Material und Methoden - elib.tiho-hannover.de · Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie Tierärztliche Hochschule Hannover Prokonvulsiva als pharmakologische Strategie

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1. Auflage 2012

© 2012 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH,

Gießen

Printed in Germany

ISBN 978-3-86345-0

Verlag: DVG Service GmbH

Friedrichstraße 17

35392 Gießen

0641/24466

[email protected]

www.dvg.net

70-0

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie Tierärztliche Hochschule Hannover

Prokonvulsiva als pharmakologische Strategie zur Epilepsieprävention

THESE

zur Erlangung des Grades eines DOCTOR OF PHILOSOPHY

– Ph.D. –

im Fachgebiet Pharmakologie

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover und das Zentrum für Systemische

Neurowissenschaften (ZSN) Hannover

vorgelegt von

Marta Małgorzata Rattka

Bielsko-Biała

Hannover 2012

Supervisor: Prof. Dr. W. Löscher

Wissenschaftliche Betreuung:

Prof. Dr. W. Löscher

Prof. Dr. G. Bicker

Prof. Dr. E. Ponimaskin

1. Gutachten:

Prof. Dr. W. Löscher (Institut für Pharmakologie, Toxikologie und

Pharmazie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover)

Prof. Dr. G. Bicker (Institut für Tierökologie und Zellbiologie der Stiftung Tierärztliche

Hochschule Hannover)

Prof. Dr. E. Ponimaskin (Institut für Neurophysiologie der Medizinischen Hochschule

Hannover)

2. Gutachten: Prof. Dr. R. Köhling (Institut für Physiologie der Universität Rostock)

Tag der mündlichen Prüfung: 30.03.2012

Gefördert durch ein Stipendium der Friedrich-Ebert-Stiftung. Diese Arbeit ist ein

Teilprojekt der DFG-Forschergruppe Neurodegeneration und -regeneration bei ZSN

-Erkrankungen des Hundes (Forschergruppe 1103).

Zuzannie Gąsior

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung ....................................................................................................................... 1 2. Literaturübersicht ........................................................................................................... 3

2.1 Epilepsie .......................................................................................................................3

2.2 Temporallappenepilepsie ..............................................................................................4

2.3 Epileptogenese und Epilepsieprävention ......................................................................6

2.4. Antikonvulsiva in der Epileptogeneseforschung ...........................................................8

2.4.1 Untersuchungen im Tiermodell ............................................................................. 8 2.4.2 Klinische Studien .................................................................................................10

2.5 Prokonvulsiva in der Epileptogeneseforschung ........................................................... 11

2.6 GABA und Epilepsie ................................................................................................... 12

2.6.1 Theorie der exzitatorischen GABA .......................................................................13 2.6.2 Synchronisations-Theorie ....................................................................................14

2.7 Tiermodelle für Temporallappenepilepsie ................................................................... 15

2.7.1 Das Lithium-Pilokarpin-Modell .............................................................................17 2.7.2 Das fokale Kainsäure-Modell ...............................................................................18

2.8 Pentylenterazol (PTZ) ................................................................................................. 19

3. Zielsetzung und Arbeitshypothesen ..............................................................................21 4. Material und Methoden .................................................................................................23

4.1 Tiere ........................................................................................................................... 23

4.2 Stereotaktische Operation .......................................................................................... 24

4.3.1 SE-Induktion im Pilokarpin-Modell .......................................................................28 4.3.2 SE-Induktion im fokalen Kainsäure-Modell ...........................................................29

4.5 Studie 1: Etablierung des fokalen Kainsäure-Modells ................................................. 33

4.5.1 Studiendesign ......................................................................................................33 4.5.2 Implantation von Führungsrohren und Ableitelektroden .......................................33 4.5.3 SE-Induktion ........................................................................................................34 4.5.4 EEG- und Videoüberwachung ..............................................................................34 4.5.5 Verhaltenstests ....................................................................................................35

4.5.5.1 Der Hyperexzitabilitätstest (HET) ..................................................................36 4.5.5.2 Der Elevated-Plus Maze-Test (EPM) ............................................................37 4.5.5.3 Der Open Field-Test (OF) .............................................................................39 4.5.5.4 Der Morris Water Maze-Test (MWM) ............................................................39

4.5.6 Phenobarbital-Selektion .......................................................................................41 4.5.7 Tötung der Tiere und Histologie ...........................................................................43

4.5.7.1 Transkardiale Perfusion ................................................................................43 4.5.7.2 Dekapitation .................................................................................................44

4.5.7.2.1 Histologie nach Dekapitation ..................................................................44 4.6 Studie 2: PTZ-Schwellenversuche im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell ........ 45

4.6.1 Studiendesign ......................................................................................................45 4.6.2 Implantation von Führungsrohren und Ableitelektroden .......................................46 4.6.3 SE-Induktion ........................................................................................................47

4.6.3.1 SE-Induktion im Pilokarpin-Modell .................................................................47 4.6.3.2 SE-Induktion im fokalen Kainsäure-Modell ....................................................48

4.6.4 PTZ-Schwellenbestimmung .................................................................................48 4.6.5 Bestimmung der Latenzzeit im Pilokarpin-Modell .................................................49 4.6.6 Diazepam-Vorversuch im Pilokarpin-Modell .........................................................50

Inhaltsverzeichnis

4.6.7 Bestimmung des ovariellen Zyklusstandes ..........................................................50 4.7 Studie 3: Infusionsversuche mit PTZ im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell .... 50

4.7.1 Pharmakokinetische Vorversuche ........................................................................51 4.7.1.1 PTZ-Halbwertszeitbestimmung .....................................................................51 4.7.1.2 Etablierung des Infusionsprotokolls ...............................................................51

4.7.2 Studiendesign PTZ-Behandlung ..........................................................................52 4.7.3 Implantation von Ableitelektroden und Führungsrohren ...................................53

4.7.4 Implantation von Kathetern in die Vena jugularis externa .....................................54 4.7.5 SE-Induktion ........................................................................................................55

4.7.5.1 SE-Induktion im Pilokarpin-Modell .................................................................55 4.7.5.2 SE-Induktion im fokalen Kainsäure-Modell ....................................................56

4.7.6 PTZ-Infusion ........................................................................................................56 4.7.7 EEG- und Videoüberwachung ..............................................................................58

4.8 Statistik ....................................................................................................................... 58

5. Ergebnisse ...................................................................................................................59 5.1 Studie 1: Etablierung des fokalen Kainsäure-Modells ................................................. 59

5.1.1 SE-Induktion im fokalen Kainsäure-Modell ...........................................................59 5.1.2 Entwicklung von spontanen, wiederkehrenden, epileptische Anfällen im fokalen Kainsäure-Modell ..........................................................................................................61 5.1.3 Verhaltensänderungen im fokalen Kainsäure-Modell ...........................................66

5.1.3.1 Der Hyperexcitabilitätstest (HET) ..................................................................66 5.1.3.2 Der Elevated-Plus Maze-Test (EPM) ............................................................69 5.1.3.4 Der Morris Water Maze-Test (MWM) ............................................................75

5.1.4 Die Phenobarbital-Selektion .................................................................................77 5.1.5 Histologie .............................................................................................................80

5.1.5.1 Histologie der 1. Gruppe ...............................................................................80 5.1.5.2 Histologie der 2. Gruppe ...............................................................................80

5.2 Studie 2: Schwellenversuche im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell ................ 83

5.2.1 Die SE-Induktion ..................................................................................................83 5.2.1.1 Die SE-Induktion und Latenzzeit im Pilokarpin-Modell ..................................83 5.2.1.2 Die SE-Induktion im fokalen Kainsäure-Modell ..............................................85

5.2.2 Der PTZ-Schwellentest ........................................................................................87 5.2.2.1 Schwellenveränderungen nach SE im Pilokarpin-Modell ...............................89 5.2.2.2 Schwellenveränderungen nach SE im fokalen Kainsäure-Modell ..................90

5.2.3 Vergleich beider SE-Modelle ................................................................................91 5.2.4 Einfluss des ovariellen Zyklusstandes auf die PTZ-Schwelle ...............................92

5.3 Studie 3: Infusionsversuche mit PTZ im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell .... 98

5.3.1 Pharmakokinetische Vorversuche ........................................................................98 5.3.1.1 Bestimmung der Plasmahalbwertszeit von PTZ ............................................98 5.3.1.2 Korrelation zwischen konvulsiver PTZ-Dosis und dem Plasmaspiegel ........ 100 5.3.1.3 Etablierung des Infusionsprotokolls ............................................................. 101

5.3.2 Infusionsversuche mit PTZ im Pilokarpin-Modell (60 Minuten SE-Gruppe) ........ 102 5.3.2.1 SE-Induktion ............................................................................................... 102 5.3.2.2 PTZ-Behandlung ......................................................................................... 102 5.3.2.3 Entwicklung von spontanen Anfällen nach PTZ-Behandlung ....................... 102

5.3.3 Infusionsversuche mit PTZ im Pilokarpin-Modell (90 Minuten SE-Gruppe) ........ 103 5.3.3.1 SE-Induktion ............................................................................................... 103 5.3.3.2 PTZ-Behandlung ......................................................................................... 103 5.3.3.3 Entwicklung von spontanen Anfällen nach PTZ-Behandlung ....................... 104

5.3.4 Infusionsversuche im fokalen Kainsäure-Modell (13-16 Stunden-Gruppe) ......... 105 5.3.4.1 SE-Induktion ............................................................................................... 105 5.3.4.2 PTZ-Behandlung ......................................................................................... 105

Inhaltsverzeichnis

5.3.4.3 Entwicklung von spontanen Anfällen nach PTZ-Behandlung ....................... 105 5.3.5 Infusionsversuche im fokalen Kainsäure-Modell (7 Tage-Gruppe) ..................... 106

5.3.5.1 SE-Induktion ............................................................................................... 106 5.3.5.2 PTZ-Behandlung ......................................................................................... 107 5.3.5.3 Entwicklung von spontanen Anfällen nach PTZ-Behandlung ....................... 107 5.3.5.4 Gemeinsame Auswertung der Kainsäure-Gruppen ..................................... 109

6. Diskussion .................................................................................................................. 110 6.1 Einleitung .................................................................................................................. 110

6.2 Studie 1: Etablierung des fokalen Kainsäure-Modells. .............................................. 110

6.2.1 SE-Induktion ...................................................................................................... 110 6.2.2 Anfallsausprägung nach SE ............................................................................... 112 6.2.3 Verhaltensänderungen ....................................................................................... 112 6.2.4 Pharmakologische Untersuchungen .................................................................. 115 6.2.5 Neurodegeneration ............................................................................................ 117 6.2.6 Zusammenfassung ............................................................................................ 118

6.3 Studie 2: Schwellenversuche im Pilokarpin- und im fokalen Kainsäure-Modell ......... 118

6.3.1 Einfluss von Diazepam auf die individuelle Krampfschwelle ............................... 118 6.3.2 Latenzzeit im Pilokarpin-Modell ......................................................................... 119 6.3.3 Veränderungen der individuellen Krampfschwelle bei Kontrollen ....................... 120 6.3.4 Veränderungen der Krampfschwelle nach SE .................................................... 120 6.3.5 Einfluss des Zyklusstandes auf die Krampfschwelle .......................................... 122

6.4 Studie 3: PTZ-Behandlung zur Epilepsieprävention .................................................. 123

6.4.1 Etablierung des Behandlungsprotokolls ............................................................. 123 6.4.2 PTZ-Behandlung ................................................................................................ 124

6.5 PTZ zur Epilepsieprävention: Ergebnisse und Ausblick ............................................ 125

7. Zusammenfassung ..................................................................................................... 129 8. Summary .................................................................................................................... 131 9. Literatur ...................................................................................................................... 133 10. Anhang ....................................................................................................................... 142 Publikationen ............................................................................................................... 151 Erklärung ..................................................................................................................... 152 Danksagung ................................................................................................................ 153

Abbildungsverzeichnis

Abbildungsverzeichnis:

Abb. 1: Epilepsieentstehung und –progression und Möglichkeiten der Intervention. ...............8 Abb. 2: Aufsicht auf einen Rattenschädel mit eingezeichneten Kreuzungen der Knochennähte ................................................... 26 Abb. 3: Schematische Darstellung der Lokalisation der Ableitelektrode . ................. 27 Abb. 4: Schematische Darstellung der Lokalisation des Führungsrohres ............. 27 Abb. 5 :Schematische Darstellung der Lokalisation der Injektionsnadel ............................... 30 Abb. 6 :Intrahippokampale Mikroinjektion von Kainsäure ..................................................... 30 Abb. 7: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Studie 1 ................................ 33 Abb. 8: Schematischer Aufbau des Elevated Plus Maze. ..................................................... 38 Abb. 9: Schematischer Aufbau des Open field. .................................................................... 39 Abb. 10: Schematische Darstellung des Morris Water Maze. ............................................... 40 Abb. 11: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Studie 2 ............................... 46 Abb. 12 (A-C): EEG-Veränderungen vor und nach Kainsäure-Mikroinjektion ...................... 60 Abb. 13 (A-C): Spontane epileptische Anfälle 8 Wochen nach SE-Induktion ....................... 64 Abb. 14: Tägliche Anfallsfrequenz in der 2. Tiergruppe ........................................................ 65 Abb. 15 (A-H): Ergebnisse des HET ................................................................................... 68 Abb. 16 (A-J): Ergebnisse des EPM. ................................................................................... 70 Abb. 17 (A-F): Ergebnisse des OF I ..................................................................................... 72 Abb. 18 (A-F): Ergebnisse des OF II .................................................................................... 73 Abb. 19 (A-F): Ergebnisse OF III ......................................................................................... 74 Abb. 20 : Ergebnisse des MWM. .......................................................................................... 76 Abb. 21 (A-B): MWM: Mittlere Schwimmgeschwindigkeit und Plattformkreuzungen ............ 76 Abb. 22: Tägliche Anfallsfrequenz während der PB-Selektion. ............................................ 79 Abb. 23 (A-D): Neurodegeneration im Hippokampus 40 Wochen nach Kainsäure . 82 Abb. 24: Typisches EEG-Muster eines spontanen, epileptischen Anfalls ............................ 84 Abb. 25: Kein Enfluss von Diazepam (3x10 mg/kg) auf die PTZ-Schwelle............................ 86 Abb. 26 (A-E): EEG-Ableitung während einer PTZ-Schwellenbestimmung. ........................ 88 Abb. 27 (A-C): PTZ-Schwellenveränderungen im Pilokarpin-Modell .................................... 93 Abb. 28 (A-F): Zusammengefasste Verhaltensänderungen nach PTZ-Infusion .................. 94 Abb. 29 (A-C): PTZ-Schwellenveränderungen im fokalen Kainsäure-Modell ....................... 95 Abb. 30 (A-C): Weitere Endpunkte nach PTZ-Schwellentest ............................................... 96 Abb. 31 (A-C): Verhaltensänderungen nach Ende des PTZ-Schwellentests ......................... 97 Abb. 32 :Vergleich der PTZ-Schwelle ................................................................................... 98 Abb. 33: PTZ-Plasmaspiegel ................................................................................................ 99 Abb. 34: Darstellung der konvulsiven PTZ-Dosis ................................................................ 100 Abb. 35: Wöchentliche Anfallsfrequenz im Pilokarpin-Modell ........................... . 104 Abb. 36: Wöchentliche Anfallsfrequenz im fokalen Kainsäure-Modell I. ................... 106 Abb. 37 :Wöchentliche Anfallsfrequenz im fokalen Kainsäure-Modell II. ................. 108 Abb. 38 :Wöchentliche Anfallsfrequenz nach PTZ-Behandlung kombinierte Daten ............ 109

Doktorarbeit%20Marta1.doc#_Toc312325520



























Tabellenverzeichnis

Tabellenverzeichnis Tabelle 1: Stereotaktische Koordinaten für die Implantation von DG-Elektroden und Führungsrohren. .................................................................................................. 25 Tabelle 2: Modifizierte Anfallsskala nach Racine (1972) ....................................................... 32 Tabelle 3: Tabellarische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Verhaltensbatterie ............ 35 Tabelle 4: Verwendeter Hypolokomotion-, Hyperlokomotion- und Ataxie-Score. ................. 43 Tabelle 5: Übersicht über die Tiergruppen in Studie 2. ........................................................ 46 Tabelle 6: Score-Systeme zur Beurteilung der Verhaltensänderungen ................................ 49 Tabelle 7: Übersicht über die Behandlungsgruppen in Studie 3 ............................................ 53 Tabelle 8: Übersicht über die Zeitpunkte der Katheter-Implantation Studie 3 ........................ 54 Tabelle 9: Übersicht über die zum SE-Abbruch verwendeten Substanzen ........................... 56 Tabelle 10: Übersicht über die Überwachungszeitpunkte in den einzelnen Tiergruppen . ..... 58 Tabelle 11: Durchschnittliche tägliche Anfallsfrequenz ........................................................ 63 Tabelle 12: Phenobarbital-Plasmakonzentration .................................................................. 77 Tabelle 13: Mittlerer Neurodegenerationsscore .................................................................... 81 Tabelle 14: Latenzzeit und Anfälle in den ersten 3 Tagen nach SE ..................................... 84 Tabelle 15: PTZ-Halbwertszeit der einzelnen Tiere nach 12 mg/kg PTZ Injektion ............... 99 Tabelle 16: PTZ-Plasmakonzentrationen 24 h und 48 h (1. Infusionsprotokoll) ................. 101 Tabelle 17: PTZ-Plasmakonzentrationen 24 h und 48 h (2. Infusionsprotokoll) .................. 101 Tabelle 18: Anfälle während der 48 h PTZ-Behandlung...................................................... 107

Abkürzungen

Abkürzungen

Aqua dest. destilliertes Wasser

bzw. beziehungsweise

CA1 Cornu Ammonis Region 1

CA2 Cornu Ammonis Region 2

CA3a Cornu Ammonis Region 3a

CA3c Cornu Ammonis Region 3c

cm Zentimeter

DG Gyrus Dentatus

ECoG Elektrokortikogramm

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EEG Elektroenzephalogramm

EPM Elevated-Plus Maze

g Gramm

GABA Gamma-Amino-Buttersäure

GABAA-Rezeptor Gamma-Amino-Buttersäure-Rezeptor Typ A

h Stunde

HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie

(High Performance Liquid Chromatography)

Hz Herz

ILAE Internationale Liga gegen Epilepsie

(International League Against Epilepsy)

i. p. intraperitoneal

i. v. intravenös

KCC2 Kalium-Chlorid-Cotransporter Subtyp 2

kg Kilogramm

M Mol

Mg Milligramm

min Minute

mmol Millimol

mm Millimeter

mV Millivolt

MWM Morris Water Maze

Abkürzungen

NaCl Natriumchlorid

NKCC1 Natrium-Kalium-Chlorid-Cotransporter

Subtyp 1

NMDA N-Methyl-D-Aspartat

OF Open Field

p.a. pro analysi

PTZ Pentylentetrazol

RNA Ribonukleinsäure

s Sekunde

s. c. subkutan

SE Status epileptikus

SEM gemittelter Standartdfehler (Standard Error of

Mean)

µl Mikroliter

WHO Weltgesundheitsorganisation (World Health

Organisation)

z. B. zum Beispiel

Einleitung

1

1. Einleitung

Epilepsie ist die häufigste chronische neurologische Erkrankung des Menschen. Sie

ist charakterisiert durch das Auftreten von spontanen, wiederkehrenden epileptischen

Anfällen (CHANG und LOWENSTEIN 2003). Sie kann einhergehen mit psychischen

Begleiterkrankungen wie Depressionen, Angststörungen oder kognitiven

Dysfunktionen (JACOBS et al. 2009, JONES et al. 2010). Die häufigste

Epilepsieform bei Erwachsenen ist die Temporallappenepilepsie. Bei

symptomatischen Epilepsieformen, wie der Temporallappenepilepsie, ist ein

Hirninsult (z. B. Schädel-Hirn-Trauma, Status epileptikus) der primäre Auslöser der

Erkrankung. Der Prozess zwischen Hirninsult und Epilepsieentstehung wird als

Epileptogenese bezeichnet (LÖSCHER und BRANDT 2010 a, PITKÄNEN und

LUKASIUK 2011). Das Risiko einer posttraumatischen Epilepsie liegt je nach Insult

durchschnittlich bei 20%, das bedeutet, dass 20% der Patienten nach Insult an

Epilepsie erkranken werden. Bei schwersten, penetrierenden Schädel-Hirn-

Traumata, z. B. nach Schussverletzungen, steigt das Risiko sogar auf 50% (TEMKIN

et al. 1995, AARABI et al. 2000, Richtlinien der American Association for the Trauma

Surgery 2001, EFTEKHAR et al. 2009). Die Erkrankung tritt in den meisten Fällen in

den ersten zwei Jahren nach Hirninsult auf (ENGLANDER et al. 2003). Die derzeitige

Therapie der Epilepsie ist auf eine symptomatische Anfallsunterdrückung beschränkt.

Obwohl Patienten aus der Risikogruppe leicht identifiziert werden können, gibt es bis

heute keine Möglichkeit, diese Menschen präventiv zu behandeln (DICHTER 2009

PITKÄNEN und LUKASIUK 2011).

Aus diesem Grund ist es dringend notwendig, Strategien zu entwickeln, die die

Epileptogenese verhindern oder zumindest modulieren könnten (DICHTER 2009

LÖSCHER und BRANDT 2010 a, PITKÄNEN und LUKASIUK 2011). Der Versuch,

Patienten präventiv mit Medikamenten zu behandeln, die zur symptomatischen

Anfallsunterdrückung verabreicht werden, war nicht erfolgreich, da sich bis heute

keiner dieser Stoffe als antiepileptogen erwies (TEMKIN et al. 1990 und 1999,

TEMKIN 2001 und 2009). Während der Epileptogenese kommt es zu einer Reihe

von Veränderungen im Gehirn.

Einleitung

2

Zu ihnen zählen der Verlust von Neuronen, Entzündungsprozesse und die

Entstehung von neuronaler Übererregbarkeit (STABLES et al. 2002). Zu rationalen

Strategien der Antiepileptogenese zählen die Neuromodulation, die

Entzündungshemmung, die Neuroprotektion und die Immunmodulation (LÖSCHER

und BRANDT 2010 a, PITKÄNEN 2010, PITKÄNEN und LUKASIUK 2011). Die

Neuromodulation ist eine Strategie der Antiepileptogenese, die das Entstehen der

neuronalen Übererregbarkeit nach einem Insult verhindern soll (LÖSCHER und

BRANDT 2010 a). In dieser Arbeit soll die Neuromodulation nach Insult durch

Behandlung mit einem GABAA-Rezeptor-Antagonisten erfolgen. Unter

physiologischen Bedingungen prokonvulsiv wirkende GABAA-Rezeptor-Antagonisten

konnten in experimentellen Untersuchungen antikonvulsive Effekte in epileptischen

Netzwerken entfalten (KHAZIPOV und HOLMES 2003, KLAASSEN et al. 2006). Der

Einfluss solcher Mittel auf die Epileptogenese wurde bislang nicht untersucht.

Ziel dieser Arbeit war deshalb die Behandlung mit dem GABAA-Rezeptor-

Antagonisten Pentylentetrazol (PTZ) als pharmakologische Strategie der

Epilepsieprävention. Das antiepileptogene Potential von PTZ wurde in zwei

Rattenmodellen für Temporallappenepilepsie untersucht. Der Behandlungserfolg

wurde anhand des Auftretens von spontanen Anfällen nach Behandlung beurteilt.

Literaturübersicht

3

2. Literaturübersicht

2.1 Epilepsie

Epilepsien sind die häufigsten neurologischen Erkrankungen des Menschen. Etwa 50

Millionen Menschen sind weltweit von Epilepsien betroffen, das entspricht etwa 1%

der Weltbevölkerung (WHO 2009). Es handelt sich bei Epilepsien um eine seit

langem bekannte Gruppe von Erkrankungen, die bereits im Altertum beschrieben

wurden. Epilepsien sind charakterisiert durch spontane wiederkehrende Anfälle, die

infolge von pathologischen, synchronen Neuronenentladungen auftreten (FISHER et

al. 2005). Nach Nomenklatur der Internationalen Liga gegen Epilepsie (International

League Againist Epilepsy ILAE) lassen sich sowohl Epilepsien, als auch epileptische

Anfälle verschiedenen Gruppen zuordnen.

Epilepsien kann man je nach Ätiologie in idiopathisch, symptomatisch und kryptogen

einteilen (SHORVON 2011). Bei idiopathischen Epilepsien handelt es sich um

Erkrankungen genetischen Ursprungs. Symptomatische Epilepsien haben einen

primären Hirninsult, wie z. B. ein Schädel-Hirn-Trauma als Auslöser. Kryptogene

Epilepsien sind unbekannten Ursprungs, vermutlich symptomatisch. Durch immer

genauer werdende diagnostische Verfahren werden heutzutage auch kleinste

Hirnveränderungen besser erkannt, so dass eine Vielzahl von früher kryptogen

eingestuften Epilepsien nun als symptomatisch klassifiziert wird. Aus diesem Grund

wird vermutet, dass die Mehrzahl kryptogener Epilepsien eigentlich symptomatischer

Natur ist (SHORVON 2011).

Epileptische Anfälle können ebenfalls klassifiziert werden. Je nachdem, ob während

eines Anfalls beide Hirnhemisphären betroffen sind oder nicht, werden Anfälle als

fokal oder generalisiert bezeichnet. Bei fokalen Anfällen entsteht der Anfall im

epileptischen Fokus, meist in den Strukturen des limbischen Systems im

Temporallappen und bleibt auf den Fokus begrenzt. Fokale Anfälle können bei

erhaltenem Bewusstsein auftreten (einfache fokale Anfälle), oder mit

Bewusstseinsverlust einhergehen (komplex fokale Anfälle).

Literaturübersicht

4

Wenn sich ein fokaler Anfall über den Fokus hinaus auf beide Hirnhemisphären

ausbreitet, sprechen wir von sekundär generalisierten Anfällen. Primär generalisierte

Anfälle können mit tonisch-klonischen Krämpfen einhergehen (konvulsiver Anfall).

Es kann aber auch zu einer kurzen Bewusstseinstrübung ohne Krämpfe kommen

(Absence-Anfall) (SHORVON 2011) .

Epilepsien werden ganzheitlich als Epilepsie-Syndrom zusammengefasst (FISHER et

al. 2005). Neben epileptischen Anfällen kann die Krankheit mit einer Reihe von

psychiatrischen Begleiterkrankungen einhergehen, die bedeutend für die

Lebensqualität der Betroffenen sind. Zu den häufigsten psychiatrischen

Komorbiditäten zählen Depressionen, Angststörungen, Psychosen und kognitive

Dysfunktionen (KANNER 2011). Ein weiterer Faktor, der für die Lebensqualität der

Patienten von Bedeutung ist, ist die immer noch große Stigmatisierung der

Erkrankung (GARCIA-MORALES et al. 2008, JONES et al. 2010).

2.2 Temporallappenepilepsie

Temporallappenepilepsie ist die am häufigsten auftretende Epilepsieform bei

Erwachsenen. Sie ist außerdem die Epilepsieform mit der höchsten Anzahl der

therapieresistenten Fälle und somit von besonderer Bedeutung für die medizinische

Forschung (ENGEL 1996 a). Auf dem Markt vorhandene Medikamente können vielen

Patienten helfen, die Anfälle zu kontrollieren, jedoch wird weniger als die Hälfte der

Patienten dauerhaft anfallsfrei (SPENCER 2002).

Bei dieser Erkrankung ist der Epilepsieherd in den Strukturen des Temporallappens

lokalisiert (vorwiegend im Hippokampus). Die Temporallappenepilepsie ist

gekennzeichnet durch wiederkehrende, spontane Anfälle (komplex-fokal und

sekundär generalisiert), neuronale Degeneration und psychiatrische

Begleiterkrankungen wie Depressionen und Lern- und Gedächtnisstörungen

(MAJORES et al. 2004, JONES et al. 2010). Ein möglicher Grund für die

Verknüpfung psychiatrischer Auffälligkeiten mit Temporallappenepilepsien ist die

Tatsache, dass die Anfälle im Temporallappen entstehen und dieser für emotionales

Verhalten eine besondere Rolle spielt (SCHACHER et al. 2006).

Literaturübersicht

5

Die Neurodegeneration, auch hippokampale Sklerose genannt, betrifft bestimmte

Regionen des Hippokampus (Hiluszellen des Gyrus Dentatus,

Pyramidalzellschichten CA1 und CA3c) (MARGERISON und CORSELLIS 1966,

SLOVITER 1994, KÄLVIÄINEN et al. 1998, MAJORES et al. 2004).

Die Temporallappenepilepsie ist eine symptomatische Epilepsieform. Der

Erkrankung geht ein primärer Hirninsult voraus. Eine Vielzahl von Ereignissen kann

das Entstehen einer Temporallappenepilepsie begünstigen. Zu den häufigsten

Hirninsulten zählen Schädel-Hirn-Traumata, Hirntumore, ein lang anhaltender

epileptischer Anfall, welcher als Status epileptikus (SE) bezeichnet wird,

Fieberkrämpfe, Schlaganfälle oder Infektionen des zentralen Nervensystems

(STABLES et al. 2002). Der Prozess zwischen Hirninsult und ersten spontanen

epileptischen Anfällen wird als Epileptogenese bezeichnet. Während der

Epileptogenese kommt es zu einer Reihe von Veränderungen im Gehirn, unter

anderem zu neuronaler Übererregbarkeit, Entzündung und Neurodegeneration.

Welcher dieser Prozesse ursächlich für die Epilepsieentstehung ist, ist zur Zeit nicht

bekannt (LÖSCHER und BRANDT 2010 a).

Da es bislang nicht möglich ist, der Epilepsieentstehung bei Risikopatienten durch

prophylaktische Behandlung nach einem Insult entgegenzuwirken, ist die

gegenwärtige Therapie auf eine symptomatische beschränkt (DICHTER 2009 Alle

auf dem Markt erhältlichen Antiepileptika sind antikonvulsive Stoffe, welche

symptomatisch die Anfälle unterdrücken, ohne zu einer Heilung zu führen. Die

Einnahme von Antiepileptika ist mit Nebenwirkungen verbunden, welche einen

Einfluss auf die Lebensqualität der Betroffenen haben können. Das größte Problem

der gegenwärtigen Therapie mit Antiepileptika ist jedoch die Tatsache, dass bis zu

75% der Patienten mit Temporallappenepilepsie pharmakoresistent sind (SPENCER

2002). Das bedeutet, dass sie trotz Therapie mit zwei verschiedenen Antiepileptika

(kombiniert oder als Monotherapie) nicht dauerhaft anfallsfrei werden (KWAN et al.

2010). Für pharmakoresistente Patienten ist eine chirurgische Resektion des

epileptischen Fokus oftmals die einzige Alternative. Auch nach einem solchen

Eingriff werden nicht alle Patienten anfallsfrei. Viele sind trotz Resektion auf eine

Therapie mit Antiepileptika angewiesen (FOLDVARY et al. 2001, LÖSCHER und

SCHMIDT 2006). Aus diesen Gründen ist die Antiepileptogeneseforschung von

größter Bedeutung für Patienten aus der Risikogruppe.

Literaturübersicht

6

2.3 Epileptogenese und Epilepsieprävention Als Epileptogenese werden die Prozesse bezeichnet, die im Gehirn zur

Epilepsieentstehung nach einem initialem Insult führen. Die Latenzzeit zwischen

primärem Hirninsult und der Epilepsieentstehung bietet ein Zeitfenster für eine

präventive Behandlung (STABLES et al. 2002, STAFSTROM und SUTULA 2005).

Leider ist nicht bekannt, welcher Zeitpunkt nach Insult optimal für eine präventive

Behandlung ist. Es gibt Hinweise aus tierexperimentellen Arbeiten, dass eine solche

Behandlung schnellstmöglich erfolgen sollte (CHEN et al. 2007, ECHEGOYEN et al.

2009). In einer Studie von PITKÄNEN et al. (2004) konnte jedoch selbst eine

Behandlung sieben Tage nach Hirninsult noch zu krankheitsmodifizierenden Effekten

führen. Die Latenzzeit kann bei Menschen viele Jahre andauern (FRENCH et al.

1993, SILLANPÄÄ und SCHMIDT 2006). In Nagermodellen, die zur

Epilepsieforschung etabliert wurden, ist sie auf einige Tage bis Wochen beschränkt.

Während der Epileptogenese kommt es zu verschiedenen Veränderungen im Gehirn.

Insultassoziierter Neuronenverlust, Entzündung, synaptische Reorganisation und

neuronale Übererregbarkeit sind einige von ihnen (STABLES et al. 2002). Da bis

heute nicht geklärt ist, welche dieser Prozesse ursächlich an der Epilepsieentstehung

beteiligt sind, und welche eine Konsequenz der Epilepsie darstellen, ist ein rationaler

antiepileptogener Ansatz schwierig. Als rationale Strategien der Antiepileptogenese

sind die antiinflammatorische, die immunmodulatorische, die neuromodulatorische

sowie die neuroprotektive Strategie zu nennen (PITKÄNEN et al. 2004, VEZZANI

und GRANATA 2005, BRANDT et al. 2006, JUNG et al. 2006, ANDRE et al. 2007,

ZENG et al. 2009, BRANDT et al. 2010, POLASCHECK et al. 2010, STARK und

BAZAN 2011). Neuroprotektion wurde lange Zeit als Strategie zur

Epilepsieprävention verfolgt. Obwohl neuroprotektive Stoffe identifiziert werden

konnten, blieb die Neuroprotektion ohne Auswirkungen auf die Anfallsentwicklung

(ANDRE et al. 2001, BRANDT et al. 2006, ANDRE et al. 2007, POLASCHECK et al.

2010, LANGER et al. 2011). Leider konnte bis heute kein Mittel identifiziert werden,

welches einen wahren antiepileptogenen Effekt hervorruft, das heißt, die

Epilepsieentstehung nach einem Insult verhindern kann (LÖSCHER und BRANDT

2010 a).

Literaturübersicht

7

Der Prozess der Epilepsieentstehung und Progression (Epileptogenese) bietet

mehrere Möglichkeiten der therapeutischen Intervention.

Am Anfang des Prozesses steht der initiale Insult. Das sind meist Schädel-Hirn-

Traumata, Fieberkrämpfe im Kleinkindalter, ein SE, ein Schlaganfall oder auch eine

Infektion des zentralen Nervensystems. Wenn es nicht gelingt, den durch den Insult

entstandenen Schaden zu reparieren, kann es durch begünstigende Faktoren wie

„second hit“, Empfindlichkeitsgene oder Komorbiditäten zum Auftreten von

spontanen epileptischen Anfällen kommen (WALKER et al. 2002). Der

Krankheitsverlauf kann progressiv sein, es können psychiatrische Komorbiditäten

auftreten. Oftmals ist die Epilepsie pharmakoresistent, das bedeutet, dass es zu

keiner vollständigen Anfallsunterdrückung durch Medikamente kommt (KWAN et al.

2010). Die Zeit zwischen dem initialem Insult und der klinischen Manifestation der

Epilepsie, dem Auftreten von spontanen Anfällen, wird als Latenzzeit bezeichnet. Die

Latenzzeit bietet mehrere Möglichkeiten der therapeutischen Intervention (LÖSCHER

et al. 2008). Das Ziel aller Antiepileptogenese-Studien ist es, eine wirklich

antiepileptogene Substanz zu finden, welche das Auftreten von epileptischen

Anfällen nach Hirninsult verhindern könnte. Patienten aus der Risikogruppe könnten

mit einer solchen Substanz prophylaktisch nach Insult behandelt werden. Leider ist

es bis heute nicht gelungen eine solche Substanz zu identifizieren (DICHTER 2009

Es gibt verschiedene Probleme bei therapeutischen Ansätzen. Zum einen die Wahl

des geeigneten Behandlungszeitpunktes und der Behandlungsdauer mit einer

antiepileptogenen Substanz. Zum anderen die Abgrenzung einer wirklich

antiepileptogenen Wirkung von einer Insultmodifizierung und Krankheitsmodifizierung

(LÖSCHER und BRANDT 2010 a, PITKÄNEN und LUKASIUK 2011).

Die Antiepileptogenese ist nur während der Latenzzeit, vor dem ersten Auftreten von

epileptischen Anfällen möglich. Eine andere Möglichkeit der therapeutischen

Intervention ist die Insultmodifizierung. Eine Insultmodifizierung ist z. B. ein

schnellstmöglicher SE-Abbruch oder Fiebersenkung im Falle von Fieberkrämpfen.

Durch Insultmodifizierung soll das Risiko von spontanen Anfällen gesenkt werden,

sie kann aber auch einen krankheitsmodulierenden Effekt zufolge haben z. B. einen

milderen, nichtprogressiven Krankheitsverlauf. Eine Insultmodifizierung ist nur

zeitnah zum Insult möglich. Ein krankheitsmodulierender Effekt wäre auch nach

klinischer Manifestation der Epilepsie möglich. Eine symptomatische

Literaturübersicht

8

Anfallsunterdrückung mit Antikonvulsiva ist derzeit die einzige Therapie für

Epilepsiepatienten (LÖSCHER und BRANDT 2010 a, PITKÄNEN 2010, MANI et al.

2011). Aus diesem Grund ist die Suche nach prophylaktischen

Behandlungsmaßnahmen von größter Bedeutung. Die Epilepsieentstehung und

Progression ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt.

2.4. Antikonvulsiva in der Epileptogeneseforschung Eine Reihe von Antiepileptika, die zur symptomatischen Anfallsunterdrückung

verwendet werden, wurde auf ihr antiepileptogenes Potential hin untersucht.

Solche Untersuchungen fanden in Tiermodellen, aber auch in klinischen Studien an

Patienten statt.

2.4.1 Untersuchungen im Tiermodell

Im Kindling-Modell konnte ein antiepileptogener Effekt für Phenobarbital, Valproat

und Levetiracetam gezeigt werden (TURNER et al. 1977, SILVER et al. 1991,

LÖSCHER et al. 1998, STRATTON et al. 2003). Ein Nachteil des Kindling-Modells ist

Primärer Hirninsult

Intervention

Insult-Modifizierung

Reparatur

Keine Reparatur Keine Konsequenz

Spontane Anfälle

Chronische Epilepsie

Progression der Epilepsie

Keine Progression

Epileptogenesez. B. durch „second hit“

Antiepileptogenese

Anfallsunterdrückung

Krankheitsmodifizierung

Abb. 1: Epilepsieentstehung und –progression und Möglichkeiten der Intervention. Modifiziert nach LÖSCHER et al. (2008).

Literaturübersicht

9

jedoch die Tatsache, dass die Tiere in diesem Modell nicht chronisch epileptisch

sind, sondern nur akut induzierte Anfälle haben.

Da sie jedoch im Laufe des Kindling-Prozesses immer empfindlicher auf die

induzierten Anfälle reagieren und es somit zu chronischen Veränderungen der

individuellen Krampfschwelle kommt, wird das Kindling-Modell als Epileptogenese-

Modell eingestuft. Weder Phenobarbital, noch Valproat zeigten antiepileptogene

Effekte in klinischen Studien (TEMKIN 2001). In post SE-Epilepsiemodellen wurden

ebenfalls verschiedene Antiepileptika untersucht. Solche Modelle unterscheiden sich

vom Kindling-Modell dadurch, dass die Tiere eine chronische Epilepsie nach einem

SE entwickeln (in diesen Modellen ist ein SE der initiale Insult). Bis auf Topiramat

konnte für keinen dieser Stoffe ein antiepileptogener Effekt gezeigt werden (BRANDT

et al. 2006, SUCHOMELOVA et al. 2006, BRANDT et al. 2007, JESSBERGER et al.

2007, BRANDT et al. 2010, FRANCOIS et al. 2011). Die Behandlung mit den

Antiepileptika Valproat, Carisbamat und Topiramat führte zur

Krankheitsmodifizierung in post SE-Epilepsiemodellen (BRANDT et al. 2006,

SUCHOMELOVA et al. 2006, JESSBERGER et al. 2007, FRANCOIS et al. 2011) .

Eine Behandlung mit dem Antiepileptikum Valproat war in Rattenmodellen für

Temporallappenepilepsie neuroprotektiv, ein antiepileptogener Effekt konnte jedoch

nicht erzielt werden (BRANDT et al. 2006, JESSBERGER et al. 2007). Die einzige

Studie, in der ein antiepileptogener Effekt einer Valproat-Behandlung gezeigt werden

konnte wurde von BOLANOS et al. (1998) durchgeführt. Da in dieser Arbeit die

Anfallsausprägung während der Phase ds Valproatausschleichens untersucht wurde,

ist nicht sicher, ob der beobachtete Effekt einen wahren antiepileptogenen Effekt

darstellt oder nur auf die antikonvulsive Wirkung des Valproats zurückzuführen ist.

Für Carisbamat konnte im Tiermodell ebenfalls ein starker neuroprotektiver Effekt

gezeigt werden. Zusätzlich hatte Carisbamat durch eine Insultmodifikation einen

krankheitsmodifizierenden Effekt bei der Ratte, wenn es direkt nach pilokarpin-

induziertem SE verabreicht wurde (FRANCOIS et al. 2011). Für Topiramat konnte

ebenfalls ein neuroprotektiver Effekt gezeigt werden (RIGOULOT et al. 2004). In

einer Studie von SUCHOMELOVA et al. (2006) war eine Topiramat-Behandlung

krankheitsmodifizierend. In einer Arbeit von (2002) konnte ein antiepileptogener

Effekt mit einer Topiramat-Behandlung erzielt werden, die Studie wurde 2002 als

Abstract, jedoch bislang nicht als Manuskript veröffentlicht. Eine klinische Studie zum

Literaturübersicht

10

Einsatz von Topiramat nach Schädel-Hirn-Trauma wird derzeit durchgeführt, die

Ergebnisse sind noch nicht bekannt (Quelle: clinicaltrials Datenbank).

Insgesamt ist es gelungen neuroprotektive Substanzen zu identifizieren, die

Neuroprotektion hatte jedoch keinen Einfluss auf die Epilepsieentstehung. Somit ist

es nicht gelungen einen antiepileptogenen Effekt über Neuroprotektion zu erreichen.

2.4.2 Klinische Studien

Es wurden mehrere klinische Studien mit verschiedenen Antiepileptika durchgeführt

(MANI et al. 2011). In einer verblindeten, placebokontrollierten Studie von TEMKIN et

al. (1990) wurde das Antiepileptikum Phenytoin bei Patienten mit Schädel-Hirn-

Trauma untersucht. Die prophylaktische Behandlung startete 24 h nach Insult und

wurde ein Jahr lang fortgeführt. Sie hatte keinen Effekt auf die spätere

Anfallsentwicklung. Es gab keinen signifikanten Unterschied in der Anfallsentstehung

zwischen behandelter Gruppe und Placebo-Gruppe. In einem weiteren Versuch

dieser Arbeitsgruppe (TEMKIN et al. 1999) wurden die Antiepileptika Phenytoin und

Valproat bei Patienten mit Schädel-Hirn-Trauma untersucht. Drei verschiedene

Studiendesigns wurden gewählt: 1. Phenytoin-Behandlung über eine Woche, 2.

Valproat-Behandlung über eine Woche, 3. Valproat-Behandlung über sechs Monate.

Auch in dieser Studie konnte kein antiepileptogener Behandlungseffekt gezeigt

werden. In einer Metaanalyse verschiedener Antiepileptogenesestudien konnte für

keinen der getesteten Stoffe ein antiepileptogener Effekt gezeigt werden (TEMKIN

2001). Untersucht wurden Diazepam und Phenobarbital bei Patienten mit

Fieberkrämpfen, Phenytoin und Valproat bei Hirntumorpatienten und Carbamazepin

und Phenobarbital bei Schädel-Hirn-Trauma Patienten (TEMKIN 2001). In einer

weiteren Studie von TEMKIN (2009) wurde der Einsatz von Phenobarbital,

Carbamazepin, Phenytoin, Valproat und Magnesium bei Patienten nach Schädel-

Hirn-Trauma untersucht. Mit keinem dieser Stoffe konnte ein antiepileptogener Effekt

erzielt werden. Keines der getesteten Antiepileptika erwies sich bei Risikopatienten

zur prophylaktischen Behandlung geeignet. Diese Befunde lassen darauf schliessen,

dass Prozesse, die während der Epileptogenese zur Epilepsieentstehung führen,

sich von dem Prozess der akuten Anfallsentstehung, welcher durch Antiepileptika

Literaturübersicht

11

unterdrückt wird, unterscheiden (WEAVER 2003). Aus diesem Grund werden

zunehmend andere Strategien der Antiepileptogenese verfolgt.

2.5 Prokonvulsiva in der Epileptogeneseforschung Für verschiedene Stoffe, die bei naiven Tieren prokonvulsiv wirken (HALONEN et al.

1995, WALLACE et al. 2003, CHROSCINSKA-KRAWCZYK et al. 2011), konnte

experimentell ein antikonvulsiver, neuromodulierender oder

krankheitsmodifizierender Effekt gezeigt werden (ARMSTRONG et al. 2009).

Untersucht wurden der Adenosin-Rezeptor-Agonist Koffein, der α2-Rezeptor-

Antagonist Atipamezol und der Typ 1 Cannabinoid-Rezeptor-Antagonist Rimonabant.

In einer Studie von RIGOULOT et al. (2003) wurde der Einfluss einer Koffein-

Behandlung im Lithium-Pilokarpin-Modell untersucht. Ratten wurden hierfür 15 Tage

vor SE und 7 Tage danach oral mit Koffein behandelt. Die Behandlung hatte keinen

antiepileptogenen Effekt, wirkte jedoch neuroprotektiv. Die Ergebnisse dieser Studie

sind insofern kritisch zu sehen, da die Behandlung bereits vor Insult (SE) startete,

was zu einer Modifikation des Insults führen kann und für eine Behandlung von

Risikopatienten nicht umsetzbar ist. Das Prokonvulsivum Atipamezol wurde in einer

Studie von PITKÄNEN et al. (2004) in einem Rattenmodell für

Temporallappenepilepsie (elektrisches post SE-Epilepsiemodell) untersucht. Das

Atipamezol wurde verwendet, da es bereits im Rattenmodell für Schlaganfall zum

Einsatz kam und dort zu positiven Effekten führte (PUURUNEN et al. 2001). Eine

systemische Behandlung mit Atipamezol konnte die Epilepsieentstehung zwar nicht

verhindern, die Krankheit hatte jedoch einen milderen, nichtprogressiven Verlauf

(PITKÄNEN et al. 2004). Zudem hatte die Behandlung einen neuroprotektiven Effekt.

Die Behandlung führte insgesamt zu einer Krankheitsmodifizierung.

Der Typ 1 Cannabinoid-Rezeptor-Antagonist Rimonabant wurde in mehreren Studien

auf sein antiepileptogenes Potential hin untersucht (CHEN et al. 2007, ECHEGOYEN

et al. 2009, DUDEK et al. 2010). Der Einsatz von Cannabinoid-Rezeptor-

Antagonisten sollte über Neuromodulation zur Verhinderung der neuronalen

Übererregbarkeit führen. Es gibt Hinweise, dass Veränderungen der Cannabinoid-

Rezeptoren, die nach einem Insult erfolgen, die Entstehung von neuronaler

Übererregbarkeit begünstigen können. Eine Applikation von Cannabinoid-Rezeptor-

Literaturübersicht

12

Antagonisten sollte die Entstehung der neuronalen Übererregbarkeit durch eine

Blockade der Plastizität der Cannabinoid-Rezeptoren nach einem Hirninsult

verhindern. In der Studie von CHEN et al. (2007) wurde eine Rimonabant-Applikation

2 min nach Induktion von Fieberkrämpfen bei Ratten vorgenommen.

Sechs Wochen nach Behandlung wurde die neuronale Erregbarkeit anhand einer

Kainsäure-Krampfschwelle ermittelt. Die Behandlung mit Rimonabant konnte das

Entstehen einer neuronalen Übererregbarkeit sechs Wochen nach Behandlung

verhindern. Das Auftreten von spontanen Anfällen wurde in dieser Studie jedoch

nicht untersucht. In der Studie von ECHEGOYEN et al. (2009) wurde ein ähnliches

Studiendesign in einem Schädel-Hirn-Trauma-Modell bei Ratten angewendet. Auch

in diesem Modell gelang es durch eine einmalige Rimonabant-Gabe direkt nach

Insult, die neuronale Übererregbarkeit sechs Wochen später zu verhindern. Die

neuronale Erregbarkeit wurde auch hier mittels Kainsäure-Krampfschwelle ermittelt.

Da diese Studien vielversprechende Ergebnisse lieferten, wurde Rimonabant auch in

einer Antiepileptogenese-Studie untersucht. In der Arbeit von DUDEK et al. (2010)

wurde Rimonabant im systemischen Kainsäure-Modell (chemisches post SE-

Epilepsiemodell) bei der Ratte untersucht. Die Rimonabant-Applikation erfolgte

einmalig nach SE-Induktion. Der Behandlungserfolg wurde mittels EEG- und

Videoüberwachung bis zwei Wochen nach SE überprüft. Die Rimonabant-

Behandlung hatte in dieser Untersuchung keinen Einfluss auf die Anfallsentwicklung.

Es konnte somit kein antiepileptogener Effekt erzielt werden.

Prokonvulsive GABAA-Rezeptor-Antagonisten wurden ebenfalls in der

Epilepsieforschung verwendet. Sie werden im nächsten Kapitel näher beschrieben.

2.6 GABA und Epilepsie GABA ist als wichtigster inhibitorischer Neurotransmitter von besonderem Interesse

für die Epilepsieforschung. Lange wurde Epilepsie als Ungleichgewicht zwischen

Inhibition und Exzitation gesehen und die Anfallsentstehung wurde als Konsequenz

von Veränderungen des GABAergen Systems beschrieben (ENGEL 1996 b, DALBY

und MODY 2001). Eine Reihe von antikonvulsiven Stoffen (Phenobarbital,

Diazepam, Vigabatrin, Valproat) wirkt zumindest teilweise über eine Verstärkung des

GABAergen Sytems. Neuere Hypothesen belegen jedoch, dass GABA auch

Literaturübersicht

13

proepileptogen wirken kann (COHEN et al. 2002, KHAZIPOV und HOLMES 2003,

KLAASSEN et al. 2006).

2.6.1 Theorie der exzitatorischen GABA

Es konnte gezeigt werden, dass GABA nach Insult depolarisierend und somit

exzitatorisch wirken kann. Bei Epilepsiepatienten kann es zu einem GABA-switch

von inhibitorisch zu exzitatorisch kommen. Dieser beruht auf einer veränderten

Exprimierung von Chlorid-Cotransportern in bestimmten Hirnregionen (Subiculum).

Eine Hochregulierung von NKCC1 (Subtyp 1 Natrium-Kalium-Chlorid-Cotransporter)

bei gleichzeitig gesenkter Exprimierung von KCC2 (Sybtyp 2 Kalium-Chlorid-

Cotransporter) an Neuronen führt zu Veränderungen des Chloridhaushaltes. Der

intrazelluläre Chloridgehalt steigt an. Das hat zufolge, dass GABA depolarisiered

wirkt (COHEN et al. 2002, PALMA et al. 2006). Dieser Zustand ist neonatal

physiologisch (BEN-ARI et al. 1989). Es wird vermutet, dass das Gehirn nach einem

Insult auf neonatale Funktionsweisen zurückgreift. Somit wird während der

Epileptogenese die Ontogenese wiederholt. Dieser ursächlich als

Reparaturmechanismus bestehende Prozess ist in diesem Fall kontraproduktiv

(KÖHLING 2002, BEN-ARI und HOLMES 2005). In reseziertem humanen

Temporallappengewebe von chronisch epileptischen Patienten konnte eine

depolarisiernde Wirkung von GABA im Subiculum gezeigt werden (COHEN et al.

2002). In einer Studie von PALMA et al. (2006) konnte die unphysiologische

Exprimierung von NKKC1 und KCC2 in Temporallappengewebe von chronisch

epileptischen Patienten auf RNA-Ebene gezeigt werden. Ein GABA-switch nach

Hirninsult konnte auch tierexperimentell gezeigt werden (PATHAK et al. 2007). In

der Studie von PATHAK et al. (2007) konnte bereits 24 h nach pilokarpin-induziertem

SE ein positiver EGABA-Shift (GABA Umkehr-Potential) im Hippokampus festgestellt

werden. Das lässt auf eine depolarisiernde Wirkung von GABA schließen. Zwei

weitere Arbeiten geben indirekt Hinweise auf den GABA-switch (LI et al. 2008,

BRANDT et al. 2010). In der Studie von LI et al. (2008) wurde im Maus Pilokarpin-

Modell (chemisches post SE-Epilepsiemodell) eine NKCC1-Expression im

Hippokampus bereits einen Tag nach SE auf RNA- und Protein-Ebene gezeigt. In

der Arbeit von BRANDT et al. (2010) konnte die NKCC1-Expression 24 h sowie vier

Literaturübersicht

14

Tage nach pilokarpin-induziertem SE bei Ratten immunhistochemisch gezeigt

werden. All das lässt vermuten, dass es nach einem Insult durch eine Veränderte

Exprimierung von Chlorid-Cotransportern zu einem GABA-switch von inhibitorisch zu

exzitatorisch kommt.

Da eine depolarisiernde Wirkung von GABA neonatal physiologisch ist, lassen sich

Anfälle bei Kleinkindern nur schwer mit traditionellen Antikonvulsiva unterdrücken. In

verschiedenen tierexperimentellen in vivo und in vitro Studien konnte eine

pharmakologische Blockade des NKCC1-Transporters mit dem selektiven NKCC1-

Inhibitor Bumetanid Anfälle bei Neonaten unterdrücken (DZHALA et al. 2005 und

2008, GLYKYS et al. 2009). Es wurden ebenfalls Epileptogenesestudien mit

Bumetanid vorgenommen, sowohl im modifizierten Kindlig-Modell, als auch in einem

post SE-Epilepsiemodell (MAZARATI et al. 2009, BRANDT et al. 2010). In der

Kindling-Studie von MAZARATI et al. (2009) gab es Hinweise auf einen

antiepileptogenen Effekt einer Bumetanid-Behandlung bei neonatalen Ratten. In der

Studie von BRANDT et al. (2010) konnte im Pilokarpin-Modell kein antiepileptogener

Effekt mit einer Bumetanid-Behandlung erzielt werden. Dies könnte jedoch an

methodischen Schwierigkeiten liegen (kurze Plasmahalbwertszeit und schlechte

Penetration der Blut-Hirn-Schranke durch Bumetanid).

Der Einsatz von GABAA-Rezeptor-Antagonisten wäre in Hinsicht auf diese Theorie

ebenfalls eine Möglichkeit, um durch antagonistische Wirkung am GABAA-Rezeptor

depolarisierende GABA-Aktionen zu verhindern.

2.6.2 Synchronisations-Theorie

GABA kann auch proepileptogen wirken, ohne direkte exzitatorische Eigenwirkung

zu entfalten. Nach einem Insult kommt es initial zu einem kompensatorischen

Anstieg der GABAergen Inhibition (GREEN 1986). Dadurch werden erregende

glutamaterge Neurone zunächst gehemmt. Die gesteigerte GABAerge Inhibition kann

jedoch nicht lange aufrechterhalten werden. Nach ihrem Kollaps werden viele

erregende glutamaterge Neurone gleichzeitig aus ihrer Hemmung entlassen und

können synchron feuern (MANN und MODY 2008). Diese Netzwerk-

Synchronisierung führt zu einer Übererregbarkeit in der betroffen Hirnregion, was die

Entstehung von epileptischen Anfällen begünstigen kann (MANN und MODY 2008).

Literaturübersicht

15

Der Einsatz von GABAA-Rezeptor-Antagonisten wäre in Hinsicht auf diese Theorie

sinnvoll, um den initialen Anstieg der GABAergen Inhibition zu verhindern. Das

würde in Konsequenz die Netzwerk-Synchronisierung und die daraus resultierende

neuronale Übererregbarkeit verhindern.

Es wurden bereits Studien zum Einsatz von GABAA-Rezeptor-Antagonisten in der

Epilepsieforschung durchgeführt. In einer Studie von KHAZIPOV und HOLMES

(2003) wurden elektrophysiologische Untersuchungen des Hippokampus in vivo an

anästhesierten Ratten durchgeführt. Epileptiforme Aktivität wurde mittels Kainsäure

erzeugt. Eine Zugabe des GABAA-Rezeptor-Antagonisten Bicucullin konnte die

epileptiforme Aktivität unterbinden. Es wurde postuliert, dass GABA zu einer

Netzwerk-Synchronisierung führte, die durch Bicucullin-Gabe unterbrochen wurde.

Somit hatte in dieser Untersuchung die Behandlung mit einem GABAA-Rezeptor-

Antagonisten einen antikonvulsiven Effekt. In einer Studie von KLAASSEN et al.

(2006) wurden Untersuchungen in einem genetischen Mausmodell für humane

autosomal dominante nokturnale Frontallappenepilepsie durchgeführt. In dieser

Studie konnte eine subkonvulsive Dosis des GABAA-Rezeptor-Antagonisten

Picrotoxin die klinische und elektrographische Anfallsausprägung unterdrücken. In

diesen Studien konnte in zwei verschiedenen Modellen und Untersuchungsdesigns

gezeigt werden, dass GABAA-Rezeptor-Antagonisten antikonvulsiv wirken können.

Der antikonvulsive Effekt wird auf eine Verhinderung der Netzwerk-Synchronisierung

zurückgeführt. Es wurden jedoch bislang keine Antiepileptogenesestudien mit

GABAA-Rezeptor-Antagonisten durchgeführt, obwohl es nach einem Insult

wahrscheinlich zu einer Übererregbarkeit infolge von Netzwerk-Synchronisierung

kommt. Aus diesem Grund haben wir entschieden eine Behandlung mit dem GABAA-

Rezeptor-Antagonisten Pentylentetrazol (PTZ) als Strategie der Epilepsieprävention

durchzuführen.

2.7 Tiermodelle für Temporallappenepilepsie Um Substanzen auf ihr antiepileptogenes Potential hin zu untersuchen, sind

geeignete Tiermodelle notwendig. Ein ideales Tiermodell der

Temporallappenepilepsie sollte die Konditionen der Temporallappenepilepsie beim

Menschen widerspiegeln, d.h. die Epilepsie sollte infolge eines Hirninsults und nach

Literaturübersicht

16

einer gewissen Latenzzeit auftreten, die Tiere sollten komplex fokale und sekundär

generalisierte Anfälle haben, mit Ursprung im Temporallappen, und es sollten

pathologische Veränderungen im Hippokampus auftreten (hippokampale Sklerose)

(CURIA et al. 2008). Ferner sollten die Tiere Verhaltensauffälligkeiten zeigen, welche

den psychiatrischen Komorbiditäten der Humanpatienten ähnlich sind.

Ein geeignetes Modell sollte Prädiktivität hinsichtlich der klinischen Wirksamkeit der

getesteten Arzneimittel aufweisen. Es gibt kein „ideales“ Epilepsiemodell, welches

allen Anforderungen genügt und zusätzlich praktikabel ist, aus diesem Grund kann

es sinnvoll sein, verschiedene Modelle ergänzend zu nutzen, um falsch-positive und

falsch-negative Ergebnisse zu vermeiden (LÖSCHER und BRANDT 2010 a). Es gibt

eine Vielzahl an Epilepsie- und Anfallsmodellen, nicht alle sind jedoch gleichermaßen

für Antiepileptogenestudien geeignet. Schädel-Hirn-Trauma-Modelle spiegeln die

Ätiologie der humanen Epilepsie gut wider. Sie sind jedoch aufgrund von

Praktikabilitätsgründen (lange Latenzzeit und die geringe Anzahl an epileptischen

Tieren nach Insult) nur bedingt für Antiepileptogenesestudien geeignet (BOLKVADZE

und PITKÄNEN 2011, PITKÄNEN et al. 2011 ). Die NIH/NINDS (National Institutes of

Health/National Institute of Neurological Disorders and Stroke) empfehlen das

Kindling-Modell und post SE-Epilepsiemodelle zur Erforschung von

antiepileptogenen Therapien (STABLES et al. 2002). Im Kindling-Modell sind die

Tiere nicht chronisch epileptisch, sie haben keine spontanen Anfälle, sondern nur

akut induzierte. Trotzdem kommt es bei den Tieren zu chronischen Veränderungen

(Senkung der Krampfschwelle). In post SE-Epilepsiemodellen sind die Tiere

chronisch epileptisch und haben spontane epileptische Anfälle. Da in dieser Arbeit

ausschließlich post SE-Epilepsiemodelle an der Ratte verwendet werden, wird auf

diese im Weiteren näher eingegangen.

In post SE-Epilepsiemodellen ist ein SE der initiale Hirninsult. Dieser kann elektrisch,

durch Stimulation bestimmter Hirnareale oder chemisch, durch Krampfgifte ausgelöst

werden. Diese können entweder systemisch oder fokal also direkt in Zielareale des

Gehirns verabreicht werden. Nach einer modellabhängig unterschiedlich langen

Latenzzeit kommt es bei den Tieren zu spontanen, wiederkehrenden epileptischen

Anfällen. Die Epilepsie bleibt meist lebenslänglich bestehen (LÖSCHER 2002).

Literaturübersicht

17

2.7.1 Das Lithium-Pilokarpin-Modell

Pilokarpin ist ein Parasypathomimetikum welches die Blut-Hirn-Schranke passieren

kann und dadurch sowohl periphere, als auch zentrale Wirkungen entfaltet. Das

systemische Pilokarpin-Modell, als Rattenmodell für Temporallappenepilepsie, wurde

erstmals von TURSKI et al. (1983) beschrieben.

Die Applikation von Pilokarpin führt über eine Aktivierung von muskarinergen M1-

Rezeptoren zu Krämpfen, die in einen SE übergehen (HAMILTON et al. 1997). Der

pilokarpin-induzierte SE wird nicht ausschließlich über eine Aktivierung von

muskarinergen Rezeptoren vermittelt, eine Aktivierung der NMDA-Rezeptoren ist für

die Aufrechterhaltung des SE verantwortlich (NAGAO et al. 1996, SMOLDERS et al.

1997). Die Pilokarpin-Applikation kann entweder als Bolus (400 mg/kg) oder

fraktioniert (10 mg/kg in 30 min Abständen) erfolgen (TURSKI et al. 1983, GLIEN et

al. 2001). Die fraktionierte Pilokarpin-Gabe ermöglicht es, durch eine individuelle

Dosisanpassung die ansonsten hohe Mortalitätsrate zu senken (GLIEN et al. 2001).

Eine weitere Möglichkeit der Dosissenkung besteht bei einer Vorbehandlung der

Tiere mit Lithium. Lithium, das in der Humanmedizin als Antipsychotikum

Verwendung findet, führt über eine periphere Entzündungsreaktion zu Schädigungen

der Blut-Hirn-Schranke. Es kommt zu einer Ausschüttung von Interleukin 1β und

Monozyten, die die Blut-Hirn-Schranke schädigen. Aus diesem Grund kann 12-16 h

vor Pilokarpin-Applikation eine Behandlung mit Lithium erfolgen, um durch die

Vorschädigung der Blut-Hirn-Schranke die Pilokarpin-Dosis zu senken (MARCHI et

al. 2009). Der SE wird für gewöhnlich nach 60-120 min pharmakologisch (meist

durch Diazepam) unterbrochen, da die Tiere sonst sterben würden. Nach einer

Latenzzeit von Tagen bis Wochen kommt es bei den Tieren zum Auftreten von

spontanen, wiederkehrenden epileptischen Anfällen, die lebenslang bestehen

bleiben (LEITE et al. 1990 a). Die epileptischen Tiere zeigen hyperexzitables

Verhalten sowie kognitive Störungen (RICE et al. 1998, LEITE et al. 1990 b). Bei den

Tieren kommt es außerdem zu histopathologischen Veränderungen im Gehirn, die

dem Bild der hippokampalen Sklerose des Menschen entsprechen. Die

Neuronenverluste sind jedoch stärker ausgeprägt und sind nicht ausschliesslich auf

Strukturen des Temporallappens beschränkt (SLOVITER 2005). Zusammenfassend

kann man sagen, dass das Lithium-Pilokarpin-Modell ein gutes, durch die

systemische Applikation einfaches und praktikables Modell der

Literaturübersicht

18

Temporallappenepilepsie darstellt, welches viele der Konditionen der humanen

Temporallappenepilepsie widerspiegelt (CURIA et al. 2008). Wie jedes Modell hat es

auch Nachteile, das sind vor allem das Ausmaß und die Ausprägung der

histologischen Veränderungen und Verhaltensänderungen.

Es wird auch vermutet, dass der pilokarpin-induzierte SE einen derart schweren

Insult darstellt, dass es nur bedingt möglich ist, in diesem Modell antiepileptogene

Stoffe zu entdecken (SLOVITER 2005). Aus diesem Grund haben wir beschlossen,

unsere Arbeit vergleichend an zwei Rattenmodellen für Temporallappenepilepsie

durchzuführen.

2.7.2 Das fokale Kainsäure-Modell

Kainsäure ist ein aus der Alge Dignea simplex gewonnenes Glutamat-Analogon,

welches, wie Glutamat selbst, erregend wirkt. Es entfaltet seine Wirkung über

ionotrope Glutamat-Rezeptoren (Kainat-Rezeptoren) (OLNEY et al. 1974, LODGE et

al. 1979, BEN-ARI und COSSART 2000). Eine fokale intracerebrale Kainsäure-

Applikation führt bei den Tieren zu epileptischen Anfällen (komplex fokal und

sekundär generalisiert), die in einen limbischen SE übergehen (BEN-ARI 1985). Der

SE wird in diesem Modell nicht unterbrochen und kann mehrere Stunden andauern.

Trotzdem ist die Mortalitätsrate sehr gering (RAEDT et al. 2009). Die meisten

Arbeiten zu diesem Modell wurden in den achtziger Jahren des 20. Jahrhunderts

durchgeführt. Neuere Arbeiten wurden von Bragin et al. (1999, 2004, 2005 und 2007)

und RAEDT et al. durchgeführt. Die Kainsäure-Applikation kann entweder unter

Narkose oder an wachen Ratten erfolgen (CAVALHEIRO et al. 1982, BRAGIN et al.

1999, RAEDT et al. 2009). Eine Applikation unter Narkose ist zwar einfacher

durchzuführen, die Narkose kann aber einen insultmodifizierenden Effekt haben und

dadurch die spätere Entstehung von epileptischen Anfällen beeinflussen. In einer

Studie von CAVALHEIRO et al. (1982) konnte ein kainsäure-induzierter SE zwar

spontane epileptische Anfälle auslösen, diese hörten jedoch nach 30 Tagen auf

(spontane Remission). Vermutlich ist dies auf einen insultmodifizierenden Effekt der

Narkose zurückzuführen. Aus diesem Grund haben wir uns für eine SE-Induktion an

wachen Ratten entschieden. Auch in diesem Modell kommt es zur Ausprägung von

epileptischen Anfällen nach einer Latenzzeit von Tagen bis Wochen (BABB et al.

Literaturübersicht

19

1995, RAEDT et al. 2009). In der Studie von RAEDT et al. (2009) konnte eine

Progression der Krankheit gezeigt werden. Die Tiere zeigen Verhaltensänderungen

wie gesteigerte Aggressivität und kognitive Dysfunktionen (HANDELMANN und

OLTON 1981, CAVALHEIRO et al. 1982).

Eine einseitige Kainsäure-Injektion in die CA3-Region des Hippokampus führt primär

zu Schäden der ipsilateralen Injektionsseite. Betroffen sind vor allem die CA3a- und

CA3c-Region, sowie die Hilusneurone des Gyrus Dentatus. Die CA1-Region und die

Körnerzellschicht des Gyrus Dentatus werden relativ verschont (RAEDT et al. 2009).

Die Veränderungen treten dosisabhängig auf (HANDELMANN und OLTON 1981,

CAVALHEIRO et al. 1982) . Die histopathologischen Veränderungen spiegeln das

Bild der hippokampalen Sklerose bei Humanpatienten gut wider (BABB et al. 1995,

RAEDT et al. 2009). Dadurch, dass der SE in diesem Modell nicht abgebrochen wird,

variiert die SE-Länge von Tier zu Tier, was einen Nachteil des Modells darstellt.

Durch die fokale Applikation der Kainsäure sind die Neurodegeneration und die

Verhaltensänderungen moderater als in systemischen post SE-Epilepsiemodellen.

Aus diesem Grund wollten wir dieses Modell für unser Labor etablieren.

2.8 Pentylenterazol (PTZ) PTZ ist ein GABAA-Rezeptor-Antagonist, der seine Wirkung durch Bindung an der

Picrotoxin-Bindungsstelle im Inneren des Chloridionophors entfaltet

(RAMANJANEYULU und TICKU 1984, HUANG et al. 2001). Durch seine

antagonistische Wirkung am GABAA-Rezeptor ist PTZ prokonvulsiv (MACDONALD

und BARKER 1977). PTZ wurde erstmalig in den dreißiger Jahren des 20.

Jahrhunderts zur Krampftherapie bei Behandlung von Patienten mit Depression

eingesetzt (FINK 1972 und 1984). Diese Form der Behandlung wurde durch die

elektrokonvulsive Therapie ersetzt. PTZ wurde außerdem als zentrales Analeptikum

bei Narkosezwischenfällen verwendet. Durch seine geringe therapeutische Breite ist

es für diese Indikation jedoch obsolet (COPER und HERRMANN 1988). PTZ wird

experimentell als anxiogener (JUNG et al. 2002) und aufmerksamkeitssteigernder

Stoff verwendet. In einem Maus-Modell des Down-Syndroms konnte eine PTZ-

Behandlung die Langzeitpotenzierung und dadurch die Kognition verbessern

(FERNANDEZ et al. 2007).

Literaturübersicht

20

In der experimentellen Epilepsieforschung wird PTZ zur Anfallsinduktion verwendet.

Die akute Anfallsinduktion wird auch im PTZ-Schwellentest genutzt. Mittels des PTZ-

Schwellentests kann die individuelle Krampfschwelle bestimmt werden. Der Test

kann durch subkutane, intraperitoneale oder intravenöse Applikation durchgeführt

werden.

Die intravenöse Applikation erhöht die Sensitivität des Tests durch individuelle

Dosierung. Während des Tests wird PTZ intravenös bis zum Auftreten eines

Krampfes verabreicht. Anhand der Zeit bis zum Auftreten des Anfalls, der PTZ-

Konzentration und -Infusionsrate und des Gewichtes des Tieres, kann die individuelle

Krampfschwelle ermittelt werden. Diese wird ausgedrückt in der PTZ-Dosis [mg/kg],

die nötig war, um den Anfall auszulösen. Der Test kann angewendet werden, um

Medikamente auf eventuelle antikonvulsive oder prokonvulsive Wirkung zu

untersuchen und findet breite Verwendung in der pharmazeutischen Industrie

(ORLOFF et al. 1949, LÖSCHER 2009). Der PTZ-Schwellentest kann bei einem Tier

mehrmals wiederholt werden und ermöglicht es, Änderungen der individuellen

Krampfschwelle zu erfassen, z. B. nach Prämedikation mit verschieden

Medikamenten. Dadurch, dass PTZ seine Wirkung am GABAA-Rezeptor entfaltet, ist

es vorwiegend prädiktiv für Medikamente mit GABA-potenzierendem

Wirkungsmechanismus und könnte Hinweise auf Veränderungen des GABAergen

Systems geben (LÖSCHER 2009 und2011).

Es gibt eine Reihe von Untersuchungen, die den PTZ-Metabolismus bei Ratten

beschreiben. Die PTZ-Plasmahalbwertszeit liegt bei 2-3h (ESPLIN und WOODBURY

1956, VOHLAND und ZUFELDE 1976, RAMZAN und LEVY 1985). PTZ wird bei der

Ratte in der Leber metabolisiert und renal ausgeschieden. Es penetriert die Blut-Hirn-

Schranke und breitet sich im Gehirn aus (ESPLIN und WOODBURY 1956). Die

prokonvulsive Wirkung wird durch den Hippokampus und parahippokampale

Regionen (GOLARAI et al. 1992, STRINGER 1994, WALSH et al. 1999, QIAN et al.

2011) aber auch durch den mamillothalamischen Trakt vermittelt (MIRSKI und

FERRENDELLI 1986 und 1987). Es gibt bislang keine Studien über den Einsatz

einer PTZ-Behandlung zur Epilepsieprävention.

Zielsetzung und Arbeitshypothesen

21

3. Zielsetzung und Arbeitshypothesen

Es ist bislang nicht möglich, die Epilepsieentstehung nach einem Hirninsult zu

verhindern. In zahlreichen Studien wird versucht, die Epileptogenese durch

unterschiedliche Strategien zu verhindern. Während der Epileptogenese kommt es

zu einer Reihe von Veränderungen im Gehirn, unter anderem zur neuronalen

Übererregbarkeit, zur Entzündung und zu Neuronenverlusten. In dieser Arbeit haben

wir uns auf die neuronale Übererregbarkeit fokussiert. Mit einer pharmakologischen

Strategie wollen wir die neuronale Übererregbarkeit nach einem Insult verhindern,

um in Konsequenz die Epileptogenese zu verhindern. Da es bis heute keine

Möglichkeit gibt, Patienten aus klar definierbaren Risikogruppen nach einem Insult

präventiv zu behandeln, ist eine Forschung auf diesem Gebiet von größter

Bedeutung. Da konservative Strategien einer Behandlung mit antikonvulsiven Mitteln

nach Insult bis heute nicht erfolgreich waren, wird der Einsatz von prokonvulsiven

Mitteln in der Antiepileptogeneseforschung immer häufiger diskutiert. Grund dafür ist

die Annahme, dass bei der Epileptogenese andere Mechanismen eine Rolle spielen

als bei der akuten Anfallsentstehung und deshalb der Einsatz von Antikonvulsiva

ohne Erfolg blieb. Es gibt Hinweise, dass der Einsatz von Stoffen, die eigentlich

prokonvulsiv wirken, von Vorteil sein könnte. In diesem Projekt soll der prokonvulsive

GABAA-Rezeptor-Antagonist PTZ zur Verhinderung der neuronalen Übererregbarkeit

verwendet werden. Die Wahl eines GABAA-Rezeptor-Antagonisten hat folgende

Gründe: Trotz der früheren Annahmen, dass Epilepsie durch einen Mangel an

GABAerger Inhibition ausgelöst wird, gibt es zunehmend Hinweise, dass der

inhibitorische Transmitter GABA auch proepileptogen wirken kann (KHAZIPOV und

HOLMES 2003, KLAASSEN et al. 2006). Zum einen konnte gezeigt werden, dass

eine nach Hirninsult kompensatorisch gesteigerte GABAerge Inhibition nach ihrem

Kollaps erregende Netzwerke synchronisieren kann (MANN und MODY 2008). Zum

anderen wurde ein GABA-switch von inhibitorisch zu exzitatorisch gezeigt (COHEN

et al. 2002, PATHAK et al. 2007). Dieser beruht auf einer Veränderung in der

Expression von Chlorid-Cotransportern nach einem Insult.

Zielsetzung und Arbeitshypothesen

22

Ziel dieser Arbeit war es, durch Applikation von PTZ in subkonvulsiver Dosierung die

initiale GABA-Hochregulierung nach einem Insult zu verhindern und somit der

Netzwerk-Synchronisierung entgegenzuwirken. Eine Behandlung mit PTZ wäre

ebenfalls bei einem GABA-switch sinnvoll, da PTZ die depolarisiernde Wirkung von

GABA antagonisieren könnte. Für andere GABAA-Rezeptor-Antagonisten (Picrotoxin,

Bicucullin) konnte sowohl in vivo, als auch in vitro, ein antikonvulsiver Effekt auf

epileptische Netzwerke gezeigt werden (KHAZIPOV und HOLMES 2003,

KLAASSEN et al. 2006). Der Einfluss eines solchen Stoffes auf die Epileptogenese

wurde jedoch noch nicht untersucht. Unsere Arbeitshypothese lautete:

Eine präventive Behandlung mit subkonvulsiven PTZ-Dosen nach Insult wirkt

antiepileptogen.

Diese Arbeitshypothese wollten wir in zwei Rattenmodellen für

Temporallappenepilepsie testen, im systemischen Pilokarpin-Modell und im fokalen

Kainsäure-Modell. Da wir das fokale Kainsäure-Modell für unser Institut erst

etablieren mussten, ergab sich für die Modelletablierung folgende Arbeitshypothese:

Das fokale Kainsäure-Modell ist ein geeignetes Rattenmodell für

Temporallappenepilepsie, welches ein moderateres Modell darstellt als das

systemische Pilokarpin-Modell.

Um Veränderungen des GABAergen Systems nach Insult zu beschreiben, haben wir

Veränderungen der individuellen Krampfschwelle nach SE untersucht. Das sollte uns

helfen, den am besten geeigneten Behandlungszeitpunkt nach SE herauszufinden.

Diese Untersuchungen wurden vergleichend in beiden Epilepsiemodellen

durchgeführt. Unsere Arbeitshypothese lautete hier:

Ein SE führt als initialer Insult zu Veränderungen des GABAergen Systems,

welche sich modellunabhängig im PTZ-Schwellentest als Veränderungen der

individuellen Krampfschwelle erfassen lassen.

Das Hauptziel dieser Arbeit war die Untersuchung des antiepileptogenen Potentials

von PTZ. Die Schwellenversuche waren Vorrausetzung zur Festlegung eines

Behandlungszeitfensters. Darüber hinaus sollten sie zusätzliche Informationen über

den Prozess der Epileptogenese und die zeitlichen Abläufe während dieses

Prozesses geben. Die Etablierung des fokalen Kainsäure-Modells sollte es

ermöglichen, dieses chemische SE-Modell bei der Ratte besser zu charakterisieren.

Material und Mehtoden

23

4. Material und Methoden

Im Anhang befindet sich eine Auflistung der verwendeten Substanzen,

Verbrauchsmaterialien und Geräte sowie die Herstellungsprotokolle verwendeter

Lösungen und die Färbeprotokolle.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden drei Studien durchgeführt.

Studie 1: Etablierung des fokalen Kainsäure-Modells.

Studie 2: PTZ-Schwellenversuche im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell.

Studie 3: Infusionsversuche mit PTZ im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell.

In allen Studien wurden die Methoden der stereotaktischen Operation, der Status

epileptikus-Induktion (SE-Induktion) und der EEG- und Videoüberwachung

angewendet, aus diesem Grund werden sie einleitend beschrieben. Die

studienspezifischen Details sind dann bei der entsprechenden Studie eingehend

erklärt.

4.1 Tiere Für die Versuche dieser Studien wurden weibliche Sprague Dawley-Ratten von

Harlan (Horst, Niederlande) und Charles River (Sulzfeld, Deutschland) verwendet.

Alle Ratten wogen bei ihrer Ankunft 200-220 g (Alter ~ 9 Wochen). Die Tiere mit

EEG-Aufsätzen wurden einzeln in durchsichtigen Makrolonkäfigen Typ III (Ebeco,

Caustrop-Rauxel) auf Weichholzgranulat gehalten. Tiere ohne EEG-Aufsätze wurden

in Gruppen von 5 Ratten in Makrolonkäfigen Typ IV (Ebeco, Caustrop-Rauxel)

gehalten. Sie erhielten Leitungswasser und Standardnagerdiät (Altromin, Lage) ad

libitum. Das Umsetzen in saubere Käfige erfolgte einmal pro Woche. Das Futter

wurde einmal pro Woche aufgefüllt, das Wasser zweimal pro Woche erneuert. Die

weiblichen Ratten wurden ohne männliche Tiere gehalten, um einen synchronen

Zyklusstand zu vermeiden. Die Raumtemperatur betrug 22-24° C, die Luftfeuchtigkeit

lag bei 50-60%. Die Tiere wurden in einem 12 Stunden Hell-Dunkel-Zyklus gehalten

(helle Phase von 6-18 Uhr, mitteleuropäische Zeit).


24

Nach Ankunft hatten die Tiere mindestens eine Woche, um sich an die neue

Umgebung zu gewöhnen, in dieser Zeit wurden sie täglich an den Umgang mit

Menschen und die späteren Eingriffe (Fixieren etc.) gewöhnt.

4.2 Stereotaktische Operation Nach der Eingewöhnungsphase erfolgte die stereotaktische Operation. Dieser

Eingriff diente der Implantation von EEG-Ableitelektroden und bei Tieren aus dem

fokalen Kainsäure-Modell auch von Führungsrohren zur Kainsäure-Mikroinjektion.

Die bipolaren Ableitelektroden wurden in unserem Institut aus teflonisoliertem,

rostfreien Stahldraht (Science Products, Hofheim) hergestellt. Die Führungsrohre

wurden, ebenfalls in unserem Institut, aus rostfreiem Edelstahldraht (Schoeller

Werke, Hellenthal) hergestellt, waren 17 mm lang und hatten einen

Innendurchmesser von 0,52 mm.

Die Methode der stereotaktischen Operation ermöglicht es, bestimmte

Gehirnregionen anhand ihrer Lage relativ zu sichtbaren Kreuzungen von

Knochennähten an der Schädeloberfläche (z. B. Bregma, Lambda) zu lokalisieren.

Mithilfe von ermittelten Koordinaten aus dem Rattenhirnatlas von PAXINOS und

WATSON (2007) kann die Lage von spezifischen Gehirnregionen bestimmt werden.

Diese Technik kann angewendet werden, um Ableit-, Stimulationselektroden, oder

auch Führungsrohre zu implantieren oder auch um Substanzen im Verfahren der

Mikroinjektion in bestimmte Hirnareale zu injizieren.

Die Ableitelektrode wurde in den rechten Gyrus Dentatus (DG) des Hippokampus

implantiert (siehe Abbildung 3). Die Koordinaten waren bereits in unserem Labor

etabliert. Das Führungsrohr wurde analog zu BRAGIN et al. (2004) in den rechten,

posterioren Hippokampus, 1 mm über der Zielregion (CA3-Region) implantiert (siehe

Abbildung 4). Die Koordinaten wurden in Vorversuchen ermittelt und waren anterior-

posterior für Ratten von Harlan und Charles River unterschiedlich. Die

stereotaktischen Koordinaten für Elektrode und Führungsrohr sind in nachfolgender

Tabelle dargestellt

.


25

Lage relativ zu

Bregma EEG-Elektrode Führungsrohr

Harlan-Ratten Charles-River-Ratten

Anterior-posterior

(AP) -3,9 mm -5,8 mm -5,6 mm

Lateral (L) -1,7 mm -4,5 mm

Ventral (V) -3,5 mm -4,3 mm

Tabelle 1: Stereotaktische Koordinaten für die Implantation von DG-Elektroden und Führungsrohren.

Der Zahnbalken des Stereotakten war auf -3,9 mm eingestellt, damit Bregma

(rostraler Kreuzungspunkt der Knochennähte) und Lambda (kaudaler

Kreuzungspunkt der Knochennähte) auf einer Höhe lagen.

Die Tiere wurden mit Chloralhydrat (400 mg/kg i.p., Konzentration: 36 mg/ml,

Injektionsvolumen: 10 ml/kg) oder Isofluran (als Inhalationsnarkose, 3% zur

Narkoseeinleitung, 1,5% zur Aufrechterhaltung der Narkose) narkotisiert. Die Wahl

der Narkose wird bei den einzelnen Studien eingehend beschrieben. Die

Narkosetiefe wurde anhand des Zwischenzehenreflexes beurteilt. Im Falle einer zu

flachen Chloralhydrat-Narkose wurde ein Viertel der Ausgangsdosis nachinjiziert.

Anschließend wurde die Kopfhaut rasiert. Die Tiere wurden in den Stereotakten

eingespannt, indem die Ohrbalken in den knöchernen Gehöhrgang geschoben

wurden. Nach gerader Positionierung wurde die Kopfhaut mit 70%igem Ethanol

desinfiziert. Die desinfizierte Kopfhaut wurde nun mit Lokalanästhetikum (Tetracain

2%, Einwirkzeit 5 Minuten) benetzt. Nach Einwirken der Anästhesie wurde ein 2-3 cm

langer Schnitt in der Medianen vorgenommen, und die Haut wurde mit

Bulldogklemmen zu den Seiten hin aufgeklappt. Die Schädeldecke wurde mit

Lokalanästhetikum benetzt (Bupivacain 0,2%, Einwirkzeit 5 Minuten). Nach

Einwirken der Anästhesie wurde das Periost mit einem Periostschaber entfernt und

die Schädeldecke wurde mit Wasserstoffperoxid (35%) gereinigt, um die

Knochennähte darzustellen. Die Lage von Bregma wurde nun bestimmt und markiert.

Anhand der Koordinaten relativ zu Bregma wurden die Bohrlöcher markiert und

gebohrt. Die Bohrlöcher wurden mit einem Dentalbohrer (Dremel, Leinfelden-

Echterdingen) gebohrt.


26

Insgesamt wurden 4 Bohrlöcher bei der Implantation einer Ableitelektrode gebohrt

(eins für die Elektrode, 3 für Halteschrauben). Bei der Implantation von

Ableitelektrode und Führungsrohr wurden 6 Bohrlöcher benötigt (entsprechend 2 für

Elektrode und Führungsrohr und 4 für Halteschrauben). Die Elektrode und das

Führungsrohr wurden anhand der ermittelten Koordinaten in den Bohrlöchern

implantiert. Zusätzlich zur Elektrode und dem Führungsrohr wurden Halteschrauben

(Hummer & Rieß, Nürnberg) am Schädel angebracht. An der Halteschraube rechts

neben der Elektrode, wurde die indifferente Erdungselektrode angebracht (siehe

Abbildung 2). Das implantierte Führungsrohr wurde durch einen Mandrin

verschlossen.

Die Befestigung am Schädel erfolgte mit kaltaushärtendem Zahnzement (Paladur,

Heraeus Kulzer, Hanau). Die unterste Schicht war mit Marbofloxacin-Pulver versetzt,

um postoperativen Infektionen vorzubeugen. Aus dem Zahnzement entstand ein

Aufsatz, welcher eine für den Stecker des EEG-Kabels kompatible Endung hatte.

Nach Aushärtung des Zahnzements wurden die Wundränder um den Aufsatz herum

adaptiert und mit resorbierbarem Nahtmaterial (Surgicryl PGA, Hünningen, Belgien),

durch Knopfhefte verschlossen. Die Tiere erhielten acht Tage lang Antibiose,

beginnend zwei Tage vor dem Eingriff (Marbofloxacin ca. 3 mg/kg, 0,1 ml/Tier

zweimal täglich s.c.). Nach dem Eingriff hatten die Tiere eine zwei- bis dreiwöchige

Erholungsphase. In dieser Zeit wurden sie zweimal pro Woche an Umgang mit

Menschen und die späteren Eingriffe gewöhnt.

Elektrode

Erde

Führungsrohr

Halteschraube

Abb. 2: Aufsicht auf einen Rattenschädel mit eingezeichneten Kreuzungen der Knochennähte (Bregma, Lambda) und Lokalisation von Elektrode, Erde und Führungsrohr. Modifiziert nach PAXINOS und WATSON (2007)


27

Abb. 3: Schematische Darstellung der Lokalisation der Ableitelektrode . Modifiziert nach PAXINOS und WATSON (2007).

Abb. 4: Schematische Darstellung der Lokalisation des Führungsrohres . Modifiziert nach PAXINOS und WATSON (2007).


28

4.3 SE-Induktion In den Studien dieser Arbeit wurden zwei SE-Modelle angewendet, das systemische

Pilokarpin-Modell und das fokale Kainsäure-Modell. Da es im Pilokarpin-Modell zu

massiver Neurodegeneration und Verhaltsänderungen kommt, wollten wir zusätzlich

ein moderateres Modell für unsere Untersuchungen nutzen. Aus diesem Grund

haben wir uns entschlossen, das fokale Kainsäure-Modell in unserem Institut zu

etablieren und die weiteren Studien in beiden Modellen vergleichend durchzuführen.

Modellabhängig erfolgte die SE-Induktion also durch systemische Pilokarpin-Gabe

oder durch fokale Kainsäure-Mikroinjektion. Beide Methoden der SE-Induktion sollen

im Weiteren näher beschrieben werden.

4.3.1 SE-Induktion im Pilokarpin-Modell

Die SE-Induktion im Pilokarpin-Modell erfolgte fraktioniert, analog eines an unserem

Institut etablierten Protokolls von GLIEN et al. (2001). Zwölf bis sechzehn Stunden

vor Pilokarpin-Gabe erhielten die Ratten Lithiumchlorid (127 mg/kg in 3 ml/kg aqua

dest.) oral. Aufgrund der Lithiumchlorid-Vorbehandlung ist es möglich, die Pilokarpin-

Dosis zu reduzieren. Die periphere Wirkung des Pilokarpins wurde durch

intraperitoneale (i.p.) Verabreichung von Methylscopolamin (1 mg/kg, gelöst in 1

ml/kg aqua dest.) 30 min vor Pilokarpin-Gabe antagonisiert. Das Pilokarpin wurde

ebenfalls intraperitoneal verabreicht. Das fraktionierte Pilokarpin-Protokoll ermöglicht

eine individuelle Dosierung und senkt so die Sterblichkeitsrate.

Die Tiere erhielten 10 mg/kg Pilokarpin (gelöst in 10 ml aqua dest.) in

dreißigminütigen Abständen bis zum Auftreten eines generalisierten Anfalls. Wenn

die generalisierten Anfälle nicht mehr aufhörten oder das Tier das Bewusstsein

zwischen den Anfällen nicht wiedererlangte, wurde dieser Zustand als Eintritt des SE

beschrieben. Die Zahl der Injektionen pro Tier war auf 5 beschränkt.

Erfahrungsgemäß führen weitere Injektionen nur noch bei wenigen Tieren zum SE,

sie steigern die Mortalitätsrate jedoch deutlich.

Der SE wurde, versuchsabhängig nach 60 oder 90 min (im Detail bei den einzelnen

Versuchen beschrieben), pharmakologisch unterbrochen. Der SE-Abbruch erfolgte

entweder durch Diazepam oder durch eine kombinierte Behandlung aus Diazepam,

Phenobarbital und Scopolamin (im Detail bei den einzelnen Versuchen beschrieben).


29

Der SE-Abbruch war notwendig, um zum einen die Mortalitätsrate zu senken, und

zum anderen, um die Schwere des Insults (SE) für alle Tiere gleich zu halten.

Die Kontrollen erhielten die gleiche Behandlung, lediglich das Pilokarpin wurde durch

isotone Natriumchloridlösung ersetzt (sham SE). Tiere, die trotz fünfmaliger

Pilokarpin-Gabe keinen SE hatten, wurden versuchsabhängig entweder als eigene

Untergruppe zusammengefasst oder vom Versuch ausgeschlossen (im Detail bei

den einzelnen Versuchen beschrieben).

Bei den Ratten, bei denen eine Ableitelektrode implantiert wurde, wurde die SE-

Induktion unter EEG-Kontrolle durchgeführt. Die Tiere wurden je nach

Gewichtszunahme und Allgemeinbefinden unterschiedlich lange (3 bis 5 Tage) mit

Babynahrung zwangsernährt. Im Falle der Dehydrierung erhielten die Ratten

zusätzlich einmal täglich isotone Natriumchloridlösung als Injektion (4 ml pro Ratte

i.p.).

4.3.2 SE-Induktion im fokalen Kainsäure-Modell

Die SE-Induktion erfolgte in diesem Modell durch fokale Kainsäure-Mikroinjektion in

den Hippokampus (siehe Abbildung 5). Die Mikroinjektion wurde nach einem an

unserem Institut etablierten Protokoll von GERNERT und LÖSCHER (2001) an frei

beweglichen Ratten durchgeführt (siehe Abbildung 6). Für die Mikroinjektion wurde

Kainsäure von Sigma-Aldrich verwendet. Die Kainsäure-Konzentration betrug 0,4 µg

in einem Injektionsvolumen von 0,2 µl isotoner Natriumchloridlösung, analog

BRAGIN et al. (2005). Das Mikroinjektionssystem war wie folgt aufgebaut: Eine

stählerne Injektionskanüle (1 mm länger als das Führungsrohr, um die CA3-Region

des Hippokampus zu erreichen) war durch einen 20-30 cm langen, flexiblen

Polyethylenschlauch mit einer 0,5 µl Hamiltonspritze verbunden. Nach Entfernen des

Mandrins wurde die Injektionskanüle durch das Führungsrohr eingeführt. Die

Injektionskanüle verblieb erst 1 Minute im Gehirn, um Druckreaktionen des

Gewebes abzuwarten. Nach einer Minute begann die eigentliche Mikroinjektion. Die

Kainsäure wurde über 4 Minuten injiziert (0,05 µl/Minute). Das Injektionsvolumen

wurde anhand der Vorwärtsbewegung eines Markerfarbstoffes (Thionin) kontrolliert,

welcher durch Luftblasen und destilliertes Wasser von der eigentlichen Substanz

getrennt war.


30

Nach Ende der Mikroinjektion wurde die Kanüle für eine weitere Minute im Gehirn

belassen, um der injizierten Substanz Zeit zur Diffusion zu geben. Während der

gesamten Prozedur wurden die Tiere beobachtet. Auftretende Anfälle oder

Stereotypien wurden notiert. Die Tiere wurden mindestens 10 Minuten vor der

Mikroinjektion EEG-überwacht, um ein Basis-EEG zu registrieren. Direkt nach der

Mikroinjektion wurden die Tiere ebenfalls an das EEG angeschlossen. Die EEG-

Überwachung dauerte bis zum nächsten Morgen (mindestens 20 h). Der SE wurde

nicht abgebrochen, er hörte bei allen Tieren spontan auf (nach etwa 11 h). Die

Ratten erholten sich sehr schnell und mussten im Gegensatz zum Pilokarpin-Modell

nicht mit Babynahrung gefüttert werden.

Abb. 5 : Schematische Darstellung der Lokalisation der Injektionsnadel zur Mikroinjektion. Modifiziert nach PAXINOS und WATSON (2007).

Abb. 6 : Intrahippokampale Mikroinjektion von Kainsäure bei einer wachen, freibeweglichen Ratte.


31

4.4 EEG- und Videoüberwachung

EEG-Überwachungssystem

Um epileptische Anfälle registrieren zu können, wurden die Tiere mittels EEG und

Video überwacht. Das EEG-Überwachungssystem bestand aus 16 Ein-Kanal-

Verstärkern (BioAmp ADInstruments, Spechbach) und einem 16-Kanal Analog-

Digital-Wandler (Power Lab ADInstruments, Spechbach). Die Daten wurden mit der

LabChart 6 oder LabChart 7 Windows-Software (ADInstruments, Spechbach)

aufgenommen und analysiert. Die Frequenz der EEG-Aufzeichnung lag bei 200 Hz.

Der Aufnahmebereich lag zwischen 0,1 s (Highpass-Filter) und 60 Hz (Lowpass-

Filter). Ein Notch-Filter oder Mains-Filter (Software-abhängig) filterten Frequenzen

von 50 Hz (Netzstrom) aus. Die EEG-Überwachung war mit einem

Videoüberwachungssystem kombiniert.

Das Videoüberwachungssystem verwendete zuerst digitale Webcams (Logitech,

Morges, Schweiz) mit Rotlichtlampen als Lichtquelle. Da die Bildqualitität

insbesondere nachts suboptimal war, wurde das System auf sensitivere Infrarot-

Kameras umgestellt (NYCTO Vision, CaS Services, Wunstorf) mit Infrarotlampen als

Lichtquelle. Die Kameras erlaubten eine gleichzeitige Aufnahme von 8 Tieren. Das

digitalisierte Videosignal wurde auf dem EEG-aufzeichnenden PC aufgenommen.

Die Chart-Software ermöglichte eine simultane Aufnahme von EEG- und digitaler

Video-Datei. Die über den gesamten Zeitraum eingeschalteten Infrarot-, bzw.

Rotlicht-Lampen, die über den Käfigen angebracht waren, dienten nachts als

Lichtquelle.

Die Ratten waren während der Überwachung in speziellen Einzelkäfigen aus

Plexiglas untergebracht. Zweiadrige, ummantelte Kabel mit Abschirmung dienten als

Ableitkabel und waren über einen Binder-Stecker mit den an den Köpfen der Ratten

befindlichen Aufsätzen verbunden. Die Kabel wurden anfangs in unserem Institut

hergestellt (mit Materialen von Menzel Electronic, Hannover), später bezogen wir sie

von der Firma Hopa Kabelkonfektion (Hopa Kabelkonfektion GmbH, Langenhagen).

Um den Tieren Bewegungsfreiheit zu gewährleisten, waren die Ableitkabel in

beweglichen Telefonentzwirlern an der Decke der Käfige befestigt. Die Kabel hatten

eine Aluminiumummantelung als Beißschutz.


32

Datenanalyse

Die Analyse der so gesammelten Daten erfolgte visuell. Wenn ein Anfall im EEG

gefunden wurde, wurde das entsprechende Video analysiert, um den Anfallstyp zu

bestimmen. Die Anfallstypen wurden nach einer modifizierten Anfallsskala von

RACINE (1972) klassifiziert. Wenn im EEG eindeutige Anfälle erkannt wurden, die im

Video nicht eindeutig sichtbar waren, z. B. wenn die Ratte mit dem Rücken zur

Kamera saß, oder die Aufnahme zu dunkel war, wurden diese als nicht klassifizierbar

eingestuft. Fokale Anfälle wurden im Video oft als unklassifiziert eingestuft, weil sie

schwer zu erkennen sind. Die verwendete, modifizierte Skala für Anfallstypen nach

RACINE (1972) ist in der nachfolgenden Tabelle dargestellt.

Anfallstyp Verhalten des Tieres

Typ I Stereotypes Schnüffeln,

Blinzeln, schwache

Kaubewegungen Fokale Anfälle

Typ II Kauen, Kopfnicken

Typ III Unilateraler

Vorderbeinklonus

Typ IV Bilateraler

Vorderbeinklonus mit

Aufrichten

Generalisierte Anfälle

Typ (V) Typ V ohne Umfallen, da

die Ratte durch einen

Hinterbeinklonus nach

vorne oder zur Seite fällt

Typ V Bilateraler

Vorderbeinklonus mit

Aufrichten und Umfallen

Tabelle 2: Zur Datenanalyse verwendete, modifizierte Anfallsskala nach RACINE (1972)


33

4.5 Studie 1: Etablierung des fokalen Kainsäure-Modells

4.5.1 Studiendesign

In dieser Studie sollte das fokale Kainsäure-Modell als moderates (im Vergleich zum

Pilokarpin-Modell) Temporallappenepilepsie-Modell etabliert werden. Die Studie

wurde an zwei Tiergruppen durchgeführt. In der ersten Gruppe wollten wir Tiere von

zwei verschiedenen Züchtern (Harlan und Charles River) vergleichen. Da es in

dieser Gruppe entzündungsbedingt zu vielen Verlusten der EEG-Aufsätze kam,

wurde eine zweite Tiergruppe unter optimierten Bedingungen mit Kainsäure

behandelt. Dadurch, dass wir in unserem Labor nur in wenigen Versuchen Tiere von

Charles River verwenden und keine Unterschiede in den Versuchen der ersten

Gruppe aufgefallen waren, wurden in der zweiten Gruppe ausschließlich Tiere von

Harlan verwendet. Beide Gruppen wurden zusammen ausgewertet.

1. Gruppe: Tiere von Charles River (n=10) und Harlan (n=10).

2. Gruppe: Tiere von Harlan (n=16).

Der zeitliche Ablauf der Studie ist in nachfolgender Abbildung gezeigt.

4.5.2 Implantation von Führungsrohren und Ableitelektroden

Die Implantation von Führungsrohren und Ableitelektroden erfolgte mittels

stereotaktischer Operation, wie in Kapitel 4.2 beschrieben. Alle Tiere dieser Studie

(n=36) wurden mit Chloralhydrat narkotisiert, da das Isofluran-System zu dieser Zeit

in unserem Labor noch nicht etabliert war.

Ankunft

der

Tiere

Stereotaktische

OP

SE-Induktion EEG- und

Videoüberwachung

Verhaltenstests PB-Selektion Histologie

4, 6 und 8 Wochen nach SE für 1-2,5 Wochen 24 h/Tag

1 Wo 2 Wo

13-30 Wo

nach SE

33 Wo

nach SE

40 Wo

nach SEEpileptogenese

Stereotaktische

OP

SE-Induktion EEG- und

Videoüberwachung

Verhaltenstests PB-Selektion Histologie

4, 6 und 8 Wochen nach SE für 1-2,5 Wochen 24 h/Tag

1 Wo 2 Wo

13-30 Wo

nach SE

33 Wo

nach SE

40 Wo

nach SEEpileptogenese

Abb. 7: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Studie 1 (PB - Phenobarbital).


34

Die Tiere erhielten auch in dieser Studie acht Tage lang Antibiose, beginnend zwei

Tage vor dem Engriff. Als Unterschied ist zu verzeichnen, dass die erste Tiergruppe

zuerst eine Kombination aus Gentamicin (Genta 5%, 50 mg/ml, 0,1 ml/Tier einmal

täglich s.c.) und Chloramphenicolsuccinat (112,5 mg verdünnt in 1 ml 0,9% NaCl-

Lösung, 0,1 ml/Tier, zweimal täglich i.m.) als Antibiose erhielten. Nach vermehrt

auftretenden Entzündungen und Verlusten der Aufsätze wurde ein Resistenztest

durchgeführt und die Antibiose wurde auf Marbofloxacin umgestellt. Während der

zweiwöchigen Erhohlungsphase nach der Operation wurden die Ratten zweimal pro

Woche an den Umgang mit Menschen und die späteren Eingriffe gewöhnt. Eine

Ratte starb in Narkose, acht weitere verloren die Aufsätze, so dass nur 27 Tiere in

weiteren Versuchen dieser Studie verwendet wurden.

4.5.3 SE-Induktion

Zwei Wochen nach der stereotaktischen Operation wurde bei den Tieren (n=27) ein

SE durch fokale Kainsäure-Mikroinjektion induziert. Die SE-Induktion erfolgte wie in

Kapitel 4.3.2 beschrieben. Der SE wurde nicht abgebrochen, er hörte bei allen Tieren

spontan auf. Die Ratten erholten sich sehr schnell und mussten nicht mit

Babynahrung gefüttert werden. Eine Ratte starb 2 Wochen nach SE, 4 andere

verloren ihre Aufsätze nach der Mikroinjektion, so dass 22 Ratten in weiteren

Versuchen dieser Studie verwendet wurden.

4.5.4 EEG- und Videoüberwachung

Die EEG- und Videoüberwachung erfolgte wie in Kapitel 4.4 beschrieben. Die erste

Tiergruppe (n=12) wurde 4, 6 und 8 Wochen nach SE-Induktion für jeweils 7 Tage

(24 h/d) überwacht. Die zweite Tiergruppe (n=10) wurde 8 Wochen nach SE-

Induktion zwischen 11 und 18 Tagen (24 h/d) überwacht. Die Unterschiede in der

Überwachungsdauer ergaben sich daraus, dass die erste Gruppe im Falle eines

Aufsatzverlustes weiterhin videoüberwacht wurde. Die zweite Tiergruppe sollte

ursprünglich 18 Tage überwacht werden, im Falle eines Aufsatzverlustes wurde die

Überwachung jedoch abgebrochen, da in diesem Modell oft fokale Anfälle auftreten,

welche im Video leicht übersehen werden können.


35

Die Ratten aus der zweiten Gruppe wurden zusätzlich nach 33 Wochen im Rahmen

eines Substanzversuches videoüberwacht (siehe Kapitel 4.5.6).

4.5.5 Verhaltenstests

Um die epilepsieassoziierten Verhaltensänderungen zu beurteilen, wurden bei den

Tieren diverse Verhaltenstests durchgeführt. Der Open Field- und Elevated-Plus

Maze-Test zur Beurteilung von explorations- und angstassoziiertem Verhalten, der

Hyperexzitabilitätstest zur Beurteilung der taktilen und akustischen Übererregbarkeit

und der Morris Water Maze-Test zur Beurteilung der räumlichen Orientierung und

des Lernverhaltens. Als Kontrolltiere dienten nichtepileptische Ratten (n=7). Die

Verhaltenstests wurden bei den zwei Versuchsgruppen zu unterschiedlichen

Zeitpunkten durchgeführt, da sie nicht von Anfang an in diesem Umfang geplant

waren. Der zeitliche Ablauf ist in nachfolgender Tabelle dargestellt. Aufgrund

baulicher Umbaumaßnahmen, die im Verhaltenslabor stattfanden, war es leider nicht

möglich, die zweite Tiergruppe im Morris Water Maze-Test zu testen.

Test Zeitpunkt der

Durchführung 1. Gruppe

Zeitpunkt der

Durchführung 2. Gruppe

HET: Hyperexzitabilitätstest 13 Wochen nach SE 15 Wochen nach SE

EPM: Elevated-Plus Maze-Test 26 Wochen nach SE 17 Wochen nach SE

OF: Open Field-Test 27 Wochen nach SE 18 Wochen nach SE

MWM: Morris Water Maze-Test 30 Wochen nach SE Nicht durchgeführt

Tabelle 3: Tabellarische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Verhaltensbatterie in beiden Tiergruppen.

Alle Verhaltensuntersuchungen wurden in einem speziellen Verhaltenslabor

durchgeführt, in dem standardisierte Bedingungen herrschten. Das Labor bestand

aus zwei voneinander getrennten Räumen. In einem Raum wurden die eigentlichen

Versuche durchgeführt, im anderen wurden die Tiere vor dem Versuch beobachtet

und konnten zur Ruhe kommen. Dadurch konnte gewährleistet werden, dass die

Ratten während des Versuchs nicht vom Experimentator beeinflusst wurden. Alle

Ratten wurden eine Stunde vor Versuchsbeginn in den Vorbereitungsraum gebracht,

um eine stressfreie Versuchsdurchführung zu gewährleisten.


36

Während dieser Zeit wurden sie beobachtet, um das Auftreten von epileptischen

Anfällen auszuschließen. Ein Tier wurde nur dann im Verhaltenstest untersucht,

wenn es mindestens eine Stunde vor Versuchsbeginn anfallsfrei war. Bei Anfällen,

die während des Versuchs auftraten, wurde das Tier in den Käfig zurückgesetzt und

nach einer Stunde erneut getestet. Bei einem zweiten epileptischen Anfall wurde das

Tier vom Versuch ausgeschlossen. Um den Einfluss des Experimentators auf das

Tier zu begrenzen, befanden sich die Experimentatoren während des Versuchs im

Vorbereitungsraum. Die Datenerhebung erfolgte über das Video-Tracking-System

EthoVision (Noldus, Wageningen, Niederlande). Die einzige Ausnahme hierzu war

der Hyperexzitabilitätstest, in welchem die Ratten direkt von den Experimentatoren

beurteilt wurden.

4.5.5.1 Der Hyperexzitabilitätstest (HET)

Der HET ermöglicht es, taktile sowie akustische Übererregbarkeit von epileptischen

Ratten zu beschreiben (RICE et al. 1998). Er besteht aus vier verschiedenen, einfach

durchzuführenden Tests. Vier verschiedene Experimentatoren, die über die

Behandlung der Ratten verblindet sind, führen nacheinander alle vier Tests durch.

Die Ratten werden in ihrem Heimatkäfig getestet. Das Verhalten der Tiere wird nach

einem Score-System bewertet. Dieser Test wurde ohne Kontrollratten durchgeführt.

Die Ergebnisse wurden mit Tieren aus anderen post SE-Epilepsiemodellen und

naiven Tieren aus anderen Versuchen unseres Labors verglichen.

Score-System:

Approach-response-Test

Ein Stift wird vertikal langsam zur Schnauze der Ratte hingeführt

Bewertung:

1: keine Reaktion

2: die Ratte schnüffelt am Stift

3: die Ratte bewegt sich vom Stift weg

4: die Ratte erstarrt

5: die Ratte springt vom Stift weg

6: die Ratte attackiert den Stift


37

Touch-response-Test

Die Ratte wird am Rumpf vorsichtig mit dem Stift angestupst.

Beurteilung:

1: keine Reaktion

2: die Ratte dreht sich der Berührungsstelle langsam zu

3: die Ratte läuft vorwärts, von der Berührung weg

4: die Ratte erstarrt

5: die Ratte dreht sich schnell/ruckartig zur Berührungsstelle hin

6: die Ratte dreht sich zur nicht berührten Körperseite

7: die Ratte springt mit oder ohne Vokalisation weg

Finger-snap-Test

Ein Klicker wird zügig von hinten über den Rücken der Ratte geführt (mit wenigen

Zentimetern Abstand) und geklickert.

Beurteilung:

1: keine Reaktion

2: normale Reaktion (die Ratte zuckt zusammen, wackelt mit den Ohren, springt

ein wenig, erstarrt)

3: die Ratte springt dramatisch

Pick-up-Test

Es wird versucht, die Ratte anzuheben, indem man sie um den Rumpf fasst.

Beurteilung:

1: sehr einfach

2: einfach, aber mit Vokalisation

3: etwas schwierig; die Ratte richtet sich auf und dreht sich zur Hand

4: die Ratte meidet die Hand und versucht zu entkommen

5: die Ratte springt aus dem Käfig

6: die Ratte attackiert die Hand

4.5.5.2 Der Elevated-Plus Maze-Test (EPM)

Im EPM werden explorations- und angstassoziiertes Verhalten untersucht. Das

verwendete EPM hatte eine Höhe von 86 cm und bestand aus vier plusförmig

angeordneten, schwarzen Armen (siehe Abbildung 8).


38

Zwei Arme waren offen (Länge 50 cm, Breite 14 cm), zwei geschlossen (Länge 50

cm, Breite 14 cm, Höhe 31 cm). Die offenen Arme hatten eine 0,5 cm hohe

Plexiglaskante, die das Abrutschen der Tiere verhindern sollte. An den Kreuzungen

der Arme befand sich das Zentrum (Länge 14 cm, Breite 14 cm). Der

Versuchsdurchlauf dauerte 5 Minuten pro Tier. Die Ratten wurden mit dem Kopf

immer in Richtung desselben geschlossenen Arms im Zentrum eingesetzt. Bewertet

wurden: Zahl der Eintritte in die einzelnen Kompartimente (offene Arme,

geschlossene Arme, Zentrum), Aufenthaltsdauer in den einzelnen Kompartimenten

und zurückgelegte Strecke. Diese Parameter wurden durch das Video Tracking-

System von EthoVision erfasst und quantifiziert. Aufrichten, Putzen und Headdips

(das Herauslehnen über den Rand der offenen Arme) wurden manuell gewertet,

indem eine Strichliste dieser Verhaltensweisen vom Experimentator erstellt wurde.

Diese Verhaltensweisen konnten nicht durch das Video Tracking-System erfasst

werden, es sind jedoch wichtige Verhaltensparameter. Bei epileptischen Ratten kam

es oft zu Absprüngen vom EPM, in solchen Fällen wurden die Tiere schnellstmöglich

auf das EPM zurückgesetzt. Bei zwei Absprüngen wurde das Tier vom Versuch

ausgeschlossen. Nach jedem Versuchsdurchlauf wurde das EPM mit 0,1%iger

Essigsäure gereinigt, um zu vermeiden, dass die Tiere durch Geruchsspuren der

davor getesteten Ratte abgelenkt wurden.

Abb. 8: Schematischer Aufbau des Elevated Plus Maze (modifiziert nach Verhaltens-SOP des Instituts).


39

4.5.5.3 Der Open Field-Test (OF)

Der OF-Test ist, ähnlich wie der EPM-Test, ein Test, in welchem explorations- und

angstassoziiertes Verhalten untersucht werden. Das verwendete OF hatte eine runde

Form, einen Randhöhe von 25 cm bei einem Innendurchmesser von 80 cm und war

beige. Es wurde in drei Zonen mit einem Radius von jeweils 13-13,5 cm unterteilt.

Die drei Zonen waren entsprechend von innen nach außen: Zentrum, innerer Ring

und äußerer Ring (siehe Abbildung 9). Der Versuchsdurchlauf dauerte 5 Minuten pro

Tier. Die Ratten wurden im Zentrum eingesetzt. Bewertet wurden: Zahl der Eintritte in

die einzelnen Kompartimente (innerer Ring, äußerer Ring, Zentrum),

Aufenthaltsdauer in den einzelnen Kompartimenten und zurückgelegte Strecke.

Diese Parameter wurden mittels EthoVision erfasst. Aufrichten und Putzen wurden

manuell gewertet. Diese Verhaltensweisen konnten nicht durch das Video Tracking-

System erfasst werden, es sind jedoch wichtige Verhaltensparameter. Nach jedem

Versuchsdurchlauf wurde das OF mit 0,1%iger Essigsäure gereinigt, um zu

vermeiden, dass die Tiere durch Geruchsspuren der davor getesteten Ratte

abgelenkt wurden.

4.5.5.4 Der Morris Water Maze-Test (MWM)

Im MWM werden räumliche Orientierung und Lernverhalten untersucht (MORRIS

1984). In diesem Test lernen die Versuchstiere, eine unter der Wasseroberfläche

versteckte Plattform anhand von visuellen Anhaltspunkten am Beckenrand zu finden.

Das verwendete MWM war ein schwarzes, rundes Wasserbecken mit einer Höhe

von 60 cm und einem Durchmesser von 150 cm. Die Plattform war ebenfalls

schwarz, hatte Abmessungen von 10 cm x 10 cm und befand sich 1,5 cm unter der

Wasseroberfläche.

Äusserer Ring

Innerer Ring

Zentrum

Abb. 9: Schematischer Aufbau des Open field.


40

Das MWM war in 4 Quadranten unterteilt, die mit den Himmelsrichtungen

übereinstimmten: Nord-Ost, Nord-West, Süd-Ost und Süd-West. Norden (N), Süden

(S), Osten (O) und Westen (W) waren als Einsatzpunkte der Versuchstiere markiert.

Am Beckenrand war ein Spielzeuggummihuhn als visueller Orientierungspunkt

angebracht (siehe Abbildung 10). Das Becken wurde bis auf eine Höhe von 27 cm

mit Wasser befüllt, die Wassertemperatur betrug 19 ± 1 °C. Die Wassertemperatur

wurde bewusst so niedrig gewählt, um die Ratten zum Auffinden der Plattform zu

motivieren. Durch die niedrige Wassertemperatur ist in diesem Test das Auffinden

der Plattform eine Belohnung. Durch das Auffinden der Plattform wird ein negativer,

als unangenehm empfundener Reiz (kaltes Wasser) weggenommen. Der Versuch

war in 5 Aquisitionstage gegliedert, denen ein Habituationstag voranging. Am

Habituationstag wurde jede Ratte für 60 s in das Becken (ohne Plattform) gesetzt,

um Tiere mit Schwimmdefiziten oder deutlicher Quadrantenpräferenz auszusortieren.

Während der Aquisitionstage hatte jede Ratte 4 Schwimmproben je 60 s. Zwischen

den Proben hatten die Tiere 60 s Ruhepause. Die Lage der Plattform und des

visuellen Anhaltspunktes (Huhn) war konstant, die Ratte wurde bei jeder

Schwimmprobe an unterschiedlichen Stellen (N, W, S, O) ins Wasser gesetzt. Wenn

die Ratte die Plattform gefunden hatte, musste sie 3 s darauf verbleiben. Im Falle

des Nichtauffindens wurde die Ratte nach 60 s vom Experimentator zur Plattform

hingeleitet. Die letzte Schwimmprobe des letzten Aquisitionstages (Probe trial) wurde

ohne Plattform durchgeführt und diente der Überprüfung des Kurzzeitgedächtnisses

und der Abfrage des Erlernten. Tiere, die gelernt hatten die Plattform zu finden,

schwammen in diesem Testdurchlauf wiederholt über der ehemaligen

Plattformposition. Bewertet wurden: Zeit zum Auffinden der Plattform und Zahl der

Kreuzungen über der Plattform (bei dem Probe trial).

Abb. 10: Schematische Darstellung des Morris Water Maze (modifiziert nach Verhaltens-SOP des Instituts).


41

4.5.6 Phenobarbital-Selektion

Dreiunddreißig Wochen nach SE-Induktion wurde bei 8 Ratten ein Phenobarbital-

Behandlungsversuch gestartet. Diese Untersuchung wurde vorgenommen, um das

Auftreten von Phenobarbital-Respondern und -Nonrespondern in diesem

Epilepsiemodell zu untersuchen. Responder sind Ratten, die auf eine Behandlung

mit einem Antiepileptikum mit einer Reduktion der Anfallsfrequenz um mindestens

50% reagieren. Nonresponder sind solche Tiere, bei denen es unter Behandlung zu

keiner 50%igen Reduktion der Anfallsfrequenz kommt. Für das basolaterale

Amygdala Stimulations-Modell (elektrisches post SE-Epilepsiemodell) konnte in

unserem Labor bereits das Auftreten von Phenobarbital-Respondern und

-Nonrespondern gezeigt werden (BRANDT et al. 2004).

Phenobarbital ist ein klinisch zugelassenes, früher häufig verwendetes

Antikonvulsivum. Es kann auch bei Ratten angewendet werden. Die

Plasmahalbwertszeit beträgt bei weiblichen Sprague Dawley-Ratten 16.9 ± 1,43

Stunden (BRANDT et al. 2004).

Das Dosierungsprotokoll wurde ebenfalls in unserem Labor etabliert (BRANDT et al.

2004). Die therapeutische Plasmakonzentration von Phenobarbital liegt zwischen 10-

40 µg/ml (BRANDT et al. 2004, LÖSCHER 2007). Um diese zu erreichen, wurde den

Ratten erst ein Bolus von 25 mg/kg i.p. verabreicht, 10 Stunden später erhielten sie

15 mg/kg i.p.. Danach wurde Phenobarbital in einer Dosis von 15 mg/kg zweimal

täglich im 10-14 h Interwall i.p. verabreicht. Das Phenobarbital wurde in destilliertem

Wasser gelöst, das Injektionsvolumen betrug 3 ml/kg. Der Versuchsablauf war

folgender:

4 Tage Kontrollphase: Das Auftreten von spontanen Anfällen wird bei den Tieren

untersucht

4 Tage Behandlungsphase: die Tiere werden, wie oben beschrieben, behandelt

4 Tage Auswaschphase: die Tiere werden nicht behandelt, das Auftreten von

spontanen Anfällen wird untersucht


42

Während des gesamten Versuchs wurden die Tiere kontinuierlich (24 h/d)

videoüberwacht, um das Auftreten von spontanen Anfällen zu detektieren. Eine

gleichzeitige EEG-Überwachung war nicht möglich, da die Tiere keine EEG-Aufsätze

mehr hatten. Die Videos wurden visuell ausgewertet.

Um die Konzentration von Phenobarbital im Plasma zu bestimmen, wurde 14 h nach

der letzten Injektion eine retrobulbäre Blutentnahme vorgenommen (unter 2%iger

Tetracain-Lokalanästhesie). Die Blutprobe (~0,5 ml/Ratte) wurde in einem

Eppendorfgefäß (mit 10 µl Ethylendiamintetraacetat-Lösung 5 mmol/ml Vollblut zur

Gerinnungshemmung) aufgefangen. Die Proben wurden anschließend zur

Plasmagewinnung 2,5 min bei 12000 Umdrehungen/Minute zentrifugiert.

Die Plasmaproben wurden mittels Hochleistungsflüßigkeitschromatographie (high

performance liquid chromatography, HPLC), analog POTSCHKA und LÖSCHER

(2001), analysiert. Dieses Verfahren ermöglicht die Quantifizierung der analisierten

Substanzen anhand eines bekannten Standards.

Um die phenobarbital-assozierten Nebenwirkungen zu erfassen, wurde während der

Kontrollphase und während der Behandlungsphase (60 min nach Behandlung) ein

verblindetes Ataxie-Scoring vorgenommen. Dafür wurden die Ratten nacheinander

von einem Experimentator im Open field zwei Minuten lang beobachtet. Die

Beurteilung war wie folgt:

Hypolokomotion/Sedation

Score Verhalten

1 Tendenz zu verminderter Lokomotion

2 Reduzierte Lokomotion mit häufigen Ruhepausen

3 Keine Vorwärtsbewegung

Hyperlokomotion

Score Verhalten

1 Tendenz zu erhöhter Lokomotion

2 Deutlich erhöhte Lokomotion

3 Stark erhöhte Lokomotion


43

Ataxie

Score Verhalten

1 Leichte Ataxie

2 Deutliche Ataxie

3 Dauerhafter Verlust der Stellreflexe, mit Versuch der Vorwärtsbewegung

Tabelle 4: Verwendeter Hypolokomotion-, Hyperlokomotion- und Ataxie-Score. Ein Score=0 bedeutete keine Veränderung des Verhaltens.

4.5.7 Tötung der Tiere und Histologie

Vierzig Wochen nach SE-Induktion wurden die Tiere getötet und ihre Gehirne

entnommen und histologisch untersucht.

4.5.7.1 Transkardiale Perfusion

Die Ratten aus der ersten Gruppe wurden durch transkardiale Perfusion getötet.

Zuerst wurden sie mit Chloralhydrat tief narkotisiert (bis zum Aussetzen der Atmung,

nach Wirkung dosiert). Anschließend wurden die Bauchdecke mithilfe einer Schere

eröffnet. Die Brusthöhle wurde ebenfalls eröffnet und das Zwerchfell durchtrennt.

Das Herz wurde freigelegt und eine Kanüle, die über einen Schlauch mit der

Perfusionspumpe verbunden war, wurde durch die Herzspitze in die Aorta

geschoben. Der rechte Vorhof wurde aufgeschnitten, um den Blutabfluss zu

ermöglichen. Zuerst wurde das Blut mit phosphatgepufferter Saline aus dem Gewebe

gespült (80-100 ml/Ratte), danach wurde das Gewebe fixiert. Als Fixans diente

4%iges Paraformaldehyd (250 ml/Ratte). Nach Fixierung wurden die Gehirne

entnommen, in 10%ige Saccharoselösung überführt und für 24 Stunden bei 7°C

gelagert. Nach Ablauf von 24 Stunden wurden die Gehirne in 30%ige

Saccharoselösung überführt und verblieben bis zur weiteren Aufarbeitung bei 7°C.

Die Lagerung in Saccharoselösung diente als Gefrierschutz vor dem Schneiden an

einem Gefriermikrotom.


44

4.5.7.1.1 Histologie nach transkardialer Perfusion

Die entnommenen Gehirne wurden am Gefriermikrotom, im Bereich von 2 mm bis 7

mm posterior zu Bregma, in 40 µm dicke Schnitte geschnitten. Von jedem Gehirn

wurden 4 Schnittserien angefertigt, 3 davon wurden im flüssigen Gefriermedium bei

-20°C eingefroren. Eine Serie wurde zur Elektroden- und Führungsrohrlokalisation

mit Thionin-Färbung angefärbt.

4.5.7.2 Dekapitation

Die Tiere der zweiten Gruppe wurden dekapitiert. Dafür wurden die Ratten mittels

CO2 (5%) tief narkotisiert und mit einer Nagerguillotine dekapitiert. Anschließend

wurden die Gehirne entnommen und in Behälter aus Aluminiumfolie überführt. Die

Gehirne wurden mit Gefrierschutzmedium bedeckt. Die Aluminiumbehälter wurden

für einige Minuten in einen Behälter mit 2-Methyl-Butan gestellt, das 2-Methyl-Butan

wiederum wurde durch flüssigen Stickstoff auf -80°C gekühlt. Die so eingefrorenen

Gehirne wurden bis zur weiteren Aufarbeitung bei -20°C gelagert.

4.5.7.2.1 Histologie nach Dekapitation

Die Gehirne der dekapitierten Ratten wurden am Kryostaten in 14 µm dicke Schnitte

geschnitten. Die Schnittebenen waren 2 mm, 3 mm, 4 mm, 5 mm und 6 mm posterior

zu Bregma. Pro Schnittebene wurden ca. 10 Schnitte angefertigt. Eine Serie wurde

zur Beurteilung der Neurodegeneration mittels Thionin-Färbung angefärbt. Die

Neurodegeneration wurde in den Ebenen 3 mm und 4 mm posterior zu Bregma

ausgewertet. Die späteren Sektionen waren ungeeignet zur

Neurodegenerationsauswertung, da die Einstichkanäle von Elektrode und

Führungsrohr zu Artefakten führten. Das Ausmaß der Neurodegeneration wurde mit

einem Score-System bewertet. Das Score-System ist nachfolgend beschrieben.

0: keine Neurodegeneration

1: Veränderungen der Struktur, ohne sichtbaren Neuronenverlust

2: 20% bis 50% Neuronenverlust

3: über 50% Neuronenverlust


45

Im Hilus wurde Neurodegeneration nur als vorhanden oder nichtvorhanden

beschrieben, da es aufgrund der Schnittdicke schwierig war, das Score-System in

dieser Region anzuwenden. Die Score-Daten wurden für beide Schnittebenen als

Mittelwert zusammengefasst.

4.6 Studie 2: PTZ-Schwellenversuche im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell

4.6.1 Studiendesign

Die Versuche dieser Studie wurden an zwei Rattenmodellen für

Temporallappenepilepsie durchgeführt, dem systemischen Pilokarpin-Modell und

dem fokalen Kainsäure-Modell. Die Studie wurde für das jeweilige Modell separat

ausgewertet. Im Pilokarpin-Modell wurde der Versuch in drei Tiergruppen

durchgeführt, diese wurden in der Auswertung zusammengefasst. In der Pilokarpin-

Studie wurde zusätzlich zu den eigentlichen Schwellenversuchen noch die Latenzzeit

zwischen SE und dem Auftreten von ersten spontanen Anfällen bestimmt. Dafür

wurden die Tiere direkt nach SE mittels EEG und Video bis zum Auftreten des ersten

Anfalls überwacht. Für diese Studie wurden 7 Tiere ohne PTZ-Schwellenbestimmung

als Kontrollen und die SE-Tiere aus der zweiten und dritten PTZ-Gruppe verwendet.

Da der SE bei den Pilokarpin-Tieren mittels Diazepam unterbrochen wurde, wurde in

einem separaten Vorversuch der Einfluss von Diazepam auf die PTZ-Schwelle

untersucht. Der zeitliche Ablauf der Studie ist in Abbildung 11 gezeigt. Eine Übersicht

über die einzelnen Tiergruppen der Studie 2 ist in Tabelle 5 aufgeführt.

Es ergaben sich folgende Behandlungsgruppen:

SE-Tiere - Tiere mit modellabhängig induziertem SE (Kainsäure oder Pilokarpin)

Kontrollen - Tiere mit sham SE

Tiere ohne SE – Tiere bei denen es trotz SE-Induktion nich zum SE-Eintritt kam


46

Studie Tierzahl Ableitelektroden PTZ-Schwelle

PTZ-Schwelle im

Pilokarpin-Modell

1. Gruppe

SE-Tiere n=11

Kontrollen n=10

Tiere ohne SE n=6

nein 2, 4, 6, 9, 14, 22 Tage

post SE

PTZ-Schwelle im

Pilokarpin-Modell

2. Gruppe

SE-Tiere n=2

Kontrollen n=3

Tiere ohne SE n=2

ja 2, 6, 13-14 Tage post

SE

PTZ-Schwelle im

Pilokarpin-Modell

3. Gruppe

SE-Tiere n=2

Kontrollen n=6

Tiere ohne SE n=2

ja 2, 6, 14 Tage post SE

Latenzzeitbestimmung

nach Pilokarpin-

induziertem SE

SE-Tiere n=7#

SE+PTZ-Tiere n=4* ja

2, 6, 14 Tage post SE

(nur Tiere der

SE+PTZ-Gruppe)

Diazepam-Vorversuch Tiere n=8 nein

2 Tage nach

Diazepam-Gabe

PTZ-Schwelle im

fokalen Kainsäure-

Modell

SE-Tiere n=20

Kontrollen n=15

Tiere ohne SE n=1

ja 2, 4, 6, 9, 14, 22 Tage

post SE

Tabelle 5: Übersicht über die Tiergruppen in Studie 2. *SE-Tiere aus dem 2. und 3. PTZ-Schwellenversuch #

nur sechs Tiere im Versuch verwendet (1 Ratte ohne EEG-Ableitung)

4.6.2 Implantation von Führungsrohren und Ableitelektroden

Wie in Tabelle 5 dargestellt, erfolgte bei allen Tieren mit Ausnahme der ersten

Pilokarpin-Gruppe eine Implantation von Ableitelektroden (Pilokarpin-Gruppe) oder

von Ableitelektroden und Führungsrohren (Kainsäure-Gruppe). Die stereotaktische

Operation verlief wie im Kapitel 4.2 beschrieben.

Tage nach

SE

Ankunft

der Tiere

SE-Induktion-5 +2

PTZ-Schwellenbestimmung

+4 +6 +9 +14 +22

Abb. 11: Schematische Darstellung des zeitlichen Ablaufs der Studie 2.


47

Als Änderung sind zwei zusätzliche Halteschrauben, die bei Tieren der Kainsäure-

Gruppe am Schädel angebracht wurden, zu vermerken. Die Halteschrauben sollten

helfen, entzündungsbedingte Verluste der EEG-Aufsätze zu vermeiden, da diese

trotz Antibioseumstellung häufig auftraten. Des Weiteren wurden in der dritten

Pilokarpin-Gruppe zusätzlich zu einer EEG-Ableitelektrode im Gyrus Dentatus

Kortexschrauben zur Elektrocorticogramm-Ableitung (ECoG-Ableitung) implantiert

(Koordinaten AP, -2,2 mm und L, +/- 4,8 mm relativ zu Bregma). So konnte während

der Versuche entweder hippokampales EEG oder kortikales ECoG abgeleitet

werden. Eine gleichzeitige Ableitung war technisch nicht möglich. Da jedoch in den

ersten Versuchen mit EEG ein PTZ-induzierter Myoklonus nicht sichtbar war, sollte

die kortikale Ableitung in dieser Hinsicht untersucht werden. Auch in dieser Studie

erhielten die Tiere Marbofloxacin zur postoperativen Antibiose und hatten zwei bis

drei Wochen Zeit, um sich von dem operativen Eingriff zu erholen. Während dieser

Phase wurden die Tiere mindestens zweimal wöchentlich an den Umgang mit

Menschen und spätere Eingriffe gewöhnt.

4.6.3 SE-Induktion

Zwei bis drei Wochen nach stereotaktischer Operation wurde bei den Tieren ein SE

induziert. Modellabhängig erfolgte das entweder durch systemische Pilokarpin-Gabe

oder durch fokale Kainsäure-Gabe.

4.6.3.1 SE-Induktion im Pilokarpin-Modell

Die SE-Induktion im Pilokarpin-Modell erfolgte wie im Kapitel 4.3.1 beschrieben. Die

SE-Dauer betrug 90 Minuten. Der SE wurde pharmakologisch mittels Diazepam

(Faustan, 10 mg/kg in 2ml/kg i.p.) unterbrochen. Im Falle von weiteren Krämpfen

konnte die Diazepam-Injektion bis zu zweimal im zehnminütigen Abstand wiederholt

werden. Die Kontrollen erhielten die gleiche Behandlung, lediglich das Pilokarpin

wurde durch isotone Natriumchloridlösung ersetzt (sham SE).

Der Versuch wurde an 41 Ratten durchgeführt. Nur eine Ratte starb während der SE-

Induktion. Tiere, die trotz fünfmaliger Pilokarpin-Gabe keinen SE hatten, wurden vom

Versuch ausgeschlossen. Bei den Ratten, bei denen eine Ableitelektrode implantiert

wurde, wurde der Versuch unter EEG-Kontrolle durchgeführt


48

4.6.3.2 SE-Induktion im fokalen Kainsäure-Modell

Die SE-Induktion durch fokale Kainsäure-Gabe erfolgte wie im Kapitel 4.3.2

beschrieben. Die Kontrollen erhielten isotone Natriumchloridlösung anstelle von

Kainsäure (sham SE). Um einen Einfluss des ovariellen Zyklustandes auf die SE-

Induktion ausschließen zu können, wurde bei allen Tieren direkt vor Mikroinjektion

ein Vaginalabstrich zur Zyklusbestimmung durchgeführt (siehe Kapitel 4.6.7).

4.6.4 PTZ-Schwellenbestimmung

Die Bestimmung der individuellen Krampfschwelle erfolgte im intravenösen PTZ-

Schwellentest, beschrieben bei LÖSCHER (2009 und 2011). Den Ratten wurde eine

Kanüle in die laterale Schwanzvene eingeführt und mittels Klebeband fixiert. Die

Kanüle war über einen Polyethylenschlauch mit einer Infusionspumpe verbunden.

Während des ganzen Versuchs waren die Ratten frei beweglich. Die PTZ-Infusion

(PTZ-Konzentration 0,8%, gelöst in isotoner Natriumchloridlösung) erfolgte mit einer

konstanten Flussrate von 1 ml/min Die Infusion wurde beim Auftreten des ersten

Myoklonus gestoppt. Die individuelle PTZ-Krampfschwelle wurde anhand der PTZ-

Dosis, die zum Auslösen des ersten Myoklonus nötig war, des Körpergewichts der

Ratte und der PTZ-Konzentration und -Flussrate berechnet und in mg/kg

ausgedrückt. Die Schwellenbestimmung erfolgte bei allen Tieren 5 Tage vor SE-

Induktion (Kontrollschwelle), sowie 2, 4, 6, 9, 14 und 22 Tage danach. Aufgrund der

Ergebnisse aus dem ersten Versuch, wurden in der zweiten und dritten Pilokarpin-

Gruppe keine Schwellenbestimmmungen nach 4, 9 und 22 Tagen durchgeführt. Drei

Tiere starben infolge des PTZ-Schwellentests. Die Daten aller Gruppen waren sehr

konsistent und wurden kombiniert. In der Kainsäure-Gruppe wurden alle 7

Schwellenbestimmungen durchgeführt, um beide Modelle zu vergleichen. Alle

Versuche wurden zur gleichen Tageszeit (8:00-14:00 Uhr) durchgeführt. Die Tiere

wurden eine Stunde vor Versuchsbeginn in den Versuchraum gebracht und

beobachtet, um das eventuelle Auftreten von spontanen Anfällen zu detektieren. Im

Falle von spontanen Anfällen wurde die Schwellenbestimmung erst eine Stunde

nach dem Anfall durchgeführt. Bei allen Tieren, die EEG-Ableitelektroden hatten,

wurde der Versuch unter EEG-Kontrolle durchgeführt.


49

Bei den Tieren aus der dritten Pilokarpin-Gruppe, die sowohl hippokampale, als auch

kortikale Ableitelektroden hatten, wurde der Versuch mit kortikaler ECoG-Ableitung

durchgeführt. Obwohl die Infusion nach dem ersten Myoklonus gestoppt wurde,

konnten weitere Endpunkte beobachtet werden. Weitere Endpunkte der Infusion

waren: Klonus, Klonus mit Verlust der Stellreflexe und Vorderbeintonus. Das

Auftreten von weiteren Endpunkten wurde mit einem Score-System bewertet und

notiert. Da epileptische Ratten nach Ende der Infusion noch Verhaltensänderungen

zeigten, wurden diese ebenfalls mit einem Score-System bewertet. Die beiden

Score-Systeme sind in nachfolgender Tabelle dargestellt.

Score I „Weitere Endpunkte nach PTZ-Infusion“

0 Keine weiteren Endpunkte

1 Klonus

2 Klonus mit Verlust der Stellreflexe

3 Klonus mit Verlust der Stellreflexe, Running and bouncing

4 Klonus mit Verlust der Stellreflexe, Running and bouncing, Vorderbeintonus

Score II „Verhalten nach PTZ-Schwellenbestimmung“

0 Keine Veränderungen

1 Myoklonien, verminderte Ansprechbarkeit, Stereotypien mit einer Dauer < 2 min

2 Myoklonien, verminderte Ansprechbarkeit, Stereotypien mit einer Dauer > 2 min

3 Generalisierte Anfälle (Typ IV oder V)

4 Myoklonien und generalisierte Anfälle

Tabelle 6: Score-Systeme zur Beurteilung der Verhaltensänderungen nach PTZ-Schwellentest.

4.6.5 Bestimmung der Latenzzeit im Pilokarpin-Modell

Um die Latenzzeit (Zeit zwischen SE und dem ersten spontanen Anfall) im

fraktionierten Pilokarpin-Modell zu ermitteln, wurden 6 SE-Tiere ohne PTZ-

Schwellenbestimmung und 4 SE+PTZ-Tiere (aus dem 2. und 3. PTZ-

Schwellenversuch) verwendet. Die Tiere ohne PTZ-Schwellenbestimmung waren

notwendig, um den Einfluss von PTZ auf die Latenzzeit auszuschliessen. Das

Studiendesign war wie folgt: Die Tiere wurden ab der SE-Induktion kontinuierlich bis

zu 4 Wochen EEG- und Video-überwacht, um das Auftreten von spontanen Anfällen

zu registrieren. Die SE-Induktion verlief wie im Kapitel 4.3.1 beschrieben.


50

Die Überwachung erfolgte wie in Kapitel 4.4 beschrieben. Die Auswertung der Daten

erfolgte visuell. Die Latenzzeit wurde in Tagen bis zum Auftreten des ersten

spontanen Anfalls ausgedrückt.

4.6.6 Diazepam-Vorversuch im Pilokarpin-Modell

Dieser Vorversuch wurde durchgeführt, um zu untersuchen, ob der SE-Abbruch

mittels Diazepam einen Einfluss auf die PTZ-Schwelle 48 h nach SE hat. Zu diesem

Zweck wurde bei 8 Ratten eine PTZ-Kontrollschwelle bestimmt. Drei Tage später

erhielten die Ratten Diazepam in der bei einem SE-Abbruch üblichen Dosierung (3 x

10 mg/kg im Abstand von 10 Minuten). Die PTZ-Schwelle wurde erneut nach 48 h

bestimmt und mittels Student`s t-Test mit der Kontrollschwelle verglichen.

4.6.7 Bestimmung des ovariellen Zyklusstandes

Um den Einfluss des Zyklusstandes auf die individuelle PTZ-Krampfschwelle

beschreiben zu können, wurden in der Kainsäure-Gruppe Vaginalabstriche zur

Zyklusbestimmmung entnommen. Zu diesem Zweck wurde bei jedem Tier

unmittelbar vor der Schwellenbestimmung ein Vaginalabstrich aus dem dorsalen

Scheidendach mittels Impföse entnommen. Dieser wurde auf einem Objektträger in

isotoner Natriumchloridlösung ausgestrichen und getrocknet. Die Abstriche wurden

mit der Lösung nach SHORR (1940) gefärbt. Die Auswertung erfolgte am

Lichtmikroskop. Anhand des Zellbildes im Vaginalausstrich konnten folgende

Zyklusstadien und -zwischenstadien unterschieden werden: Proöstrus, Proöstrus-

Östrus, Östrus, Östrus-Metöstrus, Metöstrus, Metöstrus-Diöstrus, Diöstrus, Diöstrus-

Proöstrus.

4.7 Studie 3: Infusionsversuche mit PTZ im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell

Ziel der Studie 3 war die Behandlung von Ratten nach SE mit subkonvulsiven PTZ-

Dosen. Die Tiere sollten nach Insult (SE) präventiv behandelt werden. Da PTZ ein

prokonvulsiver Stoff ist, musste zuerst ein geeignetes Behandlungsprotokoll erstellt

werden, um die PTZ-Dosis im subkonvulsiven Bereich zu halten.


51

4.7.1 Pharmakokinetische Vorversuche

Die Vorversuche setzten sich aus der Halbwertszeitbestimmung von PTZ und der

Ermittlung von konvulsiven PTZ-Plasmakonzentrationen zusammen. Anhand der

Daten aus diesen Versuchen konnte ein Behandlungsprotokoll erstellt werden.

Obwohl PTZ laut Literaturangaben nicht im Gewebe kumuliert, bestand doch die

Gefahr, dass es bei einer chronischen Behandlung über 48 h zu einer Kumulation

von PTZ kommt, was wiederum in Krämpfen bei den behandelten Tieren resultieren

würde.

4.7.1.1 PTZ-Halbwertszeitbestimmung

Die PTZ-Halbwertszeit beträgt laut Literaturangaben 2-3 Stunden (ESPLIN und

WOODBURY 1956 VOHLAND und ZUFELDE 1976 RAMZAN und LEVY 1985). Da

es keine Angaben zur Halbwertszeit bei weiblichen Sprague Dawley-Ratten gibt,

haben wir diese bestimmt. Die PTZ-Halbwertszeitbestimmung wurde an einer

Gruppe von 4 Ratten durchgeführt. Es wurden 2 naive Tiere und 2 Tiere 24 h nach

pilokarpin-induziertem SE verwendet. Die Tiere erhielten eine einmalige PTZ-

Injektion (12 mg/kg gelöst in isotoner Natriumchloridlösung) über die laterale

Schwanzvene. Zur PTZ-Plasmakonzentrationsbestimmung wurde den Tieren 15 min,

1 h, 2 h und 4 h nach Applikation retrobulbär Blut entnommen (siehe Kapitel 4.5.6).

Die PTZ-Konzentration wurde mittels HPLC bestimmt. Die Halbwertszeiten wurden

mit dem PK Solutions 2.0 Programm (Summit Research Services, Montrose, CO,

USA) berechnet.

4.7.1.2 Etablierung des Infusionsprotokolls

Nach Bestimmung der Halbwertszeit sollte die konvulsive PTZ-Plasmakonzentration

bestimmt werden. Zu diesem Zweck wurde bei 2 naiven Ratten und bei 2 Ratten 24 h

nach pilokarpin-induziertem SE direkt nach der PTZ-Schwellenbestimmung (siehe

Kapitel 4.6.4) retrobulbär Blut entnommen. Die PTZ-Plasmakonzentration wurde

mittels HPLC gemessen.

Basierend auf den Ergebnissen dieser Vorversuche haben wir eine subkonvulsive

Zielkonzentration von 10 µl/ml festgelegt und ein Behandlungsprotokoll erstellt.


52

Das erste Behandlungsprotokoll erstellt zur Erhaltung der 10 µg/ml

Plasmakonzentration, sah einen Bolus von 10 mg/kg und eine Infusion von 15

µg/kg/min zur Aufrechterhaltung vor. Es wurde mithilfe des PK Solution Programms

erstellt. Das Behandlungsprotokoll wurde an naiven Tieren getestet. Die verabreichte

PTZ-Dosis blieb im subkonvulsiven Bereich, sie reichte jedoch nicht aus, um den

Zielplasmaspiegel von 10 µg/ml zu erreichen. Anhand der Plasmawerte der

behandelten Tiere wurde ein zweites Behandlungsprotokoll erstellt. Das zweite

Behandlungsprotokoll zur Erhaltung der 10 µg/ml Plasmakonzentration sah einen

Bolus von 10 mg/kg und eine Infusion von 60 µg/kg/min zur Aufrechterhaltung vor.

Es wurde ebenfalls mithilfe des PK Solution Programms erstellt. Auch dieses

Behandlungsprotokoll wurde zuerst an naiven Tieren getestet.

4.7.2 Studiendesign PTZ-Behandlung

Die Infusionsversuche dieser Studie wurden, wie bereits in Studie 2 beschrieben, in

zwei Modellen durchgeführt, in dem systemischen Pilokarpin-Modell und in dem

fokalen Kainsäure-Modell. Es gab folgende Behandlungsgruppen:

Saline + Saline: sham SE-Induktion mit isotoner Natriumchloridlösung + Behandlung

mit isotoner Natriumchloridlösung

SE + Saline: SE-Induktion mit Pilokarpin oder Kainsäure + Behandlung mit isotoner

Natriumchloridlösung

SE + PTZ: SE-Induktion mit Pilokarpin oder Kainsäure + Behandlung mit PTZ

Die teilweise sehr kleinen Gruppengrößen haben mehrere Ursachen. In einem

Infusionsversuch konnten maximal 8 Ratten gleichzeitig behandelt werden. Diese 8

Tiere wurden auf zwei oder drei Behandlungsgruppen aufgeteilt. Die

Infusionsversuche sollten erste Hinweise über den Einfluss einer PTZ-Behandlung

auf die Epileptogenese liefern. Bei vielversprechenden Ergebnisssen wären die

Gruppen aufgefüllt worden.


53

Da diese Versuche jedoch eine große Belastung für die Versuchstiere darstellten,

war eine Auffüllung der Gruppen bei den gegenwärtigen Ergebnissen aus

Tierschutzgründen abzulehnen.

Die nachfolgende Tabelle zeigt die Behandlungsgruppen in den einzelnen

Versuchen.

Studie

Behandlungsgruppen Dauer der

PTZ-

Behandlung

Start der

PTZ-

Behandlung Saline+Saline SE+Saline SE+PTZ

1. Gruppe:

PTZ-Infusion im

Pilokarpin-

Modell

- - n=6 48 h Direkt nach SE-

Abbruch

2. Gruppe:

PTZ-Infusion

im Pilokarpin-

Modell

- n=4 n=4 48 h Direkt nach SE-

Abbruch

1. Gruppe:

PTZ-Infusion

im fokalen

Kainsäure-

Modell

n=2 n=2 n=5 48 h 13-16 h nach

SE-Induktion

2. Gruppe:

PTZ-Infusion

im fokalen

Kainsäure-

Modell

n=2 n=2 n=4 48 h 7 d nach SE-

Induktion

Tabelle 7: Übersicht über die Behandlungsgruppen in Studie 3.

4.7.3 Implantation von Ableitelektroden und Führungsrohren

Bei allen Tieren dieser Studie wurden EEG-Ableitelektroden implantiert. Die Tiere

aus dem fokalen Kainsäure-Modell hatten zusätzlich Führungsrohre zur Kainsäure-

Mikroinjektion. Der genaue Ablauf der stereotaktischen Operation ist in Kapitel 4.2

beschrieben. Die Tiere dieser Studie hatten zusätzliche Halteschrauben, die seitlich

am Schädel befestigt waren, um Verluste der EEG-Aufsätze zu vermeiden.


54

Ein Teil der Tiere wurde wie in Kapitel 4.2 beschrieben mit Chloralhydrat narkotisiert,

ein Teil mit dem Inhalationsnarkotikum Isofluran. Die Isofluran-Narkose wurde neu in

unserem Labor etabliert. Die Vorteile einer Inhalationsnarkose sind die bessere

Steuerbarkeit einer solchen und daraus resultierend eine tiefere Narkose bei

gleichzeitig weniger Narkosezwischenfällen. Da wir jedoch nur über einen Isofluran-

Verdampfer verfügen, wurde ein Teil der Tiere weiterhin mit Chloralhydrat

narkotisiert. Isofluran wurde in einer Konzentration von 3% zur Narkoseeinleitung

und 1,5% zur Narkoseaufrechterhaltung verabreicht. Auch in dieser Studie erhielten

die Tiere Marbofloxacin zur postoperativen Antibiose und hatten zwei bis drei

Wochen Zeit, um sich von dem operativen Eingriff zu erholen. Während dieser Phase

wurden sie mindestens zweimal wöchentlich an den Umgang mit Menschen und die

späteren Eingriffe gewöhnt.

4.7.4 Implantation von Kathetern in die Vena jugularis externa

Da die PTZ-Behandlung intravenös erfolgte, wurden den Ratten Dauerkatheter in die

Vena jugularis implantiert. In den verschiedenen Behandlungsgruppen erfolgte die

Implantation zu unterschiedlichen Zeitpunkten. Eine Übersicht dazu ist in

nachfolgender Tabelle dargestellt.

Studie Zeitpunkt Katheter-Operation

1. Gruppe PTZ-Infusion im Pilokarpin-Modell 2 Tage vor SE-Induktion

2. Gruppe PTZ-Infusion im Pilokarpin-Modell 2 Tage vor SE-Induktion

1. Gruppe PTZ-Infusion im fokalen Kainsäure-

Modell 2 Tage vor SE-Induktion

2. Gruppe PTZ-Infusion im fokalen Kainsäure-

Modell 5 Tage nach SE-Induktion

Tabelle 8: Übersicht über die Zeitpunkte der Katheter-Implantation in den einzelnen Tiergruppen der Studie 3.

Für die Operation wurden 50 cm lange Katheter aus Polyethylenschlauch verwendet.

Der Katheter sollte auf 3 cm in die Vene implantiert werden, so dass er im rechten

Vorhof lag. Diese Länge (3 cm) war auf dem Katheter markiert. Die Ratten wurden

mit Chloralhydrat oder Isofluran narkotisiert, je nach Verfügbarkeit des Isofluran-

Verdampfers, da die Isofluran-Narkose bevorzugt wurde.


55

Die Operationsfläche wurde anschließend rasiert und mit 70%igem Ethanol gereinigt.

Der Katheter wurde in die rechte V. jugularis externa implantiert und mit Garn

befestigt. Der implantierte Katheter wurde unter der Haut in den Nacken geführt, wo

er zwischen den Schulterblättern wieder austrat. Die Wunde wurde durch Knopfhefte

mit resorbierbarem Nahtmaterial verschlossen. Der Katheter wurde durch eine

Spiralfeder gefädelt, um die Ratten am Durchbeißen des Katheters zu hindern. Die

Feder war mit einem Geschirr verbunden. In diesem Geschirr verblieben die Ratten

für die Dauer der Infusion.

Die Tiere erhielten sieben Tage lang Antibiose, beginnend zwei Tage vor dem Engriff

(Marbofloxacin 3 mg/kg, 0,1 ml/Tier zweimal täglich erst s.c. nach

Katheterimplantation i.v.). Nach der Operation wurden die Ratten einzeln in

durchsichtigen Plexiglaskäfigen gehalten. Die Katheter waren über einen

beweglichen Swivel und eine spezielle Aufhängung am Käfig befestigt, was den

Ratten eine gewisse Bewegungsfreiheit gewährleistete. Die Tiere waren an eine

Infusionspumpe angeschlossen, die es ermöglichte, 8 Ratten gleichzeitig zu

infundieren. Während der Erholungsphase (2-3 Tage) vor der eigentlichen

Substanzbehandlung erhielten die Ratten heparinisierte isotone

Natriumchloridlösung (25 IE Heparin/ml) mit einer Infusionsgeschwindigkeit von 50

µl/h. Nach Ende der Dauerinfusion wurden die Katheter kurz abgeschnitten und mit

einem Stück Draht verschlossen, so dass die Tiere zurück in ihre Heimatkäfige

konnten.

4.7.5 SE-Induktion

Zwei Tage nach beziehungsweise fünf Tage vor Katheterimplantation (siehe Tabelle

8) wurde bei den Tieren ein SE induziert. Modellabhängig erfolgte das entweder

durch systemische Pilokarpin-Gabe, oder durch fokale Kainsäure-Gabe.

4.7.5.1 SE-Induktion im Pilokarpin-Modell

Die SE-Induktion erfolgte ähnlich wie im Kapitel 4.3.1 beschrieben. Die Ratten

wurden mit Lithiumchlorid und Methylscopolamin vorbehandelt. Um die Zahl der

Tiere, die nach Pilokarpin-Gabe einen SE entwickeln zu steigern, wurde das

fraktionierte Pilokarpin-Protokoll modifiziert.


56

Nach dem modifizierten Protokoll erhielten die Ratten 30 mg/kg Pilokarpin i.p. als

Initialdosis und in 30 min Abständen 10 mg/kg Pilokarpin, bis zum Auftreten eines

SE. Die Zahl der Nachinjektionen war auf drei pro Tier beschränkt. Die SE-Länge

variierte je nach Behandlungsgruppe. Bei den Tieren der 1. Gruppe wurde der SE

nach 60 min abgebrochen, bei den Tieren der 2. Gruppe nach 90 min. Der SE-

Abbruch wurde ebenfalls modifiziert, um das Auftreten von Anfällen in der Nacht

nach dem SE zu verhindern. Der modifizierte SE-Abbruch ist in nachfolgender

Tabelle dargestellt.

Substanz Dosis Injektions-

volumen

90 oder 60

min nach

SE-Beginn

4 h nach

SE-Beginn

8 h nach

SE-Beginn

Scopolamin 1 mg/kg 1 ml/kg i.v. i.p. i.p.

Diazepam 10 mg/kg 2 ml/kg i.v. i.p. i.p.

Phenobarbital 25 mg/kg 1 ml/kg i.v. i.p. i.p.

Tabelle 9: Übersicht über die zum SE-Abbruch verwendeten Substanzen.

Nach dem SE-Abbruch wurden die Ratten mit wassergefüllten

Untersuchungshandschuhen gewärmt. Die Tiere wurden je nach Gewichtszunahme

und Allgemeinbefinden 1-2 Tage nach SE mit Babynahrung zwangsernährt.

4.7.5.2 SE-Induktion im fokalen Kainsäure-Modell

Die SE-Induktion durch fokale Kainsäure-Gabe erfolgte wie im Kapitel 4.3.2

beschrieben. Die Saline+Saline-Gruppe erhielt isotone Natriumchloridlösung anstelle

von Kainsäure. Aus Gründen der Praktikabilität wurde nur bei Tieren der 2. Gruppe

direkt vor Mikroinjekton ein Vaginalabstrich zur Zyklusbestimmung entnommen

(siehe Kapitel 4.6.7). Die Tiere der 2. Gruppe wurden bis 4 Tage nach SE EEG- und

videoüberwacht.

4.7.6 PTZ-Infusion

Die PTZ-Behandlung begann zu verschiedenen Zeitpunkten nach SE (siehe Tabelle

7). In den beiden Pilokarpin-Gruppen begann die Behandlung direkt (20-30 min)


57

nach SE-Abbruch. In der 1. Kainsäure-Gruppe begann die Behandlung 13-16 h nach

SE-Induktion, in der 2. Gruppe 7 Tage nach SE-Induktion. Eigentlich sollte die PTZ-

Behandlung in der 1. Kainsäure-Gruppe 12 h nach SE-Induktion beginnen, weil zu

diesem Zeitpunkt der kainsäure-induzierte SE bei den meisten Tieren spontan

aufhört. Der PTZ-Bolus wurde jedoch versehentlich zu spät appliziert, so dass die

Behandlung, von Tier zu Tier unterschiedlich, entweder 13 h oder 16 h nach SE-

Induktion erfolgte. Das PTZ wurde über 48 Stunden infundiert, die SE+Saline-Gruppe

erhielt isotone Natriumchloridlösung statt PTZ. Um die Zielkonzentration von 10

µg/ml Plasma zu erreichen, wurde den Ratten ein Bolus von 10 mg/kg PTZ (gelöst in

2 ml isotoner Natriumchloridlösung) i.v. verabreicht. Zur Aufrechterhaltung dieser

Plasmakonzentration bekamen die Tiere PTZ in einer Dosierung von 60 µg/kg/min

(gelöst in isotoner Natriumchloridlösung). Das PTZ wurde über eine Infusionspumpe

verabreicht. Die Infusionsrate lag bei 1 µl/min/g Ratte (da die Körpergewichte

zwischen den Tieren nicht stark schwankten, wurde das gemittelte Gewicht aller

angeschlossenen Tiere verwendet). Während der gesamten Infusionsdauer (48 h)

wurden die Tiere beobachtet, um bei eventuellen PTZ-Nebenwirkungen (Krämpfe),

die Infusion zu stoppen. Wenn die Infusion zu einzelnen Anfällen (fokal oder

generalisiert) führte, wurde sie nicht gestoppt, nur im Falle von wiederholten Anfällen,

welche nicht spontan endeten. Um eine kontinuierliche Beobachtung der Ratten über

48 Stunden zu gewährleisten, haben sich immer 2 Experimentatoren tags und nachts

abgewechselt. Nach Ende der Behandlung wurden bei den Tieren retrobulbär

Blutproben entnommen, um die PTZ-Plasmakonzentration zu bestimmen (siehe

Kapitel 4.5.6). Bei Tieren der 1. Pilokarpin-Gruppe wurden Blutproben 24 h und 48 h

nach Infusionsbeginn entnommen, bei den Tieren der weiteren Behandlungsgruppen

nur nach 48 h. Die PTZ-Konzentration wurde mittels HPLC gemessen.


58

4.7.7 EEG- und Videoüberwachung

Um das Auftreten von spontanen Anfällen zu detektieren, wurden die Tiere EEG- und

videoüberwacht. Die einzelnen Gruppen wurden zu unterschiedlichen Zeitpunkten

nach Behandlung überwacht (siehe Tabelle 10). Die Überwachungsanlage ist in

Kapitel 4.4 beschrieben.

Studie Zeitpunkt der Überwachung

1. Gruppe: PTZ-Infusion im Pilokarpin-Modell 4 und 7 Wochen nach SE

2. Gruppe: PTZ-Infusion im Pilokarpin-Modell 8 Wochen nach SE

1. Gruppe: PTZ-Infusion im fokalen Kainsäure-

Modell

8 und 12 Wochen nach SE

2. Gruppe: PTZ-Infusion im fokalen Kainsäure-

Modell

8 und 16 Wochen nach SE

Tabelle 10: Übersicht über die Überwachungszeitpunkte in den einzelnen Tiergruppen der Studie 3.

Die Auswertung der Überwachungsdateien erfolgte visuell.

4.8 Statistik Die statistische Auswertung der Studien erfolgte mit der GraphPad Prism Software

5.0 (La Jolla, CA, USA). Alle Werte sind, sofern nicht anders angegeben, als

Mittelwertsfehler angegeben (Mean + SEM standard error of mean). Bei einem

Vergleich von zwei Gruppen wurde entweder der Student`s t-Test (bei

parametrischen Daten), oder der Mann-Whitney-U-Test (bei nichtparametrischen

Daten) verwendet. Bei einem Vergleich von drei, oder mehr Gruppen, von denen

parametrische Daten erhoben wurden, wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse

(ANOVA) mit Bonferroni oder Student`s t-Test als post hoc Test durchgeführt. Bei

nichtparametrischen Daten wurde entsprechend der Kruskal-Wallis-Test mit Dunn`s

oder Mann-Whitney-U-Test als post hoc Test durchgeführt. Alle statistischen Tests

wurden zweiseitig durchgeführt. Ein Singnifikanzniveau von p<0,05 wurde festgelegt.

Ergebnisse

59

5. Ergebnisse

5.1 Studie 1: Etablierung des fokalen Kainsäure-Modells

5.1.1 SE-Induktion im fokalen Kainsäure-Modell

Bei allen 27 Ratten konnte durch Kainsäure-Mikroinjektion ein SE induziert werden.

Dieser war klinisch charakterisiert durch verminderte Ansprechbarkeit, „Straub tail“

(senkrecht hochgestellter Schwanz), „Wet dog shakes“ (charakteristisches Schütteln

des Rumpfes), Verharren und Stereotypien wie Schnüffeln, Kauen und Kopfnicken.

Diese Verhaltensänderungen waren von generalisierten tonisch-klonischen Anfällen

begleitet. Da Kainsäure einen limbischen SE induziert, bei welchem es nicht

durchgehend zu generalisierter tonisch-klonischer Krampfaktivität kommt, wurde der

SE anhand des EEG-Bildes beurteilt. Vor der SE-Induktion wurde ein Basis-EEG

aufgenommen (siehe Abbildung 12 A). Nach der SE-Induktion konnten

charakteristische EEG-Veränderungen (zuerst erhöhte Frequenz und Amplitude der

Basislinie, paroxysmale Veränderungen, später hochamplitudige Veränderungen der

Basislinie (siehe Abbildung 12 B, C) beobachtet werden. Die SE-Länge und -

Schwere wurde anhand der EEG-Veränderungen (EEG-Anfälle, siehe Abbildung 12

B) bestimmt. Die ersten paroxysmalen EEG-Veränderungen traten nach etwa 10 min

auf (12,78 ± 1,19 min). Die Zahl der auszählbaren EEG-Anfälle während der 20 h

Überwachung nach SE lag im Mittel bei etwa 65 (66,8 ± 7,8). Die Dauer der

paroxysmalen EEG-Veränderungen variierte von Tier zu Tier und lag im Schnitt bei

11,2 h (3,7 - 20,5 h). Die Veränderungen der Basislinie (erhöhte Frequenz und

Amplitude, Spikes), hielten länger an. Der SE endete spontan bei allen Tieren. Die

beschriebenen EEG-Veränderungen sind in nachfolgender Abbildung dargestellt.

Ergebnisse

60

5 s

1 mV

5 s1 mV

5 s1 mV

A

B

C

Abb. 12 (A-C): EEG-Veränderungen vor und nach Kainsäure-Mikroinjektion Basis-EEG, aufgenommen vor Kainsäure-Mikroinjektion (A). Paroxysmale EEG-Veränderung (EEG-Anfall) 12 Minuten nach Kainsäure- Mikroinjektion (B). Hochamplitudige Veränderung der Basislinie 3,7 h nach Kainsäure- Mikroinjektion (C).

Ergebnisse

61

5.1.2 Entwicklung von spontanen, wiederkehrenden, epileptische Anfällen im fokalen Kainsäure-Modell

Die Studie wurde an zwei Tiergruppen durchgeführt. Die 1. Gruppe setzt sich aus

Tieren von Harlan (n=4) und Tieren von Charles River (n=8) zusammen. In der 2.

Gruppe wurden ausschließlich Tiere von Harlan (n=10) verwendet. Da es keinen

Unterschied in der SE-Induktion zwischen den Ratten beider Züchter gab, wurden

die Tiere in der Auswertung zusammengefasst. Die Tiere der ersten Gruppe wurden

nach 4, 6 und 8 Wochen, für einen Zeitraum von einer Woche überwacht. Die Tiere

der zweiten Gruppe wurden nach 8 Wochen für einen Zeitraum von 11-18 Tagen

überwacht. Acht Ratten dieser Gruppe wurden zusätzlich nach 33 Wochen im

Rahmen des Phenobarbital-Selektionsversuchs videoüberwacht (siehe Kapitel 4.5.6

und 5.1.4). Die Anfallsentwicklung war wie folgt: Sieben von 12 Tieren entwickelten

Anfälle während der ersten Überwachungsphase (4 Wochen nach SE), zwei weitere

Tiere hatten Anfälle während der zweiten Überwachungsphase (6 Wochen nach SE)

und ein weiteres Tier während der dritten Überwachungsphase (8 Wochen nach SE).

Insgesamt entwickelten 10 von 12 Ratten der ersten Gruppe epileptische Anfälle

(83%). In der zweiten Tiergruppe hatten 9 von 10 Tieren Anfälle während der ersten

Überwachungsphase 8 Wochen nach SE (90%). Bei einer der Ratten, die keine

Anfälle während der Überwachungsphase entwickelte, konnten später Anfälle

beobachtet werden, so dass insgesamt 20 von 22 Ratten dieser Studie, als

epileptisch bezeichnet werden können (91%).

Die meisten Anfälle waren sekundär generalisiert (Typ IV oder V, siehe Abbildung 13

A), es traten aber auch fokale Anfälle auf (Typ I-III, siehe Abbildung 13 B). Der

Anfallstyp (fokal oder generalisiert) konnte nicht im EEG, sondern nur mithilfe der

Videodateien bestimmt werden. Fokale Anfälle unterscheiden sich im EEG nicht von

generalisierten Anfällen, die paroxysmalen Veränderungen sind unabhängig vom

Anfallstyp. Bei den Tieren der ersten Gruppe und bei der späten Überwachung (33

Wochen nach SE) der zweiten Gruppe konnten aufgrund der hohen Verlustrate der

EEG-Aufsätze meist nur generalisierte Anfälle erfasst werden. Obwohl sich fokale

Anfälle gut von generalisierten Anfällen im Video unterscheiden lassen, ist es bei

alleiniger Videoüberwachung oft schwierig, fokale Anfälle zu erkennen.

Die mittlere Anfallsfrequenz lag während der Überwachungsphase 8 Wochen nach

SE bei 6,65 Anfällen pro Woche.

Ergebnisse

62

Bei Tieren, die sowohl 8 als auch 33 Wochen nach SE überwacht wurden, stieg die

mittlere Anfallsfrequenz von 9,26 auf 52,4 Anfälle pro Woche, was für eine

Progression der Krankheit bei diesen Tieren spricht. Einige Ratten hatten während

der Überwachung EEG-Auffälligkeiten (siehe Abbildung 13 C), welche nicht eindeutig

als Anfall klassifiziert werden konnten, aber immer mit Verhaltensänderungen

einhergingen (Verharren, seitliche Kopfbewegungen). Möglicherweise könnten diese

EEG-Ereignisse eine Form von fokalen, nichtkonvulsiven Anfällen darstellen.

Die wöchentliche Anfallsfrequenz (Zahl der Anfälle während der gesamten

Überwachungsdauer geteilt durch sieben Tage) in den einzelnen

Überwachungsphasen ist in nachfolgender Tabelle dargestellt. Die niedrigere

Anfallsfrequenz der 1. Gruppe könnte daher kommen, dass bei vielen Tieren ohne

EEG-Aufsätze nur generalisierte Anfälle detektiert werden konnten. Die tägliche

Anfallsfrequenz während der Überwachung ist für jedes Tier der 2. Gruppe individuell

dargestellt (siehe Abbildung 14).

Ergebnisse

63

Tier Züchter 4 Wochen

nach SE

6 Wochen

nach SE

8 Wochen

nach SE

33 Wochen

nach SE

MR 57 Charles River 1 1 0 -








MR 67 Harlan 2 3 0 -




MR 122 Harlan - - 4,28 16

MR 123 Harlan - - 0 -

MR 124 Harlan - - 0,54 106

MR 126 Harlan - - 0,78 12,3

MR 127 Harlan - - 5,25 56

MR 129 Harlan - - 6,61 -

MR 131 Harlan - - 26,6 80,5

MR 132 Harlan - - 10,18 26

MR 133 Harlan - - 21,78 53,4

MR 134 Harlan - - 4,67 69

Tabelle 11: Durchschnittliche wöchentliche Anfallsfrequenz (Zahl der Anfälle während der gesamten Überwachungsdauer geteilt durch sieben Tage) in den einzelnen Überwachungsphasen.

Ergebnisse

64

Abb. 13 (A-C): Spontane epileptische Anfälle 8 Wochen nach SE-Induktion. Spontaner generalisierter Anfall Typ IV (A). Spontaner fokaler Anfall Typ III (B). Spontaner nichtkonvulsiver Anfall (C).

5 s1 mV

5 s1 mV

1 mV5 s

A

B

C

Ergebnisse

65

MR 126 (18 Tage)

0

5

10

15

20

An

fälle

MR127 (16 Tage)

0

5

10

15

20

An

fälle

MR129 (18 Tage)

0

5

10

15

20

An

fälle

MR131 (15 Tage)

0

5

10

15

20

An

fälle

MR 132 (11 Tage)

0

5

10

15

20

nd *

An

fälle

MR133 (18 Tage)

0

5

10

15

20

An

fälle

MR134 (18 Tage)

0

5

10

15

20

An

fälle

MR 122 (18 Tage)

0

5

10

15

20

An

fälle

MR 124 (13 Tage)

0

5

10

15

20

An

fälle

generalisiert

fokal

nicht klassifiziert

nd - nicht detektiert (keine Überwachung)

Abb. 14: Tägliche Anfallsfrequenz in der 2. Tiergruppe 8 Wochen nach SE. Die individuelle Überwachungsdauer ist über jedem Graphen in Klammern angegeben. Die Anfälle sind aufgeteilt in generalisierte, fokale und nicht klassifizierte Anfälle (siehe Legende).

Ergebnisse

66

5.1.3 Verhaltensänderungen im fokalen Kainsäure-Modell

Im Vergleich zu Ratten aus dem systemischen Pilokarpin-Modell waren die

Kainsäure-Ratten in den ersten Wochen nach SE weniger aggressiv und einfacher

zu handhaben. Um die bei epileptischen Ratten typischen Verhaltensänderungen zu

beschreiben, haben wir eine Verhaltensbatterie durchgeführt. In den Endergebnissen

sind alle Tiere (von Harlan und von Charles River) zusammengefasst. Die

Ergebnisse im Züchtervergleich werden ebenfalls dargestellt, sie unterscheiden sich

aber grundsätzlich nicht von den zusammengefassten Daten.

5.1.3.1 Der Hyperexcitabilitätstest (HET)

Der HET ermöglicht es, taktile sowie akustische Übererregbarkeit von epileptischen

Ratten zu beschreiben und wurde in dieser Studie 13 (1. Gruppe), bzw. 15 (2.

Gruppe) Wochen nach SE durchgeführt (siehe Kapitel 4.5.5.1). Die Ratten dieser

Studie wurden mit Kontrollratten aus einem anderen Projekt verglichen

(POLASCHECK et al. 2010). Die Ergebnisse werden durch ein Score-System

beschrieben (siehe Kapitel 4.5.5.1). Die epileptischen Ratten unterscheiden sich im

Touch-Response- und Finger-Snap-Test von Kontrollen (siehe Abbildung 15 C, E),

nicht jedoch im Pick-up-Test und Approach-Response-Test (siehe Abbildung 15 G,

A). Im Züchtervergleich unterscheiden sich im Touch-Response-Test nur die

epileptischen Tiere von Harlan von den Kontrollen (siehe Abbildung 15 D). Im Finger-

Snap-Test gibt es keinen Unterschied zwischen Züchtervergleich und

Gesamtergebnissen (siehe Abbildung 15 E, F). Die Ergebnisse des Finger-Snap-

Tests sowie des Touch-Response-Tests sind ein Hinweis auf eine akustische und

taktile Übererregbarkeit der epileptischen Ratten. Im Pick-up-Test unterscheiden sich

die Kainsäure-Ratten nicht von Kontrollen, was übereinstimmt mit der besseren

Handhabbarkeit und geringeren Aggressivität der Kainsäure-Ratten im Vergleich zu

Pilokarpin-Ratten. Es lässt sich jedoch eine deutliche Teilung der Gruppe erkennen.

Ein Teil der epileptischen Tiere liegt mit den Score-Werten auf Kontrollniveau, ein

Teil liegt deutlich oberhalb des Kontrollniveaus. Die Ursachen dieser Spaltung

innerhalb der Gruppe sind nicht geklärt, da die hohen Score-Werte weder mit einer

längeren SE-Dauer, noch mit einer höheren Anfallsfrequenz korrelierten. Diese

Ergebnisse zeigen die unterschiedliche Ausprägung der epilepsieassozierten

Ergebnisse

67

Verhaltensänderungen in verschiedenen Nagermodellen für

Temporallappenepilepsie.

Kontr

ollen

KA-T

iere

0

1

2

3

4

5

6

7

*

p=0,0033

Sc

ore

Kontr

ollen

KA-T

iere

Har

lan

KA-T

iere

Ch. R

iver

0

1

2

3

4

5

6

7 *

p=0,002

Sc

ore

Kontr

ollen

KA-T

iere

0

2

4

6

p=0,2802

Sc

ore

Kontr

ollen

KA-T

iere

Har

lan

KA-T

iere

Ch. R

iver

0

2

4

6

p=0,5263

Sc

ore

Approach-Response-Test

Touch-Response-Test

A

C D

B

Ergebnisse

68

Abb. 15 (A-H): Ergebnisse des HET als Gesamtergebnisse (A, C, E, G) und im Züchtervergleich (B, D, F, H). Die epileptischen Tiere unterscheiden sich im Touch-Response-Test und im Finger-Snap-Test signifikant von Kontrolltieren. Die Gesamtergebnisse wurden mittels Mann Whitney-U-Test verglichen. Der Züchtervergleich wurde mittels Kruskal Wallis-Test mit Dunn`s-Test als post hoc-Test verglichen. Alle Daten sind als Einzelwerte mit Median dargestellt. Signifikante Unterschiede sind durch einen Stern * gekennzeichnet. Die Gruppengrößen waren wie folgt: Kontrollen n=8, epileptische Ratten n=19, davon n=13 von Harlan und n=6 von Charles River.

Kontr

ollen

KA-T

iere

0

1

2

3 *

p=0,0001

Sc

ore

Kontr

ollen

KA-T

iere

Har

lan

KA-T

iere

Ch. R

iver

0

1

2

3 * *

p=0,0003

Sc

ore

Kontr

ollen

KA-T

iere

0

2

4

6

p=0,6692

Sc

ore

Kontr

ollen

KA-T

iere

Har

lan

KA-T

iere

Ch. R

iver

0

2

4

6

p=0,1107

Sc

ore

Finger-Snap-Test

Pick-up-Test

E F

G H

Ergebnisse

69

5.1.3.2 Der Elevated-Plus Maze-Test (EPM)

Das EPM ist ein Test zur Untersuchung von explorations- und angstassoziiertem

Verhalten. In dieser Studie wurde er 27 (1. Gruppe), beziehungsweise 17 (2. Gruppe)

Wochen nach SE durchgeführt (siehe Kapitel 4.5.5.2). In diesem Test wird die

Aufenthaltsdauer in den verschiedenen Kompartimenten des EPM bewertet. Naive

Ratten empfinden die offenen Arme des EPM als aversiv und halten sich vermehrt in

den geschlossenen Armen auf. Eine längere Aufenthaltsdauer in den offenen Armen

deutet auf eine Explorationsfreudigkeit und reduziertes Angstverhalten hin.

Haeddips, also das Herauslehnen über den Rand der offenen Arme, und Absprünge

vom EPM sind relativ selten. Die Ergebnisse sind in Abbildung 16 dargestellt.

Die Frequenz der Eintritte in die einzelnen Kompartimente war in beiden Gruppen

gleich (siehe Abbildung 16 A, C, E). Die Aufenthaltsdauer in den verschiedenen

Kompartimenten war ebenfalls nicht signifikant unterschiedlich zwischen den beiden

Gruppen (siehe Abbildung 16 B, D, F). Bei den epileptischen Ratten lies sich jedoch

ein Trend zu einer verlängerten Aufenthaltsdauer in den offenen Armen beobachten

(p=0,0855), bei gleichzeitig tendenziell verkürzter Aufenthaltsdauer in den

geschlossenen Armen (p=0,058), (siehe Abbildung 16 D, F). Beide Gruppen

unterschieden sich nicht in der zurückgelegten Gesamtstrecke und der Frequenz des

Aufrichtens im EPM (siehe Abbildung 16 G, I). Die nichtepileptischen Kontrollen

putzten sich signifikant häufiger im Vergleich zu den epileptischen Ratten (siehe

Abbildung 16 J). In der epileptischen Gruppe konnte man einen Trend zu vermehrten

Headdips beobachten (p=0,0614), (siehe Abbildung 16 H). Die Ergebnisse im

Züchtervergleich unterscheiden sich nicht von den Gesamtergebnissen und sind

daher nicht abgebildet. Absprünge vom EPM konnte man nur bei den epileptischen

Ratten beobachten (nicht abgebildet). Acht von 18 epileptischen Ratten sind vom

EPM abgesprungen, ein Tier wurde nach 2 Absprüngen vom Versuch

ausgeschlossen. Abschließend kann man sagen, dass die epileptischen Tiere

tendenziell gesteigertes Explorationsverhalten und weniger angstassoziiertes

Verhalten im Vergleich zu nichtepileptischen Kontrollen zeigten (verlängerte

Aufenthaltsdauer in den offenen Armen, Headdips, Absprünge). Der Unterschied war

jedoch nicht sehr stark ausgeprägt.

Ergebnisse

70

Abb. 16 (A-J): Ergebnisse des EPM. Dargestellt sind die Frequenz der Eintritte (A, C, E) und die Aufenthaltsdauer (B, D, F) in den einzelnen Kompartimenten sowie die zurückgelegte Strecke (G) und beurteilte Verhaltensweisen (H, I, J) im EPM. Das Putzverhalten ist signifikant nidriger bei den epileptischen Ratten im Vergleich zu Kontrollen (J). Es gibt eien Trend zu vermehrten Headdips und einer längeren Aufenthaltsdauer in den offenen Armen (H, D). Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt und wurden mittels Student`s t-Test verglichen. Signifikante Unterschiede sind durch einen Stern * gekennzeichnet. Gruppengrößen: Kontrollen n=7, Kainsäure-Tiere n=17.

EPM Frequenz der Eintritte ins Zentrump=0,5534

Kontrollen KA-Tiere0

5

10

15

Fre

qu

en

z

EPM Frequenz der Eintritte in die offenen Armep=0,1215


2

4

6

8

Fre

qu

en

z

EPM Frequenz der Eintritte in die geschlossenen Armep=0,8007


2

4

6

8

10

Fre

qu

en

z

EPM Aufenthaltsdauer in den offenen Armenp=0,0855


10

20

30

40

50

Au

fen

tha

lts

da

ue

r [s

]

EPM Aufenthaltsdauer im Zentrump=0,321


10

20

30

40

Au

fen

tha

lts

da

ue

r [s

]EPM Aufenthaltsdauer in den geschlossenen Armen

p=0,0582


100

200

300

Au

fen

tha

lts

da

ue

r [s

]

EPM zurückgelegte Streckep=0,4123


500

1000

1500

2000

zu

rüc

kg

ele

gte

Str

ec

ke

[c

m]

EPM headdipsp=0,0614


2

4

6

8

10

Fre

qu

en

z

EPM Aufrichtverhalten0,976


5

10

15

20

Fre

qu

en

z

EPM Putzverhaltenp=0,0014

Kontrollen KA-Tiere0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

*

Fre

qu

en

z

A B

C D

E F

G H

I J

Ergebnisse

71

5.1.3.3 Der Open Field-Test (OF)

Der OF-Test untersucht, ähnlich wie der EPM-Test, explorations- und

angstassoziiertes Verhalten. In dieser Studie wurde er 26 (1. Gruppe)

beziehungsweise 18 (2. Gruppe) Wochen nach SE durchgeführt (siehe Kapitel

4.5.5.3). Auch hier wird die Aufenthaltsdauer in den einzelnen Kompartimenten

gewertet. Naive Ratten halten sich bevorzugt im äußeren Ring auf, der innere Ring

und das Zentrum werden als aversiv empfunden. In dieser Studie unterscheiden sich

die epileptischen Ratten von den nichtepileptischen Kontrollen in der Frequenz der

Eintritte ins Zentrum (siehe Abbildung 17 A) und in den inneren Ring (siehe

Abbildung 17 C). Wenn man den Versuch nach Züchtern getrennt auswertet,

unterscheiden sich die epileptischen Tiere in der Frequenz der Eintritte ins Zentrum

nicht von den Kontrollen (siehe Abbildung 17 B), was vermutlich an den zu kleinen

Tierzahlen liegt. Bei den epileptischen Tieren von Harlan ist die Frequenz der

Eintritte in den inneren Ring höher im Vergleich zu den Kontrollen, was den

Gesamtergebnissen entspricht (siehe Abbildung 17 D). Die Frequenz der Eintritte in

den äußeren Ring war insgesamt nicht verändert im Vergleich zur Kontrollgruppe

(siehe Abbildung 17 E, F). Was die Aufenthaltsdauer in den einzelnen

Kompartimenten betrifft, so gab es keine Unterschiede zwischen den Gruppen in der

Aufenthaltsdauer im Zentrum (siehe Abbildung 18 A, B). Im Züchtervergleich

betrachtet, hatten die Tiere von Harlan eine verlängerte Aufenthaltsdauer im inneren

Ring, was in einer entsprechend verkürzten Aufenthaltsdauer im äußeren Ring

resultierte (siehe Abbildung D, F). Diese Ergebnisse sah man als Trend (p=0,0564)

der epileptischen Ratten zu einer verlängerten Aufenthaltsdauer im inneren Ring, in

den Gesamtergebnissen (siehe Abbildung 18 C). Die Aufenthaltsdauer im äußeren

Ring war in beiden Gruppen gleich, mit einem Trend der epileptischen Tiere zur

verkürzten Aufenthaltsdauer (siehe Abbildung 18 E). Die Gruppen unterscheiden sich

weder in der zurückgelegten Strecke, noch im Putzverhalten oder im

Aufrichtverhalten (siehe Abbildung 19). Im Züchtervergleich sind die zurückgelegte

Strecke und das Aufrichtverhalten signifikant höher bei den Tieren von Charles River

(siehe Abbildung 19 B, D). Zusammenfassend kann man sagen, dass die

epileptischen Ratten eine Reihe von Verhaltensänderungen im OF-Test zeigten, wie

weniger angstassoziiertes Verhalten und vermehrtes Explorationsverhalten.

Ergebnisse

72

OF Frequenz der Eintritte ins Zentrum

Kontr

ollen

KA-T

iere

Har

lan

KA-T

iere

Ch. R

iver

0

5

10

15

Fre

qu

en

z

OF Frequenz der Eintrittein den inneren Ring

Kontr

ollen

KA-T

iere

Har

lan

KA-T

iere

Ch. R

iver

0

10

20

30

40

50

Fre

qu

en

z

OF Frequenz der Eintrittein den äusseren Ring

Kontr

ollen

KA-T

iere

Har

lan

KA-T

iere

Ch. R

iver

0

5

10

15

20

25

Fre

qu

en

z

OF Frequenz der Eintritte ins Zentrum

Kontr

ollen

KA-T

iere

0

5

10

15

*

Fre

qu

en

z

OF Frequenz der Eintrittein den inneren Ring

Kontr

ollen

KA-T

iere

0

10

20

30

40

50

Fre

qu

en

z

OF Frequenz der Eintrittein den äusseren Ring

Kontr

ollen

KA-T

iere

0

5

10

15

20

25

Fre

qu

en

z

A B

C D

E F

p=0,0256 p=0,0875

p=0,048

p=0,9934 p=0,2538

p=0,0083

* *

Abb. 17 (A-F): Ergebnisse des OF I. Dargestellt ist die Frequenz der Eintritte in die einzelnen Kompartimente als Gesamtergebnis (A, C, E) und im Züchtervergleich (B, D, F). Die epileptischen Ratten betreten das Zentrum signifikant häufiger als Kontrollen (A). Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt. Die Gesamtergebnisse wurden mittels Student`s t-Test verglichen. Die Ergebnisse des Züchtervergleiches wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) und Bonferroni-Test als post hoc Test verglichen. Signifikante Unterschiede sind durch einen Stern * gekennzeichnet. Gruppengrößen: Kontrollen n=7, Kainsäure-Tiere n=17, davon Tiere von Harlan n=11, Tiere von Charles River n=6.

Ergebnisse

73

OF Aufenthaltsdauer im Zentrum

Kontr

ollen

KA-T

iere

Har

lan

KA-T

iere

Ch. R

iver

0

5

10

15

20

Au

fen

tha

lts

da

ue

r [s

]

OF Aufenthaltsdauer im inneren Ring

Kontr

ollen

KA-T

iere

Har

lan

KA-T

iere

Ch. R

iver

0

50

100

150 *A

ufe

nth

alt

sd

au

er

[s]

OF Aufenthaltsdauer im äusseren Ring

Kontr

ollen

KA-T

iere

Har

lan

KA-T

iere

Ch. R

iver

0

100

200

300 *

Au

fen

tha

lts

da

ue

r [s

]

OF Aufenthaltsdauer im Zentrum

Kontr

ollen

KA-T

iere

0

5

10

15

20

Au

fen

tha

lts

da

ue

r [s

]

OF Aufenthaltsdauer im inneren Ring

Kontr

ollen

KA-T

iere

0

50

100

150

Au

fen

tha

lts

da

ue

r [s

]

OF Aufenthaltsdauer im äusseren Ring

Kontr

ollen

KA-T

iere

0

100

200

300

Au

fen

tha

lts

da

ue

r [s

]

A B

C D

E F

p=0,1583 p=0,3491

p=0,0564 p=0,0185

p=0,0548 p=0,0304

Abb. 18 (A-F): Ergebnisse des OF II. Dargestellt ist die Aufenthaltsdauer in den einzelnen Kompartimenten als Gesamtergebnis (A, C, E) und im Züchtervergleich (B, D, F). Die epileptischen Ratten von Harlan halten sich länger in inneren Ring und kürzer im äusseren Ring auf im Vergleich zu Kontrolltieren (D, F). Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt. Die Gesamtergebnisse wurden mittels Student`s t-Test verglichen. Die Ergebnisse des Züchtervergleiches wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) und Bonferroni-Test als post hoc Test verglichen. Signifikante Unterschiede sind durch einen Stern * gekennzeichnet. Gruppengrößen: Kontrollen n=7, Kainsäure-Tiere n=17, davon Tiere von Harlan n=11, Tiere von Charles River n=6.

Ergebnisse

74

Zurückgelegte Strecke

Kontr

ollen

KA-T

iere

Har

lan

KA-T

iere

Ch. R

iver

0

1000

2000

3000 *

zu

rüc

kg

ele

gte

Str

ec

ke

[c

m]

Aufrichtverhalten

Kontr

ollen

KA-T

iere

Har

lan

KA-T

iere

Ch. R

iver

0

10

20

30

40

*F

req

ue

nz

Putzverhalten

Kontr

ollen

KA-T

iere

Har

lan

KA-T

iere

Ch. R

iver

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Fre

qu

en

z

Zurückgelegte Strecke

Kontr

ollen

KA-T

iere

0

1000

2000

3000zu

rüc

kg

ele

gte

Str

ec

ke

[c

m]

A B

C D

E F

Aufrichtverhalten

Kontr

ollen

KA-T

iere

0

10

20

30

40

Fre

qu

en

z

Putzverhalten

Kontr

ollen

KA-T

iere

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Fre

qu

en

zp=0,7316 p=0,0296

p=0,1298 p=0,0488

p=0,3539 p=0,4988

Abb. 19 (A-F): Ergebnisse OF III. Dargestellt sind die zurückgelegte Strecke, das Aufrichtverhalten und das Putzverhalten als Gesamtergebnis (A, C, E) und im Züchtervergleich (B, D, F). Die epileptischen Tiere von Charles River sind aktiver im Vergleich zu Kontrolltieren und epileptischen Ratten von Harlan (B, D). Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt. Die Gesamtergebnisse wurden mittels Student`s t-Test verglichen. Die Ergebnisse des Züchtervergleiches wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) und Bonferroni-Test als post hoc Test verglichen. Signifikante Unterschiede sind durch einen Stern * gekennzeichnet. Gruppengrößen: Kontrollen n=7, Kainsäure-Tiere n=17, davon Tiere von Harlan n=11, Tiere von Charles River n=6.

Ergebnisse

75

5.1.3.4 Der Morris Water Maze-Test (MWM)

Im MWM werden räumliche Orientierung und Lernverhalten untersucht. Dieser Test

konnte nur in der ersten Gruppe durchgeführt werden. Der Versuch wurde 30

Wochen nach SE durchgeführt. Der Test wurde an 5 aufeinanderfolgenden Tagen

durchgeführt (siehe Kapitel 4.5.5.4). Ein Lernerfolg, gemessen in verkürzter

Latenzzeit [s] bis zum Auffinden der Plattform im Vergleich zum Vortag konnte bei

den nichtepileptischen Kontrollen ab dem zweiten Tag festgestellt werden. Im

Gegensatz dazu konnte man bei den epileptischen Ratten erst ab dem dritten Tag

einen Lernerfolg verzeichnen (siehe Abbildung 20). Am letzten Tag sah man keinen

Unterschied mehr zwischen den beiden Gruppen. Am dritten und vierten Tag war die

Zeit zum Auffinden der Plattform bei den epileptischen Ratten signifikant erhöht im

Vergleich zu den Kontrollen. Die epileptischen Ratten lernten langsamer als

Kontrollen. Diese Ergebnisse lassen auf Schwierigkeiten im konditionierten Lernen

und bei der räumlichen Orientierung sowie auf Gedächtnisdefizite der epileptischen

Ratten schließen. Im letzten Tetslauf des fünften Tages wurde ein Probe trial

durchgeführt, in welchem die Plattform aus dem Becken entfernt und die Zahl der

Kreuzungen der ehemaligen Plattformposition detektiert wurde. In diesem Test

unterscheiden sich die epileptischen Ratten deutlich von den Kontrollen (siehe

Abbildung 21 B). Diese Unterschiede konnten nicht auf Schwimmdefizite der

epileptischen Ratten zurückgeführt werden, da die mittlere Schwimmgeschwindigkeit

in beiden Gruppen gleich war (siehe Abbildung 21 A). Das Schwimmverhalten beider

Gruppen zeigte ebenfalls erhebliche Unterschiede. Die epileptischen Ratten zeigten

häufig ein zielloses Schwimmverhalten, schwammen oft am Beckenrand

(Thigmotaxis) ohne zu versuchen, die Plattform zu finden. Oft blieben sie auch nicht

auf der Plattform sitzen, wenn sie sie einmal gefunden hatten. Die Thigmotaxis kann

als angstassoziiertes Verhalten gewertet werden. All das lässt nicht nur auf Defizite

im räumlichen Gedächtnis schließen. Durch das Verhalten auf der Plattform ist es

auch sehr wahrscheinlich, dass für die epileptischen Ratten konditioniertes Lernen

ein Problem darstellte, da sie nicht imstande waren, die Zusammenhänge im MWM-

Test zu verknüpfen. Züchtervergleich: Da in diesem Versuch nur 2 Tiere von Harlan

untersucht wurden, kann über die Harlan-Tiere keine Aussage getroffen werden.

Wenn ausschließlich die Charles River Tiere gegen die Kontrollen getestet werden,

Ergebnisse

76

gibt es keinen Unterschied im Vergleich zu den kombinierten Ergebnissen (nicht

abgebildet).


10

20

30

40

A Mittlere Schwimmgeschwindigkeit p=0,0665

Gesch

win

dig

keit

[cm

/ s

]


2

4

6

*

B Kreuzungen der Plattform p=0,0096

Fre

qu

en

z

Abb. 21 (A-B): Die Ratten unterscheiden sich nicht in der mittleren Schwimmgesvchwindigkeit (A). Die Zahl der Plattformkreuzungen beim Probe Trial ist niedriger bei epileptischen Ratten (B). Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mittels Student`s t-Test untersucht und sind durch einen Stern * angezeigt. Die Gruppengrößen: Kontrollen n=7, Kainsäure-Tiere n=9.

Tag 1

Tag 2

Tag 3

Tag 4

Tag 5

0

20

40

60Kontrollen

KA-Tiere

* * *

** * *

# #

Zeit bis zum Auffinden der Plattform

Zeit

[s]

Abb. 20 : Ergebnisse MWM. Beide Gruppen zeigen über die Zeit einen Lernerfolg. Die epileptischen Ratten lernen signifikant langsamer als Kontrolltiere. Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt. Die Daten innerhalb einer Gruppe wurden mittels einseitiger Varianzanalyse mit Bonferroni-Test als post hoc-Test untersucht. Signifikante Unterschiede werden innerhalb der Gruppe durch einen Stern * angezeigt. Die Unterschiede zwischen den Gruppen wurden mittels Student`s t-Test untersucht und werden durch eine Raute # angezeigt. Die Gruppengrößen: Kontrollen n=6, Kainsäure-Tiere n=8.

Ergebnisse

77

5.1.4 Die Phenobarbital-Selektion

Dreiunddreißig Wochen nach SE wurden 8 Tiere mit Phenobarbital behandelt. Ziel

der Behandlung war die Selektion von Phenobarbital-Respondern und

Phenobarbital-Nonrespondern im fokalen Kainsäure-Modell. Phenobarbital-

Responder sind Tiere, die auf eine Behandlung ansprechen (mit einer

Anfallsreduktion um mindestens 50%). Bei Phenobarbital-Nonrespondern resultiert

die Behandlung nicht in einer Anfallsreduktion in diesem Ausmaß (siehe Kapitel

4.5.6). Der Versuch dauerte 12 Tage. Während der gesamten Zeit wurden die Tiere

kontinuierlich videoüberwacht. Der Versuch war unterteilt in 4 Tage Kontrollphase, 4

Tage Behandlungsphase und 4 Tage Auswaschphase (siehe Kapitel 4.5.6). Bei allen

Tieren lag die Phenobarbitalplasmakonzentration im therapeutischen Bereich

zwischen 10-40 µg/ml (siehe Tabelle 12).

Tier Phenobarbital im Plasma [µg/ml]

MR 124 19,05

MR 126 49,66

MR 131 18,94

MR 133 41,20

MR 122 26,63

MR 127 32,63

MR 132 25,84

MR 134 11,78

Tabelle 12: Phenobarbital-Plasmakonzentration [µg/ml] während der Behadlungsphase, bei den einzelnen Tieren. Der Phenobarbital-Gehalt im Plasma wurde 14 h nach letzer Behandlung bestimmt.

In dem viertägigen Behandlungszeitraum konnte bei allen Ratten die Anfallsfrequenz

um mindestens 50% reduziert werden (siehe Abbildung 22), somit konnten keine

Phenobarbital-Nonresponder identifiziert werden. Wir können nicht ausschließen,

dass Grund hierfür die kurze (4 Tage) Behandlungsdauer war. Die Tiere hatten keine

EEG-Aufsätze mehr und konnten ausschließlich videoüberwacht werden. Aus

diesem Grund wurde der Versuch auf 12 Tage beschränkt, da die Auswertung der

Videoüberwachung extrem zeitaufwändig ist. Es wäre sinnvoll, diesen Versuch über

einen längeren Zeitraum zu wiederholen. Phenobarbital hatte initial eine gute

Wirkung bei allen Tieren, in einem Folgeversuch mit längerer Behandlung müsste die

eventuelle Toleranzentwicklung untersucht werden.

Ergebnisse

78

Die Tiere wurden während des Versuchs einem Ataxie-, Hyperlokomotion-,

Hypolokomotion-Scoring unterzogen und zeigten unter Phenobarbital-Behandlung

leichte bis deutliche Ataxie. Alle Tiere hatten Anfälle während der Kontrollphase.

Zwei Ratten (MR 122 und MR 132) konnten nur bedingt mit in die Endauswertung

aufgenommen werden, da sie nur wenige Anfälle während der Kontrollphase zeigten.

Die durchschnittliche Anfallsfrequenz während der 4 Tage lag bei 20,4 ± 6,32.

Während der Behandlungsphase wurden 4 Ratten anfallsfrei. Die Zahl der Anfälle lag

in diesem Zeitraum im Mittel bei 1,75 ± 0,96, und war damit signifikant gesunken

(p=0,0147). In der Auswaschphase kam es zu einem signifikanten Anstieg der

Anfallsfrequenz auf 36,5 ± 9,8 (p=0,007). Die Zahl der Anfälle pro Tag im Verlauf des

Versuchs ist für jedes Tier separat in Abbildung 22 dargestellt.

Ergebnisse

79

Abb. 22: Tägliche Anfallsfrequenz während der PB-Selektion. Dargestellt ist die Zahl der Anfälle pro Tag individuell für jede Ratte in den jeweiligen Versuchsphasen (PB – Phenobarbital).

MR 124

Tag 1

Tag 2

Tag 3

Tag 4

Tag 5

Tag 6

Tag 7

Tag 8

Tag 9

Tag 1

0

Tag 1

1

Tag 1

2

0

10

20

30

40Kontrollphase PB-Behandlung Auswaschphase

An

fälle

MR 126

Tag 1

Tag 2

Tag 3

Tag 4

Tag 5

Tag 6

Tag 7

Tag 8

Tag 9

Tag 1

0

Tag 1

1

Tag 1

2

0

10

20

30


An

fälle

MR 131

Tag 1

Tag 2

Tag 3

Tag 4

Tag 5

Tag 6

Tag 7

Tag 8

Tag 9

Tag 1

0

Tag 1

1

Tag 1

2

0

10

20

30


An

fälle

MR 133

Tag 1

Tag 2

Tag 3

Tag 4

Tag 5

Tag 6

Tag 7

Tag 8

Tag 9

Tag 1

0

Tag 1

1

Tag 1

2

0

10

20

30


An

fälle

MR 122

Tag 1

Tag 2

Tag 3

Tag 4

Tag 5

Tag 6

Tag 7

Tag 8

Tag 9

Tag 1

0

Tag 1

1

0

10

20

30


An

fälle

MR 127

Tag 1

Tag 2

Tag 3

Tag 4

Tag 5

Tag 6

Tag 7

Tag 8

Tag 9

Tag 1

0

Tag 1

1

0

10

20

30


An

fälle

MR 132

Tag 1

Tag 2

Tag 3

Tag 4

Tag 5

Tag 6

Tag 7

Tag 8

Tag 9

Tag 1

0

Tag 1

1

0

10

20

30


An

fälle

MR 134

Tag 1

Tag 2

Tag 3

Tag 4

Tag 5

Tag 6

Tag 7

Tag 8

Tag 9

Tag 1

0

Tag 1

1

0

10

20

30


An

fälle

Ergebnisse

80

5.1.5 Histologie

5.1.5.1 Histologie der 1. Gruppe

Die Tiere der ersten Gruppe wurden transkardial perfundiert und die Gehirne mittels

Gefriermikrotom geschnitten. Eine Serie der Hirnschnitte (Schnittdicke 40 µm) wurde

mittels Thionin-Färbung angefärbt. Die Lage der Elektroden und Führungsrohre sollte

lichtmikroskopisch beurteilt werden. Da die Tiere erst spät nach dem Verlust der

EEG-Aufsätze getötet wurden, konnten die Schnitte nicht ausgewertet werden, denn

das Gewebe war durch die Verluste der Aufsätze und damit einhergehende

entzündliche Prozesse stark verändert. Der Einstichkanal war durch Gliose stark

vernarbt und deshalb nicht gut erkennbar.

5.1.5.2 Histologie der 2. Gruppe

Die Tiere der zweiten Gruppe wurden dekapitiert und die Gehirne mittels Kryostat

geschnitten. Eine Serie der Hirnschnitte (Schnittdicke 14 µm) wurde mittels Thionin-

Färbung angefärbt. Die Neurodegeneration wurde in den Ebenen 3 mm und 4 mm

posterior zu Bregma, mittels Score-System bewertet (siehe Kapitel 4.5.7.2.1).

Ausgewertet wurden folgende Regionen des Hippokampus: Pyramidenzellschichten

CA1, CA3a, CA3c, Körnerzellschicht des Gyrus Dentatus (DG) und Hilus des Gyrus

Dentatus. Die mittleren Score-Werte für die jeweilige Region sind in der

nachfolgenden Tabelle dargestellt.

Ergebnisse

81

Tier Score Score Score Score Score Score Score Score Neuro-

degeneration

im Hilus

CA1

re

CA3 a

re

CA3 c

re

DG re CA1

li

CA3 a

li

CA3 c

li

DG li re li

MR

123* 0,5 2 3 1 0,5 0,25 0 0

ja nein

MR

124 0,75 1,5 2 0 0,25 0 0 0

? nein

MR

126 1,25 2,75 3 1 0,25 0,25 0 0

ja nein

MR

127 0,25 2,25 1,5 0,25 0,5 0 0 0

ja nein

MR

131** 0 0,5 0 0 0,5 0 0 0

? nein

MR

132 1,5 2,75 3 1 0,75 0,5 0,5 0,75

ja nein

MR

133 1 2,5 3 1 0 0 0 0,5

ja nein

MR

134 1 2,5 2 0 0 0,5 0 0,5

? nein

Tabelle 13: Mittlerer Neurodegenerationsscore für die einzelnen Hirnregionen der Tiere der 2. Tiergruppe. Score-System: 0: keine Neurodegeneration 1: Veränderungen der Struktur, ohne sichtbaren Neuronenverlust 2: 20% bis 50% Neuronenverlust 3: über 50% Neuronenverlust *nur -4 mm Ebene **nur -3 mm Ebene

Bei 7 von 8 Tieren konnte Neurodegeneration im Hippokampus auf der ipsilateralen

Seite (rechts) beobachtet werden. Besonders stark betroffen waren die Regionen

CA3c und CA3a. In der CA1-Region konnte man ebenfalls Veränderungen sehen,

die jedoch nicht eindeutig als Neurodegeneration beschrieben werden konnten

(Score 1). Da es schwierig war, in 14 µm-dicken Schnitten die Hilus-Region zu

scoren, haben wir uns entschieden, in dieser Region nur zwischen Vorhandensein

und Nichtvorhandensein einer sichtbaren Neurodegeneration zu unterscheiden.

Neurodegeneration im Hilus konnte bei 6 von 8 Tieren auf der ipsilateralen Seite

detektiert werden. Auf der kontralateralen Seite (links) konnte in keiner Region

Neurodegeneration beobachtet werden. Lediglich in der CA1-Region gab es

Veränderungen, jedoch keine offensichtliche Neurodegeneration (Score 1).

Ergebnisse

82

Zusammenfassend kann man sagen, dass die Kainsäure-Mikroinjektion zu

deutlichen Neuronenverlusten in der ipsilateralen CA3-Region des Hippokampus

führte (siehe Abbildung 23).

A MR 133; -3.24 mm B MR 133; -3.24 mm

C MR 132; -4.08 mm D MR 132; -4.08 mm

Abb. 23 (A-D): Neurodegeneration im Hippokampus 40 Wochen nach Kainsäure- Mikroinjektion in 14 µm Thionin-Schnitten. Vergrößerung 25-fach, bzw. 100 fach (Ausschnitte). Skalierung 1000 µm, bzw. 250 µm (Ausschnitte) Kontralaterale Seite (A, C), keine sichtbare Neurodegeneration, diskrete morphologische Veränderungen in der CA1-Region, (C, Pfeil). Keine Neurodegeneration im Hilus (vergrößerte Ausschnitte). Ipsilaterale Seite (B, D). Sichtbare Neurodegeneration in der CA3a- und CA3c-Region (B, Pfeile), sowie im Hilus (B, Pfeil im Ausschnitt). Dispersion der Körnerzellschicht des Gyrus Dentatus (D, Pfeil).

Ergebnisse

83

5.2 Studie 2: Schwellenversuche im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell

5.2.1 Die SE-Induktion

Die Ergebnisse der SE-Induktion werden im Folgenden für beide SE-Modelle

getrennt beschrieben.

5.2.1.1 Die SE-Induktion und Latenzzeit im Pilokarpin-Modell

Die SE-Induktion

Für die SE-Induktion wurden insgesamt 41 Ratten verwendet. Bei 23 Tieren (56%)

konnte ein SE ausgelöst werden. Die mittlere Pilokarpin-Dosis lag bei 37 mg/kg, die

mittlere Zeit zum SE-Eintritt betrug 103 Minuten. Eine Ratte starb im SE. Während

des SE kam es zu limbischer Krampfaktivität, die sich im Verhalten durch

Stereotypien (Kaubewegungen, Blinzeln, Speicheln, verminderte Ansprechbarkeit

etc.) äußerte. Die limbische Krampfaktivität wurde von sehr häufigen generalisierten

Anfällen begleitet. Im Vergleich zu einem durch fokale Kainsäure-Mikroinjektion

induzierten SE zeigten die Tiere deutlich mehr generalisierte tonisch-klonische

Krampfaktivität. Es war somit möglich, den SE nur am Verhalten des Tieres, ohne

EEG-Ableitung festzumachen, wohingegen der SE nach Kainsäure-Mikroinjektion

hauptsächlich am charakteristischen EEG-Bild bestimmt wurde. Die Tiere der

zweiten und dritten Pilokarpin-Gruppe, sowie die Pilokarpin-Latenzzeit-Tiere, wurden

während der SE-Induktion EEG- und videoüberwacht. Im EEG konnten

hochfrequente paroxysmale Veränderungen beobachtet werden. Der SE wurde nach

90 min mittels Diazepam abgebrochen (siehe Kapitel 4.3.1). Der Abbruch mittels

Diazepam konnte den SE nicht zuverlässig unterbrechen. In der Nacht nach SE kam

es bei den Tieren zu erneuter Krampfaktivität.

Die Latenzzeit im Pilokarpin-Modell

In diesem Versuch wurden 6 SE-Ratten ohne PTZ-Schwellenbestimmung und 4 SE-

Ratten mit wiederholter PTZ-Schwellenbestimmung verwendet.

Ergebnisse

84

Die Tiere wurden bis zu 4 Wochen nach SE kontinuierlich überwacht. Anfälle, die

während der ersten 3 Tage nach SE auftraten, wurden als insultassoziiert betrachtet

und gingen nicht in die Latenzzeit-Bestimmung mit ein. Zwei Ratten hatten

insultassoziierte Anfälle. Die Latenzzeit zum Auftreten der ersten spontanen Anfälle

(siehe Abbildung 24 und Tabelle 14) lag bei den SE-Tieren durchschnittlich bei 7,3 ±

0,62 Tagen und reichte von 6 bis 10 Tagen. Bei den PTZ-Tieren lag die Latenzzeit

bei zwei Tieren entsprechend bei 6 und 9 Tagen, die anderen beiden Ratten hatten

keine Anfälle während der Überwachungszeit (nicht abgebildet). Ob die verlängerte

Latenzzeit eine normale Variation darstellt, oder als Folge der PTZ-

Schwellenversuche zu sehen ist, müsste an einer repräsentativeren Tierzahl

untersucht werden. Der erste Anfall konnte sowohl fokal als auch generalisiert (Typ

IV oder V) sein. Die individuelle Latenzzeit ist für die einzelnen Tiere in

nachfolgender Tabelle abgebildet.

Tier Dauer der Überwachung nach SE Anfälle in den ersten drei Tagen nach SE

(insultassoziiert)

Erster spontaner Anfall

MR 106 22 Tage Nein 6 Tage nach SE


MR 110 15 Tage Ja 10 Tage nach SE


MR 113 17 Tage Ja 7 Tage nach SE


Tabelle 14: : Latenzzeit und Anfälle in den ersten 3 Tagen nach SE (insultassoziierte Anfälle) bei den Kontrolltieren der Latenz-Studie im Pilokarpin-Modell.

1 mV

5 s

Abb. 24: Typisches EEG-Muster eines spontanen, epileptischen Anfalls einer Pilokarpin-Ratte.

Ergebnisse

85

5.2.1.2 Die SE-Induktion im fokalen Kainsäure-Modell

Für die SE-Induktion wurden insgesamt 21 Ratten verwendet. Bei 20 Tieren (95%)

konnte durch Kainsäure-Mikroinjektion ein SE induziert werden. Dieser war

charakterisiert durch fokale Anfälle, stereotypes Schnüffeln, Kopfnicken, „Straub tail“,

verminderte Ansprechbarkeit, „Wet dog shakes“, Verharren. Diese Stereotypien und

Verhaltensänderungen waren von generalisierten tonisch-klonischen Anfällen

begleitet. Die EEG-Veränderungen waren wie in Kapitel 5.1.1 beschrieben. Die Zahl

der auszählbaren EEG-Anfälle während der Überwachung nach SE lag im Mittel bei

etwa 90 (92,05 ±8,8). Die Dauer der paroxysmalen EEG-Veränderungen variierte von

Tier zu Tier und lag im Schnitt bei 11,8 h (5,8-16,5 h). Die Veränderungen der

Basislinie (erhöhte Amplitude, Spikes), hielten länger an. Der SE endete spontan bei

allen Tieren. Eine Ratte, die während des SE extrem viele generalisierte Anfälle

hatte, starb 48 Stunden nach SE.

Der Diazepam-Vorversuch im Pilokarpin-Modell

In diesem Versuch sollte der Einfluss von Diazepam auf die PTZ-Krampfschwelle

untersucht werden. Da der SE im Pilokarpin-Modell durch Diazepam abgebrochen

wurde, war es wichtig, den Einfluss von Diazepam auf die individuelle

Krampfschwelle zu untersuchen. Dieser Versuch war nur für das Pilokarpin-Modell

wichtig, da im fokalen Kainsäure-Modell der SE nicht abgebrochen wurde. Zu diesem

Zeck wurde bei 8 naiven Ratten die PTZ-Krampfschwelle 48 h nach Diazepam-Gabe,

mittels PTZ-Infusionstest bestimmt. Die Diazepam-Dosis entsprach der Dosis, die

zum SE-Abbruch verwendet wurde (3 x 10 mg/kg). Die Krampfschwelle 48 h nach

Diazepam wurde mit der zuvor ermittelten Kontrollschwelle verglichen. Es gab keinen

signifikanten Unterschied zwischen Kontrollschwelle und post Diazepam-Schwelle,

p=0,2429 (siehe Abbildung 25). Aufgrund dieser Ergebnisse haben wir entschieden,

in weiteren Versuchen Diazepam zum SE-Abbruch zu verwenden, da dies keinen

Einfluss auf die PTZ-Schwelle 48 h nach SE hatte.

Ergebnisse

86

Abb. 25: Kein Enfluss von Diazepam (3x10 mg/kg) auf die PTZ-Schwelle bei naiven Tieren. Die Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt und wurden mittels gepaartem Student`s t-Test verglichen, Gruppengröße n=8.

Kontrollschwelle Nach Diazepam0

10

20

30

Kontrollschwelle versus Schwelle 48 h nach Diazepam p=0,2429

PT

Z [

mg

/kg

]

Ergebnisse

87

5.2.2 Der PTZ-Schwellentest

In diesem Test sollten die Veränderungen der Hirnerregbarkeit nach einem SE,

ermittelt als Veränderungen der individuellen PTZ-Krampfschwelle, untersucht

werden. Fünf Tage vor SE-Induktion wurde bei allen Tieren eine Kontrollschwelle

mittels PTZ-Infusionstest bestimmt (siehe Kapitel 4.6.4). Die Kontrollschwelle lag bei

den Tieren bei etwa 20 mg/kg. In der Pilokarpin-Gruppe lag die Kontrollschwelle bei

19,6 ± 0,49 mg/kg, in der Kainsäure-Gruppe bei 18,8 ± 0,43 mg/kg. Drei Tiere aus

der Pilokarpin-Gruppe starben nach der Kontrollschwellenbestimmung. Die Infusion

von PTZ wurde bei dem Auftreten des ersten Myoklonus gestoppt. Bei den meisten

Ratten kam es danach noch zu einem Klonus. Weitere Endpunkte nach dem

Myoklonus wurden durch ein Score-System erfasst (siehe Kapitel 4.6.4 Score I). Für

gewöhnlich zeigten die Tiere 3 bis 5 Minuten nach Schwellenbestimmung wieder

normales Verhalten. Verhaltensänderungen nach Ende der PTZ-Infusion wurden

durch ein Score-System erfasst (siehe Kapitel 4.6.4 Score II). Bei Tieren mit einer

EEG-Ableitelektrode wurden die Schwellenversuche unter EEG-Kontrolle

durchgeführt (siehe Abbildung 26). Der Myoklonus wurde von keinen spezifischen

EEG-Ereignissen begleitet und war weder bei der hippokampalen noch bei der

kortikalen Ableitung im EEG bzw. ECoG sichtbar (siehe Abbildung 26 A-E). Der auf

den Myoklonus folgende Klonus ging mit paroxysmalen EEG-Veränderungen einher

(siehe Abbildung 26). Das EEG-Bild zeigte ableitungsabhängig (kortikal versus

hippokampal) keine Unterschiede. Es gab auch keine Unterschiede im EEG-Bild

zwischen den SE-Tieren und Kontrollen (siehe Abbildung 26). Lediglich die Dauer

der EEG-Veränderungen war bei den SE-Tieren verlängert (siehe Abbildung 26).

Dies entspricht dem durch das Score-System II beschriebenen klinischen Bild.

Ergebnisse

88

1 mV

M K/V RBPTZ

10 s

1 mV

KM K/V M (für 17 min)

PTZ

10 s

RB

PTZ M K

VT

1 mV10 s

1 mV 10 s

PTZ M K

PTZ M K K/VRB

1 mV 10 s

A

B

C

D

E

Abb. 26 (A-E): EEG-Ableitung während einer PTZ-Schwellenbestimmung. Der Pfeil zeigt den Anfang der PTZ-Infusion. Abkürzungen: M – Myoklonus, K – Klonus, K/V – Klonus mit Verlust der Stellreflexe, VT – Vorderbeintonus, RB – Running and bouncing. Paroxysmale Veränderungen sind im EEG ab dem klonischen Anfall sichtbar. Dargestellt sind PTZ-Schwellenbestimmungen im Pilokarpin-Modell (A, B, C) und im fokalen Kainsäure-Modell (D, E). Kortikale Ableitung 5 Tage vor sham SE (A). Hippokampale Ableitung 4 Tage nach sham SE (B). Hippokampale Ableitung 2 Tage nach pilokarpin-induziertem SE (C). Hippokampale Ableitung 2 Tage nach sham SE (D). Hippokampale Ableitung 2 Tage nach kainsäure-induziertem SE (E).

Ergebnisse

89

5.2.2.1 Schwellenveränderungen nach SE im Pilokarpin-Modell

Der PTZ-Schwellentest wurde in dieser Studie an 3 Tiergruppen durchgeführt. Die

Ergebnisse aller Gruppen wurden kombiniert, um eine Gruppengröße zu erreichen,

die eine statistische Aussage zulässt. Es gab Unterschiede in der Zahl der

Schwellenbestimmungen in den einzelnen Tiergruppen. Die Schwellenbestimmung

erfolgte 2, 4, 6, 9, 14 und 22 Tage nach SE in der 1. Gruppe und 2, 6 und 14 Tage

nach SE in den beiden anderen Gruppen (siehe Kapiltel 4.6.1 Tabelle 5).

Veränderungen der Krampfschwelle in der Kontrollgruppe

Bei den Kontrollen mit sham SE (n=18) stieg die individuelle Krampfschwelle nach

wiederholter Durchführung. Die dritte und sechste Schwelle war signifikant erhöht im

Vergleich zur Kontrollschwelle (siehe Abbildung 27 A). Auch weitere Endpunkte

während der Infusion (siehe Score I) und das Verhalten nach PTZ-Infusion (siehe

Score II) änderten sich nach wiederholter Krampfschwellenbestimmung (siehe

Abbildung 28). Die Ratten zeigten schwerere Anfälle (mehr weitere Endpunkte) im

Anschluss an die PTZ-Infusion, die nach dem ersten Myoklonus gestoppt wurde. Für

gewöhnlich folgte auf den Myoklonus ein Klonus. Nach der fünften und sechsten

Schwellenbestimmung traten vermehrt Anfälle mit Verlust der Stellreflexe, „Running

and bouncing“ und Vorderbeintonus auf (siehe Abbildung 28 A). Es traten auch

Veränderungen im Verhalten nach Ende der PTZ-Infusion auf. Ab der vierten

Schwellenbestimmung zeigten die Ratten Myoklonien nach Ende der PTZ-Infusion,

dieser Unterschied wurde nach der fünften Schwellenbestimmung signifikant (siehe

Abbildung 28 D). Diese Veränderungen sind womöglich eine Reaktion auf die

wiederholte PTZ-Infusion in kurzen Zeitabständen. Eine Kontrollratte starb nach der

zweiten Krampfschwellenbestimmung.

Veränderungen der Krampfschwelle in der SE-Gruppe

In der SE-Gruppe (n=15) gab es keine Veränderungen der Krampfschwelle, wenn die

Ergebnisse mit einer Varianzanalyse untersucht wurden. In der Varianzanalyse gab

es einen Trend (p=0,95). Daraufhin haben wir einen direkten Vergleich der Schwelle

2 Tage nach SE mit der Kontrollschwelle mittels Student`s t-Test durchgeführt. Wenn

man die 2-Tage-Schwelle gegen die Kontrollschwelle testete, so war sie signifikant

Ergebnisse

90

niedriger (p=0,0183) (siehe Abbildung 27 B). Die gesteigerte Empfindlichkeit

gegenüber PTZ drückte sich nicht nur in einer gesenkten Krampfschwelle aus, die

SE-Tiere zeigten nach der PTZ-Infusion deutliche Verhaltensänderungen. Während

bei den Kontrolltieren erst nach wiederholter PTZ-Infusion Verhaltensänderungen

auftraten, hatten die Pilokarpin-Ratten ab der ersten Schwellenbestimmung nach SE

(nach 2 Tagen) deutliche Verhaltensänderungen (Myoklonien, generalisierte Anfälle,

Stereotypien etc.), die bis zu 1 Stunde nach Infusion anhielten (siehe Abbildung 28

E). Die Schwere der Anfälle im Anschluss an die PTZ-Infusion (weitere Endpunkte

Score I) änderte sich im Gegensatz zu den Kontrolltieren nicht (siehe Abbildung 28

B). Wenn man die Pilokarpin-Tiere mit den Kontrollen vergleicht, so ist die

Krampfschwelle bei den post SE-Tieren zu allen Zeitpunkten signifikant niedriger als

bei den Kontrolltieren, obwohl es keinen Unterschied in der Kontrollschwelle (fünf

Tage vor SE) zwischen den beiden Gruppen gab (siehe Abbildung 27 C). Da PTZ

seinen Wirkungsort am GABAA-Rezeptor hat, lassen die Ergebnisse auf

Veränderungen des GABAergen Systems nach einem pilokarpin-induzierten SE

schließen. Die Ratten, die trotz Pilokarpin-Gabe keinen SE hatten, wurden vom

Versuch ausgeschlossen.

5.2.2.2 Schwellenveränderungen nach SE im fokalen Kainsäure-Modell

Der PTZ-Schwellentest wurde in dieser Studie an einer Tiergruppe durchgeführt. Die

Schwellenbestimmung erfolgte 2, 4, 6, 9, 14 und 22 Tage nach SE. Keine der Ratten

starb während oder nach einem PTZ-Schwellentest.

Veränderungen der Krampfschwelle in der Kontrollgruppe

Die individuelle Krampfschwelle blieb bei den Kontrollratten (n=15) über den

gesamten Zeitraum unverändert im Vergleich zur Kontrollschwelle (siehe Abbildung

29 A).

Was die Schwere der Anfälle nach PTZ-Infusion betrifft (weitere Endpunkte Score I),

so hatten die Tiere nach der letzten Schwellenbestimmung tendenziell häufiger

Klonus mit Verlust der Stellreflexe, „Running and bouncing“ und Vorderbeintonus im

Vergleich zur Kontrollschwelle, was jedoch durch die große Streuung der Daten nicht

signifikant war (siehe Abbildung 30 A). Nach sieben Schwellenbestimmungen kam es

Ergebnisse

91

bei den Kontrolltieren zu Verhaltensänderungen (Myoklonien, siehe Score II), die

nach dem letzten PTZ-Schwellentest signifikant wurden (siehe Abbildung 31 A).

Veränderungen der Krampfschwelle in der SE-Gruppe

Die individuelle Krampfschwelle war bei den SE-Tieren (n=19) an Tag 2, 9 und 22

post SE signifikant niedriger im Vergleich zur Kontrollschwelle (siehe Abbildung 29

B). Wenn man die SE-Tiere direkt mit den Kontrollen vergleicht, so haben die SE-

Tiere zu fast allen Zeitpunkten eine signifikant niedrigere Krampfschwelle. Die

einzige Ausnahme ist die Schwelle 6 Tage nach SE (siehe Abbildung 29 C). Die

Schwere der Anfälle nach PTZ-Infusion war am Tag 4 nach SE signifikant niedriger

im Vergleich zur Kontrollschwelle (siehe Abbildung 30 B). Ansonsten variierte sie

nicht signifikant von Schwellenbestimmung zu Schwellenbestimmung. Im direkten

Vergleich beider Gruppen sieht man ebenfalls, ausser bei der Schwelle 4 Tage nach

SE, keine Unterschiede (siehe Abbildung 30 C). Im Gegensatz zu den Kontrolltieren,

die für gewöhnlich 3 bis 5 Minuten nach Versuchsende wieder Normalverhalten

zeigten, kam es in der SE-Gruppe zu Verhaltensänderungen nach Infusion. Das

Verhalten nach Ende der PTZ-Infusion (Score II) war bereits 2 Tage nach SE stark

verändert. Die Tiere zeigten Myoklonien, verminderte Ansprechbarkeit und

Stereotypien, die bei einigen Tieren, ähnlich wie in der Pilokarpin-Gruppe, bis zu 1

Stunde nach Versuchsende anhielten (siehe Abbildung 31 B). Im direkten Vergleich

zeigen die SE-Tiere 2 und 6 Tage nach SE signifikant stärkere

Verhaltensänderungen im Vergleich zu Kontrollen (siehe Abbildung 31 C).

5.2.3 Vergleich beider SE-Modelle

Sowohl im Pilokarpin-Modell als auch im fokalen Kainsäure-Modell sank die PTZ-

Schwelle 2 Tage nach SE. Dieser Effekt war bei den Pilokarpin-Tieren nur im

direkten Vergleich zwischen der Kontrollschwelle und der 2-Tages Schwelle sichtbar,

was vermutlich daran lag, dass diese Gruppe sich aus drei kleineren

zusammensetzte, was die Streuung innerhalb der Gruppe erhöhte. Dass dieser

Effekt jedoch robust war, zeigte sich im Kainsäure-Modell, in dem es ebenfalls zu

einer Senkung der PTZ-Schwelle 2 Tage nach SE kam. Im direkten Vergleich beider

Gruppen gab es nur an Tag 4 nach SE signifikante Unterschiede zwischen den

Ergebnisse

92

Gruppen. Zu diesem Zeitpunkt war die PTZ-Schwelle deutlich niedriger bei den

Kainsäure-Ratten im Vergleich zur Pilokarpin-Gruppe (siehe Abbildung 32).

5.2.4 Einfluss des ovariellen Zyklusstandes auf die PTZ-Schwelle

Der Zyklusstand wurde mittels Vaginalabstrichen anhand des Zellbildes

lichtmikroskopisch bestimmt. Diese Untersuchungen wurden ausschließlich in der

fokalen Kainsäure-Gruppe durchgeführt. Die weiblichen Ratten wurden ohne

männliche Ratten gehalten, was dazu führte, dass ihr Zyklus nicht synchron war.

Viele Tiere (26 von 31) hatten keinen regelmäßigen Zyklus. Es konnte kein

Zusammenhang zwischen Zyklusstand und Höhe der PTZ-Schwelle festgestellt

werden, so dass ein hormoneller Einfluss auf die PTZ-Schwelle nicht anzunehmen

ist.

Ergebnisse

93

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

10

20

30

* *

PTZ-Schwelle Kontrollen

PTZ [

mg/k

g]

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

10

20

30

*

PTZ-Schwelle Pilokarpin-Tiere

PTZ [

mg/k

g]

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

10

20

30

#

# ## #

#

PTZ-SchwelleKontrollen versus Pilokarpin-Tiere

PTZ [

mg/k

g]

A

B

C

Kontrollen

Pilokarpin-Tiere

Abb. 27 (A-C): PTZ-Schwellenveränderungen, ausgedrückt in mg/kg, im Pilokarpin-Modell im Zeitverlauf. Dargestellt sind Schwellenveränderungen bei Kontrolltieren (A) und Pilokarpin-Tieren (B) in Relation zur Kontrollschwelle, sowie ein Vergleich beider Gruppen (C). Signifikante Unterschiede in Bezug auf die Kontrollschwelle (-5) werden durch einen Stern * angezeigt. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen werden durch eine Raute # angezeigt. Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt. Die Ergebnisse der Kontrolltiere wurden mithilfe einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) und dem Bonferroni-Test als post hoc-Test verglichen. Die Ergebnisse der Pilokarpin-Tiere wurden mittels Student`s t-Test verglichen (Kontrollschwelle mit 2-Tages Schwelle). Der Vergleich beider Gruppen erfolgte mittels Student`s t-Test. Gruppengrößen: Kontrollen n=18, Pilokarpin-Tiere n=15.

Ergebnisse

94

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

1

2

3

4 **

Sc

ore

I

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

1

2

3

4

*

Sc

ore

II

-5 2 4 6 9 14 220

1

2

3

4

Sc

ore

I

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

1

2

3

4

* * * *

Sc

ore

II

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

1

2

3

4

Sc

ore

I

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

1

2

3

4

# # #

Sc

ore

II

A

B

C

D

E

F

PTZ-Verhaltensänderungen Kontrollen

PTZ-Verhaltensänderungen Pilokarpin-Tiere

PTZ-Verhaltensänderungen Kontrollen versus

Pilokarpin-Tiere

Kontrollen

Pilokarpin-Tiere

Abb. 28 (A-F): Zusammengefasste Verhaltensänderungen nach PTZ-Infusion (Score I in A, B, C und Score II in D, E, F) im Pilokarpin-Modell. Score I beschreibt die weiteren Endpunkte nach PTZ-Infusion. Score II beschreibt Verhaltensänderungen nach Ende der PTZ-Infusion. Dargestellt sind Verhaltensänderungen der Kontrollen (A, D), der Pilokarpin-Tiere (B, E), sowie ein Vergleich beider Gruppen (C, F). Signifikante Unterschiede in Bezug auf die Kontrollschwelle (-5) werden durch einen Stern * angezeigt. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen werden durch eine Raute # angezeigt. Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt. Die Ergebnisse wurden mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse für nichtparametrische Daten (Kruskal Wallis-Test) und dem Dunn`s-Test als post hoc-Test verglichen. Der Vergleich beider Gruppen erfolgte mittels Mann Whitney-U-Test. Gruppengrößen: Kontrollen n=18, Pilokarpin-Tiere n=15.

Ergebnisse

95

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

10

20

30

13 14 15 13 15 15 15

PTZ-Schwelle Kontrollen

PTZ [

mg/k

g]

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

10

20

30

* * *

18 19 18 1719 19 19

PTZ-Schwelle Kainsäure-Tiere

PTZ [

mg/k

g]

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

10

20

30

## #

# #

PTZ-Schwelle VergleichKontrollen versus Kainsäure-Tiere

PTZ [

mg/k

g]

A

B

C

Kontrollen

Kainsäure-Tiere

Abb. 29: (A-C): PTZ-Schwellenveränderungen, ausgedrückt in mg/kg, im fokalen Kainsäure-Modell im Zeitverlauf. Dargestellt sind Schwellenveränderungen der Kontrolltiere (A) und Kainsäure-Tiere (B) in Relation zur Kontrollschwelle, sowie ein Vergleich beider Gruppen (C). Signifikante Unterschiede in Bezug auf die Kontrollschwelle (-5) werden durch einen Stern * angezeigt. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen werden durch eine Raute # angezeigt. Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt. Die Ergebnisse wurden mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse (ANOVA) und dem Bonferroni-Test als post hoc-Test verglichen. Der Vergleich beider Gruppen erfolgte mittels Student`s t-Test. Gruppengrößen: Kontrollen n=15, Kainsäure-Tiere n=19.

Ergebnisse

96

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

1

2

3

4


Sc

ore

I

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

1

2

3

4

*

PTZ-Verhaltensänderungen Kainsäure-Tiere

Sc

ore

I

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

1

2

3

4

#

PTZ-VerhaltensänderungenKontrollen versus Kainsäure-Tiere

Sc

ore

I

A

B

C

Kontrollen

Kainsäure-Tiere

Abb. 30 (A--C): Weitere Endpunkte nach PTZ-Schwellentest, ausgedrückt durch ein Score-System (Score I) im fokalen Kainsäure-Modell im Zeitverlauf. Dargestellt sind weitere Endpunkte der Kontrolltiere (A) und der Kainsäure-Tiere (B), sowie ein Vergleich beider Gruppen (C). Signifikante Unterschiede in Bezug auf die Kontrollschwelle (-5) werden durch einen Stern * angezeigt. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen werden durch eine Raute # angezeigt. Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt. Die Ergebnisse wurden mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse für nichtparametrische Daten (Kruskal Wallis-Test) und dem Dunn`s-Test als post hoc-Test verglichen. Der Vergleich beider Gruppen erfolgte mittels Mann Whitney-U-Test. Gruppengrößen: Kontrollen n=15, Kainsäure-Tiere n=19.

Ergebnisse

97

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

1

2

3

4

*


Sc

ore

II

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

1

2

3

4

**

** *

PTZ-Verhaltensänderungen Kainsäure-Tiere

Sc

ore

II

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

1

2

3

4

##

PTZ-VerhaltensänderungenKontrollen versus Kainsäure-Tiere

Sc

ore

II

A

B

C

Kontrollen

Kainsäure-Tiere

Abb. 31(A-C): Verhaltensänderungen nach Ende des PTZ-Schwellentests, ausgedrückt durch ein Score-System (Score II), im fokalen Kainsäure-Modell im Zeitverlauf. Dargstellt sind die Verhaltensänderungen der Kontrolltiere (A) und der Kainsäure-Tiere (B), sowie ein Vergleich beider Gruppen (C). Signifikante Unterschiede in Bezug auf die Kontrollschwelle (-5) werden durch einen Stern * angezeigt. Signifikante Unterschiede zwischen den Gruppen werden durch eine Raute # angezeigt. Alle Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt. Die Ergebnisse wurden mithilfe einer einseitigen Varianzanalyse für nichtparametrische Daten (Kruskal Wallis-Test) und dem Dunn`s-Test als post hoc-Test verglichen. Der Vergleich beider Gruppen erfolgte mittels Mann Whitney-Test. Gruppengrößen: Kontrollen n=15, Kainsäure-Tiere n=19.

Ergebnisse

98

5.3 Studie 3: Infusionsversuche mit PTZ im Pilokarpin- und fokalen Kainsäure-Modell

5.3.1 Pharmakokinetische Vorversuche

Um ein Infusionsprotokoll für PTZ zu etablieren, wurden pharmakokinetische

Versuche durchgeführt. Wichtig am Infusionsprotokoll war die Aufrechterhaltung

einer konstanten PTZ-Konzentration im Plasma, die jedoch über die gesamte

Behandlungsdauer im subkonvulsiven Bereich bleiben sollte. Zum einen wurde die

PTZ-Plasmahalbwertszeit bestimmt. Zum anderen sollte der Zusammenhang

zwischen individueller PTZ-Krampfschwelle [mg/kg] und dazugehöriger PTZ-

Plasmakonzentration [µg/ml] untersucht werden. Des Weiteren wurden die beiden

errechneten Infusionsdosen von 15 und 60 µg/kg/min auf Nebenwirkungen und

Erreichen der Zielplasmakonzentration untersucht.

5.3.1.1 Bestimmung der Plasmahalbwertszeit von PTZ

Die Bestimmung der PTZ-Plasmahalbwertszeit wurde an 4 Tieren durchgeführt, an 2

naiven Ratten und an 2 Ratten 24 h nach pilokarpin-induziertem SE.

-5 +2 +4 +6 +9 +14 +220

10

20

30

# Pilokarpin-Tiere

Kainsäure-Tiere

PTZ-Schwelle ModellvergleichP

TZ [

mg/k

g]

Abb. 32 : : Vergleich der PTZ-Schwelle, ausgedrückt in mg/kg, in beiden SE-Modellen im Zeitverlauf (siehe Legende). Signifikante Unterschiede werden durch eine Raute # angezeigt. Die Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt und wurden mittels Student`s t-Test verglichen. Gruppengrößen: Kainsäure-Tiere n=19, Pilokarpin-Tiere n=15.

Ergebnisse

99

Alle Ratten erhielten eine intravenöse Applikation von 12 mg/kg PTZ. Nach 15 min, 1

h, 2 h und 4 h wurde bei den Tieren retrobulbär Blut entnommen und die PTZ-

Plasmakonzentration wurde mittels HPLC bestimmt. Die Ergebnisse sind in

nachfolgender Tabelle und Abbildung 33 dargestellt. Bei einem Tier (MR 144) war

der PTZ-Plasmaspiegel von Anfang an sehr niedrig, was vermutlich auf eine

paravenöse Injektion zurückzuführen ist. Die mittels PK Solutions Software

errechnete mittlere PTZ-Halbwertszeit lag bei 3,3 h (Daten aller Tiere als Mittelwert).

0 1 2 3 40

5

10

15

naive Tiere n=2

SE-Tiere n=2

PTZ-Plasmahalbwertszeit

Zeit [h]

PT

Z [

µg

/m

l]

Abb. 33: PTZ-Plasmaspiegel [µg/ml] im Zeitverlauf, als Rechtecke dargestellt naive Tiere, als Kreise dargestellt post SE-Tiere (siehe Legende).

Tier PTZ [µg/ml]

0,25 h

PTZ [µg/ml]

1 h

PTZ [µg/ml]

2 h

PTZ [µg/ml]

4 h

Halbwertszeit

[h]

MR 105 11,41 10,57 5.94 4,45 2,59

MR 108 13,03 12,14 9,14 3,07 1,73

MR 151 post SE-Tier

11,48 11,22 10,13 7,4 5,69

MR 144 post SE-Tier

7,02 3,89 3,03 2,78 3,22

Tabelle 15: PTZ-Halbwertszeit der einzelnen Tiere nach 12 mg/kg PTZ Injektion i.v.. Die ermittelten Plasmaspiegel sind in µg/ml Plasma angegeben.

Ergebnisse

100

5.3.1.2 Korrelation zwischen konvulsiver PTZ-Dosis und dem Plasmaspiegel

Um den Zusammenhang zwischen konvulsiver PTZ-Dosis und dem dazugehörigen

Plasmaspiegel zu erfassen, haben wir den PTZ-Schwellentest durchgeführt und

direkt nach dem Krampf (Myoklonus) PTZ-Plasmaspiegel bestimmt. Der PTZ-

Schwellentest wurde wie in Kapitel 4.6.4 beschrieben durchgeführt. Direkt nach dem

Myoklonus wurde bei den Tieren retrobulbär Blut entnommen (unter Tetracain-

Lokalanästhesie). Der PTZ-Gehalt der Plasmaproben wurde mittels HPLC analysiert.

Der Versuch wurde an 2 naiven Ratten und 2 Ratten 24 h nach pilokarpin-

induziertem SE durchgeführt. Die Plasmaspiegel [µg/ml] waren hochsignifikant mit

der errechneten PTZ-Schwelle [mg/kg] korreliert, Korrelationskoeffizient r=0,9831

(p=0,0085). Es gab keinen Unterschied zwischen den naiven- und den post SE-

Tieren. Da die niedrigste konvulsive Dosis bei 14 mg/kg lag und diese mit einem

Plasmaspiegel von 18 µg/ml korrelierte, haben wir uns entschlossen in den

Infunsionsversuchen eine Plasmakonzentration von 10 µg PTZ pro ml Plasma

anzustreben. Das Ziel war, einen Plasmaspiegel aufrechtzuerhalten, der im

subkonvulsiven Bereich liegt.

Abb. 34: Darstellung der konvulsiven PTZ-Dosis [mg/kg] in Verhältnis zur PTZ- Plasmakonzentration [µg/ml]. Dargestellt die Tiere 24 h nach pilokarpin-induziertem SE, und naive Tiere (siehe Legende). Die Korrelation wurde mittels Pearson`s–Korrelationstest ermitelt.

0 10 20 30 400

10

20

30

40

PTZ-Schwelle versus Plasmaspiegel

SE-Tiere

naive Tiere

PTZ im Plasma [µg/ml]

PT

Z [

mg

/kg

]

Ergebnisse

101

5.3.1.3 Etablierung des Infusionsprotokolls

Als subkonvulsive PTZ-Plasmakonzentration haben wir anhand der PTZ-

Schwellenversuche und der pharmakokinetischen Vorversuche PTZ-Plasmaspiegel

von 10 µg/ml festgelegt. Um diese Plasmakonzentration aufrechtzuerhalten, haben

die Ratten (n=3) der ersten Behandlungsgruppe einen Bolus von 10 mg/kg und zur

Aufrechterhaltung eine Infusion von 15 µg/kg/min erhalten. Vierundzwanzig und 48

Stunden nach Infusionsbeginn wurde bei den Tieren retrobulbär Blut entnommen und

der PTZ-Plasmaspiegel mittels HPLC analysiert. Die PTZ-Plasmaspiegel sind in

nachfolgender Tabelle dargestellt. Da die Zielkonzentration von PTZ im Plasma nicht

erreicht werden konnte, wurde in der nächsten Tiergruppe (n=2) das

Infusionsprotokoll auf 60 µg/kg/min umgestellt. Bei beiden Tieren lag die ermittelte

Plasmakonzentration im Bereich der Zielplasmakonzentration (siehe Tabelle 17).

Tier PTZ [µg/ml] nach 24 h PTZ [µg/ml] nach 48 h

MR 138 2,48 -

MR 139 1,75 3,11

BUM 36 1,63 1,15

Tabelle 16: PTZ-Plasmakonzentrationen 24 h und 48 h nach Infusion von 15 µg/kg/min PTZ. Ein leeres Feld bedeutet, dass keine Blutprobe entnommen werden konnte.

Tier PTZ [µg/ml] nach 24 h PTZ [µg/ml] nach 48 h

MR 156 8,38 9,53

MR 157 7,18 10,23

Tabelle 17: PTZ-Plasmakonzentrationen 24 h und 48 h nach Infusion von 60 µg/kg/min PTZ.

Weder in der 15 µg-Gruppe, noch in der 60 µg-Gruppe kam es bei den naiven Ratten

zu PTZ-induzierten Nebenwirkungen. Aus diesem Grund haben wir uns

entschlossen, das zweite Infusionsprotokoll in allen weiteren Versuchen zu

verwenden.

Ergebnisse

102

5.3.2 Infusionsversuche mit PTZ im Pilokarpin-Modell (60 Minuten SE-Gruppe)

5.3.2.1 SE-Induktion

In diesem Versuch konnte der SE bei 6 von 6 Ratten induziert werden. Wie bereits in

Kapitel 5.2.1.1 beschrieben hatten die Tiere während des SE generalisierte Anfälle,

die mit stereotypem Verhalten einhergingen. Die mittlere Pilokarpin-Dosis lag bei

46,7 mg/kg, die mittlere Zeit zum SE-Eintritt betrug 73,8 Minuten. Eine Ratte starb an

Atemdepression nach SE-Abbruch, so dass nur 5 Tiere in den weiteren Versuchen

dieser Studie verwendet wurden. Durch den modifizierten SE-Abbruch gelang es, die

motorische Krampfaktivität und paroxysmale EEG-Veränderungen effektiv zu

unterdrücken (siehe Kapitel 4.7.5.1).

5.3.2.2 PTZ-Behandlung

Die PTZ-Behandlung erfolgte durch intravenöse Infusion. Bei den Tieren konnten

während der gesamten Behandlungsdauer keine generalisierten Anfälle beobachtet

werden. Zwei der 5 Tiere hatten Myoklonien (über ~ 10 min) 20 bzw. 25 h nach

Beginn der Infusion. Die Zielplasmakonzentration konnte bei allen Tieren erreicht

werden.

5.3.2.3 Entwicklung von spontanen Anfällen nach PTZ-Behandlung

Insgesamt wurden 7 Tiere mit PTZ behandelt, zwei naive Tiere (MR 156 und MR

157 aus den Kinetik-Versuchen) ohne SE und 5 SE-Tiere (MR 154, MR 158, MR

159, MR 161, MR 162). Von den 5 SE-Tieren wurden 3 Tiere (MR 159, MR 161, MR

162) 4 und 7 Wochen nach der Behandlung EEG- und videoüberwacht. Die anderen

2 SE-Tiere (MR 154 und MR 158) und die 2 naiven Tiere (MR 156 und MR 157 aus

den Kinetik-Versuchen) wurden 8 Wochen nach Behandlung überwacht. Die

unterschiedlichen Überwachungszeitpunkte kommen infolge der Verfügbarkeit der

Überwachungsplätze aus organisatorischen Gründen zustande. Die

Überwachungsdauer betrug jeweils 1 Woche. Die naiven Ratten (n=2) hatten keine

Anfälle. Das lässt darauf schließen, dass die alleinige Behandlung mit PTZ nicht

proepileptogen wirkte.

Ergebnisse

103

Von den 5 Ratten mit SE hatte nur eine (MR 161) Anfälle während der Überwachung

(3 Anfälle pro Woche, 4 Wochen nach Behandlung und 11 Anfälle pro Woche, 7

Wochen nach Behandlung). Alle anderen Tiere blieben anfallsfrei. Dieser Effekt ist

jedoch nicht auf die PTZ-Behandlung zurückzuführen, da Tiere aus anderen

Projekten, die nach dem 60 min SE-Protokoll behandelt wurden, ebenfalls keine

Epilepsie entwickelten (1 von 10 Tieren hatte 40 Wochen nach SE fokale Anfälle).

Aus diesem Grund war anzunehmen, dass ein SE von 60 Minuten kein ausreichend

starker Insult war, um spontane Anfälle auszulösen. Nach diesen Experimenten

haben wir uns entschlossen, die SE-Dauer auf 90 Minuten zu erhöhen und die

Versuche mit einem modifizierten Protokoll zu wiederholen.

5.3.3 Infusionsversuche mit PTZ im Pilokarpin-Modell (90 Minuten SE-Gruppe)


In diesem Versuch konnte der SE bei 8 von 9 Ratten induziert werden (88,9%). Wie

bereits in Kapitel 4.3.1 beschrieben, hatten die Tiere während des SE generalisierte

Anfälle, die mit stereotypem Verhalten einhergingen. Die mittlere Pilokarpin-Dosis lag

bei 43,75 mg/kg, die mittlere Zeit zum SE-Eintritt betrug 61,75 Minuten. Eine Ratte

starb nach SE-Abbruch, so dass nur 7 Tiere in den weiteren Versuchen dieser Studie

verwendet wurden.


Die PTZ-Behandlung erfolgte auch hier durch intravenöse Infusion. Pro

Versuchsdurchlauf konnten maximal 8 Ratten gleichzeitig behandelt werden. Die

Tiere wurden in zwei Behandlungsgruppen eingeteilt: SE+PTZ (n=4) und SE+Saline

(n=3). Es traten keine generalisierten Anfälle während der Infusion auf. Ein Tier hatte

einen generalisierten Anfall (Typ IV) während der Blutentnahme nach Ende der

Behandlung. Die Zielplasmakonzentration konnte bei 3 von 4 PTZ-Ratten (eine Ratte

zog sich den Katheter vor Ende der Behandlung) erreicht werden. Eine der

Kontrollratten hatte PTZ im Plasma, was vermutlich auf einer Verwechslung der

Infusionssysteme beruhte. Beide Tiere wurden von der Auswertung ausgeschlossen.

Ergebnisse

104


Die Ratten wurden 8 Wochen nach Behandlung mittels EEG und Video überwacht.

Alle mit PTZ behandelten Tiere hatten Anfälle während der Überwachung

(durchschnittlich 6 pro Woche). Die Kontrolltiere (n=2) hatten keine Anfälle 8 Wochen

nach SE. Obwohl es sich um kleine Gruppengrößen handelt, schien die PTZ-

Behandlung eine eher prokonvulsive Wirkung zu haben. Da dieser Versuch eine

große Belastung für die Tiere darstellt, und es keine Hinweise auf eine

antiepileptogene Wirkung der PTZ-Behandlung gab, haben wir beschlossen die

Gruppen nicht weiter aufzufüllen. Bei den gegenwärtigen Ergebnissen sind weitere

Versuche zur statistischen Absicherung des Effekts aus Tierschutzgründen

abzulehnen. Bei Tieren aus anderen Projekten, die nach diesem SE-Protokoll

behandelt wurden, hatten 6 von 11 Tieren Anfälle 8 Wochen nach SE (66%).

Kontrollgruppe PTZ-Gruppe0

2

4

6

8

An

fälle/W

och

e

Ergebnisse der PTZ-Infusion im Pilokarpin-Modell

Abb. 35: Wöchentliche Anfallsfrequenz 8 Wochen nach PTZ-Behandlung. Aufgrund der kleinen Tierzahlen ist keine statistische Auswertung der Daten möglich, es wird jedoch ein prokonvulsiver Trend in der behandelten Gruppe erkennbar. Die Daten sind als Einzelwertdarstellung mit Mittelwert dargestellt. Kontrollen n=2, PTZ-Tiere n=3. Zur Gruppengröße siehe Erklärung im Text und in Kapitel 4.7.2.

Ergebnisse

105

5.3.4 Infusionsversuche im fokalen Kainsäure-Modell (13-16 Stunden-Gruppe)


In diesem Versuch konnte der SE bei 6 von 6 Ratten induziert werden. Wie bereits

beschrieben zeigten die Tiere Stereotypien, welche von generalisierten Anfällen

begleitet wurden und mit paroxysmalen EEG-Veränderungen einhergingen. Die Zahl

und Dauer der auszählbaren EEG-Anfälle konnte bei diesen Tieren nicht bestimmt

werden, da zu vorgegebenen Zeitpunkten nach SE die PTZ-Behandlung erfolgte.


Die PTZ-Behandlung startete 13 h (n=1) oder 16 h (n=3) nach Kainsäure-

Mikroinjektion. Die PTZ-Behandlung erfolgte auch hier durch intravenöse Infusion.

Pro Versuchsdurchlauf konnten maximal 8 Ratten gleichzeitig behandelt werden. Alle

Tiere hatten Anfälle unter der PTZ-Infusion, 3 von 4 direkt nach Bolus-Applikation.

Ein Tier (MR 177) wurde nur 5 Stunden lang infundiert, weil danach der Katheter

beschädigt wurde. Da auch die beiden Kontrolltiere während des

Behandlungszeitraums Anfälle zeigten, haben wir beschlossen den Zeitpunkt der

Behandlung zu wechseln. Da Kontrollratten in diesem Zeitraum nach SE Anfälle

hatten, ist es nicht auszuschließen, dass ein Teil der beobachteten Anfälle SE-

induziert war, und PTZ-unabhängig auftrat. Eine Behandlung 13-16 h nach

Kainsäure-Mikroinjektion konnte bei einigen Tieren in die SE-Dauer fallen und diesen

verstärken. Da der SE nicht abgebrochen wurde und die SE-Dauer von Tier zu Tier

variierte, war es schwierig einen SE-nahen Behandlungszeitpunkt festzulegen. Aus

diesem Grund wurde im nächsten Versuch eine Behandlung 7 Tage nach SE

vorgenommen.


Alle Tiere wurden 8 Wochen nach PTZ-Behandlung EEG- und videoüberwacht. Die

Tiere, die keine Anfälle 8 Wochen nach Behandlung zeigten, wurden nach 12

Wochen erneut überwacht. Die Dauer der Überwachung betrug jeweils eine Woche.

Ergebnisse

106

Acht Wochen nach Behandlung hatten 3 von 4 behandelten Tieren und 1 von 2

Kontrollen Anfälle. Nach 12 Wochen waren es dann 4 von 4 behandelten Tieren und

1 von 2 Kontrollen. Da dieser Versuch eine große Belastung für die Tiere darstellt,

und es keine Hinweise auf eine antiepileptogene Wirkung der PTZ-Behandlung gab,

haben wir beschlossen die Gruppen nicht weiter aufzufüllen. Bei den gegenwärtigen

Ergebnissen sind weitere Versuche zur statistischen Absicherung des Effekts aus


5.3.5 Infusionsversuche im fokalen Kainsäure-Modell (7 Tage-Gruppe)


In diesem Versuch konnte der SE bei 7 von 7 Ratten induziert werden. Wie bereits

beschrieben, zeigten die Tiere Stereotypien, welche von generalisierten Anfällen

begleitet wurden und mit paroxysmalen EEG-Veränderungen einhergingen. Die Zahl

der auszählbaren EEG-Anfälle während der Überwachung nach SE lag im Mittel bei

etwa 70 (70,71 ± 8,6). Die Dauer der paroxysmalen EEG-Veränderungen variierte

von Tier zu Tier und lag im Schnitt bei 10 h (8 - 15,5 h).


5

10

15

20

Ergebnisse der PTZ-Infusion im fokalen Kainsäure-Modell I

An

fälle/W

och

e

Abb. 36: Wöchentliche Anfallsfrequenz 8 und 12 Wochen nach PTZ-Behandlung. Aufgrund der kleinen Tierzahlen ist keine statistische Auswertung der Daten möglich. Die Daten sind als Einzeldarstellung mit Mittelwert dargestellt. Kontrollen n=2, PTZ-Tiere n=4. Zur Gruppengröße siehe Erklärung im Text und in Kapitel 4.7.2.

Ergebnisse

107

Da die Tiere erst 7 Tage nach SE-Induktion behandelt werden sollten, wurden sie 4

Tage nach SE, EEG- und videoüberwacht. Drei von 7 Tieren entwickelten Anfälle in

den ersten 2 Tagen nach SE (siehe Tabelle 18). Diese Anfälle waren möglicherweise

insultassoziiert und auf die SE-Induktion zurückzuführen (siehe Kapitel 5.2.1.1).


Die PTZ-Behandlung startete in dieser Gruppe 7 Tage nach SE-Induktion. Die PTZ-

Behandlung erfolgte auch hier durch intravenöse Infusion. Pro Versuchsdurchlauf

konnten maximal 8 Ratten gleichzeitig behandelt werden.Vier von 5 behandelten

Tieren hatten Anfälle während der Infusion, 2 von ihnen unter Bolus-Gabe. Im

Vergleich dazu hatte 1 von 2 Kontrollratten (mit isotoner Natriumchloridlösung

infundiert) Anfälle in diesem Zeitraum (siehe Tabelle 18). Bei allen Tieren lag der

PTZ-Plasmaspiegel im angestrebten Bereich.

SE+PTZ-Tiere Anfälle während der PTZ-

Infusion

Anfälle in den ersten

48 h nach SE

(insultassoziiert)

MR 185 ja nein

MR 186 ja nein

MR 187 nein nein

MR 189 ja ja

MR 191 ja ja

SE+Saline-Tiere Anfälle während der NaCl-Infusion

Anfälle in den ersten 48 h nach SE

(insultassoziiert) MR 190 ja nein

MR 194 nein ja

Tabelle 18: Anfälle während der 48 h PTZ-Behandlung und Anfälle in den ersten 48 h nach SE (insultassoziierte Anfälle).


Alle Tiere wurden 8 Wochen nach PTZ-Behandlung EEG- und videoüberwacht. Die

Tiere, die keine Anfälle 8 Wochen nach Behandlung zeigten, wurden nach 16

Wochen erneut überwacht. Die Dauer der Überwachung betrug jeweils eine Woche.

Acht Wochen nach Behandlung hatten 3 von 5 behandelten Tieren und 1 von 2

Kontrollen Anfälle.

Ergebnisse

108

Nach 16 Wochen waren es dann 4 von 5 behandelten Tieren und 2 von 2 Kontrollen.

Da dieser Versuch eine große Belastung für die Tiere darstellt, und es keine

Hinweise auf eine antiepileptogene Wirkung der PTZ-Behandlung gab, haben wir

beschlossen die Gruppen nicht weiter aufzufüllen. Bei den gegenwärtigen

Ergebnissen sind weitere Versuche zur statistischen Absicherung des Effekts aus



5

10

15

20

Ergebnisse der PTZ-Infusion im fokalen Kainsäure-Modell II

An

fälle/W

och

e

Abb. 37 : Wöchentliche Anfallsfrequenz 8 und 16 Wochen nach PTZ-Behandlung. Aufgrund der kleinen Tierzahlen ist keine statistische Auswertung der Daten möglich. Die Daten sind als Einzelwertdarstellung mit Mittelwert dargestellt. Kontrollen n=2, PTZ-Tiere n=5. Zur Gruppengröße siehe Erklärung im Text und in Kapitel 4.7.2.

Ergebnisse

109

5.3.5.4 Gemeinsame Auswertung der Kainsäure-Gruppen

Insgesamt entwickelten, unabhängig vom Behandlungszeitpunkt, 8 von 9 PTZ-

behandelten Tieren spontane Anfälle im Vergleich zu 3 von 4 Kontrollen. Es ließen

sich keine Unterschiede in Bezug auf Anfallsschwere oder Anfallsfrequenz

feststellen.

Abb. 38: Wöchentliche Anfallsfrequenz nach PTZ-Behandlung, kombinierte Daten beider Gruppen. Es gibt keinen Unterschied zwischen Kontrollen und behandelten Tieren in der wöchentlichen Anfallsfrequenz. Die Daten sind als Mittelwert mit SEM dargestellt und wurden mittels Student`s t-Test verglichen.

.


5

10

15

20

n=4 n=9

Ergebnisse der PTZ-Infusionim fokalen Kainsäure-Modell I+II p=0,7673

An

fälle/W

och

e

6. Diskussion

6.1 Einleitung Im Rahmen dieser Arbeit sollte der Einsatz des prokonvulsiven GABAA-Rezeptor-

Antagonisten PTZ als Strategie zur Epilepsieprävention untersucht werden. Da es bis

heute keine Möglichkeit gibt, Risikopatienten präventiv zu behandeln, werden

dringend antiepileptogene Behandlungsmöglichkeiten gesucht. Die naheliegendste

Strategie wäre eine Behandlung mit antikonvulsiven Mitteln, es konnte jedoch für

eine Reihe dieser Stoffe gezeigt werden, dass sie kein antiepileptogenes Potential

haben (TEMKIN 2001 und 2009). Der Einsatz von prokonvulsiven Mitteln als

neuromodulatorische Strategie der Epilepsieprävention wird aufgrund von neuen

Studien immer häufiger diskutiert (ARMSTRONG et al. 2009). Aus diesem Grund

sollte auch in dieser Studie ein prokonvulsiver Stoff (PTZ) auf sein antiepileptogenes

Potential hin untersucht werden. Um das zu erreichen, wurden drei verschiedene

Studien durchgeführt. Da die Untersuchungen vergleichend in zwei

Epilepsiemodellen durchgeführt werden sollten, wurde zuerst das fokale Kainsäure-

Modell für unser Labor etabliert (Studie 1). Um Veränderungen der neuronalen

Erregbarkeit nach Insult zu untersuchen, wurden in der zweiten Studie

Veränderungen der individuellen Krampfschwelle nach SE untersucht (Studie 2). Als

letztes wurden pharmakokinetische Versuche vorgenommen, und es wurde ein

prophylaktischer Behandlungsversuch mit PTZ unternommen (Studie 3). Die

Ergebnisse werden im Folgenden einzeln für jede Studie diskutiert.

6.2 Studie 1: Etablierung des fokalen Kainsäure-Modells.

6.2.1 SE-Induktion

In dieser Studie gelang es uns, durch Kainsäure-Mikroinjektion an wachen,

freibeweglichen Ratten ein neues Modell für Temporallappenepilepsie für unser

Labor zu etablieren.

Diskussion

111

Die Kainsäure-Mikroinjektion führte bei allen Tieren zum Eintritt eines SE, was

übereinstimmt mit der Arbeit zum fokalen Kainsäure-Modell von RAEDT et al. (2009)

und einen Vorteil darstellt gegenüber dem systemischen Pilokarpin-Modell und

anderen Modellen (GLIEN et al. 2001, NISSINEN et al. 2000 NISSINEN und

PITKÄNEN 2007 FURTADO et al. 2011), in denen nicht bei allen behandelten Tieren

ein SE auslösbar ist. Wie bei RAEDT et al. (2009) korrelierte auch bei uns weder die

SE-Dauer noch die im EEG quantifizierten EEG-Veränderungen mit dem späteren

Auftreten von Anfällen oder der Anfallsfrequenz. Dadurch, dass es nur eine bipolare

Ableitelektrode im Hippokampus gab, so dass der Unterschied zwischen fokalen und

generalisierten Anfällen nicht bestimmt werden konnte, war die Messung von EEG-

Veränderungen auch nur begrenzt möglich. Aus diesem Grund kann man nicht

ausschliessen, dass es einen Zusammenhang gibt zwischen der Schwere des SE

und der späteren Anfallsausprägung, vielmehr ist anzunehmen, dass die SE-

Schwere nicht ausschließlich am ermittelten EEG-Bild festgemacht werden kann. In

einer Arbeit von BRANDT et al. (2003) konnte für das basolaterale Amygdala

Stimulations-Modell (elektrisches post SE-Epilepsiemodell) gezeigt werden, dass die

SE-Schwere von großer Bedeutung für die spätere Anfallsentwicklung ist. Die SE-

Schwere wurde anhand der auftretenden klinischen Anfälle bestimmt. Tiere mit

schwerstem SE, bei denen kontinuierlich generalisierte tonisch-klonische Anfälle

auftraten, entwickelten fast alle (> 90%) Anfälle. Im Vergleich dazu hatten nur etwa

30% der Tiere mit fokalen Anfällen während des SE auch später epileptische Anfälle.

Da in unserer Arbeit der SE nur im EEG aufgrund einer bipolaren Ableitelektrode im

Hippokampus und nicht im Verhalten beurteilt wurde, ist eine Korrelation zwischen

ausgewerteten SE-Parametern und späterer Anfallsausprägung nicht zu erwarten.

Ein weiterer Vorteil dieses Modells war die geringe Mortalität nach SE (insgesamt

starb in allen Versuchen nur eins von 42 Tieren nach SE) und die Tatsache, dass die

Ratten sich sehr schnell vom SE erholten und schon am nächsten Tag normale

Futteraufnahme zeigten. Das ist ein Unterschied zum systemischen Pilokarpin-

Modell sowohl in der hochdosierten Variante als auch im fraktionierten Modell

(GLIEN et al. 2001). Wie bei GLIEN et al. (2001) beschrieben, ist das hochdosierte

Pilokarpin-Modell durch eine hohe Mortalitätsrate charakterisiert. Diese lässt sich

durch die fraktionierte Pilokarpin-Gabe senken. Flüssigkeitssubstitution und

Zwangsernährung über mehrere Tage nach SE lassen sich jedoch nicht vermeiden.

Diskussion

112

Aus diesem Grund stellt das fokale Kainsäure-Modell eine vorteilhaftere Möglichkeit

der SE-Induktion dar, was das Wohlbefinden der Tiere nach SE betrifft. Analog zu

den Studien von BRAGIN et al. (1999, 2004 und 2007) und RAEDT et al. (2009)

wurde der SE in diesem Modell nicht pharmakologisch abgebrochen. Aufgrund der

vorhandenen Literaturdaten wussten wir nicht welche SE-Länge notwendig ist, damit

die Tiere später eine chronische Epilepsie entwickeln. Dies war ein Nachteil dieses

Modells, da die SE-Länge von Tier zu Tier variierte, und somit der Insult nicht bei

allen Tieren von gleicher Dauer war. Aufgrund der ermittelten durchschnittlichen SE-

Länge von etwa 11 h könnte man in weiterführenden Untersuchungen versuchen,

den SE nach 8 h oder 10 h abzubrechen.

6.2.2 Anfallsausprägung nach SE

Die Ratten wurden in diesem Versuch vier, sechs und acht Wochen nach SE

überwacht. In diesem Zeitraum entwickelten 86% der Tiere spontane Anfälle. Bei

RAEDT et al. (2009) entwickelten entsprechend 87% der Tiere spontane Anfälle in

den ersten acht Wochen nach SE, bei BRAGIN et al. (2004) waren es 73%. Acht

Ratten wurden 33 Wochen nach SE erneut überwacht. Alle Tiere entwickelten in

diesem Zeitraum Anfälle. Die mittlere wöchentliche Anfallsfrequenz stieg signifikant,

was für eine Progression der Krankheit spricht. Die Progression der durch Kainsäure-

Mikroinjektion induzierten Epilepsie wurde ebenfalls von Raedt et al. (2009)

beschrieben. Im Gegensatz dazu beschrieb CAVALHEIRO et al. (1982), dass Anfälle

nur etwa 30 Tage nach der SE-Induktion durch Kainsäure-Mikroinjektion auftreten.

Da in der Studie von CAVALHEIRO et al. (1982) die SE-Induktion an anästhesierten

Ratten durchgeführt wurde, kann man annehmen, dass die Anästhesie einen

insultmodifiziereden Effekt hatte. Dieser konnte bei einer Mikroinjektion, durchgeführt

an wachen Ratten, eliminiert werden.

6.2.3 Verhaltensänderungen

Da psychiatrische Komorbiditäten eine große Rolle bei Patienten mit

Temporallappenepilepsie spielen (HERMANN et al. 2008), ist es wichtig, Tiermodelle

zu entwickeln, die diese widerspiegeln.

Diskussion

113

In der vorliegenden Arbeit wurden Verhaltensversuche in diesem Modell (Kainsäure-

Mikroinjektion an wachen Ratten) erstmals durchgeführt. Wir nahmen an, dass die

Verhaltensänderungen durch den moderaten Insult weniger schwer sind als in

systemischen Modellen. Es ließ sich eine Reihe von Verhaltensauffälligkeiten bei den

epileptischen Tieren beobachten.

In dem Hyperexzitabilitätstest nach RICE et al. (1998) zeigten die epileptischen

Ratten im fokalen Kainsäure-Modell Anzeichen von Hyperexzitabilität im Touch-

Response- und Finger-Snap-Test, nicht aber im Approach-Response- und Pick-up-

Test. Im Gegensatz dazu äußert sich die Hyperexzitabilität im systemischen

Pilokarpin-Modell durch Auffälligkeiten im Touch-Response- und Pick-up-Test (RICE

et al. 1998). Die Tatsache, dass die Kainsäure-Ratten keine Auffälligkeiten im Pick-

up-Test zeigten, stimmt mit Beobachtungen während des Umgangs mit den Tieren

überein. Die Tiere waren in den ersten Monaten nach SE einfach zu handhaben und

zeigten Artgenossen gegenüber soziales Verhalten. Sie zeigten keine Aggressivität

gegenüber den Experimentatoren. Dies änderte sich zwar zunehmend mit der

Progression der Krankheit, die epilepsieassoziierte Hyperexzitabilität war jedoch

insgesamt nicht so stark ausgeprägt wie es bei Ratten aus dem systemischen

Piokarpin-Modell der Fall sein kann (RICE et al. 1998, POLASCHECK et al. 2010).

Somit stellt das fokale Kainsäure-Modell eine Möglichkeit dar, moderate

Hyperexzitabilität bei Ratten zu erzeugen.

Die Ratten des fokalen Kainsäure-Modells zeigten tendenziell weniger

angstassoziiertes- und mehr Explorationsverhalten im EPM und OF im Vergleich zu

Kontrollen. Dies stimmt überein mit der Arbeit von MUNOZ und GROSSMAN 1980,

in welcher Ratten nach einseitiger Hippokampus-Läsion durch Kainsäure eine

Hyperlokomotion im OF im Vergleich zu Kontrollen zeigten, diese jedoch erst bei

beidseitig lädierten Tieren signifikant wurde. Insgesamt treten bei epileptischen

Tieren oft stark ausgeprägte Verhaltensabnormalitäten, wie verändertes

angstassoziiertes Verhalten und Hyper- oder Hypolokomotion auf (HELFER et al.

1996, DETOUR et al. 2005 BRANDT et al. 2006 SUN et al. 2009 POLASCHECK et

al. 2010). In Studien im Amygdala-Kindling-Modell konnte bei Ratten oft

Hypolokomotion und vermehrtes angstassoziiertes Verhalten beobachtet werden

(ADAMEC 1990, HELFER et al. 1996). In Studien mit systemischer SE-Induktion gibt

es kontroverse Ergebnisse.

Diskussion

114

In der Arbeit von SUN et al. (2009) zeigten Ratten nach systemischer SE-Induktion

mit Kainsäure Hyperlokomotion und gesteigertes angstassoziiertes Verhalten. Im

Gegensatz dazu konnte in mehreren Studien zum systemischen Pilokarpin-Modell

eine Hyperlokomotion mit vermindertem angstassoziierten Verhalten beobachtet

werden (DETOUR et al. 2005, BRANDT et al. 2006, POLASCHECK et al. 2010).

Diese Verhaltensänderungen der epileptischen Ratten sind nicht konform mit der

klinischen Situation, da Angststörungen eine häufige epilepsieassoziierte

Komorbidität darstellen (HERMANN et al. 2008, KANNER 2011). Sie lassen sich

jedoch durch pilokarpin-verursachte großflächige Läsionen des limbischen Systems

erklären (von besonderer Bedeutung ist die neuronale Verschaltung zwischen

Hippokampus und Amygdala), welches wichtig für Emotionen und emotionales

Verhalten ist. Das könnte bei den betroffenen Tieren dazu führen, dass aversive

Situationen fehlinterpretiert werden (DETOUR et al. 2005). Im Hinblick auf diese

Theorie erscheint es logisch, dass Tiere mit fokalen Läsionen weniger von solchen

Verhaltensabnormalitäten betroffen sind als Tiere nach systemischer SE-Induktion

mit Pilokarpin.

Im MWM nach MORRIS (1984), in dem räumliche Orientierung und Gedächtnis

untersucht werden, lernten die epileptischen Ratten im fokalen Kainsäure-Modell

langsamer als die Kontrollen, die Plattformposition zu finden. Das spricht für

Störungen der hippokampalen Integrität, welche für räumliche Orientierung und

Gedächtnis verantwortlich ist (D'HOOGE und DE DEYN 2001). Auch im Probe trial,

in welchem die Beibehaltung und Abfrage des Erlernten getestet wird (BOLDING und

RUDY 2006), schnitten die epileptischen Tiere deutlich schlechter ab als Kontrollen.

Dies deutet darauf hin, dass es den Tieren nicht nur schwerer fiel, neue Aufgaben zu

erlernen, auch die Abfrage des einmal Erlernten war gestört. Diese Daten stimmen

überein mit Untersuchungen im fokalen Kainsäure-Modell bei Mäusen von

GRÖTICKE et al. (2008), in denen die epileptischen Mäuse im MWM langsamer

lernten im Vergleich zu Kontrollen. Gedächtnisprobleme bei den Ratten sprechen für

das Modell, da solche Probleme auch bei humanen Epilepsiepatienten eine große

Rolle spielen (HOPPE et al. 2007).

Diskussion

115

Eine weitere Erklärung der Schwierigkeiten von epileptischen Ratten im MWM

könnte die Tatsache sein, dass die Tiere von der Komplexizität der Aufgabe

überfordert waren, da einige Tiere niemals auf der Plattform sitzen blieben und das

Auffinden der Plattform nicht als Ausweg aus der unangenehmen Situation begriffen.

Da diese Aufgabe nicht ausschließlich räumliche Orientierung sondern auch

Fähigkeit zu konditioniertem Lernverhalten voraussetzt, ist es wahrscheinlich, dass

beides für epileptische Tiere ein Problem darstellt. Auch bei epileptischen Patienten

werden kognitive Dysfunktionen als häufige Komorbidität beschrieben (JENSEN

2011).

6.2.4 Pharmakologische Untersuchungen

Ein wichtiger Bestandteil der Studie im fokalen Kainsäure-Modell war die Behandlung

der epileptischen Ratten mit Phenobarbital. Hier sollte beurteilt werden, wie die Tiere

auf eine Behandlung mit einem Standard-Antiepileptikum ansprechen. Da

Pharmakoresistenz ein großes Problem in der Behandlung der

Temporallappenepilepsie darstellt, sollte ein Rattenmodell idealerweise auch diese

Kondition widerspiegeln. Aus diesem Grund wurde eine Behandlung zur Selektion

von Phenobarbital-Respondern und Phenobarbital-Nonrespondern vorgenommen.

Die Untersuchung wurde an acht Ratten durchgeführt, die 33 Wochen nach SE für

vier Tage behandelt wurden. Der Behandlung ging eine viertägige Kontrollphase

voraus. Auf die Behandlung folgte eine viertägige Auswaschphase. Bei allen Tieren

konnte eine Phenobarbital-Plasmakonzentration im wirksamen Bereich erzielt

werden. Während der Behandlungsphase kam es bei allen Tieren zu einer

signifikanten Anfallsreduktion. Vier Tiere wurden anfallsfrei. Alle Tiere sprachen

somit gut auf die Behandlung an. Dieses Ergebnis war insofern unerwartet, da die

Behandlung zu einem späten Zeitpunkt (33 Wochen) nach SE-Induktion erfolgte, und

eine lang unbehandelte Epilepsie klinisch ein Prädiktor für Pharmakoresistenz ist

(LÖSCHER und BRANDT 2010 b). In verschiedenen Untersuchungen sowohl

unserer (GLIEN et al. 2002, BRANDT et al. 2004, BETHMANN et al. 2007) als auch

anderer Arbeitsgruppen (NISSINEN und PITKÄNEN 2007) konnte gezeigt werden,

dass epileptische Ratten aus verschiedenen Epilepsiemodellen sich in ihrer

individuellen Reaktion auf eine Therapie mit Antiepileptika unterscheiden.

Diskussion

116

So reagieren Ratten, die nach einem SE durch elektrische Stimulation der

basolateralen Amygdala epileptisch werden im Schnitt zu etwa 30% nicht mit einer

mindestens 50%igen Anfallsreduktion auf die Behandlung (BRANDT et al. 2004).

Diese Tiere werden als Nonresponder bezeichnet. Nonresponder sind oft Tiere mit

einer hohen Anfallsfrequenz und starken epilepsieassoziierten

Verhaltensänderungen (GASTENS et al. 2008, LÖSCHER und BRANDT 2010 b).

Rattenmodelle für Temporallappenepilepsie, in denen Responder und Nonresponder

identifiziert werden können, bieten eine Grundlage zur Erforschung von

Mechanismen der Pharmakoresistenz bei Epilepsiepatienten. In unserer Studie im

fokalen Kainsäure-Modell konnten keine Nonresponder identifiziert werden, selbst

Tiere mit einer hohen Anfallsfrequenz sprachen gut auf die Behandlung mit

Phenobarbital an. Dieses Ergebnis war umso überraschender, da in einer Studie von

RIBAN et al. (2002) im fokalen Kainsäure-Modell bei der Maus gezeigt werden

konnte, dass paroxsysmale EEG-Veränderungen durch akute Diazepam-Gabe

unterdrückt wurden, nicht jedoch durch Carbamazepin, Phenytoin oder Valproat.

Diazepam verlor seine Wirksamkeit bei chronischer Behandlung über mehrere Tage.

Aus diesem Grund wurde in dieser Studie das fokale Kainsäure-Modell bei der Maus

als gutes Modell zur Untersuchung von Pharmakoresistenz beim Menschen

beschrieben. Die Untersuchungen wurden drei bis sechs Wochen nach SE

durchgeführt, und der Behandlungserfolg wurde ausschließlich anhand des EEG-

Bildes beurteilt. In unserer Studie hingegen wurde der Behandlungserfolg anhand

der spontanen Anfälle im Verhalten beurteilt, und die Behandlung erfolgte über

mehrere Tage, was die Unterschiede zwischen beiden Studien erklären kann.

Natürlich können auch Speziesunterschiede in diesem Fall eine Rolle spielen.

Wahrscheinlich ist jedoch die Dauer der Behandlung maßgeblich für das Ergebnis

verantwortlich, da eine Toleranz und die damit verbundene schlechtere

Ansprechbarkeit auf die Behandlung erst später im Laufe der Behandlung auftritt,

diese in unserer Studie aber auf vier Tage limitiert war. In einer Studie von GLIEN et

al. (2002) im Pilokarpin-Modell konnte gezeigt werden, dass während einer

zweiwöchigen Behandlungsphase mit dem Antiepileptikum Levetiracetam einige

Ratten in der zweiten Behandlungswoche schlechter auf die Behandlung

ansprachen, was eine Toleranzentstehung vermuten lässt.

Diskussion

117

Zusammenfassend kann man sagen, dass epileptische Tiere aus dem fokalen

Kainsäure-Modell gut auf eine Behandlung mit einem Standard-Antiepileptikum

ansprechen. Ob während einer längeren Behandlung bei einigen Tieren Toleranz

gegenüber Phenobarbital eintreten würde, welche eine Selektion von Respondern

und Nonrespondern ermöglichte, müsste in weiterführenden Untersuchungen

ermittelt werden. Die Pharmakologie von anderen Antiepileptika in diesem Modell

sollte ebenfalls in weiterführenden Studien untersucht werden.

6.2.5 Neurodegeneration

In dieser Studie zeigten sieben von acht Tieren des fokalen Kainsäure-Modells

Neurodegeneration im Hippokampus ipsilateral zur Kainsäure-Injektion. Betroffen

waren die Regionen CA3a und CA3c, sowie der Hilus des Gyrus Dentatus. In der

Körnerzellschicht des Gyrus Dentatus war eine Dispersion der Zellen sichtbar. Die

CA1-Region war weniger stark betroffen. Es gab morphologische Auffälligkeiten, die

jedoch nicht eindeutig als Neurodegeneration eingestuft werden konnten.

Kontralateral traten nur vereinzelt Auffälligkeiten in der CA1-Region auf. Ein

ähnliches Bild zeigte sich in der Studie von GRÖTICKE et al. (2008), in welcher

epileptische Mäuse im fokalen Kainsäure-Modell untersucht wurden. Auch hier war

der Neuronenverlust ipsilateral am deutlichsten. Mittels spezifischer Färbung von

Neuronen konnten aber auch diskrete Veränderungen im Hilus und Gyrus Dentatus

kontralateral gefunden werden. In der Arbeit von HANDELMANN und OLTON (1981)

konnten Veränderungen auch außerhalb des Hippokampus, in Amygdala und

Claustrum gefunden werden. In unserer Arbeit wurden nur Veränderungen des

Hippokampus mittels Score-System beurteil, aus diesem Grund können wir keine

Aussage zur Neurodegeneration in anderen Hirnregionen treffen. In der Arbeit von

RAEDT et al. (2009) konnte Neurodegeneration sowohl in der CA3- als auch in der

CA1-Region ipsilateral beschrieben werden. Die Tatsache, dass Kainsäure-

Mikroinjektion zu moderatem, unilateralem Neuronenverlust führt, stellt einen Vorteil

gegenüber Modellen mit systemischer SE-Induktion dar, in denen es zu einer

ausgeprägten, bilateralen Neurodegeneration im Hippokampus, aber auch in

anderen Hirnregionen kommt (TURSKI et al. 1987, SLOVITER 2005, CURIA et al.

2008).

Diskussion

118

Die moderaten Veränderungen, vorrangig auf den epileptischen Fokus begrenzt,

kommen dem Bild der hippokampalen Sklerose des Menschen näher als die massive

Neurodegeneration, welche nach systemischer SE-Induktion auftritt.

6.2.6 Zusammenfassung

Zusammenfassend kann man sagen, dass es uns in Studie 1 gelungen ist, ein

moderates Epilepsiemodell für unser Labor zu etablieren. Das fokale Kainsäure-

Modell zeichnet sich durch eine moderate Neurodegeneration im Hippokampus

sowie moderate Verhaltensänderungen bei den Tieren aus. Die moderaten

Verhaltensänderungen waren von Vorteil, da die epileptischen Tiere einfacher zu

handhaben waren und weniger aggressives Verhalten gegenüber den

Experimentatoren zeigten. Durch SE-Induktion an wachen Ratten konnten wir den

insultmodifizierenden Effekt der Anästhesie umgehen. Es kam dadurch zu einer

zuverlässigen Anfallsentwicklung und einem progressiven Krankheitsverlauf bei den

Tieren. Die spontanen Anfälle ließen sich leicht durch Phenobarbital unterdrücken,

was zunächst keine Selektion von Respondern und Nonrespondern erlaubt. Eine

weitere pharmakologische Charakterisierung dieses Modells ist jedoch notwendig.

Ein Nachteil des Modells ist die SE-Länge. Dadurch, dass der SE nicht abgebrochen

wurde, variierte die SE-Länge von Tier zu Tier, was eine unterschiedliche Insult-

Stärke zur Folge hatte. Ein nächster Schritt wäre es, einen SE-Abbruch in diesem

Modell einzuführen. Da das fokale Kainsäure-Modell die Konditionen von Patienten

mit Temporallappenepilepsie gut widerspiegelt, haben wir es in unseren Studien zur

Epileptogenese verwenden können.

6.3 Studie 2: Schwellenversuche im Pilokarpin- und im fokalen Kainsäure-Modell Den eigentlichen Schwellenversuchen gingen im Pilokarpin-Modell zwei Versuche

voraus, diese sollen im Weiteren zu Anfang besprochen werden.

6.3.1 Einfluss von Diazepam auf die individuelle Krampfschwelle

Es konnte gezeigt werden, dass 48 h nach Diazepam-Applikation im Pilokarpin-

Modell in einer Dosierung von 30 mg/kg keine Auswirkungen auf die individuelle

Diskussion

119

Krampfschwelle vorhanden waren. Das war zu erwarten, da die Halbwertszeit von

Diazepam bei Ratten bei 1,4 h liegt (LÖSCHER 2007).

6.3.2 Latenzzeit im Pilokarpin-Modell

Die in dieser Arbeit ermittelte Latenzzeit nach Pilokarpin-induziertem SE beträgt

durchschnittlich 7,3 Tage. Diese Zeitspanne stimmt überein mit Daten für männliche

Wistar-Ratten aus der Arbeit von GOFFIN et al. Die Latenzzeit lag in dieser Arbeit

durchschnittlich bei 7,2 Tagen. Die Ermittlung der Latenzzeit war für uns wichtig, um

das Zeitfenster der Behandlung festzulegen. Das Konzept der Latenzzeit in

chemischen SE-Modellen wird aufgrund einiger Studien kontrovers diskutiert

(SLOVITER 2008). Manche interpretieren die anfallsfreie Zeit als verlängerte Periode

einer subklinischen Abnormalität und nicht als präepileptischen Zustand

(BUMANGLAG und SLOVITER 2008). In der Arbeit von BUMANGLAG und

SLOVITER (2008) wurde die Latenzzeit bei Tieren nach pilokarpin-induziertem und

elektrisch-induziertem (Stimulation des Tractus perforans) SE ermittelt. Nahezu alle

Tiere entwickelten spontane Anfälle. Die Zeit zum Auftreten von ersten spontanen

Anfällen lag im Pilokarpin-Modell zwischen zwei und neun Tagen (durchschnittlich

4,9 Tage) und im elektrischen Modell zwischen einem und acht Tagen

(durchschnittlich 2,6 Tage). Diese Ergebnisse werden in der Arbeit als Argument

gegen das Konzept einer Latenzzeit nach Insult interpretiert, da die Anfälle in beiden

Modellen bei einigen Tieren direkt (ein bis zwei Tage) nach SE auftraten. Solche

Anfälle können aber auch als insultassoziiert betrachtet werden, wenn sie direkt in

den ersten Tagen nach SE auftreten. Auch bei Menschen können unmittelbar nach

Insult epileptische Anfälle auftreten, die eigentliche Epilepsie kann sich unter

Umständen erst Jahre nach Insult entwickeln, z. B. im Falle von Fieberkrämpfen

(DELANTY et al. 1998, LHATOO et al. 2001). In dieser Arbeit konnten zwar bei

einigen Ratten insultassoziierte Anfälle beobachtet werden, bei allen Tieren kam es

nichtsdestotrotz zu einer anfallsfreien Periode nach initialem Insult, so dass man in

diesem Fall von einer Latenzzeit zwischen Insult und Epilepsieentstehung sprechen

kann.

Diskussion

120

6.3.3 Veränderungen der individuellen Krampfschwelle bei Kontrollen

Die PTZ-Schwellenversuche wurden durchgeführt, um Veränderungen der

Krampfschwelle nach SE zu erfassen, denen wahrscheinlich Veränderungen des

GABAergen Systems und der neuronalen Erregbarkeit zugrunde liegen. Bei beiden

Kontrollgruppen kam es nach wiederholter Schwellenbestimmung zu einer erhöhten

Empfindlichkeit gegenüber PTZ, welche sich in tendenziell zunehmender

Anfallsschwere während der PTZ-Infusion und Verhaltensänderungen nach Ende der

PTZ-Infusion äußerte (Anfälle und Stereotypien). Dies war deutlicher ausgeprägt bei

den Kontrollen aus dem Pilokarpin-Versuch, bei denen das Verhalten an Tag 4 und

Tag 14 nach sham-SE signifikant verändert war. Bei den Kontrollen aus der fokalen

Kainsäure-Gruppe kam es erst bei der letzten Schwellenbestimmung an Tag 22 nach

sham SE zu signifikanten Verhaltensänderungen. Die erhöhte Empfindlichkeit

gegenüber PTZ kann als Kindling-ähnlicher Effekt erklärt werden (GODDARD et al.

1969). Gleichzeitig kam es bei den Kontrollen aus der Pilokarpin-Gruppe zu einer

Erhöhung der Krampfschwelle bei wiederholter Auslösung. Diese kann dadurch

erklärt werden, dass nach einen Anfall gegenläufige Prozesse im Gehirn ablaufen,

zum einen solche, die die Empfindlichkeit neuen Insulten gegenüber steigern (z. B.

Kindling-ähnliche Effekte), zum anderen jedoch solche, die protektiv und

anfallslimitierend wirken (z. B. verstärkte Inhibition nach Insult), (LÖSCHER und

KÖHLING 2010). In einer Arbeit von GREEN (1986) wurden Veränderungen des

GABAergen Systems nach elektrisch-induzierten Anfällen beschrieben. Es kam

einerseits zu einem Anstieg der funktionellen GABA-Wirkung, was in einer

gesteigerten Krampfschwelle bis 3 h nach Anfall resultierte. Andererseits kam es zu

einer fast vollständigen Hemmung der GABA-Synthese und -Ausschüttung. Diese

Mechanismen können eine Erklärung für die scheinbar paradoxen Veränderungen

der PTZ-Empfindlichkeit in der Pilokarpin-Kontrollgruppe sein.

6.3.4 Veränderungen der Krampfschwelle nach SE

Sowohl im Pilokarpin-Modell als auch im fokalen Kainsäure-Modell kam es zu

Veränderungen der PTZ-Empfindlichkeit nach SE. Die Tiere reagierten nach SE mit

einer höheren Empfindlichkeit auf PTZ.

Diskussion

121

Das äußerte sich nicht nur in einem Abfall der individuellen Krampfschwelle, auch

das Verhalten nach Ende der PTZ-Infusion war verändert (Anfälle und Stereotypien).

In beiden Gruppen kam es zu einer Senkung der Krampfschwelle zwei Tage nach

SE. Dies war deutlicher im fokalen Kainsäure-Modell, was durch die einheitliche

Gruppenzusammensetzung und die daraus resultierende geringere Streuung erklärt

werden kann. Dass dieser Effekt jedoch modellunabhängig auftritt, spricht dafür,

dass er robust ist. Im fokalen Kainsäure-Modell war die Krampfschwelle auch an Tag

9 und Tag 22 nach SE gesenkt. In beiden Gruppen waren die Krampfschwellen nach

SE, mit Ausnahme der Schwelle 4 Tage nach SE in der Kainsäure-Gruppe, zu allen

Zeitpunkten niedriger als bei Kontrollen. Verhaltensänderungen nach PTZ-Infusion

traten ebenfalls in beiden Gruppen schon ab dem ersten Test nach SE auf. Das

deutet auf permanente Veränderungen der neuronalen Erregbarkeit nach SE hin. Da

der PTZ-Test durch die Wirkungsweise von PTZ Veränderungen des GABAergen

Systems erfasst, gehen wir davon aus, dass die gesteigerte Empfindlichkeit

gegenüber PTZ Veränderungen des GABAergen Systems widerspiegelt. Diverse in

vivo (GREEN 1986, AUVIN et al. 2009) und in vitro (LEROY et al. 2004,

BARMASHENKO et al. 2011, PAVLOV et al. 2011) Studien beschreiben eine

gesteigerte neuronale Erregbarkeit und Veränderungen des GABAergen Systems

nach Hirninsult.

Die Veränderung des GABAergen Systems und die daraus resultierende neuronale

Übererregbarkeit, welche direkt nach SE, also noch in der Latenzphase auftrat, kann

verschiedene Ursachen haben. Zum einen kann eine verstärkte GABAerge Inhibition

nach ihrem Kollaps zur Netzwerk-Synchronisierung führen und somit neuronale

Übererregbarkeit erzeugen (MANN und MODY 2008). Zum anderen kann ein GABA-

switch von inhibitorisch zu exzitatorisch stattfinden, was ebenfalls zu einer

Übererregbarkeit führen würde und in Konsequenz in einer erregenden Wirkung von

GABA in der betroffenen Hirnregion resultieren würde (PATHAK et al. 2007,

BARMASHENKO et al. 2011). Auch Veränderungen in der GABAA-Rezeptor-

Pharmakologie (COULTER 2001) und Verluste von GABAergen Interneuronen

(MORIMOTO et al. 2004), beides Prozesse, die nach SE stattfinden, können für

diese neuronale Übererregbarkeit verantwortlich sein. Eine systemische PTZ-

Applikation ermöglicht keine Aussage darüber, welcher dieser Prozesse und in

welchem Ausmaß für die Ergebnisse dieser Studie ursächlich verantwortlich war.

Diskussion

122

Elektrophysiologische Untersuchungen könnten darüber Aufschluss geben, indem

man die Funktionalität des GABAergen Systems nach Insult in Hippokampus-

Schnittpräparaten untersuchen würde.

Da in beiden Modellen zwei Tage nach SE die markanteste Veränderung der

Krampfschwelle auftrat, könnte dies darauf hinweisen, dass zu diesem Zeitpunkt der

Kollaps der GABAergen Inhibition stattfindet. Der initiale Anstieg der GABAergen

Inhibition, welchen wir mit der PTZ-Behandlung verhindern wollten, müsste

demzufolge vorher, also sehr zeitnah zum SE auftreten. Dies wird auch gestützt

durch die Arbeit von GREEN (1986), in welcher die individuelle Krampfschwelle bis

zu 3 h nach Anfall erhöht war. Aufgrund dieser Annahmen und der Tatsache, dass

zwei Tage nach SE die Krampfschwelle erniedrigt war, haben wir zuerst

beschlossen, die PTZ-Behandlung direkt nach SE zu starten und auf 48 h zu

beschränken. Die Anfälle, die unter PTZ-Behandlung bei den Kainsäure-Tieren

auftraten, veranlassten uns später zu einer 48 h Behandlung 7 Tage nach SE,

analog der Studie von PITKÄNEN et al. (2004).

6.3.5 Einfluss des Zyklusstandes auf die Krampfschwelle

In unseren Untersuchungen konnte kein Einfluss des ovariellen Zyklusstandes auf

die individuelle PTZ-Schwelle gefunden werden. Die Tiere hatten keinen synchronen

Zyklus, da sie ohne Kontakt zu männlichen Ratten gehalten wurden. Das konnte

auch für andere Studien unserer Arbeitsgruppe gezeigt werden (KÜCKER et al.

2010). Obwohl einige Studien, unter anderem die von SCHARFMAN und

MACLUSKY (2006) dem Zyklusstand einen hohen Einfluss auf die neuronale

Erregbarkeit zuschreiben, scheint dieser doch substanzabhängig zu sein. In der

Arbeit von FINN und GEE (1994) wurde gezeigt, dass der ovarielle Zyklusstand

keinen Einfluss auf die individuelle PTZ-Krampfschwelle hatte. Aufgrund dieser

Ergebnisse und der Studien von KÜCKER et al. (2010) und FINN und GEE (1994)

können wir davon ausgehen, dass die Tatsache, dass in dieser Arbeit weibliche

Ratten verwendet wurden, keinen Einfluss auf die erzielten Ergebnisse hatte.

Diskussion

123

6.4 Studie 3: PTZ-Behandlung zur Epilepsieprävention

6.4.1 Etablierung des Behandlungsprotokolls

Eine Behandlung mit dem GABAA-Rezeptor-Antagonisten PTZ zur

Epilepsieprävention wurde bislang nicht durchgeführt. Aus diesem Grund gab es in

der Literatur keine Angaben über die Auswirkungen einer chronischen PTZ-

Applikation auf die Epileptogenese. In dieser Studie wurde PTZ in subkonvulsiven

Dosen verabreicht und der PTZ-Gehalt im Plasma sollte über die gesamte

Behandlungsdauer, in diesem Fall über 48 h, im subkonvulsiven Bereich liegen. Da

PTZ eine Substanz ist, die schon seit langem in der Medizin verwendet wird, gab es

diverse Arbeiten zum Metabolismus von PTZ bei der Ratte (ESPLIN und

WOODBURY 1956, VOHLAND und ZUFELDE 1976, RAMZAN und LEVY 1985). Um

ein geeignetes Behandlungsprotokoll zu etablieren, haben wir einige

Untersuchungen bei weiblichen Sprague Dawley-Ratten wiederholt. Die

Plasmahalbwertszeit liegt laut Literarurangaben bei 2-3 h (ESPLIN und WOODBURY

1956, VOHLAND und ZUFELDE 1976, RAMZAN und LEVY 1985). Die von uns

ermittelte Halbwertszeit von 3,3 h lag im Rahmen der Literaturdaten. In Arbeiten von

RAMZAN und LEVY (1985) und MARCUCCI et al. (1971) wird beschrieben, dass

PTZ-Gehalte in Serum und Gehirn weitgehend gleich sind, so dass man annehmen

konnte, dass der PTZ-Plasmagehalt den Gehalt im Gehirn widerspiegelt. Laut

Literaturangaben wird PTZ bei Ratten über die Leber metabolisiert und renal

ausgeschieden. Die Plasmaproteinbindung ist vernachlässigbar gering und es gibt

keine Hinweise auf Kumulation (ESPLIN und WOODBURY 1956). Ein wichtiges

Ergebnis der pharmakokinetischen Versuche war die hohe Korrelation (r=0,9831) der

Krampfschwelle mit dem PTZ-Plasmaspiegel. Die mittlere Krampfschwelle lag bei

unseren Tieren bei ~ 20 mg/kg und die niedrigste Krampfschwelle 24 h nach SE lag

bei 14 mg/kg, was einem Plasmaspiegel von 18 µg/ml entspricht. Aus diesem Grund

haben wir uns entschlossen, eine Zielplasmakonzentration von 10 µg/ml

anzustreben. In vitro-Daten zeigten, dass die halbe inhibitorische Konzentration

(IC50) von PTZ auf den GABAA-Rezeptor bei 1 mmol/l, liegt, während unsere

Zielplasmakonzentration bei 72 µmol/l lag (BLOMS-FUNKE et al. 1996).

Diskussion

124

Die Zielplasmakonzentration war jedoch ein Kompromiss zwischen höchstmöglicher-

und verträglicher Dosis, die jedoch stets im subkonvulsiven Bereich bleiben sollte.

Mit dem aufgrund der Ergebnisse etablierten Behandlungsprotokoll gelang es uns,

die Zielplasmakonzentration über die gesamte Behandlungsdauer (48 h)

aufrechtzuerhalten. Bei den PTZ-behandelten Tieren ohne SE traten keine

Nebenwirkungen unter der Behandlung auf. Somit war es uns bei naiven Ratten

gelungen, ein Behandlungsprotokoll für eine PTZ-Dauerbehandlung zu etablieren.

6.4.2 PTZ-Behandlung

Die PTZ-Infusion hatte modellabhängig verschiedene Auswirkungen. Im Pilokarpin-

Modell, in dem die Behandlung direkt nach SE-Abbruch begann, hatten die Tiere

keine Anfälle während der Bolus-Gabe. Auch im weiteren Verlauf der Infusion kam

es nur in vereinzelten Fällen zu Myoklonien oder fokalen Anfällen. Das lässt sich

dadurch erklären, dass Diazepam und Phenobarbital zur SE-Unterbrechung

verabreicht worden sind. Da beides GABAA-Rezeptor-Agonisten sind, können sie

den prokonvulsiven Wirkungsmechanismus von PTZ aufheben.

Anders war die Situation im fokalen Kainsäure-Modell. Im ersten Versuch, in

welchem die Infusion 13 h oder 16 h nach SE-Beginn startete, hatten alle Tiere

Anfälle während der PTZ-Behandlung. Da der SE in diesem Modell nicht

abgebrochen wurde, und auch die Kontrolltiere in diesem Zeitraum Anfälle hatten,

kann es eine normale Variation der SE-Länge oder insultassoziierte Anfälle

darstellen. Zum anderen kann es bedeuten, dass PTZ die Anfälle im SE verstärkt

hat. Dafür spricht die Tatsache, dass 3 von 4 Tieren Anfälle direkt unter Bolus-Gabe

entwickelten und somit empfindlicher auf die PTZ-Dosis reagierten. Für die zweite

Hypothese spricht auch die Tatsache, dass Tiere nach PTZ-Behandlung längere

Anfälle hatten als Kontrollen. Durch die geringen Gruppengrößen ist jedoch keine

eindeutige Aussage zu den Ursachen möglich.

Da der SE in diesem Modell nicht abgebrochen wurde, war es schwierig einen

Behandlungszeitpunkt zu wählen, der SE-nah ist, ohne gleichzeitig den SE durch die

Behandlung zu verstärken. Aufgrund der lang anhaltenden Krampfaktivität im fokalen

Kainsäure-Modell (durchnittliche SE-Länge von etwa 11 h) können epileptogene

Veränderungen möglicherweise später auftreten als im Pilokarpin-Modell.

Diskussion

125

Deshalb könnte eine Behandlung zu einem späteren Zeitpunkt nach SE sinnvoll sein.

In einer Studie von PITKÄNEN et al. (2004) konnte gezeigt werden, dass eine

Behandlung mit dem prokonvulsiven α2-Rezeptor-Antagonisten Atipamezol 7 Tage

nach einem elektrisch induziertem SE einen insultmodifizierenden Effekt hatte. In

Anlehnung an diese Studie und aufgrund der Ergebnisse der ersten

Behandlungsgruppe haben wir uns entschlossen einen späteren Zeitpunkt der

Behandlung (7 Tage nach SE) zu wählen. Auch in dieser Behandlungsgruppe hatten

4 von 5 Tieren Anfälle unter der Behandlung. Das spricht dafür, dass PTZ trotz

etabliertem Behandlungsschema prokonvulsiv wirkte. Eine Erklärung dafür wäre die

gesteigerte Empfindlichkeit gegenüber PTZ im fokalen Kainsäure-Modell. Das

bestätigen die Schwellenversuche, in welchen die Kainsäure-Tiere eine

Schwellenabsenkung 2, 9 und 22 Tage nach SE zeigten. Da auch eines von 2

Kontrolltieren Anfälle in diesem Zeitraum zeigte, ist es auch möglich, dass erste

spontane Anfälle in diesem Modell früher auftreten als angenommen. Eine sinnvolle

Lösung wäre zum einen ein SE-Abbruch, um den Insult für alle Tiere gleich zu

halten. Zum anderen sollte aufgrund der erhöhten Empfindlichkeit das etablierte

Behandlungsprotokoll für das fokale Kainsäure-Modell überarbeitet werden.

6.5 PTZ zur Epilepsieprävention: Ergebnisse und Ausblick Ziel der Arbeit war die Untersuchung des antiepileptogenen Potentials einer PTZ-

Behandlung nach Hirninsult. Der Einsatz von Prokonvulsiva zur Epilepsieprävention

wird in letzter Zeit häufig diskutiert (ARMSTRONG et al. 2009, LÖSCHER und

BRANDT 2010 a, PITKÄNEN 2010, PITKÄNEN und LUKASIUK 2011). Wichtig für

unsere Untersuchungen waren jedoch hauptsächlich zwei Theorien über die Rolle

von GABA in der Epilepsieentstehung, da wir konkret einen GABAA-Rezeptor-

Antagonisten einsetzen wollten. Es ist seit langem bekannt, dass während der

Epileptogenese Veränderungen des GABAergen Systems auftreten. Es gibt

zunehmend Hinweise, dass GABA auch proepileptogen wirken kann. Das kann zum

einen über den GABA-switch von inhibitorisch zu exzitatorisch erfolgen (PATHAK et

al. 2007). Zum anderen kann eine kompensatorische Hochregulierung von GABA,

welche nach Insult auftritt (NUTT et al. 1981, GREEN 1986), nach ihrem Kollaps eine

Netzwerk-Synchronisierung hervorrufen (MANN und MODY 2008).

Diskussion

126

Das war die Grundlage, welche uns zum Einsatz eines GABAA-Rezeptor-

Antagonisten veranlasste. Im Sinne der Synchronisationstheorie würde eine

prophylaktische Behandlung mit subkonvulsiven PTZ-Dosen nach Insult die

Netzwerk-Synchronisierung verhindern, indem die initiale GABA-Hochregulierung

verhindert wird. Auch bei einer exzitatorischen GABA-Wirkung wäre eine Behandlung

mit PTZ sinnvoll, um der exzitatorischen Wirkung von GABA in

Neuronensubpopulationen im Hippokampus entgegenzuwirken.

Trotz der Annahme, dass eine PTZ-Behandlung die Netzwerk-Synchronisierung

nach Insult verhindern und dadurch antiepileptogen wirken könnte, ist es uns nicht

gelungen, mit dem verwendeten Behandlungschema das erwartete Resultat zu

erzielen. Zehn von elf Tieren entwickelten, unabhängig von Epilepsiemodell und

Behandlungszeitpunkt, spontane Anfälle 8 bis 16 Wochen nach PTZ-Behandlung. In

der Pilokarpin-Gruppe schien die PTZ-Behandlung eher proepileptogen zu wirken, da

8 Wochen nach Behandlung alle behandelten Tiere epileptisch waren, während bei

den Kontrollen zu diesem Zeitpunkt noch keine Anfälle detektiert werden konnten.

Allerdings ist die Tierzahl der Gruppe zu gering, um einen zufälligen Effekt

ausschliessen zu können. Es gab auch keine Unterschiede in der Anfallsfrequenz

zwischen epileptischen PTZ-behandelten Tieren und epileptischen Kontrollen. Diese

Ergebnisse können mehrere Ursachen haben. Die Dauer der Behandlung, sowie das

gewählte Behandlungszeitfenster könnten inadäquat gewesen sein. Die Wahl der

geeigneten PTZ-Dosis und die Art der Behandlung (systemisch versus fokal) war

eine weitere Schwierigkeit dieser Studie. Da die zeitlichen Abläufe der

Veränderungen des GABAergen Systems nach Insult nur unvollständig geklärt sind,

war diese Arbeit ein Versuch, Behandlungszeitpunkt und -dauer anhand der

Schwellenversuche zu ermitteln. Wir haben versucht, zwei Behandlungszeitfenster

zu wählen, ein SE-nahes und ein SE-fernes, es ist jedoch trotzdem möglich, dass die

gewählten Behandlungszeitpunkte nicht die richtigen waren. Die Dauer der

Behandlung könnte ebenfalls für die Ergebnisse verantwortlich sein, falls sie zu kurz

oder zu lang gewählt worden war. Die Wahl der PTZ-Dosis erfolgte aufgrund von

Ergebnissen der Schwellenversuche, sowie der pharmakokinetischen Versuche. Die

Dosis sollte einen Kompromiss darstellen zwischen höchstmöglicher aber systemisch

verträglicher Dosis.

Diskussion

127

Dies ist nur teilweise gelungen, da die gewählte Behandlungsdosis bei den

Kainsäure-Ratten zu Anfällen führte, also möglicherweise zu hoch war. Ein weiterer

Punkt ist die systemische Behandlung. Möglicherweise laufen die Prozesse, welche

wir mit unserer Behandlung beeinflussen wollen, nicht gleichermaßen im gesamten

Gehirn ab, sondern nur im epileptischen Fokus. PTZ entfaltet seine Wirkung über

den Hippokampus (GOLARAI et al. 1992, STRINGER 1994, WALSH et al. 1999,

QIAN et al. 2011) aber auch über den mammillothalamischen Trakt (MIRSKI und

FERRENDELLI 1986 und 1987), möglicherweise wäre also eine fokale Behandlung

sinnvoll. Aus diesem Grund ist eine systemische Behandlung mit PTZ

möglicherweise nicht der richtige Weg, um diese Prozesse zu beeinflussen.

Verschiedene Studien zeigen paradoxe Effekte einer Behandlung mit prokonvulsiven

Stoffen. In einer Studie von KLAASSEN et al. (2006) konnte gezeigt werden, dass

der GABAA-Antagonist Picrotoxin in subkonvulsiver Dosierung einen antikonvulsiven

Effekt in einem genetischen Mausmodell für Epilepsie hatte. In einer Studie von

KHAZIPOV und HOLMES (2003) konnte der GABAA-Antagonist Bicucullin

epileptische Aktivität im Rattenhippokampus unterdrücken. Der Effekt einer solchen

Behandlung auf die Epileptogenese wurde jedoch nicht untersucht. Auch mit anderen

prokonvulsiven Stoffen wurde die Strategie der Neuromodulation zur

Epilepsieprävention verfolgt. Cannabinoid-Rezeptor-Antagonisten sollten die

Veränderungen des Cannabinoid-Rezeptor Systems nach Insult verhindern, die zu

einer neuronalen Übererregbarkeit führen kann. Atipamezol und Koffein wurden

aufgrund ihrer neuroprotektiven und krankheitsmodifizierenden Effekte in anderen

Krankheitsmodellen ausgewählt. Der α2-Rezeptor-Antagonist Atipamezol hatte

keinen Effekt auf die Anfallsausprägung in einem Rattenmodell für Epilepsie, der

Krankheitsverlauf konnte jedoch gemildert werden (PITKÄNEN et al. 2004). Weitere

Studien befassen sich mit dem Typ 1 Cannabinoid Rezeptor-Antagonisten

Rimonabant. In der Arbeit von CHEN et al. (2007) hat die einmalige Applikation von

Rimonabant in einem Rattenmodell für Fieberkrämpfe eine spätere neuronale

Übererregbarkeit verhindert. Dasselbe war der Fall in einem Rattenmodell für

Schädel-Hirn-Trauma, in welchem die einmalige Applikation von Rimonabant eine

spätere neuronale Übererregbarkeit verhinderte (ECHEGOYEN et al. 2009).

Diskussion

128

Eine Behandlung mit dem Cannabinoid Rezeptor-Antagonisten Rimonabant hatte

jedoch keinen Einfluss auf die Epileptogenese in einem Rattenmodell für Epilepsie

(DUDEK et al. 2010). Obwohl also prokonvulsive Stoffe und insbesondere GABAA-

Antagonisten antikonvulsiv oder neuromodulierend wirken können, ist es bis heute

nicht gelungen, eine wirklich antiepileptogene Substanz zu entdecken.

Die Behandlung mit PTZ hatte zwar keinen Einfluss auf die Epileptogenese, wir

können aber nicht ausschließen, dass eine lokale Behandlung direkt im epileptischen

Fokus erfolgreich wäre. Da es bis heute keine Möglichkeit gibt, Patienten zu helfen,

die ein erhöhtes Risiko haben an Epilepsie zu erkranken, ist es wichtig, nach neuen

Strategien zu suchen. Eine lokale Applikation von PTZ zur Epilepsieprävention in

Rattenmodellen wäre ein weiterer logischer Schritt.

Zusammenfassung

129

7. Zusammenfassung Marta Rattka

Prokonvulsiva als pharmakologische Strategie zur Epilepsieprävention

Epilepsie ist die häufigste chronische neurologische Erkrankung des Menschen.

Symptomatische Epilepsieformen, wie die Temporallappenepilepsie, entwickeln sich

nach einem Hirninsult, wie z. B. Schädel-Hirn-Trauma oder Status epileptikus (SE).

Es ist somit eine Erkrankung mit klar definierbarer Risikogruppe. Trotzdem gibt es bis

heute keine Möglichkeit, solche Patienten präventiv zu behandeln. Die einzige

Behandlungsmöglichkeit ist die symptomatische Anfallsunterdrückung mit

Antiepileptika. Ein weiteres Problem der Temporallappenepilepsie ist eine hohe

Anzahl an pharmakoresistenten Patienten. Das bedeutet, dass diese Patienten trotz

Behandlung nicht anfallsfrei werden. Aus diesem Grund ist es dringend notwendig,

Strategien zur Epilepsieprävention zu entwickeln, um Patienten aus der Risikogruppe

zu helfen. Es konnte gezeigt werden, dass paradoxerweise Mittel, die eigentlich

Krämpfe auslösen, also prokonvulsiv wirken, in subkonvulsiven Dosen verabreicht

einen akut antikonvulsiven Effekt haben können oder neuronale Übererregbarkeit

verhindern. Aus diesem Grund wird der Einsatz solcher prokonvulsiver Stoffe in der

Antiepileptogenese-Forschung immer häufiger diskutiert. In der Gruppe der

Prokonvulsiva waren GABAA-Rezeptor-Antagonisten für uns von besonderem

Interesse, da es zunehmend Hinweise gibt, dass der inhibitorische Transmitter GABA

die Entstehung einen neuronalen Übererregbarkeit nach Hirninsult begünstigen

kann. Zum einen kann eine nach Insult kompensatorisch gesteigerte GABAerge

Inhibition nach ihrem Kollaps zur Synchronisierung von erregenden Netzwerken

führen. Zum anderen kann, durch veränderte Exprimierung von Chlorid-

Cotransportern, ein GABA-switch von inhibitorisch zu exzitatorisch stattfinden. Das

war für uns der Grund den GABAA-Rezeptor-Antagonisten Pentylentetrazol (PTZ) in

unserer Studie zur Epilepsieprävention einzusetzen. Ziel dieser Arbeit war eine

Untersuchung der Auswirkungen einer prophylaktischen PTZ-Behandlung nach Insult

auf die Epileptogenese. Wir gingen davon aus, dass eine solche Behandlung

antiepileptogen sein würde. Unsere Arbeitshypothese sollte an zwei Rattenmodellen

Zusammenfassung

130

für Epilepsie, dem systemischen Pilokapin-Modell und dem fokalen Kainsäure-

Modell, untersucht werden.

Das fokale Kainsäure-Modell musste zunächst an unserem Institut etabliert werden.

Im zweiten Schritt haben wir dann in beiden Modellen zeitliche Veränderungen der

neuronalen Erregbarkeit nach Hirninsult, in unserem Fall nach SE, mittels

Bestimmung der PTZ-Krampfschwelle untersucht, um ein Behandlungszeitfenster

festlegen zu können. Zuletzt haben wir ein Behandlungsprotokoll für eine

subkonvulsive PTZ-Dosierung erstellt und eine prophylaktische PTZ-Behandlung

nach einem Insult (in unseren Modellen nach SE) durchgeführt. Der

Behandlungserfolg wurde 8 bis 16 Wochen nach Behandlung anhand des Auftretens

von spontanen epileptischen Anfällen beurteilt. Es ist uns nicht gelungen, mit einer

systemischen PTZ-Behandlung eine Epilepsieentstehung zu verhindern, weder im

systemischen Pilokarpin-Modell, noch im fokalen Kainsäure-Modell. Wir konnten

durch unsere Behandlung weder die Anfallsausprägung, noch die Anfallsfrequenz

beeinflussen. Im Pilokarpin-Modell schien die PTZ-Behandlung eher proepileptogen

zu wirken. Eine systemische Behandlung mit dem GABAA-Rezeptor-Antagonisten

PTZ, hatte, so wie wir sie durchgeführt haben, also keinen antiepileptogenen Effekt.

Es ist uns jedoch gelungen, neue Erkenntnisse über das fokale Kainsäure-Modell zu

gewinnen, insbesondere über Verhaltensänderungen und Pharmakologie in diesem

Modell. Des Weiteren haben wir Veränderungen der neuronalen Erregbarkeit nach

SE im Zeitverlauf mittels individueller Krampfschwellenbestimmung erfasst. Diese

Ergebnisse zeigen Veränderungen des GABAergen Systems nach SE und leisten

somit einen Beitrag zum besseren Verständnis der Epileptogenese. Die Ursachen

dieser Veränderungen sollten in weiterführenden Studien untersucht werden, um das

Verständnis der epileptogenen Mechanismen weiterhin zu verbessern. Obwohl eine

systemische PTZ-Behandlung nicht antiepileptogen war, kann man jedoch nicht

ausschließen, dass eine lokale Behandlung direkt im epileptischen Fokus erfolgreich

wäre. Der nächste Schritt könnte eine lokale PTZ-Behandlung sein, da Prozesse, die

wir beeinflussen wollten, möglicherweise nur im epileptischen Fokus ablaufen, was

die unwirksame systemische Behandlung erklären könnte.

Summary

131

8. Summary Marta Rattka

Proconvulsants as pharmacological strategy for epilepsy prevention

Epilepsy is the most common chronic neurological disorder in humans. Symptomatic

epilepsies are often a consequence of a brain insult, for example traumatic brain

injury or SE. The patients at risk can be easily identified, but currently we have no

possibility to prevent the disease. The only treatment for patients with epilepsy is a

symptomatic suppression of the seizures. Patients with an onset of symptomatic

epilepsy are often pharmacoresistent, which means that a treatment with common

antiepileptic drugs does not lead to seizure control. To help patients at risk, the

development of antiepileptogenic strategies is an urgent need. Experimental studies

have shown that paradoxically proconvulsant agents, at a subconvulsive dose, can

exert anticonvulsive effects, or prevent the development of neuronal hyperexcitability

after brain insult, a hallmark of epileptogenesis. The use of proconvulsant drugs for

studies on antiepileptogenesis is a new strategy. The GABAA-receptor-antagonists

play an important role among the group of proconvulsive drugs. New hypotheses

propose that the inhibitory neurotransmitter GABA can play a crucial role in the

establishment of neuronal hyperexcitability after brain insult. A compensatory up-

regulation of GABA after a brain insult can lead, after its collapse, to network

synchronisation. Another explanation is a switch of GABA from an inhibitory to an

excitatory action, due to a change in expression pattern of chloride co-transporters.

This prompted us to perform our experiments on epilepsy prevention with the

GABAA-receptor-antagonist pentylenetetrazole (PTZ). The goal of our study was the

prevention of epileptogenesis by a prophylactic PTZ-treatment after brain insult. We

tested this working hypothesis in two rat models of temporal lobe epilepsy, in the

systemic pilocarpine model and in the intrahippocampal kainic acid model. The

intrahipocampal kainic acid model was not established in our institute, so this was

our first step. Then we assessed excitability changes after brain insult in the two rat

models by determining the PTZ seizure threshold. After this we developed a

subconvulsive treatment protocol for PTZ and started with the prophylactic treatment

Summary

132

after SE. Eight to 16 weeks after the treatment we assessed the occurrence of

spontaneous seizures in our rats.

The systemic treatment with PTZ did not prevent the development of epilepsy,

neither in the pilocarpine model, nor in the kainic acid model. The treatment was not

able to affect the occurrence of spontaneous seizures or the seizure frequency. In

the pilocarpine model our intervention seems to have rather proepileptogenic

consequences. Thus the treatment with PTZ had no antiepileptogenic effect.

Nevertheless our studies provide new insights into the intrahippocampal kainc acid

model, especially with respect to behavioural alterations and the pharmacological

response of the spontaneous seizures. We also described changes in the neuronal

excitability at several time points after SE, by assessing changes in individual seizure

threshold. This results leads to a better understanding of the process of

epileptogenesis due to describing changes of the GABAergic system after SE. Our

systemic treatment failed, but we can not exclude the possibility of a successful local

treatment with PTZ. The next step should be a local treatment, because it is possible

that the processes we want to influence occur only in the epileptic focus, so that a

systemic treatment is ineffective.

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133

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Anhang

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10. Anhang

Tierhaltung und -versorgung

Verbrauchsmaterial Bezugsquelle

Einstreu (Weichholzgranulat Altromin) Altromin, Lage

Makrolonkäfig (Typ III und Typ IV) Ebeco, Caustrop-Rauxel

Milchbrei (Früchte oder Banane) Milupa GmbH, Friedrichsdorf

Tierfutter (Standardnagerdiät Atromin

1324)

Altromin, Lage

Stereotaktische Operation

Gerät Bezugsquelle

Bohrer (0,13/ 0,11 mm) Hager & Meisinger GmbH, Neuss

Dentalbohrer (Mod. 732 T1) Dremel Leinfelden-Echterdingen

Stereotakt I David Kopf Tujunga, USA

Stereotakt II Stölting Wood Dale, USA


Bepanthen Augensalbe Bayer Vital, Leverkusen

Bupivacainhydrochlorid (Carbostesin) Astra Zeneca GmbH, Wedel

Chloralhydrat Roth, Karlsruhe

Chloramphenicol-Succinat Roth, Karlsruhe

Dentalzement (Paladur®) Heraeus Kulzer, Hanau

Draht für Elektroden und Erden (SS-

8T/SA)

Science Products, Hofheim

Draht für Führungsrohre Schoeller Werker, Hellenthal

Gentamicinsulfat Caelo, Hilden

Isofluran Cp Pharma, Burgdorf

Isotone Natriumchloridlösung (NaCl

0,9%)

Braun, Tuttlingen

Marbofloxacin (Marbocyl® FD1 %) WDT,Garbsen

Anhang

143

Nahtmaterial (Surgicryl® PGA

polyglycolic acid)

SMI, Hünningen, Belgien

Sauerstoff Linde AG, Pullach

Schrauben (aus nicht rostendem Stahl) Hummer & Rieß, Nürnberg

Tetracainhydrochlorid Caesar&Loretz GmbH, Hilden

Wasserstoffperoxid (35%) AppliChem GmbH, Darmstadt

SE-Induktion Pilokarpin

Substanz Bezugsquelle

Diazepam (Faustan®) Temmler Pharma GmbH & Co. KG,

Marburg


0,9%)

Braun, Tuttlingen

Lithiumchlorid Sigma Aldrich, Steinheim

Methylscopolamin Sigma Aldrich, Steinheim

Phenobarbital-Natrium Serva, Heidelberg

Pilocarpin Sigma Aldrich, Steinheim

Scopolamin Sigma Aldrich, Steinheim

SE-Induktion Kainsäure

Substanz Bezugsquelle

Destilliertes Wasser Eigenherstellung


0,9%)

Braun, Tuttlingen

Kainsäure Sigma Aldrich, Steinheim

Thionin (Acetatsalz) Sigma Aldrich, München

Anhang

144

Gerät/Verbrauchsmaterial Bezugsquelle

Feinwaage „CPA225D“ Sartorius AG, Göttingen

Hamilton-Spritze (5 µl, 24 G) Hamilton Bonaduz AG, Bonaduz,

Schweiz

Draht für Injektionsnadel 18 mm Schoeller Werke, Hellenthal

Mikroinjektionsschlauch CMA Microdialysis, Schweden

EEG- und Videoüberwachung

Gerät Bezugsquelle

Ableitkabel Hopa Kabelkonfektion, Langenhagen

Ableitkabel Eigenproduktion Material von Radio Menzel, Hannover

Digitalkamera (Logitech, 2MPC903) Conrad Elektronic, Hannover

Infrarotkamera (Nycto Vision) CaS Buisness Servicess, Wunstorf

Infrarotlampen und Generator (Nycto

Vision)

CaS Buisness Servicess, Wunstorf

Rotlichtlampen und Generator Conrad Elektronic, Hannover

16-Ein-Kanal-Verstärker (BioAmp) ADInstuments, Spechbach

16-Kanal-Analog-Digitalwandler

(Powerlab/16SP)

ADInstuments, Spechbach

Verhaltensversuche

Gerät/Substanz Bezugsquelle

Essigsäure Riedel de Häen, Hannover

Etho Vision Software Noldus, Wageningen, Niederlande

Kamera Panasonic

Klimaanlage Fujitsu General Euro GmbH, Düsseldorf

Open field Arena Firma Zimmermann, Hannover

PC Dell

Waage, Sartorius Universal Omnilab, Göttingen

White Noise Generator 60 dB Eigenbau

Anhang

145

Histologie

Verbrauchsmaterial/Gerät Bezugsquelle

Chloralhydrat AppliChem GmbH, Darmstadt

CO2 Kohlensäurewerk, Räthen

Eideckmedium (Entellan) Merck, Darmstadt

Gefriermedium Jung, Nussloch

Gefriermikrotom, Frigomobil CM1325 Leica, Wetzlar

Kryostat HM560M Microm, Walldorf

Lichtmikroskop Leica, Wetzlar

Lichtmikroskop Zeiss, Göttingen

N-Methylbutan Fulka Chemie GmbH, Buchs, Schweiz

Objektträger und Deckgläschen Roth, Karlsruhe

Paraformaldehyd Roth, Karlsruhe

Perfusionspumpe ISM897A Ismatech Laboratoriums GmbH,

Wertheim-Modfeld

Stickstoff Westfalen Gas, Münster

Thionin Sigma Aldrich, München

Xylol Roth, Karlsruhe

Xylol Ersatzmedium (XEM) Roth, Karlsruhe

PTZ-Schwellentest


Infusionspumpe (PHD 2000) Harvard Appartus, Holliston, USA

Injektionskanüle 24 G Terumo, Leuven, Belgien


0,9%)

Braun, Tuttlingen

Pentylentetrazol Caesar & Loretz, Hilden

Polyethylenschlauch Kleinfeld Labortechnik, Gehrden

Anhang

146

PTZ-Infusion


Ein-Kanal-Swivel Instech Laboratories, Plymouth Meeting,

USA

Geschirr mit Federspirale Instech Laboratories, Plymouth Meeting,

USA

Infusionspumpe (PHD 2000) Harvard Appartus, Holliston, USA


0,9%)

Braun, Tuttlingen

Kanülen 21 G, stumpf B. Braun, Melsungen

Pentylentetrazol Caesar & Loretz, Hilden

Polyethylenschlauch Katheter Kleinfeld Labortechnik, Gehrden

Tubing Adapter (C3409500) Axel Semrau, Sprockhövel

Tygonschlauch (S-54-HL) Kleinfeld Labortechnik, Gehrden

PTZ-Analytik

Gerät Bezugsquelle

Entgaser (ERC - 3512) Erma-Elektronic, Immendingen

Filter (Millipore Kit; 0,22 μm) Millipore, Billerica, MA, USA

Hauptsäule (HPLC column EC 250/4.6; Nuceosil 120-5 C18, 250 x 4,6 mm)

Macherey-Nagel, Düren

Integrator (C - R4A) Shimadzu, Duisburg

Pumpen (LC - 6A) Shimadzu, Duisburg

Pumpencontroler (SCL-6A; Fluß: 1 ml/min 35°C)

Shimadzu, Duisburg

Säulenofen (Knauer Column Oven,

35°C)

Knauer, Berlin

UV-Detektor (SPD – 6A; Wellenlänge:

210 nm)

Shimadzu, Duisburg

Vorsäule (Nucleosil 120-5 C 18, 60 x 4

mm)

Knauer, Berlin

Zentrifuge (5415 D) Eppendorf, Hamburg

Anhang

147


Acetonnitril p.a. (HPLC FarUV) Lab-Scan, Gliwice, Polen

Calciumchlorid-Dihydrat p.a. Merck, Darmstadt

Kaliumchlorid p.a. Merck, Darmstadt

Kaliumdihydrogenphosphat p.a. Merck, Darmstadt

Magnesiumsulfat-Heptahydat p.a. Merck, Darmstadt

Methanol p.a. Lab-Scan, Gliwice, Polen

Natriumchlorid p.a. Roth, Karlsruhe

Natriumdihydrogencarbonat p.a. Merck, Darmstadt

Natriumdihydrogenphosphat p.a. Sigma-Aldrich, München

Natriumhydroxid p.a. Sigma-Aldrich, München

Pentylentetrazol Caesar&Loretz, Hilden

Salzsäure p.a. (37%ig) Merck, Darmstadt

Tetracainhydrochlorid Caesar & Loretz, Hilden

Titriplex III p.a. Merck, Darmstadt

Puffer und Lösungen

0,4 M Phosphatpuffer (Stammlösung)

800 ml Aqua dest.

57 g Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat

12,48 g Natriumdihydrogenphosphat-Dihydrat

Mit 1 M Natronlauge auf pH 7,4 einstellen

Ad 1.000 ml Aqua dest.

0,5 M Tris-gepufferte Saline (TBS)

9 g Natriumchlorid

6,057 g Tris

800 ml Aqua dest.

Mit 37%iger Salzsäure auf pH 7,6 einstellen


Anhang

148

8% Paraformaldehydlösung

800 ml Aqua dest. auf 60-70°C erhitzen

80 g Paraformaldehyd-Pulver unter Rühren hinzugeben

Mit 1 M Natronlauge bis zur Klärung titrieren

Auf Raumtemperatur abkühlen lassen und dann filtrieren


4% Paraformaldehydlösung

8%ige Paraformaldehydlösung mit 0,2 M PBS auf eine 4%ige Lösung verdünnen

10%ige Saccharoselösung (pro Rattengehirn)

3 g Zucker

Ad 30 ml 0,1M PBS

30%ige Saccharoselösung (pro Rattengehirn)

9 g Zucker

Ad 30 ml 0,1M PBS

Chromgelantine

7 g Gelantine in 1.000 ml Aqua dest. auf 60°C erwärmen

Etwas Thymol (wenige mg) zugeben

0,7 g Chrom-(III) Kaliumsulfat-Dodecanhydrat nach dem Erwärmen hinzugeben

Auf Eis auf 20°C abkühlen

filtrieren

Anhang

149

Gefriermedium

85,6g Glucose-Monohydrat

1,4g Magnesium-Chlorid-Hexahydrat

In 500 ml 0,1 M PBS lösen

Mit 87%igem Glyzerin auf 1.000 ml auffüllen

Thionin-Lösung

100 ml 1 M Essigsäure

36 ml 1 M Natronlauge


Auf 60-70°C erhitzen

1,25 g Thionin darin lösen

1 Stunde bei 60-70°C rühren und dann heiß filtrieren

Bei 60°C lagern (bis zu drei Monate haltbar)

Färbeprotokolle

Thioninfärbung

3 min in 100% Ethanol inkubieren




3 min in Aqua dest. inkubieren

75-90 sek. in Thionin-Färbelösung (42- 48°C) inkubieren


Anhang

150




3 min in Terpineol/Xylol-Ersatzmedium 1:1 inkubieren

3 min in Xylol-Ersatzmedium inkubieren

3 min in frischem Xylol-Ersatzmedium inkubieren

Sofortiges Eindecken der Schnitte mit Entellan® und Trocknen an der Luft

Färbung nach Shorr

10-mal in 70% Ethanol eintauchen

10-mal in Aqua dest. Wässern

2 min in Meyers Hämalaun inkubieren


1 min in Lithium-Carbonat (gesättigte Lösung 1:1 mit Aqua dest. verdünnt) inkubieren


10-mal in 70% Ethanol inkubieren

6 min in Shorr´scher Färbelösung inkubieren

10-mal in 95% Ethanol eintauchen

30 sek. In 95% Ethanol inkubieren

Lufttrocknen lassen

151

Publikationen

Originalarbeiten

C. BRANDT, M. NOZADZE, N. HEUCHERT, M. RATTKA and W. LÖSCHER (2010)

"Disease-modifying effects of phenobarbital and the NKCC1 inhibitor bumetanide in

the pilocarpine model of temporal lobe epilepsy."

J Neurosci 30(25): 8602-8612.

M. RATTKA, C. BRANDT, M. BANKSTAHL, S. BRÖER and W. LÖSCHER (2011)

"Enhanced susceptibility to the GABA antagonist pentylenetetrazole during the latent

period following a pilocarpine-induced status epilepticus in rats."

Neuropharmacology 60(2-3): 505-512.

Poster

RATTKA, M., C. BRANDT, M. BANKSTAHL, S. BRÖER and W. LÖSCHER (2010)

“Alterations in pentylenetetrazole seizure threshold after pilocarpine-induced status

epilepticus”

FENS Abstr., vol.5, 106.36

M. RATTKA, C. BRANDT, M. BANKSTAHL, S. BRÖER and W. LÖSCHER (2010)

„Alterations in seizure threshold to the GABAA receptor antagonist pentylenetetrazole

after pilocarpine-induced status epilepticus.”

40 th Annual Meeting Society for Neuroscience, San Diego, 350.2/K14

M. RATTKA, C: BRANDT and W: LÖSCHER (2011)

“Effects of subconvulsive pentylenetetrazole infusion on epileptogenesis in a status

epilepticus model in Sprague-Dawley rats.”

Epilepsia 52, Issue Supplement s6, 159

152

Erklärung Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation „Prokonvulsiva als pharmakologische

Strategie zur Epilepsieprävention“ selbstständig verfasst habe.

Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen:

Frau M. Gramer und Frau M. Hausknecht (Technische Angestellte am

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie) führten für mich die HPLC-

Analyse der PTZ-Plasmakonzentrationen durch. Herr Michael Weißing (Technischer

Angestellter am Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie) fertigte die

Kryostat-Schnitte der Gehirne an. Frau Nicole Ernst, Frau J. Hinz, Herr S. Obili

(Technische Angestellte am Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie)

und Herr Phillip Demmer (Biologie-Diplomand) haben mich bei der Beobachtung der

Tiere während der PTZ-Infusion unterstützt.

Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten

(Promotionsberater oder andere Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat

von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die

im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen.

Ich habe die Dissertation an folgenden Institution angefertigt:

Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie der Tierärztlichen Hochschule

Hannover. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder

für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die

vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit

entsprechend gemacht habe.

Unterschrift

153

Danksagung

Mein größter Dank gilt Herrn Professor Doktor W. Löscher für die Überlassung des

Themas, die wissenschaftliche Anleitung bei der Durchführung der Versuche und der

Abfassung dieser Dissertation sowie die jederzeit gewährte freundliche

Unterstützung.

Herrn Professor Doktor G. Bicker und Herrn Professor Doktor E. Ponimaskin danke

ich für die kompetente und freundliche Betreuung während des PhD-Studiums.

Frau Claudia Brandt, PhD möchte ich für die freundliche Betreuung, die Hilfe bei der

Durchführung der Versuche und die geduldigen Korrekturen meiner hoffnungslos

unformatierten Präsentationen danken. Ich danke ihr auch für die sehr nette

Arbeitsatmosphäre und die geduldige Beantwortung alle Fragen, sowie für die

schöne Zeit, die ich mit Marlow verbringen durfte.

Ich danke allen Mitarbeitern des Instituts für die nette Arbeitsatmosphäre und stetige

Hilfsbereitschaft. Insbesondere möchte ich Nicole Ernst, Julia Hinz, Philip Demmer

und Stefan Obili für ihre Hilfe bei allen Versuchen danken. Martina Gramer und Maria

Hausknecht möchte ich für die Durchführung der Analytik danken. Michael Weißing

möchte ich für seine Hilfe bei der Histologie danken. Bianca Backofen-Wehrhahn

möchte ich für ihre Hilfe bei der Formatierung dieser Arbeit danken.

Allen Doktoranden, Diplomanden, Auszubildenden und Praktikanten danke ich für die

Hilfe bei den Versuchen und für die schöne Zeit, die wir zusammen verbracht haben.

Meiner Oma Zuzanna Gąsior möchte ich für Ihre Liebe und Unterstützung danken.

Ich danke meinem Mann Grzegorz Żuk für seine Liebe und Geduld.

Ich danke dem Redakteur Jerzy Urban für seine Feuilletons in der „Täglichen

Wochenzeitung NIE“, die mich während der gesamten PhD-Arbeit begleitet haben.

154

Ich danke der Friedrich-Ebert-Stiftung für die Gewährung eines

Promotionsstipendiums, welches mir das PhD-Studium ermöglicht hat. Ferner

möchte ich der Stiftung für die Möglichkeit der Teilnahme an den interessanten

studienbegleitenden Seminaren danken.

Diese Arbeit ist ein Teilprojekt der DFG-Forschergruppe Neurodegeneration und –

regeneration bei ZSN-Erkrankungen des Hundes (Forschergruppe 1103).

Documents

Material und Methoden - elib.tiho-hannover.de · Institut für Pharmakologie, Toxikologie und Pharmazie Tierärztliche Hochschule Hannover Prokonvulsiva als pharmakologische Strategie