Eine neue verlässliche Nachweismethode für Pseudomonas ... · 2012 ASA Spezialenzyme GmbH Dr. Arno Cordes Dipl.-Ing. Petra Hoferichter Analytik Synthese Abbau

2012 ASA Spezialenzyme GmbH Dr. Arno Cordes

Dipl.-Ing. Petra Hoferichter

Analytik Synthese Abbau

ASA Spezialenzyme GmbH / ABS:

Eine neue verlässliche Nachweismethode für Pseudomonas aeruginosa

ASA Spezialenzyme GmbHDr. Arno Cordes / Dipl.-Ing. Petra HoferichterAm Exer 19 CD-38302 WolfenbüttelTel.: 05331 8825-30Fax: 05331 8825-32E-mail: [email protected]



Gliederung

1. Pseudomonas aeruginosa: Vorkommen, Eigenschaften, Toxizität

2. Herkömmliche Nachweismethode: Cetrimid-Agar

3. Neue spezifische Nachweismethode: Gensonde

4. Vergleichende Untersuchungen: Cetrimid-Agar versus Gensonde

5. Zusammenfassung



1. Pseudomonas aeruginosa: Vorkommen, Eigenschaften, Toxizität

Vorkommen

- feuchte Böden- Oberflächengewässern- Leitungswasser, Waschbecken, Duschen,

Toiletten, Spülmaschinen, Dialysegeräten, Medikamenten

- Lebensmittel- destilliertem Wasser- einigen Desinfektionsmitteln - Shampoos

Krankheitserreger

- für immunkompetenten (gesunde) Menschen nicht gefährlich !!

- bei Minderung der Keimabwehr durch eine Grunderkrankung (z.B. AIDS

- bei Störung der Barrierefunktion der Haut und Schleimhäute

- Mehrfachresistenzen gegenüber Antibiotika- Toxinbildner, zahlreiche Virulenzfaktoren

Infektionen

- Krankenhauskeim - ca. 10 % aller Krankenhausinfektionen- Pneumonien bei Mukoviszidose- Harnwegsinfektionen, Blutvergiftung,

Meningitis, Infektionen auf Brandwunden




Cetrimid-Agar

- enthält neben Nährstoffen Cetrimid = Quartäre Ammoniumverbindung - Hemmung viele andere Organismen einschließlich vieler anderer

Pseudonomaden-Spezies und verwandter Organismen

- fördert die Produktion von Pyocyanin sowie die Fluoreszenz von P. aeruginosa

unter UV-Licht (254 nm)

- typische P. aeruginosa Kolonien sind grünlich oder gelblich-grün

- DIN EN 12780 (im informativen Anhang, der nicht Teil der Norm war)- Empfehlung des UBA/ der BWK (Bundesgesundheitsblatt 7/2007):

� Bebrütung bei 42 °C zur Abgrenzung von P. aeruginosa von anderen Pseudomonaden, insbesondere von P. fluorescens und P. putida

Cetrimid Pyocyanin




B

Abb. 1: P. aeruginosa mit gelbgrünem Pyocyaninpigment auf Cetrimid-Agar

Abb. 2: P. aeruginosa mit fluoreszierenden Pigment unter UV-Licht auf Cetrimidagar




Theoretischer Hintergrund

-die Information zur Herstellung von Proteinen ist in den Chromosomen bzw. der DNA gespeichert

- DNA: Alphabet aus nur vier Buchstaben

- DNA-Sequenz: spezifische Reihenfolge der Buchstaben für jedes Protein (ab ca. 1.000 Buchstaben)

- alle Pseudomonas aeruginosa-Stämme

haben spezifische, identische Abschnitte auf

der DNA!

Abb. 3: DNA-Doppelstrang




Theoretischer Hintergrund

Abb. 4: DNA-Gensonde mit Fluoreszensfarbstoff




Schritt 1: Filtration der Wasserprobe auf den Membran Filter

Schritt 2: Inkubation auf Cetrimid-Agar; Überführung des kultivierten Filters.

Schritt 3: Auftropfen der Gensonde; Inkubation.

Schritt 4:Waschen und inkubieren Schritt 5:Fluoreszensmikroskop, zwei separate Fluoreszensfiltersätze




Vorgehensweise

- Anzucht von Ps. aeruginosa PAO1 (Stamm DSMZ 22644) im Schüttelkolben 20-24 h bei 30°C

- Zählen der Keimzahl mittels Thomakammer

- Herstellen einer Verdünnungsreihe bis 10 Keime/ml (Doppelbestimmung)

- Mischkultur ASA T zu den Verdünnungen pipettieren (enthält u.a. Cellulomonas-, Bacillus-,Pseudomonas-Arten; Endkonz. 1,0 x 105

Keime/ml)

- Ausstreichen der letzten sechs Verdünnungsstufen auf Cetrimid-Agar

- Gensondentest (Nachweis unter Fluoreszensmikroskop

- Fotos der grünen und roten Fluoreszens sowie der Platten




Stammlösung Ps. aeruginosa (Thomakammer): 5,3 x 108 Keime/ml

Tab. 1: Testvergleich: Cetrimid-Agar / Gensonde

Verdünnung Keimzahl [KBE/ml]

Cetrimid-Agar Gensonde

106 570 -

2 x 106 250 140

107 65 53

2 x 107 35 32

4 x 107 30 14

108 20 6



0

50

100

150

200

250

300

1 2 3 4 5

Probennummer

Kei

mza

hl [K

BE

/ml]

Cetrimid-Plattentest

Gensonde /Fluoreszenstest


Abb. 5: Testvergleich: Cetrimid-Agar / Gensonde




ASA T auf

Cetrimid-

Agar

ASA T + Ps.

aeruginosa

auf

Cetrimid-

Agar

Abb. 6:Wachstum von Ps. aeruginosa auf Cetrimid-Agar in Gegenwart anderer Bakterien




Abb. 7: Ps. aeruginosa-Zellen unter dem Fluoreszensmikroskop




Abb. 8: Wachstum verschiedener Pseudomonas-Arten auf Cetrimid-Agar

Ps. aeruginosa Ps. putida Ps. stutzeri Ps. aeruginosa

DSMZ 22644 DSMZ 33 DSMZ 5064 DSMZ 939




Abb. 9: Wachstum verschiedener Pseudomonas-Arten auf Cetrimid-Agar

Ps. aeruginosa Ps. putida Ps. stutzeri Ps. aeruginosa

DSMZ 22644 DSMZ 33 DSMZ 5064 DSMZ 939



5. Zusammenfassung

1. Der Cetrimid-Agar-Test liefert in Gegenwart anderer Bakterienarten höhere Ergebnisse als der neue Gensonden-Test

2. Die eindeutige Auswertung des Cetrimid-Agar-Tests war nur möglich, da die zugegebenen Keime bekannt waren. So gab es bei Keimen von der ASA T-Bakterienmischkultur ebenfalls gelb-grüne Kolonien auf Cetrimid-Agar

3. Verschiedene Pseudomonadenstämme sind mit dem Cetrimid-Agar-Test nicht eindeutig zu unterscheiden.

4. Die Spezifität des Gensonden-Tests ist wesentlich größer

5. Der Gensonden-Test wird nicht durch die Begleitflora ASA T oder Ps. putida beeinflusst. Die Auswertung ist eindeutig.

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