Blutgruppen-PCRLohnt sich der Aufwand?

Dr. med. Guido HeymannZentrale Abteilung für LaboratoriumsmedizinDRK-Kliniken Berlin

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Themen..

Molekulargenetische Methodik

Verfügbare Systeme Indikationen Beispiele

AB0 Rhesus MNS

Kosten und Aufwand Fazit

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Grundlagen

Ziel der PCR-UntersuchungZiel der PCR-Untersuchung

chromosome

Zellkern

Doppelsträngiges DNA Molekül

Individual nucleotides

RNAZellkern

RNA

Protein

Ziel der SerologieZiel der

Serologie

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Molekulargenetische Methodik

DNA-Vervielfältigung durch Polymerase-Kettenreaktion

Verlängerung (Extension)

DNA-Vorlage (Template)

5’

5’

3’

3’

5’

5’

3’

3’

Anlagerung Primer (anneal) 5’3’

3’5’

Forward primer

Reverse primer

Stränge werden getrennt

Denaturierung

5’

5’3’

3’

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Molekulargenetische Methodik

DNA-Vervielfältigung erfolgt Exponentiell

1,07*109 Kopien der Zielregion werden bei 100% Effizienz in ca. 32 Zyklen erzeugt.

1,07*109 Kopien der Zielregion werden bei 100% Effizienz in ca. 32 Zyklen erzeugt.

Original-DNA Zielregion

Thermal cycleThermal cycleThermal cycle

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Molekulargenetische Methodik

Amplifikatdarstellung

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Molekulargenetische Methodik Sequenzierung

Amplifikat wird in die Kapillare injiziert

Spannung wird angelegt

Amplifikattrennung durch Länge:Große Stränge wandern langsamer durch das Gel

Amplifikate wandern zur Anode

Farbfluoreszenz der endständigen Base wird detektiert

DetektorFenster

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Molekulargenetische Methodik

weitere eingesetzte Verfahren

Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLP)

PCR-SSO (sequenzspezifische Oligonukleotide)

Real-time-Verfahren

Schmelzkurvenanalyse

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Vorschriften

Richtlinien:Abschnitt 4.2.5

„Die Wahl des Untersuchungsverfahrens ist unter Berücksichtigung des aktuellen Wissensstandes zu treffen.“

MPG, QualitätssicherungRingversuch (INSTAND): AB0, Rhesus, Kell, Duffy, Kidd, MNSKontrollen, „Testreagenzien“

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Verfügbare Testsysteme

Kommerziell erhältlich: AB0 Rhesus Kell, (Kk, Kp(ab)) Kidd MNS Duffy Lutheran Cartwright (Yt) Colton (Co) Knops Wright, Diego (Di) Dombrock (Do)

sonstwie durchgeführt: McCoy Chido,Rodgers Js(ab) Lewis Xg Landsteiner-Wiener Gerbich Cromer Ii XK, Js(ab) Scianna T/Tn P-Globoside H/h Indian GIL, JMH, OK, RAPH

bisher nicht testbar (z.B.):

Vel

Lan

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Verfügbare Testsysteme: eigene Tests

Interessante Web-Seiten zum Thema:

The Blood Group Antigen Gene Mutation Database:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mhc/xslcgi.fcgi?cmd=bgmut/home

Rhesusbase:http://www.uni-ulm.de/~fwagner/RH/RB/

NCBI Entrez Nucleotidehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/

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Indikationen

wissenschaftliche Fragestellungen Zur Ergänzung von nicht eindeutigen serologischen Ergebnissen Wenn keine serologischen Untersuchungen möglich sind:

unsichere Antigenbestimmung bei Vortransfusion, Polyagglutinationsphänomen oder z.B. AIHA

Bestimmung erythrozytärer Merkmale aus fetalen Materialien genetische Disposition bei Risikoschwangerschaften Untersuchung nach KMT, bei Chimärismus

forensische Fragestellungen Vaterschaftsbegutachtung kriminalistische Zuordnung von Spuren zu Tätern

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Beispiele: AB0

Das Gen für die AB0-Transferasen liegt an Position 9q34.1-9q34.2 Es kodiert für ein Enzym, das endständige Zucker an eine

Grundsubstanz (H) anhängt Aminosäurevarianten verursachen:

geringere Transferaseaktivität Spezifitätswechsel des endständigen Zuckers

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Beispiele: AB0

AS-Pos 156 176 216 235 266 268 291 352

A101 Pro Arg Phe Gly Leu Gly Asp Arg

A201 Leu #

B101 Gly Ser Met Ala

B301 Gly Ser Met Ala Trp

0o1 Basenmutation in Codon 87 erzeugt vorzeitiges Stopcodon

0o3 Gly Arg

cisAB Leu Ala

Aktuell sind 168 Allele beschrieben (A 57, B 40, 0 66 + besondere 5)

# Deletion eines Nukleotids erzeugt Frameshiftmutation mit zusätzlich 21 AS

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Beispiele: AB0

Probleme der AB0-Typisierung:

Es existiert keine klare Vergleichbarkeit zwischen dem Allel und der serologischen Reaktion.

Die Wertigkeit (Auswirkungsstärke) der spezifischen Aminosäuren an speziellen Positionen ist nicht klar (z.B. B-Transferase weil Ala268 oder Gly176, nondeletionales 0-Allel).

Letzter Ausschluß von A101 nur durch Fehlen von Missense- oder Nonsensemutation in den Exonen 1 bis 7 (Sequenzierung).

Transfusionsrelevanz ?!

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Beispiele: Rhesus günstige Situation: nicht glycosyliertes Membranprotein

Testmöglichkeiten: RhD, C,c,E,e,Cw.. schwaches D: Dweak

oder D partial D-Zygotiebestimmung CE-Haplotypbestimmung

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Beispiele: Rhesus

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Beispiele: Rhesus

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Beispiele: Rhesus

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Beispiele: Rhesus

Probleme der Rhesus-Typisierung:

„PCR-positiv Serologie-negativ“ durch seltene Basenmutationen, die D (oder auch CE) unterdrücken.

Was wird kodiert – was wird exprimiert? c (Cyt 48) -> Intron 4 Testung für C bisher >170 Allele allein im D-Gen und 53 verschiedene Dweak

beschrieben -> Sequenzierung

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Beispiele: MNS

Sialoglycoprotein Glycophorin A (MN) und B (Ss) Ausgeprägte Homologien zwischen GpA, GpB und GpE in den

ersten Exonen. Gene entwickelten sich durch Duplikation aus GpAPNAS, 1989, 86, 4619ff

Nur wenige Basenaustausche unterscheiden M und N (5 in In1, Ex2 und In2) und S und s (1 in Ex4).

GpB

1 1Ser/Leu1

SerThrThrGly/Glu5

GpA

Leu1

SerThrThrGlu5

NH2

COOHCOOH

131

72

MN

´N´29Met/Thr

S s

NH2

GpA

GpB

GpE

Exon1 Exon2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 3´-UT

-28 2 15 227 377 1733 324 395 1822

CT

GT

Proteinstart

Homologe Region

x x

X-Over

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Beispiele: MNS

Probleme der MNS-Typisierung Protokolle zeigen Schwächen:

unterschiedliche Annealing-Temperaturen für M und N benötigtTransfusion, 1993, 33, 119ff

sehr lange Amplifikate Amplitype PE

Ausfälle bei spezifischen Allelen In J Legal Med, 1996, 109, 216f

Phänotyp alter HybridName

GP.Vw Mi.I A-B-AGP.Mur Mi.III B-A-BS

GP.Bun Mi.VI B-A-BGP.HF Mi.X B-A-B

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Beispiele: MNS

Probleme der MNS-Typisierung: Fall Patientin E.K. 21 Jahre Ak-Differenzierung: Anti-S, EA –

PCR: NNSs

Serologie: ss

Hybridmolekül; AS-Variante, die spezifisches Epitop für Ak zerstört?

Sequenzierung….

M M M N N M S s

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weitere Probleme der BG-PCR:

das Genprodukt erzeugt nicht direkt den Phänotyp, sondern ein umwandelndes Enzym:z.B. Lewis, P1, Ii

Ringversuche, Qualitätskontrolle

Kontrollproben (positiv und negativ)

Inhibitoren: z. B. Kidd, Lutheran…

seltene Allele: z. B. Rhesus D, FyX…

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Serologie PCR-SSP Sequenzierung

Aufwand + ++ +++

Zeit + (ca. 45 Min) ++ (ca. 2 h) +++ (ca. 4h)

Kosten (AB0) ca. 4-5 € ca. 7-20 € (inhouse) ca. 40-50 €ca. 30 € (kommerziell)

GOÄ (AB0) 3980 5,83 € 3920 52,46 € 3920 52,46 € (3981 10,49 €) 3922 29,14 € 3926 116,57

€

Thermocycler zwischen 3000-7000 € Photoanlage ca. 2000 € Gelkammer, Spannungsgerät ca. 700 € Sequencer ca. 30.000 bis 100.000 €

Kosten und Aufwand

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Fazit: Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

wenn PCR-Austattung für andere Anwendungen vorhanden ist und/oder eine nennenswerte Anzahl von Problemfällen auftritt

„Zukunftstechnologie“: Erfahrungen mit molekulargenetischer Diagnostik sammeln

Kein Ersatz für Serologie

61%12%

6%

11%

3%

1% 3%3% schwache Ausprägung einesMerkmals

einfache Bestimmung desMerkmals

Familientestung

serologische Probleme (Ak..)

Bestimmung bei starken WAK

Chimärismus

Autoantikörper gegen Merkmal

Vortransfusion

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interessante Publikationen:

AB0: Systematic analysis of the AB0 gene diversity within exons 6 and 7 by PCR

screening reveals new AB0 allels. A. Seltsam et al. Transfusion 2003, 43; 428ff

Single tube multiplex PCR-SSCP analysis distinguishes 7 common AB0 alleles and readily identifies new alleles. S. Yip Blood 2000, 95/4; 1487ff

Molecular genetics of the AB0 histo-blood group system. F. Yamamoto Vox sanguinis 1995, 69; 1ff (Fortsetzung in anderen Ausgaben)

Amplified product lenghth polymorphism (AFLP): a novel strategy for genotyping the AB0 blood group. G. Watanabe Human Genetics 1997, 99; 34ff

Polymorphisms at the AB0 locus in subgroup A individuals. M.L. Olsson Transfusion 1996, 36; 309ff

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interessante Publikationen:

Rhesus: RHD/CE typing by polymerase chain reaction using sequence-specific

primers. C. Gassner et. al. Transfusion 1997; Vol 37;1020ff Genetik des Rhesus-Blutgruppensystems. W.A.Flegel Deutsches Ärzteblatt

2007, 10; 573ff The Rh blood group system: a review. N. Avent, M. Reid Blood 2000, 95/2;

375ff Testing for the D zygosity with three different methods revealed altered

rhesus-boxes and a new wek D type. P. Perco et al. Transfusion 2003, 43; 335ff

Molecular basis of weak D phenotypes. F. Wagner et al. Blood 1999, 93/1; 385ff

RHD positive haplotypes in D negative europeans. F. Wagner et al. BMC Genetics 2001, 2; 10ff

RHD gene deletion occured in the Rhesus box. F. Wagner, A. Flegel Blood 2000, 95/12; 3662ff

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interessante Publikationen:

weiteres: Differentiation of autologous ABO, RHD, RHCE, KEL, JK, and FY blood group

genotypes by analysis of peripheral blood samples of patients who have recently received multiple transfusions. P. Rozman et al. Transfusion 2000, 40; 936ff

Molekulargenetische Blutgruppendiagnostik. T. Müller et.al. Deutsches Ärzteblatt 2001, 98/6; 317ff

DNA analysis for the Dombrock polymorphism. M. Rios et al. Transfusion 2001, 41; 1143ff

Quantitative Alleles of CR1: Coding sequence analysis and comparison of haplotypes in two ethnic groups. L. Xiang J. Immunology 1999, 163; 4939ff

The low-incidence MNS antigens Mv, sD, and Mit arise from single amino acid substitutions on GPB. J. Storry et al. Immunohematology 2001, 41; 269ff