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Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek
Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen
Nationalbibliografie;
Detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über http://dnb.ddb.de abrufbar.
1. Auflage 2012
© 2012 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH,
Gießen
Printed in Germany
ISBN 978-3-86345-101-1
Verlag: DVG Service GmbH
Friedrichstraße 17
35392 Gießen
0641/24466
www.dvg.net
Aus dem Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
___________________________________________________________________
Bedeutung der akuten Neuroinflammation bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems für die
Initiation und Progression von Entmarkungsprozessen
HABILITATIONSSCHRIFT zur Erlangung der Venia legendi an der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
Dr. med. vet. Andreas Alfons Beineke
aus Haan
Hannover 2012
Tag der nichtöffentlichen
wissenschaftlichen Aussprache: 10.07.2012
Die Anfertigung dieser Arbeit wurde durch Sachbeihilfen der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert (BE 4200/1-1 und BA 815/10-1).
Für Silke, Johanna und Sophie
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis 1. Vorwort ............................................................................................................. 2. Einleitung ......................................................................................................... 2.1. Die Multiple Sklerose und ihre Tiermodelle .................................................. 2.2. Die Hundestaupe .......................................................................................... 2.3. Die Theilersche murine Enzephalomyelitis .................................................. 2.4. Die Theilersche murine Enzephalomyelitis als translationales Modell für
Entmarkungskrankheiten .............................................................................. 3. Konzept und Ziele ............................................................................................ 4. Darstellung der Ergebnisse und Diskussion ................................................ 4.1. Entzündungsreaktion im Großhirn während der akuten Phase von
Morbillivirusinfektionen ................................................................................. 4.1.1. Zytokinexpression in frühen, nicht-demyelinisierenden Herden des
Großhirns bei der Hundestaupe ................................................................... 4.1.2. Charakterisierung von Antikörpern für die immunhistologische Detektion
von hämatopoetischen Zellen beim Seehund .............................................. 4.1.3. Virusproteinexpression und Phänotypisierung der zellulären Immunantwort
im Großhirn bei der Seehundstaupe ............................................................ 4.2. Mikrogliaaktivierung und Zytokinexpression während der initialen Phase
von primär degenerativen Erkrankungen des zentralen Nervensystems ..... 4.3. Entzündungsreaktionen während der akuten und chronischen Phase
der experimentellen Theilerschen murinen Enzephalomyelitis .................... 4.3.1. Herstellung und Charakterisierung eines Theilervirus-spezifischen
Antikörpers ................................................................................................... 4.3.2. Virusverteilung und Läsionsentwicklung im Gehirn von
Theilervirus-infizierten Mäusen .................................................................... 4.3.3. Immunreaktionen in peripheren lymphatischen Organen während der
Initiation und Progression der Theilerschen murinen Enzephalomyelitis ..... 4.3.4. Zytokinexpression und Phänotypisierung der zellulären Immunantwort im
Gehirn bei der Theilerschen murinen Enzephalomyelitis ............................. 4.4. Einfluss der Cuprizon-induzierten Neurodegeneration auf die spinale
Entmarkung bei der Theilerschen murinen Enzephalomyelitis ....................
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Inhaltsverzeichnis II
4.4.1. Neurodegenerative Prozesse im murinen Rückenmark durch Cuprizon ..... 4.4.2. Einfluss von Cuprizon auf immunologische Reaktionen im Rückenmark
von Theilervirus-infizierten Mäusen .............................................................. 5. Studienübergreifende Diskussion ................................................................. 5.1. Zytokinexpression bei demyelinisierenden Erkrankungen des zentralen
Nervensystems ............................................................................................. 5.2. Bedeutung der unspezifischen (angeborenen) Immunität und
der frühen Immunmodulation für die Pathogenese von demyelinisierenden Krankheiten ..................................................................
5.3. Bedeutung von B-Zellen und der humoralen Immunität für die
Pathogenese von demyelinisierenden Krankheiten ..................................... 5.4. Bedeutung von regulatorischen T-Zellen bei virusinduzierten und
degenerativen Krankheiten des zentralen Nervensystem ............................ 6. Zusammenfassung .......................................................................................... 7. Summary .......................................................................................................... 8. Literaturverzeichnis ......................................................................................... 9. Darstellung des eigenen Anteils an den wissenschaftlichen
Veröffentlichungen ..................................................................................... 10. Danksagung ..................................................................................................... 11. Anhang ............................................................................................................. 11.1. Publikation 1: Beineke A, Puff C, Seehusen F, Baumgärtner W.
Pathogenesis and immunopathology of systemic and nervous canine distemper. Veterinary Immunology and Immunopathology 2009; 127: 1-18 ......................................................................................................
11.2. Publikation 2: Beineke A, Markus S, Borlak J, Thum T, Baumgärtner W.
Increase of pro-inflammatory cytokine expression in non-demyelinating early cerebral lesions in nervous canine distemper. Viral Immunology 2008; 21: 401-410 ........................................................................................
11.3. Publikation 3: Seibel H, Stimmer L, Siebert U, Beineke A.
Immunohistochemical characterization of selected cell markers for the detection of hematopoietic cells in formalin-fixed, paraffin wax-embedded lymphoid tissues of harbor seals (Phoca vitulina) and walruses (Odobenus rosmarus rosmarus). Veterinary Immunology and Immunopathology 2010; 137: 305-309 ................................................................................................
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Inhaltsverzeichnis III
11.4. Publikation 4: Stimmer L, Siebert U, Wohlsein P, Fontaine JJ, Baumgärtner W, Beineke A. Viral protein expression and phenotyping of inflammatory responses in the central nervous system of phocine distemper virus-infected harbor seals (Phoca vitulina). Veterinary Microbiology 2010; 145: 23-33 .....................................................................
11.5. Publikation 5: Spitzbarth I, Bock P, Haist V, Stein VM, Tipold A, Wewetzer
K, Baumgärtner W, Beineke A. Prominent microglial activation in the early pro-Inflammatory immune response in naturally occurring canine spinal cord injury. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology 2011; 70: 703-714 ..................................................................................................
11.6. Publikation 6: Kummerfeld M, Meens J, Haas L, Baumgärtner W, Beineke
A. Generation and characterization of a polyclonal antibody for the detection of Theiler's murine encephalomyelitis virus by light and electron microscopy. Journal of Virological Methods 2009; 160: 185-188 .................
11.7. Publikation 7: Kummerfeld M, Seehusen F, Klein S, Ulrich R, Kreutzer R,
Gerhauser I, Herder V, Baumgärtner W, Beineke A. Periventricular demyelination and axonal pathology is associated with subependymal virus spread in a murine model for multiple sclerosis. Intervirology .............
11.8. Publikation 8: Navarrete-Talloni MJ, Kalkuhl A, Deschl U, Ulrich R,
Kummerfeld M, Rohn K, Baumgärtner W, Beineke A. Transient peripheral immune response and central nervous system leaky compartmentalization in a viral model for multiple sclerosis. Brain Pathology 2010; 20: 890-901 ..
11.9. Publikation 9: Herder V, Gerhauser I, Klein SK, Almeida P, Kummerfeld M,
Ulrich R, Seehusen F, Rohn K, Schaudien D, Baumgärtner W, Hühn J, Beineke A. Interleukin-10 expression during the acute phase is a putative prerequisite for delayed viral elimination in a murine model for multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology 2012; 15: 27-39 .............................
11.10. Publikation 10: Herder V, Hansmann F, Stangel M, Skripuletz T,
Baumgärtner W, Beineke A. Lack of cuprizone-induced demyelination in the murine spinal cord despite oligodendroglial alterations substantiates the concept of site-specific susceptibilities of the central nervous system. Neuropathology and Applied Neurobiology 2011; 37: 676-684 ...................
11.11. Publikation 11: Herder V, Hansmann F, Stangel M, Schaudien D,
Baumgärtner W, Beineke A. Cuprizone inhibits demyelinating leukomyelitis by reducing immune responses in the spinal cord without virus exacerbation in an infectious model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology 2012; 244: 84-93 ............................................................
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Abkürzungsverzeichnis IV
Abkürzungsverzeichnis
BHK baby hamster kidney
CD cluster of differentiation
CDV canine distemper virus, Hundestaupevirus
CNPase 2', 3'-cyclic nucleotide 3'-phosphodiesterase, 2', 3’-zyklische Nukleotid-
3 -Phosphodiesterase
DA Daniel’s Stamm des Theilervirus
EAE Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis
GFAP glial fibrillary acidic protein, saures Gliafaserprotein
HIV Humanes Immundefizienz-Virus
IFN Interferon
IL Interleukin
JHM John Howard Mueller
MBP myelin basic protein, basisches Myelinprotein
MHC major histocompatibility complex, Haupthistokompatibilitätskomplex
MOG Myelin-Oligodendrozyten Glykoprotein
MS Multiple Sklerose
PDV phocine distemper virus, Seehundstaupevirus
PLP Myelin-Proteolipid-Protein
RNS Ribonukleinsäure
ROS reactive oxygen species, reaktive Sauerstoffverbindungen
RT-qPCR Reverse Transkriptase-quantitative Polymerase Kettenreaktion
SLAM signaling lymphocyte activation molecule
TGF transforming growth factor, Transformierender Wachstumsfaktor
TME Theilersche murine Enzephalomyelitis
TMEV Theilersches murines Enzephalomyelitisvirus
TNF Tumor-Nekrose-Faktor
TUNEL TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling
z.B. zum Beispiel
ZNS zentrales Nervensystem
Verzeichnis der Veröffentlichungen, die Bestandteil der Habilitationsschrift sind V
Verzeichnis der Veröffentlichungen, die Bestandteil der Habilitationsschrift sind
Publikation 1 (Anhang 11.1.):
Beineke A, Puff C, Seehusen F, Baumgärtner W. Pathogenesis and immunopathology of
systemic and nervous canine distemper. Veterinary Immunology and Immunopathology
2009; 127: 1-18. doi:10.1016/j.vetimm.2008.09.023.
Publikation 2 (Anhang 11.2):
Beineke A, Markus S, Borlak J, Thum T, Baumgärtner W. Increase of pro-inflammatory
cytokine expression in non-demyelinating early cerebral lesions in nervous canine distemper.
Viral Immunology 2008; 21: 401-410. doi: 10.1089/vim.2008.0043.
Publikation 3 (Anhang 11.3):
Seibel H, Stimmer L, Siebert U, Beineke A. Immunohistochemical characterization of
selected cell markers for the detection of hematopoietic cells in formalin-fixed, paraffin wax-
embedded lymphoid tissues of harbor seals (Phoca vitulina) and walruses (Odobenus
rosmarus rosmarus). Veterinary Immunology and Immunopathology 2010; 137: 305-309.
doi:10.1016/j.vetimm.2010.05.012.
Publikation 4 (Anhang 11.4):
Stimmer L, Siebert U, Wohlsein P, Fontaine JJ, Baumgärtner W, Beineke A. Viral protein
expression and phenotyping of inflammatory responses in the central nervous system of
phocine distemper virus-infected harbor seals (Phoca vitulina). Veterinary Microbiology 2010;
145: 23-33. doi:10.1016/j.vetmic.2010.02.034.
Publikation 5 (Anhang 11.5):
Spitzbarth I, Bock P, Haist V, Stein VM, Tipold A, Wewetzer K, Baumgärtner W, Beineke A.
Prominent microglial activation in the early pro-Inflammatory immune response in naturally
occurring canine spinal cord injury. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology
2011; 70: 703-714. doi: 10.1097/NEN.0b013e3182270f8e.
Publikation 6 (Anhang 11.6):
Kummerfeld M, Meens J, Haas L, Baumgärtner W, Beineke A. Generation and
characterization of a polyclonal antibody for the detection of Theiler's murine
encephalomyelitis virus by light and electron microscopy. Journal of Virological Methods
2009; 160: 185-188. doi:10.1016/j.jviromet.2009.04.030.
Verzeichnis der Veröffentlichungen, die Bestandteil der Habilitationsschrift sind VI
Publikation 7 (Anhang 11.7):
Kummerfeld M, Seehusen F, Klein S, Ulrich R, Kreutzer R, Gerhauser I, Herder V,
Baumgärtner W, Beineke A. Periventricular demyelination and axonal pathology is
associated with subependymal virus spread in a murine model for multiple sclerosis.
Intervirology; doi: 10.1159/000336563.
Publikation 8 (Anhang 11.8):
Navarrete-Talloni MJ, Kalkuhl A, Deschl U, Ulrich R, Kummerfeld M, Rohn K, Baumgärtner
W, Beineke A. Transient peripheral immune response and central nervous system leaky
compartmentalization in a viral model for multiple sclerosis. Brain Pathology 2010; 20: 890-
901. doi:10.1111/j.1750-3639.2010.00383.x.
Publikation 9 (Anhang 11.9):
Herder V, Gerhauser I, Klein SK, Almeida P, Kummerfeld M, Ulrich R, Seehusen F, Rohn K,
Schaudien D, Baumgärtner W, Hühn J, Beineke A. Interleukin-10 expression during the
acute phase is a putative prerequisite for delayed viral elimination in a murine model for
multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology 2012; 15: 27-39.
doi.org/10.1016/j.jneuroim.2012.04.010
Publikation 10 (Anhang 11.10):
Herder V, Hansmann F, Stangel M, Skripuletz T, Baumgärtner W, Beineke A. Lack of
cuprizone-induced demyelination in the murine spinal cord despite oligodendroglial
alterations substantiates the concept of site-specific susceptibilities of the central nervous
system. Neuropathology and Applied Neurobiology 2011; 37: 676-684. doi: 10.1111/j.1365-
2990.2011.01168.x.
Publikation 11 (Anhang 11.11):
Herder V, Hansmann F, Stangel M, Schaudien D, Baumgärtner W, Beineke A. Cuprizone
inhibits demyelinating leukomyelitis by reducing immune responses in the spinal cord without
virus exacerbation in an infectious model of multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology
2012; 244: 84-93. doi:10.1016/j.jneuroim.2012.01.010.
Vorwort 1
1. Vorwort
Demyelinisierungen betreffen das zentrale oder periphere Nervensystem und sind
durch den Verlust von Myelinscheiden gekennzeichnet (WAKSMAN, 1999). Hierbei
werden primäre und sekundäre Prozesse unterschieden. Die primäre Entmarkung
entsteht durch eine initiale Schädigung der Myelinscheiden und/oder von
Oligodendrozyten, während Axone in der Frühphase nicht verändert sind. Die
sekundäre Demyelinisierung resultiert aus einer Schädigung von Axonen oder
Neuronen, woraufhin sich Myelinveränderungen anschließen (LOVE, 2006). In
Abhängigkeit von der Lokalisation im zentralen Nervensystem (ZNS) verursacht die
Entmarkung unterschiedliche neurologische Symptome, wie beispielsweise kognitive
Defizite oder motorische Störungen (ERCOLINI und MILLER, 2006; POWERS,
2004). Weiterhin unterscheiden sich demyelinisierende Herde in ihrer Ausdehnung
sowie in der Entstehungsgeschwindigkeit und Regenerationsfähigkeit (POWERS,
2004).
In der Veterinärmedizin werden entzündliche Entmarkungskrankheiten des ZNS oft
durch Virusinfektionen ausgelöst. Klassische Beispiele sind demyelinisierende
Leukoenzephalitiden bei der Hundestaupe und Seehundstaupe sowie die Visna und
Caprine Arthritis-Enzephalitis der Schafe bzw. Ziegen. Beim Menschen kommen
häufig idiopathische bzw. autoimmune Krankheiten, wie die Multiple Sklerose (MS),
vor. Vergleichbar den Prozessen bei der MS werden im fortgeschrittenen Stadium
der Hundestaupe T-zellvermittelte immunpathologische Prozesse für den
progressiven Myelinverlust verantwortlich gemacht. Die Hundestaupe stellt daher ein
spontan auftretendes translationales Tiermodell für humane demyelinisierende
Krankheiten dar (BAUMGÄRTNER und ALLDINGER, 2005).
Möglicherweise spielen verschiedene Noxen und phasenspezifische Prozesse eine
Rolle in der Pathogenese der Entmarkung bei der MS (LUCCHINETTI et al., 2000).
Diese Heterogenität wird für den variablen Therapieerfolg bei MS-Patienten
verantwortlich gemacht (WEINSHENKER et al., 1999). Gegenwärtig wird jedoch
kontrovers diskutiert, ob die Neurodegeneration bei der MS sekundär durch die
Entzündung entsteht oder den primären Auslöser für nachfolgende Immunreaktionen
darstellt (BARNETT und SUTTON, 2006). Beispielsweise führen Oligodendrozyten-
und Axonschäden bei der Theilerschen murinen Enzephalomyelitis (TME) zur
Aktivierung von glialen Zellen, wodurch weitere immunologische Reaktionen initiiert
Vorwort
2
werden (TSUNODA und FUJINAMI, 2002). Neuere Untersuchungen bei der
Hundestaupe verdeutlichen außerdem die bedeutende Rolle von Axonopathien
während der frühen Infektionsphase für die Initiation und Progression der
Demyelinisierung (SEEHUSEN und BAUMGÄRTNER, 2010). Das Verständnis der
initialen neurodegenerativen und immunologischen Vorgänge rückt daher
zunehmend in den Mittelpunkt der Erforschung demyelinisierender Krankheiten in
der Veterinär- und Humanmedizin (BARNETT und PRINEAS, 2004; BARNETT und
SUTTON, 2006; KRONE und GRANGE, 2011).
Einleitung 3
2. Einleitung
2.1. Die Multiple Sklerose und ihre Tiermodelle
MS ist die häufigste demyelinisierende autoimmune ZNS-Erkrankung des Menschen
weltweit (HAFLER, 1999; LUCCHINETTI et al., 2000). Bereits im Jahre 1868 erfolgte
durch den französischen Neurologen Jean-Martin Charcot eine detaillierte
Beschreibung der Symptomatik und der neuropathologischen Befunde der Krankheit
(CLANET, 2008; MURRAY, 2009). Klinisch unterscheidet man bei der MS eine
schubförmig remittierende (relapsing remitting) Verlaufsform, bei der es meistens zur
vollständigen Rekonvaleszenz zwischen den Schüben kommt. Diese Form kann
allerdings sekundär in einen progressiven Krankheitsverlauf übergehen (secondary
progressive; BAR-OR et al., 2000). Weiterhin kommen primär progressive
Verlaufsformen ohne intermittierende Symptomfreiheit (primary progressive) und in
seltenen Fällen akute Formen, die rasch zum Tode führen, vor (HUNTER und
RODRIQUEZ, 1995; PRINEAS et al., 2002). Die primäre Ursache der Krankheit ist
bislang unbekannt. Man nimmt an, dass zur Auslösung der MS eine genetische
Disposition, die die Entstehung von Autoimmunreaktionen erleichtert, und ein
exogener Faktor, wie beispielsweise eine Infektion, der die Immunreaktion induziert,
notwendig sind (BERTI und JACOBSON, 1999). Epidemiologische Studien geben
Hinweise auf den potentiellen Einfluss von Virusinfektionen in der Pathogenese der
MS. Hierbei wurden das Masernvirus, Epstein-Barr-Virus, Herpes-simplex-Virus,
Varizella-Zoster-Virus, Zytomegalievirus, humane Herpesvirus-6, humane T-Zell-
Leukämie-Virus, MS-assoziierte Retrovirus und kanine Staupevirus als
Krankheitsauslöser diskutiert (EBERS et al., 1986; BERTI und JACOBSON, 1999;
WILLER und EBERS, 2000; HAAHR und HÖLLSBERG, 2001; PERRON et al, 1997).
Allerdings konnte keines der genannten Viren in einen direkten kausalen
Zusammenhang mit der MS gebracht werden.
Während in der progressiven MS-Phase zunehmend eine T-zellvermittelte
Autoimmunität zur Myelinzerstörung führt, sind die initialen Vorgänge in der
Pathogenese der Demyelinisierung weitgehend unklar. Verschiedene Prozesse, die
für die progressive Neuroinflammation und Demyelinisierung bei der MS
verantwortlich gemacht werden sind in Abbildung 1 zusammengefasst. Bislang gibt
es nur wenige detaillierte Untersuchungen von frühen MS-Läsionen mit teils
Einleitung 4
widersprüchlichen Resultaten (BARNETT und PRINEAS, 2004; GAY et al. 1997).
Möglicherweise stellt die frühzeitige Apoptose von Oligodendrozyten eine
Grundvoraussetzung für die Läsionsentwicklung im ZNS dar (BARNETT und
PRINEAS, 2004). Außerdem konnte eine mikrogliale Aktivierung bereits vor dem
Auftreten von hypoxischen Veränderungen im prädemyelinisierenden Stadium im
Gehirn von MS-Patienten nachgewiesen werden (MARIK et al., 2010). Diese
Ergebnisse führten zu der Hypothese, dass neurodegenerative Vorgänge und die
Stimulation der unspezifischen (angeborenen) Immunität autoaggressive Prozesse
initiieren und damit eine primäre Rolle in der Pathogenese der Entmarkung spielen
(GANDHI et al., 2010; BARNETT und SUTTON, 2006).
Histologisch finden sich bei der MS entzündlich-degenerative Veränderungen in der
weißen Substanz des Gehirns und Rückenmarks, die durch plaqueförmige T-Zell-
und Makrophageninfiltrate mit primärem Myelinverlust gekennzeichnet sind. In der
progressiven MS-Phase kommt es außerdem zu diffusen entzündlichen Reaktionen
mit generalisierter Mikrogliaaktivierung sowie sekundärer Demyelinisierung durch
axonale Schäden (Abbildung 1; ADAMS et al., 1989; HALFER und WEINER, 1995;
LASSMANN et al., 2007; TSUNODA und FUJINAMI, 2002). Die Veränderungen in
der weißen Substanz bei der MS lassen sich anhand histologischer Kriterien in vier
verschiedene Gruppen unterteilen (LASSMANN et al., 2001). Die Gruppe I ist durch
eine T-zell- und makrophagendominierte Entzündungsreaktion gekennzeichnet. In
Läsionen der Gruppe II finden sich vermehrt Immunglobulin- und
Komplementablagerung, was für eine Mitbeteiligung der humoralen Immunantwort in
der Pathogenese spricht. Für die Veränderungen der Gruppe III, welche durch einen
selektiven Verlust des myelinassoziierten Glykoproteins und oligodendrogliale
Apoptosen gekennzeichnet sind, werden eine sekundäre hypoxische Genese oder
virale Infektionen als Ursachen diskutiert. In den selten vorkommenden Läsionen der
Gruppe IV liegen Zonen mit oligodendroglialen Nekrosen in der Nähe von aktiven
Demyelinisierungsherden, so dass hier ätiopathogenetisch ein toxisches Geschehen
angenommen wird (LUCCHINETTI et al., 2000).
Einleitung 5
Abbildung 1. Pathogenesemodell der Multiplen Sklerose. T-Zellen werden in peripheren lymphatischen Organen durch unbekannte Antigene stimuliert. Die T-Zellaktivierung führt zu einer Expression von Adhäsionsmolekülen an der Bluthirnschranke und damit zur Migration von Immunzellen in das zentrale Nervensystem. Innerhalb des Neuroparenchyms werden T-Zellen durch die Präsentation von Myelinbestandteilen durch Mikrogliazellen und Makrophagen reaktiviert. Dieser Prozess führt zu einer vermehrten Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Chemokinen, wodurch es zu einer weiteren Öffnung der Bluthirnschranke und vermehrten Infiltration von Entzündungszellen kommt. Aktivierte Lymphozyten, Makrophagen und Mikrogliazellen sezernieren myelintoxische und axonschädigende Substanzen, wie beispielsweise Proteasen, Tumor-Nekrose-Faktor- und reaktive Sauerstoffverbindungen. Außerdem kommt es durch myelinspezifische Autoantikörper durch autoaggressive B-Zellklone und durch Komplementablagerungen zum progressiven Myelinverlust (modifiziert nach BARANZINI, 2004). IL = Interleukin, IFN- = Interferon-, MHC = Haupthistokompatibilitätsantigen, ROS = reaktive Sauerstoffverbindungen, TNF- = Tumor-Nekrose-Faktor-, TZR = T-Zellrezeptor.
Aufgrund der Diversität der MS-Läsionen (Gruppe I-IV) und der damit vermutlich
verbundenen unterschiedlichen Noxen sind in der Forschung verschiedene
Tiermodelle notwendig (Tabelle 1). Anhand dieser Modelle können unterschiedliche
Aspekte der De- und Remyelinisierung untersucht werden.
Einleitung 6
Tabelle 1: Tiermodelle für die Multiple Sklerose
Modell Referenz
Virale Modelle
Natürlich vorkommende Infektionskrankheiten
Hundestaupe BAUMGÄRTNER und ALLDINGER, 2005
Visna der Schafe SIGURDSSON et al., 1957
Experimentelle Infektionskrankheiten
Murines Coronavirus (JHM-Stamm)-Infektion HERNDON et al., 1975
Semliki forest virus-Infektion FAZAKERLEY et al., 1983
Theilersche murine Enzephalomyelitis THEILER, 1934
Immunpathologische Modelle
Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis
ROBOZ-EINSTEIN, 1959
Galaktozerebrosid-Antikörper- und Komplement-induzierte Demyelinisierung
WOODRUFF und FRANKLIN, 1999
Bacillus Calmette-Guérin-induzierte Hypersensitivität
SHOENFELD und ARON-MAOR, 2000
Toxische Modelle
Cuprizon-induzierte Demyelinisierung MATSUSHIMA und MORELL, 2001
Ethidiumbromid-induzierte Demyelinisierung WOODRUFF und FRANKLIN, 1999
Lysolecithin-induzierte Demyelinisierung WOODRUFF und FRANKLIN, 1999
Genetische Modelle
PLP-Mutation (rumpshaker und jimpy mouse)
BAUMANN und PHAM-DINH, 2001
MBP-Mutation (shiverer mouse) BAUMANN und PHAM-DINH, 2001
Galaktozerebrosidase-Mutation (twitcher mouse)
SUZUKI und SUZUKI, 1983
MBP = basisches Myelinprotein; PLP = Myelin-Proteolipid-Protein; JHM = John Howard Mueller
Bei viralen Tiermodellen werden spontan auftretende und experimentelle
Krankheiten unterschieden. Die Demyelinisierung bei der natürlich vorkommenden
Staupeenzephalitis des Hundes weist deutliche Parallelen mit MS-Läsionen auf und
ermöglicht daher die Untersuchung virusinduzierter immunpathologischer Prozesse
(siehe Kapitel 2.2; ALLDINGER et al., 1993; DAL CANTO und RABINOWITZ, 1982;
Einleitung 7
BAUMGÄRTNER und ALLDINGER, 2005; SEEHUSEN et al., 2007; SEEHUSEN und
BAUMGÄRTNER, 2010; STOHLMANN und HINTON, 2001; KOESTNER, 1975;
COOK et al., 1978; HODGE und WOLFSON, 1997). Tierexperimentelle Studien an
Labornagern, wie die TME (siehe Kapitel 2.3) und die murine Hepatitisvirusinfektion
erlauben darüber hinaus hypothesengestützte Analysen unter standardisierten
Bedingungen (HERNDON et al., 1975; TSUNODA und FUJINAMI, 1996;
STOHLMAN und HINTON, 2001; ULRICH et al., 2006a,b). Bei der chronischen
demyelinisierenden TME verursacht die Virusinfektion eine initiale Schädigung des
Nervensystems, woraufhin sich eine CD4+-T-zellvermittelte Immunreaktion gegen
Virusepitope und später gegen Myelinbestandteile entwickelt (CLATCH et al., 1986;
BORROW et al., 1998; DI ROSA und BARNABA, 1998; VANDERLUGT et al., 1998;
MILLER et al., 2001). Die TME entspricht daher klinisch der primär progressiven
Verlaufsform der MS und den Gruppen I und II der histologischen MS-Klassifizierung
(Tabelle 2; LUCCHINETTI et al., 2000; TSUNODA und FUJINAMI, 1996). Da bei der
TME je nach Virusstamm und bei der murinen Hepatitisvirusinfektion ein hoher Anteil
von virusinduzierten Oligodendrozytenuntergängen in den demyelinisierten Herden
auftreten, können durch diese experimentellen Infektionen auch Aspekte der
Gruppen III und IV der MS untersucht werden (Tabelle 2; LANE und BUCHMEIER,
1997; ZOECKLEIN et al., 2003, MATTHEWS et al., 2002; STOHLMAN und HINTON,
2001). Bei der Experimentellen Autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) wird
durch die Immunisierung mit Myelinbestandteilen (z.B. durch basisches Myelinprotein
[MBP], Myelin-Proteolipid-Protein [PLP], Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein
[MOG] oder Ganglioside) in Mäusen, Ratten, Meerschweinchen, Kaninchen und
Affen eine autoimmune Demyelinisierung in der weißen Substanz ausgelöst.
Alternativ kann eine Entmarkung durch den adoptiven Transfer von ZNS-
spezifischen autoaggressiven T-Zellen in Versuchstieren induziert werden (DE-
CARVALHO et al., 1999). Das Tiermodell dient daher primär der Untersuchung von
autoimmunen Abläufen bei der MS. Die EAE entspricht klinisch der schubweise
remittierenden Form der MS. In Abhängigkeit vom Versuchsaufbau kann sie
allerdings auch primär progressiv verlaufen (GOLD et al., 2006; TSUNODA und
FUJINAMI, 1996). Die EAE wird entweder der MS-Gruppe I oder II nach
LUCCHINETTI et al. (2000) zugeordnet (Tabelle 2). Zusätzlich werden toxische
Tiermodelle zur Erforschung demyelinisierender Krankheiten eingesetzt (EDGAR et
al., 2004; ROUSSARIE et al., 2007). Hierbei wird die Demyelinisierung entweder
Einleitung 8
durch die orale Gabe (z.B. Cuprizon) oder durch die direkte stereotaktische Injektion
von toxischen Substanzen (z.B. Ethidiumbromid, Lysolecithin oder
Lipopolysaccharid) in das ZNS induziert (FELTS et al., 2005; MATSUSHIMA und
MORELL, 2001; TORKILDSEN et al., 2008; WOODRUFF und FRANKLIN, 1999).
Die toxischen Demyelinisierungen sind auf die selektive Schädigung der
Oligodendrozyten oder deren Vorläuferzellen zurückzuführen, wodurch diese
Vorgänge den Gruppen III und IV der MS nach LUCCHINETTI et al., (2000)
entsprechen (Tabelle 2). Durch die systemischen und lokal toxischen Prozesse
können außerdem Axonopathien und gliale Funktionen standardisiert untersucht
werden. Das Cuprizon-Modell eignet sich zusätzlich besonders gut zur Untersuchung
von Remyelinisierungsvorgängen im murinen Gehirn (BEDARD et al., 2007;
LINDNER et al., 2008).
Genetische Modelle basieren auf knock-out-Mäusen, wie den shiverer-Mutanten
(MBP-Defekt) oder rumpshaker-Mutanten (PLP-Defekt), die jeweils durch einen
Gendefekt eine fehlerhafte Ausbildung der Myelinscheiden aufweisen (BAUMANN
und PHAM-DINH, 2001, EDGAR et al., 2004; ROUSSARIE et al., 2007). Aufgrund
der klar definierten Veränderung kann die Bedeutung des entsprechenden Proteins
für den Erhalt einer normal strukturierten und funktionstüchtigen Myelinscheide
untersucht werden.
Tabelle 2: Einteilung der Multiplen Sklerose in vier Gruppen mit den repräsentativen Tiermodellen (modifiziert nach LUCCHINETTI et al., 2000)
MS-Gruppen Mechanismus Experimentelle Tiermodelle
I T-zell- und makrophagen-vermittelte Demyelinisierung
TME, EAE
II Antikörper- und Komplement- vermittelte Demyelinisierung
TME, EAE
III Oligodendrogliopathie und Apoptose
TME, MHV, toxische Mausmodelle*
IV primäre oligodendrogliale Degeneration
TME, MHV, toxische Mausmodelle*
TME: Theilersche murine Enzephalomyelitis; EAE: Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis; MHV: Murine Hepatitisvirusinfektion; * toxische Mausmodelle mit Cuprizon, Ethidiumbromid, Lysolecithin oder Lipopolysaccharid
Einleitung 9
2.2. Die Hundestaupe
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der gegenwärtige Stand der Literatur über
die Hundestaupe in einem Übersichtsartikel zusammengefasst. Ein besonderer
Schwerpunkt des Manuskriptes ist die ZNS-Manifestation der Krankheit unter
besonderer Berücksichtigung von immunpathologischen Prozessen bei der
demyelinisierenden Leukoenzephalomyelitis (Publikation 1, Anhang 11.1).
Das Hundestaupevirus (canine distemper virus, CDV) gehört zur Familie der
Paramyxoviridae und stellt ein behülltes, einzelsträngiges RNS-Virus mit negativer
Polarität dar. Das Genus Morbillivirus umfasst neben dem Virus der Hundestaupe,
das Seehundstaupevirus (phocine distemper virus, PDV), das Masernvirus, das
Rinderpestvirus und das Virus der Pest der kleinen Wiederkäuer. Aus
Meeressäugetieren wurden außerdem das Delphin-Morbillivirus und Schweinswal-
Morbillivirus isoliert (PRINGLE, 2000). Das Wirtsspektrum des CDV umfasst
verschiedene Familien von terrestrischen Karnivoren (Fissipedia) und
Wasserraubtierspezies (Pinnipedia; BAUMGÄRTNER et al., 2003). Das PDV führt zu
einer systemischen und zentralnervösen Infektion beim Seehund und weist
molekular und in pathogenetischer Hinsicht große Übereinstimmung mit dem CDV
auf (BEINEKE et al., 2006; KENNEDY, 1998). Die klinischen und pathologischen
Befunde der Hundestaupe wurden erstmals im Jahr 1809 von Edward Jenner
umfassend beschrieben (JENNER, 1809). Nach dem Entdecker der Virusätiologie
Henri Joseph Carré wird die Krankheit auch als Carrésche Krankheit bezeichnet
(maladie de Carré; CARRÉ, 1905; FANKHAUSER, 1982).
Der Lymphotropismus des CDV und die damit einhergehende Immunsuppression
während der akuten Phase der Hundestaupe basiert vermutlich auf der Interaktion
von viralen Hüllproteinen mit dem Zelloberflächenmolekül CD150 (signaling
lymphocyte activation molecule, SLAM; LAN et al., 2005; LANGEDIJK et al., 2011;
VON MESSLING et al., 2006; WENZLOW et al., 2007; ZIPPERLE et al., 2010).
CD46 und Nectin-4 werden als alternative Rezeptoren für den Eintritt des CDV in
CD150-negative bzw. nicht-lymphatische Zellen diskutiert (MÜHLEBACH et al.,
2011; SAWATSKY et al., 2012; SUTER et al., 2005). CD9 stellt einen potentiellen
Kofaktor für die Infektion dar, welcher die Expression der Virusrezeptormoleküle
verstärkt (SINGETHAN et al., 2006; SCHMID et al., 2000). Die ZNS-Manifestation
Einleitung 10
der CDV- und vermutlich auch der PDV-Infektion hängt vom Virusstamm sowie vom
Alter und Immunstatus des Tieres ab. Generell werden eine Polioenzephalitis und
eine Leukoenzephalitis unterschieden. Das CDV gelangt hämatogen in das ZNS und
breitet sich unter anderem über den Liquor im Neuroparenchym aus. Bislang ist
unklar, ob eine aufsteigende Infektion über die Riechnerven, wie sie bei Musteliden
beschrieben wurden, auch unter natürlichen Bedingungen beim Hund möglich ist
(RUDD et al., 2006). Ein besonderes Merkmal der CDV-Infektion ist die kurze und
transiente kortikale Infektion des Großhirns vor dem Auftreten der zerebellären
Entmarkung (VANDEVELDE und KRISTENSEN, 1977, SUMMERS et al., 1984). Das
CDV infiziert eine Vielzahl residenter Zellen des ZNS (ORLANDO et al., 2008).
Hierbei findet sich in der frühen Infektionsphase eine bevorzugte Infektion von saures
Gliafaserprotein (glial fibrillary acidic protein, GFAP)-exprimierenden Astrozyten
(MUTINELLI et al., 1989), während immature Vimentin+-Astrozyten in
fortgeschrittenen Läsionen die primäre Zielzelle des Virus darstellen (SEEHUSEN et
al., 2007). Eine Vorraussetzung für die Erregerpersistenz in der demyelinisierenden
Phase ist die nicht-lytische Infektion von Astrozyten (PLATTET et al., 2007; WYSS-
FLUEHMANN et al. 2010). Eine neuronale Infektion wird hauptsächlich bei der CDV-
induzierten Polioenzephalitis beobachtet (NESSELER et al., 1999). Hierbei liegt eine
restriktive Infektion der Neuronen vergleichbar der Infektion von Oligodendrozyten
bei der demyelinisierenden Form der Hundestaupe und der subakut sklerosierenden
Panenzephalitis des Menschen vor (NESSELER et al., 1997; ZURBRIGGEN et al.,
1986, 1987a,b). Detaillierte Studien über die Virusausbreitung und -verteilung im
ZNS sowie über den Zelltropismus bei der Seehundstaupe liegen bislang nicht vor.
Die Polioenzephalitis stellt eine seltene Manifestation der Hundestaupe dar und
umfasst die old dog encephalitis, Einschlusskörperchen-Enzephalitis und
postvakzinale Enzephalitis. Die Läsionen finden sich bevorzugt im Großhirnkortex
und in den Kerngebieten des Stammhirnes (NESSELER et al., 1999). Histologisch ist
die Polioenzephalitis durch neuronale Nekrosen mit Neuronophagie und Mikrogliose
sowie durch eine Infiltration von Makrophagen und T-Lymphozyten gekennzeichnet
(NESSELER et al., 1997; VON RÜDEN et al., 2011). Die demyelinisierende
Leukoenzephalomyelitis ist die häufigste ZNS-Manifestation der Hundestaupe
(KOESTNER, 1975; COOK et al., 1978; HODGE und WOLFSON, 1997;
BAUMGÄRTNER und ALLDINGER, 2005). Die Myelinveränderungen finden sich
überwiegend in der weißen Substanz des Kleinhirns (Pedunculus cerebellaris und
Einleitung 11
Velum cerebri) und seltener in der weißen Substanz des Großhirns und des
Rückenmarks. Aufgrund der Virusausbreitung über den Liquor kann außerdem
häufig eine periventrikuläre Entmarkung bei betroffenen Tieren nachgewiesen
werden (BAUMGÄRTNER et al., 1989; BATHEN-NÖTHEN et al., 2008).
Im Abhängigkeit vom Immunstatus der Hunde werden unterschiedliche Stadien der
Läsionen beobachtet, welche eine Progression von akuten Herden mit lediglich
glialer Aktivierung bis hin zu chronisch entzündlichen Entmarkungen darstellen
(WÜNSCHMANN et al., 1999, McCULLOUGH et al., 1974a,b). In der akuten
Infektionsphase werden hierbei hauptsächlich virusvermittelte Zellveränderungen
beobachtete, während im weiteren Krankheitsverlauf zunehmend
immunpathologische Prozesse dominieren (Abbildung 2; SUMMERS und APPEL,
1994; VANDEVELDE und ZURBRIGGEN, 2005). Neuere Untersuchungen bei der
Hundestaupe zeigen, dass axonale Schäden in akuten Läsionen bereits vor der
Demyelinisierung auftreten. Durch die Axonopathien werden Gliazellen aktiviert und
dadurch möglicherweise Myelinschäden und immunpathologische Prozesse in der
weißen Substanz hervorgerufen (IMBSCHWEILER et al., 2012; SEEHUSEN und
BAUMGÄRTNER, 2010). Die frühzeitige Aktivierung der Mikroglia und die
Freisetzung von Chemokinen (insbesondere Interleukin [IL]-8) bewirkt außerdem
eine Immigration von CD8+-T-Zellen in das CDV-infizierte ZNS. Hierdurch wird
einerseits die Virusmenge reduziert, andererseits aber die weiße Substanz durch
zytotoxische Prozesse initial geschädigt (Abbildung 2; TIPOLD, 1999;
WÜNSCHMANN et al., 1999). Die zunehmende Expression des
Haupthistokompatibilitätskomplex-Klasse II-Antigens (MHC-II) in Verbindung mit
einer abnehmenden Virusmenge spricht für das Vorliegen von virusunabhängigen
immunpathologischen Prozessen während der chronischen Entmarkungsphase
(ALLDINGER et al., 1996). Neben einer CD8-vermittelten Zytotoxizität und CD4-
vermittelten Hypersensitivitätsreaktion werden hierbei toxische Faktoren von
aktivierten Mikrogliazellen/Makrophagen (bystander demyelination) für die
Myelinzerstörung verantwortlich gemacht (Abbildung 2; STEIN et al., 2008, 2011;
VANDEVELDE und ZURBRIGGEN, 2005). Eine gesteigerte phagozytotische
Aktivität und Produktion von reaktiven Sauerstoffverbindungen durch mikrogliale
Zellen (respiratory burst) und die humorale Immunantwort führen ebenfalls zur
Schädigung von Oligodendrozyten und der Myelinscheiden bei der Hundestaupe
(VANDEVELDE und ZURBRIGGEN, 2005; STEIN et al., 2006, 2007).
Einleitung 12
Abbildung 2. Biphasischer Verlauf der demyelinisierenden Staupeenzephalitis. Im akuten Stadium der Hundestaupe finden sich direkt durch das Virus hervorgerufene Myelinschäden. Astrozyten stellen hierbei die primäre Zielzelle des Hundestaupevirus dar. Zusätzlich gibt es Hinweise auf eine restriktive Infektion und metabolische Dysfunktion von Oligodendrozyten in Verbindung mit einer reduzierten Transkription von myelinspezifischen Genen. Darüber hinaus kommt es durch die virusinduzierte Aktivierung der Mikroglia zur Freisetzung von reaktiven Sauerstoffverbindungen (respiratory burst) und einer CD8-vermittelten Zytotoxizität, wodurch die weiße Substanz initial geschädigt wird. Im chronischen Stadium dominieren immunpathologische Prozesse. Durch die Viruspersistenz werden Typ IV-Überempfindlichkeitsreaktionen ausgelöst und myelintoxische Substanzen durch aktivierte Mikrogliazellen (bystander demyelination) freigesetzt. Außerdem findet sich eine Zytotoxizität durch CD8+-T-Zellen. Die pathologische Bedeutung der myelinspezifischen Autoimmunität im fortgeschrittenen Krankheitsstadium der demyelinisierenden Staupeenzephalitis bleibt spekulativ.
Da die Entmarkung in CDV-infizierten Hunden allerdings bereits vor dem Verlust von
Oligodendrozyten auftritt wird die Bedeutung der Oligodendrogliopathie als primärer
Prozess in der Pathogenese der demyelinisierenden Leukoenzephalitis kontrovers
diskutiert (SCHOBESBERGER et al., 1999, 2002). Durch die Freisetzung von
Myelinbestandteilen werden myelinspezifische autoreaktive Lymphozyten und
Autoantikörper (epitope spreading) im Verlauf der Hundestaupe induziert
(Abbildung 2; KRAKOWKA et al., 1973; WÜNSCHMANN et al., 2000). Allerdings ist
bislang unklar, ob die Autoimmunität maßgeblich an der Entmarkung beteiligt ist oder
lediglich ein Epiphänomen ohne pathogenetische Bedeutung darstellt (KRAKOWKA
et al., 1973; CERRUTI-SOLA et al., 1983; RIMA et al., 1991; VANDEVELDE et al.,
1986). Mit Repopulation der peripheren lymphatischen Organe (ca. 7 Wochen nach
der Infektion) finden sich vermehrt perivaskuläre Infiltrate mit CD4+-T-Zellen und B-
Einleitung 13
Zellen im Gehirn der erkrankten Hunde (VANDEVELDE et al., 1981, 1982;
WÜNSCHMANN et al., 2000). Nachfolgend wird eine Differenzierung von
Plasmazellen mit intrathekaler Antikörperproduktion beobachtet, welche für die
beschleunigte Myelinzerstörung in der chronischen Phase der CDV-induzierten
Leukoenzephalitis verantwortlich gemacht wird (VANDEVELDE und ZURBRIGGEN,
2005; VANDEVELDE et al., 1981, 1982, 1986; ALLDINGER et al., 1996).
2.3. Die Theilersche murine Enzephalomyelitis
Das Theilersche murine Enzephalomyelitisvirus (Theiler’s murine encephalomyelitis
virus, TMEV) ist ein unbehülltes RNS-Virus (Familie Picornaviridae, Genus
Cardiovirus; PEVEAR et al., 1987; RACANIELLO, 2001). Nach intrazerebraler
Infektion induzieren die hochvirulenten Stämme GDVII und FA eine tödlich
verlaufende Polioenzephalitis (THEILER, 1937; THEILER und GARD, 1940; LIPTON,
1980; MONTEYNE et al., 1997; TSUNODA et al., 1996). Im Gegensatz hierzu rufen
die schwachvirulenten Daniels (DA)- und BeAn-Stämme eine Polioenzephalitis mit
einer sich anschließenden demyelinisierenden Leukoenzephalomyelitis hervor
(DANIELS et al., 1952; LIPTON, 1975 und 1980; LIPTON und DAL CANTO, 1979;
ULRICH et al., 2006b).
Der Genotyp der Mäusestämme bestimmt maßgeblich, ob die Infektion nach der
Phase der akuten Polioenzephalitis überwunden wird oder es zu einer
demyelinisierenden Leukoenzephalomyelitis kommt. Zu den hochempfindlichen
Mäusestämmen, welche zur Ausbildung der chronischen Krankheitsphase neigen,
zählen die SJL-, FVB/N- und DBA/2-Populationen, während CBA-, C3H- und AKR-
Mäuse als wenig empfindliche Mäusestämme angesehen werden. Resistente
Mäusestämme stellen C57BL/6- und Balb/c-Populationen dar, welche das TMEV
nach der akuten Phase eliminieren und eine stabile Immunität ausbilden (LIPTON
und DAL CANTO, 1979; MONTEYNE et al., 1997; BRAHIC et al., 2005). Die
Resistenz gegen die Viruspersistenz wird von verschiedenen Genen gesteuert. Die
stärkste Auswirkung hat das H-2D-Gen (LIPTON und MELVOLD, 1984; BRAHIC et
al., 2005). Mäusestämme mit dem Haplotyp H-2f,p,q,r,s,v sind demnach empfänglich.
Die Viruspersistenz wird bei Mäusen mit dem H-2d,b,k-Haplotyp, welcher dominant
vererbt wird, unterbunden. Bei diesen Mäusen kommt es zur frühzeitigen MHC-I-
abhängigen Zytotoxizität gegen das immundominante Virusepitop VP3159-166
Einleitung 14
(RODRIGUEZ et al., 1986; BORROW et al., 1992; MONTEYNE et al., 1997).
Virusspezifische zytotoxische T-Zellen lysieren über die Sezernierung von Perforin
und/oder Granzym infizierte Oligodendrozyten und sorgen auf diese Weise für eine
deutliche Reduktion des Virusgehaltes im ZNS bei empfindlichen Mäusestämmen
bzw. für die vollständige Eliminierung des Virus in resistenten Mäusestämmen. Diese
T-Zellen erkennen hauptsächlich die drei TMEV-Peptide VP1233-250, VP274-86 und
VP324-37 (GERETY et al., 1994; YAUCH und KIM, 1994). Bei C57BL/6-Mäusen ist
drei Tage post infectionem eine deutliche, gegen das VP2-Protein gerichtete
zytotoxische CD8-T-Zellantwort messbar. Im Vergleich hierzu zeigt sich bei
empfänglichen SJL-Mäusen eine nur schwach ausgeprägte zytotoxische T-
Zellantwort (LINDSLEY et al., 1991; BEGOLKA et al., 2001). ZOECKLEIN et al.
(2003) zeigten bei TMEV-infizierten SJL-Mäusen außerdem eine deutlich höhere
Anzahl CD4+-Th1-Zellen in der frühen Infektionsphase (sieben Tage post
infectionem) im Vergleich zu infizierten C57BL/6-Mäusen. Die Untersuchungen
verdeutlichen die besondere Bedeutung der frühen Infektionsphase für die Initiation
und Progression der virusinduzierten Entmarkung. Interessanterweise zeigen
Makrophagen bzw. Mikroglia von resistenten C57BL/6-Mäusen keine Produktion von
myelinzerstörenden Faktoren, wie beispielsweise Tumor-Nekrose-Faktor (TNF)-
und freie Radikale (LIUZZI et al., 1995). Eine Zusammenfassung der
Unterscheidungskriterien zwischen empfindlichen SJL- und resistenten C57BL/6-
Mäusen findet sich in Tabelle 3. Der Vergleich immunologischer Prozesse in TMEV-
infizierten empfindlichen und resistenten Mäusestämmen ermöglicht die Identifikation
von Faktoren, welche die protektive antivirale Immunität beeinflussen und damit eine
virusbedingte Immunpathologie fördern.
Einleitung 15
Tabelle 3: Vergleich verschiedener immunologischer Parameter und pathologischer Veränderungen bei der Theilerschen murinen Enzephalomyelitis in SJL- und C57BL/6-Mäusen
Mäusestamm SJL C57BL/6
Referenz
Viruspersistenz ja nein LIPTON und DAL CANTO, 1979
Akute Polioenzephalitis ja ja LIPTON und DAL CANTO, 1979
Demyelinisierende Leukomyelitis ja nein LIPTON, 1975
H-2-Haplotyp H-2f,p,q,r,s,v H-2 d,b,k RODRIGUEZ et al., 1986
Effektorzellen CD4+-Zellen CD8+-Zellen RODRIGUEZ et al., 1991
Zytotoxische CD8+-T-Zellen wenige sehr viele LINDSLEY et al., 1991
Autoreaktive CD4+-T-Zellen vorhanden nicht vorhanden KATZ-LEVY et al., 2000
Apoptotische Zellen in Frühphase viele sehr viele JELACHICH und LIPTON, 1996; TSUNODA et al., 1997
Apoptotische Zellen in Spätphase wenige keine JELACHICH und LIPTON, 1996; TSUNODA et al., 1997
Typ-IV Hypersensitivität ja nein CLATCH et al., 1986
epitope spreading ja nein MILLER et al., 1997
Die hochvirulenten Erregerstämme besitzen einen ausgeprägten neuronalen
Zelltropismus, während schwachvirulente Stämme vorwiegend mit glialen Zellen
interagieren. Das Viruskapsid der schwachvirulenten BeAn- und DA-Stämme hemmt
eine interneuronale Virusausbreitung und begünstigt somit die Erregerpersistenz im
ZNS (REDDI und LIPTON, 2002; SHAH und LIPTON, 2002). Das virale L*-Protein,
welches ausschließlich von schwachvirulenten Stämmen gebildet wird, hemmt die
Apoptose der Wirtszelle und begünstigt damit ebenfalls eine chronische Infektion
(MICHIELS et al., 1995; GHADGE et al., 1998; BRAHIC et al., 2005). Eine
entscheidende Voraussetzung für die progressive Entmarkung bei der TME ist die
Viruspersistenz in der weißen Substanz (LINDSLEY et al., 1991). DAL CANTO und
LIPTON (1982) zeigten mittels Immunhistologie, dass Makrophagen bzw. Mikroglia
die größten Virusmengen während der chronischen Phase aufweisen. Allerdings
finden sich in der Literatur unterschiedliche bzw. widersprüchliche Angaben zur
TMEV-Persistenz. So konnten AUBERT et al. (1987) mittels in situ-Hybridisierung
eine vorwiegende Infektion von Oligodendrozyten nachweisen, während ZHENG et
al. (2001) Astrozyten als die dominierende Zellpopulation für die Virusreplikation in
Einleitung 16
der späten Phase identifizierten. Obwohl die schwachvirulenten TMEV-Stämme eine
93%ige Homologie ihrer Aminosäuresequenzen besitzen, bestehen große
Unterschiede bezüglich der induzierten Demyelinisierung und des klinischen
Verlaufes. Der DA-Stamm ruft eine im Vergleich zum BeAn-Stamm deutlich stärkere
Polioenzephalitis hervor. Im weiteren Verlauf der Erkrankung weisen aber BeAn-
infizierte Mäuse früher als DA-infizierte Mäuse Entmarkungsprozesse und
neurologische Symptome auf (OLESZAK et al., 2004). In Abhängigkeit vom
verwendeten schwachvirulenten TMEV-Stamm findet sich eine virusbedingte
Schädigung der Oligodendrozyten oder eine autoreaktive Zerstörung der
Myelinscheiden (ZOECKLEIN et al., 2003). Der DA-Stamm infiziert verstärkt
Oligodendrozyten, wodurch es zur Degeneration und Nekrose der Zellen kommt.
Außerdem wird eine oligodendrogliale Apoptose durch zytotoxische T-Zellen
ausgelöst (BRAHIC et al., 2005; RODRIGUEZ et al., 1983; ZOECKLEIN et al., 2003).
Der BeAn-Stamm besitzt hingegen einen ausgeprägten Tropismus für
Mikrogliazellen/Makrophagen, wodurch eine persistente Infektion begünstigt wird.
Hierdurch kommt es zu einer fortwährenden Antigenpräsentation mit
Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ und Myelinopathien (OLESZAK
et al., 2004).
Nach intrazerebraler Infektion mit den schwachvirulenten DA- oder BeAn-Stämmen
erfolgt die Virusausbreitung im Hippocampus, Kortex und den Ventralhörnern des
Rückenmarks hauptsächlich über die Axone (BRAHIC und ROUSSARIE, 2009; DAL
CANTO und LIPTON, 1982; RODRIGUEZ et al., 1983; STROOP et al., 1981;
TSUNODA et al., 2003). Hierbei werden neuronale Apoptosen bzw. Nekrosen und
eine lymphohistiozytäre Meningoenzephalitis beobachtet (OLITSKY und
SCHLESINGER, 1941; STROOP et al., 1981; LIPTON et al., 1994; TSUNODA und
FUJINAMI, 2002; TSUNODA et al., 2003; ZOECKLEIN et al., 2003). In diesem
Krankheitsstadium kann eine Infiltration von CD4+-T-Zellen, CD8+-T-Zellen und
Makrophagen sowie von einzelnen B-Lymphozyten und Plasmazellen in die graue
und weiße Substanz nachgewiesen werden (DRESCHER et al., 1997; DAL CANTO
und LIPTON, 1982; LIPTON, 1975; MURRAY et al., 1998; OLESZAK et al., 1995;
POPE et al., 1996; ULRICH et al., 2006b). Neben Zelluntergängen sieht man eine
verminderte Transkription von myelinassoziierten Genen in infizierten
Oligodendrozyten (OZDEN et al., 1993). Weiterhin exprimieren TMEV-infizierte
Astrozyten IL-1, IL-6, TNF- und IFN- (MASSA et al., 1986; PALMA et al., 2003;
Einleitung 17
ZEINSTRA et al., 2000), wodurch eine Öffnung der Bluthirnschranke und Induktion
von entzündlichen Reaktionen in der Frühphase entsteht (DONG und BENVENISTE,
2001). Mikrogliazellen/Makrophagen begünstigen durch die vermehrte Expression
von MHC-II und kostimulierenden Faktoren (z.B. B7-1, B7-2, CD40) ein pro-
inflammatorisches Milieu im ZNS (BORROW et al., 1992; DRESCHER et al., 1997;
POPE et al., 1998; KATZ-LEVY et al., 2000). Die Sekretion von IFN- fördert
außerdem die verstärkte Migration von Makrophagen und Aktivierung von
Mikrogliazellen, welche ihrerseits über die Produktion von myelintoxischen
Substanzen (z.B. TNF-) und freien Radikalen zum progressiven Myelinverlust
beitragen (bystander demyelination; CLATCH et al., 1986; LIPTON et al., 2005;
MILLER et al., 2001; TSUNODA und FUJINAMI, 2002; ULRICH et al., 2006b).
Infolge der Freisetzung von Myelinbestandteilen ist im weiteren Krankheitsverlauf
zusätzlich eine myelinspezifische Autoimmunität nachweisbar (epitope spreading),
was deutliche Parallelen zur MS des Menschen zeigt (CLATCH et al., 1986;
DRESCHER et al., 1997; MILLER et al., 2001; TSUNODA und FUJINAMI, 2002;
ZOECKLEIN et al., 2003; LIPTON et al., 2005). Molekulares Mimikry (molecular
mimicry) wird als eine weitere Ursache für die myelinspezifische Autoimmunität
diskutiert (OLSON et al., 2001; CROXFORD et al., 2002). Hierbei erkennen
zytotoxische T-Zellen Epitope, die sowohl auf körpereigenen Proteinen des infizierten
Wirtes vorkommen als auch von Mikroorganismen gebildet werden. Aufgrund
struktureller Ähnlichkeiten werden immunologische Kreuzreaktionen zwischen Virus
und Wirtszelle hervorgerufen (OLSON et al., 2001; OLESZAK et al., 2004;
TSUNODA et al., 2006). Während der späten chronischen TME-Phase kann ein
Rückgang der entzündlichen Reaktionen im Neuroparenchym nachgewiesen werden
(LIPTON et al., 1994; ULRICH et al., 2006a). Vergleichbar mit den Verhältnissen bei
der MS kommt es allerdings aufgrund einer Dysfunktion von
Oligodendrozytenvorläuferzellen und der intraläsionalen Ablagerung von
extrazellulärer Matrix nur zu einer unvollständigen Remyelinisierung im Rückenmark
der infizierten Tiere (HAIST et al., 2012; KUMNOK et al., 2008; ULRICH et al., 2008).
Bei empfindlichen Mäusestämmen können nach intrazerebraler Infektion mit dem
BeAn-Stamm die ersten klinischen Symptome ca. ab dem 30. Versuchstag
nachgewiesen werden. Im Vergleich hierzu treten nach Infektion mit dem DA-
Stamm die ersten Bewegungsstörungen erst 140-180 Tage post infectionem auf,
welche schwerwiegender sind als die durch das BeAn-TMEV verursachten
Einleitung 18
Symptome (CLATCH et al., 1990; JELACHICH et al., 1995; OLESZAK et al., 2004;
QI und DAL CANTO, 1996; STROOP et al., 1981; TSUNODA und FUJINAMI, 1996;
ZOECKLEIN et al., 2003). Die Ataxien können sich bei schwer erkrankten Tieren bis
hin zu spastischen Lähmungen entwickeln. Die Tiere zeigen ein deutlich reduziertes
Allgemeinbefinden, Harninkontinenz und Gewichtsabnahme (LIPTON et al., 1994).
Die Infektion mit dem DA-Stamm führt bei C57BL/6-Mäusen in der akuten Phase zu
neuronalen Schäden und anfallsartigen neurologischen Symptomen und dient daher
als Tiermodell zur Untersuchung der Pathogenese entzündungsbedingter Epilepsien
(KIRKMAN et al., 2010; LIBBEY et al., 2008).
2.4. Die Theilersche murine Enzephalomyelitis als translationales Modell für Entmarkungskrankheiten
Die TME und Hundestaupe stellen experimentelle bzw. spontan auftretende
Tiermodelle für humane demyelinisierende Krankheiten dar. Trotz unterschiedlicher
Infektionswege finden sich bei TMEV- und Morbillivirusinfektionen vergleichbare
neuropathologische und immunpathologische Prozesse (Publikation 1, Anhang
11.1; OLESZAK et al., 2004; VANDEVELDE und ZURBRIGGEN, 2005). Während
die neurovirulenten TMEV-Stämme (GDVII, FA) und der CDV-Synder-Hill-Stamm
primär Polioenzephalitiden auslösen, sind Infektionen mit schwachvirulenten TMEV-
Stämmen (BeAn, DA) bei der Maus und den CDV-Genotypen R252 und A75-17 beim
Hund mit Veränderungen in der weißen Substanz im fortgeschrittenen Stadium
vergesellschaftet. Außerdem geht der Entmarkung durch die schwachvirulenten
TMEV- und CDV-Stämme ebenfalls eine transiente Infektion von Neuronen im
Großhirn voraus (SUMMERS et al., 1984). Aufgrund der neuronalen Infektion
während der akuten Phase stellen die Picornavirus- und Morbillivirusinfektionen
interessante Ansätze zur Untersuchung von neurodegenerativen Prozessen bei
entzündungsbedingten Epilepsien dar (JAFARI et al., 2012; KIRKMAN et al., 2010;
LIBBEY et al., 2008; VON RÜDEN et al., 2011). Außerdem ergibt sich hieraus die
Hypothese, dass die akute kortikale Infektion eine Voraussetzung für die
Demyelinisierung in der Spätphase darstellt. Insbesondere das Auftreten von
axonalen Schäden in der prädemyelinisierenden Phase der Hundestaupe
(SEEHUSEN und BAUMGÄRTNER, 2010; IMBSCHWEILER et al., 2012) und der
TME (TSUNODA und FUJINAMI, 2002; KREUTZER et al., 2012) führt zu
Einleitung 19
Myelinveränderungen (inside-out-model) und zur Aktivierung von Gliazellen, wodurch
potentiell immunpathologische Prozesse im weiteren Verlauf der Krankheiten
induziert werden.
Neben den virusstammspezifischen Eigenheiten wird der klinische Verlauf bei
Morbillivirus- und Picornavirusinfektionen durch den Immunstatus und das Alter der
Tiere maßgeblich beeinflusst (OLESZAK et al., 2004). Eine ineffektive antivirale
Immunität begünstigt die Persistenz der Viren im ZNS, wodurch ein biphasischer
Krankheitsverlauf entsteht. Für das TMEV wurde eine restriktive Expression viraler
Proteine (CASH et al., 1985; STAVROU et al., 2010) bzw. eine begrenzte Produktion
von infektiösem Virus beschrieben (JELACHICH und LIPTON, 1999, 2001; LIPTON
et al., 2005). Vergleichbar hiermit konnte eine restriktive Infektion bei der CDV- und
Masernvirusinfektion als Mechanismus der Viruspersistenz festgestellt werden
(LIEBERT et al., 1990; NESSELER et al., 1999; ZURBRIGGEN et al., 1987a,b).
Durch die permanente Antigenstimulation kommt es bei den experimentellen und
spontanen Krankheiten zu einer CD4-vermittelten Hypersensitivität im ZNS und
Sekretion von myelintoxischen Substanzen durch aktivierte Mikroglia (bystander
demyelination), wodurch progressiv fortschreitende Demyelinisierungen entstehen
(OLESZAK et al., 2004; STEIN et al., 2004, 2006, 2007, 2008; WÜNSCHMANN et
al., 1999). Außerdem führt eine CD8-vermittelte Zytotoxizität bei der TME und
Hundestaupe zur Viruselimination, allerdings werden zusätzlich Schädigungen des
Neuroparenchyms hervorgerufen (TIPOLD et al., 1999; RIVERA-QUINOUES et al.,
1998). Vergleichbar mit den Abläufen bei der TME kann bei der Hundestaupe durch
epitope spreading eine myelinspezifische Autoimmunität im fortgeschrittenen
Stadium nachgewiesen werden (KRAKOWKA et al., 1973; CERRUTI-SOLA et al.,
1983).
Die experimentelle Infektion der Maus mit dem CDV ruft lediglich eine
Polioenzephalitis ohne Myelinverlust hervor, sodass dieses Infektionsmodell keine
Untersuchung von Entmarkungskrankheiten erlaubt (BENCSIK et al., 1996). Die
TME bietet hingegen die Möglichkeit einer hypothesengestützten, wissenschaftlichen
Aufarbeitung von Fragestellungen, welche bei spontanen morbillivirusinduzierten
Entmarkungskrankheiten in dieser Form nicht durchgeführt werden können.
Außerdem ist es möglich, mittels der am Mausmodell erhaltenen Ergebnisse,
zielgerichtete weitergehende Untersuchungen durchzuführen und entsprechende
Einleitung
20
therapeutische Ansätze für chronische virale Infektionskrankheiten in der Tier- und
Humanmedizin zu entwickeln.
Konzept und Ziele 21
3. Konzept und Ziele
Die Hundestaupe und die TME stellen spontan auftretende bzw. experimentelle
Modelle für demyelinisierende Krankheiten dar. Während die Demyelinisierung im
chronischen Stadium der MS durch immunpathologische Prozesse hervorgerufen
wird, sind die immunologischen und neurodegenerativen Abläufe während der
Initialphase dieser Krankheit weitgehend unklar (BARNETT und PRINEAS, 2004;
HENDERSON et al., 2009). Insbesondere die Rolle der Mikroglia und infiltrierender
Leukozyten bei der Initiation von Entmarkungsprozessen wird gegenwärtig
kontrovers diskutiert, da sowohl gewebeschädigende als auch neuroprotektive
Effekte durch die Neuroinflammation beschrieben werden (GANDHI et al., 2010;
SRIRAM, 2011). Während der akuten Phase der Hundestaupe und Seehundstaupe
werden entzündliche Reaktionen im Großhirn durch die direkte Interaktion des Virus
mit residenten Zellen des ZNS hervorgerufen. Zur Charakterisierung von
erregerinduzierten immunpathologischen Prozessen wurde in den vorliegenden
Arbeiten daher die Initialphase bei Morbillivirusinfektionen untersucht. Basierend auf
der hieraus abgeleiteten Hypothese, dass eine Dysregulation der Immunhomöostase
durch Virusinfektionen während der akuten Krankheitsphase immunpathologische
Prozesse initiiert, wurden anschließend neuropathologische Vorgänge und
immunologische Parameter unter experimentellen Bedingungen bei der TME, als
Mausmodell für virusinduzierte Entmarkungskrankheiten, analysiert. Hierbei sollten
Faktoren identifiziert werden, welche die progressive Demyelinisierung begünstigen.
Im Einzelnen standen folgende Ziele im Mittelpunkt der Arbeiten:
Detaillierte Beschreibung der neuropathologischen Veränderungen bei
virusinduzierten Enzephalitiden unter Berücksichtigung des zeitlichen und
räumlichen Auftretens von Myelinveränderungen und der Vergleichbarkeit der
pathologischen Befunde im Gehirn von TMEV-infizierten Mäusen mit der
Läsionsentwicklung bei der MS und morbillivirusinduzierten ZNS-Krankheiten.
Vergleichende Betrachtung der Expression von pro- und
antiinflammatorischen Zytokinen während der Initialphase von spontan
auftretenden und experimentellen Entmarkungskrankheiten und Identifikation
Konzept und Ziele
22
von spezifischen Zytokinsignaturen, die im Zusammenhang mit einer
ineffektiven antiviralen Immunantwort stehen.
Phänotypisierung der zellulären Immunantwort im ZNS bei virusinduzierten
Enzephalitiden. Ein besonderer Aspekt war hierbei die Untersuchung der
Bedeutung von regulatorischen T-Zellen für die Krankheitsprogression.
Identifikation von spezifischen Reaktionsmustern von Mikrogliazellen infolge
von Virusinfektionen und neurodegenerativen Prozessen. Hierzu wurde in
Analogie zu den Untersuchungen bei viralen Krankheiten die Funktion der
Mikroglia im traumatisierten Rückenmark und in organotypischen spinalen
Schnittkulturen in vitro beim Hund sowie im toxischen Entmarkungsmodell bei
der Maus bestimmt.
Charakterisierung des Einflusses des peripheren Immunsystems auf die
Initiation der Neuroinflammation und Überprüfung der Hypothese einer
Kompartimentalisierung der Immunantwort im ZNS bei der TME mittels
Genexpressionsanalysen.
Klärung der Frage, inwieweit neurodegenerative Prozesse residente Zellen
und immunmodulatorische Vorgänge im ZNS beeinflussen. Hierzu wurde in
einem weiteren experimentellen Ansatz der toxische Effekt von Cuprizon auf
den klinischen Verlauf und die spinale Entmarkung bei der TME untersucht.
Die Ergebnisse stellen einen Beitrag zur Pathogeneseforschung virusinduzierter
Entmarkungskrankheiten dar. Im Hinblick auf zukünftige immunmodulatorische
Strategien und Zelltransplantationen zur Therapie von chronischen ZNS-Krankheiten
sollen die Arbeiten Aufschluss über die Bedeutung der Immunregulation für den
Verlauf von demyelinisierenden Krankheiten geben.
Darstellung der Ergebnisse und Diskussion 23
4. Darstellung der Ergebnisse und Diskussion
4.1. Entzündungsreaktion im Großhirn während der akuten Phase von Morbillivirusinfektionen (Publikation 2, Anhang 11.2; Publikation 3, Anhang 11.3; Publikation 4, Anhang 11.4)
Die demyelinisierende Leukoenzephalitis bei der Hundestaupe ist durch einen
biphasischen Krankheitsverlauf mit immunpathologischen Prozessen im chronischen
Stadium gekennzeichnet. Hierbei kann häufig eine transiente Virusinfektion des
Großhirns während der Frühphase festgestellt werden (NESSELER et al., 1997;
SUMMERS et al., 1984). Im Gegensatz zur CDV-induzierten Polioenzephalitis finden
sich hierbei allerdings keine peripheren Leukozyteninfiltrationen, sodass sich diese
Gehirnregion zur gezielten Untersuchung von direkt virusvermittelten Veränderungen
eignet. Die initiale Infektion des zerebralen Kortex stellt möglicherweise eine
Voraussetzung für nachfolgende immunologische Reaktionen und Entmarkungen im
Kleinhirn der Tiere dar. Weiterhin werden neuronale Dysfunktionen im Großhirn bei
der Staupeenzephalitis für kognitive Störungen und Epilepsien bei infizierten Hunden
verantwortlich gemacht (VON RÜDEN et al., 2011). Allerdings sind die zerebralen
immunologischen Abläufe bei der Hundestaupe bislang weitgehend unklar. Ziel der
Studie (Publikation 2, Anhang 11.2) war daher die Induktion von pro- und
antiinflammatorischen Zytokinen und assoziierte phänotypische Veränderungen im
Großhirn bei der CDV-Infektion näher zu untersuchen. Um universelle
Reaktionsmuster von residenten ZNS-Zellen und Parallelen in der
Neuroinflammation bei verschiedenen Morbillivirusinfektionen zu detektieren, wurde
in einem weiteren Ansatz die zelluläre Immunantwort im Großhirn von PDV-
infizierten Seehunden phänotypisiert (Publikation 3, Anhang 11.3; Publikation 4,
Anhang 11.4).
4.1.1. Zytokinexpression in frühen, nicht-demyelinisierenden Herden des Großhirns bei der Hundestaupe (Publikation 2, Anhang 11.2)
Zur Charakterisierung der akuten zerebralen immunologischen Reaktionen bei der
Hundestaupe wurden die Großhirne von 14 CDV-infizierten Hunden mit einer
gleichzeitig auftretenden Demyelinisierung im Kleinhirn und von vier CDV-negativen
Hunden ohne neurologische Erkrankungen (Kontrolltiere) histologisch untersucht
Darstellung der Ergebnisse und Diskussion 24
sowie die Virusverteilung und zelluläre Immunreaktion mittels CDV-, CD3 (T-Zellen)-,
CD4 (T-Helferzellen)-, CD8 (zytotoxische T-Zellen)-, MHC-II (antigenpräsentierende
Zellen)-, GFAP (Astrozyten)- und BS-1 (Mikroglia/Makrophagen)-spezifischen
Markern immunhistologisch bzw. lektionhistochemisch bestimmt. Der Virusgehalt und
die mRNS-Expression von IL-1β, IL-2, IL-6, IL-10, IL-12, IFN-, TNF- und TGF-β
wurde mittels RT-qPCR quantifiziert.
Trotz des molekularbiologischen Nachweises einer zerebralen CDV-Infektion konnte
histologisch keine Entzündung oder Demyelinisierung im Großhirn der infizierten
Hunde nachgewiesen werden. Mittels Immunhistologie wurde das Virus vorwiegend
in Neuronen, Astrozyten und Endothelzellen lokalisiert. Unterschiede in der Anzahl
und Verteilung der Lymphozytenpopulationen zwischen CDV-infizierten Hunden und
Kontrolltieren lagen nicht vor. Als Ausdruck einer mikroglialen Aktivierung und
vermehrten Antigenpräsentation fand sich eine signifikante positive Korrelation
zwischen der MHC-II-Expression und dem Virusgehalt. Weiterhin führte die CDV-
Infektion zu einer verstärkten Genexpression der proinflammatorischen Zytokine IL-6,
IL-8, IL-12 und TNF- durch residente Zellen des ZNS. Im Gegensatz dazu zeigten
die immunregulatorischen Zytokine IL-10 und TGF-β durch die Infektion keinen
signifikanten Anstieg. Die nicht detektierbare Transkription von IL-1, IL-2 und IFN-
stellte die Folge der fehlenden Infiltration von peripheren Immunzellen dar.
Fazit: Die Ergebnisse der Studie sprechen für das Vorliegen einer Expression
proinflammatorischer Zytokine durch residente Zellen des Großhirns. Die erhaltene
Integrität des Nervengewebes trotz virusbedingter glialer Veränderungen verdeutlicht
die essentielle Bedeutung zusätzlicher Faktoren, wie beispielsweise die Öffnung der
Bluthirnschranke, für die Entstehung einer CDV-spezifischen Neuropathologie
(GRÖTERS et al., 2005; MIAO et al., 2003). Weiterhin müssen bei der Interpretation
duale Funktionen der Zytokine berücksichtigt werden. Beispielsweise besitzen IL-6
und TNF- neben ihren proinflammatorischen Eigenschaften zusätzliche
neuroprotektive Funktionen, wie die Prävention von Entmarkungen und neuronalen
Schäden (CAMPBELL, 1998; CARLSON et al., 1999; SAWADA et al., 1995).
Allerdings kann ein Zusammenhang der beschriebenen zerebralen Veränderungen
mit neurodegenerativen Prozessen, insbesondere mit Axonopathien, in der
prädemyelinisierenden Phase der Hundestaupe nicht ausgeschlossen werden
(MOLL et al., 2008; PIRKO et al., 2007; SEEHUSEN und BAUMGÄRTNER, 2010;
TSUNODA et al., 2003; TSUNODA und FUJINAMI, 2002). Zur Klärung der Frage
Darstellung der Ergebnisse und Diskussion 25
inwieweit die Neurodegeneration zur mikroglialen Aktivierung beiträgt, wurde die
Zytokinexpression bei traumatischen Rückenmarkverletzungen beim Hund und in
kaninen organotypischen spinalen Schnittkulturen in vitro analysiert (Publikation 5,
Anhang 11.5). Weiterhin wurde die Bedeutung pro- und antiinflammatorischer
Zytokine für die Initiation und Progression von virusbedingten
Entmarkungskrankheiten in experimentellen Ansätzen bei der TME näher untersucht
(Publikation 9, Anhang 11.9; Publikation 11, Anhang 11.11).
4.1.2. Charakterisierung von Antikörpern für die immunhistologische Detektion von hämatopoetischen Zellen beim Seehund (Publikation 3, Anhang 11.3)
Da keine speziesspezifischen Leukozytenmarker für den Seehund vorlagen, wurden
in einer Pilotstudie zunächst 30 monoklonale (mAk) und acht polyklonale Antikörper
(pAk) verschiedener Spezies auf Ihre Kreuzreaktivität mit formalinfixierten und
paraffineingebetteten lymphatischen Geweben des Seehundes mittels
Immunhistologie getestet. Sechs mAk und acht pAk zeigten eine spezifische
Reaktion. T-Zellen und regulatorische T-Zellen wurden mittels anti-CD3 pAk bzw.
anti-Foxp3 mAk im Parakortex der Lymphknoten nachgewiesen. B-Zellen wurden mit
einem anti-CD79 mAk vorwiegend in Lymphfollikeln markiert. Subpopulationen von
Plasmazellen kreuzreagierten mit anti-Immunglobulin (Ig)A, anti-IgG und anti-IgM
pAk sowie Kappa- und Lambda-Leichtketten-spezifischen pAk und konnten in den
Marksträngen, Sinus und germinativen Zentren der Lymphknoten lokalisiert werden.
Histiozytäre Zellen wurden mit Lysozym-, myeloid/histiocytic-Antigen (MAC387)- und
CD68-spezifischen Markern detektiert. Weiterhin lag die Expression von S100 (pAk)
vorwiegend in dendritischen Zellen vor. Vergleichbar mit dem Reaktionsmuster beim
Schweinswal konnte mittels eines bovinen mAk eine MHC-II-Expression in der
Mehrheit reifer Immunzellen nachgewiesen werden (BEINEKE et al., 2001; BEINEKE
et al., 2007; BEINEKE et al., 2010). Die Verteilung der verschiedenen
Leukozytenpopulationen im phozinen Gewebe wies weitreichende
Übereinstimmungen mit der in anderen terrestrischen und marinen Säugetieren auf
(ROMANO et al., 1992; DEGUISE et al., 1997).
Fazit: Die Charakterisierung spezifischer Marker erlaubt den gezielten Nachweis
verschiedener Leukozytenpopulationen und stellt damit die Grundlage für die
Darstellung der Ergebnisse und Diskussion 26
Phänotypisierung der Entzündungsreaktion im ZNS von PDV-infizierten Seehunden
in Publikation 4 (Anhang 11.4) dar.
4.1.3. Virusproteinexpression und Phänotypisierung der zellulären Immunantwort im Großhirn bei der Seehundstaupe (Publikation 4, Anhang 11.4)
Für die Analyse von zerebralen Veränderungen während der Frühphase der
Seehundstaupe wurden die Gehirne von 28 PDV-infizierten Seehunden und zwei
Seehunden ohne neurologische Erkrankungen (Kontrolltiere) histologisch untersucht.
Zum Vergleich der pathologischen Prozesse wurden in Analogie zu den
Untersuchungen bei der akuten Hundestaupe (Publikation 2, Anhang 11.3)
infiltrierende Leukozyten und gliale Reaktionen im Großhirn der Seehunde
immunhistologisch phänotypisiert. Zur Untersuchung der Hypothese einer restriktiven
Virusinfektion, wie sie bei der Hundestaupe und humanen Masernvirusinfektion
vorkommt (MANCHESTER et al., 1999; NESSELER et al., 1999), wurde außerdem
die Expression und Verteilung der viralen Nukleo (N)-, Phospho (P)-, Matrix (M)- und
Hämagglutinin (H)-Proteine sowie der N- und P-mRNS mittels Immunhistologie bzw.
in situ-Hybridisierung ermittelt.
Bei der histologischen Untersuchung konnte eine Polioenzephalitis mit
Gliaaktivierung, Neuronennekrosen und viralen Einschlusskörperchen festgestellt
werden. Frühe Herde waren lediglich durch eine gliale Reaktion mit MHC-II-
Aufregulation gekennzeichnet (Läsionstyp I). Im weiteren Verlauf kam es zu einer
vermehrten Infiltration von CD3+-T-Zellen in das Neuroparenchym (Läsionstyp II). In
perivaskulären Infiltraten fanden sich hierbei vorwiegend CD3+-T-Zellen und BS-1+-
und MAC387+-Makrophagen in Verbindung mit einer prominenten MHC-II-
Expression. CD79+-B-Zellen wurden nur sehr vereinzelt im Gehirn der Seehunde
detektiert. Die positive Korrelation zwischen dem Virusgehalt und der Anzahl
verschiedener Leukozytenpopulationen spricht für eine virusspezifische
Immunreaktion im ZNS der infizierten Tiere. Mittels Doppelmarkierung fand sich
PDV-Antigen vorwiegend in Neurofilament-exprimierenden Neuronen. In den
Entzündungsherden lag eine Expression der viralen N-, P-, M-, F- und H-Proteine
vor. Vergleichbar mit den Prozessen bei der Hundestaupe (ALLDINGER et al., 1993)
konnte eine deutlich reduzierte Expression der viralen M- und F-Proteine in
hochgradig entzündeten Arealen nachgewiesen werden. Weiterhin ergaben sich
durch den Vergleich der viralen Proteine und mRNS Hinweise auf eine gestörte
Darstellung der Ergebnisse und Diskussion 27
Virustranslation. Eine reduzierte Virussynthese durch Antigenmodulation oder
Mutationen im Virusgenom kann im Gehirn von masernvirusinfizierten Patienten und
bei der CDV-Infektion nachgewiesen werden (BACZKO et al., 1988; CATTANEO et
al., 1986; FUJINAMI und OLDSTONE, 1980; HO und BABIUK, 1979; MÜLLER et al.,
1995; NESSELER et al., 1999).
Fazit: Die Ergebnisse verdeutlichen, dass die PDV-Infektion von Neuronen initial zu
einer glialen Stimulation führt. Dies weist Ähnlichkeiten mit der Aktivierung residenter
Zellen im CDV-infizierten Kortex während des Frühstadiums der Hundestaupe auf
(Publikation 2, Anhang 11.2). Die geringe Infiltration peripherer Immunzellen in der
Frühphase entsteht sehr wahrscheinlich, wie bei der Hundestaupe, durch die
virusinduzierte Immunsuppression (KRAKOWKA et al., 1980; WÜNSCHMANN et al.,
1999). Mit Einsetzen der Infiltration von peripheren Leukozyten zeigten die PDV-
induzierten Veränderungen deutliche Parallelen mit der CDV- und
masernvirusinduzierten Polioenzephalitis des Hundes bzw. des Menschen. Weiterhin
unterstützen die Ergebnisse die Hypothese einer gestörten Virusproteinexpression
als potentiellen Mechanismus der Erregerpersistenz bei der Seehundstaupe
(BACZKO et al., 1988; NESSELER et al., 1999). Die pathogenetische Bedeutung
des Zelltropismus von Viren für die Entstehung von Demyelinisierungen im Gehirn
wurde bei der experimentellen TMEV-Infektion in Publikation 7 (Anhang 11.7) und
Publikation 9 (Anhang 11.9) untersucht.
Darstellung der Ergebnisse und Diskussion 28
4.2. Mikrogliaaktivierung und Zytokinexpression während der initialen Phase von primär degenerativen Erkrankungen des zentralen Nervensystems (Publikation 5, Anhang 11.5)
Zur Untersuchung der Hypothese, dass residente Gliazellen durch
neurodegenerative Prozesse aktiviert werden und eine essentielle Rolle in der
Pathogenese der Gewebeschädigung spielen, wurden zunächst 1) morphologische
und molekulare immunologische Veränderungen im Verlauf von
Bandscheibenvorfällen beim Hund untersucht und 2) die Rolle immunologisch aktiver
Gliazellen im traumatisierten Rückenmark und in einem in vitro-System vergleichend
analysiert. Traumatische Rückenmarksschäden durch Bandscheibenvorfälle beim
Hund sind eine der häufigsten neurologischen Erkrankungen in der Veterinärmedizin.
Gegenwärtig wird die Rolle der spinalen Entzündungsreaktion kontrovers diskutiert,
da sowohl gewebeschädigende als auch neuroprotektive Effekte beschrieben
werden (BARTHOLDH und SCHWAB, 1997; BOMSTEIN et al., 2003; PAN et al.,
2002; POPOVICH et al., 1997; TYOR et al., 2002). Verschiedene Zytokine besitzen
in diesem Zusammenhang entzündungs- und regenerationsfördernde Eigenschaften.
Organotypische Schnittkulturen vom Rückenmark stellen ein wichtiges Modell zur
Bestimmung der Aktivität von residenten Gliazellen dar und haben im Gegensatz zu
dissoziierten Gewebekulturen den Vorteil einer erhaltenen Gewebearchitektur.
Insgesamt wurden das Rückenmark von 17 Hunde mit Bandscheibenvorfällen und
zehn Hunde ohne neurologische Erkrankungen (Kontrolltiere) sowie organotypische
Schnittkulturen vom kaninen Rückenmark untersucht. Die Gewebeschäden wurden
zunächst histologisch klassifiziert. Weiterhin wurden infiltrierende Immunzellen und
residente Gliazellen durch spezifischer Marker für T-Zellen (CD3), regulatorische T-
Zellen (Foxp3), B-Zellen (Pax5), antigenpräsentierende Zellen (MHC-II) und
Makrophagen (MAC387) immunhistologisch detektiert und die mRNS-Expression
von IL-6, IL-8, IL-10, TNF- und TGF-β mittels RT-qPCR quantifiziert. Die
immunhistologischen Untersuchungen zeigten, dass korrespondierend zur
vermehrten Anzahl an Myelinophagen eine signifikante Aufregulierung des MHC-II-
Antigens in der subakuten Gruppe (>5 Tage nach Bandscheibenvorfall) vorlag.
Anhand ihrer Morphologie handelte es sich bei den MHC-II-exprimierenden Zellen
überwiegend um Mikroglia/Makrophagen. Auf molekularer Ebene wurde im
traumatisierten Rückenmark bereits in der akuten Phase (1-4 Tage nach
Bandscheibenvorfall) eine signifikante Aufregulierung der proinflammatorischen
Darstellung der Ergebnisse und Diskussion 29
Zytokine IL-6 und IL-8 sowie eine Tendenz zur Aufregulierung von TNF-
beobachtet. Die Expression von IL-6 und TNF- näherte sich in der subakuten
Gruppe wieder dem Wert der Kontrolltiere an, während IL-8 eine konstant hohe
Expression in beiden traumatisierten Gruppen im Vergleich zu den Kontrollen zeigte.
Im Gegensatz dazu blieb die Expression neuroprotektiver Zytokine unverändert (IL-
10) oder zeigte eine verzögerte Aufregulierung (TGF-ß) in der subakuten Gruppe.
Makrophagen aus dem peripheren Blut, dargestellt mittels des MAC387-Antikörpers,
waren in geringer Anzahl lediglich in Blutungsherden der akuten Gruppe
nachweisbar. CD3+-T-Lymphozyten, Foxp3+-regulatorische T-Zellen und Pax5+-B-
Lymphozyten waren sowohl im traumatisierten Rückenmark als auch in den
Kontrolltieren lediglich sehr vereinzelt nachweisbar.
Die sich daraus ergebende Hypothese, dass residente Zellen eine entscheidende
Rolle bei der Immunantwort des traumatisierten Rückenmarkes spielen, wurde mit
Hilfe des in vitro-Systems der organotypischen Schnittkulturen überprüft. Hier
waren zu keinem Zeitpunkt MAC387+-Makrophagen aus dem peripheren Blut
nachweisbar. Allerdings fanden sich auch hier ab dem dritten Tag in Kultur vermehrt
MHC-II-exprimierende Gitterzellen, deren Anzahl bis zum neunten Tag in Kultur
zunahm. Im Hinblick auf die Zytokinexpression war eine ab Tag 3 nachweisbare und
im Gegensatz zu den Ergebnissen in vivo bis zum Tag 9 andauernde Aufregulierung
proinflammatorischer Zytokine feststellbar, während das antiinflammatorische Zytokin
IL-10 lediglich eine transiente Expressionszunahme an Tag 3 zeigte. Die im
Vergleich zum traumatisierten Rückenmark verlängerte Expression potentiell
neurotoxischer Entzündungsmediatoren in vitro deutet auf das Vorliegen intrinsischer
Regulationsmechanismen in vivo hin, die einer lang anhaltenden Expression
proinflammatorischer Mediatoren entgegenwirken.
Fazit: Möglicherweise kommt es zu einem zytokininduzierten Wechsel ortständiger
Mikroglia in einen neurotoxischen Phänotyp. Vergleichbar den Prozessen bei
virusbedingten neurologischen Krankheiten (Publikation 2, Anhang 11.2) fungiert
die frühzeitig einsetzende, traumainduzierte Expression proinflammatorischer
Zytokine hierbei potentiell als Auslöser für in späteren Phasen auftretende
immunologische Reaktionen. Zur weiteren Klärung der Bedeutung
neurodegenerativer Prozesse für das Mikromilieu im ZNS wurde der Einfluss des
Neurotoxins Cuprizon auf das murine Rückenmark und auf den Verlauf der spinalen
Darstellung der Ergebnisse und Diskussion 30
Demyelinisierung bei der TME in Publikation 10 (Anhang 11.10) und Publikation 11
(Anhang 11.11) untersucht.
4.3. Entzündungsreaktionen während der akuten und chronischen Phase der experimentellen Theilerschen murinen Enzephalomyelitis (Publikation 6, Anhang 11.6; Publikation 7, Anhang 11.7; Publikation 8, Anhang 11.8)
Die experimentelle Infektion von Mäusen mit dem TMEV führt zu einer chronischen
Entmarkung im Rückenmark, welche große Ähnlichkeiten mit der chronisch
progressiven Form der MS und der Entmarkung bei der Hundestaupe und
Seehundstaupe aufweist. Allerdings liegen nur wenige Informationen über die
Virusverteilung und Läsionsentwicklung im Gehirn bei der TME vor. Ziel der Studie
war daher die Identifikation von topographischen Unterschieden in der
Virusausbreitung und Entzündungsreaktion sowie der Axonopathien und
Demyelinisierungen im Gehirn von experimentell TMEV-infizierten SJL- und
C57BL/6-Mäusen (Publikation 6, Anhang 11.6; Publikation 7, Anhang 11.7). Zur
Klärung der Bedeutung der initialen immunologischen Prozesse bei viralen
Enzephalitiden wurde eine Phänotypisierung der Immunzellen und
Zytokinquantifizierung im Gehirn der Mäuse vorgenommen (Publikation 8, Anhang
11.8). Außerdem wurden Genexpressionsanalysen der peripheren lymphatischen
Organe bei der TME durchgeführt (Publikation 9; Anhang 11.9).
4.3.1. Herstellung und Charakterisierung eines Theilervirus-spezifischen Antikörpers (Publikation 6, Anhang 11.6)
In einer Pilotstudie wurde ein polyklonaler Antikörper zum Nachweis des TMEV
hergestellt und charakterisiert. Hierzu wurden Kaninchen mit gereinigtem TMEV vom
BeAn-Stamm immunisiert. Die Spezifität des Antikörpers wurde mittels Western Blot
bestimmt und eine Sequenzanalyse des erkannten Antigens mittels
Massenspektrometrie durchgeführt. Die Spezifität des Postimmunserums wurde
außerdem in TMEV-infizierten L-Zellen mittels Immunfluoreszenz getestet. Zusätzlich
wurden in formalinfixierten und paraffineingebetteten TMEV-infizierten BHK21-
Zellpellets und Gehirngewebe von infizierten Mäusen virales Antigen
immunhistologisch detektiert. Außerdem konnten mittels
Immunelektronenmikroskopie picornavirustypische parakristalline Ansammlungen
Darstellung der Ergebnisse und Diskussion 31
und dissoziierte Viren im Zytoplasma von infizierten BHK21-Zellen nachgewiesen
werden.
Fazit: Die Herstellung des Antikörpers stellte die Grundlage für die
immunhistologischen Untersuchungen zur Virusausbreitung und zum Zelltropismus
bei der TME in Folgearbeiten (Publikation 7, Anhang 11.7; Publikation 8, Anhang
11.8; Publikation 11, Anhang 11.11) dar.
4.3.2. Virusverteilung und Läsionsentwicklung im Gehirn von Theilervirus-infizierten Mäusen (Publikation 7, Anhang 11.7)
Zur Identifikation von topographischen Unterschieden der Läsionsentwicklung im
Gehirn wurden empfindliche SJL- und resistente C57BL/6-Mäuse experimentell mit
dem TMEV infiziert. Die Virusverteilung wurde mittels Immunhistologie und in situ-
Hybridisierung detektiert und der Phänotyp der infizierten Zellen mittels
Immunfluoreszenz dargestellt. Entzündungsreaktionen und Demyelinisierungen
wurden histologisch in definierten Gehirnregionen semiquantitativ ausgewertet und
die Anzahl von Mikrogliazellen bzw. Makrophagen und infiltrierenden T-Lymphozyten
mittels CD107b- und CD3-spezifischer Immunhistologie bestimmt. Des Weiteren
wurde die Expression von phosphoryliertem und nicht-phosphoryliertem
Neurofilament (NF) sowie des β-Amyloid Vorläufermoleküls zur Charakterisierung
zugrundeliegender axonaler Schäden immunhistologisch ermittelt.
Während der frühen Infektionsphase fand sich eine vorwiegende Infektion von
Neuronen und Astrozyten im Gehirn. Zusätzlich konnte eine transiente Infektion des
Ependyms festgestellt werden. Die sich anschließende Infektion der periventrikulären
Region des vierten Ventrikels war mit einer entzündungsbedingten Demyelinisierung
und axonalen Degenerationen in SJL-Mäusen vergesellschaftet. Die frühzeitige
Reduktion von phosphoryliertem NF in Axonen während der prädemyelinisierenden
Phase stellte hierbei eine potentielle Folge der initialen neuronalen Infektion dar.
Während die Intensität der periventrikulären Demyelinisierung und Axonopathien in
der chronischen Phase abnahm, konnte eine anhaltende Entmarkung im Stammhirn
der Tiere nachgewiesen werden. Hierbei lag in empfindlichen Mäusestämmen eine
Viruspersistenz primär in Mikrogliazellen/Makrophagen und Oligodendrozyten vor.
Als Ausdruck einer T-zellvermittelten Immunpathologie fand sich eine Infiltration von
Darstellung der Ergebnisse und Diskussion 32
CD3+-T-Zellen und CD107b+-Mikroglia/Makrophagen in demyelinisierenden
Gehirnregionen.
Fazit: Die periventrikuläre Entmarkung stellt ein bislang nicht beschriebenes
Phänomen bei der TME dar (GOINGS et al., 2008; TROTTIER et al., 2002) und weist
deutliche Ähnlichkeiten mit der Läsionsentwicklung in MS-Patienten sowie bei der
Hunde- und Seehundstaupe auf (ADAMS et al., 1987; MÜLLER et al., 2004). Der
Vergleich von SJL- und C57BL/6-Mäusen zeigt, dass der Wechsel des Zelltropismus
einen essentiellen Faktor für die Viruspersistenz und Demyelinisierung darstellt. Die
transiente Natur der Inflammation in der periventrikulären Region und die
persistierenden Schäden im Stammhirn der Mäuse verdeutlichen außerdem das
Vorkommen von topographischen Unterschieden in der Empfindlichkeit des ZNS
gegenüber virusinduzierten Läsionen und in der Regenerationsfähigkeit des
Neuroparenchyms. In den nachfolgenden Untersuchungen wurden die hiermit
assoziierten immunologischen Prozesse in peripheren lymphatischen Organen
(Publikationen 8) und im Gehirn (Publikation 9) von TMEV-infizierten Mäusen auf
molekularer Ebene näher bestimmt.
4.3.3. Immunreaktionen in peripheren lymphatischen Organen während der Initiation und Progression der Theilerschen murinen Enzephalomyelitis (Publikation 8, Anhang 11.8)
Während der progressiven demyelinisierenden Phase der MS wird eine auf das ZNS
begrenzte Immunreaktion mit intrathekaler Antikörperproduktion für die chronische
Neuroinflammation verantwortlich gemacht (LASSMANN et al., 2007; SERAFINI et
al., 2004). Vergleichbar hiermit konnte bei der TME mittels Genexpressionsanalysen
und Immunhistologie eine lokal im Rückenmark ablaufende Antigenprozessierung
und -präsentation sowie eine Immunglobulinsynthese nachgewiesen werden
(ULRICH et al., 2009). Bislang ist die Bedeutung des peripheren Immunsystems für
die Initiation und Progression der TME allerdings nur wenig untersucht worden.
Zur Charakterisierung der peripheren Immunantwort und Überprüfung der Hypothese
einer kompartimentalisierten Immunantwort im ZNS bei der TME wurden SJL-Mäuse
experimentell infiziert und Genexpressionsanalysen vom Zervikallymphknoten und
der Milz durchgeführt. Die Expression von spezifischen Kandidatengenen wurde
Darstellung der Ergebnisse und Diskussion 33
mittels Immunhistologie verifiziert. Weiterhin wurde das Gehirn und Rückenmark der
Tiere histologisch untersucht und die Virusverteilung immunhistologisch quantifiziert.
Insgesamt konnten 387 differentiell exprimierte Gene im Zervikallymphknoten und
nur sechs Gene in der Milz der infizierten Tiere nachgewiesen werden. Die
deutlichsten Veränderungen in der Genexpression lagen am 14. Versuchstag,
vergesellschaftet mit einer virusinduzierten Polioenzephalitis, vor. Eine nähere
funktionelle Analyse der Daten (functional annotation analysis) zeigte einen
deutlichen Zusammenhang der differentiell exprimierten Gene mit der B-
Zellimmunität, Antigenpräsentation und der Aktivierung des Komplementsystems.
Mittels Immunhistologie konnte eine Akkumulation von CD68+- und Lysozym+-Zellen
im Lymphknoten nachgewiesen werden, welche potentiell ZNS-stämmige
antigenpräsentierende Zellen darstellten. Im Gegensatz zur Frühphase war die späte
demyelinisierende Leukomyelitis mit einer verminderten Genexpression in
Lymphknoten und Milz verbunden. Allerdings konnte im späten chronischen
Krankheitsstadium (196. Versuchstag) eine partielle Reaktivierung der Gene in den
peripheren lymphatischen Organen nachgewiesen werden.
Fazit: Zusammenfassend sprechen die Ergebnisse für eine virusinduzierte Reaktion
in den regionären Lymphknoten des Gehirnes. Möglicherweise stellt die initiale B-
Zellaktivierung eine Voraussetzung sowohl für die antivirale Immunität als auch für
antikörpervermittelte Myelinschäden während der nachfolgenden demyelinisierenden
Phase dar. Die lokal im Gehirn ablaufenden immunologischen Prozesse während der
akuten TME-Phase und deren Bedeutung für die Krankheitsprogression wurden in
Publikation 9 (Anhang 11.9) näher untersucht.
4.3.4. Zytokinexpression und Phänotypisierung der zellulären Immunantwort im Gehirn bei der Theilerschen murinen Enzephalomyelitis (Publikation 9, Anhang 11.9)
Immunregulatorische Lymphozytenpopulationen, wie regulatorische T-Zellen und B-
Zellen, verursachen eine Reduktion der protektiven Immunantwort und begünstigen
dadurch die Viruspersistenz. Hieraus ergibt sich die Hypothese, dass ein
Ungleichgewicht der Zytokinexpression während der frühen Infektionsphase eine
effektive TMEV-spezifische Immunantwort hemmt und dadurch immunpathologische
Prozesse ausgelöst werden. Ziel der Studie war daher eine Analyse der
Darstellung der Ergebnisse und Diskussion 34
phänotypischen Veränderungen und Zytokinexpression im Gehirn während der
akuten Phase der TME. Der Vergleich immunologischer Prozesse im Gehirn von
Mäusen mit einem empfindlichen (SJL) und resistenten (C57BL/6) genetischen
Hintergrund ermöglicht hierbei die Identifizierung von Faktoren, welche eine
Erregerpersistenz begünstigen und virusinduzierte immunpathologische Prozesse
fördern.
Hierzu wurden die Mäuse der beiden Stämme intrazerebral mit dem TMEV vom
BeAn-Stamm infiziert und nach 7 und 14 Tagen untersucht. Mittels Immunhistologie
wurden infiltrierende T-Lymphozyten (CD3), regulatorische T-Zellen (Foxp3) und B-
Lymphozyten (CD45R) sowie die Akkumulation von Mikrogliazellen/Makrophagen
(CD107b) im Großhirn quantifiziert. Durch molekulare Methoden (RT-qPCR) wurde
der Virusgehalt und die Transkription der Foxp3-, TNF--, IFN--, TGF-β-, IL-1-, IL-2-
, IL-10- und IL-12-mRNS ermittelt.
Trotz einer identischen Entzündungsreaktion und Viruskonzentration im Gehirn
zeigte der Vergleich der beiden Mäusestämme eine signifikant erhöhte Infiltration von
Foxp3 -regulatorischen T-Zellen und CD45R -B-Zellen in der frühen Infektionsphase
(7. Versuchstag) bei SJL-Mäusen. Diese Infiltration war mit einer erhöhten
Genexpression von IL-10 im Gehirn der Tiere vergesellschaftet. Interessanterweise
konnte eine anhaltende IL-10-Expression bis zum 14. Versuchstag in Verbindung mit
einer erhöhten Infiltration von CD45R -B-Zellen festgestellt werden. Zu diesem
Zeitpunkt lag eine deutlich reduzierte Anzahl von ZNS-infiltrierenden Foxp3 -T-Zellen
und eine verminderte Foxp3-mRNS-Transkription vor. Im Gegensatz zu resistenten
C57BL/6-Mäusen fand sich in den Gehirnen der SJL-Mäuse weiterhin eine
verzögerte Aufregulation der mRNS-Transkription von TNF-.
+ +
+
+
Die vermehrte
Expression von proinflammatorischen Zytokinen bei resistenten Mäusestämmen war
mit einer beschleunigten Viruselimination und reduzierten Entzündungsreaktion im
weiteren Krankheitsverlauf vergesellschaftet.
Fazit: Die Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass regulatorische T-Zellen in
der initialen Phase der TME ein Ungleichgewicht der Zytokinexpression zugunsten
antiinflammatorischer Mediatoren hervorrufen. Das immunmodulatorische und
immunsuppressive Zytokin IL-10 stellt hierbei potentiell ein Schlüsselmolekül für die
reduzierte bzw. verzögert einsetzende protektive TMEV-spezifische Immunantwort
im Gehirn von SJL-Mäusen dar. Außerdem unterstreichen die Ergebnisse die
entscheidende Bedeutung der frühen akuten Infektionsphase für die Progression der
Darstellung der Ergebnisse und Diskussion 35
Demyelinisierung. Hierbei stellt sich die Frage inwieweit eine Änderung des
Mikromilieus im ZNS immunmodulatorische Prozesse und damit den Verlauf
virusbedingter Entmarkungskrankheiten beeinflusst. Hierzu wurde der Effekt des
Neurotoxins Cuprizon auf die TMEV-induzierte spinale Demyelinisierung in
Publikation 10 (Anhang 11.10) und Publikation 11 (Anhang 11.11) untersucht.
4.4. Einfluss der Cuprizon-induzierten Neurodegeneration auf die spinale Entmarkung bei der Theilerschen murinen Enzephalomyelitis (Publikationen 10, Anhang 11.10; Publikation 11, Anhang 11.11)
Immunpathologische Prozesse werden für die Demyelinisierung in der chronischen
Phase der TME und Hundestaupe verantwortlich gemacht. Im Gegensatz zu primär
autoimmunen Entmarkungskrankheiten, wie beispielsweise der EAE, führt eine
medikamentelle Immunsuppression bei der TME und Morbillivirusinfektionen zu einer
verminderten antiviralen Immunantwort und damit zur Krankheitsexazerbation. Trotz
Induktion von neurodegenerativen Prozessen mit Myelinverlust im Gehirn bewirkt
das Neurotoxin Cuprizon eine klinische Verbesserung bei der EAE. Dieses
Phänomen wird vermutlich durch die Auslösung einer immunologischen Toleranz
infolge der Expansion von myelinspezifischen regulatorischen T-Zellen hervorgerufen
(EMERSON et al., 2001; MANA et al., 2009). Basierend auf der Hypothese, dass
eine spezifische Hemmung der immunpathologischen Prozesse eine klinische
Verbesserung bei virusbedingten Entmarkungskrankheiten hervorruft, wurde in
dieser Studie der Einfluss von Cuprizon auf die spinale Demyelinisierung bei der
TME untersucht.
4.4.1. Neurodegenerative Prozesse im murinen Rückenmark durch Cuprizon (Publikation 10, Anhang 11.10)
Cuprizon induziert einen Myelinverlust vorwiegend im Corpus callosum des Gehirnes
von Mäusen. Der Einfluss der Substanz auf das Rückenmark wurde bisher nur
unzureichend untersucht. Da im TME-Modell hauptsächlich spinale
Demyelinisierungen auftreten, wurde in diesem Teilprojekt zunächst der Effekt des
Neurotoxins auf das murine Rückenmark näher analysiert. Hierzu wurde durch
Cuprizon eine Demyelinisierung im Gehirn von SJL- und C57BL/6-Mäusen
Darstellung der Ergebnisse und Diskussion 36
hervorgerufen. Spinale immunologische und gliale Reaktionen bzw.
Myelinveränderungen wurden mittels Immunhistologie (CD3, CD45R, CD107b,
GFAP, CNPase, MBP, PLP) und RT-qPCR (CD11b, GFAP, CNPase, MBP)
quantifiziert. Außerdem wurden Apoptosen im Neuroparenchym durch die TUNEL-
Methode detektiert. In SJL- und C57BL/6-Mäusen konnte durch Cuprizon keine
spinale Demyelinisierung hervorgerufen werden. Allerdings zeigten behandelte SJL-
Mäuse einen signifikanten Verlust von NogoA -Oligodendrozyten (reife
Oligodendrozyten) in Verbindung mit einer reduzierten MBP-mRNS-Expression im
Rückenmark. Die Veränderungen waren mit einer vermehrten Apoptoseinduktion und
einer verzögerten mikroglialen Aktivierung, charakterisiert durch eine vermehrte
Ansammlung von CD107b -Zellen und CD11b -Expression, vergesellschaftet.
+
+ +
Der transiente Verlauf der toxinbedingten Veränderungen und die fehlende
Demyelinisierung im Rückenmark im Vergleich zum Gehirn sprechen für eine
erhöhte Vulnerabilität von zerebralen Oligodendrozyten gegenüber Cuprizon. Hierbei
muss eine potentielle Neuroprotektion durch Mikrogliazellen im Rückenmark
angenommen werden. Die Ergebnisse unterstützen daher die Hypothese, dass
topographische Unterschiede in der Intensität von Myelinopathien und in der
Regenerationsfähigkeit des ZNS durch intrinsische zelluläre Mechanismen
beeinflusst werden. Außerdem müssen Besonderheiten der einzelnen Mäusestämme
in der Pathogenese von Myelinveränderungen berücksichtigt werden.
Fazit: Die erworbenen Daten stellen die Grundlage für die Untersuchung des
Einflusses von Cuprizon auf den Verlauf der TME in SJL-Mäusen in Publikation 11
(Anhang 11.11) dar. Insbesondere sollte in dieser folgenden Arbeit geklärt werden,
ob die toxinbedingte Aktivierung von residenten ZNS-Zellen einen protektiven Effekt
bei virusbedingten Entmarkungskrankheiten bewirkt oder aber die
Gewebeschädigung zusätzlich verstärkt.
4.4.2. Einfluss von Cuprizon auf immunologische Reaktionen im Rückenmark von Theilervirus-infizierten Mäusen (Publikation 11, Anhang 11.11)
Zur Untersuchung des Einflusses einer toxische Modulation der Entzündungsreaktion
auf den Verlauf virusinduzierter demyelinisierender Krankheiten wurden SJL-Mäuse
mit dem TMEV vom BeAn-Stamm intrazerebral infiziert und für fünf Wochen mit
Cuprizon gefüttert. Die Tiere wurden neurologisch untersucht und an definierten
Darstellung der Ergebnisse und Diskussion 37
Zeitpunkten in der chronischen Phase getötet. Die Demyelinisierung und
Leukomyelitis wurden histologisch gradiert und das Ausmaß des spinalen
Myelinverlustes densiometrisch mittels MBP-spezifischer Immunhistologie ermittelt.
Außerdem wurde die Akkumulation von nicht-phosphoryliertem NF in geschädigten
Axonen und die Virusproteinexpression quantifiziert. Der Phänotyp von Immunzellen
im Rückenmark wurde durch Antikörper gegen CD3 (T-Zellen), Foxp3 (regulatorische
T-Zellen), CD45R (B-Zellen) und CD107b (Mikroglia/Makrophagen)
immunhistologisch bestimmt. Weiterhin wurde die mRNS-Expression des Foxp3-
Gens, der TMEV-RNS und ausgewählter pro (IL-1, IL-2, IL-23, TNF-, IFN-)- und
antiinflammatorischer Zytokine (IL-4, IL-10, TGF-β) mittels RT-qPCR gemessen.
Die orale Gabe von Cuprizon bewirkte eine temporäre Verbesserung der Motorik und
eine Reduzierung der demyelinisierenden Leukomyelitis bei TMEV-infizierten Tieren.
Im Gegensatz hierzu konnten keine quantitativen Veränderungen der Axonopathien
durch die Toxinbehandlung in infizierten Mäusen nachgewiesen werden. Die
Ergebnisse der Immunpänotypisierung und molekularbiologischen Analysen
verdeutlichten, dass die Cuprizon-induzierte Reduktion der Demyelinisierung mit
einer verminderten Ansammlung von Mikrogliazellen/Makrophagen, B-Zellen und T-
Zellen, inklusive regulatorischer T-Zellen, und einer reduzierten Zytokinexpression im
Rückenmark der Tiere einhergeht. Als Ausdruck einer erhaltenen antiviralen
Immunantwort konnte keine vermehrte Virusreplikation und -ausbreitung im ZNS der
Cuprizon-behandelten Mäuse während der TME nachgewiesen werden.
Fazit: Die Untersuchungen zeigen, dass Cuprizon trotz Schädigung des Gehirns
einen entzündungshemmenden Einfluss auf das Rückenmark ausübt und damit eine
klinische Verbesserung bei der TME bewirkt. Im Gegensatz zu rein
immunsuppressiven Therapieansätzen führte das Neurotoxin scheinbar zu einer
selektiven Hemmung der immunpathologischen Prozesse bei erhaltener protektiver
Immunität. Hierdurch blieb eine Virusexazerbation bei den Versuchstieren aus.
Allerdings sind weiterführende Studien notwendig um den neuroprotektiven und
potentiell immunmodulatorischen Effekt von Cuprizon bzw. von Cuprizon-verwandten
Substanzen bei virusinduzierten demyelinisierenden Krankheiten zu verstehen.
Studienübergreifende Diskussion 38
5. Studienübergreifende Diskussion
5.1. Zytokinexpression bei demyelinisierenden Erkrankungen des zentralen Nervensystems
Zytokine vermitteln die Interaktion zwischen Immunzellen und residenten Zellen des
ZNS bei demyelinisierenden Prozessen. Eine Zusammenfassung der wichtigsten
Funktionen von pro- und antiinflammatorischen Zytokinen bei ZNS-Erkrankungen
findet sich in Abbildung 3. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit (Publikation 2,
Anhang 11.2) und vorangegangener Untersuchungen verdeutlichen, dass die
Zytokinexpression während der frühen Infektionsphase der Hundestaupe direkt durch
das CDV hervorgerufen wird (BENCSIK et al., 1996; GRÖNE et al., 2002; MARKUS
et al., 2002). Die Rolle der Zytokine in der Pathogenese der CDV-induzierten
Entmarkung ist in Abbildung 4 schematisch dargestellt. Aufgrund der
Immunsuppression und der dadurch sehr geringen Infiltration peripherer Leukozyten
während des akuten Stadiums handelt es sich hierbei überwiegend um Zytokine
residenter Zellen des ZNS (aktivierte Mikroglia und Astrozyten; GRÖNE et al., 2000;
TIPOLD et al., 1999). Während der transienten zerebralen Infektion und der akuten
demyelinisierenden Phase im Kleinhirn findet sich eine prominente Aufregulation der
proinflammatorischen Zytokine IL-6, IL-8, IL-12 und TNF- (Publikation 2, Anhang
11.2; Markus et al., 2002). Vergleichbar hiermit kann durch die experimentelle
Infektion von Musteliden mit dem neurovirulenten CDV-Snyder-Hill-Stamm eine
vermehrte mikrogliale Aktivierung und reaktive Gliose mit Expression von IL-6, IFN-
und TNF- im Gehirn nachgewiesen werden (RUDD et al., 2010). TNF- und IL-6
induzieren Adhäsionsmoleküle an der Bluthirnschranke und fördern damit die
Leukozytenextravasation in das ZNS (WEBB und MUIR, 2000). Außerdem werden
diese Zytokine für Oligodendrogliopathien bei der MS verantwortlich gemacht
(Abbildung 3, Abbildung 4; PAINTLIA et al., 2011). Innerhalb des CDV-infizierten
ZNS führt IL-8 zu einer frühzeitigen Infiltration von CD8+-T-Zellen und antiviralen
Zytotoxizität (TIPOLD et al., 1999), während IL-12 eine Th1-dominierte
Immunantwort im fortgeschrittenen Stadium der demyelinisierenden Hundestaupe
hervorruft (Abbildung 4; WÜNSCHMANN et al., 2000; GRÖNE et al., 2000). Die
besondere Bedeutung von IL-12 für Entmarkungsprozesse konnte durch den
therapeutischen Effekt von neutralisierenden IL-12-Antikörpern im EAE-Modell
nachgewiesen werden (FOX und ROSTAMI, 2000).
Studienübergreifende Diskussion 39
Interessanterweise sind die immunmodulatorischen Zytokine IL-10 und TGF-β
sowohl im Kleinhirn (MARKUS et al., 2002) als auch im Großhirn von CDV-infizierten
Hunden nicht aufreguliert (Publikation 2, Anhang 11.2). Diese Botenstoffe hemmen
unter anderem die proinflammatorische Zytokinsekretion durch Makrophagen bzw.
Mikrogliazellen und sind daher während der Rückbildung der klinischen Symptome
(Remission) bei der MS aufreguliert (FIORENTINO et al., 1991; BERTOLOTTO et al.,
1999; BROSNAN et al., 1995). Vergleichbar hiermit findet sich eine vermehrte
Expression von TNF- und IL-6 in Verbindung mit einer Exazerbation der
Hundestaupe, während IL-10 und TGF-β mit einem inaktiven Krankheitsstadium
vergesellschaftet sind (FRISK et al., 1999). Die verhältnismäßig geringe Expression
antiinflammatorischer Zytokine im Klein- und Großhirn während der akuten CDV-
Infektion ist vermutlich auf die Abwesenheit von immunmodulatorischen Zellen, wie
beispielsweise regulatorischen T-Zellen und/oder M2-Mikroglia/Makrophagen,
zurückzuführen. Das Ungleichgewicht zwischen pro- und antiinflammatorischen
Mediatoren während der initialen Infektionsphase stellt hierbei einen potentiellen
Auslöser für immunpathologische Prozesse im Gehirn im weiteren Verlauf der
Hundestaupe dar (Abbildung 4). Allerdings bewirkt das proinflammatorische
Zytokinmilieu per se keinen Myelinverlust im Gehirn der CDV-infizierten Hunde
(Publikation 2, Anhang 11.2), sodass weitere Faktoren, wie beispielsweise regionale
Unterschiede in der Bluthirnschrankenfunktion und dem myelinschädigenden
Potential residenter Zellen in der Pathogenese der Entmarkung berücksichtigt
werden müssen (GRÖTERS et al., 2005; PUFF et al., 2009; STEIN et al., 2011).
Studienübergreifende Diskussion 40
Abbildung 3. Vereinfachtes Schema der Zytokinfunktionen bei Erkrankungen des zentralen Nervensystems. Durch verschiedene Insulte, wie beispielsweise Virusinfektionen, Traumata und autoimmune Prozesse kommt es zu einer frühzeitigen Aktivierung residenter Zellen und infiltrierender Immunzellen. Das Zytokinmilieu führt hierbei zu einer Polarisierung von T-Zellen und Mikrogliazellen/Makrophagen. Während Th1-Zellen, Th17-Zellen und M1-Mikrogliazellen bzw. M1-Makrophagen durch die Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen neurodegenerative Prozesse induzieren, werden durch Th2-Zellen, regulatorische T-Zellen und M2-Mikroglia bzw. M2-Makrophagen Neuroregeneration und –reparation gefördert. IFN- = Interferon-, IL= Interleukin, M = Makrophagen, TGF-β = Transformierender Wachstumsfaktor-β, TNF- = Tumor-Nekrose-Faktor-, Treg = regulatorische T-Zellen, ZNS = zentrales Nervensystem (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Ingo Spitzbarth).
Vergleichbar mit der proinflammatorischen Zytokinexpression im Gehirn während der
akuten CDV-Infektionsphase und bei spinalen Verletzungen beim Menschen (KWON
et al., 2010) findet sich bei Hunden mit einem akuten Rückenmarkstrauma (1-4 Tage
nach Bandscheibenvorfall) eine überwiegende Expression von IL-6, IL-8 und TNF-
(Publikation 5, Anhang 11.5). Im kaninen Gehirn konnte hingegen eine
Aufregulation von sowohl pro- (IL-1, IL-6 und TNF-), als auch
antiinflammatorischen Zytokinen (IL-10 und TGF-) in Neuronen und Granulozyten
infolge einer mechanischen Traumatisierung nachgewiesen werden (YU et al., 2011).
Studienübergreifende Diskussion 41
Die Unterschiede zur vorliegenden Arbeit sind vermutlich auf topographische
Variationen der Immunantwort bzw. der mikroglialen Funktion zwischen Gehirn und
Rückenmark beim Hund zurückzuführen (ENSINGER et al., 2010). IL-8 zeigt eine
Aufregulation im traumatisierten Rückenmark während der akuten und subakuten
Phase (>5 Tage nach Bandscheibenvorfall, Publikation 5, Anhang 11.5). Beim
Menschen korreliert die IL-8-Konzentration in der Zerebrospinalflüssigkeit mit dem
Schweregrad der spinalen Verletzung (KWON et al., 2010). Im Gegensatz hierzu
besitzen IL-10 und TGF- antiinflammatorische und neuroprotektive Wirkungen beim
spinalen Trauma (BREWER et al., 1999; GENOVESE et al., 2009; TYOR et al.,
2002; ZHOU et al., 2009). Der Mangel an diesen Zytokinen während der akuten und
subakuten Phase des kaninen Rückenmarkstraumas führt daher möglicherweise zu
einer verstärkten Myelinzerstörung aufgrund einer fehlenden immunologischen
Gegenregulation. Beispielsweise zeigen IL-10-defiziente knock out-Mäuse einen
verstärkten spinalen Schaden und eine exzessive Neuroinflammation im Vergleich zu
Wildtyptieren nach experimenteller Traumatisierung (GENOVESE et al., 2009).
Weiterhin führt die systemische Applikation von TGF- zu einem neuroprotektiven
Effekt im Nagermodell für Rückenmarksverletzungen (TYOR et al., 2002). Im Hinblick
auf zukünftige Zelltransplantationen (z.B. von olfaktorischen Hüllzellen,
Schwannzellen oder mesenchymalen Stammzellen) zur Therapie spinaler Traumata
beim Hund übt das überwiegend proinflammatorische Mikromilieu vermutlich einen
hemmenden Einfluss auf transferierte Zellen aus (BOEKHOFF et al., 2011;
JEFFERY et al., 2006; WEWETZER et al., 2011). Die gezielte medikamentelle
Manipulation der Zytokinsekretion stellt daher einen entscheidenden Ansatz zur
Förderung der endogenen Regeneration und Remyelinisierung durch neuroprotektive
M2-Mikroglia im kaninen ZNS dar (Abbildung 3; GENSEL et al., 2011; KIGERL et al.,
2009; OLBY et al., 2010).
Vergleichbar den Prozessen im traumatisierten Rückenmark konnte eine
proinflammatorische Zytokinexpression ebenfalls in organotypischen spinalen
Schnittkulturen nachgewiesen werden (Publikation 5, Anhang 11.5). Die Expression
ist vorwiegend auf aktivierte residente Zellen, insbesondere Mikrogliazellen,
zurückzuführen. Der Nachweis einer dominierenden proinflammatorischen
Zytokinexpression in vitro (3 und 9 Tage in Kultur) führt zur Hypothese, dass
periphere zelluläre oder humorale Faktoren im verletzten Rückenmark eine
Studienübergreifende Diskussion 42
überschießende und andauernde Entzündungsreaktion regulieren, welche im in vitro-
System aufgrund des fehlenden Einflusses der Blutversorgung nicht vorkommen.
Im Gegensatz zur Hundestaupe und zu spinalen Traumata findet sich bei SJL-
Mäusen während der akuten Phase der TME eine prominente IL-10-Expression und
eine erst verzögert einsetzende Transkription von TNF- (Publikation 9, Anhang
11.9). IL-10 wird hauptsächlich von regulatorischen T-Zellen, Th2-Zellen, B-Zellen
und M2-Mikrogliazellen/Makrophagen gebildet und hat einen suppressiven Einfluss
auf die Antigenpräsentation, T-Zellproliferation und Expression von
proinflammatorischen Zytokinen (HOWARD et al., 1992; SABAT et al., 2010). IL-10
hemmt damit Th1-vermittelte immunpathologische Gewebeschäden, allerdings wird
durch das Zytokin die protektive Immunabwehr reduziert und somit persistente
Infektionen begünstigt. Beispielsweise kann eine verstärkte CD4- und CD8-
vermittelte antivirale Immunantwort durch die experimentelle Depletion von IL-10-
produzierenden CD11b+Ly6c+-Zellen bei der TME hervorgerufen werden (BOWEN
und OLSON, 2009). Vergleichbar hiermit führt IL-10 zu einer verminderten
virusspezifischen T-Zellantwort bei Mäusen nach Infektion mit persistenten
Lymphozytären Choriomeningitisvirus-Stämmen (BROOKS et al., 2006; EJRNAES et
al., 2006; MARIS et al., 2007). Die Untersuchungen unterstreichen die besondere
Rolle von IL-10 für die Initiation und Progression der TME und demonstrieren, dass
die Modulation von IL-10-vermittelten Prozessen einen potentiellen Therapieansatz
bei erregerbedingten ZNS-Krankheiten darstellt (MARTINIC und VON HERRATH,
2008). Die erhöhte TNF--Produktion in resistenten TMEV-infizierten C57BL/6-
Mäusen ist vermutlich für die beschleunigte Viruselimination verantwortlich
(Publikation 9, Anhang 11.9). Andererseits induziert TNF- die Freisetzung
exzitatorischer Neurotransmitter, wodurch neuronale Degenerationen und Epilepsien
in TMEV-infizierten C57BL/6-Mäusen ausgelöst werden (KIRKMAN et al., 2010;
LIBBEY et al., 2008). Im Gegensatz zu den Ergebnissen der vorliegenden Studie
findet sich während der frühen Infektionsphase (acht Tage nach Infektion) eine
vermehrte Expression von TNF- im Gehirn von SJL-Mäusen, welche mit dem DA-
Stamm des TMEV infiziert wurden. Die Differenzen sind sehr wahrscheinlich auf
virusstammspezifische Unterschiede in der Intensität der Entzündungsreaktion
während der akuten Polioenzephalitis zurückzuführen (DAL CANTO et al., 1996;
OLESZAK et al., 2004; ZOECKLEIN et al., 2003). Im chronischen Stadium der TME
konnte möglicherweise infolge eines Ungleichgewichtes der Zytokinexpression
Studienübergreifende Diskussion 43
zugunsten proinflammatorischer Mediatoren eine progressive Entzündung und
Demyelinisierung nachgewiesen werden (Publikation 11, Anhang 11.11).
Zusammenfassend findet sich trotz unterschiedlicher Noxen ein vergleichbares
Zytokinprofil während der initialen Phase der demyelinisierenden Staupeenzephalitis
und traumatischen Rückenmarksverletzung beim Hund, was für ein ähnliches
Reaktionsmuster der residenten Zellen spricht (Publikation 2, Anhang 11.2;
Publikation 5, Anhang 11.5). Im Vergleich hierzu ist die Expression der Zytokine bei
der TME sowohl auf gliale Zellen als auch auf ZNS-infiltrierende periphere
Leukozyten zurückzuführen. In Abhängigkeit vom genetischen Hintergrund der Maus
üben diese Zellen entweder protektive oder krankheitsfördernde Effekte aus
(Publikation 9, Anhang 11.9). Den initialen Abläufen von Myelinopathien kann daher
keine spezifische Zytokinsignatur zugeordnet werden, da die immunologischen
Prozesse im ZNS durch das periphere Immunsystem beeinflusst werden. Außerdem
trägt die Orchestrierung verschiedener Faktoren und nicht die Expression einzelner
Zytokine zum Myelinverlust bei (SRIRAM, 2011). Das Verständnis der Dynamik
peripherer und zentralnervöser Immunreaktionen ist daher essentiell für die
Entwicklung von immunmodulatorischen Therapieansätzen bei neurodegenerativen
und neuroinflammatorischen Krankheiten.
Studienübergreifende Diskussion 44
Abbildung 4. Bedeutung der Zytokine für die Pathogenese der demyelinisierenden Staupeenzephalitis. A) Während des akuten Stadiums werden durch die Gliaaktivierung und vermehrte Expression proinflammatorischer Zytokine potentiell Oligodendrozyten- und Axonschäden hervorgerufen. IL-6 und TNF- führen zu einer Öffnung der Bluthirnschranke. Außerdem fördert IL-8 die Chemotaxis von CD8+-T-Zellen und zytotoxische Prozesse. IL-6 im Blut von akut erkrankten Hunden spielt hierbei eine Rolle bei der Initiation der Entmarkungsprozesse, während die periphere Expression von TGF-β mit einer chronischen Demyelinisierung vergesellschaftet ist. B) Durch die permanente Sekretion von proinflammatorischen Zytokinen kommt es in der chronischen Phase zu einer vermehrten Infiltration von CD4+-T-Zellen und eine progressive Demyelinisierung. IL-12 fördert hierbei eine Th1-vermittelte Immunreaktion im ZNS. Weiterhin werden durch IFN- Mikrogliazellen und Makrophagen stimuliert und immunpathologische Vorgänge möglicherweise unterhalten. CDV = Hundestaupevirus, IL = Interleukin; IFN- = Interferon-; TGF-β = Transformierender Wachstumsfaktor-β, TNF- = Tumor-Nekrose-Faktor- (modifiziert nach Beineke et al., 2009 [Publikation 1]).
Studienübergreifende Diskussion 45
5.2. Bedeutung der unspezifischen (angeborenen) Immunabwehr und der frühen Immunmodulation für die Pathogenese von demyelinisierenden Krankheiten
Die unspezifische (angeborene) Immunabwehr im ZNS wird durch residente Zellen,
insbesondere Mikrogliazellen und Astrozyten sowie durch infiltrierende natürliche
Killerzellen, Granulozyten, dendritische Zellen und Makrophagen hervorgerufen. Sie
stellt die initiale Reaktion auf verschiedene Noxen und damit die Voraussetzung für
die spezifische (adaptive) Immunabwehr bei neurologischen Krankheiten dar
(GANDHI et al., 2010). Bei der MS kann eine mikrogliale Aktivierung bereits in frühen
Läsionen nachgewiesen werden. Allerdings ist bislang unklar, ob die Mikroglia den
primären ZNS-Schaden verursachen oder erst durch enzephalitogene T-Zellen
stimuliert werden müssen (GANDHI et al., 2010; MARIK et al., 2007).
Eine CDV-induzierte Mikrogliaaktivierung wird für die Myelinzerstörung (bystander
demyelination) während der progressiven Krankheitsphase der Hundestaupe
verantwortlich gemacht (BOTTERON et al., 1992; GRIOT et al., 1990). Als Zeichen
einer frühzeitigen Aktivierung residenter Zellen kann eine prominente MHC-II-
Aufregulation bereits vor der Infiltration von T- und B-Zellen in Gehirnläsionen bei der
Hundestaupe und Seehundstaupe festgestellt werden (Publikation 2, Anhang 11.2,
Publikation 4, Anhang 11.4). Das proinflammatorische Zytokinmilieu im Gehirn
während der akuten CDV-Infektion spricht hierbei für die Polarisierung der
Mikrogliazellen in einen potentiell neurotoxischen M1-Phänotyp (Publikation 2,
Anhang 11.2; MARKUS et al., 2002). Diese Hypothese wird durch den Nachweis
einer vermehrten Expression von Adhäsionsmolekülen, gesteigerten
Phagozytoseaktivität und Freisetzung von Sauerstoffradikalen durch isolierte
Mikrogliazellen von experimentell CDV-infizierten Hunden unterstützt (STEIN et al.,
2004, 2008). M1-Mikrogliazellen fördern die Läsionsentwicklung bei der EAE,
während immunmodulatorische M2-Zellen einen milderen klinischen Verlauf bei
autoimmunen ZNS-Krankheiten hervorrufen (MIKITA et al., 2011). Die differentielle
Aktivierung residenter Zellen im Großhirn bei der CDV- und PDV-Infektion stellt
daher einen potentiellen Initiationsfaktor weiterer immunologischer Prozesse in der
weißen Substanz dar. Vergleichbar mit den pathologischen zerebralen
Veränderungen infolge der Morbillivirusinfektionen beim Hund und Seehund findet
sich keine Entmarkung im Großhirnkortex von TMEV-infizierten Mäusen (Publikation
7 Anhang 11.7). Warum die Demyelinisierung in bestimmten Gehirnregionen
Studienübergreifende Diskussion 46
bevorzugt auftritt, ist bislang unklar. Möglicherweise stellen topographische
Variationen der Dichte und des Reaktionsmusters der Mikroglia und Astrozyten eine
entscheidende Grundlage hierfür dar (GUDI et al., 2009; SKRIPULETZ et al., 2008,
2010). Diesbezüglich konnten in vorangegangenen Arbeiten deutlich variable
Funktionszustände von Mikrogliazellen in unterschiedlichen ZNS-Regionen beim
Hund festgestellt werden (ENSINGER et al., 2010; STEIN et al., 2004, 2006, 2007).
Außerdem müssen regional unterschiedliche Vulnerabilitäten der Axone und hieraus
resultierende Axonopathien als Ursache für die Aktivierung residenter ZNS-Zellen bei
viralen Entmarkungskrankheiten berücksichtigt werden (Publikation 7; SEEHUSEN
und BAUMGÄRTNER, 2010; TSUNODA und FUJUNAMI, 2002).
Topographische Unterschiede in der Empfindlichkeit der weißen Substanz und
alternative Funktionszustände der Mikroglia zeigen sich auch im Gehirn von TMEV-
infizierten Mäusen (Publikation 7, Anhang 11.7) und im Vergleich der Cuprizon-
induzierten Myelinveränderungen im Gehirn und Rückenmark bei der Maus
(Publikation 10, Anhang 11.10). Während Mikrogliazellen und Makrophagen
entscheidend zur Entmarkung im Corpus callosum beitragen (BIANCOTTI et al.,
2008) findet sich im Rückenmark eine verzögerte Mikrogliaaktivierung, charakterisiert
durch die vermehrte Infiltration von CD107b+-Zellen und eine aufregulierte CD11b-
mRNS-Expression (Publikation 10, Anhang 11.10). Im Gegensatz zu der potentiell
neurotoxischen Funktion der Mikroglia bei der Hundestaupe, Seehundstaupe und
TME stellt dieser Prozess vermutlich eine Reaktion auf toxinbedingte
Oligodendrozytenveränderungen und apoptotische Prozesse im Rückenmark dar. In
diesem Zusammenhang können sowohl neurodegenerative Effekte, als auch
neuroprotektive Funktionen von mikroglialen Zellen mit einer beschleunigten
oligodendroglialen Remyelinisierung nachgewiesen werden (KOTTER et al., 2001,
2005). Insbesondere M2-Mikroglia/Makrophagen weisen antiinflammatorische und
regenerationsfördernde Eigenschaften auf (Abbildung 3; MANTOVANI et al., 2005;
KIGERL et al., 2009).
Neben der Bedeutung der Zellen der angeborenen Immunität für das
inflammatorische Milieu im ZNS, besitzen Makrophagen und dendritische Zellen eine
zentrale Funktion für die Induktion der spezifischen Immunantwort in peripheren
lymphatischen Organen. Vergleichbar mit den Beobachtungen bei der TME
(Publikation 8, Anhang 11.8) kommt es im Frühstadium der MS zur Migration von
CD68+-antigenpräsentierenden Zellen aus dem ZNS in den Zervikallymphknoten.
Studienübergreifende Diskussion 47
Aktivierte periphere Lymphozyten infiltrieren anschließend das ZNS und werden dort
durch antigenpräsentierende Zellen (z.B. Mikrogliazellen, dendritische Zellen)
reaktiviert (Abbildung 1; MCMAHON et al., 2005). Die MHC-II-Expression im Gehirn
während der frühen Phase der CDV- und PDV-Infektion spricht ebenfalls für eine
antigenpräsentierende Funktion der Mikroglia/Makrophagen bei diesen Krankheiten
(Publikation 2, Anhang 11.2; Publikation 4, Anhang 11.4). Allerdings wird die
Bildung einer spezifischen zentralnervösen und peripheren Immunantwort sehr
wahrscheinlich aufgrund der fehlenden Lymphozyteninfiltration in das ZNS sowie der
Depletion peripherer lymphatischer Organe und Immunsuppression bei der akuten
Hundestaupe und Seehundstaupe (BEINEKE et al., 2006; WÜNSCHMANN et al.,
2000) gehemmt. Trotz dieser unterschiedlichen immunologischen Reaktionen
während der Initialphase, werden jedoch vergleichbare immunpathologische
Prozesse und pathomorphologische Veränderungen während des chronischen
demyelinisierenden Stadiums durch die Morbilliviren und das TMEV hervorgerufen
(Publikation 1, Anhang 11.1; BEINEKE et al., 2010; OLESZAK et al., 2004).
Die Proliferation von Mikrogliazellen/Makrophagen infolge der nicht-virusinduzierten
Rückenmarksverletzung beim Hund spricht ebenfalls für eine dominierende Rolle der
unspezifischen Immunität während des akuten und subakuten Stadiums
(Publikation 5, Anhang 11.5). Die funktionelle Bedeutung der Mikrogliaaktivierung
für die Pathogenese spinaler Schäden wird in der Literatur kontrovers diskutiert.
Einerseits fördert die Phagozytose von Myelindebris die Regeneration im ZNS
(YANG et al., 2008), andererseits kann die exzessive Zytokinexpression und
Freisetzung von reaktiven Sauerstoffverbindungen durch Mikrogliazellen zur weiteren
Schädigung des Gewebes führen (BANATI et al., 1993; ENSINGER et al., 2010;
STEIN et al., 2006, 2011). Experimentelle Studien bei der Maus zeigen eine
Polarisierung der mikroglialen Zellen in einen proinflammatorischen M1-Phänotyp bei
spinalen Verletzungen (KIGERL et al., 2009). Die immunologischen Prozesse,
insbesondere die untergeordnete Rolle von peripheren Leukozyten im
traumatisierten Rückenmark weisen deutliche Paralellen mit der Pathogenese
spinaler Schäden beim Menschen auf (Publikation 5, Anhang 11.5). Zur näheren
Untersuchung der immunologischen Reaktionen von residenten glialen Zellen
wurden organotypische Schnittkulturen vom kaninen Rückenmark angefertigt
(Publikation 5, Anhang 11.5). Die Phagozytose von Myelinbestandteilen
(Myelinophagie) durch mikrogliale Zellen ist mit einer vermehrten MHC II-Expression
Studienübergreifende Diskussion 48
vergesellschaftet. Möglicherweise wird der Prozess durch die vermehrte Expression
proinflammatorischer Zytokine in autokrinen und parakrinen Mechanismen weiter
verstärkt. Vergleichbar mit diesen Resultaten kann in der Zellkultur sowie in MS-
Läsionen eine mikrogliale Aktivierung durch die Phagozytose von
Myelinbestandteilen mit Ausbildung proinflammatorischer und neurotoxischer
Eigenschaften nachgewiesen werden (PINTEAUX-JONES et al., 2008). Außerdem
spielt die Interaktion von Toll-ähnlichen Rezeptoren (toll-like receptors) auf
Mikrogliazellen mit freigesetzten zellulären Proteinen (damage associated molecular
patterns) eine entscheidende Rolle für die Gliaaktivierung und Zytokinexpression bei
ZNS-Schädigungen (KIGERL et al., 2007; KIGERL und POPOVICH, 2009). Das in
vitro-System vom kaninen Rückenmark erlaubt die funktionelle Analyse glialer Zellen
bei neurodegenerativen Prozessen und die Untersuchung des Einflusses einer
pharmakologischen Manipulation der Mikroglia in weiteren geplanten Projekten. Im
Hinblick auf Zelltransplantationen zur Therapie von ZNS-Krankheiten in der
Veterinärmedizin kann außerdem die Interaktion zwischen aktivierten residenten
Zellen und kokultivierten regenerationsfördernden Zellen in organotypischen
Schnittkulturen gezielt analysiert werden (Publikation 5, Anhang 11.5; WEWETZER
et al., 2011; GENSEL et al., 2011; KINGERL et al., 2009).
5.3. Bedeutung von B-Zellen und der humoralen Immunität für die Pathogenese von demyelinisierenden Krankheiten
TMEV-infizierte SJL-Mäuse weisen im Vergleich zu resistenten C57BL/6-Mäusen
eine prominente Infiltration von CD45R+-B-Zellen in das Gehirn auf (Publikation 9,
Anhang 11.9). Da eine CD8-vermittelte Zytotoxizität an der Elimination des TMEV
maßgeblich beteiligt ist (BORROW et al., 1992), hemmt die B-Zellantwort in
empfindlichen Mäusestämmen während der akuten Polioenzephalitisphase
vermutlich die protektive Immunität und verzögert damit die Viruselimination. Der
suppressive Effekt von B-Zellen wird unter anderem durch die Sekretion von
antiinflammatorischen Zytokinen, insbesondere von IL-10, hervorgerufen (MEINL et
al., 2006). Mittels Genexpressionsanalysen konnte darüber hinaus eine frühzeitige,
vor der Entmarkung auftretende, Antigenpräsentation und B-Zellaktivierung im
Zervikallymphknoten von TMEV-infizierten SJL-Mäusen nachgewiesen werden
(Publikation 8, Anhang 11.8). Neben der potentiellen Bedeutung für die
Studienübergreifende Diskussion 49
Viruspersistenz bei der TME, stellt die beobachtete periphere Aktivierung der
humoralen Immunität und die Infiltration von B-Zellen in das Gehirn eine
Voraussetzung für die intrathekale Immunglobulinproduktion und Bildung von
potentiell autoreaktiven Antikörpern in empfindlichen SJL-Mäusen dar (PACHNER et
al., 2007). Die besondere Bedeutung der humoralen Immunität in der Pathogenese
der MS wird durch die Präsenz von B-Zellen und Plasmazellen sowie von
myelinspezifischen Autoantikörpern in MS-Läsionen und im Liquor cerebrospinalis
verdeutlicht. Infolge der andauernden Immunstimulation ist eine intrathekale
Antikörpersynthese mit oligoklonalen Banden in der Zerebrospinalflüssigkeit durch
die isoelektrische Fokussierung bei 90-95 % der Patienten nachweisbar (MEINL et
al., 2006; VILLOSLADA, 2010). Interessanterweise führt eine medikamentelle
Reduktion von B-Zellen bzw. Plasmazellen (z.B. durch Rituximab) zu einer
Verbesserung der klinischen Symptomatik bei MS-Patienten (LASSMANN et al.,
2007). Außerdem wird durch Plasmapherese ein therapeutischer Effekt vorwiegend
in Patienten mit intraläsionalen Antikörper- und Komplementablagerungen (Typ II-
MS-Läsionen) erzielt (WEINSHENKER et al., 1999).
Im chronischen Stadium der MS entwickelt sich eine, vom peripheren Immunsystem
unabhängige, auf das ZNS beschränkte Immunreaktion. Diese
Kompartimentalisierung der Neuroinflammation ist mit der Bildung ektopischer
Lymphfollikel mit B-Zellreifung und Plasmazelldifferenzierung in den Meningen
vergesellschaftet (MEINL et al., 2006). Die autonome Immunabwehr im ZNS in
Verbindung mit einer intakten Bluthirnschranke wird für das Versagen von
immunmodulatorischen Therapien in Patienten mit chronischer MS verantwortlich
gemacht (BARNETT und SUTTON, 2006). Eine kompartimentalisierte Immunantwort
wird ebenfalls bei der TME angenommen. Nach der initialen Aktivierung des
peripheren Immunsystems während des prädemyelinisierenden TME-Stadiums
konnte mittels Transkriptomanalyse eine deutlich reduzierte Genexpression in
peripheren lymphatischen Organen während der demyelinisierenden TME-Phase
nachgewiesen werden (Publikation 8, Anhang 11.8). In diesem Zusammenhang
sprechen die Ergebnisse der immunhistologischen Phänotypisierung (Publikation
11, Anhang 11.11) und vorangegangener Genexpressionsanalysen für eine lokal im
Rückenmark der infizierten Mäuse stattfindende Antigenpräsentation mit
Plasmazelldifferenzierung und Antikörperproduktion während des progressiven
Entmarkungsstadiums (ULRICH et al., 2010). Im Hinblick auf eine
Studienübergreifende Diskussion 50
Kompartimentalisierung der humoralen Immunität im ZNS zeigen TMEV-infizierte
Mäuse deutlich höhere Antikörperkonzentrationen im Liquor cerebrospinalis als im
Serum (LIPTON und GONZALEZ-SCARANO, 1978; TSUNODA und FUJINAMI,
2009). Eine Th2-vermittelte Immunantwort kann zu Beginn der chronischen Phase
der TME nachgewiesen werden (LIPTON und GONZALEZ-SCARANO, 1978).
Neben TMEV-spezifischen Antikörpern werden während der chronischen
Infektionsphase zusätzlich myelinspezifische Autoantikörper detektiert (RAUCH und
MONTGOMERY, 1986; TSUNODA und FUJINAMI, 1996). Läsionen durch diese
potentiell myelintoxischen Antikörper weisen weitreichende pathologische
Übereinstimmungen mit MS-Herden der Gruppe II auf (LUCHNINETTI et al., 2000;
WOODRUFF et al., 1999; YAMADA et al., 1990).
Im Gegensatz zur TME findet sich während der akuten Infektionsphase der Hunde-
und Seehundstaupe durch die virusinduzierte systemische Immunsuppression keine
signifikante Infiltration von B-Zellen in das infizierte Gehirn (Publikation 2, Anhang
11.2; Publikation 4, Anhang 11.4; MARKUS et al., 2002). CDV-infizierte Hunde
zeigen während dieser Krankheitsphase eine ineffiziente protektive humorale
Immunität (BARBEN et al., 1999). Die verminderte Antikörperproduktion ist die Folge
der massiven virusbedingten Depletion der B-Zellareale in peripheren lymphatischen
Organen während des akuten Stadiums (WÜNSCHMANN et al., 2000). Durch die
Repopulation der lymphatischen Organe kommt es im weiteren Verlauf der
Hundestaupe zur Akkumulation von Plasmazellen im ZNS und einer intrathekalen
Immunglobulinproduktion (VANDEVELDE et al., 1981; VANDEVELDE et al., 1986;
WÜNSCHMANN et al., 1999). Die humorale Immunität führt einerseits zu einer
Virusreduktion im ZNS (ALLDINGER et al., 1993; BAUMGÄRTNER et al., 1989;
BOLLO et al., 1986), andererseits werden, wie bei der TME, Makrophagen und
Mikrogliazellen durch virusspezifische Antikörper und Immunkomplexablagerungen
zur Freisetzung von reaktiven Sauerstoffverbindungen (respiratory burst) und
anderen myelin- und oligodendrozytenschädigenden Substanzen angeregt
(bystander demyelination; BOTTERON et al., 1992; BÜRGE et al., 1989; GRIOT et
al., 1989a,b; GRIOT-WENK et al., 1991). Darüber hinaus finden sich
myelinspezifische Autoantikörper im ZNS von CDV-infizierten Hunden. Allerdings
bleibt spekulativ, ob diese Antikörper wie bei der MS maßgeblich an der Entmarkung
beteiligt sind oder lediglich ein Epiphänomen darstellen (CERRUTI-SOLA et al.,
1983; KRAKOWKA et al., 1980; VANDEVELDE et al., 1986).
Studienübergreifende Diskussion 51
Die intraläsionale Expression der Virusproteine in den untersuchten Seehunden
(Publikation 4, Anhang 11.4) zeigte eine deutliche Abhängigkeit vom Läsionstyp
bzw. der Entzündungsreaktion im Gehirn. Hierbei konnte eine reduzierte oder sogar
fehlende Expression der Hüllproteine in Herden mit ausgeprägter lymphohistiozytärer
Infiltration nachgewiesen werden. Vergleichbar hiermit findet sich eine verminderte
Expression verschiedener Virusantigene bei der Hundestaupe (ALLDINGER et al.,
1993). Als Ursache für dieses Phänomen wird eine gestörte Expression der viralen
Hüll- und Kernproteine infolge einer Antigenmodulation durch antivirale Antikörper
angenommen (FUJINAMI und OLDSTONE, 1980; HO und BABUIK, 1979).
5.4. Bedeutung von regulatorischen T-Zellen bei virusinduzierten und degenerativen Krankheiten des zentralen Nervensystems
Regulatorische T-Zellen spielen eine entscheidende Rolle für die immunologische
Toleranz und Hemmung von immunpathologischen Prozessen (Abbildung 3).
Beispielsweise kann bei der EAE durch die in vivo-Vermehrung (z.B. durch
Glatiramer-Azetat) oder den adoptiven Transfer von regulatorischen T-Zellen eine
verminderte Entmarkung im ZNS hervorgerufen werden (KORN et al., 2007; JEE et
al., 2007). Bei viralen ZNS-Infektionen finden sich allerdings sowohl
krankheitsfördernde als auch -hemmende Effekte durch diese Zellen. Beispielsweise
reduzieren regulatorische T-Zellen die antivirale Immunität und fördern damit die
Erregerpersistenz im ZNS bei der experimentellen Infektion mit neurotropen
Maushepatitisviren (PUNTAMBEKAR et al., 2011). Andererseits induzieren
regulatorische T-Zellen in der Frühphase der experimentellen Herpesvirusinfektion
durch eine gesteigerte Migration von virusspezifischen Effektorzellen eine protektive
Immunität im murinen ZNS (LUND et al., 2008).
Die vergleichende Analyse der zellulären Immunantwort zeigt eine prominente
Infiltration von Foxp3+-regulatorischen T-Zellen im Gehirn von TMEV-infizierten SJL-
Mäusen im Vergleich zu resistenten C57BL/6-Mäusen (Publikation 9, Anhang 11.9).
Die vermehrte Expression von IL-10 durch diese Zellen führt möglicherweise zu einer
verzögerten TMEV-Elimination in SJL-Mäusen. In diesem Zusammenhang konnte
durch die experimentelle Depletion von regulatorischen T-Zellen mittels Anti-CD25-
Antikörper eine beschleunigte Viruselimination und klinische Verbesserung bei der
TME hervorgerufen werden (RICHARDS et al., 2011). Daher ist die erhaltene
Studienübergreifende Diskussion 52
antivirale Immunität in Cuprizon-behandelten und TMEV-infizierten Mäusen
vermutlich auf die Reduktion von regulatorischen T-Zellen im Rückenmark
zurückzuführen (Publikation 11, Anhang 11.11). Weiterhin kann als Ursache des
therapeutischen Effektes von Cuprizon bei der TME eine periphere Induktion von
myelinspezifischen regulatorischen T-Zellen, wie bei der EAE beschrieben, nicht
ausgeschlossen werden (MANA et al., 2009).
Die geringe Expression der immunmodulatorischen Zytokine IL-10 und TGF-
während der frühen Infektionsphase der Hundestaupe spricht für den Mangel an
regulatorischen T-Zellen und Mikroglia/Makrophagen vom M2-Typ im Großhirn und
Kleinhirn (Publikation 2, Anhang 11.2; MARKUS et al., 2002). Ein hiermit
vergleichbarer Prozess konnte bei kaninen Rückenmarksverletzungen nachgewiesen
werden. Mittels Immunhistologie finden sich hierbei keine Foxp3+-regulatorischen T-
Zellen im akut oder subakut traumatisierten Gewebe (Publikation 5, Anhang 11.5).
Aufgrund der fehlenden Immunhomöostase kommt es in der Frühphase der viralen
Krankheiten bzw. der mechanischen spinalen Verletzung vermutlich zu einer
unkontrollierten Expression von proinflammatorischen Zytokinen durch residente
Immunzellen. Vergleichbar hiermit konnte im Verlauf der experimentellen HIV-1-
induzierten Enzephalitis bei der Maus durch regulatorische T-Zellen die Sekretion
von TNF- gehemmt und die Produktion von neuroprotektiven Wachtumsfaktoren,
wie dem brain-derived neurotropic factor und glial cell-derived neurotropic factor, in
Mikrogliazellen gefördert werden (LIU et al., 2009). In einem Mausmodell für die
Parkinsonerkrankung wurde außerdem gezeigt, dass regulatorische T-Zellen mit
Mikrogliazellen interagieren, wodurch diese zu einer vermehrten Sekretion von IL-10
und TGF- sowie Reduktion der Stickoxidproduktion angeregt und damit
heilungsfördernde Effekte ausgelöst werden (REYNOLDS et al., 2007). Außerdem
bewirken regulatorische T-Zellen eine Neuroprotektion bei ischämischen Insulten des
ZNS (z.B. Gehirninfarkt) durch die Inaktivierung mikroglialer Zellen und Reduktion
der proinflammatorischen Zytokinexpression (LIESZ et al., 2009).
Zusammenfassend verdeutlichen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeiten das
Vorkommen von dualen Funktionen von regulatorischen T-Zellen in der Pathogenese
von demyelinisierenden Krankheiten. Einerseits werden durch diese Zellen
immunpathologische Gewebeschäden reduziert, andererseits aber eine protektive
Immunität potentiell gehemmt. Im Gegensatz zu primär autoimmunen Krankheiten,
wie der EAE, besteht daher bei erregerbedingten ZNS-Krankheiten, wie der
Studienübergreifende Diskussion 53
Hundestaupe und TME, durch die vermehrte Aktivierung von regulatorischen T-
Zellen das Risiko einer Exazerbation. Im Hinblick auf eine postulierte infektiöse
Genese der MS des Menschen (BERTI und JACOBSON, 1999; EBERS et al., 1986;
HAAHR und HÖLLSBERG, 2001; PERRON et al, 1997; WILLER und EBERS, 2000)
und beispielsweise der granulomatösen Meningoenzephalitis des Hundes
(TALARICO und SCHATZBERG, 2010) bzw. durch die Reaktivierung von latenten
Virusinfektionen infolge des Einsatzes immunmodulatorischer Medikamente ist daher
die therapeutische Expansion von regulatorischen T-Zellen in der Human- und
Tiermedizin kritisch zu diskutieren und in weiteren Experimenten näher zu
untersuchen.
Zusammenfassung 54
6. Zusammenfassung
Die Hundestaupe und Theilersche murine Enzephalomyelitis (TME) stellen spontan
auftretende bzw. experimentelle Modelle für demyelinisierende Krankheiten dar.
Während die Demyelinisierung im chronischen Stadium der Multiplen Sklerose (MS)
des Menschen durch eine myelinspezifische Autoimmunität hervorgerufen wird, sind
die immunologischen und neurodegenerativen Abläufe während der Initialphase
dieser Krankheit weitgehend unklar. Ziel der vorliegenden Arbeiten war daher eine
nähere Charakterisierung der neuropathologischen Prozesse während der akuten
Phase von virusinduzierten Krankheiten des zentralen Nervensystems (ZNS) und die
Identifikation von Faktoren, die immunpathologische Vorgänge und
Myelinveränderungen induzieren.
In der Frühphase der Hundestaupe konnte im Großhirn eine dominierende
Expression der proinflammatorischen Zytokine Interleukin (IL)-6, IL-8, IL-12 und
Tumor-Nekrose-Faktor- (TNF-) durch residente Zellen nachgewiesen werden. Der
Mangel an immunregulatorischen Zytokinen führte hierbei möglicherweise zu einem
immunologischen Ungleichgewicht mit assoziierten neuroinflammatorischen
Prozessen im weiteren Krankheitsverlauf. Zur Detektion von universellen
Reaktionsmustern residenter ZNS-Zellen bei verschiedenen Morbillivirusinfektionen
wurde die zelluläre Immunantwort im Großhirn bei der Seehundstaupe
phänotypisiert. Diesbezüglich wurden in einer Pilotstudie zunächst verschiedene
Leukozytenmarker auf ihre Kreuzreaktivität mit phozinem lymphatischen Gewebe
getestet. Wie bei der Hundestaupe konnte bei der Seehundstaupe eine primäre
Infektion von Neuronen in Verbindung mit einer frühzeitigen Aktivierung residenter
Zellen im Großhirn nachgewiesen werden.
Zur näheren Analyse der Funktion der Mikroglia wurden in Analogie zu den
Untersuchungen bei viralen ZNS-Krankheiten immunologische Abläufe im
traumatisierten Rückenmark und in organotypischen spinalen Schnittkulturen in vitro
beim Hund analysiert. Vergleichbar mit den Prozessen bei der Hundestaupe fand
sich eine vorwiegende Expression proinflammatorischer Zytokine, während
neuroprotektive Zytokine nicht (IL-10) oder erst verzögert (Transformierender
Wachstumsfaktor-) aufreguliert wurden.
Zusammenfassung 55
Basierend auf der hieraus abgeleiteten Hypothese, dass eine Dysregulation der
Immunhomöostase durch Virusinfektionen während der akuten Krankheitsphase
immunpathologische Prozesse initiiert, wurden anschließend neuropathologische
Vorgänge und immunologische Parameter unter experimentellen Bedingungen bei
der TME näher untersucht. Hierbei konnten im Mausmodell deutliche Parallelen mit
der Läsionsentwicklung in MS-Patienten sowie bei der Hunde- und Seehundstaupe
nachgewiesen werden. Der Vergleich suszeptibler SJL- und resistenter C57BL/6-
Mäusen zeigte außerdem, dass die Infektion von Oligodendrozyten und
Mikroglia/Makrophagen eine essentielle Voraussetzung für die Viruspersistenz und
Demyelinisierung darstellt.
Zur weiteren Charakterisierung des Einflusses des peripheren Immunsystems auf die
Initiation der Neuroinflammation bei der TME wurden Genexpressionsanalysen
durchgeführt. Im Zusammenhang mit der virusinduzierten Polioenzephalitis konnte
eine transiente Expression von Genen vorwiegend im Zervikallymphknoten während
der akuten Infektionsphase nachgewiesen werden. Eine funktionelle Analyse der
Daten zeigte einen deutlichen Zusammenhang der differentiell exprimierten Gene mit
der B-Zellimmunität, Antigenpräsentation und Aktivierung des Komplementsystems.
Die Ergebnisse sprechen für eine virusinduzierte Reaktion in den regionären
Lymphknoten des Gehirnes. Möglicherweise stellt die initiale B-Zellaktivierung eine
Voraussetzung für antikörpervermittelte Myelinschäden und eine
Kompartimentalisierung der Immunantwort im ZNS während der demyelinisierenden
TME-Phase dar.
Zur näheren Klassifizierung der lokal im Gehirn ablaufenden immunologischen
Prozesse während der akuten TME-Phase und deren Bedeutung für die
Krankheitsprogression wurde eine Phänotypisierung der zellulären Immunantwort
und Zytokinexpressionsanalyse durchgeführt. Der Vergleich unterschiedlicher
Mäusestämme zeigte hierbei eine deutliche Infiltration von Foxp3+-regulatorischen T-
Zellen und CD45R+-B-Zellen im Gehirn von suszeptiblen SJL-Mäusen in Verbindung
mit einer erhöhten Transkription von IL-10. Im Gegensatz hierzu zeigten resistente
C57BL/6-Mäuse eine deutlich erhöhte TNF--Expression während der frühen akuten
Infektionsphase, was mit einer beschleunigten Viruselimination im weiteren
Krankheitsverlauf vergesellschaftet war. IL-10 stellt hierbei potentiell einen
Zusammenfassung 56
entscheidenden Faktor für die reduzierte bzw. verzögert einsetzende protektive
TMEV-spezifische Immunantwort im Gehirn von SJL-Mäusen dar. Außerdem
unterstreichen die Ergebnisse die entscheidende Bedeutung der frühen akuten
Infektionsphase für die Progression der Demyelinisierung. Hierbei stellt sich die
Frage, inwieweit eine Änderung des Mikromilieus im ZNS immunmodulatorische
Prozesse und damit den Verlauf virusbedingter Entmarkungskrankheiten beeinflusst.
Zur Klärung wurde in einem weiteren experimentellen Ansatz der toxische Effekt von
Cuprizon auf den klinischen Verlauf und die spinale Entmarkung bei der TME
untersucht. Durch das Neurotoxin konnten oligodendrogliale Veränderungen mit
Apoptosen und einer reduzierten mRNA-Expression des basischen Myelinproteins,
allerdings keine Entmarkung im Rückenmark nachgewiesen werden. Die Befunde
sprechen für das Vorliegen von topograpischen Unterschieden sowohl in der
Intensität von Myelinopathien als auch in der Regenerationsfähigkeit des ZNS. Bei
der TME führte Cuprizon zu einer temporären klinischen Verbesserung und
reduzierten demyelinisierenden Leukomyelitis in Verbindung mit einer verminderten
zellulären Infiltration und Zytokinexpression im Rückenmark. Im Gegensatz zu rein
immunsuppressiven Therapieansätzen führte das Neurotoxin scheinbar zu einer
selektiven Hemmung der immunpathologischen Prozesse bei erhaltener protektiver
Immunität.
Die Untersuchungen verdeutlichen die besondere Bedeutung der Frühphase von
viralen und degenerativen ZNS-Krankheiten für die Initiation von
immunpathologischen Prozessen. Im Hinblick auf zukünftige immunmodulatorische
Strategien und Zelltransplantationen zur Therapie von chronischen ZNS-Krankheiten
müssen allerdings krankheits- und tierartspezifische Besonderheiten, die auf die
unterschiedliche Modulation durch Mikrogliazellen und das periphere Immunsystem
zurückzuführen sind, berücksichtigt werden.
Summary 57
7. Summary
Canine distemper leukoencephalomyelitis and Theiler’s murine encephalomyelitis
(TME) represent spontaneous and experimental viral animal models for
demyelinating disorders of the central nervous system (CNS). While autoimmunity
leads to demyelination in the chronic progressive phase of human multiple sclerosis
(MS), immunological and neurodegenerative processes during the initial disease
phase are largely undetermined. Therefore, the aims of the present studies were a
detailed characterization of neuropathological findings during the acute phase of
virus-induced CNS disorders and identification of factors, which induce immune
mediated tissue damage and myelin loss, respectively.
During the early phase of canine distemper leukoencephalitis a dominating
expression of proinflammatory cytokines, such as interleukin (IL)-6, IL-8, IL-12 and
tumor necrosis factor (TNF)- by resident cells of the cerebrum was detected. The
lack of immune regulatory cytokines is supposed to induce a derailment of the
immune response, which triggers neuroinflammation during the progressive disease
stage. In order to detect equivalent reaction patterns of resident glial cells in other
morbillivirus infections, cellular immune responses were phenotyped in the brain of
harbor seals suffering from phocine distemper. In a pilot study a series of leukocyte
markers were tested for cross reactivity with lymphoid cells of harbor seals. Similar to
canine distemper infected seals exhibited a predominant infection of neurons and
early activation of resident cells in the cerebral cortex.
To investigate microglial function in more detail, immunological parameters have
been determined in traumatized spinal cord tissue of dogs and canine organotypic
spinal cord slice cultures. As observed in canine distemper, a dominating expression
of proinflammatory cytokines and a lack (IL-10) or delayed (transforming growth
factor-β) upregulation of neuroprotective cytokines have been observed. Based on
the hypothesis, that a dysregulated immune homeostasis during early virus infection
contributes to immunopathology, neuropathological lesions and immune responses
have been investigated in TME, as a translational mouse model. Lesion development
in infected mice was similar to that observed in MS as well as in canine and phocine
distemper. Comparison of susceptible and resistant mouse strains revealed that the
Summary 58
switch of cell tropism from neurons to microglia and oligodendrocytes represents an
essential prerequisite for persistence of the TME virus and demyelination in SJL
mice.
To characterize the impact of the peripheral immune system upon the initiation of
neuroinflammation in the TME model, global gene expression analyses have been
performed. Here, associated with virus induced polioencephalitis a transient gene
expression was detected in the brain draining cervical lymph node during the early
acute infection phase. Functional annotation analyses revealed differential
expression of genes involved in B cell immunity, antigen presentation and
complement activation. Early gene expression is indicative of virus triggered immune
responses in the brain-draining lymph node, which might initiate antibody mediated
myelin damage and a compartimentalization of CNS-inflammation during the chronic
TME phase.
For further classification of local immune responses in the brain during acute
infection, phenotyping of infiltrating immune cells and cytokine expression analyses
have been performed. Comparison of mice with different mouse strains, revealed a
prominent infiltration of Foxp3+ regulatory T cells and CD45R+ B cells associated with
the mRNA expression of IL-10 in the brain of susceptible SJL mice. In contrast, an
early increase of TNF- mRNA transcription was associated with accelerated TME
virus elimination in resistant C57BL/6 mice. Accordingly, IL-10 represents a potential
candidate molecule for the impaired antiviral immunity and virus persistence in mice
with a susceptible genetic background. Furthermore, results substantiate the
hypothesis that an imbalanced cytokine milieu during the early infection phase
contributes to immune mediated demyelination in the chronic phase. This raised the
question about the impact of neurodegenerative changes upon immunmodulatory
mechanisms in infectious MS models.
In a subsequent experiment, the effect of the neurotoxin cuprizone upon the clinical
course and spinal demyelination was tested in TME virus infected mice. Cuprizone
induces oligodendroglial alterations with apoptosis induction and reduced myelin
basic protein expression, but without overt spinal demyelination, which substantiates
the concept of major morphological and functional regional differences between brain
Summary 59
and spinal cord. In TME virus infected mice cuprizone causes a temporary
improvement of clinical signs and reduced demyelinating leukomyelitis despite toxic
myelin damage in the corpus callosum. This process was associated with reduced
infiltration of leukocytes and decreased expression of pro- and anti-inflammatory
cytokines in the spinal cord. This phenomenon is supposed to be a consequence of
selective inhibition of detrimental inflammatory responses with maintained protective
immunity against the virus.
In summary, the present studies highlight the importance of early inflammatoty
responses for the pathogeneses of progressive demyelination. However, disease
phase and species specific properties, such as differences of modulatory effects of
microglial cells and the peripheral immune system, have to be taken into
consideration for future immunoregulatory strategies and cell transplantation
approaches for the treatment of chronic CNS disorders.
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Darstellung des eigenen Anteils an den wissenschaftlichen Veröffentlichungen 79
9. Darstellung des eigenen Anteils an den wissenschaftlichen Veröffentlichungen
Beineke A, Markus S, Borlak J, Thum T, Baumgärtner W. Increase of pro-inflammatory
cytokine expression in non-demyelinating early cerebral lesions in nervous canine
distemper. Viral Immunology 2008; 21: 401-410.
Konzept, Versuchsplanung: Markus, Beineke, Baumgärtner
Experimentelle Durchführung, Auswertung: Markus, Beineke, Thum, Borlak
Diskussion, Beratung Beineke, Markus, Baumgärtner
Manuskript: Beineke, Markus
Seibel H, Stimmer L, Siebert U, Beineke A. Immunohistochemical characterization of
selected cell markers for the detection of hematopoietic cells in formalin-fixed,
paraffin wax-embedded lymphoid tissues of harbor seals (Phoca vitulina) and
walruses (Odobenus rosmarus rosmarus). Veterinary Immunology and
Immunopathology 2010; 137: 305-309.
Konzept, Versuchsplanung: Beineke
Experimentelle Durchführung, Auswertung: Seibel, Stimmer, Beineke
Diskussion, Beratung: Beineke, Seibel, Siebert
Manuskript: Seibel, Beineke
Stimmer L, Siebert U, Wohlsein P, Fontaine JJ, Baumgärtner W, Beineke A. Viral
protein expression and phenotyping of inflammatory responses in the central nervous
system of phocine distemper virus-infected harbor seals (Phoca vitulina). Veterinary
Microbiology 2010; 145: 23-33.
Konzept, Versuchsplanung: Beineke, Baumgärtner
Experimentelle Durchführung, Auswertung: Stimmer, Beineke
Diskussion, Beratung Beineke, Baumgärtner, Siebert,
Wohlsein, Fontaine
Manuskript Stimmer, Beineke
Darstellung des eigenen Anteils an den wissenschaftlichen Veröffentlichungen 80
Spitzbarth I, Bock P, Haist V, Stein VM, Tipold A, Wewetzer K, Baumgärtner W,
Beineke A. Prominent microglial activation in the early pro-Inflammatory immune
response in naturally occurring canine spinal cord injury. Journal of Neuropathology
and Experimental Neurology 2011; 70: 703-714.
Konzept, Versuchsplanung: Beineke, Baumgärtner, Spitzbarth
Experimentelle Durchführung, Auswertung: Spitzbarth, Bock, Haist, Beineke
Diskussion, Beratung: Beineke, Spitzbarth, Stein, Tipold,
Wewetzer, Baumgärtner
Manuskript: Spitzbarth, Beineke, Baumgärtner
Kummerfeld M, Meens J, Haas L, Baumgärtner W, Beineke A. Generation and
characterization of a polyclonal antibody for the detection of Theiler's murine
encephalomyelitis virus by light and electron microscopy. Journal of Virological
Methods 2009; 160: 185-188.
Konzept, Versuchsplanung: Beineke
Experimentelle Durchführung, Auswertung: Kummerfeld, Meens, Beineke
Diskussion, Beratung: Beineke, Meens, Haas,
Baumgärtner
Manuskript: Beineke, Kummerfeld
Kummerfeld M, Seehusen F, Klein S, Ulrich R, Kreutzer R, Gerhauser I, Herder V,
Baumgärtner W, Beineke A. Periventricular demyelination and axonal pathology is
associated with subependymal virus spread in a murine model for multiple sclerosis.
Intervirology, im Druck.
Konzept, Versuchsplanung: Beineke, Baumgärtner
Experimentelle Durchführung, Auswertung: Kummerfeld, Seehusen, Klein,
Ulrich, Kreutzer, Gerhauser,
Herder, Beineke
Diskussion, Beratung: Beineke, Baumgärtner
Manuskript: Beineke, Kummerfeld
Darstellung des eigenen Anteils an den wissenschaftlichen Veröffentlichungen 81
Navarrete-Talloni MJ, Kalkuhl A, Deschl U, Ulrich R, Kummerfeld M, Rohn K,
Baumgärtner W, Beineke A. Transient peripheral immune response and central
nervous system leaky compartmentalization in a viral model for multiple sclerosis.
Brain Pathology 2010; 20: 890-901.
Konzept, Versuchsplanung: Beineke, Baumgärtner, Kalkuhl,
Deschl
Experimentelle Durchführung, Auswertung: Navarrete-Talloni, Ulrich,
Kummerfeld, Beineke
Diskussion, Beratung: Beineke, Baumgärtner, Ulrich,
Rohn
Manuskript: Navarrete-Talloni, Beineke
Herder V, Gerhauser I, Klein SK, Almeida P, Kummerfeld M, Ulrich R, Seehusen F,
Rohn K, Schaudien D, Baumgärtner W, Hühn J, Beineke A. Interleukin-10 expression
during the acute phase is a putative prerequisite for delayed viral elimination in a
murine model for multiple sclerosis. Journal of Neuroimmunology 2012, 15: 27-39.
Konzept, Versuchsplanung: Beineke, Baumgärtner
Experimentelle Durchführung, Auswertung: Klein, Gerhauser, Herder,
Kummerfeld, Ulrich, Beineke
Diskussion, Beratung: Beineke, Baumgärtner, Rohn
Manuskript: Beineke, Klein, Herder
Herder V, Hansmann F, Stangel M, Skripuletz T, Baumgärtner W, Beineke A. Lack of
cuprizone-induced demyelination in the murine spinal cord despite oligodendroglial
alterations substantiates the concept of site-specific susceptibilities of the central
nervous system. Neuropathology and Applied Neurobiology 2011; 37: 676-684.
Konzept, Versuchsplanung: Beineke, Herder, Stangel,
Baumgärtner
Experimentelle Durchführung, Auswertung: Herder, Hansmann, Skripuletz
Diskussion, Beratung: Beineke, Herder, Stangel,
Baumgärtner
Manuskript: Herder, Beineke, Baumgärtner
Darstellung des eigenen Anteils an den wissenschaftlichen Veröffentlichungen 82
Herder V, Hansmann F, Stangel M, Schaudien D, Baumgärtner W, Beineke A.
Cuprizone inhibits demyelinating leukomyelitis by reducing immune responses in the
spinal cord without virus exacerbation in an infectious model of multiple sclerosis.
Journal of Neuroimmunology 2012;244: 84-93.
Konzept, Versuchsplanung: Beineke, Herder, Stangel,
Baumgärtner
Experimentelle Durchführung, Auswertung: Herder, Hansmann, Beineke
Diskussion, Beratung: Beineke, Herder, Stangel,
Schaudien, Baumgärtner
Manuskript: Herder, Beineke
Danksagung 83
10. Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Wolfgang Baumgärtner für seine
Unterstützung bei der Habilitation, seine Erreichbarkeit zu jeder Uhrzeit, seinen
ansteckenden Enthusiasmus und seine wertvollen Ratschlägen zu allen Fragen der
Forschung.
Außerdem möchte ich mich bei meinen jetzigen und ehemaligen Doktorandinnen und
Doktoranden - Yvonne Barthel, Dr. Suliman Ahmed Elmarabet, Vanessa Herder
PhD, Maximilian Iseringhausen, Dr. Stephanie Klein, Dr. Maren Kummerfeld, Maria
José Navarrete-Tallonie PhD, Visar Qeska, Dr. Lev Stimmer und Ingo Spitzbarth - für
ihren unermüdlichen Einsatz im Labor und am Schreibtisch ganz herzlich bedanken.
Ohne ihr Engagement und ihre kreativen Ideen wären diese Arbeiten und
Manuskripte nicht entstanden.
Pedro Almeida, Dr. Patricia Bock, Prof. Dr. Jürgen Borlak, Dr. Ulrich Deschl, Prof. Dr.
Jean-Jacques Fontaine, Dr. Ingo Gerhauser, Prof. Dr. Ludwig Haas, Dr. Verena
Haist, Florian Hansmann, Prof. Dr. Jochen Hühn, Dr. Arno Kalkuhl, Dr. Robert
Kreutzer, Dr. Stephanie Markus, Dr. Jochen Meens, Dr. Christina Puff, Dr. Karl Rohn,
Dr. Dirk Schaudien, Dr. Frauke Seehusen, Dr. Henrike Seibel, PD Dr. Ursula Siebert,
Dr. Thomas Skripuletz, Prof. Dr. Martin Stangel, PD Dr. Veronika Stein, Prof. Dr.
Thomas Thum, Prof. Dr. Andrea Tipold, Dr. Reiner Ulrich, Prof. Dr. Konstantin
Wewetzer und Dr. Peter Wohlsein möchte ich für die fabelhaften Kooperationen bei
den Versuchsplanungen und -durchführungen sowie für die zahlreichen Anregungen
bei der Zusammenstellung der Manuskripte danken.
Bettina Buck, Petra Grünig, Claudia Herrmann, Kerstin Rohn, Kerstin Schöne
Caroline Schütz und Danuta Waschke danke ich für die professionelle, technische
Unterstützung bei der Durchführung der Experimente und kompetente Einarbeitung
der Doktorandinnen und Doktoranden in die verschiedenen Labormethoden.
Bei allen anderen Kolleginnen und Kollegen am Institut für Pathologie bedanke ich
mich für die nette Arbeitsatmosphäre und gute Zusammenarbeit, die den
tagtäglichen, reibungslosen Ablauf in Forschung, Lehre und Diagnostik ermöglichen.
Danksagung 84
Der Deutschen Forschungsgemeinschaft möchte ich für die finanzielle Unterstützung
(BE-4200/1-1 und BA 815/10-1) sowie allen Mitgliedern der Forschergruppe 1103
(„Neurodegenereration und –regeneration bei ZNS-Erkrankungen des Hundes“) für
die Betrachtung von neurowissenschaftlichen Themen aus verschiedenen
Blickwinkeln und die interessanten Diskussionen danken.
Meiner wunderbaren Frau Dr. Silke Block danke ich für die kritische Durchsicht der
Habilitationsschrift, liebevolle Motivation und alles andere.
Anhang 85
11. Anhang 11.1. Publikation 1
Pathogenesis and immunopathology of systemic and nervous canine
distemper
Beineke A, Puff C, Seehusen F, Baumgärtner W.
Veterinary Immunology and Immunopathology 2009; 127: 1-18.
doi:10.1016/j.vetimm.2008.09.023
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19019458 Abstract
Canine distemper is a worldwide occurring infectious disease, caused by a
morbillivirus, closely related to measles and rinderpest virus. Beside dogs, the natural
host range comprises predominantly other carnivore species, such as ferrets and
seals. Canine distemper virus (CDV) infection of dogs is characterized by a systemic,
often fatal clinical course. Here, the main manifestations include demyelinating
leukoencephalitis (DL), resembling multiple sclerosis in men, and
immunosuppression. The virus represents an enveloped negative-sense single-
stranded RNA virus, which contains six structural proteins, the nucleocapsid, the
phospho-, the large, the matrix-, the hemagglutinin, and the fusion protein. Further,
CDV infects a huge variety of different cell types, including epithelial, mesenchymal,
neuroendocrine and hematopoietic cells. Here, lymphotropism and subsequent
impaired immune function is supposed to be partially a consequence of viral entry via
the signaling lymphocyte activation molecule (SLAM) expressed on different
lymphoid cell subsets, as described for human measles. Immunosuppression and
lymphoid depletion is due to diminished antigen presentation and lymphocyte
maturation as well as lymphoid cell apoptosis, respectively. The early phase of DL is
a sequel of virus-induced damage, while a CD4+-mediated delayed type
Anhang 86
hypersensitivity and cytotoxicity by CD8+ cells contribute to demyelination in the
chronic phase of the disease. Here, an expression of the pro-inflammatory cytokines
interleukin (IL)-6, IL-8, tumor necrosis factor- and IL-12 and a lack of
immunmodulatory cytokines during the initiation of demyelination is indicative of a
derailment of the immune system in canine distemper. Additionally, an altered
balance between matrix metalloproteinases and their inhibitors is pivotal for the
breakdown of the blood-brain barrier, leukocyte infiltration and myelin damage in DL.
Diagnose of canine distemper is often complicated by variable clinical courses and
antibody titers. Furthermore, CDV antigen detection can be negative in the chronic
phase of the disease. Therefore, highly sensitive PCR-based molecular techniques
represent important tools in veterinary diagnostics as a part of an effective disease
control.
Anhang 87
11.2. Publikation 2
Increase of pro-inflammatory cytokine expression in non-demyelinating early
cerebral lesions in nervous canine distemper
Beineke A, Markus S, Borlak J, Thum T, Baumgärtner W.
Viral Immunology 2008; 21: 401-410. doi: 10.1089/vim.2008.0043
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19115929
Abstract
Canine distemper virus (CDV) infection of the central nervous system results in
lesions of the gray and white matter. While a biphasic disease process has been
discussed for leukoencephalitis with a prominent loss of viral protein expression,
polioencephalitis has been associated with virus persistence. Using semi-quantitative
RT-PCR, expression of pro- and anti-inflammatory cytokines such as interleukin (IL)-
1β, -2, -6, -8, -10, -12, tumor necrosis factor (TNF)-, interferon (IFN)-β and
transforming growth factor (TGF)-β were studied in the cerebra of distemper dogs
with white matter lesions in the cerebellum. Additionally, cytokine values were
correlated with the degree of CDV infection, major histocompatibility complex class II
(MHC II) expression and infiltration of CD4-, CD8- and CD3-positive lymphocytes.
Cerebral CDV infection was not associated with detectable light microscopic lesions
or infiltration of B and T lymphocytes. However, an increasing number of CDV
antigen positive cells, was associated with an up-regulation of MHC II antigen. RT-
PCR results revealed a significant up-regulation of IL-6, -8, -12 and TNF- in the
cerebra of distemper dogs, whereas IL-10 and TGF-β showed no significant
increase. Elevated cytokine values were directly related to the presence of CDV
antigen and MHC II up-regulation, however, succeeding increases of the latter did
not result in an additional proportional elevation of cytokine expression values.
Summarizing, the present study demonstrates the expression of pro-inflammatory
cytokines by resident neural cell following CDV infection. Furthermore, the lack of
Anhang 88
light microscopic changes indicates that additional factors besides cytokines are
necessary for the development of a distemper characteristic neuropathology.
Anhang 89
11.3. Publikation 3
Immunohistochemical characterization of selected cell markers for the
detection of hematopoietic cells in formalin-fixed, paraffin wax-embedded
lymphoid tissues of harbor seals (Phoca vitulina) and walruses (Odobenus
rosmarus rosmarus)
Seibel H, Stimmer L, Siebert U, Beineke A.
Veterinary Immunology and Immunopathology 2010; 137: 305-309.
doi:10.1016/j.vetimm.2010.05.012.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20566219
Abstract
To facilitate a detailed investigation of pinniped lymphoid organs, 30 monoclonal
antibodies (mAb) as well as eight polyclonal antibodies (pAb) of different species
specificities directed against cell antigens of the hematopoietic system were tested
for immunohistochemical cross-reactivity on formalin-fixed, paraffin wax-embedded
tissues of harbor seals (Phoca vitulina) and a walrus (Odobenus rosmarus
rosmarus). Six monoclonal and eight polyclonal antibodies showed specific
immunoreactivities. Lymphocytes were immunolabeled by an anti-CD3 pAb, anti-
Foxp3 mAb and anti-CD79 mAb, while plasma cell subpopulations were recognized
by anti-IgA pAb, anti-IgG pAb and anti-IgM pAb as well as by anti-kappa- and anti-
lambda light chain pAb. Cells of the histiocytic lineage were recognized by lysozyme-
, myeloid/histiocyte antigen-, and CD68-specific markers. Furthermore, dendritic cell-
like cells were detected by an anti-S100 protein pAb. The MHC class II antigen was
labeled on the majority of immune cells of the harbor seal and walrus using a bovine
mAb. Mast cells were stained by an anti-mast cell tryptase mAb. Thus, using these
antibodies from various species, it is now possible to determine phenotypical
changes in lymphoid organs and detect different leukocyte subsets involved in
inflammatory responses in archived tissue samples of these pinniped species.
Anhang 90
11.4. Publikation 4
Viral protein expression and phenotyping of inflammatory responses in the
central nervous system of phocine distemper virus-infected harbor seals
(Phoca vitulina)
Stimmer L, Siebert U, Wohlsein P, Fontaine JJ, Baumgärtner W, Beineke A.
Veterinary Microbiology 2010; 145: 23-33. doi:10.1016/j.vetmic.2010.02.034.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20303682
Abstract
The central nervous system (CNS) represents an important target organ of the
phocine distemper virus (PDV). The aim of the present study was to characterize
pathological changes in the CNS of harbor seals suffering from natural PDV-
infection. The distribution of virus protein and mRNA was investigated by
immunhistochemistry (IHC) and in situ hybridization, respectively. In addition,
inflammatory and glial cells were characterized by IHC. Polioencephalitis with glial
activation, neuronal death and perivascular mononuclear infiltrations in the cerebral
cortex was the main histopathological finding. Inflammatory responses, dominated by
CD3+ T-cells and activated microglia/macrophages were associated with a prominent
MHC-II upregulation within the CNS. Viral protein was found predominantly in
neurofilament-expressing neurons within inflamed areas as demonstrated by
immunohistochemical double-labeling. Morbillivirus nucleo-, phospho-, matrix-,
fusion- and hemagglutinin-proteins were found in CNS lesions. The expressions of
viral matrix- and fusion-proteins were reduced in severely inflamed plaques.
Comparison of viral protein and mRNA expression revealed a diminished amount of
viral phosphoprotein preferentially associated with perivascular inflammation. In
summary, CNS-lesions in PDV-infected seals are similar to canine distemper virus-
induced acute polioencephalitis in dogs and measles virus inclusion body
polioencephalitis in men, respectively.
Anhang 91
11.5. Publikation 5
Prominent microglial activation in the early pro-Inflammatory immune response
in naturally occurring canine spinal cord injury
Spitzbarth I, Bock P, Haist V, Stein VM, Tipold A, Wewetzer K, Baumgärtner W,
Beineke A.
Journal of Neuropathology and Experimental Neurology 2011; 70: 703-714. doi:
10.1097/NEN.0b013e3182270f8e.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21760535
Abstract
Spinal cord injury (SCI) represents a devastating traumatic disease in humans
indicating the need for a solid and broad understanding of its pathogenesis to
develop new therapeutic strategies. Though several aspects of the human diseases
have been investigated in detail in various rodent models, extrapolation of these
findings requires the use of a large animal model that mimics the human disease
more closely. Similar to humans, dogs are frequently affected by spontaneously
occurring SCI and changes bear a striking resemblance to the human counterpart.
The aims of the present study were twofold i) to investigate the temporal course of
the immune response during naturally occurring canine SCI and ii) to compare the
results with an in vitro system devoid of peripheral immune cells using organotypic
spinal cord slice cultures. Immunohistochemistry revealed that the inflammatory
response during canine SCI was largely restricted to resident immune cells,
demonstrated by an activation of major histocompatibility complex class II expressing
microglia/macrophages in the subacute phase. In parallel, using quantitative
polymerase chain reaction, a significant up-regulation of the pro-inflammatory
cytokines interleukin (IL)-6, IL-8 and a trend of up-regulation of tumor necrosis factor-
α during the acute phase of naturally occurring SCI was detected. In contrast,
expression of neuroprotective cytokines remained unchanged (IL-10) or showed a
Anhang 92
delayed up-regulation (transforming growth factor-β). The hypothesis that resident
cells play a pivotal role during the immune response of SCI was verified using
organotypic spinal cord slices which showed a similar activation of MHC class II
positive microglia with a distinct but prolonged up-regulation of inflammatory
cytokines. The present study substantiates the assumption that canine SCI
represents an important bridging model for clinical and preclinical studies of human
SCI and, thereby, closing the gap between experimental basic research and
application of treatment strategies in humans.
Anhang 93
11.6. Publikation 6
Generation and characterization of a polyclonal antibody for the detection of
Theiler's murine encephalomyelitis virus by light and electron microscopy
Kummerfeld M, Meens J, Haas L, Baumgärtner W, Beineke A.
Journal of Virological Methods 2009; 160: 185-188.
doi:10.1016/j.jviromet.2009.04.030.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19414033
Abstract
The BeAn strain of Theiler‘s murine encephalomyelitis virus (TMEV) causes a
demyelinating leukomyelitis in mice, which serves as an important animal model for
multiple sclerosis in humans. The present report describes the generation and
characterization of a TMEV-specific polyclonal antibody by immunization of rabbits
with purified TMEV of the BeAn strain. The specificity of the antibody was confirmed
by Western blotting and sequence analysis of the recognized antigen by high
resolution mass spectrometry. Furthermore, the presence of TMEV-specific
polyclonal antibodies in postimmunization sera was tested on TMEV-infected L-cells
(murine lung tumor cell line) using an immunofluorescence assay. Additionally, the
rabbit serum enabled virus detection in formalin-fixed and paraffin-embedded TMEV-
infected BHK21 cell pellets and brain tissue of TMEV-infected mice by
immunohistochemistry. Immune electron microscopy revealed the visualization of
colloid gold-labeled picornavirus-typical paracrystalline arrays and non-aggregated
viral particles of TMEV-infected BHK21 cells. The present report demonstrates the
applicability of the generated marker to investigate TMEV cell tropism and viral
spread on a cellular and subcellular level in future studies.
Anhang 94
11.7. Publikation 7
Periventricular demyelination and axonal pathology is associated with
subependymal virus spread in a murine model for multiple sclerosis
Kummerfeld M, Seehusen F, Klein S, Ulrich R, Kreutzer R, Gerhauser I, Herder V,
Baumgärtner W, Beineke A.
Intervirology. doi: 10.1159/000336563.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22538300
Abstract
Objectives: Theiler´s murine encephalomyelitis virus (TMEV) infection of mice is a
widely used animal model for demyelinating disorders, such as multiple sclerosis
(MS). The aim of the present study was to identify topographical differences of
TMEV spread and demyelination in the brain of experimentally infected susceptible
SJL/J mice and resistant C57BL/6 mice. Methods: Demyelination was confirmed
using Luxol fast blue-cresyl violet-staining and axonal damage by neurofilament-
and β-amyloid precursor protein-specific immunohistochemistry. Viral dissemination
within the central nervous system (CNS) was quantified by immunohistochemistry
and in situ-hybridization. Further, the phenotype of infected cells was determined by
confocal laser scanning microscopy. Results: An early transient infection of
ependymal and periventricular cells followed by demyelination and axonopathies
around the fourth ventricle in SJL/J mice was noticed. Periventricular and brain
stem demyelination was associated with a predominant infection of
microglia/macrophages and oligodendrocytes. Conclusions: Summarized, the
demonstration of ependymal infection and subjacent spread into the brain
parenchyma as well as regional virus clearance despite ongoing demyelination and
axonal damage in other CNS compartments allows new insights into TME
pathogenesis. This novel aspect of TMEV CNS interaction will enhance the
understanding of region-specific susceptibilities to injury and regenerative capacities
of the brain in this infectious MS model.
Anhang 95
11.8. Publikation 8
Transient peripheral immune response and central nervous system leaky
compartmentalization in a viral model for multiple sclerosis
Navarrete-Talloni MJ, Kalkuhl A, Deschl U, Ulrich R, Kummerfeld M, Rohn K,
Baumgärtner W, Beineke A.
Brain Pathology 2010; 20: 890-901. doi:10.1111/j.1750-3639.2010.00383.x.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20331618
Abstract
Theiler’s virus-induced demyelination represents an important animal model to study
the chronic-progressive form of multiple sclerosis. The aim of the present study was
to identify specific genes and pathways in the deep cervical lymph node (cLN) and
spleen in experimentally infected SJL-mice, using DNA microarrays. Analyses
identified 387 genes in the deep cLN and only six genes in the spleen of infected
animals. The lymph node presented 27.4% of genes with fold changes +/- 1.5 at 14
days post infection (dpi) and a reduced transcription at later time points. K-means
clustering analyses resulted in five clusters. Accordingly, functional annotation
revealed that the B-cell immune response pathway was the most up-regulated cluster
at the early phase. Additionally, an increase of CD68- and lysozyme-positive cells in
the deep cLN was observed by immunohistochemistry. Polioencephalitis was most
intense at 14 dpi, and the spinal cord demyelinating leukomyelitis started at 42 dpi.
In summary, early gene expression is indicative of virus trigged immune responses in
the CNS-draining lymph node. The decreased gene transcription in the deep cLN
during the chronic phase and the low number of spleen genes supports the
hypothesis of a compartmentalized inflammation within the CNS, as described in
progressive multiple sclerosis.
Anhang 96
11.9. Publikation 9
Interleukin-10 expression during the acute phase is a putative prerequisite for
delayed viral elimination in a murine model for multiple sclerosis
Herder V, Gerhauser I, Klein SK, Almeida P, Kummerfeld M, Ulrich R, Seehusen F,
Rohn K, Schaudien D, Baumgärtner W, Huehn J, Beineke A.
Journal of Neuroimmunology 2012; 15: 27-39.
doi.org/10.1016/j.jneuroim.2012.04.010
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22591945
Abstract
Reduced protective immunity leads to viral persistence and demyelination in Theiler’s
murine encephalomyelitis. The aim of the present study was to compare the
phenotype of brain-infiltrating leukocytes and cytokine expression in susceptible SJL
and resistant C57BL/6 mice during Theilervirus-induced acute polioencephalitis. In
contrast to C57/BL6 mice, SJL mice show an increased number of Foxp3+ regulatory
T cells and CD45R+ B cells associated with delayed viral elimination and elevated IL-
10 mRNA transcripts in the brain. Results substantiate the hypothesis that an
imbalanced cytokine milieu during the early infection phase contributes to ineffective
antiviral immunity in animals with a susceptible genetic background.
Anhang 97
11.10. Publikation 10
Lack of cuprizone-induced demyelination in the murine spinal cord despite
oligodendroglial alterations substantiates the concept of site-specific
susceptibilities of the central nervous system
Herder V, Hansmann F, Stangel M, Skripuletz T, Baumgärtner W, Beineke A.
Neuropathology and Applied Neurobiology 2011, 37: 676-84. doi: 10.1111/j.1365-
2990.2011.01168.x.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21366663
Abstract
Though the different regions of the immune-privileged central nervous system (CNS)
consist morphologically of the same glial cell populations, brain and spinal cord may
respond differentially to insults. Based on the hypothesis that glial cell distribution
and toxin-related susceptibility differs between CNS regions the aim of the present
study was to investigate the impact of cuprizone on myelin integrity of the spinal cord
white matter and grey matter in SJL- and C57BL/6-mice compared to the corpus
callosum. Though cuprizone feeding resulted in expected characteristic lesions in the
corpus callosum of SJL-mice after five weeks feeding period no myelin damage as
determined by luxol fast blue staining as well as myelin basic protein (MBP)-,
proteolipid protein (PLP)- and CNPase-specific immunohistochemistry was found in
the spinal cord white and grey matter. In addition, the number of astrocytes as well
as T- and B-cells did not differ between cuprizone-fed and control animals in the
spinal cord. However, microglial activation was observed after withdrawal of the toxin
as demonstrated by CD107b-immunohistochemistry and CD11b-specific RT-qPCR.
In the early phase of cuprizone-feeding apoptosis was increased in the spinal cord
and MBP-mRNA-copy numbers were reduced. Additionally, cuprizone-feeding
reduced the number of NogoA-positive oligodendrocytes. Summarized, lack of myelin
loss in the cervical and thoracic spinal cord of cuprizone fed mice substantiates the
Anhang 98
concept of major morphologic and most likely also of functional regional differences
between brain and spinal cord. Possible mechanisms include site-specific
susceptibilities to oxidative stress or cytokines, which might have major implication
on the pathogenesis of demyelinating diseases.
Anhang 99
11.11. Publikation 11
Cuprizone inhibits demyelinating leukomyelitis by reducing immune responses
in the spinal cord without virus exacerbation in an infectious model of multiple
sclerosis
Herder V, Hansmann F, Stangel M, Schaudien D, Baumgärtner W, Beineke A.
Journal of Neuroimmunology 2012; 244: 84-93. doi:10.1016/j.jneuroim.2012.01.010.
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22329906
Abstract
Multiple sclerosis is one of the most common demyelinating central nervous system
diseases in young adults. Theiler’s murine encephalomyelitis (TME) is a widely used
virus-induced murine model for human myelin disorders. Immunosuppressive
approaches generally reduce antiviral immunity and therefore increase virus
dissemination with clinical worsening. In the present study, the progressive course of
TME was significantly delayed due to a five-week cuprizone-feeding period.
Cuprizone was able to minimize demyelinating leukomyelitis without virus
exacerbation. This phenomenon is supposed to be a consequence of selective
inhibition of detrimental inflammatory responses with maintained protective immunity
against the virus.
