Eine Calciumabhängige Proteinkinase aus - uni-hohenheim.de · Während bei den beiden erst genannten Mechanismen die Abwehrstoffe permanent einsatzbereit sind, werden sie bei letzteren

ETH Zürich

Abteilung für Biologie XA

Eine Calciumabhängige Proteinkinase aus

Lycopersicon esculentum:

Klonierung, Expression und Charakterisierung

Institut für Pflanzenwissenschaften ETH Zürich

Biochemie und Physiologie der Pflanzen

Prof. Dr. N. Amrhein

Diplomarbeit

vorgelegt von

Urs Gregor Stalder

Betreut durch:

Dr. Andreas Schaller

Zürich

April 2000

Inhaltsverzeichnis

- II -

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1 Pflanzenabwehr 1

1.2 Induzierte Abwehr 1

1.3 Die Rolle der Plasmamembran H+-ATPase 6

1.4 Aufgabenstellung 7

2. Material und Methoden 8

2.1 Material 8

2.1.1 Lösungen und Medien 8

2.1.2 Pflanzenmaterial 13

2.1.3 Bakterienstämme 13

2.2 Molekularbiologische Methoden 14

2.2.1 Klonierung des 3’-Endes der CDPK cDNA in den pBluescript SK(-) Vektor 14

2.2.2 RACE-PCR und Klonierung in den pCR®2.1-TOPO Vektor 14

2.2.3 Isolierung von Plasmid-DNA 15

2.2.4 DNA-Sequenzanalyse 15

2.2.5 Gesamt-RNA Extraktion 16

2.2.6 Northern-Blot Analyse 16

2.2.7 Isolierung der Genomischen DNA 17

2.2.8 Southern-Blot Analyse 18

2.2.9 Klonierung der CDPK cDNA in pGEX-G 19

2.2.10 Transformation von E. coli DH5α mit pGEX-G/CDPK-L/K 19

2.2.11 Transformation von E. coli BL21-(DE3)-RIL mit pGEX-G/CDPK-L/K 20

2.2.12 Anzucht von E. coli BL21-(DE3)-RIL Zellen 20

2.2.13 Aufschluss von E. coli BL21-(DE3)-RIL Zellen 21

Inhaltsverzeichnis

- III -

2.3 Protein-Analytische Methoden 21

2.3.1 SDS-PAGE / Western-Blot 21

2.3.2 Reinigung der GST-CDPK Fusionsproteine 21

2.3.3 Bindung von 45Ca2+ 22

2.3.4 Autophosphorylierung immobilisierter CDPK 22

2.3.5 Phosphoaminosäuretrennung mittels DC 23

2.3.6 Aktivitätstest 24

3. Resultate 26

3.1 Klonierung des 3’-Endes einer CDPK aus Tomate 26

3.2 Southern Blot Analyse 28

3.3 Northern Blot Analyse 29

3.4 Amplifizierung des 5’-Endes mittels RACE-PCR 31

3.5 Amplifizierung und Klonierung von CDPK-L und –K 38

3.6 Expression der CDPK in E. coli 40

3.7 Reinigung des Fusionsproteins 43

3.8 Bindung von 45Ca2+ 44

3.9 Autophosphorylierung der CDPK 45

3.10 Phosphoaminosäure Trennung 46

3.11 Aktivität gegenüber synthetischen Peptiden 47

4. Diskussion 49

5. Literaturverzeichnis 54

6. Abkürzungsverzeichnis 61

7. Anhang 63

Zusammenfassung

- I -

Zusammenfassung Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine cDNA einer Calciumabhängigen-

Proteinkinase (CDPK) aus Tomate (Lycopersicon esculentum cv. Castelmart II), die der von

Yoon et al. (1999) beschriebenen CDPK aus Tabak homolog ist, unter Einsatz der RACE-

Methode kloniert, heterolog exprimiert und charakterisiert.

Das offene Leseraster kodiert ein Polypeptid von 553 Aminosäuren und weist zu der CDPK

aus Tabak eine Aminosäuresequenzidentität von 94% auf. Durch Southern Blot Analyse

wurde gezeigt, dass eine Sonde, die der 3’-untranslatierten Region der cDNA entspricht,

spezifisch mit nur einem Gen der CDPK Genfamilie hybridisiert. Eine Induktion des

entsprechenden CDPK-Transkriptes nach Verwundung liess sich mittels Northern Blot

Analyse nicht nachweisen. Es konnte aber festgestellt werden, dass Transkripte der CDPK ca.

4 Stunden nach Fusicoccin-Behandlung von Tomatenpflanzen akkumulierten. Das Protein

wurde in Fusion mit Glutathion-S-Transferase in E. coli exprimiert und aus bakteriellen

Extrakten gereinigt. Mit radioaktiv markiertem 45Ca2+ konnte gezeigt werden, dass die C-

terminale, aber nicht die katalytische Domäne, Calcium bindet und folglich alleinig für die

Calciumbindefähigkeit der CDPK und vermutlich für deren Ca2+-abhängige Aktivierung

verantwortlich ist. Das gereinigte Fusionsprotein wies eine Ca2+-abhängige Ser/Thr-

Kinaseaktivität auf und war zur Autophosphorylierung in der Lage. Für das synthetische

Oligopeptid Substrat Syntide-2 wurde ein apparenter KM-Wert zwischen 82 und 89 µM

ermittelt.

Einleitung

- 1 - 1

1. EINLEITUNG

1.1 Pflanzenabwehr

Die Abwehrmechanismen von Pflanzen sind ihrer sessilen Lebensweise angepasst und daher

kaum mit den entsprechenden Vorkehrungen bei tierischen Organismen zu vergleichen.

Pflanzen im Freiland unterliegen einer Vielzahl von Herausforderungen: infektiösen

Mikroorganismen, pflanzenfressenden Tieren und konkurrierenden Arten sowie

Schwankungen von Temperatur, Strahlung und Wasserversorgung. Daher überrascht es nicht,

dass sie komplexe chemische Anpassungen entwickelten, die ihr Überleben sichern. Hierin ist

sicherlich eine Ursache für die beeindruckende Strukturvielfalt der Sekundärverbindungen zu

suchen, welche wohl erst adäquates Reagieren auf die unterschiedlichsten Herausforderungen

ermöglicht.

Offensichtlich sind jene Sekundärverbindungen, welche als chemische Schutzstoffe agieren,

unter dem Druck einer sich stetig wandelnden Umwelt entstanden; ihre Abwehrfunktion

wurde weiterentwickelt. So haben sich bestimmte Alkaloide unter Selektionsdruck als

zweckmässig für die Arterhaltung erwiesen und ihre Synthesekapazität wurde im Laufe der

Evolution optimiert.

Zur Abwehr von Herbivoren, Mikroorganismen und Viren stehen den höheren Pflanzen im

wesentlichen vier Strategien zur Verfügung: Akkumulation toxischer Verbindungen im

Gewebe, Bildung selbiger aus nichttoxischen Vorstufen bei Gewebeverletzung, Bildung

mechanischer Barrieren und induzierte Bildung von Schutzstoffen bei Angriff.

1.2 Induzierte Abwehr

Während bei den beiden erst genannten Mechanismen die Abwehrstoffe permanent

einsatzbereit sind, werden sie bei letzteren erst als Reaktion auf eine Infektion bzw.

Verletzung gebildet: induzierte Abwehr. Sie beinhaltet u. a. die Verstärkung der Zellwände

durch Quervernetzung und Kalloseablagerung, die Synthese von Phytoalexinen,

antimikrobiell wirksamen Substanzen von geringer Spezifität. Ihre Bildung beschränkt sich

auf den Ort der Infektion, wo bei inkompatibler Wechselwirkung zwischen Pathogen und

pflanzlichem Gewebe, meist lokal begrenzt, Zellen und Angreifer absterben und eine

Einleitung

- 2 - 2

Abwehrnekrose hervorrufen. Diese Gewebeläsionen werden dadurch „abgedichtet“, dass die

Zellwände der umgebenden noch lebenden Zellen Lignifizierung, Verkorkung und/oder

Imprägnierung mit Polyphenolen erfahren (Greenberg et al., 1994; Somssich und Hahlbrock,

1998). Phytoalexine fehlen in der gesunden Pflanze oder liegen nur in geringen Quantitäten

vor. Ihre de-novo-Synthese wird generell durch spezifische Signalsubstanzen, die Elicitoren,

ausgelöst. Dabei handelt es sich oft um Oligosaccharide, welche am Infektionsort als

Abbauprodukte der Zellwände von Pilz oder Pflanzen anfallen (Yoshikawa et al. 1993).

Induktion von Abwehr ist auch über die Aktivierung von Genen möglich, deren Produkte

dann eine Schutzfunktion gegenüber dem Schädling übernehmen. Beispiel eines solchen

Mechanismus ist die wundinduzierte Produktion und Akkumulation von Proteinase-

Inhibitoren bei Vertretern der Familien Cucurbitaceae, Fabaceae, Salicaceae und Solanaceae

(Ryan, 1992 und dort angegebene Referenzen; Constabel et al., 1998). Die Wundantwort ist

systemisch, das heisst, die Expression der Abwehrproteine erfolgt nicht nur in unmittelbarer

Umgebung der Verletzung, sondern zeitlich versetzt auch in weiter entfernten Teilen der

Pflanze. Die ursprünglich gefundenen Inhibitor-Proteine der Tomate wurden zwei Familien,

Inhibitor I und II, zugeordnet (Bishop et al., 1984). Angriffsziele dieser Inhibitoren sind

Serin-Proteinasen, wie sie im tierischen Verdauungstrakt vorliegen. Über das gefressene

Blattmaterial kann der Inhibitor in das Verdauungssystem einer Raupe gelangen. Diese stellt

bald darauf ihr Wachstum ein, weil die essentiellen proteinogenen Aminosäuren nicht mehr

aus dem Abbau der aufgenommenen Pflanzenproteine zur Verfügung stehen und damit die

Synthese körpereigener Proteine behindert ist (Orozco-Cardenas et al., 1993). Später wurde

gezeigt, dass die systemische Wundantwort die Akkumulation einer Vielzahl weiterer

Proteine beinhaltet (Schaller et al., 1995; Bergey et al., 1996), die unter dem Begriff SWRPs

(systemic wound response proteins) zusammengefasst sind. Dabei handelt es sich nebst

Proteinaseinhibitoren um Polyphenoloxidase (Constabel et al., 1995), Proteasen (Hildmann et

al., 1992; Walker-Simmons und Ryan, 1977; Pautot et al., 1993; Schaller und Ryan, 1996),

sowie um Proteine, die möglicherweise eine wichtige Funktion bei der Transduktion des

Wundsignals einnehmen (McGurl et al., 1992; Heitz et al., 1997; Bergey et al., 1999).

Eine systemische Induktion von SWRPs setzt die Existenz einer Signaltransfer-Kette unter

Beteiligung von Signalmolekülen voraus. Die Suche nach Molekülen mit

Signalisierungseigenschaften, hat eine Vielzahl von Verbindungen hervorgebracht, wie

Pektin- (Bishop et al., 1981), Chitosan- und Chitin-Fragmente (Walker-Simmons und Ryan,

1984) aus pflanzlichen bzw. pilzlichen Zellwänden, die Hormone Ethylen (O’Donnell et al.,

1996), Abscisinsäure (Pẽna-Cortés et al., 1989) und Jasmonsäure (Farmer und Ryan, 1992),

Einleitung

- 3 - 3

sowie Methyljasmonat (Farmer und Ryan, 1990) und das Oligopeptid Systemin (Pearce et al.,

1991), die alle an der Übermittlung des Wundsignals beteiligt zu sein scheinen.

Von der Verwundung bis zur Akkumulation der Abwehrproteine führt ein komplexer

Signaltransduktionsweg (Abb. 1). Nach der gängigen Modellvorstellung von Farmer und

Ryan (1992) entsteht im geschädigten Gewebe aus Prosystemin, einem Vorstufen-Polypeptid

aus 200 Aminosäure-Resten, durch proteolytische Spaltung das 18 Aminosäure-Polypeptid

Systemin als eigentliches Peptidhormon, welches über das vaskuläre System der Pflanze

transloziert wird (Narváez-Vásquez et al., 1995). Die Transkription von Prosystemin-mRNA

ist auf tiefem Niveau konstitutiv und wird durch Verwundung systemisch markant erhöht

(McGurl et al., 1992). Die Perzeption von Systemin durch seinen Rezeptor im Plasmalemma

einer intakten Blattzelle (Scheer und Ryan, 1999) führt zur Aktivierung einer bestimmten

Lipase, welche die Freisetzung von Linolensäure aus Membranlipiden katalysiert (Farmer und

Ryan, 1992; Narváez-Vásquez et al., 1999). Über mehrere Reaktionsschritte des sogenannten

Octadecanoid-Weges, entsteht aus α-Linolensäure die Jasmonsäure (Vick und Zimmermann,

1984). Als Signalsubstanz aktiviert Jasmonsäure auf bisher unbekannte Weise die SWRP

Gene.

Als erste messbare Antwort auf die Interaktion von Systemin mit seinem Rezeptor kommt es

zu veränderten Ionenströmen über die Plasmamembran. In Mesophyllzellen von

Tomatenpflanzen bewirkt Systemin eine rasche Depolarisation des Plasmamembran-

Potentials und in Zellkulturen von L. peruvianum eine Alkanisierungsantwort (Moyen und

Johannes 1996; Felix und Boller 1995). Inhibierung der H+-ATPase führt die Akkumulation

der Transkripte wundinduzierbarer Proteine mit sich (Schaller und Oecking, 1999). Dagegen

bewirkt eine Hyperpolarisation des Plasmamembran-Potentials durch Aktivierung der H+-

ATPase eine Unterdrückung der Alkanisierungsantwort und der Expression von

wundinduzierbaren Abwehrgenen. Aufgrund dieser Daten besteht der Verdacht, dass die

Depolarisation des Plasmamembran-Potentials für die Auslösung der Wundantwort

notwendig ist. Dabei könnte die Inhibierung der H+-ATPase Aktivität eine Vermittlerrolle

spielen.

Die systemin-induzierte Alkanisierungsantwort in L. peruvianum erfordert den Einstrom von

Ca2+-Ionen und die Aktivität einer Proteinkinase (PK) (Schaller und Oecking, 1999). Somit

könnte ein Zusammenhang zwischen dem Calciumeinstrom und/oder der Proteinkinase und

der Inhibierung der H+-ATPase bestehen. Einen indirekten Beweis für die Beteiligung von

Ca2+ im Wundsignaltransduktionsweg erbrachten Bergey und Ryan (1999). Sie beobachteten

einen Anstieg der Calmodulin mRNA und Protein-Konzentration in den Blättern von

Einleitung

- 4 - 4

Tomaten nach Verwundung, sowie bei Fütterungsexperimenten mit Systemin,

Methyljasmonat und Linolensäure. Sie stellten weiter fest, dass die Induktion der

Calmodulinexpression zeitlich mit der von anderen Signalisierungskomponenten

zusammenfällt, sich jedoch von der späteren Expression der Abwehrgene unterscheidet.

Ob Calmodulin aber an der Regulation der Aktivität einer Proteinkinase beteiligt ist, ist noch

unklar. Wahrscheinlicher, weil erheblich rascher, ist die direkte Aktivierung einer Calcium-

abhängigen Proteinkinase durch erhöhten Spiegel cytosolischen Calciums, wie von Schaller

(1999) in einem Modell der systemin-induzierten Wundantwort vorgeschlagen (Abb. 1).

Nach diesem Modell bewirkt die Interaktion von Systemin mit seinem Rezeptor SR-160 einen

Anstieg der freien cytoplasmatischen Calciumionen-Konzentration, hervorgerufen durch das

Öffnen von plasma-membranständigen Ca2+ Kanälen, sowie das Entlassen von organell-

gebundenem Ca2+. Als Folge der erhöhten cytosolischen Ca2+-Konzentration kommt es zur

Inhibierung der H+-ATPase, wobei die Beteiligung einer Calcium-abhängigen-Proteinkinase

(CDPK) vermutet wird. Die Depolarisation des Plasmamembran-Potentials könnte den

Anstieg des Ca2+-Gehalts verstärken und so zur Aktivierung einer Phospholipase A2 (PLA2)

beitragen. Die Aktivität der PLA2 scheint weiterhin durch eine Proteinkinase aus der Familie

der Mitogen-aktivierten Proteinkinasen (MAPKs) kontrolliert zu sein (Stratmann und Ryan,

1997; Ryan und Pearce, 1998). Phospholipid-hydrolyse durch eine aktivierte Phospholipase

setzt Linolensäure als Ausgangssubstrat der durch den Oktadekanoid-Biosyntheseweg

gebildeten Jasmonsäure frei. Letztere aktiviert ihrerseits auf bisher unbekannte Weise die

Abwehrgene.

Einleitung

- 5 - 5

Abb. 1: Modell des durch Systemin ausgelösten Signalisierungsweges; nach Schaller (1999), modifiziert.

Einleitung

- 6 - 6

1.3 Die Rolle der Plasmamembran H+-ATPase

Die H+-ATPase der pflanzlichen Plasmamembran ist ein Enzym von etwa 100 kDa. Ihre

Funktion liegt in der Schaffung eines transmembranen H+-Gradienten. Das errichtete H+-

elektrochemische Potential nutzt die Zelle für den Antrieb vieler transmembranen

Transportvorgänge aber auch zur Regulation des intrazellulären pH-Wertes sowie des Zell-

Turgor (Serrano 1989, 1990; Michelet und Boutry 1995). In Anbetracht der wichtigen

Funktionen, die diesem Gradienten zukommen, und dem enormen Energieverbrauch der zu

dessen Aufrechterhaltung erforderlich und der bis zu einem Viertel des zellulär gebildeten

ATPs ausmachen kann, ist es nicht erstaunlich, dass die H+-ATPase komplexen

Regulationsvorgängen unterworfen ist. Ihre Aktivität wird in vivo über die Autoinhibitor-

Domäne am C-Terminus reguliert. Bei derer Entfernung stellt sich eine deutliche Steigerung

der Aktivität ein (Palmgren et al., 1991).

Das Pilzgift Fusicoccin von Fusicoccum amygdali Del. aktiviert die H+-ATPase durch

Interaktion mit ihrer Autoinhibitor-Domäne (Johansson et al., 1993). Es konnte gezeigt

werden, dass Fusicoccin einen Komplex aus 14-3-3 Proteinen mit dem C-Terminus der

ATPase stabilisiert (Jahn et al., 1997; Oecking et al., 1997; Baunsgaard et al., 1998).

Die Interaktion von 14-3-3 Proteinen mit dem C-Terminus der H+-ATPase hängt von dessen

Phosphorylierungsstatus ab. Nur wenn ein kritischer Threoninrest im C-Terminus der

Protonenpumpe phosphoryliert vorliegt, ist eine Bindung von 14-3-3 Proteinen und damit die

Aktivierung der ATPase möglich (Svennelid et al., 1999). Weiterhin wurde die

Phosphorylierung eines Serinrestes zwischen Transmembransegmenten 8 und 9 als wichtig

für die 14-3-3 Proteinbindung beschrieben (Marra et al., 2000). Bereits Schaller und Sussman

(1988) zeigten die Ca2+–abhängige Phosphorylierung an Serin- und Threonin-Resten der

Plasmamembran H+-ATPase. Phosphorylierungsereignisse, die die Bindung von 14-3-3

Proteinen ermöglichen würden zu einer Aktivierung der Protonenpumpe führen. In der Tat ist

eine Aktivierung der ATPase durch Phosphorylierung beobachtet worden (Bidway und

Takemoto, 1987; Suzuki et al., 1992). Desweitern scheint aber auch eine Inaktivierung durch

Phosphorylierung möglich zu sein (Vera-Estrella et al., 1994; Xing et al., 1996; Lino et al.,

1998, De Nisi et al., 1999).

Die für diese beiden Phosphorylierungsereignisse verantwortlichen Proteinkinasen sind

bislang nicht identifiziert worden. Es wird aber vermutet, dass daran calciumabhängige

Proteinkinasen (CDPKs) beteiligt sind (Camoni et al., 1998; De Nisi et al., 1999). CDPKs

weisen eine für sie charakeristische Struktur auf. Die N-terminale Kinase Domäne ist über ein

Einleitung

- 7 - 7

autoinhibitorisches Verbindungsstück mit der calmodulin-ähnlichen Domäne am C-Terminus

verbunden (Harper et al., 1994; Harmon et al., 1994). Einige dieser CDPKs fand man als

plasmamembranständige Enzyme in verschiedenen Spezies (Schaller et al., 1992; Verhey et

al., 1993).

Kürzlich wurde von Yoon et al. (1999) eine CDPK aus Tabak kloniert. Einige Hinweise

zeigen an, dass es sich bei dieser CDPK möglicherweise um die Kinase handelt, die für die

Inaktivierung der H+-ATPase nach Verwundung verantwortlich sein könnte. Denn zum einen

ist die von Yoon et al. (1999) beschriebene Kinase auf transkriptioneller Ebene

wundinduzierbar, zum anderen handelt es sich dabei um ein plasmamembranständiges

Enzym, dessen Substrat sich wahrscheinlich ebenfalls in der Plasmamembran befindet.

Zudem wird die Aktivität der CDPK durch Ca2+ erhöht. All dies sind Kriterien, die für die

Proteinkinase des Wundsignalwegs zu erwarten sind.

1.4 Aufgabenstellung

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte daher die Klonierung und Charkerisierung einer

CDPK aus Tomate (Lycopersicon esculentum cv. Castelmart II) versucht werden, die der von

Yoon et al. (1999) beschriebenen CDPK aus Tabak entspricht. Ein Datenbankvergleich mit

der CDPK aus Tabak wies auf die Existenz mehrerer ESTs der Tomate hin, die hohe

Sequenzübereinstimmung mit dem Tabakenzym aufwiesen. Unglücklicherweise umfasste der

EST mit der höchsten Sequenzübereinstimmung lediglich das 3’-Ende der cDNA, welches die

3’ untranslatierte Region und nur einen kleinen Teil der kodierenden Sequenz beinhaltete.

Ausgehend von dieser Sequenzinformation sollte sowohl das 3’-Ende als auch das 5’-Ende

der cDNA unter Einsatz der RACE-Methode kloniert werden. Die CDPK sollte anschliessend

heterolog exprimiert und charakterisiert werden.

Material und Methoden

- 8 - 8

2. MATERIAL UND METHODEN

2.1 Material

2.1.1 Lösungen und Medien

Die Chemikalien stammen, sofern nichts anderes angegeben ist, von FLUKA Chemie AG,

Buchs SG, Schweiz.

LB-Medium: 2.5% w/v LB Broth, Miller

(Difco Laboratories, Detroit, MI, USA)

2x YT Medium: 1.6% w/v Bactotrypton (Difco)

1.0% w/v Bactoyeastextrakt (Difco)

0.5% w/v NaCl

Plasmid DNA -, genom. DNA Isolierung

Mini-Prep Puffer: 25 mM Tris/HCl, pH 7.5

50 mM Glucose

10 mM EDTA

CTAB-Extraktionspuffer: 2% w/v CTAB

100 mM Tris/HCl, pH 8

20 mM EDTA, pH 8

1.4 M NaCl

CTAB-NaCl Puffer: 10% w/v CTAB


10 mM EDTA, pH 8


- 9 - 9

CTAB/NaCl Fällungspuffer: 1% w/v CTAB


10 mM EDTA, pH 8

Sequenzierung, Northern-, Southernblotting

20x SSC: 173.3 g NaCl

100 g Natriumcitrat x 3 H2O

aqua dest. ad 1 Liter

pH 7, autoklaviert

50x Denhardt’s Reagenz: 5 g Ficoll

5 g Polyvinylpyrrolidon

5 g Rinderserum Albumin

aqua dest. ad 500 ml

steril filtriert

1 M Kaliumphosphatpuffer: 1 M K2HPO4

1 M KH2PO4

pH 7


10x STE: 0.1 M NaCl

10 mM Tris/HCl

1 mM EDTA

pH 8, autoklaviert

TE: 10 mM Tris/HCl

1 mM EDTA

pH 8, autoklaviert


- 10 - 10

1x TAE: 40 mM Tris/AcOH, pH 7.8

1 mM EDTA

autoklaviert

6x Ladepuffer: 0.25% w/v Bromphenolblau

0.25% w/v Xylencyanol

30% v/v Glycerin

10x Gelpuffer: 0.4 M MOPS

100 mM Natriumacetat

10 mM EDTA

pH 7, autoklaviert

Dentaturierungslösung: 1.5 M NaCl

0.5 M NaOH

Neutralisierungslösung: 1.5 M NaCl

0.5 M Tris/HCl

0.5 M EDTA

pH 8, autoklaviert

Hybridisierungslösung: 50% Formamid

5x SSC

50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7

2x Denhardt’s

100 µg/ml Heringsspermien-DNA

0.5% w/v SDS

Sequenzierladepuffer: 80% Formamid

20% 25 mM EDTA

50 mg/ml Blue Dextran


- 11 - 11

1% Agarose Gel: 1 g Agarose

100 ml aqua dest.

1x TAE

10 µl EtBr (5 mg/ml)

Glutathion Sepharose 4B Affinitätschromatographie

Puffer A: 10 mM NaCl

1 mM EDTA


1 mg/ml Lysozym

1 mM PMSF

Spatelspitze DNAse / pro 30 ml

Waschpuffer: 1% Nonidet 40 (NP 40) inPuffer A

Elutionspuffer: 5 mM red. Glutathion in 50 mM Tris/HCl,

pH 8

SDS-PAGE, Westernblotting

Trenngelpuffer: 1.5 M Tris/HCl, pH 8.8

0.4% SDS

25% Glycerin

Sammelgelpuffer: 0.5 M Tris/HCl, pH 6.8

0.4% SDS

30% Monomerengemisch: 29.2% Acrylamid

0.8% Bisacrylamid


- 12 - 12

2x Probenpuffer: 1.5 ml Sammelgelpuffer

1 ml 20% SDS

0.5 ml Glycerin

0.5 ml Mercaptoethanol

5 ml aqua dest.

Spatelspitze Bromphenolblau

10x Laufpuffer: 30 g Tris

144 g Glycin

10 g SDS


Blottingpuffer: 25 mM Tris

192 mM Glycin

20% v/v Methanol



- 13 - 13

2.1.2 Pflanzenmaterial

Für alle Untersuchungen wurde Lycopersicon esculentum cv. Castelmart II Tomatenpflanzen

eingesetzt. Ihre Anzucht erfolgte im Phytoschrank mit einem hell/dunkel Zyklus von 16.5 h

Licht (>140 µmolm-2s-1, 25°C) und 7.5 h Dunkel (18°C) bei 75% relativer Luftfeuchtigkeit.

Im Alter von 2-3 Wochen wurden sie zur Isolierung genomischer-DNA oder für

Fütterungsversuche mit Fusicoccin (3 µM) eingesetzt. In beiden Fällen wurde das gesamte

Sprossmaterial oberhalb der Kotyledonen verwendet.

2.1.3 Bakterienstämme

E. coli TOP10F’ F’{laclq Tn10 (TetR)} mcrA ∆(mrr-hsdRMS-

mcrBC)Φ80lacZ ∆M15 ∆lacX74 recA1 deoR

araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL(StrR)

endA1 nupG

E. coli DH5α supE44 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1

relA1

E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL F’ ampT hsdS (rB- mB

-) dcm+ Tetr galλ(DE3)

endA Hte [argU ileY leuW Camr]


- 14 - 14

2.2 Molekularbiologische Methoden 2.2.1 Klonierung des 3’-Endes der CDPK cDNA in den pBluescript SK(-) Vektor

Mit der Polymerase Kettenreaktion (PCR) wurde das 3’-Ende der CDPK cDNA aus cDNA-

Banken von der Tomatenblüte und dem Tomatenspross amplifiziert und mit

Restriktionsschnittstellen für die Enzyme EcoRI und XhoI versehen. Die PCR Reaktion

erfolgte in einem 50 µl Ansatz. Dieser enthielt 200 ng des Templats, 5 µl 10x M-MLV RT

Reaktionspuffer (Promega, Madison,WI, USA), 5 µl 5‘-Primer (10 µM), 5 µl 3‘-Primer (10

µM), 3 µl 25 mM MgCl2, 1 µl 10 mM dNTP’s und 26 µl nukleasefreies Wasser. Zudem

wurde der Mix mit einem TaqBeadTM (Heiss-Start-Polymerase, Promega) versetzt und mit 2

Tropfen Mineralöl überschichtet.

Das PCR-Programm umfasste 45 Zyklen (95 °C, 30 sec; 60 °C, 45 sec; 72 °C, 1 min). Die

DNA wurde durch eine Ethanolfällung aus dem Reaktionsansatz gereinigt, mit den Enzymen

EcoRI und XhoI restringiert, über ein 1 % (w/v) Agarose-Gel aufgetrennt und mit dem Biorad

Kit prep@gene aus dem Gel eluiert. Der pBluescript SK(-) Vektor wurde in gleicherweise

restringiert, mit CIAP (2 U Calf Intestine Alkaline Phosphatase) dephosphoryliert und durch

Agaroseelektrophorese gereinigt. Die Ligation mit T4-DNA Ligase wurde bei 16°C über

Nacht durchgeführt. Transformation von E. coli DH5α erfolgte auf gleiche Weise wie in

Abschnitt 2.2.10 beschrieben.

2.2.2 RACE-PCR und Klonierung in den pCR®2.1-TOPO Vektor

Die Amplifizierung des 5’ Endes der unvollständigen CDPK-cDNA erfolgte mit Hilfe des

„Smart™ RACE cDNA amplification Kit“ von Clontech (Palo Alto, Cal., USA). In einem

ersten Schritt erfolgte die Synthese der einzelsträngigen cDNA aus der Gesamt-RNA mittels

reverser Transkriptase. Dabei wurde das Protokoll des Herstellers unverändert übernommen

(im Manual Seite 8). Die auf diese Weise erhaltene einzelsträngige cDNA diente als Matrize

für die 5’RACE PCR. Abgesehen vom PCR-Programm wurde auch hier die Anleitung des

Herstellers (im Manual Seite 11) befolgt. Die dazu verwendeten Primer sind im Anhang

aufgeführt. Das leicht modifizierte „touch down“ PCR-Programm umfasste je 5 Zyklen

(94°C, 30 s; 74°C, 3 min), (94°C, 30 s; 72°C, 3 min), (94°C, 30 s; 70°C, 30 s; 72°C, 3 min)


- 15 - 15

sowie 35 Zyklen (94°C, 30 s; 68°C, 30 s; 72°C, 3 min). Die PCR-Produkte wurden durch

Agarosegelelektrophorese gereinigt und mit dem Biorad Kit prep@gene aus dem Gel eluiert.

Zur Klonierung wurde das TOPO TA Clonig® Kit von Invitrogen (Groningen, Nierderlande)

verwendet und gemäss Protokoll des Herstellers eingesetzt. Rekombinante Klone wurden auf

Vollmedium in Gegenwart von Ampicillin, IPTG und X-Gal selektioniert.

2.2.3 Isolierung von Plasmid-DNA

Plasmid-DNA wurde nach dem Prinzip der alkalischen Lyse isoliert (Birnboim und Doly,

1979). Die Anzucht der Bakterien erfolgte in 2 ml LB/Amp-Medium (100 ng Ampicillin/ml

LB-Medium) über Nacht bei 37°C und 220 rpm.

Die Übernacht-Kultur wurden bei 14'000 rpm für 2 min abzentrifugiert, der Überstand

verworfen und das Pellet in 100 µl Mini-Prep Puffer resuspendiert. Nach Zugabe von 150 µl

0.2 N NaOH, 1% (w/v) SDS und 5 min Inkubation auf Eis, wurde die Suspension ergänzt mit

150 µl 3 M Kaliumacetat und für weitere 5 min auf Eis gestellt. Durch Zentrifugation wurde

das Präzipitat entfernt und der Überstand wurde in ein neues Reaktionsgefäss mit 800 µl

vorgelegtem Ethanol transferiert. Es folgten weitere 15 min Inkubation auf Eis und 15 min

Zentrifugation der präzipitierten Plasmid-DNA, die anschliessend in 200 µl TE mit 1µl

pankreatischer RNAse (10 mg/ml) aufgenommen und 30 min bei 37°C inkubiert wurde.

Daran schloss sich je eine Extraktion mit Phenol und mit Phenol/Chloroform (1:1) an, gefolgt

von einer weiteren Ethanolfällung. Das Präzipitat wurde in 50 µl H2O aufgenommen und bei

–20°C gelagert.

2.2.4 DNA-Sequenzanalyse

Die DNA-Sequenzierung erfolgte nach der von Sanger et al. (1977) beschriebenen

Kettenabbruchmethode unter Einsatz von fluoreszenzmarkierten Dideoxynukleotiden. Diese

waren im Reaktionsmix enthalten (Perkin Elmer, Rotkreuz, Schweiz), ebenso die Taq-

Polymerase und der Puffer. In einem PCR-Ansatz von 10 µl wurden 250-500 ng Plasmid-

DNA, 1.6 pmol Primer und 4 µl Reaktionsmix eingesetzt. Es wurden 25 Reaktionszyklen wie

folgt durchgeführt: 95°C, 30 s; 50°C, 15 s; 60°C, 4 min. Die Reaktionsprodukte wurden mit


- 16 - 16

Ethanol gefällt, in 4 µl Ladepuffer aufgenommen und 2 min bei 95°C denaturiert. Die

Trennung der Nukleotidstränge erfolgte über ein 5% (w/v) Polyacrylamid-Gel in Gegenwart

von 8 M Harnstoff. Als Laufpuffer wurde 1x TBE verwendet. Die Elektrophorese dauerte bei

2500 V und 38 W 17 Stunden (ABI 373 DNA Sequencer, Perkin Elmer). Analysiert und

ausgewertet wurden die Daten mit Hilfe des Software-Paketes der University of Wisconsin

Genetics Computer Group.

2.2.5 Gesamt-RNA Extraktion

Die Gesamt-RNA wurde aus zwei Wochen alten Pflanzen L. esculentum cv. Castelmart II

gewonnen, die in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur Verwendung bei –80°C

gelagert worden waren. Das gefrorene Pflanzenmaterial von jeweils 6 Pflanzen (ca. 0.8 g

Frischgewicht) wurde mit Mörser und Pistill in flüssigem Stickstoff zu einem feinem Pulver

zerrieben.

Die Extraktion erfolgte mit 300 µl Phenol, equilibriert in 100 mM Tris/HCl, pH 8, und 300 µl

Tris/HCl, pH 8. Die wässrige Phase wurde anschliessend vier weiteren Phenol- (equilibriert

in 100 mM Tris, pH 8), sowie einer Phenol/Chloroform (1:1) Extraktion unterzogen. An die

sich Ethanol-, Lithiumchlorid- und Ethanolfällungen anschlossen. Aufgenommen wurde das

Pellet in 50 µl TE. Die RNA-Konzentration wurde anhand der Absorption bei einer

Wellenlänge von 260 nm bestimmt und auf 1 µg/µl eingestellt.

2.2.6 Northern-Blot Analyse

Es wurden 5.5 µl RNA (1µg/µl) mit 1 µl 10x Formaldehydgelpuffer (Sambrook et al., 1989),

3.5 µl Formaldehyd und 10 µl Formamid gemischt, während 15 min bei 65°C denaturiert und

auf Eis abgekühlt. Nach Zugabe von 2 µl Formaldehyd-Ladepuffer wurde die Probe auf

einem 1.2% (w/v) Agarosegel in Gegenwart von 6.5% (v/v) Formaldehyd während 5 h bei

120 V elektrophoretisch aufgetrennt. Nach erfolgter Elektrophorese wurde das Gel 2x 20 min

in Wasser gewaschen. Die RNA wurde entweder mit Ethidiumbromid angefärbt oder mittels


- 17 - 17

Kapillartransfer auf eine Nitrocellulosemembran (BA 85, Schleier & Schuell, Dassel,

Deutschland) übertragen und mit einer radioaktiv markierten DNA-Sonde hybridisiert.

Für die Ethidiumbromidfärbung wurde das Gel 30 min in Wasser mit Ethidiumbromid (1

µg/ml) inkubiert und über Nacht in Wasser entfärbt. Die Nukleinsäurebanden wurden unter

UV-Licht (354 nm) sichtbar gemacht und dokumentiert (Eagle Eye, Stratagene, La Jolla, Cal.,

USA).

Der Kapillartransfer der RNA auf eine Nitrocellulosemembran erfolgte über Nacht in

Gegenwart von 10x SSC. Die Membran wurde danach für kurze Zeit in 2x SSC gewaschen

und im UV-Crosslinker (Stratagene) bestrahlt, um die RNA kovalent auf die

Membranoberfläche zu binden. Die Vorhybridisierung sowie die Hybridisierung wurden in 5x

SSC, 50 mM KPP, pH 7, 2x Denhardt’s, 100 µg/ml Heringssperma DNA und 0.5% SDS bei

42°C für 4 h bzw. über Nacht durchgeführt. Die radioaktive Markierung der Sonde erfolgte

nach der Methode von Feinberg und Vogelstein (1983). Dabei wurde ein kommerzielles

Produkt vorbereiteter Reagenzien (Prime-it) nach Angaben des Herstellers Stratagene

verwendet. Nichtinkorporierte Nukleotide wurden mittels Gelfiltration über Sephadex G50

(Amersham Pharmacia Biotech, Dübendorf, Schweiz) von der markierten Sonde getrennt. Der

Einbau radioaktiven dATP’s wurde im Scintillationszähler überprüft. Die sich an die

Hybridisierung anschliessenden Waschschritte erfolgten mit abnehmenden

Salzkonzentrationen. Sie wurden alle bei 60°C für je 30 min durchgeführt. Der erste

Waschschritt erfolgte mit einer 1x SSC, 0.5% (w/v) SDS Lösung. Auf diesen folgten zwei

weitere mit jeweils einer 0.2x SSC, 0.5% (w/v) SDS Lösung.

Die Membran wurde dann über Nacht auf einer PhosphorImager Kassette exponiert und

anschliessend am PhosphorImager unter Anwendung der entsprechenden Software (Image

Quant, Molecular Dynamics, Sunnyvale, Cal., USA) analysiert.

2.2.7 Isolierung der Genomischen DNA

Das in flüssigem Stickstoff schockgefrorene und bei –80°C gelagerte Pflanzenmaterial (10 g

Frischgewicht) wurde mit Mörser und Pistill in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver

zerrieben. Dieses wurde in 50 ml vorgewärmten (65°C) CTAB-Extraktionspuffer, welcher 2%

(v/v) 2-Mercaptoethanol enthielt, überführt. und für 30 min bei 65°C inkubiert. Während

dieser Zeit wurde der Ansatz mehrmals vorsichtig gemischt. Die anschliessende Extraktion

mit Chloroform wurde mit einem dem Ansatz entsprechenden Volumen durchgeführt. Bei


- 18 - 18

5000 xg wurde 5 min zentrifugiert. Dann wurde der zuvor abgenommenen wässrigen Phase

1/10 Volumenteil CTAB-NaCl Puffer zugesetzt und vorsichtig geschüttelt. Es schloss sich

eine weitere Chloroform-Extraktion an, worauf die wässrige Phase mit dem gleichen

Volumen CTAB-Fällungspuffer versetzt wurde. Da sich das Präzipitat nicht sogleich bildete,

wurde die Lösung für 30 min bei 65°C inkubiert. Nach einem zweiten Zentrifugationsschritt

bei 5000 xg für 5 min wurde das Pellet in 10 ml STE für 30 min bei 65°C resuspendiert und

anschliessend mit 6 ml Isopropanol überschichtet. Die ausgefallene DNA wurde mittels einer

Pasteurpipette aus der Interphase “gefischt” und in 80% (v/v) Ethanol gewaschen. Das

luftgetrocknete Pellet wurde in 2.5 ml TE aufgenommen und zur Elimination von RNA mit 10

µg/ml RNAse versehen. An die Inkubationszeit von 30 min bei 37°C folgte eine weitere

Präzipitation mit 800 µl 10 M Ammoniumacetat und 6.5 ml Ethanol. Das Präzipitat wurde bei

7500 xg und 4°C für 15 min sedimentiert, anschliessend in 80% (v/v) Ethanol gewaschen,

vacuumzentrifugiert (Savant) und in 0.5 ml TE aufgenommen. Die Konzentration der DNA-

Lösung wurde durch Messen der OD260 einer 1/50 Verdünnung bestimmt.

2.2.8 Southern-Blot Analyse

Die genomische DNA aus Sprossen von 20 Tage alten Tomaten wurde mit den Enzymen

DraI, EcoRI, HindIII und XbaI restringiert. Das Gesamtvolumen der einzelnen

Reaktionsansätze betrug 100 µl und beinhaltete 10 µg genom. DNA, 0.1 mg/ml BSA und 50

U der Restriktionsendonuclease im entsprechenden Puffer (MBI Fermentas, Vilnius,

Lithauen). Nach einer Reaktionszeit von 2 h bei 37°C wurden erneut 50 U des

Restriktionsenzyms zugegeben und für weitere 2 h inkubiert. Es folgten Hitzeinaktivierung

des Enzyms und Ethanolfällung der DNA. Die elektrophoretische Trennung der

Restriktionsfragmente wurde über Nacht bei einer Spannung von 40 V auf einem 0.8%

Agarose Gel durchgeführt. Als Elektrophoresepuffer wurde 1x TAE unter Zusatz von 0.25

µg/ml EtBr eingesetzt. Die im Gel immobilisierten DNA Fragmente wurden partiell

hydrolysiert (20 min in 500 ml 0.25 N HCl), denaturiert (30 min in 500 ml 1.5 M NaCl, 0.5 M

NaOH) und neutralisiert (2x 15 min in je 500 ml 1.5 M NaCl, 0.5 M Tris/HCl pH 8).

Der anschliessende Kapillartransfer der DNA Fragmente auf die Nitrocellulosemembran

erfolgte über Nacht in Gegenwart von 20x SSC. Alle weiteren Schritte wurden gemäss (2.2.6)

durchgeführt.


- 19 - 19

2.2.9 Klonierung der CDPK cDNA in pGEX-G

Beim pGEX-G Vektor (Schmid und Görlach, 1996) handelt es sich um ein Derivat des

pGEX-3X Vektors (Amersham Pharmacia Biotech). Der Vektor erlaubt die Expression eines

Proteins in N-terminaler Fusion mit Glutathion S-Transferase (GST) unter der Kontrolle des

mit IPTG induzierbaren tac-Promoters. Die Trennung des zu exprimierenden Proteins

(CDPK) von der GST Domäne ist durch proteolytische Spaltung mit Faktor Xa möglich.

Das offene Leseraster der CDPK cDNA wurde mittels PCR amplifiziert. Der eingesetzte 5’-

und 3’-Primer (im Anhang aufgeführt) war am 5’-Ende phosphoryliert, bzw. wies am Ende

eine Restriktionsschnittstelle für das Enzyme KpnI auf. Im Reaktionsansatz von 100 µl

Volumen wurden 500 ng cDNA, 0.5 µM beider Primer, 0.1 mM dNTPs und 2.5 U Pwo-

Polymerase im entsprechenden MgCl2 Puffer (Roche Diagnostics, Rotkreuz, Schweiz)

eingesetzt. Die PCR im DNA Thermal Cycler (Perkin Elmer Cetus) umfasste 25 Zyklen

(95°C, 15 s; 52°C, 30 s; 72°C, 2 min; nach dem zehnten Zyklus wurde die Reaktionszeit bei

72°C jeweils um 20 s gegenüber dem vorhergegangenen Zyklus verlängert. Die amplifizierten

PCR-Produkte wurden mit Phenol/Chloroform extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und mit

KpnI restringiert. Die über ein Agarosegel aufgetrennten Produkte wurden mit dem Kit

prep@gene (BioRad) gereinigt. Entsprechend wurde der pGEX-G Vektor mit StuI und KpnI

restringiert und mit CIAP dephosphoryliert. Die Ligation erfolgte mit T4-DNA Ligase über

Nacht bei 16°C und resultierte in pGEX-G/CDPK-L. Auf gleiche Weise wurde eine C-

terminal um die calmodulin-ähnliche Domäne verkürzte Form der CDPK amplifiziert und

kloniert (Primer sind im Anhang aufgeführt). Der resultierende Expressionsvektor wurde mit

pGEX-G/CDPK-K bezeichnet.

2.2.10 Transformation von E. coli DH5α mit pGEX-G/CDPK-L/K

Für die Transformation wurden die Ligationsansätze aus 2.2.9 zu je 200 µl kompetenten E.

coli DH5α Zellen, die auf Eis aufgetaut wurden, zugegeben und 30 min auf Eis, 30 s bei 42°C

und 5 min auf Eis inkubiert. Der Ansatz wurde mit 800 µl LB-Medium ergänzt und für 45

min bei 37°C auf dem Schüttler inkubiert. Zum Ausplattieren wurden 50 µl bzw. 500 µl des

Ansatzes auf LB-Platten mit 100 mg/l Ampicillin gebracht und über Nacht bei 37°C inkubiert.

Mit den auf LB/Amp-Platten gewachsenen Kolonien wurden 2 ml LB/Amp-Flüssigkulturen,


- 20 - 20

(100 ng Ampicillin/ml LB-Medium) inokuliert. Die Flüssigkulturen wurden erneut über Nacht

bei 37°C und 220 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Nach der Plasmid-Isolation (2.2.3) wurde

deren Identität anhand von Restriktions- und Sequenzanalyse (2.2.4) bestätigt.

2.2.11 Transformation von E. coli BL21-(DE3)-RIL mit pGEX-G/CDPK -L/K

Zur Transformation von E. coli BL21-(DE3)-RIL wurden Aliquots von 50 µl auftauender

kompetenter E. coli Zellen mit je 1 µl verdünntem β-Mercaptoethanol (1:10) versetzt und 10

min auf Eis gehalten. Während dieser Inkubationszeit wurden die Bakterien alle 2 min

vorsichtig gemischt. Nach der Zugabe von je 50 ng der pGEX-G/CDPK-L/K Plasmid-DNAs

(2.2.10) folgten 30 min Inkubation auf Eis, 20 s Hitzeschock bei 42°C und weitere 2 min auf

Eis. Die Ansätze wurden mit 450 µl LB-Medium ergänzt und für ca. 45 min im 37°C

Wasserbad inkubiert. Auf LB/Amp-Platten (100 mg/l Ampicillin) wurden jeweils 50 µl bzw.

200 µl des Transformationsansatzes ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert.

2.2.12 Anzucht von E. coli BL21-(DE3)-RIL Zellen

Die Anzucht der Bakterien erfolgte in 5 ml LB-Flüssigkulturen in Gegenwart von 100 mg/l

Ampicillin. Die über Nacht bei 37°C und 220 rpm gewachsenen Zellen wurden andern Tags

in 500 ml LB/Amp-Flüssigkulturen transferiert und wie zuvor bei 37°C und 220 rpm bis zu

einer optischen Dichte von 1.0 angezogen. Durch Zugabe von IPTG zu 1 mM wurde die

Expression des Fusionsproteins induziert. Daraufhin wurden die Schüttelkulturen bei

Raumtemperatur oder bei 30°C gehalten. Die Zellen wurden zu den angegebenen Zeitpunkten

abzentrifugiert (3 min, 2400 xg, 4°C) und das Sediment wurde bei -80 °C gelagert.


- 21 - 21

2.2.13 Aufschluss von E. coli BL21-(DE3)-RIL Zellen

Das Zellsediment einer 250 ml Kultur wurde mit Hilfe einer 10 ml Stabpipette in 30 ml Puffer

A (10 mM NaCl, 1 mM EDTA, 50 mM Tris/HCl, pH 8), 1 mg/ml Lysozym, 1 mM PMSF und

einer Spatelspitze DNAse resuspendiert. Die Lyse erfolgte während 20 min auf Eis. Der

Zellaufschluss erfolgte am Sonicator (W-380, Heat Systems, Ultrasonics). Dazu wurde die

Zellsuspension 5x 30 s mit Ultraschall behandelt. Zelltrümmer sowie unlösliche Proteine,

sogenannte „Inclusion Bodies“, wurden durch Zentrifugation (30 min, 2800 xg, 4°C) entfernt.

Der Überstand wurde über einen Faltenfilter filtriert und bis zu seiner Verwendung bei 4°C

gelagert. Zur Reinigung der unlöslichen Proteine wurde das Sediment unlöslicher Proteine mit

1% NP40 in 30 ml Puffer A gewaschen und erneut in 30 ml Puffer A resuspendiert. Aliquote

des Überstands als auch des Sediments wurden durch SDS-PAGE analysiert.

2.3 Protein-Analytische Methoden 2.3.1 SDS-PAGE / Western-Blot

Die Auftrennung des Proteingemisches erfolgte über ein 8% SDS-Polyacrylamidgel, in einem

diskontinuierlichen Gelsystem nach Lämmli (1970), welches sich aus einem 4.5%-igen

Sammelgel und einem 8%-igen Trenngel zusammensetzt. Vor dem Laden des Gels, wurde die

Proteinlösung mit SDS Lämmli Probenpuffer versehen und während 5 min bei 95°C

denaturiert. Die Elektrophorese dauerte 2.5 h bei 150 V. Zur Anfärbung der Proteinbanden

wurde Coomassie Brillant Blue R 250 eingesetzt. Der Transfer (Western Blot), der mittels

SDS-PAGE aufgetrennten Proteine auf eine Nitrocellulosemembran (Schleicher & Schuell),

erfolgte während 1 h bei 200 mA im Blottingpuffer (gemäss 2.1.1).

2.3.2 Reinigung der GST-CDPK Fusionproteine

Das Reinigungsprinzip der Glutathion Sepharose Affinitätschromatographie beruht auf der

Fähigkeit des GST Anteils des Fusionsproteins, an die Säulenmatrix zu binden.


- 22 - 22

Glutathion Sepharose 4B-Säulen von 2 ml Bettvolumen wurden bei 4°C mit Puffer A (aus

2.2.13) äquilibriert. Die Kapazität der Matrix beträgt 5 mg Fusionsprotein je 1 ml

Bettvolumen. Bei einer Flussrate von 4 ml/h wurde der Proteinextrakt (2.2.13) auf die Säule

aufgetragen und anschliessend bei erhöhter Flussrate (7 ml/h) mit 50 ml Puffer A gewaschen.

Nach einem weiteren Waschgang mit 15 ml 50 mM Tris/HCl, pH 8, wurden GST-CDPK

Fusionsproteine mit 5x 2 ml 10 mM reduziertem Glutathion in 50 mM Tris/HCl, pH 8, von

der Säule eluiert und bei 4°C oder -20°C gelagert. Die Bestimmung der Proteinkonzentration

der gesammelten Eluatfraktionen erfolgte nach Bradford (1976). Das Farbreagens (basierend

auf Coomassie Brilliant Blue G-250, Pierce Chem. Co.) wurde 1:10 (v/v) mit der zu

analysierenden Proteinlösung gemischt und anschliessend im Spektrophotometer bei einer

Wellenlänge von 595 nm gemessen. Die Proteinkonzentrationen wurde anhand einer BSA-

Eichgerade errechnet.

2.3.3 Bindung von 45Ca2+

Die mittels SDS-PAGE (2.3.1) aufgetrennten Proteine wurden elektrophoretisch auf eine

Nitrocellulosemembran übertragen (Western Blot, 2.3.1). Nach erfolgtem Transfer wurde die

Membran 3x 20 min in (60 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Imidazol/HCl, pH 6.8)

gewaschen. Zum Test auf Bindung von 45Ca2+ wurde die Membran in 20 ml einer Lösung von

60 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Imidazol/HCl, pH 6.8 und 20 µCi 45CaCl2 für 10 min im

Mini Hybridisierungsofen bei RT inkubiert. Anschliessend wurde die Membran in Wasser

gewaschen und für 12 h auf Kodak X-O-mat Röntgenfilm exponiert.

2.3.4 Autophosphorylierung immobilsierter CDPK

Die mittels SDS-PAGE (2.3.1) aufgetrennten Proteine wurden elektrophoretisch auf eine

Nitrocellulosemembran übertragen (Western Blot, 2.3.1; ohne Methanol im Transferpuffer).

Nach erfolgtem Transfer wurde die Membran zunächst in 30 mM HEPES mit 5% (w/v)

Magermilchpulver 30 min bei Raumtemperatur abgesättigt. Dann wurde die Membran mit

Denaturierungspuffer (7 M Guanidin Hydrochlorid, 50 mM Tris/HCl, pH 8.3, 50 mM DTT, 2

mM EDTA, 0.25% (w/v) Magermilchpulver) für 1 h bei RT inkubiert. Auf die Denaturierung


- 23 - 23

folgte eine Renaturierung. Der dazu eingesetzte Renaturierungspuffer (50 mM Tris/HCl, pH

7.5, 100 mM NaCl, 2 mM DTT, 2 mM EDTA, 0.1% Nonidet P-40, 0.25% (w/v)

Magermilchpulver) wurde während 16 h mehrmals ausgetauscht. Die Membran wurde danach

in 30 mM HEPES, pH 7.5 grüdlich gewaschen und anschliessend in calciumhaltigen - (50

mM HEPES, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 2 mM DTT, 1.1 mM CaCl2, 0.01µM

ATP, 0.0022 µM [γ-32P]-ATP (4500 Ci/mmol)) bzw. calciumfreiem Kinase Puffer (50 mM

HEPES, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 5 mM EGTA, 2 mM DTT, 0.01µM ATP, 0.0022 µM [γ-32P]-

ATP (4500 Ci/mmol)) während 30 min bei RT im Mini-Hybridisierungsofen inkubiert. Es

folgten Waschschritte mit 30 mM HEPES, pH 7.5, gefolgt von 1 N HCl (1 h, 40°C), gefolgt

von 30 mM HEPES, pH 7.5. Daraufhin wurde die Membran 24 h auf einer PhosphorImager-

Kassette (Molecular Dynamics) exponiert. Die Auswertung erfolgte mit der Software Image

Quant (Molecular Dynamics).

2.3.5 Phosphoaminosäuretrennung mittels DC

Die Analyse von Phosphoaminosäuren wurde nach der Methode von Shi et al (1999) in leicht

abgeänderter Form übernommen. Das nach (2.3.2) gereinigte GST-CDPK-L Protein (5 µg)

wurde zur Autophosphorylierung in einem Reaktionsvolumen von 500 µl mit 50 mM HEPES,

pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1.1 mM CaCl2, 2 mM DTT, 0.025 µM ATP und 0.022

µM [γ-32P]-ATP (4500 Ci/mmol) für 30 min bei 30°C inkubiert. Zur Präzipitation des

Proteins mit 10% (w/v) Trichloressigsäure wurde der Ansatz 10 min auf Eis gehalten und

anschliessend 10 min zentrifugiert. Daran schlossen sich drei Waschschritte mit je 5% TCA

und ein weiterer mit 95% (w/v) Ethanol an. Das Protein wurde in 200 µl 6 N HCl bei 110°C

für 1 h hydrolysiert. Das Hydrolysat wurde in vacuo eingetrocknet, dann in 6 µl einer

wässrigen Lösung nichtradioaktiver Phosphoaminosäuren (je 2 mg/ml P-Thr, P-Tyr und P-

Ser) resuspendiert und auf eine cellulosebeschichtete Dünnschichtplatte (E. Merck,

Darmstadt, Deutschland) aufgetragen. Die zweidimensionale Auftrennung der hydrolysierten

Aminosäuren erfolgte in erster Dimension während 10 h in Isobuttersäure:0.5 M NH4OH (5:3,

v/v). In zweiter Dimension erfolgte die Trennung während 7 h in Propionsäure:1 M

NH4OH:2-Propanol (45:17.5:17.5, v/v/v). Die Platte wurde getrocknet und zur

Aminosäureanfärbung mit einer 0.25% Ninhydrin/Aceton Lösung besprüht und 10 min bei

60°C inkubiert. Zur Autoradiographie wurde die Platte für 20 min auf Kodak X-O-mat


- 24 - 24

Röntgenfilm exponiert. Durch Vergleich des Röntgenfilms und der gefärbten Platte konnten

die in der CDPK autophosphorylierten Aminosäuren identifiziert werden.

2.3.6 Aktivitätstest

Kinetische Analysen der CDPK Aktivität mit dem Oligopeptid Syntide-2

(PLARTLSVAGLPGKK) als Substrat wurden nach Harmon et al. (1994) durchgeführt. In

einem 50 µl Reaktionsansatz wurden 30 nM CDPK mit unterschiedlich hohen

Substratkonzentrationen (10 µM, 20 µM, 30µM, 40 µM, 50 µM, 100 µM 150 µM) und dem

Kinase Puffer (50 mM HEPES, pH 7.5, 10 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 1.1 mM CaCl2, 2 mM

DTT, 0.1 mg/ml BSA) zusammengebracht. Nach einer Inkubationszeit von 5 min bei 30°C,

wurde die Reaktion durch Zugabe von 60 µM [γ-32P]-ATP (500 cpm/pmol) gestartet und für

weitere 15 min bei 30°C inkubiert. Abgestoppt wurde die Reaktion durch Auftragen von 10 µl

des Reaktionsansatzes auf einen Streifen (1 cm x 2 cm) Phosphocellulosepapiers (Whatman

P81). Die Streifen wurden anschliessend gründlich in 150 mM H3PO4 gewaschen und zum

Trocknen mit Aceton gespült. Die luftgetrockneten Proben wurden mit 4 ml

Scintillationslösung versetzt und am Scintillationszähler gemessen.

Resultate

- 26 - 26

3. RESULTATE Mittels eines Datenbankvergleichs wurde ein EST der Tomate (tomest: expressed sequence

tag der Tomate) identifiziert, der hohe Sequenzierähnlichkeit mit der von Yoon et al. (1999)

beschriebenen Calcium-abhängigen Proteinkinase aus Tabak aufwies. Ein volllänge cDNA

Klon dieser CDPK aus Tomate sollte mittels PCR kloniert werden.

3.1 Klonierung des 3’Endes einer Calciumabhängigen Proteinkinase (CDPK) aus Tomate

Zur Klonierung des 3’-Endes dieser CDPK cDNA wurden cDNA-Banken von der

Tomatenblüte und dem Tomatenspross, die in den pBluescript SK(-) Vektor konstruiert

worden waren (angelegt von Andreas Schaller), als Matrize eingesetzt. Die Amplifikation der

CDPK cDNA erfolgte mittels PCR. Als 5’-Primer wurde ein Oligonukleotid eingesetzt (vgl.

Abb. 2), dessen Sequenz von dem EST (tomest) abgeleitet worden war. Der T7 Primer des

pBluescript Vektors diente als 3’-Primer.

Von den 22 Klonen, die der Sequenzierung zugeführt wurden, wiesen alle 22 Klone dieselbe

Sequenz auf. Lediglich die Länge der 3’-untranslatierten Regionen unterschied sich in den

cDNAs die aus der Spross-, bzw. Blüten-Bank isoliert worden waren. Die erhaltene

Nukleotidsequenz des 3’-Endes der CDPK cDNA stimmte vollständig mit dem EST der

Datenbank überein (Abb. 2). Die cDNA wies eine singuläre HindIII-Schnittstelle auf. Durch

Restriktion mit HindIII und mit XhoI im Bereich des „Polylinkers“ des Vektors konnte ein

Fragment generiert werden, welches der 3’-untranslatierten Region der mRNA entspricht.

Dieses Fragment wurde als Sonde bei Northern- und Southern Blot Analysen eingesetzt.

Resultate

- 27 - 27

1 50

klon25 .......... .......... .......... GGTATGGGTG ATGAGGCCAC tomest GATGAATTGG AAAACGCTAT GAAGGAATAT GGTATGGGTG ATGAGGCCAC 51 100 klon25 CATCAAGGAG ATAATCGCAG AGGTGGGCAC TGACAATGAC GGTAGGATCA tomest ATTACGAGGA GTTCTGTGCT ATGATGAGAA GTGGAACAAC ACAACCACAA 151 200 klon25 CAAAAGCTTT TCTAGTGCAT CGAGAGCAAA TTACCCTTGC AACGAGCAGA tomest CAAAAGCTTT TCTAGTGCAT CGAGAGCAAA TTACCCTTGC AACGAGCAGA

201 250 klon25 GAACGTTCAC CAGCCAGCAC GATGGAGAGA TGTCTATCAC GAGAGGATCA tomest GAACGTTCAC CAGCCAGCAC GATGGAGAGA TGTCTATCAC GAGAGGATCA 251 300 klon25 GTAACTTAAC ATACTTCCAT ATTTCTTCAA TCCTTCAGCT ATCTTCAAAA tomest AGCACTGGAG TACATGAGAC CTTTTTCGTG TAGGTTGAGT TCGCGTGGAA 351 400 klon25 AATGTGTGTA TAGCTAGTTA ATGGTATATT TCGAGTTTCT TGTAATGTAT tomest AATGTGTGTA TAGCTAGTTA ATGGTATATT TCGAGTTTCT TGTAATGTAT 401 450 klon25 TTGATCCCCC TTCGTAATTT TGTGTGGATC GCGTTGTGAA GTTGACCTCC tomest TTGATCCCCC TTCGTAATTT TGTGTGGATC GCGTTGTGAA NNAAA..... 451 500 klon25 CGTAGAGATT ATAACAAGAC AATCTGAATA TAGCTTTATG CTTGAAAAAA tomest .......... .......... .......... .......... ..........

Abb. 2: Nukleotidsequenz des 3’-Endes der CDPK cDNA, isoliert aus der Blüten-Bank. Die kursiv gedruckten

Nukleotide bilden die Schnittstelle für HindIII. Der PCR Primer (LePK32) ist hervorgehoben. Die cDNAs,

welche aus dem Spross isoliert wurden, waren um die unterstrichene Nukleotidsequenz kürzer.

3.2 Southern Blot Analyse

LePK52

Resultate

- 28 - 28

Genomische DNA der Tomatenpflanze wurde mit verschiedenen Restriktionsenzymen (DraI,

EcoRI, HindIII und XbaI) restringiert und nach Trennung über ein Agarosegel (Abb. 3A) auf

eine Nitrocellulosemembran transferiert. Die Hybridisierung der Membran erfolgte mit dem

HindIII/XhoI-Fragment der bislang erhaltenen CDPK-cDNA (s. 3.1), welches der 3’-

untranslatierten Region des Transkriptes entspricht. DNA-Fragmente, welche mit der Sonde

hybridisierten, weisen im Southern Blot eine Markierung auf (Abb. 3B). In jeder Spur konnte

nur ein Fragment nachgewiesen werden. Offensichtlich ist die eingesetzte Sonde

genspezifisch, d.h. sie hybridisiert mit nur einem Gen der CDPK-Genfamilie. Die Sonde ist

demnach geeignet, in weiterführenden Experimenten die Expression dieser CDPK-Isoform

auf Northern Blots zu untersuchen.

Abb. 3: Southern-Analyse genomischer DNA aus Lycopersicon esculentum cv. Castelmart II, die mit XbaI,

HindIII, EcoRI und DraI geschnitten wurde. Es wurden jeweils 10 µg genom. DNA verwendet,

elektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und dort mit einer CDPK-Sonde

(entsprechend dem 3’untranslatierten Bereich der mRNA) hybridisiert. Die Lage und Grösse bekannter DNA

Fragmente (Gibco/BRL, Basel, Schweiz) sind links der Abbildungen angegeben. Sowohl das EtBr- gefärbte Gel

(A), als auch der davon erhaltene Gel-Blot (B) sind gezeigt.

3.3 Northern Blot Analyse

XbaI

HindIII

DraI

EcoR

I

XbaI

HindIII

DraI

EcoR

I

0.5

1

1.6

3

5

12

kb

0.5

1

1.6

3

5

12

kb

A B

XbaI

HindIII

DraI

EcoR

I

XbaI

HindIII

DraI

EcoR

I

0.5

1

1.6

3

5

12

kb

0.5

1

1.6

3

5

12

kb

A B

0.5

1

1.6

3

5

12

kb

0.5

1

1.6

3

5

12

kb

A B

Resultate

- 29 - 29

Zunächst wurden die organspezifische Expression in Tomatenpflanzen untersucht. Dazu

wurde die Gesamt-RNA aus Kotyledonen, Blättern, Wurzeln, Blüten und aus in Suspension

kultivierten Zellen isoliert, aufgetrennt und zur Sichtung der entsprechenden mRNAs mit der

unter 3.2 beschriebenen Sonde hybridisiert. Es zeigte sich, dass die CDPK in allen hier

untersuchten Organen exprimiert ist. Die Transkriptspiegel waren jedoch in Kotyledonen und

Blättern wesentlich geringer als in Wurzeln, Blüten oder undifferenzierten Zellen (Abb. 4).

Abb. 4: Northern Blot Analyse der CDPK Expression in verschiedenen Organen der Tomate. Jeweils 4.5 µg

Gesamt-RNA aus Kotyledonen (1), Blättern (2), Wurzeln (3), Blüten (4) und Zellkulturen (5) wurden der RNA

Gelblot Analyse unterzogen. Die Blots wurden mit einer spezifischen CDPK- und einer Ubiquitin Sonde

hybridisiert und mittels des PhosphorImagers analysiert.

Weiterhin wurde eine mögliche Induzierbarkeit durch Verwundung oder Fusicoccin

untersucht. Während sich die Transkriptspiegel der CDPK in Blättern verwundeter

Tomatenpflanzen nicht änderten (Daten nicht gezeigt), war eine deutliche Akkumulation des

CDPK

UBQ

1 2 3 4 5

CDPK

UBQ

1 2 3 4 5

Resultate

- 30 - 30

Transkripts in Blättern Fusicoccin behandelter Pflanzen zu beobachten (Abb. 5). Die

Induktion war 4 h nach Gabe des Toxins maximal, danach nahm der „steady state“ Gehalt des

CDPK Transkriptes wieder ab. Die Induktion der CDPK Expression durch Fusicoccin ist

daher schneller als die von typischen „Pathogenesis related“ (PR) Proteinen (Abb. 5). Das in

Abbildung 5 gezeigte, mit Ethidiumbromid gefärbte Gel ist mit jenem identisch, von dem die

RNA auf eine Membran transferiert wurde. Es zeigt, dass die Gesamt-RNA-Konzentration in

den entsprechenden Spuren gleich war.

Abb. 5: Northern Blot Analyse Fusicoccin gefütterter Tomatenpflanzen. Zur Analyse wurden jeweils 4.5 µg

Gesamt-RNA eingesetzt. Die RNA-Gel Blots wurden mit radioaktiv markierten Sonden der CDPK-cDNA (dem

HindIII/XhoI-Fragment) und zur Kontrolle mit einer sauren Chitinase hybridisiert. Ein weiteres Gel wurde mit

Ethidiumbromid gefärbt. 0 – 8 h: Zeitangabe nach Beginn der Fusicoccin-Behandlung.

3.4 Amplifizierung des 5’-Endes mittels RACE-PCR

0 h 0.5 h

1 h 1.5 h4 h 6 h 8 h2 h

CDPK

Saure Chitinase

Ethidiumbromidgel25s rRNA

18s rRNA

0 h 0.5 h

1 h 1.5 h4 h 6 h 8 h2 h

CDPK

Saure Chitinase

Ethidiumbromidgel25s rRNA25s rRNA

18s rRNA18s rRNA

Resultate

- 31 - 31

Die vorausgegangene Northern Blot Analyse (3.3) zeigte, dass der Anteil des CDPK

Transkriptes an der Gesamt-RNA 4 Stunden nach Behandlung mit Fusicoccin relativ hoch

war. Aufgrund dieser neu gewonnenen Erkenntnis diente die RNA aus 4 Stunden mit

Fusicoccin behandelten Pflanzen als Ausgangsmaterial für eine Amplifikation des CDPK 5’-

Endes durch RACE (rapid amplification of cDNA ends)-PCR. Wie zuvor wurden auch hier

zwei zu tomest komplementäre Oligonukleotide als 3’-Primer eingesetzt (PKGSP1, LePK32;

s. Anhang). Die generierten RACE Produkte wurden anschliessend gelelektrophoretisch

aufgetrennt (Abb. 6).

Abb. 6: Amplifikation der CDPK cDNA (5’Bereich) mittels RACE PCR. Als Templat diente die Gesamt-RNA

aus Fusicoccin-behandelten (4 h) Tomatenpflanzen. Die RACE Produkte wurden über ein EtBr-gefärbtes

Agarosegel getrennt. In den Spalten 1 & 2 wurde PKGSP1, in 4 & 5 LePK32 als 3’ PCR Primer benutzt. Die zu

erwartende Produktegrösse beträgt ungefähr 2 kb.

Die amplifizierten Produkte von etwa 2 kb zeigten eine von verwandten CDPKs zu

erwartende Grösse. Die in dem Agarosegel identifizierten Banden wurden isoliert und in den

1 2 M 4 5

0.5

23

1.6

1

kb1 2 M 4 5

0.5

23

1.6

1

kb

Resultate

- 32 - 32

TOPO Vektor kloniert. Nach Isolierung des Plasmids wurde durch Restriktionsverdau mit

EcoRI das Vorhandensein der entsprechenden Insertion überprüft (Abb. 7). Die cDNA ist im

Vektor beiderseits von einer EcoRI Schnittstelle flankiert. Zudem scheint die inserierte CDPK

cDNA über eine interne EcoRI Schnittstelle zu verfügen (Abb. 7). Die Grösse der beiden

beobachteten Restriktionsfragmente (1.2 und 0.8 kb) entspricht in Summe der zu erwartenden

Grösse von 2 kb.

Abb. 7: EcoRI-Restriktionsverdau von 9 unabhängigen Klonen der CDPK cDNA im TOPO Vektor. Die

restringierte Plasmind-DNA wurde im Vergleich mit einem Grössenmarker (1 kb DNA-Ladder)

gelelektrophoretisch aufgetrennt.

In lediglich 2 von 9 Fällen (Spuren 1 und 5) ist eine cDNA Insertion zu beobachten und

bestätigt das Vorhandensein des gewünschten Inserts. Der leichte Unterschied in

Fragmentgrössen zwischen Klon 1 und 5 ist auf die unterschiedlichen Primer (PKGSP1 bzw.

LePK32) zurückzuführen.

Für die Sequenzbestimmung wurde die cDNA zunächst von den Enden her ansequenziert.

Dazu wurden als Primer die Oligonukleotide aus der RACE-PCR sowie 2 Primer

flankierender Vektorsequenzen benutzt. Die so gewonnene Sequenzinformation erlaubte es,

Oligonukleotide auszuwählen, die dann als Primer in weiteren Sequenzierreaktionen

eingesetzt wurden. Auf diese Art und Weise konnten beide Stränge der cDNA vollständig

durchsequenziert werden. Ihre Sequenz, sowie die damit überlappende Sequenz des zuvor

klonierten 3’-Endes der cDNA (vgl. Abb. 2, Klon 25) und die davon abgeleitete

Aminosäuresequenz sind in Abbildung 9 dargestellt. Wie aus der Sequenz zu entnehmen ist,

erstreckt sich die cDNA über 2229 Nukleotide. An der Position 219 beginnt mit dem ATG

Codon das offene Leseraster (ORF), welches 1659 bp umfasst und für ein Protein von 553

Aminosäuren kodiert. Ein zusätzliches Stopcodon im selben Leseraster 5’-aufwärts lässt

1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

1 kb

1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

1 kb

Resultate

- 33 - 33

vermuten, dass es sich hierbei um eine Volllänge-cDNA handelt. Die vom ORF abgeleitete

Aminosäuresequenz weist Ähnlichkeit zu bekannten pflanzlichen CDPKs auf. Die

Sequenzähnlichkeit mit der von Yoon et al. (1999) beschriebenen Tabak CDPK ist dabei

besonders ausgeprägt (94% identische Aminosäuren). Durch den Sequenzvergleich lassen

sich leicht die putative katalytische Domäne und die C-terminale Calcium-binde Domäne mit

vier charakteristischen EF-Hand Motiven ausmachen (Abb. 8).

Abb. 8: Aminosäuresequenzvergleich der CDPK aus Tomate mit der aus Tabak (NtCDPK1). Die Katalytische

Domäne, das autoinhibitorische, verbindende Peptid und die Calcium-binde Domäne mit den EF-Hand Motiven

sind gekennzeichnet. Horizontale Striche (-) weisen auf identische Aminosäuren hin, während Punkte (.) Lücken

symbolisieren, um eine maximale Sequenzidentität zu erlangen. Der Sequenzvergleich wurde mit dem

Programm „gap“ des GCG-Programmpaketes erstellt.

GGCAAGTGGGGAAAAAGCCTAGAAAAATAACAAGGGCAAAAGCTGGCAAAGAAAGTGTGT 1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60 CCGTTCACCCCTTTTTCGGATCTTTTTATTGTTCCCGTTTTCGACCGTTTCTTTCACACA

LeCDPK MGGCFSKKYT QQDAN.GHRA GRR.VNQAYQ KPPQPQPERP YQPQPQQERP 48 NtCDPK1 ---------R –EG--G-Y-- T--NA--E-- ----H----- ----...... 44 LeCDPK YQPPPQPAYQ PPPQPKPQPQ PHPVPVTVQS GQPQDQMQGP HMNNILGKPF 98 NtCDPK1 ....---..- -Q---R---- A-..T--X-P X-T------- -L-------F 86 LeCDPK EEIRKLYTLG KELGRGQFGV TYYCTENSTG NPYACKSILK RKLVSKNDRE 148 NtCDPK1 -D---Q---- ---------- --H------- ---------- ----R----- 136 LeCDPK DMKREIQIMQ HLSGQPNIVE FKGAYEDRQS VHLVMELCAG GELFDRIIAR 198 NtCDPK1 ---------- ---------- --------H- ---------- ---------- 186 LeCDPK GYYSEKDAAE IIRQIVNVVN ICHFMGVMHR DLKPENFLLT SKDENAMLKA 248 NtCDPK1 ---------- -----A---- ---------- ---------- ------K--- 236 LeCDPK TDFGLSVFIE EGKVYRDIVG SAYYVAPEVL RRSYGKEADV WSAGVILYIL 298 NtCDPK1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- 286 LeCDPK LSGVPPFWAE TEKGIFNTIL KGEIDFQSDP WPSISNSAKD LIRKMLTQEP 348 NtCDPK1 ---------- -------A-- ---------- ---------- ---------- 336 LeCDPK RKRITSAQVL EHPWLRLGEA SDKPIDSAVL SRMKQFRAMN KLKKLALKVI 398 NtCDPK1 ---M------ ------M--- ---------- ---------- ---------- 386 LeCDPK AENLSEEEIK GLKAMFHNID TDNSGTITYE ELKSGLARLG SKLTETEVKQ 448 NtCDPK1 ---------- ------A--- ---------- ---------- ---------- 436 LeCDPK LMEAADVDGN GSIDYIEFIT ATMHRHRLER DEHLFKAFQH FDKDHSGFIT 498 NtCDPK1 ---------- -T-------- ---------- ---------Y ---------- 486 LeCDPK RDELENAMKE YGMGDEATIK EIIAEVGTDN DGRINYEEFC AMMRSGTTQP 548 NtCDPK1 -----S---- ---------- ------D--- ---------- ------.--- 535 LeCDPK QQKLF* 554 NtCDPK1 -P---* 540

EF-Hand1

EF-Hand1

EF-Hand1

EF-Hand1

Autoinhibitorische Domäne

Katalytische Domäne

Variable Domäne LeCDPK MGGCFSKKYT QQDAN.GHRA GRR.VNQAYQ KPPQPQPERP YQPQPQQERP 48 NtCDPK1 ---------R –EG--G-Y-- T--NA--E-- ----H----- ----...... 44 LeCDPK YQPPPQPAYQ PPPQPKPQPQ PHPVPVTVQS GQPQDQMQGP HMNNILGKPF 98 NtCDPK1 ....---..- -Q---R---- A-..T--X-P X-T------- -L-------F 86 LeCDPK EEIRKLYTLG KELGRGQFGV TYYCTENSTG NPYACKSILK RKLVSKNDRE 148 NtCDPK1 -D---Q---- ---------- --H------- ---------- ----R----- 136 LeCDPK DMKREIQIMQ HLSGQPNIVE FKGAYEDRQS VHLVMELCAG GELFDRIIAR 198 NtCDPK1 ---------- ---------- --------H- ---------- ---------- 186 LeCDPK GYYSEKDAAE IIRQIVNVVN ICHFMGVMHR DLKPENFLLT SKDENAMLKA 248 NtCDPK1 ---------- -----A---- ---------- ---------- ------K--- 236 LeCDPK TDFGLSVFIE EGKVYRDIVG SAYYVAPEVL RRSYGKEADV WSAGVILYIL 298 NtCDPK1 ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- 286 LeCDPK LSGVPPFWAE TEKGIFNTIL KGEIDFQSDP WPSISNSAKD LIRKMLTQEP 348 NtCDPK1 ---------- -------A-- ---------- ---------- ---------- 336 LeCDPK RKRITSAQVL EHPWLRLGEA SDKPIDSAVL SRMKQFRAMN KLKKLALKVI 398 NtCDPK1 ---M------ ------M--- ---------- ---------- ---------- 386 LeCDPK AENLSEEEIK GLKAMFHNID TDNSGTITYE ELKSGLARLG SKLTETEVKQ 448 NtCDPK1 ---------- ------A--- ---------- ---------- ---------- 436 LeCDPK LMEAADVDGN GSIDYIEFIT ATMHRHRLER DEHLFKAFQH FDKDHSGFIT 498 NtCDPK1 ---------- -T-------- ---------- ---------Y ---------- 486 LeCDPK RDELENAMKE YGMGDEATIK EIIAEVGTDN DGRINYEEFC AMMRSGTTQP 548 NtCDPK1 -----S---- ---------- ------D--- ---------- ------.--- 535 LeCDPK QQKLF* 554 NtCDPK1 -P---* 540

EF-Hand1

EF-Hand1

EF-Hand1

EF-Hand1

Autoinhibitorische Domäne

Katalytische Domäne

Variable Domäne

Resultate

- 34 - 34

AGCATTTTCATGGAGTTTTTTCCCATGAAGTCAATGAAGAGGGTTCAAAACGTTGGCATT 61 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120 TCGTAAAAGTACCTCAAAAAAGGGTACTTCAGTTACTTCTCCCAAGTTTTGCAACCGTAA TTCTGATCTGTGGAATATCTTTTAGGTTGTTGTTTTTTTTGTAACTTGTTGAGGAATTGA 121 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180 AAGACTAGACACCTTATAGAAAATCCAACAACAAAAAAAACATTGAACAACTCCTTAACT AGTATCCAAAGTTCAATCTTGTTGAATAGACTGTAGAAATGGGTGGTTGTTTTAGCAAGA 181 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240 TCATAGGTTTCAAGTTAGAACAACTTATCTGACATCTTTACCCACCAACAAAATCGTTCT * M G G C F S K K - AGTATACCCAACAAGATGCTAATGGGCATAGGGCAGGAAGAAGAGTTAATCAAGCATATC 241 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300 TCATATGGGTTGTTCTACGATTACCCGTATCCCGTCCTTCTTCTCAATTAGTTCGTATAG Y T Q Q D A N G H R A G R R V N Q A Y Q - AAAAACCACCACAACCCCAGCCAGAAAGGCCATATCAGCCTCAGCCCCAGCAGGAAAGGC 301 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360 TTTTTGGTGGTGTTGGGGTCGGTCTTTCCGGTATAGTCGGAGTCGGGGTCGTCCTTTCCG K P P Q P Q P E R P Y Q P Q P Q Q E R P - CATATCAGCCACCGCCACAGCCAGCATATCAGCCACCGCCACAGCCAAAGCCACAACCTC 361 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420 GTATAGTCGGTGGCGGTGTCGGTCGTATAGTCGGTGGCGGTGTCGGTTTCGGTGTTGGAG Y Q P P P Q P A Y Q P P P Q P K P Q P Q - AGCCCCACCCTGTTCCTGTTACTGTGCAGTCTGGACAGCCCCAAGACCAAATGCAAGGAC 421 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480 TCGGGGTGGGACAAGGACAATGACACGTCAGACCTGTCGGGGTTCTGGTTTACGTTCCTG P H P V P V T V Q S G Q P Q D Q M Q G P - CCCATATGAATAACATATTGGGAAAGCCTTTTGAGGAAATTAGAAAGCTCTATACACTTG 481 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 540 GGGTATACTTATTGTATAACCCTTTCGGAAAACTCCTTTAATCTTTCGAGATATGTGAAC H M N N I L G K P F E E I R K L Y T L G - GGAAAGAATTGGGTAGGGGTCAGTTTGGAGTGACTTACTATTGTACTGAGAACTCAACTG 541 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 600 CCTTTCTTAACCCATCCCCAGTCAAACCTCACTGAATGATAACATGACTCTTGAGTTGAC K E L G R G Q F G V T Y Y C T E N S T G - GGAACCCTTATGCTTGCAAGTCCATACTTAAGAGGAAGCTTGTAAGCAAGAATGATAGGG 601 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 660 CCTTGGGAATACGAACGTTCAGGTATGAATTCTCCTTCGAACATTCGTTCTTACTATCCC N P Y A C K S I L K R K L V S K N D R E - AGGATATGAAGAGGGAAATTCAGATTATGCAGCATTTGAGTGGGCAGCCAAACATTGTGG 661 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 720 TCCTATACTTCTCCCTTTAAGTCTAATACGTCGTAAACTCACCCGTCGGTTTGTAACACC D M K R E I Q I M Q H L S G Q P N I V E -

PKNT1

PK52

PK33

Resultate

- 35 - 35

AATTCAAGGGTGCTTATGAAGATAGGCAGTCAGTACACCTTGTGATGGAACTTTGTGCTG 721 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 780 TTAAGTTCCCACGAATACTTCTATCCGTCAGTCATGTGGAACACTACCTTGAAACACGAC F K G A Y E D R Q S V H L V M E L C A G - GAGGAGAGTTGTTTGACAGGATTATCGCCCGTGGATATTACTCAGAGAAGGATGCTGCTG 781 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 840 CTCCTCTCAACAAACTGTCCTAATAGCGGGCACCTATAATGAGTCTCTTCCTACGACGAC G E L F D R I I A R G Y Y S E K D A A E - AGATTATTAGACAGATTGTAAATGTTGTTAACATTTGCCATTTCATGGGTGTCATGCATA 841 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 900 TCTAATAATCTGTCTAACATTTACAACAATTGTAAACGGTAAAGTACCCACAGTACGTAT I I R Q I V N V V N I C H F M G V M H R - GGGATCTCAAGCCAGAGAATTTCTTACTGACTAGTAAGGATGAAAATGCTATGTTGAAGG 901 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 960 CCCTAGAGTTCGGTCTCTTAAAGAATGACTGATCATTCCTACTTTTACGATACAACTTCC D L K P E N F L L T S K D E N A M L K A - CAACTGATTTTGGACTTTCTGTCTTCATTGAAGAAGGGAAGGTGTACCGTGATATAGTTG 961 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1020 GTTGACTAAAACCTGAAAGACAGAAGTAACTTCTTCCCTTCCACATGGCACTATATCAAC T D F G L S V F I E E G K V Y R D I V G - GTAGTGCATATTATGTTGCCCCTGAAGTGTTGCGGCGTAGTTATGGGAAGGAAGCAGATG 1021 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1080 CATCACGTATAATACAACGGGGACTTCACAACGCCGCATCAATACCCTTCCTTCGTCTAC S A Y Y V A P E V L R R S Y G K E A D V - TATGGAGTGCAGGTGTTATTTTGTATATTCTGCTCAGTGGTGTACCTCCATTTTGGGCTG 1081 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1140 ATACCTCACGTCCACAATAAAACATATAAGACGAGTCACCACATGGAGGTAAAACCCGAC W S A G V I L Y I L L S G V P P F W A E - AAACTGAAAAGGGAATATTTAATACCATACTAAAAGGAGAAATTGACTTCCAAAGTGATC 1141 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1200 TTTGACTTTTCCCTTATAAATTATGGTATGATTTTCCTCTTTAACTGAAGGTTTCACTAG T E K G I F N T I L K G E I D F Q S D P - CATGGCCATCAATATCAAATAGTGCCAAGGACCTTATTCGGAAAATGCTAACGCAGGAGC 1201 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1260 GTACCGGTAGTTATAGTTTATCACGGTTCCTGGAATAAGCCTTTTACGATTGCGTCCTCG W P S I S N S A K D L I R K M L T Q E P - CAAGGAAGAGAATTACTTCCGCGCAAGTTCTTGAACATCCATGGCTTCGACTTGGAGAAG 1261 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1320 GTTCCTTCTCTTAATGAAGGCGCGTTCAAGAACTTGTAGGTACCGAAGCTGAACCTCTTC R K R I T S A Q V L E H P W L R L G E A - CATCAGATAAGCCAATAGACAGTGCAGTCCTGTCCAGAATGAAGCAGTTCAGAGCAATGA 1321 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1380 GTAGTCTATTCGGTTATCTGTCACGTCAGGACAGGTCTTACTTCGTCAAGTCTCGTTACT S D K P I D S A V L S R M K Q F R A M N -

PK34

PK54

PK53

PK32

PKCT2

Resultate

- 36 - 36

ACAAGCTCAAAAAACTCGCATTGAAGGTCATTGCGGAAAATTTATCTGAAGAAGAAATCA 1381 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1440 TGTTCGAGTTTTTTGAGCGTAACTTCCAGTAACGCCTTTTAAATAGACTTCTTCTTTAGT K L K K L A L K V I A E N L S E E E I K - AGGGTCTGAAAGCTATGTTTCACAACATTGATACGGACAATAGTGGCACAATCACTTATG 1441 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1500 TCCCAGACTTTCGATACAAAGTGTTGTAACTATGCCTGTTATCACCGTGTTAGTGAATAC G L K A M F H N I D T D N S G T I T Y E - AAGAACTGAAGTCGGGATTGGCTCGGCTTGGATCAAAGCTAACGGAGACTGAAGTCAAGC 1501 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1560 TTCTTGACTTCAGCCCTAACCGAGCCGAACCTAGTTTCGATTGCCTCTGACTTCAGTTCG E L K S G L A R L G S K L T E T E V K Q - AACTCATGGAAGCTGCTGATGTGGATGGAAATGGATCAATTGATTACATTGAGTTTATTA 1561 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1620 TTGAGTACCTTCGACGACTACACCTACCTTTACCTAGTTAACTAATGTAACTCAAATAAT L M E A A D V D G N G S I D Y I E F I T - CTGCAACGATGCATAGACATCGGCTAGAAAGGGATGAGCATCTTTTTAAAGCTTTTCAGC 1621 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1680 GACGTTGCTACGTATCTGTAGCCGATCTTTCCCTACTCGTAGAAAAATTTCGAAAAGTCG A T M H R H R L E R D E H L F K A F Q H - ATTTTGACAAGGACCATAGTGGATTCATCACGCGAGATGAATTGGAAAACGCTATGAAGG 1681 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1740 TAAAACTGTTCCTGGTATCACCTAAGTAGTGCGCTCTACTTAACCTTTTGCGATACTTCC F D K D H S G F I T R D E L E N A M K E –

AATATGGTATGGGTGATGAGGCCACCATCAAGGAGATAATCGCAGAGGTGGGCACTGACA 1741 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1800 TTATACCATACCCACTACTCCGGTGGTAGTTCCTCTATTAGCGTCTCCACCCGTGACTGT Y G M G D E A T I K E I I A E V G T D N - ATGACGGTAGGATCAATTACGAGGAGTTCTGTGCTATGATGAGAAGTGGAACAACACAAC 1801 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1860 TACTGCCATCCTAGTTAATGCTCCTCAAGACACGATACTACTCTTCACCTTGTTGTGTTG D G R I N Y E E F C A M M R S G T T Q P - CACAACAAAAGCTTTTCTAGTGCATCGAGAGCAAATTACCCTTGCAACGAGCAGAGAACG 1861 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1920 GTGTTGTTTTCGAAAAGATCACGTAGCTCTCGTTTAATGGGAACGTTGCTCGTCTCTTGC Q Q K L F * TTCACCAGCCAGCACGATGGAGAGATGTCTATCACGAGAGGATCAGTAACTTAACATACT 1921 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 1980 AAGTGGTCGGTCGTGCTACCTCTCTACAGATAGTGCTCTCCTAGTCATTGAATTGTATGA TCCATATTTCTTCAATCCTTCAGCTATCTTCAAAAAGCACTGGAGTACATGAGACCTTTT 1981 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2040 AGGTATAAAGAAGTTAGGAAGTCGATAGAAGTTTTTCGTGACCTCATGTACTCTGGAAAA

PKCT1 LePK32

LePK52

PKGSP1

Resultate

- 37 - 37

TCGTGTAGGTTGAGTTCGCGTGGAAAATGTGTGTATAGCTAGTTAATGGTATATTTCGAG 2041 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2100 AGCACATCCAACTCAAGCGCACCTTTTACACACATATCGATCAATTACCATATAAAGCTC TTTCTTGTAATGTATTTGATCCCCCTTCGTAATTTTGTGTGGATCGCGTTGTGAAGTTGA 2101 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2160 AAAGAACATTACATAAACTAGGGGGAAGCATTAAAACACACCTAGCGCAACACTTCAACT CCTCCCGTAGAGATTATAACAAGACAATCTGAATATAGCTTTATGCTTGAAAAAAAAAAA 2161 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 2220 GGAGGGCATCTCTAATATTGTTCTGTTAGACTTATATCGAAATACGAACTTTTTTTTTTT AAAAAAAAA 2221 --------- 2229 TTTTTTTTT

Abb. 9: Sequenz der CDPK cDNA aus Lycopersicon esculentum cv. Castelmart II und die davon abgeleitete

Primärstruktur. Das ORF beginnt mit dem Startcodon für Methionin bei Position 219 und endet mit dem

Stoppcodon in Position 1880. Die zur Sequenzaufklärung verwendeten Primer sind eingezeichnet und benannt.

Auch die zur RACE-PCR eingesetzten Primersequenzen (PKGSP1 und LePK32) sind hervorgehoben.

Dargestellt sind die vereinigten Sequenzen des 5’-RACE Produktes und des Klon 25 (vgl. 3.1) der dem 3’-Ende

der cDNA entspricht. markiert das 5’-Ende des Klon 25 und markiert das 3’-Ende des RACE Produktes.

3.5 Amplifizierung und Klonierung von CDPK-L und –K

Voraussetzung für weiterführende biochemische Untersuchungen ist die Expression des

offenen Leserasters der CDPK cDNA in Bakterien. Zu diesem Zweck musste zuerst das zu

exprimierende ORF in einen geeigneten Expressionsvektor gebracht werden.

In dem von Görlach und Schmid (1996) entwickelten pGEX-G Vektor haben wir ein ideales

Klonierungssystem gefunden. Dieser Vektor erlaubt die Expression eines Proteins in Fusion

mit Glutathion-S-Transferase in E. coli. Unter der Kontrolle des tac-Promoters kann mit IPTG

die Proteinexpression induziert werden. Zudem ermöglicht die Erkennungssequenz für die

Protease Faktor Xa eine allfällige Trennung des Fusionproteins.

Die Integration der zu exprimierenden cDNA-Konstrukte in den pGEX-G Vektor erfolgte

über die Restriktionsschnittstellen StuI und KpnI in der „multiple cloning site“ (MCS). Die

schematische Darstellung (Abb. 10) gibt die Klonierungsstrategie wieder.

Resultate

- 38 - 38

Abb. 10: Schematische Darstellung des pGEX-G Expressionsvektors. Die CDPK-L/K cDNAs wurden in die

StuI/KpnI–Schnittstellen der MCS des Vektors ligiert. Das Fusionsprotein GST-CDPK wird über den tac-

Promoter induziert und kann durch Faktor Xa gespalten werden.

Das offene Leseraster der CDPK cDNA wurde für die Klonierung in den pGEX-G Vektor

mittels PCR amplifiziert. Dazu wurden die Oligonukleotide PKNT1 und PKCT1 (s. Anhang

und Abb. 9) als 5’- und 3’-Primer eingesetzt. Als Templat diente die CDPK cDNA im TOPO-

Vektor (i.e. das 5’-RACE Produkt). Auf gleiche Weise wurde mit Hilfe des Primers PKCT2

eine C-terminal um die calmodulin-ähnliche Domäne verkürzte Form der CDPK amplifiziert

und kloniert. Die so erhaltenen Klone wurden der Sequenzanalyse zugeführt, mit der

Ausgangssequenz verglichen und für identisch befunden.

Sequenzier-Fragmente von pGEX-G/CDPK-L pGEX 5' <----------------+ PKNT1 <---------------+ PK52 <------------+ PK54 <----------------+ PK53 <---------------+ pGEX 3' +--------------> 5’RACE +------------------------------------------------------------------> Produkt |------|------|------|------|------|------|------|------|------|------| 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

GSTtac mcs

pGEX-G(~4950 bp )

Faktor Xa

KpnIStuICDPK

GSTtac mcs

pGEX-G(~4950 bp )

Faktor Xa

KpnIStuICDPK

KpnIStuICDPK

Resultate

- 39 - 39

Sequenzier-Fragmente von pGEX-G/CDPK-K pGEX 5' <---------------+ PKNT1 <-------------+ PK52 <--------------+ PK54 <------------+ pGEX 3' +----------------> 5’RACE +------------------------------------------------------------------> Produkt |------|------|------|------|------|------|------|------|------|------| 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Abb. 11: Sequenzierstrategie der in den pGEX-G Vektor klonierten CDPK-L/K. Die Pfeile geben Länge sowie

Orientierung der in einzelnen Analysen ermittelten Sequenzen wieder. Sie sind im Vergleich zu der Sequenz des

als Templat eingesetzten 5’-RACE Produktes dargestellt. Alle Primer-Sequenzen sind im Anhang aufgeführt.

3.6 Expression der CDPK in E. coli

Für die Expression in Escherichia coli BL-21(DE3)-RIL Zellen wurden vier 250 ml

Flüssigkulturen bei 37°C bis zu einer optischen Dichte von ungefähr 1 angezogen und durch

Zusatz von 1 mM IPTG induziert. Daraufhin wurde von jedem Klon eine Kultur bei

Raumtemperatur und eine zweite bei 30°C gehalten. Die Expression des Fusionsproteins in

Abhängigkeit der Zeit wurde durch Entnehmen von 1 ml Aliquots in regelmässigen

Zeitabständen analysiert. Für die Kontrolle wurden Ansätze mitgeführt, die nicht durch IPTG

induziert wurden.

Die Auftrennung der zuvor mit SDS Probenpuffer aufgeschlossenen Zellen erfolgte über ein

8% SDS-Polyacrylamidgel, welches zur Sichtbarmachung der Proteine mit Coomassie

Brillant Blue angefärbt wurde. Den Expressionsverlauf in Abhängigkeit von Zeit und

Temperatur gibt Abbildung 11 wieder. Sie zeigt eine massive Akkumulation der beiden GST-

Fusionsproteine, sowohl bei 30°C als auch bei RT. Aufgrund der Primärstruktur wurde für die

GST-CDPK Konstrukte eine molekulare Masse von 71.2 kDa bzw. 86.9 kDa errechnet. Mit

einer apparenten molekularen Masse von 66 kDa zeigt sich für CDPK-K eine geringe

Abweichung vom errechneten Wert. Für beide Proteine wurde nach 5 Stunden Inkubation bei

Resultate

- 40 - 40

Raumtemperatur die stärkste Akkumulation ausgemacht. Bemerkenswert ist der grosse

prozentuale Anteil von CDPK-L/K am Gesamtprotein.

Die Expression heterologer Proteine in E. coli führt oft zur Bildung von sogenannten

"Inclusion Bodies", die eine unlösliche Form des zu exprimierenden Proteins darstellen. Um

zu klären, ob GST-CDPK-L/K in löslicher Form oder aber als "Inclusion Bodies" exprimiert

werden, wurden wie beim zuvor beschriebenen Experiment bakterielle Extrakte in

Abhängigkeit der Inkubationsdauer und Temperatur erstellt, die durch Zentrifugation in eine

lösliche und eine unlösliche Fraktion getrennt wurden. Die SDS-PAGE Analyse der

gewonnenen Fraktionen zeigte, dass der Grossteil des exprimierten Proteins unlöslich ist

(Abb. 12). In Anbetracht des sehr hohen Expressionsspiegels ist der Anteil des löslichen

Proteins für weiterführende Experimente aber immer noch ausreichend. Auch die Expression

an löslichem Protein ist nach 5 Stunden Inkubationszeit bei Raumtemperatur maximal.

Resultate

- 41 - 41

Abb. 11: SDS-PAGE Analyse der Zeitabhängigkeit der GST-CDPK Expression in E. coli BL-21(DE3)-RIL

Zellen. Für GST-CDPK-K und GST-CDPK-L wurden je zwei Ansätze bei unterschiedlichen Temperaturen

angezogen und zu den angegebenen Zeitpunkten nach der IPTG Zugabe jeweils Aliquots von 1 ml entnommen.

In den Kontrollspuren ist der Zellextrakt von nicht IPTG-induzierten E. coli Zellen gezeigt. Es wurden gleiche

Volumina Zellsuspension auf 8% SDS-PAGE Gelen analysiert. Die Massen der Markerproteine (BioRad) sind in

kDa angegeben. Sowohl das SDS-Gel der GST-CDPK-L (A), als auch jenes der GST- CDPK-K (B) sind gezeigt.

3h1h 2h 4h 5h 1h 1.5h

2h 3h Kon

trolle

3h

Kon

trolle

0h

Kon

trolle

5h

Kon

trolle

0h

Mar

ker

kDa3h1h 2h 4h 5h 1h 1.5h

2h 3h Kon

trolle

3h

Kon

trolle

0h

Kon

trolle

5h

Kon

trolle

0h

Mar

ker

kDa

200

11697

66CDPK-K

200

11697

66

4545

B

97

200116

66

45

CDPK-L

RT 30°RT 30°

97

200116

66

45

97

200116

66

45

200116

66

45

A

3h1h 2h 4h 5h 1h 1.5h

2h 3h Kon

trolle

3h

Kon

trolle

0h

Kon

trolle

5h

Kon

trolle

0h

Mar

ker


2h 3h Kon

trolle

3h

Kon

trolle

0h

Kon

trolle

5h

Kon

trolle

0h

Mar

ker


2h 3h Kon

trolle

3h

Kon

trolle

0h

Kon

trolle

5h

Kon

trolle

0h

Mar

ker


2h 3h Kon

trolle

3h

Kon

trolle

0h

Kon

trolle

5h

Kon

trolle

0h

Mar

ker

kDa

200

11697

66CDPK-K

200

11697

66

4545

B 200

11697

66CDPK-K

200

11697

66

4545

B

97

200116

66

45

CDPK-L

RT 30°RT 30°RT 30°RT 30°

97

200116

66

45

97

200116

66

45

200116

66

45

A

Resultate

- 42 - 42

Abb. 12: SDS-PAGE Analyse von löslichen sowie unlöslichen Anteilen der GST-CDPK-L/K. E. coli BL-

21(DE3)-RIL Zellen wurden bei Raumtemperatur und 30°C angezogen. Zu den angegebenen Zeitpunkten nach

Induktion mit IPTG wurden Aliquots entnommen, bakterielle Extrakte erstellt, durch Zentrifugation in lösliche

und unlösliche Fraktionen getrennt und durch SDS-PAGE analysiert. Es wurden gleiche Volumenanteile des

Gesamtextraktes aufgetragen, die denen in Abb. 11 entsprechen. Zu sehen sind die beiden mit Coomassie

Brillant Blue angefärbt Polyacrylamidgele von GST-CDPK-L (A) und GST-CDPK-K (B). Die grösste

Akkumulation an löslichem Protein wurde bei RT nach 5 Stunden erreicht.

Mar

ker

5h2h 2h 5h3h 1.5h

3h1.5h

30° RT

u nlö

slic

h

unlö

slic

h

lösl

ich

lösl

ich

kDa

A

B

97

200

66

45

116

97

200

66

45

116

CDPK-L

CDPK-K

Mar

ker

5h2h 2h 5h3h 1.5h

3h1.5h

30° RT

u nlö

slic

h

unlö

slic

h

lösl

ich

lösl

ich

kDa

A

B

97

200

66

45

11697

200

66

45

11697

200

66

45

116

200

66

45

116

97

200

66

45

116

CDPK-L

CDPK-K

Resultate

- 43 - 43

3.7 Reinigung des Fusionsproteins

Die nachfolgende Reinigung der GST-CDPKs erfolgte mittels Affinitätschromatographie.

Dank dieser Methode lassen sich Fusionsproteine in einem Schritt reinigen. Das auf eine

Glutathion Sepharose 4B Säule aufgetragene Proteingemisch wird über den GST-Teil des

Fusionsproteins an die Matrix gebunden und durch Elution mit reduziertem Glutathion von

der Säule gewaschen.

In Abbildung 13 sind im einzelnen die Reinigungsschritte, begonnen mit dem Zellextrakt bis

hin zum gereinigten Fusionsprotein, dokumentiert. Die im GST-CDPK-L Eluat zu

beobachtende Proteinbande weist eine apparente molekulare Masse von 87 kDa auf, was der

molekularen Masse von 86903 Da sehr nahe kommt. Dafür ist eine gewisse Abweichung

zwischen apparenter und errechneter Masse bei der GST-CDPK-K festzustellen. Die

erwartete Masse beträgt 71173 Da, die apparente Masse aber ist 66 kDa.

Die Proteinkonzentration in den Eluaten wurde nach Bradford (1976) bestimmt. Es ergab sich

eine Ausbeute von 9 mg GST-CDPK-L und 6.5 mg GST-CDPK-K pro 500 ml

Bakterienkultur. Es ist auffällig, dass der Anteil der in unlöslicher Form exprimierten

Fusionsproteine hier wesentlich geringer ist als in den unter 3.6 beschriebenen Vorversuchen

(vgl. Abb. 11).

Abb. 13: Reinigung der rekombinanten GST-CDPK-L (A) und GST-CDPK-K (B) aus E. coli. Je eine 0.5 Liter E.

coli Kultur für GST-CDPK-L (A) und GST-CDPK-K (B) wurden durch IPTG induziert und die Zellen wurden

nach 5 h Inkubation bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Die Zellen wurden aufgeschlossen und der Rohextrakt

(Spur 1, 1/106 des Gesamtvolumens) wurde durch Zentrifugation in eine unlösliche (Spur 2, 1/106 des

Gesamtvolumens) und eine lösliche Fraktion (Spur 3, 1/106 des Gesamtvolumens) getrennt. Der Extrakt wurde

auf eine GST-Sepharose-Säule appliziert. Der Durchlauf (1/106) ist in den Spuren 4 gezeigt. Gebundenes Protein

wurde mit red. Glutathion (10 mM) eluiert (Spur 5, 0.8 bzw. 0.4 µg). Die Abbildung zeigt mit Coomassie

Brilliant Blue gefärbte SDS-PAGE Gele. Als Molekulargewichtsmarker wurde der „broad molecular weight

standards“ (BioRad) verwendet.

B

66 kDa

1 2 3 4 5A

87 kDa

1 2 3 4 5B

66 kDa

1 2 3 4 5A

87 kDa

1 2 3 4 5

Resultate

- 44 - 44

3.8 Bindung von 45Ca 2+

Ähnlich zu den tierischen Ca2+/Calmodulin Kinasen soll die Aktivierung der CDPK über eine

Konformationsänderung der C-terminalen Domäne nach Calciumbindung erfolgen. Die von

uns klonierte und exprimierte CDPK-L weist im Gegensatz zu der verkürzten CDPK-K eine

C-terminale Domäne auf, mit den vier charakteristischen Ca2+-bindenden EF-Hand Motiven.

Für die Beweiserbringung der aufgrund der Sequenz gemachten Aussagen (vgl. 3.4 und Abb.

8) wurde die Calciumbindefähigkeit mit radioaktiv markiertem 45Ca2+ überprüft. Zu diesem

Zweck wurden die mittels SDS-PAGE aufgetrennten Proteine (0.5 µg) elektrophoretisch auf

eine Nitrocellulosemembran transferiert und in einer 45CaCl2 (1.7 mM, 1 mCi L-1) Lösung

inkubiert.

Wie die Autoradiographie (Abb. 14) bestätigt, verfügt demnach nur die GST-CDPK-L über

Calciumbindestellen, nicht so die GST-CDPK-K. Dies zeigt, dass die C-terminale, aber nicht

die katalytische Domäne, Calcium bindet und folglich alleinig für die Calciumbindefähigkeit

der CDPK und vermutlich für deren calciumabhängige Aktivierung verantwortlich ist. Die

Calciumbindefähigkeit der GST-CDPK-L bleibt auch nach Einfrieren und Lagerung bei

−20°C erhalten (Abb. 14).

Abb. 14: Bindung von 45Ca2+ durch GST-CDPK-L. Je 0.5 µg der gereinigten GST-CDPK-L (Spur 1 + 4) und

GST-CDPK-K (Spur 2 + 5) wurden über ein 8% SDS Polyacrylamidgel getrennt, elektrophoretisch auf eine

Nitrocellulosemembran übertragen und durch Amidoblack angefärbt (A). Anschliessend wurden die

membrangebundenen Proteine mit 45Ca2+ inkubiert (B). In der mittleren Spur (3) ist der

Molekulargewichtsmarker „broad molecular weight standards“ (BioRad) zu sehen. Die Proteinproben in Spuren

1 + 2 waren bei 4°C, jene in Spuren 4 + 5 bei –20°C gelagert worden.

A

B

1 2 3 4 5

11697

66

kDa

87 kDa

A

B

1 2 3 4 5

A

B

1 2 3 4 5

11697

66

kDa

87 kDa

Resultate

- 45 - 45

3.9 Autophosphorylierung der CDPK

Hier sollte die Fähigkeit der GST-CDPK zur autokatalytischen Phosphorylierung untersucht

werden. Dazu wurden die Fusionsproteine wie zuvor (3.8) durch SDS-PAGE aufgetrennt und

elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Die so immobilisierten

Proteine wurden zunächst denaturiert und dann auf der Mmebran renaturiert. Durch

Inkubieren des Blots in einem Ca2+- oder EGTA-haltigen Puffer, wurde die

Autophosphorylierungsreaktion in Gegenwart von [γ-32P]-ATP ausgeführt.

Die radioaktivmarkierten Banden in Abbildung 15B repräsentieren die autophosphorylierten

Proteine. Wie die Autoradiographie zeigt, ist nur die GST-CDPK-L zur autokatalytischen

Inkorporation radioaktiven Phosphats in der Lage. Diese Phosphat-Inkorporation wird in

Gegenwart des Calciumchelators EGTA (5 mM) vollständig inhibiert. Dieser Befund deutet

darauf hin, dass es sich bei der Autophosphorylierung um eine Ca2+-abhängige Reaktion

handelt. Wie die Calciumbindefähigkeit bleibt auch die autokatalytische Aktivität nach

Einfrieren und Lagern bei –20°C erhalten (Abb. 15).

Abb. 15: Ca2+-abhängige Autophosphorylierung der rekombinanten CDPK. Aliquots von 0.5 µg der gereinigten

GST-CDPK-L und GST-CDPK-K wurden durch Western Blot auf eine Nitrocellulosemembran transferiert und

mit [γ-32P]-ATP- haltigem Puffer in Gegenwrt von EGTA oder Ca2+ inkubiert. Das inkorporierte [32P] Phosphat

wurde autoradiographisch nachgewiesen (B). Zum Vergleich dient das in Abbildung (A) abgebildete 8% SDS

Polyacrylamidgel. Das Ladeschema sowie die Proteinmengen und Laufbedingungen waren zu jenem des

Western Blots identisch.

CDPK

-L /

4°C

CDPK

-L /

-20°

C

CDPK

-K /

4°C

CDPK

-K /

-20°

C

EGTA(5mM)

Ca 2+

(1.1mM)

A

B

87 kDa

66 kDa

87 kDa

CDPK

-L /

4°C

CDPK

-L /

-20°

C

CDPK

-K /

4°C

CDPK

-K /

-20°

C

CDPK

-L /

4°C

CDPK

-L /

-20°

C

CDPK

-K /

4°C

CDPK

-K /

-20°

C

CDPK

-L /

4°C

CDPK

-L /

-20°

C

CDPK

-K /

4°C

CDPK

-K /

-20°

C

EGTA(5mM)

Ca 2+

(1.1mM)

A

B

87 kDa

66 kDa

87 kDa

CDPK

-L /

4°C

CDPK

-L /

-20°

C

CDPK

-K /

4°C

CDPK

-K /

-20°

C

CDPK

-L /

4°C

CDPK

-L /

-20°

C

CDPK

-K /

4°C

CDPK

-K /

-20°

C

Resultate

- 46 - 46

3.10 Phosphoaminosäure Trennung

Hier sollte untersucht werden, welche von den drei in Frage kommenden Aminosäuren (Tyr,

Thr und Ser) autophosphoryliert werden. Zu diesem Zweck wurden 0.5 µg GST-CDPK-L

durch [γ-32P]-ATP Kinase Puffer autophosphoryliert und anschliessend in 6 N Salzsäure

hydrolysiert. Zusammen mit je 4 µg nichtradioaktiver Phosphoaminosäure Standards wurde

das Hydrolysat auf eine Dünnschichtplatte aufgetragen und zweidimensional aufgetrennt. Die

Platte wurde dann zum Nachweis der Phosphoaminosäurestandards mit Ninhydrin angefärbt

(Abb. 16A), als auch autoradiographiert zum Nachweis radioaktiver Aminosäuren.

Radioaktive Signale finden sich in Positionen die Phosphoserin und Phosphothreonin

zuzuordnen sind. Demnach besitzt die GST-CDPK-L eine Serin/Threonin Kinase Aktivität.

Dabei ist die Inkorporation radioaktiven Phosphats in Threonin deutlich stärker als die in

Serin. Ob dies aber die Spezifität der Kinase widerspiegelt ist unklar, da nicht alle

Phosphoaminosäuren gleich stabil sind unter den drastischen Hydrolysebedingungen.

Abb. 16: Phosphoaminosäure Analyse der autophosphorylierten GST-CDPK-L. Nach Markierung mit γ-32P

wurde das Protein in 6 N HCl hydrolysiert und das Hydrolysat mittels zweidimensionaler

Dünnschichtchromatographie aufgetrennt. Abbildung A zeigt die mit Ninhydrin angefärbten Standard-

Aminosäuren. Die durch Autoradiographie sichtbargemachten autophosphorylierten Aminosäuren sind in

Abbildung B dargestellt. Die Legende am rechten Bildrand zeigt die Position von Phosphoaminosäuren an.

P-Tyr

A B

P-Thr

P-Ser

P-Tyr

A BA B

P-Thr

P-Ser

1D

2 D

Resultate

- 47 - 47

Welche Serin- und Threoninreste der CDPK durch Autophosphorylierung modifiziert werden

konnte noch nicht ermittelt werden. Erste Versuche, diese Reste durch einen

massenspektrometrischen Vergleich tryptischer Peptide der phosphorylierten bzw.

unphosphorylierten CDPK zu identifizieren, führten bislang zu keinem Ergebnis.

3.11 Aktivität gegenüber synthetischen Peptiden

Roberts und Harmon (1992) zeigten, dass sich synthetische Peptide, welche über die Sequenz

eine K/R-X-X-Ser/Thr Sequenz verfügen, als Substrat von CDPKs eignen. Aufgrund dieses

Befundes viel unsere Substratwahl für die Aktivitätsmessungen auf das Oligopeptid Syntide-2

(PLARTLSVAGLPGKK; Phosphorylierungsmotiv ist unterstrichen).

Geeignete Reaktionsbedingungen (Enzymkonzentration, Reaktionsdauer), welche einen

linearen Reaktionsverlauf gewährleisten wurden in Vorversuchen ermittelt. Die kinetischen

Untersuchungen wurden darum in Ansätzen von 50 µl 30 nM GST-CDP-L und variierenden

Substratkonzentrationen in einem calcium- und [γ-32P]-ATP-haltigen Puffer durchgeführt.

Nach einer Reaktionszeit von 15 min wurde die Reaktion durch Entnahme von 10 µl und

Auftragen auf Phosphocellulosepapier abgestoppt. Die Papierstreifen mit dem ionisch

gebundenen Reaktionsprodukt wurden anschliessend gewaschen und im Scintillationszähler

gemessen.

Die gemessenen Aktivitäten wurden nun gegen die jeweilige Substratkonzentration

aufgetragen. Die in Abbildung 17A dargestellte Kurve zeigt den charakteristischen Verlauf

einer Michaelis Menten Sättigungskurve. Die nach Lineweaver und Burk linearisierten Daten

sind in Abbildung 17B gezeigt. In vier unabhängigen Experimenten wurden KM-Werte für

Syntide-2 von 82 bis 89 µM ermittelt. Es bleibt darauf hinzuweisen, dass sich der

Aktivitätsverlauf bei höheren Substratkonzentrationen nicht mehr durch die Michaelis-

Menten Gleichung beschreiben liess. Die Ursache dafür mag darin liegen, dass sich mit dem

Threonin in Position 5 von Syntide-2 eine zweite potentielle Phosphorylierungsstelle im

Substrat befindet. Die Frage bleibt letztlich aber ungeklärt. Zwei weitere Peptide, nämlich

Systemin (AKQSKPPSKRDPPKMQTD) und Myelin-basic Protein (QKRPSQRSKYL)

wurden als mögliche Substrate getestet, wurden aber durch GST-CDPK-L nicht

phosphoryliert.

Resultate

- 48 - 48

Abb. 17A: Aktivität von GST-CDPK-L gegenüber Syntide-2. Die Figur zeigt das repräsentative Ergebnis eines

von vier Experimenten. Jeder Punkt stellt den Mittelwert einer vierfach Bestimmungen dar.

Abb. 17B: Linearisierung der in Abb. 17A gezeigten Daten nach Lineweaver-Burk.

0

100

200

300

400

500

600

700

0 20 40 60 80 100 120

Akt

ivitä

t (cp

m)

Syntide-2 Konzentration (µM)

A

0

100

200

300

400

500

600

700

0 20 40 60 80 100 120

Akt

ivitä

t (cp

m)

Syntide-2 Konzentration (µM)

A

1/Syntide-2 (1/µM)

1/A

ktiv

ität (

1/cp

m)

B

y = 0.0709x + 0.0008R2 = 0.9912

0

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

1/Syntide-2 (1/µM)

1/A

ktiv

ität (

1/cp

m)

B

y = 0.0709x + 0.0008R2 = 0.9912

0

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06

Diskussion

- 49 -

4. Diskussion

Während viele der biochemische Mechanismen zur Signaltransduktion zwischen Pflanzen und

Tieren konserviert zu sein scheinen – so weist etwa der Wundsignalweg der Pflanzen grosse

Ähnlichkeiten auf zur Eicosanoid Signalübermittlung in Tieren (Ryan und Pearce, 1998) –

gibt es auch deutliche Unterschiede, die ihre Ursache in der unterschiedlichen Lebensart und

Antwort auf Umwelteränderungen finden mögen (Stone und Walker, 1995; Satterlee und

Sussman, 1998). In Pflanzen wie in Tieren sind einzigartige Signaltransduktionskomponenten

anzutreffen. Dazu zählt auch eine neue Klasse von Proteinkinasen, die den Namen Calcium-

abhängige (Calmodulin-unabhängige) Proteinkinase (CDPKs) trägt. Vertreter dieser Klasse

sind nur im Pflanzenreich anzutreffen (Roberts und Harmon, 1992). CDPKs sind überwiegend

Ser/Thr Proteinkinasen (Stone und Walker, 1995). Wie der Name schon verrät, wird die

Kinaseaktivität direkt durch Bindung von Calcium an eine Calmodulin-ähnliche Domäne

reguliert. Die Primärstruktur der CDPKs umfasst eine N-terminale Kinase Domäne, die über

ein autoinhibitorsches Verbindungspeptid mit der calmodulin-ähnlichen Domäne am C-

Terminus verbunden ist. Kennzeichnend für die C-terminale Domäne sind vier Ca2+-bindende

EF-Hand Motive. In Abwesenheit von Calcium kommt es zur Inhibierung der Kinaseaktivität

durch Interaktion der autoinhibitorischen (Pseudosubstrat) – mit der katalytischen Domäne

(Binder et al., 1994; Harmon et al., 1994 ; Harper et al., 1994 ; Huang et al., 1996 ; Yoo und

Harmon, 1996). Obwohl CDPKs stark konserviert sind, so sind doch bei den verschiedenen

Vertretern der CDPK Familie unterschiedliche Eigenschaften zu beobachten. So kann die

Zahl der charakteristischen Ca2+-bindenden EF-Hand Motive zwischen 1 und 4 variieren, was

wahrscheinlich eine unterschiedliche Kinetik der Enzym-Aktivität in Abhängigkeit von

Calcium zur Folge hat (Zhao et al., 1994). Ausserdem verfügen CDPKs über eine stark

variierende N-terminale Region, die oft eine Erkennungssequenz zur N-Myristoylierung

aufweist.

Seit der ersten Charakterisierung einer CDPK (Harmon et al., 1987) wurden weitere

Isoformen gefunden und die entsprechenden Gene bzw. cDNAs kloniert. Es zeigte sich, dass

CDPKs einer grossen Gen-Familie angehören: bis zu 20 verschiedene Isoformen werden in

Arabidopsis thaliana vermutet (Hrabak et al., 1996), neun bzw. drei Isoformen wurden in

Mais (Saijo et al., 1997) und Reis (Kawasaki et al., 1993; Breviario et al., 1995) identifiziert.

Strukturelle Unterschiede zwischen den Isoformen sind überwiegend in der Anzahl der EF-

Hand Motive sowie in der Länge und Zusammensetzung des N-terminalen Endes

Diskussion

- 50 -

auszumachen. Wenn auch CDPKs in letzter Zeit viel Aufmerksamkeit auf sich zogen, sind

ihre biologischen Funktionen weiterhin grösstenteils ungeklärt.

Im Rahmen dieser Arbeit konnte mittels RACE-PCR die cDNA einer CDPK aus Tomate

amplifiziert werden. Das offene Leseraster der cDNA kodiert ein Polypeptid von 553

Aminosäuren. Die vom ORF abgeleitete Aminosäuresequenz weist alle charakteristischen

Merkmale einer CDPK auf. Durch den Sequenzvergleich lassen sich die putative katalytische

Domäne sowie die C-terminale Ca2+-binde Domäne mit den vier EF-Hand Motiven aus

machen. Die Sequenzähnlichkeit mit der von Yoon et al. (1999) beschriebenen Tabak CDPK

ist dabei besonders ausgeprägt. Es zeigte sich eine Aminosäuresequenzidentität von 94%.

Zudem verfügt die CDPK ebenfalls über die Pro-Gln-reiche Sequenz am N-terminus, die ein

Charakteristikum dieser Isoform zu sein scheint (Yoon et al. 1999).

Southern-Analyse genomischer DNA mit dem 3’-untranslatierten Fragment der CDPK-cDNA

zeigte, dass die Sonde spezifisch mit nur einem Gen der CDPK Genfamilie hybridisierte.

Daher ist die Sonde geeignet, die Expression der hier interessierenden CDPK auf Northern

Blots zu untersuchen. Während sich anders als bei der Tabak CDPK (Yoon) keine Induktion

nach Verwundung nachweisen lies, ergab die Northern Blot Analyse, dass Transkripte der

CDPK nach Fusicoccin-Behandlung von Tomatenpflanzen akkumulierten. Die Menge des

Transkriptes war bereits 1.5 Stunden nach Gabe des Toxins erhöht und wies nach 4 h das

Maximum auf. Da Fusicoccin zu einer Aktivierung der H+-ATPase führt (Serrano, 1990;

Palmgren, 1991), ist die erhöhte Expression der CDPK in Antwort auf FC-Gabe

möglicherweise ein Indiz, dass die CDPK ebenfalls an der Regulation der ATPase beteiligt

ist. Es ist denkbar, dass die Zelle einer erhöhten Aktivität der H+-ATPase nach FC-

Behandlung entgegenzuwirken bestrebt ist, und daher verstärkt eine CDPK exprimiert, die in

der Lage ist, die ATPase zu inaktivieren. Damit wäre trotz der ausbleibenden

Wundinduzierbarkeit eine Rolle für die hier untersuchte CDPK in der Regulation der

Aktivität der H+-ATPase denkbar.

In weiterführenden Experimenten wird zu klären sein, ob die H+-ATPase Substrat der CDPK

ist, in vitro und in vivo. Auch wird zu untersuchen sein, ob eine mögliche Phosphorylierung

der H+-ATPase durch die CDPK eine Aktivitätsänderung zur Folge hat.

Diskussion

- 51 -

Ca2+-abhängige Autophosphorylierung

Wie das Autophosphorylierungs-Experiment (3.9) zeigte, verfügt nur die GST-CDPK-L über

autokatalytische Fähigkeiten, nicht so die um die C-terminale Domäne verkürzte GST-CDPK-

K. Dieser Befund deutet darauf hin, dass es sich bei der autokatalytischen Phosphorylierung

um eine calciumabhängige Reaktion handelt. Er steht in Einklang mit zwei unabhängigen

Studien (Harmon et al., 1994; Harper et al., 1994), die die autoinhibitorischen Eigenschaften

der Verbindungsdomäne von CDPKs untersuchten: Die Verbindungsdomäne ist in der Lage

in Abhängigkeit von Ca2+ Calmodulin wie auch die C-terminale Calmodulin-ähnliche

Domäne zu binden. Das deutet an, dass die Autoinhibierung der CDPK ähnlich wie bei

Calmodulin-abhängigen Proteinkinasen aufgehoben wird. Bei der Myosin-light-chain Kinase

sowie der Calmodulin-abhängigen Proteinkinase vom Typ II (CaMKII) bewirkt die Bindung

von Calmodulin an ihre autoinhibitorische Domäne eine Stimulierung der Kinase Aktivität

(Bagchi et al., 1992; Kemp und Pearson, 1991; Soderling, 1990). Obwohl das Phänomen der

Autophosphorylierung in zahlreichen CDPKs (Roberts and Harmon, 1992) beobachtet werden

konnte, ist bislang weitgehend unklar ob und inwieweit die Autophosphorylierung die Ca2+-

Abhängigkeit der Aktivierung oder die Kinase-Aktivität der CDPKs beeinflusst. Bogre et al.

(1988) und Saha und Singh (1995) beobachteten eine Stimulierung bzw. eine Hemmung der

Kinase-Aktivität nach Autophosphorylierung. Ähnlich wurde auch für die Phosphorylase

Kinase eine Stimulierung durch Autophosphorylierung beobachtet (King et al., 1983)

während sie bei CaMKII reversibel die Ca2+/Calmodulin-Abhängigkeit zu regulieren scheint

(Lai et al., 1993). Denkbar wäre aber auch eine Veränderung in der Interaktion mit

Effektorproteinen in Abhängigkeit vom Phosphorylierungsstatus. Eine mögliche Funktion der

Autophosphorylierung für die hier charakterisierte CDPK bleibt ungeklärt.

Diskussion

- 52 -

Membran-assozierte CDPK

Verschiedene plasmamembran-assozierte Proteine sind durch Myristat, einer C14 gesättigten

Fettsäure, modifiziert. Die kovalente Verkettung von Myristat erfolgt über eine Peptidbindung

zum Glycin der N-terminalen Domäne mit der Konsensus-Sequenz Met-Gly-x-x-x-[Ser/Thr].

Katalysiert wird die Reaktion von der N-Myristyl-Transferase und verläuft co-translationell

nach Abspaltung des Start-Methionins durch M-aminopeptidase (Russell et al., 1994).

Obgleich die Modifizierung stabil ist, ist die daraus resultierende Hydrophobizität eines

myristoylierten Peptids nicht ausreichend für eine stabile Verankerung des Proteins in der

Plasmamembran. Dies lässt vermuten, dass bei der Myristoylierung zusätzliche Mechanismen

zum Tragen kommen, die der Stabilität des plasmamembran-assozierten Proteins dienen.

Häufig ist beispielsweise eine zusätzliche Palmitoylierung an einem Cystein-Rest nahe dem

myristoylierten Glycin. Auch eine Anhäufung positiver Ladungen, die eine ionische

Wechselwirkung mit den Phospholipiden der Plasmamembran erlauben, wird beobachtet

(Yalovsky et al., 1999).

Die N-terminale Aminosäuresequenz zahlreicher CDPKs weisen die Konsensus-Sequenz für

eine N-Myristoylierung auf. Vorausgegangene Arbeiten zeigten, dass einige der

Calciumabhängigen-Proteinkinasen membran-assoziert vorliegen. So konnten zum Beispiel

CDPKs von Gerste (Klimczak und Hind, 1990) und Hafer (Schaller et al., 1992) von der

Membran isoliert und gereinigt werden. Darüber hinaus gelang die Identifizierung

membranständiger Substrate, die von CDPKs phosphoryliert werden; so das Protein Nodulin

26 (Roberts und Harmon, 1992), die Plamamembran H+-ATPase (Schaller und Sussman,

1998), TIP, ein vakuoläres Wasserkanal Protein (Johnson und Chrispeels, 1992), Chlorid-

Kanal in Vakuolen (Pei et al., 1996), sowie ein Kaliumkanal der Schliesszellen (Li et al.,

1995). Darüber hinaus ist für eine CDPK aus Cucurbita pepo L. die N-terminale

Myristoylierung in vitro nachgewiesen worden (Ellard-Ivey et al., 1999).

Die Vereinigung von CDPK und Plasmamembran könnte durch Ca2+ reguliert sein (Yuasa et

al., 1995). Recoverin, ein Ca2+-bindendes Photorezeptorprotein von Wirbeltieren, bindet

durch eine N-terminal verknüpfte Myristoyl-Gruppe an die Membran. Dabei wird der

Assoziations-Prozess von gebundenem Calcium reguliert. Es wird vermutet, dass durch Ca2+-

Bindung der hydrophobe NH2-Terminus von Recoverin exponiert wird und so mit der

Membran interagieren kann. Nach diesem Model könnte die kovalent gebundene Myristoyl-

Gruppe der CDPK an die Plasmamembran binden (Yalovsky et al., 1999).

Diskussion

- 53 -

Die abgeleitete Aminosäuresequnz der identifizierten CDPK aus Tomate weist die besagte N-

terminale Konsensus-Sequenz Met-Gly-x-x-x-[Ser/Thr] auf, wie sie bereits schon bei anderen

CDPKs beobatet worden ist. Um einen Einblick in die biologische Funktion der CDPK zu

erhalten, ist es von grossem Interesse ihre Funktionalität zu überprüfen und die Lokalisation

der CDPK zu untersuchen. Denkbar wäre etwa eine Zerstörung des Konsensus-Motivs durch

„site-directed mutagenesis“ und ein Vergleich der in vitro Myristoylierung des Wildtyp und

mutierten Proteins. Weiterhin wäre eine Bestimmung der Lokalisation in vivo und eine

Untersuchung der Ca2+-Abhängigkeit der Membranassoziation durch transiente Expression

von CDPK-GFP (green fluorescent protein)-Fusionsproteinen in Pflanzenzellen möglich.

Diese Untersuchung sollen in weiterführenden Arbeiten vorgenommen werden.

Literaturverzeichnis

- 54 -

5. LITERATURVERZEICHNIS

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Abkürzungsverzeichnis

- 61 -

6. ABKÜRZUNGEN

ATP Adenosintriphosphat

bp Basenpaare

BSA Bovine serum albumin

cDNA Complementary DNA

CDPK Calciumabhängige Proteinkinase

CDPK-K Teillänge-CDPK

CDPK-L Volllänge-CDPK

CIAP Calf intestine alkaline phosphatase

cpm Counts per minute

CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid

dATP Desoxyriboadenosintriphosphat

DC Dünnschichtchromatographie

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonucleic acid

dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat

DTT 1,4-Dithio-DL-threitol

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamin-N,N,N‘,N‘-tetraessigsäure

EGTA Ethylenglycol-Bis-(2-Aminoethyl)-Tetraessigsäure

EST Expressed sequence tag

EtBr Ethidiumbromid

FC Fusicoccin

GST Glutathion-S-Transferase

HEPES 4-(2-Hydroxymethyl)-Piperazin-1-Ethansulfonsäure

IPTG Isopropylthio-β-Galaktopyranosid

kb Kilobase

kDa Kilodalton

KM Michaeliskonstante

KPP Kaliumphosphatpuffer

LB-Medium Luria-Bertani Medium

mcs Multiple Cloning Site

Abkürzungsverzeichnis

- 62 -

MOPS 3-(N-morpholino) propansulfonsäure

mRNA Messenger RNA

OD Optische Dichte

ORF Open reading frame

PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis

PCR Polymerase chain reaction

PK Protein Kinase

PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid

PR Pathogenesis related

Pwo-Polymerase Polymerase aus Pyrococcus woesei

RACE Rapid amplification of cDNA ends

RNA Ribonucleic acid

RNAse Ribonuklease

rpm Revolutions per minute

RT Raumtemperatur

SDS Sodium dodecyl sulfate

SWRPs Systemic wound response proteins

Taq-Polymerase Polymerase aus Thermus aquaticus

TCA Trichloroacetic acid

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

v/v Volume per volume

w/v Weight per volume

X-Gal [(5-Brom-4-chlor-3-indolyl)-β-D-galactosid]

Anhang

- 63 -

7. ANHANG

7.1 Primer Sequenzen Die verwendeten Oligonukleotide sind von Microsynth, Balgach, Schweiz. PCR Primer: LePK52: 5 ´-GGGAATTCGGTATGGGTGATGAGGCCAC-3 ´ unterstrichen: eingeführte EcoRI-Schnittstelle RACE-PCR Primer: LePK32: 3 ´-GGGAATTCGCTCTCGATGCACTAGAAAAG-5 ´ PKGSP1: 3 ´-CGTGCTGGCTGGTGAACGTTCTCTGCTC-5 ´ Sequenzierprimer: PK52: 5 ´-TGGGAAAGAATTGGGTAGGG-3 ´ PK53: 5 ´-AGTGATCCATGGCCATCAAT-3 ´ PK54: 5 ´-CTTCATTGAAGAAGGGAAGG-3 ´ PK32: 3 ´-GTTCAAGAACTTGCGCGGAAG-5 ´ PK33: 3 ´-ACAATGTTTGGCTGCCCACT-5 ´ PK34: 3 ´-GACACCCATGAAATGGCAAA-5 ´

Anhang

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Pwo-PCR Primer: PKNT1: 5 ´-ATGGGTGGTTGTTTTAGCAAGAAGT-3 ´ PKCT1: 3 ´-GGGGTACCCTAGAAAAGCTTTTGTTGTGGTTG-5 ´ PKCT2: 3 ´-GGGGTACCCTATTACAGACCCTTGATTTCTTCTTCA-5 ´ unterstrichen: eingeführte KpnI-Schnittstellen fett gedruckt: Startcodon fett, kursiv: eingeführte Stoppcodons

Danksagung

Prof. Dr. N. Amrhein hat mir ermöglicht, in seiner Professur die Diplomarbeit in der Gruppe

für Biochemie und Physiologie der Pflanzen auszuführen.

Dr. Andreas Schaller hat mich in seine Arbeitsgruppe aufgenommen und mich fachlich wie

menschlich hervorragend betreut.

David Frasson, Ingar Janzik, Jochen Strassner, Werner Schmidt und Felix Hauser standen

mir, wenn immer nötig mit Rat und Tat hilfsbereit zur Seite.

Ihnen und allen nicht namentlich erwähnten Mitarbeitern der Gruppe Amrhein sei an dieser

Stelle ganz herzlich gedankt.

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Eine Calciumabhängige Proteinkinase aus - uni-hohenheim.de · Während bei den beiden erst genannten Mechanismen die Abwehrstoffe permanent einsatzbereit sind, werden sie bei letzteren