zur Darstellung des Vergleichs der Wirkungen von
Bumetanid und BUM5 wurden hierfür alle Kontrolltiere (=K), die entweder mit dem
Vehikel von Bumetanid oder dem Vehikel von BUM5 behandelt worden waren,
zusammengefasst. Dadurch ergeben sich, verglichen mit der isolierten Betrachtung
der Wirkungen von Bumetanid und BUM5 24 h nach SE, zum Teil abweichende
Signifikanzen.
Ergebnisse
97
First myoclonic twitch
K (n=3
0)
K+BUM (n
=16)
K+BUM5 (
n=11)
SE (n=1
5)
SE+BUM
(n=7
)
SE+BUM
5 (n=1
4)0
50
100
150
200
250
**
*
PT
Z [m
g/k
g]
Further myoclonic twitch
K (n=3
0)
K+BUM (n
=16)
K+BUM5 (
n=11)
SE (n=1
5)
SE+BUM
(n=7
)
SE+BUM
5 (n=1
4)0
50
100
150
200
250
***
*
PT
Z [m
g/k
g]
Clonic seizure without loss of righting reflexes
K (n=2
9)
K+BUM (n
=16)
K+BUM5 (
n=11)
SE (n=1
4)
SE+BUM
(n=7
)
SE+BUM
5 (n=1
4)0
50
100
150
200
250
****
PT
Z [m
g/k
g]
Clonic seizure with loss of righting reflexes
K (n=2
9)
K+BUM (n=1
6)
K+BUM5 (n=1
1)
SE (n=1
4)
SE+BUM (n=7
)
SE+BUM5 (n=1
3)0
50
100
150
200
250
****
**P
TZ
[mg
/kg
]
Forelimb tonus
K (n=2
2)
K+BUM (n
=11)
K+BUM5 (
n=6)
SE (n=9
)
SE+BUM
(n=7
)
SE+BUM
5 (n=8
)0
50
100
150
200
250
******
*o
PT
Z [m
g/k
g]
Hindlimb tonus
K (n=2
0)
K+BUM (n
=10)
K+BUM5 (
n=6)
SE (n=8
)
SE+BUM
(n=4
)
SE+BUM
5 (n=7
)0
50
100
150
200
250
******
*oo
PT
Z [m
g/k
g]
Abbildung 5.26: Bumetanid vs. BUM5 24 h nach SE in benötigter Menge an PTZ dargestellt
(± SEM). One-Way-ANOVA; Post hoc: Dunnett’s test for multiple comparison: *p<0,05,
**p<0,01, ***p<0,001; Student’s t-test: op<0,05,oop<0,01;
Diskussion
98
6 Diskussion
Ziel dieser Ph.D.-Arbeit war es, das antikonvulsive und antiepileptogene Potential
des NKCC1-Inhibitors Bumetanid näher zu charakterisieren. Zusätzlich wurde der
N,N-Dimethylaminoethylester von Bumetanid, BUM5, in die Untersuchungen mit
einbezogen und seine antikonvulsiven Wirkungen mit denen von Bumetanid
verglichen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei Nager-Modelle für
Temporallappenepilepsie des Menschen verwendet. Hierbei wurde versucht durch
verschiedene Strategien die Konzentration von Bumetanid im Gehirn zu erhöhen, um
darüber antiepileptogene und antikonvulsive Effekte zu erzielen. In Bezug auf die
zugrundeliegenden Arbeitshypothesen konnten folgende Hauptergebnisse erzielt
werden: Durch eine HWZ-Verlängerung von Bumetanid durch den Monooxigenase-
Inhibitor PBO konnten keine antiepileptogenen Effekte im Kindling-Modell bei der
Ratte erzielt werden. Weiter hat sich gezeigt, dass weder durch eine HWZ-
Verlängerung durch PBO noch durch eine fokale Applikation von Bumetanid oder
eine systemische Behandlung mit Bumetanid bzw. BUM5 antikonvulsive Effekte im
Kindling-Modell bei der Ratte erzielt werden konnten. Jedoch konnten hier in
Kombination mit der GABA-potenzierenden Substanz Phenobarbital sowohl durch
Bumetanid als auch durch BUM5 signifikante antikonvulsive Effekte nachgewiesen
werden. Hierbei erwies sich BUM5 als stärker wirksam im Vergleich zur
Ursprungssubstanz. Weder Bumetanid noch BUM5 konnten sowohl bei naiven
Mäusen als auch nach einer SE-Induktion mittels Pilokarpin einen antikonvulsiven
Einfluss auf die Krampfschwellen im PTZ-Krampftest ausüben. Jedoch konnte
beobachtet werden, dass eine durch einen SE unerwartete induzierte
Krampfschwellenerhöhung durch Bumetanid und BUM5 zum Teil antagonisiert
werden konnte. Die in dieser Arbeit erzielten Resultate haben gezeigt, dass BUM5
eine höhere Effektivität besitzt und in Verbindung mit einem GABA-Mimetikum zur
Epilepsietherapie besser geeignet sein könnte als eine vergleichbare Kombination
mit Bumetanid. Im Folgenden sollen die Ergebnisse der einzelnen Studien im
Hinblick auf die aufgestellten Arbeitshypothesen diskutiert werden.
Diskussion
99
Untersuchung zur antiepileptogenen Wirksamkeit von Bumetanid unter 6.1
einer Vorbehandlung mit PBO im Kindling-Modell
Es ist bekannt, dass im Kindling-Modell eine Hochregulation von NKCC1 eintritt
(OKABE et al. 2002; OKABE et al. 2003). Zudem wurde berichtet, dass in einem
abgeänderten Modell (Rapid-Kindling) Bumetanid bei neonatalen Tieren zum Teil
antiepileptogene Effekte ausüben kann (MAZARATI et al. 2009). Aufgrund der
Tatsache, dass Bumetanid von der Ratte sehr schnell metabolisiert wird
(OSTERGAARD et al. 1972; HALLADAY et al. 1978; BRANDT et al. 2010a) wurde in
dieser Arbeit versucht, den Abbau von Bumetanid im Rattenorganismus zu
verzögern, um so die Wirkung von Bumetanid verlängern zu können. Basierend auf
den Untersuchungen von HALLADAY et al. (1978), in denen der Metabolismus von
Bumetanid bei Ratten untersucht wurde, wurde PBO, ein Cyochrom-P450- bzw.
Monooxigenase-Inhibitor vor Bumetanid appliziert, um dessen HWZ zu verlängern.
Die Tiere wurden während einer Aufkindling-Studie täglich mit diesen Substanzen
vorbehandelt. Während dieser Studie wurde zudem täglich die Diurese der Tiere
überwacht. Die zugehörige Arbeitshypothese lautete, dass Bumetanid über eine
HWZ-Verlängerung durch PBO antiepileptogen im Kindling-Modell für TLE bei Ratten
wirkt. Nach Beendigung dieser Studie, die verblindet durchgeführt worden war,
wurden folgende Resultate erzielt: Eine Behandlung mit Bumetanid und PBO
während des Aufkindling-Prozesses erhöhte nicht die Anzahl der benötigten
Stimulationen bis die Tiere einen Anfall der Stufe 5 entwickelt hatten. Ebenfalls
konnte hinsichtlich der Dauer der Aufkindling-Prozedur für die Parameter cSD und
cADD keine verlängerte Dauer zum Erreichen der Krampfstadien 4 und 5 festgestellt
werden. Jedoch konnte ein Trend hin zu einer pro-epileptogenen Wirkung
beobachtet werden, bei einer gleichzeitigen Veränderung klinischer Blutparameter in
Richtung einer beginnenden metabolischen Alkalose. Dies wirft die Frage auf, ob hier
u.U. die Dosis von Bumetanid zu hoch gewählt wurde? Zur Absicherung dieser
Vermutung könnte eine weitere Aufkindling-Studie mit einer deutlich niedrigeren
Bumetanid-Dosis Aufschluss geben, um zu überprüfen, ob damit im Gegensatz zu
den vorliegenden Ergebnissen diese Effekte ausbleiben oder sogar antiepileptogene
Effekte induziert werden können.
Diskussion
100
Ein wichtiges Resultat der vorliegenden Studie bestand darin, dass während der
gesamten Versuchsdauer eine signifikant erhöhte Diurese der behandelten Tiere zu
beobachten war. Diese Tatsache repräsentiert einen wichtigen Marker im Hinblick
auf die HWZ von Bumetanid. So kann aufgrund dieses Sachverhaltes darauf
geschlossen werden, dass mindestens bis zum Beginn der Stimulation sicher eine
diuretisch wirksame Menge an intaktem Bumetanid im Organismus vorhanden war.
Entsprechend dieser Ergebnislage ergeben sich hieraus weitere Fragen: 1. Konnte
von dem im Organismus in diuretisch wirksamer Konzentration vorhandenem
Bumetanid gar nicht, oder nur sehr wenig über die Blut-Hirn-Schranke in das Gehirn
gelangen? Und 2. Falls Bumetanid in das Gehirn diffundieren konnte, war NKCC1 als
Zielstruktur überhaupt ausreichend hochreguliert?
Man geht davon aus, dass die Implantation einer Kindling-Elektrode ähnliche
funktionelle Konsequenzen im Gehirn zur Folge hat, wie nach einem perforierendem
Schädel-Hirn-Trauma (LÖSCHER 2002). Es ist zudem bekannt, dass es durch
verschiedene Hirninsulte, wie z.B. Schädel-Hirn-Traumata zu einer Schädigung der
Blut-Hirn-Schranke kommt (PITKÄNEN und LUKASIUK 2009). Auch Epilepsien
führen zu Schädigungen der Blut-Hirn-Schranke (FRIEDMAN et al. 2009). Darüber
hinaus konnte in zahlreichen Untersuchungen am Nager gezeigt werden, dass
sowohl chemisch als auch elektrisch induzierte Anfälle, wie das Kindling-Modell, zu
Veränderungen der Blut-Hirn-Schranke führen, indem u.a. die Permeabilität für an
Albumin gebundene Substanzen erhöht war (NITSCH und KLATZO 1983; OZTAS et
al. 1990; OZTAS und KAYA 1994; PADOU et al. 1995; OZTAS 1999; OZTAS et al.
2001; VAN VLIET et al. 2007; POTSCHKA et al. 2011). So ist theoretisch vorstellbar,
dass auch eine freie Substanz wie Bumetanid, die bei physiologischem pH-Wert
ionisiert vorliegt und so per se nur schlecht gehirngängig ist (FEIT 1990; BRANDT et
al. 2010a), im Kindling-Modell leichter über die Blut-Hirn-Schranke diffundieren
können müsste. Allerdings liegen bisher keine Veröffentlichungen vor, in denen
speziell untersucht wurde, inwieweit bei einem In-vivo-Modell für Epilepsie anfalls-
induzierte Schädigungen der Blut-Hirn-Schranke die Gehirnpenetration von
Bumetanid erhöhen (LÖSCHER et al. 2012). Hierzu sollten weitere Studien
angeschlossen werden. In der vorliegenden Arbeit konnte unter Anwendung des
gleichen Behandlungsprotokolls bei voll gekindelten Tieren zwar gezeigt werden,
Diskussion
101
dass Bumetanid im Hippokampus in geringen Mengen vorhanden war, jedoch in der
Amygdala und im piriformen Kortex keine nachweisbaren Mengen im HPLC-
Verfahren detektiert werden konnten (siehe Kap. 5.3.3). Dies muss jedoch die
Anwesenheit von Bumetanid in diesen Gehirnregionen nicht ausschließen, da
grundsätzlich auch die Möglichkeit besteht, dass die hier verwendete
Analysemethode nicht empfindlich genug war (das Detektionslimit für Bumetanid
betrug im Hirngewebe 100 ng/g, was einer Konzentration von 0,28 μM entspricht).
Für den piriformen Kortex ist jedoch bekannt, dass es gerade in dieser Region bei
Amygdala-Kindling bereits nach 3 generalisierten Anfällen (in der vorliegenden Arbeit
wurden bei den Versuchstieren 10 generalisierte Anfälle während der Aufkindling-
Phase induziert) zu einer Hochregulation von NKCC1 kommt (OKABE et al. 2002).
Diese Tatsache lässt vermuten, dass diese Region bei der Epileptogenese eine
wichtige Rolle spielen könnte und könnte erklären, warum in dieser hier
durchgeführten Studie keine antiepileptogenen Effekte beobachtet werden konnten.
BRANDT et al. (2010a) berichtete für das Pilokarpin-Modell bei Ratten nach SE über
eine Hochregulation von NKCC1 im Subikulum. Hierbei konnte unter einer
systemischen Bumetanid-Behandlung ebenfalls kein antiepileptogener Effekt
beobachtet werden. Dazu wurde diskutiert, dass eine NKCC1-Hochregulation bei
einer pilokarpin-induzierten Epileptogenese keine tragende Rolle spielen könnte
und/oder, dass die pharmakokinetischen Probleme (kurze HWZ, schlechte
Gehirnpenetration) von Bumetanid einfach keine ausreichend wirksame
Gehirnkonzentration dieser Substanz erlauben (BRANDT et al. 2010a). In einer
weiteren Studie zu einer pilokarpin-induzierten Epileptogenese bei Ratten konnte in
der Körnerzellschicht des Hippokampus eine verminderte Expression von KCC2 und
eine Veränderung des Gleichgewichtspotentials von GABA beobachtet werden,
wobei die Expression von NKCC1 jedoch nicht bestimmt wurde (PATHAK et al.
2007). Eine andere Studie berichtet für das Lithium-Pilokarpin-Modell während der
Epileptogenese über eine Zunahme der KCC2-Expression bei einer gleichzeitigen
Abnahme der NKCC1-Expression im entorhinalen Kortex, was zu einer
exzitatorischen Wirkung von GABA führte. Drei Wochen nach SE konnte in vitro
gezeigt werden, dass mit Bumetanid (Konzentration 10 μM) NKCC1 geblockt werden
konnte und die Veränderungen des Gleichgewichtspotentials von GABA wieder
rückgängig gemacht werden konnten (BRAGIN et al. 2009). Dazu darf jedoch nicht
Diskussion
102
unerwähnt bleiben, dass bisher keine Untersuchung bekannt ist, in der überprüft
wurde, welche Konzentration von Bumetanid nötig ist, um NKCC1 im Gehirn in vivo
zu hemmen. Ob z.B. im Hippokampus, die Region, in der in der vorliegenden Arbeit
bei voll gekindelten Tieren Bumetanid nachgewiesen wurde, NKCC1 zu diesem
Zeitpunkt aber v.a. auch schon während der Aufkindling-Phase überhaupt
ausreichend hochreguliert war, bleibt an dieser Stelle unklar. Darüber hinaus muss
der Einsatz von PBO zur HWZ-Verlängerung von Bumetanid rückblickend als eher
ungeeignet angesehen werden. Nach Abschluss der Studie wurden während der
Perfusion bei allen Versuchstieren große Mengen des während der Versuchsphase
applizierten Öls, das zur Lösung von PBO verwendet wurde, in der Bauchhöhle
vorgefunden (sowohl bei der Behandlungsgruppe als auch bei der Kontrollgruppe,
die das Öl als Vehikel erhalten hatte). Die Tatsache, dass zu diesem Zeitpunkt die
Behandlungsphase bereits Wochen zurücklag, lässt darauf schließen, dass das Öl
praktisch kaum vom Peritoneum resorbiert worden war. Da jedoch PBO nur in Öl
gelöst und appliziert werden kann, erscheint die Verwendung von PBO für ähnliche
weitere Versuchsvorhaben als sehr ungeeignet. Nach Beendigung der Aufkindling-
Phase wurden bei jedem Tier Blutproben zur Evaluierung behandlungsbedingter
Veränderungen klinischer Parameter genommen. Hierbei konnte festgestellt werden,
dass eine mehrwöchige Behandlung mit Bumetanid zu verschiedenen
Veränderungen geführt hat. So wiesen die Chloridwerte im Vergleich zu den
Kontrolltieren einen Trend hin zu einer signifikanten Erniedrigung auf. Zudem waren
die Kaliumwerte leicht erniedrigt. Weiter konnten Veränderungen hinsichtlich der
Blutgase beobachtet werden, indem der pCO2 leicht erniedrigt und der pO2
signifikant zu den Kontrolltieren erniedrigt war. Es konnte auch festgestellt werden,
dass die Werte für Bikarbonat einen Trend hin zu einer signifikanten Erhöhung
aufwiesen und zudem auch der Basenüberschuss erhöht war. Gesamt betrachtet
deuten diese Veränderungen auf die Entstehung einer metabolischen Alkalose hin,
die charakterisiert ist durch einen erhöhten pH-Wert, einen erhöhten pCO2, erhöhtes
Bikarbonat und erniedrigte Chlorid- und Kaliumwerte, was in der Gabe von
Schleifendiuretika begründet liegen kann (FREY und LÖSCHER 2007). Eine
Alkalose (v.a. eine hypokalämische Alkalose) ist ein bekanntes Problem bei einer
Behandlung von Neonaten und Kindern mit Diuretika (GREENBERG 2000). So kann
sich eine systemische Alkalose über eine Erhöhung des pH-Wertes im Gehirn sogar
Diskussion
103
krampf-begünstigend auswirken (SCHUCHMANN et al. 2009; HELMY et al. 2011).
Der pH-Wert im Gehirn konnte in der vorliegenden Studie nicht determiniert werden,
der pH-Wert des Blutes lag jedoch über dem Wert der naiven Tieren und der
Kontrolltiere. Wenn man bedenkt, dass die neurophysiologischen Verhältnisse
während der Epileptogenese neonatale Charakteristika im Hinblick auf die
Ausprägung der Kation-Chlorid-Kotransporter aufweisen (STALEY 2004; BEN-ARI
und HOLMES 2005), so kann an dieser Stelle nicht ausgeschlossen werden, dass
die hier gemessenen erhöhten Bikarbonat-Werte und der deutliche Basenüberschuss
u.U. für die beobachtete pro-epileptogene Wirkung indirekt verantwortlich sein
könnten. Dafür würde auch der gegenüber den Kontrolltieren höhere pH-Wert des
Blutes sprechen. Die generell in dieser Studie gemessenen niedrigen Kalzium-Werte
sind vermutlich haltungsbedingt (Licht? Fütterung?) und sollten diesbezüglich einer
Überprüfung unterzogen werden.
In einer Studie von MAZARATI et al. (2009) bei Rapid-Kindling in neonatalen Ratten
(Tag 11 nach Geburt) konnten zum Teil antikonvulsive Effekte auf Kindling durch
Bumetanid beobachtet werden, bei adulten Tieren, genau wie in der hier
vorliegenden Arbeit jedoch nicht. MAZARATI et al. (2009) konnten zeigen, dass bei
neonatalen Tieren durch eine Vorbehandlung mit Bumetanid das Auftreten
generalisierter Anfälle verzögert als auch deren Anzahl während des Aufkindling-
Prozesses zu den Kontrolltieren vermindert werden konnte. Darüber hinaus konnte
durch diese Behandlung eine durch die Kindling-Entwicklung generierte erhöhte
Krampfempfänglichkeit in einem Großteil der neonatalen Tiere reduziert werden,
indem es zu einer Erhöhung der ADT kam. Ob jedoch eine Verzögerung der
Kindling-Entwicklung einen antiepileptogenen oder einen krankheitsmodifizierenden
Effekt bedeutet, bleibt unklar, da allein der antikonvulsive Effekt von Bumetanid auf
die ADT zu einer Verzögerung der Kindling-Entwicklung geführt haben könnte
(LÖSCHER et al. 2012). Eine Erklärung für einen Effekt von Bumetanid in der Arbeit
von MAZARATI et al. (2009) könnte sein, dass, bezogen auf den Menschen, bei
Neonaten die Blut-Hirn-Schranke für Bumetanid eine höhere Permeabilität aufweist
und Bumetanid zudem langsamer metabolisiert wird (LOPEZ-SAMBLAS et al. 1997).
Es konnte auch gezeigt werden, dass NKCC1 im neonatalen Zustand per se noch
hochreguliert ist (WANG et al. 2002; DZHALA et al. 2005) und in der weiteren
Diskussion
104
Hirnentwicklung wieder runterreguliert wird (HÜBNER et al. 2001; YAMADA et al.
2004). Obwohl darüber diskutiert wird, dass NKCC1 im neonatalen Gehirn
gegenüber dem adulten Gehirn nicht grundsätzlich überexprimiert sein könnte
(BLAESSE et al. 2009), kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine
Hochregulation von NKCC1 für eine effektive Wirkung von Bumetanid in der Arbeit
von MAZARATI et al. (2009) verantwortlich sein könnte. Wie bereits erwähnt, ist auch
bekannt, dass es im Kindling-Modell zu einer Hochregulation von NKCC1 bei adulten
Tieren kommt (OKABE et al. 2002; OKABE et al. 2003). Es besteht hier die
Überlegung, ob bei Rapid-Kindling, einem Modell für komprimierte Epileptogenese
(LOTHMAN et al. 1985), diese Hochregulation ausgeprägter sein könnte als in dem
hier verwendeten Modell. Bisher wurden keine Arbeiten veröffentlicht, in denen die
Expression von NKCC1 in beiden Modellen verglichen wurde. Grundsätzlich kann
jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass hierbei die Wahl des Kindling-Modells
eine Rolle hinsichtlich der Wirkung von Bumetanid gespielt haben könnte.
Eine sehr interessante Option wäre sicherlich in einer weiteren Aufkindling-Studie die
Wirkungen von BUM5 zu untersuchen, da in der Arbeitsgruppe von Prof. Löscher
festgestellt werden konnte, dass BUM5 sowohl bei der Ratte als auch bei der Maus
eine bessere Gehirngängigkeit als Bumetanid besitzt (TÖLLNER et al., eingereicht).
Dabei besteht die Möglichkeit, dass dieses Derivat, entsprechend den Ergebnissen
der anderen in dieser vorliegenden Arbeit durchgeführten Studien, auch hier eine
höhere Effektivität als Bumetanid besitzen könnte und dadurch antiepileptogene
Effekte induziert werden können.
Untersuchungen der antikonvulsiven Wirksamkeit von Bumetanid und 6.2
BUM5 im Kindling-Modell
Im Rahmen dieser Untersuchungen wurden sowohl verschiedene Applikationsformen
als auch mehrere verschiedene Behandlungsprotokolle untersucht, wobei auch
Kombinationen mit PBO oder Phenobarbital zum Einsatz kamen. Der Grund dieser
Untersuchungen bestand in der Überlegung, dass bei voll gekindelten Tieren NKCC1
höher exprimiert sein könnte als während der Aufkindling-Phase. Anschließend an
die Studie zur Antiepileptogenese wurde zunächst unter Verwendung des gleichen
Behandlungsprotokolls eine Applikation von PBO und Bumetanid auf antikonvulsive
Diskussion
105
Wirkung hin untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass diese Kombination im
Kindling-Modell auf keinen der gemessenen Parameter einen signifikanten
antikonvulsiven Einfluss auszuüben in der Lage war. Von PBO ist bekannt, dass es
durch eine Hemmung des Cytochrom-p450 Systems den Metabolismus von
Bumetanid zu hemmen vermag (HALLADAY et al. 1978), sodass auch hier wie in der
Studie zur Antiepileptogenese, bis auf eine Ausnahme, eine erhöhte Diurese
festgestellt werden konnte (siehe Kap. 5.3.2), während antikonvulsive Effekte
ausgeblieben waren. Auch hier stellt sich die Frage, ob NKCC1 nicht ausreichend
hochreguliert war und/oder Bumetanid nicht in ausreichender Konzentration in das
Gehirn penetrieren konnte, um einen Effekt über eine Inhibition von NKCC1 zu
induzieren. Für den Fall, dass beide Bedingungen jedoch so vorlagen, dass eine
Inhibition von NKCC1 stattfinden konnte, könnte für das Ausbleiben von Effekten
eine Erklärung sein, dass ein GABA-switch in Neuronensubpopulationen allein nicht
ausreicht, um antikonvulsive Effekte auszuüben. Grundsätzlich existiert bisher keine
Arbeit, in der für das gesamte Gehirn eine depolarisierende Wirkung von GABA
nachgewiesen werden konnte. Vielmehr konnte in bisher veröffentlichte Studien
jeweils nur für Teilbereiche des Gehirns eine Hochregulation von NKCC1 und/oder
eine depolarisierende Wirkung von GABA nachgewiesen werden. Daran anknüpfend
ergab sich während dieser Dissertation die Überlegung, dass nur durch eine
Verstärkung des GABAergen Systems antikonvulsive Effekte erzielt werden könnten.
Zunächst wurde jedoch, nachdem bis zu diesem Punkt mittels systemischer
Applikation weder antiepileptogene noch antikonvulsive Effekte beobachtet werden
konnten, in einer Folgestudie Bumetanid intrazerebroventrikulär in verschiedenen
Dosierungen und mit unterschiedlichen Vorlaufzeiten vor Beginn der Stimulation
appliziert. Das Ziel dieser Studie war, unter Umgehung des Kreislaufs zu
untersuchen, wie sich Bumetanid nach direkter Applikation in das Gehirn auswirkt.
Nach derzeitigem Kenntnisstand wurden bisher noch keine ähnlichen
Untersuchungen durchgeführt, in denen in In-vivo-Epilepsiemodellen Bumetanid
fokal in das Gehirn bzw. in die Ventrikel appliziert wurde, sodass auch nicht bekannt
ist, welche Dosis von Bumetanid nötig ist, um NKCC1 in vivo im Gehirn zu hemmen
(LÖSCHER et al. 2012). In In-vitro-Studien konnte dahingegen gezeigt werden, dass
eine mittlere inhibitorische Konzentration bereits bei 0,2 - 0,3 μM vorliegt (O'GRADY
Diskussion
106
et al. 1987; RUSSELL 2000; HANNAERT et al. 2002). Normalerweise wird jedoch
eine Bumetanid-Konzentration von 2-10 μM verwendet, um in vitro NKCC1 zu
blocken (PAYNE et al. 2003). In der vorliegenden Arbeit konnte bei Applikation einer
Bumetanid-Dosis von 58,3 ng (Konzentration der Lösung 40 μM) und einer
Vorbehandlungszeit von 30 min zwar kein antikonvulsiver Effekt auf die ADT, jedoch
ein hoch signifikanter antikonvulsiver Effekt hinsichtlich der Nachentladungsdauer im
EEG (für die ADD2) im Vergleich zur Nachkontrolle gezeigt werden, indem die ADD2
verkürzt war. Es könnte sich dabei um einen Hinweis handeln, dass eine Inhibition
von NKCC1 bei diesem Parameter involviert war. Bei einer Erhöhung der Vorlaufzeit
auf 60 min konnte ebenso wie bei einer Bumetanid-Dosis von 14,6 ng (Konzentration
der Lösung 10 μM) und 36,4 ng (Konzentration der Lösung 25 μM) kein Effekt
beobachtet werden. Vielmehr konnte bei Applikation einer Dosis von 583 ng
(Konzentration der Lösung 400 μM) und einer Vorbehandlungszeit von 30 min eine
signifikante Erniedrigung der ADT im Vergleich zur Nachkontrolle beobachtet
werden, was an dieser Stelle einen prokonvulsiven Effekt von Bumetanid bedeutet.
Angesichts bekannter Nebenwirkungen, wie einer massiven Diurese bei
systemischer Verabreichung von Diuretika im klinischen Gebrauch und der
insbesondere bei Kindern bekannten Gefahr des Auftretens einer hypokalämischen
Alkalose (GREENBERG 2000), besteht auch die Möglichkeit, dass eine hier
beobachtete prokonvulsive Wirkung gegenüber der Nachkontrolle damit in
Verbindung gebracht werden könnte. Da eine systemische Alkalose über eine pH-
Wert Erhöhung im Gehirn sogar prokonvulsiv wirken kann (SCHUCHMANN et al.
2009; HELMY et al. 2011), ist es nicht unwahrscheinlich, dass die durch eine fokale
Applikation von Bumetanid möglicherweise induzierte Alkalose im Gehirn ähnliche
Konsequenzen nach sich zieht. Eine interessante Option wäre dabei, durch fokale
Bumetanid-Gabe mögliche entstandene Alterationen des pH-Wertes im Gehirn zu
evaluieren, was jedoch in vivo kaum realisierbar erscheint. So bleibt abzuwarten, ob
u.U. in Fortsetzungsprojekten weiter bestätigt werden könnte, dass Bumetanid bei
einer Dosis von 58,3 ng i.c.v. zumindest in Teilen antikonvulsive Eigenschaften
besitzt und gleichzeitig bei einer zehnfach höheren Dosierung im Kindling-Modell
mitunter sogar prokonvulsive Eigenschaften ausübt.
Diskussion
107
Es darf an dieser Stelle nicht unerwähnt bleiben, dass nach i.c.v.-Applikation von 583
ng z.B. im Hippokampus eine um etwa eine Zehnerpotenz niedrigere Menge von
Bumetanid mittels HPLC-Verfahren detektiert werden konnte, als nach einer
kombinierten Applikation von zweimal PBO (i.p.) und Bumetanid (i.v.) (siehe auch
Kap. 5.3.3 und 5.3.5). Entsprechend dieser gemessenen Gehirnspiegel könnte
daraus der Schluss folgen, dass Bumetanid aus den Ventrikeln anscheinend nur sehr
schlecht über die Liquor-Hirn-Schranke in das Gehirngewebe diffundieren konnte.
Weiter wäre es interessant, mittels HPLC-Verfahren zu evaluieren, welche Menge an
intakten Bumetanid zum Zeitpunkt der Stimulation im Liquor noch vorhanden ist, um
zu überprüfen, inwieweit und vor allem wie schnell bei der Ratte ein enzymatischer
Abbau von Bumetanid im Liquor stattfindet.
Im Zuge dieser Ph.D-Arbeit wurde weiter untersucht, ob Bumetanid oder BUM5 allein
einen antikonvulsiven Effekt im Kindling-Modell ausüben können. Hierbei stellte sich
heraus, dass keine der beiden Substanzen Veränderungen hinsichtlich der ADT oder
anderer gemessener Parameter bewirken konnte. Jedoch kann vermutet werden,
dass bei alleiniger Applikation von Bumetanid bzw. BUM5 eine, wenn auch nicht
sichtbare Interaktion mit NKCC1 stattgefunden haben müsste. Der Grund dafür
besteht darin, dass in Kombination mit Phenobarbital, in einer Dosierung bei der
Phenobarbital allein unwirksam war, signifikante antikonvulsive Effekte erzielt werden
konnten. Eine hier verwendete Kombination aus Phenobarbital und Bumetanid bzw.
BUM5 basierte auf zwei bisherigen Untersuchungen: DZHALA et al. (2008) konnte in
einem neonatalen Krampfmodell zeigen, dass sich eine Behandlung mit Bumetanid
und Phenobarbital als effektiver erwies als mit Bumetanid allein. BRANDT et al.
(2010a) wiederum berichtete, dass in einem Modell für Antiepileptogenese mit einer
Kombination aus Bumetanid und Phenobarbital krankheitsmodifizierende Effekte
erzielt werden können, während dies mit keiner Substanz allein möglich war
(BRANDT et al. 2010a). So wurde im Rahmen dieser vorliegenden Arbeit die
Hypothese aufgestellt, dass eine Kombination dieser beiden Substanzen zu
antikonvulsiven Effekten im Kindling-Modell führt. In der Theorie sollte zuerst durch
eine Gabe von Bumetanid der intrazelluläre Chlorid-Gehalt, hervorgerufen durch eine
Hochregulation von NKCC1 (OKABE et al. 2002; OKABE et al. 2003), gesenkt
werden. Für Furosemid (ebenfalls ein Inhibitor von Kation-Chlorid-Kotransportern) als
Diskussion
108
auch für Bumetanid konnte gezeigt werden, dass durch eine Blockade von Kation-
Chlorid-Kotransportern der intrazelluläre Chlorid-Gehalt gesenkt und somit kainat-
induzierte Anfälle bei Ratten unterdrückt werden konnten (SCHWARTZKROIN et al.
1998). Der verminderte intrazelluläre Chlorid-Gehalt sollte zunächst zu einer Umkehr
der Wirkung des depolarisierenden GABA führen, um dann im nächsten Schritt durch
Phenobarbital die GABAerge Wirkung zu erhöhen, da Phenobarbital über eine
Modulation am GABAA-Rezeptor eine Steigerung der GABA-vermittelten
inhibitorischen synaptischen Transmission bewirkt (ROGAWSKI und LÖSCHER
2004). Diese Hypothese konnte im Zuge dieser Arbeit bestätigt werden. Darüber
hinaus konnte gezeigt werden, dass hierbei BUM5 sogar eine effektivere Wirkung als
Bumetanid selbst aufwies. Eine alleinige systemische Vorbehandlung weder mit
Bumetanid noch mit BUM5, zweimalig in einem Intervall von 30 Minuten appliziert,
konnte keinen Einfluss auf die Nachentladungsschwelle der amygdala-gekindelten
Tiere ausüben. Somit schienen weder Bumetanid noch BUM5 in der Lage zu sein, in
ausreichender Konzentration im Gehirn zu akkumulieren. Diese Überlegung passt zu
den Ergebnissen von JAVAHERI et al. (1993), in der an gesunden Hunden gezeigt
werden konnte, dass Bumetanid bei systemischer Applikation einer sogar 5-fach
höheren Dosierung wie in der vorliegenden Arbeit nicht die Elektrolyt-
Zusammensetzung im Liquor verändern konnte (JAVAHERI et al. 1993). Dies lässt
eigentlich darauf schließen, dass Bumetanid ggf. auch BUM5 bei systemischer Gabe
nicht oder nur kaum die Blut-Hirn-Schranke überwinden kann. Jedoch konnte bei
einer Kombination mit Phenobarbital, in einer Dosierung bei der Phenobarbital allein
unwirksam war, erreicht werden, dass durch eine Kombination mit Bumetanid oder
BUM5 die antikonvulsiven Eigenschaften dieses GABA-Mimetikums signifikant
verstärkt wurden. Dies lässt darauf schließen, dass Bumetanid bzw. BUM5 in einer
gewissen Menge in das Gehirn diffundieren konnte. Im Gehirn angekommen konnte
Bumetanid allein zwar keinen antikonvulsiven Effekt induzieren, jedoch liegt die
Vermutung nahe, dass die Substanz soweit NKCC1 blockieren konnte, um einer
inhibitorischen Wirkung von GABA zumindest den ,,Weg zu ebnen‘‘. Dies war jedoch
nicht ausreichend, um allein antikonvulsive Effekte zu induzieren, jedoch konnte
durch eine zusätzliche Verabreichung des GABA-Mimetikums Phenobarbital die
hyperpolarisierende Wirkung von GABA potenziert werden. Im ersten Schritt konnte
bereits mit einer einmaligen gleichzeitigen intravenösen Vorbehandlung mit
Diskussion
109
Bumetanid und Phenobarbital (30 min vor ADT-Bestimmung) eine hoch signifikante
Erhöhung der ADT beobachtet werden. Bei gleichem Schema und einer zusätzlichen
Applikation von Bumetanid, 60 min vor Bestimmung der ADT konnte ebenfalls eine
hoch signifikante Erhöhung der ADT beobachtet werden. Die Ergebnisse haben
gezeigt, dass es grundsätzlich wohl keine Rolle zu spielen scheint, ob Bumetanid
zusätzlich vor oder zusammen mit Phenobarbital verabreicht wird. Die Gabe von
Bumetanid gefolgt von einer Verabreichung von Phenobarbital wird für den klinischen
Einsatz bei Neonaten aufgrund der Überlegung empfohlen, dass zuerst durch eine
Gabe von Bumetanid der intrazelluläre Chlorid-Gehalt gesenkt werden soll, was in
einer Umkehr der Wirkung von GABA resultiert, um darauf durch Phenobarbital (oder
einem anderen Benzodiazepin) die GABAerge Wirkung zu erhöhen (NARDOU et al.
2011). Für den Fall einer Verabreichung von Phenobarbital vor Gabe von Bumetanid
besteht die Theorie, dass es vor allem in geschädigten Neuronen (z.B. nach
Hirninsulten) durch Phenobarbital zu einer zusätzlich Akkumulation von Chlorid in
den Nervenzellen kommt, wodurch die Wirkung von Bumetanid auf GABA
beeinträchtigt würde (LÖSCHER et al. 2012). Es konnte jedoch in einem Modell für
neonatale Asphyxie und Ischämie an Ratten gezeigt werden, dass bei einer
Bumetanid-Applikation nach Verabreichung von Phenobarbital signifikante
neuroprotektive Effekte erzielt werden können (LIU et al. 2012), was letztendlich nicht
gegen eine Verwendung dieser Reihenfolge spricht. Weiter konnte festgestellt
werden, dass BUM5 ein stärkeres antikonvulsives Potential besitzt, indem der ADT-
Anstieg zur Vor-und Nachkontrolle 43 bis 58% betrug, während der Anstieg unter
einer Bumetanid-Behandlung bei 28 bis 30% zur Vor- und Nachkontrolle lag. Darüber
hinaus konnten mit BUM5 die SD1 und ADD2 signifikant gegenüber der Vor- und
Nachkontrolle reduziert werden. Ein Grund für die höhere Effektivität von BUM5 kann
in einer höheren Gehirngängigkeit dieser Substanz im Vergleich zu Bumetanid
gesehen werden (TÖLLNER et al., eingereicht). Soweit im Rahmen dieser Arbeit
möglich konnten unter Variationen der Behandlungsprotokolle hinsichtlich der
Vorbehandlungszeit oder der Dosierung von BUM5 keine weiteren signifikanten
antikonvulsiven Effekte beobachtet werden.
Diskussion
110
Eine interessante Option wäre daher, in einem nächsten Schritt im Kindling-Modell
eine i.c.v.-Applikation von BUM5 zu untersuchen, um zu überprüfen, ob sich dieses
Derivat auch bei fokaler Applikation als effektiver erweist als Bumetanid.
Untersuchungen zur Wirkung von Bumetanid und BUM5 nach SE-6.3
Induktion im PTZ-Krampftest
In dieser Studie wurde an adulten Mäusen im Pilokarpin-Modell für
Temporallappenepilepsie eine SE-Induktion vorgenommen, da bekannt ist, dass
durch einen SE eine Hochregulation von NKCC1 induziert wird (LI et al. 2008).
Zudem handelt es sich hierbei um die erste bekannte Studie, in der bei Mäusen die
Auswirkungen eines SE auf die PTZ-Krampfschwelle untersucht wurden. Nach SE
wurde zu verschiedenen Zeitpunkten unter einer Vorbehandlung mit Bumetanid bzw.
BUM5 die PTZ-Schwelle als Biomarker erhöhter neuronaler Aktivität während der
Latenzphase bestimmt. Zusätzlich wurde an naiven Tieren der PTZ-Krampftest unter
einer Vorbehandlung mit Bumetanid bzw. BUM5 vorgenommen. In diesen Gruppen
konnte beobachtet werden, dass weder Bumetanid noch BUM5 in der Lage waren,
einen Einfluss auf die Krampfschwelle auszuüben. Der Grund könnte darin liegen,
dass Bumetanid bei der Maus nicht bzw. in nur unzureichender Menge die Blut-Hirn-
Schranke überwinden kann, was bereits in früheren Arbeiten für den Hund und die
Ratte gezeigt werden konnte (JAVAHERI et al. 1993; BRANDT et al. 2010a; LI et al.
2011). Die hier erzielten Resultate stehen zudem im Einklang mit der Datenlage,
dass aufgrund der Tatsache, dass im adulten Nager die NKCC1-Expression niedrig
ist, Bumetanid in akuten Epilepsiemodellen nicht in der Lage ist, antikonvulsive
Effekte auszuüben (LÖSCHER et al. 2012). Bereits OSTERGAARD et al. (1972)
berichtete, dass bei i.p.-Applikation von Bumetanid (75 mg/kg) bei adulten Mäusen
im PTZ- und MES (maximum-electroschock)-Test keine Veränderungen hinsichtlich
der Krampfschwelle beobachtet werden konnten (OSTERGAARD et al. 1972).
Vierundzwanzig Stunden nach SE-Induktion wurde bei einer ersten Tiergruppe der
PTZ-Krampftest vorgenommen. Hierbei handelte es sich um einen Zeitpunkt für den
gezeigt werden konnte, dass hier die NKCC1-Expression am stärksten ausgeprägt ist
(LI et al. 2008). Es zeigte sich, dass bei naiven Tieren unter einer Vorbehandlung mit
Bumetanid kein Einfluss auf die Krampfschwelle ausgeübt werden konnte.
Diskussion
111
Unerwartet kam es zu einem generellen Anstieg der Krampfschwelle nach SE, wobei
Bumetanid in der Lage zu sein schien diesen Anstieg teilweise antagonisieren zu
können (bei den Endpunkten Clonic seizure without loss of righting reflexes und
Clonic seizure with loss of righting reflexes). Teilweise ähnliche Beobachtungen
konnten auch 48 h nach SE gemacht werden. Der genannte generelle Anstieg der
Krampfschwelle nach SE steht deutlich im Gegensatz zu den Untersuchungen von
RATTKA et al. (2011), worin für Ratten gezeigt werden konnte, dass kurz nach SE
eine signifikante Erniedrigung der Krampfschwelle zu verzeichnen war (RATTKA et
al. 2011). Eine Woche nach SE konnte wiederum festgestellt werden, dass sich die
ersten 4 gemessenen Endpunkte ungefähr wieder auf dem Niveau von naiven Tieren
bewegten, während die letzten beiden Endpunkte (Forelimb tonus und Hindlimb
tonus) signifikant erniedrigt waren. Dabei handelt es sich um einen Zeitpunkt, an dem
nach SE eine deutliche Abnahme in der Expression von NKCC1 nachgewiesen
werden konnte (LI et al. 2008). Dementsprechend konnte 1 Woche nach SE auch
kein Effekt durch Bumetanid auf die Krampfschwelle beobachtet werden.
Bei einer Vorbehandlung mit BUM5 24 h nach SE konnte beobachtet werden, dass
diese Substanz in der Lage war, einen Anstieg der Krampfschwelle nach SE für die
Endpunkte Forelimb tonus und Hindlimb tonus zu antagonisieren. Darüber hinaus
konnte festgestellt werden, dass BUM5 den Anstieg der Krampfschwelle nach SE
auch gegenüber Bumetanid antagonisieren konnte, indem die Schwelle zum
Erreichen der Endpunkte Forelimb tonus und Hindlimb tonus zur Bumetanid-Gruppe
signifikant erniedrigt war. Dieser Sachverhalt zeigt, dass BUM5 eine höhere
Effektivität als Bumetanid zu besitzen scheint. Um diesen Effekt verständlich zu
machen, muss an dieser Stelle auf den beobachteten Anstieg der PTZ Schwelle
nach SE genauer eingegangen werden. Ein grundsätzlicher Erklärungsversuch für
einen Anstieg der Krampfschwelle könnte folgendermaßen lauten: Physiologisch
wirkt GABA inhibitorisch und PTZ als GABA-Antagonist dementsprechend
prokonvulsiv. Nach einem SE als Hirninsult wirkt GABA verursacht durch eine
transiente Hochregulation von NKCC1 (LI et al. 2008) depolarisierend, wodurch die
GABA-antagonistische Wirkung von PTZ hierbei zu einem Anstieg der
Krampfschwelle führt. Diese Theorie könnte darin bestätigt worden sein, dass in der
vorliegenden Arbeit durch die Gabe von BUM5 wieder eine Umkehr von GABA hin zu
Diskussion
112
einer inhibitorischen Wirkung induziert werden konnte, indem ein Anstieg der
Krampfschwelle zum Teil antagonisiert wurde.
MARES (2009) berichtete bei PTZ-induzierten Anfällen über antikonvulsive Effekte
durch eine Vorbehandlung mit Bumetanid bei juvenilen Ratten, während dieser
Sachverhalt sowohl bei jüngeren als auch bei älteren Tieren nicht beobachtet werden
konnte. Dabei wurde festgestellt, dass eine Vorbehandlung mit Bumetanid (von nur
0,2 bis 1 mg/kg i.p.) lediglich bei zwölf Tage alten Tieren zu einer dosisabhängigen
Abnahme des Auftretens von generalisierten tonisch-klonischen Anfällen geführt hat.
Eine Erhöhung der Dosis auf 2,5 mg/kg hatte keinen Einfluss auf tonische Anfälle,
aber verzögerte wiederum das Auftreten von generalisierten Anfällen bei der Gruppe
von zwölf Tage alten Tieren. Die Ursache für das Ausbleiben eines deutlichen
antikonvulsiven Effekts vermutete MARES in der relativ fortgeschrittenen Reifung der
Neurone im Hirnstamm, der Region, in der generalisierte tonische Krampfaktivität
ihren Ursprung hat (MARES 2009). In der vorliegenden Arbeit wurden für den PTZ-
Test adulte Mäuse verwendet. Diese Tiere hatten vor dem PTZ-Test teilweise einen
pilokarpin-induzierten SE durchlaufen, um die Epileptogenese zu induzieren (LI et al.
2008), ein Vorgang in dem sich adulte Neurone in Richtung neonataler
Eigenschaften verändern (COHEN et al. 2002; STALEY 2004; BEN-ARI und
HOLMES 2005). In der Theorie könnten dadurch die gleichen oder zumindest
ähnliche neurophysiologische Bedingungen geschaffen worden sein wie bei
neonatalen Ratten. So konnte in dieser Studie am adulten Mausmodell gezeigt
werden, dass SE-bedingte Veränderungen der PTZ-Krampfschwelle durch
Bumetanid und BUM5 zum Teil antagonisiert werden können.
Der hier erwähnte Anstieg der PTZ-Krampfschwelle nach SE bei Mäusen, im
Vergleich zum Absinken der Schwelle nach SE bei Ratten (RATTKA et al. 2011) legt
den Gedanken nahe, dass sich in diesen beiden Tierspezies zumindest betreffend
das Pilokarpin-Modell die neurophysiologischen Verhältnisse v.a. nach SE deutlich
voneinander abzugrenzen scheinen. Für Ratten ist bekannt, dass die Latenzzeit im
Pilokarpin-Modell nach SE ungefähr eine Woche beträgt (GOFFIN et al. 2007). Es ist
anzunehmen, dass in diesem Zeitraum ein veränderter neuronaler Chlorid-Haushalt
im Gehirn zu einer depolarisierenden Wirkung von GABA führt (LÖSCHER et al.
Diskussion
113
2012). Direkt bezogen auf die unterschiedlichen Krampfschwellen bei Ratten und
Mäusen kurz nach SE kann vermutet werden, dass sich ein GABA-switch hin zu
einer depolarisierenden Wirkung anscheinend bei Mäusen einfach zu einem früheren
Zeitpunkt vollzieht als bei Ratten. Der Anstieg der Krampfschwelle durch den GABA-
Antagonisten PTZ könnte hierfür einen Hinweis liefern. Um etwaige
Speziesunterschiede genauer charakterisieren zu können, wäre die Durchführung
von imunhistochemischen Untersuchungen zum Nachweis der NKCC1-Expression
ein nützliches Hilfsmittel. Für derartige Untersuchungen sind hierfür jedoch dringend
benötigte hochspezifische Antikörper für NKCC1 leider nicht erhältlich (BLAESSE et
al. 2009; LÖSCHER et al. 2012).
Aufgrund der überraschenden Datenlage hinsichtlich des beobachteten Anstiegs der
Krampfschwelle bei Mäusen wurden im Zuge der Anfertigung dieser Dissertation in
Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Rüdiger Köhling am Oskar-
Langendorff Institut für Physiologie der Universität Rostock elektrophysiologische
Untersuchungen (perforated-patch-clamp-Messungen) an Hippokampalschnitten von
Mäusen nach einem pilokarpin-induzierten SE durchgeführt. Leider ergaben sich
dabei massive methodische ex vivo Probleme, sodass in die vorliegende Dissertation
keine diesbezüglichen Daten einfließen konnten. Aus diesem Grund könnte ein
nächster Schritt darin bestehen, einen neuen optimierten Versuch zu starten, um die
physiologischen Zusammenhänge des hier beobachteten Anstiegs der
Krampfschwelle kurz nach SE weiter zu evaluieren.
Letztendlich konnte im Rahmen der in dieser Ph.D.-Arbeit durchgeführten Studie
gezeigt werden, dass das Bumetanid-Derivat BUM5 in der Lage war, einen
unerwarteten Anstieg der Krampfschwelle 24 h nach SE teilweise zu antagonisieren,
indem die Schwelle zum Erreichen der Endpunkte Forelimb tonus und Hindlimb
tonus zur Bumetanid-Gruppe signifikant erniedrigt war. Somit war BUM5 effektiver
als Bumetanid, was darauf zurückgeführt werden kann, dass bei Mäusen mit BUM5
signifikant höhere Gehirnspiegel von Bumetanid erreicht werden können als mit der
Ursprungssubstanz selbst (TÖLLNER et al., eingereicht). Dieses Resultat könnte auf
einen krankheitsmodifizierenden Effekt durch BUM5 hindeuten. Es wäre sehr
interessant, in einer Folgestudie Bumetanid bzw. BUM5 mit Phenobarbital zu
Diskussion
114
kombinieren, um zu evaluieren, ob auch in diesem Modell die antikonvulsive Wirkung
eines GABA-Agonisten potenziert werden kann.
Schlussbetrachtung 6.4
Es ist bekannt, dass es während der Epileptogenese, ähnlich dem neonatalen
Zustand, zu einer Veränderung in der Expression von Kalium-Chlorid-Kotransportern
kommt (KÖHLING 2002; STALEY 2004; BEN-ARI 2005). Inhibitoren von Kation-
Chlorid-Kotransportern und dabei vor allem der diuretisch wirksame NKCC1-Inhibitor
Bumetanid werden als mögliche Option zur Behandlung von Epilepsien vermutet
(LÖSCHER et al. 2012). Im Kindling-Modell für Temporallappenepilepsie bei Ratten
konnten Veränderungen in der Expression von NKCC1 und KCC2 beschrieben
werden (OKABE et al. 2002; RIVERA et al. 2002; OKABE et al. 2003). Ebenso
konnte für das Pilokarpin-Modell eine veränderte Expression von NKCC1
nachgewiesen werden (LI et al. 2008; BRANDT et al. 2010a). Das Ziel dieser Ph.D.-
Arbeit bestand darin, das antiepileptogene und antikonvulsive Potential von
Bumetanid in diesen Nagermodellen für Temporallappenepilepsie näher zu
charakterisieren und dabei mit der Wirkung des Derivats BUM5 zu vergleichen.
Es konnte demonstriert werden, dass Bumetanid und insbesondere das
neuentwickelte Derivat BUM5 zur Behandlung von Epilepsien als Zusatz-Therapie zu
Phenobarbital geeignet sein könnte. Eine Kombination von Bumetanid und
Phenobarbital wird derzeit in klinischen Studien zur Behandlung von neonatalen
Krampfanfällen in Europa und den USA evaluiert (FDA IND No. 101690:
http://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00830531; EU FP7 NEMO: http://www.nemo-
europe.com/). Inwieweit bei den hier beobachteten Wirkungen eine Inhibition von
NKCC1 involviert war kann letztendlich zwar vermutet aber nicht sicher bestätigt
werden. Neben Bumetanid und Furosemid werden auch für andere Diuretika, die
nicht über NKCC1 oder KCC2 wirken, antiepileptische Eigenschaften diskutiert. So
konnten für Chlorothiazid, welches den in der Niere exprimierten Na-Cl-Kotransporter
NCC hemmt (GAMBA et al. 1993; MASTROIANNI et al. 1996), sowohl im Tiermodell
als auch am Menschen antiepileptische Effekte nachgewiesen werden
(HESDORFFER et al. 1996; HESDORFFER et al. 2001). Angesichts der Tatsache,
dass NCC im menschlichen Gehirn aber gar nicht vorkommt (MASTROIANNI et al.
Diskussion
115
1996), besteht die Möglichkeit, dass antikonvulsive Effekte durch Diuretika wie
Chlorothiazid aber auch Bumetanid und Furosemid unter Umständen zumindest
teilweise auf metabolischem, hormonellem, kardiorespiratorischem Weg oder auf
eine andere Art und Weise zustande kommen, die letztendlich nur indirekt mit
zentralnervösen Strukturen verbunden ist (BLEICH 2009; BOCKENHAUER et al.
2009; SCHUCHMANN et al. 2009; LÖSCHER und KÖHLING 2010; LÖSCHER et al.
2012).
Ein grundsätzliches Problem bei der klinischen Anwendung von Bumetanid besteht
jedoch in seiner sehr stark diuretischen Wirkung, die insbesondere bei Neonaten und
kleinen Kindern über eine hypokalämische Alkalose sogar anfalls-begünstigend
wirken kann (GREENBERG 2000; SCHUCHMANN et al. 2009; HELMY et al. 2011).
Eine Alternative stellt hierbei das weniger diuretisch wirksame und besser
gehirngängige Derivat BUM5 dar (TÖLLNER et al., eingereicht), für das im Rahmen
dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass es sowohl im Pilokarpin-Modell als auch
im Kindling-Modell für TLE deutlichere antikonvulsive Wirkungen aufwies als
Bumetanid selbst. Weitere Studien in Modellen für Epileptogenese sollten an diese
vielversprechenden Ergebnisse angeschlossen werden, um das antiepileptogene
Potential von BUM5 zu charakterisieren.
Zusammenfasssung
116
7 Zusammenfassung
Manuel Töpfer
Untersuchungen zur antiepileptogenen und antikonvulsiven Wirkung des
NKCC1-Inhibitors Bumetanid
Epilepsien zählen zu den häufigsten neurologischen Erkrankungen bei Mensch und
Tier. In der Tiermedizin sind vor allem Hunde und Katzen betroffen. Symptomatische
Epilepsieformen wie die Temporallappenepilepsie entwickeln sich typischerweise mit
einer Latenzzeit von Monaten bis Jahren nach Hirninsulten, wie Schädel-Hirn-
Traumata, Schlaganfällen, Entzündungen oder auch nach einem Status epilepticus.
Während dieser Zeit im Gehirn der Betroffenen ablaufende Veränderungen werden
unter dem Begriff Epileptogenese subsumiert. Derzeit existiert keine effektive
Möglichkeit, während der Epileptogenese präventive Maßnahmen zu ergreifen, um
die Entwicklung von Epilepsien entweder ganz zu unterbinden oder wenigstens einen
milderen Verlauf dieser Erkrankung erreichen zu können. Somit handelt es sich bei
Epilepsie um eine Erkrankung, bei der die Risikogruppe zwar wohl bekannt ist,
jedoch bis jetzt keine therapeutische Option verfügbar ist, diese erfolgreich
prophylaktisch behandeln zu können.
Seit einigen Jahren ist bekannt, dass sich nach Hirninsulten während der
Epileptogenese adulte Neurone in Richtung neonataler Eigenschaften verändern, die
die für Epilepsien typische Übererregbarkeit des Gehirns teilweise erklären könnte. In
diesem Kontext kommt es in den Nervenzellen durch eine erhöhte Expression des
Natrium-Kalium-Chlorid-Kotransporters NKCC1 und eine gleichzeitige verminderte
Expression des Kalium-Chlorid-Kotransporters KCC2 zu einer erhöhten
intrazellulären Chlorid-Akkumulation. Dieser während der Ontogenese eigentlich
physiologische Zustand hat im ausgereiften Gehirn pathologische Konsequenzen. So
lässt der GABA-gekoppelte Chloridkanal nach Aktivierung durch den eigentlich
inhibitorisch wirksamen Neurotransmitter GABA plötzlich Chlorid aus der Zelle statt in
die Zelle, wodurch die neuronale Membran depolarisiert anstatt hyperpolarisiert wird.
Zusammenfasssung
117
Somit verändert sich die Wirkung von GABA von inhibitorisch zu exzitatorisch,
sodass die Neurone durch GABA erregt statt gehemmt werden. Die Konsequenzen
könnten dabei sein, dass dadurch zum einen die Epileptogenese erst entsteht und
zum anderen GABA-potenzierende Antiepileptika während der Epileptogenese
unwirksam sind oder sogar pro-epileptogen wirken könnten.
Das Diuretikum Bumetanid ist aufgrund seines Wirkungsmechanismus als NKCC-
Inhibitor in den letzten Jahren als mögliche neue therapeutische Option zur
Behandlung von Epilepsien, aber auch zur Behandlung anderer Erkrankungen wie
zerebralen Ödemen oder Autismus, zunehmend in den Fokus der Wissenschaft
gerückt. Das Ziel dieser Ph.D.-Arbeit war, mithilfe von In-vivo-Modellen für
Temporallappenepilepsie zu untersuchen, inwieweit Bumetanid als neue Option zur
Epilepsieprävention und -behandlung für Mensch und Tier ein probates Mittel
darstellen könnte.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte festgestellt werden, dass in Kombination mit dem
Antiepileptikum Phenobarbital in einer Dosierung, bei der Phenobarbital alleine
unwirksam war, kombiniert mit Bumetanid oder dem neusynthetisierten Derivat
BUM5 signifikante antikonvulsive Effekte erzielt werden können. Das Ziel war dabei,
NKCC1 zuerst durch Bumetanid bzw. BUM5 zu blocken, um so über eine
Verminderung der intrazellulären Chloridmenge die GABAerge Inhibition von
Phenobarbital zu potenzieren. Die erzielten Resultate zeigen, dass diese Strategie
erfolgreich war. Hierbei erwies sich zudem BUM5 als die potentere Substanz von
beiden. Weder mittels intrazerebroventrikulärer Applikation von Bumetanid noch
unter einer intravenösen Behandlung mit Bumetanid oder BUM5 allein konnten bei
voll gekindelten Ratten antikonvulsive Effekte beobachtet werden. Darüber hinaus
konnten im Kindling-Modell, trotz einer Halbwertszeitverlängerung von Bumetanid
mittels Piperonylbutoxid, keine antiepileptogenen Effekte erzielt werden. Vielmehr
ließ sich hierbei ein leicht pro-epileptogener Effekt erkennen. Im Pentylentetrazol-
Krampftest bei Mäusen konnte kurz nach einem pilokarpin-induzierten Status
epilepticus ein unerwarteter Anstieg der Krampfschwelle beobachtet werden, der mit
BUM5 und Bumetanid teilweise antagonisiert werden konnte. Hierbei erwies sich
BUM5 24 h nach Status epilepticus in Teilen effektiver als Bumetanid. Weder
Zusammenfasssung
118
Bumetanid noch BUM5 konnte bei naiven Tieren oder zu einem späteren Zeitpunkt
nach SE einen Effekt auf die PTZ-Krampfschwelle ausüben.
Die im Rahmen dieser Ph.D.-Arbeit erzielten Resultate geben Anstoß für zahlreiche
weitere Studien, um vor allem das antiepileptogene Potential von BUM5 zu
charakterisieren. Zum jetzigen Zeitpunkt kann festgehalten werden, dass BUM5,
auch aufgrund seiner geringeren diuretischen Wirkung, in Verbindung mit einem
GABA-Agonisten zur Behandlung von Epilepsien besser geeignet sein könnte als
Bumetanid.
Summary
119
8 Summary
Manuel Töpfer
Investigations on antiepileptogenic and anticonvulsive effects of the NKCC1-
inhibitor bumetanide
Epilepsies represent among the most common neurologic diseases in humans, dogs
and cats. Symptomatic epilepsies and particular temporal lobe epilepsy can be
induced by a variety of brain insults, including traumatic brain injury, stroke,
inflammations or status epilepticus. After a latency period, termed epileptogenesis,
that can take several months or even years, spontaneous recurrent seizures may
occur. Up to now no antiepileptogenic drug treatments are available to prevent or to
modify the development of epilepsy. Therefore, epilepsy represents a disease where
patients at risk are well known but no prophylactic treatment exists so far. For some
years now, it is known that during epileptogenesis several neuronal changes
progress, which could partly explain the development of cerebral hyperexcitability
and indicates recapitulation of ontogenesis. In this context it is known that after brain
insults the potassium-chloride-co-transporter KCC2 is downregulated while the
sodium-potassium-chloride-co-transporter NKCC1 is upregulated, leading to an
increase of intracellular chloride and to a shift from hyperpolarizing, inhibitory to
depolarizing and even excitatory GABA action that contributes to the development of
neuronal hyperexcitability in the brain. On the one hand this process itself might
induce epileptogenesis and on the other hand could be the reason why GABA-
potentiating antiepileptic drugs are ineffective or could even act pro-epileptogenic
during epileptogenesis.
During recent years the diuretic drug bumetanide has attracted much scientific
interest as a new putative therapeutic option due to its mechanism of selectively
blocking NKCC. Furthermore it has been implicated in the treatment of conditions
such as cerebral edema or autism. The objective of this Ph.D.-Thesis was, to
investigate in in-vivo-models of temporal lobe epilepsy, whether bumetanide would
Summary
120
be a useful tool for human and veterinary use to prevent epileptogenesis as well as
to treat epilepsy.
Within this study it could be demonstrated that bumetanide as well as the newly
synthesized prodrug BUM5 were able to potentiate significantly the anticonvulsive
effects of the antiepileptic drug phenobarbital at a dosage at which phenobarbital
alone was ineffective. The goal was in a first step, to block NKCC1 with
bumetanide/BUM5 and thereafter to administer the GABA-agonist phenobarbital to
enhance the potency of GABAergic action. The results demonstrate that this strategy
led to success. Furthermore, it could be observed that BUM5 was more effective
compared to the parent drug. Nor intracerebroventricular neither intravenous
treatment with bumetanide or BUM5 were able to induce anticonvulsive effects in
fully kindled rats. Furthermore, prolongation of the half-life of bumetanide via
pretreatment with piperonyl butoxide did not lead to antiepileptogenic effects in the
kindling model. In contrast, a slightly pro-epileptogenic effect could be observed.
Shortly after a pilocarpine-induced status epilepticus in mice, an increase of the
seizure threshold could be observed which was unexpected. This increase could be
partly counteracted by both BUM5 and bumetanide. 24 hours after status epilepticus
it could be observed that BUM5 was partly more effective than the parent drug. Nor
bumetanide neither BUM5 could alter the PTZ-seizure-threshold in non-epileptic mice
or at later time points after status epilepticus.
These results give rise to perform additional studies, in order to further characterize
the antiepileptogenic potency of BUM5. At this stage it can be assumed that
compared to bumetanide, the less diuretic drug BUM5, as adjunct to GABA-agonists,
would be a better option for the treatment of epilepsy.
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Turski (1983). "Limbic seizures produced by pilocarpine in rats - behavioral, electroencephalographic and neuropathological study." Behavioural Brain Research 9: 315-335.
Twyman, R. E., C. J. Rogers and R. L. Macdonald (1989). "Differential regulation of
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Literaturverzeichnis
136
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anticonvulsants and bumetanide on 4-aminopyridine-induced seizure-like events in immature rat hippocampal-entorhinal cortex slices." Epilepsia 52: 94-103.
Walcott, B. P., K. T. Kahle and J. M. Simard (2012). "Novel treatment targets for
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Wang, D. D. and A. R. Kriegstein (2009). "Defining the role of gaba in cortical
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Anhang
137
10 Anhang
Geräte und Verbrauchsmaterialen 10.1
Tierhaltung und Versorgung
Verbrauchmaterial Bezugsquelle
Makrolonkäfig (Typ I, III und IV) Ebeco, Castrop-Rauxel
Einstreu (Weichholzgranulat Altromin) Altromin, Lage
Tierfutter (Standardnagerdiät Altromin 1324) Altromin, Lage
Babybrei Milupa GmbH, Friedrichsdorf
Stereotaktische Operationen
Gerät Bezugsquelle
Stereotakt I David Kopf, Tujunga, CA, USA
Stereotakt II Stölting, Wood Dale, IL, USA
Stereotakt III World Precision Instruments, Sarasota, FL, USA
Dentalbohrer (Mod. 732 T1) Dremel, Leinfelden-Echterdingen
Bohrer (0,11 mm) Hager & Meisinger GmbH, Neuss
Verbrauchsmaterial Bezugsquelle
Chloralhydrat Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe
Bupivacainhydrochlorid (Carbostesin®) Astra Zeneca GmbH, Wedel
Tetracainhydrochlorid Caesar & Loretz, Hilden
Isotonische Natriumchloridlösung (NaCl 0,9%) Braun, Tuttlingen
Wasserstoffperoxid (35% AppliChem GmbH, Darmstadt
Gentamycinsulfat Caelo, Hilden
Dentalzement (Paladur®) Heraeus Kulzer, Hanau
Draht für Elektroden und Erden Science Products, Hofheim
Draht für Führungsrohre Schoeller Werke, Hellenthal
Draht für Mandrins Schoeller Werke, Hellenthal
Schlauch zur Fixation der Mandrins,
Tygon (54HL)
Kleinfeld Labortechnik, Gehrden
Schrauben (rostfreier Stahl) Hummer & Rieß, Nürnberg
Strohalme Papstar, Kall
Nahtmaterial I (Surgicryl® , 4-0, PGA polyglycolic
acid)
SMI, Hünnigen, Belgien
Anhang
138
Nahtmaterial II (Ethicon®, 4-0, Vicryl polyglactin
910)
Johnson & Johnson, St-Stevens-Woluwe,
Belgien
Marbofloxacin (Marbocyl® FD 1%) Vétoquinol GmbH, Ravensburg
SE-Induktion
Substanz Bezugsquelle
Methylskopolamin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Pilokarpin Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim
Diazepam (Faustan®) Temmler Pharma GmbH & Co. KG, Marburg
Isotonische Natriumchloridlösung (NaCl 0,9%) B. Braun, Vet Care GmbH, Tuttlingen
Aqua ad injectabilia B. Braun, Melsungen AG, Melsungen
Aqua destillata Eigenherstellung
Ethanol (Rotipuran®, >99,8%) Carl Roth GmbH und Co. KG, Karlsruhe
Pentylentetrazol-Krampftest und Vorbehandlung
Geräte und Verbrauchsmaterial Bezugsquelle
Infusionspumpe (Syringe Infusion Pump 22) Harvard Apparatus, Rhema Labortechnik,
Hofheim
Polyethylenschlauch Kleinfeld Labortechnik, Gehrden
Injektionskanüle 27 G Terumo, Leuven, Belgien
Metall-Fixationskäfig für Mäuse Eigenbau, Institut für Pharmakologie, Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover
Substanz Bezugsquelle
Bumetanid Sigma-Aldrich, München
HP-β-Cyclodextrin (Kleptose®, HP Parenteral
Grade)
Roquette, Lestrem, Frankreich
Pentylentetrazol Sigma-Aldrich, München
BUM 5 Prof. Thomas Erker, Medizinische Chemie, Wien,
Österreich
Kindling-Prozedur und anhängige Studien
Geräte und Verbrauchsmaterial Bezugsquelle
Stimulator HSE, Harvard Apparatus, March-Hugstetten
Switchbox (Eigenbau) Herr Koch, Fachgebiet Medizinische Physik,
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
Anhang
139
Thermoschreiber (UD 12) Schwarzer, Picker International, München
Rotarod I (Eigenbau) Herr Briese, Institut für Pharmakologie, Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover
Rotarod II (Eigenbau) Solvay Pharmaceuticals, Hannover
Open Field (Durchmesser: 78 cm, Wandhöhe: 25
cm, schwarzer Kunststoff, Auftragsarbeit)
Zimmermann & Collegen, Kunststoff-Technik,
Hannover
Käfige (Makrolon Typ III) Ebeco, Castrop-Rauxel
Draht für Injektionsnadel 18 mm Schoeller Werke, Hellenthal
Mikroinjektionsschlauch (FEP tubing) Microbiotech, Stockholm, Schweden
Mikroinjektionsspritze 5 μl, Syr N, FN 0,47
(G26s)b51
ILS, Innovative Labor Systeme, Stützerbach
Filterpapier Munktell, grade 1 F, Falum, Schweden
Feinwaage für Filterpapier (1219 MP) Sartorius AG, Göttingen
Mikrofilter (FP 30/0,2 CA-S) Whatman, Dassel
Mikrofilter (Durapore Membrane Filter, 0,22 μm) Merck Millipore, Darmstadt
Venenverweilkanüle (Introcan®, 24 G) B. Braun Melsungen AG, Melsungen
Tierwaage (LA 4200 S) Sartorius AG, Göttingen
Mikro-Hämatokrit-Kapillaren (Na-heparinisiert) Brand GmbH + Co. KG, Wertheim
Serumröhrchen mit Gerinnungsaktivator, 1,3 ml Z Sarstedt AG & Co., Nürnbrecht
Substanz Bezugsquelle
Bumetanid Sigma-Aldrich, München
HP-β-Cyclodextrin (Kleptose® HP Parenteral
Grade)
Roquette, Lestrem, Frankreich
D(+)-Glucose Merck, Darmstadt
BUM5-Hydrochlorid Prof. Erker, Medizinische Chemie, Wien,
Österreich
Phenobarbital-Natrium Serva, Heidelberg
Piperonylbutoxid Merck Schuchhardt OHG, Hohenbrunn
Mazola Keimöl Unilever, Hamburg
Natriumhydrogencarbonat Merck, Darmstadt
Natriumchlorid Merck, Darmstadt
Magnesiumsulfat (x 7 H2O) Merck, Darmstadt
Kaliumchlorid Merck, Darmstadt
Calciumchlorid Merck, Darmstadt
Kaliumhydrogenphosphat Merck, Darmstadt
Anhang
140
Protokoll zur Anfertigung der HP-β-Cyclodextrin-Lösung
� 5 g Kleptose®
� 1,12 g D(+)-Glucose
� Mit Aqua dest. ad 50 ml auffüllen
Protokoll zur Anfertigung von aCSF (mock CSF)
� 25 mM Natriumhydrogencarbonat: 2,1 g/l
� 122 mM Magnesiumsulfat (x 7 H2O): 295,8 mg/l
� 3 mM Kaliumchlorid: 223,7 mg/l
� 1,3 mM Calciumchlorid: 191,1 mg/l
� 0,4 mM Kaliumhydrogenphophat: 54,4 mg/l
Alle Substanzen wurden in 900 ml Aqua dest. gelöst und mit Salzsäure (2 M) auf pH
7,4 eingestellt. Darauf wurde auf 1000 ml mit Aqua dest. aufgefüllt und anschließend
filtriert (Filter: 0,22 μm, Millipore Kit).
Histologische Aufarbeitung
Geräte und Verbrauchsmaterial Bezugsquelle
Gefriermikrotom (Frigomobil CM 1325) Leica, Wetzlar
Lichtmikroskop Leica, Wetzlar
Objektträger Roth, Karlsruhe
Deckgläschen Roth, Karlsruhe
Substanzen Bezugsquelle
Eindeckmedium (Entellan®) Merck, Darmstadt
Paraformaldehyd-Pulver Sigma-Aldrich, Seelze
Terpineol Roth, Karlsruhe
Xylol-Ersatzmedium (XEM) Roth, Karlsruhe
Thionin (Acetatsalz) Sigma-Aldrich, München
Anhang
141
Perfusion und histologische Färbung
4% Paraformaldehydlösung
� 800 ml Aqua dest. auf 60-70°C erhitzen
� 80 g Paraformaldehyd-Pulver unter Rühren hinzugeben
� 1 M Natronlauge bis zur Klärung tropfenweise hinzugeben
� Nach Abkühlung auf Raumtemperatur abfiltrieren
� Mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen
Thioninlösung
� 100 ml 1 M Essigsäure + 36 ml 1 M Natronlauge
� Mit Aqua dest. auf 1000 ml auffüllen
� Auf 60-70°C erhitzen
� 1,25 g Thionin darin auflösen
� 60 min auf dem Magnetrührer rühren
� Anschließend heiß filtrieren
Thioninfärbung
Auf Objektträger gezogene Schnitte wurden wie folgt behandelt
� 3 min in 100% Ethanol
� 3 min in 95% Ethanol
� 3 min in 70% Ethanol
� 3 min in 50% Ethanol
� 3 min in Aqua dest.
� 75 bis 90 Sek. in Thioninlösung
� 3 min in 50% Ethanol
� 3 min in 70% Ethanol
� 3 min in 95% Ethanol
� 3 min in 100% Ethanol
� 3 min in Terpineol/Xylol-Ersatzmedium (Mischverhältnis 1:1)
� 3 min in Xylol-Ersatzmedium
Anhang
142
� Sofortiges Eindecken der Schnitte mit Entellan und anschließendem Trocknen
an der Luft
Sonstige Ergebnisse aus den Kindling-Studien 10.2
10.2.1 Untersuchungen zur intrazerebroventrikulären Applikation von
Bumetanid
Behandlungsschema: Bumetanid i.c.v.; Dosis: 14,6 ng; 30 min vor
Stimulationsbeginn
Bum 53
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
60�A
Bum 54
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
60
75
�A
Bum 57
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
110
�A
Bum 61
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
42
�A
Abb.10.1: Hier für jedes der vier Tiere einzeln dargestellt: ADT-Werte (in μA) unter Bumetanid-
Behandlung im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle.
Anhang
143
SD1
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
Sek
.SD2
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
Sek
.ADD1
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
Sek
.
ADD2
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
Sek
.
Abb. 10.2: Zusammengefasste Werte für SD1, SD2, ADD1 und ADD2 (n=4) im Vergleich zur Vor-
und Nachkontrolle (in Sek.=Sekunden ± SEM).
Anhang
144
Behandlungsschema: Bumetanid i.c.v.; Dosis: 36,4 ng; 30 min vor
Stimulationsbeginn
Bum 53
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
60
�A
Bum 54
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
60
90
�A
Bum 55
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
200
160
�A
Bum 56
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
6075�A
Bum 59
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
5060
�A
Bum 60
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
7590
�A
Bum 61
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
4250
�A
Bum 63
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
7590
�A
Abb. 10.3: Hier für jedes der acht Tiere einzeln dargestellt: ADT-Werte (in μA) im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle.
Anhang
145
SD1
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
Sek
.SD2
Vorkontro
lleBum
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
Sek
.
ADD1
Vorkontro
lleBum
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
Sek
.
ADD2
Vorkontro
lleBum
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek
.
Abb.10.4: Zusammengefasste Werte für SD1, SD2, ADD1 und ADD2 (n=8) im Vergleich zur Vor-
und Nachkontrolle (in Sek.=Sekunden ± SEM).
Anhang
146
Behandlungsschema: Bumetanid i.c.v.; Konzentration: 58,3 ng; 30 min vor
Stimulationsbeginn
Bum 53
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
42
50
�A
Bum 54
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
42
50
�A
Bum 60
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
60
75
90
�A
Bum 61
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
42
50
�A
Bum 63
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
75
90
�A
Abb. 10.5: Hier für jedes der fünf Tiere einzeln dargestellt: ADT-Werte (in μA) im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle. Hierbei hatten 4 von 5 Tieren mit einer Erhöhung der ADT zur
Vorkontrolle reagiert.
Anhang
147
SD1
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
Sek
.SD2
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
Sek
.
ADD1
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek
.
ADD2
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
**
Sek
.
Abb. 10.6: Zusammengefasste Werte der fünf Tiere für SD1, SD2, ADD1 und ADD2 (in
Sek.=Sekunden) im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle (in Sek.=Sekunden ± SEM). One-
Way-ANOVA for repeated measures; Post hoc: Dunett’s test for multiple comparison; **p<0,01.
Anhang
148
Behandlungsschema: Bumetanid i.c.v.; Konzentration 58,3 ng; 60 min vor
Stimulationsbeginn
Bum 53
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
36
42
�A
Bum 59
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
75
90
�ABum 60
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
75
�A
Bum 61
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
42
36
�A
Bum 63
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
75
90
�A
Abb. 10.7: Hier für jedes der fünf Tiere einzeln dargestellt: ADT-Werte (in μA) im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle.
Anhang
149
SD1
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
Sek
.SD2
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
Sek
.
ADD1
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
Sek
.
ADD2
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
Sek
.
Abb. 10.8: Zusammengefasste Werte im Vergleich zu Vor- und Nachkontrolle aller fünf Tiere
bzw. vier Tiere (ein Tier hatte bei der Nachkontrolle in der SD2-Phase den Elektrodenaufbau
verloren und taucht bei diesem Wert nicht mehr auf). SD1, SD2, ADD1 und ADD2 in
Sekunden=Sek. Dargestellt (in Sek.=Sekunden ± SEM).
Anhang
150
Behandlungsschema: Bumetanid i.c.v.; Konzentration: 583 ng; 30 min vor
Beginn der Stimulation
Bum 77
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
60
75
�A
Bum 78
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
4250
60
�A
Bum 81
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
6075
130
�A
Bum 81 (GST)
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
75
130
160
�A
Bum 80
Vork
ontrolle
BUM
Nachko
ntrolle
75
90
�A
Bum 86
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
75
90
�A
Abb. 10.9: Hier für jedes der fünf Tiere einzeln dargestellt: ADT-bzw. GST-Werte (in μA) unter
Bumetanid-Behandlung im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle (bei Bum 86 ist bei der
Nachkontrolle aufgetretene GST-Wert nicht dargestellt, wurde jedoch in der folgenden
Gesamtdarstellung mit berücksichtigt). Hierbei reagierten 4 von 5 Tieren mit einer Erniedrigung
der ADT im Vergleich zur Vor-und Nachkontrolle.
Anhang
151
SD1
Vorkontro
lleBUM
Nachkontro
lle0
20
40
60
80Se
k.SD1 (GST)
Vorkontro
lleBUM
Nachkontro
lle0
20
40
60
80
Sek.
SD2
Vorkontro
lleBUM
Nachkontro
lle0
100
200
300
400
500
Sek.
SD2 (GST)
Vorkontro
lleBUM
Nachkontro
lle0
100
200
300
400
500
Sek.
ADD1
Vorkontro
lleBUM
Nachkontro
lle0
20
40
60
80
100
Sek.
ADD1 (GST)
Vorkontro
lleBUM
Nachkontro
lle0
20
40
60
80
100
Sek.
ADD2
Vorkontro
lleBUM
Nachkontro
lle0
20
40
60
80
100
Sek.
ADD2 (GST)
Vorkontro
lleBUM
Nachkontro
lle0
20
40
60
80
100
Sek.
Abb. 10.10: Zusammengefasste Werte im Vergleich zu Vor- und Nachkontrolle aller fünf Tiere
bzw. vier Tiere für SD1, SD2, ADD1 und ADD2 für ADT bzw. GST dargestellt (in Sek.=Sekunden
± SEM).
Anhang
152
10.2.2 Untersuchungen zur intravenösen Applikation von Bumetanid und BUM5
+/- Phenobarbital
Behandlungsschema: Bumetanid (10 mg/kg in 5 ml pro kg), 10 min vor
Stimulationsbeginn: Daten aus 1. Versuchsdurchlauf
Bum 53
Vorkontro
lle
BUM
Nachkontrolle
50
36
Bumetanid im Plasma: 0,28 µg/ml
�A
Bum 55
Vorkontro
lle
BUM
Nachkontrolle
130
Bumetanid im Plasma: 1,07 µg/ml
�A
Bum 56
Vorkontro
lle
BUM
Nachkontrolle
60
5042
Bumetanid im Plasma: 0,88 µg/ml
�A
Bum 59
Vorkontro
lle
BUM
Nachkontrolle
42
Bumetanid im Plasma: 3,24 µg/ml
�A
Bum 61
Vorkontro
lle
BUM
Nachkontrolle
42
50
36
Bumetanid im Plasma: 0,55 µg/ml
�A
Abb. 10.11: Hier für jedes der fünf Tiere einzeln dargestellt: ADT (in μA) unter Bumetanid-
Behandlung im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle. Jeweils darunter: Plasmawerte von
Bumetanid, 30 min nach Applikation.
Anhang
153
SD1
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
�ASD2
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
100
200
300
400
500
�A
ADD1
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
�A
ADD2
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
�A
Abb. 10.12: Zusammengefasste Werte (n=5) im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle für SD1,
SD2, ADD1 und ADD2 für ADT dargestellt (in Sek.=Sekunden ± SEM).
Anhang
154
Daten aus 2. Versuchsdurchlauf
Bum 55
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
160
130
Bumetanid im Plasma: 0,87 µg/ml
�A
Bum 56
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
42
60
50
Bumetanid im Plasma: 1,50 µg/ml�
A
Bum 59
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
42
Bumetanid im Plasma: 1,06 µg/ml
�A
Bum 61
Vorkontro
lle
BUM
Nachko
ntrolle
4236
Bumetanid im Plasma: 1,43 µg/ml
�A
Abb. 10.13: Hier für jedes der vier Tiere aus dem 2. Versuch einzeln dargestellt: ADT-Werte (in
μA) unter Bumetanid-Behandlung im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle. Jeweils darunter:
Plasmawerte von Bumetanid, 30 min nach Applikation.
Anhang
155
SD1
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
�ASD2
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
100
200
300
400
500
�A
ADD1
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
�A
ADD2
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
�A
Abb. 10.14: Zusammengefasste Werte (n=4) im Vergleich zu Vor- und Nachkontrolle für SD1,
SD2, ADD1 und ADD2 für ADT bzw. GST in Sekunden=Sek. dargestellt (in Sek.=Sekunden ±
SEM).
Anhang
156
Behandlungsschema: Zweimal PBO (150 mg/kg) i.p. 10 und 20 min vor
Bumetanid; Bumetanid (10 mg/kg) i.v. 30 min vor Beginn der Stimulation
Bum 55
Vorkontro
lle
PBO+BUM
Nachko
ntrolle
160
130
�A
Bum 56
Vorkontro
lle
PBO+BUM
Nachko
ntrolle
5042
�A
Bum 59
Vorkontro
lle
PBO+BUM
Nachko
ntrolle
4236�A
Bum 57
Vorkontro
lle
PBO+BUM
Nachko
ntrolle
75
50
110
�A
Bum 61
Vorkontro
lle
PBO+BUM
Nachko
ntrolle
3036�A
Abb. 10.15: Hier für jedes der fünf Tiere einzeln dargestellt: ADT (in μA) unter PBO- und
Bumetanid-Behandlung im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle.
Anhang
157
SD1
Vorkontro
lle
PBO+BUM
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek
.SD2
Vorkontro
lle
PBO+BUM
Nachko
ntrolle
0
100
200
300
400
500
Sek
.
ADD1
Vorkontro
lle
PBO+BUM
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
200
Sek
.
ADD2
Vorkontro
lle
PBO+BUM
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
200
Sek
.
Abb. 10.16: Zusammengefasste Werte (n=5) im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle für SD1,
SD2, ADD1 und ADD2 für ADT bzw. GST in Sekunden=Sek. dargestellt (in Sek.=Sekunden ±
SEM).
Anhang
158
Behandlungsschema: Phenobarbital 10 mg/kg i.v., 30 min vor Beginn der
Stimulation
1. Tiergruppe
Bsc-11-1
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
36
µA
Bsc-11-3
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
60
75
µA
Bsc-11-4
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
60
75
90
µA
Bsc-11-4 (GST)
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
100
200
300
µA
Bsc-11-6
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
240
280
µA
Bsc-11-8
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
3642
50
µA
Abb. 10.17: Einzelwertdarstellung aller fünf Tiere für die ADT bzw. GST (in μA) unter
Phenobarbital-Behandlung im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle.
Anhang
159
SD1
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek
. SD1 (GST)
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek
.
SD2
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
800
Sek
.
SD2 (GST)
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
800
Sek
.
ADD1
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
100
200
300
Sek
.
ADD1 (GST)
Vorkontro
lle
Pheno
Nachonko
ntrolle
0
100
200
300
Sek
.
ADD2
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
100
200
300
Sek
.
ADD2 (GST)
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
100
200
300
Sek
.
Abb. 10.18: Zusammengefasste Werte (n=5) von ADT und GST im Vergleich zur Vor- und
Nachkontrolle für SD1, SD2, ADD1 und ADD2 dargestellt (in Sek.=Sekunden ± SEM).
Anhang
160
2. Tiergruppe
Bum 124
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
60
75
µA
Bum 125
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
50
42
µA
Bum 129
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
330
µA
Bum 131
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
60
75µ
A
Bum 132
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
90
75
µA
Bum 133
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
75
90
60
µA
Abb. 10.19: Einzelwertdarstellung aller sechs Tiere für die ADT bzw. GST (in μA) unter
Phenobarbital-Behandlung im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle.
Anhang
161
SD1
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
Sek
.SD2
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
Sek
.
ADD1
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek
.
ADD2
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek
.
Abb. 10.20: Zusammengefasste Werte (n=5) im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle für SD1,
SD2, ADD1 und ADD2 dargestellt (in Sek.=Sekunden ± SEM).
Anhang
162
Behandlungsschema: Phenobarbital 20 mg/kg i.v., 30 min vor Beginn der
Stimulation
Bum 122
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
75
90
�A
Bum 125
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
60
�ABum 133
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
90110
200
�A
Bum 133 (GST)
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
11090
330
�A
Bum 135
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
4250
75
�A
Abb. 10.21: Einzelwertdarstellung aller vier Tiere für die ADT bzw. GST (in μA) unter
Phenobarbital-Behandlung im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle.
Anhang
163
SD1
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80S
ek.
SD1 (GST)
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
Sek
.
SD2
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
100
200
300
400
500
Sek
.
SD2 (GST)
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
100
200
300
400
500
Sek
.
ADD1
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
Sek
.
ADD2 (GST)
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
Sek
.
ADD2
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
Sek
.
ADD1 (GST)
Vorkontro
lle
Pheno
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
Sek
.
Abb. 10.22: Zusammengefasste Werte (n=4) für SD1, SD2, ADD1 und ADD2 der ADT und GST
im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle dargestellt (in Sek.=Sekunden ± SEM).
Anhang
164
Behandlungsschema Bumetanid (10 mg/kg) i.v. und einmal Phenobarbital (10
mg/kg) i.v., 30 min vor Beginn der Stimulation
BSc-11-2
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
75
90
�A
Bsc-11-7
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
36
60
75
�A
Bsc-11-8
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
36
60
�A
Bsc-11-10
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
7590
110
�A
Bsc-11-3
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
60
75
�A
Abb. 10.23: Einzelwertdarstellung aller fünf Tiere für die ADT bzw. GST (in μA) unter
Phenobarbital-und Bumetanid-Behandlung im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle.
Anhang
165
SD1
Vorkontro
lle
BUM+P
heno
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
Sek
.SD2
Vorkontro
lle
BUM+P
heno
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
800
Sek
.
ADD1
Vorkontro
lle
BUM+P
heno
Nachko
ntrolle
0
100
200
300
Sek
.
ADD2
Vorkontro
lle
BUM+P
heno
Nachko
ntrolle
0
100
200
300
Sek
.
Abb. 10.24: Zusammengefasste Werte (n=5) für SD1, SD2, ADD1 und ADD2 der ADT und GST
im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle dargestellt (in Sek.=Sekunden ± SEM).
Anhang
166
Behandlungsschema: Bumetanid (10 mg/kg) i.v., 60 min und Phenobarbital (10
mg/kg) mit Bumetanid (10 mg/kg) i.v. 30 min vor Beginn der Stimulation
Bum 122
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
757575
�A
Bum 124
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
42
60
�A
Bum 123
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
75
90
�A
Bum 123 (GST)
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
75
130
�A
Bum 126
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
50
60
�A
Bum 129
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
160
�A
Abb. 10.25: Einzelwerte der ADT bzw. GST (n=5) in μA im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle.
Anhang
167
Bum 130
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
50
90
�ABum 132
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
36
42
�A
Bum 133
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
50
75
�A
Bum 134
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
4250
110�A
Bum 135
Vorkontro
lle
BUM+Phen
o
Nachko
ntrolle
36
60
�A
Abb. 10.26: Einzelwerte der ADT (n=5) in μA im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle.
Anhang
168
SD1
Vorkontro
lle
BUM+Pheno
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
�A
SD1 (GST)
Vorkontro
lle
BUM+Pheno
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
�A
SD2
Vorkontro
lle
BUM+Pheno
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
�A
SD2 (GST)
Vorkontro
lle
BUM+Pheno
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
�A
ADD1
Vorkontro
lle
BUM+Pheno
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
�A
ADD1 (GST)
Vorkontro
lle
BUM+Pheno
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
�A
ADD2
Vorkontro
lle
BUM+Pheno
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
�A
ADD2 (GST)
Vorkontro
lle
BUM+Pheno
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
�A
Abb. 10.27: Zusammengefasste Werte der ADT bzw. GST (n=10) für SD1, SD2, ADD1 und ADD2
im Vergleich zu Vor- und Nachkontrolle dargestellt (in Sek.=Sekunden ± SEM).
Anhang
169
Behandlungsschema: Zweimal Bumetanid (10 mg/kg) i.v., 60 und 30 min vor
Beginn der Stimulation
Bum 122
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
75
�A
Bum 125
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
10
20
30
40
50
Bum 123
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
75
�A
Bum 123 (GST)
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
100
200
300
400
�A
Bum 126
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
Bum 134
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
3642
�A
Bum 135
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
50
Abb. 10.28: Einzelwerte der ADT bzw. GST (n=6) in μA im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle.
Anhang
170
SD1
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
Sek
.
SD1(GST)
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
Sek
.
SD2
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
100
200
300
400
500
Sek
.
SD2 (GST)
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
Sek
.
ADD1
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
Sek
.
ADD1(GST)
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
Sek
.
ADD2
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek
.
ADD2 (GST)
Vorkontro
lleBUM
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek
.
Abb. 10.29: Zusammengefasste Werte (n=6) für SD1, SD2, ADD1, ADD2 der ADT bzw. GST im
Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle dargestellt (in Sek.=Sekunden ± SEM).
Anhang
171
Behandlungsschema: BUM5 (13 mg/kg) i.v., 30 min später BUM5 (13 mg/kg)
und Phenobarbital (10 mg/kg) i.v., 30 min später Beginn der Stimulation
Bum 121
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
50
36
�A
Bum 123
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
75
110
�A
Bum 122
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
9075
�A
Bum 122 (GST)
Vorkontro
lle
Bum5+
Pheno
Nachko
ntrolle
90
280
µA
Bum 124
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
75
160
�A
Bum 124 (GST)
Vorkontro
lle
Bum5+
Pheno
Nachko
ntrolle
75
280
µA
Abb. 10.30: Einzelwerte der ADT bzw. GST (n=4) in μA im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle.
Anhang
172
Bum 125
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
50
42
�ABum 126
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
60
130
�A
Bum 130
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
60
75
�A
Bum 129
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
0
100
200
300
400
µA
Bum 134
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
90
42
�A
Bum 134 (GST)
Vorkontro
lle
Bum5+
Pheno
Nachko
ntrolle
90
130
42
µA
Bum 131
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
60
µA
Abb. 10.31: Einzelwerte der ADT bzw. GST (n=6) in μA im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle.
Anhang
173
SD1
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
****
Sek.
SD1 (GST)
Vorkontro
lle
Bum5+
Pheno
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek.
SD2
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
800
Sek.
SD2 (GST)
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
Sek.
ADD1
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek.
ADD1 (GST)
Vorkontro
lle
Bum5+
Pheno
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek.
ADD2
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
** *
Sek.
ADD2 (GST)
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek.
Abb. 10.32: Zusammengefasste Werte (n=10) im Vergleich zu Vor- und Nachkontrolle für ADT
und GST (in μA ± SEM), der SD1, SD2, ADD1 und ADD2 in Sek. (=Sekunden ± SEM).). One-way
ANOVA for repeated measures; post hoc: Dunnett’s test for multiple comparison;*p<0,05,
**p<0,01.
Anhang
174
Behandlungsschema: BUM5 (13 mg/kg) i.v., 30 min später BUM5 (13 mg/kg) i.v.,
30 min später Beginn der Stimulation
Bum 122
Vorkontro
lle
BUM5
Nachko
ntrolle
75
�A
Bum 123
Vorkontro
lle
BUM5
Nachko
ntrolle
75
�A
Bum 124
Vorkontro
lle
BUM5
Nachko
ntrolle
50
60
�A
Bum 125
Vorkontro
lle
BUM5
Nachko
ntrolle
36
42
�A
Bum 130
Vorkontro
lle
BUM5
Nachko
ntrolle
60
�A
Bum 131
Vorkontro
lle
BUM5
Nachko
ntrolle
50
60
Abb. 10.33: Einzelwerte der ADT (n=6) in μA im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle.
Anhang
175
SD1
Vorkontro
lle
BUM5
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
Sek
. SD2
Vorkontro
lle
BUM5
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
Sek
. ADD1
Vorkontro
lle
BUM5
Nachko
ntrolle
0
20
40
60
80
100
Sek
.
ADD2
Vorkontro
lle
BUM5
Nachko
ntrolle
0
50
100
150S
ek.
Abb. 10.34: Zusammengefasste Werte (n=6) für SD1, SD2, ADD1, ADD2 der ADT im Vergleich
zur Vor- und Nachkontrolle dargestellt (in Sek.=Sekunden ± SEM).
Anhang
176
Behandlungsschema: BUM5 (1,3 mg/kg) i.v. 60 min vor Stimulation, dann BUM5
(1,3 mg/kg) und Phenobarbital (10 mg/kg) i.v. 30 min später Beginn der
Stimulation
Bum 126
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
60
75
�A
Bum 130
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
60
90
50�A
Bum 133
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
50
60
µA
Abb. 10.35: Einzelwerte (n=3) der ADT (in μA) im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle
dargestellt.
Anhang
177
SD1
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek
. SD2
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
800
Sek
. ADD1
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek
.
ADD2
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
0
50
100
150S
ek.
Abb. 10.36: Zusammengefasste Werte (n=3) für SD1, SD2, ADD1, ADD2 der ADT im Vergleich
zur Vor- und Nachkontrolle dargestellt (in Sek.=Sekunden ± SEM).
Anhang
178
Behandlungsschema: BUM5 (1,3 mg/kg) i.v. 60 min vor Stimulation, dann BUM5
dann Phenobarbital (10 mg/kg) i.v. 30 min vor Stimulation, dann BUM5 15 min
vor Beginn der Stimulation
Bum 122
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
75
µA
Bum 129
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
160
200
�A
Bum 131
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
50
60
�A
Bum 135
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
50
75
36µA
Abb. 10.37: Einzelwerte (n=4) der ADT (in μA) im Vergleich zur Vor- und Nachkontrolle
dargestellt.
Anhang
179
SD1
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek
. SD2
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
0
200
400
600
800
Sek
.
ADD1
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek
.
ADD2
Vorkontro
lle
BUM5+Phen
o
Nachko
ntrolle
0
50
100
150
Sek
.
Abb. 10.38: Zusammengefasste Werte (n=4) der SD1, SD2, ADD1, ADD2 im Vergleich zur Vor-
und Nachkontrolle dargestellt (in Sek.=Sekunden ± SEM).
Publikationen
180
11 Publikationen
Originalarbeiten
Töllner K., Brandt C., Töpfer M., Brunhofer G., Feit. P., Gabriel M., Erker T., Löscher
W.: A novel bumetanide prodrug with reduced diuretic but enhanced anticonvulsant
and disease-modifying effects in rodent models of epilepsy (in Revision, Journal of
Neuroscience).
Zitierfähige Kongressbeiträge
M. Töpfer, K. Töllner, C. Brandt, W. Löscher: The influence of the NKCC1-Inhibitor
bumetanide on alterations in seizure susceptibility after status epilepticus in mice.
Ninth Göttingen Meeting of the German Neuroscience Society, 23.03-27.03.2011:
Poster: T11-13C.
K. Töllner, C. Brandt, M. Töpfer, G. Brunhofer, T. Erker, P.W. Feit, W. Löscher:
Development and characterization of new prodrugs of bumetanide in combination
with the monooxygenase inhibitor piperonyl butoxide for antiepileptogenesis.
In: Epilepsia 52 (Suppl. 6) 29th International Epilepsy Congress, Rom, 28.08.-
01.09.2011; 2011, S. 52.
M. Töpfer, K. Töllner, C. Brandt, L. Müller, R. Köhling, W. Löscher: Effects of the
NKCC1-inhibitor bumetanide on alterations in seizure susceptibility and GABAergic
transmission after status epilepticus in mice.
65th Annual Meeting of the American Epilepsy Society, 02.12.-06.12.2011, Baltimore,
MD, USA: Poster: 1.281.
M. Töpfer, K. Töllner, C. Brandt, W. Löscher: Effects of the NKCC1-inhibitor
bumetanide in the kindling model of temporal lobe epilepsy in rats.
66th Annual Meeting of the American Epilepsy Society, 30.11.-04.12.2012, San
Diego, CA, USA: Poster: 3.215.
Publikationen
181
Sonstige Beiträge
M. Töpfer: Effects of the NKCC1-inhibitor bumetanide on alterations in seizure
susceptibility and GABAergic transmission after status epilepticus in mice. Vortrag im
Rahmen des Treffens der DFG-Forschergruppe 1103, 04.07.2011, Institut für
Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.
M. Töpfer, K. Töllner, C. Brandt, W. Löscher: The influence of the NKCC1-Inhibitor
bumetanide on alterations in seizure susceptibility after status epilepticus in mice.
Poster im Rahmen des First International Workshop of Veterinary Neuroscience,
31.03.-02.04.2011, Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule
Hannover.
M. Töpfer: Investigations on antiepileptogenic and anticonvulsive effects of the
NKCC1-inhibitor bumetanide.
Vortrag im Rahmen des Graduate School Day der HGNI der Stiftung Tierärztliche
Hochschule Hannover, 24.11.-25.11.2011, Relaxa Hotel, Bad Salzdetfurth.
M. Töpfer: Ein Diuretikum als neue Option zur Epilepsiebehandlung?
Vortrag im Rahmen des Pharmakologischen Kolliquiums, 14.11.2012, Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie, Stiftung Tierärztliche Hochschule
Hannover.
M. Töpfer: Effects of the NKCC1-Inhibitor bumetanide and a novel prodrug in the
kindling model of temporal lobe epilepsy in rats. Poster im Rahmen des Graduate
School Day der HGNI der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover, 23.11.-
24.11.2012, Institut für Pathologie, Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover.
M. Töpfer: Untersuchungen zur antiepileptogenen und antikonvulsiven Wirkung des
NKCC1-Inhibitors Bumetanid.
Bericht über die Ph.D.-Arbeit im Rahmen der Vortragsreihe Neurowissenschaften in
der Tiermedizin, Grundlagen und Klinik, 09.01.2013, Institut für Pathologie, Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover.
Eidesstattliche Erklärung
182
12 Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation Untersuchungen zur antiepileptogenen
und antikonvulsiven Wirkung des NKCC1-Inhibitors Bumetanid selbstständig verfasst
habe.
Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:
Stefan Obili (ehemaliger Auszubildender am Institut für Pharmakologie, Toxikologie
und Pharmazie) assistierte mir bei der Implantation der Kindling-Elektroden und bei
der Durchführung der Kindling-Studien.
Franziska Kaiser (Auszubildende am Institut für Pharmakologie, Toxikologie und
Pharmazie) unterstützte mich bei der Durchführung der Kindling-Studien und bei der
SE-Induktion.
Edith Kaczmarek, Franziska Kaiser, Julia Hinz, Doris Möller und Nicole Ernst
(Technische Angestellte am Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie)
assistierten mir bei der Implantation der Kindling-Elektroden und Führungsrohre und
bei der Durchführung der Kindling-Studien.
Edith Kaczmarek, Julia Hinz und Nicole Ernst unterstützten mich bei der bei der SE-
Induktion und der Durchführung der PTZ-Krampftests.
Martina Gramer und Maria Hausknecht (Technische Angestellte am Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie) führten für mich die Analyse der
Plasma- und Gehirnkonzentrationen von Bumetanid mittels HPLC durch.
Michael Weissing und Doris Möller (Technische Angestellte am Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie) beteiligten sich bei der Anfertigung
histologischer Gehirnschnitte.
Richard Baum (Feinmechaniker im Institut für Pharmakologie, Toxikologie und
Pharmazie) unterstützte mich bei der Anfertigung der für einen Teil der Kindling-
Studien benötigten Injektionskanülen und Führungsrohre.
Marta Rattka, Ph.D. (ehemals Institut für Pharmakologie, Toxikologie und
Pharmazie), Claudia Brandt, Ph.D. und Kerstin Römermann, Ph.D. (Institut für
Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie) unterstützten mich bei der Durchführung
der Kindling-Studien.
Eidesstattliche Erklärung
183
Kathrin Töllner, Ph.D. unterstützte mich bei der Durchführung der SE-Induktion und
bei der Durchführung der PTZ-Krampftests.
Sonja Bröer (Ph.D.-Studentin im Institut für Pharmakologie, Toxikologie und
Pharmazie) unterstützte mich bei der Durchführung der Kindling-Studien.
Sara Rösch (ehemals Studentin im praktischen Jahr) unterstützte mich bei der
Durchführung der SE-Induktion und bei der Durchführung der PTZ-Krampftests.
Laura Gey, Diana Busley, Daniela Deus und Kristin Kleinsorgen (ehemals
Studentinnen im praktischen Jahr) unterstützten mich bei der Durchführung der
Kindling-Studien.
Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten
(Promotionsberater oder andere Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat
von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die
im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.
Ich habe die Dissertation an der folgenden Institution angefertigt:
Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule
Hannover. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder
für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die
vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit
entsprechend gemacht habe.
Manuel Töpfer
Danksagung
184
13 Danksagung
Mein größter Dank gilt Herrn Prof. Dr. Wolfgang Löscher für die Überlassung dieses
Dissertationsthemas und die stets freundliche, intensive und verbindliche Betreuung
während der Anfertigung dieser Arbeit. Seine Disziplin und die Herangehensweise an
wissenschaftliche Fragestellungen waren mir stets ein großes Vorbild. Des Weiteren
bedanke ich mich bei Herrn PD Dr. Jörg Ahrens und Herrn Prof. Dr. Anibh Das für die
freundliche Supervision meiner Arbeit.
Weiter möchte ich mich sehr herzlich bei Claudia Brandt, Ph.D. und Kathrin Töllner,
Ph.D. für die immer hilfsbereite und nette Betreuung und die Anleitung zum
wissenschaftlichen Arbeiten bedanken.
Ich danke auch allen technischen und wissenschaftlichen Mitarbeitern und natürlich
auch meinen Mitdoktoranden des Instituts für die absolut uneingeschränkte
Hilfsbereitschaft, das ausnahmslos zuvorkommende und oft auch sehr sehr lustige
kollegiale Miteinander während der vergangenen Jahre. Besonders möchte ich mich
an dieser Stelle bei Edith Kaczmarek und Doris Möller bedanken, die immer dafür
gesorgt haben, dass ich auch in stressigen Situationen stets einen kühlen Kopf
bewahren konnte.
Ein sehr großer Dank gilt meiner Familie, die mich immer unterstützt und stets
vorbehaltlos hinter mir gestanden hat.
Ebenso danke ich meiner zukünftigen Ehefrau Annika Pukropski, die mir immer in
jeder Situation Verständnis, Motivation und Liebe geschenkt hat.
Zuletzt möchte ich mich ganz besonders bei der Akademie für Tiergesundheit e.V.
bedanken, die mir die Anfertigung dieser Ph.D.-Arbeit durch die Gewährung eines
Promotionsstipendiums ermöglicht hat.
