Einführendes Praktikum in die HPLC - uni-regensburg.de · wirksam sein können (2,2´-Dipyridin, Phenanthrolin), benötigen nicht nur end- gecappte RP-Phasen, sondern auch noch ein

HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2018/19 Rev 1 Seite 1

Universität RegensburgLS für Organische ChemieProf. B. König

AbteilungInstrumentelle Analytik

Einführendes Praktikum in die HPLC

WS 2018/19

Dr. R. Vasold

CH 32.1.04

Seite 2 HPLC-Praktikum Dr. Vasold Skript-WS 2018/19 Rev 1

Inhalt

I Theoretischer Teil

I.1 Einleitung ............................................................. 4

I.2 Zielsetzung .......................................................... 4

I.3 Die stationäre Phase (Festphase): hier eine RP-Phase (reversed-phase-Phase) .......................... 5

I.3.1 Richtiger Umgang mit HPLC-Säulen ................................ 7

I.4 Die mobile Phase (Eluent) .................................. 7

I.4.1 Bestandteile und Vorbereitung von mobilen Phasen ........ 7

I.4.2 Einsatzarten von mobilen Phasen .................................... 9

I.4.2.1 Die Isokratische-Elution ........................................... 10 I.4.2.2 Die Gradienten-Elution ............................................ 10

I.5 Die Pumpen ....................................................... 11

I.5.1 Anforderungen an das Pumpensystem ........................... 11

I.5.2 Beispiele für Pumpensysteme ........................................ 11

I.6 Die Injektionseinheit ......................................... 12

I.6.1 Der automatische Probengeber (Autosampler) .............. 12

I.6.2 Die manuelle Injektion ..................................................... 12

I.7 Der Detektor ....................................................... 13

I.8 Die Steuerungs- und Auswerte-Software ....... 16

I.9 Die Methode des Internen Standards (ISTD) .. 17

I.9.1 Wahl eines geeigneten Tracers ...................................... 17

I.10 Aufgaben zum Theoretischen Teil................... 19


II Experimenteller Teil

II.1 Einleitung ........................................................... 20

II.2 Durchführung ..................................................... 21

II.2.1 Vorbereitung der benötigten Lösungen ......................... 21

II.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen ......................... 21 II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrier)lösung ................ 21 II.2.1.2 Vorbereitung der Probenlösungen ......................... 22 II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen ................................. 23

II.2.2.1 Die Pumpen-Programmierung ................................. 23 II.2.2.2 Die Programmierung des Injektionsvolumens ........ 24 II.2.2.3 Die Detektor-Programmierung................................. 24 II.2.2.4 Die Programmierung des Säulenthermostaten ....... 25 II.2.2.5 Die Einstellung der Integrationsparameter .............. 25 II.2.2.6 Die Programmierung des Autosamplers .................. 26 II.2.2.7 Das Starten der Proben-Sequence ......................... 26 II.2.3 Die quantitative Auswertung ........................................... 27

II.2.3.1 Der Menüpunkt: Data-Analysis ................................ 27 II.2.3.2 Das Erstellen der Kalibriertabelle ............................ 27 II.2.3.3 Das Erstellen des quantitativen Reportes ............... 28

I.3 Aufgaben zum Experimentellen Teil ................ 29

III Auswertung Theoretischer Teil ........ 30

IV Auswertung Experimenteller Teil ..... 31


Einführendes Praktikum in die HPLC

I Theoretischer Teil

I.1 Einleitung

Die HPLC (High Performance/Pressure Liquid Chromatography) ist eine leis-

tungsfähige Methode zur analytischen, wie auch präparativen chromatographi-

schen Trennung und quantitativen Bestimmung von organischen und anorgani-

schen Verbindungen fast aller Klassen. Für fast alle Verbindungen, die man in

Lösung bringen kann, kann man in der Regel auch ein chromatographisches

Trennsystem finden, mit dem man die Verbindungen trennen und anschließend

qualitativ oder quantitativ bestimmen kann.

Aber: die HPLC ist (noch) keine Knopfdruckmethode! Ihre erfolgreiche Anwen-

dung erfordert die richtige Auswahl des chromatographischen Trennsystems,

sorgfältiges, sauberes Arbeiten und viel Fingerspitzengefühl. Man muss die Ei-

genschaften der zu trennenden Substanzen und ihr Verhalten im Trennsystem

abschätzen können, man muss Misserfolge bei der Trennung erklären können

und sich am besten durch viel Praxis einen großen Erfahrungsschatz erwerben.

I.2 Zielsetzung

Das Ziel dieses Teils des Praktikums ist es, dem Studierenden eine Einführung

in die HPLC zu geben.

In diesem Praktikum sollen u.a.

die einzelnen Bestandteile und Komponenten eines HPLC-Trennsystems

kennen gelernt werden, wie

- die stationäre Phase (in diesem Fall eine sog. RP-Phase, d.h. re-

versed phase-Phase) und ihr "Behälter", die Trennsäule.

- die mobile Phase mit Eluentenversorgung,

- Pumpen und Einspritzventil (Autosampler),

- der Detektor,

- die Steuerungs- und Auswertesoftware;

die Trennleistung eines Systems an einem einfachen Beispiel beurteilt wer-

den;


wichtige chromatographische Kenngrößen, wie Retentionszeit, Durch-

bruchszeit, Retentionsvolumen, Durchbruchsvolumen, Wanderungsge-

schwindigkeit der mobilen Phase, Kapazitätsfaktor etc. bestimmt werden.

die quantitative Bestimmung einer chemischen Substanz in verschiedenen

Realproben mit der Methode des Internen Standards durchgeführt werden.

Im folgenden werden die Bestandteile und Komponenten eines HPLC-Systems

näher beschrieben.

I.3. Die stationäre Phase (Festphase): hier eine RP-Phase (reversed-phase-Phase)

RP-Phasen gehören zu den sog. chemisch modifizierten Kieselgelphasen, von

denen eine kaum noch überschaubare Vielfalt im Angebot ist. Bei den RP-

Phasen ist die normalerweise polare, nicht chemisch modifizierte, Kieselgelo-

berfläche (normal-Phase) durch kovalent gebundene, hydrophobe Reste (z.B.

C-18-Ketten [RP-18], C-12-Ketten [RP12], C-8-Ketten [RP8] usw.) unpolar ge-

macht worden (sog. „endcapping“). Über die chemischen Einzelheiten der Her-

stellung solcher Festphasen und die verschiedenen Typen, sowie über die Ei-

genschaften (Einheitlichkeit der Korngröße, Porosität) und die Charakterisie-

rung von RP-Phasen muss man sich in geeigneten Büchern oder beim Herstel-

ler informieren. RP-Phasen haben gegenüber Normal-Phasen aber eine Reihe

von Vorteilen, die dazu geführt haben, dass heute weit über 90% aller Trennun-

gen auf RP-Phasen durchgeführt werden. Neben der öfteren Wiederverwend-

barkeit (bei guter Pflege) liegt der wesentliche Vorteil in der schnellen Einstel-

lung der Gleichgewichte beim Eluentenwechsel und der deutlich erhöhten Re-

produzierbarkeit der Retentionszeiten. Diese Eigenschaften sind vor allem beim

Gradientenbetrieb sehr wichtig.

Durch fast vollständiges „endcapping“ sind weniger Wechselwirkungen mit noch freien Silanolgruppen (SiOH) möglich. Folge: „scharfe Peakform“

Abb. 1.3.a Schematische Darstellung eines relativ gut “endgecappten“ C18-Materials.

Si Si Si Si Si Si Si Si Si

Si

NCH

3

CH3

N

Cl

C18-Ketten

Si H O

Si H O

Si

H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si H O

Si

Probensubstanz Beispiel einer Probensubstanz

Silicagel


Im Versuch wird eine RP-18- Phase vom Typ LUNA RP18 der Firma Pheno-

menex verwendet (also eine Phase mit einem entsprechend „hydrophobem

Schild“ auf der Kieselgelbasis).

Bei Kieselgeloberflächen, bei denen nicht alle ursprünglich vorhandenen Sila-

nolgruppen mit unpolaren Ketten modifiziert wurden, liegt ein je nach Hersteller

unterschiedlicher Anteil der Silanolgruppen noch unmodifiziert vor. Wegen der

schwach sauren Eigenschaften der Silanolgruppen verleiht dieser Restanteil

den diesen nicht vollständig „endgecappten" RP-Phasen gewisse „Ionenaus-

tauscheigenschaften“.

Für ungeladene Substanzen hat das meist keine nachteiligen Folgen. Geladene

Substanzen, bzw. Substanzen, die in Abhängigkeit vom pH-Wert ihren La-

dungszustand ändern, z.B. saure Substanzen (z.B. Phenole) und besonders

basische Substanzen (Amine, N-Heterocyclen) neigen jedoch auf solchen "nicht

vollständig endgecappten“ RP-Phasen zur Bandenverbreiterung und zum Tai-

ling. Bei manchen Aminen kann dieser unerwünschte Effekt so stark sein, dass

man keine ausreichenden Trennungen erzielen kann. Deshalb gibt es heute

viele spezielle RP-Phasen für basische Verbindungen. Bei diesen speziellen

RP-Phasen werden auch die restlichen Silanolgruppen noch meist mit kürzeren

organischen Resten (z.B. C12) möglichst vollständig modifiziert.

Verbindung interagiert mit noch „freien Silanolgruppen“ Folge: „Bandenverbreiterung“ und „Peaktailing“

Abb. 1.3.b Schematische Darstellung eines relativ schlecht „endgecappten“

C18-Materials.

Viele (heterocyclische) Diamine und andere Substanzen, die als Chelatliganden

wirksam sein können (2,2´-Dipyridin, Phenanthrolin), benötigen nicht nur end-

gecappte RP-Phasen, sondern auch noch ein Gerüst-Kieselgel, das völlig frei

ist von Schwermetallverunreinigungen (z.B. Merck: Purospher).

Si Si Si Si Si Si Si Si Si

Si

N C H 3 C H 3

N

Cl

C18-Ketten

Si H

O

Si H

O

Si

H

O

Si H

O

Si HO

Si

H

O

Si H

O

Si H

O

Si H

O

Si H

O

Si

H O

Si

H O

Si H

O

Si H

O

Si H

O

Si

H

O

H

OH

O

H

OH

O

Silicagel


I.3.1 Richtiger Umgang mit HPLC-Säulen

Hauptursachen für die Schädigung von RP-Phasen und anderen Festphasen

sind:

1. Verunreinigungen und Verstopfungen am Säulenkopf durch irre-

versibel retardiertes (Proben)-Material oder unlösliche Bestandteile (Staub,

Pumpenabrieb) in Probe oder Eluent.

Abhilfe: Bessere Eluenten- und Probenvorbereitung (Filtration des

Eluenten und der Probe); Verwendung von guard-columns

(=Vorsäulen); Säulenspülung mit geeignetem Eluenten.

2. Schrumpfung der Festphase bei Anwendung extremer pH-Werte.

Abhilfe: Verwendung von "gepufferten Eluenten"

3. Falsche Säulenaufbewahrung.

Wegen Pilzwachstum (Pufferlösungen !) und der Gefahr des Auskristallisie-

rens von Puffersalzen, sollen Säulen niemals in 100% Wasser oder gar in

Pufferlösungen aufbewahrt werden. RP-Pasen müssen nach Verwendung

von Puffern gut mit Wasser und anschließend mit Methanol od. Acetonitril

gespült werden. Als Eluent für eine längere Aufbewahrung empfiehlt sich

eine Mischung aus 20% H2O und 80% Acetonitril.

I.4 Die mobile Phase (Eluent)

I.4.1 Bestandteile und Vorbereitung von mobilen Phasen

In der Normal-Phasen-Chromatographie besteht die mobile Phase aus einem

unpolaren organischen Lösungsmittel(gemisch), dem nur in bestimmten Fäl-

len (welchen?) etwas polares Lösungsmittel oder gar Wasser (in geringen Men-

gen) zugesetzt wird. Die Elutionskraft oder „Stärke“ der verschiedenen Eluenten

wurde empirisch bestimmt und ist für jeden Eluenten als Zahlenwert festgehal-

ten. Als Symbol dafür verwendet man E0 oder ε0. Die so gefundene Reihenfolge

von schwachen zu mittleren bis hin zu starken Eluenten nennt man die Eluo-

trope Reihe. Es zeigt sich, dass darin die Eluenten nach ihrer Polarität geord-


net sind. Ein (in der NP-Adsorptionschromatographie) stärkerer Eluent ist immer

polarer, ein schwächerer unpolar:

Eluent Polarität [E0] UV-Grenze

[nm]

NP

-Chr

omat

ogra

phie

* n-Hexan 0,00 190

Toluol 0,29 285

Chloroform 0,40 245

Dichlormethan 0,42 230

Aceton 0,56 330

Essigsäureethylester 0,58 260

RP

-Chr

omat

ogra

phie

* Dimethylsulfoxid 0,62 270

Diethylamin 0,63 275

Acetonitril 0,65 190

Ethanol 0,88 210

Methanol 0,95 205

Wasser >1,11 <190 * im angegebenen Chromatographiemodus (RP/NP) häufig, aber nicht aus-

schließlich verwendet. Wichtige Voraussetzung ist die Mischbarkeit der Eluenten

Tab. 1.4.1 Eluotrope Reihe (Auszug) (Lit.: Meyer V.R. „Praxis der

Hochleistungsflüssigchromatographie“ Salle+Sauerländer

7, S. 110ff). Die angegebenen E0-Werte gelten streng ge-

nommen für Aluminiumoxid als Adsorbens, doch sind sie

für Silicagel nur um einen konstanten Faktor verschieden:

E0 (SiO2) = 0,77 E0 (Al2O3). Die Lösungsmittelreihenfolge

ändert sich also nicht, wenn man von Aluminiumoxid auf

Silicagel übergeht. In der linken Spalte ist angegeben, bei

welcher Chromatographieart die Eluenten häufiger Ver-

wendung finden.

In der RP-Chromatographie ist es umgekehrt: Dort besteht die mobile Phase

in der Mehrzahl der Fälle aus einem überwiegend polaren Eluenten.

Stark polare Eluenten, (z.B. Wasser) verzögern die Elution. Beimengungen von

dazu schwächer polaren Eluenten (z.B. MeOH, Acetonitril) beschleunigen sie.

Bei Standardtrennungen ist meist Acetonitril im Vergleich zu Methanol die bes-

sere Wahl (warum ?). Das verwendete Wasser muss stets sehr rein sein (Milli-

pore-Qualität) und darf insbesondere keine organischen Verunreinigungen ent-

halten (deshalb niemals Wasser verwenden, das lediglich mit Ionenaustau-

schern entionisiert wurde).


Weiterhin sollten die Eluenten (besonders das Wasser) keine gelösten Gase

enthalten (warum?). Deshalb müssen die Eluenten vor Gebrauch sorgfältig ent-

gast werden. Für diese Zwecke sind verschiedene Verfahren im Gebrauch: Va-

kuumentgasung, Membranfiltration, Ultraschall, Heliumspülung (Helium ist in

Wasser unlöslich und transportiert die in Wasser gelösten Gase, die mit Helium

mischbar sind, ab).

Ganz wichtig ist auch, dass die Eluenten (ebenso wie die Probenlösung) frei

von Partikeln (z.B. Staub, ungelöste Substanzrückstände etc.) sind, die die sehr

feinen Einlassfritten (2 m) der Trennsäule verstopfen könnten oder gar die

Pumpenköpfe schädigen könnten. Eine (Membran)-Filtration der Eluenten oder

der Gebrauch von Einlassfiltern ist deshalb unerlässlich. Besondere Vorsicht ist

bei der Verwendung von wässerigen Salzlösungen (Puffern) angeraten. Es

muss sicher gestellt sein, dass es nicht zu Ausfällungen kommt, wenn die wäs-

serige Pufferlösung mit einem organischen Lösungsmittel vermischt wird. Nie-

mals darf ein Eluentengemisch, das eine wässerige Salzlösung enthält, nach

Beendigung der Trennung im HPLC-System verbleiben. Totalschäden an Pum-

pen, Säulen und Detektorzellen sind vorprogrammiert, wenn darin Salze im

Laufe der Zeit auskristallisieren!

I.4.2 Einsatzarten von mobilen Phasen

Im Versuch werden Gemische aus Wasser und Acetonitril verwendet mit einem

Volumenanteil Acetonitril zwischen 0,10 und 0,95 (0,10 < < 0,95). Dies ent-

spricht einer Eluentenzusammensetzung von 10% ACN bis 95% ACN gegen

H2O im Verlauf der Trennung.

Anmerkung:

Man muss sich leider damit abfinden, dass in fast allen HPLC-Büchern und Ar-

beitsanweisungen die Zusammensetzung der mobilen Phase nicht so wie oben

unter Verwendung der definierten Gehaltsgröße σ "Volumenanteil", sondern oft

nicht ganz eindeutig angegeben wird. So heißt es z.B. oft: "Methanol/Wasser

50:50" oder "50% Wasser in Methanol" etc. Man kann dann aber davon ausge-

hen, dass damit der Volumenanteil gemeint ist, weil dies der gängigen Arbeits-

weise entspricht.

Beim Einsatz der mobilen Phasen unterscheidet man generell zwischen zwei

Arbeitsweisen: Der isokratischen Elution und der sog. Gradientenelution.


I.4.2.1 Die Isokratische-Elution

D.h. die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der Tren-

nung nicht. Die Eluenten werden im benötigten Verhältnis vorgemischt und ent-

gast und können dann von z.B. nur einer Pumpe gefördert werden.

- Vorteil: es wird nur eine Pumpe benötigt;

- Nachteil: mangelnde Flexibilität, denn bei wechselnden Trennprob-

lemen oder in der Erprobungsphase eines neuen Eluenten-

systems muss der Vorratsbehälter der mobilen Pase häufig

gewechselt werden. Erfahrung oder langwierige Erprobun-

gen sind nötig, um ein geeignetes isokratisches Eluenten-

gemisch zu optimieren (Zeitaufwendig !!).

I.4.2.2 Die Gradienten-Elution

D.h. die Zusammensetzung der mobilen Phase ändert sich während der Tren-

nung! Man spricht von binären Gradienten, wenn sich die mobile Phase aus

zwei, von ternären bzw. quaternären Gradienten, wenn sie sich aus drei, bzw.

vier Bestandteilen zusammensetzt. Der zeitliche Verlauf der Änderung der Zu-

sammensetzung kann mit Hilfe der Steuerungssoftware programmiert werden.

Auf diese Weise sind viele Arten von Gradientenverläufen (linear, konvex, kon-

kav, stufenförmig) möglich. Meist jedoch sind lineare Gradienten völlig ausrei-

chend.

- Vorteil: hohe Flexibilität; Bewältigung von schwierigen Trennprob-

lemen, die isokratisch nicht zu lösen sind; Verkürzung von

Analysenzeiten bei stark retardierten Substanzen;

- Nachteil: es werden oft mehrere Pumpen (Hochdruckgradient) bzw.

komplexere Pumpensysteme benötigt. Erfahrungen im

Gradientendesign sind nötig. So muss man z.B. wissen,

dass Methanol-Wasser-Gemische zur Bildung von Gradien-

ten nicht optimal sind, weil die Mischungsreaktion stark

exotherm ist, sowie eine Volumenverminderung und eine

Viskositätserhöhung (Druckerhöhung!) eintritt. Gemische

aus Acetonitril und Wasser sind in dieser Hinsicht viel un-

problematischer.


Einlaßventil

Auslaßventil

Kolben

Hydraulik-Flüssigkeit

Membran

Kolben

I.5 Die Pumpen

I.5.1 Anforderungen an das Pumpensystem

Über die raffinierten technischen Einzelheiten von Aufbau und Funktion der

Pumpen muss man sich in geeigneten Büchern informieren. Als die zwei wich-

tigsten Anforderungen, die an die Pumpen gestellt werden müssen, seien ge-

nannt:

Es muss eine konstante und reproduzierbare Fließgeschwindigkeit ge-

währleistet werden.

Von der Fließgeschwindigkeit sind die Retentionszeiten der Peaks und

damit die Reproduzierbarkeit der Messung abhängig.

Es muss ein möglichst pulsationsfreier Fluss gewährleistet werden, weil

sonst die Grundlinie des Detektors zu unruhig wird, und Druckstöße die

stationäre Phase schädigen können.

Die van Deemter-Gleichung für die Flüssigkeitschromatographie (LC) zeigt,

dass sich die Bodenzahl einer Trennsäule und damit die Güte einer Trennung

durch die Steigerung der Fließgeschwindigkeit über einen bestimmten Wert

hinaus nicht mehr wesentlich optimieren lässt. Abgesehen davon, würde der

Rückdruck bei zu hohen Fließgeschwindigkeiten und sehr kleinen Korngrößen

der stationären Phase (< 3 m) auch viel zu hoch werden.

I.5.2 Beispiele für Pumpensysteme

Abb. 1.5.2.a Kolbenpumpe Abb. 1.5.2.b Diaphragmapumpe


I.6 Die Injektionseinheit

I.6.1 Der automatische Probengeber (Auto-sampler)

Moderne HPLC-Anlagen sind fast ausschließlich mit einer automatischen Pro-

bengeber-Einheit ausgestattet. Die Vorteile liegen nicht nur in einer deutlichen

Zeitersparnis beim Abarbeiten größerer Probenmengen, sondern auch in der

außerordentlichen Reproduzierbarkeit und Präzision des Einspritzvorganges.

I.6.2 Die manuelle Injektion

Das Probeninjektionsventil bei der manuellen Injektion ist ein wichtiges, emp-

findliches und verschmutzungsanfälliges Einzelteil einer HPLC-Anlage. In Ver-

bindung mit einer Probenschleife gestattet es die Injektion eines definierten

Probenvolumens in ein HPLC-System, das unter hohem Druck steht. Über die

technischen Einzelheiten von Aufbau und Funktionsweise muss man sich in

geeigneten Büchern informieren. Sollte man einmal in Ermangelung eines Au-

tosamplers auf die Benutzung eines manuellen Injektionsventils angewiesen

sein, seien hier einige wichtige Bedienungshinweise zur geflissentlichen Beach-

tung genannt:

Niemals das Ventil ohne Lösungsmittelfluss betätigen.

Vor jedem Einspritzen einer Probe muss die Probenschleife gespült werden.

Das kann per Hand mit einer Spritze geschehen. Zum Einspritzen der Probe

dürfen nur spezielle Mikroliterspritzen mit stumpfen Endungen verwendet

werden, damit die Dichtungen im Inneren des Ventils nicht beschädigt wer-

den.

Der Umschaltvorgang des Ventils von der "load"- auf die "inject"-Stellung,

der ja bei laufenden Pumpen erfolgt, muss zügig und schnell erfolgen, da es

sonst zu einem Druckstoß im System kommen kann, der die Säulenpackung

schädigen kann oder eventuell die Sicherheitsabschaltung des gesamten

Systems auslöst.

Das Probeninjektionsventil kann zu einer Quelle von Verunreinigungen wer-

den, wenn es nicht regelmäßig gereinigt und gepflegt wird.


I.7 Der Detektor

Ohne Detektor ist jedes Chromatographiesystem blind. Es gibt eine Vielzahl

von Detektionsverfahren. Diejenigen, die auf der Absorption von UV- oder

sichtbarer Strahlung beruhen, haben einen großen Einsatzbereich. Viele orga-

nische und anorganische Moleküle (Aromaten, Carbonylverbindungen, etc.)

absorbieren im mittleren UV-Bereich (250nm - 300nm) mit ausreichend großen

Absorptionskoeffizienten (Lambert-Beersches-Gesetz). Wenn das nicht aus-

reicht, kann man auch in das kurzwellige UV (190nm - 250nm) wechseln. Dann

allerdings ist eine etwaige Eigenabsorption der Eluenten zu berücksichtigen.

Abb. 1.7.a: Schematische Darstellung eines einfachen UV/VIS-Detektors (z.B.

sog. VWD- oder MWD-Detektor) mit einstellbaren Einzel-

Wellenlängen (nicht kontinuierlich).

Anstelle eines einfachen UV/VIS-Detektors (Abb. 1.7.a), bei dem man meist nur

eine bestimmte Wellenlänge auswählen kann, ist es besser, ein spezielles,

computerunterstütztes Spektrophotometer, den Photodioden-Array-Detektor

(DAD) mit sog. „inverser Optik“ zu verwenden (siehe Abb. 1.7.b). Die Be-

zeichnung „inverse Optik“ bedeutet, dass hier die Messzelle nicht nach, son-

dern vor dem spektralen Gitter angebracht ist. Das gesamte Licht fällt so durch

die Flusszelle und wird erst danach am Gitter spektral aufgeteilt. Der spektrale

Lichtfächer fällt dann auf ein Dioden-Array. Dies ist ein Chip mit zahlreichen

(100 - 1000) lichtempfindlichen Photodioden. Diese Dioden werden kontinuier-

lich in sehr kurzer Zeit (ca. 50 ms) elektronisch ausgelesen und daraus eine

Vielzahl von UV-Spektrum generiert. Der DAD-Detektor ist somit in der Lage,

während einer chromatographischen Trennung die kompletten UV-Spektren

aller Peaks zu registrieren und abzuspeichern. Dies ist besonders wichtig zur

Peakidentifikation, zur Reinheitskontrolle (Peak-Purity-Check) und zur Ermitt-

lung optimaler Detektionswellenlängen bei der Untersuchung unbekannter Pro-

ben.

Spalt

Deuteriumlampe

Gitter

Flußzelle

PhotozelleLampe (UV/VIS)


Deuteriumlampe

Gitter

Spalt Photodioden

Flußzelle

Abb. 1.7.b: Schematische Darstellung eines Diodenarray-Detektors

(DAD-Detektor)

Weitere häufig eingesetzte HPLC Detektoren sind: HPLC-Detektoren Anwendung Nachweisgrenze Linearität

UV/VIS bzw. DAD (Dioden-Array-Det.)

selektiv für UV/VIS-aktive Analyte (ca. 190-950 nm)

ca. 0,3 ng/mL ca. 1 x 104

RI (Refractive-Index-Det.) Analyte mit unterschiedlichem Brechungsindex zum Eluenten (temperaturabhängig, keine Gradientenelution möglich, wenig empfindlich)

ca. 0,7 g/mL ca. 3 x 103

FLD (Fluorescence-Det.)

selektiv nur für fluoreszierende Analyte

ca. 0,2 pg/mL (!) ca. 103 -

104 ECD (Electro-Chemical-Det.)

selektiv nur für oxidierbare bzw. reduzierbare Analyte

ca. 1,0 pg/mL (!) -

CD (Conductivity-Det.)

Ionen a) ca. 105

ELSD (Evaporative-Light Scattering-Det.)

speziell geignet für Substanzen, die im UV/VIS nicht absorbieren z.B. Zucker, Salze (Gradientenelution möglich)

- -

MSD (Mass-Selective-Det.) für alle im MS ionisierbaren Analyte

- -

a) kann bis zu ca. 0,2% Unterschied in der Leitfähigkeit nachweisen.

Tab. 1.7 Übersicht über häufig eingesetzte HPLC-Detektoren:

Lampe (UV/VIS)


I.8 Die Steuerungs- und Auswerte-Software

Bei modernen HPLC-Anlagen werden alle zugehörigen Einzelgeräte (Pro-

benaufgabe, Pumpen, Säulenthermostat, Ventile, Detektoren) von einem

Rechner aus gesteuert. Die dafür nötige Software übernimmt auch die Dar-

stellung, Speicherung und Verwaltung der Chromatographie-Daten. Nach

Aufnahme des Chromatogramms muss die Software natürlich auch die Be-

arbeitung und Auswertung des Chromatogramms übernehmen und einen

passenden Ausdruck der Ergebnisse liefern. Bei älteren HPLC-Anlagen, bei

denen die Steuerung der Geräte nicht zentral von einem PC aus erfolgt,

übernimmt ein separater Integrator die Aufzeichnung und Auswertung der

Chromatogramme (heute nicht mehr gebräuchlich).

Bei quantitativen Analysen ist die Ermittlung der Peakflächen (Integration)

wohl die wichtigste Aufgabe der Auswerte-Software. Die beste Vorausset-

zung zur exakten Ermittlung der Peakflächen liegt vor, wenn die einzelnen

Peaks völlig getrennt sind (Grundlinientrennung), und wenn die Grundlinie

konstant verläuft. Zwar kann eine gute Integrationssoftware auch überlap-

pende oder aufsitzende Peaks integrieren und auch eine eventuelle Drift der

Grundlinie berücksichtigen, jedoch ist es immer angebracht, zunächst die

Trennung zu optimieren oder die Probenvorbereitung zu verbessern um

Störpeaks zu beseitigen.

Für die Integration der einzelnen Peaks benötigt die Software die sog. Peak-

verarbeitungsparameter, die entweder vom Anwender gesetzt, oder aus den

Chromatographie-Rohdaten automatisch ermittelt werden. Die beiden wich-

tigsten Peakverarbeitungsparameter sind:

- Peak-Width: legt die minimale Breite (in Sekunden) eines Peaks fest, der

ausgewertet werden soll. Optimaler Wert: Halbwertsbreite des schmalsten

interessierenden Peaks.

- Slope-Sensitivity: legt Beginn und Ende eines Peaks fest (Peakerken-

nungsempfindlichkeit). Wenn die ermittelte positive (Peakbeginn) bzw. ne-

gative Steigung (Peakende) einen vorgegebenen, aus den Schwankungen

der Grundlinie ermittelten Wert erreicht kommt es zur Peakerkennung

durch die Software.


I.9 Die Methode des Internen Standards (ISTD)

In der HPLC ist es von größter Wichtigkeit, dass die vom Detektor erhaltenen

Daten quantitativ ausgewertet werden können und somit unter geeigneten Be-

dingungen eine quantitative Bestimmung der untersuchten Komponenten erlau-

ben. Als Meßgröße dient in der Regel die Fläche unter einem Peak. Bei exakt

symmetrischen (Gauß-) Peaks kann auch die Peakhöhe als Maß herangezogen

werden. Peakfläche bzw. Peakhöhe sind dann proportional zur Menge der zu

analysierenden Substanz. Das Detektorsignal ist jedoch außer von der Kon-

zentration des Analyten auch stark von dessen Extinktionskoeffizienten abhän-

gig. So können zwei Substanzen in einer Lösung durchaus die gleiche Konzent-

ration besitzen, aber in der Messung eine gänzlich andere Fläche (oder

Peakhöhe) ergeben. Aus diesem Grund sollte bei quantitativen Analysen vor-

zugsweise mit einem Internen Standard gearbeitet werden oder ein vergleich-

barer Korrekturfaktor verwendet werden.

I.9.1 Wahl eines geeigneten Tracers

Beim Verfahren des Internen Standards gibt man sowohl der zu untersuchen-

den Probenlösung, als auch jeder Stammlösung eine weitere Komponente, den

sog. Internen Standard (Tracer) zu. Eine Substanz, die als interner Standard

eingesetzt werden soll, muss aber unbedingt einige wichtige Bedingungen erfül-

len:

sie darf nicht von vorneherein in der zu untersuchenden Realprobe vor-

kommen.

sie muss chemisch stabil bzw. inert sein gegenüber den restlichen Kom-

ponenten in der Probe, sowie gegenüber dem Packungsmaterial der

Säule und der verwendeten mobilen Phase.

sie sollte in möglichst hoher Reinheit vorliegen.

sie sollte über möglichst ähnliche physikalisch-chemische Eigenschaften

(Retentionszeit, Detektorverhalten, Löslichkeit, etc.) wie die zu bestim-

mende Substanz verfügen.

sie sollte von allen in der Realprobe enthaltenen Substanzen unter den

chromatographischen Bedingungen gut getrennt werden und in ver-

gleichbarer Konzentration zugesetzt werden.

Nach der HPLC-Analyse einer Eichlösung, welche die Stammlösung mit den

genauen Einwaagen der zu bestimmenden Probenkomponenten, die als reine

Referenzsubstanzen verfügbar sein müssen, und den internen Standard in ähn-


lichen Konzentrationsverhältnissen wie in der Realprobe enthält, lässt sich für

jede Substanz i ein sog. Kalibrierfaktor KFi aus den Response-Faktoren fTr und

fi nach folgenden Zusammenhängen ermitteln:

fi = i

i

m

a

fi = Response-Faktor der

Komponente i

ai = Fläche der Substanz i

mi = Masse der Komponente i

KFi = i

Tr

f

f = K

iKTr

KTr

Ki

am

am

KFi = Kalibrierfaktor der

Komponente i

fTr = Response-Faktor

desTracers

miK = Masse der Komponente i in

der Kalibrierlösung (K)

mTrK = Masse des Tracers in der

Kalibrierlösung (K)

aTrK = Fläche des Tracers in der

Kalibrierlösung (K)

aiK = Fläche der Komponente i in

der Kalibrierlösung (K)

m xi = KFi

xTr

xi

a

amTr

m xi = Masse der Komponente i in

der Probenlösung (X)

m xTr = Masse des Tracers in der

Probenlösung (X)

a xi = Fläche der Komponente i

a xTr = Fläche des Tracers

Da jeder Probenlösung der interne Standard in exakt gleicher Menge und glei-

cher Konzentration (Masse mTr) zugesetzt wird, lassen sich mit Hilfe der aus der

Eichung ermittelten KF-Werte die Massen der gesuchten Komponenten nach

Formel (3) ermitteln.

(1)

(2)

(3)


I.10 Aufgaben zum Theoretischen Teil

1.) In welche zwei grundlegenden Typen von Phasensystemen kann die Ad-

sorptionschromatographie unterschieden werden?

2.) Erklären sie den Begriff „endcapping“.

3.) Welche Effekte hinsichtlich der Peakform können auftreten, wenn z.B.

stark basische Substanzen (Amine, Phenole) auf schlecht endgecappten

RP-Phasen chromatographiert werden (2 Beispiele aufzeichnen )?

4.) Nennen Sie mindestens drei Vorteile, die RP-Phasen im Vergleich zu

NP-Phasen aufweisen.

5.) Was versteht man unter der Eluotropen Reihe, wie wurde sie bestimmt,

und welchem Ordnungsprinzip folgt sie?

6.) Welcher Zusammenhang besteht zwischen Eo (Al2O3) und Eo (SiO2) ?

7.) Zwischen welchen beiden grundlegenden Arbeitsweisen wird beim Ein-

satz der mobilen Phase während einer chromatographischen Trennung

unterschieden und wie nennt man diese Formen der Elution?

8.) Erläutern sie in diesem Zusammenhang die Begriffe „binärer“, „ternärer“

und „quaternärer“ Gradient.

9.) Nennen sie zwei Gründe, warum Eluenten entgast werden sollten.

10.) Nennen sie vier mögliche Verfahren der Eluentenentgasung.

11.) Wie ist der Kalibrierfaktor KFi einer Komponente i definiert ?

12.) Nennen sie mindestens vier Eigenschaften, die ein geeigneter Tracer

aufweisen muss.

13.) Nennen sie einen wesentlichen Unterschied zwischen dem Bauprinzip

eines herkömmlichen UV/VIS-Detektors und eines DAD-Detektors. Erläu-

tern sie in diesem Zusammenhang den Ausdruck: „Inverse Optik“.

14.) Nennen sie neben UV/VIS vier weitere Arten von HPLC-Detektoren.


II Experimenteller Teil

HPLC-Bestimmung von Coffein in Getränken (Kaffee und Energy-Drinks) mit der Methode des Internen Standards

II.1 Einleitung

Coffein gehört als pharmazeutischer Wirkstoff in die große Gruppe der Psycho-

pharmaka und in die Untergruppe der Psychoanaleptika. Analeptika sind Sub-

stanzen, die das Zentralnervensystem stimulieren und in hohen Dosen Krämpfe

auslösen. Psychoanaleptika sind unspezifisch wirksame Substanzen, die vor-

wiegend die "Psyche" anregen, aber auch noch andere, z.B. bei Coffein diureti-

sche, Wirkungen zeigen. Eine tägliche Coffeinzufuhr hinterläßt in der Regel kei-

ne bleibenden organische Schädigungen.

Chemisch gesehen ist Coffein (1,3,7-

Trimethylxanthin), genau wie Theophyllin und Theo-

bromin als Xanthinderivat eine Purinbase. Alle drei

genannten Xanthinderivate kommen in Teeblättern

vor, Theobromin auch in der Kakaobohne und in der

Colanuß. In der Kaffeebohne und auch in Teeblät-

tern ist Coffein gegenüber den beiden anderen Xan-

thinderivaten der Hauptbestandteil.

N

NN

N

O

O

CH3

CH3

CH3

Auch in vielen käuflichen Limonaden ist Coffein in bisher erlaubten Konzentrati-

onen von 85 - 250 mg/L enthalten. Die sog. Energy-Drinks dürfen nach speziel-

len Genehmigungen der Lebensmittelbehörden Coffein in höherer Konzentrati-

on (ca. 350 mg/L) und außerdem noch weitere Inhaltsstoffe, wie Taurin (2-

Amino-ethansulfonsäure), Glucuronolacton, Inosit und sehr viel Zucker enthal-

ten. Diese Inhaltsstoffe sollen angeblich zur höheren "Leistungsfähigkeit" ver-

helfen (Werbung: "pure Energie für Kopf und Körper"). Während die Wirksam-

keit von Coffein als Anregungsmittel nicht umstritten ist (250 mL Energy Drink

hat die Wirkung einer starken Tasse Bohnenkaffee), ist die Wirksamkeit der

übrigen Bestandteile eher spekulativ.

Coffein


II.2 Durchführung

II.2.1 Vorbereitung der benötigten Lösungen

II.2.1.1 Vorbereitung der Stammlösungen

Coffein-Stammlösung (Lösung A):

10 mg Coffein (27600 Fluka ≥ 99% HPLC) werden in ein Zinnwägeschiffchen

(Typ Z 276 Tin Boats, 4x4x11 mm, Art Nr, 22137418, Fa. Elementar Analysen-

systeme GmbH, D-63452 Hanau, Germany), genau eingewogen. Anschließend

wird das Wägeschiffchen vorsichtig mit einer Pinzette in einen 25 ml Meßkolben

überführt und mit H2O (Millipore-Qualität) bis zur Eichmarke aufgefüllt. Der

Messkolben wird verschlossen und 30 s gut geschüttelt. Der Meßkolben wird

beschriftet (Lösung A / Konzentration-Coffein [mg/ml] ! ).

Tracer-Stammlösung (Lösung B):

25 mg Benzophenon (84676 Fluka) werden in ein Zinnwägeschiffchen (Typ Z

276 Tin Boats, 4x4x11 mm, Art Nr, 22137418, Fa. Elementar Analysensysteme

GmbH, D-63452 Hanau, Germany) genau eingewogen. Anschließend wird das

Wägeschiffchen vorsichtig mit einer Pinzette in einen 25 ml Meßkolben über-

führt und mit Acetonitril (HPLC –Ultra-Gradient-Grade 9017, Fa. Mallinkrodt Ba-

ker, D-64347 Griesheim, Germany) bis zur Eichmarke aufgefüllt. Der Messkol-

ben wird verschlossen und 30 s gut geschüttelt. Der Meßkolben wird beschriftet

(Lösung B / Konzentration-Benzophenon [mg/ml] ! ).

II.2.1.2 Vorbereitung der Eich-(Kalibrier)lösung

Herstellung der Eichlösung C:

Mit einer Pipette (Transferpette ,Fa. Brandt, D-97861 Wertheim, Germany) wer-

den je 700µl Lösung A und 700µl Lösung B in einem Präparategläschen zu-

sammenpipettiert (Vorsicht ! dabei unbedingt Luftblasen in der Pipettenspitze

vermeiden !). Das Präparategläschen wird mit einem Schnappdeckel verschlos-

sen und 10 s geschüttelt und beschriftet.

Filtration: Die so hergestellte Eichlösung C wird in eine 2ml Einweg-Spritze

(NormJect, Luer, Fa. Henke Sass Wolf, D-78532 Tuttlingen, Germany) mittels

einer aufgesteckten Einmalkanüle (Typ Erosa, Pravaz, 0.90 x 40mm 20G x


11/2, Fa. Rose GmbH, D-5500 Trier, Germany) aufgezogen. Danach wird die

Kanüle von der Spritze wieder entfernt (Achtung ! Spritze dabei senkrecht nach

oben halten, damit die aufgezogene Lösung nicht ausläuft !) und ein Chromafil

Einmalfilter (PTFE Typ O-20/15, organisch, Porendurchm. 0.2µm, Fa. Mache-

rey-Nagel, D-52313 Düren, Germany) aufgesetzt. Die Lösung wird vorsichtig !

durch den aufgesetzten Filter in ein Autosampler-Injektionsgläschen gepresst.

Das Gläschen wird mit einer Anbördelkappe fest verschlossen und beschriftet

(Lösung C / Konzentrationen in [mg/ml] ! ). Achtung: Jeweils Vialkonzentratio-

nen angeben !

II.2.1.3 Vorbereitung der Probenlösungen

Herstellung der Kaffee-Probenlösung (P1):

Der aufgebrühten und auf Raumtemperatur abgekühlten Kaffee-Lösung wer-

den mit der Transferpette 700µl entnommen und in ein Präparategläschen

überführt. Es werden 700µl Lösung B (Tracer-Stammlösung) zupipettiert. Es

wird mit einem Schnappdeckel verschlossen und 10 s geschüttelt. Filtration

analog Lösung C.

Herstellung der Red-Bull-Probenlösung (P2):

700µl (Transfepette) Red-Bull-Lösung (keine weitere Vorbereitung) werden mit

700µl (Transferpette) Lösung B (Tracer-Stammlösung) versetzt und in ein

Präparategläschen überführt. Es wird mit einem Schnappdeckel verschlossen

und 10 s geschüttelt. Filtration analog Lösung C.

Herstellung der Coca-Cola-Probenlösung (P3):

700µl (Transferpette) Coca-Cola-Lösung (keine weitere Vorbereitung) werden

mit 700µl (Transferpette) Lösung B (Tracer-Stammlösung) versetzt und in ein

Präparategläschen überführt. Es wird mit einem Schnappdeckel verschlossen

und 10 s geschüttelt. Filtration analog Lösung (C).


II.2.2 Durchführung der HPLC-Analysen

Säule:

Phenomenex Luna© C18 / 3µm / 150 x 4.6 mm

Vorbereitung:

Nachdem die HPLC-Anlage mit den benötigten Eluenten (Kanal A: 100% H2O

[Millipore-Qualität] / Kanal B: 100% Acetonitril [HPLC –Ultra-Gradient-Grade

9017, Fa. Mallinkrodt Baker, D-64347 Griesheim, Germany] bestückt wurde,

wird zunächst die Säule für 10 min mit 98% B gespült. Anschließend konditio-

niert man die Säule für weitere 10 min auf die gewünschten Anfangsbedingun-

gen (hier 10% B). Danach wird die Software programmiert. Bevor die Sequence

mit der Eichlösung (C) und den einzelnen Probenlösungen (P1, P2, P3) ver-

messen werden, wird ein Chromatogramm der Tracer-Lösung (B) aufgenom-

men, um beurteilen zu können, ob Benzophenon als Interner Standard über-

haupt verwendet werden kann.

II.2.2.1 Die Pumpen-Programmierung

A : Geben sie eine Flussrate von 1.00 ml/min ein.

B : Stellen sie Solvent B auf 10% ein (Anfangsbedingungen).

C : Programmieren sie die Timetable in dem sie das gewünschte Gra-

dientenprogramm angeben 10% B → 95% B in 20 min.

B

C

A


II.2.2.2 Die Programmierung des Injektionsvolumens

D : Geben sie als Injektionsvolumen 5.0 µl ein.

II.2.2.3 Die Detektor-Prammierung

E : Geben sie als Signalspur A = 220 nm ein.

F : Geben sie als Signalspur B = 254 nm ein.

D

E

F


II.2.2.4 Die Programmierung des Säulenthermostaten

G : Geben sie als Temperatur für den Säulenthermostaten 25.0°C ein.

II.2.2.5 Die Einstellung der Integrationsparameter

H : Geben sie für die Slope Sensitivity den Wert 50 ein.

I : Geben sie für die Peak Width den Wert 0.05 ein.

G

H

I


II.2.2.6 Die Programmierung des Autosamplers

J : Geben in der Sequence Table (programmiert den Autosampler) die

Bezeichnungen der Proben in der Reihenfolge ein, in der sie abge-

arbeitet werden sollen (Eichlösung / P1 / P2 / P3 ).

Unter „Inj/Location“ ist standardmäßig 1 eingetragen, was bedeu-

tet, dass jede Probe nur jeweils einmal injiziert werden soll.

Tragen sie unter der Rubrik „Sample Info“ die jeweiligen Vialkon-

zentrationen der Komponenten in ihrer Lösung ein.

II.2.2.7 Das Starten der Proben-Sequence

K : Starten sie mit dem Kommando „Run Sequence“ die Analysense-

quence, nachdem sie die Proben in den Probenteller des Auto-

samplers gestellt haben.

J

K


II.2.3 Die quantitative Auswertung

II.2.3.1 Der Menüpunkt: Data Analysis

L : Die Auswerung der gewonnenen Analysenergebnisse erfolgt unter

dem Menüpunkt „Data Analysis“. Hier können u.a. die Integrations-

parameter für die aufgenommenen Chromatogramme optimiert, als

auch spektroskopische Analysen (UV-Spektren, Isoplot, 3-D-Plot

etc.) durchgeführt werden.

II.2.3.2 Das Erstellen der Kalibriertabelle

M : Laden sie das Datenfile des Eich-Chromatogramms und öffnen sie

die „Calibration Table“. Geben sie unter der Rubrik „Compound“

für den jeweiligen Peak den entsprechenden Namen ein.

N : Geben sie in der der Spalte „Amt (=Amount !)“ die Vialkonzentrati-

on der Komponente ein. Indizieren sie den Tracer in der Spalte

ISTD mit „YES“. Nach abspeichern als Kalibrier-Methode drucken

sie mit „Print“ die Tabelle aus und schließen mit „OK“ ab.

L

N M


II.2.3.3 Das Erstellen des quantitativen Reportes (ISTD-Report)

O : Nachdem sie die Kalibriertabelle erstellt und abgespeichert haben

(Punkt II.2.3.2), können nun nacheinander die Chromatogramme

der Lösungen P1 bis P3 geladen werden und für jedes Chromato-

gramm der quantitative Report erstellt werden. Dazu wählen sie

den Menüpunkt „Specify Report“ aus. Im Fenster „Destination“

wählen sie „Printer“, im Fenster „Style“ wählen sie „Short“ aus.

Unter der Rubrik „Quantitative Results“ muss „ISTD“ aktiviert sein.

Die restlichen Einstellungen können beibehalten werden. Mit dem

Kommando „Print Report“ kann danach jeweils der spezifische

quantitative Ergebnis-Report erstellt werden. Drucken sie diesen

Report für jedes Chromatogramm aus.

O


II.3 Aufgaben zum Experimentellen Teil

1.) Was versteht man unter der chromatographischen Durchbruchszeit tm.

2.) Welche apparativen Einflüsse (zusätzlich zur Säule) können in der HPLC zu

einer deutlichen Beeinflussung der Durchbruchszeit führen (nennen sie 2

Beispiele)?

3.) Ermitteln sie aus dem Tracer-Chromatogramm die Retentionszeit tR(X)

von Benzophenon

4.) Berechnen sie die Wanderungsgeschwindigkeit der mobilen Phase um in

[cm/min] bei einer gegebenen Durchbruchszeit von tm = 1.33 min (Länge

der Säule = 150 mm).

5) Berechnen sie das Durchbruchsvolumen Vm der mobilen Phase sowie

das Retentionsvolumen VR von Benzophenon.

6.) Berechnen sie den Kapazitätsfaktor k für Benzophenon.

7.) Berechnen sie ausgehend von den erhaltenen chromatographischen Er-

gebnissen der Kalibriermessung den KF-Wert für Coffein.

8.) Berechnen sie mit Hilfe des ermittelten KF-Wertes die Konzentration an

Coffein [mg/ml] in den jeweils untersuchten Originalgetränken (Kaffee-

Lösung / Red Bull / Coca-Cola).

9.) Der „Energy-Drink“ Red-Bull enthält neben Coffein auch die Substanz

Taurin. Chemisch gesehen handelt es sich hierbei um 2-Amino-ethan-

sulfonsäure. Geben Sie die entsprechende chemische Formel an.

10.) In welchem Teil des Chromatogramms würden sie Taurin relativ zum

Coffein-Peak in etwa erwarten (niedrigere oder höhere Retentionszeit).

Begründen sie ihre Aussage.

11.) Wie würden sie die Detektionsfähigkeit von Taurin im UV/VIS-Detektor

einschätzen (Begründung)? Nennen sie eine alternative Detektionsme-

thode für Taurin.


III Auswertung Theoretischer Teil


IV Auswertung Experimenteller Teil

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Einführendes Praktikum in die HPLC - uni-regensburg.de · wirksam sein können (2,2´-Dipyridin, Phenanthrolin), benötigen nicht nur end- gecappte RP-Phasen, sondern auch noch ein