Entwicklung einer Kultivierungsstrategie unter Serumentzug ...€¦ · dieses Proteins eher zufällig durch eine Gruppe von Wissenschaftlern. Sie untersuchten Extrakte aus Quetschpräparaten

Hochschule für Angewandte Wissenschaften Hamburg

Fakultät Life Siences

Entwicklung einer Kultivierungsstrategie unter

Serumentzug zur Effizienzsteigerung der Expression

von rekombinantem Grün Fluoreszierenden Protein

bei transgenen CHO-Zellen

Bachelorarbeit

im Studiengang Biotechnologie

vorgelegt von

Lisa Schindler

Hamburg-Bergedorf

am 18.05.2012

1. Gutachter: Herr Prof. Dr. phil. nat. Oliver Ullrich (HAW Hamburg)

2. Gutachter: Frau Prof. Dr Gesine Cornelissen (HAW Hamburg)

Das Bachelorarbeit wurde betreut und erstellt im Labor für Molekularbiologie und

Zellkulturtechnik der Hochschule für Angewandte Wissenschaften Hamburg.

2

Danksagung

Mit der vorliegenden Bachelorarbeit geht der erste Abschnitt meines Studiums zu

Ende. Ich möchte mir deshalb an dieser Stelle die Zeit für ein paar Worte des Dankes

nehmen.

Ganz besonders möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. Oliver Ullrich bedanken, der mir

die Möglichkeit gegeben hat diese Arbeit in seinem Labor für Molekularbiologie und

Zellkulturtechnik an der HAW Hamburg zu verwirklichen. Ebenso möchte ich ihm für

die gute Betreuung und Unterstützung bei allen Fragen und Problemen während

meiner Arbeit danken.

Ein liebes Dankeschön gilt Frau Elisabeth Schäfer, die mir bei allen Aufgaben im Labor

immer mit Rat und Tat zur Seite stand.

Frau Prof. Dr. Gesine Cornelissen möchte ich für die Übernahme der Zweitkorrektur

danken.

Herrn Prof. Dr. Birger Anspach danke ich für die Bereitstellung des

Spektrofluorometers.

Ein großes Dankeschön geht auch an meine Familie und Freunde, die mir immer Kraft

und Mut gegeben haben diesen Abschnitt meines Lebens zu meistern. Ohne sie wäre

die tolle Zeit in Hamburg nicht möglich gewesen.

3

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung...................................................................................................................... 5

1.1 Bedeutung von Serum in der Zellkultur.......................................................................... 5 1.2 Kultivierung von Zellen ohne Serum in der Industrie und medizinischen

Forschung.................................................................................................................................... 6 1.3 Alternativen zum Serum ....................................................................................................... 7 1.4 Rolle von CHO-Zellen in der Forschung und Industrie.............................................. 8 1.5 Markerproteine für die Expression in eukaryotischen Zellen................................ 9 1.6 Grün Fluoreszierendes Protein (GFP).............................................................................. 9 1.7 Methode der Fluoreszenzspektometrie ........................................................................11 1.8 Aufgabenstellung ...................................................................................................................15

2 Material und Methoden............................................................................................. 16

2.1 Zellkultur...................................................................................................................................16 2.1.1 Verwendete Zelllinien ...............................................................................................16

2.1.1.1 Erste verwendete CHO-Zelllinie: stabile His6-GFP-CHO-Zellinie ........16 2.1.1.2 Zweite verwendete CHO-Zelllinie: stabile His6-GFP-Rab11-CHO-

Zelllinie .......................................................................................................................17 2.1.2 Kultivierung der Zellen .............................................................................................17

2.1.3.1 Material und Lösungen.........................................................................................18 2.1.3.2 Auftauen der tiefgefrorenen Zellkulturen und Aussaat der Zellen .....19 2.1.3.3 Optische Kontrolle der Zellkultur ....................................................................20 2.1.3.4 Passagieren der Zellen / Medienwechsel......................................................20 2.1.3.5 Aussaat der CHO-Zellen in 24-Well-Platten .................................................22 2.1.3.6 Kryokonservierung................................................................................................24

2.2 Zellzahlbestimmung..............................................................................................................24 2.2.1 Beladen der Zählkammer/ Messung durch Countess™ Automated Cell

Counter ............................................................................................................................25 2.3 Fluoreszenzmessung ............................................................................................................26

2.3.1 Spektrofluorometer....................................................................................................26 2.3.2 Vorbereiten der Zellen von einer 24-Well-Platte zur anschließenden

Vermessung im Spektrofluorometer....................................................................27 2.3.3 Messung der Probe mit Hilfe der Software Panorama .................................28 2.3.4 Peakflächenberechnung mit Hilfe der Software Panorama........................30

2.4 Fluoreszenzmikroskopie.....................................................................................................32

3 Ergebnisse................................................................................................................... 35

3.1 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression der beiden Zelllinien CHO-GFP und CHO-GFP-Rab11 in Abhängigkeit von der Aussaatdichte ....................35

3.1.1 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei niedriger Aussaatdichte (1x105)................................................................................................35

3.1.2 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei hoher Aussaatdichte (1x106)................................................................................................38

3.1.3 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei mittlerer Aussaatdichte (3x105, 5x105)..................................................................................41

4

3.2 Versuche zur Entwicklung einer Kultivierungsstrategie zur optimalen Ausbeute an GFP unter Serumentzug ............................................................................47

3.2.1 Proliferation und Expression bei einer niedrigen Aussaatdichte ................ (1x105).............................................................................................................................48 3.2.2 Proliferation und Expression bei einer mittleren Aussaatdichte ................. (5x105).............................................................................................................................51

3.3 Fluoreszenzmikroskopie.....................................................................................................54 3.3.1 Fluoreszenzmikroskopische Analyse der CHO-GFP-Rab11-Zellen..........54 3.3.2 Fluoreszenzmikroskopische Analyse der CHO-GFP-Zellen ........................55

4 Diskussion ................................................................................................................... 58

4.1 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei verschiedenen Aussaatdichten........................................................................................................................58

4.2 Kultivierungsstrategie zur optimalen Produktion von GFP/ GFP-Rab11 unter Serumentzug................................................................................................................60

4.3 Fluoreszenzmikroskopie.....................................................................................................61 4.4 Fazit .............................................................................................................................................62

5 Zusammenfassung...................................................................................................... 63

6 Literaturverzeichnis .................................................................................................. 64

7 Anhang........................................................................................................................ 67

7.1 Abbildungsverzeichnis.........................................................................................................67 7.2 Tabellenverzeichnis ..............................................................................................................69 7.3 Material und Geräte ..............................................................................................................70 7.4 Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................................72

Einleitung

5

1 Einleitung

Die Zellkultur, Kultivierung von aus lebenden Geweben isolierten Zellen in vitro (lat.

‚im Glas’), ist ein anerkanntes, wertvolles Werkzeug der biomedizinischen Forschung

zur Gewinnung reproduzierbarer Daten und zur Produktion diagnostischer und

therapeutischer Proteine [Gstraunthaler, 2003]. In heutiger Zeit werden mit Hilfe von

Zellkulturen immer mehr hochwertige Produkte im großen Maßstab für Medizin und

Forschung hergestellt, wie zum Beispiel Insulin, Wachstumsfaktoren, Impfstoffe und

vielen weiteren Proteinen. Ebenso stellt die Zellkultur eine hervorragende Alternative

zu Tierversuchen dar und ist aus diesem Grund ein wichtiger Teil in Industrie und

Forschung.

1.1 Bedeutung von Serum in der Zellkultur

In vitro kultivierte Zellen benötigen zum Wachstum sogenannte Nährlösungen

(Medien), die eine möglichst exakte Nachahmung der physiologischen Situation

in vivo (d.h. im lebenden Körper) darstellen. Dabei spielt das Vorhandensein von

Blutserum eine enorme Rolle und ist aufgrund der vielseitigen Zusammensetzung der

am häufigsten verwendete Medienzusatz. Es kann artübergreifend verwendet

werden. Ebenso ist wissenschaftlich nachgewiesen, dass einige Zelllinien ohne das

Vorhandensein von Serum nicht in der Lage sind, zu proliferieren. Durch in der

Vergangenheit durchgeführte Experimente und zahlreiche Versuche erwies sich, dass

das Serum von ungeborenen Föten als besonders hochwertig gilt, da sich im fötalen

Entwicklungsstadium eine enorme Zellaktivität entfaltet [Boxberger, 2007].

Bei dem am häufigsten verwendeten Serum handelt es sich um das Fötale

Kälberserum (FKS), auch bekannt unter den Bezeichnungen „Fetal Bovine Serum“

(FBS) oder „Fetal Calf Serum“ (FCS). Die genaue Zusammensetzung sowie alle

wirksamen Faktoren und Wirkstoffkombinationen des Serums sind bis heute noch

nicht entschlüsselt. Schätzungen zu folge ist die komplexe Flüssigkeit aus mehr als

5000 verschiedenen Komponenten zusammengesetzt, wobei diese Zahl von Charge zu

Charge stark schwanken kann [Schrödel, 2007]. Die in dem Serum vorhandenen

Einleitung

6

Proteine, Aminosäuren, Spurenelemente, Hormone, Wachstumsfaktoren etc. sind ein

wichtiger Faktor für die langfristige Kultivierung. Ebenso ist bewiesen, dass Serum

hilfreich bei der Anheftung der Zellen am Kulturboden ist (bei adhärent wachsenden

Zellen), oder als natürliches Puffermittel zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes im

Kulturmedium dient [Uppangala, 2010]. Zudem erhöht Serum die Viskosität des

Mediums und kann somit zum Schutz der Zellen vor mechanischer Beschädigung, wie

zum Beispiel beim Pipettieren, beitragen. Mit dem heuten Wissen, der modernen

Zellbiologie und Biochemie lässt sich ebenso zeigen, dass die Rolle des fötalen

Kälberserums auch einen entscheidenden Einfluss auf die Differenzierung von Zellen

einnimmt [Gstraunthaler, 2003]. Allerdings bringt die Kultivierung mit

serumhaltigem Medium auch ungewollte Nachteile, die im nächsten Absatz 1.2

verdeutlicht werden.

1.2 Kultivierung von Zellen ohne Serum in der Industrie und

medizinischen Forschung

Einer der wichtigsten Gründe für die Etablierung einer Kultivierungsmethode von

eukaryotischen Zellen ohne FCS besteht in der Betrachtung der ethischen Seite zur

Gewinnung des Serums [Shailer und Corrin, 1999; van der Valk et al., 2003]. Der

Gewinnung für FKS geht die Entnahme der Gebärmutter des Muttertieres mitsamt des

etwa drei bis sieben Monate alten, ungeborenen Fetus voraus. Anschließend wird das

Herz des Fetus punktiert (kardiale Interpunktion) und Blut entnommen, welches im

Folgenden für die Serumgewinnung verwendet wird. Diese Methode ist ethisch

äußerst fragwürdig und muss unter einem kritischen Aspekt betrachtet werden

[taz.de, 2005].

Ein weiterer wichtiger negativer Faktor ist die mögliche Kontamination mit Bakterien,

Mycoplasmen, Pilzen oder Rinderviren, die trotz zahlreicher Filtrationsschritte,

Hitzeinaktivierung und/oder Behandlung mit UV-Strahlung nicht entfernt bzw.

inaktiviert werden können. Dies könnte in der medizinischen Forschung und

Entwicklung von Medikamenten fatale Folgen haben, da sich darunter unter anderem

die viralen Erreger der Maul- und Klauenseuche (Bovine Rhinotracheitis) oder die

Erreger der Bovinen Spongiformen Enzephalophatie (Prionen) befinden, wobei

letztere beim Menschen zu der sogenannten Creutzfeld-Jakob-Krankheit führen

können [Boxberger, 2007].

Einleitung

7

Aus diesen Gründen ist die Kultivierung von Zellen, die bei der Herstellung von

Arzneimitteln eingesetzt werden, nur unter ganz bestimmten Aspekten möglich.

Darunter zählt unter anderem die Verwendung von serumfreien Medien, bei deren

Verwendung somit keine Gefahr für den menschlichen Organismus ausgeht. Ebenso

würde auf diese Weise die von der FDA (Food and Drug Administration),

Pharmacopoe Europeae bzw. ISO (Internationale Organisation für Normung) zu

überprüfende Virus-Sicherheit garantiert werden. Hier ist der Nachweis zu erbringen,

dass keine schädlichen Viren im Endprodukt enthalten sind [http://www.zwisler-

laboratorium.com/sites/news/virus_news.html].

1.3 Alternativen zum Serum

Seit mehr als 25 Jahren versucht man, aufgrund der oben genannten Nachteile, einen

optimalen Ersatz mit besten Kultivierungsbedingungen, zum Beispiel in Bezug auf die

Aussaatdichte und Kultivierungstemperatur, für das Fötale Kälberserum zu finden.

Die größte Herausforderung liegt darin, einen angemessenen Ersatz für die

zahlreichen wachstumsfördernden Serumkomponenten zu finden [Boxberger, 2007].

Das Angebot an serumfreien Zellkulturmedien ist in den letzten Jahren stark

gestiegen. Allerdings bedarf es durch die selektive Einsetzbarkeit der Medien eines

gründlichen und zeitaufwendigen Rechercheaufwandes, um ein ideales Medium für

eine bestimmte Zelllinie zu finden. Die serumfreie Kultivierung stellt eine moderne,

wissenschaftlich akzeptierte Alternative zur Verwendung von FCS in der Zellkultur

dar [Gstraunthaler, 2003]. Deshalb ist es von großer Bedeutung, die Forschung an

serumfreien Medien und die Optimierung der Kultivierungsbedingungen weiterhin

voran zu treiben.

Einer der größten Nachteile der Kultivierung mit serumfreien Medien ist jedoch die

noch sehr langsame Zellproliferation im Gegensatz zur Kultivierung mit

serumhaltigem Medium, die durch einzelne Kultivierungsbedingungen und Strategien

verbessert werden kann. Dabei spielt auch die Wahl der Zelllinie eine wichtige Rolle,

da einige Zelllinien serumunabhängiger und anpassungsfähiger sind als andere.

Einleitung

8

1.4 Rolle von CHO-Zellen in der Forschung und Industrie

Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO, engl. Chinese Hamster Ovary) sind die

am häufigsten verwendeten Säugetierzellen zur Transfektion, Expression und

Produktion rekombinanter Proteine. Es handelt sich hierbei um eine immortalisierte,

adhärent wachsende Zelllinie. Im Jahre 1957 hat Theodore T. Puck diese

„unsterbliche“ Zelllinie aus den Eierstockzellen eines chinesischen Hamsters isoliert

[Puck et al., 1958]. Der Vorteil der CHO-Zellen ist, dass sie den menschlichen Zellen

sehr ähnlich sind, da es sich auch hier um Säugertierzellen handelt, weshalb man mit

ihnen komplexe therapeutische menschliche Proteine produzieren kann. Nahezu

70 % aller rekombinant hergestellten Proteine, mit Bestimmung zur therapeutischen

Verwendung, werden heutzutage in CHO-Zellen exprimiert [Voedisch et al., 2005]. Im

Vergleich zu anderen Zelllinien haben sie große Vorteile. Einer davon ist, dass die

Gefahr, dass sie mit gefährlichen Viren infiziert sind, sehr gering ist, was für die

Produktion von therapeutischen Proteinen wichtig ist. Vor allem sind die CHO-Zellen

seit langem etabliert und man hat es geschafft, viel Erfahrung im Umgang mit ihnen zu

sammeln. Mittlerweile stehen zahlreiche Varianten mit unterschiedlichen genetischen

Veränderungen zur Verfügung.

Abbildung 1.1: Chinese Hamster Ovary Cells. Morphologie der CHO-Zelllinie in niedriger (links) und hoher Zelldichte (rechts)

Quelle: http://www.lgcstandards-atcc.org/Attachments/1768.jpg

Einleitung

9

1.5 Markerproteine für die Expression in eukaryotischen Zellen

Um nicht nur die äußerlich sichtbaren Veränderungen von Zellen in der Wahl der

Kultivierungsmethode beurteilen zu können, wie zum Beispiel Wachstum und

Morphologie der Zellen, ist es wichtig sich auch den Gesichtpunkt der Expression von

zellspezifischen Proteinen zu betrachten. Dabei bezieht sich die Wissenschaft auf

sogenannte Markerproteine, wofür bekannte Proteine mit gegebenen Eigenschaften

(Größe, relative Molekülmasse, chemische Eigenschaften) eingesetzt werden.

1.6 Grün Fluoreszierendes Protein (GFP)

Ein in der Zellkultur häufig verwendetes Markerprotein ist das Grün Fluoreszierende

Protein (GFP; engl.= green fluorescent protein), welches ebenso ein wichtiges

Instrument der Molekularbiologie darstellt [Chalfie, 1994]. Erstmals wurde das

Protein 1961 von Osamu Shimomura beschrieben. Dabei erfolgte die Entdeckung

dieses Proteins eher zufällig durch eine Gruppe von Wissenschaftlern. Sie

untersuchten Extrakte aus Quetschpräparaten der pazifischen Qualle Aequoria

victoria und isolierten daraus die Ca2+- aktivierbare Oxoluciferase Aequorin, sowie

das daran assoziierte und nach UV-Bestrahlung Grün Fluoreszierende Protein, woher

dieses auch seinen Namen bekam (GFP) [Shimomura et al., 1962].

Einleitung

10

Abbildung 1.2: Grün Fluoreszierendes Protein: Dreidimensionale Struktur des GFP. Die Aminosäuren bilden eine zylinderförmige Struktur aus, in deren Mitte sich die Licht-emittierende Gruppe befindet (links); Pazifikqualle Aequoria victoria, in dieser Qualle wurde das Grün Fluoreszierende Protein entdeckt (rechts).

Quelle: links: http://www.fsbio-hannover.de/oftheweek/293.htm rechts: http://mabryonline.org

Der Vergleich zwischen Emissions- und Anregungsmaxima von Aequorin und GFP

zeigte, dass sich das Emissionsmaximum von Aequorin mit dem Anregungsmaximum

von GFP übereinstimmt. Diese Erkenntnis deutet auf eine Anregung des GFPs durch

Aequorin hin. Das Absorptionsspektrum und die Fluoreszenzquantenausbeuten des

GFP, sowie der strahlungslose Energietransfer zwischen Aequorin und GFP wurde

erstmals 1974 beschrieben [Morise et al., 1974].

Die Primärsequenz von GFP, sowie die Klonierung des GFP- Gens wurde 1992 zum

ersten Mal veröffentlicht, was einen enormen wissenschaftlichen Durchbruch

bedeutete [Prasher et al., 1992]. GFP besteht aus 238 Aminosäuren, besitzt eine

Molekülmasse von 26,9 kDa und eine ungewöhnliche Struktur, die in 11 beta-

Faltblattstrukturen angeordnet ist (siehe Abbildung 1.2). Diese sind in einer Art

Zylinder geordnet, in dessen Mitte sich das Fluorophor befindet. Es besitzt die

Aminosäuren Serin, Tyrosin und Glycin, deren Seitenketten miteinander reagieren

können und so die typische Fluoreszenz bewirken. Diese wurde 1996 durch zwei

Gruppen unabhängig voneinander bestimmt [Ormö et al., 1996; Yang et al., 1996].

Einleitung

11

Eine weitere äußerst außergewöhnliche Eigenschaft des natürlich vorkommenden

GFP (wtGFP, engl. = wild type GFP) ist, dass es zwei Absorptionsmaxima besitzt, jedoch

nur ein Emissionsmaximum. Im Protein kann das Tyrosin66 in seiner Hydroxy-Form,

bei einem Anregungsmaximum von 395nm oder der deprotonierten Enolat-Form, bei

einem Anregungsmaximum von 475nm (blauer bzw. ultravioletter Strahlungsbreich),

vorliegen. Der einzige fluoreszierende Zustand ist jedoch die angeregte Phenolat-

Form, die Licht bei 508nm (grüner Strahlungsbreich) emittiert. Durch die Anregung

wird der Säure-Charakter des Tyrosin66 erhöht, wodurch es zu einem Übergang in die

Phenolat-Form unter Abspaltung eines Protons kommt. Unter Lichtemission kehrt

diese in den Grundzustand zurück [Ormö et al., 1996].

Beim GFP handelt es sich um ein besonders stabiles Protein, was wahrscheinlich auf

die kompakte Struktur zurückzuführen ist. Durch das in der Struktur gut geschützte

innenliegende Fluorophor, ist es über einen sehr großen pH-Bereich (pH 5-12) stabil

und denaturiert erst bei Temperaturen über 65°C [Tsien, 1998]. Außerdem ist es

nahezu resistent gegenüber den meisten Proteasen (u.a. Trypsin, Chymotrypsin,

Elastase, Papain) und zeigt auch eine sehr hohe Stabilität in Lösungen, die zum

Beispiel Detergentien, wie SDS, Triton X-100, Tween 80 oder CHAPS enthalten.

Da zur Erzeugung der Fluoreszenz keinerlei Co-Faktoren benötigt werden, konnte

GFP inzwischen in einer Vielzahl von Organismen erfolgreich funktional exprimiert

werden. GFP ist in einer Zelle durch die vorhandene Lumineszenz und nach Anregung

mit UV- oder blauem Licht leicht detektierbar.

1.7 Methode der Fluoreszenzspektometrie

Als Fluoreszenz wird im Allgemeinen die Absorption von Licht einer bestimmten

Wellenlänge (=Anregungslicht) mit der gleichzeitigen Emission von Licht mit

größerer Wellenlänge bezeichnet [Gey, 2008]. Dieses Verhalten (Absorption von

kurzwelligem Licht, Emission von längerwelligem Licht) ist auch beim GFP zu

beobachten. Um sich einen Eindruck von der Menge und Intensität an vorhandenen

GFP in Zellen zu machen, kann die sogenannte Fluoreszenzspektroskopie

herangezogen werden.

Die Fluoreszenz einer Substanz hängt in ganz starkem Maße von den umgebenden

Bedingungen ab. Daher erfolgt die Fluoreszenzmessung im Gegensatz zur

Einleitung

12

Absorptionsspektroskopie "relativ zur Dunkelheit". Somit ist die

Fluoreszenzspektroskopie einerseits als Sensor für die Umgebung und andererseits

aufgrund der noch nachweisbaren Konzentration, bis zu einzelnen Molekülen, eine

sehr empfindliche Untersuchungsmethode der Molekül- und Bioanalytik [Gey, 2008].

Die einzelnen Prozesse, die von der Absorption von Anregungslicht zur Emission von

Fluoreszenzlicht führen, können mit Hilfe eines bestimmten Energiediagramms

dargestellt werden. Diese Diagramme sind nach dem polnischen Physiker Alexander

Jablonski benannt, der damit als Begründer der modernen Fluoreszenzspektroskopie

gilt. Ein Jablonski-Diagramm zeigt die Energien der Elektronenübergänge, die bei

Absorption und Emission von Photonen auftreten [Böcker. 1997]. Viele Fluorochrome

haben aromatische Ringstrukturen, wie Quinine, Fluorescein, Rhodamin B, POPOP,

Acrdinorange und Umbelliferone. Solche Moleküle besitzen delokalisierte Elektronen

in sogenannten bindenden p-Orbitalen. Die Elektronen dieser Orbitale treten leicht in

Wechselwirkung mit der Umgebung und erreichen bei Absorption eines

Anregungsphotons ein höheres Orbital (p*). In bindenden Orbitalen liegen Elektronen

normalerweise mit antiparallelem Spin vor, eine Anordnung, die die sogenannten

Singulett-Zustände charakterisiert (S0, S1, S2) (siehe Abbildung 1.3). Die Absorption

eines Anregungsphotons (hnA) hebt ein Elektron aus dem Grundzustand S0 in einen

der angeregten Zustände S1 oder S2. Dieser Vorgang ist extrem schnell, er vollzieht

sich innerhalb etwa 10-15 Sekunden. Aus dem oberen angeregten Zustand ist ein

Übergang nach S1 möglich, ohne das eine Photon emittiert wird ("innere

Umwandlung"), aber beim Übergang in den Grundzustand wird die freiwerdende

Energie als Fluoreszenzphoton (hnF) emittiert. Die Energie des emittierten Photons ist

immer geringer als die des absorbierten Photons, damit ist die Wellenlänge des

Fluoreszenzlichts größer als die des Anregungslichts (Stokessche Regel). Die mittlere

Verweilzeit im angeregten Zustand (Fluoreszenz-Lebenszeit) ist bei vielen

Fluorochromen im Bereich von 10 Nanosekunden. Bei manchen Verbindungen kann

es zu einem Übergang aus einem angeregten Singulettzustand in einen Triplett-

Zustand (T1) kommen. Bei diesem Vorgang ("Interkombination") kommt es zu einer

Spinumkehr des angeregten Elektrons und auch der Sprung in den Grundzustand

erfordert eine Spinumkehr. Solche Vorgänge sind jedoch sehr unwahrscheinlich und

die Emissionsraten sind sehr gering (1-1000 pro s). Diese geringe Übergangsrate ist

Einleitung

13

der Grund für das langsame Abklingen der Phosphoreszenz bei Leuchtziffern und

Spielzeug, das im Dunkeln leuchtet.

Abbildung 1.3: Jablonski Diagramm. Energiezustände bei der Lichtabsorption und Fluoreszenz-Emission; S0 = Singulett-Grundzustand; S1/ S2 =angeregte Singulettzustände. Die Absorption eines Anregungsphotons hebt ein Elektron aus dem Grundzustand S0 in einen der angeregten Zustände S1 oder S2. Die dicken waagerechten Linien verdeutlichen die niedersten Schwingungsniveaus des Elektronenzustandes. Die schmalen Linien darüber bezeichnen das Schwingungsniveaus, die als Unterniveaus des einzelnen angeregten Zustandes aufzufassen sind. Es kann zu einem Übergang aus einem angeregten Singulettzustand in einen Triplett-Zustand (T1) kommen

Quelle: Lakowicz, J. R., 1999

Eine Lichtquelle sendet über ein optisches System mit Anregungsfilter eine

vorgegebene Extinktionswellenlänge (λex) direkt durch die Mikrodurchflussküvette,

in der sich die zu analysierende Probe befindet. Diese elektromagnetische Strahlung

wird von den darin enthaltenen Molekülen absorbiert und senkrecht zur

Strahlungsebene über einen Emissionsfilter in Form einer Emissionswellenlänge

(λem) auf den Photodioden detektiert [Gey, 2008]. Die Messung der Emission ist der

wesentliche Unterschied zu anderen spektroskopischen Methoden, bei denen die

Absorption der Strahlung gemessen wird. Dieser Vorgang wird im Folgenden

schematisch dargestellt (vgl. Abbildung 1.4)

Einleitung

14

Abbildung 1.4: Fluoreszenzmessung mit Hilfe eines Spektrofluorometers. Die Lichtquelle emittiert im UV-Bereich. Die Monochromatoren dienen der Selektion der Anregungswellenlänge (1) bzw. der Analyse des Fluoreszenzlichtes (2). Die Probe wird in einer Küvette in den Proberaum gegeben. Der Detektor empfängt das emittierte Signal und leitet es an eine weitere elektronische Einheit weiter. Der Monochromator 2 steht senkrecht zur Anregungswellenlänge, so dass diese das Extinktionssignal nicht stört.

Quelle: Gey, 2008

Einleitung

15

1.8 Aufgabenstellung

Die Kultivierung von Zellen ohne Serum spielt in der medizinischen Forschung und

Herstellung von Arzneimitteln eine wichtige Rolle, da hier ein geringes

Infektionsrisiko für den Menschen von enormer Bedeutung ist. Allerdings ist die

Kultivierung ohne die im Serum enthaltenen Proteine, Aminosäuren, Spurenelemente,

Hormone und Wachstumsfaktoren sehr schwierig.

Das Ziel dieser Arbeit ist den Einfluss von Serum auf die Proteinexpression in

CHO-Zellen zu untersuchen und dabei die Bedeutung von Parametern, wie Zelldichte,

Kultivierungsdauer und Zellproliferation zu erfassen. Dies sollte anhand zweier

rekominanter, leicht quantifizierbarer Markerproteine (GFP und GFP-Rab11), die

diese verwendeten Zelllinien exprimieren, untersucht werden. Um detailliertere

Aussagen treffen zu können, sollten zwei verschiedene Zelllinien (His6-GFP-CHO und

His6-GFP-Rab11-CHO) miteinander verglichen werden. Aus diesen Ergebnissen sollte,

wenn möglich, eine Kultivierungsempfehlung für die optimale Expression von

Proteinen in CHO- Zellen aufgestellt werden, wobei auf die Verwendung von fetalem

Kälberserum möglichst verzichtet werden sollte.

Material und Methoden

16

2 Material und Methoden

2.1 Zellkultur

Alle zellbiologischen Arbeiten und die damit verbundene Kultivierung der Zellen in

Kulturmedium wurden unter sterilen Bedingungen an einer Sterilwerkbank mit

laminarem Luftstrom durchgeführt. Wichtige Voraussetzung für das sterile Arbeiten

war die Befreiung der verwendeten Arbeitsmaterialien (Kulturmedien,

Medienzusätze, Zellkulturgefäße etc.) von lebenden Mikroorganismen einschließlich

ihrer Ruhestadien. Das sterile Arbeiten ist insbesondere sehr wichtig, um die Zellen

vor Kontaminationen zu schützen.

Um eine optimale Kultivierung zu gewährleisten, wurde ein für die verwendeten CHO-

Zelllinien (Chinese Hamster Ovary) etabliertes Medium (Ham`s F12) unter Zusatz von

Antibiotika (Penicillin/ Streptomycin), L-Glutamin und FCS eingesetzt und weitere

Kultivierungsbedingungen an diese Zelllinie angepasst. Dabei wurden die Zellen in

einem Brutschrank mit einer Temperatur von 37°C und kontinuierlicher

Kohlenstoffdioxidzufuhr (5% CO2) sowie bei einer konstant hohen Luftfeuchtigkeit

(etwa 70%) kultiviert.

Die Hauptkultur der verwendeten Zelllinien wurde in Zellkulturflaschen (T25, T75)

aus Kunststoff (Polystyrol) herangezüchtet, wobei allerdings als Anzuchtgefäß der

Zellen für die einzelnen Experimente eine 24-Well-Platte, ebenfalls aus einem

Kunststoff (Polystyrol), eingesetzt wurde.

2.1.1 Verwendete Zelllinien

2.1.1.1 Erste verwendete CHO-Zelllinie: stabile His6-GFP-CHO-Zellinie

Die verwendete His6-GFP-exprimierende transgene CHO-Zelllinie wurde im Rahmen

der Diplomarbeit von Laura Gonda im Jahr 2006 an der Hochschule für Angewandte

Wissenschaften Hamburg hergestellt (siehe Abbildung 2.1). Die benötigte

CHO- Zelllinie für diesen Versuch wurde von Prof. M. Zerial (Max-Planck-Institut für

Molekulare Zellbiologie und Genetik, Dresden) zur Verfügung gestellt. Dabei handelt

es sich um einen Subklon der adhärent wachsenden CHO-Zelllinie, die von T. T. Puck


17

bei einer Biopsie von Ovarien eines erwachsenen Chinesischen Hamsters 1957

isoliert wurde, den CHO-K1-Zellen [Puck et al., 1958].

Das GFP ist ein cytosolisches Protein und somit gleichmäßig in der Zelle verteilt ist.

Abbildung 2.1: Aufnahme der stabilen CHO-GFP-His₆-Zellinie mit Hilfe eines Lichtmikroskopes mit Phasenkontrast Die Zellen wurden in einer T75-Zellkuturflasche bei 37°C und 5%CO₂ im Brutschrank kultiviert. Die Aufnahme würde mit einer 200-fachen Vergrößerung aufgenommen, nachdem die Zellen 3 Tage inkubiert wurden.

2.1.1.2 Zweite verwendete CHO-Zelllinie: stabile His6-GFP-Rab11-CHO-Zelllinie

Bei der in den folgenden Experimenten ebenso verwendeten Zelllinie handelt es sich

um eine stabile His6-GFP-Rab11-exprimierende CHO-Zelllinie, die von Mareen Glausch

im Rahmen ihrer Diplomarbeit im Jahre 2006 an der Hochschule für Angewandte

Wissenschaften Hamburg hergestellt wurde. Die Zelllinie ist von der Morphologie

sehr ähnlich den CHO-GFP-His₆-Zellen.

Im Gegensatz zum GPF ist das Rab11 ein membrangebundenes Protein, was somit

vorwiegend in der perinuklearen Region der Zelle vorkommt [Ullrich et al., 1996].

2.1.2 Kultivierung der Zellen

Die Kultivierung beider stabiler Zelllinien (His6-GFP-CHO; His6-GFP-Rab11-CHO) wird

nach den jeweils gleichen Arbeitsabläufen durchgeführt, die in den folgenden

Abschnitten beschrieben werden.

CHO-Zellen wachsen auf geeigneter Unterlage als Monolayer, da aufgrund von

Kontaktinhibition ein Übereinanderwachsen verhindert wird.


18

2.1.3.1 Material und Lösungen

Für die Kultivierung der in Abschnitt 2.1.1 und 2.1.2 vorgestellten CHO-Zelllinien

werden folgende Lösungen und Kulturgefäße angesetzt bzw. verwendet und

anschließend zur Kultivierung genutzt. Diese werden in den nachfolgenden Tabellen

dargestellt.

Tabelle 2.1: Für die Kutlivierung der CHO-Zellen verwendete Lösungen und ihre Zusammensetzung

Kulturmedium

500 ml Ham´s F12 50 ml fetales Kälberserum (FCS) 5 ml 200mM L-Glutamine 5 ml Penicillin/Streptomycin (10.000 Units/ml; 10.000 μg/ml)

PBS 0,8 g/l NaCl 0,2 g/l KCl 1,1 g/l Na₂HPO₄ 0,2 g/l KH₂PO₄, pH 7,4

Trypsin/ EDTA- Lösung 0,05 % / 0,02 % (w/v) in PBS- G418 50 mg/ml (Endkonzentration: 200 μg/ml) Einfriermedium Für 10ml Ansatz:

9ml Kulturmedium 1ml Dimethylsulfoxyd

Tabelle 2.2: Benötigte Volumina der verwendeten Lösungen zum Ablösen der ahärenten Zellen in dem jeweils verwendeten Kulturgefäß

Zellkulturgefäße/-platten Volumina PBS [ml]

Volumina Trypsin/EDTA [ml]

Volumina Medium [ml]

25 cm² - Kulturflasche 5 2 6 75 cm² - Kulturflasche 10 5 15 24-Well-Platte (1,862cm²) 0,5 0,2 0,8


19

Tabelle 2.3: Für die Kultivierung der CHO-Zellen verwendete Kulturgefäße und die benötigten Volumina der zur Aussaat verwendeten Lösungen/ Zellsuspension bei einer Konfluenz der Zellen von etwa 80% in der zu passagierenden Kulturflasche (T25/T75)

Zellkulturflaschen-/ platten

Volumina Zellsuspension [ml]

Volumina Medium [ml]

Volumina G418 [µl]

25 cm² - Kulturflasche 1 7 28 75 cm² - Kulturflasche 4 11 60

2.1.3.2 Auftauen der tiefgefrorenen Zellkulturen und Aussaat der Zellen

Um eine langfristige Lagerung der Zellen ohne Qualitätsverlust zu gewährleisten,

werden diese in flüssigem Stickstoff (-196°C) in sogenannten Kryoröhrchen

aufbewahrt.

Die tiefgefrorenen Zellkulturen sind sehr empfindlich und müssen möglichst

schonend behandelt werden, damit sie in ihrer Struktur nicht zerstört oder

beschädigt werden. Die meisten Zellen, so auch die verwendeten CHO-Zelllinien, sind

empfindlich gegenüber dem im Einfiermedium enthaltenen Dimethylsulfoxyd

(DMSO), daher wurden die folgenden Schritte möglichst schnell und

kontaminationsfrei durchgeführt. Dimethylsulfoxyd verhindert beim Einfrieren der

Zellen die Bildung von schädlichen Wasserkristallen und die parielle Dehydration des

Cytoplasmas [Boxberger, 2007]. Allerdings besitzt DMSO eine zytotoxische Wirkung

und ist somit ein Zellgift, das zur Zerstörung von Zellwand bzw. Zellmembran und

somit zum Zelltod führen kann.

Die tiefgefrorenen Zellen wurden zum Anfang in einer 25cm²-Zellkulturflasche

kultiviert, die noch vor direktem Auftauen der Zellen in den Kryoröhrchen mit

frischem Medium befüllt wurde. Die Temperatur des Kulturmediums sollte bereits

eine Temperatur von 37°C besitzen. Das Füllvolumen betrug 7ml. Anschließend

wurde ein Kryoröhrchen der entsprechenden Zelllinie aus dem Stickstoffbehälter

entnommen. Dabei mussten schützende Maßnahmen, wie das Tragen von

Schutzbrille, Gesichtschutz und Kälteschutzhandschuhe, getroffen werden, da Gesicht

und Hände durch die niedrigen Temperaturen des Stickstoffs gefährdet wären. Die

Zellen wurden nun möglichst schnell unter gelegentlichen Schwänken in einem auf

37°C vorgeheiztem Wasserbad aufgetaut. Bevor das Röhrchen unter die

Sterilwerkbank gestellt werden konnte, wurde es mit 70%iger alkoholischer

Desinfektionslösung abgesprüht und somit keimfrei gehalten. Beide Zelllinien waren


20

in einem Volumen von 1ml Suspension weggefroren, die nun mit einer 1000µl-Pipette

mit abgeschnittener blauer Spitze unter vorsichtigem Mischen entnommen und in die

bereitgestellte Kulturflasche mit dem frischen Medium überführt wurde. Dabei ist

eine vorsichtige Handhabung wichtig, damit keine schädlichen Luftblasen, die die

Zellen schädigen könnten, beim Pipettieren entstehen. Die Zellsuspension wird durch

kurzes und langsames Schwenken der Kulturflasche auf dem Boden verteilt und

anschließend bei 37°C im Inkubator unter optimalen Bedingungen (siehe Abschnitt

2.1) kultiviert. Um den Gehalt an noch vorhandenem DMSO in der nun ausgesäten

Zellsuspension weitgehend zu entfernen, wurde nach einer Zeit von 4h das alte

Medium durch ein neues Medium ausgetauscht. Da es sich um adhärente Zellen

handelt, wurden beim Medienwechsel, der im Abschnitt 2.1.3.4 noch genauer

beschrieben wird, keine lebenden Zellen entnommen oder beschädigt.

2.1.3.3 Optische Kontrolle der Zellkultur

Die frisch aufgetauten Zellen beginnen nicht sofort mit der Zellteilung, sondern

verbleiben noch einige Zeit in der sogenannten lag-Phase. Das Wort „lag“ kommt aus

dem Englischen und bedeutet „Verzögerung“. Für eine optimale Zellkultur ist es

wichtig, dass man die Gesamtheit der Zellen und das Kulturmedium stetig kontrolliert,

da so eine mögliche Kontamination, die falsche CO₂- Konzentration oder verbrauchtes

Medium schnell erkannt werden. Durch die optische Kontrolle können auch konkrete

Aussagen über Zelltod oder Zellproliferation gegeben werden.

Die visuelle Prüfung erfolgte mit Hilfe eines Mehrlinsenlichtmikroskops unter

Verwendung des 10er Objektivs. Dabei konnte eine gute Einschätzung über Zelldichte,

sowie Belastung des Mediums durch tote Zellen und Debris (Zelltrümmer) gegeben

werden. Durch diese Informationen konnte eine gute Prognose erstellt werden, ob

bzw. wann die noch freien Stellen des Kultivierungsbodens konfluent sind, d.h. wann

ein Splitten (engl. = teilen) der Zellen notwendig ist.

2.1.3.4 Passagieren der Zellen / Medienwechsel

Nach vier Tagen exponentiellen Wachstums haben die Zellen meist einen

Konfluenzgrad von etwa 80% erreicht und bieten damit die optimale Dichte pro

Flächeneinheit für eine Subkultivierung. Dabei ist eine makroskopische und

mikroskopische Beurteilung der Zellkultur notwendig. Zum einen wurde die Farbe


21

des Mediums und zum anderen die Wachstumsdichte der Zellen bewertet. Sobald das

Medium eine leichte Orangefärbung annimmt und der Zellrasen ausreichend

konfluent ist, wurden die Zellen passagiert, wie im Folgenden beschrieben wird. Das

Passagieren ist notwendig, da sich nach Erreichen der maximalen Ausbreitungsdichte

ein Stillstand der Teilungsaktivität, was auch als Kontaktinhibition bezeichnet wird,

einstellt und somit eine maximale Ausbeute nicht möglich ist. Eine Ausdünnung durch

Passagieren ermöglicht ein weiteres Zellwachstum.

Im ersten Schritt des Passagiervorgangs wird das alte Kulturmedium mit Hilfe einer

10ml-Pipette abgenommen und verworfen. Anschließend wurden die Zellen einmal

mit PBS- gewaschen und mit leicht erwärmten Trypsin/EDTA (37°C) durch

Schwenken benetzt. Die verwendeten Volumina sind der in Kapitel 2.1.3 aufgeführten

Tabelle (Tabelle 2.2) zu entnehmen. Zum effektiveren Ablösen wurden die benetzten

Zellen für 3-5min im Brutschrank inkubiert und anschließend leicht angeklopft, damit

sich die Zellen effektiver vom Boden ablösen. EDTA ist ein Chelatbildner, der eine

enorme Affinität für zweifach geladene Kationen, wie zum Bespiel Ca²+ besitzt. Durch

den somit entstandenen Calziumentzug kommt es zu einer Aufweichung der

Zellanheftungs- und Zellstrukturen und damit zu einer Auflösung des Zellrasens in

Einzelzellen [Boxberger, 2007]. Durch das ebenso vorhandene Trypsin wird die

Ablösung der Zellen von der Unterlage gleichfalls unterstützt, da es sich hier um ein

Verdauungsenzym mit proteolytischer Aktivität handelt. Nachdem sich alle Zellen

abgerundet und vom Boden abgelöst haben, wurde der Vorgang des „Trypsinierens“

durch die Zugabe von warmem FCS-haltigen Mediums (ca. 37°C) abgestoppt und

somit eine weitere Schädigung der Zellen verhindert. Im Weiteren wurden die Zellen

durch mehrmaliges Auf- und Abziehen mit einer 10ml-Pipette vereinzelt und somit

eine optimale Grundlage für das Subkultivieren und weitere Experimente geschaffen.

Im letzten Schritt wurden die Zellen verdünnt und in einer neuen Zellkulturflasche

ausgesät. Abhängig von der Menge der Zellen, die für die dementsprechenden

Experimente benötigt wurden, wurden neue Flaschen angesetzt. Die einzelnen

Volumina sind wieder der Tabelle 2.3 zu entnehmen. Durch das eingesetzte

Antibiotikum G418 sollen mögliche Kontaminationen verhindert werden. Alle neu

angesetzten Kulturflaschen wurden beschriftet (Name der Zelllinie, Passagenzahl,

Datum) und in den Brutschrank gestellt.


22

2.1.3.5 Aussaat der CHO-Zellen in 24-Well-Platten

Die Aussaat der Zellen in 24-Well-Platten bildet die Grundlage für alle durchgeführten

Experimente. Je nach unterschiedlichen Ansätzen, welche im Kapitel Ergebnisse noch

weiter beschrieben werden, wurden verschiedene Zelldichten/Zellzahlen ausgesät.

Beim anschließenden Medienwechsel wurde mit verschiedenen Konzentrationen an

fötalem Rinderserum (FCS) gearbeitet. Durch die untereinander abgetrennten

Plattenvertiefungen war es möglich, eine Vielzahl von Versuchsreihen auf einer Platte

durchzuführen. Ebenso haben die gewählten Zellkulturplatten optimale optische

Eigenschaften und garantieren einen kontrollierten Gasaustausch bei geringer

Verdunstung, was eine mögliche Fehlerquote sehr gering hält.

Die Aussaat der Zellen knüpft an das schon in Abschnitt 2.1.3.4 beschriebene Ablösen

der Zellen an. Dazu wurden die Zellen in den vorher kultivierten

T75-Zellkulturflaschen mit PBS- gewaschen, mit Trypsin/EDTA abgelöst und die

Reaktion mit Medium abgestoppt. Für eine definierte Zellzahl der einzelnen

Experimente, wurde die vorhandene Anzahl an Zellen mit Hilfe eines Zellzählgerätes

bestimmt. Dieser Arbeitsschritt wird in Abschnitt 2.2 „Zellzahlbestimmung“

ausführlicher beschrieben. Je nach gewünschter Zelldichte wurde die Zellsuspension

in einem dafür vorbereitetem 15 ml- oder 50 ml-Zentrifugengefäß verdünnt. Dabei

wurde zuerst das berechnete Medium mit dem Antibiotikum G418 (200 μg/ ml → 4 μl

der konzentrierten Stammlösung auf 1 ml Medium) vorgelegt und folgend das

Volumen an Zellsuspension hinzugegeben. Anschließend wurde durch mehrmaliges,

vorsichtiges Schwenken des Zentrifugengefäßes die Suspension vermischt. Von dieser

Suspension wurde mit Hilfe einer 1000µl Pipette mit abgeschnittener blauer Spitze

jeweils 1 ml in ein Well pipettiert. Um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu

gewährleisten, wurde nach dem Verteilen auf 4 Wells die Zellsuspension erneut

vorsichtig durch Schwenken resuspendiert. Nach 24h wurde das alte Medium entfernt

und durch das in den einzelnen Experimenten relevante Medium mit gewähltem FCS-

Anteil ersetzt, was in der folgenden Tabelle dargestellt ist. Dabei wurde jeweils 1ml

neues Medium pro Well verwendet.


23

Tabelle 2.4 Medienansatz mit unterschiedlichen FCS- Konzentrationen für ein Standardansatzvolumen von 10ml Mediengemisch

FCS- Anteil [%] Medium Ham´s F12 [ml] (inkl. Pen/Strep, L-Glu) FCS [ml] G418 [µl]

0 10 - 40 2 9,8 0,2 40 4 9,6 0,4 40 6 9,4 0,6 40 8 9,2 0,8 40 10 9 1 40

Es wurden pro Experiment jeweils zwei identisch befüllte 24-Well-Platten verwendet,

wobei für jeden Test (definierte Zellzahl mit definierter FCS- Konzentration im

Medium) ein Doppelansatz vorbereitet wurde. Dabei wurde eine Platte für die

Zellzahlbestimmung und die zweite Platte für die Bestimmung des GFP-Gehalts am

Spektrofluorometer genutzt, was in Kapitel 2.3 beschrieben wird.

Die Verteilung der Zellsuspension ist in Abbildung 2.2 dargestellt.

Abbildung 2.2: Pipettierschema zur Aussaat der CHO-Zellen in einer 24-Well-Platte. Pro Analysengang wurden jeweils zwei indentisch befüllte Platten ausgesät, um zum einen die Zellzählung und zum anderen die Fluoreszenzmessung durchzuführen. Dabei wurden jeweils die ersten vier Wells mit je 1ml Zellsuspension befüllt (1-4). Nach Resuspendieren der Suspension durch Schwenken wurden die nächsten vier Wells der anderen Platte befüllt (5-8). Je nach Vorgabe des Experiments wurde die entsprechende Menge an Wells nach diesem Schema befüllt.

Quelle: eigene Zeichnung; Lisa Schindler; 2012


24

2.1.3.6 Kryokonservierung

Um eine Zelllinie möglichst dauerhaft zu erhalten, ist es von großer Wichtigkeit,

Zellen in niedrieger Passagenzahl in einem oder mehreren Kryoröhrchen

einzufrieren. Voraussetzung dafür ist, eine gesunde, unkontaminierte und möglichst

junge und vitale Zellkultur zu verwenden. Dazu werden die ausgewählten Zellen in

den Kulturflaschen mit PBS- gewaschen, mit Trypsin/EDTA abgelöst und

anschließend mit Medium versetzt. Dieser Arbeitsablauf wurde im oberen Abschnitt

2.1.3.4 (Passagieren von Zellen/ Medienwechsel) genauer beschrieben. Nachdem die

Zellsuspension vorsichtig resuspendiert wurde, konnte diese in ein 50ml-

Zentrifugenröhrchen überführt werden. Im Anschluss wurden die Zellen 3 min bei

300Xg (g= Erdbeschleunigung ≈9,81m/s²) bei Raumtemperatur zentrifugiert und der

Überstand verworfen. Je nach Suspensionsvolumen wurde das entstandene Pellet in

Einfriermedium resuspendiert. Dabei wurde pro 10ml Zellsuspension je 1ml

Einfriermedium verwendet. Die so entstandene Suspension wurde nun auf

Tiefkühlröhrchen aliquotiert (pro Röhrchen jeweils 1ml Einfriersuspension) und

zuerst für zwei Stunden in einem Styroporbehälter bei 4°C gekühlt, anschließend über

Nacht bei -20°C und danach über Nacht bei -80°C eingefroren. Hier sind die Zellen nun

mehrere Monate haltbar. Um eine Langzeitaufbewahrung zu gewährleisten, wurden

die Zellen nach Einfrieren bei -80°C in flüssigen Stickstoff eingelagert. Das

schrittweise Abkühlen der Zellen ist notwendig, um die Zellen möglichst schonend

tiefzugefrieren und keine Schäden an der Zellstruktur zu hinterlassen.

2.2 Zellzahlbestimmung

Die Zellzahlmessung war für die exakte Auswertung der Ergebnisse der einzelnen

Experimente notwendig, um einen genauen Verlauf des Zellwachstums bzw.

Zellsterbens zu erkennen. Ebenso war diese Messung notwendig, um das gemessene

Fluoreszenzsignal auf die Anzahl an CHO-Zellen zu beziehen und somit eine Aussage

über die Expression der Zellen von rekominantem grün fluoreszierendem Protein

treffen zu können.

Bei dem verwendeten Zellzählgerät handelt es sich um den „Countess™ Automated

Cell Counter“ von Invitrogen.


25

Die Herstellung der zu messenden Zellsuspension knüpft an das schon in Kapitel

2.1.3.4 beschriebene Ablösen der Zellen an. Abhängig davon, ob es sich um das

Ablösen von einer Zellkulturflasche, oder einer 24-Well-Platte handelt, werden die

entsprechenden Volumina, die der Tabelle 2.2 zu entnehmen sind, verwendet.

2.2.1 Beladen der Zählkammer/ Messung durch Countess™ Automated Cell Counter

Hierzu wurden vorbereitend die Probe im Verhältnis 1:1 mit einer 0,4%igen

Trypanblau- Lösung gemischt. Anschließend wurden aus diesem Gemisch 10µl in eine

der beiden halbmondförmigen Zellzählkammeröffnungen pipettiert (gekennzeichnet

mit A oder B). Anschließend wurde die Seite mit der Probe nach vorn in die passende

Öffnung im Zellzählgerät geschoben, bis ein leises „Klick“ ertönt. Um ein scharfes Bild

der Zellen zu bekommen, und somit eine präzise Messung zu gewährleisten, wurde als

erstes die Zoomtaste betätigt, sodass die einzelnen Zellen gut sichtbar waren. Mit

Hilfe des Fokusrädchens an der Seite des Gerätes konnte man das Bild so einstellen,

dass eine optimale Messung möglich war. Dazu sollen die lebenden Zellen ein klares

Zentrum und eine dunkle Umrandung besitzen, wobei die toten Zellen einen

gleichförmigen dunklen Farbraum ohne ein helles Zentrum aufweisen (siehe

vergleichend Abb. 2.3).

Abbildung 2.3: Lebende und tote Zellen mit der richtigen/optimalen Einstellung am Countess™ Automated Cell Counter von Invitrogen. Die als lebend gekennzeichneten Zellen (Live) besitzen ein klares Zentrum und eine dunkle Umrandung. Die als tot gekennzeichneten Zellen (Dead) haben einen gleichförmigen dunklen Farbraum ohne ein helles Zentrum. Mit Hilfe der Software des Gerätes können diese beiden Signaltypen unterschieden werden.

Quelle::invitrogen.com


26

Um die Messung durchzuführen musste die „Count cells – Taste“ betätigt werden.

Nach circa 30sec erscheint das Ergebnis der Messung auf dem Display und kann von

dort auf einen USB-Stick gespeichert werden. Mit Hilfe des Countess™ Automated Cell

Counter von Invitrogen kann nicht nur die Gesamtzellzahl, sondern auch die jeweils

lebenden und toten Zellen genau bestimmt werden. In Abbildung 2.4 werden die

einzelnen Schritte noch einmal mit Hilfe von Bildern dargestellt.

Abbildung 2.4: Schrittweise durchgeführte Zellzahlmessung mit Hilfe des Countess™ Automated Cell Counter von Invitrogen. Pipettieren der vorbereiteten Zelllösung in die Zählkammer (A); die befüllte Zellzählkammer wir in das Gerät eingeführt (B); nach Einstellung der gewünschten Parameter muss der Knopf „Count cells“ betätigt werden (C); nach cirka 30sec erscheint das Ergebnis auf dem Display des Zählgerätes.

Quelle: invitrogen.com

2.3 Fluoreszenzmessung

2.3.1 Spektrofluorometer

Bei einem Spektrofluorometer handelt es sich um ein wissenschaftlich genutztes

Instrument, das die fluoreszierenden Eigenschaften von Verbindungen nutzt, um eine

Aussage über Konzentration einer Probe zu liefern. Speziell für die Vermessung von

GFP nutzt man die Fluoreszenzspektroskopie, auch bekannt als Fluorometrie oder


27

Spektrofluorometrie, die eine spezielle Art der elektromagnetischen Spektroskopie

darstellt und die Fluoreszenz einer Probe analysiert.

Für die Messung der Probe wurde ein Spektrofluorometer der Firma Shimadzu

(Modell: RF-5301PC) verwendet. Als Probengefäß wurde eine Quarzküvette

eingesetzt, da diese das zur Messung verwendete UV-Licht nicht absorbiert und somit

die Ergebnisse nicht verfälscht.

Mit Hilfe der speziell entwickelten Software „Panorama“ die auf einem an das

Spektrofluorometer angeschlossenen Computer installiert ist, können die Messungen

gesteuert und ausgewertet werden.

Bevor die einzelnen Ansätze vermessen werden konnten, musste das

Spektrofluorometer bereits etwa 30min vor Messbeginn eingeschaltet werden, damit

der Verschleiß der Lampe möglichst gering gehalten wird und somit die

Nutzungsdauer erhöht werden kann.

Abbildung 2.5: Spektrofluorometer der Firma Shimadzu (Modell: RF-5301PC) Gerät mit angeschlossenem Computer (Bild links); Probenraum zur Messung der GFP-Proben (Bild rechts)

Quelle: eigene Fotos; Lisa Schindler; 2012

2.3.2 Vorbereiten der Zellen von einer 24-Well-Platte zur anschließenden Vermessung im Spektrofluorometer

Um die Zellen für die Messung im Spektrofluorometer vorzubereiten, müssen diese

mit Hilfe eines Lysatpuffers permeabilisiert werden, da es sich beim GFP um ein

intrazelluläres Protein handelt. Dabei muss besonders darauf geachtet werden, dass


28

das GFP durch das Einwirken des Lysatpuffers nicht denaturiert und somit verloren

geht. Ebenso ist es von enormer Wichtigkeit, dass der Puffer keinen Einfluss auf die

Messung ausübt und somit beispielsweise keine Streuung dieser bewirkt. Aus der

Projektarbeit von Aasif und Schröder konnte entnommen werden, dass sich für diesen

Versuch ein Gemisch aus PBS- mit 0,5% Triton X-100 am besten eignet [Aasif und

Schröder, 2010].

Beim Vorbereiten der Zellen für die anschließende Vermessung am

Spektrofluorometer waren keine sterilen Arbeitsbedingungen nötig. Im ersten Schritt

wurde das alte Medium verworfen und jedes mit Zellen bewachsene Well einmal

vorsichtig mit 1ml PBS- gewaschen. Im Folgenden wurde in jedes Well jeweils 2ml des

vorbereiteten Lysatpuffer pipettiert. Anschließend wurde die 24-Well-Platte in einem

mit Eis gefüllten Gefäß auf einem Kippschüttler positioniert und für 30min bei

ständiger Bewegung inkubiert. Eine Kühlung war notwendig, um das Protein zu

schonen und somit eine genauere Messung zu ermöglichen [Aasif und Schröder,

2010]. Nach Abschluss der Inkubationszeit wurde das Zelllysat mit Hilfe einer 1000µl

Pipette mehrmals resuspendiert, um noch eventuell intakte Zellen mechanisch

aufzubrechen.

Zur Messung des GFP-Signals der Probe wurde das Lysat in eine Quarzküvette

überführt, in den Probenmessraum des Gerätes platziert (siehe Abbildung 2.5) und

sofort vermessen.

2.3.3 Messung der Probe mit Hilfe der Software Panorama

Mit Hilfe der Ausarbeitungen von Stephanie Westphal zum Thema „Einfluss von

Serum und Serumersatzstoffen auf die Expression von rekombinantem Grün

Fluoreszierenden Protein in CHO-Zellen“ konnten alle Parameter, wie zum Beispiel

Wellenlänge, Emissionsstart, Emissionsstop oder die Messgeschwindigkeit

übernommen werden. Die einzelnen Werte werden in der folgenden Tabelle 2.5

aufgeführt.


29

Tabelle 2.5 Einzelne, am Gerät einzustellende Parameter für die Messung der GFP-Probe

2D Emissionsmessung

Anregungswellenlänge Emissions-Start Emissions-Stop

434 nm 300 nm 600 nm

Instrumentenparameter

Anregungs- Schlitzbreite Emissions- Schlitzbreite Empfindlichkeit

10 nm 10 nm Hoch

Messparameter

Messgeschwindigkeit Antwortzeit Abtastzeit

Super Automatisch 1 nm

Um im vollen Umfang eine Messung durchführen und anschließend speichern zu

können, muss zuerst einmalig ein Überordner erstellt werden, der für diese Arbeit mit

„LS“ gekennzeichnet wurde. Dies ist unter dem Menüpunkt <Projekt><Neu> möglich.

Ebenso war es im Anschluss möglich für jedes durchgeführte Experiment einen

Unterordner zu erstellen, der mit dem jeweiligen Datum und der Nummer des

Experimentes benannt wurde.

Abbildung 2.6: Software Panorama; Ausschnitt des Ordners <Projekt> Unter dem in der Menüleiste angeführten Ordner „Projekt“ kann ein neuer/ eigener Projektordner erstellt werden.

Quelle: Westphal, 2011

Anschließend wurde im Menüpunkt <RF-5301> die Messmethode

2D-Emissionsmessung für die Vermessung der GFP-Proben eingestellt.


30

Abbildung 2.7: Software Panorama; Ausschnitt des Ordners <RF-5301> Unter dem in der Menüleiste angeführten Ordner „RF-5301“ ist die Methode der 2D Emissionsmessung auszuwählen.


Für die nun folgende Probenmessung wurde die gesamte vorbereitete Probe (siehe

Kapitel 2.3.2) in eine Quarzküvette pipettiert. Hier muss besonders darauf geachtet

werden, dass die Seitenwände der Küvette möglichst sauber und klar sind, damit die

Messung nicht verfälscht wird. Ebenso kann es durch die gekühlte Probe zu einer

Kondenswasserbildung an den Seitenwänden kommen. Diese müssen vor der

Messung mit Hilfe eines Papiertuches getrocknet werden.

Nachdem die Eingabe der Messdaten erfolgt ist (Tabelle 2.5), wurde die Küvette samt

Probeninhalt in den vorgesehenen Halter im Probenmessraum positioniert und die

Messung gestartet. Nach Abschluss der Messung konnte durch das automatische

Öffnen eines Fensters auf dem Display der Name und das Datum der Einzelmessung

gespeichert werden, um eine Übersicht der Messergebnisse zu gewährleisten.

2.3.4 Peakflächenberechnung mit Hilfe der Software Panorama

Zum Berechnen der Peakflächen wurde unter dem Menüpunkt <Mathematik> das

Programm <Peaksuche> ausgewählt.


31

Abbildung 2.8: Peakflächenberechnung a) Menüpunkt <Mathematik> mit der Auswahl <Peaksuche> in der Sofware Panorama, b) Ausschnitt des Fenster nach Auswahl des Programmpunktes <Peaksuche>


Nach Auswahl des Menüpunkes <Peaksuche> erscheint eine rote Gerade über der

Messkurve (siehe Abbildung 2.9). Diese Gerade wurde mit Hilfe einer Pfeiltaste nach

unten bewegt bis sich die Fläche unter der Kurve grau eingefärbt hat. Anschließend

wurde die Schaltfläche <Berechnen> ausgewählt. Die vom Programm automatisch

festgelegten Anfangs- und Endwerte zur Berechnung der Peakfläche wurden in der

Peaktflächentabelle (Abbildung 2.10) angezeigt und konnten nach Belieben verändert

werden. Nach einer möglichen Änderung wurde der Wert für die Peakfläche von der

Software automatisch angepasst bzw. berechnet.

Abbildung 2.9: Darstellung der Grenzen der Peakflächenberechnung Die dargestellten Zahlen im oberen Bereich zeigen die Emissionswellenlänge der vom Programm ermittelten Maxima. Die obere Gerade stellt dabei den Anfangszustand dar. Die untere Gerade stellt Soll-Endzustand für Berechnung dar. Die geraden dürfen nur so verschoben werden, dass der Peak in einem grauen Farbton erscheint. Die ist der Berechnungsbereich für das Fluoreszenzsignal.



32

Abbildung 2.10: Peakflächentabelle Türkis hinterlegtes Feld stellt Messdaten der GFP-Expression dar. Anfangs- und Endwert der Peakflächenberechnung können verändert werden. Peakflächenwerte werden der Spalte "Peakfläche" entnommen.


2.4 Fluoreszenzmikroskopie

In der Fluoreszenzmikroskopie können Strukturen oder Proteine spezifisch durch

Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen sichtbar gemacht werden. Fluoreszierende

Farbstoffmoleküle absorbieren Licht bei bestimmten Wellenlängen und emittieren

längerwelliges, charakteristisches Fluoreszenzlicht.

Abbildung 2.11: Verwendetes Fluoreszenzmikroskop der Firma Olympus (Modell: BX41)

Quelle: eigenes Foto; Lisa Schindler; 2012

Um eine Immunfluoreszenzanalyse durchführen zu können, mussten die

entsprechenden CHO-Zelllinien auf sterilen Deckgläschen in einer 24-Well-Platte

ausgesät werden. Die Deckgläschen wurden dazu vorher autoklaviert und

anschließend mit einer spitzen Pinzette möglichst vorsichtig unter sterilen

Bedingungen in die 24-Well-Kulturplatte überführt. Im Folgenden wurden die aus


33

einer konfluenten T75-Flasche abgelösten Zellen (Arbeitsanweisungen siehe

Kap. 2.1.2) mit einer Zelldichte von 1x105 und 1x106 Zellen pro Well ausgesät. Die

Zellkulturplatten werden nun im Inkubator bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert.

Nach 24 h wurde das alte Medium entfernt und durch neues Medium mit

unterschiedlichen FCS-Anteilen ersetzt, was in der oben bereits eingefügten Tabelle

2.3 dargestellt ist. Dabei wurde jeweils 1ml neues Medium pro Well verwendet.

Nach einer Inkubationszeit von 96h wurden die Zellen für die

Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet. Dazu wurde das alte Medium verworfen und die

Zellen im ersten Schritt jeweils zweimal kurz mit PBS- gewaschen. Anschließend

wurden 500µl einer 3%ige Paraformaldehydlösung in die Wells pipettiert und für

30min inkubiert, was die Zellen fixierte. Sodann wurden die Zellen jeweils drei Mal für

5min mit PBS- gewaschen und mit 1000µl einer 50mM Ammoniumchlorid-Lösung (in

PBS gelöst) überschichtet und für 30min inkubiert. Dieser Schritt dient dem

Quenchen der Aldehydgruppen (Schlagartiges Abbrechen der Reaktion).

Anschließend wurden die Zellen dreimal für 5min mit PBS- gewaschen. Im letzten

Schritt wird auf einen Objektträger je 5µl Mowiol vorgelegt und das Deckgläschen

kurz in autoklaviertes Wasser getaucht, wobei der Überschuss an Wasser wieder

vorsichtig mit einem Papiertuch entfernt wird. Mowiol wird verwendet, da es die

Fluoreszenz der Zellen nicht verändert. Die Deckgläschen werden mit den Zellen nach

unten auf den Mowiol-Tropfen gelegt, über Nacht in einer lichtundurchlässigen Box

getrocknet und können dann für die Fluoreszenzmikroskopie verwendet werden.

Tabelle 2.6: Lösungen für die Fluoreszenzmikroskopie

Paraformaldehydlösung

- 1600ml PBS auf 80°C erhitzen - 60g Paraformaldehyd zufügen und

mischen, bis klare Lösung entsteht - 200µl 1M CaCl2 zufügen und mit 200µl 1M

MgCl2 versetzt, während die Lösung noch warm ist

- abkühlen lassen und mit PBS- auf 2000ml auffüllen

- auf pH 7.4 einstellen - Lagerung: bei -20°C in 10ml Aliquots


34

Ammoniumchlorid - 2,675g NH4Cl in PBS lösen - auf 1l mit PBS auffüllen

Mowiol - 6g Glycerol in einem 50ml Falkon abwiegen

- 2,49g Mowiol zufügen und gut mischen - 6ml ddH2O hinzu und etwa 2h bei RT gut

mischen - 12ml 0,2M Tris-HCL-Lösung (pH8.5)

hinzufügen und bei 53°C mischen, bis Mowiol gut gelöst ist

- um Lösung zu klären bei 4.000rpm 20min zentrifugieren; den Überstand aliquotieren und bei -20°C lagern

Ergebnisse

35

3 Ergebnisse

3.1 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression der beiden Zelllinien CHO-GFP und CHO-GFP-Rab11 in Abhängigkeit von der Aussaatdichte

Beide CHO-Zelllinien wurden nach Ablösen von einer T75-Zellkuturflasche mit Hilfe

des Zellzählgerätes gezählt und somit die genaue Zellzahl bestimmt. Die für das

Experiment benötigten Zellzahlen (1x105, 3x105, 5x105, 1x106 Zellen pro Well)

wurden anschließend in einem 50ml-Zentrifugenröhrchen mit der dementsprechend

ausgerechneten Menge an Ham´s F12 Medium verdünnt. Ebenso wurde diese

Zellsuspension mit Antibiotikum (G418) versetzt. Die einzelnen Ansätze wurden auf

24-Well-Platten verteilt und für 24h in den Brutschrank gestellt. Nach dieser

Inkubationszeit wurde ein Medienwechsel mit den verschiedenen Konzentrationen an

FCS (0% FCS – 10% FCS) durchgeführt, wobei für jeden Medienansatz

Doppelbestimmungen vorlagen.

3.1.1 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei niedriger Aussaatdichte (1x105)

Für die genaue Betrachtung der Proteinexpression in adhärenten Zellen ist die

Aussaatdichte ein sehr wichtiger Faktor. Ebenso ist die Untersuchung der

Unterschiede zwischen den im Medium enthaltenen Konzentrationen an FCS ein

wichtiger Aspekt [Boxberger, 2007].

Ergebnisse

36

0

100000

200000

300000

400000

0%FCS 2%FCS 4%FCS 6%FCS 8%FCS 10%FCS

FCS-Konzentration

Ze

llza

hl

pro

cm

²

CHO-GFP-Rab11

CHO-GFP

Zellaussat pro cm²

Abbildung 3.1: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei niedriger Aussaatdichte (1x105) Dargestellt ist der Verlauf des Wachstums der Zellen pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Linie stellt die Zelldichte (hier: 1x105) dar, mit der die Zellen ausgesät wurden. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.

In Abbildung 3.1 wird das Zellwachstum in Abhängigkeit der vorhandenen

Konzentration an fetalem Kälberserum im Kulturmedium dargestellt. Dabei wurden

zwei unterschiedliche Zelllinien miteinander verglichen, um die Allgemeingültigkeit

der Ergebnisse und den daraus erzielten Aussagen zu untersuchen. Um die einzelnen

Zelllinien voneinander unterscheiden zu können, wurden unterschiedlich farbige

Diagrammbalken (rosa, blau) verwendet.

Es ist deutlich zu erkennen, dass das Zellwachstum anfänglich linear ansteigt, je mehr

FKS im Medium enthalten ist. Betrachtet man dabei die einzelnen Zelllinien

untereinander ist ihre Wachstumkurve in etwa gleich. Dabei zeigt sich, dass diese

Entwicklung bei einer FCS-Konzentration von 4% abflacht und erreicht ein Plateau.

Durch die im Diagramm eingezeichnete Aussaat-Linie ist zu erkennen, dass die Zellen

in jedem Ansatz proliferieren. Dabei wird allerdings ein enormer Unterschied

zwischen dem Zellwachstum bei 0% FCS und 10% FCS im Medium deutlich. Bei einer

FCS- Konzentration von 0% hat sich die Zellzahl um etwa das Doppelte gesteigert.

Vergleichend dazu sind die Zellendichten bei einer FCS- Konzentration von 10% um

etwa das vier bis fünf fache gestiegen.

Im Weiteren wurde nicht nur das Zellwachstum, sondern auch die im

Spektrofluorometer gemessene Expression von GFP pro Zelle in Bezug gestellt.

Ergebnisse

37

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012

0,014

0,016

0,018


FCS-Konzentration

GF

P (

Pe

ak

flä

che

) p

ro Z

ell

e

CHO-GFP-Rab11

CHO-GFP

Abbildung 3.2: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle bei niedriger Aussaatdichte (1x105) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle in Abhängigkeit von der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP/ GFP-Rab11 wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.

Betrachtet man nun die Expression an GFP/ GFP-Rab11, ist zu erkennen, dass bei

Zugebe von FCS im Medium die beobachtbare Proteinexpression zurückgeht

(Abbildung 3.2). Die größte Expressionsabnahme ist von 0% auf 2% FCS festzustellen,

danach schwanken die Werte auf ähnlichem Niveau. Dabei ist in beiden Zelllinien zu

sehen, dass das größte Signal des fluoreszierenden Proteins bei einer Konzentration

von 0% FCS im Medium gemessen wurde. Unterschiedlich sind die einzelnen Werte

der Zelllinien untereinander. Dabei ergeben die Signale der CHO-GFP-Zelllinie erhöhte

Werte im Bezug auf die andere Zelllinie (CHO-GPF-Rab11).

Ergebnisse

38

0

1000

2000

3000


FCS-Konzentration

GF

P (

Pe

ak

flä

che

) p

ro c

m²

CHO-GFP-Rab11

CHO-GFP

Abbildung 3.3: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm² bei niedriger Aussaatdichte (1x105) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression bezogen auf die Wachstumsfläche pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.

Die Messung des gesamten Zelllysates gab Aufschluss über den Anteil an GFP pro cm²

bewachsener Kulturfläche und spiegelt somit die Summe beider Parameter Zelldichte

und Expression der Zellen wider. Dabei ist zu erkennen, dass die Menge an GFP pro

cm² mit steigender FCS- Konzentration stetig zunimmt, wobei ab 4% FCS die

Zunahme stark abflacht (Abbildung 3.3). Dabei wurde feststellt, dass trotz der hohen

Werte in der GFP-Expression pro Zelle bei einer Kultivierung ohne Serum, die Signale

der Gesamtprobe relativ gering im Vergleich zur Kultivierung mit Serum sind. Das

liegt daran, dass die Zellen ohne serumhaltiges Medium eine viel geringe Proliferation

aufweisen.

3.1.2 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei hoher Aussaatdichte (1x106)

Um die Bedeutung der Aussaatdichte der Zellen auf das Wachstum und die

entsprechende GFP-Expression zu untersuchen, wurden die Zellen in einem zweiten

Experiment sehr dicht ausgesät. Dabei sollte untersucht werden, ob sich beide

Zelllinien bei einer Aussaatdichte von 1x106 pro Well ähnlich verhalten wie in dem

vorherigen Experiment, bei einer Zelldichte von 1x105 pro Well.

Ergebnisse

39

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000


FCS-Konzentration

Ze

llza

hl

pro

cm

²CHO-GFP-Rab11

CHO-GFP

Zellaussat pro cm²

Abbildung 3.4: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei hoher Aussaatdichte (1x106) Dargestellt ist der Verlauf des Wachstums der Zellen pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Linie stellt die Zelldichte (hier: 1x106) dar, mit der die Zellen ausgesät wurden. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.

Bei einer Aussaatdichte von 1x106 ist deutlich zu sehen, dass es kein weiteres

Zellwachstum in den einzelnen Ansätzen gab. Vielmehr ist durch die Reduzierung

oder das Weglassen von FCS ein deutlicher Abfall der Zelldichte zu beobachten, was

besonders in den Ansätzen mit 0%-4% FCS zu sehen ist. Dies deutet auf das Sterben

von Zellen hin. Das Fehlen der wichtigen Faktoren, die im FCS enthalten sind

(Wachstumsfaktoren, Spurenelemente, Hormone), hat offensichtlich bei einer hohen

Aussaatdichte einen besonders großen Einfluss auf das Überleben der Zellen. Für die

Kultivierung mit 6%-10% FCS ist zu erkennen, dass die Zellen trotz Serum nicht

weiter proliferieren können. Dies lässt darauf schließen, dass mit einer Zelldichte von

1E6 pro Well die maximale Wachstumsfläche ausgeschöpft ist.

Ergebnisse

40

0

0,002

0,004

0,006


FCS-Konzentration

GF

P (

Pe

ak

flä

che

) p

ro Z

ell

e

CHO-GFP-Rab11

CHO-GFP

Abbildung 3.5: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle bei hoher Aussaatdichte (1x106) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle in Abhängigkeit von der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP/ GFP-Rab11 wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.

Auch bei einer hohen Aussaatdichte ist zu sehen, dass die Produktion an GFP/

GFP-Rab11 pro Zelle bei serumfreier Kultur bzw. niedriger FCS- Konzentration am

deutlichsten ausgeprägt ist und somit die Präsenz von Serum die Expression von GFP

reduziert. Allerdings ist dieser Effekt nicht mehr so stark ausgeprägt, wie bei der in

Abbildung 3.2 dargestellten geringern Aussaatdichte.

Zusätzlich ist noch der Unterschied zwischen den einzelnen Zelllinien bzw.

expremierten Proteinen zu berücksichtigen. Die rosa hinterlegten Balken, die auf die

Werte der CHO-GFP-Zelllinie hinweisen, zeigen einen Abfall der Werte an

vorhandenem GFP, je weniger Serum sich im Medium befindet. Hingegen verhält sich

die CHO-GFP-Rab11-Zelllinie, die durch blau hinterlegte Balken gekennzeichnet ist,

eher leicht ansteigend, bzw. auf einer gleichen Konzentrationsebene an GFP, je mehr

Serum im Medium enthalten ist.

Weiterführend wurden auch hier die Werte für Zelldichte und GFP-Expression

verknüpft, um die Ausbeute an rekombinantem Protein pro cm² Kulturflasche

wiederzugeben.

Ergebnisse

41

0

1000

2000

3000


FCS-Konzentration

GF

P (

Pe

ak

flä

che

) p

ro c

m²

CHO-GFP-Rab11

CHO-GFP

Abbildung 3.6: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm² bei hoher Aussaatdichte (1x106) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression bezogen auf die Wachstumsfläche pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.

Die Ausbeute pro cm² Wachstumsfläche folgt für das Membranprotein GFP-Rab11

einem ähnlichen Verlauf, wie dies bereits bei niedriger Aussaatdichte zu beobachten

war (Abbildung 3.3), mit zunehmender FCS- Konzentration steigt die

Proteinausbeute. Für das cytosolische GFP ist das nicht der Fall, hier hat CS keinen

förderlichen Einfluss auf die Produktausbeute.

3.1.3 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei mittlerer Aussaatdichte (3x105, 5x105)

Um zu untersuchen, wie die Zellen sich bei mittleren Aussaatdichten verhalten

wurden diese in Konzentrationen von 3x105 und 5x105 Zellen pro Well ausgesät und

vermessen. Dabei sollte festgestellt werden, wie sich die Zellen im Vergleich zu den

vorher vermessenen extremen Aussaatdichten von 1x105 und 1x106 verhalten.

Ergebnisse

42

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000


FCS-Konzentration

Ze

llza

hl

pro

cm

²

CHO-GFP-Rab11

CHO-GFP

Zellaussat pro cm²

Abbildung 3.7: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei mittlerer Aussaatdichte (3x105) Dargestellt ist der Verlauf des Wachstums der Zellen pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Linie stellt die Zelldichte (hier: 3x105) dar, mit der die Zellen ausgesät wurden. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.

Auch bei einer mittleren Aussaatdichte von 3x105 pro Well ist zu beobachten, dass

sich das Zellwachstum mit zunehmender FCS- Konzentration deutlich steigert. Ab

einer FCS- Konzentration von 4% (GFP) bzw. 6% (GFP-Rab11) flacht die Steigung ab.

Dabei wachsen die CHO-GFP-Rab11-Zellen etwas langsam, besonders in serumfreier

Kultur. Im Gegensatz dazu haben sich die CHO-GFP-Zellen in serumfreien Medium

sehr gut vermehrt und können eine fast 100%ig höhere Zellzahl nach 72h aufweisen.

Bei einer Kultivierung mit serumhaltigem Medium ist allerdings eine bis zu dreimal

höhere Zellzahl als ohne Serum zu erkennen. Das Wachstum der Zellen wird somit

auch bei einer mittleren Aussaatdichte stark vom Vorhandensein von Serum

beeinflusst.

Ergebnisse

43

0

0,002

0,004

0,006

0,008

0,01

0,012


FCS-Konzentration

GF

P (

Pe

ak

flä

che

)pro

Ze

lle

CHO-GFP-Rab11

CHO-GFP

Abbildung 3.8: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle bei mittlerer Aussaatdichte (3x105 ) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle in Abhängigkeit von der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP/ GFP-Rab11 wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.

Beider Betrachtung der GFP/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle ist wieder deutlich

erkennbar, dass bei beiden Zelllinien der Expression an Protein bei einer

Konzentration von 0%FCS deutlich erhöht ist. Mit steigendem Serumanteil im

Medium sinken die relativen Werte an GFP pro Zelle, wobei sich der Trend bei etwa

6% FCS- Anteil stabilisiert. Beide Zelllinien verhalten sich in ihrem Verlauf auch hier

sehr ähnlich.

Ergebnisse

44

0

1000

2000

3000


FCS-Konzentration

GF

P (

Pe

ak

flä

che

) p

ro c

m²

CHO-GFP-Rab11

CHO-GFP

Abbildung 3.9: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm² bei mittlerer Aussaatdichte (3x105) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression bezogen auf die Wachstumsfläche pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.

In Bezug auf die Ausbeute pro Wachstumsfläche kann wieder festgestellt werden,

dass die Werte mit steigender FCS- Konzentration sich schrittweise deutlich erhöhen.

Dabei ist zu erkennen, dass sich für die GFP- Expression die Werte im Bereich von

4%-10% FCS angleichen und ein Plateau erreichen. Die Expression von GFP-Rab11

steigt hingegen kontinuierlich an und flacht er bei 10% FCS- Anteil ab, ähnlich der

Beobachtung bei hoher Aussaatdichte (Abbildung 3.6).

Um einen weiteren Bereich in der mittleren Aussaatdichte abdecken zu können,

wurden im Folgenden die Zellen in einer Konzentration von 5x105 Zellen pro Well

ausgesät.

Ergebnisse

45

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000


FCS-Konzentration

Ze

llza

hl

pro

cm

²

CHO-GFP-Rab11

CHO-GFP

Zellaussat pro cm²

Abbildung 3.10: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) Dargestellt ist der Verlauf des Wachstums der Zellen pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Linie stellt die Zelldichte (hier: 5x105) dar, mit der die Zellen ausgesät wurden. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.

Auch bei dieser Aussaatdichte ist ein stetiger Anstieg des Zellwachstums mit

steigender FCS- Konzentration im Medium zu sehen. Bei 6% FCS- Anteil wird ein

Plateau erreicht. Hierbei sind die Werte und der allgemeiner Verlauf für beide

Zelllinien sehr ähnlich. Werden die Zellen ohne Serum kultiviert, zeigt sich nur eine

Zellezunahme von circa 20%. Hingeben ist bei einer Kultivierung mit serumhaltigem

Medium (10% FCS) eine um 100% gestiegene Zellzahl zu beobachten.

Ergebnisse

46

0

0,002

0,004

0,006

0,008


FCS-Konzentration

GF

P (

Pe

ak

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) p

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ell

e

CHO-GFP-Rab11

CHO-GFP

Abbildung 3.11: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle in Abhängigkeit von der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP/ GFP-Rab11 wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.

Im Hinblick auf die GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle wird auch hier deutlich,

dass sich mit einer Kultivierung ohne Serum das größte Fluoreszenzsignal ergibt.

Dabei zeigt sich, dass ab einer Reduzierung des Serums auf 4% FCS sich die

Expression stabilisiert. Vergleich man die einzelnen Zelllinien untereinander, so ist zu

erkennen, dass die CHO-GFP-Zellen in allen FCS- Konzentrationen erhöhte werde

aufweisen. Dabei ist allerdings der Unterschied bei einer Kultivierung ohne Serum am

geringsten.

Ergebnisse

47

0

1000

2000

3000


FCS-Konzentration

GF

P (

Pe

ak

flä

che

) p

ro c

m²

CHO-GFP-Rab11

CHO-GFP

Abbildung 3.12: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm² bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) Dargestellt ist der Verlauf der GFP-/ GFP-Rab11-Expression bezogen auf die Wachstumsfläche pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium. Die relativen Werte an GFP wurden mit Hilfe eines Spektrofluorometer und der Software Panorama als Peakfläche dargestellt und berechnet. Die Zellen wurden 24h nach Anheftung in das entsprechende Medium überführt und weitere 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert. Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Es wurden zwei verschiedene Zelllinien (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) miteinander verglichen, die mit unterschiedlich farbigen Balken gekennzeichnet sind.

Betrachtet man wieder die GFP- bzw. GFP-Rab11-Ausbeute pro cm² Wachstumsfläche

ist deutlich zu erkennen, dass sich die Werte bis etwa 6% FCS- Anteil leicht erhöhen

(um ca. 20%), um darüber ein Plateau ohne weitere Steigung zu erreichen.

3.2 Versuche zur Entwicklung einer Kultivierungsstrategie zur optimalen Ausbeute an GFP unter Serumentzug

Mit Hilfe dieser Experimente sollte eine Kultivierungsstrategie entwickelt werden, die

es möglich macht eine möglichst hohe Ausbeute an Protein zu erhalten. Dabei wurde

eine längere Kultivierung der Zellen mit zusätzlichen Medienwechseln ausgetestet.

In diesem Experiment wurde nur die CHO-GFP-exprimierende Zelllinie verwendet.

Dabei wurden die Zellen nach Ablösen von einer T75-Zellkuturflasche mit Hilfe eines

Zellzählgerätes gezählt und somit die genaue Zellzahl bestimmt. Die für das

Experiment benötigten Zellzahlen (1x105 oder 5x105) wurden anschließend in einem

50ml-Zentrifugenröhrchen mit der entsprechenden Menge an FCS-haltigem (x%)

Ham´s F12 Medium verdünnt und mit dem Antibiotikum G418 versetzt. Die einzelnen

Ansätze wurden auf 24-Well-Platten verteilt und für 24h im CO2- Inkubator kultiviert.

Nach dieser Inkubationszeit wurde ein Medienwechsel mit den verschiedenen

Konzentrationen an FCS (0% FCS – 10% FCS) durchgeführt, wobei für jeden Ansatz

Ergebnisse

48

Doppelbestimmungen vorgenommen wurden. Nach einer Kultivierung der Zellen für

72h wurde ein zweiter Medienwechsel durchgeführt, wobei das gesamte alte Medium

durch neues Ham´s F12 (+G418, 0-10% FCS) ersetzt wurde. Die ersten Messungen

(Zellzahl und GFP-Expression) wurden nach weiteren 72h Inkubationszeit

durchgeführt. Anschließend wurde ein weiter Medienwechsel durchgeführt, wobei

die Zusammensetzung des neuen Mediums unterschiedlich war. In einem Versuchsteil

bestand das neue Medium aus frischem Ham´s F12 (+G418, 0-10% FCS), in einem

anderen wurde eine 50:50 Medienmischung aus neuem und alten konditionierte

Medium eingesetzt. Die Messung dieser beiden Versuche wurde nach weiteren 96h

Inkubationszeit durchgeführt.

3.2.1 Proliferation und Expression bei einer niedrigen Aussaatdichte (1x105)

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000


FCS-Konzentration

Ze

llza

hl

pro

cm

² nach 6 Tagennach 10 Tagen (1)nach 10 Tagen (2)Zellaussat pro cm²

Abbildung 3.13: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei niedriger Aussaatdichte (1x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit Dargestellt ist der Verlauf des Wachstums der Zellen pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium nach einer geringen Aussaatdichte von 1x105. Für 12h inkubierte Zellen wurden nach dem ersten Medienwechsel für weitere 72h und nach zweitem Medienwechsel nochmals 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert (blaue Balken). Beim zweiten Ansatz wurde ein dritter Medienwechsel mit neuem Medium durchgeführt und die Zellen weitere 96h inkubiert (rosa Balken). Im dritten Ansatz wurde ebenfalls ein dritter Medienwechsel durchgeführt, hier aber mit einer Gemisch aus neuem und altem Medium im Verhältnis 50:50 (gelbe Balken). Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Aussaat-Linie stellt die Zelldichte (hier: 1x105) dar, mit der die Zellen vor Medienwechsel ausgesät wurden.

Die Zellen wurden hier mit einer Zelldichte von 1x105 pro Well ausgesät und das

Experiment wie im oberen Abschnitt 3.2 beschrieben durchgeführt. Die

Ergebnisse

49

Kultivierungsverfahren des Versuches wurden mit unterschiedlich farbigen Balken

gekennzeichnet. Dabei stellen die blauen Balken die Messung nach 6 Tagen und zwei

Medienwechseln dar. Die rosa farbigen Balken stellen die Messung nach 10 Tagen und

drei Medienwechseln mit neuem Ham´s F12 dar. Die gelben Balken repräsentieren die

Messung der Zellen nach 10 Tagen mit drei Medienwechseln, wobei beim dritten

Medienaustausch eine Mischung aus 50:50 neuem und altem konditionierten Medium

verwendet wurde.

Es ist zu sehen, dass die Zellen sowohl nach 6 Tagen, als auch nach 10 Tagen in

Abhängigkeit von der Serumkonzentration, je mehr Serum im Medium enthalten ist,

umso besser in das Wachstum. Dabei spielt es für das Wachstum der Zellen aber keine

Rolle, ob beim dritten Medienwechsel komplett neues Medium, oder die Mischung aus

neuem und altem Medium verwendet wurde. Die Dauer der Kultivierung hat auf die

erreichte Zellmenge einen größeren Einfluss als die Höhe des verwendeten

FCS- Anteils im Medium.

0

0,005

0,01

0,015

0,02


FCS-Konzentration

GF

P (

Pe

ak

flä

che

) p

ro Z

ell

e

nach 6 Tagennach 10 Tagen (1)nach 10 Tagen (2)

Abbildung 3.14: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro Zelle bei niedriger Aussaatdichte (1x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit Dargestellt ist der Verlauf der GFP-Expression pro Zellen in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium nach einer geringen Aussaatdichte von 1x105. Für 12h inkubierte Zellen wurden nach dem ersten Medienwechsel für weitere 72h und nach zweitem Medienwechsel nochmals 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert (blaue Balken). Beim zweiten Ansatz wurde ein dritter Medienwechsel mit neuem Medium durchgeführt und die Zellen weitere 96h inkubiert (rosa Balken). Im dritten Ansatz wurde ebenfalls ein dritter Medienwechsel durchgeführt, hier aber mit einer Gemisch aus neuem und altem Medium im Verhältnis 50:50 (gelbe Balken). Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Aussaat-Linie stellt die Zelldichte (hier: 1x105) dar, mit der die Zellen vor Medienwechsel ausgesät wurden.

Ergebnisse

50

Betrachtet man nun die zelluläre GFP- Expression ist wieder deutlich zu sehen, dass

die Werte der Kultivierung ohne Serum im Vergleich zur Kultivierung mit Serum

deutlich erhöht sind. Diese Tendenz tritt sowohl bei der Messung nach 6 Tagen, als

auch bei der Messung nach 10 Tagen auf. Interessanterweise ist allerdings zu sehen,

dass bei der Messung nach 10 Tagen generell die Balken mit der Medienmischung aus

50:50 neuem und altem Medium deutlich erhöht sind, obwohl die Zellen genauso gut

gewachsen sind, wie beim Medienwechsel mit komplett frischem Medium

(Abbildung 3.13).

-1000

1000

3000

5000


FCS-Konzentration

GF

P (

Pe

ak

flä

che

) p

ro c

m²


Abbildung 3.15: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro cm² bei niedrigen Aussaatdichte (1x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit Dargestellt ist der Verlauf der GFP-Expression pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium nach einer geringen Aussaatdichte von 1x105. Für 12h inkubierte Zellen wurden nach dem ersten Medienwechsel für weitere 72h und nach zweitem Medienwechsel nochmals 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert (blaue Balken). Beim zweiten Ansatz wurde ein dritter Medienwechsel mit neuem Medium durchgeführt und die Zellen weitere 96h inkubiert (rosa Balken). Im dritten Ansatz wurde ebenfalls ein dritter Medienwechsel durchgeführt, hier aber mit einer Gemisch aus neuem und altem Medium im Verhältnis 50:50 (gelbe Balken). Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Aussaat-Linie stellt die Zelldichte (hier: 1x105) dar, mit der die Zellen vor Medienwechsel ausgesät wurden.

In Bezug auf die GFP- Expression pro cm² wird deutlich, dass die Werte der GFP-

Signale bei der Messung nach 6 Tagen einen leichten Anstieg aufweisen, je mehr

Serum im Medium vorhanden ist. Bei der Messung nach 10 Tagen ist zu erkennen,

dass die Signale des fluoreszierenden Proteins bei einem Wert von 0%FKS im Medium

deutlich erhöht sind und sich klar von allen anderen, serumhaltigen Medien absetzen.

Aus dem Diagramm ist ebenso ersichtlich, dass nach dem dritten Medienwechsel mit

Ergebnisse

51

dem Gemisch aus neuem und altem konditionierten Medium die mit Abstand höchste

GFP- Expression erreicht wird.

3.2.2 Proliferation und Expression bei einer mittleren Aussaatdichte (5x105)

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000


FCS-Konzentration

Ze

llza

hl

pro

cm

² nach 6 Tagennach 10 Tagen (1)nach 10 Tagen (2)Zellaussat pro cm²

Abbildung 3.16: Einfluss von FCS auf Proliferation bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit Dargestellt ist der Verlauf des Wachstums der Zellen pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium nach einer mittleren Aussaatdichte von 5E5. Für 12h inkubierte Zellen wurden nach dem ersten Medienwechsel für weitere 72h und nach zweitem Medienwechsel nochmals 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert (blaue Balken). Beim zweiten Ansatz wurde ein dritter Medienwechsel mit neuem Medium durchgeführt und die Zellen weitere 96h inkubiert (rosa Balken). Im dritten Ansatz wurde ebenfalls ein dritter Medienwechsel durchgeführt, hier aber mit einer Gemisch aus neuem und altem Medium im Verhältnis 50:50 (gelbe Balken). Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Aussaat-Linie stellt die Zelldichte (hier: 5x105) dar, mit der die Zellen vor Medienwechsel ausgesät wurden.

Die Zellen wurden hier mit einer Zelldichte von 5x105 pro Well ausgesät und das

Experiment wie im oberen Abschnitt 3.2 beschrieben durchgeführt. Ziel war es hier zu

überprüfen, ob es vorteilhaft ist die Zellen etwas dichter auszusäen, damit sie

schneller einen dichten Konfluenzgrad erreichen und somit mehr Ausbeute an Zellen

und rekombinantem Protein zu gewinnen ist.

Im Diagramm zur Proliferation der Zellen bei einer Aussaat von 5x105 pro Well ist zu

erkennen, dass unter serumfreien Bedingungen die Zellen weder nach 6 Tagen, noch

nach 10 Tagen über die Aussaatdichte hinaus wachsen. Erst ab einem FCS-Gehalt von

Ergebnisse

52

2% im Medium zeigen die Zellen signifikantes Wachstum, das bei 10 Tagen

Kultivierungsdauer deutlich höher ausfällt, als nach 6 Tagen. Diese Erhöhung der

Zellzahl zeigt sich umso ausgeprägter, je mehr Serum im Medium vorhanden ist.

0

0,005

0,01

0,015

0,02


FCS-Konzentration

GF

P (

Pe

ak

flä

che

) p

ro Z

ell

e


Abbildung 3.17: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro Zelle bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit Dargestellt ist der Verlauf der GFP-Expression pro Zellen in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium nach einer mittlerer Aussaatdichte von 5x105. Für 12h inkubierte Zellen wurden nach dem ersten Medienwechsel für weitere 72h und nach zweitem Medienwechsel nochmals 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert (blaue Balken). Beim zweiten Ansatz wurde ein dritter Medienwechsel mit neuem Medium durchgeführt und die Zellen weitere 96h inkubiert (rosa Balken). Im dritten Ansatz wurde ebenfalls ein dritter Medienwechsel durchgeführt, hier aber mit einer Gemisch aus neuem und altem Medium im Verhältnis 50:50 (gelbe Balken). Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Aussaat-Linie stellt die Zelldichte (hier: 5x105) dar, mit der die Zellen vor Medienwechsel ausgesät wurden.

Betrachtet man die Expression an GFP pro Zelle zeichnet sich die Tendenz ab, dass die

Biildung des rekombinanten Proteins in serumfreiem Medium erhöht ist, unabhängig

von der Kultivierungsdauer. Bei einem Zusatz von Serum im Medium wird lauf

Diagramm deutlich, dass es keinen signifikanten Unterschied in Bezug auf die

GFP-Expression pro Zelle macht, ob die Kultur mit 2%, 4%, 6%, 8% oder 10% FCS

versetzt wurde.

Ergebnisse

53

-1000

1000

3000

5000


FCS-Konzentration

GF

P (

Pe

ak

flä

che

) p

ro c

m²


Abbildung 3.18: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro cm² bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit Dargestellt ist der Verlauf der GFP-Expression pro cm² in Abhängigkeit der Konzentration an FCS (0%-10%) im Kulturmedium nach einer mittleren Aussaatdichte von 5x105. Für 12h inkubierte Zellen wurden nach dem ersten Medienwechsel für weitere 72h und nach zweitem Medienwechsel nochmals 72h im Brutschrank bei 37°C und 5%CO₂ inkubiert (blaue Balken). Beim zweiten Ansatz wurde ein dritter Medienwechsel mit neuem Medium durchgeführt und die Zellen weitere 96h inkubiert (rosa Balken). Im dritten Ansatz wurde ebenfalls ein dritter Medienwechsel durchgeführt, hier aber mit einer Gemisch aus neuem und altem Medium im Verhältnis 50:50 (gelbe Balken). Die Fehlerbalken symbolisieren die Standardabweichung der Doppelwerte der einzelnen Ansätze. Die dargestellte Aussaat-Linie stellt die Zelldichte (hier: 5x105) dar, mit der die Zellen vor Medienwechsel ausgesät wurden.

Die GFP-Expression pro cm² zeigt, dass die Werte im Bereich von 0%FKS im Medium

am höchsten sind. Dabei ist offensichtlich, dass die Messungen nach 6 Tagen die

geringsten Signale bei allen FCS- Konzentrationen ergeben. Die Ansätze bei denen

auch ein dritter Medienwechsel durchgeführt wurde, ergeben die höchsten Werte,

wobei sie sich untereinander in ihren Werten nicht bedeutend unterscheiden.

Ergebnisse

54


3.3.1 Fluoreszenzmikroskopische Analyse der CHO-GFP-Rab11-Zellen

Mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie sollte die Intensität und Lokalisation des

GFP-Rab11 in der verwendeten Zelllinie dargestellt werden. Dabei wurden die Zellen

mit Medien, die von 0%-10% FCS enthalten, kultiviert.

Abbildung 3.19: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP-Rab11 bei einer Zelldichte von 1x105 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium. Dargestellt sind fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen, die die Lokalisation und Intensität des grün fluoreszierenden Fusionsproteins zeigen. Die Zellen wurden in einer 24-Well-Platte kultiviert. Nach 24h wurde ein Medienwechsel mit den entsprechenden FCS- Konzentrationen durchgeführt. Nach weiteren 96h Inkubationszeit wurden die Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet. Die Aufnahmen entstanden mit einer 200fachen Vergrößerung.

Die Aufnahmen der CHO-GFP-Rab11-Zelllinie bei einer Aussaat von 1x105 pro Well

zeigen, dass mit der Zunahme an Serum im Medium die fluoreszierenden Zellen eine

höher Konfluenz aufweisen. Die Intensität an produziertem GFP-Rab11 pro Zelle

verändert sich kaum zwischen den einzelnen FCS- Konzentrationen. Das

membrangebundene rekombinante Protein, ist deutlich in der perinuklearen Region

in der Zelle sichtbar.

Ergebnisse

55

Abbildung 3.20: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP-Rab11 bei einer Zelldichte von 1x106 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium

Dargestellt sind fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen, die die Lokalisation und Intensität des grün fluoreszierenden Fusionsproteins zeigen. Die Zellen wurden in einer 24-Well-Platte kultiviert. Nach 24h wurde ein Medienwechsel mit den entsprechenden FCS- Konzentrationen durchgeführt. Nach weiteren 96h Inkubationszeit wurden die Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet. Die Aufnahmen entstanden mit einer 200fachen Vergrößerung.

Bei einer Aussaat von 1x106 pro Well zeigen die Zellen eine deutlich verminderte

Fluoreszenz. Die Kulturen, die mit 2%-10% FCS im Medium kultiviert wurden zeigen

eine sehr schwache Produktion an GFP-Rab11 pro Zelle. Ein verschwindend geringes

Signal wird bei der Kultivierung ohne Serum sichtbar. Hier ist fast gar keine

Fluoreszenz zu erkennen.

3.3.2 Fluoreszenzmikroskopische Analyse der CHO-GFP-Zellen

Vergleichend zu ersten Zelllinie wurden auch fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen

von der verwendeten zweiten Zelllinie mit dem rekombinantem GFP erstellt. Dies

sollte u.a. die unterschiedliche Lokalisation von GFP in den Zellen verdeutlichen.

Ergebnisse

56

Abbildung 3.21: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP bei einer Zelldichte von 1x105 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium

Dargestellt sind fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen, die die Lokalisation und Intensität des Grün Fluoreszierenden Proteins zeigen. Die Zellen wurden in einer 24-Well-Platte kultiviert. Nach 24h wurde ein Medienwechsel mit den entsprechenden FCS- Konzentrationen durchgeführt. Nach weiteren 96h Inkubationszeit wurden die Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet. Die Aufnahmen entstanden mit einer 200fachen Vergrößerung.

Die Aufnahmen zeigen ein deutliches GFP- Signal in allen FCS- Konzentrationen. Das

GFP ist gleichmäßig in der Zelle verteilt, was die Lokalisation des GFP als ein

cytosolisches Protein unterstreicht. Darüber hinaus findet sich auch GFP im Zellkern

wieder, eine für GFP bekannte Lokalisation.

57

Abbildung 3.22: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP bei einer Zelldichte von 1x106 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium

Dargestellt sind fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen, die die Lokalisation und Intensität des grün fluoreszierenden Proteins zeigen. Die Zellen wurden in einer 24-Well-Platte kultiviert. Nach 24h wurde ein Medienwechsel mit den entsprechenden FCS- Konzentrationen durchgeführt. Nach weiteren 96h Inkubationszeit wurden die Zellen für die Fluoreszenzmikroskopie vorbereitet. Die Aufnahmen entstanden mit einer 200fachen Vergrößerung.

Bei einer Aussaat von 1x106 pro Well ist auch hier deutlich zu erkennen, dass das

Signal an GFP sehr gering ist. Dabei weisen lediglich die Zellen bei einer Kultivierung

mit 10%FCS- Anteil im Medium eine leichte Fluoreszenz auf.

Diskussion

58

4 Diskussion

Das Ziel der Arbeit war es anhand zweier rekominanter, leicht quantifizierbarer

Markerproteine (GFP und GFP-Rab11) zu untersuchen, wie die Parameter

Serumkonzentration, Aussaatdichte und Kultivierungsdauer die Proliferation und

Proteinexpression beeinflussen. Aus diesen Ergebnissen sollte, wenn möglich, eine

Kultivierungsempfehlung für die optimale Expression von Proteinen in CHO- Zellen

aufgestellt werden. Dabei sollte auf die Verwendung von fetalem Kälberserum

möglichst verzichtet werden. Dies ist besonders in der medizinischen Forschung und

Arzneimittelherstellung sehr wichtig, da das Serum viele Nachteile mit sich bringt

[Boxberger, 2007].

4.1 Einfluss von FCS auf Proliferation und Expression bei verschiedenen Aussaatdichten

Bei jeder der ausgesäten Zelldichten wird deutlich, dass die Proliferation mit

steigendem FCS-Gehalt im Serum zunimmt. Das heißt, je mehr Serum im

Kulturmedium enthalten ist, desto besser wachsen die Zellen. Das lässt auf die im

Serum enthaltenen Wachstumsfaktoren, Adhäsionsproteine und viele andere

Faktoren schließen, die positiv auf die Zellvermehrung wirken [Boxberger, 2007].

Allerdings spielt auch die Aussaatdichte eine wichtige Rolle. Werden die Zellen in

einer sehr niedrigen bis mittleren Dichte (1x105, 3x105, 5x105 pro Well) ausgesät, so

wird deutlich, dass die Zelldichte im Vergleich zur Aussaatdichte immer zunimmt

(Abb. 3.1, 3.7, 3.10). Allgemein ist zu sagen, dass die CHO-GFP-Rab11-Zelllinie ein

weniger starkes Wachstum aufweist, als die CHO-GFP-Zellen. Dies kann an den

unterschiedlichen Expressionssystemen (GFP/ GFP-Rab11) der Zellen liegen [Gonda,

2006; Glausch, 2007]. Betrachtet man nun aber die Wachstumswerte bei einer hohen

Aussaatdichte von 1x106 Zellen pro Well (Abb. 3.4), zeigt sich bis zu einem FCS-

Gehalt von 4% ein massives Zellsterben, was auf das Fehlen von Nährstoffen und

Sauerstoff zurück zu führen ist. Die Zellen sind in diesem Medium (FCS-Gehalt von

0%-4%) nicht mehr in der Lage die ausgesäte hohe Zelldichte zu erhalten, da ihnen

zum Überleben wichtige Faktoren fehlen, die im Serum enthalten sind bzw. durch den

Entzug des konditionierten Mediums verloren gegangen sind. Da mit einer

Aussaatdichte von 1x106 pro Well die maximale Kapazität der Kultivierungsfläche

erreicht ist, die bei einer 24-Well-Platte etwa 1,862cm² pro Well beträgt, zeigt sich

Diskussion

59

auch im Bereich von 6%-10% FCS kein zusätzliches Wachstum mehr. Allerdings sind

die Zellen hier in der Lage ihre Zellzahl zu halten oder durch Wachstum eventuelle

Verluste zu kompensieren. Auch in diesem Versuch verhalten sich die beiden

verwendeten Zelllinien sehr ähnlich (siehe Abb. 3.4).

Betrachtet man nun neben dem Wachstum der Zellen auch die Expression des

rekombinanten Grün Fluoreszierenden Proteins (GFP) und des Fusionsproteins GFP-

Rab11, so lässt sich feststellen, dass die Kultivierung in serumfreien Medium einen

äußerst positiven Effekt auf die zelluläre Produktion der Proteine ausübt. Allerdings

zeigt sich beim Vergleich der Diagramme deutlich, dass die Unterschiede zu den

Signalstärken der anderen serumhaltigen Ansätze (2%-10% FCS) geringer werden, je

höher die Aussaatdichte ist (siehe Abb. 3.5). Ebenso werden die Signale, je mehr

Zellen im Well wachsen, generell immer geringer. Daraus lässt sich schließen, dass bei

einer hohen Aussaatdichte weniger GFP/ GFP-Rab11 pro Zelle, als bei einer niedrigen

bis mittleren Aussaatdichte (vgl. Abb. 3.3, 3.5 und 3.8, 3.11) exprimiert wird.

Auch die Arbeitsgruppe um Dana R. Broussard hat herausgefunden, dass eine

Konzentration von 10% FCS im Kulturmedium für ein logarithmisches Wachstum

notwendig ist. Dabei zeichnet sich auch in dieser Arbeit ab, dass eine erhöhte

FCS-Konzentration im Medium einen negativen Effekt auf die Proteinexpression

ausübt. Hierbei wurden allerdings alle Versuche in den Zellen des S. frugiperda

durchgeführt [Broussard, 1988]. Trotzdem lassen sich Zusammenhänge zwischen

dieser Zelllinie und den verwendeten CHO-Zelllinien bezüglich der Expression und

Proliferation in Abhängigkeit der Serumkonzentration finden.

Einer der wichtigsten Aspekte für Industrie und Forschung ist allerdings die

Proteinausbeute pro Kulturfläche, die sich aus der Kombination von Proliferation und

Expression pro Zelle zusammensetzt. Dabei zeigt sich, dass trotz der geringen

Proteinexpression bei einer hohen Aussaatdichte (1x106 Zellen pro Well), bezogen auf

die Produktion pro Fläche, ein positiver Trend abzeichnet. Daraus wird deutlich, dass

es für diese Form der Kultivierung nicht mehr so relevant ist, ob mit serumfreien oder

serumhaltigen Medium kultiviert wird (Abbildung 3.6). Die Werte liegen ungefähr auf

einer Höhe. Diese Tendenz ist auch noch bei einer Aussaatdichte von 5x105 Zellen pro

Well zu sehen (Abbildung 3.12). Bei einer geringeren Aussaatdichte zeigt sich noch

Diskussion

60

ein leichter Anstieg bei der Kultivierung mit serumhaltigem Medium (Abbildung 3.3,

3.9).

4.2 Kultivierungsstrategie zur optimalen Produktion von GFP/ GFP-Rab11 unter Serumentzug

Durch die gesammelten Ergebnisse in den ersten Experimenten konnte nun eine

Strategie entwickelt werden, die sowohl die optimale Aussaatdichte, als auch eine

bestmögliche Kultivierungsdauer kombiniert. Dabei wurde nicht nur ein

Medienwechsel durchgeführt, sondern über die lange Kultivierungsdauer (6 bis 10

Tage) bis zu dreimal das Kulturmedium gewechselt. Die Zellen sollten sich somit

besser an das serumfreie oder serumreduzierte Medium adaptieren können.

Es wurden zwei Aussaatdichten gewählt, die einen guten Vergleich untereinander

möglich machen. Zum einen waren das 1x105 Zellen pro Well und zum anderen 5x105

Zellen pro Well.

Bei einer niedrigen Aussaatdichte (1x105 Zellen pro Well) war sowohl nach 6 Tagen

(mit zwei Medienwechseln), als auch nach 10 Tagen (mit 3 Medienwechseln) ein

starkes Wachstum zu sehen, je mehr Serum im Kultivierungsmedium vorhanden war

(Abbildung 3.13). Vergleichend dazu ist zu sagen, dass bei einer etwas höheren

Aussaatdichte (5x105 Zellen pro Well) auch ein verbessertes Wachstum bei

serumhaltigen Medien zu sehen ist (Abbildung 3.16). Allerdings ist hier das

Wachstum relativ verlangsamt, da die Zellen offensichtlich weniger Platz haben um zu

proliferieren. Auch das Wachstum in serumfreien Medium ist deutlich ausgeprägter

bei einer geringen Aussaatdichte (vgl. Abb. 2.13 und 2.16).

Geht man näher auf die Expression von GFP pro Zelle ein, so zeigt sich bei beiden

ausgesäten Zelldichten, dass eine Kultivierung in serumfreien Medium sich positiv auf

die Produktion der Proteine auswirkt. Dies wird sowohl nach 6 Tagen, als auch nach

10 Tagen Inkubationszeit sichtbar. Betrachtet man nun allein die Kultivierung in

serumfreien Medium, so ist zu erkennen, dass bei einer geringen Aussaatdichte, die

Zellen, die bei einem dritten Medienwechsel mit einem Gemisch aus neuem und

konditionierten altem Medium kultiviert wurden, einen deutlich erhöhten Wert

anzeigen (Abb. 3.14). Dies kann daran liegen, dass die Zellen während ihrer

Wachstumsphase an das Medium bestimmte Stoffe abgeben, die positiv auf die

Diskussion

61

Proteinexpression zurück wirken. Allerdings ist dieser Effekt bei einer mittleren

Aussaatdichte von 5x105 Zellen pro Well nicht mehr zu beobachten. Hier scheinen die

Werte zwischen komplettem dritten Medienwechsel und dem Mediengemisch

annähernd gleich zu sein. Dies lässt darauf schließen, dass die Zellen in einer deutlich

subkonfluenten Konzentration weniger förderliche Stoffe ins Medium abgeben bzw.

von der Präsenz weniger abhängig sein [Plattner, Hentschel, 1977].

Der förderliche Einfluss von FCS auf die Expression von GFP/ GFP-Rab11 in Bezug auf

die Wachstumsfläche in der gesamten Probe ist nach einer Kultivierungsdauer von 10

Tagen verschwindend gering. Es zeigt sich, dass die Zellen sich schon nach einem

zweiten Medienwechsel an ihre neue serumfreie bzw. serumreduzierte Umgebung

gewöhnt haben. Sowohl nach 6 Tagen, als auch nach 10 Tagen zeigen die Ergebnisse

deutlich, dass eine Kultivierung ohne Serum einen offensichtlich positiven Einfluss auf

die Proteinausbeute pro Wachstumsfläche hat. Weiterhin erhöht sich die Menge an

exprimiertem Protein nochmals um etwa 30%, wenn die Zellen 10 Tage und mit drei

Medienwechseln kultiviert werden, im Gegensatz zu einer Kultivierungszeit von 6

Tagen und 2 Medienwechseln.


Durch die Fluoreszenzaufnahmen zeichnet sich ab, dass die Zellen bei einer geringen

Aussaatdichte mehr GFP pro Zelle exprimieren. Dabei zeigte sich allerdings kein

gravierender Unterschied zwischen den in serumfreien und serumhaltigen Medium

kultivierten Zellen (vgl. Abb. 3.19, 3.20, 3.21 und 3.22). Diese Beobachtung ist durch

zukünftige Quantifizierungen zu untermauern, für die im Rahmen dieser

Bachelorarbeit die Zeit fehlte.

Die Lokalisation von GFP und GFP-Rab11 in den beiden Zelllinien konnte durch die

Analysen mit dem Fluoreszenzmikroskop verdeutlicht werden. Dabei zeigt das

membrangebundene GFP-Rab11 ein deutliches Signal in der Nähe des Zellkernes auf.

Dies entspricht der Lokalisation des endogenen Rab11, das sich im perinuklearen

Recycling- Kompartiment befindet [Ullrich et al., 1995]. Im Gegensatz dazu leuchtete

das cytosolisches Protein GFP im gesamten Zellraum und war im Zellkern

angereichert [Barka et al., 2004; Savina et al., 2020].

Diskussion

62

4.4 Fazit

Diese Versuche zeigen, dass es durchaus möglich ist mit der Kultivierung ohne Serum

hohe Proteinausbeuten zu erhalten. Dabei spielt es in dieser Untersuchung keine

Rolle, welche Zelllinie (CHO-GFP, CHO-GFP-Rab11) man verwendet und welches

Protein betrachtet wird (cytosolisch/ membrangebunden), da sie in ihrer

Proliferation und Expression sehr ähnlich auf die Kulturbedingungen reagieren.

Wichtig ist offenbar die Aussaatdichte und Kultivierungsdauer. Man muss den Zellen

die Möglichkeit geben sich bei einer Kultivierung ohne Serum an das Medium zu

gewöhnen. Durch diesen Zeitraum der Anpassung können die Zellen den Mangel und

Stress, den sie durch den Medienwechsel zum serumfreien Medium erfahren haben,

kompensieren und sich an die neuen Bedingungen anpassen. Es scheint, dass durch

das Fehlen der im Serum enthaltenen Wachstumsfaktoren die zelluläre

Stoffwechselaktivität primär die Produktion der rekombinanten Proteine steigert und

nicht das Zellwachstum. Daraus lässt sich eine Kultivierungsstrategie für die

serumfreie Produktion von rekombinanten Proteinen ableiten, wobei die Zellen in

einer mittleren Zelldichte ausgesät werden (5x105 Zellen pro Well) und dann über

einen längeren Zeitraum von 10 Tagen kultiviert werden.

Zusammenfassung

63

5 Zusammenfassung

Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung einer optimalen Kultivierungsstrategie für

die Expression rekombinanter Proteine in CHO-Zellen unter Berücksichtigung von

Parametern wie Aussaatdichte, Serumkonzentration und Kultivierungsdauer. Dabei

sollte möglichst auf die Verwendung von Serum im Medium verzichtet werden. Die

Analyse erfolgte an zwei transgenen CHO-Zelllinien die das cytosolische Grün

Fluoreszierende Protein (GFP) und das membrangebundene Fusionsprotein GFP-

Rab11 als leicht messbare Modellproteine exprimieren.

Es zeigte sich, dass durch die Zugabe von Serum im Medium das Zellwachstum der

einzelnen Kulturen ernorm gesteigert wird und somit einen positiven Einfluss auf die

schnelle Produktion von Zellmasse ausübt. Die mit serumhaltigem Medium

kultivierten Zellen weisen ein bis zu doppelt so hohes Wachstum auf, wie die in

serumfreiem Medium kultivierten Zellen. Im Gegensatz dazu hemmt das Serum

überraschenderweise die Expression von rekombinantem GFP und GFP-Rab11.

Sowohl in Bezug auf die Expression pro Zelle, als auch pro Kulturfläche wurde für die

serumfreie Kultivierung eine bis zu doppelt so hohe Ausbeute an rekombinantem

Protein gemessen, wie in einer serumhaltigen Kultur. Der Vergleich der beiden

verwendeten Zelllinien untereinander zeigte dabei sehr ähnliche Tendenzen für

Proliferation und Expression. Bei weiteren Untersuchungen wurde deutlich, dass es

von entscheidendem Vorteil ist eine relativ lange serumfreie Kultivierungsdauer von

10 Tagen durchzuführen. Im Vergleich zu einer 6-tägigen Kultivierung konnte die

Produktion an rekombinantem Protein nochmals um 30% gesteigert werden. Die

Aussaat einer mittleren Zelldichte (2,7x105 Zellen pro cm²) stellte sich als beste

Ausgangskonzentration für eine produktorientierte serumfreie Kultivierung von CHO-

Zellen heraus.

Literaturverzeichnis

64

6 Literaturverzeichnis

Aasif, Mostafa und Schröder, Constantin. 2010. Die Expression von GFP in

rekombinanten CHO Zellen in Abhängigkeit der Medienzusammensetzung. Studienprojekt, HAW- Hamburg

Böcker, Jürgen. 1997. Spektroskopie. Würzburg : Vogel-Verlag

Boxberger, Hans Jürgen. 2007. Leitfaden für die Zell- und Gewebekultur: Einführung

in Grundlagen und Techniken. Weinheim: Wiley-VCH

Broussard, Dana R. and Summers, Max D..1988. Effects of Serum Concentration and

Media Composition on the Level of Polyhedrin and Foreign Gene Expression by

Baculovirus Vectors. Journal of Invertebrate Pathology 54, 144-150

Ganten, Detlev. 2008. Grundlagen der Molekularen Medizin. Berlin, Heidelberg: Springer Verlag

Gey, Manfred H. 2008. Instrumentelle Analytik und Bioanalytik. Berlin, Heidelberg : Springer Verlag

Glausch, Mareen. 2007. Herstellung stabiler GFP-CHO-Zellen und Analyse von

GFP-Rab11-CHO-Zellen. Diplomarbeit, HAW- Hamburg

Gonda, Laura 2006. Etablierung einer stabilen GFP-Rab11 exprimierenden

CHO-Zelllinie. Diplomarbeit, HAW- Hamburg

Gstraunthaler, Gerhard. 2003. Alternatives to the Use of Fetal Bovine Serum: Serum-

free Cell Culture. Altex 20, 4/03

Kück, Ulrich. 2005. Praktikum der Molekulargenetik. Berlin, Heidelberg: Springer Verlag

Krug, Laura. 2008. Etablierung eines Affinitätsreinigungsverfahrens zur Isolierung und

Analyse von Recycling Endosomen aus His6-GFP-Rab11-exprimierenden CHO-Zellen. Diplomarbeit, HAW Hamburg

Lakowicz, J. R.. 1999. Principles of Fluorescence Spectroscopy. Berlin, Heidelberg: Springer Verlag

Lindl, Toni. 2002. Zell- und Gewebekultur: Einführung in die Grundlagen sowie

ausgewählte Methoden und Anwendungen. Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag, 2002. Lodish, Harvey. A., Berk, Anold, Zipursky, S. Lawrence, Baltimore, David und Darnell, James E.. 2001. Molekulare Zellbiologie. Berlin, Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag,


65

Minuth, Will W., Strehl, Raimund und Schumacher, Karl. 2003. Zukunftstechnologie Tissue Engineering: von der Zellbiologie zum künstlichen Gewebe.

Weinheim: Wiley-VCH

Morgan, S. J. und Darling, D. C. 1994. Kultur tierischer Zellen. Berlin, Heidelberg: Spektrum Akademischer Verlag,

Ormö, Mats, Cubitt, Andrew B., Kallio, Karen, Gross, Larry A., Tsien, Roger Y. und Remington, S. James. 1996. Crystal Structure of the Aquorea Victoria Green

Fluorescent Protein. .Science: Vol. 273 no. 5280 pp. 1392-1395

Plattner, Helmut und Hentschel, Joachim. 1977. Zellbiologie. Thieme: 2. Auflage

Pörtner, Ralf. 1996. Reaktionstechnik der Kultur tierischer Zellen. Hamburg : Shaker Verlag

Prasher, Douglas C, Eckenrobe, Virginia, Ward, William W., Prendergast, Frank G. und Cormier, Milton J.. 1991. Primary structure of the Aequorea Victoria green-

fluorescent protein. Elyevier Science Publisher B.V.

Prasher, Douglas, Chalfie, Martin, Tu, Yuan, Euskirchen Ghia und Ward, William W. 1994. Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression. Sience: Vol. 263

Puck, Theodore T. Cieciura, Steven J und Robinson, Arthur. 1958. Long Term

Cultivation of euploid cells from hunan and animal subjects. J Exp Med. 1958, Bd. 108, 945-953.

Schmitz, Sabine. 2007. Der Experimentator: Zellkultur. München : Elsevier GmbH

Schrödel, Andrea. 2007. Die Rolle des fetalen Kälberserums in Zellkulturmedien. Weinheim: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co.

Shailer, C. and Corrin, K. (1999). Serum supply: policies and controls operating in

New Zealand. Dev. Biol. Stand. 99, 71-77

Shimomura, Osamu. 2005. The discovery of awquorin and green fluorescent protein. Journal of Microscokpie 2005, Bd. 217, 3-15

Stemmer, Willem P.C., Crameri, Andreas, Whitehorn, Erik A. und Tate, Emily. 1995. Improved Green Fluorescent Protein by Molecular Evolution Using DNA Shuffling. Nature Biotechnologie: Volume 14

Tsien, Roger Y. 1998. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem, 1998, 67: 509-544

Ullrich, O., S. Reinsch, S. Urbe, M. Zerial, and R. G. Parton. 1996. Rab11 Regulates

Recycling through the pericentriolar Recycling Endosome. J. Cell Biol., 135:913-924

Uppangala, Nidhi. 2010. Animal Cell Culture Media: Natural and Artificial. Biotech Professionals


66

van der Valk, J., Mellor, D., Brands, R. et al. (2003). The humane collection of fetal

bovine serum and possibilities for serum-free cell and tissue culture. Toxicol. in Vitro 17, in press.

Voedisch, Bernd, Menzel, Christian, Jordan, Eva, El-Ghezal, Aymen, Schirmann, Thomas, Hust, Michael und Jostock, Thomas. 2005. Expression rekombinanter

Proteinpharmazeutika. Intraskript: Nr. 7

Widengren, Jerker, Terr, Bob und Rigler, Rudolf. 1999. Protonation kinetics of GFP

an FITC investigated by FCS – aspects of the use of fluorescent indicators for measunring

pH. Elsevier Science B.V.

Wink, M. 2004. Molekulare Biotechnologie. Wiley-VCH Verlag, Weinheim

Taz.de. 2005. Ein grausamer Nebeneffekt. [Online] 18.02.2005 [Zitata vom: 19. 04.2012] http://www.taz.de/1/archiv/?dig=2005/02/18/a0259

Anhang

67

7 Anhang

7.1 Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1.1: Chinese Hamster Ovary Cell ……………………..…………………………... 8 Abbildung 1.2: Grün Fluoreszierendes Protein..…..…………………………………………10 Abbildung 1.3: Jablonski Diagramm ………………………………………………………….…..13 Abbildung 1.4: Fluoreszenzmessung mit Hilfe eines Spektrofluorometers …..…14 Abbildung 2.1: Aufnahme der stabilen CHO-GFP-His₆-Zellinie mit Hilfe eines

Lichtmikroskopes mit Phasenkontrast………...…………………………17 Abbildung 2.2: Pipettierschema zur Aussaat der CHO-Zellen in einer 24-Well-

Platte ………………………………………………………………………………..… 23 Abbildung 2.3: Lebende und tote Zellen mit der richtigen/optimalen

Einstellung am Countess™ Automated Cell Counter von Invitrogen …...…………………………………………………………………..……25

Abbildung 2.4: Schrittweise durchgeführte Zellzahlmessung mit Hilfe des Countess™ Automated Cell Counter von Invitrogen ……………..…26

Abbildung 2.5: Spektrofluorometer der Firma Shimadzu (Modell: RF-5301PC) ……………………………………………………….….. 27

Abbildung 2.6: Software Panorama; Ausschnitt des Ordners <Projekt> ……..…. 29 Abbildung 2.7: Software Panorama; Ausschnitt des Ordners <RF-5301> …...…. 30 Abbildung 2.8: Peakflächenberechnung …………………………………………………….….31 Abbildung 2.9: Darstellung der Grenzen der Peakflächenberechnung………….….31

Abbildung 2.10: Peakflächentabelle …………………………………………………………….….32 Abbildung 2.11: Fluoreszenzmikroskop der Firma Olympus (Modell: BX41)..….. 32 Abbildung 3.1: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei niedriger

Aussaatdichte (1x105).…………………………………………………………. 36 Abbildung 3.2: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle

bei niedriger Aussaatdichte (1x105)………………….……………………37 Abbildung 3.3: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm²

bei niedriger Aussaatdichte (1x105)……………….……………………....38 Abbildung 3.4: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei hoher Aussaatdichte

(1x106)………………………………………………………………………………….39

Abbildung 3.5: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle bei hoher Aussaatdichte (1x106)…………………….………………………40

Abbildung 3.6: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm² bei hoher Aussaatdichte (1x106)……………………….……………………41

Abbildung 3.7: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei mittlerer Aussaatdichte (3x105)………………………………………………………...….42

Abbildung 3.8: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle bei mittlerer Aussaatdichte (3x105 )…………………...…………………....43

Abbildung 3.9: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm² bei mittlerer Aussaatdichte (3x105)…………………………...…..………44

Abbildung 3.10: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei mittlerer Aussaatdichte (5x105)………………......……………………………………….45

Anhang

68

Abbildung 3.11: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro Zelle bei mittlerer Aussaatdichte (5x105)………………………………......……46

Abbildung 3.12: Einfluss von FCS auf GFP-/ GFP-Rab11-Expression pro cm² bei mittlerer Aussaatdichte (5x105)………………………..…...…………47

Abbildung 3.13: Einfluss von FCS auf die Proliferation bei niedriger Aussaatdichte (1x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit ..48

Abbildung 3.14: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro Zelle bei niedriger Aussaatdichte (1x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit ………………………………………………………..…………49

Abbildung 3.15: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro cm² bei niedrigen Aussaatdichte (1x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit ..............................................................................................50

Abbildung 3.16: Einfluss von FCS auf Proliferation bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit ……………….……..51

Abbildung 3.17: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro Zelle bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit ……………………………………………………….………….52

Abbildung 3.18: Einfluss von FCS auf Expression von GFP pro cm² bei mittlerer Aussaatdichte (5x105) und 6 bzw. 10 Tagen Kultivierungszeit …………………………………………………………………. 53

Abbildung 3.19: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP-Rab11 bei einer Zelldichte von 1x105 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium ……………..54

Abbildung 3.20: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP-Rab11 bei einer Zelldichte von 1x106 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium ……………..55

Abbildung 3.21: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP bei einer Zelldichte von 1x105 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium …………..…56

Abbildung 3.22: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen der Zelllinie CHO-GFP bei einer Zelldichte von 1x106 pro Well und unterschiedlichen FCS- Konzentrationen im Medium…......……….57

Anhang

69

7.2 Tabellenverzeichnis

Tabelle 2.1: Für die Kultivierung der CHO-Zellen verwendete Lösungen und ihre Zusammensetzung ……………………………………...………... 18

Tabelle 2.2: Benötigte Volumina der verwendeten Lösungen zum Ablösen der ahärenten Zellen in dem jeweils verwendeten Kulturgefäß .……………………………………………………………………. 18

Tabelle 2.3: Für die Kultivierung der CHO-Zellen verwendete Kulturgefäße und die benötigten Volumina der zur Aussaat verwendeten Lösungen/ Zellsuspension bei einer Konfluenz der Zellen von etwa 80% in der zu passagierenden Kulturflasche (T25/T75).…………………………………………………………..………………. 19

Tabelle 2.4 Medienansatz mit unterschiedlichen FCS- Konzentrationen für ein Standardansatzvolumen von 10ml Mediengemisch…….. 23

Tabelle 2.5 Einzelne Parameter für die Messung der GFP-Probe ...……...……. 29 Tabelle 2.6 : Ansatz für die Lösungen für die

Fluoreszenzmikroskopie……………………………………….……………… 33

Anhang

70

7.3 Material und Geräte

Tabelle 7-1: Verwendete chemische Substanzen Hersteller/ Bezugsquelle Cat-No

Ammoniumchlorid Sigma-Aldrich 235-186-4 Ethanol vergällt > 98% Carl Roth K928.4 FKS BIOCHROM AG S0115 G418 Solution GIBCO 1003772 Ham´s F12 BIOCHROM AG F0815 L-Glutamin BIOCHROM AG K0282 Mowiol CALBIOCHEM B23468 PBS BIOCHROM AG L182-50 Penicillin/Streptomycin BIOCHROM AG A2212 Triton-X 100 Roche 10789704001 Trypan Blue Stain 0.4% GIBCO 15250 Trypson EDTA BIOCHROM AG L2143 Paraformaldehyd Sigma-Aldrich P6148 Tabelle 7-1: Verwendete Materialien

Hersteller/ Bezugsquelle Cat-No /

Modelnummer

Cell counting chamber slides Invitrogen 2CO5221 Pipettenspitzen (2-200µl) Eppendorf AG Z142260 Pipettenspitzen (50-1000µl) Eppendorf AG A144744N Pipettierhilfe Brand Accu-jet 26300 Pipetten (10-100µl) Eppendorf AG Pipetten (100-1000µl) Eppendorf AG Serologische Pipetten (2ml) FALCON 357507 Serologische Pipetten (5ml) FALCON 94005 Serologische Pipetten (10ml)

FALCON 94010

Serologische Pipetten (25ml)

FALCON 94525

UV-Küvette Hellma 980-04187 Zellkulturflaschen (25cm²) BIOCHROM AG 90026 Zellkulturflaschen (75 cm²) BIOCHROM AG 90076 Zentrifugenröhrchen (15ml) Falcon N461.1 Zentrifugenröhrchen (50ml) Falcon N465.1 Eppendorf -Reaktionsgefäße VWR 211-2130

Anhang

71

Tabelle 7-3: Verwendete Geräte Hersteller/

Bezugsquelle Modell(-nummer)

Autoklav Systec V150 Automated Cell Counter Invitrogen Countess CO2 – Inkubator Binder CB150 #05-74745 Digitalkamera Canon PowerShot A95 Eismaschine Scotsman AF80 Fluoreszenzmikroskop Olympus BX41 Kippschüttler EMBL Heidelberg 22708 Kühlschrank (4°C) Liebherr Kühltruhe (-20°C) Liebherr Kühltruhe (-80°C) Liebherr Magnetrührer Heidolph MR3001 Mehrlinsenmikroskop (invers) Zeiss Axiovert 40 Reinstwasseranlage Millipore Synergy Stickstofftank (-196°C) AIR Liquide TR11 Spectroflurometer Shimadzu Spülmaschine Miele Professional G7883 Sterilwerkbank Kendro Laboratory KS18, HERA safe Thermocycler Biometra 2807122 VE-Anlage Sterling Berkfeld miniRO Vortexer Heidolph Reaxtop Waage Satorius TE 1502s (max 1500g;

d.=0.01g) Wasserbad GFL Tabelle 7-4: Verwendete Software Hersteller Verwendungszweck

Adobe Photoshop Adobe Bildbearbeitung Microsoft Exel 2010 Microsoft Statistische Auswertung PanoramaRF Shimadzu Messung und

Auswertung der Fluoreszenz

Countess Software Invitrogen Zellzählung

Anhang

72

7.4 Abkürzungsverzeichnis

°C Grad Celsius

CHO Chinese Hamster Ovary

CO2 Kohlenstoffdioxid

DMSO Dimethylsulfoxid

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

FCS Fetal Calf Serum

FDA Food and Drug Administration

G418 Geneticin 418

GFP Grün Fluoreszierendes Protein

h Stunde(n)

ISO International Organisation für Normung

KCl Kalumclorid

KH2PO4 Kaliumhydrogenphosphat

L-Glu L-Glutamin

min Minute(n)

ml Milliliter

µl Mikroliter

µg Mikrogramm

nm Nanometer

NaCl Natriumchlorid

Na2HPO4 Dinatriumhydrogenphosphat

PBS Phosphate Buffered Saline

Pen Penicillin

s Sekunde(n)

Strep Streptomycin

USB Universal Serial Bus

UV ultaviolett

Anhang

73

Eidesstattliche Erklärung

Ich versichere, dass ich die vorliegende Bachelorarbeit ohne fremde Hilfe verfasst und

nur die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe. Wörtlich oder dem Sinn nach aus

anderen Werken entnommene Stellen sind unter Angabe der Quellen kenntlich

gemacht.

Lisa Schindler

Hamburg, den 18.05.2012

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Entwicklung einer Kultivierungsstrategie unter Serumentzug ...€¦ · dieses Proteins eher zufällig durch eine Gruppe von Wissenschaftlern. Sie untersuchten Extrakte aus Quetschpräparaten