Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

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Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?. Dr. med. Guido Heymann Zentrale Abteilung für Laboratoriumsmedizin DRK-Kliniken Berlin. Themen. Molekulargenetische Methodik Verfügbare Systeme Indikationen Beispiele AB0 Rhesus MNS Kosten und Aufwand Fazit. Ziel der PCR-Untersuchung. - PowerPoint PPT Presentation

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  • Blutgruppen-PCRLohnt sich der Aufwand?Dr. med. Guido HeymannZentrale Abteilung fr LaboratoriumsmedizinDRK-Kliniken Berlin

    Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  • Themen..Molekulargenetische MethodikVerfgbare SystemeIndikationenBeispieleAB0RhesusMNSKosten und AufwandFazit

    Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  • GrundlagenchromosomeZellkernDoppelstrngiges DNA MoleklIndividual nucleotidesRNAZellkernRNAProtein

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  • Molekulargenetische MethodikDNA-Vervielfltigung durch Polymerase-Kettenreaktion

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  • Molekulargenetische MethodikDNA-Vervielfltigung erfolgt Exponentiell1,07*109 Kopien der Zielregion werden bei 100% Effizienz in ca. 32 Zyklen erzeugt.

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  • Molekulargenetische MethodikAmplifikatdarstellung

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  • Molekulargenetische MethodikSequenzierungAmplifikat wird in die Kapillare injiziertSpannung wird angelegtAmplifikattrennung durch Lnge: Groe Strnge wandern langsamer durch das GelAmplifikate wandern zur AnodeFarbfluoreszenz der endstndigen Base wird detektiert

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  • Molekulargenetische Methodikweitere eingesetzte Verfahren

    Restriktionsfragment-Lngenpolymorphismen (RFLP)

    PCR-SSO (sequenzspezifische Oligonukleotide)

    Real-time-Verfahren

    Schmelzkurvenanalyse

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  • VorschriftenRichtlinien: Abschnitt 4.2.5 Die Wahl des Untersuchungsverfahrens ist unter Bercksichtigung des aktuellen Wissensstandes zu treffen. MPG, Qualittssicherung Ringversuch (INSTAND): AB0, Rhesus, Kell, Duffy, Kidd, MNS Kontrollen, Testreagenzien

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  • Verfgbare TestsystemeKommerziell erhltlich:AB0RhesusKell, (Kk, Kp(ab))KiddMNSDuffyLutheranCartwright (Yt)Colton (Co)KnopsWright, Diego (Di)Dombrock (Do)sonstwie durchgefhrt:McCoyChido,RodgersJs(ab)LewisXgLandsteiner-WienerGerbichCromerIiXK, Js(ab)SciannaT/TnP-GlobosideH/hIndianGIL, JMH, OK, RAPH

    bisher nicht testbar (z.B.):VelLan

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  • Verfgbare Testsysteme: eigene TestsInteressante Web-Seiten zum Thema:

    The Blood Group Antigen Gene Mutation Database: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/mhc/xslcgi.fcgi? cmd=bgmut/home Rhesusbase: http://www.uni-ulm.de/ ~fwagner/RH/RB/ NCBI Entrez Nucleotide http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/

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  • Indikationenwissenschaftliche FragestellungenZur Ergnzung von nicht eindeutigen serologischen ErgebnissenWenn keine serologischen Untersuchungen mglich sind:unsichere Antigenbestimmung bei Vortransfusion, Polyagglutinationsphnomen oder z.B. AIHABestimmung erythrozytrer Merkmale aus fetalen Materialiengenetische Disposition bei RisikoschwangerschaftenUntersuchung nach KMT, bei Chimrismusforensische FragestellungenVaterschaftsbegutachtungkriminalistische Zuordnung von Spuren zu Ttern

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  • Beispiele: AB0Das Gen fr die AB0-Transferasen liegt an Position 9q34.1-9q34.2Es kodiert fr ein Enzym, das endstndige Zucker an eine Grundsubstanz (H) anhngtAminosurevarianten verursachen:geringere TransferaseaktivittSpezifittswechsel des endstndigen Zuckers

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  • Beispiele: AB0Aktuell sind 168 Allele beschrieben (A 57, B 40, 0 66 + besondere 5)

    # Deletion eines Nukleotids erzeugt Frameshiftmutation mit zustzlich 21 AS

    AS-Pos156176216235266268291352A101ProArgPheGlyLeuGlyAspArgA201Leu#B101GlySerMetAlaB301GlySerMetAlaTrp0o1Basenmutation in Codon 87 erzeugt vorzeitiges Stopcodon0o3GlyArgcisABLeuAla

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  • Beispiele: AB0Probleme der AB0-Typisierung:

    Es existiert keine klare Vergleichbarkeit zwischen dem Allel und der serologischen Reaktion.Die Wertigkeit (Auswirkungsstrke) der spezifischen Aminosuren an speziellen Positionen ist nicht klar (z.B. B-Transferase weil Ala268 oder Gly176, nondeletionales 0-Allel).Letzter Ausschlu von A101 nur durch Fehlen von Missense- oder Nonsensemutation in den Exonen 1 bis 7 (Sequenzierung).Transfusionsrelevanz ?!

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  • Beispiele: Rhesusgnstige Situation: nicht glycosyliertes Membranprotein

    Testmglichkeiten:RhD, C,c,E,e,Cw..schwaches D: Dweak oder D partialD-ZygotiebestimmungCE-Haplotypbestimmung

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  • Beispiele: Rhesus

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  • Beispiele: Rhesus

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  • Beispiele: Rhesus

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  • Beispiele: RhesusProbleme der Rhesus-Typisierung:

    PCR-positiv Serologie-negativ durch seltene Basenmutationen, die D (oder auch CE) unterdrcken.Was wird kodiert was wird exprimiert?c (Cyt 48) -> Intron 4 Testung fr Cbisher >170 Allele allein im D-Gen und 53 verschiedene Dweak beschrieben -> Sequenzierung

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  • Beispiele: MNSSialoglycoproteinGlycophorin A (MN) und B (Ss)Ausgeprgte Homologien zwischen GpA, GpB und GpE in den ersten Exonen. Gene entwickelten sich durch Duplikation aus GpA PNAS, 1989, 86, 4619ffNur wenige Basenaustausche unterscheiden M und N (5 in In1, Ex2 und In2) und S und s (1 in Ex4).GpBNH2GpAGpBGpEExon1 Exon2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 3-UT -28 2 15 227 377 1733 324 395 1822CTGTProteinstartHomologe Regionxx

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  • Beispiele: MNSProbleme der MNS-TypisierungProtokolle zeigen Schwchen:unterschiedliche Annealing-Temperaturen fr M und N bentigtTransfusion, 1993, 33, 119ffsehr lange AmplifikateAmplitype PEAusflle bei spezifischen Allelen In J Legal Med, 1996, 109, 216f

    PhnotypalterHybridNameGP.VwMi.IA-B-AGP.MurMi.IIIB-A-BSGP.BunMi.VIB-A-BGP.HFMi.XB-A-B

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  • Beispiele: MNSProbleme der MNS-Typisierung: FallPatientin E.K. 21 JahreAk-Differenzierung: Anti-S, EA

    PCR: NNSs

    Serologie: ss

    Hybridmolekl; AS-Variante, die spezifisches Epitop fr Ak zerstrt?Sequenzierung.M M M N N M S s

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  • weitere Probleme der BG-PCR:das Genprodukt erzeugt nicht direkt den Phnotyp, sondern ein umwandelndes Enzym: z.B. Lewis, P1, Ii

    Ringversuche, Qualittskontrolle

    Kontrollproben (positiv und negativ)

    Inhibitoren: z. B. Kidd, Lutheran

    seltene Allele: z. B. Rhesus D, FyX

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  • Kosten und AufwandSerologiePCR-SSPSequenzierung

    Aufwand + ++ +++

    Zeit + (ca. 45 Min) ++ (ca. 2 h) +++ (ca. 4h)

    Kosten (AB0) ca. 4-5 ca. 7-20 (inhouse) ca. 40-50 ca. 30 (kommerziell)GO (AB0)3980 5,83 3920 52,46 3920 52,46 (3981 10,49 )3922 29,14 3926 116,57

    Thermocycler zwischen 3000-7000 Photoanlage ca. 2000 Gelkammer, Spannungsgert ca. 700 Sequencer ca. 30.000 bis 100.000

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  • Fazit: Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?wenn PCR-Austattung fr andere Anwendungen vorhanden ist und/oder eine nennenswerte Anzahl von Problemfllen auftrittZukunftstechnologie: Erfahrungen mit molekulargenetischer Diagnostik sammelnKein Ersatz fr Serologie

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    Diagramm2

    97

    18

    9

    17

    5

    1

    4

    5

    Tabelle1

    AB0Rhesusgesamt

    schwache Ausprgung eines Merkmals286997

    einfache Bestimmung des Merkmals61218

    Familientestung639

    serologische Probleme (Ak..)12517

    Bestimmung bei starken WAK235

    Chimrismus101

    Autoantikrper gegen Merkmal044

    Vortransfusion325

    Tabelle1

    Tabelle2

    Tabelle3

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  • interessante Publikationen:AB0:Systematic analysis of the AB0 gene diversity within exons 6 and 7 by PCR screening reveals new AB0 allels. A. Seltsam et al. Transfusion 2003, 43; 428ffSingle tube multiplex PCR-SSCP analysis distinguishes 7 common AB0 alleles and readily identifies new alleles. S. Yip Blood 2000, 95/4; 1487ffMolecular genetics of the AB0 histo-blood group system. F. Yamamoto Vox sanguinis 1995, 69; 1ff (Fortsetzung in anderen Ausgaben)Amplified product lenghth polymorphism (AFLP): a novel strategy for genotyping the AB0 blood group. G. Watanabe Human Genetics 1997, 99; 34ffPolymorphisms at the AB0 locus in subgroup A individuals. M.L. Olsson Transfusion 1996, 36; 309ff

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  • interessante Publikationen:Rhesus:RHD/CE typing by polymerase chain reaction using sequence-specific primers. C. Gassner et. al. Transfusion 1997; Vol 37;1020ffGenetik des Rhesus-Blutgruppensystems. W.A.Flegel Deutsches rzteblatt 2007, 10; 573ffThe Rh blood group system: a review. N. Avent, M. Reid Blood 2000, 95/2; 375ffTesting for the D zygosity with three different methods revealed altered rhesus-boxes and a new wek D type. P. Perco et al. Transfusion 2003, 43; 335ffMolecular basis of weak D phenotypes. F. Wagner et al. Blood 1999, 93/1; 385ffRHD positive haplotypes in D negative europeans. F. Wagner et al. BMC Genetics 2001, 2; 10ffRHD gene deletion occured in the Rhesus box. F. Wagner, A. Flegel Blood 2000, 95/12; 3662ff

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  • interessante Publikationen:weiteres:Differentiation of autologous ABO, RHD, RHCE, KEL, JK, and FY blood group

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