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Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?. Dr. med. Guido Heymann Zentrale Abteilung für Laboratoriumsmedizin DRK-Kliniken Berlin. Themen. Molekulargenetische Methodik Verfügbare Systeme Indikationen Beispiele AB0 Rhesus MNS Kosten und Aufwand Fazit. Ziel der PCR-Untersuchung. - PowerPoint PPT Presentation
Blutgruppen-PCRLohnt sich der Aufwand?
Dr. med. Guido HeymannZentrale Abteilung für LaboratoriumsmedizinDRK-Kliniken Berlin
Heymann Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand? 2
Themen..
Molekulargenetische Methodik
Verfügbare Systeme Indikationen Beispiele
AB0 Rhesus MNS
Kosten und Aufwand Fazit
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Grundlagen
Ziel der PCR-UntersuchungZiel der PCR-Untersuchung
chromosome
Zellkern
Doppelsträngiges DNA Molekül
Individual nucleotides
RNAZellkern
RNA
Protein
Ziel der SerologieZiel der
Serologie
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Molekulargenetische Methodik
DNA-Vervielfältigung durch Polymerase-Kettenreaktion
Verlängerung (Extension)
DNA-Vorlage (Template)
5’
5’
3’
3’
5’
5’
3’
3’
Anlagerung Primer (anneal) 5’3’
3’5’
Forward primer
Reverse primer
Stränge werden getrennt
Denaturierung
5’
5’3’
3’
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Molekulargenetische Methodik
DNA-Vervielfältigung erfolgt Exponentiell
1,07*109 Kopien der Zielregion werden bei 100% Effizienz in ca. 32 Zyklen erzeugt.
1,07*109 Kopien der Zielregion werden bei 100% Effizienz in ca. 32 Zyklen erzeugt.
Original-DNA Zielregion
Thermal cycleThermal cycleThermal cycle
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Molekulargenetische Methodik
Amplifikatdarstellung
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Molekulargenetische Methodik Sequenzierung
Amplifikat wird in die Kapillare injiziert
Spannung wird angelegt
Amplifikattrennung durch Länge:Große Stränge wandern langsamer durch das Gel
Amplifikate wandern zur Anode
Farbfluoreszenz der endständigen Base wird detektiert
DetektorFenster
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Molekulargenetische Methodik
weitere eingesetzte Verfahren
Restriktionsfragment-Längenpolymorphismen (RFLP)
PCR-SSO (sequenzspezifische Oligonukleotide)
Real-time-Verfahren
Schmelzkurvenanalyse
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Vorschriften
Richtlinien:Abschnitt 4.2.5
„Die Wahl des Untersuchungsverfahrens ist unter Berücksichtigung des aktuellen Wissensstandes zu treffen.“
MPG, QualitätssicherungRingversuch (INSTAND): AB0, Rhesus, Kell, Duffy, Kidd, MNSKontrollen, „Testreagenzien“
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Verfügbare Testsysteme
Kommerziell erhältlich: AB0 Rhesus Kell, (Kk, Kp(ab)) Kidd MNS Duffy Lutheran Cartwright (Yt) Colton (Co) Knops Wright, Diego (Di) Dombrock (Do)
sonstwie durchgeführt: McCoy Chido,Rodgers Js(ab) Lewis Xg Landsteiner-Wiener Gerbich Cromer Ii XK, Js(ab) Scianna T/Tn P-Globoside H/h Indian GIL, JMH, OK, RAPH
bisher nicht testbar (z.B.):
Vel
Lan
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Verfügbare Testsysteme: eigene Tests
Interessante Web-Seiten zum Thema:
The Blood Group Antigen Gene Mutation Database:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/mhc/xslcgi.fcgi?cmd=bgmut/home
Rhesusbase:http://www.uni-ulm.de/~fwagner/RH/RB/
NCBI Entrez Nucleotidehttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/
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Indikationen
wissenschaftliche Fragestellungen Zur Ergänzung von nicht eindeutigen serologischen Ergebnissen Wenn keine serologischen Untersuchungen möglich sind:
unsichere Antigenbestimmung bei Vortransfusion, Polyagglutinationsphänomen oder z.B. AIHA
Bestimmung erythrozytärer Merkmale aus fetalen Materialien genetische Disposition bei Risikoschwangerschaften Untersuchung nach KMT, bei Chimärismus
forensische Fragestellungen Vaterschaftsbegutachtung kriminalistische Zuordnung von Spuren zu Tätern
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Beispiele: AB0
Das Gen für die AB0-Transferasen liegt an Position 9q34.1-9q34.2 Es kodiert für ein Enzym, das endständige Zucker an eine
Grundsubstanz (H) anhängt Aminosäurevarianten verursachen:
geringere Transferaseaktivität Spezifitätswechsel des endständigen Zuckers
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Beispiele: AB0
AS-Pos 156 176 216 235 266 268 291 352
A101 Pro Arg Phe Gly Leu Gly Asp Arg
A201 Leu #
B101 Gly Ser Met Ala
B301 Gly Ser Met Ala Trp
0o1 Basenmutation in Codon 87 erzeugt vorzeitiges Stopcodon
0o3 Gly Arg
cisAB Leu Ala
Aktuell sind 168 Allele beschrieben (A 57, B 40, 0 66 + besondere 5)
# Deletion eines Nukleotids erzeugt Frameshiftmutation mit zusätzlich 21 AS
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Beispiele: AB0
Probleme der AB0-Typisierung:
Es existiert keine klare Vergleichbarkeit zwischen dem Allel und der serologischen Reaktion.
Die Wertigkeit (Auswirkungsstärke) der spezifischen Aminosäuren an speziellen Positionen ist nicht klar (z.B. B-Transferase weil Ala268 oder Gly176, nondeletionales 0-Allel).
Letzter Ausschluß von A101 nur durch Fehlen von Missense- oder Nonsensemutation in den Exonen 1 bis 7 (Sequenzierung).
Transfusionsrelevanz ?!
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Beispiele: Rhesus günstige Situation: nicht glycosyliertes Membranprotein
Testmöglichkeiten: RhD, C,c,E,e,Cw.. schwaches D: Dweak
oder D partial D-Zygotiebestimmung CE-Haplotypbestimmung
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Beispiele: Rhesus
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Beispiele: Rhesus
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Beispiele: Rhesus
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Beispiele: Rhesus
Probleme der Rhesus-Typisierung:
„PCR-positiv Serologie-negativ“ durch seltene Basenmutationen, die D (oder auch CE) unterdrücken.
Was wird kodiert – was wird exprimiert? c (Cyt 48) -> Intron 4 Testung für C bisher >170 Allele allein im D-Gen und 53 verschiedene Dweak
beschrieben -> Sequenzierung
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Beispiele: MNS
Sialoglycoprotein Glycophorin A (MN) und B (Ss) Ausgeprägte Homologien zwischen GpA, GpB und GpE in den
ersten Exonen. Gene entwickelten sich durch Duplikation aus GpAPNAS, 1989, 86, 4619ff
Nur wenige Basenaustausche unterscheiden M und N (5 in In1, Ex2 und In2) und S und s (1 in Ex4).
GpB
1 1Ser/Leu1
SerThrThrGly/Glu5
GpA
Leu1
SerThrThrGlu5
NH2
COOHCOOH
131
72
MN
´N´29Met/Thr
S s
NH2
GpA
GpB
GpE
Exon1 Exon2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 3´-UT
-28 2 15 227 377 1733 324 395 1822
CT
GT
Proteinstart
Homologe Region
x x
X-Over
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Beispiele: MNS
Probleme der MNS-Typisierung Protokolle zeigen Schwächen:
unterschiedliche Annealing-Temperaturen für M und N benötigtTransfusion, 1993, 33, 119ff
sehr lange Amplifikate Amplitype PE
Ausfälle bei spezifischen Allelen In J Legal Med, 1996, 109, 216f
Phänotyp alter HybridName
GP.Vw Mi.I A-B-AGP.Mur Mi.III B-A-BS
GP.Bun Mi.VI B-A-BGP.HF Mi.X B-A-B
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Beispiele: MNS
Probleme der MNS-Typisierung: Fall Patientin E.K. 21 Jahre Ak-Differenzierung: Anti-S, EA –
PCR: NNSs
Serologie: ss
Hybridmolekül; AS-Variante, die spezifisches Epitop für Ak zerstört?
Sequenzierung….
M M M N N M S s
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weitere Probleme der BG-PCR:
das Genprodukt erzeugt nicht direkt den Phänotyp, sondern ein umwandelndes Enzym:z.B. Lewis, P1, Ii
Ringversuche, Qualitätskontrolle
Kontrollproben (positiv und negativ)
Inhibitoren: z. B. Kidd, Lutheran…
seltene Allele: z. B. Rhesus D, FyX…
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Serologie PCR-SSP Sequenzierung
Aufwand + ++ +++
Zeit + (ca. 45 Min) ++ (ca. 2 h) +++ (ca. 4h)
Kosten (AB0) ca. 4-5 € ca. 7-20 € (inhouse) ca. 40-50 €ca. 30 € (kommerziell)
GOÄ (AB0) 3980 5,83 € 3920 52,46 € 3920 52,46 € (3981 10,49 €) 3922 29,14 € 3926 116,57
€
Thermocycler zwischen 3000-7000 € Photoanlage ca. 2000 € Gelkammer, Spannungsgerät ca. 700 € Sequencer ca. 30.000 bis 100.000 €
Kosten und Aufwand
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Fazit: Blutgruppen-PCR Lohnt sich der Aufwand?
wenn PCR-Austattung für andere Anwendungen vorhanden ist und/oder eine nennenswerte Anzahl von Problemfällen auftritt
„Zukunftstechnologie“: Erfahrungen mit molekulargenetischer Diagnostik sammeln
Kein Ersatz für Serologie
61%12%
6%
11%
3%
1% 3%3% schwache Ausprägung einesMerkmals
einfache Bestimmung desMerkmals
Familientestung
serologische Probleme (Ak..)
Bestimmung bei starken WAK
Chimärismus
Autoantikörper gegen Merkmal
Vortransfusion
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interessante Publikationen:
AB0: Systematic analysis of the AB0 gene diversity within exons 6 and 7 by PCR
screening reveals new AB0 allels. A. Seltsam et al. Transfusion 2003, 43; 428ff
Single tube multiplex PCR-SSCP analysis distinguishes 7 common AB0 alleles and readily identifies new alleles. S. Yip Blood 2000, 95/4; 1487ff
Molecular genetics of the AB0 histo-blood group system. F. Yamamoto Vox sanguinis 1995, 69; 1ff (Fortsetzung in anderen Ausgaben)
Amplified product lenghth polymorphism (AFLP): a novel strategy for genotyping the AB0 blood group. G. Watanabe Human Genetics 1997, 99; 34ff
Polymorphisms at the AB0 locus in subgroup A individuals. M.L. Olsson Transfusion 1996, 36; 309ff
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interessante Publikationen:
Rhesus: RHD/CE typing by polymerase chain reaction using sequence-specific
primers. C. Gassner et. al. Transfusion 1997; Vol 37;1020ff Genetik des Rhesus-Blutgruppensystems. W.A.Flegel Deutsches Ärzteblatt
2007, 10; 573ff The Rh blood group system: a review. N. Avent, M. Reid Blood 2000, 95/2;
375ff Testing for the D zygosity with three different methods revealed altered
rhesus-boxes and a new wek D type. P. Perco et al. Transfusion 2003, 43; 335ff
Molecular basis of weak D phenotypes. F. Wagner et al. Blood 1999, 93/1; 385ff
RHD positive haplotypes in D negative europeans. F. Wagner et al. BMC Genetics 2001, 2; 10ff
RHD gene deletion occured in the Rhesus box. F. Wagner, A. Flegel Blood 2000, 95/12; 3662ff
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interessante Publikationen:
weiteres: Differentiation of autologous ABO, RHD, RHCE, KEL, JK, and FY blood group
genotypes by analysis of peripheral blood samples of patients who have recently received multiple transfusions. P. Rozman et al. Transfusion 2000, 40; 936ff
Molekulargenetische Blutgruppendiagnostik. T. Müller et.al. Deutsches Ärzteblatt 2001, 98/6; 317ff
DNA analysis for the Dombrock polymorphism. M. Rios et al. Transfusion 2001, 41; 1143ff
Quantitative Alleles of CR1: Coding sequence analysis and comparison of haplotypes in two ethnic groups. L. Xiang J. Immunology 1999, 163; 4939ff
The low-incidence MNS antigens Mv, sD, and Mit arise from single amino acid substitutions on GPB. J. Storry et al. Immunohematology 2001, 41; 269ff