This work has been digitalized and published in 2013 by Verlag Zeitschrift für Naturforschung in cooperation with the Max Planck Society for the Advancement of Science under a Creative Commons Attribution4.0 International License.

Dieses Werk wurde im Jahr 2013 vom Verlag Zeitschrift für Naturforschungin Zusammenarbeit mit der Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung derWissenschaften e.V. digitalisiert und unter folgender Lizenz veröffentlicht:Creative Commons Namensnennung 4.0 Lizenz.

Die Verteilung von Adenovirus-Komponenten im Zweiphasensystem wäßriger polymerer Lösungen

W . A . K . S C H M I D T *

Institut für Hygiene und Mikrobiologie der Universität des Saarlandes, Homburg (Saar) Direktor: Prof. Dr. Dr. W . ZIMMERMANN)

(Z. N a t u r f o r s c h . 23 b , 90—93 [1968] ; e i ngegangen am 5. M a i 1967)

The distribution of antigen components of adenovirus type 26 in aqueous two-phase systems of sodium dextran sulfate and polyethylene glycol is described. Depending on composition and NaCl molarity of the system, the infectious particles and the soluble haemagglutinin were either con-centrated in one phase or distributed in two phases and separated from one another. The com-plement-fixing group antigen could not be determined, since the polymers interfered extensively with the CF test.

Durch Verteilung im Zweiphasensystem wäßriger polymerer Lösungen ist es möglich, Zellpartikeln und Makromoleküle zu reinigen und zu konzentrie-ren. A L B E R T S S O N

1 berichtete eingehend darüber. Die Methode ist zur Bestimmung der Verteilungskoeffi-zienten und Konzentration von Viren 2 - 5 und Bak-teriophagen 2> 4 und auch zur Fraktionierung von Zellkomponenten 6' 7 herangezogen worden.

Die Möglichkeit, Zellbestandteile im polymeren Zweiphasensystem voneinander isolieren zu können, regte uns an, die Methode zur Trennung der Unter-einheiten von Adenoviren einzusetzen. Als Polymere wählten wir Natriumdextransulfat und Polyäthylen-glykol und als Modellvirus Adenovirus Typ 26, das wenigstens zwei von der infektiösen Partikel abtrenn-bare Komponenten besitzt8.

Material und Methoden

1. Virus und Virusvermehrung

Zur Untersuchung wurde Adenovirus Typ 26, Stamm BAR-2 benutzt9. Die Vermehrung erfolgte in HeLa-Zellen nach einer bereits beschriebenen Methode10. Nach Viruseinsaat wurde bis zum vollständigen cyto-

* Gegenwärtige Anschrift: Institut für Medizinische Mikro-biologie und Virologie der Universität Düsseldorf, 4 Düs-seldorf, Witzelstr. 111.

1 P. A . ALBERTSSON , Partition of Cell Particles and Macro-molecules, Wiley, New York 1960.

2 P. A . ALBERTSSON U . G . FRICK , Biochim. biophysica Acta [ A m s t e r d a m ] 3 7 , 2 3 0 [ I 9 6 0 ] .

3 H . NAKAI , Acta virol. 9 , 8 9 [ 1 9 6 5 ] . 4 L . PHILIPSON, P . A . ALBERTSSON U . G . FRICK , Virology 1 1 ,

5 5 3 [ I 9 6 0 ] . 5 T. W E S S L E N , P . A. ALBERTSSON U . L . PHILIPSON , Arch. ges.

V i r u s f o r s c h . 9 , 5 1 0 [ 1 9 5 9 ] .

pathischen Effekt bei 37 °C bebrütet, bei —20 °C ein-gefroren, abgefüllt und bei gleicher Temperatur aufbe-wahrt ( = Rohantigen). Vor Gebrauch wurde das Rohantigen vom Zelldetritus befreit (10 Min. 2000 g).

2. Bestimmung der Infektiosität

Die Infektiositätsermittlung erfolgte in HeLa- bzw. Struma-Zellen. Halblog. Verdünnungen der drei Phasen wurden pro Verdünnungsstufe in Mengen von 0,25 ml in zwei bis drei Röhrchen verimpft. Der Infektiositäts-titer wurde nach der Methode von R E E D und M U E N C H 1 1

bestimmt.

3. Hämagglutinintitration

Die Hämagglutininbestimmung erfolgte durch Ver-dünnen der Phasen mit dem Faktor 2 in Plexiglasplat-ten unter Verwendung von schwach gepufferter NaCl-Lösung (pn 7,2). Zu je 0,4 ml der Verdünnungsreihe wurden 0,2 ml einer 2-proz. Erythrocytenaufschwem-mung (menschliches 0-Blut) zugefügt. Nach ein bis zwei Stdn. bei Zimmertemperatur erfolgte die Ablesung des Titers.

Die untere Phase kann u. U. bis zur Verdünnung von I : 160 eine Hämagglutination menschlicher 0-Blutkör-perchen verursachen. Sie läßt sich von der durch Adeno-viren hervorgerufenen Hämagglutination nicht unter-scheiden. Aus diesem Grunde wurde jedes Phasen-system doppelt angesetzt. Der Hauptversuch enthielt

6 P . A . ALBERTSSON , Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 2 7 , 3 7 8 [ 1 9 5 8 ] .

7 P . A . ALBERTSSON , V. HANZON u. G . TOSCHI, J . Ultrastructure R e s . 2 , 3 6 6 [ 1 9 5 9 ] .

8 H. GELDERBLOM , R. WIGAND U. H. BAUER , Nature [London] 2 0 5 , 6 2 5 [ 1 9 6 5 ] .

9 L . ROSEN , Virology 5 , 5 7 4 [ 1 9 5 8 ] . 1 0 W . A. K. SCHMIDT U. R. W I G A N D , Arch. ges. Virusforsch.

1 9 , 3 8 [ 1 9 6 6 ] . I I L . J . R E E D U. H. MUENCH , Amer. J . Hyg. 2 7 , 4 9 3 [ 1 9 3 8 ] .

Rohantigen, der Kontrollversuch das Erhaltungsmedium der HeLa-Zellen. War die unspezifische Hämagglutina-tion der Kontrolle genau so hoch oder höher als die-jenige des Hauptversuches, so wurde der Hauptversuch durch Vorsatz eines <C gekennzeichnet.

4. Durchführung der Verteilungsversuche

1. P o l y m e r e u n d L ö s u n g e n : Natriumdex-transulfat 500 (DS, Pharmacia, Uppsala) , Polyäthylen-glykol 6000 (PG; Serva, Heidelberg), 5-m. NaCl-Lö-sung zum Variieren des Salzgehaltes im System, 0,1 -m. Phosphatpuffer vom ph 7,2 zur Pufferung des Systems.

2. H e r s t e l l u n g d e s P h a s e n s y s t e m s: Das Endvolumen der Phasensysteme betrug 50 bzw. 100 ml. Sie setzten sich zusammen aus 25 bzw. 50 ml ( = 50%) sedimentfreiem Rohantigen, 5 bzw. 10 ml ( = 10%) 0,1-m. Phosphatpuffer und unterschiedlichen Mengen 5-m. NaCl-Lösung, DS und PG. DS und PG wurden für jeden Ansatz neu eingewogen. Nach Lösen der Polymere wurde auf das Endvolumen mit dest. Wasser aufgefüllt. Sämtliche Mengenangaben beziehen sich auf das Endvolumen. Bei der Angabe der Molari-tät blieb das im Rohantigen enthaltene NaCl unberück-sichtigt.

Die fertigen Systeme wurden in 100 ml Scheidetrich-ter gefüllt, auf ca. 4 °C abgekühlt und durch 100-mali-ges Umkehren der Gefäße intensiv durchmischt. Nach 24 Stdn. Aufbewahrung bei ca. 4 °C wurden die drei Phasen getrennt entnommen. Die wenige mm dicke Schicht aus ausgefällten Zellproteinen, die sich zwischen der oberen und unteren Phase befand, wurde als Inter-phase bezeichnet.

0,5% DS, 7% PG HA Inf.

[ml] [%] [%]

0,05-m. NaCl

0,10-m. NaCl

0,15-m. NaCl

0,30-m. NaCl

0,45-m. NaCl

0,90-m. NaCl

Ergebnisse

Die Tab. 1 zeigt die Verteilung der Infektiosität und des Hämagglutinins in den drei Phasen des Systems Dextransulfat/Polyäthylenglykol bei unter-schiedlichen NaCl- und DS-Mengen. Der PG-Gehalt betrug bei dieser Versuchsreihe stets 7 Prozent. Die angegebenen Werte sind die Mittelwerte aus zwei Versuchen.

Ohne NaCl-Zusatz kam es nicht zur Phasentren-nung; bei den niederen DS-Konzentrationen (0,5% und 2%) und 0,05-m. NaCl trat ebenfalls keine Trennung ein.

Nach Erhöhung der NaCl-Konzentration im Sy-stem 0,5% DS, 7% PG verringerte sich die untere Phase, und es fanden sich ab 0,3-m. NaCl fast das gesamte Hämagglutinin und die gesamte Infektiosi-tät in der Interphase. Im System 2% DS, 7% PG kam es zur Ausbildung des gleichen Effektes. Bei der höchsten NaCl-Konzentration war die Hämagglu-tination der virusfreien Kontrolle bereits so hoch, daß möglicherweise eine Anwesenheit von Häm-agglutinin in der unteren Phase vorgetäuscht wurde. Nach Zusatz von 8% DS war eine Bewertung der Verteilung des Hämagglutinins ab 0,3-m. NaCl we-gen der hohen unspezifischen Hämagglutination nicht mehr möglich.

2% DS, 7% PG 8% DS, 7% PG HA Inf. HA Inf.

[ml] [o/0] [%] [ml] [o/0] [o/0]

57 0 0** 1 15 100

42 85 0 62 0 0

1 14 100 37 86 0 33 0 0

1 54 97 16 46 3 35 0 0

1 >68 100 14 < 3 2 0 37 0 0

1 > 7 3 100 12 < 2 7 0 38 0 0

1 > 4 2 100 11 < 5 8 0

obere Phase Interphase untere Phase

obere Phase Interphase untere Phase obere Phase Interphase untere Phase

obere Phase Interphase untere Phase obere Phase Interphase untere Phase obere Phase Interphase untere Phase

97 1 2

97 1 2

97,5 1 1,5

98 1 1

99 1

0 86 14 0

51 49

0 > 9 8 < 2

0 > 9 9 < 1

0 100

0 80 20

0 99

1 0

100 0 0

100 0 0

100

89 1

10

44,5 1 4,5

0 51 49

0 47 53

45 0 1 > 9 6 4 < 4

45,5 0 1 > 9 2 3,5 < 8

96 1 3

0 > 7 7 < 2 3

0 100

0 0

100 0

0 100

0 0

100 0 0

100 0

Tab. 1. Die Verteilung der infektiösen Partikeln und des Hämagglutinins von Adenovirus Typ 26 im Zweiphasensystem aus Dextransulfat und Polyäthylenglykol. * Keine Phasentrennung. ** Inf. 0 = < 1 Prozent.

Wie Tab. 2 zeigt, konnte ein ähnlicher Anreiche-rungseffekt statt durch NaCl auch durch Erhöhung des PG-Gehaltes bei niederer DS-Konzentration er-reicht werden. Im System 1% DS, 13% oder 16% PG und 0,15-zn. NaCl ließen sich Hämagglutinin und Infektiosität in der Interphase konzentrieren.

1% DS, 13%PG 1% DS, 16%PG HA Inf. HA Inf.

[ml] [%] [o/0] [ml] [%] [%]

0,15-m. obere Phase 97 1 0* 98,5 0 0 NaCl Interphase 1 > 9 7 100 1 98 97

untere Phase 2 < 2 0 0,5 2 3

Tab. 2. Die Verteilung der infektiösen Partikeln und des Hämagglutinins von Adenovirus Typ 26 im Zweiphasensystem aus Dextransulfat und Polyäthylenglykol. * Inf. 0 = < 1 Pro-

zent.

Wie man aus Tab. 3 ersieht, ist es audi möglich, durch Erhöhung der DS-Konzentration auf 11% oder 15% und Verringerung der PG-Menge auf 4% Infek-tiosität und Hämagglutinin auf verschiedene Phasen zu verteilen. Die zugesetzte NaCl-Menge darf 0,1 -m. nicht überschreiten. Die Infektiosität befindet sich dann vollständig in der Interphase, während fast das gesamte Hämagglutinin die untere Phase aufgesucht hat.

11% DS, 4%PG 15% DS, 4%PG HA Inf. HA Inf.

[ml] [%] [%] [ml] [%] [%]

0,05-m. obere Phase 30 3 0* 14 1 0 NaCl Interphase 1 2 100 1 3 100

untere Phase 69 95 0 35 96 0

0.10-m. obere Phase 42 0 0 18 2 0 NaCl Interphase 1 3 100 1 22 100

untere Phase 57 97 0 31 76 0

0,15-ra. obere Phase 46 0 0 18 1 0 NaCl Interphase 1 > 4 6 100 1 > 2 8 100

untere Phase 53 < 5 4 0 31 < 7 1 0

Tab. 3. Die Verteilung der infektiösen Partikeln und des Hämagglutinins von Adenovirus Typ 26 im Zweiphasensystem aus Dextransulfat und Polyäthylenglycol. * Inf. 0 = < 1 Pro-

zent.

Die Bestimmung des komplementbindenden Grup-penantigens in den Phasen des Systems ließ sich we-gen der störenden Wirkung der Polymere nicht durchführen. Eine Ausfällung des Dextransulfats mit BaCU 4 brachte keine Vorteile; Versuche, das

1 2 P . J . FORSYTH U. B . ROIZMAN, Virology 5 , 3 9 3 [ 1 9 5 8 ] .

Antigen nach Präzipitation mit Polyphosphorsäure 10

oder Methanol12 zu bestimmen, verliefen nicht zu-friedenstellend.

Diskussion

A L B E R T S S O N 1 zeigte, daß Zweiphasensysteme aus

wasserlöslichen Polymeren geignet sind für die Kon-zentration und Abtrennung von Partikeln und Ma-kromolekülen. Verschiedene Phasensysteme mit un-terschiedlichen Eigenschaften sind von ihm beschrie-ben worden.

Zur Herstellung des von uns benutzten Systems dienten Lösungen von Dextransulfat (DS) und Poly-äthylenglykol (PG) in verschiedener Konzentration. Da die Eigenschaften dieses Systems — es enthält einen Polyelektrolyten — in besonderem Maße vom Salzgehalt abhängen, wurde als dritter Faktor die NaCl-Konzentration variiert. Die Menge der bereits im Rohantigen enthaltenen Salze bestimmte das Mi-nimum.

A L B E R T S S O N 1 und P H I L I P S O N et al .4 ermittelten

die Verteilungskoeffizienten von Echovirus Typ 7 und 9, Adenovirus Typ 2 und vom Phagen T2 im gleichen System. Sie konnten die Echoviren und den Phagen bei niederer Salzkonzentration in die untere Phase und bei höherer Salzkonzentration in die obere Phase treiben. Die Adenoviren bevorzugten die In-terphase.

Das von uns gewählte Adenovirus Typ 26 enthält außer dem nicht hämagglutinierend wirkenden Vir-ion 13 im Gewebekulturüberstand noch zwei Kom-ponenten unterschiedlicher Größe, ein Hämaggluti-nin und ein komplementbindendes Gruppenantigen 8.

Wir versuchten, durch Variation des DS/PG-Ver-hältnisses und des NaCl-Gehaltes diese Untereinhei-ten vom Virion zu trennen. Eine Abhängigkeit in der Verteilung der Komponenten vom Salzgehalt des Phasensystems ließ sich beobachten; von Einfluß war auch die Konzentration an DS und PG. Während das Virion unabhängig vom DS/PG-Verhältnis und NaCl-Zusatz stets die Interphase aufsuchte, konnte das Hämagglutinin nach Zusatz geringer Salzmengen (0,1-m. und 0,05-m.) zum System 11% bzw. 15% DS und 4% PG in die untere Phase getrieben und vom Virion abgetrennt werden. In der Interphase reicherte es sich gemeinsam mit dem Virion an,

13 H. BAUER, R . WIGAND U. W . ADAM, Z. Naturforschg. 19 b, 587 [1964].

wenn 0,5% bzw. 2% DS und 7% PG im System vor-handen waren und wenigstens 0,3-m. NaCl zugefügt wurden. Wurde die PG-Menge erhöht (1% DS, 13% bzw. 16% PG), so genügte bereits ein geringerer NaCl-Zusatz (0,15-m.), um das Hämagglutinin in die Interphase zu befördern.

Durch Verteilung im Zweiphasensystem wasser-löslicher Polymere lassen sich damit nicht nur Viren und ihre Untereinheiten konzentrieren, sondern diese einfache Methode scheint auch für die Abtrennung

von Viruskomponenten eine gewisse Bedeutung zu haben. Die störende Wirkung der verwendeten Poly-mere in der Komplementbindungs-Reaktion setzt al-lerdings einer Bestimmung komplementbindender Antigene gewisse Grenzen.

Die Arbeit wurde mit Unterstützung der D e u t -s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t durchge-führt. Frau I . MAURER, Fräulein B . BLOCK und Fräu-lein J . HÖFLER ist für ihre Mitarbeit zu danken.

Hemmung des cytopathischen Effektes durch Blockierung der DNS-Synthese von Vaccinia-Virus mit 5-Fluor-2'-desoxyuridin.

Autoradiographische Untersuchungen * W . H E N I G S T

Bakteriologische Untersuchungsanstalt München, Virologische Untersuchungsstelle, und

K . PLELSTICKER

Deutsches Krebsforschungszentrum Heidelberg, Institut für experimentelle Pathologie

(Z. Naturforsch. 23 b, 93—98 [1968] ; eingegangen am 26. April 1967)

5-Fluor-2'-desoxyuridin (FUdR) blockiert in tierischen Zellen und Bakterien fast ausschließlich die DNS-Synthese. Audi die Vermehrung von Viren, deren Genom aus DNS besteht, wird in der-artigen Zellen selektiv gehemmt.

Wir versuchten mit der meist verwendeten FUdR-Dosis von 1 /uMo\/l den cytopathischen Effekt von Vaccinia-Virus in „KB"-Zellfilmen (monolayer) zu unterdrücken. Dies gelang jedoch erst mit 50 /uMo\/l FUdR. Zur Klärung der diskutierten möglichen Ursachen dieses Versagens untersuchten wir mit 3H-markiertem Thymidin (3H-TdR) die Vorgänge bei der Vaccinia-Virus-Infektion und bei deren Hemmung. Die autoradiographische Auswertung ergab folgendes:

Mit 1 /uMol/l und mit 50 //Mol/Z behandelte Zellfilme wiesen weit mehr 3H-TdR-markierte Zell-kerne auf als unbehandelte Kontrollen, was als Synchronisationseffekt von FUdR angesehen wird.

Die Unterdrückung der Zell-DNS-Synthese durch die Vaccinia-Virus-Infektion war deutlich zu beobachten, ebenso die Ausbildung der cytoplasmatischen Herde der Virus-DNS-Synthese.

Bei Verwendung von 1 ,uMol// FUdR wurde ein verzögertes Ingangkommen der Virus-DNS-Syn-these beobachtet. Anzeichen hierfür blieben bei 50 /uMo\/l aus.

Antimetabolite auf der Grundlage von Nuclein-säurebasen-Analogen kamen im Verlauf des letzten Jahrzehnts immer häufiger zur Anwendung. 1957 wurden von H E I D E L B E R G E R et a l . 1 die fluorinierten Pyrimidine erstmals beschrieben. BOSCH et al. 2 und C O H E N et al. 3 stellten fest, daß durch diese Verbin-dungen die Desoxyribonucleinsäure-(DNS)-Synthese in Bakterien und tierischen Zellen gehemmt wird. Aufbauend auf diesen Ergebnissen klärten H A R B E R S

* Mit technischer Assistenz von H E L E N STEIGERWALD. 1 C . H E I D E L B E R G E R , N . K . CHAUDHURI, P . DANNEBERG, D .

M O O R E N , L . GRIESBACH , R . DUSCHINSKY , R . J . SCHNITZER, E .

P L E V E N , and J. SCHEINER , Nature [London] 179, 633 [ 1 9 5 7 ] .

2 L . BOSCH, E . H A R B E R S , and C. H E I D E L B E R G E R , Cancer Res. 1 8 , 3 3 5 [ 1 9 5 8 ] ,

et al. 4 und HEIDELBERGER 5 die Wirkungsweise des 5-Fluoruracils und seiner Derivate. Die beobachtete Beeinflussung der Ribonucleinsäure-(RNS)-Synthese und die Hemmung der Uridin-Phosphorylase der Zellen wird durch die Verwendung des Desoxyribo-sids des 5-Fluor-Uracils weitgehend umgangen, so daß dieses 5-Fluor-2'-desoxyuridin (FUdR) nahezu ausschließlich die DNS-Synthese blockiert. Es wird zwar phosphoryliert, kann aber wegen seines Fluor-

3 S . S . COHEN, J . G . F L A K S , H . D . B A R N E R , M . R . L O E B , a n d J .

LICHTENSTEIN , Proc. nat. Acad. Sei. USA 4 4 , 1 0 0 4 [ 1 9 5 8 ] . 4 E . H A R B E R S , N . K . CHAUDHURI , and C . H E I D E L B E R G E R , J . biol.

Chemistry 234 , 1255 [ 1 9 5 9 ] . 5 C. HEIDELBERGER , in: "Biological Approaches to Cancer

Chemotherapy", ed. by R . J . C. H A R R I S , pp. 4 7 — 5 8 , Aca-demic Press, New York 1961.