Die Wirkung des Phosphodiesterase-IV-Inhibitors Mesopram ...Die Multiple Sklerose (MS), auch unter dem Namen Encephalomyelitis disseminata, Polysklerose oder Sklerosis multiplex bekannt,

Aus der Neurologischen Klinik und Poliklinik

der Universität Würzburg

Direktor: Professor Dr. med. K.V. Toyka

Die Wirkung des Phosphodiesterase-IV-Inhibitors

Mesopram

auf Faktoren der Blut-Hirn-Schranke

Inaugural-Dissertation

zur Erlangung der Doktorwürde der

Medizinischen Fakultät Würzburg

der

Julius-Maximilians-Universität Würzburg

vorgelegt von

Harriet Schmid

aus

Worms

Würzburg, August 2007

Referent: Prof. Dr. med. P. Rieckmann

Koreferent: Prof. Dr. med. G. Stoll

Dekan: Prof. Dr. med. M. Frosch

Tag der mündlichen Prüfung: 20.02.2008

Die Promovendin ist Ärztin.

Meinen lieben Eltern

Inhaltsverzeichnis

I

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG - 1 -

1.1 MULTIPLE SKLEROSE - 1 -

1.1.1 Geschichte der Multiplen Sklerose - 1 -

1.1.2 Epidemiologie und Genetik - 1 -

1.1.3 Klinik - 3 -

1.1.4 Verlaufsformen der MS - 3 -

1.1.5 Prognose - 5 -

1.1.6 Diagnostik - 6 -

1.1.7 Pathologie der Multiplen Sklerose - 6 -

1.2 BLUT-HIRN-SCHRANKE UND IHRE REGULATION - 9 -

1.2.1 Tight junction Proteine: ZO-1, Claudin, Occludin - 11 -

1.2.2 Adhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1 und MCAM - 12 -

1.2.3 Wachstumsfaktoren, Zytokine, Chemokine - 12 -

1.2.4 Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF) - 13 -

1.2.5 Matrix-Metalloproteasen - 14 -

1.3 PHOSPHODIESTERASE-IV-INHIBITION - 14 -

1.3.1 Zyklisches Adenosin-3´, 5´-Monophosphat (cAMP) - 15 -

1.3.2 Familie der Phosphodiesterasen und ihr Wirkungsmechanismus - 17 -

1.3.3 Mesopram, ein spezifischer Inhibitor der Phophodiesterase-IV - 18 -

1.4 TUMOR-NEKROSE-FAKTOR-α - 19 -

1.5 ZIELSETZUNG - 21 -

2 MATERIAL UND METHODEN - 22 -

2.1 MATERIAL - 22 -

2.1.1 Laborgeräte - 22 -

2.1.2 Verbrauchsmaterial - 22 -

Inhaltsverzeichnis

II

2.1.3 Chemikalien - 23 -

2.1.4 Antikörper - 23 -

2.1.5 Kommerzielle Kits - 24 -

2.1.6 Reagenzien für die Zellkultur - 24 -

2.2 METHODEN - 26 -

2.2.1 Zellkultur - 26 -

2.2.1.1 Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC’s) - 26 -

2.2.1.2 Medien - 26 -

2.2.1.3 Passagieren von zerebralen Endothelzellen - 27 -

2.2.1.4 Auftauen und Einfrieren von zerebralen Endothelzellen - 27 -

2.2.2 Stimulation cerebraler Endothelzellen mit Mesopram - 28 -

2.2.3 Immuncytologie - 29 -

2.2.3.1 Prinzip - 29 -

2.2.3.2 Durchführung - 30 -

2.2.4 Quantitative Bestimmung von Oberflächenmolekülen mittels

Durchflusscytometer (FACS) - 31 -

2.2.4.1 Prinzip - 31 -


2.2.5 „Enzyme-linked Immunosorbent Assay“ (ELISA) - 33 -

2.2.5.1 Prinzip - 33 -

2.2.5.2 Proteingewinnung für den cAMP-ELISA - 33 -


2.2.6 Western Blot - 36 -

2.2.6.1 Prinzip - 36 -

2.2.6.2 Proteingewinnung für Western Blots - 36 -

2.2.6.3 Proteinkonzentrationsbestimmung - 37 -


2.2.7 Zymographie - 38 -

2.2.7.1 Prinzip - 38 -

2.2.7.2 Proteinkonzentration - 39 -

2.2.7.3 Proteinbestimmung - 39 -


Inhaltsverzeichnis

III

3 ERGEBNISSE - 41 -

3.1 CHARACTERISIERUNG VON “HUMAN BRAIN MICROVASCULAR

ENDOTHELIAL CELLS” (HBMEC’s) - 41 -

3.2 WIRKUNG DES PHOSPHODIESTERASE-IV-INHIBITORS

MESOPRAM AUF DEN cAMP-SPIEGEL IN HBMEC’s - 43 -

3.3 EINFLUSS VON MESOPRAM AUF THIGHT JUNCTION PROTEINE -

44 -

3.4 OBERFLÄCHENEXPRESSION DER ADHÄSIONSMOLEKÜLE ICAM-

1, MCAM UND VCAM-1 - 45 -

3.4.1 FACS-Analyse von VCAM-1 - 45 -

3.4.2 Nachweis der Expression von ICAM-1 mittels FACS-Analyse - 46 -

3.4.3 Nachweis der Expression von MCAM mittels FACS-Analyse - 47 -

3.5 PROTEINBESTIMMUNG IN ZELLKULTURÜBERSTÄNDEN VON

HBMEC’s - 49 -

3.5.1 Amphiregulin-ELISA - 49 -

3.5.2 BDNF (brain-derived neurotrophic factor)-ELISA - 51 -

3.5.3 MCP-1 (monocyte chemotactic protein)-ELISA - 52 -

3.5.4 Interleukin-8-ELISA - 54 -

3.5.5 Interleukin-6-ELISA - 55 -

3.5.6 Human sTNF-RI-ELISA (human soluble tumor necrosis factor receptor I) - 57

-

3.6 MATRIX-METALLOPROTEASEN (MMP), NACHWEIS MITTELS

ZYMOGRAPHIE - 57 -

3.7 TABELLARISCHE UND STATISTISCHE ZUSAMMENFASSUNG DER

ERGEBNISSE - 59 -

4 DISKUSSION - 64 -

4.1 Einfluss von Mesopram auf Tight junction Proteine - 65 -

Inhaltsverzeichnis

IV

4.2 Einfluss von Mesopram auf Adhäsionsmoleküle - 67 -

4.3 Einfluss von Mesopram auf Zytokine und Chemokine - 68 -

4.4 Einfluss von Mesopram auf den Brain Derived Neurotrophic Factor

(BDNF) - 71 -

4.5 Einfluss von Mesopram auf Matrix-Metalloproteasen - 71 -

4.6 Schlussfolgerung - 72 -

5 ZUSAMMENFASSUNG - 74 -

6 LITERATUR - 75 -

DANKSAGUNG

LEBENSLAUF

Abkürzungsverzeichnis

V

ABKÜRZUNGEN

Abb. Abbildung

AEP akustisch evozierte Potenziale

AJ adherent junction

APC Antigenpräsentierende Zellen

AR Amphiregulin

ASM anti-smooth-muscle-protein

ATP Adenosintriphosphat

BDNF brain-derived neurotrophic factor

BHS Blut-Hirn-Schranke

BSA Bovines-Serum-Albumin

cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat

CD Cluster of differentiation

CEC cerebral endothelial cells

cMRT cranielle Magnetresonanz-Tomographie

CO2 Kohlendioxid

Cy3 Cyanin Konjugat

GDP Guanosindiphosphat

GTP Guanosintriphosphat

DAB Diaminobenzidin

DABCO Diazobycyclo-Octan

DAPI Diamidino-Phenylindol

DMSO Dimethylsulfoxid

DPBS Dulbecco’s phosphate buffered saline

EAE experimental autoimmune encephalomyelitis

EC endothelial cell (Endothelzellen)

ECGS endothelial cell growth supplement

EDSS expanded disability status scale

EGF endothelial growth factor

EDTA Ethylendiamintetraacetet

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay


VI

FACS Floureszensaktivierter Zellsorter

FCS Fetales Kälberserum

FITC Fluorescein Isothiocyanate

FCS Forward scatter

GFAP glial fibrillary acidic protein

HBMEC human brain microvascular endothelial cells

HCl Salzsäure

HLA Humanes Leukozytenantigen

hsTNF-RI humane soluble tumor necrosis factor receptorI

ICAM intercellular adhesion molecule

IFN Interferon

Il Interleukin

LFA-1 leucocyte function associated molecule-1

MCAM melanoma cell adhesion molecule

MEP motorisch evozierte Potenziale

MMP Matrix Metalloproteinase

MRT Magnetresonanz-Tomographie

MS Multiple Sklerose

PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung

PDE Phosphodiesterase

PKA Proteinkinase A

SDS Sodiumdodecylsulfat

SSC Side scatter

SSEP Somato-sensibel evozierte Potenziale

Tab. Tabelle

Th T-Helferzelle

TJ tight junction

TNFα Tumor Nekrose Faktor alpha

Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan

VCAM-1 vascular cell adhesion molecule-1

VEP visuell evozierte Potenziale

VLA-4 very late antigen-4


VII

vWF von Willebrand Faktor

ZNS Zentrales Nervensystem

ZO-1 Zonula occludens Protein-1

Einleitung

- 1 -

1 EINLEITUNG

1.1 MULTIPLE SKLEROSE

1.1.1 Geschichte der Multiplen Sklerose

Die Multiple Sklerose (MS), auch unter dem Namen Encephalomyelitis disseminata,

Polysklerose oder Sklerosis multiplex bekannt, ist eine chronisch entzündlich,

demyelinisierende Erkrankung des Zentralnervensystems (ZNS).

Erste Krankheitsaufzeichnungen, die den Symptomen der MS ähneln, findet man bereits

im 14. Jahrhundert aus Mitteilungen des Holländers Jan von Beieren (41). Ebenso

beschreiben die Tagebücher des Briten August d’Este (1774-1848) ein Krankheitsbild,

welches heute der MS zugeordnet wird. Der französische Mediziner Jean Cruveilhier

(1791-1873) dokumentierte den ersten Fall eines an MS erkrankten Mannes,

wohingegen die ersten systematischen Aufzeichnungen der Krankheitssymptome von

dem französischen Arzt Jean Martin Charcot (1825-1893) stammen. Heute nimmt man

an, dass die häufigste neurologische Erkrankung im jüngeren Erkrankungsalter– MS –

eine Immunzell-vermittelte Autoimmunerkrankung des ZNS ist, bei der sowohl

genetische als auch Umweltfaktoren (15) eine wichtige Rolle spielen.

1.1.2 Epidemiologie und Genetik

MS befällt weltweit ca. 1,2 Millionen Menschen. In Deutschland leben über 122000

Erkrankte, die Prävalenz liegt bei 149,1 pro 100000 Einwohnern (37), wird aber auch in

einigen Studien mit 80-100 pro 100000 angegeben (55). Das Auftreten von MS scheint

auch an Umweltfaktoren gekoppelt zu sein, weil starke geographische Unterschiede

aufgezeigt werden konnten. Die Prävalenz in südlichen Breitengraden ist wesentlich

niedriger als in den gemäßigten Klimazonen, so dass von einem Nord-Süd-Gefälle

gesprochen wird. Am häufigsten tritt MS zwischen dem 40. und dem 60. Breitengrad

auf. Die schwarze Bevölkerung der USA und Afrika, sowie Japaner, Inder, Indianer und

Eskimos sind auffallend selten von MS betroffen (Abbildung 1-1).

Einleitung

- 2 -

Abbildung 1-1: Globale Verteilung von MS, schwarz: 80-140 Erkrankte pro 100000 Einwohner, grau: 4-50 Erkrankte pro 100000 Einwohner (40, modifiziert nach MSlife)

In Migrationsstudien werden genetische und Umwelteinflüsse analysiert. Für

Menschen, die aus Hochrisikoregionen für MS in Äquatornähe umsiedeln, sinkt die

Erkrankungs-wahrscheinlichkeit und umgekehrt steigt sie, wenn aus Regionen mit

niedrigem Risiko in Hochrisikoregionen umgezogen wird. Eine entscheidende Grenze

scheint das 15. Lebensjahr zu sein. Bei einer Umsiedelung vor dem 15. Lebensjahr passt

sich das Risiko an MS zu erkranken dem neuen Heimatland an, danach wird die

Wahrscheinlichkeit des Geburtslandes beibehalten.

Als genetischer Faktor scheint das HLA-DR2 Allel eine Rolle zu spielen, denn HLA-

DR2 positive Personen haben ein vierfach erhöhtes Risiko an MS zu erkranken

gegenüber HLA-DR2 negativen Individuen. Auch Verwandte von an MS-Erkrankten

zeigen ein 20-40-fach erhöhtes Risiko (77). Ist ein Zwilling von einem eineiigen

Zwillingspaar erkrankt, liegt die Wahrscheinlichkeit für den zweiten Zwilling ebenfalls

zu erkranken bei 21-40 %, während sie bei einem zweieiigen Zwillingspaar nur bei 0-

4,7 % liegt (45).

Einleitung

- 3 -

1.1.3 Klinik

Erste Symptome der Krankheit MS können in jedem Alter von 15-60 Jahren auftreten,

wobei ein Erkrankungsmaximum zwischen 20-40 Jahren vorliegt. Eventuell aufgrund

der hormonellen Konstellation tritt die Erkrankung häufiger bei Frauen als bei Männern

auf (Geschlechtsverteilung: Frau/Mann = 1,9-3,1/1).

Wegen der unterschiedlichen Lokalisationen der Entmarkungsherde sind auch die

symptomatischen Erscheinungen vielfältig. Häufige Erst-Manifestationen sind

Optikusneuritis, Paresen und Sensibilitätsstörungen (71). Im Verlauf leiden die

Patienten unter psychischen Symptomen (z.B.: depressive Verstimmung, 78) Miktions-,

Defäkations- und Sexualfunktionsstörungen (48), Augenmotilitätsstörungen,

Schmerzen, Artikulations- und Koordinationsstörungen sowie dem Fatigue-Syndrom

(ein Symptomenkomplex bestehend aus dauerhafter Müdigkeit, Erschöpfung,

Kopfschmerzen, Schlafstörungen, Muskelschmerzen und Konzentrationsstörungen).

1.1.4 Verlaufsformen der MS

Bei der Einteilung der verschiedenen MS-Verlaufsformen muss auf die genaue

Definition des Schubes geachtet werden. Als Schub werden akut auftretende

neurologische Ausfälle bzw. Verschlechterungen vorbestehender Symptome bezeichnet,

die länger als 24 h andauern und mehr als 30 Tage von Beginn eines vorherigen

Schubes entfernt sind. Die Symptome dürfen nicht durch Infekt oder Fieber ausgelöst

sein. Eine anerkannte Einteilung der Krankheitsverläufe ist die nach Lublin (59,

Abbildung 1-2).

Einleitung

- 4 -

Tabelle 1-1: klinische Verlaufsformen der Multiplen Sklerose (modifiziert nach Lublin, 1996)

Schubförmig-remittierende MS

(Relapsing Remitting, RR)

Sekundär chronisch-progredienter Verlauf

(Sekondary Progressive, SP)

Primär chronisch-progredienter Verlauf

(Primary Progressive, PP)

Schubförmig-progredienter Verlauf

Relapsing Progressive RP)

Zeitlich abgrenzbarer Krankheitsschub mit

kompletter oder inkompletter Remission;

keine Krankheitsprogression im

Schubintervall

Initial schubförmiger Verlauf mit Übergang in

einen chronisch progredienten Verlauf; superponierte Schübe

oder temporäre Verbesserungen können

auftreten, aber kein progressionsfreies

Intervall

Von Krankheitsbeginn an chronisch

progredienter Verlauf ohne Auftreten von

Schüben; gelegentlich temporäre Plateaus bzw.

Verbesserungen

Primär progrediente Verlaufsform

kombiniert mit eindeutig abgrenzbaren

Schüben

Zusätzlich kennt man die Einteilung in eine benigne, bei der 15 Jahre nach

Diagnosestellung noch keine wesentliche Beeinträchtigung in der Bewältigung des

Alltags auftritt, sowie eine maligne MS-Verlaufsform, die einen rasch progredienten

Verlauf zeigt. Von der Marburger MS Variante wird gesprochen, wenn es sich um eine

fulminant verlaufende entzündlich demyelinisierende Erkrankung handelt.

Ungefähr 80 % der Patienten leiden an einem primär schubförmigen remittierenden

Verlauf, davon gehen 40 - 60 % innerhalb von 10 Jahren in eine sekundär chronisch-

progrediente Form über (85). Lediglich 5-10 % der Patienten zeigen einen primär

chronisch-progredienten Verlauf. Dieser Verlauf wird gehäuft bei Patienten mit

höherem Erkrankungsalter beobachtet.

Einleitung

- 5 -

Abbildung 1-2: Verlaufsformen der MS. Eine akute Verschlechterung mit Rückbildung (A) oder ohne vollständige Rückbildung (B) kennzeichnet einen schubförmigen Verlauf der MS. Dagegen findet sich bei der primär chronisch-progredienten Form eine Zunahme des neurologischen Defizits ohne (C) oder mit gelegentlichen Plateaus und Remissionen (D). Initialen Schüben folgt bei der sekundär chronisch-progredienten MS eine kontinuierliche Verschlechterung (E), wobei gelegentliche Schübe und geringgradige Remissionen möglich sind (F). (modifiziert nach Lublin, 1996)

1.1.5 Prognose

Bei Diagnosestellung eine Aussage über die Prognose zu machen, ist schwierig, da

keine Prognose-spezifischen Marker bekannt sind. In Tabelle 1-2 sind einige

prognostische Faktoren aufgeführt, die helfen, den Verlauf von MS zu beurteilen.

Tabelle 1-2: Prognostische Faktoren für den Verlauf der MS-Erkrankung (modifiziert nach Weinshenker, 1991, 92, und Kesselring, 1997, 48)

Prognostisch günstige Faktoren Prognostisch ungünstige Faktoren

Niedriges Erkrankungsalter (<35. LJ)

Monosymptomatischer Beginn

Schubförmiger Verlauf

Dauer des ersten Schubes < 6 Monate

Lange Remission nach erstem Schub

Geringe Schubfrepuenz zu Beginn

Eher sensible Symptome

Erhaltene Gehfähigkeit

Schwangerschaft

Leere Familienanamnese

Spätes Erkrankungsalter (>35. LJ)

Chronischer Verlauf

Rasche initiale Schubfolge

Lange Dauer des Schubes

Schlechte Rückbildung nach den ersten Schüben

Zerebelläre, psychiatrische od motorische Symptome zu Beginn

Initial multiple NMR-Läsionen

Nur selten führt die Multiple Sklerose selbst unmittelbar zum Tode, etwa als Folge

eines akuten Schubes. In ungefähr der Hälfte der Fälle ist die Todesursache indirekt auf

Einleitung

- 6 -

die Krankheit zurückzuführen; sekundäre Komplikationen von MS sind

Bronchiopneumonien, Pyelonephritiden mit Urämie oder Sepsis (2) sowie

Lungenembolien. Bei MS-Patienten ist die Suizidalität im Vergleich zur

Allgemeinbevölkerung um das 7fache erhöht (76).

1.1.6 Diagnostik

Die Diagnose Multiple Sklerose wird zunächst klinisch gestellt. Einer ausführlichen

Anamnese folgt eine klinisch-neurologische Untersuchung. Zur weiteren

Diagnosesicherung schließen sich Kernspintomographie (kraniales und spinales MRT

mit dem Kontrastmittel Gadolinium), Liquoruntersuchung mit Zytologie (spezifische

oligoklonale Banden, eventueller Nachweis von intrathekaler Synthese von Antikörpern

gegen neurotrope Viren wie Masern, Röteln, Herpes Zoster) sowie

elektrophysiologische Untersuchungen (VEP, SSEP, MEP, AEP) an (65).

Besonders die Kernspintomographie gewinnt an Bedeutung in der Diagnostik. Mc

Donald et al (85) stellten 2001 neue Diagnosekriterien auf, die Klinik sowie im cMRT

feststellbare Läsionen berücksichtigen. Filippi konnte bei 95 % aller Patienten mit

klinisch sicherer MS Entmarkungsherde im MRT feststellen (26). Bei über 50 % findet

man beim ersten Schub bereits eine subklinische Dissemination.

Um das neurologische Defizit eines MS-Patienten zu standardisieren, stellte Kurtzke

(54) die Expanded Disability Status Scale (EDSS) zusammen. Die EDSS gibt Auskunft

über den Grad der Behinderung eines MS-Patienten. Sie reicht von 0,0 (keine

neurologischen Defizite) bis 10 (Tod infolge MS). Die Angaben der Grade (von 0-10)

in der EDSS beziehen sich auf die Untersuchung der Funktionellen Systeme (FS) durch

den behandelnden Arzt.

1.1.7 Pathologie der Multiplen Sklerose

Im Einzelnen sind die Pathomechanismen der MS noch nicht vollständig geklärt. MS ist

eine systemische Autoimmunerkrankung, bei der die inflammatorische Immun-Antwort

im ZNS zu Demyelinisierung, dem Tod von Oligodendrozyten, Axon-Schädigung,

Gliose und Neurodegeneration führt (49).

Makroskopisch findet man neben periventrikulären Entmarkungsherden radial

angeordnete Läsionen, die dem Verlauf der Blutgefäße folgen, sowie kleinere kortikale

Einleitung

- 7 -

Läsionen. In diesen befinden sich neben T-Lymphozyten auch Makrophagen, Mikroglia

und B-Lymphozyten. Zusätzlich lassen sich in aktiven Plaques proinflammatorische

Zytokine (z.B. TNFα, Il-1, Il-6) nachweisen (13).

Molekulares Mimikry scheint ein relevanter Auslöser der Autoimmunreaktion zu sein.

Hierbei handelt es sich um eine Kreuzreaktion zwischen viralen oder bakteriellen

Antigenen und Autoantigenen (72). Verschiedene virale Proteine, wie Masern-, Herpes-

Hepatitis B-, Influenza- und Adenoviren, haben ähnliche Aminosäuresequenzen wie

einige Komponenten der Myelinscheide. Die wichtigsten Vertreter sind das basische

Myelinprotein (MBP), das Proteolipidprotein (PLP), das myelinassoziierte Glykoprotein

(MAG) sowie das Myelin-Oligodendroglia-Glykoprotein (MOG). Die Kreuzreaktivität

kann so eine unspezifische Aktivierung der T-Zellen gegen Komponenten des Myelins

erzeugen.

Die aktivierten T-Zellen sowie Makrophagen infiltrieren das ZNS und sezernieren dort

proinflammatorische Zytokine (19). Um dorthin zu gelangen, muss die Blut-Hirn-

Schranke (BHS, siehe 1.2) überwunden werden. Die wichtigsten Schritte dabei sind

erstens ein selektinabhängiger Prozess, wodurch die Leukozyten an dem Gefäßendothel

entlang „rollen“, zweitens eine durch Zytokine heraufregulierte Expression von

Integrinen und Adhäsionsmolekülen (Adhäsion von Leukozyten), drittens ein durch

chemotaktische Faktoren und Matrix-Metallo-Proteinasen (MMP) ermöglichtes

Durchdringen der Gefäßwand. Die BHS bzw. ihre Störung scheint daher eine ganz

entscheidende Rolle bei der Pathogenese der MS zu spielen und wird daher im

folgenden Abschnitt genauer dargestellt.

Haben die aktivierten T-Zellen die Blut-Hirn-Schranke überwunden und ein passendes

Antigen gefunden, kann es zu einer weiteren lokalen Schrankenstörung mit

perivaskulärem Ödem und entzündlicher Infiltration kommen. Das Antigen kann nur

gefunden werden, wenn gleichzeitig Histokompatibilitätsantigene (HLA) exprimiert

werden. HLA-Klasse-II-Moleküle sind auf Gliazellen, Monozyten und Astrozyten

lokalisiert (90), dadurch gehören diese Zellen zu Antigenpräsentierenden Zellen (APC).

Durch unspezifische Gewebeschädigung werden die HLA-Moleküle hochreguliert und

Einleitung

- 8 -

durch neurotrophe Faktoren wie BDNF (brain derived neurotrophic factor) und NGF

(nerve growth factor) supprimiert. Bei der Schädigung des Myelin können also sowohl

das Überwiegen proinflammatorischer Faktoren als auch das Fehlen von

modulatorischen Faktoren mitwirken (32).

Abbildung 1-3: Transendotheliale Migration von T-Zellen über die Blut-Hirn-Schranke. Durch Interaktionen zwischen Selektinen und deren Liganden beginnen T-Zellen auf der Oberfläche von Endothelzellen entlang zu rollen (1). Die Adhäsion (2) wird durch Adhäsionsmoleküle (ICAM-1 – LFA-1, VCAM-1 –VLA-4) gefestigt, gefolgt durch Transmigration der T-Zellen über die BHS (3). Innerhalb des ZNS Parenchyms läuft ein komplexer Vorgang zwischen Immunzellen und Zellen des ZNS ab (4), der zur Schädigung des Myelins führt (5). Ast: Astrozyt, BHS: Blut-Hirn-Schranke, Mi: Mikroglia, T: T-Zelle, TcR: T-Zell-Rezeptor (modifiziert nach Lee, 1999, 56).

Einleitung

- 9 -

Von den aktivierten T-Zellen gibt es zwei Typen, den TH1- und TH2-Typ, die sich in

der Sekretion von Zytokinen unterscheiden. TH1-Zellen sezernieren

proinflammatorische Zytokine wie Il-2, IFN-γ, TNFα und TNFβ, die direkt an der

demyelinisierenden Entzündungsreaktion mitwirken und Makrophagen und Mikroglia

aktivieren.

TH2-Zellen produzieren unter anderem Il-4, Il-5 und Il-10, diese aktivieren B-Zellen zur

Antikörperproduktion, die das Komplementsystem aktivieren und so die

Myelinscheiden schädigen können.

1.2 BLUT-HIRN-SCHRANKE UND IHRE REGULATION

Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) ist eine komplexe Organisation aus zerebralen

Endothelzellen (CEC), Perizyten und Basallamina, die von Astrozyten und

perivaskulären Makrophagen umgeben werden (66). Die Endothelzellen regulieren die

endotheliale Barrierefunktion; sie verhindern durch bessere Vernetzung die Passage von

Plasmaproteinen und zirkulierenden Zellen (28). Durch aktive Kontrollfunktion und

Energie-abhängige Transportsysteme wird entschieden, welche Faktoren ins ZNS

gelangen und welche nicht. Dadurch wird die für die neuronale Leistung notwendige

Homöostase des Gehirns aufrechterhalten.

In unserer AG konnte Kallmann nachweisen, dass humane CEC eine deutlich erhöhte

Expression von Genen mit immunmodulatorischen Funktionen, angiogenetischem und

neurologischem Potenzial besitzen als andere EC (44).

Humane CEC verfügen im Vergleich zu anderen EC über verschiedene Besonderheiten.

Dazu gehören eine erhöhte Anzahl von Tight junctions (TJ, z. B.: ZO-1, Claudin-3,

Occludin), die Abwesenheit von Fenestrationen und ein spärlicher pinocytischer

vesikulärer Transport (4). Auch bei der Differenzierung und dem Wachstum neuronaler

Zellen (58) wirken sie unter anderem durch Produktion von neurotrophen Faktoren (z.

B.: BDNF) mit. Als HLA-II exprimierende Zellen scheint ihnen eine Bedeutung in der

Antigenpräsentation bei MS zuzukommen (66).

Einleitung

- 10 -

Abbildung 1-4: Schemazeichnung Blut-Hirn Schranke: Die BHS beinhaltet Interaktionen von 4 Zellentypen, jedoch nur die cerebralen Endothelzellen haben direkten Kontakt zum Blutkreislauf und somit „Schrankenfunktion“.

Abbildung 1-5: Schematische Repräsentation der Blut-Hirn-Schranke. Interaktion von Proteinen, die mit tight junction Molekülen assoziiert sind. Claudin, Occludin und junction adhesion molecule sind transmembranäre Proteine, ZO-1, ZO-2, ZO-3 und Cingulin und andere sind cytoplasmatische Proteine. Claudine sind durch intermediäre cytoplasmatische Proteine mit Actin verbunden (modifiziert nach Ballabh, 2003, 4).

Traumata oder Infektionen können, wie es zum Beispiel auch bei MS der Fall ist, zu

einem Zusammenbruch der BHS führen (95). Die Migration von Leukozyten ins ZNS

triggert eine Signaltransduktionskaskade, die zu einer Verminderung der tight junctions

Einleitung

- 11 -

(ZO, Occludin) führt (4). Dadurch erhöht sich die vaskuläre Permeabilität, wodurch

Ödeme, entzündliche oder metastatische Zellinfiltrationen hervorgerufen werden (28).

Eine Erhöhung der Permeabilität der BHS, an der die in dieser Arbeit untersuchten

Faktoren maßgeblich beteiligt sind, hat prognostisch ungünstige Auswirkungen auf die

Progression der MS. Durch den Einfluß des PDE-IV-Inhibitors Mesopram soll diese

Signalkaskade mit Permeabilitätserhöhung möglicherweise beeinflusst werden.

Die in dieser Arbeit untersuchten Faktoren der BHS werden in den folgenden

Abschnitten erläutert.

1.2.1 Tight junction Proteine: ZO-1, Claudin, Occludin

TJ formen am luminalen Ende des interzellulären Zwischenraumes eine kontinuierliche,

ringsum verlaufende, gürtelförmige Struktur, sie sind die Torhüter des parazellulären

Weges (79). Dazu gehören Occludin und Claudine als integrale Membranproteine und

ZO-1 als cytoplasmatisches Protein.

Claudine sind 22 kDa große Phosphoproteine mit vier transmembranären Domänen.

Mittlerweile sind bereits 24 verschiedene Claudine identifiziert worden (68). Sie

verbinden sich mit Claudinen benachbarter Zellen, an ihrem COOH-Ende binden sich

cytoplasmatische Proteine (ZO-1/-2/-3) an. In TJ von gesunden cerebralen

Endothelzellen sind Claudin-3 und Claudin-5 gefunden worden. Inflammatorische

Bedingungen führen zu einem Verlust von Claudin-3 (94).

Auch Occludin ist ein Phosphoprotein (65 kDa) mit vier transmembranösen Domänen.

Die extracellulären Domänen von Claudinen und Occludin formen gemeinsam die

parazelluläre Barriere der TJ. Die cytoplasmatische Domäne von Occludin ist ebenfalls

mit ZO-Proteinen assoziiert (4). Occludin scheint ein regulatorisches Protein zu sein,

welches die parazelluläre Permeabilität verändern kann (38).

Das cytoplasmatische Protein ZO-1 (Zonula occludens, 220 kDa) gehört zu der Gruppe

der MAGUKs (membrane-associated guanylate kinase-like proteins). Über

verschiedene Domänen ist es mit den Claudinen bzw. dem Occludin verbunden.

Zusätzlich bindet Actin an ZO-1, so dass eine Verbindung zwischen den

transmembranösen Elementen und dem Stützskelett der EC entsteht (36)

Einleitung

- 12 -

1.2.2 Adhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1 und MCAM

Das interzelluläre Adhäsionsmolekül (inter cellular adhesion molecule-1, ICAM-1), das

vaskuläre Zell-Adhäsionsmolekül (vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1) sowie

das Melanom-assoziierte Zell-Adhäsionsmolekül (melanoma cell adhesion molecule,

Mel-CAM, auch als MCAM, CD146, A32 Antigen oder S-Endo-1 bekannt) gehören zu

der Familie der Immunglobulin-ähnlichen Adhäsionsmoleküle.

VCAM-1 und ICAM-1 spielen bei der Migration von aktivierten Leukozyten ins ZNS

eine wichtige Rolle.

ICAM-1 ist ein 76-115 kDa großes Oberflächen-Glykoprotein mit fünf extrazellulären

Immunglobulin-ähnlichen Domänen (86). Es ist ein Ligand für LFA-1 (lymphocyte

function-associated antigen-1) sowie für MAC-1 (CD11b/CD18) und für CD43. ICAM-

1 ist auf der Zelloberfläche lokalisiert und wird durch proinflammatorische Zytokine,

Hormone, zellulären Stress und viraler Infektion verstärkt exprimiert (34).

VCAM-1 besteht aus sieben extrazellulären Ig-homologen Domänen. Es interagiert mit

dem very-late-antigen-4 (VLA-4) der Lymphozyten und wird ebenfalls durch

proinflammatorische Zytokine induziert (12).

MCAM ist ein transmembranöses Glykoprotein mit fünf extrazellulären Immunglobulin-

ähnlichen Domänen, es wird konstitutiv auf Endothelzellen exprimiert, aber auch in

anderen Zellen gefunden (Melanom-Zellen, Glatte Muskelzellen, follikuläre

dendritische Zellen) (5). MCAM spielt eine wichtige Rolle in der Tumor-Progression,

Implantation und Plazentation. Es ist involviert in folgende Prozesse: Signalwege,

fokale Adhäsion, Reorganisation des Zyto-Skelett, interzelluläre Interaktionen,

Aufrechterhaltung der Zellform, Kontrolle von Zell-Migration und -Proliferation (83).

1.2.3 Wachstumsfaktoren, Zytokine, Chemokine

Zytokine sind als interzelluläre Mediatoren an der Aktivierung von spezifischen Zellen

und an der Immunregulation beteiligt.

Amphiregulin (AR) ist ein Zytokin, welches der EGF-(Epidermal growth factor) Familie

zugeordnet ist. Es wird, wie alle Mitglieder dieser Familie, als membran-gebundenes

Vorläufer-Protein gebildet, das durch enzymatische Spaltung in das aktive Protein

umgewandelt wird. AR fungiert einerseits als ein Mitogen für neuronale Stammzellen,

Einleitung

- 13 -

andererseits als ein autokrines Mitogen für Zellen der Schwannschen Nervenscheide

(24, 51, 53, 69).

Interleukin-6 (Il-6) ist ein 26 kDa großes Protein, zugehörig zu den Zytokinen. Es wird

von mononukleären Phagozyten, vasklären EC, Fibroblasten, Leukozyten und anderen

Zellen als Antwort auf Il-1 und TNFα synthetisiert. Il-6 übernimmt wichtige Aufgaben

beim Wachstum und Differenzierung von B-Zellen (42). Il-6 steht im Zusammenhang

mit der spezifischen Immunabwehr und ist ein Stimulus der Produktion der Akute-

Phase-Proteine (74).

Chemokine sind chemotaktische Zytokine, die zu einer Akkumulation von Leukozyten

im Entzündungsbereich führen. In den letzten Jahren wurde aufgrund weiter

entwickelter Methoden eine Vielzahl neuer Chemokine entdeckt. Man unterscheidet

mindestens vier bis fünf Gruppen aufgrund ihrer Primärstruktur; CC-Chemokine

beispielsweise weisen zwei Cystein-Reste auf, die direkt nebeneinander positioniert

sind, CXC-Chemokine haben zwischen diesen Cystein-Resten eine andere Aminosäure.

Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1/CCL2) gehört zu der CC-Familie. Neben

seiner Eigenschaft als Oberflächenprotein auf Leukozyten, Fibroblasten, ECs, Glatte

Muskelzellen, Melanozyten und Keratinozyten wird es auch aktiv von diesen Zellen

sezerniert. Es wirkt chemotaktisch auf Monocyten, dendritische Zellen, T-Zellen und

natürliche Killerzellen (61). Ein enger Zusammenhang von MCP-1 mit der Pathogenese

von MS und EAE (experimental autoimmune encephalomyelitis) wird diskutiert (84).

Interleukin-8 (Il-8) gehört zu den Neutrophilen-spezifischen CXC-Chemokinen. Es ist

ein 8 kDa großer potenter chemotaktischer und aktivierender Faktor für Neutrophile, der

von vielen verschiedenen Zellen produziert wird (Monozyten, Makrophagen, T-Zellen,

EC, Fibroblasten, Astrozyten, etc.). Ebenso wie Il-6 wird Il-8 nach Stimulation mit

proinflammatorischen Faktoren (Il-1, TNFα) vermehrt gebildet. Lee et al. schreibt Il-8

eine Rolle bei der Modulation der transendothelialen Migration von Neutrophilen zu

(50).

1.2.4 Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF)

Der zur Familie der Neutrophine gehörende BDNF ist ein 13 kDa großes nicht-

glykosyliertes Polypeptid. Es ist zu 52 % mit dem NGF (nerve growth factor) identisch,

Einleitung

- 14 -

enthält sechs Cystein-Reste, die untereinander drei Disulfidbrücken bilden. BDNF wird

von unterschiedlichen Zellen gebildet, einschließlich Fibroblasten, Astrocyten,

Neurone, Megakaryocyten, Schwannzellen, Glatten Muskelzellen, aktivierte T-Zellen,

B-Zellen, Monocyten (47) und von humanen CEC (7). Die Funktionen von BDNF sind

vielfältig. Es begünstigt unter anderem das Überleben von Neuronen, ist involviert in

die Regulation von EC und besitzt immunregulatorische Eigenschaften (75).

1.2.5 Matrix-Metalloproteasen

Die Matrix-Metalloproteasen MMP-2 und MMP-9 gehören zu der großen Familie Zink-

abhängiger, strukturell verwandter Endopeptidasen, die zum Verdau extrazellulärer

Matrix und Proteine befähigt sind (87, 93). Man unterscheidet Kollagenasen,

Gelatinasen, Stromelysine, Matrilysin, Metalloelastase und membranständige MMPs.

MMP-2 und MMP-9 sind Gelatinasen (Tabelle 1-3).

MMPs werden in einer inaktiven Vorstufe sezerniert und werden durch enzymatische

Spaltung (durch MMPs oder andere Proteasen) aktiviert.

Tabelle 1-3: Matrix-Metalloproteasen MMP-2 und MMP-9 und ihre bevorzugten Substrate. S: sezerniert, A: aktiviert.

Enzym Nummerierung Größe Substrate

72 kDa Typ IV Kollagenase bzw. Gelatinase A MMP-2

72 S

66 A Kollagen IV, V, VII, X, Fibronektin,

Gelatine

92 kDa Typ IV Kollagenase bzw. Gelatinase B MMP-9

92 S

86 A Kollagen I, III, IV, V, Gelatine,

Fibronektin

MMP-2 und MMP-9 werden von Neutrophilen, Mikroglia und EC gebildet (14).

Verschiedene Studien belegen die wichtige Rolle von MMP-2 und MMP-9 bei dem

Zusammenbruch der BHS bei MS und EAE. Sie ermöglichen hier die Infiltration von

Monozyten und T-Zellen ins ZNS (50, 29, 64, 6,).

1.3 PHOSPHODIESTERASE-IV-INHIBITION

Bei der Pathologie der MS spielt die bereits beschriebene Zerstörung der BHS eine

wichtige Rolle. Die Idee dieser Arbeit ist es, durch eine Mesopram-induzierte cAMP-

Erhöhung die Permeabilität der BHS zu stabilisieren, und damit den Verlauf der

Erkrankung zu beeinflussen.

Einleitung

- 15 -

Im Folgenden wird der Wirkmechanismus des second messengers cAMP, die Familie

der PDE’s sowie deren Inhibition durch Mesopram vorgestellt.

1.3.1 Zyklisches Adenosin-3´, 5´-Monophosphat (cAMP)

cAMP ist ein sogenannter “second messenger”, der erstmals im Jahr 1957 von Earl

Wilbur Sutherland entdeckt wurde. Second messenger sind intrazelluläre Vermittler von

extrazellulären Signalen (z.B. Hormonbindung an spezifische Rezeptoren).

Die Signalkaskade beginnt bei der Hormonbindung an membranständige Rezeptoren,

die an heterotrimere G-Proteine (bestehend aus α-, β-, und γ-Untereinheit) gekoppelt

sind. Die α-Untereinheit ist inaktiv, wenn sie mit GDP beladen ist. Durch die

Hormonbindung wird sie aktiviert und tauscht GDP gegen GTP aus. Dadurch kommt es

zu einer Dissoziation des G-Proteinkomplexes. Die α-Untereinheit führt zur Aktivierung

der Adenylatcyklase, welche aus Adenosin-Tri-Phosphat (ATP) unter Abspaltung eines

Pyrophosphates zyklisches Adenosin-3´, 5´-Monophosphat (cAMP) bildet. Zur

Inaktivierung der Adenylatcyklase kommt es durch Hydrolyse des GTP auf der α-

Untereinheit, die über eine intrinsische GTPase-Aktivität verfügt. cAMP wird von

zyklischen Nukleotid-Phosphodiesterasen zu AMP hydrolysiert.

Einleitung

- 16 -

Abbildung 1-6: Ablauf der Signaltransduktion. Angriffsort des Phosphodiesterase-IV-Inhibitors Mesopram. ATP: Adenosin-Tri-Phosphat, 5´-AMP: 5`-Adenosin-Mono-Phosphat, PKA: Proteinkinase A.

Die Anwesenheit von cAMP führt bei der Proteinkinase A (PKA) zur Dissoziation der

beiden regulatorischen Untereinheiten von den katalytischen, so dass die PKA aktiv ist.

Sie phosphoryliert ATP-abhängig Serin-, Threonin- und Thyronin-Reste von Proteinen,

die zelluläre Mechanismen regulieren. Hierbei spielt die Aktivierung von

Transkriptionsfaktor CREB (cAMP-response-element binding protein)eine Rolle.

Dieses Protein bindet an Promoterregionen bestimmter Gene, so dass deren Expression

beeinflusst werden kann.

Eine cAMP-Erhöhung führt unter anderem zu einer Reduktion der EC-Permeabilität,

denn cAMP stabilisiert unter anderem epitheliale Junctions (TJ und AJ) (89). Auf

Immun- und Entzündungszellen wirkt eine cAMP-Erhöhung antiinflammatorisch:

Monozyten produzieren weniger TNFα und Eicosanoide, Lymphozyten sezernieren

weniger IFN-γ, Il-2 und Il-13 (11, 46, 67).

Einleitung

- 17 -

1.3.2 Familie der Phosphodiesterasen und ihr Wirkungsmechanismus

Phosphodiesterasen (PDEs) begrenzen den intrazellulären cAMP- und cGMP-Anstieg,

indem sie cAMP zu 5’-AMP, bzw. cGMP zu 5’-GMP abbauen. Eine Inhibiton von

PDEs führt über den gehemmten Abbau zur intrazellulären cAMP- bzw. cGMP-

Erhöhung (Abbildung 1-6).

Mittlerweile sind 11 Isoenzymfamilien beschrieben, die sich aufgrund von

Sequenzhomologien, Substratspezifität und – affinität sowie in ihrer Sensitivität

gegenüber Co-Faktoren bzw. Inhibitoren unterscheiden (8, 25). Innerhalb dieser Klassen

gibt es unterschiedlich viele bekannte Subtypen und Splicevarianten, die eine

verschieden starke Affinität zum Substrat zeigen, aber durch denselben Inhibitor

gehemmt werden können (Tabelle 1-4).

Die Phosphodiesterase-IV ist cAMP-spezifisch und typischerweise in Zellen des

Immunsystems und des ZNS zu finden (9).

Einleitung

- 18 -

Tabelle 1-4: Übersicht über die bisher bekannten Phophodiesterase-Isoenzyme. PDE: Phosphodiesterase, cAMP: cycl. Adenosin-Mono-Phosphat, cGMP: cycl. Gyanosil-Mono-Phosphat (modifiziert nach 8 Beavo, 1995; 25 Fawcett, 2000; 23, Essayan, 2001).

Klasse Bezeichnung Charakteristika Vorkommen Inhibitoren

I Ca2+/Calmodulin-PDE 7 bekannte Isoformen Herz, ZNS, Lunge,

Glatte Muskulatur Vinpocetin

II cGMP-stimulierte PDE

2 bekannte Isoformen, hydrolytische Aktivität für

cAMP

Nebenniere, Herz, Lunge, Leber, Thrombozyten

-

III cGMP-inhibierte PDE

2 bekannte Isoformen, hohe Spezifität für cAMP

Herz, Lunge, Leber, Thrombozyten,

Fettgewebe, Immunozyten

Enoximone, Milrinone

IV cAMP-spezifische PDE

30 bekannte Isoformen, Regulation durch cAMP-

abhängige oder direkt Phosphorilierung

Sertolizellen, Niere, ZNS, Leber, Lunge,

Immunozyten

Mesopram, Rolipram,

Zadaverdin

V cGMP-spezifische PDE

1 bekannte Isoform, hohe Spezifität für cGMP

Lunge, Thrombozyten, Glatte Muskulatur

Zaprinast, Sildenafil

VI Rod outer segment PDE

9 bekannte Isoformen, Photorezeptor Isoenzym

Photorezeptoren Vardenafil, Dipyridamol

VII cAMP-spezifische PDE

1 bekannte Isoform, verwandt mit PDE-IV

Skelettmuskel, Herz, Niere, ZNS, Pancreas,

T-Zellen -

VIII cAMP-spezifische PDE

1 bekannte Isoform, cAMP- Regulation der

Keimzellentwicklung

Testes, Auge, Leber, Skelettmuskel, Herz, Niere, Ovar,ZNS, T-

Zellen

Dipyridamol

IX cGMP-spezifische PDE

1 bekannte Isoform, sehr hohe Spezifität für cGMP

Niere, Leber, Lunge, ZNS Zaprinast

X cAMP-inhibierte PDE

1 bekannte Isoform, hydrolysiert cAMP und cGMP

Testes, ZNS IBMX

XI cAMP-spezifische PDE

3 bekannte Isoformen, hydrolysiert cAMP und cGMP

Skelettmuskel, Prostata, Niere, Leber, Testes,

Hypophyse, Speicheldrüse

IBMX, Dipyridamol

1.3.3 Mesopram, ein spezifischer Inhibitor der Phophodiesterase-IV

Es ist bekannt, dass PDE-IV-Inhibitoren (z.B. Rolipram) die Synthese von

proinflammatorischen Zytokinen (TNFα, IFN-γ) unterdrücken und die Synthese von

anti-inflammatorischen (Il-10) induzieren können (22). Vermutet wird dadurch die

Möglichkeit einer Stabilisation der BHS, weshalb in der MS-Forschung PDEs als

Einleitung

- 19 -

mögliche Therapeutika untersucht werden. Gegenstand aktueller Forschungen ist der

spezifische PDE-IV-Inhibitor Mesopram. Er hemmt einerseits die Aktivierung von

Makrophagen, die bei MS die Myelinschichten angreifen, andererseits T-Zellen, die

wiederum Makrophagen aktivieren.

In einer tierexperimentellen Studie haben Dinter et al. beschrieben, dass Mesopram

dosisabhängig den klinischen Krankheitsgrad von EAE bei Nagetieren reduziert, die

Infiltration von inflammatorischen Zellen ins ZNS unterdrückt und die Produktion von

Zytokinen inhibiert (18).

1.4 TUMOR-NEKROSE-FAKTOR-α

Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNFα) ist ein 17 kDa großes proinflammatorisches Zytokin,

bestehend aus drei gleichen Untereinheiten. Er wird hauptsächlich von aktivierten

mononukleären phagozytierenden Zellen (Monozyten, Makrophagen), Natürlichen

Killerzellen, B-Zellen, aktivierte T-Zellen, von Astrozyten und Mikroglia im ZNS

gebildet. Die Produktion von TNFα ist mit der Th-1-Antwort assoziiert und induziert

die Aktivierung von einer Vielzahl von Zellen und die Expression von

Adhäsionsmolekülen, Chemokinen und Zytokinen (42).

Sowohl in aktiven MS-Läsionen (66) als auch im Liquor und im Serum von MS-

Patienten findet man eine Erhöhung von TNFα, welche die Krankheitsaktivität von MS

widerzuspiegeln scheint (73) Die endotheliale Permeabilität der BHS wird durch TNFα

und Il-1β erhöht (16). Zusätzlich wird TNFα ein direkt demyelinisierender Effekt (in

vitro) zugeschrieben (81). Aufgrund dieser Erkenntnisse verwendeten wir in dieser

Arbeit TNFα als inflammatorischen Stimulator für die Versuche mit den HBMEC’s.

Zu den die Entzündung fördernden Eigenschaften von TNFα kommen Eigenschaften

hinzu, die der Reparatur und der Proliferation dienen (Tabelle 1.5).

Einleitung

- 20 -

Tabelle 1-5: Effekte von TNFα auf Zellen des ZNS bei MS (modifiziert nach Sharief, 1998, 82)

Entzündungsfördernde Eigenschaften Entzündungshemmende Eigenschaften

Induktion von NO-Synthase, freie O2-Radikale, Exzitotoxine

Induktion der Oligodendrozyten Apoptose

Hochregulation von Adhäsionsmolekülen

Hochregulation von MHC I und II

Genproduktion

Steigerung der EC-Permeabilität

Neuroprotektin in experimentellen Ischämien

Induktion der Superoxid-Dismutase

Stabilisierung des Kalzium-Gleichgewichts

Stimulation der Astrozyten-Proliferation

Antivirale Effekte

Es gibt zwei transmembranöse Rezeptoren für TNFα. Der TNF-RI (tumor necrosis

factor receptor I) hat ein Molekulargewicht von 55 kDa und ist sowohl in der Nähe des

Golgi Apparates als auch an der Zelloberfläche lokalisiert. Der 75 kDa TNF-RII wird an

der Zelloberfläche präsentiert.

Der TNF-RI enthält eine sogenannte death domain, die essentiell für die Induktion von

Apoptose zu sein scheint (70). Neben dieser Aufgabe (Übertragung von apoptotischen

Signalen) steuert der TNF-RI die Aktivierung von EC (17).

Beide Rezeptortypen werden auch als lösliche Formen in humanem Urin und Plasma

gefunden. Man geht davon aus, dass die lösliche Form mit der membrangebundenen

Form um die Bindung von TNFα kompetiert. Erhöhte Level von hsTNF-RI (human

soluble tumor necrosis factor receptor I) werden unter anderem im Plasma von Patienten

mit Infektionen, Malignomen aber auch bei MS gefunden.

Einleitung

- 21 -

1.5 ZIELSETZUNG

MS ist eine chronisch demyelinisierende Erkrankung des ZNS, deren

pathophysiologischen Mechanismen noch nicht bis ins Detail bekannt sind.

Die Permeabilität der BHS spielt im Zusammenhang mit der Infiltration von

Entzündungszellen ins ZNS bei MS eine wichtige Rolle. Adhäsionsmoleküle (ICAM-1,

VCAM-1, MCAM), TJ (Occludin, Claudin, ZO-1), Zytokine (Il-6, Il-8, MCP-1, AR),

Neutrophine (BDNF) und Matrix-Metalloproteinasen (MMP-2/-9) sind Faktoren, die

die Permeabilität der BHS mitbestimmen und die Migration von Lymphozyten

ermöglichen.

Der second messenger cAMP beeinflusst einerseits die Stabilität der BHS direkt,

andererseits nimmt er über eine Signalkaskade Einfluss auf die Transkription

verschiedener Moleküle.

Gegenstand bisheriger Studien des PDE-IV-Inhibitors Rolipram zeigten in

tierexperimentellen Studien eine Stabilisierung der BHS (27).

Ziel dieser Arbeit war es den neuen, selektiven PDE-IV-Inhibitor Mesopram auf

ähnliche Eigenschaften hin zu untersuchen.

Die Fragestellung im Speziellen war, inwiefern ein Mesopram-induzierter Anstieg der

intrazellulären cAMP-Konzentration in vitro Einfluss auf die Expression der genannten

Faktoren unter inflammatorischen Bedingungen (TNFα-Stimulation) beeinflusst und

inwiefern daraus ein therapeutischer Ansatz resultieren könnte.

Material und Methoden

- 22 -

2 MATERIAL UND METHODEN

2.1 MATERIAL

2.1.1 Laborgeräte

Biofuge 15 bzw. 15R Heraus, Osterode

Digitale Kamera mit Software-System Olympus, Hamburg

Elektrophorese Power Supply ST 305 Gibco-BRL-Life-Technologies,

Eggenstein

Feinwaage PB Mettler-Toledo AG, Greifensee, Schweiz

FACscan Becton Dickinson, Bedford, USA

Floureszenz-Mikroskop IX 70 Olympus, Hamburg

Hera cell 240, CO2 water-jacketed Incubator Kendro

IKA-Vibrax-VXR Hartenstein, Würzburg

Mikropipetten Gilson, Villiers-le-Bel, Frankreich

Multiskan Photometer, ELISA Labsystems, Helsinki, Finnland

Multipette plus Eppendorf, Hamburg

Reamix 2789 Hartenstein, Würzburg

Sicherheitswerkbank Laminar Flow Klasse II Nuaire-Zapf, Sarstedt, Nümbrecht

Zentrifuge CR422 Jouan, Unterhaching

2.1.2 Verbrauchsmaterial

Einwegsspritzen Becton Dickinson, Heidelberg

FACS-Röhrchen Becton Dickinson, Heidelberg

Kryo-Röhrchen Nunc, Roskilde, Dänemark

Multi-well-Platten Nunc, Roskilde, Dänemark

Pipettenspitzen (10,20,200,1000 µl) Greiner, Würzburg

Reaktionsgefäße 0,7, 1,5, 2,0 ml Eppendorf, Hamburg

Sterilfilteraufsätze 0,2 µm Schleicher&Schuell, Dassel

Zellkulturschalen 24-well Nunc, Roskilde, Dänemark

Zellkulturschalen 6-well Nunc, Roskilde, Dänemark

Zellkulturschalen (10 cm) Nunc, Roskilde, Dänemark


- 23 -

Zellschaber Nunc, Roskilde, Dänemark

Zentrifugenröhrchen, Polypropylen Falcon, München

15 bzw. 50 ml

2.1.3 Chemikalien

Bovines Serum Albumin (BSA) Sigma, Deisenhofen

CoomassieBlue 250 Sigma, Deisenhofen

4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Sigma, Deisenhofen

1,4-Diazabicyclo(2.2.2)octan (DABCO) Sigma, Deisenhofen

Dimethylsulfoxid (DMSO) Roth, Karlsruhe

Eisessig (100 % Essigsäure) Merck, Darmstadt

Ethanol, absolut J.T. Baker, Deventer, Niederlande

Ethylendinitrilotetraacetat-dinatriumsalz Sigma, Deisenhofen

(EDTA)

Formaldehyd, 37 % Merck, Darmstadt

Gelatine Sigma, Deisenhofen

Natriumacid (NaN3) Sigma, Deisenhofen

Salzsäure (HCl) Merck, Darmstadt

SYTOX Green nucleic acid stain (SYTOX) Molecular Probes, Eugene, USA

Tris Sigma, Deisenhofen

Triton-X-100 Sigma, Deisenhofen

2.1.4 Antikörper

Anti CD146 Chemicon, Tenecula, USA

Anti Claudin-3/-5 Zymed Laboratories Inc., San Francisco,

USA

Anti Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP) Dako, Glostrup, Dänemark

Anti ICAM-1 FITC-Conjugat Biosource, Belgium, Europa

Anti Occludin Zymed Laboratories Inc., San Francisco,

USA

Anti VCAM-1 (FITC) Ancell Cooperation, Bayport, USA

Anti von Willebrand-Faktor (vWF) Dako, Glostrup, Dänemark


- 24 -

Anti ZO-1 Zymed Laboratories Inc., San Francisco,

USA

Anti α-Actin (ASM) Roche Diagnostics GmbH, Mannheim

Cyanine Konjugate (Cy3) Anti Mouse IgG Chemicon, Temecula, USA

Cyanine Konjugate (Cy3) Anti Rabbit IgG Biotrend, Köln

Rabbit bzw. Anti Mous IgG1, κ Sigma

Rekombinantes humanes TNF-α Strathmann Biotech GmbH, Hannover

Streptavidin-Fluorescein Boehringer Mannheim, Mannheim

2.1.5 Kommerzielle Kits

Amphiregulin ELISA R&D Systems GmbH, Wiesbaden

cAMP ELISA R&D Systems GmbH, Wiesbaden

BDNF ELISA R&D Systems GmbH, Wiesbaden

Il-6 ELISA R&D Systems GmbH, Wiesbaden

Il-8 ELISA R&D Systems GmbH, Wiesbaden

MCP-1 ELISA R&D Systems GmbH, Wiesbaden

2.1.6 Reagenzien für die Zellkultur

Amphotericin (250 µg/ml) Gibco-BRL-Life-Technologies,

Eggenstein

Endothelial cell growth supplement Sigma, Deisenhofen

ECGS (15 mg)

Fetales Kälberserum (FCS) Boehringer Ingelheim, Heidelberg

Seromed, Berlin

Gelatine Sigma, Deisenhofen

Gentamicin (10 mg/ml) Gibco-BRL-Life-Technologies,

Eggenstein

Heparin (100000 U) Sigma, Deisenhofen

L-Glutamin (200 mM) Biochrom, Berlin

MEM-Vitamine Biochrom, Berlin

Na-Pyruvat (100 mM) Biochrom, Berlin


- 25 -

Penicillin (5000 U) / Streptomycin (5 mg/ml) Gibco-BRL-Life-Technologies,

Eggenstein

Phosphate Buffered Saline (PBS) Biochrom, Berlin

RPMI 1640(mit HEPES/L-Glutamin) Gibco-BRL-Life-Technologies,

Eggenstein

Dulbeccos´s Phosphate Buffered Saline Biowhittaker, Verviers, Belgien

(DPBS)

Trypsin-EDTA (1x Lsg. für EC-Kulturen) Sigma, Deisenhofen


- 26 -

2.2 METHODEN

2.2.1 Zellkultur

2.2.1.1 Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC’s)

Human brain microvascular endothelial cells sind SV-40 transfizierte Zellen (largeT),

die uns freundlicherweise von Kwang Sik Kim aus der John Hopkins University School

of Medicine aus Baltimore zur Verfügung gestellt wurden. Es handelt sich um im

Monolayer adhärent wachsende Endothelzellen, die Adhäsionsmoleküle exprimieren

(95). Diese Zellen sind aufgrund ihrer Morphologie sowie ihrer Eigenschaft, unter

inflammatorischen Bedingungen eine erhöhte Expression von Adhäsionsmolekülen

auszubilden (20, 88), von besonderer Bedeutung für diese Arbeit.

2.2.1.2 Medien

Kulturmedium FCS 5 % 5 ml

ECGS 3 µg/ml 1 ml

Heparin 5 U/ml 100 µl

L-Glutamin 2 mM 1 ml

Na-Pyruvat 1mM 1 ml

MEM Vitamine 1ml auf 100ml 1 ml

RPMI 1640 80 ml

Auftaumedium FCS 5 %

ECGS 3 µg/ml

Heparin 5 U/ml

L-Glutamin 2 mM

Na-Pyruvat 1 mM

MEM Vitamine 1 ml auf 100 ml

Penicilin/Streptomycin 1:100

RPMI 1640

Einfriermedium 90 % FCS

10 % DMSO

Waschmedium RPMI 1640 mit 10 % FCS


- 27 -

Coating Medium 2 % Gelatine in DPBS

Die angesetzten Medien werden steril filtriert, in 2-4 Tagen verwendet und bei 4°C

gelagert. Die aliquotierten Medienzusätze sind bei –20°C gelagert und werden bei

Bedarf aufgetaut.

2.2.1.3 Passagieren von zerebralen Endothelzellen

Um vor Beginn der Versuche eine geeignete Menge von HBMEC’s zu erhalten, werden

die Zellen in 75 ml Kulturflaschen angezüchtet. Da es sich um adhärent wachsende

Zellen handelt, ist eine vorherige Präparation der Flaschen mit 2% Gelatine in DPBS

über eine halbe Stunde bei Raumtemperatur erforderlich.

Nach 2-3 Tagen sind die Zellen konfluent und können in einem Verhältnis von 1:2 – 1:4

gesplittet werden. Das Abnehmen des Mediums erfolgt mit einer Pasteurpipette.

Nachfolgend werden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, um tote Zellen und

Zellfragmente zu entfernen. Um die Zellen aus ihrem Verband zu lösen, werden 2 ml

Trypsin-EDTA hinzugegeben. Nach ungefähr fünf Minuten Inkubation sind die meisten

Zellen gelöst, unterstützend wirkt leichtes Klopfen an die Zellkulturflasche.

Die noch ungelösten Zellen werden mit einer Pipette vorsichtig heruntergespült und in

Waschmedium überführt. Hierdurch wird der Trypsin-Verdau beendet. Durch

Zentrifugation (1350 rpm, 5 min, Raumtemperatur) wird das Trypsin entfernt. Das

HBMEC-Pellet wird noch einmal in Waschpuffer resuspendiert, erneut zentrifugiert

(1350 rpm, 5 min, Raumtemperatur) und in entsprechender Menge in Kulturmedium

aufgenommen.

Bevor die Zellsuspension in die Zellkulturflaschen gegeben werden kann, muss das

überschüssige DPBS abgesaugt werden.

Für die meisten Versuche werden die Endothelzellen auf 24-well-Platten ausgesät.

2.2.1.4 Auftauen und Einfrieren von zerebralen Endothelzellen

Beim Auftauen von Zellen werden die Kryo-Röhrchen aus dem Stickstofftank auf Eis

transportiert und in ein 37°C warmes Wasserbad überführt. Hier verweilen sie nur so

lange, bis noch ein kleiner Rest des Gefrorenen sichtbar ist. Anschließend werden die

Zellen mit einer Pipette aufgenommen und in vorgekühltes Waschmedium (100 µl

RPMI 1640 mit 10 % FCS) gegeben. Nun wird jede Minute eine steigende Menge von


- 28 -

Waschmedium hinzu pipettiert, um das für die Zellen toxische DMSO zu verdünnen

(120 µl, 150 µl, 190 µl, 260 µl, 360 µl, 520 µl, 860 µl, 1,69 ml, 4,75 ml, 10 ml). Bei der

nachfolgenden Zentrifugation (1200 rpm, 10 min, 4°C) werden die Zellen vom DMSO

getrennt und können nach erneutem Waschen in 10 ml Auftaumedium (HBMEC-

Kulturmedium mit Pen/Strep) resuspendiert werden. Die Zellen werden bei 37°C / 5 %

CO2 in 75ml Kulturflaschen kultiviert.

Zum Einfrieren verwendet man wie beim Passagieren Trypsin-EDTA, um den

Zellverband zu lösen. Nach zweimaligen Waschen mit Waschmedium (RPMI 1640 mit

10 % FCS) – 10-minütige Zentrifugation bei 1200rpm bei 4°C – werden die Zellen aus

einer Kulturflasche in 1 ml eisgekühltes Einfriermedium (90 % FCS und 10 % DMSO)

in Kryo-Röhrchen überführt, die auf Eis vorgekühlt werden. Zum langsamen Einfrieren

werden die Zellen über Nacht bei -80°C belassen, um dann in flüssigem Stickstoff

gelagert zu werden.

2.2.2 Stimulation cerebraler Endothelzellen mit Mesopram

Für die verschiedenen Versuchsansätze werden die HBMEC’s in 24-well

Zellkulturplatten bzw. 10 cm Zellkulturschalen (für den hohen Proteinbedarf des

Western Blots) ausgesät. Nach 24 h, wenn die Zellen konfluent sind und eine Zelllage

bilden, wird ein Medienwechsel vorgenommen und es werden die spezifischen

Bedingungen hergestellt. Das Medium für die Stimulation entspricht dem normalen

HBMEC-Medium allerdings ohne den Zusatz von FCS. Als inflammatorische

Bedingung wird das Zytokin TNFα in unterschiedlichen Konzentrationen (1 ng/ml, 10

ng/ml, 100 ng/ml) zugesetzt. Der spezifische Phosphodiesterase-IV-Inhibitor

Mesopram, in DMSO gelöst, ist in den Konzentrationen von 0,3 nM-3000 nM getestet

worden. Um eine Kontrolle für die Wirkung von DMSO auf die Zellen zu haben,

werden DMSO-Kontrollen in den gleichen Konzentrationen (0,3 nM-3000 nM)

mituntersucht.

Die Zellen werden nach 24 h und 48 h geerntet, die Überstände der einzelnen

Bedingungen in 500 µl-tubes aliquotiert und bei –80°C gelagert und die Zellen entweder

für FACS-Färbungen, Immunhistologie oder Western Blots verwendet.

Die Kinetik bei den Versuchen für die Messung der cAMP-Konzentration mittels

ELISA ist mit 15, 30 und 60 Minuten kürzer gewählt worden. Es wird nur die höchste


- 29 -

TNFα-Konzentration (100 ng/ml) getestet. Die Mesopram-Konzentrationen sind 0,3, 3,

30 und 300 nM.

2.2.3 Immuncytologie

2.2.3.1 Prinzip

Wasch-/Verdünnungspuffer 10 % FCS in DPBS

Zellfixans 3,7 % Formaldehyd in DPBS

0,1 % Triton-X-100 in DPBS

Zur immunhistochemischen Färbung werden die Zellen in 24- bzw. 6-well-Platten

kultiviert. Das Prinzip der Immuncytologie beruht auf einer Antikörper-

Antigenbindung. An spezifische Oberflächenmoleküle (tight junction-Proteine,

Adhäsionsmoleküle, etc.) binden in der ersten Phase die gewünschten Antikörper (z.B.:

GFAP, ASM, ZO-1, VW-Faktor). In der zweiten Phase bindet ein floureszenz-

markierter Antikörper an den ersten, wodurch diese Strukturen sichtbar gemacht werden

können (Abbildung 2-1).

Abbildung 2-1:Prinzip der Immuncytologie


- 30 -

2.2.3.2 Durchführung

Das Medium wird von der Zellkultur herunter genommen. Die Zellen werden vorsichtig

zweimal mit Waschpuffer gewaschen. Als erstes Fixans wird 3,7 % Formaldehyd in

DPBS aufgetragen und für 13 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend

wird das Formaldehyd abgesaugt und durch das zweite Fixans, 0,1 % Triton-X-100,

ersetzt. Dieses inkubiert 7 Minuten ebenfalls bei Raumtemperatur. Nach einmaligem

Waschen folgt eine 15-minütige Inkubationszeit mit Waschpuffer.

Der Primärantikörper wird in entsprechender Verdünnung auf die Zellen aufgetragen

und zum Binden an die passende Struktur für eine Stunde bei Raumtemperatur belassen.

Es wird erneut zweimal gewaschen und dann der Sekundärantikörper, der Cyanine

Konjugat (Cy3, bzw. FITC) gelabelt ist, ebenfalls in entsprechender Konzentration auf

die Zellen gegeben. Auch der Sekundärantikörper wird für eine Stunde bei

Raumtemperatur inkubiert. Es muss darauf geachtet werden, dass dies im Dunkeln

geschieht.

Nach zweimaligem Waschen erfolgt die Färbung der Zellkerne mit Dapi (1:3000

verdünnt). Nach 5 Minuten bei Raumtemperatur sind die Zellkerne stark genug

angefärbt, so dass ein letztes Mal gewaschen werden kann. Zum Abschluss werden in

jedes Well 1-2 Tropfen DABCO gegeben.

Die Auswertung erfolgt am Floureszenz-Mikroskop IX 70, an welches eine digitale

Kamera mit Software-System für die quantitative Auswertung angeschlossen ist.


- 31 -

Tabelle 2-1: Antikörper der Immuncytologie

Primärantikörper Wirt Verdünnung Sekundärantikörper (1:300)

ASM-1 (anti-smooth-Muscle) Rabbit 1:50 Cyanine Konjugat (Cy3)

Rabbit

Claudin-3 Rabbit 1:15 Cy3 Rabbit

Claudin-5 Rabbit 1:15 Cy3 Rabbit

Dapi 1:3000

GFAP (Glial fibrillary acidic protein) Rabbit 1:100 Cy3 Rabbit

ICAM-1 Mouse 1:40/1:20 FITC

ISO ICAM-1 Mouse 1:40/1:20 Cy3 Mouse

ISO mouse Mouse 1:300 FITC

ISO rabbit Rabbit 1:300 Cy3 Rabbit

ISO VCAM-1 Mouse 1:10 FITC

Occludin Rabbit 1:50 Cy3 Rabbit

VCAM-1 Mouse 1:10 FITC

VE-Cadherin Rabbit 1:50/1:100 Cy3 Rabbit

VW-Faktor (Von Willebrand-Faktor) Rabbit 1:100 Cy3 Rabbit

ZO-1 (Zonulae occludentes) Mouse 1:100 Cy3 Mouse

2.2.4 Quantitative Bestimmung von Oberflächenmolekülen mittels

Durchflusscytometer (FACS)

2.2.4.1 Prinzip

Die Durchflusszytometrie bedient sich verschiedener physikalischer Eigenschaften einer

Zelle. Im floureszenzaktivierten Zellsorter (FACS) werden die Zellen einzeln in einem

feinen Flüssigkeitsstrom in einer Kapillare an der Messeinheit vorbei geleitet. Dort

werden die Streuung von der Laserlichtquelle und die Emission der Floureszenz

bestimmt. Die Lichtsignale werden in elektronische Signale umgewandelt, verstärkt und

in einem Computer digital gespeichert.

Anhand der Streuung von Laserlicht werden die Eigenschaften Größe und Granularität

bestimmt. Die Vorwärtsstreuung (forward scatter, FSC), die in einem Winkel von 2-20°

zum einfallenden Laserstrahl gemessen wird, beschreibt die Zellgröße. Das


- 32 -

Seitwärtsstreulicht (side scatter, SSC), in einem Winkel von 90° zur Achse des

einfallenden Lichts gemessen, ist proportional der Zellgranularität.

Anhand der Messung der Emission von Floureszenz können zu bestimmende

Oberflächenstrukturen, die durch Antikörper-Reaktion und einen zweiten

floureszierenden Antikörper detektiert werden, ermittelt werden. Die Intensität der

Emission ist hierbei proportional zur Menge der gebundenen Antikörper.


Auch bei der FACS-Analyse werden die HBMEC’s mit Trypsin-EDTA aus dem

Zellverband gelöst und pro well in 2 ml RPMI 1640 mit 10 % FCS in FACS-Röhrchen

aufgenommen. Das Trypsin wird durch Zentrifugation (1400 rpm, 4 min, 4°C) entfernt.

Anschließend wird mit PAB-Puffer (DPBS, 0,1 % BSA, 0,1 % NaN3) gewaschen.

Zum Blocken wird das zum Antikörper passende Serum (meist Maus-Serum, 10 % in

PAB-Puffer) zu den Zellen gegeben und für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach dieser

Zeit gibt man 2 ml PAB-Puffer hinzu und wäscht das Serum aus.

Die FITC-gelabelten Antikörper werden in der entsprechenden Konzentration in PAB-

Puffer verdünnt, zu den Zellen gegeben und für 45 Minuten auf Eis und in Dunkelheit

inkubiert. Durch nachfolgendes Waschen mit DPBS werden die ungebundenen

Antikörper entfernt.

In 500 µl DPBS aufgenommen können die Zellen im Durchflusszytometer analysiert

werden. Pro Ansatz werden ca. 10000 Zellen gemessen, im Programm CellQuest

aufgezeichnet und ausgewertet.

Der Antikörper CD146 ist Biotin-gelabelt, so dass eine zweite 45-minütige

Inkubationszeit mit Streptavidin-Cy3 (1:30, 1:300, 1:3000, in PAB-Puffer) zum

Detektieren notwendig ist. Es wird auf Eis und in Dunkelheit inkubiert. Des Weiteren

wird wie oben beschrieben vorgegangen.

Tabelle 2-2: Antikörper der FACS-Analyse

Primärantikörper Wirt Verdünnung Floureszens

ICAM-1

VCAM-1

CD146

Mouse

Mouse

Mouse

1:20

1:5

1:200

FITC

FITC

Biotin


- 33 -

2.2.5 „Enzyme-linked Immunosorbent Assay“ (ELISA)

2.2.5.1 Prinzip

Der Nachweis von Proteinen in Flüssigkeiten gelingt mit dem ELISA. Es handelt sich

um ein immunologisches Verfahren, das nach dem Prinzip der Antikörper-Antigen-

Reaktion funktioniert.

Zu dem gesuchten Antigen homologe Antikörper werden am Boden von

Mikrotiterplatten gebunden. Wird der Überstand mit den passenden Antigenen

hinzugegeben, findet eine Antikörper-Antigen-Reaktion statt. In einem weiteren Schritt

wird unter Zugabe eines zweiten enzymmarkierten Antikörpers der Antikörper-Antigen-

Komplex zum Antikörper-Antigen-Antikörper-Komplex erweitert, weswegen der

ELISA auch als Sandwichtest bezeichnet wird. In der nachfolgenden Enzymreaktion

wird hinzugegebenes Substrat umgesetzt. Die umgesetzte Substratmenge ist

proportional zur Menge der gebundenen Antigene.

Bei den in dieser Arbeit verwendeten ELISA-Kits ist der zweite Antikörper mit

Meerrettich-Peroxidase konjugiert. Die tetramethylbenzidin-haltige Substratlösung

reagiert mit diesem Enzym unter Ausbildung einer blauen Farbe. Durch Zugabe einer

Stopplösung (2N H2SO4) erhält man einen Farbumschlag von blau nach gelb. Nun

erfolgt die photometrische Messung am Multiscan Photometer.

Eine Ausnahme ist der cAMP-ELISA. Hier ist der Zweitantikörper mit alkalischer

Phosphatase konjugiert, die dann mit nitrophenyl-phosphat-haltiger Substratlösung

reagiert. Nach Zugabe der Stopplösung (Trinatrium-Phosphate) wird am Multiscan

Photometer gemessen.

2.2.5.2 Proteingewinnung für den cAMP-ELISA

Der cAMP-ELISA wird nicht, wie bei anderen ELISA´s, mit Überständen durchgeführt,

sondern mit Zelllysaten. Der Überstand der Zellkultur wird in 500 µl tubes aliquotiert

und bei –80°C weggefroren. Die Zellen werden zwei- bis dreimal mit DPBS

gewaschen. Anschließend wird 0,1 N HCl (550 µl pro well einer 6-well-Kulturplatte)

auf die Kulturplatte gegeben und dieses für 10-20 Minuten inkubiert. Wenn die Zellen

sich gelöst haben – mikroskopische Kontrolle – wird das Zelllysat mit einer Pipette

aufgenommen, in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt und bei 600 g zentrifugiert.


- 34 -

Danach wird der Überstand in ein neues Eppendorfgefäß gegeben und bei –80°C

aufbewahrt. Das weitere Procedere entspricht der Vorgehensweise des Sandwich-

ELISAs.


Die meisten in dieser Arbeit verwendeten ELISA-Kits von R&D beinhalten eine

Mikrotiterplatte, bei der bereits der erste Antikörper (Capture Antibody) fixiert ist.

Lediglich für den AR-ELISA muss der verdünnte Capture Antibody für eine Stunde bei

Raumtemperatur stehen, damit dieser sich in die Vertiefungen der einzelnen wells

binden kann.

In jedes well werden 100 µl Verdünnungspuffer (Assay Diluent) und der Standard bzw.

die Proben in bestimmter Verdünnung pipettiert. Damit sich im Zellüberstand

befindliches Zytokin bzw. Antigen an den immobilisierten Antikörper binden kann,

wird die Platte 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert.

Ungebundene Substanzen werden durch viermaliges Waschen mit Waschpuffer (400

µl/well) entfernt. Um den Waschpuffer vollständig aus der Mikrotiterplatte hinaus zu

befördern, wird diese kräftig auf Zellophan ausgeklopft.

Anschließend wird der zweite Antikörper als Konjugat (100 µl/well) dazugegeben.

Nach einer Stunde Inkubationszeit wird die Platte erneut viermal gewaschen. Es folgt

die Zugabe von der Substratlösung (200 µl/well) und eine Inkubation über 30 Minuten

bei Raumtemperatur im Dunkeln. Angehalten wird diese Reaktion mit der Stopplösung

(50 µl/well). Innerhalb der nächsten 30 Minuten wird die optische Dichte gemessen.


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Tabelle 2-3: Besonderheiten der verschiedenen ELISA-Kits

cAMP-ELISA Amphiregulin-ELISA BDNF-ELISA Il-6-ELISA Il-8-ELISA MCP-1 ELISA

Verwendete Proben Zelllysate Zellüberstände Zellüberstände Zellüberstände Zellüberstände Zellüberstände

Verdünnung der Proben 1:1 1:1 1:1 1:100 in Calibrator

Diluent RD5A 1:20 in Calibrator

Diluent RD5P 1:50 in Calibrator

Diluent RD5L

Ablauf

100µl Capture Antibody, 1 h Inkubation, 3x

Waschen

50 µl Neutralizing Reagent, +50 µl

Conjugat 100 µl Assay Diluent 100 µl Assay Diluent 100 µl Assay Diluent

+100 µl Standard/Probe

100 µl Standard/Proben

+ 50 µl Standard/Probe

+100 µl Standard/Probe

+50 µl Standard/Probe 200 µl Standard/Probe

1,5h Inkubation 2h Inkubation 2h Inkubation 2h Inkubation 2h Inkubation

3x Waschen Nicht Waschen! 4x Waschen 4x Waschen 3x Waschen

+50 µl Antibody Solution

100 µl Detection Antibody +100 µl Conjugat +200 µl Conjugat +100 µl Conjugat +200 µl Conjugat

2h Inkubation 1,5h Inkubation 1h Inkubation 2h Inkubation 1h Inkubation 1h Inkubation

3x Waschen 3x Waschen 3x Waschen 4x Waschen 4x Waschen 3x Waschen

200 µl Substrat 100 µl Substrat 200 µl Substrat 200 µl Substrat 200 µl Substrat 200 µl Substrat

1h Inkubation 20min Inkubation 30min Inkubation 20min Inkubation 30min Inkubation 20min Inkubation

50 µl Stopplösung 50 µl Stopplösung 50 µl Stopplösung 50 µl Stopplösung 50 µl Stopplösung 50 µl Stopplösung

Messung

Korrektur

405nm

540nm

450nm

540nm

450nm

540nm

450nm

540nm

450nm

540nm

450nm

540nm


- 36 -

2.2.6 Western Blot

2.2.6.1 Prinzip

Der Western Blot ist eine Methode, um spezifische Proteine aus einem komplexen

Proteingemisch zu identifizieren. Es lassen sich sowohl aus Gesamtzellprotein als auch

aus Gewebelysaten Proteine nachweisen.

Die Auftrennung der Proteine erfolgt gelelektrophoretisch entsprechend ihrem

Molekulargewicht. Im Anschluss werden die Proteine auf eine Membran transferiert

(geblottet) und sind dadurch immobil.

Die Detektion des Proteins geschieht durch eine Antikörper-Antigen-Reaktion. Über

einen Peroxidase-gekoppelten Zweit-Antikörper wird das Protein letztendlich sichtbar

gemacht.

2.2.6.2 Proteingewinnung für Western Blots

RIPA-Puffer 50 mM Tris-HCL 7,4

1 % NP-40

0,25 % Natrium-Desxycholat

150 mM NaCl

1 mM EDTA

Aqua dest. ad 100 ml

Proteaseinhibitor-Lösung 1 Tablette Complete® (Roche) in 2 ml

Aqua dest.

Für die Western Blots werden die HBMEC’s in 10 cm Zellkulturschalen von Nunc

gezogen. Nach 24 h/48 h Stimulation mit TNFα wird der Überstand abgenommen und à

500 µl aliquotiert und bei –80°C weggefroren. Die Schale wird mit 10 ml PBS-Puffer

gewaschen. Nach Zugabe von 1 ml RIPA-Puffer mit Proteaseinhibitorlösung (1:25) und

Schwenken der Schale, werden die Zelllysate mit dem Cell-Scraper systematisch

abgeschabt.

In ein 1,5 ml Eppendorfgefäß überführt, werden die Lysate für 20 Minuten im

Kühlraum hart geschüttelt und dann zentrifugiert (14000 rpm, 15 min, im Kühlraum).

Der Überstand wird in ein neues 1,5 ml Eppendorfgefäß pipettiert, für ca. 2 Minuten in

flüssigem Stickstoff eingefroren und dann bei –80°C gelagert.


- 37 -

2.2.6.3 Proteinkonzentrationsbestimmung

Um die verschiedenen Versuchsansätze miteinander vergleichen zu können, muss der

Proteingehalt der Proben einander angeglichen werden. Hierfür wird die Proteinmenge

von jeder Probe ermittelt und dann die gleiche Menge an Gesamtprotein auf das Gel

aufgetragen.

Die Proteinkonzentration wird mit dem Coomassie® Protein Assay Reagent Kit

ermittelt. 0,1 ml des Standards bzw. der Probe werden mit 5 ml Coomassie Reagent

gemischt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Anschließend wird

die Absorption bei 595 nm im Spectrophotometer gemessen. Um absolute

Proteinkonzentrationen zu bestimmen, wird zusätzlich eine Standardkurve von BSA-

Standardlösungen erstellt.


Die Proben werden mit der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-Page)

entsprechend ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Die beiden Glasplatten (10x12 cm)

und die Spacer sind mit Ethanol zu reinigen. Die Spacer werden zwischen die

Glasplatten gelegt und durch die Klammern befestigt. Die Platten werden mit 1 %

Agarose in SDS-Laufpuffer abgedichtet.

15% Sammelgel H2O 4,6 ml

30 % Acrylamid 10 ml

1,5 M Tris-Puffer (pH8,8) 5 ml

10 % SDS 0,2 ml

10 % Ammoniumpersulfat 0,2 ml

TEMED 0,008 ml

Trenngel H2O 4,1 ml

30 % Acrylamid 1 ml

1,5 M Tris-Puffer (pH6,8) 0,75 ml

10 % SDS 0,06 ml

10 % Ammoniumpersulfat 0,06 ml

TEMED 0,006 ml


- 38 -

Zuerst gießt man das Sammelgel zwischen die Glasplatten bis ca. 1,5 cm unterhalb der

Oberkante. Dann muss sofort das Trenngel folgen und der Kamm hineingedrückt

werden. Nach etwa 40 Minuten sind die Gele auspolymerisiert.

Zu den verdünnten Proben wird Probenpuffer (62,5 nM Tris/HCl pH 6,8, 8 % SDS, 15

% Glycerin, 3 % Mercaptoethanol, eine Spatelspitze Bromphenolblau) hinzugegeben,

sie werden für 3 Minuten bei 100°C gekocht und auf die Gele aufgetragen. Die

Gelelektrophorese läuft 1 h bei 40 mA in Laufpuffer (5x, 100 g Glycin, 15 g Tris, 5 g

SDS, ad 1 l Aqua dest.).

Blotting-Puffer 10 ml 10x Puffer (144 g Glycin, 30,3 g

Tris, ad 1 l H2O)

20 ml Methanol

70 ml H2O

Zum Blotten werden die Gele mit der Nitrocellulose-Membran zwischen Whatman-

Papiere gelegt (200 mA, 1,5 h). Zum Prüfen des Blots färbt man mit PonceauS an (ca. 5

Minuten). In etwas PBS entfärbt werden die Membranen für 2 h bei Raumtemperatur in

PBS mit 1 % Milchpulver geblockt. Über Nacht erfolgt die Inkubation mit den

Primärantikörper (Occludin 1:1000, ZO-1 1:1000, Claudin-3 1:500) bei 4°C auf einem

Schüttler. Anschließend wird dreimal 10 Minuten lang in PBS mit 0,1 % Tween20

gewaschen. Nun erfolgt die 1 h Inkubation mit dem Peroxidase-gekoppelten

Zweitantikörper (anti-rabbit-Antikörper 1:3000), worauf wieder ein dreimaliger

10minütiger Waschgang folgt. Die Entwicklerlösung wird unmittelbar vor Gebrauch

angesetzt. Dabei wird 0,1 % Diaminobinzidin (DAB, 1 mg/ml) in PBS mit 0,1 %

Tween20 versetzt und schließlich mit 30 % H2O2 aktiviert. Diese Lösung führt zu einer

Farbreaktion. Anhand des Proteinmarkers kann die Größe des zu detektierenden

Proteins zugeordnet werden.

2.2.7 Zymographie

2.2.7.1 Prinzip

Mit der Gelatine-Zymographie ist der Nachweis von Aktivität und Größe von gelatine-

verdauenden Proteasen möglich. In dieser Arbeit wurde Novex Zymogram Gel

verwendet. Die in den Gelen enthaltene Gelatine dient als Substrat für die Proteasen.

Auch hier müssen gleiche Mengen an Gesamtprotein aufgetragen werden. Dazu müssen


- 39 -

die Proben konzentriert und mit Probenpuffer angesetzt werden. Nach dem

Elektrophorese-Lauf sind die Proteine ihrer Größe nach aufgereiht. Durch Entfernen des

SDS erhalten die Enzyme ihre Tertiärstruktur und somit ihre Aktivität zurück. Nach

einer Inkubation in spezifischem Puffer und nachfolgender CoomassieBlue R250

Färbung sind die Zonen gelatinolytischer Aktivität als weiße Banden sichtbar. Die

Gelatine färbt sich blau.

2.2.7.2 Proteinkonzentration

Um eine ausreichende Proteinmenge auf die Gele auftragen zu können, müssen die

Proben konzentriert werden. Dies geschieht anhand von Amicon-Säulen. 500 µl

Überstand wird auf die Säulen aufgetragen und bei 12000 g für 5 Minuten bei

Raumtemperatur zentrifugiert. Anschließend wird noch zweimal mit 500 µl Aqua dest.

gewaschen.

2.2.7.3 Proteinbestimmung

Zur Proteinbestimmung werden die Proben 1:25 mit Aqua dest. verdünnt, mit

CoomassieBlue R250 versetzt und in einer Mirkotiterplatte für 15 Minuten auf einem

Schüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Anhand einer Albumin-Standardkurve kann

die Proteinmenge der Proben am ELISA-Reader ermittelt werden.


Probenvorbereitung Probe x µl

Novex Sample Buffer 7,5 µl

Aqua dest. ad 15 µl

Die Gele werden in die Elekrophorese-Kammer eingespannt, die mit Probenpuffer

versetzten Proben aufgetragen und der Laufpuffer (Novex Tris-Glycinw SDS Running

Buffer, 1:10 in Aqua dest.) hinzugegeben. Bei einer Spannung von 125 V läuft die

Elektrophorese für 90 Minuten.

Danach werden die Gele erst in Novex Zymogram Renaturing Buffer (1x) für 30

Minuten und anschließend in Novex Zymogram Developing Buffer (1x) bei

Raumtemperatur und leichtem Schütteln inkubiert. In frischem Developing Buffer

bleiben die Gele über Nacht bei 37°C und ebenfalls leichtem Schütteln stehen.


- 40 -

Färbelösung 250 ml 100 % Methanol

50 ml 100 % Essigsäure

0,5 g CoomassieBlue R250

199,5 ml Aqua dest.

Entfärber 50 ml 100 % Ethanol

35 ml 100 % Essigsäure

415 ml Aqua dest.

Für 45 Minuten werden die Gele in der Färbelösung gefärbt und dann für 45 Minuten

mit Entfärber inkubiert.

Ergebnisse

- 41 -

3 ERGEBNISSE

3.1 CHARACTERISIERUNG VON “HUMAN BRAIN MICROVASCULAR

ENDOTHELIAL CELLS” (HBMEC’s)

Mit der Immuncytologie wurden verschiedene Eigenschaften der HBMEC’s (Abbildung

3-1) überprüft und nachgewiesen.

Abbildung 3-1: HBMEC’s im Auflichtmikroskop

Zur Überprüfung der Reinheit der Zellkultur wurden Färbungen mit ZO-1 und

vonWillebrand-Faktor (vW-Faktor) durchgeführt; bei ZO-1 handelt es sich um ein tight

junction Protein, der vonWillebrand-Faktor ist ein dem Faktor VIII der Blutgerinnung

assoziiertes Antigen. Beide fungieren als anerkannte Marker für Endothelzellen. Beide

Faktoren waren eindeutig und hoch positiv (Abbildung 3-2, Abbildung 3-3). Bei den

Färbungen mit dem Perizytenmarker anti-smooth-muscle-Protein-1 (ASM-1) und dem

Astrozytenmarker glial fibrilary acid Protein (GFAP) zum Nachweis des

Kontaminationsgrades waren nur vereinzelte Zellen positiv (< 5 %).

Das TJ Protein Claudin-3 ließ sich im Gegensatz zu Claudin-5 gut anfärben. Claudin-5

konnte nicht nachgewiesen werden. Occludin, ein tight junction assoziiertes Protein,

konnte immuncytologisch angefärbt werden.

Die Zellen ließen sich positiv mit den Oberflächenadhäsionsmolekülen ICAM-1 und

VCAM-1 anfärben. Allerdings war die Expression von ICAM-1 (Abbildung 3-4)

Ergebnisse

- 42 -

wesentlich höher als bei VCAM-1 (Abbildung 3-5), nur einzelne Zellen exprimierten

dieses Molekül.

Weder unter TNFα-Stimulation, noch unter PDE-IV-Inhibition bzw. in Kombination,

konnte eine Zu- oder Abnahme in der Expression der verschiedenen Proteine beobachtet

werden.

Abbildung 3-2: Immuncytologie von HBMEC´c mit ZO-1 (Cy3), stimuliert mit TNFα (100 ng/ml), 20-fache Vergrößerung

Abbildung 3-3: Immunzytologie von HBMEC’s mit vW-Faktor (Cy3), 20-fache Vergrößerung

Abbildung 3-4: Immuncytologie von HBMEC’s mit ICAM-1 (FITC), stimuliert mit TNFα (100 ng/ml), 20-fache Vergrößerung

Abbildung 3-5: Immucytologie von HBMEC’s mit VCAM-1 (FITC), stimuliert mit TNFα (100 ng/ml), 20-fache Vergrößerung

Ergebnisse

- 43 -

3.2 WIRKUNG DES PHOSPHODIESTERASE-IV-INHIBITORS MESOPRAM

AUF DEN cAMP-SPIEGEL IN HBMEC’s

Der cAMP-ELISA wurde zum Nachweis der Wirkung des PDE-IV-Inhibitors

Mesopram auf die EC-Kulturen dreimal durchgeführt. Wie im Methodenteil

beschrieben, wurden die Zellen für 15, 30 und 60 Minuten stimuliert und mit

verschiedenen Konzentrationen von Mesopram (0,3, 3, 30, 300 nM) inkubiert.

Mit dem cAMP-ELISA konnte ein deutlicher Anstieg der cAMP-Konzentration unter

Zugabe von Mesopram nachgewiesen werden. Am stärksten war dieser Anstieg nach

einer Stimulation von 15 Minuten auf ungefähr das Dreifache des Kontrollwertes. Bei

der Mesopram-Konzentration von 30 nM war die nachgewiesene Erhöhung der cAMP-

Konzentration am niedrigsten (Abbildung 3-6).

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

0 0,3 3 30 300

Mesopram-Konzentration (nM)

Ratio

(x/c

tr) 15

30

60

Abbildung 3-6: Dosisabhängiger Verlauf der cAMP-Konzentration unter PDE-IV-Inhibition mit Mesopram (0,3, 3, 30, 300nM) (Schwarze Raute: 15 min, schwarzes Quadrat: 30 min, schwarzes Dreieck: 60 min)

Ergebnisse

- 44 -

3.3 EINFLUSS VON MESOPRAM AUF THIGHT JUNCTION PROTEINE

Mit der Methode des Western Blots wurde untersucht, ob eine Quantifizierung der

Proteine ZO-1, Claudin-3 und Occludin unter Phosphodieesterase-Inhibition möglich

ist.

Die Zellen wurden für 24 und 48 h mit TNFα (10 ng/ml) stimuliert und mit Mesopram

in den Konzentrationen 30 nM, 300 nM und 3000 nM inkubiert.

Das TJ assoziierte Protein Occludin läuft bis 65 kd und wies in allen Proben, sowohl

nach 24 h, als auch nach 48 h, eine breite Bande auf (Abbildung 3-7). Die Kontrolle

exprimierte Occludin genauso, wie die TNFα-stimulierten mit und ohne Zusatz von

Mesopram in verschiedenen Konzentrationen.

Abbildung 3-7: Western Blot von Occludin nach 24 h Stimulation mit TNFα (10 ng/ml) und Mesopram (30, 300, 3000 nM). Occludin läuft bei 65 kd. Nummerierung: 1 Kontrolle, 2 Mesoram 30 nM, 3 Mesopram 300 nM, 4 Mesopram 3000 nM, 5 DMSO 30 nM, 6 DMSO 3000nM, 7 TNF 10 ng/ml, 8 TNF 10 ng/ml und Mesopram 30 nM, 9 TNF 10 ng/ml und Mesopram 300 nM, 10 TNF 10 ng/ml und Mesopram 3000 nM, 11 TNF 10 ng/ml und DMSO 30 nM, 12 TNF 10 ng/ml und DMSO 3000 nM

Claudin-3 ist bei 20-27 kd zu erwarten. Im Western Blot trat nach 24 h und nach 48 h

eine sehr feine Bande in diesem Bereich auf (Abbildung 3-8). Unter TNFα-Stimulation

wurde Claudin-3 stärker exprimiert, allerdings ohne unterschiedlichen Ausprägungsgrad

unter den verschiedenen Mesopram- und DMSO-Konzentrationen.

Abbildung 3-8: Western Blot von Claudin-3 nach 48 h Stimulation mit TNFα (10 ng/ml) und Mesopram (30, 300, 3000 nM). Claudin läuft bei 22 kd . Nummerierung: 1 Kontrolle, 2 Mesoram 30 nM, 3 Mesopram 300 nM, 4 Mesopram 3000 nM, 5 DMSO 30 nM, 6 DMSO 3000nM, 7 TNF 10 ng/ml, 8 TNF 10 ng/ml und Mesopram 30 nM, 9 TNF 10 ng/ml und Mesopram 300 nM, 10 TNF 10 ng/ml und Mesopram 3000 nM, 11 TNF 10 ng/ml und DMSO 30 nM, 12 TNF 10 ng/ml und DMSO 3000 nM.

Ergebnisse

- 45 -

Ähnlich verhielt es sich bei dem dritten Protein, ZO-1, welches bis zu 220 kd läuft.

Auch hier fanden wir nur eine feine, gleichmäßige Bande, ohne Unterschiede zwischen

den Proben (Abbildung 3-9).

Abbildung 3-9: Western Blot von ZO-1 nach 24h Stimulation mit TNFα (10 ng/ml) und Mesopram (30, 300, 3000 nM). ZO-1 läuft bei 220 kd . Nummerierung: 1 Kontrolle, 2 Mesoram 30 nM, 3 Mesopram 300 nM, 4 Mesopram 3000 nM, 5 DMSO 30 nM, 6 DMSO 3000nM, 7 TNF 10 ng/ml, 8 TNF 10 ng/ml und Mesopram 30 nM, 9 TNF 10 ng/ml und Mesopram 300 nM, 10 TNF 10 ng/ml und Mesopram 3000 nM, 11 TNF 10 ng/ml und DMSO 30 nM, 12 TNF 10 ng/ml und DMSO 3000 nM.

3.4 OBERFLÄCHENEXPRESSION DER ADHÄSIONSMOLEKÜLE ICAM-1,

MCAM UND VCAM-1

Die Oberflächenexpression von Adhäsionsmolekülen ließ sich mit der Durchfluss-

zytometrie analysieren. Die Ergebnisse der Abbildungen 3-10 bis 3-13 resultierten

jeweils aus 3 Versuchsansätzen.

3.4.1 FACS-Analyse von VCAM-1

Bei VCAM-1 war die Expression so gering, wie nach der Immuncytologie zu erwarten.

Auch unter TNFα ließ sich keine Veränderung nachweisen (Tabelle 3-1).

Tabelle 3-1: FACS-Analyse der VCAM-1-Expression von HBMEC’s nach 24 bzw. 48h Stimulation mit und ohne TNFα, sowie mit und ohne FCS (Angaben in %)

Kinetik TNF Iso ohne FCS

VCAM-1 ohneFCS

Iso mit FCS

VCAM-1 mit FCS

24h / 0,40 0,02 1,36 0,10

100 ng/ml 0,69 0,06 3,48 0,17

48h / 0,60 0,06 0,64 0,01

100 ng/ml 4,82 0,14 1,94 0,04

Ergebnisse

- 46 -

3.4.2 Nachweis der Expression von ICAM-1 mittels FACS-Analyse

Die Zellen zeigten nach 24 h unstimuliert eine 86,0 %ige Expression (nach 48 h 83,3 )

des Adhäsionsmoleküls ICAM-1 (intracellular adhesion molecule-1). Unter TNFα stieg

die Expression auf 99,5 Prozent (bei 10 ng/ml TNFα) an. Unter Mesopramgabe (30-300

nM) zeigte sich eine unveränderte ICAM-1 Expression, nach zusätzlicher Stimulation

mit TNFα ein unveränderter Anstieg auf über 95% ICAM-1 Expression. Auch uner

DMSO-Gabe war keine Modulation festzustellen. Die mit Mesopram behandelten

Zellen verhielten sich entsprechend. (Abbildung 3-10). Nach 48 h Stimulation zeigte

sich unter den verschiedenen Stimulationsbedingungen ein ähnliches Expressionsmuster

(Abbildung 3-11).

75,00

80,00

85,00

90,00

95,00

100,00

105,00

ICAM Meso30 Meso300 Meso3000 DMSO30 DMSO300 DMSO3000

posi

tive

cells

(%)

ctr TNF10 TNF100

Abbildung 3-10: FACS-Analyse von ICAM-1 nach 24 h Stimulation mit TNFα (10, 100 ng/ml) und Mesopram (30, 300, 3000 nM)

Medium

Ergebnisse

- 47 -

75,00

80,00

85,00

90,00

95,00

100,00

105,00

ICAM Meso30 Meso300 Meso3000 DMSO30 DMSO300 DMSO3000

posi

tive

cells

(%)

ctr TNF10TNF100

Abbildung 3-11: FACS-Analyse von ICAM-1 nach 48 h Stimulation mit TNFα (10, 100 ng/ml) und Mesopram (30, 300, 3000 nM)

3.4.3 Nachweis der Expression von MCAM mittels FACS-Analyse

Bei dem Adhäsionsmolekül MCAM war die Grundexpression nach 24h Stimulation

24,2 %. Durch die Einwirkung von TNFα war diese geringfügig kleiner (20,1 % bei

TNFα 10 ng/ml, 19,9 bei TNFα 100 ng/ml). Unter Mesopram sank die Expression

konzentrationsabhängig. Der größte Abfall war unter der höchsten Mesopram-

Konzentration (3000 nM) mit 13,3 % zu verzeichnen. Mit TNFα 100 ng/ml und

Mesopram behandelt fiel die MCAM-Expression leicht niedriger aus (Mesopram 3000

nM: 12,6 %). Die DMSO-Kontrollen lagen alle unter der entsprechenden Mesopram-

Probe. Bei der höchsten DMSO-Kontrolle sank die Expression auf 3,1 % ohne TNFα

und 3,5 % mit TNFα 100 ng/ml (Abbildung 3-12).

Medium

Ergebnisse

- 48 -

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

MCAM Meso3 Meso30 Meso300 DMSO3 DMSO30 DMSO300

posi

tive

cells

(%)

ctrTNF10TNF100

Abbildung 3-12: FACS-Analyse von MCAM nach 24 h Stimulation mit TNFα (10, 100 ng/ml) und Mesopram (3, 30, 300, 3000 nM)

Nach 48 h war die Grundexpression von MCAM nahezu unverändert mit 22,6 %. Die

mit TNFα behandelten Zellen wiesen eine höhere Expression auf (29,4 % bei TNFα 10

ng/ml, 25,1% bei TNFα 100 ng/ml). Mit Mesopram lag das Protein in allen

Konzentrationen bei ungefähr 20 %. Unter TNFα-Stimulation stiegen die Werte in den

Konzentrationen 3, 30 und 300 nM Mesopram auf 25 % an. Bei der höchsten

Mesopram-Konzentration sank die MCAM-Expression auf 19,0 %. Die DMSO-

Kontrollen wiesen einen dosisabhängigen Abfall der Expression auf. Der niedrigste

Wert (6,9 %) wurde in der höchsten DMSO-Kontrolle erreicht. Die Proben, die mit

DMSO und TNFα stimuliert waren, lagen mit ihrer Expression von MCAM zwischen

21,8 % (DMSO 3000 nM) und 25,2 % (Abbildung 3-13).

Medium

Ergebnisse

- 49 -

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

35,00

40,00

45,00

MCAM Meso3 Meso30 Meso300 DMSO3 DMSO30 DMSO300

posi

tive

cells

(%)

ctrTNF10TNF100

Abbildung 3-13: FACS-Analyse von MCAM nach 48 h Stimulation mit TNFα (10, 100 ng/ml) und Mesopram (3, 30, 300, 3000 nM)

3.5 PROTEINBESTIMMUNG IN ZELLKULTURÜBERSTÄNDEN VON

HBMEC’s

Da die absoluten Werte der Protein-Konzentration in den verschiedenen Versuchsreihen

stark variierten, wurde eine Ratio gebildet, wobei die jeweiligen Proben durch den

Mittelwert der zugehörigen doppelt bestimmten Kontrolle geteilt wurden (x/ctr, die

Kontrolle entspricht dem Mittelwert aus den doppelt bestimmten Kontroll-Proben) und

die Versuche so untereinander vergleichbar gemacht. Auch hier setzten sich die

Ergebnisse der Abbildungen 3-14 bis 3-24 durchschnittlich aus jeweils 3 Versuchs-

ansätzen zusammen.

3.5.1 Amphiregulin-ELISA

Nach 24 h konnte kein Unterschied der AR-Konzentration in den Proben ohne TNFα-

Stimulation im Vergleich mit der Kontrolle festgestellt werden. Unter TNFα-

Stimulation stieg die Amhiregulin-Konzentration bei TNFα 10 ng/ml auf das 1,7-fache

und bei TNFα 100 ng/ml auf das 1,5-fache der unstimulierten Kontrolle. Die

Mesopram-haltigen Überstände wiesen bei 10 ng/ml TNFα das 1,5 – 1,6-fache und bei

100 ng/ml TNFα das 1,5 – 1,7-fache auf. Die DMSO-Kontrollen verhielten sich

Medium

Ergebnisse

- 50 -

entsprechend (Abbildung 3-14). Bereits nach 24 h konnten wir eine dosisunabhängige

TNF-induzierte AR-Freisetzung feststellen, die keine Modulation durch Mesopram

zeigt.

0,000,501,001,502,002,503,003,50

ctr

Meso30

Meso30

0

Meso30

00

DMSO30

DMSO300

DMSO3000

Rat

io (x

/ctr) ctr

TNF10TNF100

Abbildung 3-14: Amphiregulin-ELISA von HBMEC-Überständen nach 24 h Stimulation mit TNFα

(10, 100 ng/ml) und Mesopram (30, 300, 3000 nM)

Auch nach 48 h Stimulation waren die AR-Expressionen der TNFα-freien Proben der

Kontrolle ähnlich. Die mit 10 ng/ml TNFα behandelten Zell-Überstände lagen bei dem

1,7-fachen der dazugehörigen Kontrolle. Mit 100 ng/ml TNFα betrug die AR-

Expression das 2,5-fache der zugehörigen Kontrolle. Die mit Mesopram behandelten

Proben stiegen unter 100 ng/ml TNFα auf ungefähr das Zweifache (2,04 – 2,1-fach) an.

Unter DMSO war der TNFα-Einfluss (100 ng/ml) mit einem Anstieg auf das 2,03 –

2,33-fache der Kontrolle zu verzeichen (Abbildung 3-15). Nach 48 h konnten wir

keinen Effekt von Mesopram in den verschiedenen Konzentrationen auf die

dosisabhängige TNFα induzierte AR-Freisetzung nachweisen.

Ergebnisse

- 51 -

0,000,501,001,502,002,503,003,50

ctr

Meso30

Meso30

0

Meso30

00

DMSO30

DMSO300

DMSO3000

Rat

io (x

/ctr) ctr

TNF10TNF100

Abbildung 3-15: Amphiregulin-ELISA von HBMEC-Überständen nach 48 h Stimulation mit TNFα (10, 100 ng/ml) und Mesopram (30, 300, 3000 nM)

3.5.2 BDNF (brain-derived neurotrophic factor)-ELISA

Unstimulierte Zellen wiesen nach 24 h weder durch Mesopram noch durch DMSO

unterschiedliche BDNF-Expressionen in ihren Überständen auf. Mit 10 ng/ml TNFα

wurden nur leicht erhöhte (1,2-fache) Werte für BDNF gefunden. Unter 100 ng/ml

TNFα lagen alle Proben in ihren BDNF-Werte minimal unter dem Kontrollwert

(Abbildung 3-16)

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

ctr Meso30 Meso300 Meso3000 DMSO3000

Rat

io (x

/ctr) ctr

TNF10 TNF100

Abbildung 3-16: BDNF-ELISA von HBMEC-Überständen nach 24 h Stimulation mit TNFα (10, 100 ng/ml) und Mesopram (30, 300, 3000 nM)

Ergebnisse

- 52 -

Nach 48 h zeigten die Proben ohne TNFα alle in etwa die gleiche BDNF-Konzentration

wie die Kontrolle. Nur die beiden kleineren DMSO-Konzentrationen waren etwas

niedriger. Unter 10 ng/ml TNFα war nach 48 h in der Kontrolle der BDNF-Wert auf das

0,8-fache gesunken. Unter Mesopram (30 nM) lag die Konzentration bei dem 1,1-

fachen der Kontrolle. Bei den anderen Mesopram-Proben war zur passenden

unstimulierten Probe keine Veränderung zu erkennen. Die mit 100 ng/ml TNFα

behandelten Zellen enthielten in ihren Überständen das 1,2-fache des Kontroll-BDNF-

Wertes. Unter zusätzlicher Gabe von Mesopram 300 nM wurde der höchste Wert mit

dem 1,4-fachen erreicht. Die DMSO-Kontrollen lagen mit ihren BDNF-

Konzentrationen zwischen dem 0,9- bis 1,2-fachen (Abbildung 3-17).

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

1,60

1,80

ctr Meso30 Meso300 Meso3000 DMSO30 DMSO300 DMSO3000

Rat

io (x

/ctr) ctr TNF10TNF100

Abbildung 3-17: BDNF-ELISA von HBMEC-Überständen nach 48 h Stimulation mit TNFα (10, 100 ng/ml) und Mesopram (30, 300, 3000 nM)

3.5.3 MCP-1 (monocyte chemotactic protein)-ELISA

Bei dem MCP-1-ELISA waren die Konzentrationen in der Kontrolle ohne TNFα sehr

niedrig. Um die Ratio bilden zu können, wurde die Kontrolle mit 1 definiert.

Mit 1 ng/ml TNFα behandelt lag Mesopram-freie Kontrolle nach 24 h bei dem 4,5-

fachen der Ausgangskonzentration. Sowohl mit Mesopram als auch mit DMSO lagen

die Werte zwischen dem 2,7- bis 3,6-fachen. Erst bei Verwendung von TNFα in einer

Konzentration von 10 ng/ml war ein starker Anstieg von MCP-1 auf das 74,7-fache der

Kontrolle zu verzeichnen. Die niedrigen Mesopram-Konzentrationen (0,3, 3 nM) sowie

Ergebnisse

- 53 -

die DMSO-Konzentrationen 3, 30, 300 nM zeigten keine Veränderung. In den höheren

Mesopram-Konzentrationen stiegen die MCP-1-Werte dosisabhängig an.

Ähnlich verhielt es sich unter 100 ng/ml TNFα, wobei alle Werte unter denen lagen, die

mit 10 ng/ml TNFα stimuliert wurden (Abbildung 3-18).

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

160,00

180,00

ctr

Meso0,3

Meso3

Meso30

Meso30

0

Meso30

00

DMSO3

DMSO30

DMSO300

DMSO3000

ratio

(x/c

tr)

ctr TNF1 TNF10TNF100

Abbildung 3-18: MCP-1-ELISA von HBMEC-Überständen nach 24 h Stimulation mit TNFα (1, 10, 100 ng/ml) und Mesopram (0,3, 3, 30, 300, 3000 nM)

Nach 48 h verhielt es sich ähnlich. Hier fand jedoch die größte Veränderung von MCP-

1 unter 100 ng/ml TNFα statt. Die Mesopram-freie Kontrolle stieg auf das 47,3-fache

und die hohen Mesopram-Konzentrationen auf das 61,6- bis 81,4-fache (bei 3000 nM).

Unter 10 ng/ml TNFα lagen die Kontrolle, die Mesopram-Konzentrationen 30, 300,

3000 nM und die DMSO-Konzentrationen 30, 300, 3000 nM bei ungefähr dem 20-

fachen des Ausgangswertes. (Abbildung 3-19).

Ergebnisse

- 54 -

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

120,00

140,00

160,00

180,00

ctr

Meso0,3

Meso3

Meso30

Meso30

0

Meso30

00

DMSO3

DMSO30

DMSO300

DMSO3000

ratio

(x/c

tr)

ctrTNF1 TNF10TNF100

Abbildung 3-19: MCP-1-ELISA von HBMEC-Überständen nach 48 h Stimulation mit TNFα (1, 10, 100 ng/ml) und Mesopram (0,3, 3, 30, 300, 3000 nM) Il-8-ELISA

3.5.4 Interleukin-8-ELISA

TNFα induzierte die Il-8-Freisetzung um das 6,4-fache im Vergleich zur unbehandelten

Kontrolle. Mit 10 ng/ml und 100 ng/ml TNF stieg die Ratio auf 12,0 bzw. 13,1. Ohne

TNFα behandelte Proben zeigten die gleiche Il-8-Konzentration wie die Kontrolle.

Unter der kleinsten TNFα-Konzentration lagen sowohl die Mesopram-Proben, als auch

die DMSO-Kontrollen ungefähr um das Vierfache höher. Die Zellüberstände, die mit

Mesopram behandelt waren, stiegen unter TNFα (10, 100 ng/ml) dosisabhängig an bis

zu einer Ratio von 17,1 (TNFα 10 ng/ml, Mesopram 3000 nM) (Abbildung 3-20).

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

ctr

Meso0,3

Meso3

Meso30

Meso30

0

Meso30

00

DMSO3

DMSO30

DMSO300

DMSO3000

Rat

io (x

/ctr) ctr

TNF1TNF10TNF100

Abbildung 3-20: Il-8-ELISA von HBMEC-Überständen nach 24 h Stimulation mit TNFα (1, 10, 100 ng/ml) und Mesopram (0,3, 3, 30, 300, 3000 nM)

Ergebnisse

- 55 -

Nach 48 h Stimulation waren die Kontrollwerte ähnlich denen nach 24 h. Auch in den

niedrigen Mesopram-Konzentrationen war kaum ein Unterschied zu den 24 h Werten zu

erkennen. Unter 100 ng/ml TNFα lag die Ratio von Mesopram (30, 300, 3000 nM) bei

16-17, bei 10 ng/ml nur bei 9-11. Die DMSO-Kontrollen stiegen unter TNFα

dosisabhängig an. Bei der höchsten DMSO-Konzentration bis auf das 22,3-fache der

Ausgangskontrolle (Abbildung 3-21).

0,00

5,00

10,00

15,00

20,00

25,00

30,00

ctr

Meso0,3

Meso3

Meso30

Meso30

0

Meso30

00

DMSO3

DMSO30

DMSO300

DMSO3000

Rat

io (x

/ctr)

ctrTNF1TNF10TNF100

Abbildung 3-21: Il-8-ELISA von HBMEC-Überständen nach 48 h Stimulation mit TNFα (1, 10, 100 ng/ml) und Mesopram (0,3, 3, 30, 300, 3000 nM)

3.5.5 Interleukin-6-ELISA

Die Konzentration von dem Interleukin Il-6 war ohne TNFα in den Mesopram-Proben

um ungefähr das Dreifache höher als in der Ausgangskontrolle. Unter TNFα stieg die

Ratio der Mesopram-freien Proben auf 68,7 bei 10 ng/ml TNFα und auf 79,3 bei 100

ng/ml. Unter Mesopram und TNFα lagen die Il-6-Konzentrationen dosisabhängig

zwischen einer Ratio von 61,7 und 96,3 (bei 10 ng/ml TNFα und 3000 nM Mesopram).

Die DMSO-Kontrolle lag mit 67,7 deutlich unter der zugehörigen Kontrolle (Abbildung

3-22).

Ergebnisse

- 56 -

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

ctr Meso30 Meso300 Meso3000 DMSO3000

ratio

(x/c

tr) ctrTNF10TNF100

Abbildung 3-22: Il-6-ELISA von HBMEC-Überständen nach 24 h Stimulation mit TNFα (10, 100 ng/ml) und Mesopram (30, 300, 3000 nM)

Nach 48 h war ohne TNFα kein Unterschied zwischen der Kontrolle und den mit

Mesopram behandelten Proben zu erkennen. Mit 10 ng/ml TNFα stimulierte

Zellüberstände enthielten eine 17,6-fach höhere Il-6-Konzentration als die Kontrolle.

Auch die Mesopram-Proben lagen in diesem Bereich. Unter 100 ng/ml TNFα fiel die

Ratio höher aus. Sie lag bei 36,0. Unter Mesopram verhielt sich die Il-6-Konzentration

ähnlich. Die DMSO-Kontrollen fielen niedriger aus (Abbildung 3-23).

0,00

20,00

40,00

60,00

80,00

100,00

ctr Meso30 Meso300 Meso3000 DMSO30 DMSO300 DMSO3000

ratio

(x/c

tr) ctr TNF10TNF100

Abbildung 3-23: Il-6-ELISA von HBMEC-Überständen nach 48 h Stimulation mit TNFα (10, 100 ng/ml) und Mesopram (30, 300, 3000 nM)

Ergebnisse

- 57 -

3.5.6 Human sTNF-RI-ELISA (human soluble tumor necrosis factor receptor I)

In den verwendeten Zellüberständen ließ sich der sTNF-Rezeptor-I nachweisen. Nach

24 h lagen die Konzentrationen der TNFα-freien Proben ungefähr gleich den Proben,

die mit 10 ng/ml TNFα stimuliert wurden. Lediglich unter DMSO 300 nM sank die

sTNF-RI-Konzentration auf beinahe die Hälfte des Kontrollwertes. Unter 100 ng/ml

TNFα lagen alle Proben bei einer Ratio von 0,08-0,14 (Abbildung 3-24, A).

Nach 48 h war der Wert der Kontrolle und der Wert der Probe, die mit 10 ng/ml TNFα

behandelt wurde, beinahe gleich hoch. Die Mesopram-Proben lagen wenig höher (30

nM) und deutlich unter (300 nM) der Kontrolle nach 48 h. Die DMSO-Konzentration

von sTNF-Rezeptor war mit einer Ratio von 0,7 am niedrigsten. Unter 10 ng/ml TNFα

verhielten sich die Proben entsprechend den Kontrollen. Auch nach 48 h war die sTNF-

RI-Konzentration in allen Proben gleich niedrig (Abbildung 3-24, B).

A

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

ctr Meso30 Meso300 DMSO300

Rat

io (x

/ctr)

ctr

TNF10

TNF100

B

0,00

0,20

0,40

0,60

0,80

1,00

1,20

1,40

ctr Meso30 Meso300 DMSO300

Rat

io (c

tr/x)

ctr

TNF10

TNF100

Abbildung 3-24: human sTNF-RI-ELISA nach 24 h (Figur A) und 48 h (Figur B) Stimulation mit TNFα (10, 100 ng/ml) und Mesopram (30, 300 nM)

3.6 MATRIX-METALLOPROTEASEN (MMP), NACHWEIS MITTELS

ZYMOGRAPHIE

Die Zellüberstände wurden, wie unter 2.2.7 beschrieben, behandelt. Es wurden nur

Zellüberstände nach 48 h Stimulation untersucht. Es konnte MMP-2 inaktiv

nachgewiesen werden. In verschiedenen Stimulationen wurde keine Regulation

festgestellt. MMP-9 und MMP-2 aktiv konnten in den Zellüberständen nicht

nachgewiesen werden (Abbildung 3-25).

Ergebnisse

- 58 -

Abbildung 3-25: Zymographie von HBMEC-Überständen nach 48 h Stimulation mit TNFα (10, 100 ng/ml) und Mesopram (30, 3000 nM), 2 µg Protein pro Ansatz. Abbildung A: 1 MMP-2/-9-Standard, 2 Kontrolle, 3 Mesopram 3000 nM, 4 Mesopram 30 nM, 5 DMSO 3000 nM, 6 DMSO 30 nM, 7 Kontrolle TNFα 10 ng/ml, 8 Mesopram 3000 nM und TNFα 10 ng/ml, 9 Mesopram 30 nM und TNFα 10 ng/ml, 10 DMSO 3000 nM und TNFα 10 ng/ml, 11 DMSO 30 nM und TNFα 10 ng/ml. Abbildung B: 1 MMP-2/-9-Standard, 2 Kontrolle TNFα 100 ng/ml, 3 Mesopram 3000 nM und TNFα 100 ng/ml, 4 Mesopram 30 nM und TNFα 100 ng/ml, 5 DMSO 3000 nM und TNFα 100 ng/ml, 6 DMSO 30 nM und TNFα 100 ng/ml

Ergebnisse

- 59 -

3.7 TABELLARISCHE UND STATISTISCHE ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE

Tabelle 3-2: Zusammenfassung der Ergebnisse

Protein Methode Unstimulierte Expression Expression unter TNFα Expression unter Mesopram Expression unter TNFα und Mesopram

cAMP ELISA cAMP-Konzentration lag zwischen 2,2 pg/ml (nach 60 min) und 10,0 pg/ml (nach 15

min)

Kaum ein Unterschied der cAMP-Konzentration zur

Kontrolle

Höchster Anstieg der cAMP-Konzentration auf das Dreifache nach 15 Minuten Stiumulation

mit Mesopram

Ähnlich hoher Anstieg der cAMP-Konzentration wie ohne TNFα, deshalb keine weitere Berücksichtigung von TNFα

Occludin Western Blot Occludin nachgewiesen Occludin nachgewiesen, kein Unterschied zur Kontrolle

Occludin nachgewiesen, kein Unterschied zur Kontrolle,

keine Regulation unter Mesopram

Occludin nachgewiesen, kein Unterschied zur Kontrolle, keine

Regulation unter Mesopram

Claudin-3 Western Blot Claudin-3 nachgewiesen Claudin-3 nachgewiesen, stärkere Expression unter TNFα

als in der Kontrolle

Claudin-3 nachgewiesen, kein Unterschied zur Kontrolle,


Claudin-3 nachgewiesen, stärkere Expression unter TNFα

als in der Kontrolle, keine Regulation unter Mesopram

ZO-1 Western Blot ZO-1 nachgewiesen ZO-1 nachgewiesen, kein Unterschied zur Kontrolle

ZO-1 nachgewiesen, kein Unterschied zur Kontrolle,


ZO-1 nachgewiesen, kein Unterschied zur Kontrolle, keine

Regulation unter Mesopram

VCAM-1 FACS Nur 1 % der Zellen exprimieren VCAM-1

Nur 1 % der Zellen exprimieren VCAM-1, kein Unterschied zur

Kontrolle

Nicht untersucht Nicht untersucht

ICAM-1 FACS Ungefähr 85 % der Zellen exprimieren ICAM-1 (nach 24 h

und 48 h)

ICAM-1-Expression steigt auf nahezu 100 %, gleicher Effekt

nach 24 h und 48 h

Ungefähr 85 % der Zellen exprimieren ICAM-1 (nach 24 h

oder 48 h), keine Regulation unter Mesopram

ICAM-1-Expression steigt auf nahezu 100 %, gleicher Effekt

nach 24 h und 48 h, keine Regulation unter Mesopram

Ergebnisse

- 60 -

Protein Methode Unstimulierte Expression Expression unter TNFα Expression unter Mesopram Expression unter TNFα und

Mesopram

MCAM FACS Ungefähr 24 % der Zellen exprimieren MCAM (nach 24 h

und 48 h)

Nach 24 h liegt die Expression von MCAM unter der Kontroll-Expression, nach 48 h über der

Kontroll-Expression

Nach 24 h sinkt die MCAM-Expression unter Mesopram

dosisabhängig ab (bei 3000 nM auf 13 %). Nach 48 h bleibt die

Expression leicht unter der Kontroll-Expression

Nach 24 h sind die Werte denen ohne TNFα-Stimulation ähnlich. Nach 48 h liegen die Werte über denen ohne TNFα-Stimulation.

Amphiregulin ELISA AR konnte nachgewiesen werden

Unter TNFα Anstieg der AR-Konzentration auf ungefähr das 1,6-fache nach 24 h, nach 48 h auf das 2,5-fache unter TNFα

100 ng/ml

Keine Veränderung unter Mesopram im Vergleich zur Kontrolle (weder nach 24 h

noch nach 48 h)

Nach 24 h keine Regulation unter Mesopram. Nach 48 h

liegt die Konzentration niedriger als der Probenwert ohne

Mesopram (2-fach bei TNFα 100 ng/ml

BDNF ELISA BDNF konnte nachgewiesen werden

Nach 24 h: unter TNFα 10 ng/ml Anstieg auf das 1,2-

fache; keine Veränderung unter TNFα 100 ng/ml.

Nach 48h: unter TNFα 10 ng/ml lag die BDNF-Konzentration

unter der Kontrolle; unter TNFα 100 ng/ml Anstieg auf das 1,2-

fache.

BDNF konnte nachgewiesen werden, keine Veränderung

unter Mesopram

Keine Regulation durch Mesopram nach 24 h.

Nach 48 h: unter TNFα 10 ng/ml werden etwas höhere Werte erreicht als unter der

vergleichbaren TNFα-Konzentration; unter TNFα 100 ng/ml und Mesopram 300 nM

höchste Konzentration von BDNF

Ergebnisse

- 61 -


Mesopram

MCP-1 ELISA Nach 24 h MCP-1-Konzentration beinahe unter der Nachweis-grenze. Nach 48 h gut

nachweisbar

Unter TNFα steigt die MCP-1-Konzentration auf bis das 45-

60-fache an.

MCP-1 konnte nachgewiesen werden, keine Veränderung im

Vergleich zur Kontrolle

In den kleinen Mesopram-Konzentrationen erhöht sich die MCP-1-Konzentration nur auf das 5- 8-fache (dosisabhängig).

In den höheren Mesopram-Konzentrationen steigen die Werte ähnlich hoch, wie die

Vergleichswerte. Unter Mesopram 3000 nM höchste MCP-1-Konzentration (100-

115-fach)

Il-6 ELISA Il-6 konnte nachgewiesen werden

Nach 24 h: Anstieg auf das 65-80-fache der Kontrolle.

Nach 48 h: Anstieg auf das 20-35-fache der Kontrolle.

Il-6 konnte nachgewiesen werden, keine Veränderung

unter Mesopram

Unter TNFα 10 ng/ml nach 24 h höhere Werte für Il-6 in den

hohen Mesopram-Konzentrationen. Unter TNFα 100 ng/ml kein Unterschied zu

Vergleichswerten.

Nach 48h: Keine Veränderung unter Mesopram im Vergleich

zu Proben ohne Mesopram.

Il-8 ELISA Il-8 konnte nachgewiesen werden

Unter TNFα dosisabhängiger Anstieg der Il-8-Konzentration auf das 13-fache nach 24 h und

auf das 15-fache nach 24 h Stimulation mit 100 ng/ml

TNFα

Il-8 konnte nachgewiesen werden, keine Regulation unter

Mesopram

In den kleinen Mesopram-Konzentrationen liegen die Il-8-

Werte unter den Vergleichswerten, in den

höheren Mesopram-Konzentrationen übersteigen sie

die Vergleichswerte.

Ergebnisse

- 62 -


Mesopram

hsTNF-RI ELISA hsTNF-RI konnte nachgewiesen werden.

Unter TNFα 10 ng/ml leichte Erhöhung der hsTNF-RI-

Konzentration. Unter TNFα 100 ng/ml sinkt die Konzentration

auf das 0,1-fache der Kontrolle.

Unter Mesopram 30 nM leichte Erhöhung unter Mesopram 300

nM leichte Erniedrigung der hsTNF-RI-Konzentration.

Unter TNFα 10 ng/ml keine Veränderung durch Mesopram. Das Verhalten von hsTNF-RI

unter 100 ng/ml TNFα entspricht dem niedrigen Wert der TNFα 100ng/ml Kontrolle

MMP-2/-9 Zymographie MMP-2 inaktiv nachgewiesen, MMP-2 aktiv und MMP-9 nicht

nachgewiesen

MMP-2 inaktiv nachgewiesen, MMP-2 aktiv und MMP-9 nicht

nachgewiesen, keine Veränderung zur unstimulierten

Kontrolle

MMP-2 inaktiv nachgewiesen, MMP-2 aktiv und MMP-9 nicht nachgewiesen, keine Regulation

unter Mesopram erkennbar

MMP-2 inaktiv nachgewiesen, MMP-2 aktiv und MMP-9 nicht

nachgewiesen, keine Veränderung zur unstimulierten

Kontrolle, keine Regulation unter Mesopram erkennbar

Alle Ergebnisse dieser Arbeit weisen darauf hin, dass sich die jeweiligen Kontrollen mit DMSO nicht signifikant von den Proben mit

Mesopram unterscheiden. Aus diesem Grund kann in dieser Zusammenfassung auf eine noch detaillierte Auflistung verzichtet werden.

Ergebnisse

- 63 -

Nach Prüfung aller Einzelergebnisse auf eine statistische Auswertung kam lediglich

eine Analyse bestimmter Proteine in Bezug auf deren Expression unter TNFα-

Stimulation in Frage.

Der dieser Analyse zugrunde liegende T-Test, ein parametrisches Testverfahren,

erforderte die Zusammenfassung der Parameter Kontrolle, Mesopram (in den

unterschiedlichen Konzentrationen) und DMSO (in den unterschiedlichen

Konzentrationen).

Folgende Proteine wurden im T-Test-Verfahren statistisch analysiert: ICAM, BDNF,

MCP-1 und Il-6.

Die in dieser Arbeit verwendeten HBMEC’s zeigten unter TNFα-Stimulation einen

statistisch hoch signifikanten (T=0,0006; p≤0,01) Anstieg der ICAM-Expression

gegenüber der unstimulierten Kontrolle.

Die BDNF-Expression stieg unter TNFα-Stimulation hoch signifikant an (T= 0,0004;

p≤0,01).

Ebenso konnte ein hoch signifikanter Unterschied in der Expression von MCP-1 und Il-

6 (T= 0,00007 (MCP-1), T= 0,0001 (Il-6); p≤0,01 (MCP-1, Il-6)) auf die TNFα-

Stimulation in Bezug zur jeweiligen Kontrolle gezeigt werden.

.

Diskussion

- 64 -

4 DISKUSSION

MS ist eine chronisch entzündlich, demyelinisierede Erkrankung des ZNS. Es handelt

sich um eine T-Zell vermittelte Autoimmunerkrankung, die zur Demyelinisierung, dem

Tod von Oligodendrozyten, Axon-Schädigung, Gliose und Neurodegeneration führt

(49). Diese Autoimmunerkrankung zerstört durch inflammatorische Läsionen

hauptsächlich die weiße Substanz des ZNS. In den auch als sklerotischen Plaques

bezeichneten Läsionen befinden sich neben T-Lymphozyten auch Makrophagen,

Mikroglia und B-Lymphozyten und es lassen sich proinflammatorische Zytokine (Il-β,

Il-6, TNFα, IFN-γ) nachweisen (13).

Ein wichtiger Schritt in der Pathogenese von MS ist eine erhöhte Permeabilität der BHS

und damit verbunden die Migration von aktivierten T-Lymphozyten und Makrophagen

durch die BHS ins ZNS. Dabei spielen die in dieser Arbeit untersuchten Moleküle (TJ’s,

Adhäsionsmoleküle, Zytokine, MMP’s) eine spezielle Rolle. Die Leukozyten „rollen“

selektinabhängig am Gefäßendothel entlang. Durch einen lokalen inflammatorischen

Stimulus wird die Anzahl von Adhäsionsmolekülen und Integrinen erhöht, wodurch die

Leukozyten vermehrt adhärieren. Anschließend ermöglichen von EC sezernierte

MMP’s und chemotaktische Faktoren eine Lockerung der TJ und damit ein vermehrtes

Eindringen ins ZNS (4).

Der second messengers cAMP spielt bei vielen dieser Prozesse als intrazellulärer

Signaltransduktor eine wichtige Rolle. Durch die cAMP-abhängige Phosphorylierung

von Proteinen durch die PKA werden Transkriptionsfaktoren aktiviert, die eine

veränderte Expression verschiedener Proteine zur Folge hat.

Da bekannt ist, dass MS-Patienten ein niedriges intrazelluläres cAMP-Niveau auf-

weisen (63, 60) und PDE-I Inhibitoren als potenzielle Therapeutika diskutiert werden,

sind die Wirkungen einer cAMP-Erhöhung auf die BHS untersucht worden. Eine solche

cAMP-Erhöhung führt zu einer Senkung der Permeabilität von ECs und zur

Stabilisierung von endothelialen Junctions (TJ’s und AJ’s) (89). In dieser Arbeit wurde

untersucht, inwiefern eine Mesopram-induzierte cAMP-Erhöhung auf die Expression

Diskussion

- 65 -

von TJ’s, Adhäsionsmolekülen, Zytokinen sowie MMP´s in HBMEC’s Auswirkungen

hat oder sie zu modulieren vermag.

Der bekannte und gut in EAE-Experimenten untersuchte PDE-IV-Inhibitor Rolipram

reduziert signifikannt die BHS-Permeabilitat im Rückenmark von Mäusen mit EAE

(27). Aufgrund dieser Ergebnisse und da Endothelzellen hauptsächlich PDE’s vom Typ

II, III und IV besitzen (23), ist Mesopram, als potenter und neuer selektiver PDE-IV-

Inhibitor, ein geeignetes Medikament für unsere Untersuchungen.

Mesopram wurde von Dinter et al in einer tierexperimentellen Studie verwendet. Er

beschreibt eine dosisabhängige Reduktion des klinischen Krankheitsgrades von EAE

bei Nagetieren, eine Unterdrückung der Infiltration von inflammatorischen Zytokinen

ins ZNS sowie eine Inhibition der Produktion von Zytokinen (18). Hier in dieser Arbeit

wurde Mesopram verwendet, um dessen Wirkung auf Faktoren der BHS zu

untersuchen.

Mittlerweile wird die Wirkung von Mesopram in einer Phase 2 Studie an Patienten mit

klinisch gesicherter MS erprobt. Mesopram hemmt einerseits die Aktivierung von

Makrophagen, die bei MS die Myelinschichten angreifen und andererseits die T-Zellen,

die ihrerseits die Makrophagen aktivieren (39).

Die positive Wirkung des PDE-IV-Inhibitors Mesopram auf den intrazellulären cAMP-

Spiegel dieser Zellen wurde im Zellüberstand nach 15, 30, 60 minütiger Stimulation mit

Mesopram nachgewiesen.

Aufgrund vorhergegangener Experimente erschien uns die Wahl des Zeitfensters von 24

und 48 Stunden nach Stimulationsbeginn zur Auswertung von TJ-Proteinen,

Adhäsionsmolekülen, Zyto- und Chemokinen, Neutrophinen und MMP’s sinnvoll.

4.1 Einfluss von Mesopram auf Tight junction Proteine

TJ’s spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der endothelialen Barriere.

In der Literatur ist beschrieben, dass Occludin ein Schlüssel-TJ-Protein ist, dessen

Expression die Gewebe-Barriereeigenschaft bestimmt (35). Das TJ Protein Occludin

zeigte bei den HBMEC’s im Western Blot sowie in der Immuncytologie in dieser Arbeit

eine konstante Expression. Es ließ sich weder unter inflammatorischen Bedingungen

Diskussion

- 66 -

mit TNFα noch unter Mesopram-induzierter PDE-Inhibition alleine oder in

Kombination mit TNFα verändert darstellen.

Es ist also anzunehmen, dass weder TNFα noch eine Mesopram-induzierte cAMP-

Erhöhung Einfluss auf die Gesamtexpression von Occludin in HBMEC’s haben. Diese

Beobachtung deckt sich mit Experimenten von Wachtel et al., bei denen unter alleiniger

TNFα-Stimulation kein Effekt auf die Expression von Occludin festgestellt wurde (91).

Minagar et al. konnte sowohl unter IFN-γ als auch unter TNFα und INF-γ eine

reduzierte Expression von Occludin in vitro feststellen (66).

Obwohl bekannt ist, dass Claudin-5 besonders in der BHS für die Größenselektion von

Molekülen, die die BHS passieren wollen, zuständig ist (33), konnten wir Claudin-5 im

Gegensatz zu Claudin-3 bei den HBMEC’s durch Immuncytologie nicht nachweisen.

Folglich untersuchten wir nur Claudin-3 im Western Blot. Claudin-3 wurde von den

HBMEC’s unter TNFα verstärkt exprimiert. Dieser Effekt steht der Beobachtung von

Wolfburg et al. gegenüber. Hier wurde ein Verlust von Claudin-3 unter Inflammation

beschrieben, der zum Zusammenbruch der BHS führte (94).

Alleinige Stimulation von HBMEC’s mit Mesopram zeigte in dieser Arbeit keinen

Einfluss auf die Claudin-3 Expression. Auch in Kombination mit TNFα änderte sich das

Expressionsmuster von Claudin-3 nicht weiter. Somit wurde im Western Blot keine

regulatorische Funktion von Mesopram auf die Claudin-3 Expression festgestellt.

Das zytoplasmatische TJ Protein ZO-1 gehört zu den MAGUKs (membrane-associated

guanylate kinase-like proteins). Es ist bekannt, dass eine verminderte BHS Integrität,

verursacht durch Il-1β-induzierte Transmigration von Neutrophilen durch das cerebrale

Endothel, in vivo zu einem Verlust der Färbung von Occludin und ZO-1 an Zellgrenzen

führt (35).

Bei den hier untersuchten HBMEC’s ließ sich im Western Blot des Proteins ZO-1 keine

Reaktion auf die TNFα-Stimulation und keine Regulation durch Mesopram nachweisen.

Folglich ist hier wie bei Occludin zu vermuten, dass die Transkription von ZO-1 bei

diesen Zellen nicht durch Mesopram und TNFα verändert wird.

Die in dieser Arbeit untersuchten HBMEC’s zeigten innerhalb der Gruppe der TJ-

Proteine keine regulatorische Modulation durch den selektiven PDE-IV-Inhibitor

Diskussion

- 67 -

Mesopram. Es muß offen bleiben, ob subzelluläre Umverteilungen der Proteine hier

eine Rolle spielen, wie es z.B. für den Einfluß von TNFα/ INF-γ auf JAM (junctional

adhesion molecules) beschrieben wurde.

4.2 Einfluss von Mesopram auf Adhäsionsmoleküle

Zur Familie der Immunglobulin-ähnlichen Adhäsionsmoleküle gehören unter anderem

die hier untersuchten Adhäsionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1 und MCAM.

ICAM-1 und VCAM-1 sind Oberflächenmoleküle, die bei der Adhäsion und Migration

von aktivierten Leukozyten ins ZNS eine wichtige Rolle spielen. VCAM-1 interagiert

mit VLA-4 der Lymphozyten und ICAM-1 ist ein Ligand für LFA, MAC-1

(CD11b/CD18) und für CD43.

Bei der Regulation der Expression von ICAM-1 und VCAM-1 sind

proinflammatorische Zytokine beteiligt (34, 12, 43). Die Entwicklung von klinischen

Zeichen bei EAE ist mit dem Zusammenbruch der BHS, einer Hochregulation der

Adhäsionsmoleküle sowie mit der Invasion von inflammatorischen Zellen ins ZNS

assoziiert (80).

Die HBMEC’s zeigten sowohl bei der Immuncytologie als auch bei der FACS-Analyse

eine sehr geringe Expression von VCAM-1, die auch unter inflammatorischer

Stimulation mit TNFα nicht zunahm. Diese Ergebnisse kontrastieren mit Befunden von

Kallmann et.al. in primären EC-Kulturen (43). Aufgrund dieser niedrigen

Grundexpression konnten wir VCAM-1 nicht verwenden, um einen Einfluss des PDE-

IV-Inhibitors Mesopram auf dieses Adhäsionsmolekül zu untersuchen.

Die ICAM-1-Expression war in der Immuncytologie deutlich sichtbar. In der FACS-

Analyse allerdings lag sie unstimuliert schon bei 80 % und ließ sich unter TNFα-

Stimulation auf nahezu 100 % steigern. Ein solcher TNFα-induzierter Anstieg ist auch

in der Literatur beschrieben (3).

Laut Bernot et al. ist eine persistierende cAMP-Erhöhung, die die PKA aktiviert, in der

Lage, die ICAM-1-Expression auf der Zelloberfläche von Endothelzellen unter

proinflammatorischen Bedingungen zu erhöhen (10). Bei den hier untersuchten

HBMEC’s ließ sich dieser Effekt durch PDE-IV-Inhibition mit Mesopram nicht

darstellen. Eine mögliche Ursache hierfür könnte die hohe Basalexpression von ICAM-

1 der HBMEC’s sein, was einen eventuellen Effekt von Mesopram maskierte.

Diskussion

- 68 -

MCAM ist ein aus der Melanom-Forschung bekanntes Adhäsionsmolekül, welches

auch auf Endothelzellen gefunden wird. Diesem in endothelialen Junction lokalisierten

Oberflächenmolekül wird eine Rolle in der Kontrolle von Zell-Zell-Kontakten sowie der

Kontrolle der parazellulären Permeabilität zugeschrieben (5).

Etwa 20 % der HBMEC’s exprimierten MCAM. Es zeigten sich geringfügige

Schwankungen der Expression von MCAM-1 unter TNFα-Stimulation.

Unter alleiniger Behandlung mit Mesopram sowie in Kombination mit TNFα konnten

wir keine signifikante Veränderungen der Expression nachweisen. Diese

Veränderungen zeigten sich jedoch auch unter den Kontrollen mit dem Lösungsmittel

DMSO, so dass dieser Effekt nicht auf Mesopram zurückzuführen ist.

In den Experimenten mit den verwendeten HBMEC’s konnte in dieser Arbeit keine

Mesopram-induzierte Regulation der Adhäsionsmoleküle ICAM-1 und MCAM

festgestellt werden, weder unter normalen noch unter inflammatorischen Bedingungen.

4.3 Einfluss von Mesopram auf Zytokine und Chemokine

Zytokine sind als interzelluläre Mediatoren an der Aktivierung von spezifischen Zellen

und an der Immunregulation beteiligt. Sie sind wichtige Komponenten von

inflammatorischen Prozessen und greifen mit in den Oligodendrozyten-Zelltod, in die

axonale Degeneration sowie in die neuronale Dysfunktion ein, welches Grundzüge der

Pathologie von MS sind (42).

Il-6 gehört zu den Zytokinen. Es ist ein wichtiger Regulator von inflammatorischen und

Immun-Reaktionen und erhöht die endotheliale Permeabilität durch Neuordnung von

Aktionsfilamenten (52).

Die HBMEC’s produzierten im Zellüberstand nachweisbares Il-6. Unter

inflammatorischer Stimulation mit TNFα wurde das 70-fache der Kontrollkonzentration

erreicht. Il-6 war folglich gut durch TNFα induzierbar. Il-6 wird im ZNS in der

Induktionsphase von EAE hoch reguliert (42).

Im Zellüberstand der Proben, die nur mit Mesopram behandelt wurden, war die

Expression von Il-6 geringfügig höher als in der unbehandelten Probe. Zusätzlich mit

Diskussion

- 69 -

TNFα stimuliert stieg die Konzentration von Il-6 auf ähnlich hohe Werte, wie in der

Kontrolle enthalten. Es ließ sich also keine Modulation der Il-6 Expression durch

Mesopram-induzierte cAMP-Erhöhung nachweisen.

Das zur Familie der EGF’s gehörende AR wird als membrangebundenes

Vorläuferprotein gebildet und durch enzymatische Spaltung in das aktive Protein

umgewandelt.

Die in dieser Arbeit verwendeten HBMEC’s exprimierten AR. Unter TNFα-Stimulation

wurden anhand von ELISA-Auswertungen erhöhte Werte für AR im Zellüberstand

nachgewiesen. Eine Mesopram-induzierte cAMP-Erhöhung zeigte keine regulatorische

Modulation des Zytokins AR, obwohl in der Literatur eine, durch cAMP-Erhöhung und

PKA-Aktivierung, induzierte Transkription von AR beschrieben ist (21)

Die Aufgaben von AR im ZNS sind bisher wenig erforscht (24, 51, 53, 69).

Chemokine sind chemotaktische Zytokine, die zu einer Akkumulation von Leukozyten

im Entzündungsbereich führen.

MCP-1 gehört zur CC-Familie, es ist unter anderem auf EC’s lokalisiert und scheint in

engem Zusammenhang mit der Pathogenese von MS und EAE zu stehen (84). Es spielt

eine wichtige Rolle bei der Rekrutierung von Leukozyten durch die BHS und es ist in

aktiven und chronischen Läsionen von MS-Patienten nachweisbar (62).

MCP-1 wurde von HBMEC’s unter unstimmulierten Bedingungen in so geringer

Konzentration exprimiert, dass es sich im ELISA beinahe unter der Nachweisgrenze

befand. Erst mit inflammatorischer Stimulation durch TNFα stieg die MCP-1-

Konzentration im Zellüberstand hoch an. Mit alleiniger Mesopram-Stimulation blieb

der MCP-1-Spiegel unverändert niedrig. In den kleinen Konzentrationen von Mesopram

mit zusätzlicher TNFα-Stimulation blieb die MCP-1-Konzentration im Gegensatz zur

unbehandelten TNFα-Kontrolle niedrig. Die hohen Mesopram-Konzentrationen stiegen

mit TNFα behandelt auf Werte, die ähnlich hoch lagen wie die der TNFα-Kontrolle.

Diese Beobachtung deckt sich jedoch mit den Ergebnissen der DMSO-Kontroll-Proben,

somit ist dieser Effekt nicht Mesopram spezifisch.

Das Chemokin MCP-1 konnte nicht durch Mesopram-induzierte cAMP-Erhöhung

moduliert werden, weder unter normalen noch unter inflammatorischen Bedinungen.

Diskussion

- 70 -

Il-8 ist ein Neutrophilen-spezifisches CXC-Chemokin. Unter proinflammatorischen

Faktoren wird Il-8 vermehrt gebildet. Il-8 bindet an endotheliale Zellen, erhöht so die

Permeabilität von endothelialen Zell-Monolayers (52), wodurch die modulierende Rolle

von Il-8 bei der transendothelialen Migration von Neutrophilen verstanden wird (57).

In dieser Arbeit konnte im Zellüberstand von HBMEC’s anhand von ELISA-Daten Il-8

bestimmt werden. Die mit Mesopram stimulierten Zellen produzierten in gleichem

Maße das Chemokin Il-8. Unter inflammatorischen Bedingungen (TNFα) wurden um

ein Vielfaches erhöhte Il-8-Konzentrationen festgestellt. Il-8 ließ sich folglich in den

HBMEC’s gut durch TNFα induzieren.

Mit TNFα in Kombination mit Mesopram behandelte HBMEC’s stiegen mit ihrer Il-8-

Konzentration im Zellüberstand auf ebenso hohe Werte an wie in der nur mit TNFα

behandelten Probe. Die Proben, die mit den kleinen Mesopram-Konzentrationen

behandelt wurden, stiegen mit ihrer Il-8-Produktion nicht so hoch an. Dieser Effekt war

auch in den vergleichbaren DMSO-Kontrollen vorhanden, so dass es sich auch hier

nicht um eine spezifische Modulation durch Mesopram handelte.

Für den in dieser Arbeit verwendeten inflammatorischen Faktor TNFα gibt es zwei

transmembranöse Rezeptoren. Hier wurde nur die lösliche Form des TNF-RI

untersucht.

Die lösliche Form wird in humanem Urin und Plasma gefunden. Man geht davon aus,

dass die lösliche Form mit der membrangebundenen Form um die Bindung von TNFα

kompetetieren kann. Erhöhte Level von sTNF-RI werden unter anderem im Plasma von

Patienten mit Infektionen und Malignomen gefunden.

Im Zellüberstand von den HBMEC’s konnte sTNF-RI nachgewiesen werden. Unter

inflammatorischer Stimulation mit 10 ng/ml TNFα wurden keine signifikanten

Veränderungen von sTNF-RI im Zellüberstand von HBMEC’s gefunden. Mit der

höchsten verwendeten TNFα-Konzentration (100 ng/ml) wurde die sTNF-RI-

Konzentration stark reduziert. Dieser Effekt wurde durch den Mesopram-induzierten

cAMP-Anstieg nicht verändert. Eine mögliche Erklärung für diesen Effekt könnte eine

unvollständige Detektion des sTNF-RI in Anwesenheit von hohen TNFα-

Konzentrationen sein.

Diskussion

- 71 -

Zusammenfassend kann bei den HBMEC’s in dieser Arbeit eine regulatorische

Modulation durch den PDE-IV-Inhibitor Mesopram bezüglich der untersuchten

Zytokine und Chemokine nicht bestätigt werden.

4.4 Einfluss von Mesopram auf den Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF)

Der zur Familie der Neutrophine gehörende BDNF wird von vielen unterschiedlichen

Zellen gebildet, einschließlich Fibroblasten, Astrocyten, Neurone, Megakaryozyten,

Schwannzellen, Glatten Muskelzellen, aktivierten T-Zellen, B-Zellen, Monozyten

(47)und von HCEC’s (7). Es ist bekannt, dass BDNF eine Rolle bei der Organisation

von vaskulärem Endothel spielt (75), immunregulatorische Eigenschaften besitzt und in

Leukozyten von MS-Patienten in erhöhtem Maße zu finden ist (31).

BDNF konnte im Zellüberstand der hier verwendeten HBMEC’s nachgewiesen werden.

Nach 24 h TNFα Stimulation mit 10 ng/ml war die BDNF-Konzentration etwas höher

als in der unstimulierten Kontrolle. Mit 100 ng/ml TNFα stimuliert lag die BDNF-

Konzentration ungefähr gleich mit der Kontroll-Konzentration.

Sowohl mit als auch ohne TNFα-Stimulation stellte sich unter Mesopram-Behandlung

bei den HBMEC’s das gleiche Bild ein. Es konnte keine regulatorische Modulation von

Mesopram nachgewiesen werden.

Nach 48 h Stimulation drehte sich das Verhältnis zwischen den vermessenen TNFα-

Konzentrationen um. Hier lag die 10 ng/ml TNFα-Kontrolle mit ihrer BDNF-

Konzentration leicht unter der unstimulierten Kontrolle, wohingegen die hohe TNFα-

Kontrolle (100 ng/ml) leicht höhere BDNF-Werte aufwies. Auch nach 48 h Stimulation

mit Mesopram in Kombination mit und ohne TNFα stellte sich kein Unterschied in der

Konzentration von BDNF ein.

Die in dieser Arbei untersuchten HBMEC’s zeigten unter Mesopram-Behandlung keine

Veränderung des BDNF-Musters.

4.5 Einfluss von Mesopram auf Matrix-Metalloproteasen

Die in dieser Arbeit untersuchten MMP’s -2/-9 sind Gelatinasen, von denen bekannt ist,

dass sie eine wichtige Rolle beim Zusammenbruch der BHS bei MS und EAE spielen.

Diskussion

- 72 -

Nur mit dem extracellulären Verdau von diesen MMP’s wird die Infiltration von

Monozyten und T-Zellen ins ZNS ermöglicht (6, 29, 50, 64).

In den Zellüberständen der hier verwendeten HBMEC’S konnte nur inaktive MMP-2

nachgewiesen werden. Weder die aktive Form von MMP-2 noch die inaktive Form von

MMP-9 konnte durch Zymographie gefunden werden.

Unter TNFα-Stimulation wurde keine Veränderung der Expression von MMP-2

festgestellt, obwohl in der Literatur erhöhte Level von MMP-2 und MMP-9 nach Th1-

Immunantworten, wie bei MS, gefunden wurden (1).

Die mit Mesopram behandelten Zellüberstände zeigten keine veränderte Expression von

MMP-2. Auch in Kombination mit dem inflammatorischen Faktor TNFα war eine

Regulation durch Mesopram nicht zu verzeichnen.

4.6 Schlussfolgerung

Der ebenso wie Mesopram PDE-IV spezifische PDE-Inhibitor Rolipram verhinderte in

einer tierexperimentellen Studie die klinischen Erscheinungen von EAE, den

Zusammenbruch der BHS, sowie die Invasion von inflammatorischen Zellen ins ZNS

(30).

Diese Daten und die von Dinter et all (19) beschriebenen positiven Erkenntnisse über

den hier untersuchten PDE-IV-Inhibitor Mesopram veranlassten uns zu den

beschriebenen Experimenten.

Für die Untersuchungen von Faktoren der BHS wurden HBMEC’s ausgewählt. Diese

Zellen stellen ein anerkanntes BHS-Model dar (4, 19, 20). Es handelt sich hierbei

jedoch um eine Zelllinie, so dass die beschriebenen Ergebnisse nicht direkt auf primäre

CEC’s übertragbar sind. Zudem ist bekannt, dass Zelllinien im Vergleich mit primären

Zellen häufig über veränderte Signaltransduktionswege verfügen.

Neben dem bekannten und hier auch nachgewiesenen Effekt, den intrazellulären cAMP-

Spiegel zu erhöhen, sind andere Angriffspunkte von Mesopram denkbar.

Die Wirkung von Mesopram-induzierter cAMP-Erhöung an primären CEC’s ist

Gegenstand weiterer Untersuchungen.

Diskussion

- 73 -

Eine Regulation der hier untersuchten Faktoren der BHS konnte durch Mesopram im

Experiment nach den gewählten Zeitpunkten mit 24 und 48 h Stimulation konnte nicht

festgestellt werden.

Der in dieser Arbeit untersuchte PDE-Inhibitor Mesopram hatte in den HBMEC’s

weder auf die untersuchten TJ Proteine (ZO-1, Claudin-3, Occludin), die

Adhäsionsmoleküle (ICAM-1, MCAM), die Zyto- und Chemokine (Il-6, AR, Il-8,

MCP-1), das Neutrophin (BDNF) noch auf die MMP’s (MMP-2, MMP-9) einen

modulierenden Einfluss, so dass experimentell kein Hinweis auf eine mögliche

Stabilisierung der BHS in vitro gefunden werden konnte. Da es sich in dieser Arbeit um

in vitro Untersuchungen handelt, kann ein Einfluss von Mesopram in vivo nicht

ausgeschlossen werden.

Zusammenfassung

- 74 -

5 ZUSAMMENFASSUNG

Multiple Sklerose ist eine chronisch degenerative Erkrankung des ZNS, deren Therapie-

möglichkeiten noch immer begrenzt sind.

In der vorliegenden Arbeit wurde in vitro der selektive PDE-IV-Inhibitor Mesopram

untersucht, welcher bereits in einer Phase II Studie bei Patienten mit klinisch gesicherter

MS zum Einsatz kommt.

Anhand von HBMEC’s, die als ein Model der menschlichen BHS gelten, konnten TJ’s

(ZO-1, Claudin-3, Occludin), Adhäsionsmoleküle (ICAM, VCAM, MCAM), Zytokine

und Chemokine (AR, Il-6, MCP-1, Il-8) und MMP-2 nachgewiesen werden. Diese

Faktoren sind bei der Zerstörung der BHS in der Pathologie der MS beteiligt. Die Idee

dieser Arbeit war es, durch die spezifische PDE-IV-Inhibition mit Mesopram die

untersuchten Faktoren der BHS so zu beeinflussen, dass eine weitere

Permeabilitätserhöhung verhindert werden könnte.

Da es sich bei MS um eine inflammatorische Erkrankung handelt und TNFα in MS-

Läsionen gefunden wird, wurde in dieser Arbeit TNFα als inflammatorischer Stimulus

verwendet. Unter TNFα-Stimulation wurden die meisten der genannten Faktoren

vermehrt exprimiert. Keine Veränderung unter TNFα zeigten Occludin, ZO-1, VCAM

und MMP-2.

Die HBMEC’s wurden über 24 und 48 h mit TNFα und Mesopram stimuliert. Es konnte

in den unterschiedlichen Auswertungen (ELISA, FACS, Western Blot, Zymographie)

keine regulatorische Modulation der verschiedenen Faktoren unter Mesopram-

induzierter cAMP-Erhöhung nachgewiesen werden.

Literatur

- 75 -

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Danksagung

DANKSAGUNG

Herrn Prof. Dr. med. P. Rieckmann danke ich für die Überlassung des Themas und die

fachkundige Beratung.

Herrn Prof. Dr. G. Stoll danke ich für die Übernahme des Koreferats.

Mein besonderer Dank gilt Dr. B. Kallmann und Dr.V. Hummel, die mich während aller

Phasen dieser Arbeit hervorragend betreuten.

Nicht unerwähnt bleiben dürfen meine Eltern, Prof. Dr. med. H. Bindewald und Dr.

med. V. Bindewald, die mich während meines gesamten Studiums liebevoll und

fachkundig unterstützt haben, sowie mein Ehemann, Dr. FG Schmid, der mir besonders

in der Endphase dieser Arbeit beratend zur Seite stand.

Lebenslauf

LEBENSLAUF

Persönliche Daten

Name Harriet Schmid, geb. Bindewald

Geburtsdatum 13.11.1980

Geburtsort Hannover

Schul- und Hochschulbildung

05/2007 Dritter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

12/2006 – 04/2007 Drittes Tertial des Praktischen Jahres

Universität Würzburg, Innere Medizin

08/2006 – 12/2006 Zweites Tertial des Praktischen Jahres

Universität Würzburg, Gynäkologie

04/2006 – 08/2006 Erstes Tertial des Praktischen Jahres

Inselspital Bern (CH), Visceralchirurgie

04/2006 Zweiter Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

08/2003 Erster Abschnitt der Ärztlichen Prüfung

Seit 04/2003 Studium der Humanmedizin

Julius – Maximilian – Universität Würzburg

10/2002 – 03/2003 Studium der Humanmedizin

Universität Wien (Österreich)

09/2002 Ärztliche Vorprüfung

10/2000 – 09/2002 Studium der Humanmedizin

Universität Rostock

06/2000 Allgemeine Hochschulreife

08/1991 – 06/2000 Rudi-Stefan-Gymnasium Worms

08/1988 – 07/1991 Westendgrundschule Worms

07/1987 – 06/1988 Grundschule Neckargemünd

Kemnath im Juli 2007

Documents

Die Wirkung des Phosphodiesterase-IV-Inhibitors Mesopram ...Die Multiple Sklerose (MS), auch unter dem Namen Encephalomyelitis disseminata, Polysklerose oder Sklerosis multiplex bekannt,