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Modifizierung von Kollagenmatrizes zur Verbesserung der Angiogenese:

Eigenschaften von heparinisierten und mit VEGF beladenen

Kollagenschwämmen

Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-WestfälischenTechnischen Hochschule Aachen

zur Erlangung des akademischen Grades eines

Doktors der Medizin

genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Gerrit Christian Grieb

aus

Göttingen

Berichter: Herr Universitätsprofessor Dr.med. Dr.univ.med. N. Pallua

Herr Universitätsprofessor

Dr.rer.nat. J. Bernhagen Tag der mündlichen Prüfung: 26. Juni 2006 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar

II

Meinen Eltern Hildegard und Norbert Grieb

III

1 Einleitung ........................................................................................................... 1

1.1 Wundersatz .................................................................................................................................. 1

1.1.1 Wundersatz allgemein ....................................................................................................... 1 1.1.2 Hautdefekt am Beispiel der chronischen Wunde............................................................... 2 1.1.3 Bekannte Hautersätze und Therapieformen zur Deckung von Hautdefekten................... 3

1.2 VEGF............................................................................................................................................. 7

1.2.1 Angiogenese, Bildung von neuen Blutgefäßen ................................................................. 7 1.2.2 Wachstumsfaktoren mit angiogenetischer Wirkung .......................................................... 8 1.2.3 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor)..................................................................... 9

1.3 Kollagen ..................................................................................................................................... 11

1.3.1 Kollagen als Gewebsersatz und Trägermaterial.............................................................. 11 1.3.2 Eigenschaften von Kollagen ............................................................................................ 12 1.3.3 Struktur und natürliche Vernetzung ................................................................................. 12 1.3.4 Kollagenabbau und exogene Verknüpfungen ................................................................. 15 1.3.5 Künstliche Vernetzung von Kollagen............................................................................... 15 1.3.6 Vernetzung mit EDC/NHS ............................................................................................... 16

1.4 Bindungen von VEGF an Kollagen über Heparin .................................................................. 18

1.4.1 Heparin, Struktur und Funktion........................................................................................ 18 1.4.2 Bindung von Heparin an Kollagen ................................................................................... 19 1.4.3 Bindung von Wachstumsfaktoren an Heparin ................................................................. 20

1.5 Arbeitsziel und Aufgabenstellung........................................................................................... 21

2 Material............................................................................................................. 22

2.1 Geräte ......................................................................................................................................... 22

2.2 Reagenzien und Lösungen ...................................................................................................... 24

2.3 Trägermaterial ........................................................................................................................... 26

2.4 Zellen .......................................................................................................................................... 26

3 Methoden ......................................................................................................... 27

3.1 Herstellung der modifizierten Schwämme ............................................................................. 27

IV

3.2 Quantitative Bestimmung von VEGF mittels ELISA.............................................................. 29

3.2.1 Prinzip des ELISA............................................................................................................ 29 3.2.2 Durchführung des VEGF-ELISA...................................................................................... 30 3.2.3 Bestimmung der VEGF-Stabilität in vitro ......................................................................... 30 3.2.4 VEGF-Freisetzung der modifizierten Schwämme in vitro................................................ 31

3.3 Bestimmung von biologischen Effekten modifizierter Kollagenschwämme in der Zellkultur .......................................................................................................................................... 32

3.3.1 Zellkultivierung von HUVECs........................................................................................... 32 3.3.2 Bestimmung des proliferativen Effektes modifizierter Kollagenschwämme in der

24-well-Platte..... .............................................................................................................. 33 3.3.3 Bestimmung des proliferativen Effektes modifizierter Kollagenschwämme in der

6-well-Platte.... ................................................................................................................. 35 3.3.4 Ermittlung der VEGF-Freisetzung modifizierter Schwämme in der Zellkultur ................. 37 3.3.5 Ermittlung der Zellproliferation mittels BrdU-Test............................................................ 37 3.3.6 Ermittlung der Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Kammer................................................. 38

3.4 Histologische Untersuchung ................................................................................................... 40

3.5 Datenverarbeitung und statistische Auswertung.................................................................. 40

4 Ergebnisse ....................................................................................................... 41

4.1 ELISA-Messungen..................................................................................................................... 41

4.1.1 VEGF-Stabilität in vitro .................................................................................................... 41 4.1.2 VEGF-Release-Kinetik in vitro ......................................................................................... 43

4.2 Zellkultur .................................................................................................................................... 55

4.2.1 VEGF-Release-Kinetik in der Zellkultur........................................................................... 55 4.2.2 Der proliferative Effekt der modifizierten Kollagenschwämme in der 24-well-Platte mit

je 10000 HUVECs pro well .............................................................................................. 57 4.2.3 Der proliferative Effekt der modifizierten Kollagenschwämme in der 24-well-Platte mit

je 25000 HUVECs pro well .............................................................................................. 60 4.2.4 Der proliferative Effekt der modifizierten Kollagenschwämme in der 6-well-Platte mit

je 125000 HUVECs pro well ............................................................................................ 63

4.3 Histologie ................................................................................................................................... 64

V

5 Diskussion ....................................................................................................... 69

5.1 Biomaterialen............................................................................................................................. 69

5.1.1 Kollagen als artifizieller Hautersatz.................................................................................. 69 5.1.2 Vorteile der modifizierten Matrix ...................................................................................... 70

5.2 Eigenschaften von VEGF ......................................................................................................... 71

5.2.1 VEGF-Verhalten in vitro................................................................................................... 71 5.2.2 VEGF-Verhalten in vivo ................................................................................................... 72

5.3 Eigenschaften und biologische Effekte der modifizierten Kollagenmatrix ........................ 73

5.3.1 Freisetzungskinetik von VEGF ........................................................................................ 73 5.3.2 Einfluß der Matrix auf die Proliferation von Endothelzellen............................................. 78

5.4 Ausblick ..................................................................................................................................... 84

6 Zusammenfassung.......................................................................................... 88 7 Literatur............................................................................................................ 90 8 Abkürzungsverzeichnis…………………………………….………...……..……..104 9 Danksagung….…....………………..…….….………...…..………………………..105

10 Curriculum Vitae………………..……..………...…..………………......…...……..107

VI

1

1 Einleitung 1.1 Wundersatz 1.1.1 Wundersatz allgemein Bei großflächigen Zerstörungen des Hautorgans, z.B. durch ausgedehnte chronische

Wunden oder bei schweren Verbrennungen kann nur eine ausreichende und

rechtzeitige Deckung bzw. Schließung der Wunde schwere Komplikationen, wie z.B.

eine tödliche Sepsis verhindern (Aubock and Fritsch 1987, Ward 1998, Zacchi et al.

1998). Die Behandlung von großflächigen Wunden nimmt somit in der plastischen

Chirurgie einen sehr hohen Stellenwert ein.

Neben dem reinen Verschluss der Wunde, z.B. durch autologe Transplantate oder

Biomaterialien, spielt auch die Wiederherstellung der angrenzenden Gewebe eine

wesentliche Rolle. Nicht nur die Rekonstruktion der ursprünglichen Form und

Funktion, sondern auch das ästhetische Ergebnis sind dabei von großer Bedeutung.

Die plastische Deckung durch autologe Hauttransplantate stellt eine gängige

Methode in der rekonstruktiven Chirurgie dar, bedeutet aber immer einen

zusätzlichen chirurgischen Eingriff in gesundes Gewebe mit weiteren möglichen

Komplikationen (Infektion, unbefriedigendes ästhetisches Ergebnis) (Grikscheit and

Vacanti 2002, Przybilski et al. 2004). Hinzu kommt, daß bei sehr ausgedehnten

Hautdefekten die Spenderareale auch einen limitierenden Faktor darstellen.

Diskussionen in der Literatur verdeutlichen, daß das Missverhältnis zwischen

Gewebebedarf und Gewebevorrat bei der Deckung von großflächigen Wunden

immer noch große Einschränkungen bedeutet (Peters et al. 1998). Auf der Suche

nach möglichen Alternativen, verweist die Literatur häufig auf die Herstellung von

Biomaterialien, welche die autologen Transplantate ersetzen können und

möglicherweise die Wundheilung, z.B. durch den Einsatz von Wachstumsfaktoren,

noch zusätzlich beschleunigen könnten. Die in-vitro-Herstellung von menschlichem

Gewebe, dem sogenannten „Tissue Engineering“, wird dabei eine besonders große

Bedeutung zugemessen (Badiavas et al. 2002).

2

1.1.2 Hautdefekt am Beispiel der chronischen Wunde Chronische Wunden stellen einen beachtlichen Anteil der in der Klinik anzutreffenden

Fälle mit ausgedehnter Zerstörung des Hautorgans dar. Kenntnisse der Ätiologie und

Therapiemöglichkeiten von chronischen Wunden sind somit für einen schnellen,

komplikationslosen Verschluss mit gutem funktionellem und ästhetischem Ergebnis

absolut essentiell (Falanga 1998).

Chronische Wunden sind per Definition Wunden, die nach vier Wochen

konsequenter lokaler und ursachenbezogener Behandlung makroskopisch keine

Heilungstendenzen aufweisen (Siewert 2001). Für das Auftreten solcher

Wundheilungsstörungen sind verschiedene Ursachen verantwortlich. Neben lokalen

Störfaktoren, wie Fremdkörper, Wundödem und Wundinfektion führen Mikro- (z.B.

bei Polyneuropathie) und Makroangiopathien (z.B. arterielle Verschlusskrankheit) zur

Ischämie. Dies hat eine Verminderung der nutritiven Substanzen im Gewebe, vor

allem aber eine lokale Hypoxie zu Folge (Siewert 2001). Der daraus resultierende

niedrige pO2 korreliert signifikant mit einer Verminderung der Zellproliferation und

Zunahmen der Wundgröße (Coerper et al. 1999). Auch eine chronisch venöse

Insuffizienz kann zu einer gestörten Wundheilung mit Ulcerationen führen. Als

Ursache wird neben einer Aktivierung der Leukozyten (Burnand et al. 1992) auch

eine Extravasion von Proteinen, u.a. auch Fibrin vermutet. Fibrinogen wird im

umliegenden Gewebe zu Fibrin aktiviert und bindet andere Proteine, wie z.B.

Wachstumsfaktoren. Somit wird die Wirkung für die Wundheilung wichtiger Faktoren

unterdrückt (Falanga and Eaglstein 1993). Neben den lokalen werden auch noch

systemische Störfaktoren in der Literatur beschrieben. Hierzu zählen u.a. reduzierter

Ernährungszustand, Stoffwechselerkrankungen (Diabetes mellitus), Immun-

suppression, Chemotherapie und Radiatio (Hehenberger et al. 1999).

Bei der Therapie von chronischen Wunden nimmt neben der feuchten

Wundbehandlung (Siewert 2001), der chirurgischen Wundsäuberung (Coerper et al.

1995) und der chirurgischen Revaskularisierung bzw. venenchirurgischen Sanierung

(Bello et al. 1999) der Hautersatz einen entscheidenden Stellenwert ein (Falanga et

al. 2002).

3

1.1.3 Bekannte Hautersätze und Therapieformen zur Deckung von Hautdefekten

Mittlerweile existiert eine große Anzahl an verschiedenen Methoden zur

Wundabdeckung. Die Gängigsten sollen hier kurz dargestellt werden.

Eine Möglichkeit des Wundverschlusses stellt die autogene Spalthaut dar (Heimbach

1987), die mittels eines Dermatoms aus einem intaktem Hautareal entnommen wird

(Smirnov et al. 1998). Eine mögliche Modifizierung des Spalthauttransplantates ist

das Mesh-Graft. Durch Einschnitte wird ein Gittertransplantat konstruiert, das eine

Flächenvergrößerung auf das eineinhalb- bis sechsfache erzielen kann (Hanselka

1974, Vandeput et al. 1995). Bei einer weiteren von Meek entwickelten Technik wird

eine Vergrößerung der Fläche auf das zehnfache durch die Verteilung kleiner

quadratischer Hautinseln auf dem Wundgrund erreicht (Kreis et al. 1993, Lari and

Gang 2001, Papp and Harma 2003).

Eigenhauttransplantate sind schnell verfügbar und stellen eine permanente,

funktionelle Wundabdeckung sicher. Da dies jedoch durch beschränkte

Hautentnahmeflächen und den Allgemeinzustand des Patienten limitiert ist (Herndon

and Spies 2001, Hettich and Koslowski 1984, Koslowski 1984, Zellner 1971), muß

auf andere Hautdeckungsverfahren ausgewichen werden (Bozinko et al. 1998,

Eaglstein and Falanga 1998, Helvig 1997, McHugh et al. 1997). Es gelang zu zeigen,

dass kultivierte Epidermis viele charakteristische Eigenschaften von natürlichem

Epithel aufweist (Green et al. 1979, Sun and Green 1976).

Das 1975 von Rheinwald und Green entwickelte Feeder-Layer-Verfahren wird heute

zur Herstellung von Keratinozytenkulturen häufig angewendet (Rheinwald and Green

1975). Aus zwei bis vier Quadratzentimetern Spalthaut wird enzymatisch mit Trypsin

eine Einzelzellsuspension aus Basalzellen erzeugt, die gemeinsam mit subletal

bestrahlten 3T3-Fibroblasten kokultiviert werden (Green et al. 1979, Pittelkow and

Scott 1986, Rheinwald and Green 1977). Diese Technik ermöglicht aus einem

Quadratzentimeter durch Subkultivierung nach zwei bis drei Wochen etwa

sechstausend Quadratzentimeter anzuzüchten. Die kultivierten Epithelzellen stehen

als Sheet oder als Zellsuspension zur Verfügung. OĆonnor beschrieb als Erster den

Einsatz von autologen Keratinozytensheets zur Wunddeckung am Menschen

(OĆonnor 1981). In vitro gezüchtete autologe Epithelzellen wurden in vielen Kliniken

gezüchtet und angewandt (De Luca et al. 1989, Eldad et al. 1987, Gallico et al. 1984,

4

Hefton et al. 1986, McAree et al. 1993, Munster et al. 1990, Rue et al. 1993, Schaller

et al. 1991). Seit 1989 sind sie kommerziell erhältlich.

Ein Nachteil der alleinigen Wunddeckung durch autologe Epidermis ist die Dauer des

Zeitintervalls von zwei bis drei Wochen bis eine ausreichende Anzahl von

gezüchteten Zellen zur Verfügung steht. In diesem Zeitraum muß der Hautdefekt

anderweitig temporär gedeckt werden (Aubock and Fritsch 1987). Zusätzlich ergeben

sich häufig Probleme hinsichtlich der Stabilität des Transplantates wie Blasenbildung,

Ulzerationen, Narben- und Kontrakturbildungen (Freedlander 1998, Putland et al.

1995).

Viele Arbeitsgruppen beschäftigten sich auch mit sogenannten Mischhauttrans-

plantaten, die neben autologen Hautanteilen auch aus homologen Hautanteilen

bestehen. Für die Herstellung solcher Mischhauttransplantate wurden verschiedenste

Methoden und Modifizierungen angewandt (Alexander et al. 1981, Hafemann et al.

1989, Heck et al. 1985, Kaiser et al. 1994).

Auf der Suche nach Alternativen zu homologer Dermis bzw. autologer Spalthaut

wurden in den letzten Jahren enorme Anstrengungen unternommen artifizielle

Hautersatzverfahren zu entwickeln. Hier hat der Begriff des „Tissue Engineering“

rasch an Bedeutung gewonnen. Dieses Verfahren ist nicht nur für den Bereich der

rekonstruktiven Chirurgie von großem Interesse, da im gesamten Medizinbereich ein

großer Bedarf an Ersatzmaterialien herrscht, um die unterschiedlichsten Defekte zu

versorgen. Daher handelt es sich beim Tissue Engineering um ein Forschungsgebiet,

das auf der Zusammenarbeit zwischen Biomaterialforschung, Zellbiologie,

Zellkulturtechnik und verschiedenen medizinischen Fachrichtungen basiert. Eine

künstliche Herstellung von Gewebe wie Knorpel, Knochen oder sogar komplette

Organe wie Herz oder Leber könnte therapeutisch sehr gute Ergebnisse erzielen und

erhebliche Kosten reduzieren. Beim Tissue Engineering handelt es sich allerdings

erst um ein sehr junges Fachgebiet, das noch am Anfang steht und kann sicherlich

erst mittelfristig eine mögliche Alternative für einen Hautersatz bieten.

Derzeitige Alternativen stellen unter anderem die schon kommerziell erhältlichen

Hautersatzprodukte dar. AlloDerm® (LifeCell Corporation) z.B. kommt bei

ausgedehnten Hautdefekten zum Einsatz und besteht aus azellulärer humaner

Dermis. Dabei bleiben Kollagen Typ IV und VII sowie Teile des Basalmembran-

komplexes (Laminin 1 und 5) chemisch und strukturell erhalten. Da das Transplantat

frei von MHC-I und –II -Komplexen ist, erfolgt keine Abstoßungsreaktion. Als

5

Epidermisersatz dienen Keratinozytensheets oder Spalthaut, die bereits bei der

Transplantation appliziert werden können. Klinische Studien zeigen, daß Alloderm®

das Auftreten von Myofibroblasten mit nachfolgender Wundkontraktion verhindern

kann (Freedlander 1998, Wainwright 1995).

Abb. 1: Alloderm®

Ein weiterer kommerziell erhältlicher Hautersatz ist das zweischichtige Produkt

Integra® (Integra Lifesciences Corporation, USA). Es besteht aus einer

Wasserdampfdurchlässigen Silikonschicht als temporärer Epidermisersatz sowie

einer dreidimensionalen Porenmatrix aus bovinem Kollagen und Chondroitin-6-Sulfat.

Integra® ist für drittgradige Verbrennungen zugelassen (Bozinko et al. 1998, Ryan et

al. 2002, Sheridan et al. 2000) und erwies sich im klinischen Einsatz

erfolgversprechend (Heitland et al. 2004, Lorenz et al. 1997). Jedoch erwies sich die

zweizeitige epidermale Deckung als ein Nachteil. Die Silikonschicht verhindert

Wunddrainage und erhöht das Risiko der Ausbildung von Infektionen, Hämatomen

und Narben (Heimbach et al. 1988, Nanchahal and Ward 1992). Ein weiteres

Problem ist die schlechte Revaskularisierung des Wundgrundes.

6

Abb. 2:

Integra®

Ein weiteres kommerziell erhältliches Produkt ist Apligraf® (Organogenesis Inc.,

USA). Es handelt sich dabei um eine Kollgenmatrix mit Fibroblasten und

Keratinozyten (Bell et al. 1981, Coulomb et al. 1986, Fray et al. 1998), die bei

chronisch-venösen Beinulzera gute Ergebnisse zeigt (Guerret et al. 2003). Apligraf®

regt neben der Synthese von Matrix- und Basalmembrankomponenten auch die von

Wachstumsfaktoren an, die durch beschleunigte Angiogenese zu einer schnelleren

Wundheilung führen.

Abb. 3:

Apligraf®

7

Wünschenswert wäre als Hautersatz ein Material, das nicht nur Synthese von

Wachstumsfaktoren anregt, sondern auch selber welche freisetzt, so daß im

Wundgebiet auch über einen längeren Zeitraum eine konstante angiogenetische

Wirkung erhalten bleibt. Somit wäre eine schnellere und komplikationsfreie

Wundheilung gewährleistet.

1.2 VEGF 1.2.1 Angiogenese, Bildung von neuen Blutgefäßen Die fundamentalen Prozesse, durch die neue Blutgefäße entstehen, bezeichnet man

als Angiogenese und Vaskulogenese (Carmeliet 2000, Risau 1997, Risau and

Flamme 1995). Vaskulogenese ist definiert als Differenzierung von Angioblasten in

Endothelzellen und die de novo Formation eines primitiven Netzwerks aus Gefäßen.

Angiogenese dagegen ist als Wachstum von neuen Kapillaren von einem bereits

existierenden Blutgefäß aus definiert (Risau 1997). In der Embryonalzeit entstehen

neue Gefäße durch Vaskulogenese und Angiogenese. Beim Erwachsenen dagegen

tritt die Bildung neuer Blutgefäße nur unter bestimmten physiologischen

Bedingungen auf (z.B. bei Placentawachstum in der Schwangerschaft oder

Wundheilungsprozessen) und entsteht in erster Linie durch Angiogenese. Um durch

Bioimplantate ein gerichtetes und schnelles Gefäßwachstum zu induzieren, müssen

angiogenetische Prozesse im Detail verstanden werden.

Die Angiogenese ist ein sehr komplexer Vorgang, der zur Zeit noch Gegenstand

intensiver Grundlagenforschung ist. Viele angiogenetische Moleküle spielen hier eine

essentielle Rolle, darunter auch Wachstumsfaktoren wie VEGF (Vascular Endothelial

Growth Factor) (Folkman and Shing 1992). Zwei Mechanismen von Angiogenese

sind in der Literatur beschrieben, Sprouting (=Sprießen) und Intussusception. Bei der

Intussusception kommt es zur Abgabe von interstitiellen Endothelzellreihen in das

Lumen eines bereits bestehenden Gefäßes. Stabilisierung und kontinuierliches

Wachstum dieser Zellreihen induzieren eine Teilung des Gefäßes und eine

Neuformung des lokalen Gefäßnetzes (Risau 1997). Beim Sprouting müssen zwei

Phasen differenziert betrachtet werden: das Wachstum des neuen Gefäßes und

dessen Stabilisierung (neovessel growth and stabilization). Beim Wachstum kommt

es zunächst zur Auflösung der Basalmembran und der angrenzenden interstitiellen

8

Matrix des „Muttergefäßes“. Die Endothelzellen migrieren in diesen erschaffenen

Raum in Richtung des auslösenden angiogenetischen Faktors und proliferieren. Es

kommt zur Ausbildung von Gefäßlumen und Anastomosen. In der

Stabilisierungsphase wird die Endothelzellproliferation gestoppt, eine neue

Basalmembran angelegt und das neue Gefäß mit Perizyten umschlossen. Beide

Phasen sind gleich wichtig, denn ohne Stabilisierung würde jede neue Kapillare

sofort durch Apoptose untergehen (Benjamin et al. 1998).

Der komplexe Vorgang der Angiogenese wird durch zahlreiche Moleküle und

Faktoren gesteuert. Neben wasserlöslichen Wachstumsfaktoren kontrollieren auch

unlösliche extrazelluläre Matrixmoleküle die Angiogenese. Lösliche Wachstums-

faktoren können über große Distanzen kapillares Endothelzellwachstum auslösen,

wohingegen die extrazellulare Matrix (ECM) die Zellsensibilität für diese

Wachstumsstimuli im lokalen Mikrosystem reguliert (Ingber and Folkman 1989,

Ingber et al. 1995). Diese permanente Interaktion von unterschiedlichsten pro-

angiogenetischen und angiostatischen Faktoren führt zum Begriff der angio-

genetischen Balance, der häufig in der Literatur verwendet wird (Iruela-Arispe and

Dvorak 1997). Einer der potentesten pro-angiogenetischen Faktoren ist der

Wachstumsfaktor VEGF (Beck and D'Amore 1997), der in dieser Studie eine zentrale

Rolle spielt.

1.2.2 Wachstumsfaktoren mit angiogenetischer Wirkung Wachstumsfaktoren sind körpereigene Substanzen, die das Zell- bzw. das

Körperwachstum durch Bindung an spezifische Rezeptoren stimulieren (Gruyter de

1997). Dazu gehören Hormone, wie z.B. das somatotrope Hormon (STH), Zytokine,

wie z.B. Interleukine und eine Vielzahl anderer Peptide und Proteine.

Wachstumsfaktoren können einerseits Zellteilung, Zelldifferenzierung und

Zellmigration stimulieren, andererseits auch reduzieren, je nachdem auf welche Art

von Zellen sie wirken (Nimni 1997). Mit der Hilfe verschiedener Methoden wie

Chromatographie, PCR (polymerase chain reaction), DNA-Sequenzzierung und

Immunoassays konnten Wachstumsfaktoren genauer definiert werden. Folkmann

konnte zeigen, daß menschliche Zellen durch angiogenetische Wachstumsfaktoren

so stimuliert werden können, daß sie neue Gefäße bilden (Folkmann et al., 1979).

Bei Krankheitsbildern wie Psoriasis, diabetische Retinopathie oder rheumatoide

9

Arthritis traten auch pathologische Gefäßneubildungen auf (Folkman 1995). Selbst

bei physiologischen Vorgängen, wie Entzündungsreaktion und Wundheilung spielen

Gefäßneubildungen eine herausragende Rolle (Vailhe et al. 2001). Fournier gelang

es durch die Anwesenheit von angiogenetischen Wachstumsfaktoren die Angio-

genese auch in künstlichen Geweben zu steigern (Fournier and Doillon 1996).

Zu den bedeutendsten Wachstumsfaktoren mit angiogener Potenz gehören neben

VEGF, FGF (Fibroblast Growth Factor), TGF (Transforming Growth Factor), EGF

(Epidermal Growth Factor) und PDGF (Platelet Derived Growth Factor).

Angiogenetische Faktoren lassen sich in indirekte und direkte angiogenetische

Wachstumsfaktoren unterteilen. Indirekte wirken über Mechanismen wie Chemotaxis,

Mobilisation von Makrophagen oder Freisetzung direkter Wachstumsfaktoren. Direkte

angiogenetische Wachstumsfaktoren wirken direkt über Rezeptoren auf die

Endothelzelle. Zu ihnen gehören z.B. FGF, TGF α und VEGF.

1.2.3 VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) VEGF ist ein 34- bis 42- KD großes Glykoprotein und besteht aus zwei identischen

Untereinheiten (Senger et al. 1993). Es gibt mindestens vier verschieden VEGF-

Formen mit unterschiedlicher Anzahl von Aminosäuren (VEGF 121, VEGF 165,

VEGF 189, VEGF 206). Diese unterschiedlichen Formen entstehen durch Spleißen,

d.h. durch Herausschneiden verschiedener Sequenzen aus einer ursprünglichen

RNA. VEGF 121 und VEGF 165 werden von Zellen freigesetzt, VEGF 189 und VEGF

206 liegen in der extrazellulären Matrix gebunden vor. In dieser Studie wird VEGF

165 verwendet, da es etwa hundertmal potenter ist als VEGF 121 (Keyt et al. 1996).

VEGF 165 besitzt eine Masse von 38,2 KD und besteht aus zwei identischen

Polypeptidketten mit je 165 Aminosäuren.

Die Sequenz des Proteins kann Abb. 4 entnommen werden.

10

MNFLLSWVHW 1

SLALLLYLHH 11

1 AKWSQAAPMA 21

11 EGGGQNHHEV 31

21 VKFMDYVQRS 41

31 YCHPIETLVD 51

41 IFQEYPDEIE 61

51 YIFKPSCVPL 71

61 MRCGGCCNDE 81

71 GLECVPTEES 91

81 NITMQIMRIK 101

91 PHQGQHIGEM 111

101 SFLQHNKCEC 121

111 RPKKDRARQE 131

KKSVRGKGKG 141

QKRKRKKSRY 151

KSWSVPCGPC 161

121 SERRKHLFVQ 171

131 DPQTCKCSCK 181

141 NTDSRCKARQ 191

151 LELNERTCRC 201

161 165 DKPRR 211

Abb. 4:

Translatierte Sequenz des VEGF-Gens. Aminosäuren 1–26 stellen das Signalpeptid dar, Aminosäuren

142-165 werden durch „Splicing“ entfernt. Das VEGF165 Polypeptid ist in rot gekennzeichnet (Chen,

2001)

VEGF ist zuerst als Produkt von Tumorzellen entdeckt worden (Dvorak et al. 1991,

Senger et al. 1983) konnte später aber auch in gesundem Gewebe z.B. in der Niere

(Brown et al. 1992, Iijima et al. 1993), in aktivierten Makrophagen (Fava et al. 1994),

in der Lunge (Berse et al. 1992), in der Leber und in glatten Muskelzellen (Monacci et

al. 1993) nachgewiesen werden.

VEGF zeigt hohe Affinität zu bestimmten Rezeptoren auf der Endothelzelloberfläche.

Zwei sogenannte Tyrosin-Kinase Rezeptoren reagieren sehr sensibel auf VEGF.

Zum Einen die 180 KD große fas-like tyrosin kinase (flt-1), zum Anderen der 2000

KD Kinase inset Domain-containing Receptor (KDR), wobei KDR bei Endothelzellen

den weitaus wichtigeren Rezeptor darstellt (Klagsbrun and D'Amore 1996, Shen et

al. 1998). Studien zeigen, daß VEGF ein sehr potentes und spezifisches Mitogen für

Endothelzellen ist (Ferrara and Alitalo 1999), das als einziger Wachstumsfaktor die

11

Fähigkeit besitzt, allein auf Endothelzellen proliferierend zu wirken (Ferrara and

Alitalo 1999, Keyt et al. 1996, Neufeld et al. 1999, Vernon and Sage 1999). Somit

würden z.B. Fibroblasten, von denen man vermutet, daß sie bei der Narbenbildung

beteiligt sind keinen Proliferationsstimuls erhalten. VEGF wird als eine Antwort

verschiedener Stimuli, z.B. Hypoxie, von vielen differenzierten Zellen synthetisiert

und sezerniert. VEGF ist in der Lage in vivo die Zahl der Blutgefäße und die

Permeabilität von Blutgefäßen zu steigern (Clauss et al. 1990). In der Literatur wird

aus diesem Grund auch die Bezeichnung VPF (Vasculary Permeability Factor)

verwendet (Senger et al. 1993). In vitro induziert VEGF verstärkt vaskuläre Pro-

liferation, Migration und Gefäßformung (Clauss et al. 1990).

Die hohe angiogenetische Potenz von VEGF könnte möglicherweise ein Lösungs-

ansatz sein, die geringe Vaskularisierung der unter 1.1.3 genannten Hautersätze zu

verbessern und somit die Wundheilung zu beschleunigen. Allerdings wird VEGF von

körpereigenen Proteinasen sehr schnell abgebaut besitzt daher eine extrem kurze

Halbwertszeit in vivo (Elcin et al. 2001). Um allerdings eine gesteigerte Angiogenese

über mehre Tage zu erhalten, muß ein konstanter Einfluß von pro-angiogentischen

Faktoren im Wundmilieu vorhanden sein. Durch die Bindung von VEGF an eine

Trägersubstanz könnte man eine kontinuierliche Abgabe und Wirkung von VEGF im

Wundmilieu erhalten. Ein bisher erfolgreich eingesetztes Trägermaterial in der Wund-

behandlung ist Kollagen (Friess 1998), das auch in dieser Studie als Trägersubstanz

dienen soll.

1.3 Kollagen 1.3.1 Kollagen als Gewebsersatz und Trägermaterial Gewebsersatz sollte biokompatibel und leicht zu sterilisieren sein. Weiterhin sollten

seine Abbauprodukte vom Körper leicht zu metabolisieren oder ausgeschieden

werden können. Auf der Suche nach einem geeigneten Biomaterial verweist die

Literatur häufig auf Kollagen: Kollagen eignet sich hervorragend als Grundlage für

ein Biomaterial zum Verschluss oder vollständigen Ersatz von Weichteildefekten

(Mikos et al. 1998).

12

1.3.2 Eigenschaften von Kollagen Kollagen ist ein Protein, das etwa 30% aller Körperproteine von Vertebraten

ausmacht. Mehr als 90% der extrazellulären Matrixproteine in Sehnen und Knochen

und mehr als 50% der Haut bestehen aus Kollagen. Die geringe Toxizität, die

geringe Immunogenität und die hohe Biokompabilität lassen sich auf die große

Übereinstimmung der Aminosäuresequenz zwischen den einzelnen Spezies und auf

die geringe Anzahl an aromatischen Aminosäuren zurückführen. Ferner stellt

Kollagen ein gutes Substrat für Zelladhäsion durch Integrinkleber dar und erzielt

durch chemotaktische Wirkungen eine beschleunigte Infiltration der Umgebungs-

zellen (Anselme et al. 1990, Chvapil 1977, Matton et al. 1985).

Durch den Fortschritt in der Technologie ist es mittlerweile möglich, Kollagen in

verschiedensten Formen wie Gele, Filme, Röhren oder Schwämme einzusetzen

(Ellis and Yannas 1996, Friess 1998). Dies ermöglicht den Einsatz von Kollagen in

der Klinik als Grundlage für Haut und- Bindegewebsersatz. Der größte Anteil der

kommerziell erhältlichen Hautersätze wie Alloderm® oder Integra® bestehen aus

Kollagen (s. a. 1.1.3). Nehrer (Nehrer et al. 1997) nutzte Kollagen als Gerüst für

Chondrozytenkulturen und konnte zeigen, daß allein der Kollagentyp und die Poren-

größe der Kollagenmatrix einen großen Einfluß auf Chondrozyten ausüben. Daneben

gibt es verschiedene therapeutische Möglichkeiten Kollagen als Trägesubstanz für

Medikamente zu nutzen, wie z.B. in der Ophthalmologie (Rubin et al. 1973). Dies

gelang mit Medikamenten wie Antibiotika, lokalen Anästhetika, Steroiden und

Chemotherapeutika, aber auch mit bioaktiven Molekülen wie Zytokinen oder

Wachstumsfaktoren (Friess 1998). Die durch den natürlichen Abbau von Kollagen

bedingte kontrollierte Freisetzung solcher bioaktiven Subtanzen, hat im Bereich des

Tissue Engineering einen großen Stellenwert eingenommen, denn sie ermöglicht

eine Steuerung der zellulären Aktivität und somit eine bessere Funktionssteuerung

eines gesamten Gewebekomplexes (Friess et al. 1999). Durch eine kontinuierliche

Freisetzung von Wachstumsfaktoren ließe sich z.B. Angiogenese besser

kontrollieren.

1.3.3 Struktur und natürliche Vernetzung Die verschiedenen Polypeptidketten von Kollagen bestehen aus allen 20

Aminosäuren, wobei die genaue Zusammensetzung vom Gewebetyp, in dem das

13

jeweilige Protein synthetisiert worden ist, abhängt. Die verschiedenen Variationen an

Aminosäuresequenzen haben unterschiedliche Längen der Kollagenhelizes zur

Folge. Hinzukommen noch Unterschiede in Aufbau und Länge der nicht helikalen

Anteile, so daß eine Vielzahl an verschiedenen Kollagenen existiert, die von Kollagen

Typ I bis XIX klassifiziert sind. Mehr als 90% aller fibrillösen Proteine bestehen aus

Kollagen Typ I. In Biomaterialien ist Typ I daher das mit Abstand am häufigsten und

erfolgreichsten angewandte Kollagen (Friess 1998).

Der Name Kollagen umfasst eine große Anzahl von Molekülen, die supramolekulare

Matrixstrukturen bilden. Sie bestehen alle aus 3 individuellen α-Helizes, die

biosynthetisch vernetzt und zu einer Tripplehelix (Tertiärsruktur) gefaltet sind. Die α–

Helizes sind ca. 300kD schwer, besitzen eine Länge vom etwa 300 nm und einen

mittleren Durchmesser von etwa 1,5 nm. Kollagen Typ I besteht aus zwei identischen

Peptidketten (α1) und einer dritten mit anderer Aminosäuresequenz (α2). Die

anderen Kollagentypen bestehen je aus drei identischen α1-Ketten. Die drei

linksdrehenden α-Helizes bestehen etwa aus 1000 Aminosäuren. Die Ketten sind mit

einer Distanz von 2,91 Angström und einem Winkel von –110° ineinander verdreht,

so daß der Abstand zwischen den einzelnen Glycinsäuren, die sich an jeder dritten

Stelle befindet, 8,7 Angström beträgt. Etwa 3,27 Aminosäuren beschreiben eine volle

Umdrehung der Kette.

Kollagene weisen ein sehr homogene Struktur auf: Neben Glycin, der kleinsten

Aminosäure, sind Kollagene durch einen sehr hohen Anteil an Hydroxylysin und

Hydroxyprolin charakterisiert. Diese Aminosäuren entstehen posttranslational aus

Prolin und Lysin durch die Enzyme Peptidyl-Prolin-Hydroxylase und Peptidyl-Lysin-

Hydroxylase. Bei Hydroxylysin kommt es weiterhin zu einer Glykolysierung. Dabei

wird eine unterschiedliche Anzahl von α-1,2-Glukosylgaktoseresten mit der OH-

Gruppe des Hydroxylysins verbunden; dadurch entstehen unterschiedliche

Kollagentypen, z.B. für Basalmembranen mit hohem Glykosylierungsgrad, für die

Haut mit geringerem (Junqueira and Carneiro 1996). Durch die zyklischen

Aminosäuren Prolin (Pro) und Hydroxyprolin (Hyp) wird die Tertiärstruktur stabilisiert.

Die verschiedenen Strukturen zeigt Abb. 5.

14

Abb. 5:

Struktur von Kollagen

Daneben sind Hydroxylgruppen des Hydroxyprolins an Wasserstoffbrücken-

bindungen beteiligt, die auch einen großen Anteil zur Stabilisierung beitragen. Pro

Triplet lassen sich zwei verschiedene Wasserstoffbrückenbindungen identifizieren:

zum Einen zwischen der NH-Gruppe von Glycin und der Co-Gruppe der Aminosäure

an zweiter Stelle des Triplets der gegenüberliegenden Kette und zum Anderen über

Wassermoleküle zu den Hydroxylgruppen von Hydroxyprolin an der dritten Stelle

eines Triplets. Dieses Wasserstoffbrückenmodell wurde durch physiochemische

Studien von Kollagenmolekülen in wässriger Lösung bestätigt. Es erklärt möglicher-

weise die Tatsache, daß die thermische Stabilität der Kollagenhelix stark von

Hydroxyprolin und nicht von Prolin abhängig ist. In der Literatur werden Glycin,

Hydroxyprolin und Prolin als triple-Helix bildende Aminosäuren bezeichnet, da nur

Moleküle, die diese 3 Aminosäuren enthalten, in der Lage sind, solch eine spezielle

Struktur wie eine Helix darzustellen (Zeeman et al. 1999a).

Die mechanische und chemische Stabilität des Kollagens entsteht durch intra- und

intermolekulare Verknüpfungen. Intramolekulare Verknüpfungen entstehen zwischen

zwei α-Ketten in einem nicht helikalen Abschnitt durch eine Aldolkondensation zweier

Aldehyde, die aus einer Oxidation von Lysyl-Aminogruppen durch das Enzym

Lysyloxidase hervorgehen. Brücken zwischen verschiedenen Tropokollagen-

molekülen resultieren aus einer Bindung zwischen Aldehydresten und ε-Amino-

a) Primärstruktur

Gly-Pro-y-Gly-x-Hyp

b) Sekundärstruktur

c) Tertiärstruktur d) Quartärstruktur

15

gruppen von Lysin und Hydroxilysin. Sie ermöglichen es, daß Kollagenfasern durch

eine enorme Festigkeit und Stabilität ausgezeichnet sind (Friess 1998).

1.3.4 Kollagenabbau und exogene Verknüpfungen Kollagen besitzt eine sehr hohe Widerstandskraft gegenüber neutralen Proteasen.

Diese ist auch notwendig, denn sonst hätte es keine Beständigkeit als lebens-

notwendiges Protein im Körper. Nur spezifische Kollagenasen können die native

Helix spalten.

Der Abbau von Kollagenfasern beginnt durch die Bindung von Kollagenase an die

Triple-Helizes. Nach der Aufspaltung der Tripplehelix zerteilen Enzyme wie

Gelatinase oder unspezifische Proteinasen das primäre Fragment in kleinere Peptide

und Aminosäuren. Elastase und Chatepsine unterstützen den Abbau durch ihre

Fähigkeit nichthelikale Telopeptide zu verdauen.

Der in-vivo-Abbau von Kollagen ist ein multienzymatischer und komplexer Prozess,

der daher in vitro nur vereinfacht durch den Einsatz von Kollagenase, Cathepsin,

Pepsin oder Trypsin dargestellt werden kann.

Kollagen, das nicht speziell modifiziert ist, wird im Körper schnell abgebaut. Daher

muß die Halbwertszeit von Kollagen, das länger im Körper verbleiben soll, angepasst

werden. Optimal wäre ein fließender Übergang vom Bioimplantat zu körpereigenem

Gewebe ohne ein Gewebedefizit oder –überschuss. Um eine De-novo-Synthese von

Kollagen anzuregen, wird allerdings eine biologisch aktive Form des Kollagens

benötigt. Dafür muß aus Kollagen die dreidimensionale Struktur der extrazellulären

Matrix nachgebaut werden. Da die Zellen direkt auf Kontakt des Kollagens reagieren

ist die Porengröße der Matrix von entscheidender Bedeutung (Nehrer et al. 1997).

Die daraus resultierenden hochspezifischen Zell-Matrix-Interaktionen steuern den

Ablauf des Wundheilungsprozesses (Murphy et al. 1990).

1.3.5 Künstliche Vernetzung von Kollagen Grundsätzlich gibt es zwei Möglichkeiten Kollagen zusätzlich zu stabilisieren und

somit die biologische Halbwertszeit zu erhöhen. Einerseits läßt sich eine

physikalische Vernetzung durchführen, andererseits stellt die chemische Vernetzung

eine interessante Alternative dar. Bei der physikalischen Vernetzung kommen

16

Methoden wie das Dehydrothermal Treatment (DHT) oder UV-Bestrahlung zum

Einsatz. Der Vorteil dieser Vorbehandlung von Kollagen besteht darin, daß keine

Substanzen in den lebenden Organismen gebracht werden, die potentiell gefährlich

sein könnten. Ein Nachteil der Methoden zeichnet sich allerdings dadurch aus, daß

die Kollagenmatrizes durch Verhärtungs- und Schrumpfprozesse ihre ursprüngliche

Form verlieren. Die chemische Vernetzung hingegen beruht auf der Bildung neuer

Bindungen zwischen den Kollagenmolekülen durch bestimmte Substanzen. Vorteil-

haft ist, daß bei vielen chemischen Vernetzungsmethoden die natürlichen Eigen-

schaften von Kollagengewebe, wie z.B. Flexibilität in der Matrix erhalten bleiben

(Khor 1997). Eine der am häufigsten beschriebenen Vernetzungsmethoden ver-

wendet Glutaraldehyd. Sie weist einen besonders hohen Vernetzungsgrad im

Vergleich zu anderen Substanzen, wie z.B. Formaldehyd, Epoxy-Komponenten,

Cyanamid und Acyazide auf (Jayakrishnan and Jameela 1996). Allerdings konnte

man neben Kalzifikation der mit Glutaraldehyd modifizierten Kollagenmatrizes auch

zelltoxische Rückstände bei der Zersetzung in vivo nachweisen (Doillon et al. 1994,

Zeeman et al. 1999b). Aus diesem Grund suchte man nach weiteren Substanzen,

Glutaraldehyd ersetzen zu können. Eine grundlegende Überlegung besteht darin,

Carboxyl-Gruppen eines Kollagenmoleküls mit den Aminogruppen eines anderen

Kollagenmoleküls zu verknüpfen, so daß die Substanzen die zur Vernetzung

notwendig waren letzten Endes ausgespült werden können und keine Reste von

toxischen Substanzen in der Kollagenmatrix zurückbleiben (Katalysatoreffekt). Eine

solche Art von Vernetzung wurde mit Carbodiimiden schon häufig in der Literatur

beschrieben (Wissink et al. 2001, Wissink et al. 2000a) und soll auch Grundlage

dieser Studie sein.

1.3.6 Vernetzung mit EDC/NHS Die wasserlösliche Substanz N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-Ethylcarbodiimid (EDC)

ermöglicht die Vernetzung zwischen Carboxylgruppen und Aminogruppen. EDC

aktiviert lediglich die Carboxylgruppen und ist daher in der Bindung selbst nicht

enthalten (Nimni et al. 1987). Die Zugabe des nukleophilen N-hydroxysuccinimid

(NHS) zu EDC während der Vernetzung verschiebt die Gleichgewichtsreaktion von

EDC mit den nicht aktivierten Carboxylgruppen zugunsten der aktiven Form (Olde

Damink et al. 1996). Grundsätzlich läßt sich das Vernetzugsprozedere mit EDC und

17

NHS im Kollagen folgendermaßen beschreiben: Durch die Aktivierung mit EDC

entstehen aus den Carboxylgruppen von Aspartat oder Glutamat O-Acylisourea

Gruppen. Durch Zugabe von NHS entsteht wiederum eine aktivierte Carboxylgruppe,

die an Aminogruppen von Lysin bzw. Hydroxylysin bindet (Grabarek and Gergely

1990) (s. Abb. 6). EDC/NHS ist somit nicht Bestandteil der Bindung und kann so

nicht als potentiell zytotoxische Substanz aus der Kollagenmatrix freigesetzt werden.

Die Endprodukte von EDC/NHS die aus der Reaktion hervorgehen sind wasserlöslich

und leicht durch Spülen der Matrix zu entfernen (Gratzer and Lee 2001).

Abb. 6:

Crosslink durch EDC/NHS

Durch die Vernetzung mit EDC/NHS zeigt Kollagen eine höhere Stabilität und eine

höhere enzymatische Resistenz als Glutaraldehyd. Weiterhin zeigt es eine geringe

Kalzifizierungsneigung und besitzt eine hohe Biokompatibilität (van Wachem et al.

N C

N

N ( C H 3 ) 2

N

O H

O O

C

O

O N

O

O

H 2 N - K o l l a g e n

C

O

N K o l l a g e n

H

C

O

O C

N

R2

N H

R1

R1

R2

C O O H

+

18

1994). EDC-vernetzte Kollagenmatrizes können mehr Wasser als unbehandelte

Kollagenmatrizes aufnehmen, was unter anderem Zellproliferation und –migration

unterstützt (Park et al. 2002). EDC/NHS befindet sich bei pH 6 – 7 in einem stabilen

Zustand, bei pH 5 ist es allerdings sehr reaktiv (Gilles et al. 1990). Für die

Vernetzung von Kollagen ist ein pH-Wert von 5.5 optimal (Olde Damink et al. 1996).

1.4 Bindungen von VEGF an Kollagen über Heparin 1.4.1 Heparin, Struktur und Funktion Heparin ist ein Biopolymer und gehört zu der Klasse der Mucopolysaccharride

(Glykosaminoglykane, GAGs). Es zeichnet sich in erster Linie durch seine

antikoagulatorische Wirkung aus, die den etablierten Einsatz von Heparin in der

Klinik erklärt (Classen et al. 1994). Aber auch eine lipolytische Funktion von Heparin

konnte nachgewiesen werden (Löffler and Petrides 2003). Rund 70% des Heparins

können durch sich wiederholende Dissaccharideinheiten aus 1,4-verknüpfter L-

Iduronsäure und D-Glucoamine beschrieben werden (s. Abb. 7). Die Iduronsäuren

sind an Position 2 O-Sulfatisiert und die Glucoamine an Position 6 N-Sulfatisiert. Dies

wurde auch durch nukleare Magnet-Resonanz (NMR) Spektroskopie bestätigt (Perlin

1977).

Abb. 7:

Struktur von Heparin

O O

O O O O

O

CH OH2

OH

NHSO H3

CH OH2COOH COOH

OSO H3 OSO H3

OSO H3NHSO H3

OH

OH

19

Bei physiologischem pH sind die Carboxyl- und Sulfatgruppen von Heparin ionisiert.

Dadurch ist Heparin ein starker Polyelektrolyt, der mit anderen Proteinen interagieren

und diese binden kann. Einige Plasmaproteine z.B., die normalerweise im Blut in

sehr geringer Konzentration auftreten, zeigen eine sehr hohe und spezifische

Bindungsaffinität zu Heparin. Der bekannte antithrombotische Effekt von Heparin läßt

sich möglicherweise auch durch solch eine Bindung erklären. Heparin bindet

Antithrombin über eine spezifische Pentasacharidsequenz, die nur zu einem sehr

kleinen Teil in Heparin vertreten ist. Durch diese Bindung verändert Antithrombin

seine Struktur, die zu einer etwa eintausendmal stärkeren Thrombin und Faktor Xa

Inaktivierung führt (Hirsh et al. 1998). Die lipolytische Aktivität von Heparin läßt sich

durch Formieren eines Komplexes mit Lipoproteinlipasen (LPL) erklären (Olivecrona

et al. 1977).

Heparin besitzt selbst eine angiogenetische Potenz und scheint eine sehr wichtige

Rolle in der Angiogenese zu spielen (Bombardini and Picano 1997).

1.4.2 Bindung von Heparin an Kollagen Wie bereits zuvor erwähnt läßt sich Kollagen mit EDC/NHS über Carboxylgruppen

vernetzen (s. 1.3.6). Da Heparin auch über Carboxylgruppen verfügt, besteht somit

die Möglichkeit auch Heparin kovalent an Kollagen zu binden. Dadurch entsteht ein

Biomaterial, welches zusätzlich eine angiogenetische Potenz besitzt.

Die Bindung von Heparin an Biomaterialien wurde bisher in erster Linie für die

antithrombotische Wirkung verwendet. Die Bildung von Blutgerinnsel an Blut- oder

Plasma ausgesetzten Oberflächen wie z.B. von künstlichen Gefäßen, Herzklappen

oder Katheter sollte verhindert werden (Kang et al. 1996). Neben diesen im Körper

beständigen Materialien wurde Heparin auch mit nicht beständigen Biomaterialen als

Heparin-delivery-system angewandt (Ahola et al. 2001, Yang et al. 1999), wie z.B.

Kollagen, das mit Abstand am häufigsten eingesetzte Biomaterial (s. 1.3). Diverse

Studien beschreiben die Verknüpfung von Heparin an Kollagen, da Kollagen als

thrombogenetisches Material neben Blutplättchenadhäsionen und –aggregationen

auch das intrinsische Gerinnungssystem aktiviert. Senatore et al. konnten zeigen,

daß durch an Kollagen gebundenes Heparin die genannten gerinnungsaktivierenden

Faktoren reduzieren kann (Senatore et al. 1990). Einige Arbeitsgruppen beschäftigen

sich auch mit der Wirkung von heparinisierten Kollagen auf Endothelzellen. Hier

20

konnte neben einem inhibierenden Effekt (Nojiri et al. 1987) in erster Linie eine

verstärkte Endothelzellproliferation festgestellt werden (Bos et al. 1998). Neben

diesen in-vitro-Untersuchung gibt es auch in-vivo-Studien, die zeigen, daß

heparinisiertes Kollagen als Implantat sowohl die Vaskularisierung in der Ratte

steigern (van Wachem et al. 2001) als auch die Wundheilung verbessern kann (Kratz

et al. 1998).

1.4.3 Bindung von Wachstumsfaktoren an Heparin Wachstumsfaktoren können genau wie andere Proteine an Heparin gebunden

werden. Wachstumsfaktoren, die eine besonders hohe Affinität zu Heparin haben,

werden als heparinbindende Wachstumsfaktoren bezeichnet. Zu Ihnen gehören u.a.

aFGF, bFGF und VEGF. bFGF zeigt eine proliferierende Wirkung auf Endothelzellen

in vitro und eine Gefäßzunahme in vivo (Bhora et al. 1995). Auch VEGF besitzt eine

Heparinbindungstelle und wird als sehr potenter Wachstumsfaktor beschrieben. Eine

Bindung solcher angiogenetisch hoch potenter Wachstumsfaktoren über Heparin an

Kollagen würde aufgrund des natürlichen Abbaus von Kollagen in vivo die gewünscht

kontinuierliche Freisetzung von Wachstumsfaktoren (s. 1.1.3) ermöglichen und die

natürliche Degradation der Wachstumsfaktoren verhindern (Bos et al. 1999, Doi and

Matsuda 1997, van Wachem et al. 2001). So wäre eine konstante Konzentration von

Wachstumsfaktoren und damit ein konstanter Proliferationsreiz im Gewebe

gewährleistet. Die angiogenetische Wirkung von Wachstumsfaktoren wäre durch den

Einfluß von Heparin zusätzlich potenziert. Eine so modifizierte Kollagenmatrix hat

somit ein optimales angiogenetisches Potential (s. Abb. 8).

21

Abb. 8:

Modell der modifizierten Matrix

Die hohe angiogenetische Wirkung solch einer Matrix ist bereits in der Literatur

beschrieben. Wissink zeigte, daß heparinisierte Trägermaterialen, die mit bFGF

beladen worden sind, Endothelzellproliferation in vitro und Vaskularisierung in vivo im

Gegensatz zu nicht heparinisierten Trägermaterialien steigern können (Wissink et al.

2001). Diese Studie soll ähnliche Ergebnisse mit der Kopplung von VEGF an

heparinisierte Kollagenmatrizes erzielen.

1.5 Arbeitsziel und Aufgabenstellung Ziel und Aufgabe dieser Arbeit war es:

1) den Wachstumsfaktor VEGF an eine mit Heparin und EDC/NHS modifizierte

Kollagenmatrix zu binden

2) die VEGF-Freisetzung einer solchen Matrix in vitro zu bestimmen

3) den biologischen Effekt dieser Matrix in der Zellkultur zu untersuchen

VEGF

fibrilläres Kollagen

Heparin

EDC/NHS-Vernetzung

22

2 Material 2.1 Geräte

Feinwaage Sartorius

IKA Vibrax® Janke & Kunkel

Thermoshake Gerhardt

Gefrierschrank –73°C GFl, Jürgens

Gefrierschrank –73°C Jewett

N2-Behälter Arpege

Kühlschrank 4°C Bosch

Elisareader Victor® Wallac

Elisareader Dynex Technologies

Brutschrank Heraeus

Autoklav Melag

Lamina Flow Kojair

Absaugvorrichtung Integra Biosciences

Zentrifuge Minifuge T® Heraeus

Wasserbad GFL

Mikroskop Zeiss

96-well-Immunoplate Nunc

23

24-well-Platten (d:15mm, A:1,8cm) Becton, Dickison

6-well-Platten (d:34 mm; A:9,07cm) Becton, Dickison

Kulturflaschen (250ml, 75 cm²) Greiner

Petrischalen Sarstedt

Pasteurpipetten (Glas) Brand

Beerenkanülen Braun

Stöpsel für Kanüle Braun

Skalpell Feather

10 ml-Spritzen Braun

Bechergläser 100 ml Schott Duran

Multipipette Eppendorf

Pipetus-akku® Hirschmann

Pipetten (5, 10, 25 ml) Greiner, Sarstedt

Pipetten (10, 20, 100, 1000 µl) Gilson, Eppendorf

Multichannelpipette Research pro® Eppendorf

Pipettenspitzen (10, 20, 100, 1000µl) Eppendorf

Eppendorfcups Eppendorf

Spatel Rochem

Pinzette Rochem

Reagenzgläser Greiner

Zentrifugenröhrchen 50 ml Greiner

Parafilm American National Can

24

Ceiling Tape Nunc

Neubauer-Kammer Brand

Deckplättchen BB medica

Stückzähler IVU

2.2 Reagenzien und Lösungen

Heparin (170 U/mg) Sigma

EDC Sigma

NHS Sigma

VEGF Tebu

Capture-VEGF-Antibody Tebu

Detection-VEGF-Antibody Tebu

Avidin-peroxidase Tebu

ABTS Sigma

PBS Biochrom

Tween 20 Fluka

Bovines Serumalbumin (BSA) Sigma

Kollagenase Typ I Worthington

Kollagenase CLS1 (210 U/ml) Biochrom

NaCl 0,9% Delta-Pharma

Trypsin-EDTA PAA

25

Alkohol 70% Hofmann

0,2-mol-Na2HPO4 Merck

4 mol-NaCl Merck

bidestiliertes H2O Uk Aachen

MES-Puffer (ph= 5,6) Merck

0,05-mol 2-Morpholinoethansulonsäure Merck

HEPES-Puffer Merck

Trypsin-EDTA Merck

Zellkulturrmedium A Bio Whittaker

EBM-2, Clonetics®

Mit folgenden Zusätzen:

FBS, 10 Ml

Hydrocortison, 0,2 Ml

HFGF-B, 2Ml

R³-IGF-1, 0,5 Ml

VEGF, 0,5 Ml

Ascorbinsäure, 0,5 Ml

HEGF, 0,5 Ml

GA-1000, 0,5Ml

Heparin, 0,5 Ml

Zellkulturmedium B Bio Whittaker

EBM-2, Clonetics®


FBS, 10 Ml

26

Hydrocortison, 0,2 Ml

R³-IGF-1, 0,5 Ml

Ascorbinsäure, 0,5 Ml

HEGF, 0,5 Ml

GA-1000, 0,5Ml

Heparin, 0,5 Ml

BrdU-Kit Roche


BrdU-Lösung

FixDenat®

Detection-BrdU-Antibody

Anitbody-Verdünnungs-Lsg

Waschpuffer (PBS)

Substratlösung

2.3 Trägermaterial

Kollagen Suwelack Skin & Health Care AG

2.4 Zellen HUVECs Marienhospital Aachen

(Human umbilical vein endothelial cells)

27

3 Methoden 3.1 Herstellung der modifizierten Schwämme Beim verwendeten Kollagen handelt es sich um Kollagen Typ I, das aus Rinderhaut

isoliert worden ist. Hergestellt wird es von der Firma Suwelack Skin & Health Care

AG, Billerbeck, die durch bestimmte thermische Verfahren eine uniforme

Mikrostruktur mit einer Porengröße von ca. 40 µm im bovinen Kollagen erreicht. Das

Produkt ist zertifiziert unter GMP Bedingungen lieferbar. Die weitere Modifizierung

erfolgte nach Steffens et al (Steffens et al. 2003).

Das Kollagen wird mit einem Skalpell in würfelförmige Schwämme mit einer Größe

von 5*5*5 mm (3,8- 4,2 mg) oder 10*10*10 mm (24- 26 mg) geschnitten (s. Abb. 9).

Abb. 9:

Kollagenschwämme

28

Die Carboxylgruppen des für die Modifizierung benötigten Heparins (Hep-COOH)

werden mit EDC/NHS für 10 min bei 37°C in 0,05-mol 2-Morpholinoethansulonsäure

(MES-Puffer, pH= 5,6) aktiviert. Das Gewichtsverhältnis von Heparin und EDC/NHS

in der Lösung wird variiert und ist kennzeichnend für die Modifikation des

Kollagenschwammes. Die nativen Schwämme werden für vier Stunden bei 37°C

unter leichtem Schütteln in der erstellten Lösung inkubiert. Anschließend werden die

Schwämme gründlich in 0,2 mol-Na2HPO4 (über 2 h), in 4 mol-NaCl (viermal in 24 h)

und destilliertem Wasser (viermal in 24 h) gewaschen. Die modifizierten Kollagen-

schwämme werden nun bei –70°C über Nacht gefroren und anschließend für 12 h

lyophilisiert. Bis zu ihrer Verwendung werden die modifizierten Kollagenschwämme in

geschlossenen Reagenzgläsern bei Raumtemperatur aufbewahrt.

Wie bereits zuvor erwähnt spielt das Massenverhältnis von EDC/NHS und Heparin

eine wichtige Rolle. Ein Kollagenschwamm, der in einer Lösung inkubiert wird, die 1

mg Heparin und 1 mg EDC/NHS pro 500 µl Lösung enthält, wird z.B. als „H1E1“

bezeichnet. Somit erhält man durch Variierung der Massenverhältnisse von Heparin

und EDC/NHS eine ganze Reihe von verschieden modifizierten Schwämmen,

ausgehend vom nativen, unbehandelten Schwamm H0E0 bis zum einfach

heparinisierten und stark vernetzten Schwamm H1E2. Die Nomenklatur der

verschiedenen Schwämme ist in Tabelle 1 nochmals dargestellt.

Tabelle 1:

Unterschiedlich modifizierte Kollagenschwämme nach Steffens et al. Die in schwarz

gedruckten Schwämme sind Teil der Studie.

H1E2 H0E2

2 mg EDC

H1E1 H0E1 1 mg EDC

H1E0 H0E0 0 mg EDC

1 mg Heparin

0 mg Heparin

In 500µl Lsg

29

Alle in der Zellkultur verwendeten Schwämme werden folgendermaßen sterilisiert:

Die Schwämme lagern vorerst für 24 Stunden in 70%igen Ethanol, anschließend für

weitere 24 Stunden in 0,9%igen NaCl und schließlich für 24 Stunden in Zellkultur-

medium (B).

3.2 Quantitative Bestimmung von VEGF mittels ELISA 3.2.1 Prinzip des ELISA Mit Hilfe eines ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) lassen sich

spezifische Antigene quantitativ nachweisen. Das Prinzip dieses Assays beruht auf

der immunspezifischen Bindung von Antigenen und den zugehörigen Antikörper

(Sandwich-Prinzip). Ein für das zu untersuchende Antigen spezifischer monoklonaler

Antikörper (Capture-Ab) wird auf dem Boden einer Mikrotiterplatte adsorbiert. Die

verschiedenen Proben werden aufgetragen und das vorhandene Antigen gebunden.

Ein weiterer enzymgekoppelter spezifischer Antikörper (Detection-Ab) wird

aufgetragen und bindet an das Antigen (s. Abb. 10). Anschließend wird eine

Substratlösung zugefügt, die sich durch das gebundene Enzym verfärbt. Diese

Farbentwicklung ist der Menge an gebundenen und somit in den aufgetragenen

Lösungen vorhandenen Antigenen proportional und kann über das Lambert-

Beer´sche Gesetz photometrisch bestimmt werden.

Abb. 10:

Prinzip des Sandwich-ELISA

Enzymgekoppelter spezifischer Antikörper

Antigen (z. B. VEGF)

spezifischer Antikörper am Boden des Wells

30

3.2.2 Durchführung des VEGF-ELISA In jedes well einer 96-well-Platte werden 100 µl der VEGF-Capture-Ab-Lösung (0,5

µg/ml) pipettiert. Die Platte wird mit Hilfe eines Tapes verschlossen und über Nacht

(min. 12 h) bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wird viermal mit einem

Waschpuffer (0,5 ml Tween 20 in 1 l PBS) gewaschen (400 µl/well) und die nicht

durch Antikörper belegten Anteile des Plattenbodens mittels einer Block-Lösung (1%

BSA in PBS) (300 µl/well) unspezifisch belegt. Nach erneut viermaligem Waschen

wird ein mit dem verwendeten VEGF erstellter Messstandard aufgetragen. Von den

unterschiedlich konzentrierten VEGF-Standardlösungen (2560, 1280, 640, 160, 40

und 0 pg/ml) werden je 100 µl in zwei wells pipettiert (insgesamt zwölf wells für den

Standard). Die restlichen wells werden mit 100 µl/well der zu untersuchenden VEGF-

Lösung gefüllt und die ganze Platte für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.

Die Platte wird nochmals viermal gewaschen und in jedes well 100 µl einer

Peroxidase-Lösung pipettiert, die eine weitere halbe Stunde bei Raumtemperatur

inkubiert wird. Um absolut alle Rückstände des Enzyms zu entfernen wird die Platte

zehnmal gewaschen und nun 100 µl der ABTS-Substrat-Lösung aufgetragen. Die zu-

nehmende Farbentwicklung wird mittels Victor®-ELISA-Reader bei 405 nm durch

Messen der Absorption beobachtet. Die Messung, in der der höchste Wert der

VEGF-Standardkurve eine Absorption von 1,2 noch nicht überschreitet wird für die

Auswertung herangezogen.

3.2.3 Bestimmung der VEGF-Stabilität in vitro 2 ml einer VEGF-Lösung (3000 pg/ml) werden über 48 Stunden in einem

Reagenzglas permanent leicht geschüttelt. Zu den Zeitpunkten 0, 1, 3, 24 und 48 h

werden Proben von je 250 µl entnommen und bei –70°C eingefroren. Spätestens

nach 48 Stunden werden alle Proben aufgetaut, um im ELISA gemessen zu werden.

Die in vitro Stabilität von VEGF wird so über 48 Stunden ermittelt.

Mit einer weiteren 2 ml VEGF-Lösung (3000 pg/ml) wird ähnlich verfahren, nur daß

der Lösung von Beginn an Kollagenase (160 u/ml) zugesetzt wird. Der Einfluß von

Kollagenase über 48 Stunden auf die VEGF-Stabilität soll somit bestimmt werden.

Beide Versuchsreihen werden bei Raumtemperatur und bei 37°C durchgeführt um

einen möglichen Einfluß der Temperatur auf die Stabilität von VEGF zu erkennen.

31

3.2.4 VEGF-Freisetzung der modifizierten Schwämme in vitro Modifizierte Kollagenschwämme (s. 3.1) vom Typ H0E0, H0E1, H1E1 und H1E2

(Größe: 5*5*5 mm) werden auf mögliche unterschiedliche VEGF-Freisetzungs-

Kinetiken untersucht. Je ein Schwamm wird mit Hilfe einer Pinzette in ein

Reagenzglas gelegt und mit 100 µl einer VEGF-Lösung (100 ng/ml) versetzt, so daß

jeder Schwamm mit 10 ng VEGF beladen ist. Die Reagenzgläser werden mit

Parafilm verschlossen und für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.

Bei Versuchsstart (t=0) werden 1 ml Diluent (0,5 ml Tween 20 in 1 l PBS mit 1%

BSA) in die Reagenzgläser gegeben und nun die Schwämme über 48 Stunden

permanent geschüttelt. An den Messzeitpunkten t=0, 1, 3, 24 und 48 h wird die

überschüssige Flüssigkeit in den Reagenzgläsern in Eppendorfcups gegossen und

bis zur Auswertung durch ELISAs (max. 48 h) bei -70°C eingefroren. Bei jeder

Probenentnahme wird die abgenommene Flüssigkeit erneut durch 1 ml Diluent

ersetzt. Spätestens nach 48 Stunden werden alle Proben aufgetaut um im ELISA

gemessen zu werden.

Eine weitere Versuchsreihe wird analog durchgeführt, nur daß zusätzlich

Kollagenase zugeführt wird. Das mit Kollagenase versetzte Diluent (160 u/ml) wird

stets erst kurz vor Gebrauch angesetzt und bei allen Messzeitpunkten (jeweils 1 ml)

anstatt des unbehandelten Diluents zugegeben.

Beide Versuchsreihen werden jeweils bei Raumtemperatur und bei 37°C durch-

geführt.

Eine zusätzliche Versuchsreihe basiert auf einer Kombination der beiden zuvor

genannten. Bis einschließlich zum Messzeitpunkt t=3 h wird die entnommene

Lösungen durch Diluent ohne Kollagenase ersetzt. Ab t=24 h Stunden erfolgt der

Ersatz durch das bereits beschriebene kollagenasehaltige Diluent.

32

3.3 Bestimmung von biologischen Effekten modifizierter Kollagenschwämme in der Zellkultur

3.3.1 Zellkultivierung von HUVECs 3.3.1.1 Isolierung

HUVECs (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) sind Endothelzellen, die aus

venösem Blut humaner Nabelschnüre isoliert werden. Die Vorgehensweise zur

Isolierung entspricht der von Jaffe et al. beschriebenen Methode (Jaffe et al. 1973).

Grundsätzlich sind alle verwendeten Materialen, die in direktem Zellkontakt stehen,

vorher autoklaviert worden. Für die Isolierung der Endothelzellen werden die

Nabelschnüre bis zur weiteren Verarbeitung in HEPES-Transport-Puffer gelagert.

Innerhalb von maximal zwei Tagen sollte die Isolierung der Endothelzellen erfolgen.

Hierzu wird die Vena umbilicalis an beiden Enden kanüliert und zweimal mit sterilem

HEPES-Puffer gespült, um Blutreste und –koagel zu entfernen. Zum Ablösen der

Endothelzellen wird die Vene mit einer 0,1%igen Kollagenase-HEPES-Lösung

gefüllt, in ein Gefäß mit HEPES-Puffer gegeben und zehn Minuten im Wasserbad

bei 37°C inkubiert. Mit 10 ml Medium (A) werden die Zellen in ein

Zentrifugenröhrchen gespült. Durch die Calciumionen wird die Aktivität der

Kollagenase gestoppt. Nach zehn Minuten Zentrifugation (1200 Umdrehungen/min ≈

300 g) wird der Überstand dekantiert, das Zellpellet in 5 ml Medium erneut

resuspendiert und die Lösung in eine vorgewärmte Kulturflasche überführt. Im

Brutschrank werden die Zellen bei einer Atmosphäre mit 5% CO2, 10% O2, 95%

Luftfeuchtigkeit und bei einer Temperatur von 37°C inkubiert.

3.3.1.2 Zellwachstum

Während der Wachstums- und Proliferationsphase werden die Zellen täglich

lichtmikroskopisch begutachtet. Es wird auf Proliferation, Zellform und –dichte und

mögliche Kontamination z.B. durch Bakterien oder Pilze geachtet. Zweimal pro

Woche werden die Zellen mit frischem Endothelzellmedium (A) versorgt (ca. 10 ml/

Kulturflasche). Sobald sich ein konfluenter Zellrasen in der Kulturflasche gebildet hat,

erfolgt eine Zellpassage.

33

3.3.1.3 Zellpassage

Zuerst wird das Medium abgesaugt und die Zellen mit 10 ml sterilem PBS zweimal

gespült. Anschließend werden die Zellen mit ca. 3 ml Trypsin-EDTA-Lösung fünf

Minuten bei 37°C inkubiert. Durch Zugabe von weiteren 7 ml Medium wird Trypsin

inaktiviert. Die Zellsuspension wird anschließend zentrifugiert (1200 Um-

drehungen/min ≈ 300 g). Die Aussaht erfolgt im Verhältnis 1:3, d.h. mit den Zellen

einer Flasche werden drei neue Flaschen beschickt. Für die Experimente dieser

Studie wurden ausschließlich Zellen der zweiten Passage (P2) verwendet.

3.3.2 Bestimmung des proliferativen Effektes modifizierter

Kollagenschwämme in der 24-well-Platte HUVECs werden entsprechend einer Zellpassage aus der Kulturflasche abgelöst,

zentrifugiert und mit 5 ml Endothelzellmedium (B) resuspendiert. Es erfolgt eine

Bestimmung der Zellzahl durch die Neubauer-Kammer (s. 3.3.5) und Verdünnung mit

Endothelzellmedium (B) auf 20000 HUVECs/ml. In jedes well einer 24-well-Platte

werden 500 µl dieser Zellsuspension gegeben, so daß jedes well 10000 Zellen

enthält (5555 Zellen/cm²). Bei einer zweiten Versuchsreihe wird die Zellsuspension

auf 50000 HUVECs/ml verdünnt, so daß jedes well 25000 Zellen enthält. Dies ent-

spricht einer Zelldichte von 13888 Zellen/cm². Um die Zellen am Boden der wells

adhärieren zu lassen, werden die 24-well-Platten für 24 Stunden im Brutschrank

inkubiert.

Falls die Zelladhäsion regelrecht und ohne Kontamination verläuft, beginnt der

Versuch mit den zu untersuchenden Kollagenschwämmen (t=0 d). Es handelt sich

dabei um Kollagenschwämme der Größe 5*5*5 mm und der Gruppen H0E0, H0E1

und H1E1. Die in Medium (B) schwimmenden Schwämme werden auf eine

Petrischale gelegt und vorsichtig mit einer Pinzette ausgedrückt. Von jeder Gruppe

werden pro Platte sechs Schwämme verwendet von denen jeweils drei mit 25 ng

VEGF (in 50 µl) beladen werden. Die Schwämme werden anschließend für zwei

Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Nach dem Absaugen des Mediums aus den

wells, werden die Schwämme mit einer Pinzette in die Mitte des jeweiligen wells

gelegt. Die genaue Anordnung kann Abb. 11 entnommen werden. Abb. 12 zeigt eine

Aufnahme der 24-well-Platte mit den Schwämmen in Kultur.

34

Abb. 11

Schematische Darstellung der Versuchsanordnung in der 24-well-Platte

Abb. 12:

Kollagenschwämme in der 24-well-Platte

V

VV V

H1E1

H0E1

H0E0

+VEGF +VEGF +VEGF25000 Huvecs/ Well

V

VVV

VVV

VV

35

Die wells werden vorsichtig wieder mit 500 µl Endothelzellmedium (B) aufgefüllt,

ohne daß der Schwamm aus seiner zentralen Position im well verrutscht.

Die Zugabe von VEGF für die Kontrollgruppen ohne Schwamm erfolgt direkt ins

Medium. Die Platten werden anschließend im Brutschrank inkubiert. Die Platten

werden entweder am ersten, dritten oder fünften Tag nach Aufgabe der Schwämme

mittels BrdU-Test (s. 3.3.5) oder Zellzählung in der Neubauer-Kammer (s. 3.3.6)

untersucht. Mediumwechsel finden am ersten, dritten und fünften Tag statt.

3.3.3 Bestimmung des proliferativen Effektes modifizierter Kollagenschwämme in der 6-well-Platte

Der Versuchsablauf in den 6-well-Platten ist prinzipiell vergleichbar, zu den

Versuchen mit 24-well-Platten. HUVECs werden entsprechend einer Zellpassage aus

der Kulturflasche abgelöst, zentrifugiert und in Endothelzellmedium (B)

resuspendiert. Nach Bestimmung der Zellzahl in der Neubauer-Kammer (s 3.3.6)

erfolgt allerdings eine Verdünnung auf 62500 HUVECs/ml. In jedes well werden 2 ml

der Zellsuspension gegeben, so daß 125000 HUVECs/well enthalten sind. Dies

entspricht einer Zelldichte von 13888 Zellen/ml, also identisch mit der Zelldichte der

zweiten Versuchsreihe mit 24-well-Platten. Der weitere Versuchsablauf wird in

gleicher Weise wie mit 24-well-Platten durchgeführt, nur daß größere Schwämme

(10*10*10 mm) verwendet werden, die mit 100 ng VEGF (in 400 µl) beladen sind.

Eine mögliche Anordnung kann Abb. 13 entnommen werden. Abb. 14 zeigt eine

Aufnahme der 6-well-Platte mit Schwämmen in Kultur.

36

Abb. 13:

Schematische Darstellung der Versuchsanordnung in der 6-well-Platte

Abb. 14:

Kollagenschwämme in der 6-well-Platte

H0E0

+VEGF125000 Huvecs/ Well

V

V

37

Die Zellzählung in der Neubauer-Kammer erfolgt am ersten, dritten oder fünften Tag.

3.3.4 Ermittlung der VEGF-Freisetzung modifizierter Schwämme in der Zellkultur

Bei dem unter 3.3.2 beschriebenen Versuchsablauf mit 24-well-Plattten wird

zusätzlich vor jedem Mediumwechsel 200 µl des sich in Kultur befindenden

verbrauchten Mediums in Eppendorfcups abpipettiert und bei –70°C eingefroren.

Damit werden Proben der Medien von t=0 d bis t=1d, t=1 d bis t=3 d und t= 3 d bis

t=5 d der verschiedenen Schwämme gewonnen, die auf VEGF-Konzentration im

ELISA (s. 3.3.2) untersucht werden. Im zeitlichen Verlauf läßt sich somit die VEGF-

Freisetzungskinetik der verschiedenen Schwämme in der Zellkultur bestimmen.

3.3.5 Ermittlung der Zellproliferation mittels BrdU-Test 3.3.5.1 Prinzip des BrdU-Test

Der BrdU-Test ist ein Zellproliferationstest, der eine Alternative zu dem radioaktiven

[³H]-Thymidin-Test darstellt. BrdU (5´-Bromo-2-desoxyuridin) ist ein Thymidin-

analogon, das von proliferierenden Zellen anstelle von Thymidin in die DNA

eingebaut wird. Nach einer bestimmten Inkubationszeit werden mit einer speziellen

Denaturierungslösung die Zellen zerstört und die BrdU-haltige DNA freigesetzt. Mit

Hilfe eines enzymgekoppelten spezifischen monoklonalen Antikörpers wird die BrdU-

haltige DNA nach dem ELISA-Prinzip (s. 3.2.1) markiert. Durch die Zugabe einer

Substratlösung kann die Menge an BrdU-haltiger DNA photometrisch bestimmt

werden. Die Menge an BrdU-haltiger DNA ist der Proliferationsrate der untersuchten

Zellen proportional.

3.3.5.2 Durchführung des BrdU-Test

Die für den jeweiligen Tag zur Auswertung vorgesehene 24-well-Platte wird dem

Brutschrank entnommen und das Endothelzellmedium (B) durch frisches ersetzt. Die

Schwämme werden mit einer Pinzette aus den wells genommen und in 70% Ethanol

zur histologischen Untersuchung eingelegt (s. 3.4). In zwei Kontroll-wells wird 50 µl

70% Ethanol gegeben um eine weitere Proliferation zu unterbinden. Der an diesen

38

beiden wells photometrische gemessene Wert stellt somit den Nullwert der

Zellproliferation dar. 13 µl der BrdU-Lösung (Markierungsreagenz) werden mit 1,287

ml Endothelzellmedium (B) auf 1:100 verdünnt und 50 µl dieser Lösung in jedes well

pipettiert. Die Platte wird nun für zwei Stunden bei 37°C im Brutschrank inkubiert.

Anschließend wird die BrdU-Lösung abgesaugt und 500 µl der FixDenat®-

Lösung/well aufgetragen. Nach 30 Minuten Inkubationszeit bei Raumtemperatur wird

die Lösung abgesaugt und die Platte auf Filterpapier ausgeklopft. Es folgt die

Applikation von 400 µl/well der Detection-BrdU-Antibody-Lösung, von der unmittelbar

zuvor 120 µl der Originallösung mit 11,88 ml Antibody-Verdünnungs-Lösung

verdünnt worden sind. Diese wird für weitere 90 Minuten bei Raumtemperatur

inkubiert. Anschließend wird das Antikörperkonjugat abgesaugt, jedes well dreimal

mit 2 ml Waschpuffer gespült und abgesaugt und die gesamte Platte auf Filterpapier

ausgeklopft. Nach Zugabe von 400 µl Substratlösung pro well und 10 minütiger

Inkubationszeit bei Raumtemperatur wir die Farbreaktion durch die Zugabe von 100

µl H2SO4 gestoppt. Innerhalb von fünf Minuten wird nun die Zellproliferation durch

Messen der Absorption am ELISA-Reader (Dynex-Technologies) bestimmt.

3.3.6 Ermittlung der Zellzahl mit Hilfe der Neubauer-Kammer Die zur Auswertung vorgesehene 24- bzw. 6-well-Platten werden dem Brutschrank

entnommen und das Medium wird abgesaugt. Die 24-well-Platten werden je zweimal

mit 1 ml/well PBS gespült und es wird 300 µl/well Trypsin-EDTA-Lösung aufgetragen.

Nach einer Inkubationszeit von fünf Minuten im Brutschrank wird die Trypsinlösung

mit 700 µl/well Zellmedium neutralisiert. Mit den 6-well-Platten wird in analoger

Weise verfahren, nur daß 4 ml PBS, 1 ml Trypsin und 2 ml Medium pro well

verwendet werden.

Die Neubauer-Kammer wird mit einem Deckplättchen durch Adhäsionskräfte

abgedeckt. Das verwendete Modell der Neubauer-Kammer enthält zwei Kammern,

die beide mit der zu untersuchenden Zellsuspension gefüllt werden. Unter dem

Mikroskop lassen sich pro Kammer vier große Quadrate identifizieren, die je aus 16

kleineren Quadraten bestehen. Abb. 15 stellt schematisch eine Zählkammer dar.

39

Abb. 15:

Zählfelder der Neubauer-Kammer

In beiden Kammern werden alle vier großen Quadrate mit dem Zähler ausgezählt.

Beide Kammern werden anschließend nach Reinigung der Kammern mit 70%-

Ethanol erneut mit einer Probe der gleichen Zellsuspension gefüllt und ausgezählt.

Insgesamt werden somit für eine bestimmte Probe 16 große Quadranten ausgezählt.

Die Zellzahl pro ml kann mit folgender Formel berechnet werden.

Zellzahl gezählte Zellzahl ----------- = --------------------------------- X 10000 ml Anzahl der großen Quadrate

40

3.4 Histologische Untersuchung Die aus den 24-well-Platten entnommenen Kollagenschwämme (s. 3.3.5.2) werden in

Plastikgitternetze gelegt und in einem Becherglas in 70%-Ethanol eingelegt. Nach

der Einbettung in Paraffin werden histologische Schnitte erstellt und diese mit

Hämatoxylin-Eosin (HE) gefärbt. Die H.E.-Färbungen werden auf Zelladhäsionen

oder Migrationen in die verschiedenen Schwämme in unterschiedlichen Vergrös-

serungen unter dem Mikroskop untersucht.

3.5 Datenverarbeitung und statistische Auswertung Die Weiterverarbeitung und Strukturierung der Daten wurde mit dem Programm

Microsoft Exel® durchgeführt. Nach Beratung durch das Institut für medizinische

Statistik der RWTH Aachen (Direktor: Prof. Dr. rer. nat. R.-D. Hilgers) dienten als

Signifikanztests die einfaktorielle Annova und der T-Test. Als Statistikprogramm

wurde SPSS für Windows eingesetzt. Aufgrund der explorativen Datenanalyse im

Bereich der Grundlagenforschung wurde auf die Adjustierung des Signifikanzniveaus

verzichtet. Die statistischen Tests wurden somit auf einem lokalem Signifikanzniveau

von 5% durchgeführt.

41

4 Ergebnisse 4.1 ELISA-Messungen 4.1.1 VEGF-Stabilität in vitro Die Abb. 16-19 zeigen den prozentualen Anteil der zu Anfang gegebenen VEGF-

Menge, die nach den Messzeitpunkten (t=0, 1, 3, 24, 48 h) bei Raumtemperatur und

37°C jeweils ohne und unter dem Einfluß von Kollagenase (160 U/ml) noch im ELISA

nachzuweisen ist.

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60

Zeit (h)

VEG

f (%

)

Abb. 16:

VEGF-Stabilität in vitro bei Raumtemperatur (n=9)

42

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60

Zeit (h)

VEG

F (%

)

Abb. 17:

VEGF-Stabilität in vitro bei Raumtemperatur unter Einfluß von Kollagenase (160 U/ml) (n=9)

0

20

40

60

80

100

120

0 10 20 30 40 50 60

Zeit (h)

VEG

F(%

)

Abb. 18:

VEGF-Stabilität in vitro bei 37°C (n=9)

43

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60

Zeit (h)

VEG

F (%

)

Abb. 19:

VEGF-Stabilität in vitro bei 37°C unter Einfluß von Kollagenase (160 U/ml) (n=9)

Eine signifikante Veränderung der VEGF-Menge im Messzeitraum von 48 Stunden

kann in keiner der Versuchsanordnungen nachgewiesen werden.

4.1.2 VEGF-Release-Kinetik in vitro 4.1.2.1 VEGF-Freisetzung der modifizierten Kollagenschwämme in vitro ohne

Einfluß von Kollagenase

Abb. 20 zeigt die VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme (H0E0, H0E1, H1E1,

H1E2) zu den verschiedenen Messzeitpunkten (t=0, 1, 3, 24, 48 h) bei

Raumtemperatur. Die VEGF-Menge ist prozentual von der anfangs applizierten

VEGF-Menge angegeben (100%=10ng).

44

0

2

4

6

8

10

12

14

0 1 3 24 48

Messzeitpunkte (h)

VEG

F (%

) H0E0H0E1H1E1H1E2

Abb. 20:

VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme bei Raumtemperatur (n=9)

Nach 24 Stunden zeigt sich eine signifikant höhere VEGF-Abgabe von H0E0

gegenüber H1E1 (p=0,001) und H1E2 (p<0,001). Die maximale VEGF-Freisetzung

nach 48 Stunden zeigt H0E0 mit durchschnittlich 8,5% der aufgetragenen Menge.

Sie ist somit signifikant höher als die der modifizierten Schwämme (alle p<0,001).

In Abb. 21 sind die kumulativ freigesetzten Mengen von VEGF über den Versuchs-

zeitraum von 48 Stunden dargestellt.

45

05

1015202530

0 20 40 60Zeit (h)

VEG

F (%

) H0E0H0E1H1E1H1E2

Abb. 21:

VEGF-Freisetzung (Summe) der Kollagenschwämme bei Raumtemperatur (n=9)

Die Summierung der Ergebnisse zeigt nach 24 Stunden eine signifikant höhere

VEGF-Freisetzung von H0E0 (beide p<0,001) und H0E1 (p=0,001; p=0,014)

gegenüber den mit Heparin modifizierten Kollagenschwämmen (H1E1, H1E2). Die

insgesamt höchste freigesetzte Menge von VEGF zeigt H0E0 nach 48 Stunden. Sie

ist signifikant höher als die von H0E1, H1E1 und H1E2 (alle p<0,001). Weiterhin zeigt

auch H0E1 eine signifikant höhere Freisetzung als die beiden heparinisierten

Schwämme H1E1 (p<0,001) und H1E2 (p<0,001).

Abb. 22 zeigt den gleichen Versuch bei einer Temperatur von 37°C. Die VEGF-

Menge ist prozentual von der anfangs applizierten VEGF-Menge angegeben

(100%=10ng).

46

-5

0

5

10

15

20

25

0 1 3 24 48

Messzeitpunkt (h)

VEG

F (%

)

H0E0H0E1H1E1H1E2

Abb. 22:

VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme bei 37°C (n=9)

Nach drei Stunden zeigt sich eine signifikant höhere VEGF-Abgabe von H0E0 und

H0E1 gegenüber den heparinisierten Kollagenschwämmen H1E1 (p=0,001) und

H1E2 (p=0,001). Zum Messzeitpunkt nach 24 Stunden läßt der unbehandelte

Schwamm (H0E0) die höchste VEGF-Freisetzung erkennen, die sich signifikant

höher darstellt als die aller anderen Schwämme (p=0,004; p=0,007; p=0,001). Die

maximale VEGF-Freisetzung nach 48 Stunden zeigt H0E0 mit durchschnittlich 16,2%

der applizierten Menge nach 48 Stunden. Sie ist signifikant höher als die der

modifizierten Schwämme (alle p<0,001). Weiterhin zeigt auch der einfach vernetzte

Kollagenschwamm (H0E1) nach 48 Stunden eine signifikant größere VEGF-

Freisetzung als die mit Heparin Modifizierten (H1E1, H1E2) (p=0,032; p<0,001).

In Abb. 23 sind die kumulativ freigesetzten Mengen von VEGF über den

Versuchszeitraum von 48 Stunden dargestellt.

47

0

10

20

30

40

50

0 20 40 60Zeit (h)

VEG

F (%

) H0E0H0E1H1E1H1E2

Abb. 23:

VEGF-Freisetzung (Summe) der Kollagenschwämme bei 37°C (n=9)

Auch bei 37°C ist die insgesamt freigesetzte VEGF-Menge von H0E0 nach 24 und

48 Stunden signifikant höher als die aller modifizierten Kollagenschwämme (alle

p<0,001 außer nach 24 Stunden H0E0 vs. H0E1: p=0,029). Auch der einfach

vernetzte Schwamm (H0E1) zeichnet sich sowohl nach 24 Stunden (p=0,003;

p<0,001) als auch nach 48 Stunden (p=0,002; p<0,001) durch eine signifikant höhere

Freisetzung gegenüber den heparinisierten Kollagenschwämmen (H1E1, H1E2) aus.

4.1.2.2 VEGF-Freisetzung der modifizierten Kollagenschwämme in vitro unter

Einfluß von Kollagenase

Abb. 24 zeigt die VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme (H0E0, H0E1, H1E1,

H1E2) zu den verschiedenen Messzeitpunkten (t=0, 1, 3, 24, 48 h) bei

Raumtemperatur unter dem Einfluß von Kollagenase (160 u/ml). Die VEGF-Menge

ist prozentual von der anfangs applizierten VEGF-Menge angegeben (100%=10ng).

48

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

0 1 3 24 48

Messzeitpunkte (h)

VEG

F (%

) H0E0H0E1H1E1H1E2

Abb. 24:

VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme bei Raumtemperatur unter Einfluß von

Kollagenase (160 U/ml) (n=9)

Der unbehandelte Kollagenschwamm (H0E0) zeigt seine höchste VEGF-Freisetzung

beim Messzeitpunkt nach drei Stunden. Sie ist mit 40% signifikant höher als die der

übrigen Schwämme (alle p<0,001). Die mit Heparin modifizierten Kollagen-

schwämme (H1E1, H1E2) weisen ihre höchste Freisetzung zum Messzeitpunkt nach

24 Stunden auf, die mit 50% zu diesem Zeitpunkt auch signifikant höher liegen als

die des nativen (H0E0) (beide p<0,001) und des einfachen vernetzten

Kollagenschwammes (H0E1) (p=0,01; p= 0,017).

Die kumulativ freigesetzten Mengen von VEGF über den Versuchszeitraum von 48

Stunden zeigt Abb. 25.

49

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60

Zeit (h)

VEG

F (%

) H0E0H0E1H1E1H1E2

Abb. 25:

VEGF-Freisetzung (Summe) der Kollagenschwämme bei Raumtemperatur unter Einfluß von

Kollagenase (160 U/ml) (n=9)

Im Durchschnitt werden bei allen Schwämmen zwischen 70% und 90% des

applizierten VEGF nachgewiesen. Signifikante Unterschiede der VEGF-Freisetzung

zeigen sich beim Messzeitpunkt nach drei Stunden. Der unbehandelte

Kollagenschwamm (H0E0) zeigt hier eine höhere Gesamtfreisetzung als die

Modifizierten (alle p<0,001). Unter den modifizierten Kollagenschwämmen zeigt der

einfach vernetzte Schwamm (H0E1) eine signifikant höhere VEGF-Freisetzung als

die Heparinisierten (H1E1, H1E2) (beide p<0,001). Zum Messzeitpunkt nach 48

Stunden zeigen die Schwämme H0E0, H1E1 und H1E2 wieder eine etwa gleich

hohe VEGF-Gesamtfreisetzung um 90%.

Abb. 26 zeigt den gleichen Versuch bei einer Temperatur von 37°C. Die VEGF-

Menge ist prozentual von der anfangs applizierten VEGF-Menge angegeben

(100%=10ng).

50

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

0 1 3 24 48

Messzeitpunkte (h)

VEG

F (%

)

H0E0H0E1H1E1H1E2

Abb. 26:

VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme bei 37°C unter Einfluß von Kollagenase (160 U/ml) (n=9)

Der unbehandelte Kollagenschwamm (H0E0) zeigt seine höchste VEGF-Freisetzung

beim Messzeitpunkt nach einer Stunde. Sie ist mit 37,5% signifikant höher als die der

übrigen Schwämme (alle p<0,001). Auch der einfach modifizierte Schwamm läßt hier

eine signifikant höhere Freisetzung als die mit Heparin modifizierten Schwämme

(H1E1, H1E2) erkennen (p=0,005; p<0,001). Nach drei Stunden kann der native

Schwamm (H0E0) signifikant von H1E2 abgegrenzt werden (p=0,008). Die mit

Heparin modifizierten Kollagenschwämme (H1E1, H1E2) wiederum zeigen hohe

Freisetzungen von VEGF nach 24 Stunden. Diese stellen sich signifikant höher als

die der Schwämme H0E1 (p= 0,002; p=0,003) und H0E0 (beide p<0,001) dar. Auch

nach 48 Stunden ist die VEGF-Freisetzung gegenüber den Schwämmen H0E1

(beide p=0,006) und H0E0 (beide p<0,001) weiterhin signifikant erhöht.

In Abb. 27 sind kumulativ freigesetzten Mengen von VEGF über den

Versuchszeitraum von 48 Stunden unter Einfluß von Kollagenase bei 37°C

dargestellt.

51

-20

0

20

40

60

80

100

120

0 20 40 60

Zeit (h)

VEG

F (%

) H0E0H0E1H1E1H1E2

Abb. 27:

VEGF-Freisetzung (Summe) der Kollagenschwämme bei 37°C unter Einfluß von Kollagenase

(160 U/ml) (n=9)

Auch bei 37°C lassen sich bei allen Schwämmen durchschnittlich rund 90% des

aufgetragenen VEGF nachweisen. Signifikante Unterschiede in der Freisetzung

lassen sich lediglich zum Messzeitpunkt nach insgesamt drei Stunden feststellen.

Hier läßt sich vom unbehandelten Schwamm (H0E0) erneut eine statistisch

signifikante größere VEGF-Freisetzung gegenüber den Modifizierten verzeichnen

(p=0,002, p<0,001; p<0,001). Der Vergleich zwischen den modifizierten Schwämmen

weist eine statistisch signifikante höhere VEGF-Freisetzung von H0E1 gegenüber

den Heparinschwämmen (H1E1, H1E2) (p=0,031; p=0,002) auf.

4.1.2.3 VEGF-Freisetzung der modifizierten Kollagenschwämme in vitro unter

verzögerter Zugabe von Kollagenase

Abb. 28 zeigt die VEGF-Freisetzung der modifizierten Schwämme (H0E0, H0E1,

H1E1 und H1E2) zu den verschiedenen Messzeitpunkten (t=0, 1, 3, 24 und 48 h) bei

Raumtemperatur mit Zugabe von Kollagenase (160 u/ml) ab dem Messzeitpunkt

52

nach 24 Stunden. Die Angabe der VEGF-Menge erfolgt prozentual, bezogen auf die

anfangs applizierte VEGF-Menge (100%=10ng).

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

0 1 3 24 48

Messzeitpunkte (h)

VEG

F (%

) H0E0H0E1H1E1H1E2

Abb. 28:

VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme bei Raumtemperatur unter Einfluß von Kollagenase (160

U/ml) ab t=24 h

Nach Zugabe der Kollagenase zeigt sich, daß nach 24 Stunden noch ein signifikant

hoher Prozentsatz (~50%) des applizierten VEGF in jedem der Schwämme

vorhanden ist (alle p<0,001).

Die kumulativ freigesetzten Mengen von VEGF sind in Abb. 29 dargestellt.

Zugabe Kollagenase

53

010203040506070

0 20 40 60

Zeit (h)

VEG

F (%

) H0E0H0E1H1E1H1E2

Abb. 29:

VEGF-Freisetzung (Summe) der Kollagenschwämme bei Raumtemperatur unter Einfluß

von Kollagenase (160 U/ml) ab t=24 h

Insgesamt lassen sich bei dieser Versuchsanordnung ~60% des applizierten VEGF

bei jedem Schwamm nachweisen.

Ähnliche Ergebnisse wie bei Raumtemperatur zeigt dieser Versuch bei 37°C (Abb.

30).

Zugabe Kollagenase

54

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 1 3 24 48

Messzeitpunkte (h)

VEG

F (%

) H0E0H0E1H1E1H1E2

ZugabeKollagenase

Abb. 30:

VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme bei 37°C unter Einfluß von Kollagenase (160 U/ml) ab

t=24 h

Auch bei 37°C ist nach Zugabe der Kollagenase (t=24h) bei jedem Schwamm eine

signifikant hohe VEGF-Abgabe (~60%) zu erkennen (alle p<0,001).

Die kumulativ freigesetzten VEGF-Mengen ist in Abb. 31 dargestellt.

55

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60

Zeit (h)

VEG

F (%

) H0E0H0E1H1E1H1E2

ZugabeKollagenase

Abb. 31:

VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme bei 37°C unter Einfluß von Kollagenase (160 U/ml) ab

t=24 h

Insgesamt lassen sich in dieser Versuchsanordnung bei jedem Schwamm ~70% des

applizierten VEGF nachweisen.

4.2 Zellkultur 4.2.1 VEGF-Release-Kinetik in der Zellkultur Abb. 32 zeigt die VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme H0E0, H0E1 und H1E1

in der HUVEC-Kultur. Das Endothelzellmedium wird jeweils zu den verschiedenen

Messzeitpunkten (t=1, 3, 5 d) in den 24-well-Platten mit jeweils 25000 HUVECs pro

well auf VEGF-Gehalt untersucht. Die VEGF-Menge ist prozentual von der anfangs

applizierten VEGF-Menge angegeben (100%=25ng).

56

0

1020

30

40

5060

70

1 3 5

Messzeitpunkt (d)

VEG

F (%

)

H0E0H0E1H1E1

Abb. 32:

VEGF-Freisetzung der Kollagenschwämme in der HUVEC-Kultur

Der unbehandelte Kollagenschwamm (H0E0) zeigt zum Messzeitpunkt nach einem

Tag eine signifikant höhere VEGF-Freisetzung als die beiden Modifizierten (beide

p<0,001). Auch der einfach vernetzte Kollagenschwamm (H0E1) zeigt nach einem

Tag noch eine signifikant höhere VEGF-Freisetzung als der Heparinisierte (H1E1)

(p<0,001). Nach fünf Tagen zeigen hingegen die beiden modifizierten Schwämme

eine signifikant höhere VEGF-Freisetzung als der unbehandelte Kollagenschwamm

(beide p<0,001).

Die kumulativ abgegebenen VEGF-Mengen über den Versuchszeitraum von fünf

Tagen zeigt sich in Abb. 33.

57

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6

Zeit (d)

VEG

F (%

)

H0E0H0E1H1E1

Abb. 33:

VEGF-Freisetzung (Summe) der Kollagenschwämme in der HUVEC-Kultur

Insgesamt lassen sich bei den Schwämmen zwischen 70% und 100% des

aufgetragenen VEGF nachweisen. Der unbehandelte Schwamm (H0E0) zeigt nach

fünf Tagen eine höhere VEGF-Abgabe als die modifizierten Schwämme (H0E1,

H1E1) (p<0,001; p=0,039). Am ersten und dritten Tag zeigt H0E0 die signifikant

höchste und H1E1 die signifikant niedrigste VEGF-Abgabe (alle p<0,001).

4.2.2 Der proliferative Effekt der modifizierten Kollagenschwämme in der 24-

well-Platte mit je 10000 HUVECs pro well 4.2.2.1 BrdU-Test mit 10000 HUVECs pro well in der 24-well-Platte

Die Ergebnisse der BrdU-Tests mit je 10000 Zellen pro well sind in der folgenden

Abb. 34 dargestellt. Die Messungen erfolgten wie in 3.3.2 und 3.3.5 beschrieben am

ersten, dritten und fünften Tag.

58

00,050,1

0,150,2

0,250,3

0,350,4

0,45

H1E1 +

VEGF

H1E1

H0E1 +

VEGF

H0E1

H0E0 +

VEGF

H0E0

Zellen

+ VEGF

Zellen

Zellen

in E

thano

l

Abs

Tag 1Tag 3Tag 5

Abb. 34:

BrdU-Test in der 24-well-Platte mit 10000 HUVECs pro well (n=9)

An allen drei Messzeitpunkten zeigt der heparinisierte und vernetzte

Kollagenschwamm (H1E1) mit VEGF die höchste Endothelzellproliferation (alle

p<0,001 außer H1E1 + VEGF vs. H1E1 am dritten und fünften Tag: p=0,001;

p=0,002). Auch ohne VEGF zeigt dieser an den Tagen drei und fünf eine signifikant

höhere Zellproliferation als die anderen Schwämme (alle p<0,001). Weiterhin läßt

sich zu jedem Messzeitpunkt eine signifikant höhere Endothelzellproliferation des

einfach vernetzten Schwamms (H0E1) mit VEGF gegenüber H0E0 mit (p<0,001;

p=0,002; p=0,003) und ohne VEGF (p<0,001; p<0,001; p=0,001) abgrenzen.

Ein signifikanter Unterschied durch die Zugabe von VEGF ist bei H1E1 (p<0,001;

p<0,001; p=0,001) und H0E1 (p<0,001; p=0,007; p<0,001) zu allen Messzeitpunkten

und bei den Zellen ohne Kollagenschwamm nach einem (p=0,004) und drei

(p=0,001) Tagen festzustellen. Die mit Ethanol fixierten Zellen weisen durchgehend

den signifikant kleinsten Wert auf (alle p<0,001 außer Zellen in Ethanol vs. Zellen am

fünften Tag: p=0,007).

Weiterhin läßt sich feststellen, daß während des Messzeitraumes von fünf Tagen die

Endothelzellproliferation bei allen untersuchten Kollagenschwämmen stagniert. Dies

59

ist bei allen Gruppen, außer den in Ethanol fixierten Zellen signifikant messbar (alle

p<0,001).

4.2.2.2 Zellzählung in der Neubauer-Kammer mit 10000 HUVECs pro well in der 24-

well-Platte

Die Ergebnisse der Zellzählung mit je 10000 Zellen pro well sind in der folgenden

Abb. 35 dargestellt. Die Messungen erfolgten wie beim BrdU-Test und in 3.3.2 und

3.3.6 beschrieben am ersten, dritten und fünften Tag.

02000400060008000

100001200014000160001800020000

H1E1 +

VEGF

H1E1

H0E1 +

VEGF

H0E1

H0E0 +

VEGF

H0E0

Zellen

+ VEGF

Zellen

Zellz

ahl (

n) Tag 1Tag 3Tag 5

Abb. 35:

Zellzählung in der 24-well-Platte mit 10000 HUVECs pro well (n=9)

Der vernetzte und heparinisierte Kollagenschwamm (H1E1) mit VEGF zeigt zu allen

drei Messzeitpunkten stets die größte Zellzahl (alle p<0,001 außer H1E1+VEGF vs.

H1E1 am ersten Tag: p=0,004). Des Weiteren zeigt dieser Schwamm am ersten und

dritten Tag auch ohne VEGF eine signifikant höhere Zellzahl als der unbehandelte

Schwamm (H0E0) (p=0,001 und p<0,001) und als die Kontrollgruppen (Zellen +

60

VEGF, Zellen) (alle p<0,001). Gleiches gilt auch für den einfach vernetzten

Schwamm (H0E1) mit VEGF (alle p≤0,001 außer H0E1+VEGF vs. H0E0 am ersten

und am dritten Tag: p=0,006; p=0,018 ). Die Zugabe von VEGF zeigt nur bei dem

vernetzten und heparinisierten Schwamm (H1E1) signifikante Unterschiede, welche

sich allerdings zu allen Messzeitpunkten nachweisen lassen (p=0,004; p<0,001;

p<0,001).

Des Weiteren läßt sich keine statistisch signifikante Veränderung der Zellzahl der

verschiedenen Gruppen nachweisen.

4.2.3 Der proliferative Effekt der modifizierten Kollagenschwämme in der 24-well-Platte mit je 25000 HUVECs pro well

4.2.3.1 BrdU-Test mit 25000 HUVECs pro well in der 24-well-Platte

Die Ergebnisse der BrdU-Tests mit je 25000 Zellen pro well lassen sich in der

folgenden Abb. 36 entnehmen. Die Messungen erfolgten wie mit 10000 Zellen pro

well am ersten, dritten und fünften Tag.

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

H1E1 +

VEGF

H1E1

H0E1 +

VEGF

H0E1

H0E0 +

VEGF

H0E0

Zellen

+ VEGF

Zellen

Zellen

in E

thano

l

Abs

Tag 1Tag 3Tag 5

Abb. 36:

BrdU-Test in der 24-well-Platte mit 25000 HUVECs pro well (n=9)

61

Zu allen drei Messzeitpunkten zeigt der vernetzte und heparinisierte

Kollagenschwamm (H1E1) mit VEGF deutlich die höchste Endothelzellproliferation

(alle p<0,001). Des Weiteren zeigt dieser Schwamm auch ohne VEGF zu allen

Messzeitpunkten eine signifikant höhere Zellproliferation als der unbehandelte

Schwamm (H0E0) (alle p<0,001) und als die Kontrollgruppen (Zellen + VEGF, Zellen)

(alle p<0,001). Gleiches gilt auch für den einfach vernetzten Schwamm (H0E1) mit

VEGF (p<0,001; p<0,001; p=0,001). Zwischen H0E0 (mit / ohne VEGF) und den

Zellen lassen sich keine signifikanten Unterschiede der Proliferation nachweisen. Der

Einfluß von VEGF wird bei den Kollagenschwämmen H1E1 (alle p<0,001) und H0E1

(p<0,001; p<0,001; p=0,023) zu allen Messzeitpunkten, bei H0E0 nur am ersten Tag

(p=0,007) und bei den Zellen ohne Schwamm nur am dritten Tag (p=0,004)

signifikant deutlich. Die in Ethanol fixierten Zellen zeigen an allen Tagen die

signifikant kleinste Proliferation (alle p<0,001).

Weiterhin verdeutlicht die Abbildung über den gesamten Messzeitraum eine

signifikante Endothelzellproliferationsstagnation von allen untersuchten Gruppen (alle

p<0,001 außer Zellen in Ethanol: p=0,041).


well-Platte

Die Ergebnisse der Zellzählung mit je 25000 Zellen pro well sind in der

nachfolgenden Abb. 37 dargestellt. Auch hier erfolgte die Messung am ersten, dritten

und fünften Tag.

62

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

H1E1 +

VEGF

H1E1

H0E1 +

VEGF

H0E1

H0E0 +

VEGF

H0E0

Zellen

+ VEGF

Zellen

Zellz

ahl

Tag 1Tag 3Tag 5

Abb. 37:


Zu allen drei Messzeitpunkten zeigt der vernetzte und heparinisierte

Kollagenschwamm (H1E1) mit VEGF signifikant die größte Endothelzellzahl (alle

p<0,001 außer H1E1 + VEGF vs. H1E1 am ersten Tag: p=0,002). Auch ohne VEGF

zeigt dieser Schwamm stets eine größere Endothelzellzahl als der unbehandelte

Schwamm (H0E0) mit und ohne VEGF (alle p<0,001 außer H1E1 vs. H0E0 + VEGF

am ersten Tag: p=0,002). Der einfach vernetzte Kollagenschwamm (H0E1) zeigt nur

am fünften Tag eine größere Zellzahl als der Unbehandelte (H0E0), jeweils mit

(p<0,001) und ohne VEGF (p=0,001). H0E0 wiederum weist keine signifikant höhere

Zellzahl als die Kontrollgruppen (Zellen + VEGF, Zellen) auf. Die Zugabe von VEGF

zeigt bei H1E1 zu allen Messzeitpunkten (p=0,002; p<0,001; p<0,001), bei H0E1 nur

nach dem ersten und fünften Tag (p=0,023; p=0,005) und bei den Zellen ohne

Schwamm (Kontrolle) nur am dritten Tag (p=0,019) signifikante Unterschiede.

Des Weiteren zeigt die Abbildung, daß allein der vernetzte und heparinisierte

Schwamm (H1E1) mit VEGF beladen eine signifikante Steigerung der Endothel-

zellzahl bis zum fünften Tag zeigt (p=0,001). Der unbehandelte Kollagenschwamm

63

(H0E0 + VEGF, H0E0) (p=0,002; p=0,015) und die Zellen ohne Schwamm aber mit

VEGF (p=0,005) weisen eine signifikante Abnahme der Endothelzellzahl über den

gesamten Messzeitraum auf.

4.2.4 Der proliferative Effekt der modifizierten Kollagenschwämme in der 6-well-Platte mit je 125000 HUVECs pro well


well-Platte

Die Ergebnisse der Zellzählung mit je 125000 Zellen pro well sind in der nach-

folgenden Abb. 38 dargestellt. Auch hier erfolgten die Messungen am ersten, dritten

und fünften Tag.

0

50000

100000

150000

200000

250000

300000

350000

400000

H1E1 +

VEGF

H1E1

H0E1 +

VEGF

H0E1

H0E0 +

VEGF

H0E0

Zellen

+ VEGF

Zellen

Zellz

ahl (

n)

Tag 1Tag 3Tag 5

Abb. 38:


An allen drei Messpunkten zeigt der vernetzte und heparinisierte Kollagenschwamm

(H1E1) mit VEGF signifikant die größte Endothelzellzahl bzw. den größten Zuwachs

64

an Endothelzellen (alle p<0,001 außer am ersten Tag H1E1 + VEGF vs. H1E1 und

H0E1 + VEGF: p=0,038 p=0,002). Des Weiteren zeigt dieser Schwamm auch ohne

VEGF an allen Messzeitpunkten, neben dem einfach vernetzten Schwamm (H0E1)

mit VEGF, einen signifikant höheren Zellzuwachs als der unbehandelte Schwamm

(H0E0 + VEGF, H0E0) und als die Kontrollgruppen (Zellen + VEGF, Zellen) (alle

p<0,001 außer am ersten Tag H1E1 vs. H0E0 + VEGF und H0E0: p=0,002;

p=0,039). Auch der einfach vernetzte Kollagenschwamm (H0E1) mit VEGF zeigt an

allen Messzeitpunkten einen signifikant höheren Zellzuwachs als der unbehandelte

Schwamm (H0E0 + VEGF, H0E0) und als die Kontrollgruppen (Zellen + VEGF,

Zellen) (alle p<0,001 außer H0E1 + VEGF vs. H0E0 + VEGF: p=0,002). Zudem weist

dieser ohne VEGF nach dem ersten (p=0,003) und nach dem dritten Tag (p=0,005)

einen signifikant höheren Zellzuwachs als der unbehandelte Schwamm H0E0 auf.

Dieser wiederum zeigt mit VEGF zu allen drei Messzeitpunkten einen signifikant

höheren Zellzuwachs als die Kontrollgruppen (Zellen mit (p=0,025; p<0,001;

p<0,001) und ohne VEGF (p=0,016; p<0,001; p<0,001)). Auch ohne VEGF zeigt

dieser Schwamm zu allen drei Messzeitpunkten einen signifikant höheren

Zellzuwachs als die Kontrollgruppen (Zellen mit (p=0,04; p=0,001; p=0,02) und ohne

VEGF (p=0,028; p<0,001; p<0,001)). Die Zugabe von VEGF führt bei H1E1 zu allen

Messzeitpunkten (p=0,002; p<0,001; p<0,001), bei H0E1 (beide p<0,001) und der

Kontrollgruppe (Zellen) (p=0,013; p=0,001) nur nach dem dritten und fünften Tag und

bei H0E0 nur nach dem fünften Tag zu signifikanten Zellzahlunterschieden

(p<0,001).

Weiterhin sind bei allen untersuchten Gruppen über den gesamten Messzeitraum

signifikante Zunahmen der Zellzahl zu beobachten (alle p<0,001).

4.3 Histologie

Die HE-Färbung in den Schnittbildern färben Bindegewebe wie Kollagen und lassen

daher die Porenstruktur der Kollagenschwämme gut erkennen. Abb. 39 und Abb. 40

zeigen einen der mit Heparin modifizierten Kollagenschwämme (H1E1) nach fünf

Tagen in der HUVEC-Kultur.

65

Abb. 39:

H1E1 + VEGF nach Tag 5 in 5000facher Vergrößerung (Mitte)

66

Abb. 40:

H1E1 + VEGF nach Tag 5 in 20000facher Vergrößerung (Mitte)

Abb. 41 und Abb. 42 zeigen Aufnahmen der gleichen Kollagenschwämme (H1E1).

Sie stellen den Rand des Schwammes dar, der Kontakt zum Boden des wells und

somit zu den Zellen hatte.

67

Abb. 41:

H1E1 + VEGF nach Tag 5 in 5000facher Vergrößerung (Rand)

68

Abb. 42:

H1E1 + VEGF nach Tag 5 in 20000facher Vergrößerung (Rand)

Die Abbildungen zeigen keine signifikanten Ansammlungen von Endothelzellen im

Schwamm selbst oder an dessen Rand. Auch eventuelle Migrationen von

Endothelzellen in den Kollagenschwamm lassen sich nicht nachweisen. Auch bei

den weiteren Schwammtypen (H0E0 und H0E1) lassen sich keine signifikanten

Ansammlungen oder Migrationen nachweisen.

69

5 Diskussion 5.1 Biomaterialen 5.1.1 Kollagen als artifizieller Hautersatz Für den erfolgreichen Einsatz von Biomaterialien sind biochemische Eigenschaften

von großer Bedeutung. Neben der Biokompatibilität spielen auch Reproduzierbarkeit

und Kosten bei der Herstellung eine wichtige Rolle. Synthetische Materialien (z.B.

organische Polymere) können relativ einfach und preiswert in variablen Strukturen

hergestellt werden. Auch ihre Eigenschaften wie z.B. Hydrophobie oder mechanische

Stärke lassen sich gut kontrollieren. Ein großer Nachteil synthetischer Materialien ist,

daß viele über einen langen Zeitraum immunologische Reaktionen hervorrufen

können (Bostman 1991). Im Gegensatz dazu führen natürliche Materialen meist zu

keiner immunologischen Reaktion, weshalb sie als biokompatibel angesehen

werden. Eines der am häufigsten eingesetzten natürlichen Biomaterialen ist Kollagen

(Chevallay et al. 2000, Orwin and Hubel 2000, Pieper et al. 1999). Es stellt den

größten Anteil der extrazellulären Matrix des Bindegewebes dar (van der Rest and

Garrone 1991). Aufgrund der Vielzahl von unterschiedlichen Strukturen lassen sich

die Kollagene von Typ I bis XIX klassifizieren. Das im Körper am häufigsten

vorkommende Kollagen, Kollagen Typ I läßt sich leicht aus Schweine- oder

Rinderhaut isolieren und ist durch besondere Festigkeit charakterisiert (Schoof et al.

2001). Vor allem ist es aber leicht zu sterilisieren und gehört daher zu den am

meisten eingesetzten Biomaterialien (Friess 1998).

Die vielseitige Verwendbarkeit von Kollagen als Implantatgrundgerüst spiegeln

zahlreiche Studien wieder. Rocha et al. zeigten, daß allein die Modifizierung der

Kollagenstruktur und –porengröße Einfluß auf Immunreaktion und Gewebe-

wachstum haben (Rocha et al. 2002). Mehrere Studien, die sich mit Zellen in

direktem Kontakt mit einer Kollagenmatrix befassten, lieferten vielversprechende

Ergebnisse. Es gelang Hepatozyten (Glicklis et al. 2000), Chrondrozyten (Glicklis et

al. 2000) und Fibroblasten (Doillon et al. 1984) durch den Kollagenkontakt zu

verstärkter Proliferation und Wachstum anzuregen. Zusätzlich stellt Kollagen ein

mögliches Trägergerüst für Wachstumsfaktoren dar. Die Bindung von Wachstums-

faktoren an Trägermatrizes hat mittlerweile einen hohen Stellenwert erreicht, denn

70

Gewebeform und Zellfunktion können hierdurch positiv beeinflußt werden (Lu et al.

2000). In der Literatur sind erfolgreiche Bindungen von Wachstumsfaktoren, wie z. B.

EGF, bFGF und VEGF an Kollagen beschrieben (Dellian et al. 1996, Fujisato et al.

1996). Zusätzlich ließ sich durch Einsatz von bioaktiven Molekülen, wie z.B.

Hyaluronsäuren, Glykosaminoglykane oder Heparin, die Bindung von Wachstums-

faktoren an Kollagen besser steuern und zellproliferative und angiogenetische

Effekte weiter steigern (Jansen et al. 2004, Park et al. 2002, Pieper et al. 2000,

Wissink et al. 2000b).

Die bisher in der Literatur beschriebenen vielseitigen Ansätze und Möglichkeiten von

Kollagen unterstreichen seine große Bedeutung als Grundgerüst bei der Herstellung

eines optimalen Gewebeersatzes.

5.1.2 Vorteile der modifizierten Matrix Das Ziel des „Tissue Engineering“ ist es, einen Gewebsersatz zu entwickeln, der

vergleichbare Eigenschaften des zu ersetzenden Gewebes besitzt und nach

Implantation Form und Funktion übernehmen kann. Somit ist das Überleben der an

das künstliche Gewebe angrenzenden Zellen essentiell. Eine ausreichende

Versorgung dieser Zellen mit Sauerstoff und nutritiven Substanzen ist jedoch nur

durch eine ausreichende Vaskularisierung gewährleistet. Dies verdeutlicht warum die

Entwicklung eines künstlichen Gewebes mit hohem angiogenetischen Potential eines

der führenden Interessen im „Tissue engineering“ darstellt (Nomi et al. 2002).

Es sind viele Methoden beschrieben worden das angiogenetische Potenzial eines

Ersatzgewebes zu erhöhen. Eine Möglichkeit besteht darin, Wachstumsfaktoren so

an Biomaterialen zu binden, daß diese kontinuierlich freigesetzt werden und somit

über einen längeren Zeitraum eine konstante angiogenetische Wirkung gewähr-

leistet ist. Dies gelang etwa durch die Bindung von VEGF an „calcium alginate

microspheres“ (Elcin et al. 2001) und an Polyglycolide (Murphy et al. 2000). Auch die

erfolgreiche Bindung von NGF (Nerve Growth Factor) an eine Fibrinmatrix konnte

dargestellt werden (Sakiyama-Elbert and Hubbell 2000). Pieper et al. beschrieb eine

Kollagenmatrix, die durch eine Modifizierung mit EDC (1-ethyl-3-(3-dimethyl

aminopropyl)carbodiimid) in der Lage war, Chondroitinsulfat kovalent zu binden

(Pieper et al. 1999). Die Verwendung von EDC und NHS (N-hydroxysuccinimid) als

intra- und intermolekularer Vernetzer zeichnet sich dadurch aus, daß es nach der

71

Reaktion mit Wasser ohne Rückstände ausgewaschen werden konnte (Nimni et al.

1987). Nach Implantation in den Empfänger treten somit keine toxischen Substanzen

auf, wie man sie bei Verwendung anderer Chemikalien zur Modifizierung von

Biomaterial anwendet. Zusätzlich können Wachstumsfaktoren unter Verwendung von

EDC/NHS an Kollagen gebunden werden (Wissink et al. 2000a). Die höchste Menge

von gebundenem Heparin ließ sich bei einem Verhältnis von 2:1 (EDC/NHS zu

Heparin) nachweisen (Yao 2003). Auch die in vitro Degradation war stark von der

verwendeten EDC/NHS-Konzentration und dem Verhältnis EDC/NHS zu Heparin

abhängig. Eine höhere EDC/NHS-Konzentration oder ein hohes Verhältnis von

EDC/NHS zu Heparin resultierten in einer langsameren Degradation der

Kollagenmatrix (Yao 2003). Dies beruht auf dem Effekt, daß durch EDC/NHS nicht

nur Heparin gebunden wird, sondern auch kovalente intra- und intermolekulare

Verbindungen entstehen, die den entsprechenden Kollagenschwamm stabilisieren.

Heparin selbst besitzt neben seiner starken antithrombotischen Wirkung auch eine

angiogenetische Potenz (Bombardini and Picano 1997) und ist in der Lage

Wachstumsfaktoren zu binden. Wissink et al. verwendeten eine mit EDC/NHS und

Heparin modifizierte Kollagenmatrix zur Bindung von bFGF und konnten die

gewünschte kontinuierliche Freisetzung von bFGF nachweisen (Wissink et al.

2000a). Ähnlich vielversprechende Ergebnisse ließen sich in der vorliegenden Studie

unter Verwendung einer analogen Kollagenmatrix zur Bindung des

Wachstumsfaktors VEGF realisieren.

5.2 Eigenschaften von VEGF 5.2.1 VEGF-Verhalten in vitro Die hohe angiogenetische Potenz von VEGF ist ein möglicher Lösungsansatz, die

verzögerte Revaskularisierung im Wundareal zu verbessern (Soker et al. 2000). Der

Grundgedanke VEGF an eine Matrix zu koppeln, beruht in erster Linie auf der extrem

hohen Instabilität von VEGF in vivo (s. 5.2.2). Allerdings wird auf das Verhalten von

VEGF in vitro in der Literatur wenig eingegangen. Es ist jedoch von großer

Bedeutung, da die gewünschte kontinuierliche VEGF-Freisetzung in dieser Studie

unter anderem in vitro untersucht wurde.

72

Die Bestimmung der in-vitro-Stabilität von VEGF wurde unter vier verschiedenen

Versuchsbedingungen durchgeführt (s. 3.2.3 und 4.1.1). Dies ist notwendig, denn die

VEGF-Stabilitätsbestimmung muß unter den gleichen Versuchsbedingungen

durchgeführt werden wie die Freisetzungskinetik (s. 3.2.4). Somit wurde die Stabilität

von VEGF je bei Raumtemperatur und 37°C ohne und unter Einfluß von

Kollagenase bestimmt.

Bei allen vier Versuchsbedingungen zeigte VEGF eine überraschend hohe Stabilität

in vitro. Bis zum letzten Messpunkt bei t=48 h ließ sich bei keiner der Versuchs-

bedingungen ein Rückgang der VEGF-Konzentration feststellen. Ein möglicher

spontaner Zerfall des VEGF-Moleküls in eine im ELISA nicht mehr nachweisbare

Form, würde somit nur auf einen nicht signifikanten, minimalen Teil zutreffen.

Trotz der sehr hoch gewählten Konzentration von Kollagenase (s. 3.2.3 und 5.3) ließ

sich kein Einfluß dieses Enzyms auf VEGF unter den oben genannten Bedingungen

nachweisen.

Somit erwies sich VEGF unter den getesteten in-vitro-Bedingungen als aus-

gesprochen stabil.

5.2.2 VEGF-Verhalten in vivo In vivo verfügen die verschiedensten Wachstumsfaktoren, Zytokine und Gonado-

tropine über unterschiedlichen starken Einfluß auf die Angiogenese. Ein Großteil

dieses Einflusses ist nicht durch eine direkte Reaktion des betreffenden Moleküls mit

Endothelzellen bedingt, sondern über eine Interaktion mit VEGF. Die VEGF

Expression läßt sich daher in einem sehr komplexen System sehen, die je nach

unterschiedlichen Stimuli einen angiogenetischen oder anti-angiogenetischen Effekt

auslöst (Neufeld et al. 1999). Daher nimmt VEGF eine wichtige Schlüsselposition in

der Regulierung der Angiogenese ein.

Die eigentliche Angiogeneseinduktion über Proliferationssteigerung von

Endothelzellen durch VEGF konnte in verschiedensten in-vivo-Studien verifiziert

werden. Neovaskularisationen und Angiogenese durch VEGF in der Netzhaut sind

mehrfach in der Literatur beschrieben (Adamis et al. 1994, Pierce et al. 1995). Auch

bei der Angiogenese von Tumorgewebe spielt VEGF eine bedeutende Rolle.

Tumorwachstum ist direkt von der durch VEGF bedingten Angiogenese abhängig

(Kim et al. 1993). Auch Versuche mit mirkochirurgischen Lappen an Ratten zeigten

73

unter dem Einsatz von VEGF bessere Ergebnisse als ohne Verwendung von VEGF

(Machens et al. 2003). Eine wichtige Tatsache, die bei der Verwendung von VEGF in der Literatur mehrfach

beschrieben und diskutiert wurde, ist die hohe Instabilität in vivo. VEGF wird

innerhalb von kürzester Zeit durch körpereigenen Proteasen abgebaut und besitzt

daher eine extrem kurze Halbwertszeit in vivo (Elcin et al. 2001). Die Bindung von VEGF an Kollagen ermöglicht, unter der Vorraussetzung, daß ein

kontinuierlicher Abbauprozess von Kollagen stattfindet, eine konstante Freisetzung

von VEGF. Diese gewährleistet trotz der hohen Instabilität von VEGF in vivo eine

konstante VEGF-Konzentration im vorhandenen Milieu, die eine konstante

angiogenetische Wirkung und somit in eine beschleunigte Wundheilung zur Folge

hat.

5.3 Eigenschaften und biologische Effekte der modifizierten Kollagenmatrix

5.3.1 Freisetzungskinetik von VEGF Für die Bestimmung der Freisetzungskinetik der Kollagenmatrizes in vitro wurden

vier verschiedene Modifikationen ausgewählt. Ein einfach vernetzter Kollagen-

schwamm ohne Heparin (H0E1), ein einfach vernetzter Schwamm mit Heparin

(H1E1), ein stark vernetzter Schwamm mit Heparin (H1E2), da dieser die größt-

mögliche Aufnahme von Heparin zeigte (s. 5.1.2) und ein unbehandelter Kollagen-

schwamm als Kontrolle (H0E0). Die Versuche der Freisetzungskinetik in vitro wurden

je bei Raumtemperatur und 37°C sowohl ohne, als auch unter permanentem bzw.

verzögertem Einfluß von Kollagenase durchgeführt (s. 3.2.4). Die Raumtemperatur

bietet den Vorteil, die Versuche ohne extremen technischen Aufwand durchzuführen

und diese jeder Zeit gut zu überwachen. Die Ergebnisse geben des Weiteren

Auskunft über die Einflußgröße der Temperatur bei der VEGF-Freisetzung, wenn

diese mit den Ergebnissen bei einer Temperatur von 37°C verglichen werden. 37°C

wurde als zweite Messtemperatur gewählt, da diese Temperatur der

Körpertemperatur näherungsweise gleicht. Sakiyma-Ebert und Hubbel beschrieben

die Freisetzung von NGF (Nerve Growth Fachtor) von einer Fibrinmatrix bei

Raumtemperatur (Sakiyama-Elbert and Hubbell 2000). Wissink et al. führten den

74

Nachweis einer konstanten Freisetzung von bFGF (basic Fibroblast Growth Factor)

ausschließlich bei 37°C durch (Wissink et al. 2000a).

Der zusätzliche Einsatz von Kollagenase simuliert einen Abbau der Kollagenmatrix in

vitro. Die in diesen Versuchsreihen gewählte Kollagenasekonzentration von 160 U/ml

ist bewusst hoch gewählt um einen deutlichen Abbaueffekt der Kollagenschwämme

zu erzeugen. Die Versuchsreihen, die auf einer einmaligen Gabe von Kollagenase

(160 U/ml) nach dem Zeitpunkt (t=24 h) basieren, dienen in erster Linie der

Beurteilung, wieviel VEGF sich nach 24 Stunden ohne den Einfluß von Kollagenase

im Kollagenschwamm noch nachweisen läßt.

In der Versuchsreihe der VEGF-Freisetzung ohne Einfluß von Kollagenase bei

Raumtemperatur (s. 4.1.2.1) zeigte der unmodifizierte Kollagenschwamm (H0E0)

eine höhere Freisetzung von VEGF als die modifizierten und einen deutlichen

Unterschied zu den mit Heparin modifizierten Schwämmen (Abb. 21). Dies spricht für

eine stärkere Bindung von VEGF an die modifizierten Schwämme. Allerdings ließ

sich mit einer maximalen VEGF-Freisetzung der heparinisierten Schwämme von ca.

8% nur recht wenig des aufgetragenen VEGF nachweisen. Als Ursache dieser

geringen Freisetzung kommen mehrere Gründe in Frage. Zum Einen können

theoretisch VEGF-Moleküle in Gegenwart der Kollagenmatrix nicht mehr

nachzuweisen sein; z. B. durch eine hohe Instabilität, die in den zuvor

durchgeführten Stabilitätsversuchen (s. 4.1.1) nicht gemessen werden konnte. Viel

wahrscheinlicher ist jedoch, daß die Bindung von VEGF an Kollagen die Ursache für

eine geringe VEGF-Freisetzung ist (s. 1.4, Abb. 28-31). Dies zeigen die Ergebnisse

der analogen Versuchsanordnung (s. 3.2.4) mit dem Unterschied, daß erst nach 24

Stunden eine Zugabe von Kollagenase (160 U/ml) erfolgte. Diese

Versuchsanordnung ermöglicht es, VEGF in noch an den Kollagenschwamm

gebundener Form nachzuweisen. Die Ergebnisse (s. 4.1.2.3) zeigen einen Anstieg

der VEGF-Freisetzung nach Zugabe der Kollagenase bei Raumtemperatur und bei

37°C. Dies ist auf die enzymatische Aktivität der Kollagenase zurückzuführen, die

einen Abbau des Kollagens bewirkt und somit das gebundene VEGF freisetzt.

Insgesamt ließen sich somit nach weiteren 24 Stunden (t=48 h) 55 bis 77 % des

anfangs aufgetragenen VEGF nachweisen.

75

Daraus läßt sich schlussfolgern, daß die geringe Freisetzung von VEGF bei

Raumtemperatur ohne Einfluß von Kollagenase auf der gewünschten Bindung von

VEGF an die Kollagenmatrix beruht.

Gleiches gilt für die VEGF-Freisetzung bei einer Temperatur von 37°C. Auch hier

ließen sich nach 48 h nur maximal 37 % der aufgetragenen VEGF-Menge

nachweisen (s. 4.1.2.1). Die Ergebnisse mit Zugabe von Kollagenase nach 24

Stunden (s. 4.1.2.3) machen deutlich, daß auch bei diesem Versuchsaufbau eine

Bindung von VEGF an die Kollagenmatrix für die verzögerte VEGF-Freisetzung

verantwortlich ist. Dies wird durch die Tatsache bestätigt, daß auch bei 37°C der

native Kollagenschwamm (H0E0) die höchste Freisetzung zeigte. Die modifizierten

Kollagenmatrizes wiesen hingegen eine stärkere VEGF-Bindung auf. Insbesondere

die heparinisierten Kollagenschwämme (H1E1, H1E2) zeigten nochmals eine

langsamere Freisetzung als der einfach vernetzte Kollagenschwamm (H0E1). Dies

könnte auf einer stärkeren Bindung an Kollagen durch Heparin als Bindeglied

beruhen, welche auch in der Literatur bereits beschrieben ist. Wissink et al. konnten

nachweisen, daß mit Heparin behandelte Kollagenmatrizes, im Gegensatz zu nativen

Kollagenmatrizes eine verzögerte Freisetzung des Wachstumsfaktors bFGF zeigen

(Wissink et al. 2000b). Ferner gelang Sakiyama-Elbert und Hubbell die verzögerte

Freisetzung von NGF von einer mit Heparin modifizierten Fibrinmatrix im Gegensatz

zur Fibrinmatrix ohne Heparin (Sakiyama-Elbert and Hubbell 2000).

Der identische Versuchsaufbau unter permanentem Einfluß des Enzyms Kollagenase

zeigte eine deutliche Veränderung der Ergebnisse (s. 4.1.2.2). In Abb. 24 läßt sich

erkennen, daß die maximale VEGF-Freisetzung der verschieden modifizierten

Kollagenschwämme zu verschiedenen Messzeitpunkten auftrat. Der unbehandelte

Schwamm (H0E0) zeigte diese nach drei Stunden, die mit Heparin modifizierten

Schwämme (H1E1, H1E2) nach 24 Stunden. Die gemessene VEGF-Menge zu den

Messzeitpunkten stellt allerdings die Menge des VEGFs dar, die über den gesamten

Zeitraum zwischen den Messzeitpunkten freigesetzt wurde. Exakt formuliert zeigte

somit der unbehandelte Kollagenschwamm seine höchste Freisetzung an VEGF im

Zeitraum von einer bis drei Stunden, die heparinisierten Schwämme dagegen im

Zeitraum von drei bis 24 Stunden. Dies bedeutet, daß die unbehandelte

Kollagenmatrix die maximale VEGF-Menge nicht nur früher sondern auch in einem

wesentlich kürzeren Zeitraum abgab. Dies unterstützt die zuvor genannte

Schlussfolgerung, daß die modifizierten und insbesondere die mit Heparin

76

modifizierten Kollagenschwämme eine stärkere Bindung zu VEGF aufweisen als die

Unbehandelten.

Abb. 25 verdeutlicht die insgesamt im Versuch wiederauffindbare VEGF-Menge. Es

ließ sich ein recht hoher Anteil zwischen 70% und 90% des aufgetragenen VEGF

nachweisen. Die schwächere Bindung von VEGF zu den unbehandelten

Schwämmen wurde beim Messzeitpunkt von drei Stunden deutlich. Auch hier zeigte

sich eine höhere VEGF-Freisetzung des nicht modifizierten Kollagenschwammes.

Die Versuche unter Einfluß von Kollagenase bei 37°C zeigten analoge Ergebnisse

(Abb. 26 und 27). Sie verdeutlichen die schwächere Bindung von VEGF an die

nativen Kollagenmatrizes und die daraus resultierende schnellere Freisetzung des

Proteins.

Eine nahezu vollständige Freisetzung des gesamten VEGF binnen 2 Tagen in vivo

wäre für klinische Anwendungen jedoch nicht sinnvoll, da es sich bei chronische

Wunden per Definition um Wunden handelt, die nach vier Wochen konsequenter

lokaler und ursachenbezogener Behandlung makroskopisch keine

Heilungstendenzen aufweisen (Siewert 2001). Hier ist zu beachten, daß sich

Freisetzungskinetiken dieses in-vitro-Modellversuchs nicht eins zu eins auf die

klinische Situation übertragen lassen. Die für die Versuchsreihen gewählte

Konzentration von Kollagenase ist mit 160 U/ml sehr hoch und ermöglicht einen

zügigen Abbau von Kollagen mit einer entsprechend hohen VEGF-Freisetzung. Die

Freisetzung ohne den Einfluß einer so hohen Kollagenasekonzentration ermöglicht

hingegen die kontinuierliche VEGF Freisetzung bis zu 14 Tagen, was im Rahmen

eines klinischen Einsatzes sinnvoller wäre (Murphy et al. 2000).

Die durchgeführten Freisetzungsversuche verdeutlichen, daß unter verschiedenen

Bedingungen, wie z. B. unterschiedlichen Temperaturen, mit bzw. ohne Einfluß von

Kollagenase, die unbehandelten Kollagenschwämme zu einem früheren

Messzeitpunkt als die modifizierten Schwämme einen Großteil des aufgetragenen

VEGF abgeben. Dies kann auf eine verstärkte Bindung von VEGF an Kollagen

zurückgeführt werden. Besonders die mit Heparin behandelten Kollagenmatrizes

zeigen darüber hinaus eine sehr hohe Affinität zu VEGF. Auch anderen

Arbeitsgruppen gelang es eine solch verzögerte Freisetzung von verschiedensten an

Kollagen gebundenen Wachstumsfaktoren zu realisieren. Neben verzögerten

Freisetzung von Wachstumsfaktoren über eine Bindung an Heparin (Sakiyama-Elbert

and Hubbell 2000, Wissink et al. 2001), sind weiterhin Bindungen an „calcium

77

alginate microspheres“ oder Polyglukolide beschrieben (Elcin et al. 2001, Murphy et

al. 2000).

Darüber hinaus zeigten die modifizierten Kollagenschwämme unter Einfluß von

Kollagenase bei Raumtemperatur und bei 37°C eine geringere Degradation. Dies

wurde nicht quantitativ bestimmt, allerdings ließ sich der unbehandelte

Kollagenschwamm (H0E0) nach 24 Stunden mit bloßem Auge nicht mehr erkennen

und war komplett aufgelöst. Alle modifizierten Schwämme hingegen waren nach 48

Stunden zumindest teilweise noch vorhanden. Dies wird durch die Ergebnisse von

Yao bestätigt (Yao 2003). Er postulierte, daß die Zugabe von EDC/NHS nicht nur zu

einer stärkeren Heparinbindung an Kollagen führt, sondern daß auch kovalente

intramolekulare Kollagenbindungen entstehen, die den Kollagenschwamm

stabilisieren. Dadurch resultiert eine verlangsamte VEGF-Abgabe der einfach

vernetzten Kollagenmatrix (H0E1) im Vergleich zur Unbehandelten (H0E0). Die

nochmals verzögerte VEGF-Abgabe der heparinisierten Kollagenmatrizes gegenüber

der einfach Vernetzten beruht auf der zusätzlichen Bindung von VEGF an Heparin.

Die optimierte Verzögerung der VEGF-Freisetzung besitzt somit eine zusätzliche

vernetzte und mit Heparin behandelte Kollagenmatrix.

Die Bedingungen für die VEGF-Freisetzungsversuche in der Zellkultur wurden exakt

denen der Zellversuchen angepasst (s. 3.3.4). Wie bei den Zellversuchen wurden die

Schwämme (H0E0, H0E1 und H1E1) mit je 25 ng VEGF beladen und das

Zellmedium jeweils nach einem, drei und fünf Tag(en) auf den VEGF-Gehalt

untersucht (s 3.3.4 und 4.2.1). Somit differieren die aufgetragene VEGF-Menge und

die gewählten Messzeitpunkte etwas von denen der reinen in-vitro-Versuche (s.

3.2.4).

Abb. 33 (s. 4.2.2) zeigt deutliche Unterschiede in der VEGF-Freisetzung der

verschiedenen Kollagenschwämme. Zu allen drei Messzeitpunkten zeigte der

unbehandelte Kollagenschwamm (H0E0) die größte, der einfach vernetzte

Kollagenschwamm (H0E1) die zweitgrößte und der heparinisierte Kollagenschwamm

(H1E1) stets die kleinste VEGF-Gesamtfreisetzung. Dies bestätigt auch unter den

Zellkulturbedingungen und etwas anders gewählten Messzeitpunkten, die bereits

aufgrund der in-vitro-Versuche (s. 4.1.2) aufgestellte Annahme, daß VEGF zu den

behandelten Schwämme eine stärkere Bindung aufweist als zu den Unbehandelten.

Ebenfalls zeigte auch in diesem Versuch der vernetzte und heparinisierte

Kollagenschwamm (H1E) die stärkste Bindung zu VEGF. Bei genauer Betrachtung

78

lassen sich sehr ähnlich Kurvenverläufe zur in-vitro-VEGF-Freisetzung bei 37°C

ohne Kollagenase (s. 4.1.2.1), zumindest bis zum Zeitpunkt nach 48 Stunden

feststellen. Andere Arbeitsgruppen, die mit vergleichbaren Trägermatrizes arbeiteten,

die eine langsame Freisetzung von Wachstumsfaktoren ermöglichen sollen, zeigten

ähnliche Ergebnisse (Sakiyama-Elbert and Hubbell 2000).

Beim weiteren Vergleich der VEGF-Freisetzung in der Zellkultur mit der VEGF-

Freisetzung unter Einfluß von Kollagenase ließen sich bei beiden Versuchen am

Ende des Messzeitraums etwa die gleichen Mengen des aufgetragenen VEGFs

nachweisen (70-90%). Trotzdem stellten sich die Kurvenverläufe insbesondere der

modifizierten Kollagenschwämme sehr unterschiedlich dar. Dies hängt

möglicherweise mit dem Einfluß der Kollagenase zusammen.

Wissink et al. arbeiteten auch mit einer mit Heparin modifizierten Kollagenmatrix,

verzichteten aber auf den Einsatz von Kollagenase und vergrößerten stattdessen

den Messzeitraum auf 28 Tage (Wissink et al. 2000b). Andere Studien beschreiben

wiederum kürzere Messzeiträume und gelangten zu einem ähnlichen Ergebnis

(Murphy et al. 2000, Sakiyama-Elbert and Hubbell 2000). Grundsätzlich gibt es

verschiedene Möglichkeiten eine verzögerte Freisetzung von Wachstumsfaktoren zu

erreichen. Als Trägermatrix können Polymere, Polyglukolide oder Kollagen dienen

(Murphy et al. 2000, Pieper et al. 1999, Sheridan et al. 2000). Die Art der Bindung

des Wachstumsfaktors an die Trägermatrix bietet weiterhin die Möglichkeit,

Eigenschaften der verknüpfenden Struktur zu nutzen. Die in dieser Studie

durchgeführte Bindung von VEGF an Kollagen über Heparin bietet den Vorteil, daß

Heparin selbst, neben seiner intrinsischen Wirkung auf das Gerinnungssystem, eine

angiogenetische Potenz besitzt (Bombardini and Picano 1997). Dies ermöglicht, die

angiogenetische Wirkung einer Kollagenmatrix zusätzlich zu steigern und somit

letztlich die Angiogenese zu beschleunigen.

5.3.2 Einfluß der Matrix auf die Proliferation von Endothelzellen In den Versuchsreihen mit Endothelzellen wurden drei verschiedene modifizierte

Gruppen von Kollagenschwämmen verwendet. Dies ermöglichte einen direkten

Vergleich zwischen vernetzten und heparinisierten (H1E1), einfach vernetzten

(H0E1) und nativen Kollagenmatrizes (H0E0). Die Gruppe H1E2 (maximaler Anteil

von Heparin) wurde nicht eingesetzt, da sie in der VEGF-Freisetzungskinetik keinen

79

signifikanten Unterschied zur der Gruppe H1E1 zeigte (s. 4.1.2). Die VEGF-Mengen

für die 5*5*5 mm großen Schwämme in der 24-well-Platte und für die 10*10*10 mm

großen Schwämme wurden aufgrund von Ergebnissen der Vorversuche auf 25 bzw.

100 ng VEGF pro Kollagenschwamm festgelegt. Während des gesamten

Versuchablaufs wurde ausschließlich Endothelzellmedium (B) verwandt, das im

Gegensatz zu Endothelzellmedium (A) kein zusätzliches FGF oder VEGF enthält.

Dadurch wirkt ausschließlich das im Versuch aufgetragene VEGF. Die Zelldichte

wurde auf einheitliche 13900 Zellen/cm² festgelegt um die unterschiedlichen

Ergebnisse der beiden Plattentypen direkt miteinander zu vergleichen. Die weitere

Versuchsreihe mit 24-well-Platten und einer Zelldichte von 5600 Zellen/cm² er-

möglichte die Bestimmung des Einflusses der Zelldichte selbst auf das Ergebnis. Der

BrdU-Test (s. 3.3.5) machte eine genaue Bestimmung der Zellproliferation in den

verschieden wells möglich, zusätzlich wurde die Zellzahl mittels Neubauer-Kammer

bestimmt (s. 3.3.6). Diese Methode ist ungenauer als der BrdU-Test und die

Ergebnisse zeigen größere Streuungen. Dennoch wurden auch hier signifikante

Unterschiede deutlich.

In allen durchgeführten Versuchsreihen zeigte sowohl in den BrdU-Tests, als auch in

den Zellzählversuchen der vernetzte und heparinisierte Kollagenschwamm (H1E1)

mit VEGF stets die höchste Zellproliferation bzw. die größte Zellzahl. Der

Unterschied zum gleichen Kollagenschwamm ohne VEGF ließ sich bei allen

Versuchsreihen abgrenzen. Somit erzielte der heparinisierte Schwamm mit Zugabe

von Wachstumsfaktoren den größten zellproliferierenden Effekt. Dies zeigten auch

bereits zuvor durchgeführte Versuche von Markowicz et al., Aachen (bisher noch

unveröffentlicht). Auch Sikayana-Elbert und Hubbel konnten dies mit einer

heparinisierten Fibrinmatrix und NGF (Nerve Growth Factor) nachweisen (Sakiyama-

Elbert and Hubbell 2000). Allerdings zeigte der identische Kollagenschwamm ohne

VEGF auch in allen Versuchsreihen eine höhere Zellproliferation bzw. größere

Zellzahl als der native Kollagenschwamm (H0E0), unabhängig davon, ob dieser mit

oder ohne VEGF eingesetzt worden ist. Dies legt die Schlussfolgerung nahe, daß die

Art der Vernetzung der Kollagenschwämme und somit ihre Struktur und Porengröße

sehr viel größeren Einfluß auf die Zellproliferation haben als die Zugabe von VEGF.

Tsuruga et al. konnten zeigen, daß die Porengröße einer Matrix von großer

Bedeutung ist und daß es für unterschiedliche Versuchsbedingungen jeweils eine

optimale Porengröße zu geben scheint (Tsuruga et al. 1997). Dies wird auch durch

80

die Tatsache bestätigt, daß einige Versuchsreihen (s. 4.2) eine höhere

Zellproliferation bzw. größere Zellzahl des einfach vernetzten Schwammes (H0E1)

als des unbehandelten Kollagenschwammes (H0E0) aufwiesen, teilweise

unabhängig davon, ob VEGF eingesetzt wurde oder nicht. Somit bewirkt allein die

Veränderung der Struktur der Matrix einen Unterschied auf die

Endothelzellproliferation, denn die verwendete Vernetzungsreagenz EDC/NHS wird

nach der festgelegten Reaktionszeit aus der Matrix ausgespült und hinterläßt

ausschließlich inter- und intramolekulare Verknüpfungen im Kollagen (Nimni et al.

1987). Darüber hinaus wird in verschiedenen Versuchsreihen (s. 4.2) deutlich, daß

allein der unbehandelte Schwamm (H0E0) eine höhere Endothelzellproliferation bzw.

größere Zellzahl zeigte als die Kontrollgruppen ohne Schwamm, unabhängig davon,

ob VEGF verwendet wurde oder nicht. Daraus läßt sich schließen, daß allein die

Gegenwart einer dreidimensionalen Kollagenmatrix einen proliferationssteigernden

Effekt in der Zellkultur induziert. Der additive proliferationssteigernde Effekt durch die

Zugabe von VEGF ließ sich beim heparinisierten und vernetzten Kollagenschwamm

(H1E1) immer, bei den anderen Versuchsreihen nur zu bestimmten Messzeitpunkten

nachweisen (s. 4.2). Wissink et al. beschrieben den proliferativen Effekt von an

Kollagen gebundene Wachstumsfaktoren in der Zellkultur, indem die Trägermatrizes

mit unterschiedlichen Mengen von bFGF beladen worden (Wissink et al. 2001). Der

additive proliferationssteigernde Effekt durch die Zugabe von VEGF ist aber sehr viel

kleiner als der proliferationssteigernde Effekt, der durch die Veränderungen der

Kollagenmatrix auftritt. Dies konnte auch bei Versuchen an der Chorio-

allantoismembran von Hühnereiern und an Ratten gezeigt werden (Yao 2003).

Zudem wiesen die beiden für die Zellversuche eingesetzten Plattentypen (24-well-

Platte und 6-well-Platte) deutliche Unterschiede untereinander auf. In der 6-well-

Platte wiesen alle untersuchten Gruppen eine Zunahme der Zellzahl auf, während in

der 24-well-Platte dies nur bei der Gruppe des Kollagenschwammes H1E1

nachzuweisen war. Überwiegend zeigte sich aber keine Veränderung der Zellzahl

oder gar eine Stagnation der Zellzahl über den gesamten Messzeitraum. Dies ist

bislang in der Literatur noch nicht beschrieben und kann wie folgt erklärt werden.

81

S1

S2

d1

d2

d1

S1

d2

S2

Durchmesser der 6-well-Platte

Durchmesser der 24-well-Platte

Kollagenschwamm in der 6-well-Platte

Kollagenschwamm in der 24-well-Platte

6-well-Platte 24-well-PlatteVerlust der Zellwachstumsfläche

Abb. 43:

Konstellation der Versuche mit 6- und 24-well-Platten

Abb. 43 zeigt eine schematische Darstellung je eines wells aus einer 6-well-Platte

(links) und einer 24-well-Platte (rechts) mit einer Kollagenmatrix in der Mitte. Die

Zellzahl zu Versuchsbeginn beträgt in der 6-well-Platte 125000 und in der 24-well-

Platte 25000. Die 6-well-Platte hat einen Durchmesser von 34 mm (d1) und somit

eine Fläche von 9,07 cm², die 24-well-Platte besitzt einen Durchmesser von 15 mm

(d2) und somit eine Fläche von 1,8 cm². Somit beträgt in beiden wells die Zelldichte

13900 Zellen/cm². Die täglichen mikroskopischen Beobachtungen des Zellwachs-

tums zeigten, daß sich Zellen nach Zugabe der Kollagenmatrizes ausschließlich am

Rande des wells auffinden ließen. Der Raum unter dem Schwamm und dessen

unmittelbare Umgebung blieben stets zellfrei. Angenommen die Endothelzellen

adhärieren nicht bis zu einer willkürlich gewählten Distanz von <4 mm zum

Schwamm (in blau dargestellt), würde dies für eine 6-well-Platte (bei einer

Kollagenschwammgröße von 10*10*10 mm), einen Flächenverlust für potentielles

Zellwachstum von ca. 1,96 cm² und somit 21% der Gesamtfläche bedeuten. Bei

einer 24-well-Platte hätte dies (bei einer Kollagenschwammgröße von 5*5*5mm)

einen Flächenverlust für potentielles Zellwachstum von ca. 0,81 cm² und somit einen

Gesamtflächenverlust von 45% zur Folge. Also mehr als der doppelte Anteil im

82

Vergleich zur 6-well-Platte. Dies könnte das schlechtere Gesamtwachstum der

Versuchsgruppen in der 24-well-Platte erklären.

Dennoch zeigte bei allen Versuchsgruppen der heparinisierte und vernetzte

Kollagenschwamm (H1E1) mit VEGF die höchste Zellproliferation bzw. die größte

Zellzahl. Auch andere Arbeitsgruppen konnten zeigen, daß mit Heparin und

Wachstumsfaktoren modifizierte Kollagenmatrizes stärkeren proliferativen Einfluß auf

Zellen haben als unbehandelte. Wissink et al. gelang es, starkes Zellwachstum

nachzuweisen indem HUVECs direkt auf eine mit Heparin und EDC/NHS behandelte

Kollagenmatrix ausgesät worden. Mit dem Wachstumsfaktor bFGF konnte somit

verstärktes Wachstums der Endothelzellen bis zu zehn Tagen nachgewiesen werden

(Wissink et al. 2000a). Auch andere Studien konnten zeigen, daß eine heparinisierte

und vernetzte Kollagenmatrix mit VEGF den größten angiogenetischen Effekt besitzt.

Bei Tierversuchen wurden Ratten im Dorsalbereich subkutan verschieden

modifizierte Kollagenschwämme implantiert. Nach 15 Tagen wurden diese wieder

entnommen und auf den Gehalt an Hämoglobin untersucht. Der heparinisierte und

vernetzte Kollagenschwamm (H1E1) zeigte hier den größten Anteil an Hämoglobin

(Yao 2003). Ferner wies der gleiche Kollagenschwamm bei Versuchen an der

Chorioallantoismembran von Hühnereiern den größten Zuwachs an Kapillaren

gegenüber den Kontrollgruppen auf (Yao 2003). Auch hier erwies sich der additive

Effekt durch die Zugabe von VEGF wesentlich kleiner, als die Veränderung des

Kollagenschwammes selbst. Eine mögliche Erklärung wäre, daß VEGF nach

Adhäsion an die Kollagenmatrix, immer noch im ELISA als Antigen nachzuweisen ist,

aber nicht mehr die gleiche biologische Aktivität besitzt. Allerdings konnten Sheridan

et al. zeigen, daß VEGF nach Adhäsion an eine Trägermatrix durchaus noch eine

sehr hohe biologische Aktivität besitzt (Sheridan et al. 2000). Der angiogenetische

Effekt einer Matrix wird somit in erster Linie durch die Art ihrer Modifizierung

bestimmt. Neben Struktur und Porengröße haben daher auch andere Moleküle, die

Teil der Matrix sein können, Einfluß auf ihr angiogenetisches Potential. Die

Gegenwart von Heparin, dem selbst ein großes angiogenetisches Potential

zugeschrieben wird (Bombardini and Picano 1997), könnte die angiogenetische

Wirkung einer Kollagenmatrix potenzieren. Dies wäre eine mögliche Erklärung für

den großen proliferativen Effekt, die der heparinisierte und vernetzte

Kollagenschwamm (H1E1) in diesen Versuchsreihen zeigt. Abb. 44 zeigt ein

83

mögliches Model der verschiedenen Wirkungsmechanismen der Matrix auf die

Zellen.

Kollagenschwamm

Zellen

VEGFStruktur der

MatrixHeparin

Abb. 44:

Wirkungsmechanismen des Kollagenschwamms auf die Endothelzellen

Darüber hinaus hat möglicherweise die Art und Weise der Sterilisierung der

Kollagenschwämme Einfluß auf die Ergebnisse. Das Einlegen in hochprozentiges

Ethanol ist ein einfaches und effizientes Verfahren, möglicherweise jedoch nicht die

optimale Methode. Durch Einfluß von Ethanol wäre eine Art Fixierung und somit eine

Veränderung der Kollagenmatrix denkbar. Eine mögliche Alternative, die γ-

Sterilisierung zeigte allerdings, daß die Kollagenmatrix selbst einer solchen Prozedur

nicht standhält (Noah et al. 2002). Andere Arbeitsgruppen legten die

Kollagenmatrizes lediglich für 24 Stunden in eine Penicillin/Streptomycin-Lösung und

berichteten dabei nicht von Problemen mit Kontaminationen (Wissink et al. 2001).

84

Dies könnte durchaus eine Alternative darstellen, da diese Methode die Struktur der

Kollagenmatrix vergleichbar wenig beeinflußt.

Entscheidend aber ist, das stets die mit Heparin behandelte Kollagenmatrix, die

langsamste VEGF-Abgabe bzw. das größte Endothelzellwachstum zeigte. Dies deckt

sich nicht nur mit den Ergebnissen von Sakiyama-Elbert et al., Sheridan et al. und

Wissink et al. (Sakiyama-Elbert and Hubbell 2000, Sheridan et al. 2000, Wissink et

al. 2000a, Wissink et al. 2000b) sondern führt schließlich auch zur der Erfüllung der

anfangs gestellten Aufgabenstellung.

5.4 Ausblick Die Entwicklung eines künstlichen Hautersatzes mittels „Tissue Engineering“ stellt

gegenüber der plastischen Deckung durch autologe Hautransplantate eine vielver-

sprechende Alternative dar. Im Gegensatz zu einem reinen Epidermisersatz, wie z.B.

Keratinozytenkulturen, handelt es sich bei einem kompletten Dermisersatz um eine

neue Herausforderung. Neben bindegewebigen Konstruktionen müssen komplexe

Strukturen wie vollständige Gefäß- und Nervensysteme hergestellt werden. Diese

komplexe Aufgabe konnte bislang noch nicht überzeugend experimentell gelöst

werden. Eine biokompatible Trägermatrix zu verwenden und diese mit wachstums-

beschleunigenden Substanzen zu verknüpfen, ist dennoch ein vielversprechender

Ansatz um beispielsweise lokal eine gerichtete Angiogenese zu induzieren. Die

Applikation und Freisetzung von Wachstumsfaktoren innerhalb von Wundauflagen

könnten darüber hinaus zu einer beschleunigten Wundheilung und damit zum

schnelleren Wundverschluß führen. Neben Kollagen als Trägersubstanz werden

derzeit sowohl bereits erprobte Materialen wie Fibrin oder Hyaluronsäuren optimiert,

als auch neuartige Polymere auf Biokompatibilität untersucht. Neben VEGF wurden

andere Wachstumsfaktoren wie bFGF, β-NGF oder EGF erfolgreich an

Trägermatrizes gekoppelt. Im Rahmen dieser Untersuchungen wird deutlich, daß

weitere umfassende Untersuchungen notwendig sind, um eine optimale Matrix mit

dem optimalen Wachstumsfaktor oder gar mit einer Kombination verschiedener

Wachstumsfaktoren, die sich gegenseitig potenzieren, zu definieren. Der sequentielle

Prozess der Angiogenese ist jedoch äußerst komplex und vielschichtig. Für den

lokalen Einsatz von Wachstumsfaktoren ist der Zeitpunkt entscheidend in dem

85

Wachstumsfaktoren appliziert werden, da sie teils agonistische und teils

antagonistische angiogenetische Effekte aufweisen. Oftmals fehlt es noch an dem

grundlegenden Wissen über die genauen Wirkmechanismen von Wachstumsfaktoren

und deren Bedeutung für die Angiogenese. Trotzdem ist die vorgestellte

Kollagenmatrix, an die über Heparin neben VEGF auch bFGF gebunden werden

kann ein viel versprechender Lösungsansatz. Die von uns modifizierte

Kollagenmatrix lässt eine Vielzahl weiterer biochemischer, mechanischer und

physikalischer Variationsmöglichkeiten zu. Möglicherweise lassen sich durch Ver-

änderung der Struktur und Porengröße der Kollagenschwämme noch größere angio-

genetische Effekte erzielen. Zusätzlich sollte die Versuchsmethodik zur Unter-

suchung unserer modifizierten Kollagenmatrix erweitert werden. Neben weiteren

Untersuchungen der Freisetzungskinetik von VEGF aus den verschiedenen

Kollagenschwämmen unter unterschiedlichen Versuchsbedingungen sollten auch

andere Methoden, die eine genauere Bestimmung des Zellwachstums als der BrdU-

Test ermöglichen in Betracht gezogen werden. Eine molekularbiologische Methode

wie die RT-PCR ermöglicht z.B. eine genaue Untersuchung der verstärkt aktivierten

Zellwachstums-, Zellteilungs- und Zellmigrationsgene. Ähnlich Untersuchungen

lassen sich auch mit der FACS-Messung (Fluorescence Activated Cell Sorting)

durchführen.

Des Weiteren sollten neben den schon durchgeführten Experimenten an Ratten

weitere Tierexperimente durchgeführt werden. Größere Studien an Versuchstieren

mit verschiedenen Implantationsorten über einen langen Beobachtungszeitraum

könnten neue Daten liefern.

Die in dieser Studie durchgeführte Histologie ließ leider keine Zellmigration in die

Kollagenmatrix erkennen. Wahrscheinlich ist es notwendig, die zu untersuchenden

Zellen direkt auf oder sogar in der Kollagenmatrix zu positionieren.

Eine Aufnahme einer Immunhistologie in einer Kollagenmatrix zeigt Abb. 45.

86

Abb. 45:

Immunhistologische Aufnahme von Endothelzellen in der Kollagenmatrix

Die in die Matrix injizierten Zellen sind deutlich dargestellt, es lassen sich sogar

tubulusähnliche Formationen erkennen.

Neben Endothelzellen sollten auch andere Zellkulturen in Betracht gezogen werden.

Eine Mischkultur aus z.B. HUVECs (Human Umbilical Endothelial Cells) und

Fibroblasten würde dem Ziel einen vollständigen Dermisersatz zu schaffen

näherkommen. Diese wäre neben der Gefäßneubildung auch in der Lage

bindegewebige interzelluläre Strukturen zu generieren.

HUVECs bieten sich für experimentelle in-vitro-Untersuchungen an, jedoch können

diese Daten nicht ohne weiteres aufgrund der größeren proliferativen Potenz dieser

Zellen auf die in-vivo-Situation übertragen werden. Auch stehen sie bei einer

möglichen humanen klinischen Anwendung als autologe Endothelzellresource in den

seltensten Fällen zur Verfügung. Da der alleinige Einsatz von homologen Zellen oder

Geweben aufgrund der umfassenden und komplexen Immunreaktion stets

problematisch ist, müssen Alternativen in Betracht gezogen werden. Eine Möglichkeit

autologe Endothelzellen zu kultivieren besteht in den Zellkulturen von EPCs

(Endothelial Progenitor Cells). Diese Endothelvorläuferzellen lassen sich relativ

einfach aus Blut isolieren und kultivieren. Nach erfolgter Differenzierung zu

Endothelzellen und Herstellung des gewünschten Transplantats, ließe sich dieses

aus immunologischer Sicht problemlos wieder am Spender einsetzen. Abb. 46

verdeutlicht dieses Prinzip.

87

Empfänger / Spender

Isolierung von Zellen (u.a. EPC)

Synthese der Matrix

Implantation der Matrix

Abb. 46:

Prinzip der autologen Matrixsynthese

Insgesamt sind noch erhebliche Forschungsanstrengungen notwendig, um einen

kompletten Dermisersatz für klinische Anwendungen herzustellen. Einfache

neuartige Wundauflagen für eine verbesserte Angiogenese im Rahmen der

Wundheilung sind jedoch auch kurzfristig realisierbar.

88

6 Zusammenfassung Die Behandlung von großflächigen Wunden und ausgedehnten dermalen Defekten

nimmt in der plastischen Chirurgie einen sehr hohen Stellenwert ein. Die Deckung

durch autologe Hauttransplantate stellt eine gängige Methode in der rekonstruktiven

Chirurgie dar, bedeutet aber immer einen zusätzlichen chirurgischen Eingriff in

gesundes Gewebe mit möglichen Komplikationen und hinterläßt einen Hebedefekt.

Der Einsatz von Biomaterialien als artifizieller Dermisersatz stellt somit eine

vielversprechende Alternative dar. Die bisher erhältlichen kommerziellen Dermis-

produkte können allerdings, aufgrund einer sehr niedrigen angiogenetischen Potenz,

nur eingeschränkt eingesetzt werden. Eine Immobilisierung von Wachstumsfaktoren

könnte die starke in-vivo-Degradation von Wachstumsfaktoren verhindern und mittels

Steigerung der Revaskularisierung zu einer verbesserten Wundheilung führen. In

dieser Studie wurden mit Heparin und EDC/NHS modifizierte Kollagenmatrizes auf

die in-vitro-Freisetzungskinetik des Wachstumsfaktors VEGF (Vasculary Endothelial

Growth Factor) und auf ihre biologische Wirkung in der Endothelzellkultur untersucht.

Durch den Einsatz von EDC/NHS wurde eine Bindung von Heparin an Kollagen und

gleichzeitig eine Vernetzung des Kollagens selbst erreicht. Dadurch entstanden

verschiedene Gruppen von Kollagenschwämmen (Größe: 5*5*5 mm und 10*10*10

mm): Inkubation in einer Lösung mit 0 mg EDC/NHS und 0 mg Heparin in 500 µl, mit

1 mg EDC/NHS und 0 mg Heparin in 500µl, mit 1 mg EDC/NHS und 1 mg Heparin in

500µl und mit 2 mg EDC/NHS und 1 mg Heparin in 500µl. Die verschiedenen

Schwämme wurden mit VEGF beladen und die in-vivo-Freisetzung von VEGF wurde

über 48 Stunden (mit und ohne Einfluß von Kollagenase) bzw. fünf Tage (Zellkultur)

mittels ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) quantifiziert. Zusätzlich

wurde die in-vitro-Stabilität von VEGF bestimmt. Weiterhin wurde die

Endothelzellproliferation (HUVECs) unter Einfluß der verschiedenen Kollagen-

schwämme untersucht. Hierfür wurden 24 Stunden vor Versuchsbeginn HUVECs mit

unterschiedlichen Zelldichten (5600 und 13900 HUVECs/cm²) in verschiedene

Zellkulturplatten (6- und 24-well-Platten) ausgesät. Der Proliferationszuwachs wurde

mittels BrdU-Test und mittels Bestimmung der absoluten Zellzahl durch Auszählen in

der Neubauer-Kammer nach einem, drei und fünf Tagen bestimmt.

In dem Versuchszeitraum von 48 Stunden zeigte sich VEGF in vitro als sehr stabil.

Der Vergleich der VEGF-Freisetzungskinetiken der verschiedenen Kollagen-

89

schwämme wies sowohl in vitro als auch in der Zellkultur deutliche Unterschiede auf.

Hier wurde eine verlangsamte VEGF-Freisetzung der modifizierten Kollagen-

schwämme im Gegensatz zu den nativen Kollagenschwämmen deutlich. Die stärkste

Verzögerung der VEGF-Freisetzung wiesen die zusätzlich mit Heparin modifizierten

Kollagenschwämme auf. Dies galt für die Experimente bei Raumtemperatur und

37°C, für die Experimente mit und ohne Kollagenase und für die Experimente in der

Zellkultur. Auch in den Versuchsreihen der Endothelzellproliferation zeigten die

modifizierten Kollagenschwämme sowohl im BrdU-Test als auch in der Auszählung in

der Neubauer-Kammer in 24- und in 6-well-Platten einen größeren zellproliferativen

Effekt als die nativen Kollagenschwämme. Den größten Zuwachs an Zellproliferation

zeigten die zusätzlich mit Heparin modifizierten Kollagenschwämme. Zudem ließen

sich Steigerungen der Zellproliferation durch die Zugabe von VEGF nachweisen.

Diese Ergebnisse zeigen, daß durch die Bindung von VEGF an eine mit Heparin

modifizierte Kollagenmatrix die Endothelzellproliferation gesteigert werden kann.

Neben der angiogenetischen Wirkung von VEGF bestimmen auch die Art und Weise

der Modifizierung des Kollagens und additive Stoffe wie Heparin das angio-

genetische Potential der Trägermatrix.

Neben weiteren Untersuchungen der Kollagenmatrix sind für die Zukunft auch

Studien an anderen Trägermatrizes (wie z.B. Fibrin) mit weiteren Wachstumsfaktoren

(wie z.B. bFGF oder NGF) von großer Bedeutung. Auch die Variation der

Versuchsmethodik ist ein wichtiger Bestandteil des weiteren Vorgehens. Die erzielten

Ergebnisse müssen durch molekularbiologische Methoden (RT-PCR, FACs) und in-

vivo-Experimente am Tier verifiziert werden. Nur durch eine permanente

Weiterentwicklung des künstlichen Hautersatzes ist es möglich, zu dem optimalen

artifiziellen Dermisersatz zu gelangen, der letztendlich als Gewebsersatz am

Menschen eingesetzt werden kann.

90

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8 Abkürzungsverzeichnis BrdU 5´-Bromo-2-desoxyuridin

DHT Dehydrothermal Treatment

ECM Extrazelluläre Matrix

EDC N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-Ethylcarbodiimid

EGF Epidermal Growth Factor

FGF Fibroblast Growth Factor

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

EPCs Endothelial Progenitor Cells

FACS Flourescence Activated Cell Sorting

flt fas-like tyrosin Kinase

H0E0 unbehandelter Kollagenschwamm

H0E1 einfach vernetzter Kollagenschwamm

H1E1 einfach vernetzter und mit Heparin modifizierter Kollagenschwamm

H1E2 stark vernetzter und mit Heparin modifizierter Kollagenschwamm

HUVECs Human Umbilical Vein Endothelial Cells

Hyp Hydroxyprolin

KDR Kinase inset Domain containing Receptor

LPL Lipoproteinlipasen

MHC Major Histocompatibility Complex

NHS N-Hydroxysuccinimid

NGF Nerve Growth Factor

NMR Nukleare Magnet Resonanz

PCR Polymerase Chain Reaction

PGDF Platelet Derived Growth Factor

pO2 Sauertstoffpartialdruck

Pro Prolin

STH Somatotropes Hormon

TGF Transforming Growth Factor

VEGF Vascular Endothelial Growth Factor

VPF Vascular Permeability Factor

105

9 Danksagung Als erstes möchte ich herzlich meinem Doktorvater Herrn Universitätsprofessor

Dr. Dr. med. Norbert Pallua für die Überlassung des Themas, für das stetige

Interesse am Fortschritt meiner Arbeit und für die Möglichkeit, die Ergebnisse auf

Kongressen vorzustellen danken.

Mein ganz besonderer Dank gilt Herrn Dr. med. Andreas Gröger für die persönliche

Betreuung, uneingeschränkte Unterstützung und kompetente Beratung. Während der

gesamten Zusammenarbeit fand er vor allem immer wieder Zeit für aufbauende

Gespräche und anregende Diskussionen.

Ein großes Dankeschön auch an Dr. rer. nat. Guy Steffens für die Betreuung des

biochemischen Teils meiner Arbeit und für die vielen anregenden Ratschläge.

Herrn Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Jürgen Bernhagen danke ich für die

Möglichkeit zur Nutzung der Laboratorien des Instituts für Biochemie.

Weiterhin möchte ich Herrn PD Dr. med. Ernst Magnus Noah für die Organisation

des gesamten Projektes danken, wodurch meine Arbeit erst ermöglicht wurde.

Bedanken möchte ich mich weiterhin bei allen Kollegen und Mitarbeitern der

Laboratorien für Plastische Chirurgie und Biochemie, die mir stets mit Rat und Tat

zur Seite standen. Insbesondere möchte ich an dieser Stelle Dr. med. Chang Yao,

Dr. med. Marta Markowicz, Dr. med. Andrzej Piatkowski, Dr. med. vet. Pascal Prével,

Sabine Koch, Tanja Oepen, Helge Fünfzig und Michael Thiele erwähnen.

Ein großes Dank auch an die Firma Suwelack Skin & Health Care AG für die

Herstellung der verwendeten Kollagenprodukts.

Mein Dank richtet sich auch an Universitätsprofessor Dr. rer. nat. Ralf-Dieter Hilgers

und seine Mitarbeiter für die statistische Beratung meiner Ergebnisse.

106

Meinen Eltern Hildegard und Norbert Grieb gilt mein Dank für ihre uneingeschränkte

Unterstützung und Motivation. Sie allein haben mir die ärztliche Ausbildung

ermöglicht. Ihnen möchte ich diese Arbeit widmen.

Außerdem danke ich meiner Frau Jule, die immer an mich glaubte und allzu oft

geduldig Korrektur las. Sie bestärkte mich in meinen Ideen und stand mir

ausnahmslos in allen Höhen und Tiefen zur Seite.

Leipzig im Juni 2006

107

Curriculum Vitae

Persönliche Daten:

Name: Gerrit Christian Grieb

Geburtsdatum: 08. Februar 1978

Geburtsort: Göttingen

Familienstand: verheiratet, keine Kinder

Schulausbildung: 08/1984 – 07/1990 Grundschule Bonifatius, Göttingen

08/1990 – 07/1992 Gymnasium Isernhagen, Isernhagen

08/1992 – 07/1997 Gymnasium Syke, Syke Abschluss: Abitur (Note: 1,7)

10/1994 – 03/1995 11. Klasse an der Ross. S. Sterling Highschool, Baytown, Texas, USA

Zivildienst: 08/1997 – 08/1998 Deutsches Rotes Kreuz, Rettungswache Bassum Ausbildung zum Rettungssanitäter (Abschlussnote: 1,1)

Hochschulausbildung: 10/1998 – 10/2001 Philipps Universität Marburg

09/2000 Physikum

08/2001 1. Staatsexamen

10/2001 – 09/2003 RWTH Aachen

10/2003 – 06/2004 “Universidad de Santiago de Compostela”, Spanien

Einjähriges ERASMUS-Stipendium an der Universität von Santiago de Compostela

Teilnahme an Vorbereitungskursen für das „Médico Interno Residente“ (spanisches Staatsexamen)

07/2004 – 11/2005 RWTH Aachen

09/2004 2. Staatsexamen (Note: „gut“)

108

11/2005 3. Staatsexamen (Note: „sehr gut) Ärztliche Gesamtnote: 1,9

12/2005 Approbation als Arzt

Praktisches Jahr: 10/2004 – 02/2005 Plastische Chirurgie, Hand- und Verbrennungschirurgie,

Universitätsklinikum der RWTH Aachen

02/2005 – 05/2005 Innere Medizin, Anstellung als Unterassistent am Regionalspital Emmental, Schweiz

05/2005 – 09/2005 Viszeral-, Thorax- und Gefäßchirurgie, Medizinisches Zentrum Kreis Aachen GmbH

Klinische Ausbildung: Basisweiterbildung für Chirurgie:

seit 01/2006 Assistenzarzt in der Klinik für Intensivmedizin und Anästhesiologie, Gesundheitszentrum Bitterfeld/Wolfen, Klinikum Bitterfeld

Forschung:

Kongressbeiträge:

Grieb G., Gröger A., Steffens G., Noah E.M., Pallua N. „Die Entwicklung von modifizierten Kollagen-Matrizes als verbesserter Wunderersatz für Schwerbrandverletzte“.

23. Jahrestagung der deutschsprachigen Arbeitsgemeinschaft für Verbrennungschirurgie (DAV), 2005, Falera, Schweiz, Vortrag Grieb G., Groger A., Steffens G., Noah E.M., Pallua N. “Modification of collagen matrices for enhanced angiogenesis: Characteristics of heparinized collagen sponges loaded

with Vascular Endothelial Growth Factor”. 16th European Students Conference (ESC), 2005, Berlin, Germany, Oral Presentation, Winner in Session Surgery

Gröger A., Grieb G., Steffens G., Noah E.M., Pallua N. „Eigenschaften und biologische Wirkung von modifizierten Kollagen-Matrizes zur Verbesserung der

Angiogenese“. 121. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie, 2004, Berlin, Deutschland, Vortrag

Groger A., Grieb G., Steffens G., Noah E.M., Pallua N. ”Enhancing angiogenetic potential of collagen matrices“. 7th European Conference of Scientists and Plastic

Surgeons (ECSAPS), 2003, Geneva, Switzerland, Oral Presentation

109

Publikationen: Groger A.*, Grieb G.*, Markowicz M., Piatkowski A., Noah E. M., Schenck P., Steffens G.,

Pallua N. *Groger A. and Grieb G. contributed eqaully to this paper “Modification of collagen matrices for enhanced

angiogenesis: Characteristics of heparinized collagen sponges loaded with Vascular Endothelial Growth Factor”. Journal of Artificial Organs, submitted 2006

Koch S., Yao C., Grieb G., Prevel P., Noah E.M., Steffens G. “Enhancing angiogenesis in collagen matrices by covalent incorporation of VEGF“. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, accepted 2005

Auslandspraktika: 02/2001 – 03/2001 Interplastcamp 2001, Rekonstruktive Chirurgie am „Asha Niketan

Hospital“ in Bhopal, Indien und am „Katra Hospital“ in Mandla, Indien

02/2002 – 03/2002 Plastische Chirurgie am Universitätsklinikum Groningen, Holland, Prof. J. P. Nicolai, M.D., Ph.D.

Zusatzqualifikationen: 04/2002 – 07/2002 Kurs der mikroskopischen Chirurgie Leiter: PD Dr. med. Franz Lassner

11/2004 – 12/2004 Kurs der abdominellen Sonographie Leiter: PD Dr. med. R. Winograd

voraussichtlich Kurs für die Zusatzbezeichnung Notfallmedizin 11/06

Sprachkenntnisse: Deutsch: Muttersprache Englisch: Fließend Spanisch: Fließend Französisch: Gute Kenntnisse

Tätigkeiten neben der Ausbildung: 04/2000 – 07/2001 Betreuung von Kursen der makroskopischen und mikroskopischen

Anatomie, Institut für Anatomie, Philipps Universität Marburg, Prof. Dr. med. E. Weihe

Seit 02/2000 Nebenberufliche und Ehrenamtliche Tätigkeit als Skilehrer und Reiseleiter beim Deutschen Skiverband und verschiedenen Reiseanbietern

Seit 10/2001 Ehrenamtliche Tätigkeit als Segelfluglehrer beim Deutschen Aeroclub

Leipzig, im Juni 2006

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