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Blutgruppen-PCRLohnt sich der Aufwand?Dr. med. Guido
HeymannZentrale Abteilung fr LaboratoriumsmedizinDRK-Kliniken
Berlin
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Themen..Molekulargenetische MethodikVerfgbare
SystemeIndikationenBeispieleAB0RhesusMNSKosten und AufwandFazit
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GrundlagenchromosomeZellkernDoppelstrngiges DNA MoleklIndividual
nucleotidesRNAZellkernRNAProtein
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Molekulargenetische MethodikDNA-Vervielfltigung durch
Polymerase-Kettenreaktion
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Molekulargenetische MethodikDNA-Vervielfltigung erfolgt
Exponentiell1,07*109 Kopien der Zielregion werden bei 100%
Effizienz in ca. 32 Zyklen erzeugt.
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Molekulargenetische MethodikAmplifikatdarstellung
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Molekulargenetische MethodikSequenzierungAmplifikat wird in die
Kapillare injiziertSpannung wird angelegtAmplifikattrennung durch
Lnge: Groe Strnge wandern langsamer durch das GelAmplifikate
wandern zur AnodeFarbfluoreszenz der endstndigen Base wird
detektiert
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Molekulargenetische Methodikweitere eingesetzte Verfahren
Restriktionsfragment-Lngenpolymorphismen (RFLP)
PCR-SSO (sequenzspezifische Oligonukleotide)
Real-time-Verfahren
Schmelzkurvenanalyse
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VorschriftenRichtlinien: Abschnitt 4.2.5 Die Wahl des
Untersuchungsverfahrens ist unter Bercksichtigung des aktuellen
Wissensstandes zu treffen. MPG, Qualittssicherung Ringversuch
(INSTAND): AB0, Rhesus, Kell, Duffy, Kidd, MNS Kontrollen,
Testreagenzien
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Verfgbare TestsystemeKommerziell erhltlich:AB0RhesusKell, (Kk,
Kp(ab))KiddMNSDuffyLutheranCartwright (Yt)Colton (Co)KnopsWright,
Diego (Di)Dombrock (Do)sonstwie
durchgefhrt:McCoyChido,RodgersJs(ab)LewisXgLandsteiner-WienerGerbichCromerIiXK,
Js(ab)SciannaT/TnP-GlobosideH/hIndianGIL, JMH, OK, RAPH
bisher nicht testbar (z.B.):VelLan
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Verfgbare Testsysteme: eigene TestsInteressante Web-Seiten zum
Thema:
The Blood Group Antigen Gene Mutation Database:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/mhc/xslcgi.fcgi?
cmd=bgmut/home Rhesusbase: http://www.uni-ulm.de/ ~fwagner/RH/RB/
NCBI Entrez Nucleotide http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/
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Indikationenwissenschaftliche FragestellungenZur Ergnzung von
nicht eindeutigen serologischen ErgebnissenWenn keine serologischen
Untersuchungen mglich sind:unsichere Antigenbestimmung bei
Vortransfusion, Polyagglutinationsphnomen oder z.B. AIHABestimmung
erythrozytrer Merkmale aus fetalen Materialiengenetische
Disposition bei RisikoschwangerschaftenUntersuchung nach KMT, bei
Chimrismusforensische
FragestellungenVaterschaftsbegutachtungkriminalistische Zuordnung
von Spuren zu Ttern
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Beispiele: AB0Das Gen fr die AB0-Transferasen liegt an Position
9q34.1-9q34.2Es kodiert fr ein Enzym, das endstndige Zucker an eine
Grundsubstanz (H) anhngtAminosurevarianten verursachen:geringere
TransferaseaktivittSpezifittswechsel des endstndigen Zuckers
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Beispiele: AB0Aktuell sind 168 Allele beschrieben (A 57, B 40, 0
66 + besondere 5)
# Deletion eines Nukleotids erzeugt Frameshiftmutation mit
zustzlich 21 AS
AS-Pos156176216235266268291352A101ProArgPheGlyLeuGlyAspArgA201Leu#B101GlySerMetAlaB301GlySerMetAlaTrp0o1Basenmutation
in Codon 87 erzeugt vorzeitiges Stopcodon0o3GlyArgcisABLeuAla
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Beispiele: AB0Probleme der AB0-Typisierung:
Es existiert keine klare Vergleichbarkeit zwischen dem Allel und
der serologischen Reaktion.Die Wertigkeit (Auswirkungsstrke) der
spezifischen Aminosuren an speziellen Positionen ist nicht klar
(z.B. B-Transferase weil Ala268 oder Gly176, nondeletionales
0-Allel).Letzter Ausschlu von A101 nur durch Fehlen von Missense-
oder Nonsensemutation in den Exonen 1 bis 7
(Sequenzierung).Transfusionsrelevanz ?!
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Beispiele: Rhesusgnstige Situation: nicht glycosyliertes
Membranprotein
Testmglichkeiten:RhD, C,c,E,e,Cw..schwaches D: Dweak oder D
partialD-ZygotiebestimmungCE-Haplotypbestimmung
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Beispiele: Rhesus
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Beispiele: Rhesus
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Beispiele: Rhesus
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Beispiele: RhesusProbleme der Rhesus-Typisierung:
PCR-positiv Serologie-negativ durch seltene Basenmutationen, die
D (oder auch CE) unterdrcken.Was wird kodiert was wird exprimiert?c
(Cyt 48) -> Intron 4 Testung fr Cbisher >170 Allele allein im
D-Gen und 53 verschiedene Dweak beschrieben -> Sequenzierung
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Beispiele: MNSSialoglycoproteinGlycophorin A (MN) und B
(Ss)Ausgeprgte Homologien zwischen GpA, GpB und GpE in den ersten
Exonen. Gene entwickelten sich durch Duplikation aus GpA PNAS,
1989, 86, 4619ffNur wenige Basenaustausche unterscheiden M und N (5
in In1, Ex2 und In2) und S und s (1 in Ex4).GpBNH2GpAGpBGpEExon1
Exon2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 3-UT -28 2 15 227 377 1733 324
395 1822CTGTProteinstartHomologe Regionxx
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Beispiele: MNSProbleme der MNS-TypisierungProtokolle zeigen
Schwchen:unterschiedliche Annealing-Temperaturen fr M und N
bentigtTransfusion, 1993, 33, 119ffsehr lange AmplifikateAmplitype
PEAusflle bei spezifischen Allelen In J Legal Med, 1996, 109,
216f
PhnotypalterHybridNameGP.VwMi.IA-B-AGP.MurMi.IIIB-A-BSGP.BunMi.VIB-A-BGP.HFMi.XB-A-B
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Beispiele: MNSProbleme der MNS-Typisierung: FallPatientin E.K.
21 JahreAk-Differenzierung: Anti-S, EA
PCR: NNSs
Serologie: ss
Hybridmolekl; AS-Variante, die spezifisches Epitop fr Ak
zerstrt?Sequenzierung.M M M N N M S s
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weitere Probleme der BG-PCR:das Genprodukt erzeugt nicht direkt
den Phnotyp, sondern ein umwandelndes Enzym: z.B. Lewis, P1, Ii
Ringversuche, Qualittskontrolle
Kontrollproben (positiv und negativ)
Inhibitoren: z. B. Kidd, Lutheran
seltene Allele: z. B. Rhesus D, FyX
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Kosten und AufwandSerologiePCR-SSPSequenzierung
Aufwand + ++ +++
Zeit + (ca. 45 Min) ++ (ca. 2 h) +++ (ca. 4h)
Kosten (AB0) ca. 4-5 ca. 7-20 (inhouse) ca. 40-50 ca. 30
(kommerziell)GO (AB0)3980 5,83 3920 52,46 3920 52,46 (3981 10,49
)3922 29,14 3926 116,57
Thermocycler zwischen 3000-7000 Photoanlage ca. 2000 Gelkammer,
Spannungsgert ca. 700 Sequencer ca. 30.000 bis 100.000
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Fazit: Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?wenn
PCR-Austattung fr andere Anwendungen vorhanden ist und/oder eine
nennenswerte Anzahl von Problemfllen auftrittZukunftstechnologie:
Erfahrungen mit molekulargenetischer Diagnostik sammelnKein Ersatz
fr Serologie
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Diagramm2
97
18
9
17
5
1
4
5
Tabelle1
AB0Rhesusgesamt
schwache Ausprgung eines Merkmals286997
einfache Bestimmung des Merkmals61218
Familientestung639
serologische Probleme (Ak..)12517
Bestimmung bei starken WAK235
Chimrismus101
Autoantikrper gegen Merkmal044
Vortransfusion325
Tabelle1
Tabelle2
Tabelle3
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interessante Publikationen:AB0:Systematic analysis of the AB0
gene diversity within exons 6 and 7 by PCR screening reveals new
AB0 allels. A. Seltsam et al. Transfusion 2003, 43; 428ffSingle
tube multiplex PCR-SSCP analysis distinguishes 7 common AB0 alleles
and readily identifies new alleles. S. Yip Blood 2000, 95/4;
1487ffMolecular genetics of the AB0 histo-blood group system. F.
Yamamoto Vox sanguinis 1995, 69; 1ff (Fortsetzung in anderen
Ausgaben)Amplified product lenghth polymorphism (AFLP): a novel
strategy for genotyping the AB0 blood group. G. Watanabe Human
Genetics 1997, 99; 34ffPolymorphisms at the AB0 locus in subgroup A
individuals. M.L. Olsson Transfusion 1996, 36; 309ff
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interessante Publikationen:Rhesus:RHD/CE typing by polymerase
chain reaction using sequence-specific primers. C. Gassner et. al.
Transfusion 1997; Vol 37;1020ffGenetik des
Rhesus-Blutgruppensystems. W.A.Flegel Deutsches rzteblatt 2007, 10;
573ffThe Rh blood group system: a review. N. Avent, M. Reid Blood
2000, 95/2; 375ffTesting for the D zygosity with three different
methods revealed altered rhesus-boxes and a new wek D type. P.
Perco et al. Transfusion 2003, 43; 335ffMolecular basis of weak D
phenotypes. F. Wagner et al. Blood 1999, 93/1; 385ffRHD positive
haplotypes in D negative europeans. F. Wagner et al. BMC Genetics
2001, 2; 10ffRHD gene deletion occured in the Rhesus box. F.
Wagner, A. Flegel Blood 2000, 95/12; 3662ff
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interessante Publikationen:weiteres:Differentiation of
autologous ABO, RHD, RHCE, KEL, JK, and FY blood group genotypes by
analysis of peripheral blood samples of patients who have recently
received multiple transfusions. P. Rozman et al. Transfusion 2000,
40; 936ffMolekulargenetische Blutgruppendiagnostik. T. Mller et.al.
Deutsches rzteblatt 2001, 98/6; 317ffDNA analysis for the Dombrock
polymorphism. M. Rios et al. Transfusion 2001, 41;
1143ffQuantitative Alleles of CR1: Coding sequence analysis and
comparison of haplotypes in two ethnic groups. L. Xiang J.
Immunology 1999, 163; 4939ffThe low-incidence MNS antigens Mv, sD,
and Mit arise from single amino acid substitutions on GPB. J.
Storry et al. Immunohematology 2001, 41; 269ff
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