Eisenwiener, Morger, Lergier und Gillessen: Bestimmung der p-Amhiobenzoesäure mit Fluram® im Urin 557

J. Clin. Chem. Clin. Biochem.Vol. 20, 1982, pp. 557-565

Die Bestimmung der p-Aminobenzoesäure mit Fluram® im Urin nach Durchführung desPankreasfunktionstests mit Bentiromid

Von //. G. Eisenwiener > F. Morger, W. Lergier und D. Gillessen

Aus den Forschungs- und Entwicklungs-Laboratorien der Sparte Diagnostica, Firma F. Hoffmann-La Röche & Co. A G,Basel

(Eingegangen am 11. Dezember 1981/20. April 1982

Zusammenfassung: Es wird ein Verfahren vorgestellt, das bei der Durchführung des Pankreas-Funktions-Tests die Aus-scheidung von p-Arninobenzoesäure in Urin nach Verabreichung von Bentiromid (N-Benzoyl-£-tyrosyl-p-aminobenzoe-säure) mit (Fluram) (Fluorescamin) bestimmt. Das Verfahren liefert zuverlässige Werte und erlaubt eine einfache fakto-rielle Berechnung der ausgeschiedenen Menge anp-Aminobenzoesäure.

The Use of Fluram R for the determination ofp-aminobenzoic acid in test for pancreatic function with bentiromide

Summary: A procedure is presented for the use of <Fluram> (Fluorescamine) in the detection ofp-aminobenzoic acidin urine after administration of bentiromide (N-benzoyl-/,-tyrosyl-p-aminobenzoic acid) äs a pancreas function test.This procedure gives accurate values and allows a simple factorial calculation of the amount ofp-aminobenzoic acidexcreted.

Einführung

Für die Bestimmung der p-Aminobenzoesäure im Urinwurde bislang die Methode von Bratton-Marshatt (1)beziehungsweise Modifikationen davon eingesetzt.Alle auf dieser Methode basierenden Verfahren bestim-men p-Aminobenzoesäure oder andere diazotiefbareprimäre Arylamine über die Bildung eines stabilenAzofarbstoffes. In unseren Forschungslabpratorienwurde die Möglichkeit des Einsatzes von Flüorescämin(Fluram) zur photornetrischen Bestimmung der p-Aminobenzpesäure und ihrer Metaboliten im Urinerarbeitet.

Reagenzien, Vorbereitungen und Vorgehen

Chemikalien(Fluram) Röche (3) (Fluorescamin) =l4-phenylspiro furan-2(3H),l'-phthalanh3,3'-dipn, 4-Aminobenzoesäure puriss. 99%(Fluka), Ethanol 95% (Merck), Käliumchlörid z. A. (Merck),'NatriumacetatJcrist. z.A.,(Merck), Essigsäure z.A. (Merck),Natriumnitrit z. A. (Merck), Am.moniumamidosulfonat z. A.(Merck), N-(l-Naphthyl)-ethylendiammoniumdichlorid z, A.(Merck), Salzsäure rauchend 37% (Meick), Salzsäure 32%z. A. (Merck).

Reaktionslösungen für die <Fluram)-Methode. Pufferlösungen: KCl/ffÖl-Puffer, pH 2,4: 950 ml Kalium-

chlorid 0,1 mol/1 (7,456 g/l) und 50 mlSalzsäure 0,1 mol/1 werden gemischt.

2. Fluramlösung:3. Standardlösung:

Natriumacetatpuffer, pH 3,0: 6,80 gNatriumacetat in ca. 500 ml dest. Wasserlösen, 105 g Essigsäure zusetzen und mitdest. Wasser auf 1000 ml auffüllen.l g/l in Ethanol, 950 ml/l.18,2 mg 4-Aminobenzoesäure werden ineinem 100 ml-Meßkolben mit 10 ml Ethanol950 ml/l gelöst und mit KCl/HCl- oderAcetatpuffer auf 100 ml aufgefüllt.

4. Chromogen- Diese wird stets frisch durch Mischen vonGebrauchslösung: 100 ml Pufferlösung und 30 ml Fluram-

lösung hergestellt.

Reaktiönslösungen für die modifizierte Bratton-Marshall-Methode1. Natriumnitrit- 14,49 mmol/1: l g/l bidest. Wasser.

Lösung:2. Ammonium- 43,81 mmol/1: 5 g/l bidest. Wasser,

amidosulfonat-Lösung:

3. Naphthyl- 3,86 mmol/l: l g/l bidest. Wasser (inethylendiamih- brauner Flasche aufbewahren).Lösung:

VorbereitungenDie Urine werden je nach dem Ausscheidungsvolumen folgender-maßen verdünnt:bei Ausscheidung von < 120 ml: l Teil Urin + 9 Teile Wasserbei Ausscheidung von 120-500 ml: l Teil Urin + 4 Teile Wasserbei Ausscheidung von > 500 ml: unverdünntDie Urine wurden sowohl l h bei etwa 96 ± 2 °C als auch 16 hbei 37 °C mit Salzsäure (30% ~ 10 mol/1) inkubiert, wofür l ml

0340-076X/82/0020-0557$02.00© by Walter de Gruyter & Co. - Berlin · New York

558 Eisen wiener, Morger, Lergier und Gillcssen: Bestimmung der p-Aminobenzoesäure mit Fluram® im Urin

Urin und 0,1 ml Salzsäure 10 mol/1 angesetzt wurden. Der Ein-fluß der Inkubationszeiten auf das Ausmaß der Hydrolyse wurdenäher untersucht. Die späteren Befunde zeigten, daß auch mitSalzsäure 25% (~ 7,5 mol/1) gearbeitet werden kann.

Durchführung des Pankreas-Funktions-TestsDer Pankreas-Funktions-Test wurde folgendermaßen durchge-führt: Nach der Entleerung der Blase wurden 200 ml Flüssigkeitzum Trinken gegeben und die nach l h ausgeschiedene MengeUrin gemessen (= Vg). Anschließend wurde nach Verabreichungvon Bentiromid und Trinken von etwa 400 ml Flüssigkeit inner-halb der nächsten Stunden, die während 6 h ausgeschiedeneMenge an Urin (= VA) gemessen. In beiden Urinmengen VA undVß wurden die p-Aminobenzoesäure-Konzentrationen bestimmt.Bei der <Fluram>-Methode wurden bei 30 Proben sowohl bei derErmittlung des Ausscheidungswertes als auch des Basiswertes stetsProben-Leerwerte mitgeführt. Die Hydrolyse wurde bei 96 °Cteilweise während 60 min, teilweise während 30 min Inkubationund mit 300 g/kg beziehungsweise 250 g/kg HC1 durchgeführt.

Vorgehen mit der (Fluram)-MethodeWeder die auf Bratton & Marshall zurückgehenden Methodennoch diese neue Methode mit (Fluram) sind auf p-Aminobenzoe-säure absolut spezifisch; <Fluram) erfaßt unter den hier gewähltenBedingungen generell primäre Arylamine. Aus diesem Grundewurde prinzipiell je eine Urinprobe vor (für den Basiswert) undnach der Belastung (für den Ausscheidungswert) eingesetzt.Da während der Hydrolyse des Urins eine Braunfärbung -deren Intensität bei den verschiedenen Proben unterschiedlichist - auftritt, wurden prinzipiell Proben-Leerwerte mitgeführt,um deren Einfluß auf die Bestimmung zu ermitteln. Dazu wurdenalle Absorptionen ausschließlich gegen eine mit Wasser gefüllteKüvette gemessen. Die Berechnung erfolgte über einen mitge-führten Standard von 182 mg/1 p-Aminobenzoesäure. In dieBerechnung geht dann infolge der Verdünnung des Urins für denInkubationsschritt (l ml Urin + 0,1 ml Salzsäure) der Faktor182 X 1,1 =200 mg/1 ein:

A (P)p-Aminobenzoesäure: c [mg/l] = —— X 200A (S)

wobei A (P) = gemessene Absorptionsdiffe-renz zwischen Probe undProben-Leerwert

A (S) = gemessene Absorptionsdiffe-renz zwischen Standard undReagenzien-Leerwert

PipettierschemaP = Probe, PL = Proben-Leerwert, S = Standard, RL = Reagen-zien-Leer wer t, A = Absorption.

Ansätze (in )

Basis- Aussehei- Swert dungswertP! PL, P2 PL2

RL

Hydrolysierter Urin 50 50(von vor" der Ein-nahme)Hydrolysierter Urin - - 50 50- -(von nach der Ein-nahme)Standard (l 82 mg/1) - - - - 50 -Dest. Wasser _ _ _ _ _ 5 0Pufferlösung - 2500 - 2500 -Chromogen- 2500 - 2500 - 2500 2500Gebrauchslösung

Gut mischen und etwa 10 min reagieren lassen.

Da der jeweilige Einfluß der einzelnen Komponenten zu ermittelnwar, wurden alle Absorptionen gegen Wasser gemessen und fürdie Berechnung folgende Differenzen gebildet:

A(Pi)-A(PLi)-A(RL)A(P2)-A(PL2)-A(RL)A(S) -A(RL)

Um den Einfluß der einzelnen Einflußgrößen auf die Aussehetdungsmenge zu eruieren, wurden folgende Berechnungen durch-geführt:a) Berücksichtigung der Proben-Leerwerte sowohl beim Aus-scheidungs- als auch beim Basiswert.

Verfahren I:r f Aga)-A(PLa)-A(RL)TW [mg] = U—-- *—«—-—

L A(S) - A(RL)

·*[·—iLOOOL

A(Pi)-A(PLi)-A(RL)

X 200 X V X —^-1 - (Gl. 1)1000 J Ausscheidurigswert

A(S) - A(RL)

200 XlOOOJ Basiswert

b) Berücksichtigung des Proben-Leerwertes nur bei dem Aus-scheidungswert (Verfärbung durch Hydrolyse).

Verfahren II:f f A(P2) - A(PL2) - A(RL)m [mgj = ---------------- - -

A(S)^-A(RL)

X 200 X V X

6 X

1000 J AusscheidungswertA(Pi)-A(RL)

- (Gl. 2)

A(S) - A(RL)

200 X -̂ 5-11ÖOOJ Basiswert

c) keine Berücksichtigung der Proben-Leerwerte.Verfahren III: ' '··-

mL A(S) - A(RL)

VAX 200 X V X

lOOOJ AusscheidungswertAflPO-AiRl)

- (Gl. 3)

A(S)-A(RL)

200 XlOOOJ Basiswert

d) Weder Berücksichtigung von Pröben-Leerwerten noch vonBasiswerten.

Verfahren IV:

m [mg] = fA(P2)-A(RL)l A(S) - A(RL)

X 200 X V X1000J Ausscheidungswert .

(GL 4)

m = p-Aminobenzoesäure [mg]V = Verdünnung des UrinsVA = Gesamtmenge der Urinausscheidung in mlVß = Urinmenge pro Stunde vor der Einnahme; der Faktor 6

ergibt sich unter der Annahme, daß die vom Test unab-0 hängige stündliche Basisausscheidung während der sechs-

stündigen Testzeit die gleiche ist, wie in der Kontroll·periode. -;

J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 20, 1982 / No. 8

Eisenwiener, Morger, Lergier und Gillessen: Bestimmung der p-Aminobenzoesäure mit Flurarn® im Urin 559

Die relative Ausscheidung von p-Aminobenzoesäure ergibt sichunter Zugrundelegung der theoretisch möglichen Menge von339 mg bei Verabreichung von l g Bentiromid (= N-Benzoyl-,-tyrosyl-p-aminobenzoesäure) als

Anteil ausgeschieden = 0,295 X m,bzw. von 322 mg bei Verabreichung von l g des entsprechendenNatriumsalzes als

Anteil ausgeschieden = 0,311 X m.

Vorgehen bei der modifizierten Bratton-Marshall-MethodeDie modifizierte Bratton-Marshall-Meihode wurde wie folgt durch-geführt: Die Urinhydrolysate wurden so weit verdünnt, daß ihrGehalt zwischen 0,5 und 2,5 mg/1 an p-Aminobenzoesäurebetrug. Zu l ml verdünntem Urin wurden 0,2 ml HC11,2 mmol/1und 0,1 ml Natriumnitrit-Lösung gegeben und nach 4 min 0,1 mlAmmoniumamidosulfonat-Lösung zugesetzt und wiederum4 min gewartet. Dann wurden 0,1 ml Naphthylethylendiamin-Lösung dem Ansatz zugefügt und nach 10 min die Absorptionbei 546 nm gegen den Reagenzien-Leerwert gemessen. DieBerechnung erfolgte über eine Standardkurve.

Ergebnisse

Optimierung der Inkubationsbedingungen bezüglichHydrolyseDas Arbeiten mit 300 g/kg HC1 (-10 mmol/1) ist geruchs-belästigend und die Pipettierung nicht problemlos.

Der zeitaufwendigste Schritt der p-Aminobenzoesäure-Bestimmung ist der Hydrolyseschritt. Dieser sollte effek-tiv und möglichst bei Raumtemperatur beziehungsweisebei 37 °C ausführbar sein sowie keine langen Inkuba-tionszeiten erfordern.

Um den Einfluß der Hydrolysezeit zu eruieren, wurdenUrine verschieden lange inkubiert und die p-Amino-benzoesäure-Kqnzentratioh riach der Hydrolyse be-stimmt.

Aus den Abbildungen l und 2 gehen die Abhängigkeitder Inkubation bei 37 °C und 96 °C mit 300 g/kg HC1

uoo-

uoo

0 10 20 30 45 60 90 120t [min 3

160

Abb. la. Bestimmung der p-Ammobenzoesäure. Abklärungder erforderlichen Inkubationszeiten bei 96 °C mitHC1 300 g/kg. Kurve l, 2, 3: Einsatz von 3 verschie-denen Urinen.

= 1200cn

71000

g 800

.i<t

600

400

200

0 5 10 15 20 25 30t [ m i n ]

45 60

Abb. Ib. Bestimmung der p-Aminobenzoesäure. Abklärung dererforderlichen Inkubationszeiten bei 96 °C mit HC1250 g/kg. Kurve l, 2, 3: Einsatz von 3 verschiedenenUrinen.

1400-

0 1 4 8 16t [h]

32 48

Abb. 2. Bestimmung der p-Aminobenzoesäure. Abklärung dererforderlichen Inkubationszeiten bei 37 °C mit HC1300 g/kg. Kurve l, 2, 3: Einsatz von 3 verschiedenenUrinen.

(~ 10 mmol/1) hervor. Die Ergebnisse zeigen, daßmindestens 32 h bei 37 °C inkubiert werden muß, umdie gleichen Ergebnisse zu erhalten wie nach etwa30 min bei 96 °C.

30 min Inkubationszeit bei etwa 96 °C erwiesen sich alsausreichend. Die dunklere Farbe der Hydrolysate beiInkubation von 96 °C spielt eine untergeordnete Rolle,da das Proben- zu Reagenzvolumenverhältnis bei deranschließenden photometrischen Bestimmung l :50beträgt. Auch kann durch Mitfuhren eines Proben-Leer-wertes die Eigenfarbe des hydrolysierten Probengutesberücksichtigt werden. Ein größeres Problem stellendie manchmal auftretenden Niederschläge währendder Hydrolyse dar. Um anschließend reproduzierbare,photometrische Bestimmungen ausführen zu können,wird eine Zentrifugation empfohlen.

J. Clin. Chem, Clin. Biochem. / Vol. 20,1982 / No. 8

560 Eisenwiener, Morger, Lergier und Gillessen: Bestimmung der /7-Aminobenzoesäure mit Fluram® im Urin

Aus den Abbildungen l a, Ib und 2 folgt, daß aus zeit-lichen Gründen die Inkubationstemperatur von etwa96 °C beibehalten werden sollte. Aus Abbildung 3 istersichtlich, daß eine 250 g/kg Salzsäure zur Hydrolyseausreichend ist. Versuche, das Verhältnis Urinvolumenzu Salzsäure-Volumen zu verändern, zeigten, daß dasVerhältnis 10 Teile Urin zu l Teil Salzsäure am bestengeeignet ist. Es traten weniger Trübungen beziehungs-weise Ausfällungen auf.

0,1 -

HOO

,-,1200

-1000)

:§ 800QJO

I 600

<t 400

200

370 350 320 300H Cl [g/kg l

250 200

Abb. 3. Bestimmung der p-Aminobenzoesäure. Abklärung dererforderlichen Salzsäure-Konzentration. Inkubationszeit30 min, Inkubationstemperatur 96 °C. Kurve l, 2, 3:Einsatz von 3 verschiedenen Urinen.

Aus den Versuchen ist zu schließen, daß eine Hydrolysemit 250 g/kg Salzsäure während 30 min bei etwa 96 °Cbei einem Volumenverhältnis Urin zu Salzsäure von10:1 optimal sein dürfte.

SpektrumAbbildung 4 zeigt den Verlauf der Spektren der Reak-tionsansätze aus 2,5 ml Chromogen-Gebrauchslösungund 50—250 p-Aminobenzoesäure 182 mg/1. Kurve Izeigt das Spektrum des Reagenzien-Leerwertes. AlleAbsorptionsmaxima (402/403 nm) liegen unter dengewählten Bedingungen übereinander.

Farbentwicklungskuve und Färb StabilitätAus Abbildung 5 gehen die Farbentwicklungskürveund die Farbstabilität eines Reaktionsansatzes aus 2,5ml Chromogen-Gebrauchslösung und 50 p-Amino-benzoesäure-Standard hervor. Es ist ersichtlich, daß dieFarbentwicklung unter den gewählten Bedingungennach 6 min bereits abgeschlossen ist. Die Absorptions-stabilität ist mindestens 20 min lang gegeben, danachist die Absorptionsabnahme etwa 0,005 Absorptions-einheiten pro Stunde.

Abb. 4. Bestimmung der/7-Aminobenzoesäure. Spektrenauf-nahme der Reaktionsansätze.2,5 ml Chromogen-Gebrauchslösung+ 50 1( ) Wasser+ 50 1( )+ 100 (III)+ 150 (IV)

/7-Aminobenzoesäure182 mg/1

+ 200 (V)+ 250 (VI)Welleniängfcnbereich: 350-500 nmPapiervorschub: 5 cm/min = 50 nm/minRegistrierung: I-III: A = 0 - 0.1 (l x)

IV-VI: A = 0 - 0.2 (0.5 x)

ab- geänderterPapierschuto

j ^10

t [min]Ib 90

Abb. 5. Bestimmung der/7-Aminobenzoesäure. Farjbentwicklungs-kurve und Farbstabilität.Reaktionsansatz: 2,5 ml Chromogen-Gebrauchslösuiig

50 p-Aminobenzoesäure 182 mg/i. Papiervorschub: 0—20 min - l cm/min, dann

0,1 cm/minWellenlänge: 402 nm .;

J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 20, 1982/No. 8

Eiscnwiener, Morger, Lergier und Gillessen: Bestimmung der p-Aminobenzoesäure mit Fluram® im Urin 561

Lineari tat und EmpfindlichkeitAbbildung 6 zeigt, daß bei diesem Vorgehen und beiden eingesetzten Konzentrationen ein gesicherter Line-aritätsbereich bis 700 mg/1 p-Aminobenzoesäure vor-liegt. Die Empfindlichkeit ist etwa 0,0022 Absorptions-einheiten pro mg/1 p-Aminobenzoesäure.

2,000

1500

1,000

0,500

0 50 200 400 600 800p-Aminobenzoesäure [mg/l]

1000

Abb. 6. Bestimmung der p-Aminobenzoesäure. Linearität undEmpfindlichkeit.

2,5 ml Chromogen-Gebrauchslösung50 jul Probemenge

Präzision und Abklärung einer faktoriellen Berechnungs-möglichkeit

3. Faktorielle Berechnung:Über 6 Wochen wurden täglich mehrere Standardsmitgefuhrt und aus der Größe A(S) - A (RL) derBerechnungsfaktor ermittelt.Der Berechnungsfaktor schwankte bei 136 innerhalbvon 6 Wochen durchgeführten Bestimmungen beieinem Mittelwert von 4620 (s = 8,7, VK = 1,9%) ummaximal 389; Maximalwert: 4454. Die sehr guteReproduzierbarkeit der Größe A(S) - A(RL) erlaubtes, die Berechnung auch direkt mit einem Faktor vor-zunehmen.

VergleichsuntersuchungenIm Urin von 44 Patienten, bei denen der Pankreas-Funktions-Test durchgeführt worden war, wurden vorund nach der Einnahme von Bentiromid die Ausschei-dung an /7-Aminobenzoesäure sowie sich wie diep-Aminobenzoesäure verhaltenden Komponenten sowohlnach der Bratton-Marshall- als auch nach der (Fluram)-Methode ermittelt.

Aus Tabelle 2 geht ein Vergleich der erhaltenen Aus-scheidungswerte von 28 Patientenproben, bei denen alle4 Verfahren parallel durchgeführt wurden, hervor.

Tab. 2. Bestimmung der p-Aminobenzoesäure. Vergleich dernach den verschiedenen Berechnungsverfahren erhal-tenen Resultate (mit/ohne Berücksichtigung vonProben-Leerwerten und Analysen der Basis-Ausschei-dungswerte). Die Bratton-Marshall-Methode wurde stetsohne Proben-Leerwert durchgeführt.

Für die Präzisionsaussagen wurden folgende Daten er-halten (vgl. Tab. 1):

1 . Präzision der Inkubation (Hydrolyseschritt):3 Urine wurden in 12-fach-Bestimmung hydrolysiert.

2. Präzision der photometrischen Bestimmung:In 3 hydrolysierten Urinen wurden in 12-fach-Bestimmung die p-Aminobenzoesäure bestimmt.

Tab. 1. Bestimmung der p-Aminobenzoesäure. Präzisionsdatenfür HydiolyserSchritt und photometrische Bestimmung.

a) Präzision der Inkubation(n =12) s VK(%)

. l cm Urinl 0,259 0,002 0,9*A402nm Urin 2 0,620 0,004 0,6

Urin 3 0,307 0,003 1,1

Die Hydrolyse wurde 12 X und die photometrische Bestimmung1 X durchgefühlt.

b) Präzision der photometrischen Bestimmung(n = 12) s VK (%)

A A l c m Urinl 0,251 0,001 0,3AA402nm Uria2 0,603 0,003 0,4Urin 3 0,300 0,001 0,4 .

Die Hvdrolvse wurde bei iedem Urin nur 1 X durchgeführt.

p-Aminobenzoesäure [mg]Urin-Nr.

123456789

1lu111213i j14151617·*· /

1819202122232425262728

Bratton-Marshall

285,0244,0277,0170,0251,0268,0245,0270,0134,0£/·\ r\6U,U242,0206,0m o,V/

268,0277,0131,0159,0287*0

80,0242,0293,0230,0278,0179,0302,0236,0103,0327,0

Ver-fahrenI

257,0243,9230,4152,8219,8242,4218,8254,6111,1ro QJ J,;7

208,5193,2121,3250^9206,497,4

131,9249,*978,0

195,1248,6203,9232,9151,4258,9190,585,7

291,9

Ver-fahrenII

251,3232,0226,1147,9214,0235,4213,4219,0107,440 3*t^Lyj

199,0185,3107,2239^6197,292,8

118,1241,*751,7

127,0239,5193,5218,3143,9254,2184,477,9

271,2

Ver-fahrenIII

256,7237,2240,5153,5221,4251,8223,1236,0116,4

AQ ö*f O,ö

218,6195,2111,4248,4233,9126,3127,82594

67,0157,6253,2214,0243,2160,6275,1204,4

93,1293,0

Ver-fahrenIV

265,6241,9247,5161,8235,2261,7231,2274,5122,1

£A Q,-7233,1206,8128,2267^3249,0134,5146,4271,'l

92,0228,3265,0220,7259,3166,8280,4211,5102,9313,0

J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 20, 1982 / No. 8

562 Eisenwiener, Morger, Lergier und Gillessen: Bestimmung der p-Aminobenzoesäure mit Fluram® im Uiin

Verfahren I (Berechnung gemäß Gl. 1):Mit Berücksichtigung aller Proben-Leerwerte und mitBerücksichtigung von 6 X Basiswert-Ausscheidung.

Verfallen II (Berechnung gemäß Gl. 2):Ohne Proben-Leerwert beim Basisurin und Berücksich-tigung von 6 X Basiswert-Ausscheidung.

Verfahren III (Berechnung gemäß Gl. 3):Ohne Proben-Leerwert-Berücksichtigung beim Ausschei-dungs- und Basisurin und Berücksichtigung von 6 X Basis-wert-Ausscheidung.

Verfallen IV (Berechnung gemäß Gl. 4):Ohne jegliche Berücksichtigung von Proben-Leerwert undBasis-Ausscheidung.

Von den untersuchten Patientenurinen waren einige tief-gefroren, die anderen im Kühlschrank mindestens14 Tage aufbewahrt worden. Bei den tiefgefrorenenUrinen tritt nach dem Auftauen eine Trübung in Erschei-nung. Es ist notwendig, solche Urine vor der Entnahmeeines entsprechenden Volumens für die Hydrolyse aufRaumtemperatur zu bringen und gut zu homogenisieren.

Diskussion

In Tabelle 3 sind die statistischen Daten der 28 parallelnach 4 Verfahren und der Braffon-Marshall-Methode

durchgeführten Bestimmungen aufgezeigt (Korrelations·diagramm). Aus dem Diagramm ergeben sich folgendeSchlußfolgerungen (vgl. auch Abb. 7):1. Der größte Korrelationskoeffizient (0,992) wird

zwischen der Bmton-MarshallMetfote und VerfahrenIV (ohne jegliche Berücksichtigung von Proben- undAusscheidungswerten) erhalten. Dies ist erklärlich,denn auch bei der Brntton^Marshalt-Methode wurdenkeine Proben^Leerwerte berücksichtigt.

2. Die nach der Bratton-Marshall-Methode erhaltenenWerte liegen zwischen 5 und 10% höher.

3. Je exakter die Bestimmung durchgeführt wird (Ver-fahren I und Verfahren II), desto größere Diskre-panzen ergeben sich gegenüber der Bratton-Marshall-Methode. Daraus ist ersichtlich, daß die Proben-Leerwerte keine unbedeutende Rolle spielen. DieDurchführung gemäß Verfahren I ist jedoch sehr zeit-aufwendig und erfordert die Mitführung zahlreicherAnsätze.

Aus der Gegenüberstellung der nach den 4 verschiedenenBerechnungsmöglichkeiten unter teilweiser Berücksich-tigung sowohl der Basis-Ausscheidung als auch derProben-Leerwerte ergibt sich jedoch, daß die einfachsteBerechnung (ohne Proben-Leerwerte und ohne Berück-sichtigung des Basiswertes) im allgemeinen für klinisch-chernische Schlußfolgerungen ausreichend sein dürfte.

Die sich wie p-Aminobenzoesäure verhaltenden Sub-stanzen im Basisurin (Basis-Ausscheidung X 6) machteneinen Anteil von 0,014 ari der Gesamt ̂ Ausscheidung aus(n = 29, = 0,0133, Maximal-Betrag 0,083, Minimal-Betrag 0,0004, s = 0,0158, VK = 118%). Bei einem Urin

Tab. 3. Bestimmung der p-Aminobenzoesäure. Korrelationsdiagramm, und y mg.

Bratton-Marshall Verfahren I Verfahren II Verfahren III Verfahren IV

Bratton·Marshall

VerfahrenI

Verfahren

VerfahrenIII

VerfahrenIV

220,3y= 192,2r =0,9790y= 0,5985+0,8697x

x=192,2 x = 179,7 x=195,3 x= 210,1y=220,3 y=220,3 y=220,3 y=220,3r= 0,979 r= 0,9597 r= 0,9790 r- 0,9919y= 8,4856+l,1021x y= 28,7121 + l,0661x y= 10,8346+1,0727x y= -9,3162+l,0928x

x=179,7 x=195,3 x=210,ly= 192,2 y= 192,2 y= 192,2r = 0,9803 r = 0,9805 r = 0,9905y= 18,3451+0,9674x y= 5,8380+0,9543x y=-ll,5008+0,9695x

x=220,3 x= 192,2y=179,7 y = 179,7r = 0,9597 r = 0,9803y=-10,6236+0,8639x y=-ll,2269+0,9934x

x=220,3y= 195,3r= 0,9790y=- l,5715+0,8935x

x = 192,2 x= 179,7y=195,3 y= 195,3r = 0,9805 r= 0,9917y= l,6645+l,0024x y= 14,5974+1,0054x

x= 195,3 =210,1y= 179,7 y= 179,7r = 0,9917 r = 0,9639y=-ll,2h3+O,9781x y=-21,1488+iO,9559x

x=210,1y= 195,3r = 0,9806y=-ll,9072+0;9861x

x=220,3 x=192,2 x=179,7 x= 195,3y=210,l y=210,l y=210,l y=210,lr= 0,9919 r = 0,9905 r = 0,9639 r = 0,9806y= ll,7713+0,9003x y= 15,5941 + l,0121x y= 35,4677+0,9718x y= 19,6770+0,9752x

J. ain. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 20,1982 / No. 8

Eisenwiener, Morger, Lergier und Gillessen: Bestimmung der p-Aminobenzoesäure mit Fiuram® im Urin 563

400,0

300,0

200,0

100.0

£ 50,0

u-

_L

400;0

S 0,0 50,0 100,0 200,0 300,0 400,0 0,0 50,0 100,0 200,0 300,0 400,0

e·<400,0

300.0

H 200.0

100,0

50.0

0,0l

400,0

300.0

0cO) 200,0

100.0

50.0

_ d

50,0 100,0 200,0 300.0 400,0 0.0 50.0 100,0 200.0p- Aminobenzoesöure (Brotton-MorshoU-Verfahren} [mg]

A Bratton-Marshall -*· Verfahren I

= 0,60 + 0,87x;Syx = 13,48= 8,49+l,10y;sxy=15,17= 220,30 mg= 192,20 mg

Mediän = 242,00 mgr = 0,98n =28

B Bratton-Marshall'-* Verfahren II

y = 10,62 + 0,86 x; Syx = 18,83= 28,71 + l,07 y;sxy = 20,92= 220,29 mg

y = 179,69 mgMediän = 242,00 mgr = 0,96n =28

300,0 400.0

C Bratton-Marshall - Verfahren III

y =- 1,57 * 0,89 x; Syx =13,85= 10,84+1,07 y;sxy= 15,18

x = 220,29 mgy = 195,26 mgMediän = 24 2,00 mgr = 0,98n =28

D Bratton-Marshall-+ Verfahren IV

y = 11,77 + 0,90 x; s^ = 8,58=-9,32 +1,09 y;sxy = 9,45

x = 220,29 mgy =210,07 mgMediän = 242,00 mgr = 0,99n =28

Abb. 7. Bestimmung derp-Aminobenzoesäure. Bei-allen vier Darstellungen wurde das Bratton-Marshall-Ver&hTen als Bezugsverfahren(x-Werte) zur Darstellung der Korrelation mit Verfahren I-IV eingesetzt.

betrug jedoch der sechsfache Basiswert 0,083 der Gesamt- Bei sehr niedrigen Ausscheidungswerten sollten aufausscheidung. Bei solchen Urinen ist es erforderlich, bei jeden Fall die Proben-Leerwerte berücksichtigt werden.Berücksichtigung der Basiswerte einen Proben-Leerwertmitzufuhren, da sonst zu viel subtrahiert wird.

J. Clin. Chem. Clin. Biochem. /Vol. 20, 1982 / No. 8

564 Eisenwicner, Morger, Lcrgier und Gillessen: Bestimmung der p-Aminobenzoesäure mit Fluram® im Urin

Schlußfolgerungen

Aus den aufgezeigten Daten wird folgender Vorschlagzur Bestimmung der p-Aminobenzoesäure gemacht:

a) Schnellverfahren ohne Berücksichtigung von Proben-Leerwert und Basiswert.

b) Durchführung unter Berücksichtigung des Proben-Leerwertes und des Basiswertes. Dieses Verfahrensollte sich stets bei nicht eindeutigen, zweifelhaftenund an der Entscheidungsgrenze der Ausscheidungliegenden Werten an das Schnellverfahren anschließen.

Reagenzien

1 Pufferlösung2 <Fluram)

3 Standard

4 Hilfsreagenz

Acetatpuffer l ,8 mol/1Fluorescamin l ,0 g/l

p-Aminobenzoesäure 182 mg/1

Salzsäure 250 g/kg

Vorbereitungen

1. Gekühlte oder gefrorene Urinproben auf Raumtempe-ratur bringen, gut homogenisieren (nicht filtrierenoder zentrifugieren). Je nach Urinausscheidungfolgende Verdünnungen vornehmen:

< 120 ml: l Teil Urin + 9 Teile WasserVerdünnungsfaktor: f = 10

120-500 ml: l Teü Urin + 4 Teile WasserVerdünnungsfaktor: f = 5

> 500 ml: unverdünnt einsetzenVerdünnungsfaktor: f = l

2. Zur Hydrolyse werden l ml der jeweiligen Uririver-dünnung mit 0,1 ml Salzsäure 250 g/kg in einemverschlossenen Pyrex-Reagenzglas 40 min bei etwa96 °C (± 2 °C) inkubiert.

3. (Fluram)-Lösung50 mg (Fluram) in 50 ml Ethanol 950 ml/l lösen.

4. Gebrauchslösung20 ml Pufferlösung l und 6 ml <Fluram>-Lösungmischen.

Verwendbarkeit: etwa l Woche bei 2-8 °C, es wirdjedoch empfohlen, die Gebrauchslösung stets frischherzustellen.

Vorgehen

a) Schnellverfahren

Ansätze (in )

hydrolysierter UrinGebrauchslösung

502500

Gut mischen. Nach etwa 10 min aber innerhalb l hA(P) gegen Gebrauchslösung in Küvetten mit l cmSchichtdicke messen.

Wellenlänge: Spektralphotometer 402 nrnSpektrallinienphotometer Hg 405 nm

P = ProbeA = Absorption

Ausscheidung der p-Aminobenzöesäure :

m [mg] s A(P) X 462 X V X-^-1 - J 1000m = p-Aminobenzoesäure [mg]

V = Verdünnungsfaktor

VA = Gesamt^Urinausscheidung [ml]

p-Aminobenzoesäureaüsscheidung als Anteil der theo-retisch möglichen Menge unter Zugrundelegung einerVerabreichung von l g Bentiromid (als freie Säure):

Anteil ausgeschieden = 0,295 X m.

b) Vorgehen unter Berücksichtigung von Proben-Leerwerten und Basisausscheidung

Ansätze (in )Basiswert Ausscheidungswert

P! P2 PL2 S RL

hydiolysierter Urin(von vor der Ein-nahme)hydrolysierter Urin(von nach der Ein-nahme)Standard (l82 mg/1)dest. WasserPufferlösung lGebrauchslösung

50 50 -

50 50 -

- - - - 5 0 -- - - - - 5 0

2500 - 2500 - -2500 - 2500 - 2500 2500

Gut mischen. Nach etwa 10 min A(Pi) respektive A(P?)und A(S) gegen den RL sowie AdPLj) und A(PL2) gegenPufferlösung messen.

Wellenlänge: Spektralphotometer 402 nmSpektrallinienphotometer Hg 405 nm

P = ProbePL = Proben-Leerwert

RL = Reagenzien-LeerwertA = »Absorption

J. qin. Chem. Cliri. Biochem. / Vol. 20, 1982 / No. 8

Eisenwiener, Morger, Lergier und Gillessen: Bestimmung der p-Aminobenzoesäure mit Fluram® im Urin 565

Ausscheidung der p-Aminobenzoesäure : m = p-Aminobenzoesäure [mg]V = VerdünnungVA = Gesamt-Urinausscheidung in ml

AfP ^ — AfPL ^B = Urinmenge Pro Stunde vor der Einnahme, derm [mg] = l ^ 2' — - — — · Faktor 6 ergibt sich unter der Annahme, daß

^*' die vom Test unabhängige stündliche Basisaus-VA ] _ Scheidung während der sechsstündigen Testzeit

X 200 X V Ausscheiduagswert ~ die gleiche ist wie in der Kontrollperiode.

A(Pi) — A(PLi) p-Aminobenzoesäureausscheidung als Anteil der theore-l A(S) tisch möglichen Menge unter Zugrundelegung einer Ver-

t-v , abreichung von l g Bentiromid (als freie Säure):X200X ^B-

1 000 J Basiswert Anteil ausgeschieden = 0,295 X m .

Literatur

1. Bratton, A. C. & Marshall, E. K. (1939) J. Biol. Chem. 228, 3. Udenfriend, S., Stein, S., Bohlen, P., Daivman, W., Leim-537-550. gruber, W. & Weigele, M. (1972) Science 178, 871-872.

2. Gillessen, D. & Lergier, W.: Publikation in Vorbereitung.Dr. Hans-Georg Eisen wienerF. Hoffmann-La Röche + Co. AGForschungs- und Entwicklungsabteilungder Sparte DiagnosticaPostfachCH-4002 Basel

J. Clin. Chem. Clin. Biochem. / Vol. 20,1982 / No. 8