Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

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    10-Jan-2016

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Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?. Dr. med. Guido Heymann Zentrale Abteilung fr Laboratoriumsmedizin DRK-Kliniken Berlin. Themen. Molekulargenetische Methodik Verfgbare Systeme Indikationen Beispiele AB0 Rhesus MNS Kosten und Aufwand Fazit. Ziel der PCR-Untersuchung. - PowerPoint PPT Presentation

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  • Blutgruppen-PCRLohnt sich der Aufwand?Dr. med. Guido HeymannZentrale Abteilung fr LaboratoriumsmedizinDRK-Kliniken Berlin

    Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  • Themen..Molekulargenetische MethodikVerfgbare SystemeIndikationenBeispieleAB0RhesusMNSKosten und AufwandFazit

    Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?

  • GrundlagenchromosomeZellkernDoppelstrngiges DNA MoleklIndividual nucleotidesRNAZellkernRNAProtein

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  • Molekulargenetische MethodikDNA-Vervielfltigung durch Polymerase-Kettenreaktion

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  • Molekulargenetische MethodikDNA-Vervielfltigung erfolgt Exponentiell1,07*109 Kopien der Zielregion werden bei 100% Effizienz in ca. 32 Zyklen erzeugt.

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  • Molekulargenetische MethodikAmplifikatdarstellung

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  • Molekulargenetische MethodikSequenzierungAmplifikat wird in die Kapillare injiziertSpannung wird angelegtAmplifikattrennung durch Lnge: Groe Strnge wandern langsamer durch das GelAmplifikate wandern zur AnodeFarbfluoreszenz der endstndigen Base wird detektiert

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  • Molekulargenetische Methodikweitere eingesetzte Verfahren

    Restriktionsfragment-Lngenpolymorphismen (RFLP)

    PCR-SSO (sequenzspezifische Oligonukleotide)

    Real-time-Verfahren

    Schmelzkurvenanalyse

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  • VorschriftenRichtlinien: Abschnitt 4.2.5 Die Wahl des Untersuchungsverfahrens ist unter Bercksichtigung des aktuellen Wissensstandes zu treffen. MPG, Qualittssicherung Ringversuch (INSTAND): AB0, Rhesus, Kell, Duffy, Kidd, MNS Kontrollen, Testreagenzien

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  • Verfgbare TestsystemeKommerziell erhltlich:AB0RhesusKell, (Kk, Kp(ab))KiddMNSDuffyLutheranCartwright (Yt)Colton (Co)KnopsWright, Diego (Di)Dombrock (Do)sonstwie durchgefhrt:McCoyChido,RodgersJs(ab)LewisXgLandsteiner-WienerGerbichCromerIiXK, Js(ab)SciannaT/TnP-GlobosideH/hIndianGIL, JMH, OK, RAPH

    bisher nicht testbar (z.B.):VelLan

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  • Verfgbare Testsysteme: eigene TestsInteressante Web-Seiten zum Thema:

    The Blood Group Antigen Gene Mutation Database: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/mhc/xslcgi.fcgi? cmd=bgmut/home Rhesusbase: http://www.uni-ulm.de/ ~fwagner/RH/RB/ NCBI Entrez Nucleotide http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ entrez/

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  • Indikationenwissenschaftliche FragestellungenZur Ergnzung von nicht eindeutigen serologischen ErgebnissenWenn keine serologischen Untersuchungen mglich sind:unsichere Antigenbestimmung bei Vortransfusion, Polyagglutinationsphnomen oder z.B. AIHABestimmung erythrozytrer Merkmale aus fetalen Materialiengenetische Disposition bei RisikoschwangerschaftenUntersuchung nach KMT, bei Chimrismusforensische FragestellungenVaterschaftsbegutachtungkriminalistische Zuordnung von Spuren zu Ttern

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  • Beispiele: AB0Das Gen fr die AB0-Transferasen liegt an Position 9q34.1-9q34.2Es kodiert fr ein Enzym, das endstndige Zucker an eine Grundsubstanz (H) anhngtAminosurevarianten verursachen:geringere TransferaseaktivittSpezifittswechsel des endstndigen Zuckers

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  • Beispiele: AB0Aktuell sind 168 Allele beschrieben (A 57, B 40, 0 66 + besondere 5)

    # Deletion eines Nukleotids erzeugt Frameshiftmutation mit zustzlich 21 AS

    AS-Pos156176216235266268291352A101ProArgPheGlyLeuGlyAspArgA201Leu#B101GlySerMetAlaB301GlySerMetAlaTrp0o1Basenmutation in Codon 87 erzeugt vorzeitiges Stopcodon0o3GlyArgcisABLeuAla

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  • Beispiele: AB0Probleme der AB0-Typisierung:

    Es existiert keine klare Vergleichbarkeit zwischen dem Allel und der serologischen Reaktion.Die Wertigkeit (Auswirkungsstrke) der spezifischen Aminosuren an speziellen Positionen ist nicht klar (z.B. B-Transferase weil Ala268 oder Gly176, nondeletionales 0-Allel).Letzter Ausschlu von A101 nur durch Fehlen von Missense- oder Nonsensemutation in den Exonen 1 bis 7 (Sequenzierung).Transfusionsrelevanz ?!

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  • Beispiele: Rhesusgnstige Situation: nicht glycosyliertes Membranprotein

    Testmglichkeiten:RhD, C,c,E,e,Cw..schwaches D: Dweak oder D partialD-ZygotiebestimmungCE-Haplotypbestimmung

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  • Beispiele: Rhesus

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  • Beispiele: Rhesus

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  • Beispiele: Rhesus

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  • Beispiele: RhesusProbleme der Rhesus-Typisierung:

    PCR-positiv Serologie-negativ durch seltene Basenmutationen, die D (oder auch CE) unterdrcken.Was wird kodiert was wird exprimiert?c (Cyt 48) -> Intron 4 Testung fr Cbisher >170 Allele allein im D-Gen und 53 verschiedene Dweak beschrieben -> Sequenzierung

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  • Beispiele: MNSSialoglycoproteinGlycophorin A (MN) und B (Ss)Ausgeprgte Homologien zwischen GpA, GpB und GpE in den ersten Exonen. Gene entwickelten sich durch Duplikation aus GpA PNAS, 1989, 86, 4619ffNur wenige Basenaustausche unterscheiden M und N (5 in In1, Ex2 und In2) und S und s (1 in Ex4).GpBNH2GpAGpBGpEExon1 Exon2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 3-UT -28 2 15 227 377 1733 324 395 1822CTGTProteinstartHomologe Regionxx

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  • Beispiele: MNSProbleme der MNS-TypisierungProtokolle zeigen Schwchen:unterschiedliche Annealing-Temperaturen fr M und N bentigtTransfusion, 1993, 33, 119ffsehr lange AmplifikateAmplitype PEAusflle bei spezifischen Allelen In J Legal Med, 1996, 109, 216f

    PhnotypalterHybridNameGP.VwMi.IA-B-AGP.MurMi.IIIB-A-BSGP.BunMi.VIB-A-BGP.HFMi.XB-A-B

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  • Beispiele: MNSProbleme der MNS-Typisierung: FallPatientin E.K. 21 JahreAk-Differenzierung: Anti-S, EA

    PCR: NNSs

    Serologie: ss

    Hybridmolekl; AS-Variante, die spezifisches Epitop fr Ak zerstrt?Sequenzierung.M M M N N M S s

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  • weitere Probleme der BG-PCR:das Genprodukt erzeugt nicht direkt den Phnotyp, sondern ein umwandelndes Enzym: z.B. Lewis, P1, Ii

    Ringversuche, Qualittskontrolle

    Kontrollproben (positiv und negativ)

    Inhibitoren: z. B. Kidd, Lutheran

    seltene Allele: z. B. Rhesus D, FyX

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  • Kosten und AufwandSerologiePCR-SSPSequenzierung

    Aufwand + ++ +++

    Zeit + (ca. 45 Min) ++ (ca. 2 h) +++ (ca. 4h)

    Kosten (AB0) ca. 4-5 ca. 7-20 (inhouse) ca. 40-50 ca. 30 (kommerziell)GO (AB0)3980 5,83 3920 52,46 3920 52,46 (3981 10,49 )3922 29,14 3926 116,57

    Thermocycler zwischen 3000-7000 Photoanlage ca. 2000 Gelkammer, Spannungsgert ca. 700 Sequencer ca. 30.000 bis 100.000

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  • Fazit: Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?wenn PCR-Austattung fr andere Anwendungen vorhanden ist und/oder eine nennenswerte Anzahl von Problemfllen auftrittZukunftstechnologie: Erfahrungen mit molekulargenetischer Diagnostik sammelnKein Ersatz fr Serologie

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    Diagramm2

    97

    18

    9

    17

    5

    1

    4

    5

    Tabelle1

    AB0Rhesusgesamt

    schwache Ausprgung eines Merkmals286997

    einfache Bestimmung des Merkmals61218

    Familientestung639

    serologische Probleme (Ak..)12517

    Bestimmung bei starken WAK235

    Chimrismus101

    Autoantikrper gegen Merkmal044

    Vortransfusion325

    Tabelle1

    Tabelle2

    Tabelle3

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  • interessante Publikationen:AB0:Systematic analysis of the AB0 gene diversity within exons 6 and 7 by PCR screening reveals new AB0 allels. A. Seltsam et al. Transfusion 2003, 43; 428ffSingle tube multiplex PCR-SSCP analysis distinguishes 7 common AB0 alleles and readily identifies new alleles. S. Yip Blood 2000, 95/4; 1487ffMolecular genetics of the AB0 histo-blood group system. F. Yamamoto Vox sanguinis 1995, 69; 1ff (Fortsetzung in anderen Ausgaben)Amplified product lenghth polymorphism (AFLP): a novel strategy for genotyping the AB0 blood group. G. Watanabe Human Genetics 1997, 99; 34ffPolymorphisms at the AB0 locus in subgroup A individuals. M.L. Olsson Transfusion 1996, 36; 309ff

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  • interessante Publikationen:Rhesus:RHD/CE typing by polymerase chain reaction using sequence-specific primers. C. Gassner et. al. Transfusion 1997; Vol 37;1020ffGenetik des Rhesus-Blutgruppensystems. W.A.Flegel Deutsches rzteblatt 2007, 10; 573ffThe Rh blood group system: a review. N. Avent, M. Reid Blood 2000, 95/2; 375ffTesting for the D zygosity with three different methods revealed altered rhesus-boxes and a new wek D type. P. Perco et al. Transfusion 2003, 43; 335ffMolecular basis of weak D phenotypes. F. Wagner et al. Blood 1999, 93/1; 385ffRHD positive haplotypes in D negative europeans. F. Wagner et al. BMC Genetics 2001, 2; 10ffRHD gene deletion occured in the Rhesus box. F. Wagner, A. Flegel Blood 2000, 95/12; 3662ff

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  • interessante Publikationen:weiteres:Differentiation of autologous ABO, RHD, RHCE, KEL, JK, and FY blood group genotypes by analysis of peripheral blood samples of patients who have recently received multiple transfusions. P. Rozman et al. Transfusion 2000, 40; 936ffMolekulargenetische Blutgruppendiagnostik. T. Mller et.al. Deutsches rzteblatt 2001, 98/6; 317ffDNA analysis for the Dombrock polymorphism. M. Rios et al. Transfusion 2001, 41; 1143ffQuantitative Alleles of CR1: Coding sequence analysis and comparison of haplotypes in two ethnic groups. L. Xiang J. Immunology 1999, 163; 4939ffThe low-incidence MNS antigens Mv, sD, and Mit arise from single amino acid substitutions on GPB. J. Storry et al. Immunohematology 2001, 41; 269ff

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